interação de dois ácidos biliares, um citotóxico e um

Interação de dois ácidos biliares, um citotóxico e um

citoprotetor, com modelos biomembranares

Marina Sofia Ivanova Esteves

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em

Engenharia Biológica

Orientador: Professora Doutora Benilde de Jesus Vieira Saramago

Júri:

Presidente: Professor Doutor Arsénio do Carmo Sales Mendes Fialho

Orientadora: Professora Doutora Benilde de Jesus Vieira Saramago

Vogal: Professora Doutora Anabela Catarino Fernandes

Novembro de 2014

i

i. Agradecimentos

Gostaria de agradecer em primeiro lugar à Professora Benilde Saramago, a orientadora deste

trabalho, por ter sugerido o tema e por todo o apoio, confiança e conhecimento transmitidos ao longo

deste processo. Agradeço todo o empenho com que acompanhou a minha Tese de Mestrado.

Às Professoras Amélia Gonçalves da Silva e Anabela Fernandes pela atenção e disponibilidade que

sempre demonstraram em ajudar com a interpretação dos resultados obtidos com a Balança de

Langmuir e a Calorimetria Diferencial de Varrimento, respetivamente.

À Dr.ª Maria João Ferreira e ao Prof. José Ascenso pela ajuda com a realização e análise dos

espectros relativos à Ressonância Magnética Nuclear de Fósforo.

À Agniezska Kozica, que ajudou a completar o estudo da interação dos ácidos biliares com as

Monocamadas de Langmuir.

Aos meus amigos e colegas de laboratório: Ana Valente, Andreia Cuco, Andreia Pimenta, José

Restolho, Patrizia Paradiso e Vanessa Moreira, por me terem recebido tão bem e por se demonstrarem

sempre disponíveis a ajudar sempre que precisei.

A todos os meus amigos, e especialmente às meninas Catarina Cabanas, Liliana Fernandes e

Madalena Testas que me apoiaram durante estes últimos anos e que sempre demonstraram uma

enorme paciência para comigo e estiveram sempre prontas a dar uma força em momentos mais

complicados.

À minha família, em especial ao meu pai pela paciência e apoio durante toda a minha vida.

Por fim, mas não menos importante, ao António, à Carolina e à Marisa Correia que estão sempre

presentes quando mais preciso.

iii

ii. Resumo

Os ácidos biliares são importantes digestivos naturais, e, por isso, essenciais para o bom

funcionamento do aparelho digestivo. Contudo, encontram-se envolvidos no desencadeamento de

cancro do cólon e de outras doenças hepáticas. Este estudo surge com o intuito de esclarecer de que

modo estes ácidos interagem com as membranas celulares e quais os seus efeitos nas mesmas. Foram

então estudados os efeitos de dois ácidos biliares, um citotóxico (DCA) e outro citoprotetor (UDCA),

bem como da mistura equimolar DCA/UDCA, sobre vários modelos biomembranares: monocamadas e

lipossomas adsorvidos e em suspensão.

A composição lipídica foi escolhida de modo a simular a composição das jangadas lipídas (lipid rafts)

que são domínios membranares envolvidos em diversos eventos celulares. Com esse objetivo, utilizou-

se uma mistura equimolar de 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), esfingomielina (SM)

e colesterol (Chol). Para estudar a influência do colesterol foi estudada, também, a mistura 1:1

POPC/SM. As técnicas experimentais utilizadas foram: Balança de Langmuir (monocamada lipídica);

Microbalança de Cristal de Quartzo com Dissipação (QCM-D) (lipossomas suportados); Calorimetria

Diferencial de Varrimento (DSC) e Ressonância Magnética Nuclear de Fósforo (31P-NMR) (lipossomas

em suspensão).

Concluiu-se que o DCA provoca a fluidificação dos modelos membranares estudados, observando-

se o rompimento dos lipossomas POPC/SM (1:1) para a concentração de 1000 µM. O UDCA tem pouca

influência nos sistemas, sendo que deverá promover uma estabilização das membranas por interação

com as cabeças fosfolipídicas. A mistura equimolar DCA/UDCA apresenta resultados que resultam, em

geral, de uma cooperação entre os dois ácidos: a ação fluidificante do DCA promove a incorporação

do UDCA.

Palavras Chave: Jangada lipídica; Ácidos Biliares; Monocamada de Langmuir; QCM-D; DSC; P-NMR

v

iii. Abstract

Bile acids (BA) are naturally-occurring detergents that solubilize dietary lipids in the intestinal tract.

However, they are involved in the triggering of diseases like colon cancer and other liver problems. This

study has the purpose of investigating how these acids interact with cell membranes and their effects

on them. We studied the effects of two bile acids, a cytotoxic (DCA) and other cytoprotective (UDCA)

and the equimolar mixture of the two bile acids on biomembranare models.

The lipid composition was chosen with the purpose of mimicking lipid rafts, which are cell membrane

domains involved in several cell events. This way, an equimolar mixture of 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-

glycero-3-phosphocholine (POPC), sphingomyelin (SM), and cholesterol (Chol) was used as a model

for lipid raft. In order to perceive the influence of cholesterol in bile acid – lipid interactions a 1:1

POPC/SM mixture was also utilized. The experimental techniques used were: Langmuir trough (lipid

monolayer); Quartz Crystal Microbalance with Dissipation (QCM-D) (supported liposomes); Differential

Scanning Calorimetry (DSC) and Phosphorus Nuclear Magnetic Resonance (31P-NMR) (liposomes in

suspension).

With this work we concluded that DCA causes fluidization of the membrane models studied,

promoting the rupture of POPC/SM liposomes, for a 1000 µM concentration. UDCA has little influence

on the systems studied, and might provide a stabilization of membranes by interaction with phospholipid

headgroups. The equimolar mixture DCA/UDCA shows that, in general, there is a cooperation between

the two acids: the fluidizing effect of DCA promotes incorporation of UDCA.

Keywords: Lipid Raft; Bile acids; Langmuir monolayer; QCM-D; DSC; P-NMR

viii

Índice

i. Agradecimentos .................................................................................................................................i

ii. Resumo ........................................................................................................................................... iii

iii. Abstract .............................................................................................................................................v

iv. Lista de Figuras ............................................................................................................................... xi

v. Lista de Tabelas ............................................................................................................................ xvi

vi. Lista de Abreviaturas ................................................................................................................... xviii

vii. Lista de Símbolos ....................................................................................................................... xx

1. Introdução ........................................................................................................................................ 1

1.1. Enquadramento ....................................................................................................................... 1

1.2. Estado da Arte ......................................................................................................................... 1

1.2.1. Interacção de ácidos biliares com membranas celulares ............................................... 1

1.2.2. Interacção de ácidos biliares com modelos biomembranares ........................................ 2

1.3. Motivação ................................................................................................................................ 3

1.4. Conteúdo ................................................................................................................................. 3

2. Fundamentos Teóricos .................................................................................................................... 4

2.1. Membranas Celulares Eucarióticas ......................................................................................... 4

2.1.1. Lipid Rafts ........................................................................................................................ 7

2.2. Modelos Biomembranares ....................................................................................................... 8

2.2.1. Bicamadas Fosfolipídicas Planares................................................................................. 8

2.2.2. Bicamada Fosfolipídica Suportada (SLB) ....................................................................... 9

2.2.3. Monocamadas Auto-Montadas (SAM) ............................................................................ 9

2.2.4. Monocamadas de Langmuir .......................................................................................... 10

2.2.5. Lipossomas .................................................................................................................... 10

2.2.6. Modelos para o estudo de Lipid Rafts ........................................................................... 11

2.3. Ácidos Biliares ....................................................................................................................... 12

2.3.1. No Corpo Humano ......................................................................................................... 12

2.3.2. Características ............................................................................................................... 13

2.3.3. Síntese ........................................................................................................................... 14

2.3.4. Ácido Deoxicólico .......................................................................................................... 15

ix

2.3.5. Ácido Ursodeoxicólico ................................................................................................... 16

2.4. Técnicas Experimentais ........................................................................................................ 17

2.4.1. Balança de Langmuir ..................................................................................................... 17

2.4.2. QCM-D – Microbalança de Cristal de Quartzo com Dissipação ................................... 18

2.4.3. DSC – Calorimetria Diferencial de Varrimento .............................................................. 20

2.4.4. 31P NMR – Ressonância Magnética Nuclear de Fósforo .............................................. 21

3. Materiais e Métodos ...................................................................................................................... 22

3.1. Materiais ................................................................................................................................ 22

3.2. Preparação de Lipossomas ................................................................................................... 22

3.3. Balança de Langmuir ............................................................................................................. 23

3.4. QCM-D – Microbalança de Cristal de Quartzo com Dissipação ........................................... 23

3.5. DSC – Calorimetria Diferencial de Varrimento ...................................................................... 24

3.6. 31P NMR – Ressonância Magnética Nuclear de Fósforo ...................................................... 25

4. Resultados e Discussão ................................................................................................................ 26

4.1. Balança de Langmuir ............................................................................................................. 26

4.1.1. Efeito do Colesterol ....................................................................................................... 26

4.1.2. Efeito dos ácidos biliares dissolvidos na subfase ......................................................... 27

4.1.3. Efeito dos ácidos biliares espalhados na superfície ...................................................... 31

4.1.4. Conclusões Gerais ........................................................................................................ 34

4.2. QCM-D ................................................................................................................................... 35


4.2.2. Efeito do DCA ................................................................................................................ 37

4.2.3. Efeito do UDCA ............................................................................................................. 40

4.2.4. Efeito da Mistura 1:1 DCA/UDCA .................................................................................. 43


4.3. DSC ....................................................................................................................................... 46


4.3.2. Efeito do DCA ................................................................................................................ 47

4.3.3. Efeito do UDCA ............................................................................................................. 48



x

4.4. 31P-NMR ................................................................................................................................ 50


4.4.2. Efeito do DCA ................................................................................................................ 51

4.4.3. Efeito do UDCA ............................................................................................................. 52



5. Conclusões e Trabalho Futuro ...................................................................................................... 54

Bibliografia ............................................................................................................................................. 56

Anexos .................................................................................................................................................. A-1

A. Dados adicionais sobre os resultados e a modelação QCM-D ................................................ A-1

1. Interacção com DCA ............................................................................................................ A-1

2. Interacção com UDCA .......................................................................................................... A-2

3. Interacção com a mistura equimolar DCA/UDCA ................................................................ A-3

xi

iv. Lista de Figuras

Figura 2.1 – Modelo do Mosaico Fluido. Adaptado de [28]. .................................................................... 4

Figura 2.2 – Estrutura do POPC. Adaptado de [31]. ............................................................................... 5

Figura 2.3 – Estrutura da Esfingomielina. Adaptado de [33]. .................................................................. 6

Figura 2.4 – Estrutura do Colesterol. Adaptado de [35]. ......................................................................... 6

Figura 2.5 – Membrana celular destacando os dois tipos de lipid rafts encontrados nas membranas. (a)

rafts planares; (c) rafts ricos em caveolina. Adaptado de [41]. ............................................................... 7

Figura 2.6 – Formação de uma Bicamada Fosfolipídica Planar dopada de proteínas. Adaptado de [67].

................................................................................................................................................................. 9

Figura 2.7 – Exemplo da distribuição das moléculas de lípidos numa SLB. Adaptado de [73]. ............. 9

Figura 2.8 – À esquerda apresenta-se um exemplo da funcionalização do substrato com um alcano-tiol

(Adaptado de [76]). À direita apresenta-se um exemplo de uma SAM (Adaptado de [77]). ................. 10

Figura 2.9 – Exemplo de vários estados de agregação dos lípidos em monocamada. Adaptado de [70].

............................................................................................................................................................... 10

Figura 2.10 – Visualização de lipossoma em corte, contento material no seu interior. Adaptado de [81].

............................................................................................................................................................... 11

Figura 2.11 – Diagrama para a mistura binária POPC/SM. Adaptado de [85]. .................................... 11

Figura 2.12 – Diagrama de fases ternário para a mistura POPC/SM/Chol a 22ºC, 34ºC e 46ºC. Adaptado

de [85]. ................................................................................................................................................... 12

Figura 2.13 – Representação do aparelho digestivo. Adaptado de [89]. .............................................. 12

Figura 2.14 – Estrutura geral de um ácido biliar. Adaptado de [87]. ..................................................... 13

Figura 2.15 – Síntese dos ácidos biliares primários, a partir do colesterol. Adaptado de [104]. .......... 15

Figura 2.16 – Estrutura e configuração do ácido deoxicólico. Adaptado de [99]. ................................. 16

Figura 2.17 – Estrutura e configuração do ácido ursodeoxicólico. Adaptado de [102]. ........................ 16

Figura 2.18 – Exemplo de isotérmica obtida pela técnica evidenciando as diferentes fases de

agregação: gás (G), líquido expandido (LE), líquido condensado (LC), sólido (S), e colapso da

monocamada. Adaptado de [70]. .......................................................................................................... 17

Figura 2.19 – Funcionamento de uma Balança de Langmuir. Adaptado de [20]................................. 18

Figura 2.20 – Ilustração do corte realizado em cristais de quartzo para a formação dos sensores para

a técnica. Adaptado de [129]. ................................................................................................................ 19

Figura 2.21 – Exemplo de Termograma. Adaptado de [138]. ............................................................... 20

Figura 2.22 – Espectros típicos de diferentes estados de agregação. Adaptado de [140]. ................. 22

Figura 4.1 – Painel A-Isotérmicas -A dos compostos puros, POPC (curva 1), esfingomielina (curva 2)

e colesterol (curva 3), da mistura binária POPC/SM (1:1) (curva 4) e da mistura ternária POPC/SM/Chol

(1:1:1) (curva 5), a 25ºC numa subfase de tampão HEPES 10 mM (pH 7,4). No painel B, encontram-se

representadas as isotérmicas traçadas das misturas binária (curva 1) e ternária (curva 3) e as que

resultariam de uma mistura binária ideal (curva 2) e de uma mistura ternária ideal (curva 4). ............ 26

xii

Figura 4.2 – Isotérmicas -A das misturas POPC/SM (1:1) (A) e POPC/SM/Chol (1:1:1) (B), a 25ºC,

numa subfase de tampão HEPES 10 mM (pH 7,4). As curvas identificadas com (1) correspondem à

isotérmica do DCA com uma concentração de 8 µM na subfase. A preto, contínuo, encontram-se as

isotérmicas das misturas lipídicas puras, apresentando-se as restantes, da esquerda para a direita,

com concentrações crescentes (1,33 µM; 2,63 µM; 8 µM e 13,3 µM) de DCA dissolvido na subfase. O

valor de A na abcissa representa a área ocupada por molécula de lípido, exceto para as curvas (1)

onde representa a área ocupada por molécula de DCA. ...................................................................... 27

Figura 4.3 – Isotérmicas -A das misturas POPC/SM (1:1) (A) e POPC/SM/Chol (1:1:1) (B), a 25ºC

numa subfase de tampão HEPES 10 mM (pH 7,4). As curvas identificadas com (1) correspondem à

isotérmica do UDCA com uma concentração de 8 µM na subfase. A preto contínuo encontram-se as

isotérmicas das misturas lipídicas puras, apresentando-se as restantes, da esquerda para a direita,

com concentrações crescentes (1,33 µM; 2,63 µM; 8 µM e 13,3 µM) de UDCA dissolvido na subfase.

O valor de A na abcissa representa a área ocupada por molécula de lípido, exceto para as curvas (1)

onde representa a área ocupada por molécula de DCA. ...................................................................... 28

Figura 4.4 – Isotérmicas -A das misturas POPC/SM (1:1) (A) e POPC/SM/Chol (1:1:1) (B), a 25ºC

numa subfase de tampão HEPES 10 mM (pH 7,4). A preto contínuo encontram-se as isotérmicas das

misturas lipídicas, apresentando-se as restantes, da esquerda para a direita, com concentrações

crescentes (1,33 µM; 2,63 µM; 8 µM e 13,3 µM) da mistura 1:1 DCA/UDCA dissolvida na subfase. .. 29

Figura 4.5 – Variação da área molecular média de lípido em função da concentração dos ácidos biliares

na subfase: DCA (bolas a cheio), do UDCA (bolas em aberto), da mistura DCA/UDCA (1:1) (quadrados

a cheio), (A e B) na mistura binária POPC/SM (1:1), (C e D) na mistura ternária POPC/SM/Chol (1:1:1),

a 15mN/m (A e C) e a 30 mN/m (B e D).Os triângulos representam o efeito da mistura DCA/UDCA (1:1)

calculado com base na regra de aditividade do efeito dos componentes isolados. ............................. 30

Figura 4.6 – Isotérmicas -A das misturas POPC/SM (A) e POPC/SM/Chol (B), a 25ºC, numa subfase

de tampão HEPES 10 mM (pH 7,4). A preto contínuo encontra-se representada a mistura lipídica pura

estando as restantes isotérmicas representadas, da esquerda para a direita, de acordo com o aumento

da fração molar de DCA na solução de espalhamento (xac = 0,67; 0,75 e 0,8 (para POPC/SM) e xac =

0,3; 0,5; 0,7 e 0,8 (para POPC/SM/Chol)). ............................................................................................ 31

Figura 4.7 – Isotérmicas-A das misturas POPC/SM (A) e POPC/SM/Chol (B), a 25ºC, numa subfase

de tampão HEPES 10 mM (pH 7,4). A preto contínuo, encontra-se representada a mistura lipídica pura


da fração molar de UDCA na solução de espalhamento (xac = 0,67; 0,75 e 0,8 (para POPC/SM) e xac =

0,3; 0,5; 0,7 e 0,8 (para POPC/SM/Chol)). ............................................................................................ 32

Figura 4.8 – Isotérmicas -A das misturas POPC/SM (A) e POPC/SM/Chol (B), a 25ºC, numa subfase

de tampão HEPES 10 mM (pH 7,4). A preto contínuo encontra-se representada a mistura lipídica pura


da fração molar da mistura 1:1 DCA/UDCA na solução de espalhamento (xac = 0,67; 0,75 e 0,8 (para

POPC/SM) e xac = 0,3; 0,5; 0,7 e 0,8 (para POPC/SM/Chol))............................................................... 33

Figura 4.9 – Variação da área molecular média de lípido em função da fração molar de ácidos biliares

incluídos na mistura de espalhamento: DCA (bolas a cheio), do UDCA (bolas em aberto), da mistura

xiii

DCA/UDCA (1:1) (quadrados a cheio). (A e B) na mistura binária POPC/SM (1:1), (C e D) na mistura

ternária POPC/SM/Chol (1:1:1), a 5mN/m (A e C) e a 15 mN/m (B e D).Os triângulos representam o

efeito da mistura DCA/UDCA (1:1) calculado com base na regra de aditividade do efeito dos

componentes isolados. .......................................................................................................................... 34

Figura 4.10 – Exemplo da variação da frequência (a preto) e da dissipação (a cinzento) da 3ª harmónica

para uma experiência de adsorção dos lipossomas no cristal de quartzo a 37ºC. Lipossomas POPC/SM

à esquerda e POPC/SM/Chol à direita. (1) Adição de lipossomas; (2) enxaguamento. ...................... 35

Figura 4.11 – Variação de frequência e de dissipação da 3ª harmónica, observados quando se dá a

adsorção dos lipossomas aos cristais de quartzo. A preto encontram-se os dados correspondentes aos

lipossomas POPC/SM e a cinzento POPC/SM/Chol. ........................................................................... 36

Figura 4.12 – Desvios de frequência (à esquerda) e de dissipação (à direita) observados ao longo do

ensaio afetados do desvio padrão. Exemplo da interação de lipossomas POPC/SM (topo) e

POPC/SM/Chol (baixo) com 1 mM de DCA. Cinzento-escuro: 3ª harmónica; cinzento médio: 5ª

harmónica; cinzento: 7ª harmónica; cinzento claro: 9ª harmónica. ...................................................... 37

Figura 4.13 – Valores médios da variação da frequência (à esquerda) e da dissipação (à direita) da 3ª

harmónica ao longo do decorrer do ensaio para as três concentrações estudadas. Topo: lipossomas

POPC/SM; Baixo: lipossomas POPC/SM/Chol. A preto: valores médios dos lipossomas, cinzento-

escuro: após enxaguamento; cinzento: após adição do ácido; cinzento claro: após enxaguamento final.

