Isolamento e cultivo de microrganismos BsicoPublicado em 18/11/2005 O estudo dos microrganismos est muitas vezes dependente da possibilidade de cultivar e manter microrganismos viveis no laboratrio, sob a forma de culturas puras . As necessidades nutricionais especficas dos microrganismos variam de espcie para espcie, sendo possvel distinguir vrios grupos nutricionais de microrganismos. Com o conhecimento dos nutrientes necessrios ao crescimento dos microrganismos, possvel a formulao de meios de cultura que promovam o crescimento de um determinado microrganismos no laboratrio. O isolamento de um determinado microrganismo em cultura pura a partir de uma populao mista (por exemplo, presente numa amostra de solo, na gua de um rio, num esgoto, num alimento ou tecido contaminado, etc.) envolve, em geral, o uso de meios de cultura slidos e o recurso a tcnicas de isolamento de colnias, como seja pelo mtodo de espalhamento em placa, ilustrado na animao ao lado. Este mtodo permite obter colnias individualizadas e espacialmente separadas que, teoricamente, so originadas a partir de uma nica clula, correspondendo, por isso, a uma cultura pura de um microrganismo particular. Sabe-se, contudo, que cerca de 90% a 99% do nmero total de microrganismos que existem no Ambiente (por exemplo, no solo, gua ou ar) no so cultivveis em meios de cultura e outras condies laboratoriais conhecidos. Este facto tem limitado a possibilidade de serem isolados, a partir do Ambiente, microrganismos com potencial interesse para aplicaes biotecnolgicas. Contudo, presentemente, em consequncia do grande desenvolvimento das tcnicas da Biologia Molecular nas ltimas dcadas, o microbiologista pode identificar e estudar os microrganismos com base na anlise directa das suas macromolculas (em particular do seu DNA), sem que seja necessrio isol-los em meios de cultura laboratoriais. Entre as tcnicas da Biologia Molecular que permitem este progresso salienta-se a Reaco em Cadeia da Polimerase (PCR Polymerase Chain Reaction).As bactrias so conhecidas desde 1674, mas a sua estrutura ainda objecto de estudo, so os seres vivos mais simples do ponto de vista estrutural, e de menor tamanho, podendo ser conhecidas tambm como micrbios. As bactrias so microorganismos unicelulares, procariontes, e algumas causam doenas. So abundantes no ar, no solo e na gua, e na sua maioria inofensivas para o ser humano, sendo algumas at benficas. Por serem microrganismos procariontes, no apresentam um ncleo definido, estando o seu material gentico compactado e enovelado numa regio do citoplasma chamada de nucleide. As bactrias apresentam uma membrana plasmtica recoberta por uma parede celular, o seu tamanho pode variar entre 0,2 a 5,0 micrmetros, sendo por isso observveis apenas ao microscpio. As bactrias reproduzem-se por diviso celular, as causadoras de doenas

denominam-se patognicas. Estas possuem diversas formas, que podem variar de acordo com o meio e com o tipo de associao. A cultura de bactrias o crescimento de colnias de microorganismos induzida pelo Homem para facilitar o seu estudo. Para a realizao de uma cultura bacteriana, precisamos de um inoculo e de um meio de cultura. O meio de cultura uma substncia lquida ou slida, simples ou complexa, que permite a nutrio, o crescimento e a multiplicao dos microorganismos do inoculo. Os meios de cultura so seleccionados consoante o tipo de bactria a observar. As bactrias multiplicam-se em meios de cultura apropriados desde que sejam respeitadas as condies de temperatura, pH, humidade e composio. Esta actividade tem como objectivo inocular, introduzir artificialmente microrganismos num meio especfico, qualquer objecto de uso corrente num meio de cultura esterilizado, com o intuito de as bactrias que se encontravam nesse objecto se multiplicarem, formando colnias.1. Tcnicas asspticas As chamadas "tcnicas asspticas" so indispensveis para o isolamento, cultivo e identificao de microrganismos. Elas tm a finalidade de evitar contaminaes do meio de cultura ou dos materiais utilizados para determinado procedimento por microrganismos presentes no meio (ar, gua, mos, roupas, etc.). A seguir, listamos algumas medidas essenciais que devem ser observadas pelo manipulador na ocasio da prtica de tcnicas de crescimento e isolamento de microrganismos, com o fim de preservar a pureza do cultivo e minimizar os riscos de infeco ou intoxicao no laboratrio. 1.1 - Zona de esterilidade As manipulaes devem ser feitas dentro de uma capela microbiolgica de fluxo laminar (Figura 1), que pode ser tanto de fluxo horizontal quanto vertical. O fluxo um ambiente estril dentro da capela. Na ausncia de uma capela laminar, a manipulao deve ser feita por trs da chama do bico de gs, de forma a garantir o estabelecimento de uma zona de esterilidade. somente nesta zona estril, que os tubos ou recipientes com meios de cultura estreis e o material biolgico a ser inoculado, devero ser abertos ou manipulados. Qualquer outro material estril (ex: caixa de ponteiras, seringas, potes contendo microtubos, etc.) utilizado nos procedimentos s pode ser aberto nesta rea, para ser preservada a sua esterilidade.

