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Biotransformao de

Isoflavonas de SojaPESQUISA

Aplicao da biotecnologia enzimtica na converso de isoflavonas com maior atividade biolgica

Brasil o segundomaior exportadorde gros de soja

(Glycine max) e oprincipal exporta-

dor de farelo de soja, com 32% domercado mundial, que represen-tam 75% da produo brasileira(Roessing, 1995). H possibilidade deque, em 2001, haja um aumento decerca de 10% a mais que no ano passa-do, ou seja, alcanar aproximadamen-te, 12,7 milhes de toneladas. As previ-ses para a receita do complexo soja(gro, leo e farelo) mostram um au-mento de at 14%, algo em torno de US$

4,8 bilhes. A rea plantada foi de 13,7milhes de ha na safra 2000/2001.A soja vem sendo utilizada h muito

tempo como alimento devido ao seuelevado teor protico, muito emboratambm possua em sua composioqumica compostos polifenlicos como,por exemplo, os isoflavonides(Figu-ra 1) que tm sido relacionados a impor-tantes propriedades biolgicas, taiscomo: atividade anti-oxidante (Esaki etal., 1999; Esaki et al., 1998; Shahidi et al.,1992), atividade antifngica (Naim et al.

1974), propriedades estrognicas (Mur-phy, 1982) e atividade anticancergena

(cncer de mama e prstata) (Coward etal., 1993; Peterson & Barnes, 1993; De-nis et al., 1999).

Figura 1: Estruturas de

isoflavonas encontradas na soja

Pases orientais, como Japo e Chi-na, j utilizam h muitos anos a sojafermentada na alimentao e, atual-mente, tem-se percebido um crescenteconsumo dessa leguminosa e de seusderivados em pases europeus e nosEstados Unidos, como alimento funcio-

nal. Nos Estados Unidos, em 2000, aproduo de alimentos funcionais comoa soja foi de, aproximadamente, 20bilhes de dlares, contudo, estima-seque haver um crescimento exponenci-al, que, no ano 2010, atingir a cifra dequase 60 bilhes de dlares (Henry,1999). Isoflavonas so a maioria doscompostos fenlicos da soja (Ahluwaliaet al., 1953). Soja e farinha desengordu-rada de soja, que tenham sofrido leveaquecimento durante o processamento,contm, principalmente, 6-O-malonil-glicosil isoflavonas, com menor quanti-dade de b-glicosil isoflavonas e traos

de6-O-acetil-glicosil isoflavonas. Lei-te de soja, tofue outros alimentos base de soja, que sofrem aquecimen-to a 100C durante o processamento,contm, principalmente,b-glicosil iso-

flavonas. Farinha torrada e protenaisolada de soja tm quantidadesmoderadas de cada conjugadode isoflavonas (Barnes, 1995).Isoflavonas agliconas so absor-

vidas na parte superior do intes-tino delgado com muitos medi-camentos de estrutura similar (Co-

ward et al., 1993). b-Glicosil iso-flavonas so excelentes substra-tos para b-glicosidase e seria es-perado que fossem absorvidosno intestino delgado. As malonil

e acetil-glicosil isoflavonas mo-dificadas so substratos inade-quados para a hidrlise enzim-tica, sendo absorvidas no intesti-no grosso aps hidrlise induzi-

da por enzimas bacterianas no intes-tino (Ebata et al., 1972).

Algumas isoflavonas, com genis-tena (forma aglicona) tm grandepoder de controle de clulas cance-rosas. Genistena tambm inibiu ocrescimento de clulas tumorais daprstata humana quando comparada

sua forma glicosilada (Matsuda etal., 1994). Alm disso, foi reportadoque a atividade antioxidante de ge-nistena ou outras isoflavonas aglico-nas foram superiores quelas de gli-cosil isoflavonas (Onozawa et al.,1998). A converso de b-glicosil emisoflavonas agliconas resulta em quan-tidades maiores de compostos ben-ficos sade humana. O objetivodeste trabalho foi converter b-glicosilisoflavonas em agliconas, e estabele-cer um processo adequado para con-

verso de formas glicosiladas em agli-conas.