............................................................................................................................................................... 38



POPC/SM/Chol (em baixo) com 1 mM de UDCA. Cinzento-escuro: 3ª harmónica; cinzento médio: 5ª

harmónica; cinzento: 7ª harmónica; cinzento claro: 9ª harmónica. ...................................................... 40



POPC/SM; Baixo: lipossomas POPC/SM/Chol. A preto: valores médios dos lipossomas, cinzento


............................................................................................................................................................... 41



POPC/SM/Chol (em baixo) com 1 mM da mistura 1:1 DCA/UDCA. Cinzento-escuro: 3ª harmónica;

cinzento médio: 5ª harmónica; cinzento: 7ª harmónica; cinzento claro: 9ª harmónica. ........................ 43



POPC/SM; Baixo: lipossomas POPC/SM/Chol. A preto: valores médios dos lipossomas, cinzento


............................................................................................................................................................... 44

Figura 4.18 – Termogramas para os lipossomas puros. A curva a cinzento representa a mistura binária

POPC/SM e a preta a mistura ternária, POPC/SM/Chol. ..................................................................... 46

xiv

Figura 4.19 – Do lado esquerdo encontram-se representados os termogramas para a mistura binária

POPC/SM sujeitos a interação com concentrações crescentes de DCA. A preto encontra-se o

termograma dos lipossomas; tracejado 500 µM, cinzento escuro 700 µM e cinzento claro 900 µM. Na

figura do lado direito apresenta-se a influência que a concentração de DCA provoca na Tt. .............. 47

Figura 4.20 – Termogramas para a mistura ternária POPC/SM/Chol sujeitos a interação com

concentrações crescentes de DCA. A preto encontra-se o termograma dos lipossomas; tracejado 500

µM, cinzento escuro 700 µM e cinzento claro 900 µM. ......................................................................... 48


POPC/SM sujeitos a interação com concentrações crescentes de UDCA. A preto encontra-se o

termograma dos lipossomas; tracejado 500 µM, cinzento escuro 700 µM e cinzento claro 900 µM. Na

figura do lado direito apresenta-se a influência que a concentração de UDCA provoca na Tt. ............ 48


POPC/SM sujeitos a interação com concentrações crescentes da mistura equimolar de DCA/UDCA. A

preto encontra-se o termograma dos lipossomas; tracejado 500 µM, cinzento escuro 700 µM e cinzento

claro 900 µM. Na figura do lado direito apresenta-se a influência que a concentração da mistura

DCA/UDCA provoca na Tt, apresentando-se a preto os valores obtidos experimentalmente e a cinzento

os valores que calculados pela média aritmética dos valores obtidos para as T t de cada ácido em

separado. ............................................................................................................................................... 49

Figura 4.23 – Espectros de 31P-NMR para os lipossomas POPC/SM (a preto) e POPC/SM/Chol (a

cinzento), para as temperaturas de 12ºC (esquerda), 25ºC (centro) e 37ºC (direita). ......................... 50

Figura 4.24 – Espectros de 31P-NMR para os lipossomas POPC/SM (à esquerda, cinzento escuro) e

POPC/SM/Chol (à direita, cinzento escuro) e o espectro da interação destes lipossomas com o DCA

(cinzento claro) para as temperaturas de 12ºC (topo), 25ºC (centro) e 37ºC (baixo). .......................... 51


POPC/SM/Chol (à direita, cinzento escuro) e o espectro da interação destes lipossomas com o UDCA

(cinzento claro) para as temperaturas de 12ºC (topo), 25ºC (centro) e 37ºC (baixo). .......................... 52


POPC/SM/Chol (à direita, cinzento escuro) e o espectro da interação destes lipossomas com a mistura

1:1 DCA/UDCA (cinzento claro) para as temperaturas de 12ºC (topo), 25ºC (centro) e 37ºC (baixo). 53

Figura A.1 – Desvios de frequência (à esquerda) e de dissipação (à direita) observados ao longo do


POPC/SM/Chol (baixo) com 500 µM de DCA. Cinzento escuro: 3ª harmónica; cinzento médio: 5ª

harmónica; cinzento: 7ª harmónica; cinzento claro: 9ª harmónica. ..................................................... A-1



POPC/SM/Chol (baixo) com 750 µM de DCA. Cinzento escuro: 3ª harmónica; cinzento médio: 5ª




xv

POPC/SM/Chol (baixo) com 500 µM da UDCA. Cinzento escuro: 3ª harmónica; cinzento médio: 5ª








POPC/SM/Chol (baixo) com 500 µM da mistura equimolar DCA:UDCA. Cinzento escuro: 3ª harmónica;

cinzento médio: 5ª harmónica; cinzento: 7ª harmónica; cinzento claro: 9ª harmónica. ....................... A-3



POPC/SM/Chol (baixo) com 750 µM da mistura equimolar DCA:UDCA. Cinzento escuro: 3ª harmónica;

cinzento médio: 5ª harmónica; cinzento: 7ª harmónica; cinzento claro: 9ª harmónica. ....................... A-3

xvi

v. Lista de Tabelas

Tabela 2.1– Propriedades dos ácidos biliares utilizados no trabalho. .................................................. 14

Tabela 4.1 – Valores médios das propriedades viscoelásticas dos lipossomas POPC/SM e

POPC/SM/Chol a 37ºC. Os valores apresentados encontram-se como média ± desvio padrão. ....... 36

Tabela 4.2– Valores médios das propriedades viscoelásticas dos lipossomas POPC/SM a interagir com

500 µM de DCA a 37ºC, estimados pela ferramenta QTools. Os valores apresentados encontram-se

como média ± desvio padrão. ............................................................................................................... 38

Tabela 4.3 – Valores médios das propriedades viscoelásticas dos lipossomas POPC/SM/Chol a

interagir com 500 µM de DCA a 37ºC, estimados pela ferramenta QTools. Os valores apresentados

encontram-se como média ± desvio padrão. ....................................................................................... 39

Tabela 4.4 – Valores médios das propriedades viscoelásticas dos lipossomas POPC/SM a interagir

com 750 µM de DCA a 37ºC, estimados pela ferramenta QTools. Os valores apresentados encontram-

se como média ± desvio padrão. .......................................................................................................... 39


interagir com 750 µM de DCA a 37ºC, estimados pela ferramenta QTools. Os valores apresentados



com 1000 µM de DCA a 37ºC, estimados pela ferramenta Qtools. Os valores apresentados encontram-



interagir com 1000 µM de DCA a 37ºC, estimados pela ferramenta Qtools. Os valores apresentados



com 500 µM da UDCA a 37ºC, estimados pela ferramenta QTools. Os valores apresentados encontram-



interagir com 500 µM da UDCA a 37ºC, estimados pela ferramenta QTools. Os valores apresentados



com 750 µM de UDCA a 37ºC, estimados pela ferramenta QTools. Os valores apresentados encontram-



interagir com 750 µM de UDCA a 37ºC, estimados pela ferramenta QTools. Os valores apresentados



com 1 mM de UDCA a 37ºC, estimados pela ferramenta Qtools. Os valores apresentados encontram-


xvii


interagir com 1 mM de UDCA a 37ºC, estimados pela ferramenta Qtools. Os valores apresentados



com 500 µM da mistura equimolar DCA:UDCA a 37ºC, estimados pela ferramenta QTools. Os valores

apresentados encontram-se como média ± desvio padrão. ................................................................ 44


interagir com 500 µM da mistura equimolar DCA:UDCA a 37ºC, estimados pela ferramenta QTools. Os

valores apresentados encontram-se como média ± desvio padrão. .................................................... 45


com 750 µM da mistura equimolar DCA:UDCA a 37ºC, estimados pela ferramenta QTools. Os valores



interagir com 750 µM da mistura equimolar DCA:UDCA a 37ºC, estimados pela ferramenta QTools. Os

valores apresentados encontram-se como média ± desvio padrão. .................................................... 45


com 1 mM da mistura 1:1 DCA/UDCA a 37ºC, estimados pela ferramenta Qtools. Os valores



interagir com 1 mM da mistura 1:1 DCA/UDCA a 37ºC, estimados pela ferramenta Qtools. Os valores


xviii

vi. Lista de Abreviaturas

POPC 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina

DCA Ácido Deoxicólico

UDCA Ácido Ursodeoxicólico

SLB Bicamadas Fosfolipídicas Suportadas

DSC Calorimetria Diferencial de Varrimento

Chol Colesterol

GEM/DIG Complexos Enriquecidos em Glicolípidos Insolúveis em Detergente

CMC Concentração Micelar Crítica

SM Esfingomielina

LC Fase líquida condensada

Ld Fase líquida desordenada

LE Fase líquida expandida

Lo Fase líquida ordenada

PC Fosfatidil Colina

PE Fosfatidil Etanolamina

PG Fosfatidil Glicerol

PI Fosfatidil Inositol

PS Fosfatidil Serina

DRM Membranas Resistentes a Detergentes

QCM-D Microbalança de Cristal de Quartzo com Dissipação

AFM Microscopia de Força Atómica

SAM Monocamadas Auto Montadas

ESR Ressonância Eletrão Spin

31P-NMR Ressonância Magnética Nuclear de Fósforo

Tt Temperatura de transição

FRET Transferência de Energia de Ressonância por Fluorescência

LUV Vesiculas Unilamelares Grandes

xx

vii. Lista de Símbolos

Δσ Anisotropia do desvio químico

Cp Capacidade calorífica

Cf Constante de Sensibilidade Característica do Sensor

ρ Densidade

ΔA/A0 Desvio de área molecular média

𝜎|| Desvio químico paralelo ao campo magnético aplicado

𝜎┴ Desvio químico perpendicular ao campo magnético aplicado

δ Espessura

Π Pressão superficial

γ Tensão superficial

ΔD Variação da dissipação

Δf Variação da frequência

Δm Variação de massa adsorvida

η

Viscosidade

1

1. Introdução

1.1. Enquadramento

Os ácidos biliares são importantes digestivos naturais, produzidos no fígado, cuja função principal

é solubilizar lípidos na bílis e no trato intestinal [1];[2];[3]. No entanto, encontram-se envolvidos no

desencadeamento de cancro do cólon [2];[4], bem como doenças hepáticas, como a colestase que é

caracterizada por uma diminuição, ou paragem, do fluxo biliar usual podendo dar origem a diversos

problemas hepáticos [5]. As interações dos ácidos biliares com a superfície da membrana celular não

estão ainda bem definidas, havendo dois pontos de vista diferentes. Por um lado, as propriedades

fluidizantes do ácido deoxicólico (DCA) em membranas celulares [6];[7] são conhecidas mas, por outro,

há estudos que defendem que o início da geração de um cancro ocorre devido à interação do mesmo

ácido com recetores celulares na superfície da membrana [4];[8]. Já o ácido ursodeoxicólico (UDCA),

sabe-se que é utilizado na prevenção de pedras na vesícula e que tem propriedades citoprotetoras [9].

1.2. Estado da Arte

1.2.1. Interação de ácidos biliares com membranas celulares

Os estudos realizados sobre interações dos ácidos biliares com as membranas celulares têm como

objetivo compreender o seu efeito nas mesmas com base nas respetivas características de

hidrofilicidade/hidrofobicidade [10];[7]. Clouzeau et al. [5] observaram com um microscópio o efeito da

hidrofobicidade dos ácidos biliares na estabilidade membranar de células do fígado de ratos, tendo

concluído que o ácido hidrofóbico (Ácido Taurodeoxicólico) promove uma fluidização da membrana por

penetração na mesma, enquanto o ácido mais hidrofílico (Ácido Taurocólico) não provoca modificações

a nível estrutural.

O estudo efetuado por Martinez et al. [11] testou o efeito da incubação com DCA ou UDCA no

crescimento de linhas celulares tumorais. Verificou-se que as células incubadas com DCA sofreram

apoptose, enquanto que as incubadas com UDCA, além de prevenção da morte celular, apresentaram

uma inibição da proliferação celular que é uma característica de células cancerígenas. Foi também

testado o efeito que uma enzima (Proteína Cinase C, PKC) poderia ter no processo, tendo-se

observado uma diminuição do efeito apoptótico do DCA ao adicionar um inibidor desta enzima, o que

poderia sugerir que o processo seria desencadeado diretamente pela interação do DCA com a enzima.

O mesmo tipo de estudo foi posteriormente efetuado por Ignacio et al. [2], mas em linhas celulares não

tumorais, tendo sido observado o mesmo efeito, sugerindo que o mecanismo de morte celular é

originado indiretamente pela inserção e difusão do DCA na membrana, que provoca alterações a nível

estrutural e, consequentemente, a ativação de enzimas na superfície membranar.

Rodrigues et al. relatam o efeito protetor do UDCA que, adicionado em conjunto com o DCA, evita

a despolarização da membrana causada pelo DCA sozinho. Estes autores sugerem que o mecanismo

2

de proteção se deve à prevenção da formação de poros na membrana, não estando o mecanismo de

interação bem descrito [12].

1.2.2. Interação de ácidos biliares com modelos biomembranares

Com o intuito de compreender o mecanismo de ação dos ácidos biliares nas membranas celulares

são muitas vezes adotados modelos biomembranares, sistemas menos complexos que as células, que

simulam o sistema, sendo mais facilmente estudados [13];[14].

De acordo com vários estudos [15];[16] a incorporação de colesterol nos modelos estudados

promove sempre uma proteção contra a ação fluidizante dos ácidos biliares.

Além do efeito do colesterol Zhou et al. [15] estudaram o efeito da concentração dos ácidos na

permeabilização de lipossomas. As concentrações utilizadas encontram-se dentro da gama das

utilizadas no presente estudo, tendo-se concluído que com o aumento da concentração tanto de UDCA

como de DCA há uma maior libertação de calceína, contida no interior dos lipossomas, e portanto, um

aumento da permeabilidade. É notório ainda uma maior influência por parte do DCA, bem como um

efeito sinergístico quando se testam os efeitos da mistura dos dois ácidos biliares [15]. O mesmo

acontece quando se testam as mesmas condições em sistemas que incluem colesterol, no entanto, o

efeito fluidizante é menos pronunciado.

Num estudo levado a cabo por Heuman et al. [16] verificou-se uma diminuição da adsorção dos

ácidos biliares estudados, com a inclusão de colesterol na composição dos lipossomas. Concluíram

também que o efeito da mistura de dois ácidos, o Ácido Taurodeoxicólico (hidrofóbico) e o Ácido Tauro-

ursodeoxicólico (hidrofílico), proporcionava efeitos protetores apenas quando este último constitui 50%

ou mais da mistura.

Estudos indicam que o modo de interação destes ácidos com as membranas não é bem definido,

sendo que Güldütuna et al. [17] defendem que os ácidos biliares se intercalam na estrutura, destacando

o efeito que o UDCA tem na diminuição da fluidez da membrana, bem como o aumento da estabilidade

da mesma, um efeito semelhante ao oferecido pela incorporação de colesterol nestas estruturas. Por

outro lado Ben Mouaz et al. [18] afirmam que a localização dos ácidos biliares hidrofílicos deverá ser

periférica.

Em Schubert et al. [19] foi demonstrado que a afinidade dos sais biliares, formas desprotonadas dos

ácidos, para a membrana diminui com o aumento da sua acumulação na mesma, até atingir um mínimo

a partir do qual há um aumento abrupto provocando uma solubilização da membrana.

3

1.3. Motivação

Com este trabalho, pretende-se estudar as interações a nível membranar deste tipo de ácidos,

sendo os seus efeitos estudados de acordo com vários modelos membranares. Os modelos

membranares adotados são as monocamadas de Langmuir e os lipossomas. Ambos são considerados

modelos de estudo adequados uma vez que, para ambos os casos, a organização do sistema é

semelhante à encontrada nas membranas celulares [20];[21]. A construção destes modelos

membranares é conseguida recorrendo-se a 3 tipos lípidos, um glicerofosfolípido (POPC),

esfingomielina (SM) e colesterol (Chol), representantes dos lípidos mais abundantes da membrana

celular [22].

O objetivo deste trabalho consiste em tentar compreender de que modo o DCA contribui para a

destabilização das membranas, bem como de que modo o UDCA executaria o seu papel como

citoprotetor. Além disso, espera-se compreender se os papéis destes dois ácidos biliares, de acordo

com as funções descritas, são dependentes ou não da sua interação com o colesterol, ou seja, se os

ácidos interagem preferencialmente com os lípidos raft, estruturas lipídicas ricas em colesterol e

esfingomielina.

1.4. Conteúdo

O trabalho desenvolvido é apresentado ao longo dos próximos 4 capítulos. No primeiro e presente

capítulo, apresentam-se os fundamentos teóricos necessários a uma melhor compreensão do trabalho,

focando-se a função e composição das membranas celulares eucarióticas, com enfoque nas jangadas

lipídicas (lipid rafts) e no seu papel nas membranas celulares. De seguida, no capítulo 2, são descritos

alguns modelos utilizados para o estudo de biomembranas e, por fim, apresenta-se uma pequena

explicação sobre o que são os ácidos biliares e as suas propriedades, dando especial atenção ao Ácido

Deoxicólico e ao Ácido Ursodeoxicólico. Após a descrição dos modelos e sistemas estudados no

trabalho, dá-se uma explicação das técnicas experimentais utilizadas, sendo elas Balança Langmuir,

Microbalança de Cristal de Quartzo com Dissipação (QCM-D), Calorimetria Diferencial de Varrimento

(DSC) e Ressonância Magnética Nuclear de Fósforo (31P-NMR).

No capítulo dos Resultados e Discussão, capítulo 3, apresentam-se os resultados obtidos e uma

análise dos mesmos, focando o efeito que a interação de cada um dos ácidos biliares, bem como de

uma mistura equimolar destes, tem nos dois modelos membranares estudados.

No último e quarto capítulo apresentam-se as conclusões mais importantes a retirar desta

dissertação, bem como sugestões para futuros trabalhos relacionados com o tema.

4

2. Fundamentos Teóricos

2.1. Membranas Celulares Eucarióticas

Todas as células são delimitadas por uma membrana celular, que atua como uma fronteira entre os

meios intra e extra celular. As membranas diferem na sua composição entre células pró e eucarióticas,

bem como entre as eucarióticas vegetais e animais [22]. De acordo com o âmbito do trabalho, serão

apenas focadas as membranas eucarióticas animais.

As células eucarióticas além da membrana exterior encontram-se compartimentadas em pequenas

secções, designadas como organelos celulares, delimitadas também por membranas de composição

semelhante à citoplasmática, onde são executadas várias funções necessárias à manutenção e

sobrevivência das células [23];[24].

A membrana plasmática, além de ser a fronteira das células, constitui uma barreira que impede o

fluxo livre de moléculas hidrossolúveis e iões, servindo como uma barreira física seletiva das moléculas

que podem ou não atravessá-la, determinando assim a composição do meio intracelular e tendo como

objetivo manter o meio intracelular em homeostasia [22];[24].

A formação das membranas biológicas tem por base as propriedades dos lípidos sendo que todas

as membranas partilham da mesma disposição: bicamadas fosfolipídicas com proteínas associadas

[22]. As proteínas são responsáveis por várias funções específicas, podendo funcionar como recetores

de sinais externos [25], para transportar seletivamente moléculas através da membrana [26] ou, ainda,

participar no transporte de eletrões, que permite à célula fabricar energia (processo de fosforilação

oxidativa) [27]. Assim a membrana tem essencialmente duas funções: proteger o meio intracelular e

mediar interações das células com o ambiente e com outras células.

Figura 2.1 – Modelo do Mosaico Fluido. Adaptado de [28].

O modelo atualmente aceite para a descrição da estrutura membranar é o Modelo do Mosaico Fluido

descrita por Singer e Nicholson em 1972 (figura 2.1), o qual descreve as membranas biológicas com

as características anteriormente referidas, destacando também o facto destas estruturas serem fluidas

5

e terem cerca de 5 a 8 nm de espessura. Os lípidos que constituem as membranas são designados por

fosfolípidos com uma zona polar e outra apolar; é esta estrutura que permite a agregação em bicamada,

com as zonas polares (e portanto hidrofílicas) em contacto com os meios aquosos, e com as zonas

apolares (hidrofóbicas) organizadas para o interior da bicamada. Enquanto os fosfolípidos conferem a

forma da membrana plasmática, as proteínas são responsáveis por desempenhar funções específicas.