Figura 1 - Capela de Fluxo Laminar Vertical 1.2 - Flambagem 1.2.1 - Alas de platina Tanto a ala quanto o fio de platina devem ser flambados antes e depois de qualquer operao de semeadura ou inoculao de microrganismos. Para tanto, devem ser aquecidos ao rubro e a parte inferior do cabo deve ser passada na chama 2 a 3 vezes. A posio correta para a flambagem da ala que a mesma faa um ngulo de 45o em relao mesa de trabalho (Figura 2). Deve ser utilizado o cone interno da chama do bico de Bunsen. Para retirar o material, seja para fazer um esfregao ou para uma semeadura, esfriar previamente a ala. Deixar esfriar nas proximidades da chama, ou em um tubo contendo gua estril.

Figura 2 - Posio correta para a flambagem da ala. 1.2.2 - Tubos ou frascos Toda vez que fizer uma semeadura ou inoculao de microrganismos, utilizando tubos de ensaio, tubos de rosca ou frascos do tipo Erlenmeyer, deve-se flambar a boca dos mesmos imediatamente aps a retirada da tampa (ou tampo de algodo). A tampa dever ser mantida segura pelo dedo mnimo da mo (Figura 3). Caso esteja repicando a cultura para outro tubo, o mesmo procedimento deve ser feito com este outro tubo antes da inoculao dos microrganismos. Inclin-los, sempre, a aproximadamente 30. No caso de tubo com gar inclinado, este deve ficar de preferncia na horizontal. Aps a retirada do material com

ala ou pipetas, flambar novamente a boca do tubo e colocar a tampa. Descartar as ponteiras usadas em recipientes, de preferncia, contendo solues detergentes ou desinfetantes.

Figura 3 - Posio correta para a remoo da tampa de tubos ou frascos Erlenmeyer 1.3 - Esterilizao de materiais 1.3.1 - Autoclave A autoclave um equipamento muito eficiente para a esterilizao de diversos materiais e meios de cultura. Consiste no tratamento trmico mido sob presso, em geral, a 121C por quinze minutos. Como exemplos de uso da autoclave tm-se a esterilizao de placas de Petri, tubos falcon, microtubos, ponteiras, meios de cultura lquidos ou contendo gar, papis toalha, materiais contaminados, pipetas manuais, etc. No entanto, como medidas de segurana ou para evitar estragos com os materiais e meios de cultura, alguns cuidados devem ser tomados, como por exemplo: acomodar bem os materiais e no encher demais a autoclave; deixar sair todo o vapor para ento fechar a vlvula de segurana; estar atento temperatura marcada na autoclave e sempre medir o tempo transcorrido; assim que desligar a autoclave, esperar a temperatura abaixar para ento abrir a vlvula de escape do vapor e, quando todo o vapor sair, a autoclave pode ser aberta e o material que foi esterilizado retirado. A autoclave pode existir de diversos tamanhos e configuraes, dependendo da sua finalidade (Figura 4).

Figura 4 - Exemplos de configuraes de autoclave 1.3.2 - Forno de Pasteur

Algumas substncias e materiais, como instrumentos metlicos, seringas de vidro, vaselinas e leos, s vezes no podem ser submetidos ao calor mido e devem ser esterilizados sob calor seco. Em geral, so necessrias temperaturas maiores e tempos de exposio mais longos para se atingir a esterilizao do que os empregados na autoclave, uma vez que o poder de penetrao do calor seco menor que o do calor mido. 1.3.3 - Produtos qumicos Compreende a utilizao de produtos do grupo dos aldedos, glutaraldedos e formaldedos. Como apresentam toxicidade, no so indicados como medida de primeira escolha, no entanto so indispensveis para a esterilizao de materiais termossensveis, tais como artigos de nylon e teflon, luvas, tubos de borracha e outros. 1.4 - Desinfeco e antissepsia A desinfeco e antissepsia consistem na descontaminao de materiais inertes e tecidos vivos, respectivamente, por microrganismos em suas formas vegetativas. Para fins de desinfeco e antissepsia, em geral, faz-se o uso de produtos qumicos, Entre estes produtos, so largamente utilizados o hipoclorito de sdio, lcool etlico a 70%, solues de iodo e aldedos. 2. Cultivo de microrganismos Os microrganismos podem ser provenientes de diversas fontes naturais ou ento serem adquiridos de culturas previamente armazenadas, podendo estar refrigerados ou liofilizados. O crescimento destes microrganismos otimizado quando inoculados em meios de cultura apropriados e mantidos em condies de temperatura, aerao e tempo de crescimento adequados. Caso no se conhea os microrganismos que esto sendo cultivados, como no caso do estudo da microbiota de determinado local, normalmente eles so isolados e identificados para ento poderem ser adquiridas as culturas puras. Inmeras tcnicas de cultivo e isolamento de microrganismos podem ser empregadas e no presente texto, somente abordada uma viso superficial dos procedimentos bsicos utilizados para tais fins. 2.1 - Condies de incubao As tcnicas empregadas para o isolamento e cultivo de microrganismos dependem da fonte (alimentos, tecidos vivos, gua, ar, etc.) e do tipo de microrganismo que se deseja isolar (enteropatgenos, bactrias lcticas, fungos filamentosos, leveduras, etc.). Por exemplo, alguns microrganismos crescem somente ou preferencialmente em condies de anaerobiose e, portanto, aps o repique em meios de cultura adequados, os tubos ou placas devem ser acondicionados em cmaras de anaerobiose (Figura 5). Na ausncia desta, existem outros equipamentos com o fim de manter uma atmosfera livre de oxignio, como jarras de anaerobiose e envelope plstico para anaerobiose.

Figura 5 - Cmara de anaerobiose Para os microrganismos aerbios, a incubao das placas ou tubos contendo os inculos normalmente feita em estufas bacteriolgicas (Figura 6). Tanto em condies aerbias e anaerbias, o controle da temperatura importante para se obter o crescimento dos microrganismos na taxa adequada. Enquanto muitos microrganismos crescem em temperatura ambiente ou at mesmo em condies extremas, outros tm a melhor taxa de crescimento a 37C e, assim, devem ser mantidos em estufas com a temperatura regulada.

Figura 6 - Estufa Bacteriolgica 2.1 - Cultivo em tubos contendo meios de cultura lquidos Tal procedimento bastante til, pois possibilita a rpida e elevada multiplicao de microrganismos. Se o objetivo for o isolamento, os microrganismos podem ser crescidos nos meios de cultura lquidos adequados, seguido por semeadura em placas. A inoculao de microrganismos em meios de cultura lquidos pode ser feita com o auxlio de uma ala de platina previamente flambada ou ala descartvel esterilizada, caso os microrganismos sejam provenientes de meios slidos ou semi-slidos, ou atravs de uma pipeta, normalmente quando se est fazendo o repique de uma cultura que est armazenada em meio lquido (Figura 7).

Figura 7 - Repique de uma cultura com o auxlio de pipetas automticas 2.3 - Semeadura em placas Na maioria dos casos, o microorganismo a ser isolado faz parte de uma populao mista, sendo indispensvel o seu isolamento no sentido de obteno de cultura pura. Uma das maneiras de se obter uma cultura pura consiste no emprego da tcnica de semeadura, em que so obtidas colnias isoladas de microrganismos. As colnias so caracterizadas por suas caractersticas morfolgicas e, dependendo do objetivo, so cultivadas separadamente em meios slidos ou lquidos para a posterior identificao. A tcnica de semeadura tambm pode ser aplicada em determinados estudos com o objetivo apenas de cultivo ou para quantificar a populao microbiana. 2.1.1. Inoculao por estrias ou esgotamento em placas de gar A tcnica de semeadura por estrias mltiplas consiste em espalhar o material com o auxlio de uma ala bacteriolgica, fazendo estrias sucessivas at o esgotamento do material, de modo a obter-se um perfeito isolamento das bactrias existentes na amostra, que aps a incubao, formaro as colnias isoladas sobre a superfcie do gar. A execuo simples e devem ser tomados alguns cuidados para que realmente consiga o isolamento das bactrias. Primeiramente, deve-se flambar a ala de platina (ou ento pode-se utilizar alas de plstico descartveis previamente esterilizadas) e introduzi-la no meio contendo as bactrias. Fazer ento o estriamento na superfcie do gar da placa de Petri Aps a primeira estria, flambar novamente a ala, girar a placa cerca de 30 e puxar nova estria. Repetir esse passo pelo menos mais 2 vezes (Figura 5). Lembre-se de que a quantidade de material a ser inoculada deve ser mnima, sendo que em muitos casos, necessrio diluir o meio do qual os microrganismos so provenientes; caso contrrio, pode haver a justaposio das colnias e por isso no se pode isol-las.

Figura 5 - Semeadura por esgotamento em placa: segundo e terceiro conjunto de estrias 2.1.2 - Mtodo de "espalhamento" em placa Consiste em espalhar o material (suspenso bacteriana na maioria das vezes) com o auxlio de um swab (para obteno de tapete uniforme) ou ala de Drigalski (para obteno de colnias isoladas aps diluio), fazendo a semeadura por toda a superfcie da placa de Petri (Figura 6). Deve-se ter o cuidado de garantir que toda a superfcie da placa seja semeada, evitando regies sem semeadura. Recomenda-se que o procedimento de semeadura com o swab seja feito em trs direes distintas, com diferena de 30 graus, e com a ala em toda a superfcie, girando a placa.

Figura 6 - Semeadura em placa por espalhamento utilizando ala de Drigalski

Tipos de Meio de Cultura Histrico gar: - descoberto no Japo; - criado a partir de algas; - usado em alimentos.

Fannie e Walter Hess; Robert Koch; Histrico Robert Koch: - Introduo dos meios slidos (1880); - Bacilo da tuberculose (Bacilo de Koch Mycobacterium tuberculosis); - Estudo de espcies isoladas (culturas puras). DIAGRAMA DE CLASSIFICAO Processos de preparao Cada meio tem uma finalidade prpria e, para tal, tem um mtodo adequado de produo, assim como materiais e componentes. De modo geral, usa-se materiais como placas de Petri e tubos de ensaio (para conter o meio propriamente dito), autoclave (esterilizao), bicos de Bunsen (ou outras formas de aquecimento lamparinas ou microondas), indicadores de pH (se for necessrio tal especificao), alas de inoculao (de platina, de repicagem etc). Entre os reagentes, os mais comuns so gua destilada, peptona, caldo de carne, NaCl, agentes solidificantes (gar-gar ou outros mais especficos), acidificantes e alcalinizantes (geralmente cido Ltico e NaOH). Podemos citar, por exemplo, o mtodo de produo do Caldo Simples e do gar Simples como processos de preparao rotineiros num laboratrio de microbiologia praticamente todos os outros mtodos so variaes. Etapas bsicas: esterilizao dos materiais (autoclavagem, detergentes enzimticos, flambar ao rubro, lcool), pesagem e diluio do gar em gua aquecida, adio de outras substncias necessrias (vitaminas, aminocidos, sangue etc.), solidificao e inoculao de microorganismos no meio. Estado fsico

Slidos: quando contm agentes solidificantes, principalmente gar (cerca de 1 a 2%); Os meios de cultura slidos so preparados a partir da adio, ao meio lquido correspondente, de um agente solidificante antes da esterilizao do meio. Semi-slidos: quantidade de gar e/ou gelatina de 0,075 a 0,5 %, de uma consistncia intermediria, de modo a permitir o crescimento de microrganismos em tenses variadas de oxignio ou a verificao da motilidade e tambm para conservao de culturas. Lquidos: sem agentes solidificantes, como um caldo, utilizado para ativao das culturas, repiques de microrganismos, provas bioqumicas etc. Um gel duro, por excesso de gar frequentemente nefasto para o crescimento dos tecidos, mas os meios de baixa concentrao em gar perdem gua facilmente por evaporao. A escolha da quantidade de gar resulta de um compromisso entre um meio duro que minimize as perdas de gua e um meio mole que permita uma melhor difuso dos nutrientes. Geralmente, o crescimento de microalgas realizado em meio lquido. Os frascos da cultura lquida so colocados frequentemente nos shakers (mesa agitadora) a fim introduzir O2 ao lquido e manter a uniformidade da cultura. Em 5 mL de meio de cultura lquido, conseguimos quantidades enormes como 5 bilhes de bactria. procedncia dos constituintes Naturais (ou Complexos): Ingredientes sem composio qumica definida, geralmente extratos vegetais, animais ou de outros microorganismos. Usados para microorganismos menos exigentes na nutrio. Ex.: Meio de Lwenstein Jensen, que contm sais, ovos e pedaos de batata. Artificiais (ou Sintticos ou Quimicamente Definidos): Ingredientes de composio e quantidade conhecidas Geralmente para microorganismos mais especficos. Ex.: Caldo Tetrationato, que contm apenas iodo, KI e gua eficiente para enriquecimento de Salmonella spp. composio qumica Quanto composio qumica podem ser: Simples (ou meios bsicos): aqueles que permitem o crescimento bacteriano, sem satisfazer, contudo nenhuma exigncia em especial Ex.: Caldo e gar simples;