Yong Kun ParkProf. Dr. Laboratrio de Bioqumica, Fac.

Engenharia de Alimentos, UNICAMP,

Campinas SP,

ykpark@fea.unicamp.br

Cludio Lima AguiarDoutorando em Cincia de Alimentos, Fac.

Engenharia de Alimentos, UNICAMP,

Campinas SP,

claguiar@yahoo.com.br

Severino Matias AlencarDoutorando em Cincia de Alimentos, Fac.

Engenharia de Alimentos, UNICAMP,

Campinas SP,

matias@ fea.unicamp.br

Adilma Regina Pippa Scamparini,Profa. Dra., Fac. Engenharia de Alimentos,

UNICAMP, Campinas SP.

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METODOLOGIA

A soja foi obtida no Instituto Agron-mico de Campinas. Os padres de genis-tena e daidzena, bem como o substratopara reao enzimtica, p-Nitrofenil-b-gli-copiranosdio (pNPG), foram obtidos daSigma Chemical Co. (St. Louis, Mo., USA).Os padres de genistina e daidzina foram

obtidos da Funakoshi Chemical Co. (T-quio, Japo).

Os gros de soja foram modos at quese obtivesse uma farinha bem fina. Essafarinha foi desengordurada com hexanopor 30 minutos, a temperatura ambiente.

A farinha desengordurada de soja (FDS)foi misturada a 10 mL de soluo 80% demetanol a 60C, por uma hora, para extra-o das isoflavonas (b-glicosiladas e agli-conas) presentes naquela FDS. O sobre-nadante contendo as isoflavonas foi utili-zado para anlise do teor de isoflavonas

em cromatografia lquida de alta eficinciaem fase reversa (CLAE-FR), e para osestudos de converso enzimtica.

A converso de b-glicosil isoflavonasem agliconas foi estudada sob fermenta-o semi-slida com Aspergillus oryzae

ATCC 22786. A enzima, b-glicosidase, uti-lizada foi obtida a partir de fungo filamen-toso em meio semi-slido (esterilizado a121C, por 20 min) de farinha de soja egua (1:1, p/v) a 30C, por 48 horas. Aatividade enzimtica foi monitorada pelomtodo do pNPG. Os extratos obtidos

aps as converses foram conseguidospela extrao metanlica (soluo 80%).Esses extratos foram analisados em CLAE-FR. Foi utilizado um cromatgrafo Shima-dzu SPD-M10 AVP equipado com coluna

YMC PACK ODS-A e detector de arranjode fotodiodos. Usou-se um fluxo de 0,5mL/min e eluio gradiente, que consis-tue em aumento linear de 20% a 80% demetanol em gua e cido actico (19:1).

A atividade antioxidante dos extratosde isoflavonas foi avaliada pela oxidaoacoplada de b-caroteno e cido linolico,

como descrito por Hammerschmidt &Pratt (1978).

RESULTADOS E DISCUSSO

Produo de b-glicosidaseHidrlise enzimtica de glicosil isofla-

vonas de soja por microrganismos temsido reportada por pesquisadores da rea.Esses microrganismos so Rhizopus oryzae(Gyrgy et al., 1964); Rhizopus oligospo-rus (Ebata et al., 1972); e Lactobacilluscasei (Matsuda et al., 1994), que sousados na manufatura de alimentos fer-mentados de soja. Foi tambm reportado

que b-glicosidase endgena de soja hi-drolisa as glicosil isoflavonas suas for-mas agliconas (Ha et al., 1992; Carro-Panizzi et al., 1999). Foi verificada produ-o de b-glicosidase por todos essesmicrorganismos, includo Aspergillusoryzae, que usado na fermentao desoja em meio semi-slido, muito emboraA. oryzaetenha produzido maior ativida-

de enzimtica (17,1 UI/mg) que outros.Portanto, b-glicosidase de A. oryzae foiutilizada neste estudo.