Os autores distinguem ainda duas classes de proteínas, as integrais e as periféricas. As periféricas

estão geralmente ligadas por meio de interações electroestáticas a proteínas integrais ou às zonas

polares dos fosfolípidos. As proteínas integrais podem ser transmembranares, ou seja, atravessam toda

a membrana, sendo estabilizadas por meio de interações hidrofóbicas no seio intramembranar [29]. A

composição proteica das células é bastante variável dependendo das funções que esta desempenha,

no entanto, todas as células apresentam proteínas transportadoras com o objetivo de importar e/ou

exportar solutos orgânicos e iões através da membrana [22].

Em relação à composição fosfolipídica, as membranas contêm principalmente glicerofosfolípidos) e

esfingolípidos. Os glicerofosfolípidos distinguem-se pelo grupo ligado ao fosfatidil, sendo os mais

representativos a fosfatidil colina (PC), o fosfatidil glicerol (PG), a fosfatidil etanolamina (PE), o fosfatidil

inositol (PI) e a fosfatidil serina (PS). Quanto aos esfingolipidos, o mais importante é a esfingomielina

(SM). Em conjunto, PC, PE, PS e SM correspondem a cerca de 50% dos lípidos da membrana celular.

Estes lípidos encontram-se distribuídos assimetricamente pelas duas faces da membrana. A

esfingomielina e a PC encontram-se maioritariamente na parte superior (que contacta com o exterior)

da membrana, sendo que os restantes, PG, PE e PI, se encontram dominantemente na zona interior

da bicamada. Sendo destes o PI que confere uma carga negativa ao interior da célula, uma vez que as

suas cabeças polares se encontram carregada negativamente. O PI, apesar de muito pouco dominante,

é de elevada importância dada a sua função como sinalizador celular [22].

Os glicerofosfolípidos derivam do glicerol. Para cada tipo de glicerofosfolípido há uma grande

variedade nas cadeias acílicas, tanto em termos de comprimento, como nas insaturações das cadeias

[30]. Normalmente lípidos com cadeias insaturadas promovem a fluidez da membrana porque originam

empacotamentos pouco densos. Na figura 2.2 apresenta-se o glicerofosfolípido utilizado neste estudo,

o 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-colina (POPC).

Figura 2.2 – Estrutura do POPC. Adaptado de [31].

Esfingolípidos como a esfingomielina utilizada neste trabalho (figura 2.3) diferem dos

glicerofosfolípidos por possuírem em vez de um glicerol uma esfingosina, sendo que uma das suas

cadeias longas não é um ácido gordo, mas uma cadeia da esfingosina [32]; [30]. A esfingosina é um

amino-álcool de cadeia longa e, tal como o nome indica, contem na sua estrutura um grupo álcool (-

6

OH) e um grupo amina (-NH2): o grupo amina liga-se à cadeia de ácido gordo e o grupo álcool promove

a ligação fosfodiéster ao grupo polar (geralmente colina ou etanolamina) [22].

Figura 2.3 – Estrutura da Esfingomielina. Adaptado de [33].

Além de fosfolípidos a membrana celular animal é composta por glicolípidos e colesterol. Os

glicolípidos diferem dos fosfolípidos na região polar que é formada por um açúcar. Estes apenas

existem na camada exterior da membrana, estando a parte de carbohidrato voltada para o lado de fora,

e representam 2% da composição da membrana [22]. Já o colesterol pode-se encontrar na mesma

quantidade que os restantes fosfolípidos, sendo um constituinte bastante importante da membrana

celular.

O colesterol (figura 4), é um esteroide que consiste em quatro anéis, três com seis lados e um com

cinco, com uma cauda apolar e com um grupo hidroxilo que lhe confere polaridade [34].

Figura 2.4 – Estrutura do Colesterol. Adaptado de [35].

O colesterol, por si só, não forma uma bicamada, mas quando em conjunto com outros fosfolípidos,

ele insere-se entre eles, com a sua cabeça polar (o grupo hidroxilo) junto das cabeças polares dos

restantes fosfolípidos [34];[36] . O colesterol é importante uma vez que tem diferentes ações na fluidez

da membrana consoante a temperatura. A temperaturas mais altas o colesterol interfere com a

movimentação das cadeias de ácidos gordos dos outros fosfolípidos, torna a membrana menos fluida,

e portanto menos permeável a moléculas pequenas. No entanto, a baixas temperaturas o efeito é o

contrário, uma vez que, interferindo com as interações entre as cadeias dos ácidos gordos, impede o

seu congelamento e mantem a fluidez da membrana [22], [37]. Este é um exemplo de um componente

que não se encontra como constituinte das membranas de bactérias, ou de células vegetais [22].

Em termos de distribuição do colesterol pela membrana, esta não é homogénea, ou seja, sabe-se

que há zonas da membrana na qual o colesterol se encontra agregado com esfingolípidos

(esfingomielina e glicolípidos), formando os rafts que se movimentam lateralmente pela membrana,

7

podendo associar-se a proteínas existentes na mesma [38]. Os lipid rafts (ou jangadas lipídicas)

formam-se espontaneamente e estão associados à dinâmica da membrana celular. Estes domínios

encontram-se enriquecidos com proteínas envolvidas em processos de sinalização celular e de

endocitose. No subcapítulo seguinte serão descritas as propriedades dos rafts com maior pormenor.

2.1.1. Lipid Rafts

Os lipid rafts (figura 5), ou simplesmente, rafts são estruturas da membrana celular ricos em

esfingomielina e colesterol [39], com cerca de 10 a 200 nm de diâmetro [40]. Pensa-se que estas

estruturas celulares poderão estar ligadas a funções de sinalização celular, uma vez que se verifica a

agregação de proteínas nas mesmas [39]. Além destes fatores, pensa-se que estas estruturas são

transientes no tempo [40].

Figura 2.5 – Membrana celular destacando os dois tipos de lipid rafts encontrados nas membranas. (a) rafts planares; (c) rafts ricos em caveolina. Adaptado de [41].

Estes domínios foram descobertos nos anos 70 [42] sendo posteriormente observados e mapeados,

de acordo com a separação das fases, por Ressonância Eletrão-Spin (ESR) por McConnell e Shimshick

[43]. Lenz et al demonstraram por fluorescência anisotrópica que havia uma mistura não homogénea

de fosfolípidos com cadeias saturadas e insaturadas [44].

A formação de lípidos raft está relacionada com a afinidade que o colesterol tem para interagir com

determinados fosfolípidos [45]. Jain e White [46] propuseram um modelo que consiste na organização

da membrana em zonas ordenadas e outras desordenadas (mais fluidas). Posteriormente surgiram

estudos onde se introduziam os conceitos de fase líquida-ordenada (Lo) e líquida-desordenada (Ld). A

fase liquida ordenada (Lo) é formada pela interação preferencial do colesterol com as cadeias de acilo

saturadas dos lípidos, sendo a fase líquida desordenada (Ld) correspondente a zonas mais ricas em

fosfolípidos insaturados [47];[48].

Os rafts foram isolados pela primeira vez da membrana plasmática por dissolução com detergentes

não iónicos a 4ºC, tendo-se observado uma dissolução das zonas fluidas das membranas, mas não

dos rafts. Devido a este facto, as estruturas raft são também denominadas “complexos enriquecidos

em glicolípidos insolúveis em detergente” (GEMs/DIGs) ou como “membranas resistentes a

detergentes” (DRMs). No entanto, verificou-se que este método de extração pode promover a

agregação de moléculas que não correspondem à realidade da membrana pré-tratada [49], ou que

diferentes detergentes têm a capacidade de solubilizar os rafts de maneira distinta, levando à obtenção

8

de extratos com composições diferentes em termos lipídicos e proteicos [50]. Estes domínios, que

possuem uma espessura maior do que a espessura média da membrana, resultam da associação entre

os esfingolípidos (de cadeia longa e saturada) com o colesterol, havendo uma interações hidrofóbicas

entre as cadeias saturadas e os anéis que formam o núcleo esteroide do colesterol [51].

Pensa-se existirem dois tipos de rafts: planares e os ricos em caveolina [41]. Nos rafts planares

encontram-se muito frequentemente proteínas ancoradas ao glicolípido glicosil-fosfatidil-inositol (GPI-

anchored proteins) [52], já os ricos em caveolina, formam invaginações na membrana e estão

associados com o processo de endocitose [53].

Outras funções atribuídas aos rafts são de atuarem como transdutores de sinais de

neurotransmissores [54] e de anticorpos [55], poderem servir de via de infeção por parte dos vírus [56];

[57], e estarem envolvidos em fenómenos de adesão celular e em mecanismos génese de cancros [58],

[59]. Além de fenómenos intercelulares, os rafts têm funções de transporte de lípidos e proteínas [60],

[61].

O estudo destes domínios pode ser realizado por Microscopia de Fluorescência, e por Transferência

de Energia de Ressonância por Fluorescência (FRET) [62], in vivo, e Ressonância Magnética Nuclear

(NMR) [63], in vitro.

2.2. Modelos Biomembranares

Sendo os lípidos os principais constituintes da membrana celular, a utilização de modelos

biomembranares baseados na composição lipídica desta constituem uma aproximação razoável ao

estudo da membrana biológica, relacionando os resultados do estudo dos modelos com o observado

nas membranas naturais [13].

2.2.1. Bicamadas Fosfolipídicas Planares

As Bicamadas Fosfolipídicas Planares (figura 2.6), também conhecidas como Membranas Lipídicas

Negras foram o primeiro modelo concebido para a simulação de biomembranas [64]. O processo de

fabrico deste tipo de membranas consiste na formação de uma pequena abertura num material

hidrofóbico, como o Teflon. Em cada lado da abertura é colocado um solvente apolar, de modo a não

ocorrer a dissolução na água do mesmo. Em seguida o recipiente que contém a montagem anterior é

preenchido com uma solução salina, sendo, por fim, adicionados os lípidos. O mecanismo de formação

da bicamada é o seguinte: os lípidos irão formar monocamadas na superfície hidrofóbica fornecida pelo

solvente base, sendo que com o aumento da quantidade de lípido dos dois lados da abertura há a

formação da bicamada, que expulsa a solução salina existente entre si [65];[66].

As maiores restrições associadas a este tipo de estruturas são os resíduos de solvente e a

estabilidade das membranas [66].

9

Figura 2.6 – Formação de uma Bicamada Fosfolipídica Planar dopada de proteínas. Adaptado de [67].

2.2.2. Bicamada Fosfolipídica Suportada (SLB)

Nestes sistemas as bicamadas (figura 2.7) encontram-se sobre um suporte sólido, geralmente a

sílica, óxido de titânio ou zircónia [68], e portanto só a parte superior da camada poderá ser estudada,

uma vez que a inferior estará a interagir com o suporte.

A formação destas bicamadas poderá ter por base a deposição e posterior fusão à superfície de

vesículas unilamelares pequenas (lipossomas com diâmetros inferiores a 100 nm) [69]. Outros métodos

de formação destas bicamadas são baseados na transferência de monocamadas de Langmuir por

Langmuir-Blodgett e Langmuir-Schaefer [70]; [71].

Uma grande vantagem destes sistemas em relação aos anteriores é o facto de serem mais estáveis

[68]. O facto de se encontrarem num suporte sólido é uma vantagem para a sua análise com técnicas

de caracterização, com a Microscopia de Força Atómica (AFM) [72], que de outra maneira não seria

possível.

Figura 2.7 – Exemplo da distribuição das moléculas de lípidos numa SLB. Adaptado de [73].

2.2.3. Monocamadas Auto-Montadas (SAM)

As Monocamadas Auto-Montadas (figura 2.8) são formadas através da adsorção das moléculas

num substrato funcionalizado, de materiais como o ouro, a prata e o óxido de alumínio [74]. De modo

a proceder à formação de monocamadas auto-montadas de lípidos é necessário tornar o substrato

hidrofóbico e tal é conseguido através da modificação com alcano-tióis, havendo depois uma interação

entra a parte hidrofóbica dos fosfolípidos com os alcanos, formando a monocamada [75]; [74].

10

Figura 2.8 – À esquerda apresenta-se um exemplo da funcionalização do substrato com um alcano-tiol (Adaptado de [76]). À direita apresenta-se um exemplo de uma SAM (Adaptado de [77]).

2.2.4. Monocamadas de Langmuir

As monocamadas de Langmuir (figura 2.9) consistem na deposição na interface água-ar de lípidos

dissolvidos num solvente orgânico volátil. O seu princípio assenta no facto das cabeças polares dos

fosfolípidos interagirem com a água, formando uma camada com as suas caudas apolares no sentido

contrário [78].

Estas monocamadas, além contribuírem para o estudo da dinâmica celular na interface, permitem

compreender a agregação lateral dos fosfolípidos [79].

Figura 2.9 – Exemplo de vários estados de agregação dos lípidos em monocamada. Adaptado de [70].

2.2.5. Lipossomas

Os lipossomas (figura 2.10) são vesículas unilamelares pequenas (<100 nm) ou grandes (>100 nm)

[69] que podem ser estudados em suspensão ou adsorvidos em substratos, são um ótimo modelo para

o estudo das membranas celulares uma vez que, devido à sua formulação se assemelham às

membranas nativas [21].

Os lipossomas são estruturas compostas por uma bicamada fosfolipídica que, tal como no caso das

membranas biológicas, separa um meio interior do exterior [21]. Estudos apontam que, ao contrário do

que acontece com superfícies de ouro não-oxidado onde os lipossomas se fixam formando SLBs,

quando a superfície é oxidada, tornando-a mais hidrofílica os lipossomas são capazes de aderir sem

perder a sua estrutura inicial [80].

11

Figura 2.10 – Visualização de lipossoma em corte, contento material no seu interior. Adaptado de [81].

2.2.6. Modelos para o estudo de Lipid Rafts

Um grande número de misturas lipídicas tem sido utlizado de modo a mimetizar as características

biofísicas dos rafts em modelos biomembranares. Veatch et al. [82] destacam a importância de utilizar

os componentes das misturas naturais, como a esfingomielina e o colesterol e Simons et al. [36]

referiram a utilização de sistemas de misturas ternárias (com o colesterol) e binárias (sem o colesterol).

Deste modo, as misturas utilizadas para o estudo destes domínios devem consistir em misturas

ternárias de um fosfolípido insaturado (como o caso do POPC utilizado) com uma Temperatura de

transição (Tt) baixa, esfingomielina, um fosfolípido com cadeias saturadas, com Tt elevada, que é capaz

de se ligar à cabeça hidroxilo do colesterol por ligação de hidrogénio, e colesterol [51]. Além dos fatores

citados anteriormente, esses lípidos são os mais representativos dos fosfolípidos existentes da camada

exterior da membrana [22] permitindo estudar o efeito que a presença de colesterol tem e assim serem

simulados os lipid rafts.

Estudos têm sido desenvolvidos no sentido de determinar diagramas de fase ternários, que

permitem avaliar em que estado organizacional se encontram os modelos construídos [42], [83], [84].

Nas figuras 2.11 e 2.12 encontram-se exemplificados os diagramas de fases para as misturas

estudadas. Na mistura binária (figura 2.11) encontra-se destacado a cinzento a mistura utilizada (1:1

POPC:SM) apenas para denotar que a mistura, com o aumento da temperatura, passa por uma

transição de fase sólida (So) para líquida desordenada (Ld), transição essa que ocorre

aproximadamente entre os 3ºC e os 34ºC.

Figura 2.11 – Diagrama para a mistura binária POPC/SM. Adaptado de [85].

Ld+So

Ld

So

12

Em relação à mistura ternária (figura 2.12), pode-se observar que com o aumento da temperatura

há diferentes domínios, verificando-se que para misturas menos ricas em colesterol há variações nas

fases observadas. No entanto, na gama de temperaturas apresentada, a mistura equimolar (assinalada

a verde, na figura 2.12) apresenta-se sempre numa zona onde há equilíbrio entre a fase líquida

ordenada (Lo) e a fase líquida desordenada (Ld).

Figura 2.12 – Diagrama de fases ternário para a mistura POPC/SM/Chol a 22ºC, 34ºC e 46ºC. Adaptado de [85].

2.3. Ácidos Biliares

2.3.1. No Corpo Humano

Os ácidos biliares são produzidos no fígado, armazenados na vesícula biliar e lançados no duodeno

(figura 2.13) com o objetivo de facilitar a digestão. A sua principal função a, nível fisiológico, é a emulsão

e a promoção de absorção de moléculas, como vitaminas lipossolúveis, cálcio e gorduras que fazem

parte da dieta do ser humano, necessárias aos organismos vivos [86].

Possuem também uma ação anti-microbiana, prevenindo o crescimento descontrolado de bactérias

no intestino delgado [87]; [88].

Figura 2.13 – Representação do aparelho digestivo. Adaptado de [89].

13

2.3.2. Características

Os ácidos biliares são moléculas anfipáticas, constituídas por anéis alifáticos (três anéis de seis

lados e um de cinco), conhecidos como o núcleo esteroide, que possuem uma cadeia lateral acídica,

podendo possuir um ou mais grupos hidroxilo (-OH) na sua composição. [90]. Estes ácidos podem

também ser encontrados sob a forma de sais, que correspondem à espécie desprotonada, conjugada

com um ião (Na+, K+, Ca2+), podendo ainda ser encontrada conjugação com aminoácidos, como a

glicina [87].

Estas moléculas, apesar de estruturalmente semelhantes, diferem entre si em três aspetos: a

estrutura da cadeia lateral; a estereoquímica da fusão dos anéis (os anéis A e B (figura 14) podem ligar-

se de duas formas, apresentando uma conformação cis dando uma forma curva à molécula ou trans,

conferindo uma forma esticada); a distribuição do número, posição e estereoquímica dos grupos

hidroxilo do núcleo esteroide [91].

Figura 2.14 – Estrutura geral de um ácido biliar. Adaptado de [87].

Ao contrário das formas desprotonadas, os ácidos são moléculas fracamente solúveis em água [90].

No entanto, ambas as espécies são capazes de formar micelas, devido às interações entre as suas

cadeias hidrofóbicas, sendo que a existência e orientação de grupos hidroxilo nos anéis proporciona

uma maior ou menor hidrofobicidade à molécula e, como consequência, a sua concentração micelar

crítica (CMC) varia (maior hidrofobicidade implica menor CMC). Agemi et al. demonstraram que os

grupos hidroxilo são o fator mais importante na solubilidade deste tipo de ácidos em água [92]. A

presença de grupos hidroxilo com orientações opostas, torna as moléculas mais hidrofílicas e impede

a formação de micelas. Uma diminuição da cadeira lateral, que contém o grupo acídico também provoca

um aumento da hidrofilicidade e, portanto, origina um aumento da CMC. A orientação destes grupos

hidroxilo apresenta também grande influência na capacidade de solubilização dos fosfolípidos e do

colesterol pelos ácidos biliares.

A gama de concentrações fisiológicas reportadas é bastante variada. Savage et al [93], [94]

observaram que a concentração destes ácidos pode atingir um valor máximo de 20 mM, à saída do

estômago. No entanto, sabe-se que concentrações na ordem dos micromolar (µM) são capazes de

provocar alterações das membranas celulares [95];[96];[97].

Na tabela 2.1 apresentam-se algumas propriedades importantes dos ácidos biliares utilizados neste

trabalho: ácido deoxicólico (DCA) e ácido ursodeoxicólico (UDCA). O coeficiente de partição, P, é a

relação entre a concentração de uma substância numa fase orgânica e numa fase aquosa. Assim

quanto maior este fator, maior afinidade terá a molécula para a fase orgânica e, portanto, para interagir

com lípidos [98].

14

Tabela 2.1– Propriedades dos ácidos biliares utilizados no trabalho.

Ácido Bliar

Peso Molecular (g/mol)

CMC1 (mM)

Solubilidade em água (µM)

Log(P) pKa1

DCA 392.57 [99] 3 [98] [92] 10 [98] [92] 3.5 [100] 6.58 [101]

UDCA 392.58 [102] 7 [98] [92] 19 [98] [92] 3 [100] 5.29 [103]

1 em solução salina 150 mM NaCl.

Os valores de pKa destes ácidos (tabela 1), demostram que a pH 7.4, o utilizado para os estudos

efetuados neste trabalho, e proporcionado pelo tampão constituído por HEPES (ácido N-(2-

hidroxietil)piperazina-N'-2-etanossulfónico), os ácidos devem encontrar-se maioritariamente sob a

forma desprotonada.

2.3.3. Síntese

O único órgão capaz de proceder à transformação completa do colesterol nos seus derivados é o

fígado. São necessárias, no total, 17 enzimas diferentes para a síntese dos ácidos biliares, sendo que

a sua síntese ocorre em diferentes compartimentos celulares. Dado que alguns são citotóxicos a

regulação dos seus níveis tem de ser feita rigorosamente, havendo mecanismos de regulação génica

muito apertada. Erros no metabolismo e/ou regulação destes ácidos podem provocar doenças do foro

hepático, como falha do fígado e cirroses [87].

Em [87], [104] e [86] são descritos os processos de conversão do colesterol nos diferentes ácidos

biliares. A conversão envolve essencialmente 7 passos, como se pode observar na figura 2.15, dando

origem ao Ácido Cólico e ao Ácido Xeno-Deoxicólico, designados de “ácidos biliares primários” que,

por ação posterior de bactérias presentes no organismo, dão origem aos restantes ácidos biliares

conhecidos [105].

Os nomes atribuídos aos ácidos biliares geralmente têm origem na fonte da qual foram isolados

[92], por exemplo, um dos ácidos utilizados neste estudo, o Ácido Ursodeoxicólico, foi primeiro isolado

a partir da bílis de urso [106].

15

Figura 2.15 – Síntese dos ácidos biliares primários, a partir do colesterol. Adaptado de [104].

2.3.4. Ácido Deoxicólico

O Ácido Deoxicólico (figura 2.16) tem sido ligado ao cancro do cólon, sabendo-se que funciona como

promotor tumoral por alteração da sinalização celular, provocada pela destabilização da membrana [10]

[4]. O facto de este tipo de ações ser mais característico dos ácidos hidrofóbicos, não se observando

este efeito para os ácidos mais hidrofílicos, apoia o raciocínio de que as alterações são devidas a

perturbações a nível estrutural da membrana celular.

Apesar desse efeito do DCA, as suas propriedades fluidificantes podem ter aplicações benéficas

não só no tratamento de pedras na vesícula [107], mas também em outras áreas. Por exemplo Chen

et al. [108] mostram como micelas compostas por DCA, ácido fólico e polímero-inteligente de quitosano,

carregadas com um fármaco anti-cancerígeno podem ser utilizadas na formulação de novas

alternativas na administração de fármacos. Yang et al. [109] apresentam um estudo semelhante

utilizando amido em vez de quitosano. Ainda dentro do mesmo tema, Alam et al. [110], apresentaram

um estudo sobre como a formulação de micelas mistas de DCA e heparina, (um composto anti-

angiogénico, muito utilizado na prevenção da expansão de cancros) promove uma melhor absorção da

heparina e, consequentemente, a sua biodisponibilidade de modo a bloquear a formação de novos

vasos sanguíneos.

16

Figura 2.16 – Estrutura e configuração do ácido deoxicólico. Adaptado de [99].

2.3.5. Ácido Ursodeoxicólico

O Ácido Ursodeoxicólico foi isolado pela primeira vez, a partir do suco biliar de urso polar [106]. A

sua estrutura (figura 2.17) foi estabelecida em 1936 [92], após o que ocorreu um estímulo da indústria

para desenvolver métodos de síntese deste ácido e explorar as suas propriedades fisiológicas e

terapêuticas.

As propriedades terapêuticas centram-se em doenças do foro hepático. Conhecem-se propriedades

preventivas a nível do desenvolvimento de cancro do cólon [111], efeitos benéficos na doença hepática

gordurosa não alcoólica [112], geralmente associada a diabetes do tipo 2 [113] e que tem como

consequência final o aparecimento de cirrose [114],[115], e ainda na doença colestática [116],[117],

definida como uma condição patológica na qual o suco biliar não é lançado no duodeno, geralmente,

devido a um impedimento físico.

Atualmente existem diversas formas comerciais, como o Actigall® e o Urso Forte, cuja função básica

se centra na prevenção da absorção de colesterol, bem como na remoção e prevenção do

aparecimento de pequenas pedras na vesícula [118].

Figura 2.17 – Estrutura e configuração do ácido ursodeoxicólico. Adaptado de [102].

17

2.4. Técnicas Experimentais

2.4.1. Balança de Langmuir

As moléculas anfipáticas, constituídas por uma cadeia apolar e uma cabeça polar, organizam-se na

interface líquido-ar de modo a minimizar a energia livre. Assim sendo cria-se uma camada com uma

molécula de espessura, ou seja, uma camada monomolecular ou simplesmente monocamada [119].

As monocamadas podem formar-se espontaneamente por adsorção na superfície a partir da solução

aquosa (monocamadas de Gibbs) ou serem depositadas na interface ar-água (monocamadas de

Langmuir).

Moléculas orgânicas com cadeias hidrofóbicas com mais de 12 carbonos são extremamente

insolúveis em água, no entanto, dissolvendo estes lípidos num solvente orgânico volátil, como o

clorofórmio, e depositando esta mistura na interface ar-água, as moléculas espalham-se pela superfície

ocupando todo a área disponível, formando assim uma monocamada [120]; [91].

As monocamadas são um bom modelo para o estudo das membranas uma vez que representam

metade da bicamada que constitui as membranas celulares [20]; [79]. Através do uso das

monocamadas é possível estudar os vários estados de agregação da membrana, ou seja estudar como

se comportam os lípidos em termos de interações laterais [79]. As isotérmicas dão informação sobre,

estrutura, área, interações, transições de fase e compressibilidade dos sistemas [70]. De notar que nas

monocamadas ocorrem diversas transições entre estados, sendo estas transições correspondentes a

descontinuidades na isotérmica [121], tal como observado na figura 2.18.

Figura 2.18 – Exemplo de isotérmica obtida pela técnica evidenciando as diferentes fases de agregação: gás (G), líquido expandido (LE), líquido condensado (LC), sólido (S), e colapso da monocamada. Adaptado de [70].

Existem diversos mecanismos de colapso da monocamada, podendo haver a formação de

bicamadas na interface, micelas (quando o grupo polar da molécula anfipática é fortemente polar e se

a concentração for superior à CMC) ou vesículas (ocorre quando a parte polar é fracamente polar,

havendo interações entre a zona hidrofóbica das moléculas, como é o caso dos fosfolípidos) [119].

O equipamento para estudar as monocamadas designa-se por balança de Langmuir e consiste

(figura 2.19) numa tina, de um material hidrofóbico (geralmente o Teflon®), que se enche com a

LE

LC

G LE

18

subfase, barreiras móveis (uma ou duas) cuja função é comprimir a monocamada formada na interface

a velocidade constante, e um sensor de pressão superficial (placa de Wilhelmy). A tina deverá estar

ligada a um banho termostatizado, com o objetivo de controlar a temperatura do meio.

Figura 2.19 – Funcionamento de uma Balança de Langmuir. Adaptado de [20].

A pressão medida (Π) é a diferença ente a tensão superficial da água (𝛾0,cerca de 72,8 mN/m a

20ºC [119]) e a tensão superficial da interface onde está depositada a monocamada (𝛾), sendo então

descrita pela equação abaixo:

𝛱 = 𝛾0 − 𝛾 (2.1)

Com o decorrer da compressão as moléculas, que estavam inicialmente afastadas, são juntas

exercendo forças umas sobre as outras, e sobre a placa de Wilhelmy, sendo medida a variação da

tensão superficial do sistema. A representação gráfica da variação da pressão superficial em função

da área ocupada por molécula designa-se por isotérmica 𝛱 − 𝐴.

O comportamento da monocamada depende das propriedades das moléculas anfipáticas, da

subfase, da temperatura da subfase, do comprimento da cadeia hidrofóbica, e da magnitude de outras

forças coesivas/repulsivas [122].

2.4.2. QCM-D – Microbalança de Cristal de Quartzo com Dissipação

A microbalança de cristal de quartzo (QCM-D), com dissipação, é uma técnica que permite fazer

medidas muito sensíveis de massa e propriedades viscoelásticas do material depositado sobre o sensor

[123]. É uma técnica aplicada na medição de processos de adsorção em meios líquidos [124] e gasosos

[125].

Este método tem por base o aproveitamento das propriedades piezoelétricas do quartzo e da

relação que existe entre a frequência de oscilação e a massa de material depositada no cristal [126];

[127].

Os sensores são formados a partir do corte de uma fina fatia com uma inclinação de 35º25’ em

relação ao eixo dos z’s do quartzo (identificado como corte AT), tal como demonstrado na figura 2.21.

Estes sensores podem ser revestidos com diferentes materiais, desde elementos como o ouro e o cobre

a óxidos ou polímeros, de acordo com o fim a que se destinam [128].

19

Figura 2.20 – Ilustração do corte realizado em cristais de quartzo para a formação dos sensores para a técnica. Adaptado de [129].

O princípio de funcionamento da microbalança baseia-se na oscilação de um cristal de quartzo, que

ao ser introduzido entre dois elétrodos que provocam um campo elétrico ao longo do cristal, oscila com

sua frequência de ressonância. A deposição de massa sobre o cristal irá alterar essa frequência de

vibração, podendo essa quantidade de massa ser quantificada de acordo com a equação de Sauerbrey

(equação 2.2):

𝛥𝑚 = −𝐶𝑓

𝑛𝛥𝑓 (2.2)

, na qual 𝐶𝑓é uma constante característica do sensor (para o caso dos cristais de quartzo utilizados,

𝐶𝑓= 17,7 ng.Hz-1cm-2) e n é o número da harmónica [130]; [131].

A relação de Sauerbrey é apenas válida para filmes rígidos, finos e distribuídos homogeneamente

sobre a superfície do cristal, portanto para filmes viscoelásticos, que não vibram acoplados à vibração

do cristal, esta equação subestima a massa adsorvida [131] [132], sendo necessário recorrer a outras

soluções matemáticas.

Esta mesma técnica tem a particularidade de além da frequência de ressonância do cristal (f),

detetar a dissipação de energia (D) que ocorre quando o campo elétrico aplicado no sistema é

desligado, medindo-se a quantidade de energia dissipada face à energia do sistema, sendo este

procedimento realizado várias vezes por segundo [133]; [134]. A dissipação é dada então pela seguinte

razão:

𝐷 =𝐸𝑑𝑖𝑠𝑠𝑖𝑝𝑎𝑑𝑎

2𝜋𝐸𝑎𝑟𝑚𝑎𝑧𝑒𝑛𝑎𝑑𝑎 (2.3)

É a partir deste fator que é possível distinguir se a camada adsorvida é viscoelástica ou rígida, sendo

que valores altos de dissipação são indicativas de filmes pouco rígidos e valores baixos indicam que o

material adsorvido forma uma camada rígida sobre a superfície do cristal [135]; [134].

Através dos valores de f e D para várias harmónicas (no mínimo duas) é possível calcular

parâmetros como a viscosidade (η), a espessura (δ) e o módulo de rigidez/cisalhamento (µ) do filme

adsorvido usando o modelo de Voigt (incorporado no software Qtools) [124]; [130], quando o filme

depositado sobre o cristal se tratar de um sólido viscoelástico [136].

20

2.4.3. DSC – Calorimetria Diferencial de Varrimento

A Calorimetria Diferencial de Varrimento (DSC) permite determinar a dependência da capacidade

calorífica de excesso (Cp) em função da temperatura (T), devido a transições de fase por efeito da

variação da temperatura. Os termogramas de capacidade calorífica dos lipossomas que sofrem estas

transições contêm informações sobre a entalpia e a entropia de transição de fase [137].

A DSC é sensível tanto à composição química dos lipossomas, como ao seu estado físico, podendo

ser utilizado como uma ferramenta para o controlo da qualidade dos lipossomas. Tendo o cuidado de

se escolher uma referência apropriada, com características calorimétricas pré-conhecidas é possível

avaliar a qualidade e estabilidade dos lipossomas preparados, já que cada tipo terá um termograma

distinto, dependendo da sua composição [137].

A partir de um termograma (figura 2.21) é possível obter informação sobre a temperatura média de

transição (temperatura à qual o Cp é máximo) e, por integração da área por baixo do gráfico, obtém-se

ainda a entalpia de transição de fase [137].

Figura 2.21 – Exemplo de Termograma. Adaptado de [138].

O princípio de funcionamento baseia-se na medida da quantidade de energia requerida para manter

a mesma temperatura nas duas células (a célula de referência e a que contém a amostra). Aumenta-

se a temperatura de todo o sistema a uma velocidade constante, assim se/enquanto o Cp for o mesmo,

a mudança é igual nas duas células. No entanto, quando se atinge uma transição de fase na amostra,

o calor fornecido, que deveria provocar o aumento da temperatura da célula, é consumido no processo

de transição de fase (que é um processo endotérmico, neste caso), observando-se um atraso no

aquecimento desta célula em relação à referência. Assim sendo, torna-se necessário adicionar uma

segunda fonte de calor à célula que contém a amostra, com o objetivo de manter as temperaturas das

duas células o mais próximo possível uma da outra. A observável experimental é então a energia

(elétrica) extra requerida para manter as duas células à mesma temperatura [139].

Um ensaio consiste em ciclos de aquecimento/arrefecimento, com uma velocidade constante de

aquecimento/arrefecimento, sendo que com a modificação deste gradiente, também o termograma

pode variar em forma. Este procedimento permite entender se o processo é reversível ou irreversível

[139].

Tt

21

2.4.4. 31P NMR – Ressonância Magnética Nuclear de Fósforo

A Ressonância Magnética Nuclear de Fósforo (31P-NMR) é uma ótima técnica para estudar a zona

polar dos fosfolípidos que constituem a membrana celular, mais concretamente, esta técnica permite

inferir sobre a organização das membranas [140], sendo especialmente útil no estudo de

biomembranas dada a abundância do isótopo 31P e a sua elevada razão giromagnética [141];[142].

Qualquer técnica de NMR assenta no princípio segundo o qual os núcleos, que têm momentos

magnéticos, se orientam de forma paralela ou anti-paralela segundo o campo magnético local, sendo

as duas configurações energéticas próximas. Assim, ao sujeitar estes núcleos à ação de um campo

magnético exterior promove-se a orientação dos núcleos de acordo com esse campo e, quando este é

removido, o decaimento energético dá informação sobre a estrutura local do núcleo. Por exemplo, a

largura de um pico depende das interações locais, deste modo, se o movimento for rápido o pico irá

ser mais afilado e se o movimento for lento esse pico será mais largo [64]; [143].

A forma do espectro de um lipossoma depende da movimentação do grupo polar, que contém o

fósforo, sobre a bicamada fosfolipídica, estando a largura associada à movimentação das cabeças

polares [144].

O desvio químico (δ) é uma medida da diferença entre as frequências de ressonância da amostra

em relação a um padrão externo, sendo contabilizado em partes por milhão (ppm). A anisotropia do

desvio químico (medida da largura do espectro), Δσ, é dada pela diferença entre o desvio químico

isotrópico (𝜎||, corresponde ao pico mais alto a campos baixos de desvio, e ao componente do tensor

paralelo ao eixo de rotação em relação ao campo magnético aplicado) e o anisotrópico (𝜎┴, corresponde

ao pico mais alto a campos altos de desvio, e ao componente do tensor perpendicular ao eixo de

rotação em relação ao campo magnético aplicado) [142]; [145].

Os espectros de 31P-NMR têm características muito bem definidas de acordo com as fases em que

os lípidos analisados se encontram. De modo a poder relacionar o comportamento das diferentes fases

com os espectros obtidos apresentam-se na figura 2.22 os exemplos para três tipos de sistemas, com

restrições diferentes [140]. Como se pode observar, o espectro para um lipossoma em fase ordenada

tem uma maior largura de base com um pico a campos altos, a fase hexagonal (que consiste de

estruturas tubulares agregadas) apresenta uma menor largura, com um pico a campos mais baixos

comparativamente aos lipossomas e no espectro de micelas observa-se um pico muito afilado com

desvio químico nulo, uma vez que os lípidos não têm restrição movimentacional [141].

22

Figura 2.22 – Espectros típicos de diferentes estados de agregação. Adaptado de [140].

22

3. Materiais e Métodos

3.1. Materiais A esfingomielina (SM, cérebro suíno; referência 860062) e o 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-

fosfocolina (POPC; referência 850457) foram adquiridos à Avanti Polar Lipids, Inc. O colesterol

(referência C8667), o ácido deoxicólico (referência D2510) e o ácido ursodeoxicólico (referência U5127)

são da Sigma Aldrich.

Outros reagentes relevantes para o trabalho como o HEPES (ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-2-

etanossulfónico; com 99.5% de pureza; referência H7637), o dodecil sulfato de sódio (SDS; referência

L3771) e o Clorofórmio (referência 52,873-0) são da Sigma Aldrich e o Metanol (referência M74056/17)

é da Fisher Chemical.

A amónia (referência 121129.1611), o cloreto de sódio (referência 121659.1211) e o peróxido de

hidrogénio (referência 121076.1211) utilizados são da Panreac.

Os detergentes como o Hellmanex II ® (referência 9-307-010-3-507) foi comprado à Hellma

Analytics e o Extran ® (referência 1.07555.2500) à Merck.

Na preparação de todas as soluções foi utilizada água Mili-Q (membranas milipore 0.22 µM de

diâmetro).

Para a preparação das soluções de ácido deoxicólico e ursodeoxicólico, usou-se um tampão com

uma concentração final de 10 mM em HEPES e 100 mM em NaCl, com um pH final de cerca de 7.4.

3.2. Preparação de Lipossomas A preparação dos lipossomas foi realizada de acordo com o protocolo conhecido e fornecido pela

Avanti Polar Lipids [146].

O extrusor utilizado no processo foi construído nas oficinas do Complexo Interdisciplinar, tendo sido

utilizadas membranas de policarbonato de 600 nm (referência 110608, Whatman), 200 nm (referência

110606, Whatman) e 100 nm da Marine Manufacturing LLC (referência 1215606). A concentração final

dos lipossomas obtidos foi de cerca de 1.12 mM ou 25 mM para o caso dos ensaios de RMN.

A preparação dos lipossomas envolve dois passos. No primeiro os lípidos são dissolvidos em

clorofórmio, sendo este evaporado com uma corrente branda de azoto, sendo posteriormente

submetidos a vácuo, de modo a remover quaisquer restos de solvente, durante um período de cerca

de 3 horas. O segundo passo envolve a hidratação do filme lipídico obtido. O filme é hidratado com

tampão HEPES e é colocado num banho a 65ºC durante cerca de 1 hora, com agitações intercalares

manuais e no vórtex.

A temperatura de 65ºC foi escolhida dado que a transição da esfingomielina termina a 55 ºC [147]

e a temperatura a que ocorre a preparação dos lipossomas deverá ser 10ºC acima da temperatura de

transição.

Após este processo, é necessário extrudir a suspensão de modo a obter vesículas unilamelares

grandes (LUVs). Para isso, faz-se passar a suspensão através de membranas de 600, 200 e 100 nm

sequencialmente, 5 a 10 vezes por cada membrana, de modo a obter uma suspensão com um tamanho

médio de lipossomas o mais homogéneo possível. Para promover a passagem da suspensão por cada

uma das membranas utlizadas são aplicadas pressões de azoto, respetivamente de 4, 8 e 12 bar. Os

23

lipossomas são guardados a 4ºC durante 1 semana, período após o qual as cadeias dos ácidos gordos

começam a sofrer hidrólise, o que promova a desintegração dos lipossomas [148].