Especiais (ou complexos): quando cumprem com as exigncias vitais de determinados microrganismos, contendo para isso, diversas substncias como meio de infuso de crebro e corao, soro bovino, fragmento de fgado etc. Ex.: Meios Shahidi Ferguson Perfringens (SFP) e Triptose Sulfito Ciclosserina (TSC) etc. finalidade bacteriolgica E/OU micolgica Subdividem-se em: Meios de Contagem Meios de Estocagem Meios de Triagem Meios de Identificao Meios de Pr-Enriquecimento Meios de Enriquecimento Meios Diferenciais Meios Seletivos MEIOS DE CONTAGEM Empregado para a determinao quantitativa da populao microbiana. MEIOS DE ESTOCAGEM OU MANUTENO Utilizados para conservao de microrganismos no laboratrio por garantirem a viabilidade de microrganismos. MEIOS DE TRIAGEM Meios que avaliam determinadas atividades metablicas permitindo caracterizao e identificao superficial ou pressuposta de muitos microorganismos. MEIOS DE IDENTIFICAO

Utilizados para a realizao de provas bioqumicas e verificao de funes fisiolgicas de organismos submetidos identificao. Meios de Pr-Enriquecimento O pr enriquecimento um mtodo usado para anlise de material desidratado, ou para favorecer a recuperao de organismos danificados, permitindo a recuperao da clula antes da inoculao em meios seletivos. Ex.: gua peptonada e caldo lactosado (isolamento de salmonela de leite em p). Meios de Enriquecimento Meios de enriquecimento proporcionam nutrientes ao crescimento de microrganismos, mesmo aqueles mais difceis de serem cultivados, e inibir tambm a presena de microorganismos competidores, satisfazendo as necessidades nutricionais do microorganismo. Ex. Caldo Tetrationato e Selenito-Cistina para cultivo de Salmonelas (lquidos), Caldo Tioglicolato para Clostridium perfringens. Meios Diferenciais Permite estabelecer diferenas entre microorganismos parecidos, facilita a identificao da bactria quando existem outras bactrias crescendo no mesmo meio. Ex.: gar Sangue, que contm clulas vermelhas do sangue, muito utilizado pelos microbiologistas para identificao de espcies bacterianas capazes de destruir clulas sanguneas. Meios Seletivos So aqueles que possuem substncias que inibem o desenvolvimento de um determinado grupo de microorganismos favorecendo o crescimento de outras espcies. Ex.: Meios com sais biliares e verde brilhante para isolamento seletivo de microorganismos como a Salmonella. CURIOSIDADES Ingredientes Bizarros:

base de alguns meios, adicionado sangue de cavalo, carneiro ou coelho em temperatura alta, o que faz com que as hemcias lisem, liberando hemina e hematina, compostos fundamentais para o crescimento dos microrganismos exigentes. Em outros casos, como no Caldo BHI (Brain Heart Infusion), existem nutrientes de crebro e corao, peptona e dextrose. A peptona e a infuso so fontes de nitrognio (N), carbono (C), enxofre (S) e vitaminas. Meios Caseiros: Meios de proliferao que podem acontecer por descuido ou acidente. Envolvem, em sua maioria, fungos, atacando principalmente alimentos mal conservados. Outros exemplos: uma parede com infiltrao que embolora, po velho e frutas que so deixados ao ar livre, um p com frieira etc. Tambm se pode fabricar meios mais controlados com potes de manteiga, caldo de carne e gelatina sem sabor. AUTORES Amanda Dias Amanda Martins Bruna Marangoni Caroline Crevellaro Giselaine Alves Thiago Zanesco Vtor Freire 3F Tcnico em Qumica Professora: Anglica Teixeira BIBLIOGRAFIA http://www.biologico.sp.gov.br/ http://www.biomedicinabrasil.blogspot.com/ http://www.microbiologia.ufba.br/

http://www.microbiologiabrasil.blogspot.com/ http://www.utilizadores.leirianet.pt/ (pginas acessadas entre 09 e 18 de abril de 2011) LACAZ-RUIZ, Rogrio. Manual Prtico de Microbiologia Bsica.