Converso de glicosilisoflavonas em agliconas,por processo enzimtico

Durante fermentao de FDS por 48horas (Tabela 1), a maioria das 724 mg/gde glicosil isoflavonas foram convertidasem agliconas (564 mg/g). Malonil isofla-

vonas podem ser convertidas em suas

correspondentes formas glicosadas portratamento trmico da farinha de soja.

Como mostra a figura 2 A, os ismerosde malonil isoflavonas foram transforma-dos por decomposio trmica a 121Cpor 40 minutos. As formas glicosadas deisoflavonas, por sua vez, podem ser bio-transformadas pelo complexo enzimti-co produzido por bactrias do intestino,ou, ainda, biotecnologicamente, pode-seobter a converso de glicosil isoflavonas

em suas formas agliconas por ao deenzimas fngicas, como b-glicosidase deAspergillus oryzae (Figura 2-B e C). Aconverso de glicosil em isoflavonas agli-conas foi devido presena de b-glicosi-dase (Figura 2). De fato, os esporos de A.oryzae germinaram e a atividade enzim-tica foi tambm detectada aps 24 horasde fermentao. No entanto, aparenteque a converso ocorreu principalmenteaps as 24 horas. Conclui-se que, durantea fermentao, a quantidade total deisoflavonas agliconas aumentou cerca de

27 vezes, quando comparada com valo-

Figura 2: CLAE-FR dos extratos metanlicos deisoflavonas durante a biotransformao

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res anteriores reao. Nesse experi-mento, 10 gramas de FDS aps esterili-zao a 121C continha 724 mg/g, en-quanto 10 gramas de FDS sem esteriliza-o continha 1.179 mg/g. Considera-seque, durante o tratamento trmico, quan-tidades significativas de glicosil isofla-

vonas foram decompostas.

Atividade antioxidantedo extrato metanlico

da FDS fermentada

As atividades antioxidantes dos ex-tratos metanlicos de FDS foram medi-das antes e aps a fermentao (Figura3). O extrato metanlico de farinha desoja aps a fermentao mostrou maioratividade antioxidante que antes dafermentao. Esses resultados so devi-do converso de glicosil isoflavonasem agliconas, as quais tm maior ativi-dade antioxidante, como j havia sidopercebido em testes anteriores.

CONCLUSES

A produo de b-glicosidase micro-biana, que est envolvidana hidrlise de glicosil iso-flavonas de soja em aglico-nas, foi obtida usando-se

vrias linhagens de micror-ganismos que entram nafermentao da soja, e oAspergillus oryzae produ-ziu alta atividade na con-

verso de glicosil em isofla-vonas agliconas. A enzima

converteu eficientementeglicosil isoflavonas extra-das de FDS em suas formasagliconas, e altas concen-traes de isoflavonas agli-conas mostraram elevadaatividade antioxidante.

AGRADECIMENTO

Os autores agradecem Fundaode Amparo Pesquisa no Estado de SoPaulo pelo apoio a este projeto (Projeto

FAPESP n 00/10611-7).

REFERNCIAS

Ahluwalia, V.K.; Bhasin, M.M.; Sesha-dri, T.R. (1953) Isoflavones of soybeans.Current Science, 22:263-265.

Barnes, S. Effect of genistein on inVitro and In Vivo models of cancer. (1995)Journal of Nutrition, 125:777S-783.

Carro-Panizzi, M.C.; Belia, A.P.; Ki-tamura, K.; Oliveira, M.C.N. (1999) Effectsof genetics and environment on isoflavo-ne content of soybean from different regi-ons of Brazil. Pesquisa Agropecuria Bra-

sileira, 34(10):1787-1795.Coward, L.; Barnes, N.C.; Setchell,

K.D.R.; Barnes S. (1993) Genistein, Dai-dzein, and their b-glucoside conjugates:

Antitumor isoflavones in soybean foodsfrom American and Asian diets. Journal of

Agricultural and Food Chemistry, 41:1961-1967.