3.3. Balança de Langmuir Todos os ensaios foram realizados numa tina média (KSV 5000, área de 5300 cm2) (KSV

instruments, Helsínquia) de teflon, com duas barreiras também de teflon. A Placa de Wilhelmy utilizada

era de platina, sendo conservada numa solução de etanol entre os ensaios.

Os ensaios foram realizados com compressão simétrica e uma velocidade de compressão de 5

mm/min para cada barreira (10 mm/min no total).

Foram preparadas soluções de cada um dos lípidos (POPC, SM e Colesterol) individualmente com

concentrações de cerca de 1 mM, numa mistura de Clorofórmio:Metanol (4:1). Procedeu-se do mesmo

modo para as soluções de DCA e UDCA que foram utilizadas para testar a interação destes com os

lípidos na interface. Para os restantes ensaios os ácidos foram dissolvidos no tampão de HEPES com

concentrações na ordem dos 13,3 µM.

De modo a iniciar o ensaio, a tina é cheia com a subfase (tampão HEPES 10 mM, NaCl 100 mM).

Em seguida, os lípidos são colocados sobre a subfase e espera-se cerca de 10 minutos até que o

solvente (clorofórmio) evapore, dando-se depois início à compressão.

Nos ensaios realizados com os ácidos dissolvidos na subfase, optou-se por adicioná-los por meio

de injeção com uma seringa de vidro de 5mL até obter a concentração pretendida na subfase.

Num outro tipo de estudos optou-se por incluir os ácidos biliares nas soluções de espalhamento,

sendo esta solução depositada na interface, procedendo-se posteriormente à compressão.

Utilizou-se um banho termostatizado a 25ºC de modo a manter a temperatura constante.

A lavagem da balança é realizada com acetona, etanol, água Mili-Q quente (cerca de 50ºC) e, por

fim, água Mili-Q à temperatura ambiente.

3.4. QCM-D – Microbalança de Cristal de Quartzo com Dissipação O equipamento utilizado foi uma Q-Sense E4 (Q-Sense AB, Gothenburg, Suécia), com quatro

câmaras para sensores e uma bomba (Ismatec IPC-N 4). Os sensores são cristais de quartzo

revestidos a ouro (corte AT (35º25’ de ângulo em relação ao eixo z do cristal, 4.95 MHz, 14 mm de

diâmetro) comprados à Q-Sense AB (Gotemburgo, Suécia).

Os cristais são tratados a dois ciclos de irradiação com luz UV-ciclo do Ozono, de 15 minutos cada,

realizado num equipamento PSD Series UV-Ozone Cleaning & Sterilization da Nocascan. Após cada

ciclo os cristais são lavados com água Mili-Q e secos com uma corrente branda de Azoto, com o

propósito de deixar a superfície mais hidrofílica [80].

Os ensaios foram monitorizados e registados pelo software Qsoft 401, registando-se os dados

relativos até à 9ª harmónica. Antes de cada ensaio é realizado um varrimento ao ar da frequência de

ressonância de cada cristal, bem como da dissipação.

Os ensaios realizados tiveram como linha de base o solvente, ou seja, o tampão HEPES, que foi

passado durante cerca de 10 minutos com um fluxo de 0.100mL/min, seguindo-se uma fase de

estabilização.

24

Os ensaios foram todos realizados a uma temperatura de 37ºC, utilizando uma suspensão de

lipossomas com concentração de 1.12 mM, e concentrações compreendidas entre 500 e 1000 µM para

os Ácidos Biliares.

Os ensaios dividem-se em quatro fases, uma primeira em que são passados os lipossomas, seguida

de uma lavagem com o HEPES de modo a remover os lipossomas não adsorvidos ao cristal. Em

seguida, introduzem-se os ácidos, e, por fim, volta-se a fazer uma lavagem com HEPES. Todas as

etapas têm tempos de estabilização de cerca de 30 minutos.

A limpeza da balança é feita com uma solução de SDS e com outra de Hellmanex, intercaladas por

água Mili-Q. Os cristais são lavados através de 3 ciclos consecutivos de ultrassons, o primeiro com

uma solução de SDS e as restantes com água Mili-Q, sendo por fim secos com um fluxo brando de

Azoto.

Para a modelação, usou-se o software Qtools, utilizando os dados da 3ª à 9ª harmónicas, e o modelo

de Voigt para a estimativa dos parâmetros viscoelásticos. A viscosidade e a densidade do fluido foram

admitidas idênticas às da água (0.001 Pa.s e 1000 Kg/m3) e a densidade do filme foi considerada como

1060 Kg/m3 [149]. Os valores estimados representam a médias dos obtidos em 3 ensaios e são

apresentados com os respetivos desvios padrão.

3.5. DSC – Calorimetria Diferencial de Varrimento

Os ensaios foram realizados num VP-DSC Micro-Calorimetro da MicroCal (Northampton, MA). As

células têm um volume de 0.585 mL, sendo a pressão no seu interior de ≈ 180 kPa. Os ensaios

consistem de cerca de 6 ciclos, 3 de aquecimento e 3 de arrefecimento, de modo a observar a

consistência e reprodutibilidade dos termogramas e portanto a estabilidade dos sistemas.

Os ciclos de aquecimento foram feitos entre as temperaturas de 10 e 50ºC, com uma velocidade de

aquecimento de 60ºC/hora. Para os arrefecimentos utilizou-se o mesmo procedimento, mas em sentido

contrário. Antes de cada ciclo, as amostras permaneceram durante 15 minutos a termostatizar à

temperatura de início do ciclo.

A célula de referência encontra-se preenchida com o tampão HEPES e as amostras foram

preparadas imediatamente antes da injeção no equipamento, com uma concentração final de lípidos

de 1.12 mM e de ácidos entre 500 e 900 µM.

As amostras que contêm lipossomas não foram sujeitas a desgaseificação, no entanto todas as

outras soluções, tais como, o tampão e as soluções de ácidos biliares, foram desgaseificadas

imediatamente antes da adição aos lipossomas. O total de amostra preparada foi de cerca de 1 mL por

cada ensaio de modo a garantir que a célula da amostra ficaria cheia, sendo o excesso removido com

uma seringa própria para o efeito.

Os termogramas (CP vs T) foram analisados com o software Origin 7.0 (OriginLab corporation,

Northampton, WA), tendo sido subtraído o termograma da célula de referência ao termograma da

amostra, de modo a eliminar os efeitos devidos ao solvente.

25

3.6. 31P NMR – Ressonância Magnética Nuclear de Fósforo

Os espectros de 31P foram obtidos utilizando um espectrómetro da Brucker Avance 500MHz

(UltraShield Plus Magnet) (Karlsruhe, Alemanha) com um campo magnético de 11.746 T, frequência

de 202.457 MHz de ressonância do 31P e uma sonda BBO de 5 mm. Todos os espectros foram obtidos

com desacoplamento de protões (31P{1H}).

Os espectros têm uma região espectral de 200 ppm, tempo de pulso 1.5 s e um pulso contínuo de

radiofrequência, para o desacoplamento. Os espectros foram submetidos a transformada de Fourier.

O tempo de aquisição de cada experiência foi de 1h, com 2000 scans.

Todos os espectros foram realizados com uma concentração em lípidos de 12.5 mM e 1.5 mM

de ácidos, às temperaturas de 12ºC, 25ºC e 37ºC. Não foi possível aumentar a proporção de modo a

manter as proporções utilizadas nas outras técnicas devido à solubilidade limitada dos ácidos no

tampão.

Os espectros foram analisados utilizando o software MestReNova ©.

26

4. Resultados e Discussão

4.1. Balança de Langmuir

4.1.1. Efeito do Colesterol

Na figura 4.1-A apresentam-se as isotérmicas -A, a 25ºC numa subfase de tampão HEPES (10

mM) com pH 7.4, dos diferentes lípidos utilizados neste estudo (curvas 1 a 3), bem como as duas

misturas estudadas (POPC/SM (1:1) (curva 4) e POPC/SM/Chol (1:1:1) (curva 5). Na figura 4.1-B

encontram-se representadas as isotérmicas -A das misturas estudadas (curvas 1 e 3), bem como as

isotérmicas que resultariam da mistura ideal dos lípidos (curvas 2 e 4). O comportamento de mistura

ideal é observado quando a mistura pode ser descrita através da média ponderada entre as isotérmicas

dos compostos puros.

Figura 4.1 – Painel A-Isotérmicas -A dos compostos puros, POPC (curva 1), esfingomielina (curva 2) e colesterol (curva 3), da mistura binária POPC/SM (1:1) (curva 4) e da mistura ternária POPC/SM/Chol (1:1:1)

(curva 5), a 25ºC numa subfase de tampão HEPES 10 mM (pH 7.4). No painel B, encontram-se representadas as isotérmicas traçadas das misturas binária (curva 1) e ternária (curva 3) e as que resultariam de uma mistura

binária ideal (curva 2) e de uma mistura ternária ideal (curva 4).

Em relação aos compostos puros, o POPC (figura 4.1, painel A, curva 1) apresenta uma isotérmica

com início na área de 115 Å2 /molécula, colapsando à pressão de 45 mN/m para uma área de 60

Å2/molécula, o que está de acordo com o reportado por Huynh et al. [150]. O processo de compressão

do POPC envolve a compressão de uma fase líquida expandida e não indica qualquer transição de

fase, uma vez que não se observam descontinuidades da isotérmica [150]. O facto de a isotérmica ter

início a áreas moleculares elevadas está relacionada com o facto do POPC apresentar uma insaturação

numa das suas cadeias de acilo, que dificulta a organização da monocamada.

A isotérmica da SM inicia-se a áreas moleculares de 89 Å2/molécula, terminando a 38 Å2 e pressões

de 57 mN/m. Esta isotérmica apresenta duas fases distintas (figura 4.1, painel A, curva 2), sendo

observável que ocorre uma transição entre uma fase líquida expandida (LE) para uma líquida

condensada (LC), denotada por um aumento do declive na isotérmica, entre cerca de 17 mN/m e 27

mN/M [151];[152].

O Chol apresenta uma isotérmica muito abrupta (figura 4.1, painel A, curva 3), com início a áreas

moleculares de 42 Å2/molécula e com um colapso a 36 Å2/molécula e a uma pressão de 44 mN/m. O

0

10

20

30

40

50

60

30 50 70 90 110 130

Π(m

N/m

)

A (Å2/molec)

(1)

(2)

(3) (4)

(5)

0

10

20

30

40

50

60

30 50 70 90 110 130

Π(m

N/m

)

A (Å2/molec)

(3)(1)

(2)(4)

A B

27

facto da isotérmica ser abrupta deriva do facto do colesterol ser uma molécula rígida e ao adoptar uma

orientação perpendicular à interface dá origem a uma monocamada extremamente incompressível

[152].

No painel B da figura 4.1 observa-se que a isotérmica da mistura binária (curva 1), até π≈20mN/m

se comporta de acordo com um comportamento de mistura ideal. No entanto, para pressões superiores

a 20 mN/m, não se observa a transição de fase característica da SM que levaria ao desvio da isotérmica

para áreas moleculares inferiores, tal como observado na isotérmica calculada através da média

ponderada dos componentes puros (curva 4). O colapso ocorre a uma pressão de 45 mN/m, tal como

observado no caso do POPC. Estes factos indicam que ao misturar a SM com o POPC, haverá um

efeito fluidizante por parte deste último que impede, total ou parcialmente, a agregação da SM em

domínios mais condensados.

Através da isotérmica obtida para a mistura ternária POPC/SM/Chol (figura 4.1, painel B, curva 3) é

notório que há um efeito condensante, quando comparada com a isotérmica que resultaria da mistura

ideal dos três componentes (figura 4.1, painel B, curva 4). Este efeito será devido à incorporação do

Chol na mistura, sendo que Yeagle et al. indicam que este fenómeno é observado tanto em fosfolípidos

saturados (SM) como em mono-insaturados (POPC) [34].

4.1.2. Efeito dos ácidos biliares dissolvidos na subfase

4.1.2.1. Efeito do DCA

Na figura 4.2 apresentam-se as isotérmicas -A traçadas com concentrações crescentes de DCA

dissolvido na subfase. No painel A encontra-se representado o efeito deste ácido na mistura binária

POPC/SM (1:1), e no painel B na mistura ternária POPC/SM/Chol (1:1:1).

Figura 4.2 – Isotérmicas -A das misturas POPC/SM (1:1) (A) e POPC/SM/Chol (1:1:1) (B), a 25ºC, numa

subfase de tampão HEPES 10 mM (pH 7.4). As curvas identificadas com (1) correspondem à isotérmica do DCA

com uma concentração de 8 µM na subfase. A preto, contínuo, encontram-se as isotérmicas das misturas

lipídicas puras, apresentando-se as restantes, da esquerda para a direita, com concentrações crescentes (1.33

µM; 2.63 µM; 8 µM e 13.3 µM) de DCA dissolvido na subfase. O valor de A na abcissa representa a área

ocupada por molécula de lípido, exceto para as curvas (1) onde representa a área ocupada por molécula de

DCA.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

30 50 70 90 110 130

Π(m

N/m

)

A (Å2/molec)

CDCA

(1)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

30 50 70 90 110 130

Π(m

N/m

)

A (Å2/molec)

(1)

CDCA

A B

28

Da análise da figura 4.2 é possível observar o efeito que o DCA tem sobre as duas misturas lipídicas:

com o aumento da concentração de DCA na subfase há um desvio de toda a isotérmica para áreas por

molécula cada vez maiores.

Através da análise da isotérmica traçada a partir de uma solução de 8 µM de DCA, dissolvido no

tampão HEPES e na ausência de lípidos na interface (figura 4.2, curva 1), observa-se que o DCA altera

as características da subfase. A diferença observada é ao nível da diminuição da tensão superficial,

traduzida pelo aumento da pressão superficial verificado logo após a sua introdução na subfase

(grandes áreas moleculares).

A mistura binária POPC/SM (1:1) é mais afetada pela presença do DCA, do que a mistura ternária

POPC/SM/Chol (1:1:1), observando-se desvios maiores em relação à isotérmica da mistura pura. É

também, de notar que para áreas moleculares elevadas e pressões baixas, há uma maior penetração

do DCA na monocamada da mistura POPC/SM do que na mistura POPC/SM/Chol, indicada pelo

aumento da pressão superficial. O facto da pressão superficial ser superior para a mistura POPC/SM é

indicativo de uma maior incorporação do DCA nesta monocamada, do que a observada na presença

de colesterol.

4.1.2.2. Efeito do UDCA

Na figura 4.3 apresentam-se as isotérmicas -A traçadas com concentrações crescentes de UDCA

dissolvido na subfase. No painel A encontra-se representado o efeito deste ácido na mistura binária

POPC/SM (1:1), e no painel B na mistura ternária POPC/SM/Chol (1:1:1).

Figura 4.3 – Isotérmicas -A das misturas POPC/SM (1:1) (A) e POPC/SM/Chol (1:1:1) (B), a 25ºC numa subfase de tampão HEPES 10 mM (pH 7.4). As curvas identificadas com (1) correspondem à isotérmica do UDCA com uma concentração de 8 µM na subfase. A preto contínuo encontram-se as isotérmicas das misturas lipídicas

puras, apresentando-se as restantes, da esquerda para a direita, com concentrações crescentes (1.33 µM; 2.63 µM; 8 µM e 13.3 µM) de UDCA dissolvido na subfase. O valor de A na abcissa representa a área ocupada por

molécula de lípido, exceto para as curvas (1) onde representa a área ocupada por molécula de DCA.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

30 50 70 90 110 130

Π(m

N/m

)

A (Å2/molec)

(1)

CUDCA

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

30 50 70 90 110 130

Π(m

N/m

)

A (Å2/molec)

CUDCA

(1)

A B

29

Da análise das isotérmicas traçadas com diferentes concentrações de UDCA observa-se que este

ácido penetra muito pouco na monocamada, uma vez que o aumento da área molecular média é muito

pequeno. O efeito é ligeiramente superior para o caso da mistura POPC/SM (figura 4.3, painel A) do

que para o caso da mistura POPC/SM/Chol (figura 4.3, painel B). De notar que, para ambas as misturas

lipídicas, as concentrações de 1.33 e 2.63 μM se encontram invertidas, ou seja, observa-se um desvio

para áreas moleculares maiores para a menor concentração. Em relação a esta observação, no caso

da mistura binária 1:1 POPC/SM, observa-se que a diferença é muito pequena, assim este fenómeno

encontra-se dentro do erro experimental. Já para o caso da mistura ternária a “contração” da

monocamada poderá ser explicada pela interação do UDCA com os domínios de colesterol, por

ligações de hidrogénio, promovendo uma maior compactação da monocamada.

Do mesmo modo que no caso do DCA, foi traçada uma isotérmica de UDCA dissolvido na subfase

(CUDCA = 8 µM) na ausência de lípidos (figura 4.3, curva 1). Como se pode observar na figura 4.3, não

há alteração da pressão superficial, ao contrário do que ocorre para o DCA (figura 4.2, curva 1).

Uma vez que a variação de área observada é pequena e há um aumento da pressão de colapso,

verificado para as concentrações de 8 µM e 13,3 µM, em ambas as misturas lipídicas, pensa-se que o

UDCA deverá interagir com as zonas polares dos lípidos, promovendo uma estabilização da

monocamada [153].

4.1.2.3. Efeito da Mistura

Na figura 4.4 apresentam-se os resultados relativos à influência que a mistura 1:1 de DCA:UDCA

tem nos dois sistemas estudados (mistura POPC/SM (A) e POPC/SM/Chol (B)).

Figura 4.4 – Isotérmicas -A das misturas POPC/SM (1:1) (A) e POPC/SM/Chol (1:1:1) (B), a 25ºC numa subfase de tampão HEPES 10 mM (pH 7.4). A preto contínuo encontram-se as isotérmicas das misturas lipídicas,

apresentando-se as restantes, da esquerda para a direita, com concentrações crescentes (1,33 µM; 2.63 µM; 8 µM e 13.3 µM) da mistura 1:1 DCA/UDCA dissolvida na subfase.

De modo a proceder a uma comparação entre os sistemas estudados (misturas equimolares

POPC/SM e POPC/SM/Chol e ácidos DCA, UDCA e DCA/UDCA) apresenta-se em seguida a variação

da área molecular média (em percentagem) em função da concentração dos ácidos biliares na subfase,

a duas pressões diferentes (figura 4.5). A pressão de 30 mN/m foi escolhida por ser considerada a

pressão à qual é possível comparar o comportamento da monocamada a bicamadas lipídicas [150].

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

30 50 70 90 110 130

Π(m

N/m

)

A (Å2/molec)

CAc

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

30 50 70 90 110 130

Π(m

N/m

)

A (Å2/molec)

CAc

A B

30

Todos ensaios foram repetidos três vezes de modo a testar a reprodutibilidade dos ensaios, não tendo

sido observados resultados discrepantes entre os mesmos. Assim, foi utilizado o valor médio registado

nos ensaios.

As variações de área molecular foram calculadas com base na seguinte equação:

ΔA

A0=

A−A0

A0 (4.1)

, onde A0 representa a área molecular média registada, a uma determinada pressão superficial (π = 15

mN/M ou 30 mN/m), para a isotérmica da mistura lipídica pura e A representa a área molecular média

registada na isotérmica das misturas lipídicas colocadas sobre a subfase que contém diferentes

concentrações dos ácidos biliares.

Figura 4.5 – Variação da área molecular média de lípido em função da concentração dos ácidos biliares na

subfase: DCA (bolas a cheio), do UDCA (bolas em aberto), da mistura DCA/UDCA (1:1) (quadrados a cheio), (A e B) na mistura binária POPC/SM (1:1), (C e D) na mistura ternária POPC/SM/Chol (1:1:1), a 15mN/m (A e C) e a

30 mN/m (B e D).Os triângulos representam o efeito da mistura DCA/UDCA (1:1) calculado com base na regra de aditividade do efeito dos componentes isolados.

Da análise da figura 4.5 é possível concluir que o DCA apresenta a maior influência nas

monocamadas estudadas (misturas lipídicas equimolares POPC/SM e POPC/SM/Chol) sendo maiores

os desvios na mistura binária face à ternária. Esta observação deverá estar relacionada com o facto de

que a introdução de colesterol na monocamada leva à formação de domínios mais rígidos, ricos em

esfingomielina e colesterol, onde a penetração do DCA é mais difícil, resultando numa menor

incorporação do ácido na monocamada.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 2 4 6 8 10 12 14

ΔA

/A0

C (µM)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 2 4 6 8 10 12 14

ΔA

/A0

C (µM)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0 2 4 6 8 10 12 14

ΔA

/A0

C (µM)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0 2 4 6 8 10 12 14

ΔA

/A0

C (µM)

A C

B D

(π=15 mN/m) (π=15 mN/m)

(π=30 mN/m) (π=30 mN/m)

31

O efeito da mistura equimolar dos ácidos dissolvidos na subfase (quadrados) é comparado com o

efeito aditivo calculado pela média das variações observadas para cada ácido (triângulos) para a

mistura binária POPC/SM (figura 4.5, painéis A e B) e ternária POPC/SM/Chol (figura 4.5, painéis C e

D). Observou-se em ambos os sistemas uma variação experimental superior ao valor calculado,

sugerindo um efeito sinergístico entre os dois ácidos. Esta observação parece indicar que a presença

de DCA promove a incorporação de UDCA nas monocamadas lipídicas. Este efeito cooperativo é

especialmente acentuado no caso da mistura ternária POPC/SM/Chol (figura 4.5, painéis C e D), onde

para baixas concentrações se observa um aumento de área superior ao observado na presença de

DCA puro. Este resultado indica que deverá haver uma interação preferencial dos ácidos biliares com

a membrana lipídica na presença do colesterol.

4.1.3. Efeito dos ácidos biliares espalhados na superfície

4.1.3.1. Efeito do DCA

De modo a observar de que modo a incorporação dos ácidos biliares influencia a formação da

monocamada, quando espalhado em conjunto com os lípidos, foram feitas misturas de espalhamento

(em clorofórmio) dos lípidos em conjunto com os ácidos em diferentes proporções. Estas soluções

foram espalhadas na interface, tendo-se traçado as isotérmicas resultantes (figura 4.6).

Figura 4.6 – Isotérmicas -A das misturas POPC/SM (A) e POPC/SM/Chol (B), a 25ºC, numa subfase de tampão HEPES 10 mM (pH 7.4). A preto contínuo encontra-se representada a mistura lipídica pura estando as restantes

isotérmicas representadas, da esquerda para a direita, de acordo com o aumento da fração molar de DCA na solução de espalhamento (xac = 0.67; 0.75 e 0.8 (para POPC/SM) e xac = 0.3; 0.5; 0.7 e 0.8 (para

POPC/SM/Chol)).

No geral observa-se a incorporação do DCA na monocamada formada. O desvio observado é tanto

maior quanto maior a fração de ácido biliar na solução de espalhamento. De notar que o efeito é mais

acentuado para a mistura POPC/SM/Chol (painel B) face à mistura POPC/SM (painel A), ao contrário

do observado quando se dissolve o DCA na subfase (figura 4.2). Esta observação poderá indicar uma

afinidade preferencial para o colesterol. Poderá haver a incorporação de dímeros deste ácido na

monocamada, tal como proposto por Ben Mouaz et al. [18] para a localização deste ácido em

lipossomas de fosfatidilcolina.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

30 50 70 90 110 130

Π(m

N/m

)

A (Å²/molec)

xDCA

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

20 40 60 80 100 120

Π(m

N/m

)

A (Å²/molec)

xDCA

A B

32

4.1.3.2. Efeito do UDCA

Na figura 4.7 encontram-se representadas as isotérmicas -A resultantes da mistura dos lípidos com

diferentes proporções de UDCA. No painel A encontram-se representadas as isotérmicas para a

mistura POPC/SM (1:1) e no painel B para a mistura POPC/SM/Chol (1:1:1).

Do mesmo modo que em relação ao DCA, observa-se uma maior influência/incorporação do UDCA

na mistura POPC/SM/Chol (painel B) face à mistura POPC/SM (painel A), sendo o oposto ao verificado

na dissolução do ácido na subfase (figura 4.3).

Figura 4.7 – Isotérmicas-A das misturas POPC/SM (A) e POPC/SM/Chol (B), a 25ºC, numa subfase de tampão HEPES 10 mM (pH 7.4). A preto contínuo, encontra-se representada a mistura lipídica pura estando as restantes isotérmicas representadas, da esquerda para a direita, de acordo com o aumento da fração molar de UDCA na

solução de espalhamento (xac = 0.67; 0.75 e 0.8 (para POPC/SM) e xac = 0.3; 0.5; 0.7 e 0.8 (para POPC/SM/Chol)).

É possível observar que na mistura POPC/SM (painel A) o desvio é pequeno para todas as

concentrações experimentadas, o que poderá ser explicado pela maior solubilidade do UDCA na

subfase. No caso da mistura ternária (figura 4.7, painel B) observa-se, de um modo geral, um aumento

significativo e proporcional à fração de ácido na solução de espalhamento, o que deverá ser atribuído

à presença de colesterol. Isto significa que o colesterol terá tendência a reter uma maior quantidade de

UDCA à superfície. De notar que, para a menor fração de UDCA (linha preto a tracejado, painel B),

observa-se uma contração da monocamada lipídica, o que poderá estar relacionado com um aumento

de coesão na monocamada induzido pela presença de colesterol.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

30 50 70 90 110 130

Π(m

N/m

)

A (Å²/molec)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

20 40 60 80 100 120

Π(m

N/m

)

A (Å²/molec)

xUDCA

xUDCA

A B

33

4.1.3.3. Efeito da Mistura 1:1 DCA/UDCA

O efeito que a incorporação da mistura DCA/UDCA (1:1) na solução de espalhamento provoca nas

isotérmicas -A encontra-se representado na figura 4.8.

Figura 4.8 – Isotérmicas -A das misturas POPC/SM (A) e POPC/SM/Chol (B), a 25ºC, numa subfase de tampão HEPES 10 mM (pH 7.4). A preto contínuo encontra-se representada a mistura lipídica pura estando as restantes isotérmicas representadas, da esquerda para a direita, de acordo com o aumento da fração molar da mistura 1:1 DCA/UDCA na solução de espalhamento (xac = 0.67; 0.75 e 0.8 (para POPC/SM) e xac = 0.3; 0.5; 0.7 e 0.8 (para

POPC/SM/Chol)).

O efeito que a mistura 1:1 de DCA/UDCA tem nas isotérmicas π-A (figura 4.8), quando é incorporado

na solução de espalhamento, é semelhante ao verificado para a incorporação de cada um dos ácidos

em separado (figuras 4.6 e 4.7). Assim, o aumento da fração de ácidos biliares na solução de

espalhamento aumenta o desvio da isotérmica -A para maiores áreas.

De modo a comparar o efeito dos ácidos optou-se por representar a variação da área molecular

média (em percentagem) em função às pressões de 5 mN/m e de 15mN/m, em função da fração de

ácidos biliares incluídos na solução de espalhamento (figura 4.9). As variações de área molecular média

foram calculadas a partir da equação (4.1), sendo que, neste caso, A representa a área molecular

média registada para as misturas lipídicas, contendo diferentes frações molares de ácidos biliares na

sua constituição.

É possível observar que, ao contrário do que acontece quando os ácidos são dissolvidos na subfase

(figura 4.5), neste caso as moléculas de ácido têm mais tendência a associar-se à mistura ternária.

Este efeito deverá ser promovido pela interação preferencial dos ácidos com os domínios ricos em

colesterol promovendo, assim, uma maior incorporação na monocamada da mistura ternária

POPC/SM/Chol.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

30 50 70 90 110 130

Π(m

N/m

)

A (Å²/molec)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

20 40 60 80 100 120

Π(m

N/m

)

A (Å²/molec)

xAc

xAc

A B

34

Figura 4.9 – Variação da área molecular média de lípido em função da fração molar de ácidos biliares incluídos na mistura de espalhamento: DCA (bolas a cheio), do UDCA (bolas em aberto), da mistura DCA/UDCA (1:1) (quadrados a cheio). (A e B) na mistura binária POPC/SM (1:1), (C e D) na mistura ternária POPC/SM/Chol

(1:1:1), a 5mN/m (A e C) e a 15 mN/m (B e D).Os triângulos representam o efeito da mistura DCA/UDCA (1:1) calculado com base na regra de aditividade do efeito dos componentes isolados. (xac = 0.67; 0.75 e 0.8 (para

POPC/SM) e xac = 0.3; 0.5; 0.7 e 0.8 (para POPC/SM/Chol)).

Pode-se observar que, neste caso, o efeito da mistura DCA/UDCA 1:1 se assemelha, em geral, ao

efeito calculado com base na regra de aditividade dos efeitos dos componentes isolados. Apesar de se

observar um maior desvio proporcionado pelo DCA, para a monocamada constituída por POPC/SM, à

pressão de 15 mN/m ambos os ácidos influenciam de forma semelhante o desvio da isotérmica, i. e.

quando os ácidos biliares são espalhados em conjunto com os lípidos na interface promove-se uma

maior inserção destes na monocamada. A baixa incorporação do UDCA quando espalhado na subfase,

poderá ser explicado pelo facto deste ácido ser mais hidrofílico e, portanto, quando dissolvido na

subfase não ter tendência a perturbar a monocamada, apenas interagindo com as cabeças polares dos

lípidos. Observa-se, também, para o caso do espalhamento em conjunto (figura 4.9) uma maior

inserção deste na presença de colesterol (painéis C e D).

4.1.4. Conclusões Gerais

A introdução de colesterol na mistura lipídica promove uma compactação da monocamada;

Quando dissolvido na subfase, o DCA tem uma maior influência na monocamada, do que o UDCA,

sendo observada uma incorporação deste ácido tanto maior quanto maior a sua concentração;

-0,05

0,05

0,15

0,25

0,35

0,6 0,7 0,8 0,9

ΔA

/A0

xAc

(π=5 mN/m)A

-0,05

0,05

0,15

0,25

0,35

0,2 0,4 0,6 0,8

ΔA

/A0

xAc

(π=5 mN/m)C

-0,05

0,05

0,15

0,25

0,6 0,7 0,8 0,9

ΔA

/A0

xAc

(π=15 mN/m)B

-0,05

0,05

0,15

0,25

0,2 0,4 0,6 0,8

ΔA

/A0

xAc

(π=15 mN/m)D

35

O UDCA quando é dissolvido na subfase apresenta uma pequena influência na monocamada, sendo

que promoverá uma estabilização por interação com os grupos polares dos lípidos;

A mistura 1:1 de DCA/UDCA quando dissolvida na subfase, apresenta um efeito maior do que o

observado no caso do DCA isolado (há um deslocamento da isotérmica para maiores áreas

moleculares) para as concentrações mais baixas, invertendo-se a tendência para a maior

concentração analisada. Deste modo, pensa-se que o efeito fluidizante do DCA poderá promover a

incorporação de UDCA na monocamada;

Em relação aos resultados obtidos quando se espalham os lípidos em conjunto com os ácidos sobre

a superfície, é de notar que o comportamento da mistura pode ser considerado ideal uma vez a

variação de área molecular observada é aproximadamente igual à média dos dois ácidos. Isto

significa que na interface há um aumento das interações dos ácidos com os grupos polares dos

lípidos que constituem a monocamada em detrimento das respetivas interações com a água na

subfase;

De notar, ainda, sobre o efeito que a presença de colesterol na mistura lipídica tem no

comportamento da monocamada. Quando os ácidos são dissolvidos na subfase o colesterol

promove a compactação da monocamada, impedindo a incorporação destes na mesma. Contudo,

quando os ácidos biliares são espalhados em conjunto com a solução de espalhamento há uma

inversão deste comportamento, registando-se um maior desvio registado quando há colesterol na

monocamada.

4.2. QCM-D

Na figura 4.10 encontra-se representado um exemplo da variação da frequência e da dissipação da

3ª harmónica durante a adsorção dos lipossomas à superfície do cristal de quartzo revestido a ouro.

A escolha da monitorização da 3ª harmónica durante o decorrer dos ensaios deve-se ao facto desta

ser a harmónica com maior profundidade de penetração, dando assim informação sobre a interface.

Além disso apresenta bons resultados não contendo ruído devido a oscilações exteriores [154].

Figura 4.10 – Exemplo da variação da frequência (a preto) e da dissipação (a cinzento) da 3ª harmónica para uma experiência de adsorção dos lipossomas no cristal de quartzo a 37ºC. Lipossomas POPC/SM à esquerda e

POPC/SM/Chol à direita. (1) Adição de lipossomas; (2) enxaguamento.

(1)

(2) (2) (1)

36

Observa-se na figura 4.10, um desvio da frequência para valores negativos após a introdução dos

lipossomas, sendo que estes valores estão de acordo com os observados anteriormente para a

adsorção destas vesículas em superfícies de ouro [155]. A adsorção é irreversível dado que com o

enxaguamento não há uma variação significativa dos valores da frequência e da dissipação.

Além da variação da frequência, o aumento da dissipação está de acordo com o facto da camada

formada não ser rígida, sendo então necessário utilizar modelos viscoelásticos para a modelação das

propriedades [136].


Na figura 4.11 apresentam-se os valores médios para a variação observada na 3ª harmónica da

frequência de ressonância obtidos para a adsorção de lipossomas de mistura binária e ternária e

utilizados para a modelação das propriedades viscoelásticas.

Figura 4.11 – Variação de frequência e de dissipação da 3ª harmónica, observados quando se dá a adsorção

dos lipossomas aos cristais de quartzo. A preto encontram-se os dados correspondentes aos lipossomas POPC/SM e a cinzento POPC/SM/Chol.

Tal como esperado, observa-se um maior desvio para os lipossomas correspondentes à mistura

ternária POPC/SM/Chol, o que poderá ser explicado pela pequena deformação sofrida por estes

lipossomas durante o processo de adsorção. Uma maior deformação deverá ser observada para os

lipossomas da mistura binária POPC/SM dado que à temperatura de 37ºC se encontram numa fase

desordenada, tendo tendência a ocupar uma maior área face aos lipossomas de POPC/SM/Chol que

se encontram numa fase mais ordenada. Em resultado, estes lipossomas não se deformarão tanto,

levando à deposição de uma maior quantidade de lipossomas sobre o cristal e, portanto, um desvio

maior para frequência mais negativas [154]. Em relação aos valores da dissipação, ambos os valores

são elevados o que está de acordo com o pressuposto dos lipossomas adsorvidos ao cristal terem

propriedades viscoelásticas [136].

Na tabela 4.1 mostram-se os parâmetros viscoelásticos, obtidos através da modelação com o

recurso à ferramenta Qtools3, para os lipossomas das misturas estudadas (POPC/SM e

POPC/SM/Chol) adsorvidos aos cristais.

Tabela 4.1 – Valores médios das propriedades viscoelásticas dos lipossomas POPC/SM e POPC/SM/Chol a 37ºC. Os valores apresentados encontram-se como média ± desvio padrão.

Parâmetros POPC/SM POPC/SM/Chol

Viscosidade (mPa.s) 1,9 ± 0,2 2,5 ± 0,3

Módulo cisalhamento (kPa) - 4 ± 2

Espessura (nm) 106 ± 9 109 ± 10

37

Os lipossomas da mistura ternária apresentam uma viscosidade maior, dada a existência de fases

ordenadas nestes lipossomas. Em termos da espessura estimada para os lipossomas, os valores são

muito semelhantes embora a espessura dos lipossomas da mistura ternária seja ligeiramente maior.

Quanto ao módulo de cisalhamento, não é possível comparar porque não se obtiveram valores

adequados para os lipossomas de POPC/SM.

4.2.2. Efeito do DCA

Na figura 4.12 mostra-se a variação dos diferentes harmónicos da frequência e dissipação ao longo

de ensaios de QCM-D em que se adiciona solução de DCA (1000 µM) às camadas de lipossomas

adsorvidos com composição POPC/SM (em cima) e POPC/SM/Chol (em baixo). Os símbolos

representam os valores médios e os respetivos desvios-padrão das variações de frequência e de

dissipação obtidos em cada passo das experiências: adsorção dos lipossomas (Lipo), enxaguamento

com tampão de HEPES (Hepes), introdução da solução do ácido DCA de concentração 1000 µM (Ácido

In), estabilização (Ácido F), e enxaguamento final (Hepes). Gráficos análogos correspondentes às

concentrações de DCA de 500 µM e 750 µM são apresentados em anexo (figuras A.1 e A.2). Na figura

4.13 comparam-se os valores médios da variação da frequência (à esquerda) e da dissipação (à direita)

da 3ª harmónica ao longo do decorrer do ensaio para as três concentrações estudadas.

Figura 4.12 – Desvios de frequência (à esquerda) e de dissipação (à direita) observados ao longo do ensaio

afetados do desvio padrão. Exemplo da interação de lipossomas POPC/SM (topo) e POPC/SM/Chol (baixo) com 1 mM de DCA. Cinzento-escuro: 3ª harmónica; cinzento médio: 5ª harmónica; cinzento: 7ª harmónica; cinzento

claro: 9ª harmónica.

-350

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0

Lipo Hepes Ácido In Ácido F Hepes

Δf

(Hz)

0

10

20

30

40

50

60


ΔD

(1

0-6

)

-350

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0


Δf

(Hz)

0

10

20

30

40

50

60


ΔD

(1

0-6

)

38

Figura 4.13 – Valores médios da variação da frequência (à esquerda) e da dissipação (à direita) da 3ª harmónica

ao longo do decorrer do ensaio para as três concentrações estudadas. Topo: lipossomas POPC/SM; Baixo: lipossomas POPC/SM/Chol. A preto: valores médios dos lipossomas, cinzento-escuro: após enxaguamento;

cinzento: após adição do ácido; cinzento claro: após enxaguamento final.

Da análise das figuras 4.12 e 4.13 é notório que o efeito do primeiro enxaguamento é sempre

desprezável, indicando que o processo de adsorção dos lipossomas ao cristal é irreversível. A adição

do DCA aos lipossomas de POPC/SM e de POPC/SM/Chol produz um desvio positivo na frequência e

uma diminuição da dissipação que se acentuam com o aumento da concentração. A única exceção

verifica-se na interação de DCA (500 µM) com a mistura binária que levou a um desvio negativo na

frequência e a um aumento da dissipação.

Para poder interpretar as variações simultâneas de frequência e dissipação obtidas, fez-se a

modelação das propriedades viscoelásticas das camadas de lipossomas adsorvidos. Nas tabelas 4.2

a 4.7 apresentam-se os parâmetros resultantes para os dois tipos de lipossomas estudados a interagir

com diferentes concentrações de DCA (500 µM, 750 µM e 1000 µM). Os valores referem-se às

situações de equilíbrio atingido após cada introdução.

Tabela 4.2– Valores médios das propriedades viscoelásticas dos lipossomas POPC/SM a interagir com 500 µM de DCA a 37ºC, estimados pela ferramenta QTools. Os valores apresentados encontram-se como média ± desvio

padrão.

-350

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0

500 µM 750 µM 1000 µMΔ

f 3(H

z)

0

10

20

30

40

50

60

500 µM 750 µM 1000 µM

ΔD

3(1

0-6

)-350

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0

500 µM 750 µM 1000 µM

Δf 3

(Hz)

0

10

20

30

40

50

60

500 µM 750 µM 1000 µM

ΔD

3(1

0-6

)

Parâmetros Lipossomas HEPES Ácido HEPES

Viscosidade (mPa.s) 1.86 ± 0.09 1.8 ± 0.1 1.9 ± 0.2 1.8 ± 0.2

Módulo cisalhamento (kPa) 2 ± 1 2 ± 1 - 2 ± 1

Espessura (nm) 105 ± 6 106 ± 6 115 ± 7 109 ± 6

39

Tabela 4.3 – Valores médios das propriedades viscoelásticas dos lipossomas POPC/SM/Chol a interagir com 500 µM de DCA a 37ºC, estimados pela ferramenta QTools. Os valores apresentados encontram-se como média ±

desvio padrão.



Módulo cisalhamento (kPa) 5 ± 2 5 ± 2 6.5 ± 0.6 5 ± 3

Espessura (nm) 116 ± 7 116 ± 7 114 ± 10 111 ± 9

Tabela 4.4 – Valores médios das propriedades viscoelásticas dos lipossomas POPC/SM a interagir com 750 µM

de DCA a 37ºC, estimados pela ferramenta QTools. Os valores apresentados encontram-se como média ± desvio

padrão.



Módulo cisalhamento (kPa) - - - -

Espessura (nm) 108 ± 8 104 ± 4 118 ± 4 104 ± 3

Tabela 4.5 – Valores médios das propriedades viscoelásticas dos lipossomas POPC/SM/Chol a interagir com 750 µM de DCA a 37ºC. estimados pela ferramenta QTools. Os valores apresentados encontram-se como média ±

desvio padrão.




Espessura (nm) 106 ± 5 103 ± 6 101 ± 8 108 ± 8

Tabela 4.6 – Valores médios das propriedades viscoelásticas dos lipossomas POPC/SM a interagir com 1000 µM de DCA a 37ºC, estimados pela ferramenta Qtools. Os valores apresentados encontram-se como média ± desvio

padrão.

Parâmetros Lipossomas Hepes Ácido Hepes



Espessura (nm) 106 ± 8 107 ± 9 85 ± 7 85 ± 8

Tabela 4.7 – Valores médios das propriedades viscoelásticas dos lipossomas POPC/SM/Chol a interagir com 1000 µM de DCA a 37ºC, estimados pela ferramenta Qtools. Os valores apresentados encontram-se como média ±

desvio padrão.



Módulo cisalhamento (kPa) 4.7 ± 0.7 3.5 ± 0.2 2 ± 1 2 ± 1

Espessura (nm) 108 ± 10 108 ± 10 100 ± 10 105 ± 11

A adição de DCA aos lipossomas de POPC/SM traduz-se essencialmente num aumento da

espessura para as concentrações de 500 µM e 750 µM, podendo este aumento ser atribuído à adsorção

do DCA. Para a concentração de 1000 µM a espessura diminui em resultado da solubilização de lípidos

e consequente rutura de lipossomas. Estes resultados estão de acordo com os reportados por Schubert

et al. [19] que indicam a incorporação dos ácidos no sistema até atingir um máximo a partir do qual

promovem a disrupção dos lipossomas. No caso da mistura ternária, a espessura dos lipossomas

diminui ligeiramente com a adição do DCA e é ao nível da viscosidade e do módulo de cisalhamento

que se verificam maiores alterações, em particular, para a concentração de 1000 µM. A diminuição da

viscosidade e rigidez dos lipossomas sugere que este ácido deverá promover uma desordenação da

40

bicamada dos lipossomas que pode levar à perda de água intersticial, sem, no entanto, levar à sua

rutura.

4.2.3. Efeito do UDCA

Na figura 4.14 encontram-se representados os valores médios registados para as variações da

frequência e da dissipação, afetados dos desvios-padrão correspondentes, para os ensaios em que se

adiciona solução de UDCA (1000 µM) às camadas de lipossomas adsorvidos com composição

POPC/SM (em cima) e POPC/SM/Chol (em baixo). Gráficos análogos correspondentes às

concentrações de DCA de 500 µM e 750 µM são apresentados em anexo (figuras A.3 e A.4).


afetados do desvio padrão. Exemplo da interação de lipossomas POPC/SM (topo) e POPC/SM/Chol (em baixo) com 1 mM de UDCA. Cinzento-escuro: 3ª harmónica; cinzento médio: 5ª harmónica; cinzento: 7ª harmónica;

cinzento claro: 9ª harmónica.

Como se pode observar, a interação dos lipossomas com o UDCA é bastante pequena, observando-

se que a introdução do ácido promove uma ligeira diminuição da frequência, acompanhada por um

aumento da dissipação. Tal facto indica que deverá haver adsorção do ácido a ambos os lipossomas.

É de notar o facto de, para os lipossomas POPC/SM, após o enxaguamento final, haver a reversão dos

valores de frequência e dissipação para os observados anteriormente à promoção da interação com o

UDCA.

Na figura 4.15 comparam-se os valores médios da variação da frequência (à esquerda) e da

dissipação (à direita) da 3ª harmónica ao longo do decorrer do ensaio para as três concentrações

estudadas.

-350

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0


Δf

(Hz)

0

10

20

30

40

50

60


ΔD

(1

0-6

)

-350

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0


Δf

(Hz)

0

10

20

30

40

50

60


ΔD

(1

0-6

)

41


ao longo do decorrer do ensaio para as três concentrações estudadas. Topo: lipossomas POPC/SM; Baixo: lipossomas POPC/SM/Chol. A preto: valores médios dos lipossomas, cinzento escuro: após enxaguamento;


Analisando o efeito do UDCA com o aumento da concentração (figura 4.15) observa-se que, para a

mistura POPC/SM há uma ligeira diminuição da frequência, acompanhada por um aumento da

dissipação, quando a solução de UDCA é adicionada ao sistema. No entanto, estas variações

registadas não parecem seguir uma tendência com a variação da concentração, mantendo-se dentro

da mesma gama de valores. Em relação à mistura ternária POPC/SM/Chol apesar de pouco notório,

ocorre uma pequena variação da frequência com o aumento da concentração. Para a concentração de

500 µM, em média, não se verifica variação da frequência quando o UDCA é adicionado, no entanto,

para a concentração de 1000 µM há uma ligeira diminuição do valor registado. Os valores médios da

dissipação aumentam ligeiramente quando a solução é introduzida, não se observando uma variação

de acordo com a concentração, sendo os valores semelhantes.

Nas tabelas 4.8 a 4.13 apresentam-se os parâmetros resultantes da modelação viscoelástica dos

dados obtidos para os dois tipos de lipossomas estudados a interagir com diferentes concentrações de

UDCA (500 µM, 750 µM e 1000 µM). Os valores referem-se às situações de equilíbrio atingido após

cada introdução.

Tabela 4.8 – Valores médios das propriedades viscoelásticas dos lipossomas POPC/SM a interagir com 500 µM da UDCA a 37ºC, estimados pela ferramenta QTools. Os valores apresentados encontram-se como média ± desvio

padrão.



Módulo cisalhamento (kPa) 7 ± 3 7 ± 3 8 ± 4 8 ± 4

Espessura (nm) 96 ± 3 96 ± 3 98 ± 4 96 ± 4

-350

-300

-250

-200

-150

500 µM 750 µM 1000 µMΔ

f 3(H

z)

0

10

20

30

40

50

60

500 µM 750 µM 1000 µM

ΔD

3(1

0-6

)

-350

-300

-250

-200

-150

500 µM 750 µM 1000 µM

Δf 3

(Hz)

0

10

20

30

40

50

60

500 µM 750 µM 1000 µM

ΔD

3(1

0-6

)

42

Tabela 4.9 – Valores médios das propriedades viscoelásticas dos lipossomas POPC/SM/Chol a interagir com 500 µM da UDCA a 37ºC, estimados pela ferramenta QTools. Os valores apresentados encontram-se como média ±

desvio padrão.



Módulo cisalhamento (kPa) 6.9 ± 0.6 5 ± 1 5 ± 1 5 ± 1

Espessura (nm) 108 ± 4 108 ± 4 108 ± 4 108 ± 4

Tabela 4.10 – Valores médios das propriedades viscoelásticas dos lipossomas POPC/SM a interagir com 750 µM de UDCA a 37ºC, estimados pela ferramenta QTools. Os valores apresentados encontram-se como média ± desvio

padrão.


Viscosidade (mPa.s) 2.0 ± 0.1 2.0 ± 0.1 2,0 ± 0.1 1.9 ± 0.1

Módulo cisalhamento (kPa) 4 ± 1 4 ± 1 4.3 ± 0.7 4.0 ± 0.7

Espessura (nm) 108 ± 5 109 ± 5 116 ± 6 112 ± 6

Tabela 4.11 – Valores médios das propriedades viscoelásticas dos lipossomas POPC/SM/Chol a interagir com 750 µM de UDCA a 37ºC, estimados pela ferramenta QTools. Os valores apresentados encontram-se como média ±

desvio padrão.


Viscosidade (mPa.s) 2.5 ± 0.20 2.5 ± 0.2 2.5 ± 0.2 2.5 ± 0,2


Espessura (nm) 108 ± 3 109 ± 3 115 ± 4 113 ± 4

Tabela 4.12 – Valores médios das propriedades viscoelásticas dos lipossomas POPC/SM a interagir com 1 mM de UDCA a 37ºC, estimados pela ferramenta Qtools. Os valores apresentados encontram-se como média ± desvio

padrão.



Módulo cisalhamento (kPa) 2.4 ± 0.7 2.7 ± 0.4 4 ± 1 3 ± 1

Espessura (nm) 110 ± 5 110 ± 4 116 ± 8 114 ± 6

Tabela 4.13 – Valores médios das propriedades viscoelásticas dos lipossomas POPC/SM/Chol a interagir com 1 mM de UDCA a 37ºC, estimados pela ferramenta Qtools. Os valores apresentados encontram-se como média ±

desvio padrão.

Lipossomas Hepes Ácido Hepes


Módulo cisalhamento (kPa) 2 ± 1 3 ± 2 - -

Espessura (nm) 111 ± 2 112 ± 3 114 ± 3 112 ± 3

A introdução de UDCA 1000 µM, nos lipossomas POPC/SM, promove uma adsorção acompanhada

de um ligeiro aumento da espessura e da rigidez dos lipossomas, denotado pelo aumento do módulo

de cisalhamento e da espessura (tabela 4.12). No entanto, o efeito deverá ser superficial dado que

quando se procede ao enxaguamento final o sistema reverte para os valores semelhantes aos

previamente verificados. Em relação à mistura ternária o efeito deste ácido não é muito notório, sendo

que os parâmetros se mantêm constantes ao longo de todo o ensaio (tabela 4.13).

O mesmo é observado para as restantes concentrações estudadas, sendo que as propriedades

viscoelásticas se mantêm inalteradas ao longo do ensaio (tabelas 4.8 a 4.11).

43

4.2.4. Efeito da Mistura 1:1 DCA/UDCA

Na figura 4.16 apresentam-se os valores médios dos desvios da frequência e da dissipação, com

os respetivos desvios-padrão, observados quando se adiciona solução composta pela mistura 1:1

DCA/UDCA (1000 µM) às camadas de lipossomas adsorvidos com composição POPC/SM (em cima)

e POPC/SM/Chol (em baixo). Gráficos análogos correspondentes às concentrações de 1:1 DCA/UDCA

de 500 µM e 750 µM são apresentados em anexo (figuras A.5 e A.6).


afetados do desvio padrão. Exemplo da interação de lipossomas POPC/SM (topo) e POPC/SM/Chol (em baixo) com 1 mM da mistura 1:1 DCA/UDCA. Cinzento-escuro: 3ª harmónica; cinzento médio: 5ª harmónica; cinzento:

7ª harmónica; cinzento claro: 9ª harmónica.

Como se pode observar, a interação com a mistura 1:1 dos ácidos biliares com os lipossomas

promove uma diminuição de frequência, acompanhada de aumento da dissipação. A grande diferença

entre os dois sistemas é a notória reversibilidade do efeito para os lipossomas POPC/SM

Na figura 4.17, encontram-se representadas as variações observadas na 3ª harmónica para os

valores de frequência e dissipação, sendo notório o efeito que o enxaguamento final tem na mistura

binária, para todas as concentrações, observando-se a reversão para os valores anteriores à introdução

da solução dos ácidos.

-350

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0


Δf

(Hz)

0

10

20

30

40

50

60


ΔD

(1

0-6

)

-350

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0


Δf

(Hz)

0

10

20

30

40

50

60

70


ΔD

(1

0-6

)

44


ao longo do decorrer do ensaio para as três concentrações estudadas. Topo: lipossomas POPC/SM; Baixo: lipossomas POPC/SM/Chol. A preto: valores médios dos lipossomas, cinzento escuro: após enxaguamento;


Observa-se a diminuição da frequência, acompanhado de um aumento da dissipação quando se

introduz a solução 1:1 DCA/UDCA 1000 µM. Verificando-se que, para a mistura binária, este efeito é

reversível, ao contrário da mistura ternária onde após o enxaguamento final, apesar de uma ligeira

alteração dos valores estes mantêm-se mais elevados que antes da adição da mistura 1:1 DCA/UDCA.

Para os lipossomas POPC/SM/Chol, a variação dos valores é proporcional à concentração da

solução, sendo que para os lipossomas POPC/SM, para a concentração de 1000 µM se observa uma

estabilização da variação detetada.

Nas tabelas 4.14 a 4.19 apresentam-se os parâmetros resultantes da modelação viscoelástica dos

dados obtidos para os dois tipos de lipossomas estudados a interagir com diferentes concentrações da

mistura 1:1 DCA/UDCA (500 µM, 750 µM e 1000 µM). Os valores referem-se às situações de equilíbrio

atingido após cada introdução.

Tabela 4.14 – Valores médios das propriedades viscoelásticas dos lipossomas POPC/SM a interagir com 500 µM da mistura equimolar DCA:UDCA a 37ºC, estimados pela ferramenta QTools. Os valores apresentados encontram-se como média ± desvio padrão.




Espessura (nm) 107 ± 9 107 ± 8 117 ± 7 109 ± 7

-400

-350

-300

-250

-200

-150

500 µM 750 µM 1000 µMΔ

f 3(H

z)

0

10

20

30

40

50

60

500 µM 750 µM 1000 µM

ΔD

3(1

0-6

)-400

-350

-300

-250

-200

-150

500 µM 750 µM 1000 µM

Δf 3

(Hz)

0

10

20

30

40

50

60

500 µM 750 µM 1000 µMΔ

D3

(10

-6)

45

Tabela 4.15 – Valores médios das propriedades viscoelásticas dos lipossomas POPC/SM/Chol a interagir com 500 µM da mistura equimolar DCA:UDCA a 37ºC, estimados pela ferramenta QTools. Os valores apresentados encontram-se como média ± desvio padrão.



Módulo cisalhamento (kPa) 0.8 ± 0.6 0.9 ± 0.6 - -

Espessura (nm) 110 ± 9 104 ± 3 116 ± 9 114 ± 8

Tabela 4.16 – Valores médios das propriedades viscoelásticas dos lipossomas POPC/SM a interagir com 750 µM da mistura equimolar DCA:UDCA a 37ºC, estimados pela ferramenta QTools. Os valores apresentados encontram-se como média ± desvio padrão.




Espessura (nm) 109 ± 7 101 ± 7 112 ± 9 108 ± 9

Tabela 4.17 – Valores médios das propriedades viscoelásticas dos lipossomas POPC/SM/Chol a interagir com 750 µM da mistura equimolar DCA:UDCA a 37ºC, estimados pela ferramenta QTools. Os valores apresentados encontram-se como média ± desvio padrão.




Espessura (nm) 107 ± 5 107 ± 5 116 ± 6 113 ± 6

Tabela 4.18 – Valores médios das propriedades viscoelásticas dos lipossomas POPC/SM a interagir com 1 mM da mistura 1:1 DCA/UDCA a 37ºC, estimados pela ferramenta Qtools. Os valores apresentados encontram-se como média ± desvio padrão.




Espessura (nm) 108 ± 6 109 ± 7 124 ± 13 113 ± 14

Tabela 4.19 – Valores médios das propriedades viscoelásticas dos lipossomas POPC/SM/Chol a interagir com 1 mM da mistura 1:1 DCA/UDCA a 37ºC, estimados pela ferramenta Qtools. Os valores apresentados encontram-se como média ± desvio padrão.




Espessura (nm) 111 ± 4 112 ± 4 126 ± 4 121 ± 5

A mistura equimolar DCA:UDCA (1000 µM) induz um aumento da espessura das camadas de

lipossomas de POPC/SM bem como de POPC/SM/Chol (tabela 4.18 e 4.19), o que indica que a mistura

dos ácidos mostra um efeito sinergístico, em que a ação fluidificante do DCA, promove uma inserção

simultânea do UDCA, que não ocorre quando isolado (tabelas 4.8 e 4.9).

É interessante notar (nas tabelas 4.14 a 4.19) que o efeito da mistura de ácidos a nível da

viscosidade dos sistemas é desprezável em ambos os casos. Este efeito poderá ser devido ao facto do

UDCA poder exercer funções semelhantes às do Chol como estruturante da membrana,

contrabalançando o efeito fluidizante do DCA [17].

A comparação das tabelas 4.14 a 4.19 mostra que, em geral, o efeito da mistura dos ácidos aumenta

com a concentração, embora não muito significativamente. Para as três concentrações testadas

46

confirma-se que o efeito do enxaguamento final só é importante para a mistura binária. Assim se pode

concluir que há uma interação preferencial dos ácidos com o colesterol desde que eles tenham

conseguido penetrar na bicamada.


O colesterol aumenta a viscosidade dos lipossomas;

O DCA diminui a viscosidade dos lipossomas constituídos pela mistura ternária e adsorve-se

aos lipossomas de mistura binária, a baixas concentrações, enquanto, a altas concentrações,

solubiliza alguns lípidos provocando a rutura de lipossomas de mistura binária;

O UDCA afeta muito pouco os lipossomas de ambas as composições, adsorvendo-se

ligeiramente aos lipossomas, da mistura binária;

A mistura DCA:UDCA 1:1 induz um aumento da espessura das camadas de ambos os

lipossomas aliando à ação fluidificante do DCA, a possibilidade de inserção do UDCA. A

principal diferença entre a mistura binária e a ternária é a irreversibilidade do efeito dos ácidos

que parece ocorrer só na mistura ternária, o que indica que poderá haver uma interação

preferencial dos ácidos com o colesterol, impedindo (parcialmente) o seu arrastamento quando

se faz o enxaguamento. No caso dos lipossomas POPC/SM não haverá interação preferencial

com os fosfolípidos, os ácidos poderão ser arrastados pelo tampão de enxaguamento

(HEPES).

4.3. DSC


Na figura 4.18 apresentam-se os termogramas para os dois tipos de lipossomas estudados neste

trabalho. Optou-se por utilizar os dados relativos ao 3º ciclo de aquecimento, tendo-se observado uma

reversibilidade do sistema.

Figura 4.18 – Termogramas para os lipossomas puros. A curva a cinzento representa a mistura binária POPC/SM e a preta a mistura ternária, POPC/SM/Chol.

Da análise dos termogramas é possível afirmar que para os lipossomas constituídos por POPC/SM

há uma transição de fase, denotada pelo pico observado, com uma Tt de cerca de 23,2°C, ao contrário

-0,0013

-0,0012

-0,0012

-0,0012

10 20 30 40 50

Cp

(c

al/

mo

l.°C

)

T (°C)

47

dos constituídos pela mistura POPC/SM/Chol, onde não é observada transição. Acerca dos lipossomas

correspondentes à mistura binária, é importante referir que, neste termograma, não é possível

determinar a temperatura de início de transição, devido a restrições impostas pelo equipamento, mas

que esta será inferior a 10ºC e terminando a cerca de 38ºC.

O POPC apresenta uma insaturação numa das suas cadeias de acilo, o que confere maior entropia

ao sistema, tendo como consequência uma temperatura de transição baixa, cerca de -2ºC [156]. A

esfingomielina possui duas cadeias saturadas o que proporciona uma maior organização em relação

ao POPC, tendo uma Tt de cerca de 35ºC [157]. Assim lipossomas constituídos por estes dois

componentes têm uma temperatura de transição intermédia dado a interferência que o POPC induz na

organização das cadeias da esfingomielina.

A introdução de colesterol promove uma maior organização do sistema, por interação preferencial

com a esfingomielina. É assim expectável que a Tt dos lipossomas compostos pela mistura ternária

seja superior à da mistura binária. No entanto, a adição de mais de 20-30% de colesterol a sistemas

com esfingomielina faz desaparecer a transição de fase [84],[158], o que corrobora o facto de não ser

observável uma transição de fase do termograma. Dados de Raios-X também demonstram que, apesar

do favorecimento do aparecimento de micro-domínios mais rígidos no lipossoma, havendo uma

coexistência das duas fases [34],[159],[84],[158].


Na figura 4.19 apresentam-se os termogramas para os lipossomas POPC/SM a interagir com

diferentes concentrações de DCA.

Figura 4.19 – Do lado esquerdo encontram-se representados os termogramas para a mistura binária POPC/SM sujeitos a interação com concentrações crescentes de DCA. A preto encontra-se o termograma dos lipossomas;

tracejado 500 µM, cinzento escuro 700 µM e cinzento claro 900 µM. Na figura do lado direito apresenta-se a influência que a concentração de DCA provoca na Tt.

O DCA induz uma diminuição da Tt dos lipossomas POPC/SM, bem como uma temperatura de final

de transição tanto menor, quanto maior for a concentração do ácido em questão, o que indica que

haverá uma diminuição gradual do ΔH. Dado que o comportamento termotrópico dos lipossomas é

bastante sensível a alterações organizacionais das bicamadas lipídicas, observa-se um abaixamento

da Tt quando fatores externos interferem (reduzem) na sua organização [158]. Assim, de acordo com

-0,00030

-0,00025

-0,00020

-0,00015

-0,00010

-0,00005

0,00000

10 20 30 40 50

Cp

(ca

l/m

ol.°

C)

T (°C)

19

20

21

22

23

24

25

26

0 500 1000

T (°C

)

C (µM)

48

este princípio e com a diminuição do ΔH observada, o DCA deverá ter um efeito desorganizador a nível

da membrana lipídica, corroborando os efeitos fluidificantes deste ácido [153].

Figura 4.20 – Termogramas para a mistura ternária POPC/SM/Chol sujeitos a interação com concentrações crescentes de DCA. A preto encontra-se o termograma dos lipossomas; tracejado 500 µM, cinzento escuro 700

µM e cinzento claro 900 µM.

Na figura 4.20 encontram-se representados os termogramas correspondentes à ação do DCA

nos lipossomas constituídos por POPC/SM/Chol. É possível observar um ligeiro desvio do termograma

para temperaturas inferiores, não sendo observável uma transição de fase nesta gama de

temperaturas. Não é, no entanto, possível concluir com certeza de que maneira este ácido influencia

estes tipo de lipossomas.


Figura 4.21 – Do lado esquerdo encontram-se representados os termogramas para a mistura binária POPC/SM sujeitos a interação com concentrações crescentes de UDCA. A preto encontra-se o termograma dos

lipossomas; tracejado 500 µM, cinzento escuro 700 µM e cinzento claro 900 µM. Na figura do lado direito apresenta-se a influência que a concentração de UDCA provoca na Tt.

Observando os termogramas apresentados na figura 4.21, é possível concluir que o UDCA

provoca um alargamento da transição, acompanhado de um aumento da Tt, com o aumento da

concentração. Mouaz et al. [18] defendem que este ácido poderá ter funções semelhantes às do

colesterol, ou seja, promover a rigidificação das membranas, o que estaria de acordo com o aumento

da Tt observado.

-0,0012

-0,0012

-0,0012

-0,0012

-0,0011

-0,0011

10 20 30 40 50

Cp

(c

al/°C

.mo

l)

T(°C)

-0,00030

-0,00025

-0,00020

-0,00015

-0,00010

-0,00005

0,00000

10 20 30 40 50

Cp

(ca

l/m

ol.°

C)

T (°C)

19

20

21

22

23

24

25

26

0 500 1000

T (°C

)

C (µM)

49


Figura 4.22 – Do lado esquerdo encontram-se representados os termogramas para a mistura binária POPC/SM sujeitos a interação com concentrações crescentes da mistura equimolar de DCA/UDCA. A preto encontra-se o termograma dos lipossomas; tracejado 500 µM, cinzento escuro 700 µM e cinzento claro 900 µM. Na figura do

lado direito apresenta-se a influência que a concentração da mistura DCA/UDCA provoca na Tt, apresentando-se a preto os valores obtidos experimentalmente e a cinzento os valores que calculados pela média aritmética dos

valores obtidos para as Tt de cada ácido em separado.

O efeito desencadeado pela mistura dos dois ácidos estudados (figura 4.22) aparenta ser

semelhante ao observado no UDCA, promovendo um aumento da Tt. Este efeito misto poderá ser

devido à incorporação de ambos os ácidos sendo havendo um efeito rigidificante oferecido pelo UDCA,

mas com a incorporação de DCA os lipossomas há também uma desestabilização dos mesmos, sendo

que, apesar de um aumento da Tt, a temperatura de final de transição é cada vez menor com o aumento

da concentração. Quando se comparam as Tt obtidas experimentalmente com as que seriam

registadas, caso a influência de cada ácido fosse cumulativa, nota-se que seriam mais baixas. Assim

comprova-se que a rigidificação promovida pelo UDCA se sobrepõe à fluidificação/desorganização

promovida pelo DCA.


A introdução de colesterol na composição dos lipossomas faz desaparecer a transição de fase

para as proporções estudadas;

O DCA provoca uma diminuição da Tt, bem como da entalpia de transição de fase nos lipossomas

de composição binária, o que indica uma destabilização do sistema;

A adição de UDCA aos lipossomas de composição binária leva a um aumento da Tt o que indica

uma rigidificação do sistema;

A mistura 1:1 segue um comportamento semelhante ao observado com a adição de UDCA, sendo

de notar um efeito sinergístico entre os ácidos, sendo que ao efeito fluidificante do DCA se

sobrepõe a rigidificação imposta pelo UDCA, havendo assim um aumento da Tt.

-0,00030

-0,00025

-0,00020

-0,00015

-0,00010

-0,00005

0,00000

10 20 30 40 50

Cp

(ca

l/m

ol.°

C)

T (°C)

19

20

21

22

23

24

25

26

0 500 1000

T (°C

)

C (µM)

1:1 DCA/UDCA

1:1 DCA/UDCA Teor

50

4.4. 31P-NMR


Figura 4.23 – Espectros de 31P-NMR para os lipossomas POPC/SM (a preto) e POPC/SM/Chol (a cinzento), para as temperaturas de 12ºC (esquerda), 25ºC (centro) e 37ºC (direita).

Na figura 4.23 apresentam-se os espectros de 31P NMR para os lipossomas constituídos por

POPC/SM (a preto) e POPC/SM/Chol (a cinzento).

Na figura 4.23, observa-se que a 12ºC, para a mistura binária POPC/SM (a preto), o espectro

apresenta um pico a desvios químicos altos e um “ombro” a desvios químicos baixos. Este tipo de

espectro corresponde ao típico espectro de bicamadas lipídicas, onde há coexistência de fases líquida

desordenada e líquida ordenada [140]. A 25ºC o desvio do pico para campos mais baixos indica um

aumento da mobilidade dos lípidos. Além do estreitamento da base do espectro, quando comparando

com os espectros já conhecidos, típicos de diversas estruturas lipídicas, este espectro assemelha-se

ao espectro de uma fase “hexagonal” na qual os lípidos, apesar de aglomerados, têm menor restrição

de movimentos [140]. Com a evolução da temperatura observa-se a deslocação do pico máximo para

o lado esquerdo do espectro sendo que, a 37ºC, não se observa nenhum “ombro”, ou seja, a

movimentação é livre, o que indica a existência de uma fase única e desordenada, que corrobora com

o facto de a esta temperatura a mistura se encontrar num estado líquido desordenado [155].

Para a mistura ternária (figura 4.23, a cinzento), a 12ºC, apenas se observa um pico a desvios

químicos elevados, não se observando um “ombro” a desvios químicos mais baixos, visto que a fase

predominante a esta temperatura é a líquida ordenada [85]. Observa-se um alargamento da largura na

base do espectro com o aumento da temperatura, tal deverá estar relacionado com o facto de o

colesterol promover propriedades fluidificantes a baixas temperaturas, mas promover a rigidificação a

temperaturas mais elevadas, permitindo a manutenção de uma fase líquida ordenada [22].

51


Figura 4.24 – Espectros de 31P-NMR para os lipossomas POPC/SM (à esquerda, cinzento escuro) e POPC/SM/Chol (à direita, cinzento escuro) e o espectro da interação destes lipossomas com o DCA (cinzento

claro) para as temperaturas de 12ºC (topo), 25ºC (centro) e 37ºC (baixo).

Na Figura 4.24 encontram-se representados os espectros dos lipossomas POPC/SM e

POPC/SM/Chol, bem como dos espectros resultantes da interação destes lipossomas com uma

solução de DCA (concentração final de 1.5 mM).

Analisando em primeiro lugar o efeito do DCA na mistura binária (figura 4.24, à esquerda), é notório

que, a 12ºC, apesar de um alargamento da linha do espetro, há o aparecimento de um pico que poderá

corresponder a uma componente isotrópica. Este pico poderá ser explicado pelo aparecimento de uma

fase mais desorganizada enquanto que os lipossomas não afetados darão origem ao sinal típico das

bicamadas.

Ainda na mesma figura, a 25ºC pode-se observar que os espectros são bastante semelhantes, o

que indica que o DCA não deverá promover a dissolução dos lipossomas, mas sim a incorporação nos

mesmos. De acordo com os dados obtidos por DSC a esta temperatura (25ºC) em ambos os casos os

lipossomas encontram-se na transição de fase, e portanto ainda não estão numa fase desordenada

onde o movimento não é totalmente isotrópico.

A 37ºC, a diminuição da largura do pico está de acordo com o efeito fluidificante do DCA sobre a

bicamada de mistura binária mas não explica a possível dissolução de lípidos e rutura de lipossomas

observada para a maior concentração estudada com a QCM-D.

Para a mistura ternária (figura 4.24, à direita) observa-se um afilamento do pico, o que implica que

o DCA interage com os lipossomas, tendo um efeito desorganizador da bicamada. Tal é bastante visível

a temperaturas superiores (37ºC) onde, se observa um único pico, em contraste com um espectro mais

52

alargado da mistura ternária, que deve corresponder ao efeito fluidificante do DCA sobre a fase mais

ordenada.


Figura 4.25 – Espectros de 31P-NMR para os lipossomas POPC/SM (à esquerda, cinzento escuro) e POPC/SM/Chol (à direita, cinzento escuro) e o espectro da interação destes lipossomas com o UDCA (cinzento

claro) para as temperaturas de 12ºC (topo), 25ºC (centro) e 37ºC (baixo).

Na Figura 4.25 encontram-se representados os espectros dos lipossomas POPC/SM e

POPC/SM/Chol, bem como dos espectros resultantes da interação destes lipossomas com uma

solução de UDCA (concentração final de 1,5 mM).

Em todos os espectros obtidos após a adição do UDCA, verifica-se um alargamento da base do

espectro para a qual não foi encontrada explicação. No entanto, pela análise exclusiva dos picos é

possível concluir que não há praticamente alteração dos movimentos das cabeças polares dos lípidos.

Para os lipossomas constituídos pela mistura binária, a 25ºC, observa-se um alargamento do pico

original que poderá ser atribuído ao efeito organizador do UDCA, já referido anteriormente quando da

análise dos termogramas (secção 4.3.3). Este efeito, semelhante ao do colesterol, pode restringir os

movimentos das cabeças polares e, assim, aumentar a anisotropia do sinal.

53


Figura 4.26 – Espectros de 31P-NMR para os lipossomas POPC/SM (à esquerda, cinzento escuro) e POPC/SM/Chol (à direita, cinzento escuro) e o espectro da interação destes lipossomas com a mistura 1:1

DCA/UDCA (cinzento claro) para as temperaturas de 12ºC (topo), 25ºC (centro) e 37ºC (baixo).

O efeito da mistura 1:1 DCA:UDCA, como se pode observar na figura 4.26, assemelha-se mais ao

efeito do DCA para os lipossomas de mistura ternária, e ao do UDCA, para os lipossomas de mistura

binária.

De facto, a mistura de ácidos provoca um ligeiro estreitamento do pico na mistura ternária a 37ºC,

consistente com uma fluidificação da bicamada.

Já para a mistura binária, a 25ºC, se observa um alargamento do pico que poderá ser atribuído a

um aumento da organização da bicamada.


O colesterol promove a organização/rigidez dos lipossomas;

O DCA destabiliza os lipossomas, provocando uma ligeira diminuição da anisotropia resultante da

fluidificação das fases mais ordenadas;

O UDCA tem um efeito muito pequeno sobre os lipossomas, sendo ligeiramente mais significativo

na mistura binária onde induz alguma organização da bicamada;

A mistura dos dois ácidos promove uma rigidificação da bicamada da mistura binária tal como

ocorre com o UDCA, no entanto, no que respeita à mistura ternária, parece haver uma maior

mobilidade das cabeças dos fosfolípidos, podendo indicar a fluidificação destes lipossomas;

As discrepâncias observadas entre os resultados dos espectros de 31P-NMR e os resultados das

outras técnicas podem ser explicadas porque a técnica de NMR só é sensível aos movimentos

das cabeças polares dos lípidos.

54

5. Conclusões e Trabalho Futuro

Em geral, o efeito do DCA é o de penetração nas monocamadas e bicamadas lipídicas, provocando

uma fluidificação das mesmas. Este efeito é tanto maior quanto maior for a sua concentração e pode

culminar com a dissolução dos lípidos para concentrações elevadas. Tendencialmente, o DCA tem

maior efeito sobre a mistura binária do que para a mistura ternária, mas, em virtude da especificidade

de cada técnica e do respetivo modelo membranar testado, é difícil fazer comparações diretas. Os

resultados obtidos com as monocamadas mostram que o DCA se incorpora em maior extensão na

monocamada de POPC/SM do que na de POPC/SM/Chol. No caso dos lipossomas adsorvidos, a

interação do DCA com os lipossomas de composição POPC/SM é claramente mais forte para elevadas

concentrações (1000 µM) levando à solubilização de lípidos, o que não acontece aos lipossomas que

contém colesterol. As concentrações mais baixas, o DCA adsorve-se à superfície dos lipossomas de

composição POPC/SM e origina uma ligeira fluidificação dos lipossomas de POPC/SM/Chol. As

técnicas de DSC e 31P-NMR também indicaram uma fluidificação dos lipossomas pela interação com o

DCA mas não permitiram concluir definitivamente sobre o efeito preferencial deste ácido relativamente

às misturas lipídicas com ou sem colesterol

O UDCA tem um efeito protetor das monocamadas e bicamadas, induzindo a sua organização. Os

resultados obtidos com a balança de Langmuir indicam que este ácido deverá promover a estabilização

das monocamadas, com e sem colesterol, através de interações com as suas cabeças polares, e a

mesma conclusão se obtém com as determinações de DSC que mostram o efeito rigidificador do UDCA

nos lipossomas de composição binária. Através das técnicas de QCM-D e 31P-NMR foi possível concluir

que a interação do UDCA com ambos os tipos de lipossomas era muito pequena, mas no caso da

mistura binária verificou-se um ligeiro aumento da rigidez destes lipossomas.

O efeito da mistura 1:1 DCA/UDCA sobre os vários modelos membranares depende da técnica

utilizada, mas, em geral, reflete uma cooperação entre os dois ácidos. Relativamente aos resultados

obtidos no estudo das monocamadas, observa-se uma inserção simultânea dos ácidos para ambas as

misturas lipídicas, indicando que o efeito fluidificante do DCA sobre a monocamada promove a

interação com o UDCA. Resultados semelhantes foram obtidos com os lipossomas adsorvidos

estudados com a microbalança QCM-D. Através da modelação dos parâmetros viscoelásticos,

observa-se este mesmo efeito em ambos os lipossomas estudados (POPC/SM e POPC/SM/Chol),

traduzido no aumento da espessura dos lipossomas, e na ausência de perturbações na sua

viscosidade. Os resultados de DSC, relativos apenas aos lipossomas constituídos por POPC/SM,

parecem indicar uma pequena rigidificação dos lipossomas, efeito semelhante ao obtido com a adição

de UDCA mas mais atenuado. Isto pode significar que, neste caso, prevaleceu o efeito do UDCA,

apesar de alguma fluidificação por parte do DCA. Este efeito é corroborado pelos resultados de 31P-

NMR, em que a mistura 1:1 DCA/UDCA induz um aumento da largura do espectro dos lipossomas de

POPC/SM, tal como no caso do UDCA. Os espectros 31P-NMR, correspondentes à mistura ternária,

mostram uma ligeira fluidificação da bicamada semelhante à provocada pelo DCA mas, de menor

intensidade. As discrepâncias observadas entre os resultados de 31P-NMR são, de certo modo,

55

expectáveis porque esta técnica dá informação sobre a mobilidade das cabeças polares dos lípidos e

é pouco sensível ao comportamento do interior das bicamadas.

Através deste estudo foi possível confirmar o efeito desorganizador que o DCA tem sobre os

sistemas lipídicos, em especial na ausência de colesterol, e o efeito contrário por parte do UDCA. No

entanto, as conclusões mais interessantes dizem respeito ao efeito sinergístico dos ácidos misturados

e, em particular, à irreversibilidade do seu efeito sobre os lipossomas de POPC/SM/Chol o que sugere

uma interação preferencial com o colesterol que promove a retenção dos ácidos.

No futuro, seria interessante promover estudos no sentido de compreender melhor a natureza das

interações destes ácidos, em particular, das suas misturas, com os modelos biomembranares, dado

que os resultados obtidos não foram inequívocos. Técnicas microscópicas como a Microscopia de

Força Atómica (AFM) e a microscopia de ângulo de Brewster seriam importantes para a visualização

do efeito dos ácidos, respetivamente, sobre os lipossomas adsorvidos e sobre as monocamadas.

Estudos recorrendo a 1H-NMR permitiriam determinar a organização das cadeias de acilo dos

fosfolípidos, o que seria um indicativo do efeito a nível intra-membranar. Construir lipossomas incluindo

os ácidos biliares na sua composição, utilizando as técnicas empregues neste trabalho, forneceria

informação adicional sobre de que modo a incorporação dos ácidos nos lipossomas afeta as

características dos mesmos.

56

Bibliografia

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A-1

Anexos

A. Dados adicionais sobre os resultados e a modelação QCM-D

1. Interação com DCA

Figura A.1 – Desvios de frequência (à esquerda) e de dissipação (à direita) observados ao longo do ensaio

afetados do desvio padrão. Exemplo da interação de lipossomas POPC/SM (topo) e POPC/SM/Chol (baixo) com 500 µM de DCA. Cinzento escuro: 3ª harmónica; cinzento médio: 5ª harmónica; cinzento: 7ª harmónica; cinzento



afetados do desvio padrão. Exemplo da interação de lipossomas POPC/SM (topo) e POPC/SM/Chol (baixo) com 750 µM de DCA. Cinzento escuro: 3ª harmónica; cinzento médio: 5ª harmónica; cinzento: 7ª harmónica; cinzento


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A-2

2. Interação com UDCA

Figura A.3 – Desvios de frequência (à esquerda) e de dissipação (à direita) observados ao longo do ensaio afetados do desvio padrão. Exemplo da interação de lipossomas POPC/SM (topo) e POPC/SM/Chol (baixo) com

500 µM da UDCA. Cinzento escuro: 3ª harmónica; cinzento médio: 5ª harmónica; cinzento: 7ª harmónica; cinzento claro: 9ª harmónica.




harmónica; cinzento: 7ª harmónica; cinzento claro: 9ª harmónica.

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A-3

3. Interação com a mistura equimolar DCA/UDCA

Figura A.5 – Desvios de frequência (à esquerda) e de dissipação (à direita) observados ao longo do ensaio afetados do desvio padrão. Exemplo da interação de lipossomas POPC/SM (topo) e POPC/SM/Chol (baixo) com

500 µM da mistura equimolar DCA:UDCA. Cinzento escuro: 3ª harmónica; cinzento médio: 5ª harmónica; cinzento: 7ª harmónica; cinzento claro: 9ª harmónica.


afetados do desvio padrão. Exemplo da interação de lipossomas POPC/SM (topo) e POPC/SM/Chol (baixo) com

750 µM da mistura equimolar DCA:UDCA. Cinzento escuro: 3ª harmónica; cinzento médio: 5ª harmónica;

cinzento: 7ª harmónica; cinzento claro: 9ª harmónica.

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interação de dois ácidos biliares, um citotóxico e um

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