Denis, L.; Morton, M. S.; Griffiths, K.(1999) Diet and its preventive role inprostatic disease. European Urology, 35(5-6): 377-387.

Ebata, J.; Hukuda, Y.; Hirai, K.; Murata,

K. (1972) Nipon Nogeikagaku Kaishi,46:323-329.

Esaki, H.; Watanabe, R.; Onozaki, H.;Kawakishi, S.; Osawa, T. (1999) Formationmechanism for potent antioxadative o-dihydroxyisoflavones in soybean fermen-ted with Aspergillus saitoi. Biosci. Biotech-nol. Biochem. 63(5):851-858.

Esaki, H.; Onozaki, H.; Morimitsu, Y.

(1998) Potent antioxidative isoflavones iso-

late from soybeans fermented with Aspergi-llus saitoi. Bioscience Biotechnology Bio-chemistry, 62(4):740-746.

Gyrgy, P.; Murata, K.; Ikehata, H. (1964)Antioxidants isolated from fermented soybe-ans (Tempeh). Nature, 202:870-872.

Ha, E.Y.W.; Morr, C.V.; Seo, A. (1992)Isoflavone aglucones and volatile organiccompounds in soybeans: effect of soakingtreatment. Journal of Food Science, v. 57:414-417.

Hammerschmidt, P.A.; Pratt, D.E. (1978)Phenolic antioxidants of dried soybeans.

Journal of Food Science, 43:556-559.Henry, C. M. (1999) Nutraceuticals: Food

or Trend ?. Chemical & Engineering News,21:42-47.

Matsuda, S.; Norimoto, F.; Matsumoto,Y.; Ohba, R.; Teramoto, Y.; Ohta, N.; Ueda,S. (1994) Solubilization of novel isoflavoneglycoside hydrolyzing b-glucosidase fromLactobacillus caseisubsp. Rhamnosus. Jour-nal of Fermentation and Bioengineering,77:439-441.

Murphy, P. A. (1982) Phytoestrogen con-tent of processed soybean products. Food

Technology, 36(1):60-64.Naim, M.; Gestetner, B.; Zilkah, S.; Birk,

Y.; Bondi, A. (1974) Soybean isofla-vones. Characterization, determina-tion, and antifungal activity. J. Agric.Food Chemistry, 22(5):806-810.

Onozawa, M.; Fukuda, K.; Ohta-ni, M.; Akaza, H.; Sugimura, T.; Waka-bayashi, K. (1998) Effects of soybeanisoflavones on cell growth and apop-tosis of the human prostatic cancercell line LNCaP. Japanese Journal ofClinical Oncology, 28:360-363.

Peterson, G.; Barnes, S. (1993)Genistein and Biochanin A inhibitthe growth of human prostate can-cer cells but not epidermal growthfactor receptor tyrosine autophos-phorylation. The prostate, 22:335-

345.Roessing, A. C. (1995) Situao mundial

de oleaginosas. Informe econmico CNPSo,2:9-10.

Shahidi, F.; Wanasundara, P. K. J. P. D.(1992) Pnenolic antioxidants. CRC criticalReview Food Science and Nutrition, 32(1):67-

103.

Tabela 1: Biotransformao de glicosil isoflavonas em agliconas

Antes FermentaoAps Fermentao

Daidzina

310 1148 3

Glicitina

78 311 1

Genistina

336 2317 2

Total

72476

Daidzena

9 2298 26

Glicitena

ND27 3

Genistena

12 1260 10

Total

21585

Os dados representam microgramas de isoflavonas por grama de farinha desengordurada de soja. Mdia SD das

amostras em triplicata. ND = No Detectado

Glicosil isoflavonas, mmmmmg/g Isoflavonas agliconas, mmmmmg/g

Figura 3: