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INSTITUTO POLITEacuteCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOacuteGICAS
INFORME TEacuteCNICO FINAL
ESTUDIO DE ALGUNAS VARIABLES AMBIENTALES
QUE AFECTAN LA BIORREDUCCIOacuteN DE
CROMO HEXAVALENTE [Cr(VI)]
Clave SIP 20071302
Director del Proyecto Dr ELISEO CRISTIANI URBINA
MEacuteXICO DF ENERO DE 2008
2
RESUMEN
Los objetivos principales de este trabajo fueron evaluar la influencia del ioacuten sulfato sobre
la tolerancia al Cr(VI) y la reduccioacuten del mismo por una cepa de Candida sp aislada a
partir del agua residual de una curtiduriacutea asiacute como seleccionar el sistema de reaccioacuten
maacutes conveniente para la reduccioacuten del metal cuando la levadura se cultiva en un
contactor gasliacutequido del tipo airlift con tubo conceacutentrico
En ausencia de Cr(VI) el sulfato no tuvo efecto ni estimulador ni inhibidor sobre el
crecimiento de la levadura cuando se utilizaron medios de cultivo con diferentes
concentraciones de sulfato En contraste en presencia de Cr(VI) el crecimiento de la
levadura y la reduccioacuten del Cr(VI) dependieron de las concentraciones de sulfato y de
Cr(VI) ensayadas Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM las
mayores velocidades especiacuteficas de crecimiento eficiencias y velocidades volumeacutetricas
globales de reduccioacuten del metal se obtuvieron con concentraciones de sulfato de 10 a
2392 mM Sin embargo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM la velocidad
especiacutefica de crecimiento eficiencia y velocidad de reduccioacuten del metal se incrementaron
a medida que aumentoacute la concentracioacuten de sulfato Estos resultados indican que el
sulfato desempentildea un papel importante en la tolerancia al Cr(VI) y la reduccioacuten del
mismo en la cepa de levadura utilizada en este trabajo
Asimismo el estudio cineacutetico del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de
Cr(VI) por ceacutelulas de Candida sp cultivadas en diferentes sistemas de reaccioacuten (cultivo
por lote cultivo por lote repetido cultivo continuo de una etapa cultivo por lote
alimentado y cultivo por lote alimentado repetido) en un biorreactor airlift con tubo
conceacutentrico indica que el cultivo por lote es el maacutes adecuado para la reduccioacuten de 15
mM de Cr(VI) ya que en este sistema se alcanzan niveles altos de eficiencia (100) y
velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal [164 mgLh]
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I INTRODUCCIOacuteN
11 Generalidades
Las actividades antropogeacutenicas han ocasionado gran deterioro y contaminacioacuten del medio
ambiente debido a que los recursos naturales se han utilizado inadecuadamente y a las
malas praacutecticas de almacenamiento e incorrecta disposicioacuten de los residuos generados
(Ishibashi y col 1990 Rege y col 1997)
Entre los contaminantes presentes en agua aire y suelo que requieren mayor atencioacuten
se encuentran los metales pesados ya que algunos de ellos son altamente toacutexicos
carcinogeacutenicos mutageacutenicos y teratogeacutenicos (Wang 2000) Ademaacutes a diferencia de los
compuestos orgaacutenicos los metales pesados no pueden ser degradados ni quiacutemica ni
bioloacutegicamente por lo que permanecen indefinidamente en el medio ambiente
(Cervantes y col 2001) y de manera eventual se acumulan a traveacutes de la cadena
troacutefica lo que incrementa los riesgos para la salud de los seres vivos (Volesky y Vieira
2000) Los metales pesados maacutes toacutexicos para el ser humano son el plomo mercurio
cadmio arseacutenico y el cromo
Para disminuir su toxicidad facilitar su desecho o su reutilizacioacuten los metales pesados
pueden ser sometidos a procesos que provocan cambios en su estado fiacutesico yo en su
estado de oxidacioacuten (Ruiacutez 2000)
12 Cromo
El cromo es el veintiunavo elemento maacutes abundante en la tierra Se le encuentra en
muy diversos ambientes tales como en los oceacuteanos aguas superficiales y subterraacuteneas
suelos rocas aire seres vivos y en alimentos (Guertin y col 2005) Es un metal de
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transicioacuten de color gris que ocupa el nuacutemero 24 en la Tabla Perioacutedica y tiene un peso
atoacutemico de 52
Fue descubierto en 1797 por Louis Vauquelin y se utilizoacute primeramente como pigmento
Su nombre proviene de la palabra griega ―chrocircma que significa color como referencia a
los diferentes colores que presentan sus compuestos Su punto de fusioacuten es de 1857 degC y
el de ebullicioacuten es de 2672 degC Su densidad es de 719 gcm3 (Barnhart 1997
httpwwwchemicalelementscomelementscrhtml)
El cromo existe en varios estados de oxidacioacuten del -2 al +6 siendo los maacutes estables en
el medio ambiente natural el cromo metaacutelico [Cro o Cr(0)] el trivalente [Cr3+ o Cr(III)] y
el hexavalente [Cr6+ o Cr(VI)] los cuales presentan propiedades fisicoquiacutemicas diferentes
(Jianlong y col 2004 Viamajala y col 2004)
El cromo tiene una alta resistencia a la corrosioacuten al desgaste por friccioacuten y al impacto
asiacute como una gran dureza a alta temperatura (Barnhart 1997) entre otras propiedades
que lo hacen muy atractivo para su uso en diversos sectores industriales tales como en
la galvanoplastia en curtiduriacuteas de piel en la fabricacioacuten de tintes y pigmentos para
pinturas y textiles en la produccioacuten de acero inoxidable de productos refractarios de
inhibidores de la corrosioacuten de tintas para maacutequinas de copiado de conservadores de la
madera asiacute como para el pulido de metales (Smith y Gadd 2000
httpwwwatsdrcdcgovfacts7 html)
La principal fuente de cromo es el mineral conocido como cromita o ferrocromo
(FeCr2O4) Para el antildeo 2003 se reportoacute una produccioacuten mundial de cromita de 15500
5
millones de toneladas cuacutebicas de las cuales el 912 fue utilizada por la industria
metaluacutergica el 52 por la industria quiacutemica el 28 por la industria de la fundicioacuten y el
08 por la industria refractaria
(httpmineralserusgsgovmineralspubscommoditychromium180494pdf) Los
principales paiacuteses productores de cromita son Sudaacutefrica Kazakhstan India Zimbawe
Finlandia Brasil y Turquiacutea
(httpmineralserusqsgovmineralspubscommoditychromium180494pdf)
El cromo metaacutelico [Cr(0)] no se encuentra en forma natural en el medio ambiente sino
que es generado por procesos industriales Se le usa principalmente en la produccioacuten de
acero y de otras aleaciones metaacutelicas (httpwwwatsdrcdcgovfacts7html)
El cromo trivalente se encuentra en la naturaleza en minerales por ejemplo como
cromato de fierro (FeCr2O4) Este estado de oxidacioacuten del cromo forma precipitados de
oacutexidos hidroacutexidos o sulfatos y por consiguiente es menos moacutevil que la forma
hexavalente En el suelo se le encuentra unido principalmente a la materia orgaacutenica
(Jianlong y col 2004 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004 Cervantes y col 2001)
El cromo trivalente es un nutriente esencial tanto para los seres humanos como para los
animales ya que tiene un papel importante en el metabolismo de la glucosa de liacutepidos y
de proteiacutenas Asimismo se considera que potencia el reconocimiento de la insulina por
las ceacutelulas por lo que podriacutea tener aplicaciones para el tratamiento de la diabetes
(Garbisu y col 1998 Wang 2000 Lloyd 2003 Ksheminska y col 2005)
6
La FDA (Food and Drug Administration) ha propuesto un consumo diario (Reference Daily
Intake) de cromo de 120 gd en adultos (httpwwwepagoviris) Algunas fuentes de
cromo son el broacutecoli la levadura de cerveza el hiacutegado quesos granos integrales y
cereales (Guertin y col 2005)
No es comuacuten encontrar cromo hexavalente en forma natural en el medio ambiente y
cuando se le encuentra generalmente es como cromato de plomo PbCrO4
(httpwwwatsdrcdcgovfacts7html) Su presencia en el ambiente se debe
principalmente a las actividades realizadas por el hombre (wwwclu-
inorgdownloadstudentpapersbio_of_metals_paperpdf) En soluciones acuosas el
Cr(VI) generalmente se encuentra presente como oxianioacuten cromato [CrO42-] yo
dicromato [Cr2O72-] dependiendo del pH de la solucioacuten
Debido a su naturaleza fuertemente oxidante el cromo hexavalente puede reaccionar
con la materia orgaacutenica o con agentes reductores con lo que se forma cromo trivalente
Esta transformacioacuten ocurre maacutes raacutepidamente en ambientes aacutecidos tales como en suelos
con pH bajo (Cervantes y col 2001 Jianlong y col 2004)
En el aire el cromo hexavalente ocasionalmente reacciona con partiacuteculas de polvo o con
otros contaminantes con lo que se convierte en cromo trivalente En aguas superficiales
ricas en materia orgaacutenica el Cr(VI) exhibe un tiempo de vida corto en ese estado de
oxidacioacuten (httpwwwepagoviris)
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13 Toxicidad del cromo
La EPA (Environmental Protection Agency) considera al cromo hexavalente - y a sus
derivados - como uno de los diecisiete agentes quiacutemicos de mayor peligrosidad para la
salud puacuteblica y para el medio ambiente (Marsh y McInerney 2001)
Al ser humano el cromo hexavalente le puede provocar dantildeo al rintildeoacuten e hiacutegado asiacute como
alteraciones neuroloacutegicas La inhalacioacuten de cromo hexavalente en niveles mayores a 2
microgm3 puede causar irritacioacuten de las mucosas comezoacuten hemorragias uacutelceras y
perforacioacuten del tabique nasal (httpwwwatsdrcdcgovfacts7html)
Se ha encontrado que algunas personas son extremadamente sensibles al contacto de su
piel con el cromo hexavalente Algunas de las reacciones aleacutergicas detectadas consisten
en el enrojecimiento marcado de la piel e hinchazoacuten
(httpwwwatsdrcdcgovfacts7html Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos
Naturales y Pesca NMX-AA-044-SCFI-2001 httpwwwepagoviris Ksheminska y
col 2005)
La EPA clasifica a los compuestos del cromo hexavalente en el grupo A el cual incluye a
los agentes carcinogeacutenicos para el hombre Ademaacutes el cromo hexavalente tiene efecto
mutageacutenico y teratogeacutenico en animales y humanos (Wang 2000
httpwwwatsdrcdcgovfacts7html Smith y col 2002)
El cromo hexavalente tambieacuten es toacutexico para la mayoriacutea de los microorganismos auacuten a
bajas concentraciones debido a que reduce su actividad enzimaacutetica afecta sus procesos
metaboacutelicos y les produce mutaciones (Wang 2000) Lo anterior tiene gran impacto en
8
los sistemas de tratamiento bioloacutegico de aguas residuales ya que reduce
significativamente la eficiencia de remocioacuten de los contaminantes y la calidad del efluente
(Stasinakis y col 2002 2003)
En las plantas el cromo hexavalente reduce la actividad de las enzimas fotosinteacuteticas y
en general de las proteiacutenas (Morales 2005) ocasiona enfermedades como la clorosis e
interfiere en diversos procesos metaboacutelicos que causan finalmente la muerte de estos
organismos Asimismo se ha demostrado que rompe la unioacuten azuacutecar-fosfato de la
cadena de aacutecido desoxirribonucleico (DNA) y produce una hiper-metilacioacuten de las bases
nitrogenadas lo que ocasiona mutaciones al azar (Labra y col 2004)
Diversos estudios han demostrado que el cromo hexavalente es cien veces maacutes toacutexico
(Garbisu y col 1998) y mil veces maacutes mutageacutenico que el estado trivalente (Wang
2000 Saxena y col 2000 Lloyd 2003)
14 Cantidad de cromo liberado al medio ambiente y legislacioacuten ambiental
Se estima que maacutes de 170000 toneladas de residuos que contienen cromo se descargan
al medio ambiente cada antildeo (Marsh y McInerney 2001) En la tabla 1 se muestran
algunos datos reportados sobre el contenido de cromo en algunos efluentes industriales
asiacute como en aguas superficiales y freaacuteticas Se puede apreciar que la concentracioacuten de
cromo de los efluentes variacutea considerablemente incluso en los del mismo sector
industrial
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Tabla 1 Concentraciones de cromo total yo Cr(VI) de efluentes industriales y cuerpos
de agua
Fuente Concentracioacuten de cromo total
Concentracioacuten de Cr (VI)
Referencia
Industria galvanizadora ---
5000 mgL
Gaballah y col 1994
Industria galvanizadora (1) Industria galvanizadora (2)
---
---
127 mgL
3700 mgL
Fujie y col 1996
Acuiacutefero Aromas Red Sands (California)
---
6-36 gL
Gonzaacutelez y col 2005
Agua subterraacutenea contaminada (EEUU)
gt 1500 gL
---
Wilkin y col 2005
Riacuteo receptor de efluentes de la industria papelera
20-80 mgL
---
Cervantes y col 2001
Planta de tratamiento de desechos de produccioacuten de
ferrocromita
---
3-57 mgL
(fase disuelta)
Su y Ludwig 2005
Curtiduriacutea de pieles
(Grecia)
2000 ndash 3500
mgL
--- httpesepagovtechpubs41230
4html
Curtiduriacutea de pieles (tanque de sedimentacioacuten)
3500 gmL
40 gmL
Ganguli y Tripathi 1999
Curtiduriacutea de pieles (tanque de descarga)
5000 gmL
3000 gmL
Ganguli y Tripathi 1999
Curtiduriacutea de pieles (India) 200 - 2400 mgL ---
Balasubramanian y Pugalenthi 1999
Curtiduriacutea de pieles (Portugal)
2467 mgL
---
Beleza y col 2001
Efluente tratado de
curtiduriacutea de pieles (India)
---
096 mgL
Srinath y col 2002
Curtiduriacutea de pieles (Egipto)
---
1300-2500
mgL
Hafez y col 2002
Curtiduriacutea de pieles (1) (Pakistaacuten) Curtiduriacutea de pieles (2) (Pakistaacuten)
2877 mgL
220 mgL
---
---
Ali-Awan y col 2003
Curtiduriacutea de pieles 12 mgL --- Song y col 2004
Curtiduriacutea de pieles (Guanajuato Meacutexico)
250 gmL
---
Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004
Curtiduriacutea de pieles (India) 500-1000 mgL
---
Aravindhan y col 2004
Bantildeos de curtido al cromo
en curtiduriacuteas (Leoacuten Guanajuato Meacutexico)
3000 ndash10000 mgL
---
Aacutelvarez y col 2004
10
En Meacutexico no se tienen datos precisos sobre la cantidad y concentracioacuten de cromo total
o hexavalente de los residuos generados por las diversas industrias sin embargo se ha
informado que las industrias del curtido de pieles generan de 250 a 270 toneladas de
Cr2O3 al antildeo (Zuacutentildeiga 2005)
Debido a las grandes cantidades de cromo que se liberan al medio ambiente asiacute como a
los efectos indeseables que este metal ocasiona sobre los seres vivos en muchos paiacuteses
se han establecido Normas Ambientales que pretenden regular la concentracioacuten de cromo
total yo de Cr(VI) de los desechos liacutequidos soacutelidos o gaseosos que se descargan al
medio ambiente
En Meacutexico la Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca ha decretado
normas oficiales que establecen los liacutemites maacuteximos permisibles de contaminantes
incluido el cromo ya sea como cromo total o como cromo hexavalente de las aguas
residuales que se descargan en aguas y bienes nacionales (Secretariacutea de Medio
Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996) (tabla 2) asiacute como en los
sistemas de alcantarillado urbano o municipal (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos
Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996) (tabla 3)
En cuanto al agua para uso y consumo humano la Secretariacutea de Salud ha emitido la
Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-1994 (Secretariacutea de Salud Proyecto de
Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-1994) donde se indica
como liacutemite maacuteximo permisible una concentracioacuten de cromo total de 005 mgL
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Tabla 2 Liacutemites maacuteximos permisibles de cromo total para las aguas residuales que se descargan en aguas y bienes
nacionales (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996)
Paraacutemetros
( )
Riacuteos Embalses
Naturales y
Artificiales
Aguas Costeras Suelo
(mgL) Uso en
riego
agriacutecola
(A)
Uso
puacuteblico
urbano
(B)
Proteccioacuten
de vida
acuaacutetica
( C )
Uso en
riego
agriacutecola
(B)
Uso
puacuteblico
urbano
( C )
Explotacioacuten
pesquera
navegacioacuten
y otros
usos (A)
Recreacioacuten
(B)
Estuarios
(B)
Uso en
riego
agriacutecola
(A)
Humedales
naturales
(B)
PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD
Cromo 1 15 05 10 05 10 1 15 05 10 05 10 1 15 05 10 05 10 05 10
() Medidos de manera total PD = Promedio diario PM = Promedio mensual (A) (B) y ( C ) Tipo de cuerpo receptor seguacuten la Ley Federal de Derechos
Tabla 3 Liacutemites maacuteximos permisibles de cromo hexavalente para los sistemas de alcantarillado urbano o municipal
(Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996)
Paraacutemetros (mgL) Promedio Mensual Promedio Diario Instantaacuteneo
Cromo hexavalente 05 075 1
12
Por su parte la EPA ha establecido como liacutemite una concentracioacuten de 01 mg de cromo
por litro de agua potable (httpwwwatsdrcdcgovfacts7html)
La Organizacioacuten Mundial para la Salud (OMS) y la Comunidad Econoacutemica Europea (CEE)
establecen una concentracioacuten de 005 mg de cromo totalL como paraacutemetro de calidad
para aguas destinadas a consumo humano (httpwwgemesmaterialdocument)
Algunos valores sentildealados por otras instancias internacionales se muestran en la tabla
4
Tabla 4 Liacutemites permisibles para cromo sentildealados por Directivas Internacionales
sobre agua potable y aguas embotelladas (Zuacutentildeiga 2005)
Paraacutemetro Canadaacute 1 Japoacuten 2 Aguas embotelladas Nivel de
Administracioacuten Federal sobre
Productos Farmaceacuteuticos de EEUU
Cromo
005 mgL
005 mgL
01 mgL
1 Liacutemite establecido por el Ministerio de Salud de Canadaacute
2 Liacutemite establecido por el Ministerio de Salud y Bienestar Social de Japoacuten
15 Meacutetodos para la remocioacuten de cromo de los efluentes industriales
Para disminuir los efectos toacutexicos del metal es conveniente aplicar alguacuten(os)
tratamiento(s) a los efluentes industriales que contienen cromo antes de descargarlos en
los cuerpos de agua o en el suelo asiacute como restaurar los ecosistemas contaminados En
la actualidad estaacuten disponibles varias tecnologiacuteas para estos propoacutesitos (Eccles 1999)
Estas tecnologiacuteas se han empleado para reducir la toxicidad del contaminante [mediante
la transformacioacuten quiacutemica o bioloacutegica del Cr(VI) a Cr(III)] para removerlo de un lugar
para disminuir la extensioacuten de la contaminacioacuten o para contenerlo en un aacuterea en
particular (Guertin y col 2005)
13
151 Procesos convencionales
Los meacutetodos convencionales para la remocioacuten de los metales pesados son de naturaleza
fisicoquiacutemica y pueden ser utilizados en varias etapas del tratamiento de aguas
residuales Los meacutetodos maacutes usuales para la remocioacuten de Cr(VI) de los efluentes
industriales son los siguientes 1) reduccioacuten quiacutemica ndash precipitacioacuten en donde el Cr(VI)
es reducido quiacutemicamente a Cr(III) a pH aacutecido utilizando alguacuten agente reductor (por
ejemplo el bisulfito de sodio) y posteriormente se adiciona cal o alguacuten otro compuesto
alcalino para formar hidroacutexido de cromo (III) el cual es separado por sedimentacioacuten y
2) coagulacioacuten-floculacioacuten En general estos meacutetodos tienen algunas desventajas tales
como 1) son costosos ya que el agente activo no puede ser recuperado para su
posterior reutilizacioacuten 2) algunos reactivos quiacutemicos son sumamente toacutexicos 3) su
selectividad es baja 4) generan lodos quiacutemicos con altas concentraciones de metales los
cuales son difiacuteciles de tratar 5) la remocioacuten de los metales es incompleta principalmente
cuando la concentracioacuten de eacutestos en los efluentes es inferior a 100 mgL y 6) las aguas
residuales resultantes no satisfacen los criterios de calidad establecidos en la legislacioacuten
ambiental (Cantildeizares-Villanueva 2000 Ruiacutez 2000 Saxena y col 2000 Cheung y Gu
2003)
Algunas otras tecnologiacuteas que se utilizan ocasionalmente para la remocioacuten del Cr(VI) son
el intercambio ioacutenico la adsorcioacuten el tratamiento electroquiacutemico la oacutesmosis inversa y la
evaporacioacuten (Garbisu y col 1998 Camargo y col 2003 Kurniawan y col 2006) Las
principales desventajas de estos meacutetodos son los altos costos fijos de operacioacuten y de
mantenimiento por lo que su aplicacioacuten a grandes voluacutemenes de agua o su uso por
pequentildeas y medianas empresas estaacute muy limitado
14
La EPA recomienda los siguientes meacutetodos para la remocioacuten de cromo del agua potable
en caso de que eacutesta exceda el liacutemite permisible para este metal coagulacioacuten-filtracioacuten
intercambio ioacutenico y oacutesmosis inversa (httpepagov)
En Meacutexico en caso de que el agua destinada a uso y consumo humano exceda el liacutemite
permisible de cromo total la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-1994
(Secretariacutea de Salud Proyecto de Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-
127-SSA1-1994) indica como tratamientos a aplicar el intercambio ioacutenico o la oacutesmosis
inversa
152 Procesos biotecnoloacutegicos
En las uacuteltimas dos deacutecadas se han llevado a cabo estudios con el fin de utilizar
microorganismos y plantas para la restauracioacuten de sitios y para el tratamiento de
efluentes industriales contaminados con metales toacutexicos (Stephen y Macnaughton 1999
Lloyd 2003)
En la actualidad se considera que los procesos microbioloacutegicos son la alternativa maacutes
atractiva para remover algunos metales toacutexicos de los sitios y efluentes contaminados
ya que estos procesos son ―amigables con el medio ambiente los subproductos que
generan son usualmente inocuos son muy eficientes en la remocioacuten de los metales
(particularmente cuando las concentraciones de eacutestos son bajas condiciones en las que
algunos procesos fisicoquiacutemicos son muy ineficientes) y son de bajo costo (Cheung y
Gu 2005 Chardin y col 2002 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004)
15
Dentro de los procesos biotecnoloacutegicos propuestos para la remocioacuten de Cr(VI) se
encuentran la biosorcioacuten y la reduccioacuten bioloacutegica en los cuales se han utilizado
principalmente microorganismos (Volesky y Vieira 2000 Fruchter 2002 Cheung y Gu
2003)
En la biosorcioacuten se utilizan ciertos tipos de adsorbentes bioloacutegicos por ejemplo biomasa
microbiana (viva o inactivada en suspensioacuten o inmovilizada) con los que no se requiere
energiacutea metaboacutelica para retener pasivamente al cromo hexavalente mediante procesos
fiacutesicos (adsorcioacuten fiacutesica principalmente por fuerzas de van Der Waals) o quiacutemicos
(quimisorcioacuten) (Cantildeizares-Villanueva 2000 Volesky y Vieira 2000 Aravindhan y col
2004) En algunos casos se ha observado que el metal es transportado activamente al
interior de las ceacutelulas (a expensas de energiacutea metaboacutelica) proceso al que se le denomina
como bioacumulacioacuten
En la biorreduccioacuten o reduccioacuten bioloacutegica el cromo hexavalente es transformado a la
forma trivalente este uacuteltimo puede ser faacutecilmente precipitado en una etapa posterior de
tratamiento ajustando el pH del agua residual a un valor cercano al neutro para
removerlo finalmente por meacutetodos fiacutesicos (Chardin y col 2002 Cheung y Gu 2003) Se
considera que este proceso es una alternativa tecnoloacutegica potencial para el tratamiento
de suelos cuerpos de agua y efluentes industriales contaminados ya que la reduccioacuten
del Cr(VI) disminuye significativamente la toxicidad (100 veces) solubilidad en agua y
movilidad del metal a traveacutes del medio ambiente (Cheung y Gu 2003 Lloyd 2003
Wang 2000)
16
Se han aislado varios microorganismos que pueden reducir el Cr(VI) a Cr(III) ya sea
como cultivos puros (Horitsu y col 1987 Wang 2000 Pattanapipitpaisal y col 2001
Chardin y col 2002 Cheung y Gu 2003 Middleton y col 2003 Morales-Barrera
2005 Pal 1997 Muter y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004 Thacker y col
2006) o como cultivos mixtos (Smith y col 2002 Cheung y Gu 2003) Las fuentes de
aislamiento han sido muy diversas como por ejemplo efluentes de curtiduriacuteas de la
industria metaluacutergica de mantos freaacuteticos de aguas superficiales contaminadas de
sedimentos anoacutexicos en lagos de plantas de tratamiento de aguas residuales entre
otros (Horitsu y col 1987 Fujii y col 1990 Ganguli y Tripathi 1999 Badar y col
2000 Saxena y col 2000 Pattanapipitpaisal y col 2001 Middleton y col 2003
Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004 Zuacutentildeiga 2005 Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
Entre los geacuteneros microbianos que son capaces de reducir Cr(VI) se tienen los
siguientes Achromobacter Aeromonas Agrobacterium Bacillus Desulfovibrio
Escherichia Enterobacter Micrococcus Pseudomonas (Horitsu y col 1987 Wang
2000) Staphylococcus (Saxena y col 2000) Microbacterium (Pattanapipitpaisal y col
2001) Pyrobaculum Streptomyces Deinococcus (Chardin y col 2002)
Desulfomicrobium Desulfotomaculum Pantoea (Cheung y Gu 2003) Shewanella
(Middleton y col 2003) Trichoderma (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
Phanerochaete (Pal 1997) y Candida (Muter y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col
2004)
De los estudios reportados en la literatura acerca de la reduccioacuten microbioloacutegica del
Cr(VI) sobresalen tres hechos 1) Las bacterias han sido los microorganismos maacutes
ampliamente estudiados y es muy escasa la informacioacuten disponible sobre la capacidad de
17
reduccioacuten del metal de las levaduras y de los hongos filamentosos 2) la mayoriacutea de los
microorganismos ensayados soacutelo son capaces de tolerar y reducir muy bajas
concentraciones de Cr(VI) usualmente dentro del intervalo de 0001 a 05 mM esto
uacuteltimo se ha atribuido a los efectos toacutexicos y mutageacutenicos del metal y 3) casi todos los
estudios se han realizado en cultivo por lote
1521 Transporte del cromo al interior de las ceacutelulas
Tanto en organismos procariotes como en muchos eucariotes los oxianiones cromato y
dicromato (fuentes de cromo hexavalente) ingresan principalmente a las ceacutelulas a traveacutes
de las membranas citoplaacutesmicas mediante el sistema de transporte del sulfato (Badar y
col 2000) lo cual se ha atribuido a la similitud en la carga y estructura de estos iones
(Smith y Gadd 2000) Esto fue demostrado primeramente en Salmonella typhimurium y
posteriormente en otras bacterias tales como en Escherichia coli Pseudomonas
fluorescens y Alcaligenes eutrophus Se ha comprobado que esto mismo ocurre en
algunas levaduras tales como en Candida (Muter y col 2001 Cervantes y col 2001)
Sin embargo en general el cromato penetra al interior de las levaduras por medio de un
transportador anioacutenico no especiacutefico (Czakoacute-Veacuter y col 1999 Cervantes y col 2001)
En algunos microorganismos se ha demostrado que el sulfato inhibe competitivamente el
transporte del cromato al interior de las ceacutelulas (Ohtake y col 1987 Pepi y Baldi 1992)
y que esta inhibicioacuten es maacutes marcada en ceacutelulas anaerobias que en aerobias (Zakaria y
col 2006) Tambieacuten se ha reportado el transporte del cromato por la viacutea de los fosfatos
aunque la viacutea del sulfato es la maacutes utilizada (Ohtake y col 1987)
18
El transporte del cromato al interior de las plantas tambieacuten es a traveacutes del sistema del
ioacuten sulfato Ya en el interior de la planta el cromo hexavalente se acumula en diversos
oacuterganos en cantidades diferentes El cromo hexavalente se acumula de 10 a 100 veces
maacutes en las raiacuteces que en los retontildeos o en otros tejidos (Cervantes y col 2001)
En contraste las membranas celulares de los organismos son praacutecticamente
impermeables al cromo trivalente y a sus compuestos (Ksheminska y col 2006)
1522 Mecanismos microbianos de resistencia al Cr(VI) y de reduccioacuten del
Cr(VI)
Una caracteriacutestica importante que deben tener los microorganismos que se van a utilizar
en procesos de tratamiento de efluentes contaminados con cromo hexavalente es que
sean tolerantes (resistentes) a eacuteste Esta propiedad ha sido descrita en bacterias hongos
y levaduras (Horitsu y col 1987 Cervantes y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004)
Entre los mecanismos de resistencia al cromo hexavalente que se han encontrado se
tienen los siguientes
Acumulacioacuten del metal en la superficie o en el interior de las ceacutelulas (Volesky y Vieira
2000 Saxena y col 2000)
Disminucioacuten yo impedimento en el transporte del cromo hexavalente al interior de
las ceacutelulas (Pepi y Baldi 1992)
Excrecioacuten del metal del interior de la ceacutelula al medio circundante (Cervantes y col
2001)
Reacciones de oacutexido-reduccioacuten en las que el cromo hexavalente es reducido a cromo
trivalente el cual es menos toacutexico (Baldi y col 1990 Muter y col 2001)
19
La resistencia al cromo hexavalente puede estar codificada en el genoacuteforo de las
bacterias o en plaacutesmidos Esto uacuteltimo se ha encontrado en Pseudomonas aeruginosa P
fluorescens P putida y en Alcaligenes eutrophus (Baldi y col 1990 Ishibashi y col
1990 Cervantes y col 2001) Sin embargo la tolerancia al metal no implica
necesariamente que los microorganismos seraacuten capaces de removerlo por alguacuten
mecanismo
En el interior de las ceacutelulas bacterianas los iones cromato [CrO42-] pueden ser reducidos
a cromo trivalente por ciertas enzimas (Ishibashi y col 1990 Horitsu y col 1987) En
condiciones de aerobiosis se han identificado las siguientes proteiacutenas que parecen ser las
responsables de la reduccioacuten del Cr(VI) reductasas flavoproteiacutenas enzimas
dependientes de NADH y NAD(P)H (Ishibashi y col 1990) en cambio en condiciones de
anaerobiosis los estudios indican que ciertas hidrogenasas y citocromos son los
responsables (Chardin y col 2003 Cheung y Gu 2007)
El cromo hexavalente tambieacuten puede ser reducido por compuestos quiacutemicos reductores
que son producidos durante el crecimiento de los microorganismos (Desjardin y col
2003) tales como el glutatioacuten y la cisteiacutena los cuales pueden actuar dentro o fuera de
los organismos (Zakaria y col 2006) En organismos superiores se ha identificado al
ascorbato como agente reductor del cromo hexavalente (Ksheminska y col 2006)
Casi no hay informacioacuten sobre el mecanismo responsable de la reduccioacuten del Cr(VI) en
ceacutelulas eucariotas especiacuteficamente en levaduras Con la finalidad de dilucidar dicho
20
mecanismo se han realizado estudios en los que se ha modificado la resistencia de las
levaduras al Cr(VI) o se ha inactivado alguna enzima en particular
En un trabajo llevado a cabo con algunas levaduras no convencionales se encontroacute que
algunas de eacutestas durante su crecimiento excretaron sustancias reductoras asiacute como
sustancias quelantes que formaron complejos con el cromo trivalente que fue generado
durante la transformacioacuten del cromo hexavalente (Ksheminska y col 2006)
1523 Factores que afectan la reduccioacuten bioloacutegica del Cr(VI)
En algunos microorganismos se ha estudiado el efecto que tienen las variables
ambientales tales como condiciones de aerobiosis yo de anaerobiosis donadores y
aceptores finales de electrones concentracioacuten de cromo hexavalente y potencial de
oacutexido-reduccioacuten entre algunas otras sobre la reduccioacuten del metal (Shen y Wang 1995
Shakoori y col 2000 Wang 2000 Smith y col 2002 Wang y Xiao 1995 Fujii y col
1990 Muter y col 2001 Smith y Gadd 2000 Lloyd 2003 Jianlong y col 2004
Viamajala y col 2004)
La reduccioacuten del Cr(VI) puede realizarse en ambiente aerobio yo anaerobio En
organismos aerobios y anaerobios facultativos se ha investigado el efecto del oxiacutegeno
disuelto en el medio sobre la reduccioacuten del metal (Wang 2000) Se ha encontrado que
la sensibilidad del proceso de reduccioacuten del Cr(VI) a la tensioacuten de oxiacutegeno es diferente
para cada microorganismo En cultivos de Enterobacter cloacae HO1 concentraciones
iniciales de oxiacutegeno mayores a 45 ppm inhibieron fuertemente la reduccioacuten del Cr(VI)
(Komori y col 1989) mientras que la reduccioacuten del metal fue maacutes lenta en condiciones
21
de anaerobiosis que en aerobiosis en el caso de Thiobacillus ferrooxidans (QuiIntana y
col 2001)
Asimismo se ha investigado el efecto de algunos iones sobre la reduccioacuten bioloacutegica del
Cr(VI) Con respecto al sulfato [SO42-] existe una analogiacutea estructural y de carga entre
este anioacuten [SO42-] y el ioacuten cromato [CrO4
2-] por lo que puede establecerse una
competencia entre ellos por los transportadores de sulfato existentes en las ceacutelulas
influyendo asiacute en la reduccioacuten del cromo hexavalente (Smith y Gadd 2000)
En cultivos aerobios no se ha reportado inhibicioacuten por sulfato en la reduccioacuten del cromo
hexavalente (Wang y Xiao 1995 Ishibashi y col 1990 Wang 2000) En contraste se
ha informado que en cultivos anaerobios el sulfato afecta la reduccioacuten del Cr(VI) debido
a que este anioacuten compite con el cromato como aceptor final de electrones (Garbisu y
col 1998)
Por otro lado en un estudio realizado con varios geacuteneros de levadura (Pichia Candida
Debaryomyces Saccharomyces Schwanniomyces Cryptococcus Hansenula) que tienen
capacidad para acumular cromo se encontroacute que el sulfato afectoacute la tolerancia de las
levaduras al Cr(VI) siendo mayor o menor el efecto en funcioacuten de la levadura en estudio
(Kaszycki y col 2003)
Otros iones que se han investigado son el Mg2+ Mn2+ Ca2+ y el Fe En cultivos con
ceacutelulas pasivas (resting cells) de Agrobacterium radiobacter se encontroacute que debe
controlarse principalmente la cantidad de fierro para incrementar la capacidad de
reduccioacuten del microorganismo (Llovera y col 1993)
22
Los donadores de electrones que se han utilizado principalmente en los estudios de
reduccioacuten del Cr(VI) son compuestos alifaacuteticos y aromaacuteticos carbohidratos de bajo peso
molecular aminoaacutecidos y aacutecidos orgaacutenicos (Wang y Xiao 1995 Wang 2000 Smith y
col 2002 Ksheminska y col 2006) El descubrimiento de microorganismos que son
capaces de reducir el cromo hexavalente utilizando una amplia variedad de fuentes de
carbono y energiacutea favorece su uso en procesos de remediacioacuten in situ (Smith y col
2002)
Para la reduccioacuten del cromo hexavalente es conveniente conocer el pH y la temperatura
oacuteptimos para el crecimiento de los microorganismos (Wang 2000 Shakoori y col 2000
Camargo y col 2002 Faisal y Hasnain 2004) En cultivos de Streptomyces griseus se
estudioacute la reduccioacuten del Cr(VI) en el intervalo de valores de pH de 4 a 8 y de
temperatura de 28 a 50 degC obtenieacutendose la mayor reduccioacuten a un pH de 6-7 y a una
temperatura de 28 degC (Laxman y More 2002)
En cultivos de Ochrobactrum sp se trabajoacute en el intervalo de temperatura de 30 a 45 degC
y de pH de 6 a 8 obtenieacutendose la mayor reduccioacuten del Cr(VI) y el crecimiento celular
maacutes alto a 35 degC y a un pH de 7 (Thacker y Madamwar 2005) En estudios realizados
con Escherichia coli ATCC 33456 se ensayoacute la reduccioacuten del Cr(VI) en el intervalo de
valores de pH de 3-8 y de temperatura de 40-60 degC encontraacutendose que el pH y la
temperatura de incubacioacuten oacuteptimos fueron de 7 y 37 degC respectivamente (Bae y col
2000)
Se ha observado que la concentracioacuten inicial de Cr(VI) influye en la velocidad de
reduccioacuten del metal (Wang 2000) La velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) exhibida por los
23
cultivos de Bacillus sp Pseudomonas fluorescens LB300 (Wang y Xiao 1995)
Ochrobactrum sp (Thacker y Madamwar 2005) y de Candida sp LBM2 (Juvera-Espinosa
y col 2006) se incrementoacute conforme aumentoacute la concentracioacuten inicial de Cr(VI) En
contraste la velocidad de reduccioacuten de Bacillus sp Arthrobacter sp (Megharaj y col
2003) y de Trichoderma viride (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006) disminuyoacute al
incrementar la concentracioacuten inicial de cromo hexavalente
Para obtener una reduccioacuten importante del Cr(VI) se requieren altas concentraciones de
biomasa (Wang 2000) La concentracioacuten inicial de biomasa tiene efecto sobre la
velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) de Bacillus sp y Pseudomonas fluorescens LB300 ya
que eacutesta aumentoacute al haber mayor cantidad de biomasa inicial (Wang y Xiao 1995) Este
mismo efecto se observoacute en cultivos de una cepa bacteriana gram positiva a la que se le
denominoacute como cepa ATCC 700729 (Shakoori y col 2000)
El potencial redox se ha medido en algunos estudios realizados con diferentes
microorganismos y condiciones de cultivo para determinar su efecto sobre la reduccioacuten
del Cr(VI) (Komori y col 1989 Turick y col 1996 McLean y Beveridge 2001) sin
embargo no se ha reportado un intervalo oacuteptimo de potencial redox para llevar a cabo la
reduccioacuten del Cr(VI) a su forma menos toacutexica (Wang 2000)
En algunos estudios se ha evaluado la influencia de algunos metales (Mn Ni Zn Pb Cu
Co As Se y Hg) sobre la reduccioacuten del Cr(VI) ya que las cepas microbianas que sean
resistentes a uno o varios metales y que sean capaces de reducir el Cr(VI) seriacutean de gran
utilidad en la biorremediacioacuten de efluentes industriales (Faisal y Hasnain 2004 Cheung
y Gu 2005 Thacker y col 2006) En estudios con Escherichia coli ATCC 33456 se
24
investigoacute el efecto de varios iones (Hg2+ Ag2+ Mn2+ Zn2+ Pb2+ Cd2+ Ca2+ y Mg2+) que
pueden estar presentes junto con el Cr(VI) en efluentes industriales Con el magnesio
se observoacute un ligero aumento en la actividad reductora del microorganismo mientras
que con el mercurio se inhibioacute por completo su capacidad de reduccioacuten (Bae y col
2000)
En el caso particular de microorganismos filamentosos los esfuerzos de corte pueden
causar dantildeo fiacutesico a las ceacutelulas y como consecuencia afectar su capacidad de reduccioacuten
de Cr(VI) En cultivos de Trichoderma viride realizados en matraz y en un reactor
agitado mecaacutenicamente con un impulsor se observoacute que los micelios eran de menor
tamantildeo cuando el hongo se cultivaba en el reactor Asimismo el incremento celular y la
eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidos en matraz fueron superiores a los alcanzados
en el reactor agitado con un impulsor Estos resultados sugirieron que las fuerzas de
cizalla creadas por el impulsor fragmentan el micelio y afectan la viabilidad celular y la
capacidad de reduccioacuten del microorganismo (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
16 Sistemas de reaccioacuten
En la mayoriacutea de los estudios sobre reduccioacuten de Cr(VI) el sistema de reaccioacuten que maacutes
se ha empleado es el cultivo por lote Este sistema es ampliamente utilizado en procesos
biotecnoloacutegicos para la produccioacuten de biomasa y de metabolitos de intereacutes industrial La
duracioacuten de este tipo de cultivo depende del tamantildeo del inoacuteculo de las condiciones
ambientales como el pH los componentes del medio de cultivo y la temperatura
Aunque su operacioacuten es sencilla ofrece pocas opciones de control de las variables
intensivas de intereacutes (concentracioacuten de biomasa sustrato producto) en comparacioacuten
con otros sistemas de reaccioacuten
25
(httpfaiunneeduarbiologiamicroindcultivo20y20biorreactoreshtm) Asimismo
despueacutes de un cultivo por lote se requiere de un periodo para la descarga limpieza y
esterilizacioacuten del equipo asiacute como para el arranque de un nuevo cultivo por lote lo que
disminuye la productividad global del proceso (Wang y col 1979)
Pocos son los estudios relacionados con la reduccioacuten del Cr(VI) en los que se ha
trabajado con otros sistemas de reaccioacuten tales como con el cultivo continuo (DeLeo y
Ehrlich 1994 Bhide y col 1996 Chirwa y Wang 1997 Bae y col 2000) y el cultivo
por lote alimentado o fed-batch (Fujii y col 1990 Fujie y col 1996)
El cultivo continuo permite alcanzar un estado estacionario independiente del tiempo en
el que los microorganismos presentan un crecimiento consumo de sustrato y produccioacuten
constantes por lo que es posible obtener una alta productividad o velocidad volumeacutetrica
(httpuserpagesumbcedu gferre1bmcohtml) En este sistema es posible controlar
la cantidad de biomasa utilizando un uacutenico nutriente limitante del crecimiento (Wang y
col 1979)
A pesar de que el cultivo continuo tiene la desventaja de ser susceptible de contaminarse
debido a los periodos prolongados de operacioacuten (Stanbury 1984) en estudios con Cr(VI)
se minimizariacutea lo anterior ya que este estado de oxidacioacuten del cromo es altamente toacutexico
para la mayoriacutea de los microorganismos auacuten a bajas concentraciones
El cultivo por lote alimentado se utiliza industrialmente para la produccioacuten de varios
productos bioloacutegicos de intereacutes (enzimas antibioacuteticos vitaminas aminoaacutecidos entre
otros) El sistema es uacutetil para obtener una alta concentracioacuten de metabolitos asociados
26
al crecimiento ya que es posible alcanzar una alta concentracioacuten de biomasa aunque
tambieacuten se emplea para la produccioacuten de compuestos no asociados al crecimiento como
por ejemplo de algunos antibioacuteticos Su uso tambieacuten se recomienda cuando se trabaja
con compuestos toacutexicos o de muy baja solubilidad y no requiere mayor equipo que el
utilizado en un cultivo por lote (httpuserpagesumbcedu gferre1fedbatchhtml)
Otras ventajas de este sistema son 1) los tiempos totales del proceso fermentativo son
menores y no requiere de un nuevo inoacuteculo cada vez que se repite el ciclo en
comparacioacuten con un cultivo por lote y 2) menor riesgo de contaminacioacuten que el cultivo
continuo (Roukas 1993)
27
2 OBJETIVOS
21 Objetivos generales
1) Determinar el efecto del ioacuten sulfato sobre el crecimiento celular consumo de glucosa y
reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
2) Realizar el estudio cineacutetico del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de
Cr(VI) de Candida sp en sistemas por lote y lote repetido en un reactor airlift
3) Seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten del Cr(VI) por
Candida sp
22 Objetivos especiacuteficos
a) Determinar el efecto de la concentracioacuten de sulfato de amonio sobre el crecimiento
celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
b) Evaluar el crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote y lote repetido
c) Realizar el estudio cineacutetico del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa
d) Evaluar el crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote alimentado repetido
e) Seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes conveniente para la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp
28
3 MATERIAL Y MEacuteTODOS
31 Microorganismo
Para el desarrollo del presente trabajo se utilizoacute una levadura que se aisloacute a partir del
agua residual de una industria curtidora de pieles que se encuentra ubicada en la Ciudad
de Leoacuten Guanajuato Mediante teacutecnicas morfoloacutegicas y bioquiacutemicas que fueron
realizadas en el Laboratorio de Micologiacutea de la Facultad de Medicina de la UNAM asiacute
como por teacutecnicas de biologiacutea molecular que fueron llevadas a cabo en el Laboratorio de
Microbiologiacutea General de la Escuela Nacional de Ciencias Bioloacutegicas se determinoacute que la
levadura pertenece al geacutenero Candida La amplificacioacuten y secuenciacioacuten del dominio
D1D2 del gen 26S rDNA de la levadura aislada reveloacute que estaacute relacionada con Candida
petrohuensis (GenBank accession number U45819) Candida acudensis (GenBank
accession number U45810) y Candida drimydis (GenBank accession number U45815)
con un nivel de confidencia del 896 La baja similitud de las secuencias parciales
conocidas del gen 26S rDNA y la de la cepa de levadura empleada en este trabajo podriacutea
sugerir que es una cepa no identificada no registrada en el GenBank por lo que se le
denominoacute como Candida sp La relacioacuten filogeneacutetica de la cepa de Candida usada en este
estudio y la de otras especies de levadura se muestra en la figura 1
29
Figura 1 Relaciones filogeneacuteticas de la levadura
AJ508572Cmucifera
AB041003Candida
AB041006Cmucifera
AB041005Stephanoascus
U45822Cchiropterorum
U40103Arxula
U40094Arxula
AY283605Sympodiomyces
AF017247Trichomonascus
U40110Blastobotrys
AY442294Sympodiomyces
U40096Sympodiomyces
AY559042Cmokoenaii
FGSFEP
U45819Cpetrohuensis
U45810Cancudensis
U45815Cdrimydis
U45806Cbondarzewiae
U45816Ctepae
U45812Candida
U45812Cantillancae
U45811Csantjacobensis
U76531Stephanoascus
AB196536Stephanoascus
U70245Cedax
AF017236Cbertae
U45835Cvaldiviana
AY618511Cnovakii
U45807Ccastrensis
U45826Cpaludigena
AF294910Cbituminiphila
U45829Pichia
U84241Zygozyma
U76350Myxozyma
U76527Lipomyces
U45804Debaryomyces
U75524Pichia
U68552Saccharomyces
AY545582Naumovia
AY007888Saccharomyces 100 100
43 100
100
100
43 100
100
72
100
86
95
95
100
91
58 69
99
98
84
92
60
63
54
40
56
37
49
21
39
61
16
002
30
32 Propagacioacuten del inoacuteculo
La composicioacuten quiacutemica del medio de cultivo basal que se utilizoacute en este trabajo para la
propagacioacuten del inoacuteculo y para los experimentos de remocioacuten de Cr(VI) en diferentes
sistemas de reaccioacuten los cuales fueron realizados en un reactor neumaacutetico se muestra
en la tabla 5
Tabla 5 Composicioacuten quiacutemica del medio de cultivo
Compuesto Concentracioacuten
(gL)
Glucosa 100
(NH4)2SO4 30
KH2PO4 10
MgSO4 7H2O 03
KCl 01
Extracto de levadura 01
CaCl2 005
FeCl3 0001
Para los experimentos en los que se determinoacute el efecto del sulfato sobre la tolerancia de
Candida sp al Cr(VI) y la reduccioacuten del mismo el inoacuteculo se propagoacute en el mismo medio
de cultivo pero el (NH4)2SO4 se reemplazoacute por NH4Cl (243 gL) y el MgSO47H2O por
MgCl26H2O (0247 gL)
31
El pH inicial de los medios de cultivo fue de aproximadamente 60 A matraces
Erlenmeyer de 1000 mL que conteniacutean 200 mL de medio de cultivo se les adicionoacute una
asada de Candida sp y posteriormente se incuboacute con agitacioacuten constante a 28-30 ordmC
durante 42 h A continuacioacuten la biomasa se separoacute por centrifugacioacuten a 1500 rpm a
4 degC durante 15 min bajo condiciones de asepsia El paquete celular resultante se lavoacute
dos veces con agua destilada esteacuteril para eliminar los componentes del medio de cultivo
y los residuos celulares El paquete celular se resuspendioacute en un pequentildeo volumen de
agua destilada esteacuteril y se homogeneizoacute La suspensioacuten celular resultante se utilizoacute como
inoacuteculo para los experimentos realizados en este trabajo
Para la conservacioacuten de la levadura se usaron viales con medio inclinado de YPG
(glucosa 2 peptona de caseiacutena 1 extracto de levadura 1 y agar bacterioloacutegico
2) los cuales se mantuvieron en refrigeracioacuten a 4 degC Las resiembras se realizaron
cada dos meses
33 Reactores airlift
Se utilizoacute un contactor gas-liacutequido (reactor agitado neumaacuteticamente) del tipo airlift con
tubo conceacutentrico (figuras 2a y 2b) con un volumen total de 52 litros y un posible
volumen de operacioacuten de 42 litros para realizar los estudios de remocioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en sistemas por lote lote repetido lote alimentado y lote alimentado
repetido El reactor estaacute hecho de vidrio Pyrex y consta de una base columna y una
tapa Entre la base y la columna asiacute como entre la columna y la tapa se colocaron
empaques de neopreno para evitar el contacto vidrio-vidrio asiacute como para evitar fugas
de aire yo de medio de cultivo Las secciones se unieron mediante bridas de Nylamid La
32
base del reactor tiene un difusor del tipo placa plana de vidrio poroso para el suministro
de aire
33
Oliva para
toma de muestra
Aire
Tubo conceacutentrico (liso con
perforaciones de
malla)
Filtro de aire
Venteo
Difusor de vidrio poroso(poro fino)
Difusor de vidrio
poroso (poro fino)
Aire
50deg
4
65
3 m
m
77 mm
11
5
mm
128 mm
88 mm
15
mm
70 mm
4
50
3 m
m
Figuras 2a y 2b Reactor del tipo airlift con tubo conceacutentrico
34
En el interior del reactor se colocoacute un tubo conceacutentrico liso (sin perforaciones) de vidrio
Pyrex un tubo conceacutentrico de vidrio Pyrex con perforaciones circulares (4 mm de
diaacutemetro) o un tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable No 316 (grado
alimentario nuacutemero de malla = 20 abertura = 3344 mm) los cuales tienen la misma
longitud y diaacutemetro El tipo de tubo que se utilizoacute para los experimentos de reduccioacuten
del Cr(VI) dependioacute del sistema de reaccioacuten que se ensayoacute el tubo conceacutentrico liso se
utilizoacute para llevar a cabo experimentos en cultivos por lote y lote repetido el tubo
conceacutentrico con perforaciones se empleoacute para realizar cultivos por lote lote alimentado y
lote alimentado repetido y el tubo de malla metaacutelica se usoacute para cultivos por lote
Para el cultivo continuo de una etapa se utilizoacute un reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
con un volumen total de 650 mL y un posible volumen de operacioacuten de 550 mL el cual
tiene las mismas relaciones geomeacutetricas que el reactor antes mencionado
En todos los sistemas de reaccioacuten ensayados se suministroacute aire en el interior del tubo
conceacutentrico El aire de entrada se controloacute mediante una vaacutelvula reguladora de presioacuten y
su velocidad de flujo se midioacute con un rotaacutemetro
34 Meacutetodos experimentales
341 Efecto de la concentracioacuten de sulfato sobre el crecimiento celular
consumo de glucosa remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp
Se evaluoacute el efecto de la concentracioacuten de sulfato sobre el crecimiento celular consumo
de glucosa remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivos por lote a
nivel matraz Para estos experimentos parte o todo del (NH4)2SO4 y del MgSO4 7H2O del
medio de cultivo basal (tabla 5) se reemplazoacute con NH4Cl y MgCl26H2O respectivamente
35
a fin de mantener las mismas concentraciones iniciales de nitroacutegeno (454 mM) y de
magnesio (1217 mM) en todos los medios de cultivo ensayados
Se prepararon tres series de matraces Erlenmeyer de 500 mL que conteniacutean 135 mL de
medio de cultivo con diferentes concentraciones iniciales de sulfato Las
concentraciones de sulfato ensayadas fueron las siguientes 00 1217 25 50 100
150 200 y 2392 mM (esta uacuteltima concentracioacuten corresponde a la del ioacuten sulfato
presente en el medio de cultivo basal) Estas concentraciones no incluyen la cantidad de
sulfato proporcionado por algunos otros componentes del medio de cultivo (provenientes
del extracto de levadura yo de sales inorgaacutenicas) ya que el Laboratorio Central de
Instrumentacioacuten del Departamento de Biofiacutesica de la Escuela Nacional de Ciencias
Bioloacutegicas IPN determinoacute que la concentracioacuten de este ioacuten en el medio de cultivo que
conteniacutea cloruro de amonio y cloruro de magnesio como uacutenicas fuentes de nitroacutegeno
inorgaacutenico y de magnesio respectivamente era de 23 mgL (002 mM) A este uacuteltimo
medio de cultivo es al que se le denominoacute en el presente trabajo como ―0 mM de ioacuten
sulfato Para la cuantificacioacuten del ioacuten sulfato se utilizoacute el meacutetodo recomendado por la
Norma Oficial Mexicana NMX-AA-74-1981 (Secretariacutea de Comercio y Fomento Industrial
1981) El pH inicial de todos los medios de cultivo ensayados fue de aproximadamente
60
A una serie de matraces con medio de cultivo no se le adicionoacute Cr(VI) con la finalidad de
determinar el efecto del sulfato sobre el crecimiento celular y consumo de glucosa por la
levadura en ausencia del metal (cultivos control) A los matraces de la segunda y tercera
serie se les adicionoacute un determinado volumen de una solucioacuten stock esteacuteril de cromato
de potasio (20 gL) para obtener concentraciones iniciales de Cr(VI) de 17 y 33 mM
36
respectivamente Los matraces fueron inoculados con un determinado volumen de
suspensioacuten celular concentrada a fin de que la concentracioacuten inicial de biomasa de todos
los cultivos fuera de aproximadamente 1 mgmL Los matraces se colocaron en un bantildeo
metaboacutelico con agitacioacuten constante a 28-30 degC Se recolectaron muestras a diferentes
tiempos de incubacioacuten a las que se les determinoacute la concentracioacuten de biomasa glucosa
Cr(VI) y cromo total residual asiacute como el pH
342 Controles abioacuteticos
Se utilizaron controles libres de ceacutelulas con el propoacutesito de determinar si el Cr(VI) era
reducido abioacuteticamente a Cr(III) por los componentes del medio de cultivo
Durante los experimentos de remocioacuten de Cr(VI) con ceacutelulas viables (cultivos problema)
se observoacute que el pH de los medios de cultivo disminuyoacute desde aproximadamente 6
hasta 25-42 dependiendo de la concentracioacuten de sulfato y de cromo utilizada Como
se sabe que los pHrsquos bajos favorecen que la materia orgaacutenica (donadores de electrones)
reduzca el Cr(VI) a Cr(III) en este trabajo se llevaron a cabo experimentos sin biomasa
de Candida sp (controles libres de ceacutelulas) a distintos valores de pH (25 3 4 5 y 6) y
a las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas (17 y 33 mM) para determinar
el grado de reduccioacuten causado por los constituyentes del medio de cultivo
Como controles libres de ceacutelulas se utilizaron matraces Erlenmeyer que conteniacutean medio
de cultivo a los que se les adicionoacute un volumen determinado de una solucioacuten stock
esteacuteril de cromato de potasio (20 gL) para obtener concentraciones iniciales de Cr(VI)
de 17 y 33 mM A continuacioacuten se ajustoacute el pH del medio de cultivo a alguno de los
37
valores antes mencionados La adicioacuten de la solucioacuten stock esteacuteril de cromato de potasio
y el ajuste del pH se realizoacute en condiciones de asepsia
Los controles abioacuteticos se incubaron a las mismas condiciones que los matraces
problema Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se les
determinoacute la concentracioacuten de Cr(VI)
343 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa
remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivo por lote en un
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Se realizoacute la evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa remocioacuten
de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso (sin perforaciones) El cultivo por lote se llevoacute a cabo con 4 litros de
medio de cultivo basal con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM [igual a 78
mgL de Cr(VI)] y con un pH inicial de aproximadamente 60 El reactor se inoculoacute con
un volumen determinado de suspensioacuten celular concentrada para obtener una
concentracioacuten inicial de biomasa cercana a 12 mgmL Se suministroacute aire con un flujo
volumeacutetrico de 4 litrosmin equivalente a 1 vvm (vvm = volumen de aire por volumen
de medio de cultivo por minuto)
El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que el nivel de Cr(VI) residual fue
despreciable Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se
les determinoacute la concentracioacuten de biomasa de glucosa Cr(VI) y cromo total residual asiacute
como el pH
38
344 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote repetido en un reactor
airlift con tubo conceacutentrico liso
Los sistemas por lote repetido se iniciaron con un cultivo por lote Cuando se alcanzaron
niveles bajos de Cr(VI) residual en el primer cultivo por lote se procedioacute a recolectar un
determinado volumen de medio y se reemplazoacute con medio fresco que teniacutea una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM A continuacioacuten el sistema se operoacute nuevamente por
lote (segundo cultivo por lote o cultivo por lote repetido) hasta que ya no se detectaron
variaciones considerables en la concentracioacuten de Cr(VI) residual
Se ensayaron tres diferentes relaciones de recambio de medio de cultivo (f = volumen de
medio recolectadovolumen inicial de medio liacutequido en el reactor) las cuales fueron de
04 06 y 08 Para las dos uacuteltimas relaciones se realizaron experimentos sin ajustar el
pH del medio al inicio del segundo cultivo por lote (lote repetido) asiacute como ajustando el
pH a 60 Para la primera relacioacuten (f = 04) soacutelo se realizoacute el experimento sin ajustar el
pH del medio al inicio del cultivo por lote repetido ya que los experimentos realizados a
las relaciones de recambio de 06 y 08 mostraron que la eficiencia y velocidad de
reduccioacuten de Cr(VI) de los cultivos por lote repetido eran mayores cuando no se ajustaba
el pH
Durante los cultivos por lote repetido se recolectaron muestras a diferentes tiempos de
incubacioacuten a las cuales se les determinoacute la concentracioacuten de biomasa glucosa Cr(VI) y
el pH Con los datos obtenidos se estimaron algunas variables cineacuteticas que se utilizaron
para seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para los fines que se persiguen en
este trabajo
39
345 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa en un
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Para el cultivo continuo de una etapa se utilizoacute un biorreactor airlift con tubo conceacutentrico
liso con un volumen de operacioacuten de 500 mL Al reactor se le suministroacute continuamente
medio de cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM por medio de una
bomba peristaacuteltica Se ensayaron dos flujos volumeacutetricos de medio de cultivo de 378 y
50 mLh que corresponden a velocidades de dilucioacuten de 00076 h-1 y de 00100 h-1
respectivamente
Con los datos obtenidos a la velocidad de dilucioacuten de 00076 h-1 se estimoacute la velocidad
volumeacutetrica global y la eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) las cuales se utilizaron
para seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp
346 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular y la remocioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo conceacutentrico de
malla de acero inoxidable y de vidrio perforado
Se realizaron cultivos por lote en el reactor airlift en el cual se colocoacute un tubo conceacutentrico
de malla de acero inoxidable No 316 (grado alimentario calibre No 20 abertura =
3344 mm) o un tubo conceacutentrico de vidrio con perforaciones circulares de
aproximadamente 4 mm de diaacutemetro Al reactor se le adicionaron 4 litros de medio de
cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM [igual a 78 mgL de Cr(VI)] y
un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada para obtener una
40
concentracioacuten inicial de biomasa de aproximadamente 12 mgmL El pH inicial del medio
fue de aproximadamente 60 Se ensayaron dos flujos de aire de 05 y 1 vvm
El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que el nivel de Cr(VI) residual fue bajo Se
recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se les determinoacute la
concentracioacuten de biomasa y de Cr(VI) residual Con los datos obtenidos se estimaron
algunas variables cineacuteticas que sirvieron como criterio de seleccioacuten para determinar el
tubo conceacutentrico maacutes adecuado para llevar a cabo los cultivos por lote alimentado y lote
alimentado repetido
347 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote
alimentado repetido en un reactor airlift
Para los cultivos por lote alimentado y lote alimentado repetido se utilizoacute el reactor airlift
con el tubo conceacutentrico seleccionado previamente Los cultivos por lote alimentado se
iniciaron con un cultivo por lote utilizando las condiciones iniciales mencionadas en el
inciso 446 y una aireacioacuten de 05 vvm El cultivo por lote se mantuvo en operacioacuten
hasta que la concentracioacuten de Cr(VI) residual fue baja
A continuacioacuten el reactor se drenoacute hasta alcanzar un volumen de liacutequido en el reactor de
25 litros y se inicioacute el suministro continuo de medio de alimentacioacuten con una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM La alimentacioacuten se mantuvo hasta que se alcanzoacute un
volumen de medio liacutequido en el reactor de 37 litros (primer cultivo por lote alimentado)
41
Posteriormente el reactor se volvioacute a drenar hasta obtener un volumen de medio de 25
litros y enseguida se volvioacute a suministrar continuamente medio de cultivo basal con una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM utilizando el mismo flujo de alimentacioacuten que para el
primer cultivo por lote alimentado El suministro de medio se mantuvo hasta alcanzar un
volumen de liacutequido en el reactor de 375-40 litros (segundo cultivo por lote alimentado o
cultivo por lote alimentado repetido)
Se ensayaron dos flujos de alimentacioacuten de 659 y 1343 mLh que representan cargas
maacutesicas de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh
Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las cuales se les
determinoacute la concentracioacuten de biomasa de glucosa y Cr(VI) residual asiacute como el pH
Con los datos obtenidos se estimaron las velocidades volumeacutetricas globales y las
eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI)
35 Meacutetodos analiacuteticos
351 Determinacioacuten de la concentracioacuten de biomasa
La concentracioacuten celular se determinoacute mediante el peso seco de la masa celular Las
muestras recolectadas se filtraron a traveacutes de membranas de fibra de vidrio (Whatman
GFA) con un diaacutemetro de poro de 16 m las cuales se colocaron previamente puestas a
peso constante Posteriormente las membranas se colocaron en una estufa a 95 degC
hasta alcanzar un peso constante Los filtrados se utilizaron para determinar la
concentracioacuten de glucosa Cr(VI) y cromo total residual asiacute como el pH
352 Determinacioacuten de la concentracioacuten de glucosa
42
Se determinoacute mediante un meacutetodo enzimaacutetico empleando a la glucosa oxidasa y
peroxidasa (Worthington Biochemical Corporation 1972)
Principio El meacutetodo se basa en que la glucosa es oxidada a aacutecido glucoacutenico por la
glucosa oxidasa la cual cataliza la siguiente reaccioacuten
-D-glucosa + H2O + O2 Aacutecido D-glucoacutenico + H2O2
El peroacutexido de hidroacutegeno generado reacciona con el sistema peroxidasa - orto-
dianisidina dando como resultado la oxidacioacuten de la orto-dianisidina y la produccioacuten de
agua de acuerdo con la siguiente reaccioacuten
H2O2 + orto-dianisidina (reducida) ortondashdianisidina (oxidada) + H2O
peroxidasa
La orto-dianisidina oxidada presenta un color pardo que en medio aacutecido vira a color
rosa la cual se lee a una longitud de onda de 540 nm (figura 3)
Figura 3 Orto-dianisidina (33rsquo ndash dimetoxidibencidina)
H2N NH2
OCH3
OCH3
43
353 Determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo hexavalente
La concentracioacuten de cromo hexavalente se determinoacute por la teacutecnica de la 15-
difenilcarbohidrazida siguiendo los procedimientos descritos en el meacutetodo 8023 del Hach
Water Analysis Handbook (2002) Este meacutetodo estaacute aprobado por la EPA (Environmental
Protection Agency) (Hach 2002) y por la Norma Oficial Mexicana NMX-AA-044-SCFI-
2001 (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NMX-AA-044-SCFI-
2001)
Principio Se utilizoacute un reactivo en polvo llamado ChromaVer3 el cual contiene una
solucioacuten buffer aacutecida combinada con la 15-difenilcarbohidrazida Este uacuteltimo compuesto
reacciona con el cromo hexavalente dando un compuesto de color puacuterpura (figura 4) El
meacutetodo es aplicable para el agua ya sea fresca o de muestras de agua residual La
intensidad del color es ldirectamente proporcional a la concentracioacuten de cromo
hexavalente presente
Figura 4 Reaccioacuten de la 15-difenilcarbohidrazida con el cromo hexavalente
+ Cr 6+
Compuesto colorido
puacuterpura
N N
Cr O
C R
O
N N
H H
C R
15-difenilcarbohidrazida
2 N N N
H H
N C
H O
H
44
354 Determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo total
La determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo total de los filtrados de las muestras
recolectadas (cromo total en solucioacuten) se realizoacute por espectroscopiacutea de absorcioacuten
atoacutemica con flama de acetileno-aire (SpectrAA220 FS Varian Inc)
Para determinar la cantidad de cromo retenido por la biomasa de Candida sp las ceacutelulas
fueron lavadas con agua desionizada deshidratadas y posteriormente fueron digeridas
con aacutecido niacutetrico concentrado La solucioacuten obtenida se enfrioacute a temperatura ambiente y
se le adicionoacute agua desionizada hasta obtener un volumen final de 50 mL Este
procedimiento estaacute descrito en la Norma Oficial Mexicana NMX-AA-051-SCFI-2001
(Secretariacutea de Economiacutea 2001) La concentracioacuten de cromo total de la solucioacuten
resultante se determinoacute en un espectrofotoacutemetro de absorcioacuten atoacutemica con un horno de
grafito (SpectrAA220 FS Varian Inc)
355 Determinacioacuten del pH
Se realizoacute con un potencioacutemetro marca Oakton
45
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Meta No 1 Determinar el efecto del ioacuten sulfato sobre la reduccioacuten
de Cr(VI)
41 Efecto del sulfato sobre el crecimiento celular consumo de glucosa
remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp
411 Evaluacioacuten de la influencia del sulfato sobre el crecimiento celular de
Candida sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
Se determinoacute el efecto de ocho concentraciones diferentes de sulfato (00 1217 25
50 100 150 200 y 2392 mM) sobre el crecimiento celular de Candida sp cuando
eacutesta se cultivoacute por lote a nivel matraz en medios de cultivo sin Cr(VI) y con
concentraciones iniciales del metal de 17 y 33 mM Para visualizar mejor el efecto las
curvas de crecimiento celular se construyeron utilizando la relacioacuten xxo (x =
concentracioacuten celular a un determinado tiempo de incubacioacuten xo = concentracioacuten inicial
de biomasa) como variable dependiente y el tiempo de incubacioacuten (t) como variable
independiente (graacuteficas de xxo vs t) En cada una de las curvas de crecimiento se trazoacute
una liacutenea horizontal a una relacioacuten xxo de 10 para observar si ocurriacutea crecimiento o
lisis celular
En la figura 5 se muestran las curvas de crecimiento celular de Candida sp cuando eacutesta
se cultivoacute en medios de cultivo con diferentes concentraciones de sulfato y sin Cr(VI) Se
observa que el crecimiento de Candida sp fue muy semejante a las diferentes
concentraciones de sulfato ensayadas La levadura fue capaz de crecer en el medio de
cultivo al que no se le adicionoacute sulfato de amonio y sulfato de magnesio (0 mM de
46
SO42-) lo cual sugiere que la cantidad de sulfato proporcionado por otros componentes
del medio de cultivo ndash por ejemplo provenientes del extracto de levadura yo de
impurezas contenidas en las sales inorgaacutenicas adicionadas al medio de cultivo (002
mM) mdash fue suficiente para permitir un adecuado crecimiento de la levadura Los
resultados tambieacuten mostraron que la adicioacuten de sulfato en forma de sales inorgaacutenicas
[(NH4)2SO4 o Mg(SO4)7H20] no tuvo alguacuten efecto inhibidor o estimulador del crecimiento
celular
Figura 5 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo sin Cr(VI)
En la figura 6 se presentan las curvas de crecimiento de Candida sp que se obtuvieron
cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo con una concentracioacuten inicial de
Cr(VI) de 17 mM a las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas En la figura se
aprecia lo siguiente 1) A una concentracioacuten de sulfato de 0 mM ocurrioacute lisis celular 2)
el crecimiento neto de la levadura fue praacutecticamente nulo a una concentracioacuten de sulfato
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
47
de 1217 mM 3) el crecimiento de la levadura fue evidente a partir de una
concentracioacuten de sulfato de 25 mM y 4) en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de
10 a 2392 mM el crecimiento de la levadura fue muy semejante y superior al alcanzado
a una concentracioacuten de sulfato de 5 mM Asimismo cuando se utilizaron concentraciones
de sulfato de 10 a 2392 mM se alcanzaron niveles de concentracioacuten de biomasa
similares a los obtenidos en ausencia del metal (cultivos control) (figuras 5 y 6) De
estos resultados es evidente que a medida que se incrementoacute la concentracioacuten de
sulfato los efectos toacutexicos del Cr(VI) sobre el crecimiento de la levadura disminuyeron
hasta que eacutestos fueron praacutecticamente nulos es decir la tolerancia de la levadura al
Cr(VI) aumentoacute conforme se incrementoacute la concentracioacuten de sulfato en el medio de
crecimiento de Candida sp
Figura 6 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo con 17 mM de Cr(VI)
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
48
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM ocurrioacute lisis celular
cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo con concentraciones de sulfato en el
intervalo de 0 a 5 mM (figura 7) en contraste el crecimiento celular de la levadura se
incrementoacute a medida que la concentracioacuten de sulfato aumentoacute de 10 a 2392 mM En
este uacuteltimo intervalo de concentracioacuten de sulfato se observoacute que a tiempos de
incubacioacuten superiores a las 150 h se presentoacute lisis celular A ninguna de las
concentraciones de sulfato ensayadas se alcanzaron densidades celulares semejantes a
las obtenidas en los cultivos sin Cr(VI) o con 17 mM de Cr(VI) lo cual podriacutea deberse a
la mayor toxicidad de los medios de cultivo
Figura 7 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo con 33 mM de Cr(VI)
En la figura 8 se muestra la variacioacuten de la velocidad especiacutefica de crecimiento ( ) y de
lisis celular (kd) de Candida sp en funcioacuten de la concentracioacuten de SO42- a las diferentes
concentraciones de Cr(VI) ensayadas [0 17 y 33 mM]
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
49
Figura 8 Variacioacuten de la velocidad especiacutefica de crecimiento o de lisis celular en funcioacuten
de la concentracioacuten de SO42- a las diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI)
ensayadas
-0002
0
0002
0004
0006
0008
001
0012
0014
0016
0018
0 5 10 15 20 25 30
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Ve
loc
ida
d e
sp
ec
iacutefic
a [
h-1
]
0 mM
17 mM
33 mM
Promedio
Sin Cr(VI)
50
Cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo sin Cr(VI) su velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento se mantuvo praacutecticamente constante en todo el intervalo de
concentracioacuten de sulfato ensayado con un valor promedio de 00144 h-1
A la concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la velocidad especiacutefica de crecimiento de
Candida sp aumentoacute casi linealmente con respecto a la concentracioacuten de sulfato en el
intervalo de concentracioacuten de 0 a 10 mM (r2 = 096) alcanzando un valor maacuteximo de
00142 h-1 a la uacuteltima concentracioacuten de sulfato Esta velocidad especiacutefica de crecimiento
es muy similar a las obtenidas en los cultivos sin Cr(VI) A concentraciones de sulfato
superiores a 5 mM la velocidad especiacutefica de crecimiento se mantuvo praacutecticamente
constante Estos resultados concuerdan con los perfiles de crecimiento celular mostrados
anteriormente
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM se obtuvieron
velocidades especiacuteficas de lisis celular (kd) de 00013 a 00003 h-1 ( = -00013 - 00003
h-1) en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de 0 a 5 mM (figura 8) A
concentraciones de sulfato superiores a 5 mM la velocidad neta de crecimiento fue
positiva La velocidad especiacutefica aumentoacute linealmente en todo el intervalo de
concentracioacuten de sulfato ensayado (r2 = 099) aunque las velocidades alcanzadas fueron
notoriamente inferiores a las obtenidas en los medios de cultivo sin Cr(VI) y con una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM
De los resultados anteriores se deduce que el sulfato desempentildea un papel importante en
la tolerancia (resistencia) de Candida sp a los efectos toacutexicos del Cr(VI) A medida que
se incrementoacute la concentracioacuten de sulfato la levadura fue maacutes tolerante (resistente) a
51
los efectos dantildeinos del Cr(VI) y por consiguiente su crecimiento celular fue menos
afectado Asimismo los resultados muestran que el ―efecto protector del sulfato sobre el
crecimiento de Candida sp dependioacute de la concentracioacuten inicial de Cr(VI)
Pepi y Baldi (1992) investigaron el efecto de diferentes aminoaacutecidos azufrados y del
sulfato sobre la tolerancia de algunas levaduras al Cr(VI) Estos investigadores
encontraron que en presencia de 02 mM de Cr(VI) se requirieron pequentildeas cantidades
de cisteiacutena [001ndash01 mM] para estimular significativamente [10-100] el crecimiento
de Rhodosporidium sp y que para incrementar el crecimiento de Candida sp en hasta
80 fue necesaria una concentracioacuten de cisteiacutena de 01 mM Un comportamiento similar
se observoacute en estas dos cepas cuando se adicionoacute metionina En contraste el
crecimiento celular de Candida famata fue inhibido cuando la levadura se cultivoacute en
medios con concentraciones de cisteiacutena superiores a 005 mM y con 02 mM de Cr(VI)
Por otra parte cuando Candida sp se cultivoacute en medios con diferentes concentraciones
de sulfato (4ndash160 mM) y de Cr(VI) (004ndash02 mM) se encontroacute que el ioacuten sulfato
incrementoacute la tolerancia de la levadura al Cr(VI) El mecanismo general de resistencia al
cromato en Candida sp se atribuyoacute a una reducida captacioacuten (incorporacioacuten) de cromo
(Pepi y Baldi 1992)
Ohtake y col (1987) encontraron que la adicioacuten de altas concentraciones de sulfato
incrementoacute el crecimiento celular de dos cepas de Pseudomonas fluorescens (LB300 y
LB303) en presencia de CrO42- Ademaacutes encontraron que el nivel de resistencia al CrO4
2-
en P fluorescens dependioacute de la fuente de azufre en el medio de cultivo ya que las
ceacutelulas bacterianas que crecieron con cisteiacutena fueron mucho maacutes resistentes al CrO42-
que las ceacutelulas que crecieron sobre sulfato Como el cromato es transportado al interior
52
de las ceacutelulas de Pseudomonas a traveacutes del sistema de transporte del sulfato la habilidad
del sulfato para proteger a las ceacutelulas de P fluorescens LB300 de los efectos inhibitorios
del Cr(VI) se atribuyoacute a que el sulfato inhibioacute competitivamente la captacioacuten del cromato
por las ceacutelulas bacterianas (Ohtake y col 1987)
En contraste la resistencia de Ochrobactrum tritici cepa 5bvI1 al Cr(VI) fue
independiente de la concentracioacuten de sulfato (Branco y col 2004)
412 Evaluacioacuten del efecto del sulfato sobre el consumo de glucosa por Candida
sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
La glucosa fue completamente consumida (eficiencia global de consumo de glucosa =
100) en aproximadamente 83 h de incubacioacuten cuando la levadura se cultivoacute en medios
que no conteniacutean Cr(VI) y con diferentes concentraciones de sulfato No se observoacute
diferencia considerable en el consumo de glucosa a ninguna de las concentraciones de
sulfato utilizadas (figura 9)
53
Figura 9 Variacioacuten en el consumo de glucosa por Candida sp cuando se utilizaron
medios de cultivo con diferentes concentraciones de sulfato y sin Cr(VI)
En los experimentos realizados con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM
(figura 10) se observoacute que la levadura fue capaz de consumir aproximadamente 30-
35 de la glucosa inicialmente adicionada a los medios que conteniacutean sulfato a
concentraciones de 0 y 1217 mM a pesar de que a estas condiciones de cultivo ocurrioacute
lisis celular [0 mM de SO42-] o el crecimiento celular de la levadura fue despreciable
[1217 mM de SO42-] (figura 6) Candida sp consumioacute todo el monosacaacuterido presente
en los medios de cultivo con concentraciones de sulfato superiores a 1217 mM
(eficiencia global de consumo de glucosa del 100) sin embargo el tiempo que se
requirioacute para que eacutesto sucediera disminuyoacute a medida que se incrementoacute la concentracioacuten
de sulfato (figura 10) Los perfiles de consumo de glucosa en los cultivos de Candida
sp fueron semejantes cuando se utilizaron concentraciones de sulfato de 10 a 2392
mM y eacutestos a su vez fueron similares a los obtenidos en los medios de cultivo que no
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa
re
sid
ua
l [
]0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
54
conteniacutean Cr(VI) (figuras 9 y 10) Lo anterior podriacutea deberse a que el crecimiento
celular de estos cultivos fue semejante (figura 6)
Figura 10 Variacioacuten del porcentaje de glucosa residual en los cultivos de Candida sp a
las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas y con 17 mM de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
55
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM los niveles de glucosa
residual disminuyeron a medida que aumentoacute la concentracioacuten de sulfato (figura 11)
Sin embargo estos niveles fueron superiores a los alcanzados a 17 mM de Cr(VI) a
todas las concentraciones de sulfato ensayadas La mayor eficiencia de consumo de
glucosa fue de aproximadamente 80 y se obtuvo a una concentracioacuten de sulfato de
2392 mM
Figura 11 Variacioacuten del porcentaje de glucosa residual en los cultivos por lote de
Candida sp a las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas y con 33 mM de
Cr(VI)
A las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas [17 y 33 mM] se observoacute que
en las primeras horas de incubacioacuten los cultivos de levadura en los que ocurrioacute lisis
celular consumieron una determinada cantidad de glucosa la cual probablemente se
utilizoacute para el mantenimiento de las ceacutelulas vivas
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa r
es
idu
al [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
56
Tanto en los experimentos realizados a 17 como a 33 mM de Cr(VI) se encontroacute que
los cultivos que alcanzaron mayores densidades celulares fueron los que consumieron
mayor cantidad de glucosa y esto ocurrioacute cuando se utilizaron concentraciones altas de
sulfato
413 Evaluacioacuten del efecto del sulfato sobre la variacioacuten del pH de los cultivos
de Candida sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
Los perfiles de variacioacuten del pH de los medios de cultivo fueron muy semejantes a las
diferentes concentraciones de sulfato ensayadas cuando la levadura se cultivoacute en los
medios de cultivo sin Cr(VI) (figura 12) A todas las concentraciones de sulfato
utilizadas el pH disminuyoacute desde aproximadamente 6 hasta 28 en las primeras once
horas de incubacioacuten En el periodo comprendido entre las 11 y las 60 h de incubacioacuten el
pH de los medios de cultivo disminuyoacute ligeramente hasta alcanzar valores cercanos a
25 A tiempos posteriores a 60 h el pH de los medios de cultivo se mantuvo
praacutecticamente constante
Figura 12 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo de Candida sp en ausencia de
Cr(VI) y a las diferentes concentraciones de SO42- ensayadas
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
57
En la figura 13 se muestran los perfiles de variacioacuten del pH de los medios de cultivo
cuando la levadura se cultivoacute a las diferentes concentraciones de sulfato y a una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM El pH de los cultivos disminuyoacute raacutepidamente
en las primeras 15 h de incubacioacuten a todas las concentraciones de sulfato ensayadas La
disminucioacuten del pH fue mayor en los cultivos con las concentraciones maacutes altas de
sulfato lo cual podriacutea deberse a que a estas condiciones la levadura consumioacute mayor
cantidad de glucosa y las densidades celulares alcanzadas fueron maacutes altas A tiempos
de incubacioacuten superiores a 15 h el pH continuoacute disminuyendo pero a menor velocidad
Los niveles de pH maacutes bajos se obtuvieron cuando se utilizaron concentraciones de
sulfato de 5 a 2392 mM alcanzaacutendose valores semejantes a los obtenidos en los medios
sin Cr(VI) (de aproximadamente 25)
Figura 13 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
58
Un comportamiento cualitativo similar se obtuvo cuando Candida sp se cultivoacute en medios
con diferentes concentraciones de sulfato y con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33
mM (figura 14) El pH maacutes bajo se alcanzoacute a concentraciones altas de sulfato [20 y
2392 mM] y fue de aproximadamente 36 el cual es superior a los valores maacutes bajos
que se obtuvieron en los cultivos sin Cr(VI) y con 17 mM de Cr(VI) Esto uacuteltimo podriacutea
deberse a que el incremento de la concentracioacuten celular y el consumo de glucosa fueron
inferiores a los alcanzados con las otras concentraciones de Cr(VI) [0 y 17 mM]
Figura 14 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
414 Efecto del sulfato sobre la remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp
En la figura 15 se muestran las variaciones del porcentaje de Cr(VI) residual de los
cultivos de Candida sp cuando se emplearon diferentes concentraciones de sulfato y
una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM A una concentracioacuten de sulfato de 0 mM
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
59
la remocioacuten de Cr(VI) fue muy baja (de aproximadamente 83) es conveniente
mencionar que a esta concentracioacuten de sulfato (0 mM) y de Cr(VI) (17 mM) ocurrioacute lisis
celular y la levadura consumioacute una pequentildea cantidad de glucosa en las primeras horas
de incubacioacuten La remocioacuten de Cr(VI) se incrementoacute a medida que aumentoacute la
concentracioacuten de sulfato de 0 a 10 mM A partir de esta uacuteltima concentracioacuten de sulfato
los perfiles de remocioacuten de Cr(VI) fueron muy similares y esto podriacutea deberse a que la
densidad celular de los cultivos fueron praacutecticamente iguales Todo o casi todo el Cr(VI)
inicialmente adicionado a los medios de cultivo fue removido cuando se empleoacute una
concentracioacuten de sulfato igual o superior a 25 mM (figura 15)
Figura 15 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
En contraste cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM la levadura
no fue capaz de remover todo el Cr(VI) inicialmente presente en los medios de cultivo a
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
60
ninguna de las concentraciones de sulfato ensayadas (figura 16) Sin embargo los
niveles de Cr(VI) residual disminuyeron a medida que se incrementoacute la concentracioacuten de
sulfato
Figura 16 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
A las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas los cultivos de levadura en los
que ocurrioacute lisis celular en las primeras horas de incubacioacuten [0 mm de SO42- 17 mM de
Cr(VI) y 0-5 mM de SO42- 33 mM de Cr(VI)] fueron capaces de remover una pequentildea
cantidad de Cr(VI) Estos resultados concuerdan con lo reportado por Wang y Shen
(1997) quienes encontraron que la densidad celular de los cultivos de Escherichia coli y
Bacillus sp disminuyoacute continuamente durante el curso de la remocioacuten de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
61
A las diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI) y de sulfato ensayadas se observoacute
que aunque los niveles de Cr(VI) residual disminuyeron a medida que la incubacioacuten
progresoacute las concentraciones de cromo total en solucioacuten permanecieron casi constantes
a lo largo de todo el periodo de incubacioacuten (aproximadamente el 97 del cromo
inicialmente adicionado a los medios de cultivo estuvo siempre presente en solucioacuten)
Maacutes auacuten el anaacutelisis del contenido de cromo en la biomasa de Candida sp (de muestras
recolectadas al final de los experimentos) reveloacute que uacutenicamente el 29 009 del
cromo total removido por los cultivos fue incorporado en la biomasa
Como se mostroacute anteriormente los cultivos con ceacutelulas viables se iniciaron con un pH de
aproximadamente 60 y eacuteste disminuyoacute durante el tiempo de incubacioacuten hasta valores de
25 ndash 36 dependiendo de la concentracioacuten de sulfato y de Cr(VI) utilizada Como se
sabe que los pHacutes bajos favorecen la reduccioacuten del Cr(VI) por la materia orgaacutenica
(donadores de electrones) en el presente trabajo se llevaron a cabo experimentos sin
biomasa de Candida sp (controles libres de ceacutelulas) a diferentes valores de pH (25 3
4 5 y 6) y a las dos diferentes concentraciones de Cr(VI) ensayadas (17 y 33 mM)
para determinar si los componentes presentes en los medios de cultivo pueden reducir el
Cr(VI) En las figuras 17 y 18 se muestran los perfiles de Cr(VI) residual que se
obtuvieron con los controles abioacuteticos ensayados
62
Figura 17 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los controles libres de
ceacutelulas llevados a cabo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y a diferentes
valores de pH
Figura 18 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los controles libres de
ceacutelulas realizados con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y a diferentes
valores de pH
00
200
400
600
800
1000
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
pH = 25
pH = 3
pH = 4
pH = 5
pH = 6
00
200
400
600
800
1000
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
pH = 25
pH = 3
pH = 4
pH = 5
pH = 6
63
A las dos concentraciones de Cr(VI) ensayadas se observoacute una reduccioacuten despreciable
del metal (inferior a 05) en el intervalo de valores de pH de 4 a 6 a un pH de 3 el
porcentaje de reduccioacuten fue de aproximadamente 12 y de 3 cuando el pH fue de
25 Estos resultados sugieren que los componentes de los medios de cultivo
praacutecticamente no redujeron el Cr(VI) a ninguno de los pHrsquos ensayados
En conjunto los resultados antes mostrados indican que el principal mecanismo de
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp fue la biotransformacioacuten (reduccioacuten) del Cr(VI) a
Cr(III) y que la reduccioacuten abioacutetica del Cr(VI) y la captacioacuten de cromo por la biomasa de
la levadura fueron despreciables Asimismo los resultados tambieacuten muestran que la
reduccioacuten del Cr(VI) por los cultivos se debioacute a la actividad metaboacutelica de las ceacutelulas de
Candida sp
En la figura 19 se presentan las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) que se
obtuvieron a las diferentes concentraciones iniciales de sulfato y de Cr(VI) ensayadas Se
aprecia que cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la eficiencia
de reduccioacuten se incrementoacute desde 179 hasta 986 a medida que la concentracioacuten
de sulfato aumentoacute de 0 a 25 mM a concentraciones de sulfato superiores la eficiencia
de reduccioacuten fue del 100 Asimismo en los experimentos realizados a 33 mM de
Cr(VI) la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) aumentoacute desde 83 hasta 84 conforme la
concentracioacuten de sulfato aumentoacute de 0 a 2392 mM
64
Figura 19 Eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por los cultivos de
Candida sp a las diferentes concentraciones de sulfato y de Cr(VI) ensayadas
La velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) tambieacuten fue afectada por la
concentracioacuten de sulfato y de Cr(VI) utilizada (figura 20) Cuando se empleoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten maacutes alta
fue de 098 mg de Cr(VI)Lh y se obtuvo en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de
10 a 2392 mM En cambio la velocidad maacutes alta que se alcanzoacute a 33 mM de Cr(VI) fue
de 044 mg de Cr(VI)Lh y se obtuvo a la maacutexima concentracioacuten de sulfato ensayada
(2392 mM)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 1217 25 5 10 15 20 2392
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Efi
cie
ncia
glo
bal d
e r
ed
uccioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
17 mM
33 mM
65
Figura 20 Velocidades volumeacutetricas globales de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas en los
cultivos de Candida sp a diferentes concentraciones de sulfato y de Cr(VI)
A todas las concentraciones de sulfato ensayadas la eficiencia y velocidad volumeacutetrica de
reduccioacuten de Cr(VI) alcanzadas a una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM fueron
superiores a las obtenidas a 33 mM de Cr(VI) y esto podriacutea deberse a que los efectos
toacutexicos del Cr(VI) sobre la levadura se incrementan a medida que aumenta la
concentracioacuten del metal
De los resultados anteriores es evidente que el sulfato afectoacute la reduccioacuten aeroacutebica de
Cr(VI) por Candida sp Estos resultados difieren con lo reportado por otros
investigadores quienes no han encontrado un efecto inhibidor ni estimulador del sulfato
sobre la reduccioacuten de Cr(VI) en cultivos aeroacutebicos
000
010
020
030
040
050
060
070
080
090
100
0 1217 25 5 10 15 20 2392
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica d
e r
ed
uccioacute
n d
e C
r(V
I)
[mg
de
Cr(
VI)
Lh
]
17 mM
33 mM
66
Ishibashi y col (1990) encontraron que concentraciones de sulfato de hasta 1 mM
incrementaron la resistencia de Pseudomonas putida al cromato pero no tuvieron efecto
sobre la reduccioacuten de eacuteste En cultivos de Bacillus sp (Wang y Xiao 1995) y de
Acinetobacter haemolyticus (Zakaria y col 2006) se observoacute que una concentracioacuten de
sulfato de 10 mM no afectoacute la reduccioacuten de Cr(VI) Liu y col (2006) reportaron que
concentraciones de sulfato de 40 y 80 mgL (0416 y 083 mM) no tuvieron efecto sobre
la reduccioacuten aeroacutebica de Cr(VI) por Bacillus sp XW-4
En contraste el sulfato generalmente tiene efecto sobre la reduccioacuten bacteriana del
cromato bajo condiciones de anaerobiosis lo cual podriacutea deberse a que el sulfato compite
con el cromato como aceptor final de electrones (Garbisu y col 1998 Liu y col 2006)
En cultivos anaeroacutebicos de Escherichia coli ATCC 33456 la velocidad de reduccioacuten de
Cr(VI) no fue afectada por hasta 416 mM de sulfato sin embargo la velocidad
disminuyoacute a 83 mM de sulfato (Shen y Wang 1994) La actividad de reduccioacuten de Cr(VI)
de Enterobacter cloacae HO1 bajo condiciones anaeroacutebicas fue inhibida en 32 en
presencia de tan soacutelo 25 M de sulfato (Komori y col 1989)
Como se mencionoacute anteriormente el sulfato incrementoacute la tolerancia al Cr(VI) de la cepa
de Candida sp aislada por Pepi y Baldi (1992) sin embargo esta cepa de levadura fue
incapaz de reducir el Cr(VI) Asimismo auacuten cuando se ha reportado que Pseudomonas
fluorescens LB300 es capaz de reducir el Cr(VI) a Cr(III) (Bopp y Ehrlich 1988) y que el
sulfato incrementa el crecimiento celular de esta bacteria en presencia de cromato
(Ohtake y col 1987) hasta donde sabemos no se ha reportado el efecto del sulfato
sobre la reduccioacuten de Cr(VI) por este microorganismo
67
Los resultados anteriores muestran claramente que el sulfato afectoacute la tolerancia de
Candida sp al Cr(VI) y a su capacidad para reducirlo Es evidente que a medida que se
incrementoacute la concentracioacuten de sulfato el crecimiento de la levadura fue mayor y su
eficiencia y velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) aumentaron Los resultados tambieacuten
muestran que la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp depende de la densidad celular de
los cultivos de manera tal que a mayor cantidad de biomasa generada mayor es la
reduccioacuten de Cr(VI) Aun cuando la cepa de Candida sp es muy sensible a los efectos
toacutexicos del Cr(VI) en ausencia de sulfato esta levadura posee una capacidad notable
para reducir muy altas concentraciones del metal en presencia de sulfato
Meta No 2 Determinar la capacidad de reduccioacuten de Cr(VI) en
diferentes sistemas de reaccioacuten
42 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso
Se utilizoacute un reactor airlift con tubo conceacutentrico liso (sin perforaciones) para el cultivo por
lote de Candida sp Para este sistema de reaccioacuten se utilizoacute un volumen de operacioacuten de
4 litros de medio basal con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM El biorreactor
se inoculoacute con un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada de tal
forma que la concentracioacuten inicial de biomasa fue de 12 mgmL El pH inicial fue de
aproximadamente 60 El reactor se operoacute por lote hasta que la concentracioacuten de Cr(VI)
residual fue despreciable
68
La concentracioacuten celular se incrementoacute gradualmente a medida que la incubacioacuten
progresoacute hasta que alcanzoacute un valor maacuteximo de aproximadamente 39 gL lo cual
ocurrioacute a las 42 h de incubacioacuten A tiempos posteriores la concentracioacuten de biomasa
disminuyoacute debido a que ocurrioacute lisis celular (figura 21) La velocidad especiacutefica maacutexima
de crecimiento de la levadura fue de 00244 h-1 la cual fue superior a la obtenida en
matraz cuando crecioacute con 17 mM de Cr(VI) (00142 h-1) esta diferencia podriacutea deberse
a que en el reactor airlift las ceacutelulas de Candida sp tuvieron una mayor cantidad de
oxiacutegeno disponible para su crecimiento
Figura 21 Variacioacuten de la concentracioacuten de biomasa y de glucosa en el cultivo por lote
de Candida sp en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM
La levadura consumioacute la principal fuente de carbono y energiacutea (glucosa) presente en el
medio de cultivo a lo largo de todo el tiempo de incubacioacuten incluso durante el periodo en
el que ocurrioacute lisis celular La glucosa no fue completamente consumida por la levadura
00
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo [h]
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e g
luc
os
a
res
idu
al [g
L]
00
05
10
15
20
25
30
35
40
45
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e b
iom
as
a [
gL
]Glucosa Biomasa
69
al final del experimento la concentracioacuten de glucosa residual fue de 17 gL (figura 21)
por lo que la eficiencia global de consumo del monosacaacuterido fue del 835
El pH del medio de cultivo disminuyoacute desde 60 hasta aproximadamente 25 Este uacuteltimo
valor se alcanzoacute a las 292 h de incubacioacuten y se mantuvo praacutecticamente constante a
tiempos posteriores (figura 22)
Figura 22 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) y del pH en el cultivo por lote de
Candida sp en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM
La concentracioacuten de Cr(VI) residual disminuyoacute progresivamente a medida que se
incrementoacute el tiempo de incubacioacuten hasta que a las 468 h ya no se detectoacute Cr(VI) en el
medio de cultivo por lo que la eficiencia global de remocioacuten de Cr(VI) fue del 100 Se
observoacute una ligera remocioacuten de Cr(VI) durante el periodo en el que ocurrioacute lisis celular
(figuras 21 y 22) En contraste la concentracioacuten de cromo total en solucioacuten se
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo [h]
Cr(
VI)
y C
rom
o t
ota
l re
sid
ua
l [m
gL
]
00
10
20
30
40
50
60
70
pH
[Cr(VI)] [Cromo total] pH
70
mantuvo casi constante a lo largo del tiempo de cultivo Lo anterior indica que la
levadura fue capaz de transformar el Cr(VI) a la forma trivalente menos toacutexica
En la tabla 6 se comparan los valores de algunas variables cineacuteticas obtenidas en
matraz (cuando se hizo crecer la levadura a una concentracioacuten de Cr(VI) inicial de 17
mM) y en el biorreactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando la levadura se cultivoacute en
medio de cultivo con concentraciones iniciales semejantes de Cr(VI) y de sulfato
Tabla 6 Variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote de Candida sp realizados
en matraz y en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Variable cineacutetica Matraz Reactor
Incremento celular maacuteximo [gL] 22 263
Velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento [h-1] 00142 00244
Eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) [] 100 100
Velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI)L h] 098 164
Velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI) g biomasa h] 045 095
Capacidad de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI) g biomasa] 400 443
El incremento celular maacuteximo y la velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento de
Candida sp obtenidos en el reactor airlift fueron 1955 y 718 superiores a los
alcanzados en matraz respectivamente Como se mencionoacute previamente eacutesto podriacutea
deberse a que en el reactor airlift la levadura tuvo una mayor cantidad de oxiacutegeno
disponible para su crecimiento
71
La levadura redujo todo el Cr(VI) inicialmente presente en el medio de cultivo [eficiencia
global de reduccioacuten de Cr(VI) del 100] tanto cuando se cultivoacute en matraz como en el
reactor airlift El hecho de que Candida sp sea capaz de reducir concentraciones de
Cr(VI) tan altas como 15 mM (e incluso superiores como se mostroacute en la seccioacuten
anterior) podriacutea ser de importancia praacutectica porque la mayoriacutea de los microorganismos
ensayados son capaces de reducir parcial o totalmente concentraciones maacutes bajas de
Cr(VI) (tabla 7)
Tabla 7 Datos sobre reduccioacuten de Cr(VI) por microorganismos
Microorganismo Cultivo
Modo de
operacioacuten
Concentra-
cioacuten de
Cr(VI)
[mM]
Velocidad
volumeacutetrica
de reduccioacuten
[mg de
CrLh]
Eficiencia
de
reduccioacuten
[]
Referencia
Acinetobacter
haemolitycus
Aerobio
CPL
067 128 88 Zakaria y col
2006
Aislado de
Pseudomonas
(CRB5)
Aerobio
CPL
043 014 100 McLean y
Beveridge 2000
Arthrobacter
sp
Aerobio
CPL
017 016 65 Megharaj y col
2003
Aspergillus sp Aerobio
CPL
096 0694 100 Acevedo-Aguilar
y col 2006
Bacillus
megaterium
TKW3
Aerobio
CPL
048 009 735 Cheung y Gu
2005
Bacillus sp Aerobio
CPL
007 007 65 Megharaj y col
2003
Bacteria J3 Aerobio
CPL
01 00057 21 Badar y col
2000
Brevibacterium
CrT-13
Aerobio
CPL
288 255 68 Faisal y Hasnain
2004
E coli AC80 Aerobio
CPL
002
065
9375
Ishibashi y col
1990
Ochrabactrum
sp
Aerobio
CPL
017
034
033
038
100
88
Thacker y
Madamwar 2005
72
Ochrobactrum
intermedium Cr-
T1
Aerobio
CPL
288 326 87 Faisal y Hasnain
2004
Penicillium sp Aerobio
CPL
096 066 95 Acevedo-Aguilar y
col 2006
Phanerochaete
chrysosporium
Aerobio
CPL
058 011 100 Pal 1997
Providencia
sp
Aerobio
CPL
102 10 100 Thacker y col
2006
Pseudomonas
ambigua G-1
Aerobio
CPL
288 347 83 Horitsu y col
1987
Streptomyces
griseus
Aerobio
CPL
017 025 100 Laxman y More
2002
Trichoderma
inhamatum
Aerobio
CPL
13
075 100 Morales-Barrera y
Cristiani-Urbina
2008
Trichoderma
viride
Aerobio
CPL
16
104 100 Morales-Barrera y
Cristiani-Urbina
2006
CPL = Cultivo por lote
La velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) obtenida en el reactor neumaacutetico
con Candida sp fue de 164 mg de Cr(VI)Lh la cual fue 6735 superior a la alcanzada
en matraz [098 mg de Cr(VI)Lh] (tabla 6) Esto uacuteltimo podriacutea deberse a la mayor
cantidad de biomasa generada en el reactor la cual redujo maacutes raacutepidamente el Cr(VI)
Acinetobacter haemolitycus fue capaz de reducir completamente 096 mM de Cr(VI) en
36 h por lo que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal de este microorganismo
fue de 139 mg de Cr(VI)Lh sin embargo cuando la concentracioacuten inicial de Cr(VI) se
incrementoacute a 135 mM la eficiencia y velocidad de reduccioacuten disminuyeron (Zakaria y
col 2006)
A una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 017 mM la eficiencia y velocidad volumeacutetrica
global de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por Ochrabactrum sp fue del 100 y 033 mg
de Cr(VI)Lh respectivamente Aunque la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal
73
se incrementoacute a 038 mg de Cr(VI)Lh cuando la concentracioacuten inicial de Cr(VI) fue de
034 mM la eficiencia de reduccioacuten disminuyoacute a 88 (Thacker y Madamwar 2005)
La eficiencia y velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas con Arthrobacter
sp a las 70 h de incubacioacuten fue de aproximadamente 65 y 016 mg de Cr(VI)Lh
cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial del metal de 017 mM (Megharaj y col 2003)
Con Providencia sp se obtuvo una eficiencia de reduccioacuten del 100 al cabo de 108 h de
incubacioacuten en medios de cultivo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 102 mM
siendo su velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal de 10 mg de Cr(VI)Lh (Thacker
y col 2006) La velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Streptomyces griseus
fue de 025 mg de Cr(VI)Lh cuando se cultivoacute en presencia de 017 mM de Cr(VI)
(Laxman y More 2002)
En el caso de eucariotes Acevedo-Aguilar y col (2006) reportaron que Penicillium sp y
Aspergillus sp fueron capaces de reducir por completo 096 mM de Cr(VI) en 72 h
obtenieacutendose una velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de 0694 mg de Cr(VI)Lh
Asimismo Trichoderma viride exhibioacute una eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) del 100 y
una velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de 104 mg de Cr(VI)Lh cuando se cultivoacute en
un reactor airlift en medio de cultivo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 16 mM
(Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006) Trichoderma inhamatum fue capaz de reducir
por completo 13 mM de Cr(VI) con una velocidad volumeacutetrica de 075 mg de Cr(VI)Lh
(Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2008)
En la tabla 7 se muestran los valores de eficiencia y velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten
de Cr(VI) obtenidas con otros microorganismos
74
La velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) que se obtuvo en el reactor airlift con
Candida sp fue de 095 mg de Cr(VI)g de biomasah (tabla 6) la cual fue 211 veces
mayor que la alcanzada en matraz [045 mg de Cr(VI)g de biomasah] Bae y col
(2000) reportaron que la velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) de Escherichia coli
ATCC 33456 se encontroacute en el intervalo de 031 a 07 mg de Cr(VI)g de biomasah
cuando este microorganismo se cultivoacute por lote en diferentes medios de cultivo con una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 096 mM A una concentracioacuten de Cr(VI) de 0096 mM
los lodos activados exhibieron una velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) de
aproximadamente 008 mg de Cr(VI)g de biomasah (Stasinakis y col 2003) El cultivo
por lote de Trichoderma inhamatum exhibioacute una velocidad especiacutefica de
aproximadamente 0584 mg de Cr(VI)g de biomasah cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 13 mM (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2008)
Asimismo en cultivos por lote de Providencia sp realizados con una concentracioacuten inicial
de Cr(VI) de 034 mM se obtuvo una velocidad especiacutefica de reduccioacuten del metal de
1302 mgg de biomasah (Thacker y col 2006)
En el presente trabajo se encontroacute que en el reactor airlift cada gramo (peso seco) de
biomasa producida de Candida sp pudo reducir 4438 mg de Cr(VI) (tabla 6) valor
ligeramente superior al encontrado en matraz [40 mg de Cr(VI)g de biomasa] y
semejante al reportado para Trichoderma inhamatum (Morales-Barrera y Cristiani-
Urbina 2008) Asimismo a las 60 h de incubacioacuten la capacidad de reduccioacuten de
Penicillium sp y Aspergillus sp fue de aproximadamente 082 y 042 mg de Cr(VI)g de
biomasa (Acevedo-Aguilar y col 2006) Wang y Shen (1997) reportaron que la
capacidad maacutexima de reduccioacuten de Cr(VI) de los cultivos aeroacutebicos de Bacillus sp y
75
Pseudomonas fluorescens LB300 fue de 208 x 10-12 y 310 x 10-12 mg de Cr(VI)ceacutelula
respectivamente si se toma en cuenta que el peso seco promedio de una ceacutelula
bacteriana tiacutepica es de aproximadamente 3 x 10-13 g (Atkinson y Mavituna 1983)
entonces la capacidad de reduccioacuten de Bacillus sp y P fluorescens LB300 seriacutea de 693 y
1033 mg de Cr(VI)g de biomasa respectivamente
43 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote repetido en el reactor airlift con
tubo conceacutentrico liso
Se realizaron algunos cultivos por lote repetido en el reactor airlift con tubo conceacutentrico
liso (sin perforaciones) En cada uno de los cultivos ensayados el reactor se inoculoacute
inicialmente con un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada de la
levadura para obtener una concentracioacuten inicial de biomasa de aproximadamente 12
mgmL La concentracioacuten inicial de Cr(VI) del medio de cultivo fue de aproximadamente
15 mM y el flujo de aire fue de 1 vvm El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que la
concentracioacuten de Cr(VI) residual en el medio fue baja (primer cultivo por lote) a
continuacioacuten una parte del medio de cultivo contenido en el reactor se drenoacute y se
adicionoacute medio fresco con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM Posteriormente el
reactor se operoacute nuevamente por lote (segundo cultivo por lote o cultivo por lote
repetido) Se ensayaron tres relaciones de recambio de medio de cultivo (f = volumen de
medio cosechadovolumen inicial de medio de cultivo) de 08 06 y 04
Debido a la importancia que tiene el pH del medio de cultivo en los procesos
microbioloacutegicos de reduccioacuten de Cr(VI) en el presente trabajo se llevaron a cabo cultivos
por lote repetido con relaciones de recambio de 06 y 08 en los que el pH del medio de
76
cultivo se ajustoacute a 60 al inicio del segundo cultivo por lote (cultivo por lote repetido) asiacute
como experimentos en los que el pH no se ajustoacute a 60 por lo que el pH inicial del cultivo
por lote repetido fue el alcanzado al final del primer cultivo por lote (cercano a 30) Es
conveniente mencionar que los valores bajos de pH inhiben el crecimiento de los
microorganismos pero favorecen la reduccioacuten del Cr(VI) a Cr(III) al ocurrir esto uacuteltimo
disminuye el efecto toacutexico de la forma hexavalente del metal
En estos experimentos se observoacute que el crecimiento de la levadura y la reduccioacuten de
Cr(VI) fueron adversamente afectados cuando el pH del medio de cultivo se ajustoacute a 60
al inicio de los cultivos por lote repetido En la figura 23 se muestra la variacioacuten de la
concentracioacuten de Cr(VI) residual en los cultivos por lote y lote repetido realizados con y
sin ajuste del pH al inicio de los cultivos por lote repetido cuando se utilizaron relaciones
de recambio de 06 y 08
77
Figura 23 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los cultivos por lote y lote
repetido realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizaron
00
100
200
300
400
500
600
700
800
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [m
gL
]
f = 08 spH
f = 08 cpH
CPL CPLR
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [m
gL
] f = 06 spH
f = 06 cpH
CPL CPLR
78
relaciones de recambio de 06 y 08 (spH = sin ajuste de pH del medio de cultivo al
inicio del cultivo por lote repetido cpH = con ajuste de pH del medio de cultivo a 60 al
inicio del cultivo por lote repetido)
En la figura se aprecia que en los primeros cultivos por lote el Cr(VI) fue totalmente o
casi completamente reducido en aproximadamente 45-49 h Sin embargo en los cultivos
por lote repetido el tiempo que se requirioacute para reducir el Cr(VI) fue mayor Asimismo es
evidente que se alcanzaron concentraciones de Cr(VI) residual maacutes bajas en los sistemas
por lote repetido en los que no se ajustoacute el pH al inicio de los cultivos
Los resultados anteriores sugieren que la levadura pierde parte de su capacidad de
reduccioacuten de Cr(VI) cuando se cultiva repetidamente en medios que contienen Cr(VI)
Estos resultados concuerdan con lo reportado por Wang y Shen (1997) quienes
encontraron que Bacillus sp Pseudomonas fluorescens LB300 y Escherichia coli ATCC
33456 pierden su capacidad para reducir Cr(VI) despueacutes de que han reducido 046-052
058 y 125 mM de Cr(VI) respectivamente Un comportamiento similar tambieacuten fue
reportado por Middleton y col (2003) para Shewanella oneidensis
Como los niveles maacutes altos de reduccioacuten de Cr(VI) se obtuvieron cuando no se ajustoacute el
pH a 60 al inicio de los cultivos por lote repetido el experimento en el que se ensayoacute
una relacioacuten de recambio de 04 uacutenicamente se llevoacute a cabo sin ajustar el pH
En la figura 24 se muestra la variacioacuten de la concentracioacuten celular en los sistemas por
lote y lote repetido a las tres diferentes relaciones de recambio ensayadas (04 06 y
08) cuando no se ajustoacute el pH al inicio de los cultivos por lote repetido Se aprecia que
en ninguno de los cultivos por lote repetido se alcanzaron densidades celulares cercanas
79
a las de los cultivos por lote que los precedioacute En los cultivos por lote repetido el
incremento celular y la velocidad especiacutefica de crecimiento maacutes altos se obtuvieron
cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 06 (tabla 8) sin embargo los valores
alcanzados fueron inferiores a los obtenidos en el cultivo por lote que los antecedioacute
Figura 24 Variacioacuten de la concentracioacuten de biomasa con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo ensayadas
00
05
10
15
20
25
30
35
40
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Co
nce
ntr
acioacute
n d
e b
iom
asa
[g
L]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
80
Tabla 8 Variables cineacuteticas del crecimiento celular y de la reduccioacuten de Cr(VI)
obtenidas en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp llevados a cabo en el
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Variable Cultivo por lote Cultivo por lote repetido
Relacioacuten de recambio
04 06 08
Incremento celular
maacuteximo [gL]
224 230 235 017 038 009
Velocidad especiacutefica maacutexima de
crecimiento [h-1]
00244 00227 00220 00044 00109 00017
Eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) []
999 980 973 96 93 36
Velocidad
volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI)Lh]
160 178 151 035 046 045
En los cultivos por lote repetido se necesitoacute de una mayor cantidad de tiempo para
consumir la glucosa presente en los medios en comparacioacuten con los cultivos por lote del
cual derivaron (figura 25) Asimismo en ninguno de los cultivos se consumioacute
totalmente la glucosa la mayor eficiencia de consumo del monosacaacuterido de los cultivos
por lote repetido se obtuvo cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 06 con un
valor de 783 el cual es cercano al obtenido en los primeros cultivos por lote
(aproximadamente 835)
81
Figura 25 Variacioacuten de la concentracioacuten de glucosa con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo utilizadas
En la figura 26 se muestran los perfiles de variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI)
residual en funcioacuten del tiempo de incubacioacuten a las diferentes relaciones de recambio de
medio de cultivo utilizadas Se aprecia que en los primeros cultivos por lote se alcanzaron
niveles de Cr(VI) residual maacutes bajos y en menor tiempo que en los cultivos por lote
repetido
00
20
40
60
80
100
120
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e g
luc
os
a r
es
idu
al [g
L]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
82
Figura 26 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo ensayadas
En los primeros cultivos por lote se alcanzaron eficiencias y velocidades volumeacutetricas
globales de reduccioacuten de Cr(VI) de 973 - 999 y de 151 - 178 mgLh
respectivamente (tabla 8) Estas velocidades son superiores a la alcanzada en el cultivo
por lote realizado en matraz [098 mg de Cr(VI)Lh] y semejantes a la obtenida
previamente en el reactor airlift [164 mg de Cr(VI)Lh]
En los cultivos por lote repetido la eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) maacutes baja se
obtuvo cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 08 y esto podriacutea deberse a que el
tiempo de incubacioacuten que se utilizoacute para este cultivo fue menor que para los otros A las
relaciones de recambio de 04 y 06 las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
[Cr(
VI)
] [m
gL
]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
83
fueron semejantes con valores de 96 y 93 respectivamente Estas uacuteltimas eficiencias
fueron ligeramente inferiores a las obtenidas en los cultivos por lote que los precedioacute
(973-999) Las mayores velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) se
obtuvieron a relaciones de recambio de 06 y 08 [aproximadamente 045 mgLh] sin
embargo fueron considerablemente inferiores a la de los cultivos por lote que los
antecedioacute
44 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa en un reactor airlift
con tubo conceacutentrico liso
Para este sistema el reactor se inoculoacute con 50 mL de inoacuteculo y se dejoacute operar por lote
durante 48 horas con el propoacutesito de incrementar la densidad celular A continuacioacuten se
suministroacute continuamente medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de
15 mM [78 mgL] y con un flujo volumeacutetrico de 378 mLh por lo que la velocidad de
dilucioacuten ensayada fue de 00076 h-1 Se permitioacute que el reactor alcanzara el estado
estacionario lo cual se corroboroacute mediante la determinacioacuten de la concentracioacuten de
biomasa asiacute como de glucosa y de Cr(VI) residual de muestras colectadas a diferentes
tiempos
En el estado estacionario los valores promedio de concentracioacuten de biomasa glucosa
Cr(VI) residual y de pH fueron de 016 gL 62 gL 46 mgL y 345 respectivamente
De estos resultados es evidente que la concentracioacuten de biomasa en el reactor fue muy
baja lo que probablemente ocasionoacute que se alcanzaran valores bajos de eficiencia de
consumo de glucosa (38) y de reduccioacuten de Cr(VI) (41) asiacute como de velocidad
volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) (024 mgLh)
84
Posteriormente se ensayoacute un flujo de alimentacioacuten de 5 mLh para operar con una
velocidad de dilucioacuten de 001 h-1 Sin embargo bajo estas condiciones se presentoacute el
fenoacutemeno de lavado celular en el cual no se detecta biomasa en el reactor Este
experimento se realizoacute varias veces y en todos los casos se obtuvo el mismo resultado
El lavado celular que ocurrioacute en el cultivo continuo de Candida sp podriacutea deberse a que
la velocidad de dilucioacuten que se utilizoacute (001 h-1) es muy cercana a la velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento de la levadura [de aproximadamente 00146 h-1 determinada en
cultivo por lote en medio de cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM]
por lo que la levadura no tuvo tiempo suficiente para duplicarse y fue desplazada del
reactor Ademaacutes el suministro continuo de medio de alimentacioacuten con Cr(VI) ocasiona
que la levadura esteacute constantemente sujeta a los efectos toacutexicos del metal Es decir la
baja velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento de la levadura y los efectos toacutexicos
continuos del metal fueron probablemente los factores que limitaron la eficiencia y
velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) en cultivo continuo
Debido a que ocurrioacute lavado celular a una velocidad de dilucioacuten de 001 h-1 ya no fue
posible ensayar velocidades maacutes altas Los resultados obtenidos en cultivo continuo de
una etapa indican que este sistema de reaccioacuten no es adecuado para la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp
En la tabla 9 se presentan datos sobre la reduccioacuten de Cr(VI) por microorganismos en
cultivos continuos en suspensioacuten o inmovilizados Hasta donde es de nuestro
85
conocimiento no hay informacioacuten disponible acerca de la reduccioacuten de Cr(VI) por
levaduras y hongos filamentosos en cultivo continuo
Tabla 9 Resumen de datos sobre la reduccioacuten microbiana de Cr(VI) en cultivo continuo
Microorganismo Cultivo Concentra-
cioacuten de
Cr(VI) [mM]
Velocidad
de
dilucioacuten
[h-1]
Velocidad
volumeacutetrica
de reduccioacuten
[mg de
CrLh]
Eficiencia
de
reduccioacuten
[]
Referencia
Pseudomonas
sp C7
Aerobio 12
12
0014
0017
073
093
88
91
Gopalan y
Veeramani
1994
Pseudomonas
fluorescens
LB300
Aerobio 011
009
009
002
005
009
016
017
022
57
39
28
DeLeo y
Ehrlich
1994
Escherichia coli
ATCC 33456
Aerobio 08 005
169 843 Bae y col
2000
Pseudomonas
mendocina
MCM B-180
Aerobio
05
15
20
022
014
011
57
108
113
99
99
99
Bhide y
col 1996
Microbacterium
liquefaciens
MP30
Aerobio
(ceacutelulas
inmovilizadas
en perlas de
polivinil
alcohol-
alginato)
005
0038
009
90
Pattanapip
it-paisal y
col 2001
Bacillus sp Aerobio
(ceacutelulas
inmovilizadas
en perlas de
vidrio Pyrex)
192
192
004
008
397
797
998
998
Chirwa y
Wang
1997
86
En un estudio realizado en cultivo continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de Pseudomonas
fluorescens LB300 se encontroacute que la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute desde
57 hasta 28 y que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal se incrementoacute de
016 a 022 mg de Cr(VI)Lh a medida que la velocidad de dilucioacuten se incrementoacute de
002 a 009 h-1 cuando se utilizoacute medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI)
de 009 mM (DeLeo y Ehrlich 1994)
Los resultados obtenidos en cultivo continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de otros
microorganismos han sido alentadores Gopalan y Veeramani (1994) ensayaron tres
velocidades de dilucioacuten de 0014 0017 y 0028 h-1 y encontraron que la maacutexima
eficiencia (91) y velocidad volumeacutetrica [093 mg de Cr(VI)Lh] de reduccioacuten de Cr(VI)
de Pseudomonas sp C7 se obteniacutea a una velocidad de dilucioacuten de 0017 h-1 cuando se
utilizoacute medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de 12 mM En el estudio
realizado por Bae y col (2000) con Escherichia coli ATCC 33456 la velocidad de dilucioacuten
se mantuvo constante a 005 h-1 y se obtuvo una eficiencia y una velocidad volumeacutetrica
de reduccioacuten de Cr(VI) de 843 y de 169 mg de Cr(VI)Lh respectivamente cuando
se utilizoacute una concentracioacuten de Cr(VI) de 08 mM en el medio de alimentacioacuten En cultivo
continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de Pseudomonas mendocina MCM B-180 Bhide y col
(1996) ensayaron el efecto de diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI) [de 05 a
20 mM] y de velocidades de dilucioacuten (011 a 022 h-1) sobre la reduccioacuten de Cr(VI)
Estos investigadores encontraron altas eficiencias (99) y velocidades de reduccioacuten [57
ndash 113 mg de Cr(VI)Lh]
Asimismo con la finalidad de reducir los efectos toacutexicos del Cr(VI) sobre los
microorganismos se ha propuesto el uso de ceacutelulas inmovilizadas en reactores continuos
87
de lecho fijo Las ceacutelulas de Microbacterium liquefaciens MP30 inmovilizadas en perlas de
alginato de calcio - polivinil alcohol fueron capaces de reducir el Cr(VI) con una
eficiencia del 90 y con una velocidad de 009 mg de Cr(VI)Lh cuando se utilizoacute medio
de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de 005 mM y una velocidad de dilucioacuten
de 0038 h-1 (Pattanapipitpaisal y col 2001) En un reactor de lecho fijo con ceacutelulas de
Bacillus sp inmovilizadas en perlas de vidrio Pyrex con un diaacutemetro de 3 mm se observoacute
que al incrementar la velocidad de dilucioacuten de 004 a 008 h-1 la eficiencia de reduccioacuten
de Cr(VI) se mantuvo constante (998) y que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de
Cr(VI) se incrementoacute de 397 a 797 mgLh (Chirwa y Wang 1997)
45 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular y la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo conceacutentrico de
malla de acero inoxidable y de vidrio perforado
Los reactores airlift con tubo conceacutentrico liso (reactores convencionales) no son
adecuados para llevar a cabo cultivos por lote alimentado (procesos con volumen
variable) ya que no es posible lograr una adecuada circulacioacuten del liacutequido a cualquier
volumen de medio de cultivo En los reactores airlift convencionales uacutenicamente se logra
una adecuada circulacioacuten del fluido cuando la altura del liacutequido es mayor que la del tubo
conceacutentrico Por ello para realizar cultivos por lote alimentado en reactores airlift es
necesario que existan diversos puntos de comunicacioacuten entre las secciones de ascenso y
descenso del reactor a lo largo de toda la longitud del tubo conceacutentrico En la literatura
se han descrito algunos reactores airlift que en su interior contienen dispositivos que
permiten la comunicacioacuten entre ambas secciones del reactor Los dispositivos maacutes
comunes son tubos de mallas metaacutelicas (net draft tube) (Tung y col 1997 Wu y Wu
1990 1991 Wu y col 1992) tubos conceacutentricos de vidrio con perforaciones
88
rectangulares (Cristiani-Urbina y col 2000) placas curvas colocadas coaxialmente
(Hagino y col 1982) y bafles (placas) perforados (Galiacutendez-Mayer y col 2001) Estos
dispositivos afectan las caracteriacutesticas hidrodinaacutemicas y de transferencia de masa y calor
de los reactores por lo que es conveniente evaluar su desempentildeo
En este trabajo se evaluoacute la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivos por lote
utilizando reactores airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable asiacute como de
vidrio con perforaciones circulares Estos cultivos se realizaron con dos flujos de aire de
05 y 1 vvm Estos experimentos tuvieron como propoacutesito principal el seleccionar el tubo
conceacutentrico maacutes adecuado para llevar a cabo posteriormente los cultivos por lote
alimentado y lote alimentado repetido
En la figura 27 se muestran las curvas de crecimiento celular cuando se utilizoacute el reactor
airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos de aire
ensayados El crecimiento celular de la levadura fue mayor cuando se utilizoacute un flujo de
aire de 1 vvm lo cual podriacutea deberse a una mayor oxigenacioacuten del medio de cultivo Los
niveles de Cr(VI) residual maacutes bajos tambieacuten se obtuvieron con un flujo de aire de 1 vvm
(figura 28) y eacutesto podriacutea deberse a la mayor densidad celular alcanzada bajo estas
condiciones
89
Figura 27 Curvas de crecimiento celular de Candida sp en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos de aire ensayados
Figura 28 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual en los cultivos por lote realizados
en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos
de aire ensayados
000
050
100
150
200
250
00 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Tiempo [h]
XX
O
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
00 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Tiempo [h]
Cr(
VI)
Re
sid
ual [
]
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
90
En los experimentos realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado se
observoacute un comportamiento opuesto al obtenido previamente con el tubo conceacutentrico de
malla metaacutelica El crecimiento celular (figura 29) y la reduccioacuten de Cr(VI) (figura 30)
en el reactor con tubo conceacutentrico perforado fueron mayores a un flujo de aire de 05
vvm
Figura 29 Curvas de crecimiento celular de Candida sp en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico de vidrio perforado a los dos flujos de aire ensayados
000
050
100
150
200
00 500 1000 1500 2000 2500
Tiempo [h]
XX
O
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
91
Figura 30 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual en los cultivos por lote realizados
en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de vidrio perforado a los dos flujos de aire
ensayados
En la tabla 10 se muestran algunas variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote
realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable y con
tubo conceacutentrico perforado de vidrio a los dos flujos de aire ensayados Ademaacutes la tabla
incluye los resultados obtenidos en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
00 500 1000 1500 2000 2500
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ual [
] Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
92
Tabla 10 Variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote realizados en el reactor
airlift con las diferentes configuraciones de tubo conceacutentrico
Cultivo por lote
Variable cineacutetica Tubo conceacutentrico
liso
Malla metaacutelica Tubo conceacutentrico perforado
10 vvm 05 vvm 10 vvm 05 vvm 05 vvm 10 vvm
Incremento celular
maacuteximo [gL]
263 072 142 123 106 082
Velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento [h-1]
00244 00059 00120 00149 00178 00093
Eficiencia global de
reduccioacuten de Cr(VI) ()
100 67 95 97 95 89
Velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) [mg de Cr(VI)Lh]
164 031 056 082 084 035
Comparando los resultados obtenidos en el reactor con tubo de malla metaacutelica y con el
de vidrio perforado la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) fue mayor cuando se
utilizoacute el tubo conceacutentrico perforado de vidrio y un flujo de aire de 05 vvm con un valor
promedio de dos experimentos independientes de 083 mgLh Sin embargo esta
velocidad es aproximadamente 494 inferior a la alcanzada con el tubo conceacutentrico liso
Los resultados de crecimiento celular (incremento celular maacuteximo y velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento) y de reduccioacuten de Cr(VI) (eficiencia y velocidad volumeacutetrica)
obtenidos en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable y de
vidrio perforado a los flujos de aire ensayados podriacutean sugerir que el grado de
oxigenacioacuten del medio de cultivo y la magnitud de los esfuerzos de corte que se alcanzan
durante la agitacioacuten neumaacutetica desempentildean un papel importante en la generacioacuten de
biomasa de Candida sp en los estados fisioloacutegicos de eacutesta y por consiguiente en la
93
reduccioacuten de Cr(VI) Debido a lo anterior seriacutea conveniente investigar la influencia de la
velocidad de aireacioacuten la cual afecta los patrones de flujo del fluido la magnitud de las
fuerzas de corte y la concentracioacuten del nutriente gaseoso en la fase fluida
Como las mayores eficiencias y velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) se
obtuvieron cuando se utilizoacute el tubo conceacutentrico perforado de vidrio y un flujo de aire de
05 vvm eacutestos fueron utilizados en los cultivos por lote alimentados que se llevaron a
cabo posteriormente
46 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote alimentado
repetido en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado
En los cultivos por lote alimentado el volumen de medio liacutequido en el reactor se
incrementa gradualmente a medida que aumenta el tiempo de incubacioacuten Este cambio
de volumen provoca una dilucioacuten de los componentes presentes en el medio de cultivo lo
cual dificulta la interpretacioacuten de los resultados Debido a lo anterior en los cultivos por
lote alimentado es conveniente expresar el cambio de las variables (biomasa sustrato
etc) en teacuterminos de masa y no de concentracioacuten y para ello es necesario conocer el
volumen de medio a los diferentes tiempos de incubacioacuten Por consiguiente en el
presente trabajo se estimaron las cantidades de biomasa glucosa y de Cr(VI) y se
expresaron en teacuterminos de masa A continuacioacuten se presentan las ecuaciones para
calcular la masa de las variables de intereacutes para este trabajo
Masa celular [g] = (concentracioacuten celular gL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
94
Masa de glucosa [g] = (concentracioacuten de glucosa gL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
Masa de Cr(VI) [mg] = (concentracioacuten de Cr(VI) mgL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
En los cultivos por lote alimentado y lote alimentado repetido se ensayaron dos flujos
volumeacutetricos de medio de alimentacioacuten de 659 y 1343 mLh que corresponden a
cargas maacutesicas de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh respectivamente Los cultivos por lote
alimentado realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado se iniciaron con
cultivos por lote (los resultados obtenidos en estos uacuteltimos cultivos se mostraron en la
seccioacuten anterior)
Cuando se utilizoacute una carga maacutesica de Cr(VI) de 0514 mgh en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) se observoacute que la masa celular
de la levadura en el primer cultivo por lote alimentado fue mayor que en la del segundo
cultivo Sin embargo a pesar de que la levadura tuvo un suministro constante de fuente
de carbono y energiacutea eacutesta praacutecticamente no crecioacute
Cuando se utilizoacute una carga maacutesica de Cr(VI) de 0514 mgh fue evidente que en los
cultivos por lote alimentado se fue acumulando glucosa en el medio de cultivo lo que
indica que las ceacutelulas casi no consumieron el monosacaacuterido que teniacutean disponible para su
crecimiento La cantidad de glucosa consumida por la levadura en el cultivo por lote
alimentado repetido (segundo cultivo por lote alimentado) fue considerablemente menor
que la consumida en el primer cultivo lo cual podriacutea deberse a que habiacutea una menor
cantidad de biomasa en el reactor En el segundo cultivo por lote alimentado se alcanzoacute
95
una eficiencia de consumo de glucosa del 68 en cambio en el primer cultivo fue del
263
Se observoacute que la levadura fue capaz de reducir parcialmente el Cr(VI) adicionado al
reactor y que en el primer cultivo por lote alimentado se lograron mayores niveles de
reduccioacuten
En el primer cultivo por lote alimentado las eficiencias de reduccioacuten de Cr(VI) maacutes altas
se alcanzaron durante el periodo de incubacioacuten de las 468 a las 967 h (7188-7292)
y disminuyeron ligeramente hasta el final de este cultivo (673-6945) En el segundo
cultivo por lote alimentado (lote alimentado repetido) las eficiencias disminuyeron
gradualmente a medida que se incrementoacute el tiempo de incubacioacuten (figura 31) La
eficiencia promedio de reduccioacuten de Cr(VI) del primer cultivo por lote alimentado fue de
689 y la del segundo cultivo alimentado fue de 56
96
Figura 31 Variacioacuten de la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) de Candida sp cuando se
utilizoacute una carga maacutesica del metal de 0514 mgh
La velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute progresivamente a medida
que transcurrieron los cultivos por lote alimentado desde 0181 hasta 0063 mgLh
(figura 32) estos valores son inferiores a los alcanzados en los cultivos por lote
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Efi
cie
nc
ia d
e r
ed
uc
cioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
CPLA1 CPLA2
97
Figura 32 Variacioacuten de la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Candida sp
en el cultivo por lote alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) llevados a
cabo con una carga maacutesica del metal de 0514 mgh
Posteriormente se realizoacute el cultivo por lote alimentado y lote alimentado repetido
utilizando una carga maacutesica de Cr(VI) de 105 mgh Se observoacute que en ambos cultivos
la masa celular de Candida sp se incrementoacute gradualmente a medida que se incrementoacute
el tiempo de incubacioacuten aunque al final de cada cultivo hubo una ligera disminucioacuten en la
cantidad de biomasa en el reactor En el primer cultivo por lote alimentado se alcanzoacute un
valor maacuteximo de 523 g de biomasa (incremento celular de 053 g) a las 637 h
mientras que en el segundo cultivo se alcanzoacute una cantidad maacutexima de biomasa de 435
g (incremento celular de 13 g) a las 1822 h totales de cultivo que corresponden a 893
h del cultivo por lote alimentado repetido
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica g
lob
al d
e
re
du
ccioacute
n d
e C
r(V
I) [
mg
de
Cr(V
I)L
h]
CPLA1 CPLA2
98
Asimismo se encontroacute que la levadura fue capaz de consumir parcialmente la glucosa
suministrada En el primer cultivo por lote alimentado se obtuvo una eficiencia de
consumo de glucosa del 299 mientras que en el segundo cultivo la eficiencia fue del
388 Estos resultados probablemente se deban a que el crecimiento de la levadura fue
mayor en el cultivo por lote alimentado repetido (incremento celular = 13 g) que en el
cultivo por lote alimentado que lo precedioacute (incremento celular = 053 g)
En los cultivos por lote alimentados llevados a cabo con una carga maacutesica de 105 mg de
Cr(VI) la levadura fue capaz de reducir parcialmente el Cr(VI) adicionado al reactor sin
embargo al final del primer cultivo por lote alimentado se lograron los niveles de
reduccioacuten maacutes altos
En el primer cultivo por lote alimentado la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) se
incrementoacute a medida que aumentoacute el tiempo de incubacioacuten alcanzaacutendose el valor maacutes
alto de eficiencia (529) a las 879 h de incubacioacuten En contraste en el segundo cultivo
por lote alimentado (alimentado repetido) la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute
continuamente conforme transcurrioacute el tiempo de cultivo Al final del cultivo por lote
alimentado repetido la eficiencia de reduccioacuten del metal fue del 43 (figura 33)
99
Figura 33 Variacioacuten de la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) de Candida sp cuando se
utilizoacute una carga maacutesica del metal de 105 mgh
En estos experimentos tambieacuten se observoacute que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de
Cr(VI) disminuyoacute continuamente durante todo el periodo de incubacioacuten desde 0226
hasta 0099 mgLh (figura 34)
0
10
20
30
40
50
60
0 50 100 150 200 250
Tiempo [h]
Efi
cie
ncia
de
re
du
ccioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
CPLA1 CPLA2
100
Figura 34 Variacioacuten de la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Candida sp
en el cultivo por lote alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) llevados a
cabo con una carga maacutesica del metal de 105 mgh
Las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) que se obtuvieron con una carga maacutesica
del metal de 105 mgh fueron inferiores a las logradas con una carga de 0514 mgh y
esto podriacutea deberse a que el tiempo de contacto entre la levadura y el medio de cultivo
fue menor En contraste las velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) fueron
ligeramente superiores a una carga maacutesica de 105 mgh
Con las dos cargas maacutesicas de Cr(VI) que se ensayaron en este trabajo se observoacute una
variacioacuten semejante en el pH de los medios de cultivo Los cultivos por lote alimentado
se iniciaron con un pH de 302-306 (estos valores corresponden al pH que se obtuvo al
final de los cultivos por lote que precedioacute a los cultivos por lote alimentado) El pH se
000
004
008
012
016
020
024
0 50 100 150 200 250
Tiempo [h]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica g
lob
al d
e r
ed
uccioacute
n
de
Cr(V
I) [
mg
de
Cr(V
I)L
h]
CPLA1 CPLA2
101
incrementoacute ligeramente durante el curso de los primeros cultivos por lote alimentado y al
final de eacutestos se tuvieron valores de 355 y de 345 cuando se emplearon cargas maacutesicas
de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh respectivamente En los cultivos por lote alimentado
repetido el pH se mantuvo praacutecticamente constante durante todo el periodo de
incubacioacuten
A pesar de que el cultivo por lote alimentado es muy recomendable para trabajar con
compuestos toacutexicos ha sido poco explorado para el tratamiento de aguas contaminadas
con cromo hexavalente Fujii y col (1990) utilizaron el cultivo por lote alimentado para
investigar la reduccioacuten de Cr(VI) por la bacteria anaerobia Enterobacter cloacae cepa
HO1 En este estudio una solucioacuten de cromato se alimentoacute continuamente en pequentildeas
dosis para minimizar el efecto toacutexico del metal Los investigadores encontraron que la
reduccioacuten de Cr(VI) fue fuertemente afectada por la velocidad especiacutefica de alimentacioacuten
de cromato Cuando esta velocidad fue inferior a 25 mmol de CrO42-g de biomasah
todo el cromo adicionado fue reducido A velocidades de alimentacioacuten superiores se
observoacute que la concentracioacuten de Cr(VI) residual en el medio de cultivo se incrementaba a
medida que aumentaba la velocidad de alimentacioacuten Asimismo encontraron que la
actividad reductora de la bacteria era fuertemente inhibida cuando la concentracioacuten de
Cr(VI) del medio de cultivo era mayor a 07 mM (3639 mgL)
Posteriormente Fujie y col (1996) realizaron la simulacioacuten de un cultivo por lote
alimentado utilizando datos cineacuteticos obtenidos en cultivo por lote y un modelo
matemaacutetico que describe el comportamiento de la bacteria antes mencionada Los
resultados experimentales y los predichos por el simulador fueron semejantes
102
En la tabla 11 se presentan los valores de velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
obtenidos en el presente trabajo en los diferentes sistemas de reaccioacuten ensayados La
mayor velocidad se obtuvo en el cultivo por lote realizado en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso por lo que eacuteste seriacutea el sistema maacutes adecuado para la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp
103
Tabla 11 Velocidades volumeacutetricas globales de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas en diferentes sistemas de reaccioacuten
CPL
Matraz
CPL Reactor
airlift con
tubo liso
CPL Reactor
airlift con
malla metaacutelica
CC Reactor
airlift con
tubo liso
CPLR Reactor
airlift con
tubo liso
CPL Reactor
airlift con tubo
perforado
CPLA Reactor
airlift con
tubo perforado
CPLAR Reactor
airlift con
tubo perforado
10
Vvm
05
vvm
10
vvm
10
vvm
10
vvm
05
vvm
10
vvm
05
vvm
05
vvm
f=08 f=06 f=04
CM1 CM2 CM1 CM2
098 151 ndash178 031 056 024 045 046 035 084 035 0092-0181
0163-0195
0063-0083
0099-0145
CPL = Cultivo por lote CC = Cultivo continuo CPLR = Cultivo por lote repetido CPLA = Cultivo por lote alimentado CPLAR = Cultivo por lote alimentado repetido f = relacioacuten de recambio CM = Carga maacutesica de Cr(VI)
CM1 = 0514 mg Cr(VI)h CM2 = 105 mg Cr(VI)h
104
5 CONCLUSIONES
El sulfato desempentildea un papel importante en la tolerancia al Cr(VI) y en la reduccioacuten
del mismo en la cepa de Candida sp utilizada en este trabajo
El efecto modulador del sulfato sobre el crecimiento celular y la reduccioacuten del Cr(VI)
depende de las concentraciones de los oxianiones sulfato y cromato
El mecanismo principal de remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp es la biotransformacioacuten
del altamente toacutexico Cr(VI) al menos toacutexico Cr(III)
El cultivo por lote en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso es el sistema de
reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
La velocidad de aireacioacuten no tiene un efecto significativo sobre la reduccioacuten de Cr(VI)
por Candida sp
105
6 REFERENCIAS
1 Acevedo-Aguilar FJ Espino-Saldantildea AE Leoacuten-Rodriacuteguez IL Rivera-Cano ME Avila-Rodriguez M Wrobel K et al 2006 Hexavalent chromium removal in vitro and from industrial wastes using chromate-resistant strains of filamentous
fungi indigenous to contaminated wastes Can J Microbiol 52 809-815
2 Ali-Awan M Baig MA Iqbal J Aslam MR amp Ijaz N 2003 Recovery of chromium (III) from tannery wastewater J App Sci amp Environ Management 7 (2) 5-8
3 Aacutelvarez SG Maldonado M Gerth A amp Kuschk P 2004 Characterization of
tannery effluents and study of the water Hyacinth in chromium recovery Informacioacuten Tecnoloacutegica 15 (3) 75-80
4 Aravindhan BM Madani B Rao JR Nair BU amp Ramasami T 2004 Bioaccumulation of Chromium from Tannery Wastewater An Approach for chrome
recovery and reuse Environ Sci Technol 38 300-306
5 Atkinson B amp Mavituna F 1983 Biochemical engineering and biotechnology handbook United Kingom Nature Press
6 Badar U Ahmed N Beswick AJ Pattanapipitpaisal P amp Macaskie LE 2000 Reduction of chromate by microorganisms isolated from metal contaminated sites of
Karachi Pakistan Biotechnol Lett 22 829-836 7 Bae WC Kang TG Kang IK Won YJ amp Jeong BC 2000 Reduction of
hexavalent chromium by Escherichia coli ATCC 33456 in batch and continuous cultures J Microbiol 38(1) 36-39
8 Balasubramanian S amp Pugalenthi V 1999 Determination of total chromium in
tannery wastewater by inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry
flame atomic absorption spectrometry and uv-visible spectrophotometric methods Talanta 50 (3) 457-467
9 Baldi F Vaughan AM amp Olson GJ 1990 Chromium(VI)-resistant yeast
isolated from a sewage treatment plant receiving tannery wastes Appl Environ
Microbiol 56 (4) 913-918
10 Barnhart J 1997 Occurrences uses and properties of chromium Regulatory Toxicology and Pharmacology 26 S3-S7
11 Beleza VM Boaventura RA amp Almeida MF 2001 Kinetics of chromium removal from spent tanning liquors using acetylene production sludge Environ
Sci Technol 35 (21) 4379-4383 12 Bhide JV Dhakephalkar PK amp Paknikar KM 1996 Microbiological process for
the removal of Cr(VI) from chromate-bearing cooling tower effluent Biotechnol Lett 18 (6)667-672
106
13 Bopp LH amp Ehrlich HL 1988 Chromate resistance and reduction in
Pseudomonas fluorescens strain LB300 Archives of Microbiology 150 426-431
14 Branco R Alpoim MC amp Morais PV 2004 Ochrobactrum tritici strain 5bvI1 ndash characterization of a Cr(VI)-resistant and Cr(VI)-reducing strain Can J Microbiol
50 697-703 15 Camargo FAO Bento FM Okeke BC amp Frankenberger WT 2002 Chromate
reduction by chromium-resistant bacteria isolated from soils contaminated with dichromate Journal of Environmental Quality 32 1228-1233
16 Camargo FAO Okeke BC Bento FM amp Frankenberger WT 2003 In vitro
reduction of hexavalent chromium by a cell-free extract of Bacillus sp ES 29
stimulated by Cu2+ Appl Microbiol Biotechnol 62 569-573
17 Cantildeizares-Villanueva R 2000 Biosorcioacuten de metales pesados mediante el uso de biomasa microbiana Rev Latinoam Microbiol 42 131-143
18 Cervantes C Campos-Garciacutea J Devars S Gutieacuterrez-Corona F Loza-Tavera H Torres-Guzmaacuten JC amp Moreno-Saacutenchez R 2001 Interactions of chromium with
microorganisms and plants FEMS Microbio Rev 25 335-347 19 Chardin B Dolla A Chaspoul F Fardeau ML Gallice P amp Bruschi M 2002
Bioremediation of chromate thermodynamic analysis of the effects of Cr(VI) on sulfate-reducing bacteria Appl Microbiol Biotechnol 60 352-360
20 Chardin B Giudici-Orticoni MT De Luca G Guigliarelli B amp Bruschi M 2003
Hydrogenases in sulfate-reducing bacteria function as chromium reductase Appl
Microbiol Biotechnol 63 315-321
21 Cheung Y amp Gu G 2003 Reduction of chromate (CrO42-) by an enrichment
consortium and an isolate of marine sulfate-reducing bacteria Chemosphere 52 1523-1529
22 Cheung KH amp Gu JD 2005 Chromate reduction by Bacillus megaterium TKW3
isolated from marine sediments World Journal of Microbiology amp Biotechnology 21 213-219
23 Cheung KH amp Gu JD 2007 Mechanism of hexavalent chromium detoxification
by microorganisms and bioremediation application potential a review International
Biodeterioration amp Biodegradation 59 8-15
24 Chirwa EMN amp Wang YT 1997 Hexavalent chromium reduction by Bacillus sp in a packed-bed bioreactor Environ Sci Technol 31 1446-1451
25 Cristiani-Urbina E Netzahuatl-Muntildeoz AR Manriquez-Rojas FJ Juaacuterez-Ramiacuterez C Ruiz-Ordaz N amp Galiacutendez-Mayer J 2000 Batch and fed-batch
cultures for the treatment of whey with mixed yeast cultures Process Biochemistry 35 649-657
107
26 Czakoacute-Veacuter K Batiegrave M Raspor P Sipiczki M amp Pesti M 1999 Hexavalent
chromium uptake by sensitive and tolerant mutants of Schizosaccharomyces pombe FEMS Microbiology Letters 178 109-115
27 DeLeo PC amp Ehrlich HL 1994 Reduction of hexavalent chromium by
Pseudomonas fluorescens LB300 in batch and continuous cultures Appl Microbiol Biotechnol 40 756-759
28 Desjardin V Bayard R Lejeune P amp Gourdon R 2003 Utilization of supernatant of pure cultures of Streptomyces thermocarboxydus NH50 to reduce
chromium toxicity and mobility in contaminated soils Water Air and Soil Pollut 3 153-160
29 Eccles H 1999 Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process TIBTECH 17 462-465
30 Faisal M amp Hasnain S 2004 Comparative study of Cr(VI) uptake and reduction in
industrial effluent by Ochrobactrum intermedium and Brevibacterium sp
Biotechnology Letters 26 1623-1628
31 Fruchter J 2002 In situ treatment of chromium-contaminated groundwater Environ Sci amp Technol pp 464-472
32 Fujie K Hu H Huang X Tanaka Y Urano K amp Ohtake H 1996 Optimal operation of bioreactor system developed for the treatment of chromate wastewater
using Enterobacter cloacae HO-1 Wat Sci Tech 33 (5-6) 173-182 33 Fujii E Toda K amp Ohtake H 1990 Bacterial reduction of toxic hexavalent
chromium using a fed-batch culture of Enterobacter cloacae strain HO1 J Ferment Bioeng 69 (6) 365-367
34 Gaballah I Goy D Kilbertus G amp Thauront J 1994 Decontamination of
industrial effluents for environment protection and recycling of metals Resources
Conservation and Recycling 10 (1-2) 97-106
35 Galiacutendez-Mayer J Saacutenchez-Teja O Cristiani-Urbina E amp Ruiz-Ordaz N 2001 A novel split-cylinder airlift reactor for fed-batch cultures Bioprocess and Biosystems
Engineering 24 171-177 36 Ganguli A amp Tripathi AK 1999 Survival and chromate reducing ability of
Pseudomonas aeruginosa in industrial effluents Lett Appl Microbiol 28 76-80
37 Garbisu C Alkorta I Llama MJ amp Serra JL 1998 Aerobic chromate reduction by Bacillus subtilis Biodegradation 9 133-141
38 Gonzaacutelez AR Ndungrsquou K amp Flegal AR 2005 Natural occurrence of hexavalent chromium in the Aromas Red Sands Aquifer California Environ Sci Technol 39
(15) 5505-5511
108
39 Gopalan R amp Veeramani H 1994 Studies on microbial chromate reduction by
Pseudomonas sp in aerobic continuous suspended growth cultures Biotechnology and Bioengineering 43 471-476
40 Guertin J Jacobs JA amp Avakian CP 2005 Chromium(VI) Handbook 1st
edition CRC Press USA 41 Hach Water Analysis Handbook 2002 Hach Company Colorado USA 4th ed
pp 433-444 1210-1211
42 Hafez AI El-Manharawy MS amp Khedr MA 2002 RO membrane removal of unreacted chromium from spent tanning effluent A pilot-scale study Part 2 Desalination 144 (1-3) 237-242
43 Hagino H Odagiri H amp Okutani J 1982 Draft device for a bubble column US
Patent 4327042 44 Horitsu H Futo S Miyazawa Y Ogai S amp Kawai K 1987 Enzymatic
reduction of hexavalent chromium by hexavalent chromium tolerant Pseudomonas ambigua G-1 Agric Biol Chem 51 (9) 2417-2420
45 Ishibashi Y Cervantes C amp Silver S 1990 Chromium reduction in Pseudomonas
putida Appl Environ Microb 56 (7) 2268-2270
46 Jianlong W Zeyu M amp Xuan Z 2004 Response of Saccharomyces cerevisiae to
chromium stress Process Biochem 39 1231-1235 47 Juvera-Espinosa J Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2006 Isolation and
characterization of a yeast strain capable of removing Cr(VI) Enzyme and Microbial Technology 40 114-121
48 Kaszycki P Fedorovych D Ksheminska H Babyak L Gonchar MV Jaglarz
A amp Koloczek H 2003 Modulation of chromium(VI) and (III) tolerance and
accumulation in yeast by sulfate-containing salts European Journal of Biochemistry 1 (1) P49-53
49 Komori K Wang P Toda K amp Ohtake H 1989 Factors affecting chromate
reduction in Enterobacter cloacae Strain HO1 Appl Microbiol Biotechnol 31 567-570
50 Ksheminska H Fedorovych D Babyak L Yanovych D Kaszycki P amp Koloczek H 2005 Chromium(III) and (VI) tolerance and bioaccumulation in
yeast a survey of cellular chromium content in selected strains of representative genera Process Biochem 40 1565-1572
51 Ksheminska HP Honchar TM Gayda GZ amp Gonchar MV 2006 Extra-cellular chromate-reducing activity of the yeast cultures Central European Journal of
Biology 1 (1)137-149
109
52 Kurniawan TA Chan GYS Lo W amp Babel S 2006 Physico-chemical
treatment techniques for wastewater laden with heavy metals Chemical Engineering Journal 118 83-98
53 Labra M Grassi F Imazio S Di Fabio T Citterio S Sgorbati S amp Agradi E
2004 Genetic and DNA-methylation changes induced by potassium dichromate in Brassica napus L Chemosphere 54 1049-1058
54 Laxman RS amp More S 2002 Reduction of hexavalent chromium by Streptomyces griseus Minerals Engineering 15 831-837
55 Leustek T 2002 Sulfate metabolism The Arabidopsis Book American Society of
Plant Biologists
56 Liu YG Xu WH Zeng GM Li X and Gao H 2006 Cr(VI) reduction by
Bacillus sp isolated from chromium landfill Process Biochemistry 41 1981-1986 57 Llovera S Bonet R Simon-Pujol MD amp Congregado F 1993 Effect of culture
medium ions on chromate reduction by resting cells of Agrobacterium radiobacter Appl Microbiol Biotechnol 39 424-426
58 Lloyd JR 2003 Microbial reduction of metals and radionuclides FEMS Microbiol
Rev 27 411-425
59 Marsh TL amp McInerney MJ 2001 Relationship of hydrogen bioavailability to
chromate reduction in aquifer sediments Appl Environ Microb 67 (4) 1517-1521
60 McLean J amp Beveridge TJ 2001 Chromate reduction by a pseudomonad isolated from a site contaminated with chromated copper arsenate Applied and
Environmental Microbiology 67 (3)1076-1084 61 Megharaj M Avudainayagam S amp Naidu R 2003 Toxicity of hexavalent
chromium and its reduction by bacteria isolated from soil contaminated with tannery waste Current Microbiology 47 51-54
62 Middleton SS Latmani RB Mackey MR Ellisman MH Tebo BM amp Criddle
CS 2003 Cometabolism of Cr(VI) by Shewanella oneidensis MR-1 produces cell-associated reduced chromium and inhibits growth Biotechnol Bioeng 83 627-637
63 Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2006 Removal of hexavalent chromium
by Trichoderma viride in an airlift bioreactor Enzyme and Microbial Technology 40 107-113
64 Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2008 Hexavalent chromium removal by Trichoderma inhamatum fungal strain isolated from tannery effluent Enzyme and
Microbial Technology 40 107-113
110
65 Morales B L 2005 Aislamiento de microorganismos y estudio de su capacidad
para remover cromo hexavalente Tesis de Maestriacutea Escuela Nacional de Ciencias Bioloacutegicas IPN Meacutexico
66 Muter O Patmalnieks A amp Rapoport A 2001 Interrelations of the yeast Candida
utilis and Cr(VI) metal reduction and its distribution in the cell and medium Process Biochem 36 963-970
67 Ohtake H Cervantes C amp Silver S 1987 Decreased chromate uptake in Pseudomonas fluorescens carrying a chromate resistance plasmid J Bacteriol 169
3853-3856 68 Pal N 1997 Reduction of hexavalent chromium to trivalent chromium by
Phanerochaete chrysosporium pp 511-517 En Alleman BC amp Leeson A In Situ and On-Site Bioremediation Vol 2 Battelle Press Ohio USA
69 Pattanapipitpaisal P Brown NL amp Macaskie LE 2001 Chromate reduction by
Microbacterium liquefaciens immobilised in polyvinyl alcohol Biotechnol Lett 23
61-65
70 Pepi M amp Baldi F 1992 Modulation of chromium(VI) toxicity by organic and inorganic sulfur species in yeasts from industrial wastes BioMetals 5 179-185
71 Quintana M Curutchet G amp Donati E 2001 Factors affecting chromium(VI) reduction by Thiobacillus ferrooxidans Biochemical Engineering Journal 9 11-15
72 Ramiacuterez-Ramiacuterez R Calvo-Meacutendez C Aacutevila-Rodriacuteguez M Lappe P Ulloa M
Vaacutezquez-Juaacuterez R amp Gutieacuterrez-Corona JF 2004 Cr(VI) reduction in a chromate-
resistant strain of Candida maltosa isolated from the leather industry Antonie van Leeuwenhoek 85 63-68
73 Rege MA Petersen JN Johnstone DL Turick CE Yonge DR amp Apel WA
1997 Bacterial reduction of hexavalent chromium by Enterobacter cloacae strain
HO1 grown on sucrose Biotechnol Lett 19 (7) 691-694
74 Roukas T 1993 Ethanol production from nonsterilized carob pod extract by free and immobilized Saccharomyces cerevisiae cells using fed-batch culture
Biotechnol Bioeng 43 189-194 75 Ruiacutez MA 2000 Recuperacioacuten de metales pesados de soluciones diluidas por
biosorcioacuten con bacteria En Medrano RH Galan WL Biotecnologiacutea de Minerales CONACYT Meacutexico pp 235-262
76 Saxena D Levin R amp Firer MA 2000 Removal of chromate from industrial
effluent by a new isolate of Staphylococcus cohnii Wat Sci Technol 42 (1-2)
93-98
77 Secretariacutea de Comercio y Fomento Industrial NMX-AA-74-1981 Anaacutelisis de Agua ndash Determinacioacuten del Ioacuten Sulfato
111
78 Secretariacutea de Economiacutea NMX-AA-051-SCFI-2001 Anaacutelisis de Agua -
Determinacioacuten de Metales por Absorcioacuten Atoacutemica en Aguas Naturales Potables Residuales y Residuales Tratadas - Meacutetodo de Prueba
79 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NMX-AA-044-SCFI-
2001 Anaacutelisis de Aguas - Determinacioacuten de Cromo Hexavalente en Aguas Naturales Potables Residuales y Residuales Tratadas - Meacutetodo de Prueba En Diario Oficial de la Federacioacuten 1 de agosto 2001
80 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996
Liacutemites Maacuteximos Permisibles de Contaminantes en las Descargas de Aguas Residuales en Aguas y Bienes Nacionales En Diario Oficial de la Federacioacuten 6 de enero 1997
81 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996
Liacutemites Maacuteximos Permisibles de Contaminantes en las Descargas de Aguas Residuales a los Sistemas de Alcantarillado Urbano o Municipal En Diario Oficial de la Federacioacuten 3 de junio 1998
82 Secretariacutea de Salud Proyecto de Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-
NOM-127-SSA1-1994 Salud Ambiental Agua para Uso y Consumo Humano - Liacutemites Permisibles de Calidad y Tratamientos a que debe Someterse el Agua para su Potabilizacioacuten En Diario Oficial de la Federacioacuten 20 de Octubre 2000
83 Shakoori AR Makhdoom M amp Haq RU 2000 Hexavalent chromium reduction
by a dichromate-resistant gram-positive bacterium isolated from effluents of tanneries Appl Microbiol amp Biotechnol 53 (3) 348-351
84 Shen H and Wang YT 1994 Biological reduction of chromium by E coli Journal of Environmental Engineering 120 560-572
85 Shen H amp Wang Y 1995 Hexavalent chromium removal in two-stage bioreactor
system J Environ Eng 121 (11) 798-804
86 Smith WA Apel WA Petersen JN amp Peyton BM 2002 Effect of carbon and
energy source on bacterial chromate reduction Bioremediation J 6 (3) 205-215
87 Smith WL amp Gadd GM 2000 Reduction and precipitation of chromate by mixed culture sulphate-reducing biofilms J Appl Microbiol 88 983-991
88 Song Z Williams CJ amp Edyvean RGJ 2004 Treatment of tannery wastewater by chemical coagulation Desalination 164 (3) 249-259
89 Srinath T Verma T Ramteke PW amp Garg SK 2002 Chromium (VI)
biosorption and bioaccumulation by chromate resistant bacteria Chemosphere 48
(4) 427-435
90 Stanbury PF amp Whitaker A ―Principles of Fermentation Technology Pergamon Press Ltd Great Britain 1984 First edition Pp 11-24
112
91 Stasinakis AS Mamais D Thomaidis NS amp Lekkas TD 2002 Effect of
chromium (VI) on bacterial kinetics of heterotrophic biomass of activated sludge Water Res 36 3341-3349
92 Stasinakis AS Thomaidis NS Mamais D Karivali M amp Lekkas TD 2003
Chromium species behaviour in the activated sludge process Chemosphere 52 1059-1067
93 Stephen JR amp Macnaughton SJ 1999 Developments in terrestrial bacterial remediation of metals Current Opinion in Biotechnology 10 230-233
94 Su C amp Ludwig RD 2005 Treatment of hexavalent chromium in chromite ore
processing solid waste using a mixed reductant solution of ferrous sulfate and
sodium dithionite Environ Sci Technol 39 (16) 6208-6216
95 Thacker U Parikh R Shouche Y amp Madamwar D 2006 Hexavalent chromium reduction by Providencia sp Process Biochem 41 1332-1337
96 Thacker U amp Madamwar D 2005 Reduction of toxic chromium and partial localization of chromium reductase activity in bacterial isolate DM1 Would Journal
of Microbiology amp Biotechnology 21 891-899 97 Tung HL Chiou SY Tu CC amp Wu WT 1997 An airlift reactor with double
net draft tubes and its application in fermentation Bioprocess Eng 171-5
98 Turick CE Apel WA amp Carmiol NS 1996 Isolation of hexavalent chromium-reducing anaerobes from hexavalent-chromium-contaminated and noncontaminated environments Applied Microbiol Biotechnol 44 683-688
99 Viamajala S Peyton BM Sani RK Apel WA amp Petersen JN 2004 Toxic
effects of chromium(VI) on anaerobic and aerobic growth of Shewanella oneidensis MR-1 Biotechnol Prog 20 87-95
100 Volesky B amp Vieira RHSF 2000 Biosorption a solution to pollution Internat Microbiol 3 17-24
101 Wang DIC Cooney CL Demain AL Dunnill P Humphrey AE amp Lilly MD
1979 ―Fermentation and Enzyme Technology John Wiley amp Sons Inc USA Pp 98-115
102 Wang YT and Shen H 1997 Modelling Cr(VI) reduction by pure bacterial cultures Water Research 31 727-732
103 Wang Y amp Xiao C 1995 Factors affecting hexavalent chromium reduction in pure
cultures of bacteria Water Res 29 (11) 2467-2474
104 Wang Y 2000 Microbial reduction of chromate En Lovley DR (Ed)
Environmental Microbe-Metal Interactions ASM Press Washington DC USA pp 225-235
113
105 Wilkin RT Su C Ford RG amp Paul CJ 2005 Chromium-removal processes
during groundwater remediation by a zerovalent iron permeable reactive barrier Environ Sci Technol 39 (12) 4599-4605
106 Worthington Biochemical Corporation 1972 Worthington Enzyme Manual
Enzymes Enzyme Reagents and Related Biochemicals Freehold New Jersey USA
107 Wu J amp Wu WT 1991 Fed-batch culture of Saccharomyces cerevisiae in an airlift reactor with net draft tube Biotechnol Prog 7 230-233
108 Wu WT amp Wu JY 1990 Airlift reactor with net draught tube J Ferm Bioeng
70 359-361
109 Wu WT Wu JY amp Jong JZ 1992 Mass transfer in an airlift reactor with a net
draft tube Biotechnol Prog 8 465-468 110 Zakaria ZA Zakaria Z Surif S amp Ahmad WA 2006 Hexavalent chromium
reduction by Acinetobacter haemolyticus isolated from heavy-metal contaminated wastewater J Hazard Mater 146 30-38
111 Zuacutentildeiga M 2005 Aislamiento de microorganismos con capacidad para remover
cromo hexavalente del agua Tesis de Licenciatura Escuela Nacional de Ciencias
Bioloacutegicas IPN Meacutexico
Referencias electroacutenicas
httpepagov httpesepagovtechpubs412304html
httpfaiunneeduarbiologiamicroindcultivo20y20biorreactoreshtm httpmineralserusgsgovmineralspubscommoditychromium180494pdf
httpuserpagesumbcedu gferre1bmcohtml
httpuserpagesumbcedu gferre1fedbatchhtml httpwwgemesmaterialdocument httpwwwatsdrcdcgovfacts7 html
httpwwwchemicalelementscomelementscrhtml httpwwwepagoviris
wwwclu-inorgdownloadstudentpapersbio_of_metals_paperpdf
114
7 Impacto
En este trabajo se identificaron algunas variables ambientales que afectan la
biorreduccioacuten de cromo hexavalente [Cr(VI)] La informacioacuten obtenida podriacutea ser de
utilidad para mejorar los procesos de reduccioacuten del metal asiacute como para disminuir los
tiempos y costos del tratamiento de los efluentes industriales contaminados con Cr(VI)
Los resultaron mostraron que el sulfato afecta la tolerancia de Candida sp al Cr(VI) y a
su capacidad para reducirlo Fue evidente que a medida que se incrementoacute la
concentracioacuten de sulfato aumentoacute el crecimiento de la levadura la eficiencia global y la
velocidad global de reduccioacuten de Cr(VI) Asimismo se encontroacute que la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp depende de la densidad celular de los cultivos de manera tal que
a mayor cantidad de biomasa producida mayor es la reduccioacuten del metal Aun cuando la
cepa de Candida sp es sensible a los efectos toacutexicos del Cr(VI) en ausencia del sulfato
esta levadura posee una notable capacidad para reducir muy altas concentraciones de
Cr(VI) en presencia de sulfato por lo que podriacutea ser potencialmente uacutetil para el
tratamiento de aguas industriales altaminadas con Cr(VI) y con iones sulfato
Hasta donde sabemos este es el primer trabajo en el que se demuestra que el sulfato
desempentildea un papel impotante tanto en la tolerancia al Cr(VI) como en la reduccioacuten
aeroacutebica del mismo en microorganismos Estos descubrimientos podriacutean tener
implicaciones importantes en el tratamiento de aguas residuales contaminadas con
Cr(VI)
Ademaacutes se encontroacute que los contactores gas-liacutequido son adecuados para la reduccioacuten
aeroacutebica de Cr(VI) por Candida sp Esto uacuteltimo es de vital importancia porque seriacutea
posible disminuir significativamente los costos de tratamiento ya que estos biorreactores
se caracterizan por su baja economiacutea de aireacioacuten Las velocidades volumeacutetrica y
especiacutefica asiacute como la capacidad de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por Candida sp en el
reactor airlift con tubo conceacutentrico fueron superiores a las obtenidas en matraz y eacutesto
podriacutea deberse a que en el reactor airlift la levadura tuvo una mayor cantidad de oxiacutegeno
disponible para su crecimiento y a que el mayor nuacutemero de ceacutelulas producidas fue la
responsable de reducir maacutes eficazmente el Cr(VI) presente en el medio de cultivo
115
Las caracteriacutesticas mostradas por Candida sp en el dispositivo airlift indican que este
tipo de reactor neumaacutetico es adecuado para el crecimiento y la reduccioacuten aeroacutebica del
Cr(VI) por la levadura Asimismo los paraacutemetros cineacuteticos del proceso de reduccioacuten de
Cr(VI) catalizado por Candida sp son superiores a los reportados para otros
microorganismos lo que sugiere que esta cepa de levadura tiene potencial biotecnoloacutegico
para ser utilizada en procesos de remediacioacuten de aguas residuales industriales
contaminadas con Cr(VI)
De los diferentes sistemas de reaccioacuten ensayados (cultivos por lote lote repetido
continuo de una etapa lote alimentado y lote alimentado repetido) el cultivo por lote es
el maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
Otra de las contribuciones de este trabajo fueron la formacioacuten de recursos humanos
tanto a nivel licenciatura como de posgrado Uno de los estudiantes de licenciatura ya
sustentoacute su examen profesional y la tesis de Maestriacutea de otra estudiante ya fue revisada
y aprobada por los sinodales por lo que el examen para obtener el grado se realizaraacute en
poco tiempo Actualmente estaacuten en proceso 1 tesis de licenciatura 2 de maestriacutea y 1 de
doctorado
Entre otros productos del proyecto de investigacioacuten se tienen la publicacioacuten de 2 artiacuteculos
en revistas internacionales incluidas en la base de datos del Journal of Citation Reports
del Institute for Scientific Information (ISI) la publicacioacuten de 2 artiacuteculos en extenso en
las memorias de Congresos Internacionales y la presentacioacuten de varios trabajos en
eventos acadeacutemicos nacionales e internacionales
2
RESUMEN
Los objetivos principales de este trabajo fueron evaluar la influencia del ioacuten sulfato sobre
la tolerancia al Cr(VI) y la reduccioacuten del mismo por una cepa de Candida sp aislada a
partir del agua residual de una curtiduriacutea asiacute como seleccionar el sistema de reaccioacuten
maacutes conveniente para la reduccioacuten del metal cuando la levadura se cultiva en un
contactor gasliacutequido del tipo airlift con tubo conceacutentrico
En ausencia de Cr(VI) el sulfato no tuvo efecto ni estimulador ni inhibidor sobre el
crecimiento de la levadura cuando se utilizaron medios de cultivo con diferentes
concentraciones de sulfato En contraste en presencia de Cr(VI) el crecimiento de la
levadura y la reduccioacuten del Cr(VI) dependieron de las concentraciones de sulfato y de
Cr(VI) ensayadas Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM las
mayores velocidades especiacuteficas de crecimiento eficiencias y velocidades volumeacutetricas
globales de reduccioacuten del metal se obtuvieron con concentraciones de sulfato de 10 a
2392 mM Sin embargo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM la velocidad
especiacutefica de crecimiento eficiencia y velocidad de reduccioacuten del metal se incrementaron
a medida que aumentoacute la concentracioacuten de sulfato Estos resultados indican que el
sulfato desempentildea un papel importante en la tolerancia al Cr(VI) y la reduccioacuten del
mismo en la cepa de levadura utilizada en este trabajo
Asimismo el estudio cineacutetico del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de
Cr(VI) por ceacutelulas de Candida sp cultivadas en diferentes sistemas de reaccioacuten (cultivo
por lote cultivo por lote repetido cultivo continuo de una etapa cultivo por lote
alimentado y cultivo por lote alimentado repetido) en un biorreactor airlift con tubo
conceacutentrico indica que el cultivo por lote es el maacutes adecuado para la reduccioacuten de 15
mM de Cr(VI) ya que en este sistema se alcanzan niveles altos de eficiencia (100) y
velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal [164 mgLh]
3
I INTRODUCCIOacuteN
11 Generalidades
Las actividades antropogeacutenicas han ocasionado gran deterioro y contaminacioacuten del medio
ambiente debido a que los recursos naturales se han utilizado inadecuadamente y a las
malas praacutecticas de almacenamiento e incorrecta disposicioacuten de los residuos generados
(Ishibashi y col 1990 Rege y col 1997)
Entre los contaminantes presentes en agua aire y suelo que requieren mayor atencioacuten
se encuentran los metales pesados ya que algunos de ellos son altamente toacutexicos
carcinogeacutenicos mutageacutenicos y teratogeacutenicos (Wang 2000) Ademaacutes a diferencia de los
compuestos orgaacutenicos los metales pesados no pueden ser degradados ni quiacutemica ni
bioloacutegicamente por lo que permanecen indefinidamente en el medio ambiente
(Cervantes y col 2001) y de manera eventual se acumulan a traveacutes de la cadena
troacutefica lo que incrementa los riesgos para la salud de los seres vivos (Volesky y Vieira
2000) Los metales pesados maacutes toacutexicos para el ser humano son el plomo mercurio
cadmio arseacutenico y el cromo
Para disminuir su toxicidad facilitar su desecho o su reutilizacioacuten los metales pesados
pueden ser sometidos a procesos que provocan cambios en su estado fiacutesico yo en su
estado de oxidacioacuten (Ruiacutez 2000)
12 Cromo
El cromo es el veintiunavo elemento maacutes abundante en la tierra Se le encuentra en
muy diversos ambientes tales como en los oceacuteanos aguas superficiales y subterraacuteneas
suelos rocas aire seres vivos y en alimentos (Guertin y col 2005) Es un metal de
4
transicioacuten de color gris que ocupa el nuacutemero 24 en la Tabla Perioacutedica y tiene un peso
atoacutemico de 52
Fue descubierto en 1797 por Louis Vauquelin y se utilizoacute primeramente como pigmento
Su nombre proviene de la palabra griega ―chrocircma que significa color como referencia a
los diferentes colores que presentan sus compuestos Su punto de fusioacuten es de 1857 degC y
el de ebullicioacuten es de 2672 degC Su densidad es de 719 gcm3 (Barnhart 1997
httpwwwchemicalelementscomelementscrhtml)
El cromo existe en varios estados de oxidacioacuten del -2 al +6 siendo los maacutes estables en
el medio ambiente natural el cromo metaacutelico [Cro o Cr(0)] el trivalente [Cr3+ o Cr(III)] y
el hexavalente [Cr6+ o Cr(VI)] los cuales presentan propiedades fisicoquiacutemicas diferentes
(Jianlong y col 2004 Viamajala y col 2004)
El cromo tiene una alta resistencia a la corrosioacuten al desgaste por friccioacuten y al impacto
asiacute como una gran dureza a alta temperatura (Barnhart 1997) entre otras propiedades
que lo hacen muy atractivo para su uso en diversos sectores industriales tales como en
la galvanoplastia en curtiduriacuteas de piel en la fabricacioacuten de tintes y pigmentos para
pinturas y textiles en la produccioacuten de acero inoxidable de productos refractarios de
inhibidores de la corrosioacuten de tintas para maacutequinas de copiado de conservadores de la
madera asiacute como para el pulido de metales (Smith y Gadd 2000
httpwwwatsdrcdcgovfacts7 html)
La principal fuente de cromo es el mineral conocido como cromita o ferrocromo
(FeCr2O4) Para el antildeo 2003 se reportoacute una produccioacuten mundial de cromita de 15500
5
millones de toneladas cuacutebicas de las cuales el 912 fue utilizada por la industria
metaluacutergica el 52 por la industria quiacutemica el 28 por la industria de la fundicioacuten y el
08 por la industria refractaria
(httpmineralserusgsgovmineralspubscommoditychromium180494pdf) Los
principales paiacuteses productores de cromita son Sudaacutefrica Kazakhstan India Zimbawe
Finlandia Brasil y Turquiacutea
(httpmineralserusqsgovmineralspubscommoditychromium180494pdf)
El cromo metaacutelico [Cr(0)] no se encuentra en forma natural en el medio ambiente sino
que es generado por procesos industriales Se le usa principalmente en la produccioacuten de
acero y de otras aleaciones metaacutelicas (httpwwwatsdrcdcgovfacts7html)
El cromo trivalente se encuentra en la naturaleza en minerales por ejemplo como
cromato de fierro (FeCr2O4) Este estado de oxidacioacuten del cromo forma precipitados de
oacutexidos hidroacutexidos o sulfatos y por consiguiente es menos moacutevil que la forma
hexavalente En el suelo se le encuentra unido principalmente a la materia orgaacutenica
(Jianlong y col 2004 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004 Cervantes y col 2001)
El cromo trivalente es un nutriente esencial tanto para los seres humanos como para los
animales ya que tiene un papel importante en el metabolismo de la glucosa de liacutepidos y
de proteiacutenas Asimismo se considera que potencia el reconocimiento de la insulina por
las ceacutelulas por lo que podriacutea tener aplicaciones para el tratamiento de la diabetes
(Garbisu y col 1998 Wang 2000 Lloyd 2003 Ksheminska y col 2005)
6
La FDA (Food and Drug Administration) ha propuesto un consumo diario (Reference Daily
Intake) de cromo de 120 gd en adultos (httpwwwepagoviris) Algunas fuentes de
cromo son el broacutecoli la levadura de cerveza el hiacutegado quesos granos integrales y
cereales (Guertin y col 2005)
No es comuacuten encontrar cromo hexavalente en forma natural en el medio ambiente y
cuando se le encuentra generalmente es como cromato de plomo PbCrO4
(httpwwwatsdrcdcgovfacts7html) Su presencia en el ambiente se debe
principalmente a las actividades realizadas por el hombre (wwwclu-
inorgdownloadstudentpapersbio_of_metals_paperpdf) En soluciones acuosas el
Cr(VI) generalmente se encuentra presente como oxianioacuten cromato [CrO42-] yo
dicromato [Cr2O72-] dependiendo del pH de la solucioacuten
Debido a su naturaleza fuertemente oxidante el cromo hexavalente puede reaccionar
con la materia orgaacutenica o con agentes reductores con lo que se forma cromo trivalente
Esta transformacioacuten ocurre maacutes raacutepidamente en ambientes aacutecidos tales como en suelos
con pH bajo (Cervantes y col 2001 Jianlong y col 2004)
En el aire el cromo hexavalente ocasionalmente reacciona con partiacuteculas de polvo o con
otros contaminantes con lo que se convierte en cromo trivalente En aguas superficiales
ricas en materia orgaacutenica el Cr(VI) exhibe un tiempo de vida corto en ese estado de
oxidacioacuten (httpwwwepagoviris)
7
13 Toxicidad del cromo
La EPA (Environmental Protection Agency) considera al cromo hexavalente - y a sus
derivados - como uno de los diecisiete agentes quiacutemicos de mayor peligrosidad para la
salud puacuteblica y para el medio ambiente (Marsh y McInerney 2001)
Al ser humano el cromo hexavalente le puede provocar dantildeo al rintildeoacuten e hiacutegado asiacute como
alteraciones neuroloacutegicas La inhalacioacuten de cromo hexavalente en niveles mayores a 2
microgm3 puede causar irritacioacuten de las mucosas comezoacuten hemorragias uacutelceras y
perforacioacuten del tabique nasal (httpwwwatsdrcdcgovfacts7html)
Se ha encontrado que algunas personas son extremadamente sensibles al contacto de su
piel con el cromo hexavalente Algunas de las reacciones aleacutergicas detectadas consisten
en el enrojecimiento marcado de la piel e hinchazoacuten
(httpwwwatsdrcdcgovfacts7html Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos
Naturales y Pesca NMX-AA-044-SCFI-2001 httpwwwepagoviris Ksheminska y
col 2005)
La EPA clasifica a los compuestos del cromo hexavalente en el grupo A el cual incluye a
los agentes carcinogeacutenicos para el hombre Ademaacutes el cromo hexavalente tiene efecto
mutageacutenico y teratogeacutenico en animales y humanos (Wang 2000
httpwwwatsdrcdcgovfacts7html Smith y col 2002)
El cromo hexavalente tambieacuten es toacutexico para la mayoriacutea de los microorganismos auacuten a
bajas concentraciones debido a que reduce su actividad enzimaacutetica afecta sus procesos
metaboacutelicos y les produce mutaciones (Wang 2000) Lo anterior tiene gran impacto en
8
los sistemas de tratamiento bioloacutegico de aguas residuales ya que reduce
significativamente la eficiencia de remocioacuten de los contaminantes y la calidad del efluente
(Stasinakis y col 2002 2003)
En las plantas el cromo hexavalente reduce la actividad de las enzimas fotosinteacuteticas y
en general de las proteiacutenas (Morales 2005) ocasiona enfermedades como la clorosis e
interfiere en diversos procesos metaboacutelicos que causan finalmente la muerte de estos
organismos Asimismo se ha demostrado que rompe la unioacuten azuacutecar-fosfato de la
cadena de aacutecido desoxirribonucleico (DNA) y produce una hiper-metilacioacuten de las bases
nitrogenadas lo que ocasiona mutaciones al azar (Labra y col 2004)
Diversos estudios han demostrado que el cromo hexavalente es cien veces maacutes toacutexico
(Garbisu y col 1998) y mil veces maacutes mutageacutenico que el estado trivalente (Wang
2000 Saxena y col 2000 Lloyd 2003)
14 Cantidad de cromo liberado al medio ambiente y legislacioacuten ambiental
Se estima que maacutes de 170000 toneladas de residuos que contienen cromo se descargan
al medio ambiente cada antildeo (Marsh y McInerney 2001) En la tabla 1 se muestran
algunos datos reportados sobre el contenido de cromo en algunos efluentes industriales
asiacute como en aguas superficiales y freaacuteticas Se puede apreciar que la concentracioacuten de
cromo de los efluentes variacutea considerablemente incluso en los del mismo sector
industrial
9
Tabla 1 Concentraciones de cromo total yo Cr(VI) de efluentes industriales y cuerpos
de agua
Fuente Concentracioacuten de cromo total
Concentracioacuten de Cr (VI)
Referencia
Industria galvanizadora ---
5000 mgL
Gaballah y col 1994
Industria galvanizadora (1) Industria galvanizadora (2)
---
---
127 mgL
3700 mgL
Fujie y col 1996
Acuiacutefero Aromas Red Sands (California)
---
6-36 gL
Gonzaacutelez y col 2005
Agua subterraacutenea contaminada (EEUU)
gt 1500 gL
---
Wilkin y col 2005
Riacuteo receptor de efluentes de la industria papelera
20-80 mgL
---
Cervantes y col 2001
Planta de tratamiento de desechos de produccioacuten de
ferrocromita
---
3-57 mgL
(fase disuelta)
Su y Ludwig 2005
Curtiduriacutea de pieles
(Grecia)
2000 ndash 3500
mgL
--- httpesepagovtechpubs41230
4html
Curtiduriacutea de pieles (tanque de sedimentacioacuten)
3500 gmL
40 gmL
Ganguli y Tripathi 1999
Curtiduriacutea de pieles (tanque de descarga)
5000 gmL
3000 gmL
Ganguli y Tripathi 1999
Curtiduriacutea de pieles (India) 200 - 2400 mgL ---
Balasubramanian y Pugalenthi 1999
Curtiduriacutea de pieles (Portugal)
2467 mgL
---
Beleza y col 2001
Efluente tratado de
curtiduriacutea de pieles (India)
---
096 mgL
Srinath y col 2002
Curtiduriacutea de pieles (Egipto)
---
1300-2500
mgL
Hafez y col 2002
Curtiduriacutea de pieles (1) (Pakistaacuten) Curtiduriacutea de pieles (2) (Pakistaacuten)
2877 mgL
220 mgL
---
---
Ali-Awan y col 2003
Curtiduriacutea de pieles 12 mgL --- Song y col 2004
Curtiduriacutea de pieles (Guanajuato Meacutexico)
250 gmL
---
Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004
Curtiduriacutea de pieles (India) 500-1000 mgL
---
Aravindhan y col 2004
Bantildeos de curtido al cromo
en curtiduriacuteas (Leoacuten Guanajuato Meacutexico)
3000 ndash10000 mgL
---
Aacutelvarez y col 2004
10
En Meacutexico no se tienen datos precisos sobre la cantidad y concentracioacuten de cromo total
o hexavalente de los residuos generados por las diversas industrias sin embargo se ha
informado que las industrias del curtido de pieles generan de 250 a 270 toneladas de
Cr2O3 al antildeo (Zuacutentildeiga 2005)
Debido a las grandes cantidades de cromo que se liberan al medio ambiente asiacute como a
los efectos indeseables que este metal ocasiona sobre los seres vivos en muchos paiacuteses
se han establecido Normas Ambientales que pretenden regular la concentracioacuten de cromo
total yo de Cr(VI) de los desechos liacutequidos soacutelidos o gaseosos que se descargan al
medio ambiente
En Meacutexico la Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca ha decretado
normas oficiales que establecen los liacutemites maacuteximos permisibles de contaminantes
incluido el cromo ya sea como cromo total o como cromo hexavalente de las aguas
residuales que se descargan en aguas y bienes nacionales (Secretariacutea de Medio
Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996) (tabla 2) asiacute como en los
sistemas de alcantarillado urbano o municipal (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos
Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996) (tabla 3)
En cuanto al agua para uso y consumo humano la Secretariacutea de Salud ha emitido la
Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-1994 (Secretariacutea de Salud Proyecto de
Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-1994) donde se indica
como liacutemite maacuteximo permisible una concentracioacuten de cromo total de 005 mgL
11
Tabla 2 Liacutemites maacuteximos permisibles de cromo total para las aguas residuales que se descargan en aguas y bienes
nacionales (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996)
Paraacutemetros
( )
Riacuteos Embalses
Naturales y
Artificiales
Aguas Costeras Suelo
(mgL) Uso en
riego
agriacutecola
(A)
Uso
puacuteblico
urbano
(B)
Proteccioacuten
de vida
acuaacutetica
( C )
Uso en
riego
agriacutecola
(B)
Uso
puacuteblico
urbano
( C )
Explotacioacuten
pesquera
navegacioacuten
y otros
usos (A)
Recreacioacuten
(B)
Estuarios
(B)
Uso en
riego
agriacutecola
(A)
Humedales
naturales
(B)
PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD
Cromo 1 15 05 10 05 10 1 15 05 10 05 10 1 15 05 10 05 10 05 10
() Medidos de manera total PD = Promedio diario PM = Promedio mensual (A) (B) y ( C ) Tipo de cuerpo receptor seguacuten la Ley Federal de Derechos
Tabla 3 Liacutemites maacuteximos permisibles de cromo hexavalente para los sistemas de alcantarillado urbano o municipal
(Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996)
Paraacutemetros (mgL) Promedio Mensual Promedio Diario Instantaacuteneo
Cromo hexavalente 05 075 1
12
Por su parte la EPA ha establecido como liacutemite una concentracioacuten de 01 mg de cromo
por litro de agua potable (httpwwwatsdrcdcgovfacts7html)
La Organizacioacuten Mundial para la Salud (OMS) y la Comunidad Econoacutemica Europea (CEE)
establecen una concentracioacuten de 005 mg de cromo totalL como paraacutemetro de calidad
para aguas destinadas a consumo humano (httpwwgemesmaterialdocument)
Algunos valores sentildealados por otras instancias internacionales se muestran en la tabla
4
Tabla 4 Liacutemites permisibles para cromo sentildealados por Directivas Internacionales
sobre agua potable y aguas embotelladas (Zuacutentildeiga 2005)
Paraacutemetro Canadaacute 1 Japoacuten 2 Aguas embotelladas Nivel de
Administracioacuten Federal sobre
Productos Farmaceacuteuticos de EEUU
Cromo
005 mgL
005 mgL
01 mgL
1 Liacutemite establecido por el Ministerio de Salud de Canadaacute
2 Liacutemite establecido por el Ministerio de Salud y Bienestar Social de Japoacuten
15 Meacutetodos para la remocioacuten de cromo de los efluentes industriales
Para disminuir los efectos toacutexicos del metal es conveniente aplicar alguacuten(os)
tratamiento(s) a los efluentes industriales que contienen cromo antes de descargarlos en
los cuerpos de agua o en el suelo asiacute como restaurar los ecosistemas contaminados En
la actualidad estaacuten disponibles varias tecnologiacuteas para estos propoacutesitos (Eccles 1999)
Estas tecnologiacuteas se han empleado para reducir la toxicidad del contaminante [mediante
la transformacioacuten quiacutemica o bioloacutegica del Cr(VI) a Cr(III)] para removerlo de un lugar
para disminuir la extensioacuten de la contaminacioacuten o para contenerlo en un aacuterea en
particular (Guertin y col 2005)
13
151 Procesos convencionales
Los meacutetodos convencionales para la remocioacuten de los metales pesados son de naturaleza
fisicoquiacutemica y pueden ser utilizados en varias etapas del tratamiento de aguas
residuales Los meacutetodos maacutes usuales para la remocioacuten de Cr(VI) de los efluentes
industriales son los siguientes 1) reduccioacuten quiacutemica ndash precipitacioacuten en donde el Cr(VI)
es reducido quiacutemicamente a Cr(III) a pH aacutecido utilizando alguacuten agente reductor (por
ejemplo el bisulfito de sodio) y posteriormente se adiciona cal o alguacuten otro compuesto
alcalino para formar hidroacutexido de cromo (III) el cual es separado por sedimentacioacuten y
2) coagulacioacuten-floculacioacuten En general estos meacutetodos tienen algunas desventajas tales
como 1) son costosos ya que el agente activo no puede ser recuperado para su
posterior reutilizacioacuten 2) algunos reactivos quiacutemicos son sumamente toacutexicos 3) su
selectividad es baja 4) generan lodos quiacutemicos con altas concentraciones de metales los
cuales son difiacuteciles de tratar 5) la remocioacuten de los metales es incompleta principalmente
cuando la concentracioacuten de eacutestos en los efluentes es inferior a 100 mgL y 6) las aguas
residuales resultantes no satisfacen los criterios de calidad establecidos en la legislacioacuten
ambiental (Cantildeizares-Villanueva 2000 Ruiacutez 2000 Saxena y col 2000 Cheung y Gu
2003)
Algunas otras tecnologiacuteas que se utilizan ocasionalmente para la remocioacuten del Cr(VI) son
el intercambio ioacutenico la adsorcioacuten el tratamiento electroquiacutemico la oacutesmosis inversa y la
evaporacioacuten (Garbisu y col 1998 Camargo y col 2003 Kurniawan y col 2006) Las
principales desventajas de estos meacutetodos son los altos costos fijos de operacioacuten y de
mantenimiento por lo que su aplicacioacuten a grandes voluacutemenes de agua o su uso por
pequentildeas y medianas empresas estaacute muy limitado
14
La EPA recomienda los siguientes meacutetodos para la remocioacuten de cromo del agua potable
en caso de que eacutesta exceda el liacutemite permisible para este metal coagulacioacuten-filtracioacuten
intercambio ioacutenico y oacutesmosis inversa (httpepagov)
En Meacutexico en caso de que el agua destinada a uso y consumo humano exceda el liacutemite
permisible de cromo total la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-1994
(Secretariacutea de Salud Proyecto de Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-
127-SSA1-1994) indica como tratamientos a aplicar el intercambio ioacutenico o la oacutesmosis
inversa
152 Procesos biotecnoloacutegicos
En las uacuteltimas dos deacutecadas se han llevado a cabo estudios con el fin de utilizar
microorganismos y plantas para la restauracioacuten de sitios y para el tratamiento de
efluentes industriales contaminados con metales toacutexicos (Stephen y Macnaughton 1999
Lloyd 2003)
En la actualidad se considera que los procesos microbioloacutegicos son la alternativa maacutes
atractiva para remover algunos metales toacutexicos de los sitios y efluentes contaminados
ya que estos procesos son ―amigables con el medio ambiente los subproductos que
generan son usualmente inocuos son muy eficientes en la remocioacuten de los metales
(particularmente cuando las concentraciones de eacutestos son bajas condiciones en las que
algunos procesos fisicoquiacutemicos son muy ineficientes) y son de bajo costo (Cheung y
Gu 2005 Chardin y col 2002 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004)
15
Dentro de los procesos biotecnoloacutegicos propuestos para la remocioacuten de Cr(VI) se
encuentran la biosorcioacuten y la reduccioacuten bioloacutegica en los cuales se han utilizado
principalmente microorganismos (Volesky y Vieira 2000 Fruchter 2002 Cheung y Gu
2003)
En la biosorcioacuten se utilizan ciertos tipos de adsorbentes bioloacutegicos por ejemplo biomasa
microbiana (viva o inactivada en suspensioacuten o inmovilizada) con los que no se requiere
energiacutea metaboacutelica para retener pasivamente al cromo hexavalente mediante procesos
fiacutesicos (adsorcioacuten fiacutesica principalmente por fuerzas de van Der Waals) o quiacutemicos
(quimisorcioacuten) (Cantildeizares-Villanueva 2000 Volesky y Vieira 2000 Aravindhan y col
2004) En algunos casos se ha observado que el metal es transportado activamente al
interior de las ceacutelulas (a expensas de energiacutea metaboacutelica) proceso al que se le denomina
como bioacumulacioacuten
En la biorreduccioacuten o reduccioacuten bioloacutegica el cromo hexavalente es transformado a la
forma trivalente este uacuteltimo puede ser faacutecilmente precipitado en una etapa posterior de
tratamiento ajustando el pH del agua residual a un valor cercano al neutro para
removerlo finalmente por meacutetodos fiacutesicos (Chardin y col 2002 Cheung y Gu 2003) Se
considera que este proceso es una alternativa tecnoloacutegica potencial para el tratamiento
de suelos cuerpos de agua y efluentes industriales contaminados ya que la reduccioacuten
del Cr(VI) disminuye significativamente la toxicidad (100 veces) solubilidad en agua y
movilidad del metal a traveacutes del medio ambiente (Cheung y Gu 2003 Lloyd 2003
Wang 2000)
16
Se han aislado varios microorganismos que pueden reducir el Cr(VI) a Cr(III) ya sea
como cultivos puros (Horitsu y col 1987 Wang 2000 Pattanapipitpaisal y col 2001
Chardin y col 2002 Cheung y Gu 2003 Middleton y col 2003 Morales-Barrera
2005 Pal 1997 Muter y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004 Thacker y col
2006) o como cultivos mixtos (Smith y col 2002 Cheung y Gu 2003) Las fuentes de
aislamiento han sido muy diversas como por ejemplo efluentes de curtiduriacuteas de la
industria metaluacutergica de mantos freaacuteticos de aguas superficiales contaminadas de
sedimentos anoacutexicos en lagos de plantas de tratamiento de aguas residuales entre
otros (Horitsu y col 1987 Fujii y col 1990 Ganguli y Tripathi 1999 Badar y col
2000 Saxena y col 2000 Pattanapipitpaisal y col 2001 Middleton y col 2003
Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004 Zuacutentildeiga 2005 Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
Entre los geacuteneros microbianos que son capaces de reducir Cr(VI) se tienen los
siguientes Achromobacter Aeromonas Agrobacterium Bacillus Desulfovibrio
Escherichia Enterobacter Micrococcus Pseudomonas (Horitsu y col 1987 Wang
2000) Staphylococcus (Saxena y col 2000) Microbacterium (Pattanapipitpaisal y col
2001) Pyrobaculum Streptomyces Deinococcus (Chardin y col 2002)
Desulfomicrobium Desulfotomaculum Pantoea (Cheung y Gu 2003) Shewanella
(Middleton y col 2003) Trichoderma (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
Phanerochaete (Pal 1997) y Candida (Muter y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col
2004)
De los estudios reportados en la literatura acerca de la reduccioacuten microbioloacutegica del
Cr(VI) sobresalen tres hechos 1) Las bacterias han sido los microorganismos maacutes
ampliamente estudiados y es muy escasa la informacioacuten disponible sobre la capacidad de
17
reduccioacuten del metal de las levaduras y de los hongos filamentosos 2) la mayoriacutea de los
microorganismos ensayados soacutelo son capaces de tolerar y reducir muy bajas
concentraciones de Cr(VI) usualmente dentro del intervalo de 0001 a 05 mM esto
uacuteltimo se ha atribuido a los efectos toacutexicos y mutageacutenicos del metal y 3) casi todos los
estudios se han realizado en cultivo por lote
1521 Transporte del cromo al interior de las ceacutelulas
Tanto en organismos procariotes como en muchos eucariotes los oxianiones cromato y
dicromato (fuentes de cromo hexavalente) ingresan principalmente a las ceacutelulas a traveacutes
de las membranas citoplaacutesmicas mediante el sistema de transporte del sulfato (Badar y
col 2000) lo cual se ha atribuido a la similitud en la carga y estructura de estos iones
(Smith y Gadd 2000) Esto fue demostrado primeramente en Salmonella typhimurium y
posteriormente en otras bacterias tales como en Escherichia coli Pseudomonas
fluorescens y Alcaligenes eutrophus Se ha comprobado que esto mismo ocurre en
algunas levaduras tales como en Candida (Muter y col 2001 Cervantes y col 2001)
Sin embargo en general el cromato penetra al interior de las levaduras por medio de un
transportador anioacutenico no especiacutefico (Czakoacute-Veacuter y col 1999 Cervantes y col 2001)
En algunos microorganismos se ha demostrado que el sulfato inhibe competitivamente el
transporte del cromato al interior de las ceacutelulas (Ohtake y col 1987 Pepi y Baldi 1992)
y que esta inhibicioacuten es maacutes marcada en ceacutelulas anaerobias que en aerobias (Zakaria y
col 2006) Tambieacuten se ha reportado el transporte del cromato por la viacutea de los fosfatos
aunque la viacutea del sulfato es la maacutes utilizada (Ohtake y col 1987)
18
El transporte del cromato al interior de las plantas tambieacuten es a traveacutes del sistema del
ioacuten sulfato Ya en el interior de la planta el cromo hexavalente se acumula en diversos
oacuterganos en cantidades diferentes El cromo hexavalente se acumula de 10 a 100 veces
maacutes en las raiacuteces que en los retontildeos o en otros tejidos (Cervantes y col 2001)
En contraste las membranas celulares de los organismos son praacutecticamente
impermeables al cromo trivalente y a sus compuestos (Ksheminska y col 2006)
1522 Mecanismos microbianos de resistencia al Cr(VI) y de reduccioacuten del
Cr(VI)
Una caracteriacutestica importante que deben tener los microorganismos que se van a utilizar
en procesos de tratamiento de efluentes contaminados con cromo hexavalente es que
sean tolerantes (resistentes) a eacuteste Esta propiedad ha sido descrita en bacterias hongos
y levaduras (Horitsu y col 1987 Cervantes y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004)
Entre los mecanismos de resistencia al cromo hexavalente que se han encontrado se
tienen los siguientes
Acumulacioacuten del metal en la superficie o en el interior de las ceacutelulas (Volesky y Vieira
2000 Saxena y col 2000)
Disminucioacuten yo impedimento en el transporte del cromo hexavalente al interior de
las ceacutelulas (Pepi y Baldi 1992)
Excrecioacuten del metal del interior de la ceacutelula al medio circundante (Cervantes y col
2001)
Reacciones de oacutexido-reduccioacuten en las que el cromo hexavalente es reducido a cromo
trivalente el cual es menos toacutexico (Baldi y col 1990 Muter y col 2001)
19
La resistencia al cromo hexavalente puede estar codificada en el genoacuteforo de las
bacterias o en plaacutesmidos Esto uacuteltimo se ha encontrado en Pseudomonas aeruginosa P
fluorescens P putida y en Alcaligenes eutrophus (Baldi y col 1990 Ishibashi y col
1990 Cervantes y col 2001) Sin embargo la tolerancia al metal no implica
necesariamente que los microorganismos seraacuten capaces de removerlo por alguacuten
mecanismo
En el interior de las ceacutelulas bacterianas los iones cromato [CrO42-] pueden ser reducidos
a cromo trivalente por ciertas enzimas (Ishibashi y col 1990 Horitsu y col 1987) En
condiciones de aerobiosis se han identificado las siguientes proteiacutenas que parecen ser las
responsables de la reduccioacuten del Cr(VI) reductasas flavoproteiacutenas enzimas
dependientes de NADH y NAD(P)H (Ishibashi y col 1990) en cambio en condiciones de
anaerobiosis los estudios indican que ciertas hidrogenasas y citocromos son los
responsables (Chardin y col 2003 Cheung y Gu 2007)
El cromo hexavalente tambieacuten puede ser reducido por compuestos quiacutemicos reductores
que son producidos durante el crecimiento de los microorganismos (Desjardin y col
2003) tales como el glutatioacuten y la cisteiacutena los cuales pueden actuar dentro o fuera de
los organismos (Zakaria y col 2006) En organismos superiores se ha identificado al
ascorbato como agente reductor del cromo hexavalente (Ksheminska y col 2006)
Casi no hay informacioacuten sobre el mecanismo responsable de la reduccioacuten del Cr(VI) en
ceacutelulas eucariotas especiacuteficamente en levaduras Con la finalidad de dilucidar dicho
20
mecanismo se han realizado estudios en los que se ha modificado la resistencia de las
levaduras al Cr(VI) o se ha inactivado alguna enzima en particular
En un trabajo llevado a cabo con algunas levaduras no convencionales se encontroacute que
algunas de eacutestas durante su crecimiento excretaron sustancias reductoras asiacute como
sustancias quelantes que formaron complejos con el cromo trivalente que fue generado
durante la transformacioacuten del cromo hexavalente (Ksheminska y col 2006)
1523 Factores que afectan la reduccioacuten bioloacutegica del Cr(VI)
En algunos microorganismos se ha estudiado el efecto que tienen las variables
ambientales tales como condiciones de aerobiosis yo de anaerobiosis donadores y
aceptores finales de electrones concentracioacuten de cromo hexavalente y potencial de
oacutexido-reduccioacuten entre algunas otras sobre la reduccioacuten del metal (Shen y Wang 1995
Shakoori y col 2000 Wang 2000 Smith y col 2002 Wang y Xiao 1995 Fujii y col
1990 Muter y col 2001 Smith y Gadd 2000 Lloyd 2003 Jianlong y col 2004
Viamajala y col 2004)
La reduccioacuten del Cr(VI) puede realizarse en ambiente aerobio yo anaerobio En
organismos aerobios y anaerobios facultativos se ha investigado el efecto del oxiacutegeno
disuelto en el medio sobre la reduccioacuten del metal (Wang 2000) Se ha encontrado que
la sensibilidad del proceso de reduccioacuten del Cr(VI) a la tensioacuten de oxiacutegeno es diferente
para cada microorganismo En cultivos de Enterobacter cloacae HO1 concentraciones
iniciales de oxiacutegeno mayores a 45 ppm inhibieron fuertemente la reduccioacuten del Cr(VI)
(Komori y col 1989) mientras que la reduccioacuten del metal fue maacutes lenta en condiciones
21
de anaerobiosis que en aerobiosis en el caso de Thiobacillus ferrooxidans (QuiIntana y
col 2001)
Asimismo se ha investigado el efecto de algunos iones sobre la reduccioacuten bioloacutegica del
Cr(VI) Con respecto al sulfato [SO42-] existe una analogiacutea estructural y de carga entre
este anioacuten [SO42-] y el ioacuten cromato [CrO4
2-] por lo que puede establecerse una
competencia entre ellos por los transportadores de sulfato existentes en las ceacutelulas
influyendo asiacute en la reduccioacuten del cromo hexavalente (Smith y Gadd 2000)
En cultivos aerobios no se ha reportado inhibicioacuten por sulfato en la reduccioacuten del cromo
hexavalente (Wang y Xiao 1995 Ishibashi y col 1990 Wang 2000) En contraste se
ha informado que en cultivos anaerobios el sulfato afecta la reduccioacuten del Cr(VI) debido
a que este anioacuten compite con el cromato como aceptor final de electrones (Garbisu y
col 1998)
Por otro lado en un estudio realizado con varios geacuteneros de levadura (Pichia Candida
Debaryomyces Saccharomyces Schwanniomyces Cryptococcus Hansenula) que tienen
capacidad para acumular cromo se encontroacute que el sulfato afectoacute la tolerancia de las
levaduras al Cr(VI) siendo mayor o menor el efecto en funcioacuten de la levadura en estudio
(Kaszycki y col 2003)
Otros iones que se han investigado son el Mg2+ Mn2+ Ca2+ y el Fe En cultivos con
ceacutelulas pasivas (resting cells) de Agrobacterium radiobacter se encontroacute que debe
controlarse principalmente la cantidad de fierro para incrementar la capacidad de
reduccioacuten del microorganismo (Llovera y col 1993)
22
Los donadores de electrones que se han utilizado principalmente en los estudios de
reduccioacuten del Cr(VI) son compuestos alifaacuteticos y aromaacuteticos carbohidratos de bajo peso
molecular aminoaacutecidos y aacutecidos orgaacutenicos (Wang y Xiao 1995 Wang 2000 Smith y
col 2002 Ksheminska y col 2006) El descubrimiento de microorganismos que son
capaces de reducir el cromo hexavalente utilizando una amplia variedad de fuentes de
carbono y energiacutea favorece su uso en procesos de remediacioacuten in situ (Smith y col
2002)
Para la reduccioacuten del cromo hexavalente es conveniente conocer el pH y la temperatura
oacuteptimos para el crecimiento de los microorganismos (Wang 2000 Shakoori y col 2000
Camargo y col 2002 Faisal y Hasnain 2004) En cultivos de Streptomyces griseus se
estudioacute la reduccioacuten del Cr(VI) en el intervalo de valores de pH de 4 a 8 y de
temperatura de 28 a 50 degC obtenieacutendose la mayor reduccioacuten a un pH de 6-7 y a una
temperatura de 28 degC (Laxman y More 2002)
En cultivos de Ochrobactrum sp se trabajoacute en el intervalo de temperatura de 30 a 45 degC
y de pH de 6 a 8 obtenieacutendose la mayor reduccioacuten del Cr(VI) y el crecimiento celular
maacutes alto a 35 degC y a un pH de 7 (Thacker y Madamwar 2005) En estudios realizados
con Escherichia coli ATCC 33456 se ensayoacute la reduccioacuten del Cr(VI) en el intervalo de
valores de pH de 3-8 y de temperatura de 40-60 degC encontraacutendose que el pH y la
temperatura de incubacioacuten oacuteptimos fueron de 7 y 37 degC respectivamente (Bae y col
2000)
Se ha observado que la concentracioacuten inicial de Cr(VI) influye en la velocidad de
reduccioacuten del metal (Wang 2000) La velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) exhibida por los
23
cultivos de Bacillus sp Pseudomonas fluorescens LB300 (Wang y Xiao 1995)
Ochrobactrum sp (Thacker y Madamwar 2005) y de Candida sp LBM2 (Juvera-Espinosa
y col 2006) se incrementoacute conforme aumentoacute la concentracioacuten inicial de Cr(VI) En
contraste la velocidad de reduccioacuten de Bacillus sp Arthrobacter sp (Megharaj y col
2003) y de Trichoderma viride (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006) disminuyoacute al
incrementar la concentracioacuten inicial de cromo hexavalente
Para obtener una reduccioacuten importante del Cr(VI) se requieren altas concentraciones de
biomasa (Wang 2000) La concentracioacuten inicial de biomasa tiene efecto sobre la
velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) de Bacillus sp y Pseudomonas fluorescens LB300 ya
que eacutesta aumentoacute al haber mayor cantidad de biomasa inicial (Wang y Xiao 1995) Este
mismo efecto se observoacute en cultivos de una cepa bacteriana gram positiva a la que se le
denominoacute como cepa ATCC 700729 (Shakoori y col 2000)
El potencial redox se ha medido en algunos estudios realizados con diferentes
microorganismos y condiciones de cultivo para determinar su efecto sobre la reduccioacuten
del Cr(VI) (Komori y col 1989 Turick y col 1996 McLean y Beveridge 2001) sin
embargo no se ha reportado un intervalo oacuteptimo de potencial redox para llevar a cabo la
reduccioacuten del Cr(VI) a su forma menos toacutexica (Wang 2000)
En algunos estudios se ha evaluado la influencia de algunos metales (Mn Ni Zn Pb Cu
Co As Se y Hg) sobre la reduccioacuten del Cr(VI) ya que las cepas microbianas que sean
resistentes a uno o varios metales y que sean capaces de reducir el Cr(VI) seriacutean de gran
utilidad en la biorremediacioacuten de efluentes industriales (Faisal y Hasnain 2004 Cheung
y Gu 2005 Thacker y col 2006) En estudios con Escherichia coli ATCC 33456 se
24
investigoacute el efecto de varios iones (Hg2+ Ag2+ Mn2+ Zn2+ Pb2+ Cd2+ Ca2+ y Mg2+) que
pueden estar presentes junto con el Cr(VI) en efluentes industriales Con el magnesio
se observoacute un ligero aumento en la actividad reductora del microorganismo mientras
que con el mercurio se inhibioacute por completo su capacidad de reduccioacuten (Bae y col
2000)
En el caso particular de microorganismos filamentosos los esfuerzos de corte pueden
causar dantildeo fiacutesico a las ceacutelulas y como consecuencia afectar su capacidad de reduccioacuten
de Cr(VI) En cultivos de Trichoderma viride realizados en matraz y en un reactor
agitado mecaacutenicamente con un impulsor se observoacute que los micelios eran de menor
tamantildeo cuando el hongo se cultivaba en el reactor Asimismo el incremento celular y la
eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidos en matraz fueron superiores a los alcanzados
en el reactor agitado con un impulsor Estos resultados sugirieron que las fuerzas de
cizalla creadas por el impulsor fragmentan el micelio y afectan la viabilidad celular y la
capacidad de reduccioacuten del microorganismo (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
16 Sistemas de reaccioacuten
En la mayoriacutea de los estudios sobre reduccioacuten de Cr(VI) el sistema de reaccioacuten que maacutes
se ha empleado es el cultivo por lote Este sistema es ampliamente utilizado en procesos
biotecnoloacutegicos para la produccioacuten de biomasa y de metabolitos de intereacutes industrial La
duracioacuten de este tipo de cultivo depende del tamantildeo del inoacuteculo de las condiciones
ambientales como el pH los componentes del medio de cultivo y la temperatura
Aunque su operacioacuten es sencilla ofrece pocas opciones de control de las variables
intensivas de intereacutes (concentracioacuten de biomasa sustrato producto) en comparacioacuten
con otros sistemas de reaccioacuten
25
(httpfaiunneeduarbiologiamicroindcultivo20y20biorreactoreshtm) Asimismo
despueacutes de un cultivo por lote se requiere de un periodo para la descarga limpieza y
esterilizacioacuten del equipo asiacute como para el arranque de un nuevo cultivo por lote lo que
disminuye la productividad global del proceso (Wang y col 1979)
Pocos son los estudios relacionados con la reduccioacuten del Cr(VI) en los que se ha
trabajado con otros sistemas de reaccioacuten tales como con el cultivo continuo (DeLeo y
Ehrlich 1994 Bhide y col 1996 Chirwa y Wang 1997 Bae y col 2000) y el cultivo
por lote alimentado o fed-batch (Fujii y col 1990 Fujie y col 1996)
El cultivo continuo permite alcanzar un estado estacionario independiente del tiempo en
el que los microorganismos presentan un crecimiento consumo de sustrato y produccioacuten
constantes por lo que es posible obtener una alta productividad o velocidad volumeacutetrica
(httpuserpagesumbcedu gferre1bmcohtml) En este sistema es posible controlar
la cantidad de biomasa utilizando un uacutenico nutriente limitante del crecimiento (Wang y
col 1979)
A pesar de que el cultivo continuo tiene la desventaja de ser susceptible de contaminarse
debido a los periodos prolongados de operacioacuten (Stanbury 1984) en estudios con Cr(VI)
se minimizariacutea lo anterior ya que este estado de oxidacioacuten del cromo es altamente toacutexico
para la mayoriacutea de los microorganismos auacuten a bajas concentraciones
El cultivo por lote alimentado se utiliza industrialmente para la produccioacuten de varios
productos bioloacutegicos de intereacutes (enzimas antibioacuteticos vitaminas aminoaacutecidos entre
otros) El sistema es uacutetil para obtener una alta concentracioacuten de metabolitos asociados
26
al crecimiento ya que es posible alcanzar una alta concentracioacuten de biomasa aunque
tambieacuten se emplea para la produccioacuten de compuestos no asociados al crecimiento como
por ejemplo de algunos antibioacuteticos Su uso tambieacuten se recomienda cuando se trabaja
con compuestos toacutexicos o de muy baja solubilidad y no requiere mayor equipo que el
utilizado en un cultivo por lote (httpuserpagesumbcedu gferre1fedbatchhtml)
Otras ventajas de este sistema son 1) los tiempos totales del proceso fermentativo son
menores y no requiere de un nuevo inoacuteculo cada vez que se repite el ciclo en
comparacioacuten con un cultivo por lote y 2) menor riesgo de contaminacioacuten que el cultivo
continuo (Roukas 1993)
27
2 OBJETIVOS
21 Objetivos generales
1) Determinar el efecto del ioacuten sulfato sobre el crecimiento celular consumo de glucosa y
reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
2) Realizar el estudio cineacutetico del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de
Cr(VI) de Candida sp en sistemas por lote y lote repetido en un reactor airlift
3) Seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten del Cr(VI) por
Candida sp
22 Objetivos especiacuteficos
a) Determinar el efecto de la concentracioacuten de sulfato de amonio sobre el crecimiento
celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
b) Evaluar el crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote y lote repetido
c) Realizar el estudio cineacutetico del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa
d) Evaluar el crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote alimentado repetido
e) Seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes conveniente para la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp
28
3 MATERIAL Y MEacuteTODOS
31 Microorganismo
Para el desarrollo del presente trabajo se utilizoacute una levadura que se aisloacute a partir del
agua residual de una industria curtidora de pieles que se encuentra ubicada en la Ciudad
de Leoacuten Guanajuato Mediante teacutecnicas morfoloacutegicas y bioquiacutemicas que fueron
realizadas en el Laboratorio de Micologiacutea de la Facultad de Medicina de la UNAM asiacute
como por teacutecnicas de biologiacutea molecular que fueron llevadas a cabo en el Laboratorio de
Microbiologiacutea General de la Escuela Nacional de Ciencias Bioloacutegicas se determinoacute que la
levadura pertenece al geacutenero Candida La amplificacioacuten y secuenciacioacuten del dominio
D1D2 del gen 26S rDNA de la levadura aislada reveloacute que estaacute relacionada con Candida
petrohuensis (GenBank accession number U45819) Candida acudensis (GenBank
accession number U45810) y Candida drimydis (GenBank accession number U45815)
con un nivel de confidencia del 896 La baja similitud de las secuencias parciales
conocidas del gen 26S rDNA y la de la cepa de levadura empleada en este trabajo podriacutea
sugerir que es una cepa no identificada no registrada en el GenBank por lo que se le
denominoacute como Candida sp La relacioacuten filogeneacutetica de la cepa de Candida usada en este
estudio y la de otras especies de levadura se muestra en la figura 1
29
Figura 1 Relaciones filogeneacuteticas de la levadura
AJ508572Cmucifera
AB041003Candida
AB041006Cmucifera
AB041005Stephanoascus
U45822Cchiropterorum
U40103Arxula
U40094Arxula
AY283605Sympodiomyces
AF017247Trichomonascus
U40110Blastobotrys
AY442294Sympodiomyces
U40096Sympodiomyces
AY559042Cmokoenaii
FGSFEP
U45819Cpetrohuensis
U45810Cancudensis
U45815Cdrimydis
U45806Cbondarzewiae
U45816Ctepae
U45812Candida
U45812Cantillancae
U45811Csantjacobensis
U76531Stephanoascus
AB196536Stephanoascus
U70245Cedax
AF017236Cbertae
U45835Cvaldiviana
AY618511Cnovakii
U45807Ccastrensis
U45826Cpaludigena
AF294910Cbituminiphila
U45829Pichia
U84241Zygozyma
U76350Myxozyma
U76527Lipomyces
U45804Debaryomyces
U75524Pichia
U68552Saccharomyces
AY545582Naumovia
AY007888Saccharomyces 100 100
43 100
100
100
43 100
100
72
100
86
95
95
100
91
58 69
99
98
84
92
60
63
54
40
56
37
49
21
39
61
16
002
30
32 Propagacioacuten del inoacuteculo
La composicioacuten quiacutemica del medio de cultivo basal que se utilizoacute en este trabajo para la
propagacioacuten del inoacuteculo y para los experimentos de remocioacuten de Cr(VI) en diferentes
sistemas de reaccioacuten los cuales fueron realizados en un reactor neumaacutetico se muestra
en la tabla 5
Tabla 5 Composicioacuten quiacutemica del medio de cultivo
Compuesto Concentracioacuten
(gL)
Glucosa 100
(NH4)2SO4 30
KH2PO4 10
MgSO4 7H2O 03
KCl 01
Extracto de levadura 01
CaCl2 005
FeCl3 0001
Para los experimentos en los que se determinoacute el efecto del sulfato sobre la tolerancia de
Candida sp al Cr(VI) y la reduccioacuten del mismo el inoacuteculo se propagoacute en el mismo medio
de cultivo pero el (NH4)2SO4 se reemplazoacute por NH4Cl (243 gL) y el MgSO47H2O por
MgCl26H2O (0247 gL)
31
El pH inicial de los medios de cultivo fue de aproximadamente 60 A matraces
Erlenmeyer de 1000 mL que conteniacutean 200 mL de medio de cultivo se les adicionoacute una
asada de Candida sp y posteriormente se incuboacute con agitacioacuten constante a 28-30 ordmC
durante 42 h A continuacioacuten la biomasa se separoacute por centrifugacioacuten a 1500 rpm a
4 degC durante 15 min bajo condiciones de asepsia El paquete celular resultante se lavoacute
dos veces con agua destilada esteacuteril para eliminar los componentes del medio de cultivo
y los residuos celulares El paquete celular se resuspendioacute en un pequentildeo volumen de
agua destilada esteacuteril y se homogeneizoacute La suspensioacuten celular resultante se utilizoacute como
inoacuteculo para los experimentos realizados en este trabajo
Para la conservacioacuten de la levadura se usaron viales con medio inclinado de YPG
(glucosa 2 peptona de caseiacutena 1 extracto de levadura 1 y agar bacterioloacutegico
2) los cuales se mantuvieron en refrigeracioacuten a 4 degC Las resiembras se realizaron
cada dos meses
33 Reactores airlift
Se utilizoacute un contactor gas-liacutequido (reactor agitado neumaacuteticamente) del tipo airlift con
tubo conceacutentrico (figuras 2a y 2b) con un volumen total de 52 litros y un posible
volumen de operacioacuten de 42 litros para realizar los estudios de remocioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en sistemas por lote lote repetido lote alimentado y lote alimentado
repetido El reactor estaacute hecho de vidrio Pyrex y consta de una base columna y una
tapa Entre la base y la columna asiacute como entre la columna y la tapa se colocaron
empaques de neopreno para evitar el contacto vidrio-vidrio asiacute como para evitar fugas
de aire yo de medio de cultivo Las secciones se unieron mediante bridas de Nylamid La
32
base del reactor tiene un difusor del tipo placa plana de vidrio poroso para el suministro
de aire
33
Oliva para
toma de muestra
Aire
Tubo conceacutentrico (liso con
perforaciones de
malla)
Filtro de aire
Venteo
Difusor de vidrio poroso(poro fino)
Difusor de vidrio
poroso (poro fino)
Aire
50deg
4
65
3 m
m
77 mm
11
5
mm
128 mm
88 mm
15
mm
70 mm
4
50
3 m
m
Figuras 2a y 2b Reactor del tipo airlift con tubo conceacutentrico
34
En el interior del reactor se colocoacute un tubo conceacutentrico liso (sin perforaciones) de vidrio
Pyrex un tubo conceacutentrico de vidrio Pyrex con perforaciones circulares (4 mm de
diaacutemetro) o un tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable No 316 (grado
alimentario nuacutemero de malla = 20 abertura = 3344 mm) los cuales tienen la misma
longitud y diaacutemetro El tipo de tubo que se utilizoacute para los experimentos de reduccioacuten
del Cr(VI) dependioacute del sistema de reaccioacuten que se ensayoacute el tubo conceacutentrico liso se
utilizoacute para llevar a cabo experimentos en cultivos por lote y lote repetido el tubo
conceacutentrico con perforaciones se empleoacute para realizar cultivos por lote lote alimentado y
lote alimentado repetido y el tubo de malla metaacutelica se usoacute para cultivos por lote
Para el cultivo continuo de una etapa se utilizoacute un reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
con un volumen total de 650 mL y un posible volumen de operacioacuten de 550 mL el cual
tiene las mismas relaciones geomeacutetricas que el reactor antes mencionado
En todos los sistemas de reaccioacuten ensayados se suministroacute aire en el interior del tubo
conceacutentrico El aire de entrada se controloacute mediante una vaacutelvula reguladora de presioacuten y
su velocidad de flujo se midioacute con un rotaacutemetro
34 Meacutetodos experimentales
341 Efecto de la concentracioacuten de sulfato sobre el crecimiento celular
consumo de glucosa remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp
Se evaluoacute el efecto de la concentracioacuten de sulfato sobre el crecimiento celular consumo
de glucosa remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivos por lote a
nivel matraz Para estos experimentos parte o todo del (NH4)2SO4 y del MgSO4 7H2O del
medio de cultivo basal (tabla 5) se reemplazoacute con NH4Cl y MgCl26H2O respectivamente
35
a fin de mantener las mismas concentraciones iniciales de nitroacutegeno (454 mM) y de
magnesio (1217 mM) en todos los medios de cultivo ensayados
Se prepararon tres series de matraces Erlenmeyer de 500 mL que conteniacutean 135 mL de
medio de cultivo con diferentes concentraciones iniciales de sulfato Las
concentraciones de sulfato ensayadas fueron las siguientes 00 1217 25 50 100
150 200 y 2392 mM (esta uacuteltima concentracioacuten corresponde a la del ioacuten sulfato
presente en el medio de cultivo basal) Estas concentraciones no incluyen la cantidad de
sulfato proporcionado por algunos otros componentes del medio de cultivo (provenientes
del extracto de levadura yo de sales inorgaacutenicas) ya que el Laboratorio Central de
Instrumentacioacuten del Departamento de Biofiacutesica de la Escuela Nacional de Ciencias
Bioloacutegicas IPN determinoacute que la concentracioacuten de este ioacuten en el medio de cultivo que
conteniacutea cloruro de amonio y cloruro de magnesio como uacutenicas fuentes de nitroacutegeno
inorgaacutenico y de magnesio respectivamente era de 23 mgL (002 mM) A este uacuteltimo
medio de cultivo es al que se le denominoacute en el presente trabajo como ―0 mM de ioacuten
sulfato Para la cuantificacioacuten del ioacuten sulfato se utilizoacute el meacutetodo recomendado por la
Norma Oficial Mexicana NMX-AA-74-1981 (Secretariacutea de Comercio y Fomento Industrial
1981) El pH inicial de todos los medios de cultivo ensayados fue de aproximadamente
60
A una serie de matraces con medio de cultivo no se le adicionoacute Cr(VI) con la finalidad de
determinar el efecto del sulfato sobre el crecimiento celular y consumo de glucosa por la
levadura en ausencia del metal (cultivos control) A los matraces de la segunda y tercera
serie se les adicionoacute un determinado volumen de una solucioacuten stock esteacuteril de cromato
de potasio (20 gL) para obtener concentraciones iniciales de Cr(VI) de 17 y 33 mM
36
respectivamente Los matraces fueron inoculados con un determinado volumen de
suspensioacuten celular concentrada a fin de que la concentracioacuten inicial de biomasa de todos
los cultivos fuera de aproximadamente 1 mgmL Los matraces se colocaron en un bantildeo
metaboacutelico con agitacioacuten constante a 28-30 degC Se recolectaron muestras a diferentes
tiempos de incubacioacuten a las que se les determinoacute la concentracioacuten de biomasa glucosa
Cr(VI) y cromo total residual asiacute como el pH
342 Controles abioacuteticos
Se utilizaron controles libres de ceacutelulas con el propoacutesito de determinar si el Cr(VI) era
reducido abioacuteticamente a Cr(III) por los componentes del medio de cultivo
Durante los experimentos de remocioacuten de Cr(VI) con ceacutelulas viables (cultivos problema)
se observoacute que el pH de los medios de cultivo disminuyoacute desde aproximadamente 6
hasta 25-42 dependiendo de la concentracioacuten de sulfato y de cromo utilizada Como
se sabe que los pHrsquos bajos favorecen que la materia orgaacutenica (donadores de electrones)
reduzca el Cr(VI) a Cr(III) en este trabajo se llevaron a cabo experimentos sin biomasa
de Candida sp (controles libres de ceacutelulas) a distintos valores de pH (25 3 4 5 y 6) y
a las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas (17 y 33 mM) para determinar
el grado de reduccioacuten causado por los constituyentes del medio de cultivo
Como controles libres de ceacutelulas se utilizaron matraces Erlenmeyer que conteniacutean medio
de cultivo a los que se les adicionoacute un volumen determinado de una solucioacuten stock
esteacuteril de cromato de potasio (20 gL) para obtener concentraciones iniciales de Cr(VI)
de 17 y 33 mM A continuacioacuten se ajustoacute el pH del medio de cultivo a alguno de los
37
valores antes mencionados La adicioacuten de la solucioacuten stock esteacuteril de cromato de potasio
y el ajuste del pH se realizoacute en condiciones de asepsia
Los controles abioacuteticos se incubaron a las mismas condiciones que los matraces
problema Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se les
determinoacute la concentracioacuten de Cr(VI)
343 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa
remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivo por lote en un
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Se realizoacute la evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa remocioacuten
de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso (sin perforaciones) El cultivo por lote se llevoacute a cabo con 4 litros de
medio de cultivo basal con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM [igual a 78
mgL de Cr(VI)] y con un pH inicial de aproximadamente 60 El reactor se inoculoacute con
un volumen determinado de suspensioacuten celular concentrada para obtener una
concentracioacuten inicial de biomasa cercana a 12 mgmL Se suministroacute aire con un flujo
volumeacutetrico de 4 litrosmin equivalente a 1 vvm (vvm = volumen de aire por volumen
de medio de cultivo por minuto)
El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que el nivel de Cr(VI) residual fue
despreciable Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se
les determinoacute la concentracioacuten de biomasa de glucosa Cr(VI) y cromo total residual asiacute
como el pH
38
344 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote repetido en un reactor
airlift con tubo conceacutentrico liso
Los sistemas por lote repetido se iniciaron con un cultivo por lote Cuando se alcanzaron
niveles bajos de Cr(VI) residual en el primer cultivo por lote se procedioacute a recolectar un
determinado volumen de medio y se reemplazoacute con medio fresco que teniacutea una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM A continuacioacuten el sistema se operoacute nuevamente por
lote (segundo cultivo por lote o cultivo por lote repetido) hasta que ya no se detectaron
variaciones considerables en la concentracioacuten de Cr(VI) residual
Se ensayaron tres diferentes relaciones de recambio de medio de cultivo (f = volumen de
medio recolectadovolumen inicial de medio liacutequido en el reactor) las cuales fueron de
04 06 y 08 Para las dos uacuteltimas relaciones se realizaron experimentos sin ajustar el
pH del medio al inicio del segundo cultivo por lote (lote repetido) asiacute como ajustando el
pH a 60 Para la primera relacioacuten (f = 04) soacutelo se realizoacute el experimento sin ajustar el
pH del medio al inicio del cultivo por lote repetido ya que los experimentos realizados a
las relaciones de recambio de 06 y 08 mostraron que la eficiencia y velocidad de
reduccioacuten de Cr(VI) de los cultivos por lote repetido eran mayores cuando no se ajustaba
el pH
Durante los cultivos por lote repetido se recolectaron muestras a diferentes tiempos de
incubacioacuten a las cuales se les determinoacute la concentracioacuten de biomasa glucosa Cr(VI) y
el pH Con los datos obtenidos se estimaron algunas variables cineacuteticas que se utilizaron
para seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para los fines que se persiguen en
este trabajo
39
345 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa en un
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Para el cultivo continuo de una etapa se utilizoacute un biorreactor airlift con tubo conceacutentrico
liso con un volumen de operacioacuten de 500 mL Al reactor se le suministroacute continuamente
medio de cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM por medio de una
bomba peristaacuteltica Se ensayaron dos flujos volumeacutetricos de medio de cultivo de 378 y
50 mLh que corresponden a velocidades de dilucioacuten de 00076 h-1 y de 00100 h-1
respectivamente
Con los datos obtenidos a la velocidad de dilucioacuten de 00076 h-1 se estimoacute la velocidad
volumeacutetrica global y la eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) las cuales se utilizaron
para seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp
346 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular y la remocioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo conceacutentrico de
malla de acero inoxidable y de vidrio perforado
Se realizaron cultivos por lote en el reactor airlift en el cual se colocoacute un tubo conceacutentrico
de malla de acero inoxidable No 316 (grado alimentario calibre No 20 abertura =
3344 mm) o un tubo conceacutentrico de vidrio con perforaciones circulares de
aproximadamente 4 mm de diaacutemetro Al reactor se le adicionaron 4 litros de medio de
cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM [igual a 78 mgL de Cr(VI)] y
un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada para obtener una
40
concentracioacuten inicial de biomasa de aproximadamente 12 mgmL El pH inicial del medio
fue de aproximadamente 60 Se ensayaron dos flujos de aire de 05 y 1 vvm
El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que el nivel de Cr(VI) residual fue bajo Se
recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se les determinoacute la
concentracioacuten de biomasa y de Cr(VI) residual Con los datos obtenidos se estimaron
algunas variables cineacuteticas que sirvieron como criterio de seleccioacuten para determinar el
tubo conceacutentrico maacutes adecuado para llevar a cabo los cultivos por lote alimentado y lote
alimentado repetido
347 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote
alimentado repetido en un reactor airlift
Para los cultivos por lote alimentado y lote alimentado repetido se utilizoacute el reactor airlift
con el tubo conceacutentrico seleccionado previamente Los cultivos por lote alimentado se
iniciaron con un cultivo por lote utilizando las condiciones iniciales mencionadas en el
inciso 446 y una aireacioacuten de 05 vvm El cultivo por lote se mantuvo en operacioacuten
hasta que la concentracioacuten de Cr(VI) residual fue baja
A continuacioacuten el reactor se drenoacute hasta alcanzar un volumen de liacutequido en el reactor de
25 litros y se inicioacute el suministro continuo de medio de alimentacioacuten con una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM La alimentacioacuten se mantuvo hasta que se alcanzoacute un
volumen de medio liacutequido en el reactor de 37 litros (primer cultivo por lote alimentado)
41
Posteriormente el reactor se volvioacute a drenar hasta obtener un volumen de medio de 25
litros y enseguida se volvioacute a suministrar continuamente medio de cultivo basal con una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM utilizando el mismo flujo de alimentacioacuten que para el
primer cultivo por lote alimentado El suministro de medio se mantuvo hasta alcanzar un
volumen de liacutequido en el reactor de 375-40 litros (segundo cultivo por lote alimentado o
cultivo por lote alimentado repetido)
Se ensayaron dos flujos de alimentacioacuten de 659 y 1343 mLh que representan cargas
maacutesicas de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh
Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las cuales se les
determinoacute la concentracioacuten de biomasa de glucosa y Cr(VI) residual asiacute como el pH
Con los datos obtenidos se estimaron las velocidades volumeacutetricas globales y las
eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI)
35 Meacutetodos analiacuteticos
351 Determinacioacuten de la concentracioacuten de biomasa
La concentracioacuten celular se determinoacute mediante el peso seco de la masa celular Las
muestras recolectadas se filtraron a traveacutes de membranas de fibra de vidrio (Whatman
GFA) con un diaacutemetro de poro de 16 m las cuales se colocaron previamente puestas a
peso constante Posteriormente las membranas se colocaron en una estufa a 95 degC
hasta alcanzar un peso constante Los filtrados se utilizaron para determinar la
concentracioacuten de glucosa Cr(VI) y cromo total residual asiacute como el pH
352 Determinacioacuten de la concentracioacuten de glucosa
42
Se determinoacute mediante un meacutetodo enzimaacutetico empleando a la glucosa oxidasa y
peroxidasa (Worthington Biochemical Corporation 1972)
Principio El meacutetodo se basa en que la glucosa es oxidada a aacutecido glucoacutenico por la
glucosa oxidasa la cual cataliza la siguiente reaccioacuten
-D-glucosa + H2O + O2 Aacutecido D-glucoacutenico + H2O2
El peroacutexido de hidroacutegeno generado reacciona con el sistema peroxidasa - orto-
dianisidina dando como resultado la oxidacioacuten de la orto-dianisidina y la produccioacuten de
agua de acuerdo con la siguiente reaccioacuten
H2O2 + orto-dianisidina (reducida) ortondashdianisidina (oxidada) + H2O
peroxidasa
La orto-dianisidina oxidada presenta un color pardo que en medio aacutecido vira a color
rosa la cual se lee a una longitud de onda de 540 nm (figura 3)
Figura 3 Orto-dianisidina (33rsquo ndash dimetoxidibencidina)
H2N NH2
OCH3
OCH3
43
353 Determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo hexavalente
La concentracioacuten de cromo hexavalente se determinoacute por la teacutecnica de la 15-
difenilcarbohidrazida siguiendo los procedimientos descritos en el meacutetodo 8023 del Hach
Water Analysis Handbook (2002) Este meacutetodo estaacute aprobado por la EPA (Environmental
Protection Agency) (Hach 2002) y por la Norma Oficial Mexicana NMX-AA-044-SCFI-
2001 (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NMX-AA-044-SCFI-
2001)
Principio Se utilizoacute un reactivo en polvo llamado ChromaVer3 el cual contiene una
solucioacuten buffer aacutecida combinada con la 15-difenilcarbohidrazida Este uacuteltimo compuesto
reacciona con el cromo hexavalente dando un compuesto de color puacuterpura (figura 4) El
meacutetodo es aplicable para el agua ya sea fresca o de muestras de agua residual La
intensidad del color es ldirectamente proporcional a la concentracioacuten de cromo
hexavalente presente
Figura 4 Reaccioacuten de la 15-difenilcarbohidrazida con el cromo hexavalente
+ Cr 6+
Compuesto colorido
puacuterpura
N N
Cr O
C R
O
N N
H H
C R
15-difenilcarbohidrazida
2 N N N
H H
N C
H O
H
44
354 Determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo total
La determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo total de los filtrados de las muestras
recolectadas (cromo total en solucioacuten) se realizoacute por espectroscopiacutea de absorcioacuten
atoacutemica con flama de acetileno-aire (SpectrAA220 FS Varian Inc)
Para determinar la cantidad de cromo retenido por la biomasa de Candida sp las ceacutelulas
fueron lavadas con agua desionizada deshidratadas y posteriormente fueron digeridas
con aacutecido niacutetrico concentrado La solucioacuten obtenida se enfrioacute a temperatura ambiente y
se le adicionoacute agua desionizada hasta obtener un volumen final de 50 mL Este
procedimiento estaacute descrito en la Norma Oficial Mexicana NMX-AA-051-SCFI-2001
(Secretariacutea de Economiacutea 2001) La concentracioacuten de cromo total de la solucioacuten
resultante se determinoacute en un espectrofotoacutemetro de absorcioacuten atoacutemica con un horno de
grafito (SpectrAA220 FS Varian Inc)
355 Determinacioacuten del pH
Se realizoacute con un potencioacutemetro marca Oakton
45
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Meta No 1 Determinar el efecto del ioacuten sulfato sobre la reduccioacuten
de Cr(VI)
41 Efecto del sulfato sobre el crecimiento celular consumo de glucosa
remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp
411 Evaluacioacuten de la influencia del sulfato sobre el crecimiento celular de
Candida sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
Se determinoacute el efecto de ocho concentraciones diferentes de sulfato (00 1217 25
50 100 150 200 y 2392 mM) sobre el crecimiento celular de Candida sp cuando
eacutesta se cultivoacute por lote a nivel matraz en medios de cultivo sin Cr(VI) y con
concentraciones iniciales del metal de 17 y 33 mM Para visualizar mejor el efecto las
curvas de crecimiento celular se construyeron utilizando la relacioacuten xxo (x =
concentracioacuten celular a un determinado tiempo de incubacioacuten xo = concentracioacuten inicial
de biomasa) como variable dependiente y el tiempo de incubacioacuten (t) como variable
independiente (graacuteficas de xxo vs t) En cada una de las curvas de crecimiento se trazoacute
una liacutenea horizontal a una relacioacuten xxo de 10 para observar si ocurriacutea crecimiento o
lisis celular
En la figura 5 se muestran las curvas de crecimiento celular de Candida sp cuando eacutesta
se cultivoacute en medios de cultivo con diferentes concentraciones de sulfato y sin Cr(VI) Se
observa que el crecimiento de Candida sp fue muy semejante a las diferentes
concentraciones de sulfato ensayadas La levadura fue capaz de crecer en el medio de
cultivo al que no se le adicionoacute sulfato de amonio y sulfato de magnesio (0 mM de
46
SO42-) lo cual sugiere que la cantidad de sulfato proporcionado por otros componentes
del medio de cultivo ndash por ejemplo provenientes del extracto de levadura yo de
impurezas contenidas en las sales inorgaacutenicas adicionadas al medio de cultivo (002
mM) mdash fue suficiente para permitir un adecuado crecimiento de la levadura Los
resultados tambieacuten mostraron que la adicioacuten de sulfato en forma de sales inorgaacutenicas
[(NH4)2SO4 o Mg(SO4)7H20] no tuvo alguacuten efecto inhibidor o estimulador del crecimiento
celular
Figura 5 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo sin Cr(VI)
En la figura 6 se presentan las curvas de crecimiento de Candida sp que se obtuvieron
cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo con una concentracioacuten inicial de
Cr(VI) de 17 mM a las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas En la figura se
aprecia lo siguiente 1) A una concentracioacuten de sulfato de 0 mM ocurrioacute lisis celular 2)
el crecimiento neto de la levadura fue praacutecticamente nulo a una concentracioacuten de sulfato
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
47
de 1217 mM 3) el crecimiento de la levadura fue evidente a partir de una
concentracioacuten de sulfato de 25 mM y 4) en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de
10 a 2392 mM el crecimiento de la levadura fue muy semejante y superior al alcanzado
a una concentracioacuten de sulfato de 5 mM Asimismo cuando se utilizaron concentraciones
de sulfato de 10 a 2392 mM se alcanzaron niveles de concentracioacuten de biomasa
similares a los obtenidos en ausencia del metal (cultivos control) (figuras 5 y 6) De
estos resultados es evidente que a medida que se incrementoacute la concentracioacuten de
sulfato los efectos toacutexicos del Cr(VI) sobre el crecimiento de la levadura disminuyeron
hasta que eacutestos fueron praacutecticamente nulos es decir la tolerancia de la levadura al
Cr(VI) aumentoacute conforme se incrementoacute la concentracioacuten de sulfato en el medio de
crecimiento de Candida sp
Figura 6 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo con 17 mM de Cr(VI)
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
48
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM ocurrioacute lisis celular
cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo con concentraciones de sulfato en el
intervalo de 0 a 5 mM (figura 7) en contraste el crecimiento celular de la levadura se
incrementoacute a medida que la concentracioacuten de sulfato aumentoacute de 10 a 2392 mM En
este uacuteltimo intervalo de concentracioacuten de sulfato se observoacute que a tiempos de
incubacioacuten superiores a las 150 h se presentoacute lisis celular A ninguna de las
concentraciones de sulfato ensayadas se alcanzaron densidades celulares semejantes a
las obtenidas en los cultivos sin Cr(VI) o con 17 mM de Cr(VI) lo cual podriacutea deberse a
la mayor toxicidad de los medios de cultivo
Figura 7 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo con 33 mM de Cr(VI)
En la figura 8 se muestra la variacioacuten de la velocidad especiacutefica de crecimiento ( ) y de
lisis celular (kd) de Candida sp en funcioacuten de la concentracioacuten de SO42- a las diferentes
concentraciones de Cr(VI) ensayadas [0 17 y 33 mM]
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
49
Figura 8 Variacioacuten de la velocidad especiacutefica de crecimiento o de lisis celular en funcioacuten
de la concentracioacuten de SO42- a las diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI)
ensayadas
-0002
0
0002
0004
0006
0008
001
0012
0014
0016
0018
0 5 10 15 20 25 30
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Ve
loc
ida
d e
sp
ec
iacutefic
a [
h-1
]
0 mM
17 mM
33 mM
Promedio
Sin Cr(VI)
50
Cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo sin Cr(VI) su velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento se mantuvo praacutecticamente constante en todo el intervalo de
concentracioacuten de sulfato ensayado con un valor promedio de 00144 h-1
A la concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la velocidad especiacutefica de crecimiento de
Candida sp aumentoacute casi linealmente con respecto a la concentracioacuten de sulfato en el
intervalo de concentracioacuten de 0 a 10 mM (r2 = 096) alcanzando un valor maacuteximo de
00142 h-1 a la uacuteltima concentracioacuten de sulfato Esta velocidad especiacutefica de crecimiento
es muy similar a las obtenidas en los cultivos sin Cr(VI) A concentraciones de sulfato
superiores a 5 mM la velocidad especiacutefica de crecimiento se mantuvo praacutecticamente
constante Estos resultados concuerdan con los perfiles de crecimiento celular mostrados
anteriormente
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM se obtuvieron
velocidades especiacuteficas de lisis celular (kd) de 00013 a 00003 h-1 ( = -00013 - 00003
h-1) en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de 0 a 5 mM (figura 8) A
concentraciones de sulfato superiores a 5 mM la velocidad neta de crecimiento fue
positiva La velocidad especiacutefica aumentoacute linealmente en todo el intervalo de
concentracioacuten de sulfato ensayado (r2 = 099) aunque las velocidades alcanzadas fueron
notoriamente inferiores a las obtenidas en los medios de cultivo sin Cr(VI) y con una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM
De los resultados anteriores se deduce que el sulfato desempentildea un papel importante en
la tolerancia (resistencia) de Candida sp a los efectos toacutexicos del Cr(VI) A medida que
se incrementoacute la concentracioacuten de sulfato la levadura fue maacutes tolerante (resistente) a
51
los efectos dantildeinos del Cr(VI) y por consiguiente su crecimiento celular fue menos
afectado Asimismo los resultados muestran que el ―efecto protector del sulfato sobre el
crecimiento de Candida sp dependioacute de la concentracioacuten inicial de Cr(VI)
Pepi y Baldi (1992) investigaron el efecto de diferentes aminoaacutecidos azufrados y del
sulfato sobre la tolerancia de algunas levaduras al Cr(VI) Estos investigadores
encontraron que en presencia de 02 mM de Cr(VI) se requirieron pequentildeas cantidades
de cisteiacutena [001ndash01 mM] para estimular significativamente [10-100] el crecimiento
de Rhodosporidium sp y que para incrementar el crecimiento de Candida sp en hasta
80 fue necesaria una concentracioacuten de cisteiacutena de 01 mM Un comportamiento similar
se observoacute en estas dos cepas cuando se adicionoacute metionina En contraste el
crecimiento celular de Candida famata fue inhibido cuando la levadura se cultivoacute en
medios con concentraciones de cisteiacutena superiores a 005 mM y con 02 mM de Cr(VI)
Por otra parte cuando Candida sp se cultivoacute en medios con diferentes concentraciones
de sulfato (4ndash160 mM) y de Cr(VI) (004ndash02 mM) se encontroacute que el ioacuten sulfato
incrementoacute la tolerancia de la levadura al Cr(VI) El mecanismo general de resistencia al
cromato en Candida sp se atribuyoacute a una reducida captacioacuten (incorporacioacuten) de cromo
(Pepi y Baldi 1992)
Ohtake y col (1987) encontraron que la adicioacuten de altas concentraciones de sulfato
incrementoacute el crecimiento celular de dos cepas de Pseudomonas fluorescens (LB300 y
LB303) en presencia de CrO42- Ademaacutes encontraron que el nivel de resistencia al CrO4
2-
en P fluorescens dependioacute de la fuente de azufre en el medio de cultivo ya que las
ceacutelulas bacterianas que crecieron con cisteiacutena fueron mucho maacutes resistentes al CrO42-
que las ceacutelulas que crecieron sobre sulfato Como el cromato es transportado al interior
52
de las ceacutelulas de Pseudomonas a traveacutes del sistema de transporte del sulfato la habilidad
del sulfato para proteger a las ceacutelulas de P fluorescens LB300 de los efectos inhibitorios
del Cr(VI) se atribuyoacute a que el sulfato inhibioacute competitivamente la captacioacuten del cromato
por las ceacutelulas bacterianas (Ohtake y col 1987)
En contraste la resistencia de Ochrobactrum tritici cepa 5bvI1 al Cr(VI) fue
independiente de la concentracioacuten de sulfato (Branco y col 2004)
412 Evaluacioacuten del efecto del sulfato sobre el consumo de glucosa por Candida
sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
La glucosa fue completamente consumida (eficiencia global de consumo de glucosa =
100) en aproximadamente 83 h de incubacioacuten cuando la levadura se cultivoacute en medios
que no conteniacutean Cr(VI) y con diferentes concentraciones de sulfato No se observoacute
diferencia considerable en el consumo de glucosa a ninguna de las concentraciones de
sulfato utilizadas (figura 9)
53
Figura 9 Variacioacuten en el consumo de glucosa por Candida sp cuando se utilizaron
medios de cultivo con diferentes concentraciones de sulfato y sin Cr(VI)
En los experimentos realizados con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM
(figura 10) se observoacute que la levadura fue capaz de consumir aproximadamente 30-
35 de la glucosa inicialmente adicionada a los medios que conteniacutean sulfato a
concentraciones de 0 y 1217 mM a pesar de que a estas condiciones de cultivo ocurrioacute
lisis celular [0 mM de SO42-] o el crecimiento celular de la levadura fue despreciable
[1217 mM de SO42-] (figura 6) Candida sp consumioacute todo el monosacaacuterido presente
en los medios de cultivo con concentraciones de sulfato superiores a 1217 mM
(eficiencia global de consumo de glucosa del 100) sin embargo el tiempo que se
requirioacute para que eacutesto sucediera disminuyoacute a medida que se incrementoacute la concentracioacuten
de sulfato (figura 10) Los perfiles de consumo de glucosa en los cultivos de Candida
sp fueron semejantes cuando se utilizaron concentraciones de sulfato de 10 a 2392
mM y eacutestos a su vez fueron similares a los obtenidos en los medios de cultivo que no
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa
re
sid
ua
l [
]0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
54
conteniacutean Cr(VI) (figuras 9 y 10) Lo anterior podriacutea deberse a que el crecimiento
celular de estos cultivos fue semejante (figura 6)
Figura 10 Variacioacuten del porcentaje de glucosa residual en los cultivos de Candida sp a
las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas y con 17 mM de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
55
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM los niveles de glucosa
residual disminuyeron a medida que aumentoacute la concentracioacuten de sulfato (figura 11)
Sin embargo estos niveles fueron superiores a los alcanzados a 17 mM de Cr(VI) a
todas las concentraciones de sulfato ensayadas La mayor eficiencia de consumo de
glucosa fue de aproximadamente 80 y se obtuvo a una concentracioacuten de sulfato de
2392 mM
Figura 11 Variacioacuten del porcentaje de glucosa residual en los cultivos por lote de
Candida sp a las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas y con 33 mM de
Cr(VI)
A las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas [17 y 33 mM] se observoacute que
en las primeras horas de incubacioacuten los cultivos de levadura en los que ocurrioacute lisis
celular consumieron una determinada cantidad de glucosa la cual probablemente se
utilizoacute para el mantenimiento de las ceacutelulas vivas
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa r
es
idu
al [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
56
Tanto en los experimentos realizados a 17 como a 33 mM de Cr(VI) se encontroacute que
los cultivos que alcanzaron mayores densidades celulares fueron los que consumieron
mayor cantidad de glucosa y esto ocurrioacute cuando se utilizaron concentraciones altas de
sulfato
413 Evaluacioacuten del efecto del sulfato sobre la variacioacuten del pH de los cultivos
de Candida sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
Los perfiles de variacioacuten del pH de los medios de cultivo fueron muy semejantes a las
diferentes concentraciones de sulfato ensayadas cuando la levadura se cultivoacute en los
medios de cultivo sin Cr(VI) (figura 12) A todas las concentraciones de sulfato
utilizadas el pH disminuyoacute desde aproximadamente 6 hasta 28 en las primeras once
horas de incubacioacuten En el periodo comprendido entre las 11 y las 60 h de incubacioacuten el
pH de los medios de cultivo disminuyoacute ligeramente hasta alcanzar valores cercanos a
25 A tiempos posteriores a 60 h el pH de los medios de cultivo se mantuvo
praacutecticamente constante
Figura 12 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo de Candida sp en ausencia de
Cr(VI) y a las diferentes concentraciones de SO42- ensayadas
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
57
En la figura 13 se muestran los perfiles de variacioacuten del pH de los medios de cultivo
cuando la levadura se cultivoacute a las diferentes concentraciones de sulfato y a una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM El pH de los cultivos disminuyoacute raacutepidamente
en las primeras 15 h de incubacioacuten a todas las concentraciones de sulfato ensayadas La
disminucioacuten del pH fue mayor en los cultivos con las concentraciones maacutes altas de
sulfato lo cual podriacutea deberse a que a estas condiciones la levadura consumioacute mayor
cantidad de glucosa y las densidades celulares alcanzadas fueron maacutes altas A tiempos
de incubacioacuten superiores a 15 h el pH continuoacute disminuyendo pero a menor velocidad
Los niveles de pH maacutes bajos se obtuvieron cuando se utilizaron concentraciones de
sulfato de 5 a 2392 mM alcanzaacutendose valores semejantes a los obtenidos en los medios
sin Cr(VI) (de aproximadamente 25)
Figura 13 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
58
Un comportamiento cualitativo similar se obtuvo cuando Candida sp se cultivoacute en medios
con diferentes concentraciones de sulfato y con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33
mM (figura 14) El pH maacutes bajo se alcanzoacute a concentraciones altas de sulfato [20 y
2392 mM] y fue de aproximadamente 36 el cual es superior a los valores maacutes bajos
que se obtuvieron en los cultivos sin Cr(VI) y con 17 mM de Cr(VI) Esto uacuteltimo podriacutea
deberse a que el incremento de la concentracioacuten celular y el consumo de glucosa fueron
inferiores a los alcanzados con las otras concentraciones de Cr(VI) [0 y 17 mM]
Figura 14 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
414 Efecto del sulfato sobre la remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp
En la figura 15 se muestran las variaciones del porcentaje de Cr(VI) residual de los
cultivos de Candida sp cuando se emplearon diferentes concentraciones de sulfato y
una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM A una concentracioacuten de sulfato de 0 mM
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
59
la remocioacuten de Cr(VI) fue muy baja (de aproximadamente 83) es conveniente
mencionar que a esta concentracioacuten de sulfato (0 mM) y de Cr(VI) (17 mM) ocurrioacute lisis
celular y la levadura consumioacute una pequentildea cantidad de glucosa en las primeras horas
de incubacioacuten La remocioacuten de Cr(VI) se incrementoacute a medida que aumentoacute la
concentracioacuten de sulfato de 0 a 10 mM A partir de esta uacuteltima concentracioacuten de sulfato
los perfiles de remocioacuten de Cr(VI) fueron muy similares y esto podriacutea deberse a que la
densidad celular de los cultivos fueron praacutecticamente iguales Todo o casi todo el Cr(VI)
inicialmente adicionado a los medios de cultivo fue removido cuando se empleoacute una
concentracioacuten de sulfato igual o superior a 25 mM (figura 15)
Figura 15 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
En contraste cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM la levadura
no fue capaz de remover todo el Cr(VI) inicialmente presente en los medios de cultivo a
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
60
ninguna de las concentraciones de sulfato ensayadas (figura 16) Sin embargo los
niveles de Cr(VI) residual disminuyeron a medida que se incrementoacute la concentracioacuten de
sulfato
Figura 16 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
A las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas los cultivos de levadura en los
que ocurrioacute lisis celular en las primeras horas de incubacioacuten [0 mm de SO42- 17 mM de
Cr(VI) y 0-5 mM de SO42- 33 mM de Cr(VI)] fueron capaces de remover una pequentildea
cantidad de Cr(VI) Estos resultados concuerdan con lo reportado por Wang y Shen
(1997) quienes encontraron que la densidad celular de los cultivos de Escherichia coli y
Bacillus sp disminuyoacute continuamente durante el curso de la remocioacuten de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
61
A las diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI) y de sulfato ensayadas se observoacute
que aunque los niveles de Cr(VI) residual disminuyeron a medida que la incubacioacuten
progresoacute las concentraciones de cromo total en solucioacuten permanecieron casi constantes
a lo largo de todo el periodo de incubacioacuten (aproximadamente el 97 del cromo
inicialmente adicionado a los medios de cultivo estuvo siempre presente en solucioacuten)
Maacutes auacuten el anaacutelisis del contenido de cromo en la biomasa de Candida sp (de muestras
recolectadas al final de los experimentos) reveloacute que uacutenicamente el 29 009 del
cromo total removido por los cultivos fue incorporado en la biomasa
Como se mostroacute anteriormente los cultivos con ceacutelulas viables se iniciaron con un pH de
aproximadamente 60 y eacuteste disminuyoacute durante el tiempo de incubacioacuten hasta valores de
25 ndash 36 dependiendo de la concentracioacuten de sulfato y de Cr(VI) utilizada Como se
sabe que los pHacutes bajos favorecen la reduccioacuten del Cr(VI) por la materia orgaacutenica
(donadores de electrones) en el presente trabajo se llevaron a cabo experimentos sin
biomasa de Candida sp (controles libres de ceacutelulas) a diferentes valores de pH (25 3
4 5 y 6) y a las dos diferentes concentraciones de Cr(VI) ensayadas (17 y 33 mM)
para determinar si los componentes presentes en los medios de cultivo pueden reducir el
Cr(VI) En las figuras 17 y 18 se muestran los perfiles de Cr(VI) residual que se
obtuvieron con los controles abioacuteticos ensayados
62
Figura 17 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los controles libres de
ceacutelulas llevados a cabo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y a diferentes
valores de pH
Figura 18 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los controles libres de
ceacutelulas realizados con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y a diferentes
valores de pH
00
200
400
600
800
1000
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
pH = 25
pH = 3
pH = 4
pH = 5
pH = 6
00
200
400
600
800
1000
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
pH = 25
pH = 3
pH = 4
pH = 5
pH = 6
63
A las dos concentraciones de Cr(VI) ensayadas se observoacute una reduccioacuten despreciable
del metal (inferior a 05) en el intervalo de valores de pH de 4 a 6 a un pH de 3 el
porcentaje de reduccioacuten fue de aproximadamente 12 y de 3 cuando el pH fue de
25 Estos resultados sugieren que los componentes de los medios de cultivo
praacutecticamente no redujeron el Cr(VI) a ninguno de los pHrsquos ensayados
En conjunto los resultados antes mostrados indican que el principal mecanismo de
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp fue la biotransformacioacuten (reduccioacuten) del Cr(VI) a
Cr(III) y que la reduccioacuten abioacutetica del Cr(VI) y la captacioacuten de cromo por la biomasa de
la levadura fueron despreciables Asimismo los resultados tambieacuten muestran que la
reduccioacuten del Cr(VI) por los cultivos se debioacute a la actividad metaboacutelica de las ceacutelulas de
Candida sp
En la figura 19 se presentan las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) que se
obtuvieron a las diferentes concentraciones iniciales de sulfato y de Cr(VI) ensayadas Se
aprecia que cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la eficiencia
de reduccioacuten se incrementoacute desde 179 hasta 986 a medida que la concentracioacuten
de sulfato aumentoacute de 0 a 25 mM a concentraciones de sulfato superiores la eficiencia
de reduccioacuten fue del 100 Asimismo en los experimentos realizados a 33 mM de
Cr(VI) la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) aumentoacute desde 83 hasta 84 conforme la
concentracioacuten de sulfato aumentoacute de 0 a 2392 mM
64
Figura 19 Eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por los cultivos de
Candida sp a las diferentes concentraciones de sulfato y de Cr(VI) ensayadas
La velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) tambieacuten fue afectada por la
concentracioacuten de sulfato y de Cr(VI) utilizada (figura 20) Cuando se empleoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten maacutes alta
fue de 098 mg de Cr(VI)Lh y se obtuvo en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de
10 a 2392 mM En cambio la velocidad maacutes alta que se alcanzoacute a 33 mM de Cr(VI) fue
de 044 mg de Cr(VI)Lh y se obtuvo a la maacutexima concentracioacuten de sulfato ensayada
(2392 mM)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 1217 25 5 10 15 20 2392
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Efi
cie
ncia
glo
bal d
e r
ed
uccioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
17 mM
33 mM
65
Figura 20 Velocidades volumeacutetricas globales de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas en los
cultivos de Candida sp a diferentes concentraciones de sulfato y de Cr(VI)
A todas las concentraciones de sulfato ensayadas la eficiencia y velocidad volumeacutetrica de
reduccioacuten de Cr(VI) alcanzadas a una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM fueron
superiores a las obtenidas a 33 mM de Cr(VI) y esto podriacutea deberse a que los efectos
toacutexicos del Cr(VI) sobre la levadura se incrementan a medida que aumenta la
concentracioacuten del metal
De los resultados anteriores es evidente que el sulfato afectoacute la reduccioacuten aeroacutebica de
Cr(VI) por Candida sp Estos resultados difieren con lo reportado por otros
investigadores quienes no han encontrado un efecto inhibidor ni estimulador del sulfato
sobre la reduccioacuten de Cr(VI) en cultivos aeroacutebicos
000
010
020
030
040
050
060
070
080
090
100
0 1217 25 5 10 15 20 2392
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica d
e r
ed
uccioacute
n d
e C
r(V
I)
[mg
de
Cr(
VI)
Lh
]
17 mM
33 mM
66
Ishibashi y col (1990) encontraron que concentraciones de sulfato de hasta 1 mM
incrementaron la resistencia de Pseudomonas putida al cromato pero no tuvieron efecto
sobre la reduccioacuten de eacuteste En cultivos de Bacillus sp (Wang y Xiao 1995) y de
Acinetobacter haemolyticus (Zakaria y col 2006) se observoacute que una concentracioacuten de
sulfato de 10 mM no afectoacute la reduccioacuten de Cr(VI) Liu y col (2006) reportaron que
concentraciones de sulfato de 40 y 80 mgL (0416 y 083 mM) no tuvieron efecto sobre
la reduccioacuten aeroacutebica de Cr(VI) por Bacillus sp XW-4
En contraste el sulfato generalmente tiene efecto sobre la reduccioacuten bacteriana del
cromato bajo condiciones de anaerobiosis lo cual podriacutea deberse a que el sulfato compite
con el cromato como aceptor final de electrones (Garbisu y col 1998 Liu y col 2006)
En cultivos anaeroacutebicos de Escherichia coli ATCC 33456 la velocidad de reduccioacuten de
Cr(VI) no fue afectada por hasta 416 mM de sulfato sin embargo la velocidad
disminuyoacute a 83 mM de sulfato (Shen y Wang 1994) La actividad de reduccioacuten de Cr(VI)
de Enterobacter cloacae HO1 bajo condiciones anaeroacutebicas fue inhibida en 32 en
presencia de tan soacutelo 25 M de sulfato (Komori y col 1989)
Como se mencionoacute anteriormente el sulfato incrementoacute la tolerancia al Cr(VI) de la cepa
de Candida sp aislada por Pepi y Baldi (1992) sin embargo esta cepa de levadura fue
incapaz de reducir el Cr(VI) Asimismo auacuten cuando se ha reportado que Pseudomonas
fluorescens LB300 es capaz de reducir el Cr(VI) a Cr(III) (Bopp y Ehrlich 1988) y que el
sulfato incrementa el crecimiento celular de esta bacteria en presencia de cromato
(Ohtake y col 1987) hasta donde sabemos no se ha reportado el efecto del sulfato
sobre la reduccioacuten de Cr(VI) por este microorganismo
67
Los resultados anteriores muestran claramente que el sulfato afectoacute la tolerancia de
Candida sp al Cr(VI) y a su capacidad para reducirlo Es evidente que a medida que se
incrementoacute la concentracioacuten de sulfato el crecimiento de la levadura fue mayor y su
eficiencia y velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) aumentaron Los resultados tambieacuten
muestran que la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp depende de la densidad celular de
los cultivos de manera tal que a mayor cantidad de biomasa generada mayor es la
reduccioacuten de Cr(VI) Aun cuando la cepa de Candida sp es muy sensible a los efectos
toacutexicos del Cr(VI) en ausencia de sulfato esta levadura posee una capacidad notable
para reducir muy altas concentraciones del metal en presencia de sulfato
Meta No 2 Determinar la capacidad de reduccioacuten de Cr(VI) en
diferentes sistemas de reaccioacuten
42 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso
Se utilizoacute un reactor airlift con tubo conceacutentrico liso (sin perforaciones) para el cultivo por
lote de Candida sp Para este sistema de reaccioacuten se utilizoacute un volumen de operacioacuten de
4 litros de medio basal con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM El biorreactor
se inoculoacute con un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada de tal
forma que la concentracioacuten inicial de biomasa fue de 12 mgmL El pH inicial fue de
aproximadamente 60 El reactor se operoacute por lote hasta que la concentracioacuten de Cr(VI)
residual fue despreciable
68
La concentracioacuten celular se incrementoacute gradualmente a medida que la incubacioacuten
progresoacute hasta que alcanzoacute un valor maacuteximo de aproximadamente 39 gL lo cual
ocurrioacute a las 42 h de incubacioacuten A tiempos posteriores la concentracioacuten de biomasa
disminuyoacute debido a que ocurrioacute lisis celular (figura 21) La velocidad especiacutefica maacutexima
de crecimiento de la levadura fue de 00244 h-1 la cual fue superior a la obtenida en
matraz cuando crecioacute con 17 mM de Cr(VI) (00142 h-1) esta diferencia podriacutea deberse
a que en el reactor airlift las ceacutelulas de Candida sp tuvieron una mayor cantidad de
oxiacutegeno disponible para su crecimiento
Figura 21 Variacioacuten de la concentracioacuten de biomasa y de glucosa en el cultivo por lote
de Candida sp en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM
La levadura consumioacute la principal fuente de carbono y energiacutea (glucosa) presente en el
medio de cultivo a lo largo de todo el tiempo de incubacioacuten incluso durante el periodo en
el que ocurrioacute lisis celular La glucosa no fue completamente consumida por la levadura
00
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo [h]
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e g
luc
os
a
res
idu
al [g
L]
00
05
10
15
20
25
30
35
40
45
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e b
iom
as
a [
gL
]Glucosa Biomasa
69
al final del experimento la concentracioacuten de glucosa residual fue de 17 gL (figura 21)
por lo que la eficiencia global de consumo del monosacaacuterido fue del 835
El pH del medio de cultivo disminuyoacute desde 60 hasta aproximadamente 25 Este uacuteltimo
valor se alcanzoacute a las 292 h de incubacioacuten y se mantuvo praacutecticamente constante a
tiempos posteriores (figura 22)
Figura 22 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) y del pH en el cultivo por lote de
Candida sp en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM
La concentracioacuten de Cr(VI) residual disminuyoacute progresivamente a medida que se
incrementoacute el tiempo de incubacioacuten hasta que a las 468 h ya no se detectoacute Cr(VI) en el
medio de cultivo por lo que la eficiencia global de remocioacuten de Cr(VI) fue del 100 Se
observoacute una ligera remocioacuten de Cr(VI) durante el periodo en el que ocurrioacute lisis celular
(figuras 21 y 22) En contraste la concentracioacuten de cromo total en solucioacuten se
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo [h]
Cr(
VI)
y C
rom
o t
ota
l re
sid
ua
l [m
gL
]
00
10
20
30
40
50
60
70
pH
[Cr(VI)] [Cromo total] pH
70
mantuvo casi constante a lo largo del tiempo de cultivo Lo anterior indica que la
levadura fue capaz de transformar el Cr(VI) a la forma trivalente menos toacutexica
En la tabla 6 se comparan los valores de algunas variables cineacuteticas obtenidas en
matraz (cuando se hizo crecer la levadura a una concentracioacuten de Cr(VI) inicial de 17
mM) y en el biorreactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando la levadura se cultivoacute en
medio de cultivo con concentraciones iniciales semejantes de Cr(VI) y de sulfato
Tabla 6 Variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote de Candida sp realizados
en matraz y en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Variable cineacutetica Matraz Reactor
Incremento celular maacuteximo [gL] 22 263
Velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento [h-1] 00142 00244
Eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) [] 100 100
Velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI)L h] 098 164
Velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI) g biomasa h] 045 095
Capacidad de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI) g biomasa] 400 443
El incremento celular maacuteximo y la velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento de
Candida sp obtenidos en el reactor airlift fueron 1955 y 718 superiores a los
alcanzados en matraz respectivamente Como se mencionoacute previamente eacutesto podriacutea
deberse a que en el reactor airlift la levadura tuvo una mayor cantidad de oxiacutegeno
disponible para su crecimiento
71
La levadura redujo todo el Cr(VI) inicialmente presente en el medio de cultivo [eficiencia
global de reduccioacuten de Cr(VI) del 100] tanto cuando se cultivoacute en matraz como en el
reactor airlift El hecho de que Candida sp sea capaz de reducir concentraciones de
Cr(VI) tan altas como 15 mM (e incluso superiores como se mostroacute en la seccioacuten
anterior) podriacutea ser de importancia praacutectica porque la mayoriacutea de los microorganismos
ensayados son capaces de reducir parcial o totalmente concentraciones maacutes bajas de
Cr(VI) (tabla 7)
Tabla 7 Datos sobre reduccioacuten de Cr(VI) por microorganismos
Microorganismo Cultivo
Modo de
operacioacuten
Concentra-
cioacuten de
Cr(VI)
[mM]
Velocidad
volumeacutetrica
de reduccioacuten
[mg de
CrLh]
Eficiencia
de
reduccioacuten
[]
Referencia
Acinetobacter
haemolitycus
Aerobio
CPL
067 128 88 Zakaria y col
2006
Aislado de
Pseudomonas
(CRB5)
Aerobio
CPL
043 014 100 McLean y
Beveridge 2000
Arthrobacter
sp
Aerobio
CPL
017 016 65 Megharaj y col
2003
Aspergillus sp Aerobio
CPL
096 0694 100 Acevedo-Aguilar
y col 2006
Bacillus
megaterium
TKW3
Aerobio
CPL
048 009 735 Cheung y Gu
2005
Bacillus sp Aerobio
CPL
007 007 65 Megharaj y col
2003
Bacteria J3 Aerobio
CPL
01 00057 21 Badar y col
2000
Brevibacterium
CrT-13
Aerobio
CPL
288 255 68 Faisal y Hasnain
2004
E coli AC80 Aerobio
CPL
002
065
9375
Ishibashi y col
1990
Ochrabactrum
sp
Aerobio
CPL
017
034
033
038
100
88
Thacker y
Madamwar 2005
72
Ochrobactrum
intermedium Cr-
T1
Aerobio
CPL
288 326 87 Faisal y Hasnain
2004
Penicillium sp Aerobio
CPL
096 066 95 Acevedo-Aguilar y
col 2006
Phanerochaete
chrysosporium
Aerobio
CPL
058 011 100 Pal 1997
Providencia
sp
Aerobio
CPL
102 10 100 Thacker y col
2006
Pseudomonas
ambigua G-1
Aerobio
CPL
288 347 83 Horitsu y col
1987
Streptomyces
griseus
Aerobio
CPL
017 025 100 Laxman y More
2002
Trichoderma
inhamatum
Aerobio
CPL
13
075 100 Morales-Barrera y
Cristiani-Urbina
2008
Trichoderma
viride
Aerobio
CPL
16
104 100 Morales-Barrera y
Cristiani-Urbina
2006
CPL = Cultivo por lote
La velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) obtenida en el reactor neumaacutetico
con Candida sp fue de 164 mg de Cr(VI)Lh la cual fue 6735 superior a la alcanzada
en matraz [098 mg de Cr(VI)Lh] (tabla 6) Esto uacuteltimo podriacutea deberse a la mayor
cantidad de biomasa generada en el reactor la cual redujo maacutes raacutepidamente el Cr(VI)
Acinetobacter haemolitycus fue capaz de reducir completamente 096 mM de Cr(VI) en
36 h por lo que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal de este microorganismo
fue de 139 mg de Cr(VI)Lh sin embargo cuando la concentracioacuten inicial de Cr(VI) se
incrementoacute a 135 mM la eficiencia y velocidad de reduccioacuten disminuyeron (Zakaria y
col 2006)
A una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 017 mM la eficiencia y velocidad volumeacutetrica
global de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por Ochrabactrum sp fue del 100 y 033 mg
de Cr(VI)Lh respectivamente Aunque la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal
73
se incrementoacute a 038 mg de Cr(VI)Lh cuando la concentracioacuten inicial de Cr(VI) fue de
034 mM la eficiencia de reduccioacuten disminuyoacute a 88 (Thacker y Madamwar 2005)
La eficiencia y velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas con Arthrobacter
sp a las 70 h de incubacioacuten fue de aproximadamente 65 y 016 mg de Cr(VI)Lh
cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial del metal de 017 mM (Megharaj y col 2003)
Con Providencia sp se obtuvo una eficiencia de reduccioacuten del 100 al cabo de 108 h de
incubacioacuten en medios de cultivo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 102 mM
siendo su velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal de 10 mg de Cr(VI)Lh (Thacker
y col 2006) La velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Streptomyces griseus
fue de 025 mg de Cr(VI)Lh cuando se cultivoacute en presencia de 017 mM de Cr(VI)
(Laxman y More 2002)
En el caso de eucariotes Acevedo-Aguilar y col (2006) reportaron que Penicillium sp y
Aspergillus sp fueron capaces de reducir por completo 096 mM de Cr(VI) en 72 h
obtenieacutendose una velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de 0694 mg de Cr(VI)Lh
Asimismo Trichoderma viride exhibioacute una eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) del 100 y
una velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de 104 mg de Cr(VI)Lh cuando se cultivoacute en
un reactor airlift en medio de cultivo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 16 mM
(Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006) Trichoderma inhamatum fue capaz de reducir
por completo 13 mM de Cr(VI) con una velocidad volumeacutetrica de 075 mg de Cr(VI)Lh
(Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2008)
En la tabla 7 se muestran los valores de eficiencia y velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten
de Cr(VI) obtenidas con otros microorganismos
74
La velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) que se obtuvo en el reactor airlift con
Candida sp fue de 095 mg de Cr(VI)g de biomasah (tabla 6) la cual fue 211 veces
mayor que la alcanzada en matraz [045 mg de Cr(VI)g de biomasah] Bae y col
(2000) reportaron que la velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) de Escherichia coli
ATCC 33456 se encontroacute en el intervalo de 031 a 07 mg de Cr(VI)g de biomasah
cuando este microorganismo se cultivoacute por lote en diferentes medios de cultivo con una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 096 mM A una concentracioacuten de Cr(VI) de 0096 mM
los lodos activados exhibieron una velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) de
aproximadamente 008 mg de Cr(VI)g de biomasah (Stasinakis y col 2003) El cultivo
por lote de Trichoderma inhamatum exhibioacute una velocidad especiacutefica de
aproximadamente 0584 mg de Cr(VI)g de biomasah cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 13 mM (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2008)
Asimismo en cultivos por lote de Providencia sp realizados con una concentracioacuten inicial
de Cr(VI) de 034 mM se obtuvo una velocidad especiacutefica de reduccioacuten del metal de
1302 mgg de biomasah (Thacker y col 2006)
En el presente trabajo se encontroacute que en el reactor airlift cada gramo (peso seco) de
biomasa producida de Candida sp pudo reducir 4438 mg de Cr(VI) (tabla 6) valor
ligeramente superior al encontrado en matraz [40 mg de Cr(VI)g de biomasa] y
semejante al reportado para Trichoderma inhamatum (Morales-Barrera y Cristiani-
Urbina 2008) Asimismo a las 60 h de incubacioacuten la capacidad de reduccioacuten de
Penicillium sp y Aspergillus sp fue de aproximadamente 082 y 042 mg de Cr(VI)g de
biomasa (Acevedo-Aguilar y col 2006) Wang y Shen (1997) reportaron que la
capacidad maacutexima de reduccioacuten de Cr(VI) de los cultivos aeroacutebicos de Bacillus sp y
75
Pseudomonas fluorescens LB300 fue de 208 x 10-12 y 310 x 10-12 mg de Cr(VI)ceacutelula
respectivamente si se toma en cuenta que el peso seco promedio de una ceacutelula
bacteriana tiacutepica es de aproximadamente 3 x 10-13 g (Atkinson y Mavituna 1983)
entonces la capacidad de reduccioacuten de Bacillus sp y P fluorescens LB300 seriacutea de 693 y
1033 mg de Cr(VI)g de biomasa respectivamente
43 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote repetido en el reactor airlift con
tubo conceacutentrico liso
Se realizaron algunos cultivos por lote repetido en el reactor airlift con tubo conceacutentrico
liso (sin perforaciones) En cada uno de los cultivos ensayados el reactor se inoculoacute
inicialmente con un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada de la
levadura para obtener una concentracioacuten inicial de biomasa de aproximadamente 12
mgmL La concentracioacuten inicial de Cr(VI) del medio de cultivo fue de aproximadamente
15 mM y el flujo de aire fue de 1 vvm El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que la
concentracioacuten de Cr(VI) residual en el medio fue baja (primer cultivo por lote) a
continuacioacuten una parte del medio de cultivo contenido en el reactor se drenoacute y se
adicionoacute medio fresco con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM Posteriormente el
reactor se operoacute nuevamente por lote (segundo cultivo por lote o cultivo por lote
repetido) Se ensayaron tres relaciones de recambio de medio de cultivo (f = volumen de
medio cosechadovolumen inicial de medio de cultivo) de 08 06 y 04
Debido a la importancia que tiene el pH del medio de cultivo en los procesos
microbioloacutegicos de reduccioacuten de Cr(VI) en el presente trabajo se llevaron a cabo cultivos
por lote repetido con relaciones de recambio de 06 y 08 en los que el pH del medio de
76
cultivo se ajustoacute a 60 al inicio del segundo cultivo por lote (cultivo por lote repetido) asiacute
como experimentos en los que el pH no se ajustoacute a 60 por lo que el pH inicial del cultivo
por lote repetido fue el alcanzado al final del primer cultivo por lote (cercano a 30) Es
conveniente mencionar que los valores bajos de pH inhiben el crecimiento de los
microorganismos pero favorecen la reduccioacuten del Cr(VI) a Cr(III) al ocurrir esto uacuteltimo
disminuye el efecto toacutexico de la forma hexavalente del metal
En estos experimentos se observoacute que el crecimiento de la levadura y la reduccioacuten de
Cr(VI) fueron adversamente afectados cuando el pH del medio de cultivo se ajustoacute a 60
al inicio de los cultivos por lote repetido En la figura 23 se muestra la variacioacuten de la
concentracioacuten de Cr(VI) residual en los cultivos por lote y lote repetido realizados con y
sin ajuste del pH al inicio de los cultivos por lote repetido cuando se utilizaron relaciones
de recambio de 06 y 08
77
Figura 23 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los cultivos por lote y lote
repetido realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizaron
00
100
200
300
400
500
600
700
800
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [m
gL
]
f = 08 spH
f = 08 cpH
CPL CPLR
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [m
gL
] f = 06 spH
f = 06 cpH
CPL CPLR
78
relaciones de recambio de 06 y 08 (spH = sin ajuste de pH del medio de cultivo al
inicio del cultivo por lote repetido cpH = con ajuste de pH del medio de cultivo a 60 al
inicio del cultivo por lote repetido)
En la figura se aprecia que en los primeros cultivos por lote el Cr(VI) fue totalmente o
casi completamente reducido en aproximadamente 45-49 h Sin embargo en los cultivos
por lote repetido el tiempo que se requirioacute para reducir el Cr(VI) fue mayor Asimismo es
evidente que se alcanzaron concentraciones de Cr(VI) residual maacutes bajas en los sistemas
por lote repetido en los que no se ajustoacute el pH al inicio de los cultivos
Los resultados anteriores sugieren que la levadura pierde parte de su capacidad de
reduccioacuten de Cr(VI) cuando se cultiva repetidamente en medios que contienen Cr(VI)
Estos resultados concuerdan con lo reportado por Wang y Shen (1997) quienes
encontraron que Bacillus sp Pseudomonas fluorescens LB300 y Escherichia coli ATCC
33456 pierden su capacidad para reducir Cr(VI) despueacutes de que han reducido 046-052
058 y 125 mM de Cr(VI) respectivamente Un comportamiento similar tambieacuten fue
reportado por Middleton y col (2003) para Shewanella oneidensis
Como los niveles maacutes altos de reduccioacuten de Cr(VI) se obtuvieron cuando no se ajustoacute el
pH a 60 al inicio de los cultivos por lote repetido el experimento en el que se ensayoacute
una relacioacuten de recambio de 04 uacutenicamente se llevoacute a cabo sin ajustar el pH
En la figura 24 se muestra la variacioacuten de la concentracioacuten celular en los sistemas por
lote y lote repetido a las tres diferentes relaciones de recambio ensayadas (04 06 y
08) cuando no se ajustoacute el pH al inicio de los cultivos por lote repetido Se aprecia que
en ninguno de los cultivos por lote repetido se alcanzaron densidades celulares cercanas
79
a las de los cultivos por lote que los precedioacute En los cultivos por lote repetido el
incremento celular y la velocidad especiacutefica de crecimiento maacutes altos se obtuvieron
cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 06 (tabla 8) sin embargo los valores
alcanzados fueron inferiores a los obtenidos en el cultivo por lote que los antecedioacute
Figura 24 Variacioacuten de la concentracioacuten de biomasa con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo ensayadas
00
05
10
15
20
25
30
35
40
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Co
nce
ntr
acioacute
n d
e b
iom
asa
[g
L]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
80
Tabla 8 Variables cineacuteticas del crecimiento celular y de la reduccioacuten de Cr(VI)
obtenidas en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp llevados a cabo en el
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Variable Cultivo por lote Cultivo por lote repetido
Relacioacuten de recambio
04 06 08
Incremento celular
maacuteximo [gL]
224 230 235 017 038 009
Velocidad especiacutefica maacutexima de
crecimiento [h-1]
00244 00227 00220 00044 00109 00017
Eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) []
999 980 973 96 93 36
Velocidad
volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI)Lh]
160 178 151 035 046 045
En los cultivos por lote repetido se necesitoacute de una mayor cantidad de tiempo para
consumir la glucosa presente en los medios en comparacioacuten con los cultivos por lote del
cual derivaron (figura 25) Asimismo en ninguno de los cultivos se consumioacute
totalmente la glucosa la mayor eficiencia de consumo del monosacaacuterido de los cultivos
por lote repetido se obtuvo cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 06 con un
valor de 783 el cual es cercano al obtenido en los primeros cultivos por lote
(aproximadamente 835)
81
Figura 25 Variacioacuten de la concentracioacuten de glucosa con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo utilizadas
En la figura 26 se muestran los perfiles de variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI)
residual en funcioacuten del tiempo de incubacioacuten a las diferentes relaciones de recambio de
medio de cultivo utilizadas Se aprecia que en los primeros cultivos por lote se alcanzaron
niveles de Cr(VI) residual maacutes bajos y en menor tiempo que en los cultivos por lote
repetido
00
20
40
60
80
100
120
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e g
luc
os
a r
es
idu
al [g
L]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
82
Figura 26 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo ensayadas
En los primeros cultivos por lote se alcanzaron eficiencias y velocidades volumeacutetricas
globales de reduccioacuten de Cr(VI) de 973 - 999 y de 151 - 178 mgLh
respectivamente (tabla 8) Estas velocidades son superiores a la alcanzada en el cultivo
por lote realizado en matraz [098 mg de Cr(VI)Lh] y semejantes a la obtenida
previamente en el reactor airlift [164 mg de Cr(VI)Lh]
En los cultivos por lote repetido la eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) maacutes baja se
obtuvo cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 08 y esto podriacutea deberse a que el
tiempo de incubacioacuten que se utilizoacute para este cultivo fue menor que para los otros A las
relaciones de recambio de 04 y 06 las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
[Cr(
VI)
] [m
gL
]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
83
fueron semejantes con valores de 96 y 93 respectivamente Estas uacuteltimas eficiencias
fueron ligeramente inferiores a las obtenidas en los cultivos por lote que los precedioacute
(973-999) Las mayores velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) se
obtuvieron a relaciones de recambio de 06 y 08 [aproximadamente 045 mgLh] sin
embargo fueron considerablemente inferiores a la de los cultivos por lote que los
antecedioacute
44 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa en un reactor airlift
con tubo conceacutentrico liso
Para este sistema el reactor se inoculoacute con 50 mL de inoacuteculo y se dejoacute operar por lote
durante 48 horas con el propoacutesito de incrementar la densidad celular A continuacioacuten se
suministroacute continuamente medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de
15 mM [78 mgL] y con un flujo volumeacutetrico de 378 mLh por lo que la velocidad de
dilucioacuten ensayada fue de 00076 h-1 Se permitioacute que el reactor alcanzara el estado
estacionario lo cual se corroboroacute mediante la determinacioacuten de la concentracioacuten de
biomasa asiacute como de glucosa y de Cr(VI) residual de muestras colectadas a diferentes
tiempos
En el estado estacionario los valores promedio de concentracioacuten de biomasa glucosa
Cr(VI) residual y de pH fueron de 016 gL 62 gL 46 mgL y 345 respectivamente
De estos resultados es evidente que la concentracioacuten de biomasa en el reactor fue muy
baja lo que probablemente ocasionoacute que se alcanzaran valores bajos de eficiencia de
consumo de glucosa (38) y de reduccioacuten de Cr(VI) (41) asiacute como de velocidad
volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) (024 mgLh)
84
Posteriormente se ensayoacute un flujo de alimentacioacuten de 5 mLh para operar con una
velocidad de dilucioacuten de 001 h-1 Sin embargo bajo estas condiciones se presentoacute el
fenoacutemeno de lavado celular en el cual no se detecta biomasa en el reactor Este
experimento se realizoacute varias veces y en todos los casos se obtuvo el mismo resultado
El lavado celular que ocurrioacute en el cultivo continuo de Candida sp podriacutea deberse a que
la velocidad de dilucioacuten que se utilizoacute (001 h-1) es muy cercana a la velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento de la levadura [de aproximadamente 00146 h-1 determinada en
cultivo por lote en medio de cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM]
por lo que la levadura no tuvo tiempo suficiente para duplicarse y fue desplazada del
reactor Ademaacutes el suministro continuo de medio de alimentacioacuten con Cr(VI) ocasiona
que la levadura esteacute constantemente sujeta a los efectos toacutexicos del metal Es decir la
baja velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento de la levadura y los efectos toacutexicos
continuos del metal fueron probablemente los factores que limitaron la eficiencia y
velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) en cultivo continuo
Debido a que ocurrioacute lavado celular a una velocidad de dilucioacuten de 001 h-1 ya no fue
posible ensayar velocidades maacutes altas Los resultados obtenidos en cultivo continuo de
una etapa indican que este sistema de reaccioacuten no es adecuado para la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp
En la tabla 9 se presentan datos sobre la reduccioacuten de Cr(VI) por microorganismos en
cultivos continuos en suspensioacuten o inmovilizados Hasta donde es de nuestro
85
conocimiento no hay informacioacuten disponible acerca de la reduccioacuten de Cr(VI) por
levaduras y hongos filamentosos en cultivo continuo
Tabla 9 Resumen de datos sobre la reduccioacuten microbiana de Cr(VI) en cultivo continuo
Microorganismo Cultivo Concentra-
cioacuten de
Cr(VI) [mM]
Velocidad
de
dilucioacuten
[h-1]
Velocidad
volumeacutetrica
de reduccioacuten
[mg de
CrLh]
Eficiencia
de
reduccioacuten
[]
Referencia
Pseudomonas
sp C7
Aerobio 12
12
0014
0017
073
093
88
91
Gopalan y
Veeramani
1994
Pseudomonas
fluorescens
LB300
Aerobio 011
009
009
002
005
009
016
017
022
57
39
28
DeLeo y
Ehrlich
1994
Escherichia coli
ATCC 33456
Aerobio 08 005
169 843 Bae y col
2000
Pseudomonas
mendocina
MCM B-180
Aerobio
05
15
20
022
014
011
57
108
113
99
99
99
Bhide y
col 1996
Microbacterium
liquefaciens
MP30
Aerobio
(ceacutelulas
inmovilizadas
en perlas de
polivinil
alcohol-
alginato)
005
0038
009
90
Pattanapip
it-paisal y
col 2001
Bacillus sp Aerobio
(ceacutelulas
inmovilizadas
en perlas de
vidrio Pyrex)
192
192
004
008
397
797
998
998
Chirwa y
Wang
1997
86
En un estudio realizado en cultivo continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de Pseudomonas
fluorescens LB300 se encontroacute que la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute desde
57 hasta 28 y que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal se incrementoacute de
016 a 022 mg de Cr(VI)Lh a medida que la velocidad de dilucioacuten se incrementoacute de
002 a 009 h-1 cuando se utilizoacute medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI)
de 009 mM (DeLeo y Ehrlich 1994)
Los resultados obtenidos en cultivo continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de otros
microorganismos han sido alentadores Gopalan y Veeramani (1994) ensayaron tres
velocidades de dilucioacuten de 0014 0017 y 0028 h-1 y encontraron que la maacutexima
eficiencia (91) y velocidad volumeacutetrica [093 mg de Cr(VI)Lh] de reduccioacuten de Cr(VI)
de Pseudomonas sp C7 se obteniacutea a una velocidad de dilucioacuten de 0017 h-1 cuando se
utilizoacute medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de 12 mM En el estudio
realizado por Bae y col (2000) con Escherichia coli ATCC 33456 la velocidad de dilucioacuten
se mantuvo constante a 005 h-1 y se obtuvo una eficiencia y una velocidad volumeacutetrica
de reduccioacuten de Cr(VI) de 843 y de 169 mg de Cr(VI)Lh respectivamente cuando
se utilizoacute una concentracioacuten de Cr(VI) de 08 mM en el medio de alimentacioacuten En cultivo
continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de Pseudomonas mendocina MCM B-180 Bhide y col
(1996) ensayaron el efecto de diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI) [de 05 a
20 mM] y de velocidades de dilucioacuten (011 a 022 h-1) sobre la reduccioacuten de Cr(VI)
Estos investigadores encontraron altas eficiencias (99) y velocidades de reduccioacuten [57
ndash 113 mg de Cr(VI)Lh]
Asimismo con la finalidad de reducir los efectos toacutexicos del Cr(VI) sobre los
microorganismos se ha propuesto el uso de ceacutelulas inmovilizadas en reactores continuos
87
de lecho fijo Las ceacutelulas de Microbacterium liquefaciens MP30 inmovilizadas en perlas de
alginato de calcio - polivinil alcohol fueron capaces de reducir el Cr(VI) con una
eficiencia del 90 y con una velocidad de 009 mg de Cr(VI)Lh cuando se utilizoacute medio
de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de 005 mM y una velocidad de dilucioacuten
de 0038 h-1 (Pattanapipitpaisal y col 2001) En un reactor de lecho fijo con ceacutelulas de
Bacillus sp inmovilizadas en perlas de vidrio Pyrex con un diaacutemetro de 3 mm se observoacute
que al incrementar la velocidad de dilucioacuten de 004 a 008 h-1 la eficiencia de reduccioacuten
de Cr(VI) se mantuvo constante (998) y que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de
Cr(VI) se incrementoacute de 397 a 797 mgLh (Chirwa y Wang 1997)
45 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular y la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo conceacutentrico de
malla de acero inoxidable y de vidrio perforado
Los reactores airlift con tubo conceacutentrico liso (reactores convencionales) no son
adecuados para llevar a cabo cultivos por lote alimentado (procesos con volumen
variable) ya que no es posible lograr una adecuada circulacioacuten del liacutequido a cualquier
volumen de medio de cultivo En los reactores airlift convencionales uacutenicamente se logra
una adecuada circulacioacuten del fluido cuando la altura del liacutequido es mayor que la del tubo
conceacutentrico Por ello para realizar cultivos por lote alimentado en reactores airlift es
necesario que existan diversos puntos de comunicacioacuten entre las secciones de ascenso y
descenso del reactor a lo largo de toda la longitud del tubo conceacutentrico En la literatura
se han descrito algunos reactores airlift que en su interior contienen dispositivos que
permiten la comunicacioacuten entre ambas secciones del reactor Los dispositivos maacutes
comunes son tubos de mallas metaacutelicas (net draft tube) (Tung y col 1997 Wu y Wu
1990 1991 Wu y col 1992) tubos conceacutentricos de vidrio con perforaciones
88
rectangulares (Cristiani-Urbina y col 2000) placas curvas colocadas coaxialmente
(Hagino y col 1982) y bafles (placas) perforados (Galiacutendez-Mayer y col 2001) Estos
dispositivos afectan las caracteriacutesticas hidrodinaacutemicas y de transferencia de masa y calor
de los reactores por lo que es conveniente evaluar su desempentildeo
En este trabajo se evaluoacute la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivos por lote
utilizando reactores airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable asiacute como de
vidrio con perforaciones circulares Estos cultivos se realizaron con dos flujos de aire de
05 y 1 vvm Estos experimentos tuvieron como propoacutesito principal el seleccionar el tubo
conceacutentrico maacutes adecuado para llevar a cabo posteriormente los cultivos por lote
alimentado y lote alimentado repetido
En la figura 27 se muestran las curvas de crecimiento celular cuando se utilizoacute el reactor
airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos de aire
ensayados El crecimiento celular de la levadura fue mayor cuando se utilizoacute un flujo de
aire de 1 vvm lo cual podriacutea deberse a una mayor oxigenacioacuten del medio de cultivo Los
niveles de Cr(VI) residual maacutes bajos tambieacuten se obtuvieron con un flujo de aire de 1 vvm
(figura 28) y eacutesto podriacutea deberse a la mayor densidad celular alcanzada bajo estas
condiciones
89
Figura 27 Curvas de crecimiento celular de Candida sp en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos de aire ensayados
Figura 28 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual en los cultivos por lote realizados
en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos
de aire ensayados
000
050
100
150
200
250
00 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Tiempo [h]
XX
O
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
00 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Tiempo [h]
Cr(
VI)
Re
sid
ual [
]
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
90
En los experimentos realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado se
observoacute un comportamiento opuesto al obtenido previamente con el tubo conceacutentrico de
malla metaacutelica El crecimiento celular (figura 29) y la reduccioacuten de Cr(VI) (figura 30)
en el reactor con tubo conceacutentrico perforado fueron mayores a un flujo de aire de 05
vvm
Figura 29 Curvas de crecimiento celular de Candida sp en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico de vidrio perforado a los dos flujos de aire ensayados
000
050
100
150
200
00 500 1000 1500 2000 2500
Tiempo [h]
XX
O
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
91
Figura 30 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual en los cultivos por lote realizados
en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de vidrio perforado a los dos flujos de aire
ensayados
En la tabla 10 se muestran algunas variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote
realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable y con
tubo conceacutentrico perforado de vidrio a los dos flujos de aire ensayados Ademaacutes la tabla
incluye los resultados obtenidos en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
00 500 1000 1500 2000 2500
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ual [
] Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
92
Tabla 10 Variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote realizados en el reactor
airlift con las diferentes configuraciones de tubo conceacutentrico
Cultivo por lote
Variable cineacutetica Tubo conceacutentrico
liso
Malla metaacutelica Tubo conceacutentrico perforado
10 vvm 05 vvm 10 vvm 05 vvm 05 vvm 10 vvm
Incremento celular
maacuteximo [gL]
263 072 142 123 106 082
Velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento [h-1]
00244 00059 00120 00149 00178 00093
Eficiencia global de
reduccioacuten de Cr(VI) ()
100 67 95 97 95 89
Velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) [mg de Cr(VI)Lh]
164 031 056 082 084 035
Comparando los resultados obtenidos en el reactor con tubo de malla metaacutelica y con el
de vidrio perforado la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) fue mayor cuando se
utilizoacute el tubo conceacutentrico perforado de vidrio y un flujo de aire de 05 vvm con un valor
promedio de dos experimentos independientes de 083 mgLh Sin embargo esta
velocidad es aproximadamente 494 inferior a la alcanzada con el tubo conceacutentrico liso
Los resultados de crecimiento celular (incremento celular maacuteximo y velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento) y de reduccioacuten de Cr(VI) (eficiencia y velocidad volumeacutetrica)
obtenidos en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable y de
vidrio perforado a los flujos de aire ensayados podriacutean sugerir que el grado de
oxigenacioacuten del medio de cultivo y la magnitud de los esfuerzos de corte que se alcanzan
durante la agitacioacuten neumaacutetica desempentildean un papel importante en la generacioacuten de
biomasa de Candida sp en los estados fisioloacutegicos de eacutesta y por consiguiente en la
93
reduccioacuten de Cr(VI) Debido a lo anterior seriacutea conveniente investigar la influencia de la
velocidad de aireacioacuten la cual afecta los patrones de flujo del fluido la magnitud de las
fuerzas de corte y la concentracioacuten del nutriente gaseoso en la fase fluida
Como las mayores eficiencias y velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) se
obtuvieron cuando se utilizoacute el tubo conceacutentrico perforado de vidrio y un flujo de aire de
05 vvm eacutestos fueron utilizados en los cultivos por lote alimentados que se llevaron a
cabo posteriormente
46 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote alimentado
repetido en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado
En los cultivos por lote alimentado el volumen de medio liacutequido en el reactor se
incrementa gradualmente a medida que aumenta el tiempo de incubacioacuten Este cambio
de volumen provoca una dilucioacuten de los componentes presentes en el medio de cultivo lo
cual dificulta la interpretacioacuten de los resultados Debido a lo anterior en los cultivos por
lote alimentado es conveniente expresar el cambio de las variables (biomasa sustrato
etc) en teacuterminos de masa y no de concentracioacuten y para ello es necesario conocer el
volumen de medio a los diferentes tiempos de incubacioacuten Por consiguiente en el
presente trabajo se estimaron las cantidades de biomasa glucosa y de Cr(VI) y se
expresaron en teacuterminos de masa A continuacioacuten se presentan las ecuaciones para
calcular la masa de las variables de intereacutes para este trabajo
Masa celular [g] = (concentracioacuten celular gL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
94
Masa de glucosa [g] = (concentracioacuten de glucosa gL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
Masa de Cr(VI) [mg] = (concentracioacuten de Cr(VI) mgL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
En los cultivos por lote alimentado y lote alimentado repetido se ensayaron dos flujos
volumeacutetricos de medio de alimentacioacuten de 659 y 1343 mLh que corresponden a
cargas maacutesicas de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh respectivamente Los cultivos por lote
alimentado realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado se iniciaron con
cultivos por lote (los resultados obtenidos en estos uacuteltimos cultivos se mostraron en la
seccioacuten anterior)
Cuando se utilizoacute una carga maacutesica de Cr(VI) de 0514 mgh en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) se observoacute que la masa celular
de la levadura en el primer cultivo por lote alimentado fue mayor que en la del segundo
cultivo Sin embargo a pesar de que la levadura tuvo un suministro constante de fuente
de carbono y energiacutea eacutesta praacutecticamente no crecioacute
Cuando se utilizoacute una carga maacutesica de Cr(VI) de 0514 mgh fue evidente que en los
cultivos por lote alimentado se fue acumulando glucosa en el medio de cultivo lo que
indica que las ceacutelulas casi no consumieron el monosacaacuterido que teniacutean disponible para su
crecimiento La cantidad de glucosa consumida por la levadura en el cultivo por lote
alimentado repetido (segundo cultivo por lote alimentado) fue considerablemente menor
que la consumida en el primer cultivo lo cual podriacutea deberse a que habiacutea una menor
cantidad de biomasa en el reactor En el segundo cultivo por lote alimentado se alcanzoacute
95
una eficiencia de consumo de glucosa del 68 en cambio en el primer cultivo fue del
263
Se observoacute que la levadura fue capaz de reducir parcialmente el Cr(VI) adicionado al
reactor y que en el primer cultivo por lote alimentado se lograron mayores niveles de
reduccioacuten
En el primer cultivo por lote alimentado las eficiencias de reduccioacuten de Cr(VI) maacutes altas
se alcanzaron durante el periodo de incubacioacuten de las 468 a las 967 h (7188-7292)
y disminuyeron ligeramente hasta el final de este cultivo (673-6945) En el segundo
cultivo por lote alimentado (lote alimentado repetido) las eficiencias disminuyeron
gradualmente a medida que se incrementoacute el tiempo de incubacioacuten (figura 31) La
eficiencia promedio de reduccioacuten de Cr(VI) del primer cultivo por lote alimentado fue de
689 y la del segundo cultivo alimentado fue de 56
96
Figura 31 Variacioacuten de la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) de Candida sp cuando se
utilizoacute una carga maacutesica del metal de 0514 mgh
La velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute progresivamente a medida
que transcurrieron los cultivos por lote alimentado desde 0181 hasta 0063 mgLh
(figura 32) estos valores son inferiores a los alcanzados en los cultivos por lote
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Efi
cie
nc
ia d
e r
ed
uc
cioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
CPLA1 CPLA2
97
Figura 32 Variacioacuten de la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Candida sp
en el cultivo por lote alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) llevados a
cabo con una carga maacutesica del metal de 0514 mgh
Posteriormente se realizoacute el cultivo por lote alimentado y lote alimentado repetido
utilizando una carga maacutesica de Cr(VI) de 105 mgh Se observoacute que en ambos cultivos
la masa celular de Candida sp se incrementoacute gradualmente a medida que se incrementoacute
el tiempo de incubacioacuten aunque al final de cada cultivo hubo una ligera disminucioacuten en la
cantidad de biomasa en el reactor En el primer cultivo por lote alimentado se alcanzoacute un
valor maacuteximo de 523 g de biomasa (incremento celular de 053 g) a las 637 h
mientras que en el segundo cultivo se alcanzoacute una cantidad maacutexima de biomasa de 435
g (incremento celular de 13 g) a las 1822 h totales de cultivo que corresponden a 893
h del cultivo por lote alimentado repetido
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica g
lob
al d
e
re
du
ccioacute
n d
e C
r(V
I) [
mg
de
Cr(V
I)L
h]
CPLA1 CPLA2
98
Asimismo se encontroacute que la levadura fue capaz de consumir parcialmente la glucosa
suministrada En el primer cultivo por lote alimentado se obtuvo una eficiencia de
consumo de glucosa del 299 mientras que en el segundo cultivo la eficiencia fue del
388 Estos resultados probablemente se deban a que el crecimiento de la levadura fue
mayor en el cultivo por lote alimentado repetido (incremento celular = 13 g) que en el
cultivo por lote alimentado que lo precedioacute (incremento celular = 053 g)
En los cultivos por lote alimentados llevados a cabo con una carga maacutesica de 105 mg de
Cr(VI) la levadura fue capaz de reducir parcialmente el Cr(VI) adicionado al reactor sin
embargo al final del primer cultivo por lote alimentado se lograron los niveles de
reduccioacuten maacutes altos
En el primer cultivo por lote alimentado la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) se
incrementoacute a medida que aumentoacute el tiempo de incubacioacuten alcanzaacutendose el valor maacutes
alto de eficiencia (529) a las 879 h de incubacioacuten En contraste en el segundo cultivo
por lote alimentado (alimentado repetido) la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute
continuamente conforme transcurrioacute el tiempo de cultivo Al final del cultivo por lote
alimentado repetido la eficiencia de reduccioacuten del metal fue del 43 (figura 33)
99
Figura 33 Variacioacuten de la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) de Candida sp cuando se
utilizoacute una carga maacutesica del metal de 105 mgh
En estos experimentos tambieacuten se observoacute que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de
Cr(VI) disminuyoacute continuamente durante todo el periodo de incubacioacuten desde 0226
hasta 0099 mgLh (figura 34)
0
10
20
30
40
50
60
0 50 100 150 200 250
Tiempo [h]
Efi
cie
ncia
de
re
du
ccioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
CPLA1 CPLA2
100
Figura 34 Variacioacuten de la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Candida sp
en el cultivo por lote alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) llevados a
cabo con una carga maacutesica del metal de 105 mgh
Las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) que se obtuvieron con una carga maacutesica
del metal de 105 mgh fueron inferiores a las logradas con una carga de 0514 mgh y
esto podriacutea deberse a que el tiempo de contacto entre la levadura y el medio de cultivo
fue menor En contraste las velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) fueron
ligeramente superiores a una carga maacutesica de 105 mgh
Con las dos cargas maacutesicas de Cr(VI) que se ensayaron en este trabajo se observoacute una
variacioacuten semejante en el pH de los medios de cultivo Los cultivos por lote alimentado
se iniciaron con un pH de 302-306 (estos valores corresponden al pH que se obtuvo al
final de los cultivos por lote que precedioacute a los cultivos por lote alimentado) El pH se
000
004
008
012
016
020
024
0 50 100 150 200 250
Tiempo [h]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica g
lob
al d
e r
ed
uccioacute
n
de
Cr(V
I) [
mg
de
Cr(V
I)L
h]
CPLA1 CPLA2
101
incrementoacute ligeramente durante el curso de los primeros cultivos por lote alimentado y al
final de eacutestos se tuvieron valores de 355 y de 345 cuando se emplearon cargas maacutesicas
de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh respectivamente En los cultivos por lote alimentado
repetido el pH se mantuvo praacutecticamente constante durante todo el periodo de
incubacioacuten
A pesar de que el cultivo por lote alimentado es muy recomendable para trabajar con
compuestos toacutexicos ha sido poco explorado para el tratamiento de aguas contaminadas
con cromo hexavalente Fujii y col (1990) utilizaron el cultivo por lote alimentado para
investigar la reduccioacuten de Cr(VI) por la bacteria anaerobia Enterobacter cloacae cepa
HO1 En este estudio una solucioacuten de cromato se alimentoacute continuamente en pequentildeas
dosis para minimizar el efecto toacutexico del metal Los investigadores encontraron que la
reduccioacuten de Cr(VI) fue fuertemente afectada por la velocidad especiacutefica de alimentacioacuten
de cromato Cuando esta velocidad fue inferior a 25 mmol de CrO42-g de biomasah
todo el cromo adicionado fue reducido A velocidades de alimentacioacuten superiores se
observoacute que la concentracioacuten de Cr(VI) residual en el medio de cultivo se incrementaba a
medida que aumentaba la velocidad de alimentacioacuten Asimismo encontraron que la
actividad reductora de la bacteria era fuertemente inhibida cuando la concentracioacuten de
Cr(VI) del medio de cultivo era mayor a 07 mM (3639 mgL)
Posteriormente Fujie y col (1996) realizaron la simulacioacuten de un cultivo por lote
alimentado utilizando datos cineacuteticos obtenidos en cultivo por lote y un modelo
matemaacutetico que describe el comportamiento de la bacteria antes mencionada Los
resultados experimentales y los predichos por el simulador fueron semejantes
102
En la tabla 11 se presentan los valores de velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
obtenidos en el presente trabajo en los diferentes sistemas de reaccioacuten ensayados La
mayor velocidad se obtuvo en el cultivo por lote realizado en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso por lo que eacuteste seriacutea el sistema maacutes adecuado para la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp
103
Tabla 11 Velocidades volumeacutetricas globales de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas en diferentes sistemas de reaccioacuten
CPL
Matraz
CPL Reactor
airlift con
tubo liso
CPL Reactor
airlift con
malla metaacutelica
CC Reactor
airlift con
tubo liso
CPLR Reactor
airlift con
tubo liso
CPL Reactor
airlift con tubo
perforado
CPLA Reactor
airlift con
tubo perforado
CPLAR Reactor
airlift con
tubo perforado
10
Vvm
05
vvm
10
vvm
10
vvm
10
vvm
05
vvm
10
vvm
05
vvm
05
vvm
f=08 f=06 f=04
CM1 CM2 CM1 CM2
098 151 ndash178 031 056 024 045 046 035 084 035 0092-0181
0163-0195
0063-0083
0099-0145
CPL = Cultivo por lote CC = Cultivo continuo CPLR = Cultivo por lote repetido CPLA = Cultivo por lote alimentado CPLAR = Cultivo por lote alimentado repetido f = relacioacuten de recambio CM = Carga maacutesica de Cr(VI)
CM1 = 0514 mg Cr(VI)h CM2 = 105 mg Cr(VI)h
104
5 CONCLUSIONES
El sulfato desempentildea un papel importante en la tolerancia al Cr(VI) y en la reduccioacuten
del mismo en la cepa de Candida sp utilizada en este trabajo
El efecto modulador del sulfato sobre el crecimiento celular y la reduccioacuten del Cr(VI)
depende de las concentraciones de los oxianiones sulfato y cromato
El mecanismo principal de remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp es la biotransformacioacuten
del altamente toacutexico Cr(VI) al menos toacutexico Cr(III)
El cultivo por lote en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso es el sistema de
reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
La velocidad de aireacioacuten no tiene un efecto significativo sobre la reduccioacuten de Cr(VI)
por Candida sp
105
6 REFERENCIAS
1 Acevedo-Aguilar FJ Espino-Saldantildea AE Leoacuten-Rodriacuteguez IL Rivera-Cano ME Avila-Rodriguez M Wrobel K et al 2006 Hexavalent chromium removal in vitro and from industrial wastes using chromate-resistant strains of filamentous
fungi indigenous to contaminated wastes Can J Microbiol 52 809-815
2 Ali-Awan M Baig MA Iqbal J Aslam MR amp Ijaz N 2003 Recovery of chromium (III) from tannery wastewater J App Sci amp Environ Management 7 (2) 5-8
3 Aacutelvarez SG Maldonado M Gerth A amp Kuschk P 2004 Characterization of
tannery effluents and study of the water Hyacinth in chromium recovery Informacioacuten Tecnoloacutegica 15 (3) 75-80
4 Aravindhan BM Madani B Rao JR Nair BU amp Ramasami T 2004 Bioaccumulation of Chromium from Tannery Wastewater An Approach for chrome
recovery and reuse Environ Sci Technol 38 300-306
5 Atkinson B amp Mavituna F 1983 Biochemical engineering and biotechnology handbook United Kingom Nature Press
6 Badar U Ahmed N Beswick AJ Pattanapipitpaisal P amp Macaskie LE 2000 Reduction of chromate by microorganisms isolated from metal contaminated sites of
Karachi Pakistan Biotechnol Lett 22 829-836 7 Bae WC Kang TG Kang IK Won YJ amp Jeong BC 2000 Reduction of
hexavalent chromium by Escherichia coli ATCC 33456 in batch and continuous cultures J Microbiol 38(1) 36-39
8 Balasubramanian S amp Pugalenthi V 1999 Determination of total chromium in
tannery wastewater by inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry
flame atomic absorption spectrometry and uv-visible spectrophotometric methods Talanta 50 (3) 457-467
9 Baldi F Vaughan AM amp Olson GJ 1990 Chromium(VI)-resistant yeast
isolated from a sewage treatment plant receiving tannery wastes Appl Environ
Microbiol 56 (4) 913-918
10 Barnhart J 1997 Occurrences uses and properties of chromium Regulatory Toxicology and Pharmacology 26 S3-S7
11 Beleza VM Boaventura RA amp Almeida MF 2001 Kinetics of chromium removal from spent tanning liquors using acetylene production sludge Environ
Sci Technol 35 (21) 4379-4383 12 Bhide JV Dhakephalkar PK amp Paknikar KM 1996 Microbiological process for
the removal of Cr(VI) from chromate-bearing cooling tower effluent Biotechnol Lett 18 (6)667-672
106
13 Bopp LH amp Ehrlich HL 1988 Chromate resistance and reduction in
Pseudomonas fluorescens strain LB300 Archives of Microbiology 150 426-431
14 Branco R Alpoim MC amp Morais PV 2004 Ochrobactrum tritici strain 5bvI1 ndash characterization of a Cr(VI)-resistant and Cr(VI)-reducing strain Can J Microbiol
50 697-703 15 Camargo FAO Bento FM Okeke BC amp Frankenberger WT 2002 Chromate
reduction by chromium-resistant bacteria isolated from soils contaminated with dichromate Journal of Environmental Quality 32 1228-1233
16 Camargo FAO Okeke BC Bento FM amp Frankenberger WT 2003 In vitro
reduction of hexavalent chromium by a cell-free extract of Bacillus sp ES 29
stimulated by Cu2+ Appl Microbiol Biotechnol 62 569-573
17 Cantildeizares-Villanueva R 2000 Biosorcioacuten de metales pesados mediante el uso de biomasa microbiana Rev Latinoam Microbiol 42 131-143
18 Cervantes C Campos-Garciacutea J Devars S Gutieacuterrez-Corona F Loza-Tavera H Torres-Guzmaacuten JC amp Moreno-Saacutenchez R 2001 Interactions of chromium with
microorganisms and plants FEMS Microbio Rev 25 335-347 19 Chardin B Dolla A Chaspoul F Fardeau ML Gallice P amp Bruschi M 2002
Bioremediation of chromate thermodynamic analysis of the effects of Cr(VI) on sulfate-reducing bacteria Appl Microbiol Biotechnol 60 352-360
20 Chardin B Giudici-Orticoni MT De Luca G Guigliarelli B amp Bruschi M 2003
Hydrogenases in sulfate-reducing bacteria function as chromium reductase Appl
Microbiol Biotechnol 63 315-321
21 Cheung Y amp Gu G 2003 Reduction of chromate (CrO42-) by an enrichment
consortium and an isolate of marine sulfate-reducing bacteria Chemosphere 52 1523-1529
22 Cheung KH amp Gu JD 2005 Chromate reduction by Bacillus megaterium TKW3
isolated from marine sediments World Journal of Microbiology amp Biotechnology 21 213-219
23 Cheung KH amp Gu JD 2007 Mechanism of hexavalent chromium detoxification
by microorganisms and bioremediation application potential a review International
Biodeterioration amp Biodegradation 59 8-15
24 Chirwa EMN amp Wang YT 1997 Hexavalent chromium reduction by Bacillus sp in a packed-bed bioreactor Environ Sci Technol 31 1446-1451
25 Cristiani-Urbina E Netzahuatl-Muntildeoz AR Manriquez-Rojas FJ Juaacuterez-Ramiacuterez C Ruiz-Ordaz N amp Galiacutendez-Mayer J 2000 Batch and fed-batch
cultures for the treatment of whey with mixed yeast cultures Process Biochemistry 35 649-657
107
26 Czakoacute-Veacuter K Batiegrave M Raspor P Sipiczki M amp Pesti M 1999 Hexavalent
chromium uptake by sensitive and tolerant mutants of Schizosaccharomyces pombe FEMS Microbiology Letters 178 109-115
27 DeLeo PC amp Ehrlich HL 1994 Reduction of hexavalent chromium by
Pseudomonas fluorescens LB300 in batch and continuous cultures Appl Microbiol Biotechnol 40 756-759
28 Desjardin V Bayard R Lejeune P amp Gourdon R 2003 Utilization of supernatant of pure cultures of Streptomyces thermocarboxydus NH50 to reduce
chromium toxicity and mobility in contaminated soils Water Air and Soil Pollut 3 153-160
29 Eccles H 1999 Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process TIBTECH 17 462-465
30 Faisal M amp Hasnain S 2004 Comparative study of Cr(VI) uptake and reduction in
industrial effluent by Ochrobactrum intermedium and Brevibacterium sp
Biotechnology Letters 26 1623-1628
31 Fruchter J 2002 In situ treatment of chromium-contaminated groundwater Environ Sci amp Technol pp 464-472
32 Fujie K Hu H Huang X Tanaka Y Urano K amp Ohtake H 1996 Optimal operation of bioreactor system developed for the treatment of chromate wastewater
using Enterobacter cloacae HO-1 Wat Sci Tech 33 (5-6) 173-182 33 Fujii E Toda K amp Ohtake H 1990 Bacterial reduction of toxic hexavalent
chromium using a fed-batch culture of Enterobacter cloacae strain HO1 J Ferment Bioeng 69 (6) 365-367
34 Gaballah I Goy D Kilbertus G amp Thauront J 1994 Decontamination of
industrial effluents for environment protection and recycling of metals Resources
Conservation and Recycling 10 (1-2) 97-106
35 Galiacutendez-Mayer J Saacutenchez-Teja O Cristiani-Urbina E amp Ruiz-Ordaz N 2001 A novel split-cylinder airlift reactor for fed-batch cultures Bioprocess and Biosystems
Engineering 24 171-177 36 Ganguli A amp Tripathi AK 1999 Survival and chromate reducing ability of
Pseudomonas aeruginosa in industrial effluents Lett Appl Microbiol 28 76-80
37 Garbisu C Alkorta I Llama MJ amp Serra JL 1998 Aerobic chromate reduction by Bacillus subtilis Biodegradation 9 133-141
38 Gonzaacutelez AR Ndungrsquou K amp Flegal AR 2005 Natural occurrence of hexavalent chromium in the Aromas Red Sands Aquifer California Environ Sci Technol 39
(15) 5505-5511
108
39 Gopalan R amp Veeramani H 1994 Studies on microbial chromate reduction by
Pseudomonas sp in aerobic continuous suspended growth cultures Biotechnology and Bioengineering 43 471-476
40 Guertin J Jacobs JA amp Avakian CP 2005 Chromium(VI) Handbook 1st
edition CRC Press USA 41 Hach Water Analysis Handbook 2002 Hach Company Colorado USA 4th ed
pp 433-444 1210-1211
42 Hafez AI El-Manharawy MS amp Khedr MA 2002 RO membrane removal of unreacted chromium from spent tanning effluent A pilot-scale study Part 2 Desalination 144 (1-3) 237-242
43 Hagino H Odagiri H amp Okutani J 1982 Draft device for a bubble column US
Patent 4327042 44 Horitsu H Futo S Miyazawa Y Ogai S amp Kawai K 1987 Enzymatic
reduction of hexavalent chromium by hexavalent chromium tolerant Pseudomonas ambigua G-1 Agric Biol Chem 51 (9) 2417-2420
45 Ishibashi Y Cervantes C amp Silver S 1990 Chromium reduction in Pseudomonas
putida Appl Environ Microb 56 (7) 2268-2270
46 Jianlong W Zeyu M amp Xuan Z 2004 Response of Saccharomyces cerevisiae to
chromium stress Process Biochem 39 1231-1235 47 Juvera-Espinosa J Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2006 Isolation and
characterization of a yeast strain capable of removing Cr(VI) Enzyme and Microbial Technology 40 114-121
48 Kaszycki P Fedorovych D Ksheminska H Babyak L Gonchar MV Jaglarz
A amp Koloczek H 2003 Modulation of chromium(VI) and (III) tolerance and
accumulation in yeast by sulfate-containing salts European Journal of Biochemistry 1 (1) P49-53
49 Komori K Wang P Toda K amp Ohtake H 1989 Factors affecting chromate
reduction in Enterobacter cloacae Strain HO1 Appl Microbiol Biotechnol 31 567-570
50 Ksheminska H Fedorovych D Babyak L Yanovych D Kaszycki P amp Koloczek H 2005 Chromium(III) and (VI) tolerance and bioaccumulation in
yeast a survey of cellular chromium content in selected strains of representative genera Process Biochem 40 1565-1572
51 Ksheminska HP Honchar TM Gayda GZ amp Gonchar MV 2006 Extra-cellular chromate-reducing activity of the yeast cultures Central European Journal of
Biology 1 (1)137-149
109
52 Kurniawan TA Chan GYS Lo W amp Babel S 2006 Physico-chemical
treatment techniques for wastewater laden with heavy metals Chemical Engineering Journal 118 83-98
53 Labra M Grassi F Imazio S Di Fabio T Citterio S Sgorbati S amp Agradi E
2004 Genetic and DNA-methylation changes induced by potassium dichromate in Brassica napus L Chemosphere 54 1049-1058
54 Laxman RS amp More S 2002 Reduction of hexavalent chromium by Streptomyces griseus Minerals Engineering 15 831-837
55 Leustek T 2002 Sulfate metabolism The Arabidopsis Book American Society of
Plant Biologists
56 Liu YG Xu WH Zeng GM Li X and Gao H 2006 Cr(VI) reduction by
Bacillus sp isolated from chromium landfill Process Biochemistry 41 1981-1986 57 Llovera S Bonet R Simon-Pujol MD amp Congregado F 1993 Effect of culture
medium ions on chromate reduction by resting cells of Agrobacterium radiobacter Appl Microbiol Biotechnol 39 424-426
58 Lloyd JR 2003 Microbial reduction of metals and radionuclides FEMS Microbiol
Rev 27 411-425
59 Marsh TL amp McInerney MJ 2001 Relationship of hydrogen bioavailability to
chromate reduction in aquifer sediments Appl Environ Microb 67 (4) 1517-1521
60 McLean J amp Beveridge TJ 2001 Chromate reduction by a pseudomonad isolated from a site contaminated with chromated copper arsenate Applied and
Environmental Microbiology 67 (3)1076-1084 61 Megharaj M Avudainayagam S amp Naidu R 2003 Toxicity of hexavalent
chromium and its reduction by bacteria isolated from soil contaminated with tannery waste Current Microbiology 47 51-54
62 Middleton SS Latmani RB Mackey MR Ellisman MH Tebo BM amp Criddle
CS 2003 Cometabolism of Cr(VI) by Shewanella oneidensis MR-1 produces cell-associated reduced chromium and inhibits growth Biotechnol Bioeng 83 627-637
63 Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2006 Removal of hexavalent chromium
by Trichoderma viride in an airlift bioreactor Enzyme and Microbial Technology 40 107-113
64 Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2008 Hexavalent chromium removal by Trichoderma inhamatum fungal strain isolated from tannery effluent Enzyme and
Microbial Technology 40 107-113
110
65 Morales B L 2005 Aislamiento de microorganismos y estudio de su capacidad
para remover cromo hexavalente Tesis de Maestriacutea Escuela Nacional de Ciencias Bioloacutegicas IPN Meacutexico
66 Muter O Patmalnieks A amp Rapoport A 2001 Interrelations of the yeast Candida
utilis and Cr(VI) metal reduction and its distribution in the cell and medium Process Biochem 36 963-970
67 Ohtake H Cervantes C amp Silver S 1987 Decreased chromate uptake in Pseudomonas fluorescens carrying a chromate resistance plasmid J Bacteriol 169
3853-3856 68 Pal N 1997 Reduction of hexavalent chromium to trivalent chromium by
Phanerochaete chrysosporium pp 511-517 En Alleman BC amp Leeson A In Situ and On-Site Bioremediation Vol 2 Battelle Press Ohio USA
69 Pattanapipitpaisal P Brown NL amp Macaskie LE 2001 Chromate reduction by
Microbacterium liquefaciens immobilised in polyvinyl alcohol Biotechnol Lett 23
61-65
70 Pepi M amp Baldi F 1992 Modulation of chromium(VI) toxicity by organic and inorganic sulfur species in yeasts from industrial wastes BioMetals 5 179-185
71 Quintana M Curutchet G amp Donati E 2001 Factors affecting chromium(VI) reduction by Thiobacillus ferrooxidans Biochemical Engineering Journal 9 11-15
72 Ramiacuterez-Ramiacuterez R Calvo-Meacutendez C Aacutevila-Rodriacuteguez M Lappe P Ulloa M
Vaacutezquez-Juaacuterez R amp Gutieacuterrez-Corona JF 2004 Cr(VI) reduction in a chromate-
resistant strain of Candida maltosa isolated from the leather industry Antonie van Leeuwenhoek 85 63-68
73 Rege MA Petersen JN Johnstone DL Turick CE Yonge DR amp Apel WA
1997 Bacterial reduction of hexavalent chromium by Enterobacter cloacae strain
HO1 grown on sucrose Biotechnol Lett 19 (7) 691-694
74 Roukas T 1993 Ethanol production from nonsterilized carob pod extract by free and immobilized Saccharomyces cerevisiae cells using fed-batch culture
Biotechnol Bioeng 43 189-194 75 Ruiacutez MA 2000 Recuperacioacuten de metales pesados de soluciones diluidas por
biosorcioacuten con bacteria En Medrano RH Galan WL Biotecnologiacutea de Minerales CONACYT Meacutexico pp 235-262
76 Saxena D Levin R amp Firer MA 2000 Removal of chromate from industrial
effluent by a new isolate of Staphylococcus cohnii Wat Sci Technol 42 (1-2)
93-98
77 Secretariacutea de Comercio y Fomento Industrial NMX-AA-74-1981 Anaacutelisis de Agua ndash Determinacioacuten del Ioacuten Sulfato
111
78 Secretariacutea de Economiacutea NMX-AA-051-SCFI-2001 Anaacutelisis de Agua -
Determinacioacuten de Metales por Absorcioacuten Atoacutemica en Aguas Naturales Potables Residuales y Residuales Tratadas - Meacutetodo de Prueba
79 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NMX-AA-044-SCFI-
2001 Anaacutelisis de Aguas - Determinacioacuten de Cromo Hexavalente en Aguas Naturales Potables Residuales y Residuales Tratadas - Meacutetodo de Prueba En Diario Oficial de la Federacioacuten 1 de agosto 2001
80 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996
Liacutemites Maacuteximos Permisibles de Contaminantes en las Descargas de Aguas Residuales en Aguas y Bienes Nacionales En Diario Oficial de la Federacioacuten 6 de enero 1997
81 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996
Liacutemites Maacuteximos Permisibles de Contaminantes en las Descargas de Aguas Residuales a los Sistemas de Alcantarillado Urbano o Municipal En Diario Oficial de la Federacioacuten 3 de junio 1998
82 Secretariacutea de Salud Proyecto de Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-
NOM-127-SSA1-1994 Salud Ambiental Agua para Uso y Consumo Humano - Liacutemites Permisibles de Calidad y Tratamientos a que debe Someterse el Agua para su Potabilizacioacuten En Diario Oficial de la Federacioacuten 20 de Octubre 2000
83 Shakoori AR Makhdoom M amp Haq RU 2000 Hexavalent chromium reduction
by a dichromate-resistant gram-positive bacterium isolated from effluents of tanneries Appl Microbiol amp Biotechnol 53 (3) 348-351
84 Shen H and Wang YT 1994 Biological reduction of chromium by E coli Journal of Environmental Engineering 120 560-572
85 Shen H amp Wang Y 1995 Hexavalent chromium removal in two-stage bioreactor
system J Environ Eng 121 (11) 798-804
86 Smith WA Apel WA Petersen JN amp Peyton BM 2002 Effect of carbon and
energy source on bacterial chromate reduction Bioremediation J 6 (3) 205-215
87 Smith WL amp Gadd GM 2000 Reduction and precipitation of chromate by mixed culture sulphate-reducing biofilms J Appl Microbiol 88 983-991
88 Song Z Williams CJ amp Edyvean RGJ 2004 Treatment of tannery wastewater by chemical coagulation Desalination 164 (3) 249-259
89 Srinath T Verma T Ramteke PW amp Garg SK 2002 Chromium (VI)
biosorption and bioaccumulation by chromate resistant bacteria Chemosphere 48
(4) 427-435
90 Stanbury PF amp Whitaker A ―Principles of Fermentation Technology Pergamon Press Ltd Great Britain 1984 First edition Pp 11-24
112
91 Stasinakis AS Mamais D Thomaidis NS amp Lekkas TD 2002 Effect of
chromium (VI) on bacterial kinetics of heterotrophic biomass of activated sludge Water Res 36 3341-3349
92 Stasinakis AS Thomaidis NS Mamais D Karivali M amp Lekkas TD 2003
Chromium species behaviour in the activated sludge process Chemosphere 52 1059-1067
93 Stephen JR amp Macnaughton SJ 1999 Developments in terrestrial bacterial remediation of metals Current Opinion in Biotechnology 10 230-233
94 Su C amp Ludwig RD 2005 Treatment of hexavalent chromium in chromite ore
processing solid waste using a mixed reductant solution of ferrous sulfate and
sodium dithionite Environ Sci Technol 39 (16) 6208-6216
95 Thacker U Parikh R Shouche Y amp Madamwar D 2006 Hexavalent chromium reduction by Providencia sp Process Biochem 41 1332-1337
96 Thacker U amp Madamwar D 2005 Reduction of toxic chromium and partial localization of chromium reductase activity in bacterial isolate DM1 Would Journal
of Microbiology amp Biotechnology 21 891-899 97 Tung HL Chiou SY Tu CC amp Wu WT 1997 An airlift reactor with double
net draft tubes and its application in fermentation Bioprocess Eng 171-5
98 Turick CE Apel WA amp Carmiol NS 1996 Isolation of hexavalent chromium-reducing anaerobes from hexavalent-chromium-contaminated and noncontaminated environments Applied Microbiol Biotechnol 44 683-688
99 Viamajala S Peyton BM Sani RK Apel WA amp Petersen JN 2004 Toxic
effects of chromium(VI) on anaerobic and aerobic growth of Shewanella oneidensis MR-1 Biotechnol Prog 20 87-95
100 Volesky B amp Vieira RHSF 2000 Biosorption a solution to pollution Internat Microbiol 3 17-24
101 Wang DIC Cooney CL Demain AL Dunnill P Humphrey AE amp Lilly MD
1979 ―Fermentation and Enzyme Technology John Wiley amp Sons Inc USA Pp 98-115
102 Wang YT and Shen H 1997 Modelling Cr(VI) reduction by pure bacterial cultures Water Research 31 727-732
103 Wang Y amp Xiao C 1995 Factors affecting hexavalent chromium reduction in pure
cultures of bacteria Water Res 29 (11) 2467-2474
104 Wang Y 2000 Microbial reduction of chromate En Lovley DR (Ed)
Environmental Microbe-Metal Interactions ASM Press Washington DC USA pp 225-235
113
105 Wilkin RT Su C Ford RG amp Paul CJ 2005 Chromium-removal processes
during groundwater remediation by a zerovalent iron permeable reactive barrier Environ Sci Technol 39 (12) 4599-4605
106 Worthington Biochemical Corporation 1972 Worthington Enzyme Manual
Enzymes Enzyme Reagents and Related Biochemicals Freehold New Jersey USA
107 Wu J amp Wu WT 1991 Fed-batch culture of Saccharomyces cerevisiae in an airlift reactor with net draft tube Biotechnol Prog 7 230-233
108 Wu WT amp Wu JY 1990 Airlift reactor with net draught tube J Ferm Bioeng
70 359-361
109 Wu WT Wu JY amp Jong JZ 1992 Mass transfer in an airlift reactor with a net
draft tube Biotechnol Prog 8 465-468 110 Zakaria ZA Zakaria Z Surif S amp Ahmad WA 2006 Hexavalent chromium
reduction by Acinetobacter haemolyticus isolated from heavy-metal contaminated wastewater J Hazard Mater 146 30-38
111 Zuacutentildeiga M 2005 Aislamiento de microorganismos con capacidad para remover
cromo hexavalente del agua Tesis de Licenciatura Escuela Nacional de Ciencias
Bioloacutegicas IPN Meacutexico
Referencias electroacutenicas
httpepagov httpesepagovtechpubs412304html
httpfaiunneeduarbiologiamicroindcultivo20y20biorreactoreshtm httpmineralserusgsgovmineralspubscommoditychromium180494pdf
httpuserpagesumbcedu gferre1bmcohtml
httpuserpagesumbcedu gferre1fedbatchhtml httpwwgemesmaterialdocument httpwwwatsdrcdcgovfacts7 html
httpwwwchemicalelementscomelementscrhtml httpwwwepagoviris
wwwclu-inorgdownloadstudentpapersbio_of_metals_paperpdf
114
7 Impacto
En este trabajo se identificaron algunas variables ambientales que afectan la
biorreduccioacuten de cromo hexavalente [Cr(VI)] La informacioacuten obtenida podriacutea ser de
utilidad para mejorar los procesos de reduccioacuten del metal asiacute como para disminuir los
tiempos y costos del tratamiento de los efluentes industriales contaminados con Cr(VI)
Los resultaron mostraron que el sulfato afecta la tolerancia de Candida sp al Cr(VI) y a
su capacidad para reducirlo Fue evidente que a medida que se incrementoacute la
concentracioacuten de sulfato aumentoacute el crecimiento de la levadura la eficiencia global y la
velocidad global de reduccioacuten de Cr(VI) Asimismo se encontroacute que la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp depende de la densidad celular de los cultivos de manera tal que
a mayor cantidad de biomasa producida mayor es la reduccioacuten del metal Aun cuando la
cepa de Candida sp es sensible a los efectos toacutexicos del Cr(VI) en ausencia del sulfato
esta levadura posee una notable capacidad para reducir muy altas concentraciones de
Cr(VI) en presencia de sulfato por lo que podriacutea ser potencialmente uacutetil para el
tratamiento de aguas industriales altaminadas con Cr(VI) y con iones sulfato
Hasta donde sabemos este es el primer trabajo en el que se demuestra que el sulfato
desempentildea un papel impotante tanto en la tolerancia al Cr(VI) como en la reduccioacuten
aeroacutebica del mismo en microorganismos Estos descubrimientos podriacutean tener
implicaciones importantes en el tratamiento de aguas residuales contaminadas con
Cr(VI)
Ademaacutes se encontroacute que los contactores gas-liacutequido son adecuados para la reduccioacuten
aeroacutebica de Cr(VI) por Candida sp Esto uacuteltimo es de vital importancia porque seriacutea
posible disminuir significativamente los costos de tratamiento ya que estos biorreactores
se caracterizan por su baja economiacutea de aireacioacuten Las velocidades volumeacutetrica y
especiacutefica asiacute como la capacidad de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por Candida sp en el
reactor airlift con tubo conceacutentrico fueron superiores a las obtenidas en matraz y eacutesto
podriacutea deberse a que en el reactor airlift la levadura tuvo una mayor cantidad de oxiacutegeno
disponible para su crecimiento y a que el mayor nuacutemero de ceacutelulas producidas fue la
responsable de reducir maacutes eficazmente el Cr(VI) presente en el medio de cultivo
115
Las caracteriacutesticas mostradas por Candida sp en el dispositivo airlift indican que este
tipo de reactor neumaacutetico es adecuado para el crecimiento y la reduccioacuten aeroacutebica del
Cr(VI) por la levadura Asimismo los paraacutemetros cineacuteticos del proceso de reduccioacuten de
Cr(VI) catalizado por Candida sp son superiores a los reportados para otros
microorganismos lo que sugiere que esta cepa de levadura tiene potencial biotecnoloacutegico
para ser utilizada en procesos de remediacioacuten de aguas residuales industriales
contaminadas con Cr(VI)
De los diferentes sistemas de reaccioacuten ensayados (cultivos por lote lote repetido
continuo de una etapa lote alimentado y lote alimentado repetido) el cultivo por lote es
el maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
Otra de las contribuciones de este trabajo fueron la formacioacuten de recursos humanos
tanto a nivel licenciatura como de posgrado Uno de los estudiantes de licenciatura ya
sustentoacute su examen profesional y la tesis de Maestriacutea de otra estudiante ya fue revisada
y aprobada por los sinodales por lo que el examen para obtener el grado se realizaraacute en
poco tiempo Actualmente estaacuten en proceso 1 tesis de licenciatura 2 de maestriacutea y 1 de
doctorado
Entre otros productos del proyecto de investigacioacuten se tienen la publicacioacuten de 2 artiacuteculos
en revistas internacionales incluidas en la base de datos del Journal of Citation Reports
del Institute for Scientific Information (ISI) la publicacioacuten de 2 artiacuteculos en extenso en
las memorias de Congresos Internacionales y la presentacioacuten de varios trabajos en
eventos acadeacutemicos nacionales e internacionales
3
I INTRODUCCIOacuteN
11 Generalidades
Las actividades antropogeacutenicas han ocasionado gran deterioro y contaminacioacuten del medio
ambiente debido a que los recursos naturales se han utilizado inadecuadamente y a las
malas praacutecticas de almacenamiento e incorrecta disposicioacuten de los residuos generados
(Ishibashi y col 1990 Rege y col 1997)
Entre los contaminantes presentes en agua aire y suelo que requieren mayor atencioacuten
se encuentran los metales pesados ya que algunos de ellos son altamente toacutexicos
carcinogeacutenicos mutageacutenicos y teratogeacutenicos (Wang 2000) Ademaacutes a diferencia de los
compuestos orgaacutenicos los metales pesados no pueden ser degradados ni quiacutemica ni
bioloacutegicamente por lo que permanecen indefinidamente en el medio ambiente
(Cervantes y col 2001) y de manera eventual se acumulan a traveacutes de la cadena
troacutefica lo que incrementa los riesgos para la salud de los seres vivos (Volesky y Vieira
2000) Los metales pesados maacutes toacutexicos para el ser humano son el plomo mercurio
cadmio arseacutenico y el cromo
Para disminuir su toxicidad facilitar su desecho o su reutilizacioacuten los metales pesados
pueden ser sometidos a procesos que provocan cambios en su estado fiacutesico yo en su
estado de oxidacioacuten (Ruiacutez 2000)
12 Cromo
El cromo es el veintiunavo elemento maacutes abundante en la tierra Se le encuentra en
muy diversos ambientes tales como en los oceacuteanos aguas superficiales y subterraacuteneas
suelos rocas aire seres vivos y en alimentos (Guertin y col 2005) Es un metal de
4
transicioacuten de color gris que ocupa el nuacutemero 24 en la Tabla Perioacutedica y tiene un peso
atoacutemico de 52
Fue descubierto en 1797 por Louis Vauquelin y se utilizoacute primeramente como pigmento
Su nombre proviene de la palabra griega ―chrocircma que significa color como referencia a
los diferentes colores que presentan sus compuestos Su punto de fusioacuten es de 1857 degC y
el de ebullicioacuten es de 2672 degC Su densidad es de 719 gcm3 (Barnhart 1997
httpwwwchemicalelementscomelementscrhtml)
El cromo existe en varios estados de oxidacioacuten del -2 al +6 siendo los maacutes estables en
el medio ambiente natural el cromo metaacutelico [Cro o Cr(0)] el trivalente [Cr3+ o Cr(III)] y
el hexavalente [Cr6+ o Cr(VI)] los cuales presentan propiedades fisicoquiacutemicas diferentes
(Jianlong y col 2004 Viamajala y col 2004)
El cromo tiene una alta resistencia a la corrosioacuten al desgaste por friccioacuten y al impacto
asiacute como una gran dureza a alta temperatura (Barnhart 1997) entre otras propiedades
que lo hacen muy atractivo para su uso en diversos sectores industriales tales como en
la galvanoplastia en curtiduriacuteas de piel en la fabricacioacuten de tintes y pigmentos para
pinturas y textiles en la produccioacuten de acero inoxidable de productos refractarios de
inhibidores de la corrosioacuten de tintas para maacutequinas de copiado de conservadores de la
madera asiacute como para el pulido de metales (Smith y Gadd 2000
httpwwwatsdrcdcgovfacts7 html)
La principal fuente de cromo es el mineral conocido como cromita o ferrocromo
(FeCr2O4) Para el antildeo 2003 se reportoacute una produccioacuten mundial de cromita de 15500
5
millones de toneladas cuacutebicas de las cuales el 912 fue utilizada por la industria
metaluacutergica el 52 por la industria quiacutemica el 28 por la industria de la fundicioacuten y el
08 por la industria refractaria
(httpmineralserusgsgovmineralspubscommoditychromium180494pdf) Los
principales paiacuteses productores de cromita son Sudaacutefrica Kazakhstan India Zimbawe
Finlandia Brasil y Turquiacutea
(httpmineralserusqsgovmineralspubscommoditychromium180494pdf)
El cromo metaacutelico [Cr(0)] no se encuentra en forma natural en el medio ambiente sino
que es generado por procesos industriales Se le usa principalmente en la produccioacuten de
acero y de otras aleaciones metaacutelicas (httpwwwatsdrcdcgovfacts7html)
El cromo trivalente se encuentra en la naturaleza en minerales por ejemplo como
cromato de fierro (FeCr2O4) Este estado de oxidacioacuten del cromo forma precipitados de
oacutexidos hidroacutexidos o sulfatos y por consiguiente es menos moacutevil que la forma
hexavalente En el suelo se le encuentra unido principalmente a la materia orgaacutenica
(Jianlong y col 2004 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004 Cervantes y col 2001)
El cromo trivalente es un nutriente esencial tanto para los seres humanos como para los
animales ya que tiene un papel importante en el metabolismo de la glucosa de liacutepidos y
de proteiacutenas Asimismo se considera que potencia el reconocimiento de la insulina por
las ceacutelulas por lo que podriacutea tener aplicaciones para el tratamiento de la diabetes
(Garbisu y col 1998 Wang 2000 Lloyd 2003 Ksheminska y col 2005)
6
La FDA (Food and Drug Administration) ha propuesto un consumo diario (Reference Daily
Intake) de cromo de 120 gd en adultos (httpwwwepagoviris) Algunas fuentes de
cromo son el broacutecoli la levadura de cerveza el hiacutegado quesos granos integrales y
cereales (Guertin y col 2005)
No es comuacuten encontrar cromo hexavalente en forma natural en el medio ambiente y
cuando se le encuentra generalmente es como cromato de plomo PbCrO4
(httpwwwatsdrcdcgovfacts7html) Su presencia en el ambiente se debe
principalmente a las actividades realizadas por el hombre (wwwclu-
inorgdownloadstudentpapersbio_of_metals_paperpdf) En soluciones acuosas el
Cr(VI) generalmente se encuentra presente como oxianioacuten cromato [CrO42-] yo
dicromato [Cr2O72-] dependiendo del pH de la solucioacuten
Debido a su naturaleza fuertemente oxidante el cromo hexavalente puede reaccionar
con la materia orgaacutenica o con agentes reductores con lo que se forma cromo trivalente
Esta transformacioacuten ocurre maacutes raacutepidamente en ambientes aacutecidos tales como en suelos
con pH bajo (Cervantes y col 2001 Jianlong y col 2004)
En el aire el cromo hexavalente ocasionalmente reacciona con partiacuteculas de polvo o con
otros contaminantes con lo que se convierte en cromo trivalente En aguas superficiales
ricas en materia orgaacutenica el Cr(VI) exhibe un tiempo de vida corto en ese estado de
oxidacioacuten (httpwwwepagoviris)
7
13 Toxicidad del cromo
La EPA (Environmental Protection Agency) considera al cromo hexavalente - y a sus
derivados - como uno de los diecisiete agentes quiacutemicos de mayor peligrosidad para la
salud puacuteblica y para el medio ambiente (Marsh y McInerney 2001)
Al ser humano el cromo hexavalente le puede provocar dantildeo al rintildeoacuten e hiacutegado asiacute como
alteraciones neuroloacutegicas La inhalacioacuten de cromo hexavalente en niveles mayores a 2
microgm3 puede causar irritacioacuten de las mucosas comezoacuten hemorragias uacutelceras y
perforacioacuten del tabique nasal (httpwwwatsdrcdcgovfacts7html)
Se ha encontrado que algunas personas son extremadamente sensibles al contacto de su
piel con el cromo hexavalente Algunas de las reacciones aleacutergicas detectadas consisten
en el enrojecimiento marcado de la piel e hinchazoacuten
(httpwwwatsdrcdcgovfacts7html Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos
Naturales y Pesca NMX-AA-044-SCFI-2001 httpwwwepagoviris Ksheminska y
col 2005)
La EPA clasifica a los compuestos del cromo hexavalente en el grupo A el cual incluye a
los agentes carcinogeacutenicos para el hombre Ademaacutes el cromo hexavalente tiene efecto
mutageacutenico y teratogeacutenico en animales y humanos (Wang 2000
httpwwwatsdrcdcgovfacts7html Smith y col 2002)
El cromo hexavalente tambieacuten es toacutexico para la mayoriacutea de los microorganismos auacuten a
bajas concentraciones debido a que reduce su actividad enzimaacutetica afecta sus procesos
metaboacutelicos y les produce mutaciones (Wang 2000) Lo anterior tiene gran impacto en
8
los sistemas de tratamiento bioloacutegico de aguas residuales ya que reduce
significativamente la eficiencia de remocioacuten de los contaminantes y la calidad del efluente
(Stasinakis y col 2002 2003)
En las plantas el cromo hexavalente reduce la actividad de las enzimas fotosinteacuteticas y
en general de las proteiacutenas (Morales 2005) ocasiona enfermedades como la clorosis e
interfiere en diversos procesos metaboacutelicos que causan finalmente la muerte de estos
organismos Asimismo se ha demostrado que rompe la unioacuten azuacutecar-fosfato de la
cadena de aacutecido desoxirribonucleico (DNA) y produce una hiper-metilacioacuten de las bases
nitrogenadas lo que ocasiona mutaciones al azar (Labra y col 2004)
Diversos estudios han demostrado que el cromo hexavalente es cien veces maacutes toacutexico
(Garbisu y col 1998) y mil veces maacutes mutageacutenico que el estado trivalente (Wang
2000 Saxena y col 2000 Lloyd 2003)
14 Cantidad de cromo liberado al medio ambiente y legislacioacuten ambiental
Se estima que maacutes de 170000 toneladas de residuos que contienen cromo se descargan
al medio ambiente cada antildeo (Marsh y McInerney 2001) En la tabla 1 se muestran
algunos datos reportados sobre el contenido de cromo en algunos efluentes industriales
asiacute como en aguas superficiales y freaacuteticas Se puede apreciar que la concentracioacuten de
cromo de los efluentes variacutea considerablemente incluso en los del mismo sector
industrial
9
Tabla 1 Concentraciones de cromo total yo Cr(VI) de efluentes industriales y cuerpos
de agua
Fuente Concentracioacuten de cromo total
Concentracioacuten de Cr (VI)
Referencia
Industria galvanizadora ---
5000 mgL
Gaballah y col 1994
Industria galvanizadora (1) Industria galvanizadora (2)
---
---
127 mgL
3700 mgL
Fujie y col 1996
Acuiacutefero Aromas Red Sands (California)
---
6-36 gL
Gonzaacutelez y col 2005
Agua subterraacutenea contaminada (EEUU)
gt 1500 gL
---
Wilkin y col 2005
Riacuteo receptor de efluentes de la industria papelera
20-80 mgL
---
Cervantes y col 2001
Planta de tratamiento de desechos de produccioacuten de
ferrocromita
---
3-57 mgL
(fase disuelta)
Su y Ludwig 2005
Curtiduriacutea de pieles
(Grecia)
2000 ndash 3500
mgL
--- httpesepagovtechpubs41230
4html
Curtiduriacutea de pieles (tanque de sedimentacioacuten)
3500 gmL
40 gmL
Ganguli y Tripathi 1999
Curtiduriacutea de pieles (tanque de descarga)
5000 gmL
3000 gmL
Ganguli y Tripathi 1999
Curtiduriacutea de pieles (India) 200 - 2400 mgL ---
Balasubramanian y Pugalenthi 1999
Curtiduriacutea de pieles (Portugal)
2467 mgL
---
Beleza y col 2001
Efluente tratado de
curtiduriacutea de pieles (India)
---
096 mgL
Srinath y col 2002
Curtiduriacutea de pieles (Egipto)
---
1300-2500
mgL
Hafez y col 2002
Curtiduriacutea de pieles (1) (Pakistaacuten) Curtiduriacutea de pieles (2) (Pakistaacuten)
2877 mgL
220 mgL
---
---
Ali-Awan y col 2003
Curtiduriacutea de pieles 12 mgL --- Song y col 2004
Curtiduriacutea de pieles (Guanajuato Meacutexico)
250 gmL
---
Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004
Curtiduriacutea de pieles (India) 500-1000 mgL
---
Aravindhan y col 2004
Bantildeos de curtido al cromo
en curtiduriacuteas (Leoacuten Guanajuato Meacutexico)
3000 ndash10000 mgL
---
Aacutelvarez y col 2004
10
En Meacutexico no se tienen datos precisos sobre la cantidad y concentracioacuten de cromo total
o hexavalente de los residuos generados por las diversas industrias sin embargo se ha
informado que las industrias del curtido de pieles generan de 250 a 270 toneladas de
Cr2O3 al antildeo (Zuacutentildeiga 2005)
Debido a las grandes cantidades de cromo que se liberan al medio ambiente asiacute como a
los efectos indeseables que este metal ocasiona sobre los seres vivos en muchos paiacuteses
se han establecido Normas Ambientales que pretenden regular la concentracioacuten de cromo
total yo de Cr(VI) de los desechos liacutequidos soacutelidos o gaseosos que se descargan al
medio ambiente
En Meacutexico la Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca ha decretado
normas oficiales que establecen los liacutemites maacuteximos permisibles de contaminantes
incluido el cromo ya sea como cromo total o como cromo hexavalente de las aguas
residuales que se descargan en aguas y bienes nacionales (Secretariacutea de Medio
Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996) (tabla 2) asiacute como en los
sistemas de alcantarillado urbano o municipal (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos
Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996) (tabla 3)
En cuanto al agua para uso y consumo humano la Secretariacutea de Salud ha emitido la
Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-1994 (Secretariacutea de Salud Proyecto de
Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-1994) donde se indica
como liacutemite maacuteximo permisible una concentracioacuten de cromo total de 005 mgL
11
Tabla 2 Liacutemites maacuteximos permisibles de cromo total para las aguas residuales que se descargan en aguas y bienes
nacionales (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996)
Paraacutemetros
( )
Riacuteos Embalses
Naturales y
Artificiales
Aguas Costeras Suelo
(mgL) Uso en
riego
agriacutecola
(A)
Uso
puacuteblico
urbano
(B)
Proteccioacuten
de vida
acuaacutetica
( C )
Uso en
riego
agriacutecola
(B)
Uso
puacuteblico
urbano
( C )
Explotacioacuten
pesquera
navegacioacuten
y otros
usos (A)
Recreacioacuten
(B)
Estuarios
(B)
Uso en
riego
agriacutecola
(A)
Humedales
naturales
(B)
PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD
Cromo 1 15 05 10 05 10 1 15 05 10 05 10 1 15 05 10 05 10 05 10
() Medidos de manera total PD = Promedio diario PM = Promedio mensual (A) (B) y ( C ) Tipo de cuerpo receptor seguacuten la Ley Federal de Derechos
Tabla 3 Liacutemites maacuteximos permisibles de cromo hexavalente para los sistemas de alcantarillado urbano o municipal
(Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996)
Paraacutemetros (mgL) Promedio Mensual Promedio Diario Instantaacuteneo
Cromo hexavalente 05 075 1
12
Por su parte la EPA ha establecido como liacutemite una concentracioacuten de 01 mg de cromo
por litro de agua potable (httpwwwatsdrcdcgovfacts7html)
La Organizacioacuten Mundial para la Salud (OMS) y la Comunidad Econoacutemica Europea (CEE)
establecen una concentracioacuten de 005 mg de cromo totalL como paraacutemetro de calidad
para aguas destinadas a consumo humano (httpwwgemesmaterialdocument)
Algunos valores sentildealados por otras instancias internacionales se muestran en la tabla
4
Tabla 4 Liacutemites permisibles para cromo sentildealados por Directivas Internacionales
sobre agua potable y aguas embotelladas (Zuacutentildeiga 2005)
Paraacutemetro Canadaacute 1 Japoacuten 2 Aguas embotelladas Nivel de
Administracioacuten Federal sobre
Productos Farmaceacuteuticos de EEUU
Cromo
005 mgL
005 mgL
01 mgL
1 Liacutemite establecido por el Ministerio de Salud de Canadaacute
2 Liacutemite establecido por el Ministerio de Salud y Bienestar Social de Japoacuten
15 Meacutetodos para la remocioacuten de cromo de los efluentes industriales
Para disminuir los efectos toacutexicos del metal es conveniente aplicar alguacuten(os)
tratamiento(s) a los efluentes industriales que contienen cromo antes de descargarlos en
los cuerpos de agua o en el suelo asiacute como restaurar los ecosistemas contaminados En
la actualidad estaacuten disponibles varias tecnologiacuteas para estos propoacutesitos (Eccles 1999)
Estas tecnologiacuteas se han empleado para reducir la toxicidad del contaminante [mediante
la transformacioacuten quiacutemica o bioloacutegica del Cr(VI) a Cr(III)] para removerlo de un lugar
para disminuir la extensioacuten de la contaminacioacuten o para contenerlo en un aacuterea en
particular (Guertin y col 2005)
13
151 Procesos convencionales
Los meacutetodos convencionales para la remocioacuten de los metales pesados son de naturaleza
fisicoquiacutemica y pueden ser utilizados en varias etapas del tratamiento de aguas
residuales Los meacutetodos maacutes usuales para la remocioacuten de Cr(VI) de los efluentes
industriales son los siguientes 1) reduccioacuten quiacutemica ndash precipitacioacuten en donde el Cr(VI)
es reducido quiacutemicamente a Cr(III) a pH aacutecido utilizando alguacuten agente reductor (por
ejemplo el bisulfito de sodio) y posteriormente se adiciona cal o alguacuten otro compuesto
alcalino para formar hidroacutexido de cromo (III) el cual es separado por sedimentacioacuten y
2) coagulacioacuten-floculacioacuten En general estos meacutetodos tienen algunas desventajas tales
como 1) son costosos ya que el agente activo no puede ser recuperado para su
posterior reutilizacioacuten 2) algunos reactivos quiacutemicos son sumamente toacutexicos 3) su
selectividad es baja 4) generan lodos quiacutemicos con altas concentraciones de metales los
cuales son difiacuteciles de tratar 5) la remocioacuten de los metales es incompleta principalmente
cuando la concentracioacuten de eacutestos en los efluentes es inferior a 100 mgL y 6) las aguas
residuales resultantes no satisfacen los criterios de calidad establecidos en la legislacioacuten
ambiental (Cantildeizares-Villanueva 2000 Ruiacutez 2000 Saxena y col 2000 Cheung y Gu
2003)
Algunas otras tecnologiacuteas que se utilizan ocasionalmente para la remocioacuten del Cr(VI) son
el intercambio ioacutenico la adsorcioacuten el tratamiento electroquiacutemico la oacutesmosis inversa y la
evaporacioacuten (Garbisu y col 1998 Camargo y col 2003 Kurniawan y col 2006) Las
principales desventajas de estos meacutetodos son los altos costos fijos de operacioacuten y de
mantenimiento por lo que su aplicacioacuten a grandes voluacutemenes de agua o su uso por
pequentildeas y medianas empresas estaacute muy limitado
14
La EPA recomienda los siguientes meacutetodos para la remocioacuten de cromo del agua potable
en caso de que eacutesta exceda el liacutemite permisible para este metal coagulacioacuten-filtracioacuten
intercambio ioacutenico y oacutesmosis inversa (httpepagov)
En Meacutexico en caso de que el agua destinada a uso y consumo humano exceda el liacutemite
permisible de cromo total la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-1994
(Secretariacutea de Salud Proyecto de Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-
127-SSA1-1994) indica como tratamientos a aplicar el intercambio ioacutenico o la oacutesmosis
inversa
152 Procesos biotecnoloacutegicos
En las uacuteltimas dos deacutecadas se han llevado a cabo estudios con el fin de utilizar
microorganismos y plantas para la restauracioacuten de sitios y para el tratamiento de
efluentes industriales contaminados con metales toacutexicos (Stephen y Macnaughton 1999
Lloyd 2003)
En la actualidad se considera que los procesos microbioloacutegicos son la alternativa maacutes
atractiva para remover algunos metales toacutexicos de los sitios y efluentes contaminados
ya que estos procesos son ―amigables con el medio ambiente los subproductos que
generan son usualmente inocuos son muy eficientes en la remocioacuten de los metales
(particularmente cuando las concentraciones de eacutestos son bajas condiciones en las que
algunos procesos fisicoquiacutemicos son muy ineficientes) y son de bajo costo (Cheung y
Gu 2005 Chardin y col 2002 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004)
15
Dentro de los procesos biotecnoloacutegicos propuestos para la remocioacuten de Cr(VI) se
encuentran la biosorcioacuten y la reduccioacuten bioloacutegica en los cuales se han utilizado
principalmente microorganismos (Volesky y Vieira 2000 Fruchter 2002 Cheung y Gu
2003)
En la biosorcioacuten se utilizan ciertos tipos de adsorbentes bioloacutegicos por ejemplo biomasa
microbiana (viva o inactivada en suspensioacuten o inmovilizada) con los que no se requiere
energiacutea metaboacutelica para retener pasivamente al cromo hexavalente mediante procesos
fiacutesicos (adsorcioacuten fiacutesica principalmente por fuerzas de van Der Waals) o quiacutemicos
(quimisorcioacuten) (Cantildeizares-Villanueva 2000 Volesky y Vieira 2000 Aravindhan y col
2004) En algunos casos se ha observado que el metal es transportado activamente al
interior de las ceacutelulas (a expensas de energiacutea metaboacutelica) proceso al que se le denomina
como bioacumulacioacuten
En la biorreduccioacuten o reduccioacuten bioloacutegica el cromo hexavalente es transformado a la
forma trivalente este uacuteltimo puede ser faacutecilmente precipitado en una etapa posterior de
tratamiento ajustando el pH del agua residual a un valor cercano al neutro para
removerlo finalmente por meacutetodos fiacutesicos (Chardin y col 2002 Cheung y Gu 2003) Se
considera que este proceso es una alternativa tecnoloacutegica potencial para el tratamiento
de suelos cuerpos de agua y efluentes industriales contaminados ya que la reduccioacuten
del Cr(VI) disminuye significativamente la toxicidad (100 veces) solubilidad en agua y
movilidad del metal a traveacutes del medio ambiente (Cheung y Gu 2003 Lloyd 2003
Wang 2000)
16
Se han aislado varios microorganismos que pueden reducir el Cr(VI) a Cr(III) ya sea
como cultivos puros (Horitsu y col 1987 Wang 2000 Pattanapipitpaisal y col 2001
Chardin y col 2002 Cheung y Gu 2003 Middleton y col 2003 Morales-Barrera
2005 Pal 1997 Muter y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004 Thacker y col
2006) o como cultivos mixtos (Smith y col 2002 Cheung y Gu 2003) Las fuentes de
aislamiento han sido muy diversas como por ejemplo efluentes de curtiduriacuteas de la
industria metaluacutergica de mantos freaacuteticos de aguas superficiales contaminadas de
sedimentos anoacutexicos en lagos de plantas de tratamiento de aguas residuales entre
otros (Horitsu y col 1987 Fujii y col 1990 Ganguli y Tripathi 1999 Badar y col
2000 Saxena y col 2000 Pattanapipitpaisal y col 2001 Middleton y col 2003
Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004 Zuacutentildeiga 2005 Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
Entre los geacuteneros microbianos que son capaces de reducir Cr(VI) se tienen los
siguientes Achromobacter Aeromonas Agrobacterium Bacillus Desulfovibrio
Escherichia Enterobacter Micrococcus Pseudomonas (Horitsu y col 1987 Wang
2000) Staphylococcus (Saxena y col 2000) Microbacterium (Pattanapipitpaisal y col
2001) Pyrobaculum Streptomyces Deinococcus (Chardin y col 2002)
Desulfomicrobium Desulfotomaculum Pantoea (Cheung y Gu 2003) Shewanella
(Middleton y col 2003) Trichoderma (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
Phanerochaete (Pal 1997) y Candida (Muter y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col
2004)
De los estudios reportados en la literatura acerca de la reduccioacuten microbioloacutegica del
Cr(VI) sobresalen tres hechos 1) Las bacterias han sido los microorganismos maacutes
ampliamente estudiados y es muy escasa la informacioacuten disponible sobre la capacidad de
17
reduccioacuten del metal de las levaduras y de los hongos filamentosos 2) la mayoriacutea de los
microorganismos ensayados soacutelo son capaces de tolerar y reducir muy bajas
concentraciones de Cr(VI) usualmente dentro del intervalo de 0001 a 05 mM esto
uacuteltimo se ha atribuido a los efectos toacutexicos y mutageacutenicos del metal y 3) casi todos los
estudios se han realizado en cultivo por lote
1521 Transporte del cromo al interior de las ceacutelulas
Tanto en organismos procariotes como en muchos eucariotes los oxianiones cromato y
dicromato (fuentes de cromo hexavalente) ingresan principalmente a las ceacutelulas a traveacutes
de las membranas citoplaacutesmicas mediante el sistema de transporte del sulfato (Badar y
col 2000) lo cual se ha atribuido a la similitud en la carga y estructura de estos iones
(Smith y Gadd 2000) Esto fue demostrado primeramente en Salmonella typhimurium y
posteriormente en otras bacterias tales como en Escherichia coli Pseudomonas
fluorescens y Alcaligenes eutrophus Se ha comprobado que esto mismo ocurre en
algunas levaduras tales como en Candida (Muter y col 2001 Cervantes y col 2001)
Sin embargo en general el cromato penetra al interior de las levaduras por medio de un
transportador anioacutenico no especiacutefico (Czakoacute-Veacuter y col 1999 Cervantes y col 2001)
En algunos microorganismos se ha demostrado que el sulfato inhibe competitivamente el
transporte del cromato al interior de las ceacutelulas (Ohtake y col 1987 Pepi y Baldi 1992)
y que esta inhibicioacuten es maacutes marcada en ceacutelulas anaerobias que en aerobias (Zakaria y
col 2006) Tambieacuten se ha reportado el transporte del cromato por la viacutea de los fosfatos
aunque la viacutea del sulfato es la maacutes utilizada (Ohtake y col 1987)
18
El transporte del cromato al interior de las plantas tambieacuten es a traveacutes del sistema del
ioacuten sulfato Ya en el interior de la planta el cromo hexavalente se acumula en diversos
oacuterganos en cantidades diferentes El cromo hexavalente se acumula de 10 a 100 veces
maacutes en las raiacuteces que en los retontildeos o en otros tejidos (Cervantes y col 2001)
En contraste las membranas celulares de los organismos son praacutecticamente
impermeables al cromo trivalente y a sus compuestos (Ksheminska y col 2006)
1522 Mecanismos microbianos de resistencia al Cr(VI) y de reduccioacuten del
Cr(VI)
Una caracteriacutestica importante que deben tener los microorganismos que se van a utilizar
en procesos de tratamiento de efluentes contaminados con cromo hexavalente es que
sean tolerantes (resistentes) a eacuteste Esta propiedad ha sido descrita en bacterias hongos
y levaduras (Horitsu y col 1987 Cervantes y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004)
Entre los mecanismos de resistencia al cromo hexavalente que se han encontrado se
tienen los siguientes
Acumulacioacuten del metal en la superficie o en el interior de las ceacutelulas (Volesky y Vieira
2000 Saxena y col 2000)
Disminucioacuten yo impedimento en el transporte del cromo hexavalente al interior de
las ceacutelulas (Pepi y Baldi 1992)
Excrecioacuten del metal del interior de la ceacutelula al medio circundante (Cervantes y col
2001)
Reacciones de oacutexido-reduccioacuten en las que el cromo hexavalente es reducido a cromo
trivalente el cual es menos toacutexico (Baldi y col 1990 Muter y col 2001)
19
La resistencia al cromo hexavalente puede estar codificada en el genoacuteforo de las
bacterias o en plaacutesmidos Esto uacuteltimo se ha encontrado en Pseudomonas aeruginosa P
fluorescens P putida y en Alcaligenes eutrophus (Baldi y col 1990 Ishibashi y col
1990 Cervantes y col 2001) Sin embargo la tolerancia al metal no implica
necesariamente que los microorganismos seraacuten capaces de removerlo por alguacuten
mecanismo
En el interior de las ceacutelulas bacterianas los iones cromato [CrO42-] pueden ser reducidos
a cromo trivalente por ciertas enzimas (Ishibashi y col 1990 Horitsu y col 1987) En
condiciones de aerobiosis se han identificado las siguientes proteiacutenas que parecen ser las
responsables de la reduccioacuten del Cr(VI) reductasas flavoproteiacutenas enzimas
dependientes de NADH y NAD(P)H (Ishibashi y col 1990) en cambio en condiciones de
anaerobiosis los estudios indican que ciertas hidrogenasas y citocromos son los
responsables (Chardin y col 2003 Cheung y Gu 2007)
El cromo hexavalente tambieacuten puede ser reducido por compuestos quiacutemicos reductores
que son producidos durante el crecimiento de los microorganismos (Desjardin y col
2003) tales como el glutatioacuten y la cisteiacutena los cuales pueden actuar dentro o fuera de
los organismos (Zakaria y col 2006) En organismos superiores se ha identificado al
ascorbato como agente reductor del cromo hexavalente (Ksheminska y col 2006)
Casi no hay informacioacuten sobre el mecanismo responsable de la reduccioacuten del Cr(VI) en
ceacutelulas eucariotas especiacuteficamente en levaduras Con la finalidad de dilucidar dicho
20
mecanismo se han realizado estudios en los que se ha modificado la resistencia de las
levaduras al Cr(VI) o se ha inactivado alguna enzima en particular
En un trabajo llevado a cabo con algunas levaduras no convencionales se encontroacute que
algunas de eacutestas durante su crecimiento excretaron sustancias reductoras asiacute como
sustancias quelantes que formaron complejos con el cromo trivalente que fue generado
durante la transformacioacuten del cromo hexavalente (Ksheminska y col 2006)
1523 Factores que afectan la reduccioacuten bioloacutegica del Cr(VI)
En algunos microorganismos se ha estudiado el efecto que tienen las variables
ambientales tales como condiciones de aerobiosis yo de anaerobiosis donadores y
aceptores finales de electrones concentracioacuten de cromo hexavalente y potencial de
oacutexido-reduccioacuten entre algunas otras sobre la reduccioacuten del metal (Shen y Wang 1995
Shakoori y col 2000 Wang 2000 Smith y col 2002 Wang y Xiao 1995 Fujii y col
1990 Muter y col 2001 Smith y Gadd 2000 Lloyd 2003 Jianlong y col 2004
Viamajala y col 2004)
La reduccioacuten del Cr(VI) puede realizarse en ambiente aerobio yo anaerobio En
organismos aerobios y anaerobios facultativos se ha investigado el efecto del oxiacutegeno
disuelto en el medio sobre la reduccioacuten del metal (Wang 2000) Se ha encontrado que
la sensibilidad del proceso de reduccioacuten del Cr(VI) a la tensioacuten de oxiacutegeno es diferente
para cada microorganismo En cultivos de Enterobacter cloacae HO1 concentraciones
iniciales de oxiacutegeno mayores a 45 ppm inhibieron fuertemente la reduccioacuten del Cr(VI)
(Komori y col 1989) mientras que la reduccioacuten del metal fue maacutes lenta en condiciones
21
de anaerobiosis que en aerobiosis en el caso de Thiobacillus ferrooxidans (QuiIntana y
col 2001)
Asimismo se ha investigado el efecto de algunos iones sobre la reduccioacuten bioloacutegica del
Cr(VI) Con respecto al sulfato [SO42-] existe una analogiacutea estructural y de carga entre
este anioacuten [SO42-] y el ioacuten cromato [CrO4
2-] por lo que puede establecerse una
competencia entre ellos por los transportadores de sulfato existentes en las ceacutelulas
influyendo asiacute en la reduccioacuten del cromo hexavalente (Smith y Gadd 2000)
En cultivos aerobios no se ha reportado inhibicioacuten por sulfato en la reduccioacuten del cromo
hexavalente (Wang y Xiao 1995 Ishibashi y col 1990 Wang 2000) En contraste se
ha informado que en cultivos anaerobios el sulfato afecta la reduccioacuten del Cr(VI) debido
a que este anioacuten compite con el cromato como aceptor final de electrones (Garbisu y
col 1998)
Por otro lado en un estudio realizado con varios geacuteneros de levadura (Pichia Candida
Debaryomyces Saccharomyces Schwanniomyces Cryptococcus Hansenula) que tienen
capacidad para acumular cromo se encontroacute que el sulfato afectoacute la tolerancia de las
levaduras al Cr(VI) siendo mayor o menor el efecto en funcioacuten de la levadura en estudio
(Kaszycki y col 2003)
Otros iones que se han investigado son el Mg2+ Mn2+ Ca2+ y el Fe En cultivos con
ceacutelulas pasivas (resting cells) de Agrobacterium radiobacter se encontroacute que debe
controlarse principalmente la cantidad de fierro para incrementar la capacidad de
reduccioacuten del microorganismo (Llovera y col 1993)
22
Los donadores de electrones que se han utilizado principalmente en los estudios de
reduccioacuten del Cr(VI) son compuestos alifaacuteticos y aromaacuteticos carbohidratos de bajo peso
molecular aminoaacutecidos y aacutecidos orgaacutenicos (Wang y Xiao 1995 Wang 2000 Smith y
col 2002 Ksheminska y col 2006) El descubrimiento de microorganismos que son
capaces de reducir el cromo hexavalente utilizando una amplia variedad de fuentes de
carbono y energiacutea favorece su uso en procesos de remediacioacuten in situ (Smith y col
2002)
Para la reduccioacuten del cromo hexavalente es conveniente conocer el pH y la temperatura
oacuteptimos para el crecimiento de los microorganismos (Wang 2000 Shakoori y col 2000
Camargo y col 2002 Faisal y Hasnain 2004) En cultivos de Streptomyces griseus se
estudioacute la reduccioacuten del Cr(VI) en el intervalo de valores de pH de 4 a 8 y de
temperatura de 28 a 50 degC obtenieacutendose la mayor reduccioacuten a un pH de 6-7 y a una
temperatura de 28 degC (Laxman y More 2002)
En cultivos de Ochrobactrum sp se trabajoacute en el intervalo de temperatura de 30 a 45 degC
y de pH de 6 a 8 obtenieacutendose la mayor reduccioacuten del Cr(VI) y el crecimiento celular
maacutes alto a 35 degC y a un pH de 7 (Thacker y Madamwar 2005) En estudios realizados
con Escherichia coli ATCC 33456 se ensayoacute la reduccioacuten del Cr(VI) en el intervalo de
valores de pH de 3-8 y de temperatura de 40-60 degC encontraacutendose que el pH y la
temperatura de incubacioacuten oacuteptimos fueron de 7 y 37 degC respectivamente (Bae y col
2000)
Se ha observado que la concentracioacuten inicial de Cr(VI) influye en la velocidad de
reduccioacuten del metal (Wang 2000) La velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) exhibida por los
23
cultivos de Bacillus sp Pseudomonas fluorescens LB300 (Wang y Xiao 1995)
Ochrobactrum sp (Thacker y Madamwar 2005) y de Candida sp LBM2 (Juvera-Espinosa
y col 2006) se incrementoacute conforme aumentoacute la concentracioacuten inicial de Cr(VI) En
contraste la velocidad de reduccioacuten de Bacillus sp Arthrobacter sp (Megharaj y col
2003) y de Trichoderma viride (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006) disminuyoacute al
incrementar la concentracioacuten inicial de cromo hexavalente
Para obtener una reduccioacuten importante del Cr(VI) se requieren altas concentraciones de
biomasa (Wang 2000) La concentracioacuten inicial de biomasa tiene efecto sobre la
velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) de Bacillus sp y Pseudomonas fluorescens LB300 ya
que eacutesta aumentoacute al haber mayor cantidad de biomasa inicial (Wang y Xiao 1995) Este
mismo efecto se observoacute en cultivos de una cepa bacteriana gram positiva a la que se le
denominoacute como cepa ATCC 700729 (Shakoori y col 2000)
El potencial redox se ha medido en algunos estudios realizados con diferentes
microorganismos y condiciones de cultivo para determinar su efecto sobre la reduccioacuten
del Cr(VI) (Komori y col 1989 Turick y col 1996 McLean y Beveridge 2001) sin
embargo no se ha reportado un intervalo oacuteptimo de potencial redox para llevar a cabo la
reduccioacuten del Cr(VI) a su forma menos toacutexica (Wang 2000)
En algunos estudios se ha evaluado la influencia de algunos metales (Mn Ni Zn Pb Cu
Co As Se y Hg) sobre la reduccioacuten del Cr(VI) ya que las cepas microbianas que sean
resistentes a uno o varios metales y que sean capaces de reducir el Cr(VI) seriacutean de gran
utilidad en la biorremediacioacuten de efluentes industriales (Faisal y Hasnain 2004 Cheung
y Gu 2005 Thacker y col 2006) En estudios con Escherichia coli ATCC 33456 se
24
investigoacute el efecto de varios iones (Hg2+ Ag2+ Mn2+ Zn2+ Pb2+ Cd2+ Ca2+ y Mg2+) que
pueden estar presentes junto con el Cr(VI) en efluentes industriales Con el magnesio
se observoacute un ligero aumento en la actividad reductora del microorganismo mientras
que con el mercurio se inhibioacute por completo su capacidad de reduccioacuten (Bae y col
2000)
En el caso particular de microorganismos filamentosos los esfuerzos de corte pueden
causar dantildeo fiacutesico a las ceacutelulas y como consecuencia afectar su capacidad de reduccioacuten
de Cr(VI) En cultivos de Trichoderma viride realizados en matraz y en un reactor
agitado mecaacutenicamente con un impulsor se observoacute que los micelios eran de menor
tamantildeo cuando el hongo se cultivaba en el reactor Asimismo el incremento celular y la
eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidos en matraz fueron superiores a los alcanzados
en el reactor agitado con un impulsor Estos resultados sugirieron que las fuerzas de
cizalla creadas por el impulsor fragmentan el micelio y afectan la viabilidad celular y la
capacidad de reduccioacuten del microorganismo (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
16 Sistemas de reaccioacuten
En la mayoriacutea de los estudios sobre reduccioacuten de Cr(VI) el sistema de reaccioacuten que maacutes
se ha empleado es el cultivo por lote Este sistema es ampliamente utilizado en procesos
biotecnoloacutegicos para la produccioacuten de biomasa y de metabolitos de intereacutes industrial La
duracioacuten de este tipo de cultivo depende del tamantildeo del inoacuteculo de las condiciones
ambientales como el pH los componentes del medio de cultivo y la temperatura
Aunque su operacioacuten es sencilla ofrece pocas opciones de control de las variables
intensivas de intereacutes (concentracioacuten de biomasa sustrato producto) en comparacioacuten
con otros sistemas de reaccioacuten
25
(httpfaiunneeduarbiologiamicroindcultivo20y20biorreactoreshtm) Asimismo
despueacutes de un cultivo por lote se requiere de un periodo para la descarga limpieza y
esterilizacioacuten del equipo asiacute como para el arranque de un nuevo cultivo por lote lo que
disminuye la productividad global del proceso (Wang y col 1979)
Pocos son los estudios relacionados con la reduccioacuten del Cr(VI) en los que se ha
trabajado con otros sistemas de reaccioacuten tales como con el cultivo continuo (DeLeo y
Ehrlich 1994 Bhide y col 1996 Chirwa y Wang 1997 Bae y col 2000) y el cultivo
por lote alimentado o fed-batch (Fujii y col 1990 Fujie y col 1996)
El cultivo continuo permite alcanzar un estado estacionario independiente del tiempo en
el que los microorganismos presentan un crecimiento consumo de sustrato y produccioacuten
constantes por lo que es posible obtener una alta productividad o velocidad volumeacutetrica
(httpuserpagesumbcedu gferre1bmcohtml) En este sistema es posible controlar
la cantidad de biomasa utilizando un uacutenico nutriente limitante del crecimiento (Wang y
col 1979)
A pesar de que el cultivo continuo tiene la desventaja de ser susceptible de contaminarse
debido a los periodos prolongados de operacioacuten (Stanbury 1984) en estudios con Cr(VI)
se minimizariacutea lo anterior ya que este estado de oxidacioacuten del cromo es altamente toacutexico
para la mayoriacutea de los microorganismos auacuten a bajas concentraciones
El cultivo por lote alimentado se utiliza industrialmente para la produccioacuten de varios
productos bioloacutegicos de intereacutes (enzimas antibioacuteticos vitaminas aminoaacutecidos entre
otros) El sistema es uacutetil para obtener una alta concentracioacuten de metabolitos asociados
26
al crecimiento ya que es posible alcanzar una alta concentracioacuten de biomasa aunque
tambieacuten se emplea para la produccioacuten de compuestos no asociados al crecimiento como
por ejemplo de algunos antibioacuteticos Su uso tambieacuten se recomienda cuando se trabaja
con compuestos toacutexicos o de muy baja solubilidad y no requiere mayor equipo que el
utilizado en un cultivo por lote (httpuserpagesumbcedu gferre1fedbatchhtml)
Otras ventajas de este sistema son 1) los tiempos totales del proceso fermentativo son
menores y no requiere de un nuevo inoacuteculo cada vez que se repite el ciclo en
comparacioacuten con un cultivo por lote y 2) menor riesgo de contaminacioacuten que el cultivo
continuo (Roukas 1993)
27
2 OBJETIVOS
21 Objetivos generales
1) Determinar el efecto del ioacuten sulfato sobre el crecimiento celular consumo de glucosa y
reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
2) Realizar el estudio cineacutetico del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de
Cr(VI) de Candida sp en sistemas por lote y lote repetido en un reactor airlift
3) Seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten del Cr(VI) por
Candida sp
22 Objetivos especiacuteficos
a) Determinar el efecto de la concentracioacuten de sulfato de amonio sobre el crecimiento
celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
b) Evaluar el crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote y lote repetido
c) Realizar el estudio cineacutetico del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa
d) Evaluar el crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote alimentado repetido
e) Seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes conveniente para la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp
28
3 MATERIAL Y MEacuteTODOS
31 Microorganismo
Para el desarrollo del presente trabajo se utilizoacute una levadura que se aisloacute a partir del
agua residual de una industria curtidora de pieles que se encuentra ubicada en la Ciudad
de Leoacuten Guanajuato Mediante teacutecnicas morfoloacutegicas y bioquiacutemicas que fueron
realizadas en el Laboratorio de Micologiacutea de la Facultad de Medicina de la UNAM asiacute
como por teacutecnicas de biologiacutea molecular que fueron llevadas a cabo en el Laboratorio de
Microbiologiacutea General de la Escuela Nacional de Ciencias Bioloacutegicas se determinoacute que la
levadura pertenece al geacutenero Candida La amplificacioacuten y secuenciacioacuten del dominio
D1D2 del gen 26S rDNA de la levadura aislada reveloacute que estaacute relacionada con Candida
petrohuensis (GenBank accession number U45819) Candida acudensis (GenBank
accession number U45810) y Candida drimydis (GenBank accession number U45815)
con un nivel de confidencia del 896 La baja similitud de las secuencias parciales
conocidas del gen 26S rDNA y la de la cepa de levadura empleada en este trabajo podriacutea
sugerir que es una cepa no identificada no registrada en el GenBank por lo que se le
denominoacute como Candida sp La relacioacuten filogeneacutetica de la cepa de Candida usada en este
estudio y la de otras especies de levadura se muestra en la figura 1
29
Figura 1 Relaciones filogeneacuteticas de la levadura
AJ508572Cmucifera
AB041003Candida
AB041006Cmucifera
AB041005Stephanoascus
U45822Cchiropterorum
U40103Arxula
U40094Arxula
AY283605Sympodiomyces
AF017247Trichomonascus
U40110Blastobotrys
AY442294Sympodiomyces
U40096Sympodiomyces
AY559042Cmokoenaii
FGSFEP
U45819Cpetrohuensis
U45810Cancudensis
U45815Cdrimydis
U45806Cbondarzewiae
U45816Ctepae
U45812Candida
U45812Cantillancae
U45811Csantjacobensis
U76531Stephanoascus
AB196536Stephanoascus
U70245Cedax
AF017236Cbertae
U45835Cvaldiviana
AY618511Cnovakii
U45807Ccastrensis
U45826Cpaludigena
AF294910Cbituminiphila
U45829Pichia
U84241Zygozyma
U76350Myxozyma
U76527Lipomyces
U45804Debaryomyces
U75524Pichia
U68552Saccharomyces
AY545582Naumovia
AY007888Saccharomyces 100 100
43 100
100
100
43 100
100
72
100
86
95
95
100
91
58 69
99
98
84
92
60
63
54
40
56
37
49
21
39
61
16
002
30
32 Propagacioacuten del inoacuteculo
La composicioacuten quiacutemica del medio de cultivo basal que se utilizoacute en este trabajo para la
propagacioacuten del inoacuteculo y para los experimentos de remocioacuten de Cr(VI) en diferentes
sistemas de reaccioacuten los cuales fueron realizados en un reactor neumaacutetico se muestra
en la tabla 5
Tabla 5 Composicioacuten quiacutemica del medio de cultivo
Compuesto Concentracioacuten
(gL)
Glucosa 100
(NH4)2SO4 30
KH2PO4 10
MgSO4 7H2O 03
KCl 01
Extracto de levadura 01
CaCl2 005
FeCl3 0001
Para los experimentos en los que se determinoacute el efecto del sulfato sobre la tolerancia de
Candida sp al Cr(VI) y la reduccioacuten del mismo el inoacuteculo se propagoacute en el mismo medio
de cultivo pero el (NH4)2SO4 se reemplazoacute por NH4Cl (243 gL) y el MgSO47H2O por
MgCl26H2O (0247 gL)
31
El pH inicial de los medios de cultivo fue de aproximadamente 60 A matraces
Erlenmeyer de 1000 mL que conteniacutean 200 mL de medio de cultivo se les adicionoacute una
asada de Candida sp y posteriormente se incuboacute con agitacioacuten constante a 28-30 ordmC
durante 42 h A continuacioacuten la biomasa se separoacute por centrifugacioacuten a 1500 rpm a
4 degC durante 15 min bajo condiciones de asepsia El paquete celular resultante se lavoacute
dos veces con agua destilada esteacuteril para eliminar los componentes del medio de cultivo
y los residuos celulares El paquete celular se resuspendioacute en un pequentildeo volumen de
agua destilada esteacuteril y se homogeneizoacute La suspensioacuten celular resultante se utilizoacute como
inoacuteculo para los experimentos realizados en este trabajo
Para la conservacioacuten de la levadura se usaron viales con medio inclinado de YPG
(glucosa 2 peptona de caseiacutena 1 extracto de levadura 1 y agar bacterioloacutegico
2) los cuales se mantuvieron en refrigeracioacuten a 4 degC Las resiembras se realizaron
cada dos meses
33 Reactores airlift
Se utilizoacute un contactor gas-liacutequido (reactor agitado neumaacuteticamente) del tipo airlift con
tubo conceacutentrico (figuras 2a y 2b) con un volumen total de 52 litros y un posible
volumen de operacioacuten de 42 litros para realizar los estudios de remocioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en sistemas por lote lote repetido lote alimentado y lote alimentado
repetido El reactor estaacute hecho de vidrio Pyrex y consta de una base columna y una
tapa Entre la base y la columna asiacute como entre la columna y la tapa se colocaron
empaques de neopreno para evitar el contacto vidrio-vidrio asiacute como para evitar fugas
de aire yo de medio de cultivo Las secciones se unieron mediante bridas de Nylamid La
32
base del reactor tiene un difusor del tipo placa plana de vidrio poroso para el suministro
de aire
33
Oliva para
toma de muestra
Aire
Tubo conceacutentrico (liso con
perforaciones de
malla)
Filtro de aire
Venteo
Difusor de vidrio poroso(poro fino)
Difusor de vidrio
poroso (poro fino)
Aire
50deg
4
65
3 m
m
77 mm
11
5
mm
128 mm
88 mm
15
mm
70 mm
4
50
3 m
m
Figuras 2a y 2b Reactor del tipo airlift con tubo conceacutentrico
34
En el interior del reactor se colocoacute un tubo conceacutentrico liso (sin perforaciones) de vidrio
Pyrex un tubo conceacutentrico de vidrio Pyrex con perforaciones circulares (4 mm de
diaacutemetro) o un tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable No 316 (grado
alimentario nuacutemero de malla = 20 abertura = 3344 mm) los cuales tienen la misma
longitud y diaacutemetro El tipo de tubo que se utilizoacute para los experimentos de reduccioacuten
del Cr(VI) dependioacute del sistema de reaccioacuten que se ensayoacute el tubo conceacutentrico liso se
utilizoacute para llevar a cabo experimentos en cultivos por lote y lote repetido el tubo
conceacutentrico con perforaciones se empleoacute para realizar cultivos por lote lote alimentado y
lote alimentado repetido y el tubo de malla metaacutelica se usoacute para cultivos por lote
Para el cultivo continuo de una etapa se utilizoacute un reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
con un volumen total de 650 mL y un posible volumen de operacioacuten de 550 mL el cual
tiene las mismas relaciones geomeacutetricas que el reactor antes mencionado
En todos los sistemas de reaccioacuten ensayados se suministroacute aire en el interior del tubo
conceacutentrico El aire de entrada se controloacute mediante una vaacutelvula reguladora de presioacuten y
su velocidad de flujo se midioacute con un rotaacutemetro
34 Meacutetodos experimentales
341 Efecto de la concentracioacuten de sulfato sobre el crecimiento celular
consumo de glucosa remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp
Se evaluoacute el efecto de la concentracioacuten de sulfato sobre el crecimiento celular consumo
de glucosa remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivos por lote a
nivel matraz Para estos experimentos parte o todo del (NH4)2SO4 y del MgSO4 7H2O del
medio de cultivo basal (tabla 5) se reemplazoacute con NH4Cl y MgCl26H2O respectivamente
35
a fin de mantener las mismas concentraciones iniciales de nitroacutegeno (454 mM) y de
magnesio (1217 mM) en todos los medios de cultivo ensayados
Se prepararon tres series de matraces Erlenmeyer de 500 mL que conteniacutean 135 mL de
medio de cultivo con diferentes concentraciones iniciales de sulfato Las
concentraciones de sulfato ensayadas fueron las siguientes 00 1217 25 50 100
150 200 y 2392 mM (esta uacuteltima concentracioacuten corresponde a la del ioacuten sulfato
presente en el medio de cultivo basal) Estas concentraciones no incluyen la cantidad de
sulfato proporcionado por algunos otros componentes del medio de cultivo (provenientes
del extracto de levadura yo de sales inorgaacutenicas) ya que el Laboratorio Central de
Instrumentacioacuten del Departamento de Biofiacutesica de la Escuela Nacional de Ciencias
Bioloacutegicas IPN determinoacute que la concentracioacuten de este ioacuten en el medio de cultivo que
conteniacutea cloruro de amonio y cloruro de magnesio como uacutenicas fuentes de nitroacutegeno
inorgaacutenico y de magnesio respectivamente era de 23 mgL (002 mM) A este uacuteltimo
medio de cultivo es al que se le denominoacute en el presente trabajo como ―0 mM de ioacuten
sulfato Para la cuantificacioacuten del ioacuten sulfato se utilizoacute el meacutetodo recomendado por la
Norma Oficial Mexicana NMX-AA-74-1981 (Secretariacutea de Comercio y Fomento Industrial
1981) El pH inicial de todos los medios de cultivo ensayados fue de aproximadamente
60
A una serie de matraces con medio de cultivo no se le adicionoacute Cr(VI) con la finalidad de
determinar el efecto del sulfato sobre el crecimiento celular y consumo de glucosa por la
levadura en ausencia del metal (cultivos control) A los matraces de la segunda y tercera
serie se les adicionoacute un determinado volumen de una solucioacuten stock esteacuteril de cromato
de potasio (20 gL) para obtener concentraciones iniciales de Cr(VI) de 17 y 33 mM
36
respectivamente Los matraces fueron inoculados con un determinado volumen de
suspensioacuten celular concentrada a fin de que la concentracioacuten inicial de biomasa de todos
los cultivos fuera de aproximadamente 1 mgmL Los matraces se colocaron en un bantildeo
metaboacutelico con agitacioacuten constante a 28-30 degC Se recolectaron muestras a diferentes
tiempos de incubacioacuten a las que se les determinoacute la concentracioacuten de biomasa glucosa
Cr(VI) y cromo total residual asiacute como el pH
342 Controles abioacuteticos
Se utilizaron controles libres de ceacutelulas con el propoacutesito de determinar si el Cr(VI) era
reducido abioacuteticamente a Cr(III) por los componentes del medio de cultivo
Durante los experimentos de remocioacuten de Cr(VI) con ceacutelulas viables (cultivos problema)
se observoacute que el pH de los medios de cultivo disminuyoacute desde aproximadamente 6
hasta 25-42 dependiendo de la concentracioacuten de sulfato y de cromo utilizada Como
se sabe que los pHrsquos bajos favorecen que la materia orgaacutenica (donadores de electrones)
reduzca el Cr(VI) a Cr(III) en este trabajo se llevaron a cabo experimentos sin biomasa
de Candida sp (controles libres de ceacutelulas) a distintos valores de pH (25 3 4 5 y 6) y
a las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas (17 y 33 mM) para determinar
el grado de reduccioacuten causado por los constituyentes del medio de cultivo
Como controles libres de ceacutelulas se utilizaron matraces Erlenmeyer que conteniacutean medio
de cultivo a los que se les adicionoacute un volumen determinado de una solucioacuten stock
esteacuteril de cromato de potasio (20 gL) para obtener concentraciones iniciales de Cr(VI)
de 17 y 33 mM A continuacioacuten se ajustoacute el pH del medio de cultivo a alguno de los
37
valores antes mencionados La adicioacuten de la solucioacuten stock esteacuteril de cromato de potasio
y el ajuste del pH se realizoacute en condiciones de asepsia
Los controles abioacuteticos se incubaron a las mismas condiciones que los matraces
problema Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se les
determinoacute la concentracioacuten de Cr(VI)
343 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa
remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivo por lote en un
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Se realizoacute la evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa remocioacuten
de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso (sin perforaciones) El cultivo por lote se llevoacute a cabo con 4 litros de
medio de cultivo basal con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM [igual a 78
mgL de Cr(VI)] y con un pH inicial de aproximadamente 60 El reactor se inoculoacute con
un volumen determinado de suspensioacuten celular concentrada para obtener una
concentracioacuten inicial de biomasa cercana a 12 mgmL Se suministroacute aire con un flujo
volumeacutetrico de 4 litrosmin equivalente a 1 vvm (vvm = volumen de aire por volumen
de medio de cultivo por minuto)
El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que el nivel de Cr(VI) residual fue
despreciable Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se
les determinoacute la concentracioacuten de biomasa de glucosa Cr(VI) y cromo total residual asiacute
como el pH
38
344 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote repetido en un reactor
airlift con tubo conceacutentrico liso
Los sistemas por lote repetido se iniciaron con un cultivo por lote Cuando se alcanzaron
niveles bajos de Cr(VI) residual en el primer cultivo por lote se procedioacute a recolectar un
determinado volumen de medio y se reemplazoacute con medio fresco que teniacutea una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM A continuacioacuten el sistema se operoacute nuevamente por
lote (segundo cultivo por lote o cultivo por lote repetido) hasta que ya no se detectaron
variaciones considerables en la concentracioacuten de Cr(VI) residual
Se ensayaron tres diferentes relaciones de recambio de medio de cultivo (f = volumen de
medio recolectadovolumen inicial de medio liacutequido en el reactor) las cuales fueron de
04 06 y 08 Para las dos uacuteltimas relaciones se realizaron experimentos sin ajustar el
pH del medio al inicio del segundo cultivo por lote (lote repetido) asiacute como ajustando el
pH a 60 Para la primera relacioacuten (f = 04) soacutelo se realizoacute el experimento sin ajustar el
pH del medio al inicio del cultivo por lote repetido ya que los experimentos realizados a
las relaciones de recambio de 06 y 08 mostraron que la eficiencia y velocidad de
reduccioacuten de Cr(VI) de los cultivos por lote repetido eran mayores cuando no se ajustaba
el pH
Durante los cultivos por lote repetido se recolectaron muestras a diferentes tiempos de
incubacioacuten a las cuales se les determinoacute la concentracioacuten de biomasa glucosa Cr(VI) y
el pH Con los datos obtenidos se estimaron algunas variables cineacuteticas que se utilizaron
para seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para los fines que se persiguen en
este trabajo
39
345 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa en un
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Para el cultivo continuo de una etapa se utilizoacute un biorreactor airlift con tubo conceacutentrico
liso con un volumen de operacioacuten de 500 mL Al reactor se le suministroacute continuamente
medio de cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM por medio de una
bomba peristaacuteltica Se ensayaron dos flujos volumeacutetricos de medio de cultivo de 378 y
50 mLh que corresponden a velocidades de dilucioacuten de 00076 h-1 y de 00100 h-1
respectivamente
Con los datos obtenidos a la velocidad de dilucioacuten de 00076 h-1 se estimoacute la velocidad
volumeacutetrica global y la eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) las cuales se utilizaron
para seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp
346 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular y la remocioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo conceacutentrico de
malla de acero inoxidable y de vidrio perforado
Se realizaron cultivos por lote en el reactor airlift en el cual se colocoacute un tubo conceacutentrico
de malla de acero inoxidable No 316 (grado alimentario calibre No 20 abertura =
3344 mm) o un tubo conceacutentrico de vidrio con perforaciones circulares de
aproximadamente 4 mm de diaacutemetro Al reactor se le adicionaron 4 litros de medio de
cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM [igual a 78 mgL de Cr(VI)] y
un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada para obtener una
40
concentracioacuten inicial de biomasa de aproximadamente 12 mgmL El pH inicial del medio
fue de aproximadamente 60 Se ensayaron dos flujos de aire de 05 y 1 vvm
El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que el nivel de Cr(VI) residual fue bajo Se
recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se les determinoacute la
concentracioacuten de biomasa y de Cr(VI) residual Con los datos obtenidos se estimaron
algunas variables cineacuteticas que sirvieron como criterio de seleccioacuten para determinar el
tubo conceacutentrico maacutes adecuado para llevar a cabo los cultivos por lote alimentado y lote
alimentado repetido
347 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote
alimentado repetido en un reactor airlift
Para los cultivos por lote alimentado y lote alimentado repetido se utilizoacute el reactor airlift
con el tubo conceacutentrico seleccionado previamente Los cultivos por lote alimentado se
iniciaron con un cultivo por lote utilizando las condiciones iniciales mencionadas en el
inciso 446 y una aireacioacuten de 05 vvm El cultivo por lote se mantuvo en operacioacuten
hasta que la concentracioacuten de Cr(VI) residual fue baja
A continuacioacuten el reactor se drenoacute hasta alcanzar un volumen de liacutequido en el reactor de
25 litros y se inicioacute el suministro continuo de medio de alimentacioacuten con una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM La alimentacioacuten se mantuvo hasta que se alcanzoacute un
volumen de medio liacutequido en el reactor de 37 litros (primer cultivo por lote alimentado)
41
Posteriormente el reactor se volvioacute a drenar hasta obtener un volumen de medio de 25
litros y enseguida se volvioacute a suministrar continuamente medio de cultivo basal con una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM utilizando el mismo flujo de alimentacioacuten que para el
primer cultivo por lote alimentado El suministro de medio se mantuvo hasta alcanzar un
volumen de liacutequido en el reactor de 375-40 litros (segundo cultivo por lote alimentado o
cultivo por lote alimentado repetido)
Se ensayaron dos flujos de alimentacioacuten de 659 y 1343 mLh que representan cargas
maacutesicas de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh
Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las cuales se les
determinoacute la concentracioacuten de biomasa de glucosa y Cr(VI) residual asiacute como el pH
Con los datos obtenidos se estimaron las velocidades volumeacutetricas globales y las
eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI)
35 Meacutetodos analiacuteticos
351 Determinacioacuten de la concentracioacuten de biomasa
La concentracioacuten celular se determinoacute mediante el peso seco de la masa celular Las
muestras recolectadas se filtraron a traveacutes de membranas de fibra de vidrio (Whatman
GFA) con un diaacutemetro de poro de 16 m las cuales se colocaron previamente puestas a
peso constante Posteriormente las membranas se colocaron en una estufa a 95 degC
hasta alcanzar un peso constante Los filtrados se utilizaron para determinar la
concentracioacuten de glucosa Cr(VI) y cromo total residual asiacute como el pH
352 Determinacioacuten de la concentracioacuten de glucosa
42
Se determinoacute mediante un meacutetodo enzimaacutetico empleando a la glucosa oxidasa y
peroxidasa (Worthington Biochemical Corporation 1972)
Principio El meacutetodo se basa en que la glucosa es oxidada a aacutecido glucoacutenico por la
glucosa oxidasa la cual cataliza la siguiente reaccioacuten
-D-glucosa + H2O + O2 Aacutecido D-glucoacutenico + H2O2
El peroacutexido de hidroacutegeno generado reacciona con el sistema peroxidasa - orto-
dianisidina dando como resultado la oxidacioacuten de la orto-dianisidina y la produccioacuten de
agua de acuerdo con la siguiente reaccioacuten
H2O2 + orto-dianisidina (reducida) ortondashdianisidina (oxidada) + H2O
peroxidasa
La orto-dianisidina oxidada presenta un color pardo que en medio aacutecido vira a color
rosa la cual se lee a una longitud de onda de 540 nm (figura 3)
Figura 3 Orto-dianisidina (33rsquo ndash dimetoxidibencidina)
H2N NH2
OCH3
OCH3
43
353 Determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo hexavalente
La concentracioacuten de cromo hexavalente se determinoacute por la teacutecnica de la 15-
difenilcarbohidrazida siguiendo los procedimientos descritos en el meacutetodo 8023 del Hach
Water Analysis Handbook (2002) Este meacutetodo estaacute aprobado por la EPA (Environmental
Protection Agency) (Hach 2002) y por la Norma Oficial Mexicana NMX-AA-044-SCFI-
2001 (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NMX-AA-044-SCFI-
2001)
Principio Se utilizoacute un reactivo en polvo llamado ChromaVer3 el cual contiene una
solucioacuten buffer aacutecida combinada con la 15-difenilcarbohidrazida Este uacuteltimo compuesto
reacciona con el cromo hexavalente dando un compuesto de color puacuterpura (figura 4) El
meacutetodo es aplicable para el agua ya sea fresca o de muestras de agua residual La
intensidad del color es ldirectamente proporcional a la concentracioacuten de cromo
hexavalente presente
Figura 4 Reaccioacuten de la 15-difenilcarbohidrazida con el cromo hexavalente
+ Cr 6+
Compuesto colorido
puacuterpura
N N
Cr O
C R
O
N N
H H
C R
15-difenilcarbohidrazida
2 N N N
H H
N C
H O
H
44
354 Determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo total
La determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo total de los filtrados de las muestras
recolectadas (cromo total en solucioacuten) se realizoacute por espectroscopiacutea de absorcioacuten
atoacutemica con flama de acetileno-aire (SpectrAA220 FS Varian Inc)
Para determinar la cantidad de cromo retenido por la biomasa de Candida sp las ceacutelulas
fueron lavadas con agua desionizada deshidratadas y posteriormente fueron digeridas
con aacutecido niacutetrico concentrado La solucioacuten obtenida se enfrioacute a temperatura ambiente y
se le adicionoacute agua desionizada hasta obtener un volumen final de 50 mL Este
procedimiento estaacute descrito en la Norma Oficial Mexicana NMX-AA-051-SCFI-2001
(Secretariacutea de Economiacutea 2001) La concentracioacuten de cromo total de la solucioacuten
resultante se determinoacute en un espectrofotoacutemetro de absorcioacuten atoacutemica con un horno de
grafito (SpectrAA220 FS Varian Inc)
355 Determinacioacuten del pH
Se realizoacute con un potencioacutemetro marca Oakton
45
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Meta No 1 Determinar el efecto del ioacuten sulfato sobre la reduccioacuten
de Cr(VI)
41 Efecto del sulfato sobre el crecimiento celular consumo de glucosa
remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp
411 Evaluacioacuten de la influencia del sulfato sobre el crecimiento celular de
Candida sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
Se determinoacute el efecto de ocho concentraciones diferentes de sulfato (00 1217 25
50 100 150 200 y 2392 mM) sobre el crecimiento celular de Candida sp cuando
eacutesta se cultivoacute por lote a nivel matraz en medios de cultivo sin Cr(VI) y con
concentraciones iniciales del metal de 17 y 33 mM Para visualizar mejor el efecto las
curvas de crecimiento celular se construyeron utilizando la relacioacuten xxo (x =
concentracioacuten celular a un determinado tiempo de incubacioacuten xo = concentracioacuten inicial
de biomasa) como variable dependiente y el tiempo de incubacioacuten (t) como variable
independiente (graacuteficas de xxo vs t) En cada una de las curvas de crecimiento se trazoacute
una liacutenea horizontal a una relacioacuten xxo de 10 para observar si ocurriacutea crecimiento o
lisis celular
En la figura 5 se muestran las curvas de crecimiento celular de Candida sp cuando eacutesta
se cultivoacute en medios de cultivo con diferentes concentraciones de sulfato y sin Cr(VI) Se
observa que el crecimiento de Candida sp fue muy semejante a las diferentes
concentraciones de sulfato ensayadas La levadura fue capaz de crecer en el medio de
cultivo al que no se le adicionoacute sulfato de amonio y sulfato de magnesio (0 mM de
46
SO42-) lo cual sugiere que la cantidad de sulfato proporcionado por otros componentes
del medio de cultivo ndash por ejemplo provenientes del extracto de levadura yo de
impurezas contenidas en las sales inorgaacutenicas adicionadas al medio de cultivo (002
mM) mdash fue suficiente para permitir un adecuado crecimiento de la levadura Los
resultados tambieacuten mostraron que la adicioacuten de sulfato en forma de sales inorgaacutenicas
[(NH4)2SO4 o Mg(SO4)7H20] no tuvo alguacuten efecto inhibidor o estimulador del crecimiento
celular
Figura 5 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo sin Cr(VI)
En la figura 6 se presentan las curvas de crecimiento de Candida sp que se obtuvieron
cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo con una concentracioacuten inicial de
Cr(VI) de 17 mM a las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas En la figura se
aprecia lo siguiente 1) A una concentracioacuten de sulfato de 0 mM ocurrioacute lisis celular 2)
el crecimiento neto de la levadura fue praacutecticamente nulo a una concentracioacuten de sulfato
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
47
de 1217 mM 3) el crecimiento de la levadura fue evidente a partir de una
concentracioacuten de sulfato de 25 mM y 4) en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de
10 a 2392 mM el crecimiento de la levadura fue muy semejante y superior al alcanzado
a una concentracioacuten de sulfato de 5 mM Asimismo cuando se utilizaron concentraciones
de sulfato de 10 a 2392 mM se alcanzaron niveles de concentracioacuten de biomasa
similares a los obtenidos en ausencia del metal (cultivos control) (figuras 5 y 6) De
estos resultados es evidente que a medida que se incrementoacute la concentracioacuten de
sulfato los efectos toacutexicos del Cr(VI) sobre el crecimiento de la levadura disminuyeron
hasta que eacutestos fueron praacutecticamente nulos es decir la tolerancia de la levadura al
Cr(VI) aumentoacute conforme se incrementoacute la concentracioacuten de sulfato en el medio de
crecimiento de Candida sp
Figura 6 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo con 17 mM de Cr(VI)
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
48
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM ocurrioacute lisis celular
cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo con concentraciones de sulfato en el
intervalo de 0 a 5 mM (figura 7) en contraste el crecimiento celular de la levadura se
incrementoacute a medida que la concentracioacuten de sulfato aumentoacute de 10 a 2392 mM En
este uacuteltimo intervalo de concentracioacuten de sulfato se observoacute que a tiempos de
incubacioacuten superiores a las 150 h se presentoacute lisis celular A ninguna de las
concentraciones de sulfato ensayadas se alcanzaron densidades celulares semejantes a
las obtenidas en los cultivos sin Cr(VI) o con 17 mM de Cr(VI) lo cual podriacutea deberse a
la mayor toxicidad de los medios de cultivo
Figura 7 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo con 33 mM de Cr(VI)
En la figura 8 se muestra la variacioacuten de la velocidad especiacutefica de crecimiento ( ) y de
lisis celular (kd) de Candida sp en funcioacuten de la concentracioacuten de SO42- a las diferentes
concentraciones de Cr(VI) ensayadas [0 17 y 33 mM]
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
49
Figura 8 Variacioacuten de la velocidad especiacutefica de crecimiento o de lisis celular en funcioacuten
de la concentracioacuten de SO42- a las diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI)
ensayadas
-0002
0
0002
0004
0006
0008
001
0012
0014
0016
0018
0 5 10 15 20 25 30
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Ve
loc
ida
d e
sp
ec
iacutefic
a [
h-1
]
0 mM
17 mM
33 mM
Promedio
Sin Cr(VI)
50
Cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo sin Cr(VI) su velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento se mantuvo praacutecticamente constante en todo el intervalo de
concentracioacuten de sulfato ensayado con un valor promedio de 00144 h-1
A la concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la velocidad especiacutefica de crecimiento de
Candida sp aumentoacute casi linealmente con respecto a la concentracioacuten de sulfato en el
intervalo de concentracioacuten de 0 a 10 mM (r2 = 096) alcanzando un valor maacuteximo de
00142 h-1 a la uacuteltima concentracioacuten de sulfato Esta velocidad especiacutefica de crecimiento
es muy similar a las obtenidas en los cultivos sin Cr(VI) A concentraciones de sulfato
superiores a 5 mM la velocidad especiacutefica de crecimiento se mantuvo praacutecticamente
constante Estos resultados concuerdan con los perfiles de crecimiento celular mostrados
anteriormente
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM se obtuvieron
velocidades especiacuteficas de lisis celular (kd) de 00013 a 00003 h-1 ( = -00013 - 00003
h-1) en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de 0 a 5 mM (figura 8) A
concentraciones de sulfato superiores a 5 mM la velocidad neta de crecimiento fue
positiva La velocidad especiacutefica aumentoacute linealmente en todo el intervalo de
concentracioacuten de sulfato ensayado (r2 = 099) aunque las velocidades alcanzadas fueron
notoriamente inferiores a las obtenidas en los medios de cultivo sin Cr(VI) y con una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM
De los resultados anteriores se deduce que el sulfato desempentildea un papel importante en
la tolerancia (resistencia) de Candida sp a los efectos toacutexicos del Cr(VI) A medida que
se incrementoacute la concentracioacuten de sulfato la levadura fue maacutes tolerante (resistente) a
51
los efectos dantildeinos del Cr(VI) y por consiguiente su crecimiento celular fue menos
afectado Asimismo los resultados muestran que el ―efecto protector del sulfato sobre el
crecimiento de Candida sp dependioacute de la concentracioacuten inicial de Cr(VI)
Pepi y Baldi (1992) investigaron el efecto de diferentes aminoaacutecidos azufrados y del
sulfato sobre la tolerancia de algunas levaduras al Cr(VI) Estos investigadores
encontraron que en presencia de 02 mM de Cr(VI) se requirieron pequentildeas cantidades
de cisteiacutena [001ndash01 mM] para estimular significativamente [10-100] el crecimiento
de Rhodosporidium sp y que para incrementar el crecimiento de Candida sp en hasta
80 fue necesaria una concentracioacuten de cisteiacutena de 01 mM Un comportamiento similar
se observoacute en estas dos cepas cuando se adicionoacute metionina En contraste el
crecimiento celular de Candida famata fue inhibido cuando la levadura se cultivoacute en
medios con concentraciones de cisteiacutena superiores a 005 mM y con 02 mM de Cr(VI)
Por otra parte cuando Candida sp se cultivoacute en medios con diferentes concentraciones
de sulfato (4ndash160 mM) y de Cr(VI) (004ndash02 mM) se encontroacute que el ioacuten sulfato
incrementoacute la tolerancia de la levadura al Cr(VI) El mecanismo general de resistencia al
cromato en Candida sp se atribuyoacute a una reducida captacioacuten (incorporacioacuten) de cromo
(Pepi y Baldi 1992)
Ohtake y col (1987) encontraron que la adicioacuten de altas concentraciones de sulfato
incrementoacute el crecimiento celular de dos cepas de Pseudomonas fluorescens (LB300 y
LB303) en presencia de CrO42- Ademaacutes encontraron que el nivel de resistencia al CrO4
2-
en P fluorescens dependioacute de la fuente de azufre en el medio de cultivo ya que las
ceacutelulas bacterianas que crecieron con cisteiacutena fueron mucho maacutes resistentes al CrO42-
que las ceacutelulas que crecieron sobre sulfato Como el cromato es transportado al interior
52
de las ceacutelulas de Pseudomonas a traveacutes del sistema de transporte del sulfato la habilidad
del sulfato para proteger a las ceacutelulas de P fluorescens LB300 de los efectos inhibitorios
del Cr(VI) se atribuyoacute a que el sulfato inhibioacute competitivamente la captacioacuten del cromato
por las ceacutelulas bacterianas (Ohtake y col 1987)
En contraste la resistencia de Ochrobactrum tritici cepa 5bvI1 al Cr(VI) fue
independiente de la concentracioacuten de sulfato (Branco y col 2004)
412 Evaluacioacuten del efecto del sulfato sobre el consumo de glucosa por Candida
sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
La glucosa fue completamente consumida (eficiencia global de consumo de glucosa =
100) en aproximadamente 83 h de incubacioacuten cuando la levadura se cultivoacute en medios
que no conteniacutean Cr(VI) y con diferentes concentraciones de sulfato No se observoacute
diferencia considerable en el consumo de glucosa a ninguna de las concentraciones de
sulfato utilizadas (figura 9)
53
Figura 9 Variacioacuten en el consumo de glucosa por Candida sp cuando se utilizaron
medios de cultivo con diferentes concentraciones de sulfato y sin Cr(VI)
En los experimentos realizados con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM
(figura 10) se observoacute que la levadura fue capaz de consumir aproximadamente 30-
35 de la glucosa inicialmente adicionada a los medios que conteniacutean sulfato a
concentraciones de 0 y 1217 mM a pesar de que a estas condiciones de cultivo ocurrioacute
lisis celular [0 mM de SO42-] o el crecimiento celular de la levadura fue despreciable
[1217 mM de SO42-] (figura 6) Candida sp consumioacute todo el monosacaacuterido presente
en los medios de cultivo con concentraciones de sulfato superiores a 1217 mM
(eficiencia global de consumo de glucosa del 100) sin embargo el tiempo que se
requirioacute para que eacutesto sucediera disminuyoacute a medida que se incrementoacute la concentracioacuten
de sulfato (figura 10) Los perfiles de consumo de glucosa en los cultivos de Candida
sp fueron semejantes cuando se utilizaron concentraciones de sulfato de 10 a 2392
mM y eacutestos a su vez fueron similares a los obtenidos en los medios de cultivo que no
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa
re
sid
ua
l [
]0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
54
conteniacutean Cr(VI) (figuras 9 y 10) Lo anterior podriacutea deberse a que el crecimiento
celular de estos cultivos fue semejante (figura 6)
Figura 10 Variacioacuten del porcentaje de glucosa residual en los cultivos de Candida sp a
las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas y con 17 mM de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
55
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM los niveles de glucosa
residual disminuyeron a medida que aumentoacute la concentracioacuten de sulfato (figura 11)
Sin embargo estos niveles fueron superiores a los alcanzados a 17 mM de Cr(VI) a
todas las concentraciones de sulfato ensayadas La mayor eficiencia de consumo de
glucosa fue de aproximadamente 80 y se obtuvo a una concentracioacuten de sulfato de
2392 mM
Figura 11 Variacioacuten del porcentaje de glucosa residual en los cultivos por lote de
Candida sp a las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas y con 33 mM de
Cr(VI)
A las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas [17 y 33 mM] se observoacute que
en las primeras horas de incubacioacuten los cultivos de levadura en los que ocurrioacute lisis
celular consumieron una determinada cantidad de glucosa la cual probablemente se
utilizoacute para el mantenimiento de las ceacutelulas vivas
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa r
es
idu
al [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
56
Tanto en los experimentos realizados a 17 como a 33 mM de Cr(VI) se encontroacute que
los cultivos que alcanzaron mayores densidades celulares fueron los que consumieron
mayor cantidad de glucosa y esto ocurrioacute cuando se utilizaron concentraciones altas de
sulfato
413 Evaluacioacuten del efecto del sulfato sobre la variacioacuten del pH de los cultivos
de Candida sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
Los perfiles de variacioacuten del pH de los medios de cultivo fueron muy semejantes a las
diferentes concentraciones de sulfato ensayadas cuando la levadura se cultivoacute en los
medios de cultivo sin Cr(VI) (figura 12) A todas las concentraciones de sulfato
utilizadas el pH disminuyoacute desde aproximadamente 6 hasta 28 en las primeras once
horas de incubacioacuten En el periodo comprendido entre las 11 y las 60 h de incubacioacuten el
pH de los medios de cultivo disminuyoacute ligeramente hasta alcanzar valores cercanos a
25 A tiempos posteriores a 60 h el pH de los medios de cultivo se mantuvo
praacutecticamente constante
Figura 12 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo de Candida sp en ausencia de
Cr(VI) y a las diferentes concentraciones de SO42- ensayadas
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
57
En la figura 13 se muestran los perfiles de variacioacuten del pH de los medios de cultivo
cuando la levadura se cultivoacute a las diferentes concentraciones de sulfato y a una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM El pH de los cultivos disminuyoacute raacutepidamente
en las primeras 15 h de incubacioacuten a todas las concentraciones de sulfato ensayadas La
disminucioacuten del pH fue mayor en los cultivos con las concentraciones maacutes altas de
sulfato lo cual podriacutea deberse a que a estas condiciones la levadura consumioacute mayor
cantidad de glucosa y las densidades celulares alcanzadas fueron maacutes altas A tiempos
de incubacioacuten superiores a 15 h el pH continuoacute disminuyendo pero a menor velocidad
Los niveles de pH maacutes bajos se obtuvieron cuando se utilizaron concentraciones de
sulfato de 5 a 2392 mM alcanzaacutendose valores semejantes a los obtenidos en los medios
sin Cr(VI) (de aproximadamente 25)
Figura 13 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
58
Un comportamiento cualitativo similar se obtuvo cuando Candida sp se cultivoacute en medios
con diferentes concentraciones de sulfato y con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33
mM (figura 14) El pH maacutes bajo se alcanzoacute a concentraciones altas de sulfato [20 y
2392 mM] y fue de aproximadamente 36 el cual es superior a los valores maacutes bajos
que se obtuvieron en los cultivos sin Cr(VI) y con 17 mM de Cr(VI) Esto uacuteltimo podriacutea
deberse a que el incremento de la concentracioacuten celular y el consumo de glucosa fueron
inferiores a los alcanzados con las otras concentraciones de Cr(VI) [0 y 17 mM]
Figura 14 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
414 Efecto del sulfato sobre la remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp
En la figura 15 se muestran las variaciones del porcentaje de Cr(VI) residual de los
cultivos de Candida sp cuando se emplearon diferentes concentraciones de sulfato y
una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM A una concentracioacuten de sulfato de 0 mM
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
59
la remocioacuten de Cr(VI) fue muy baja (de aproximadamente 83) es conveniente
mencionar que a esta concentracioacuten de sulfato (0 mM) y de Cr(VI) (17 mM) ocurrioacute lisis
celular y la levadura consumioacute una pequentildea cantidad de glucosa en las primeras horas
de incubacioacuten La remocioacuten de Cr(VI) se incrementoacute a medida que aumentoacute la
concentracioacuten de sulfato de 0 a 10 mM A partir de esta uacuteltima concentracioacuten de sulfato
los perfiles de remocioacuten de Cr(VI) fueron muy similares y esto podriacutea deberse a que la
densidad celular de los cultivos fueron praacutecticamente iguales Todo o casi todo el Cr(VI)
inicialmente adicionado a los medios de cultivo fue removido cuando se empleoacute una
concentracioacuten de sulfato igual o superior a 25 mM (figura 15)
Figura 15 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
En contraste cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM la levadura
no fue capaz de remover todo el Cr(VI) inicialmente presente en los medios de cultivo a
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
60
ninguna de las concentraciones de sulfato ensayadas (figura 16) Sin embargo los
niveles de Cr(VI) residual disminuyeron a medida que se incrementoacute la concentracioacuten de
sulfato
Figura 16 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
A las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas los cultivos de levadura en los
que ocurrioacute lisis celular en las primeras horas de incubacioacuten [0 mm de SO42- 17 mM de
Cr(VI) y 0-5 mM de SO42- 33 mM de Cr(VI)] fueron capaces de remover una pequentildea
cantidad de Cr(VI) Estos resultados concuerdan con lo reportado por Wang y Shen
(1997) quienes encontraron que la densidad celular de los cultivos de Escherichia coli y
Bacillus sp disminuyoacute continuamente durante el curso de la remocioacuten de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
61
A las diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI) y de sulfato ensayadas se observoacute
que aunque los niveles de Cr(VI) residual disminuyeron a medida que la incubacioacuten
progresoacute las concentraciones de cromo total en solucioacuten permanecieron casi constantes
a lo largo de todo el periodo de incubacioacuten (aproximadamente el 97 del cromo
inicialmente adicionado a los medios de cultivo estuvo siempre presente en solucioacuten)
Maacutes auacuten el anaacutelisis del contenido de cromo en la biomasa de Candida sp (de muestras
recolectadas al final de los experimentos) reveloacute que uacutenicamente el 29 009 del
cromo total removido por los cultivos fue incorporado en la biomasa
Como se mostroacute anteriormente los cultivos con ceacutelulas viables se iniciaron con un pH de
aproximadamente 60 y eacuteste disminuyoacute durante el tiempo de incubacioacuten hasta valores de
25 ndash 36 dependiendo de la concentracioacuten de sulfato y de Cr(VI) utilizada Como se
sabe que los pHacutes bajos favorecen la reduccioacuten del Cr(VI) por la materia orgaacutenica
(donadores de electrones) en el presente trabajo se llevaron a cabo experimentos sin
biomasa de Candida sp (controles libres de ceacutelulas) a diferentes valores de pH (25 3
4 5 y 6) y a las dos diferentes concentraciones de Cr(VI) ensayadas (17 y 33 mM)
para determinar si los componentes presentes en los medios de cultivo pueden reducir el
Cr(VI) En las figuras 17 y 18 se muestran los perfiles de Cr(VI) residual que se
obtuvieron con los controles abioacuteticos ensayados
62
Figura 17 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los controles libres de
ceacutelulas llevados a cabo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y a diferentes
valores de pH
Figura 18 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los controles libres de
ceacutelulas realizados con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y a diferentes
valores de pH
00
200
400
600
800
1000
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
pH = 25
pH = 3
pH = 4
pH = 5
pH = 6
00
200
400
600
800
1000
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
pH = 25
pH = 3
pH = 4
pH = 5
pH = 6
63
A las dos concentraciones de Cr(VI) ensayadas se observoacute una reduccioacuten despreciable
del metal (inferior a 05) en el intervalo de valores de pH de 4 a 6 a un pH de 3 el
porcentaje de reduccioacuten fue de aproximadamente 12 y de 3 cuando el pH fue de
25 Estos resultados sugieren que los componentes de los medios de cultivo
praacutecticamente no redujeron el Cr(VI) a ninguno de los pHrsquos ensayados
En conjunto los resultados antes mostrados indican que el principal mecanismo de
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp fue la biotransformacioacuten (reduccioacuten) del Cr(VI) a
Cr(III) y que la reduccioacuten abioacutetica del Cr(VI) y la captacioacuten de cromo por la biomasa de
la levadura fueron despreciables Asimismo los resultados tambieacuten muestran que la
reduccioacuten del Cr(VI) por los cultivos se debioacute a la actividad metaboacutelica de las ceacutelulas de
Candida sp
En la figura 19 se presentan las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) que se
obtuvieron a las diferentes concentraciones iniciales de sulfato y de Cr(VI) ensayadas Se
aprecia que cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la eficiencia
de reduccioacuten se incrementoacute desde 179 hasta 986 a medida que la concentracioacuten
de sulfato aumentoacute de 0 a 25 mM a concentraciones de sulfato superiores la eficiencia
de reduccioacuten fue del 100 Asimismo en los experimentos realizados a 33 mM de
Cr(VI) la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) aumentoacute desde 83 hasta 84 conforme la
concentracioacuten de sulfato aumentoacute de 0 a 2392 mM
64
Figura 19 Eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por los cultivos de
Candida sp a las diferentes concentraciones de sulfato y de Cr(VI) ensayadas
La velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) tambieacuten fue afectada por la
concentracioacuten de sulfato y de Cr(VI) utilizada (figura 20) Cuando se empleoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten maacutes alta
fue de 098 mg de Cr(VI)Lh y se obtuvo en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de
10 a 2392 mM En cambio la velocidad maacutes alta que se alcanzoacute a 33 mM de Cr(VI) fue
de 044 mg de Cr(VI)Lh y se obtuvo a la maacutexima concentracioacuten de sulfato ensayada
(2392 mM)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 1217 25 5 10 15 20 2392
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Efi
cie
ncia
glo
bal d
e r
ed
uccioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
17 mM
33 mM
65
Figura 20 Velocidades volumeacutetricas globales de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas en los
cultivos de Candida sp a diferentes concentraciones de sulfato y de Cr(VI)
A todas las concentraciones de sulfato ensayadas la eficiencia y velocidad volumeacutetrica de
reduccioacuten de Cr(VI) alcanzadas a una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM fueron
superiores a las obtenidas a 33 mM de Cr(VI) y esto podriacutea deberse a que los efectos
toacutexicos del Cr(VI) sobre la levadura se incrementan a medida que aumenta la
concentracioacuten del metal
De los resultados anteriores es evidente que el sulfato afectoacute la reduccioacuten aeroacutebica de
Cr(VI) por Candida sp Estos resultados difieren con lo reportado por otros
investigadores quienes no han encontrado un efecto inhibidor ni estimulador del sulfato
sobre la reduccioacuten de Cr(VI) en cultivos aeroacutebicos
000
010
020
030
040
050
060
070
080
090
100
0 1217 25 5 10 15 20 2392
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica d
e r
ed
uccioacute
n d
e C
r(V
I)
[mg
de
Cr(
VI)
Lh
]
17 mM
33 mM
66
Ishibashi y col (1990) encontraron que concentraciones de sulfato de hasta 1 mM
incrementaron la resistencia de Pseudomonas putida al cromato pero no tuvieron efecto
sobre la reduccioacuten de eacuteste En cultivos de Bacillus sp (Wang y Xiao 1995) y de
Acinetobacter haemolyticus (Zakaria y col 2006) se observoacute que una concentracioacuten de
sulfato de 10 mM no afectoacute la reduccioacuten de Cr(VI) Liu y col (2006) reportaron que
concentraciones de sulfato de 40 y 80 mgL (0416 y 083 mM) no tuvieron efecto sobre
la reduccioacuten aeroacutebica de Cr(VI) por Bacillus sp XW-4
En contraste el sulfato generalmente tiene efecto sobre la reduccioacuten bacteriana del
cromato bajo condiciones de anaerobiosis lo cual podriacutea deberse a que el sulfato compite
con el cromato como aceptor final de electrones (Garbisu y col 1998 Liu y col 2006)
En cultivos anaeroacutebicos de Escherichia coli ATCC 33456 la velocidad de reduccioacuten de
Cr(VI) no fue afectada por hasta 416 mM de sulfato sin embargo la velocidad
disminuyoacute a 83 mM de sulfato (Shen y Wang 1994) La actividad de reduccioacuten de Cr(VI)
de Enterobacter cloacae HO1 bajo condiciones anaeroacutebicas fue inhibida en 32 en
presencia de tan soacutelo 25 M de sulfato (Komori y col 1989)
Como se mencionoacute anteriormente el sulfato incrementoacute la tolerancia al Cr(VI) de la cepa
de Candida sp aislada por Pepi y Baldi (1992) sin embargo esta cepa de levadura fue
incapaz de reducir el Cr(VI) Asimismo auacuten cuando se ha reportado que Pseudomonas
fluorescens LB300 es capaz de reducir el Cr(VI) a Cr(III) (Bopp y Ehrlich 1988) y que el
sulfato incrementa el crecimiento celular de esta bacteria en presencia de cromato
(Ohtake y col 1987) hasta donde sabemos no se ha reportado el efecto del sulfato
sobre la reduccioacuten de Cr(VI) por este microorganismo
67
Los resultados anteriores muestran claramente que el sulfato afectoacute la tolerancia de
Candida sp al Cr(VI) y a su capacidad para reducirlo Es evidente que a medida que se
incrementoacute la concentracioacuten de sulfato el crecimiento de la levadura fue mayor y su
eficiencia y velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) aumentaron Los resultados tambieacuten
muestran que la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp depende de la densidad celular de
los cultivos de manera tal que a mayor cantidad de biomasa generada mayor es la
reduccioacuten de Cr(VI) Aun cuando la cepa de Candida sp es muy sensible a los efectos
toacutexicos del Cr(VI) en ausencia de sulfato esta levadura posee una capacidad notable
para reducir muy altas concentraciones del metal en presencia de sulfato
Meta No 2 Determinar la capacidad de reduccioacuten de Cr(VI) en
diferentes sistemas de reaccioacuten
42 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso
Se utilizoacute un reactor airlift con tubo conceacutentrico liso (sin perforaciones) para el cultivo por
lote de Candida sp Para este sistema de reaccioacuten se utilizoacute un volumen de operacioacuten de
4 litros de medio basal con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM El biorreactor
se inoculoacute con un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada de tal
forma que la concentracioacuten inicial de biomasa fue de 12 mgmL El pH inicial fue de
aproximadamente 60 El reactor se operoacute por lote hasta que la concentracioacuten de Cr(VI)
residual fue despreciable
68
La concentracioacuten celular se incrementoacute gradualmente a medida que la incubacioacuten
progresoacute hasta que alcanzoacute un valor maacuteximo de aproximadamente 39 gL lo cual
ocurrioacute a las 42 h de incubacioacuten A tiempos posteriores la concentracioacuten de biomasa
disminuyoacute debido a que ocurrioacute lisis celular (figura 21) La velocidad especiacutefica maacutexima
de crecimiento de la levadura fue de 00244 h-1 la cual fue superior a la obtenida en
matraz cuando crecioacute con 17 mM de Cr(VI) (00142 h-1) esta diferencia podriacutea deberse
a que en el reactor airlift las ceacutelulas de Candida sp tuvieron una mayor cantidad de
oxiacutegeno disponible para su crecimiento
Figura 21 Variacioacuten de la concentracioacuten de biomasa y de glucosa en el cultivo por lote
de Candida sp en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM
La levadura consumioacute la principal fuente de carbono y energiacutea (glucosa) presente en el
medio de cultivo a lo largo de todo el tiempo de incubacioacuten incluso durante el periodo en
el que ocurrioacute lisis celular La glucosa no fue completamente consumida por la levadura
00
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo [h]
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e g
luc
os
a
res
idu
al [g
L]
00
05
10
15
20
25
30
35
40
45
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e b
iom
as
a [
gL
]Glucosa Biomasa
69
al final del experimento la concentracioacuten de glucosa residual fue de 17 gL (figura 21)
por lo que la eficiencia global de consumo del monosacaacuterido fue del 835
El pH del medio de cultivo disminuyoacute desde 60 hasta aproximadamente 25 Este uacuteltimo
valor se alcanzoacute a las 292 h de incubacioacuten y se mantuvo praacutecticamente constante a
tiempos posteriores (figura 22)
Figura 22 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) y del pH en el cultivo por lote de
Candida sp en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM
La concentracioacuten de Cr(VI) residual disminuyoacute progresivamente a medida que se
incrementoacute el tiempo de incubacioacuten hasta que a las 468 h ya no se detectoacute Cr(VI) en el
medio de cultivo por lo que la eficiencia global de remocioacuten de Cr(VI) fue del 100 Se
observoacute una ligera remocioacuten de Cr(VI) durante el periodo en el que ocurrioacute lisis celular
(figuras 21 y 22) En contraste la concentracioacuten de cromo total en solucioacuten se
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo [h]
Cr(
VI)
y C
rom
o t
ota
l re
sid
ua
l [m
gL
]
00
10
20
30
40
50
60
70
pH
[Cr(VI)] [Cromo total] pH
70
mantuvo casi constante a lo largo del tiempo de cultivo Lo anterior indica que la
levadura fue capaz de transformar el Cr(VI) a la forma trivalente menos toacutexica
En la tabla 6 se comparan los valores de algunas variables cineacuteticas obtenidas en
matraz (cuando se hizo crecer la levadura a una concentracioacuten de Cr(VI) inicial de 17
mM) y en el biorreactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando la levadura se cultivoacute en
medio de cultivo con concentraciones iniciales semejantes de Cr(VI) y de sulfato
Tabla 6 Variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote de Candida sp realizados
en matraz y en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Variable cineacutetica Matraz Reactor
Incremento celular maacuteximo [gL] 22 263
Velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento [h-1] 00142 00244
Eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) [] 100 100
Velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI)L h] 098 164
Velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI) g biomasa h] 045 095
Capacidad de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI) g biomasa] 400 443
El incremento celular maacuteximo y la velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento de
Candida sp obtenidos en el reactor airlift fueron 1955 y 718 superiores a los
alcanzados en matraz respectivamente Como se mencionoacute previamente eacutesto podriacutea
deberse a que en el reactor airlift la levadura tuvo una mayor cantidad de oxiacutegeno
disponible para su crecimiento
71
La levadura redujo todo el Cr(VI) inicialmente presente en el medio de cultivo [eficiencia
global de reduccioacuten de Cr(VI) del 100] tanto cuando se cultivoacute en matraz como en el
reactor airlift El hecho de que Candida sp sea capaz de reducir concentraciones de
Cr(VI) tan altas como 15 mM (e incluso superiores como se mostroacute en la seccioacuten
anterior) podriacutea ser de importancia praacutectica porque la mayoriacutea de los microorganismos
ensayados son capaces de reducir parcial o totalmente concentraciones maacutes bajas de
Cr(VI) (tabla 7)
Tabla 7 Datos sobre reduccioacuten de Cr(VI) por microorganismos
Microorganismo Cultivo
Modo de
operacioacuten
Concentra-
cioacuten de
Cr(VI)
[mM]
Velocidad
volumeacutetrica
de reduccioacuten
[mg de
CrLh]
Eficiencia
de
reduccioacuten
[]
Referencia
Acinetobacter
haemolitycus
Aerobio
CPL
067 128 88 Zakaria y col
2006
Aislado de
Pseudomonas
(CRB5)
Aerobio
CPL
043 014 100 McLean y
Beveridge 2000
Arthrobacter
sp
Aerobio
CPL
017 016 65 Megharaj y col
2003
Aspergillus sp Aerobio
CPL
096 0694 100 Acevedo-Aguilar
y col 2006
Bacillus
megaterium
TKW3
Aerobio
CPL
048 009 735 Cheung y Gu
2005
Bacillus sp Aerobio
CPL
007 007 65 Megharaj y col
2003
Bacteria J3 Aerobio
CPL
01 00057 21 Badar y col
2000
Brevibacterium
CrT-13
Aerobio
CPL
288 255 68 Faisal y Hasnain
2004
E coli AC80 Aerobio
CPL
002
065
9375
Ishibashi y col
1990
Ochrabactrum
sp
Aerobio
CPL
017
034
033
038
100
88
Thacker y
Madamwar 2005
72
Ochrobactrum
intermedium Cr-
T1
Aerobio
CPL
288 326 87 Faisal y Hasnain
2004
Penicillium sp Aerobio
CPL
096 066 95 Acevedo-Aguilar y
col 2006
Phanerochaete
chrysosporium
Aerobio
CPL
058 011 100 Pal 1997
Providencia
sp
Aerobio
CPL
102 10 100 Thacker y col
2006
Pseudomonas
ambigua G-1
Aerobio
CPL
288 347 83 Horitsu y col
1987
Streptomyces
griseus
Aerobio
CPL
017 025 100 Laxman y More
2002
Trichoderma
inhamatum
Aerobio
CPL
13
075 100 Morales-Barrera y
Cristiani-Urbina
2008
Trichoderma
viride
Aerobio
CPL
16
104 100 Morales-Barrera y
Cristiani-Urbina
2006
CPL = Cultivo por lote
La velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) obtenida en el reactor neumaacutetico
con Candida sp fue de 164 mg de Cr(VI)Lh la cual fue 6735 superior a la alcanzada
en matraz [098 mg de Cr(VI)Lh] (tabla 6) Esto uacuteltimo podriacutea deberse a la mayor
cantidad de biomasa generada en el reactor la cual redujo maacutes raacutepidamente el Cr(VI)
Acinetobacter haemolitycus fue capaz de reducir completamente 096 mM de Cr(VI) en
36 h por lo que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal de este microorganismo
fue de 139 mg de Cr(VI)Lh sin embargo cuando la concentracioacuten inicial de Cr(VI) se
incrementoacute a 135 mM la eficiencia y velocidad de reduccioacuten disminuyeron (Zakaria y
col 2006)
A una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 017 mM la eficiencia y velocidad volumeacutetrica
global de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por Ochrabactrum sp fue del 100 y 033 mg
de Cr(VI)Lh respectivamente Aunque la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal
73
se incrementoacute a 038 mg de Cr(VI)Lh cuando la concentracioacuten inicial de Cr(VI) fue de
034 mM la eficiencia de reduccioacuten disminuyoacute a 88 (Thacker y Madamwar 2005)
La eficiencia y velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas con Arthrobacter
sp a las 70 h de incubacioacuten fue de aproximadamente 65 y 016 mg de Cr(VI)Lh
cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial del metal de 017 mM (Megharaj y col 2003)
Con Providencia sp se obtuvo una eficiencia de reduccioacuten del 100 al cabo de 108 h de
incubacioacuten en medios de cultivo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 102 mM
siendo su velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal de 10 mg de Cr(VI)Lh (Thacker
y col 2006) La velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Streptomyces griseus
fue de 025 mg de Cr(VI)Lh cuando se cultivoacute en presencia de 017 mM de Cr(VI)
(Laxman y More 2002)
En el caso de eucariotes Acevedo-Aguilar y col (2006) reportaron que Penicillium sp y
Aspergillus sp fueron capaces de reducir por completo 096 mM de Cr(VI) en 72 h
obtenieacutendose una velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de 0694 mg de Cr(VI)Lh
Asimismo Trichoderma viride exhibioacute una eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) del 100 y
una velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de 104 mg de Cr(VI)Lh cuando se cultivoacute en
un reactor airlift en medio de cultivo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 16 mM
(Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006) Trichoderma inhamatum fue capaz de reducir
por completo 13 mM de Cr(VI) con una velocidad volumeacutetrica de 075 mg de Cr(VI)Lh
(Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2008)
En la tabla 7 se muestran los valores de eficiencia y velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten
de Cr(VI) obtenidas con otros microorganismos
74
La velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) que se obtuvo en el reactor airlift con
Candida sp fue de 095 mg de Cr(VI)g de biomasah (tabla 6) la cual fue 211 veces
mayor que la alcanzada en matraz [045 mg de Cr(VI)g de biomasah] Bae y col
(2000) reportaron que la velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) de Escherichia coli
ATCC 33456 se encontroacute en el intervalo de 031 a 07 mg de Cr(VI)g de biomasah
cuando este microorganismo se cultivoacute por lote en diferentes medios de cultivo con una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 096 mM A una concentracioacuten de Cr(VI) de 0096 mM
los lodos activados exhibieron una velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) de
aproximadamente 008 mg de Cr(VI)g de biomasah (Stasinakis y col 2003) El cultivo
por lote de Trichoderma inhamatum exhibioacute una velocidad especiacutefica de
aproximadamente 0584 mg de Cr(VI)g de biomasah cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 13 mM (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2008)
Asimismo en cultivos por lote de Providencia sp realizados con una concentracioacuten inicial
de Cr(VI) de 034 mM se obtuvo una velocidad especiacutefica de reduccioacuten del metal de
1302 mgg de biomasah (Thacker y col 2006)
En el presente trabajo se encontroacute que en el reactor airlift cada gramo (peso seco) de
biomasa producida de Candida sp pudo reducir 4438 mg de Cr(VI) (tabla 6) valor
ligeramente superior al encontrado en matraz [40 mg de Cr(VI)g de biomasa] y
semejante al reportado para Trichoderma inhamatum (Morales-Barrera y Cristiani-
Urbina 2008) Asimismo a las 60 h de incubacioacuten la capacidad de reduccioacuten de
Penicillium sp y Aspergillus sp fue de aproximadamente 082 y 042 mg de Cr(VI)g de
biomasa (Acevedo-Aguilar y col 2006) Wang y Shen (1997) reportaron que la
capacidad maacutexima de reduccioacuten de Cr(VI) de los cultivos aeroacutebicos de Bacillus sp y
75
Pseudomonas fluorescens LB300 fue de 208 x 10-12 y 310 x 10-12 mg de Cr(VI)ceacutelula
respectivamente si se toma en cuenta que el peso seco promedio de una ceacutelula
bacteriana tiacutepica es de aproximadamente 3 x 10-13 g (Atkinson y Mavituna 1983)
entonces la capacidad de reduccioacuten de Bacillus sp y P fluorescens LB300 seriacutea de 693 y
1033 mg de Cr(VI)g de biomasa respectivamente
43 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote repetido en el reactor airlift con
tubo conceacutentrico liso
Se realizaron algunos cultivos por lote repetido en el reactor airlift con tubo conceacutentrico
liso (sin perforaciones) En cada uno de los cultivos ensayados el reactor se inoculoacute
inicialmente con un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada de la
levadura para obtener una concentracioacuten inicial de biomasa de aproximadamente 12
mgmL La concentracioacuten inicial de Cr(VI) del medio de cultivo fue de aproximadamente
15 mM y el flujo de aire fue de 1 vvm El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que la
concentracioacuten de Cr(VI) residual en el medio fue baja (primer cultivo por lote) a
continuacioacuten una parte del medio de cultivo contenido en el reactor se drenoacute y se
adicionoacute medio fresco con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM Posteriormente el
reactor se operoacute nuevamente por lote (segundo cultivo por lote o cultivo por lote
repetido) Se ensayaron tres relaciones de recambio de medio de cultivo (f = volumen de
medio cosechadovolumen inicial de medio de cultivo) de 08 06 y 04
Debido a la importancia que tiene el pH del medio de cultivo en los procesos
microbioloacutegicos de reduccioacuten de Cr(VI) en el presente trabajo se llevaron a cabo cultivos
por lote repetido con relaciones de recambio de 06 y 08 en los que el pH del medio de
76
cultivo se ajustoacute a 60 al inicio del segundo cultivo por lote (cultivo por lote repetido) asiacute
como experimentos en los que el pH no se ajustoacute a 60 por lo que el pH inicial del cultivo
por lote repetido fue el alcanzado al final del primer cultivo por lote (cercano a 30) Es
conveniente mencionar que los valores bajos de pH inhiben el crecimiento de los
microorganismos pero favorecen la reduccioacuten del Cr(VI) a Cr(III) al ocurrir esto uacuteltimo
disminuye el efecto toacutexico de la forma hexavalente del metal
En estos experimentos se observoacute que el crecimiento de la levadura y la reduccioacuten de
Cr(VI) fueron adversamente afectados cuando el pH del medio de cultivo se ajustoacute a 60
al inicio de los cultivos por lote repetido En la figura 23 se muestra la variacioacuten de la
concentracioacuten de Cr(VI) residual en los cultivos por lote y lote repetido realizados con y
sin ajuste del pH al inicio de los cultivos por lote repetido cuando se utilizaron relaciones
de recambio de 06 y 08
77
Figura 23 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los cultivos por lote y lote
repetido realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizaron
00
100
200
300
400
500
600
700
800
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [m
gL
]
f = 08 spH
f = 08 cpH
CPL CPLR
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [m
gL
] f = 06 spH
f = 06 cpH
CPL CPLR
78
relaciones de recambio de 06 y 08 (spH = sin ajuste de pH del medio de cultivo al
inicio del cultivo por lote repetido cpH = con ajuste de pH del medio de cultivo a 60 al
inicio del cultivo por lote repetido)
En la figura se aprecia que en los primeros cultivos por lote el Cr(VI) fue totalmente o
casi completamente reducido en aproximadamente 45-49 h Sin embargo en los cultivos
por lote repetido el tiempo que se requirioacute para reducir el Cr(VI) fue mayor Asimismo es
evidente que se alcanzaron concentraciones de Cr(VI) residual maacutes bajas en los sistemas
por lote repetido en los que no se ajustoacute el pH al inicio de los cultivos
Los resultados anteriores sugieren que la levadura pierde parte de su capacidad de
reduccioacuten de Cr(VI) cuando se cultiva repetidamente en medios que contienen Cr(VI)
Estos resultados concuerdan con lo reportado por Wang y Shen (1997) quienes
encontraron que Bacillus sp Pseudomonas fluorescens LB300 y Escherichia coli ATCC
33456 pierden su capacidad para reducir Cr(VI) despueacutes de que han reducido 046-052
058 y 125 mM de Cr(VI) respectivamente Un comportamiento similar tambieacuten fue
reportado por Middleton y col (2003) para Shewanella oneidensis
Como los niveles maacutes altos de reduccioacuten de Cr(VI) se obtuvieron cuando no se ajustoacute el
pH a 60 al inicio de los cultivos por lote repetido el experimento en el que se ensayoacute
una relacioacuten de recambio de 04 uacutenicamente se llevoacute a cabo sin ajustar el pH
En la figura 24 se muestra la variacioacuten de la concentracioacuten celular en los sistemas por
lote y lote repetido a las tres diferentes relaciones de recambio ensayadas (04 06 y
08) cuando no se ajustoacute el pH al inicio de los cultivos por lote repetido Se aprecia que
en ninguno de los cultivos por lote repetido se alcanzaron densidades celulares cercanas
79
a las de los cultivos por lote que los precedioacute En los cultivos por lote repetido el
incremento celular y la velocidad especiacutefica de crecimiento maacutes altos se obtuvieron
cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 06 (tabla 8) sin embargo los valores
alcanzados fueron inferiores a los obtenidos en el cultivo por lote que los antecedioacute
Figura 24 Variacioacuten de la concentracioacuten de biomasa con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo ensayadas
00
05
10
15
20
25
30
35
40
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Co
nce
ntr
acioacute
n d
e b
iom
asa
[g
L]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
80
Tabla 8 Variables cineacuteticas del crecimiento celular y de la reduccioacuten de Cr(VI)
obtenidas en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp llevados a cabo en el
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Variable Cultivo por lote Cultivo por lote repetido
Relacioacuten de recambio
04 06 08
Incremento celular
maacuteximo [gL]
224 230 235 017 038 009
Velocidad especiacutefica maacutexima de
crecimiento [h-1]
00244 00227 00220 00044 00109 00017
Eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) []
999 980 973 96 93 36
Velocidad
volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI)Lh]
160 178 151 035 046 045
En los cultivos por lote repetido se necesitoacute de una mayor cantidad de tiempo para
consumir la glucosa presente en los medios en comparacioacuten con los cultivos por lote del
cual derivaron (figura 25) Asimismo en ninguno de los cultivos se consumioacute
totalmente la glucosa la mayor eficiencia de consumo del monosacaacuterido de los cultivos
por lote repetido se obtuvo cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 06 con un
valor de 783 el cual es cercano al obtenido en los primeros cultivos por lote
(aproximadamente 835)
81
Figura 25 Variacioacuten de la concentracioacuten de glucosa con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo utilizadas
En la figura 26 se muestran los perfiles de variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI)
residual en funcioacuten del tiempo de incubacioacuten a las diferentes relaciones de recambio de
medio de cultivo utilizadas Se aprecia que en los primeros cultivos por lote se alcanzaron
niveles de Cr(VI) residual maacutes bajos y en menor tiempo que en los cultivos por lote
repetido
00
20
40
60
80
100
120
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e g
luc
os
a r
es
idu
al [g
L]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
82
Figura 26 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo ensayadas
En los primeros cultivos por lote se alcanzaron eficiencias y velocidades volumeacutetricas
globales de reduccioacuten de Cr(VI) de 973 - 999 y de 151 - 178 mgLh
respectivamente (tabla 8) Estas velocidades son superiores a la alcanzada en el cultivo
por lote realizado en matraz [098 mg de Cr(VI)Lh] y semejantes a la obtenida
previamente en el reactor airlift [164 mg de Cr(VI)Lh]
En los cultivos por lote repetido la eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) maacutes baja se
obtuvo cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 08 y esto podriacutea deberse a que el
tiempo de incubacioacuten que se utilizoacute para este cultivo fue menor que para los otros A las
relaciones de recambio de 04 y 06 las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
[Cr(
VI)
] [m
gL
]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
83
fueron semejantes con valores de 96 y 93 respectivamente Estas uacuteltimas eficiencias
fueron ligeramente inferiores a las obtenidas en los cultivos por lote que los precedioacute
(973-999) Las mayores velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) se
obtuvieron a relaciones de recambio de 06 y 08 [aproximadamente 045 mgLh] sin
embargo fueron considerablemente inferiores a la de los cultivos por lote que los
antecedioacute
44 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa en un reactor airlift
con tubo conceacutentrico liso
Para este sistema el reactor se inoculoacute con 50 mL de inoacuteculo y se dejoacute operar por lote
durante 48 horas con el propoacutesito de incrementar la densidad celular A continuacioacuten se
suministroacute continuamente medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de
15 mM [78 mgL] y con un flujo volumeacutetrico de 378 mLh por lo que la velocidad de
dilucioacuten ensayada fue de 00076 h-1 Se permitioacute que el reactor alcanzara el estado
estacionario lo cual se corroboroacute mediante la determinacioacuten de la concentracioacuten de
biomasa asiacute como de glucosa y de Cr(VI) residual de muestras colectadas a diferentes
tiempos
En el estado estacionario los valores promedio de concentracioacuten de biomasa glucosa
Cr(VI) residual y de pH fueron de 016 gL 62 gL 46 mgL y 345 respectivamente
De estos resultados es evidente que la concentracioacuten de biomasa en el reactor fue muy
baja lo que probablemente ocasionoacute que se alcanzaran valores bajos de eficiencia de
consumo de glucosa (38) y de reduccioacuten de Cr(VI) (41) asiacute como de velocidad
volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) (024 mgLh)
84
Posteriormente se ensayoacute un flujo de alimentacioacuten de 5 mLh para operar con una
velocidad de dilucioacuten de 001 h-1 Sin embargo bajo estas condiciones se presentoacute el
fenoacutemeno de lavado celular en el cual no se detecta biomasa en el reactor Este
experimento se realizoacute varias veces y en todos los casos se obtuvo el mismo resultado
El lavado celular que ocurrioacute en el cultivo continuo de Candida sp podriacutea deberse a que
la velocidad de dilucioacuten que se utilizoacute (001 h-1) es muy cercana a la velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento de la levadura [de aproximadamente 00146 h-1 determinada en
cultivo por lote en medio de cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM]
por lo que la levadura no tuvo tiempo suficiente para duplicarse y fue desplazada del
reactor Ademaacutes el suministro continuo de medio de alimentacioacuten con Cr(VI) ocasiona
que la levadura esteacute constantemente sujeta a los efectos toacutexicos del metal Es decir la
baja velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento de la levadura y los efectos toacutexicos
continuos del metal fueron probablemente los factores que limitaron la eficiencia y
velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) en cultivo continuo
Debido a que ocurrioacute lavado celular a una velocidad de dilucioacuten de 001 h-1 ya no fue
posible ensayar velocidades maacutes altas Los resultados obtenidos en cultivo continuo de
una etapa indican que este sistema de reaccioacuten no es adecuado para la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp
En la tabla 9 se presentan datos sobre la reduccioacuten de Cr(VI) por microorganismos en
cultivos continuos en suspensioacuten o inmovilizados Hasta donde es de nuestro
85
conocimiento no hay informacioacuten disponible acerca de la reduccioacuten de Cr(VI) por
levaduras y hongos filamentosos en cultivo continuo
Tabla 9 Resumen de datos sobre la reduccioacuten microbiana de Cr(VI) en cultivo continuo
Microorganismo Cultivo Concentra-
cioacuten de
Cr(VI) [mM]
Velocidad
de
dilucioacuten
[h-1]
Velocidad
volumeacutetrica
de reduccioacuten
[mg de
CrLh]
Eficiencia
de
reduccioacuten
[]
Referencia
Pseudomonas
sp C7
Aerobio 12
12
0014
0017
073
093
88
91
Gopalan y
Veeramani
1994
Pseudomonas
fluorescens
LB300
Aerobio 011
009
009
002
005
009
016
017
022
57
39
28
DeLeo y
Ehrlich
1994
Escherichia coli
ATCC 33456
Aerobio 08 005
169 843 Bae y col
2000
Pseudomonas
mendocina
MCM B-180
Aerobio
05
15
20
022
014
011
57
108
113
99
99
99
Bhide y
col 1996
Microbacterium
liquefaciens
MP30
Aerobio
(ceacutelulas
inmovilizadas
en perlas de
polivinil
alcohol-
alginato)
005
0038
009
90
Pattanapip
it-paisal y
col 2001
Bacillus sp Aerobio
(ceacutelulas
inmovilizadas
en perlas de
vidrio Pyrex)
192
192
004
008
397
797
998
998
Chirwa y
Wang
1997
86
En un estudio realizado en cultivo continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de Pseudomonas
fluorescens LB300 se encontroacute que la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute desde
57 hasta 28 y que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal se incrementoacute de
016 a 022 mg de Cr(VI)Lh a medida que la velocidad de dilucioacuten se incrementoacute de
002 a 009 h-1 cuando se utilizoacute medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI)
de 009 mM (DeLeo y Ehrlich 1994)
Los resultados obtenidos en cultivo continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de otros
microorganismos han sido alentadores Gopalan y Veeramani (1994) ensayaron tres
velocidades de dilucioacuten de 0014 0017 y 0028 h-1 y encontraron que la maacutexima
eficiencia (91) y velocidad volumeacutetrica [093 mg de Cr(VI)Lh] de reduccioacuten de Cr(VI)
de Pseudomonas sp C7 se obteniacutea a una velocidad de dilucioacuten de 0017 h-1 cuando se
utilizoacute medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de 12 mM En el estudio
realizado por Bae y col (2000) con Escherichia coli ATCC 33456 la velocidad de dilucioacuten
se mantuvo constante a 005 h-1 y se obtuvo una eficiencia y una velocidad volumeacutetrica
de reduccioacuten de Cr(VI) de 843 y de 169 mg de Cr(VI)Lh respectivamente cuando
se utilizoacute una concentracioacuten de Cr(VI) de 08 mM en el medio de alimentacioacuten En cultivo
continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de Pseudomonas mendocina MCM B-180 Bhide y col
(1996) ensayaron el efecto de diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI) [de 05 a
20 mM] y de velocidades de dilucioacuten (011 a 022 h-1) sobre la reduccioacuten de Cr(VI)
Estos investigadores encontraron altas eficiencias (99) y velocidades de reduccioacuten [57
ndash 113 mg de Cr(VI)Lh]
Asimismo con la finalidad de reducir los efectos toacutexicos del Cr(VI) sobre los
microorganismos se ha propuesto el uso de ceacutelulas inmovilizadas en reactores continuos
87
de lecho fijo Las ceacutelulas de Microbacterium liquefaciens MP30 inmovilizadas en perlas de
alginato de calcio - polivinil alcohol fueron capaces de reducir el Cr(VI) con una
eficiencia del 90 y con una velocidad de 009 mg de Cr(VI)Lh cuando se utilizoacute medio
de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de 005 mM y una velocidad de dilucioacuten
de 0038 h-1 (Pattanapipitpaisal y col 2001) En un reactor de lecho fijo con ceacutelulas de
Bacillus sp inmovilizadas en perlas de vidrio Pyrex con un diaacutemetro de 3 mm se observoacute
que al incrementar la velocidad de dilucioacuten de 004 a 008 h-1 la eficiencia de reduccioacuten
de Cr(VI) se mantuvo constante (998) y que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de
Cr(VI) se incrementoacute de 397 a 797 mgLh (Chirwa y Wang 1997)
45 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular y la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo conceacutentrico de
malla de acero inoxidable y de vidrio perforado
Los reactores airlift con tubo conceacutentrico liso (reactores convencionales) no son
adecuados para llevar a cabo cultivos por lote alimentado (procesos con volumen
variable) ya que no es posible lograr una adecuada circulacioacuten del liacutequido a cualquier
volumen de medio de cultivo En los reactores airlift convencionales uacutenicamente se logra
una adecuada circulacioacuten del fluido cuando la altura del liacutequido es mayor que la del tubo
conceacutentrico Por ello para realizar cultivos por lote alimentado en reactores airlift es
necesario que existan diversos puntos de comunicacioacuten entre las secciones de ascenso y
descenso del reactor a lo largo de toda la longitud del tubo conceacutentrico En la literatura
se han descrito algunos reactores airlift que en su interior contienen dispositivos que
permiten la comunicacioacuten entre ambas secciones del reactor Los dispositivos maacutes
comunes son tubos de mallas metaacutelicas (net draft tube) (Tung y col 1997 Wu y Wu
1990 1991 Wu y col 1992) tubos conceacutentricos de vidrio con perforaciones
88
rectangulares (Cristiani-Urbina y col 2000) placas curvas colocadas coaxialmente
(Hagino y col 1982) y bafles (placas) perforados (Galiacutendez-Mayer y col 2001) Estos
dispositivos afectan las caracteriacutesticas hidrodinaacutemicas y de transferencia de masa y calor
de los reactores por lo que es conveniente evaluar su desempentildeo
En este trabajo se evaluoacute la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivos por lote
utilizando reactores airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable asiacute como de
vidrio con perforaciones circulares Estos cultivos se realizaron con dos flujos de aire de
05 y 1 vvm Estos experimentos tuvieron como propoacutesito principal el seleccionar el tubo
conceacutentrico maacutes adecuado para llevar a cabo posteriormente los cultivos por lote
alimentado y lote alimentado repetido
En la figura 27 se muestran las curvas de crecimiento celular cuando se utilizoacute el reactor
airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos de aire
ensayados El crecimiento celular de la levadura fue mayor cuando se utilizoacute un flujo de
aire de 1 vvm lo cual podriacutea deberse a una mayor oxigenacioacuten del medio de cultivo Los
niveles de Cr(VI) residual maacutes bajos tambieacuten se obtuvieron con un flujo de aire de 1 vvm
(figura 28) y eacutesto podriacutea deberse a la mayor densidad celular alcanzada bajo estas
condiciones
89
Figura 27 Curvas de crecimiento celular de Candida sp en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos de aire ensayados
Figura 28 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual en los cultivos por lote realizados
en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos
de aire ensayados
000
050
100
150
200
250
00 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Tiempo [h]
XX
O
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
00 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Tiempo [h]
Cr(
VI)
Re
sid
ual [
]
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
90
En los experimentos realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado se
observoacute un comportamiento opuesto al obtenido previamente con el tubo conceacutentrico de
malla metaacutelica El crecimiento celular (figura 29) y la reduccioacuten de Cr(VI) (figura 30)
en el reactor con tubo conceacutentrico perforado fueron mayores a un flujo de aire de 05
vvm
Figura 29 Curvas de crecimiento celular de Candida sp en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico de vidrio perforado a los dos flujos de aire ensayados
000
050
100
150
200
00 500 1000 1500 2000 2500
Tiempo [h]
XX
O
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
91
Figura 30 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual en los cultivos por lote realizados
en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de vidrio perforado a los dos flujos de aire
ensayados
En la tabla 10 se muestran algunas variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote
realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable y con
tubo conceacutentrico perforado de vidrio a los dos flujos de aire ensayados Ademaacutes la tabla
incluye los resultados obtenidos en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
00 500 1000 1500 2000 2500
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ual [
] Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
92
Tabla 10 Variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote realizados en el reactor
airlift con las diferentes configuraciones de tubo conceacutentrico
Cultivo por lote
Variable cineacutetica Tubo conceacutentrico
liso
Malla metaacutelica Tubo conceacutentrico perforado
10 vvm 05 vvm 10 vvm 05 vvm 05 vvm 10 vvm
Incremento celular
maacuteximo [gL]
263 072 142 123 106 082
Velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento [h-1]
00244 00059 00120 00149 00178 00093
Eficiencia global de
reduccioacuten de Cr(VI) ()
100 67 95 97 95 89
Velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) [mg de Cr(VI)Lh]
164 031 056 082 084 035
Comparando los resultados obtenidos en el reactor con tubo de malla metaacutelica y con el
de vidrio perforado la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) fue mayor cuando se
utilizoacute el tubo conceacutentrico perforado de vidrio y un flujo de aire de 05 vvm con un valor
promedio de dos experimentos independientes de 083 mgLh Sin embargo esta
velocidad es aproximadamente 494 inferior a la alcanzada con el tubo conceacutentrico liso
Los resultados de crecimiento celular (incremento celular maacuteximo y velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento) y de reduccioacuten de Cr(VI) (eficiencia y velocidad volumeacutetrica)
obtenidos en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable y de
vidrio perforado a los flujos de aire ensayados podriacutean sugerir que el grado de
oxigenacioacuten del medio de cultivo y la magnitud de los esfuerzos de corte que se alcanzan
durante la agitacioacuten neumaacutetica desempentildean un papel importante en la generacioacuten de
biomasa de Candida sp en los estados fisioloacutegicos de eacutesta y por consiguiente en la
93
reduccioacuten de Cr(VI) Debido a lo anterior seriacutea conveniente investigar la influencia de la
velocidad de aireacioacuten la cual afecta los patrones de flujo del fluido la magnitud de las
fuerzas de corte y la concentracioacuten del nutriente gaseoso en la fase fluida
Como las mayores eficiencias y velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) se
obtuvieron cuando se utilizoacute el tubo conceacutentrico perforado de vidrio y un flujo de aire de
05 vvm eacutestos fueron utilizados en los cultivos por lote alimentados que se llevaron a
cabo posteriormente
46 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote alimentado
repetido en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado
En los cultivos por lote alimentado el volumen de medio liacutequido en el reactor se
incrementa gradualmente a medida que aumenta el tiempo de incubacioacuten Este cambio
de volumen provoca una dilucioacuten de los componentes presentes en el medio de cultivo lo
cual dificulta la interpretacioacuten de los resultados Debido a lo anterior en los cultivos por
lote alimentado es conveniente expresar el cambio de las variables (biomasa sustrato
etc) en teacuterminos de masa y no de concentracioacuten y para ello es necesario conocer el
volumen de medio a los diferentes tiempos de incubacioacuten Por consiguiente en el
presente trabajo se estimaron las cantidades de biomasa glucosa y de Cr(VI) y se
expresaron en teacuterminos de masa A continuacioacuten se presentan las ecuaciones para
calcular la masa de las variables de intereacutes para este trabajo
Masa celular [g] = (concentracioacuten celular gL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
94
Masa de glucosa [g] = (concentracioacuten de glucosa gL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
Masa de Cr(VI) [mg] = (concentracioacuten de Cr(VI) mgL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
En los cultivos por lote alimentado y lote alimentado repetido se ensayaron dos flujos
volumeacutetricos de medio de alimentacioacuten de 659 y 1343 mLh que corresponden a
cargas maacutesicas de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh respectivamente Los cultivos por lote
alimentado realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado se iniciaron con
cultivos por lote (los resultados obtenidos en estos uacuteltimos cultivos se mostraron en la
seccioacuten anterior)
Cuando se utilizoacute una carga maacutesica de Cr(VI) de 0514 mgh en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) se observoacute que la masa celular
de la levadura en el primer cultivo por lote alimentado fue mayor que en la del segundo
cultivo Sin embargo a pesar de que la levadura tuvo un suministro constante de fuente
de carbono y energiacutea eacutesta praacutecticamente no crecioacute
Cuando se utilizoacute una carga maacutesica de Cr(VI) de 0514 mgh fue evidente que en los
cultivos por lote alimentado se fue acumulando glucosa en el medio de cultivo lo que
indica que las ceacutelulas casi no consumieron el monosacaacuterido que teniacutean disponible para su
crecimiento La cantidad de glucosa consumida por la levadura en el cultivo por lote
alimentado repetido (segundo cultivo por lote alimentado) fue considerablemente menor
que la consumida en el primer cultivo lo cual podriacutea deberse a que habiacutea una menor
cantidad de biomasa en el reactor En el segundo cultivo por lote alimentado se alcanzoacute
95
una eficiencia de consumo de glucosa del 68 en cambio en el primer cultivo fue del
263
Se observoacute que la levadura fue capaz de reducir parcialmente el Cr(VI) adicionado al
reactor y que en el primer cultivo por lote alimentado se lograron mayores niveles de
reduccioacuten
En el primer cultivo por lote alimentado las eficiencias de reduccioacuten de Cr(VI) maacutes altas
se alcanzaron durante el periodo de incubacioacuten de las 468 a las 967 h (7188-7292)
y disminuyeron ligeramente hasta el final de este cultivo (673-6945) En el segundo
cultivo por lote alimentado (lote alimentado repetido) las eficiencias disminuyeron
gradualmente a medida que se incrementoacute el tiempo de incubacioacuten (figura 31) La
eficiencia promedio de reduccioacuten de Cr(VI) del primer cultivo por lote alimentado fue de
689 y la del segundo cultivo alimentado fue de 56
96
Figura 31 Variacioacuten de la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) de Candida sp cuando se
utilizoacute una carga maacutesica del metal de 0514 mgh
La velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute progresivamente a medida
que transcurrieron los cultivos por lote alimentado desde 0181 hasta 0063 mgLh
(figura 32) estos valores son inferiores a los alcanzados en los cultivos por lote
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Efi
cie
nc
ia d
e r
ed
uc
cioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
CPLA1 CPLA2
97
Figura 32 Variacioacuten de la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Candida sp
en el cultivo por lote alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) llevados a
cabo con una carga maacutesica del metal de 0514 mgh
Posteriormente se realizoacute el cultivo por lote alimentado y lote alimentado repetido
utilizando una carga maacutesica de Cr(VI) de 105 mgh Se observoacute que en ambos cultivos
la masa celular de Candida sp se incrementoacute gradualmente a medida que se incrementoacute
el tiempo de incubacioacuten aunque al final de cada cultivo hubo una ligera disminucioacuten en la
cantidad de biomasa en el reactor En el primer cultivo por lote alimentado se alcanzoacute un
valor maacuteximo de 523 g de biomasa (incremento celular de 053 g) a las 637 h
mientras que en el segundo cultivo se alcanzoacute una cantidad maacutexima de biomasa de 435
g (incremento celular de 13 g) a las 1822 h totales de cultivo que corresponden a 893
h del cultivo por lote alimentado repetido
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica g
lob
al d
e
re
du
ccioacute
n d
e C
r(V
I) [
mg
de
Cr(V
I)L
h]
CPLA1 CPLA2
98
Asimismo se encontroacute que la levadura fue capaz de consumir parcialmente la glucosa
suministrada En el primer cultivo por lote alimentado se obtuvo una eficiencia de
consumo de glucosa del 299 mientras que en el segundo cultivo la eficiencia fue del
388 Estos resultados probablemente se deban a que el crecimiento de la levadura fue
mayor en el cultivo por lote alimentado repetido (incremento celular = 13 g) que en el
cultivo por lote alimentado que lo precedioacute (incremento celular = 053 g)
En los cultivos por lote alimentados llevados a cabo con una carga maacutesica de 105 mg de
Cr(VI) la levadura fue capaz de reducir parcialmente el Cr(VI) adicionado al reactor sin
embargo al final del primer cultivo por lote alimentado se lograron los niveles de
reduccioacuten maacutes altos
En el primer cultivo por lote alimentado la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) se
incrementoacute a medida que aumentoacute el tiempo de incubacioacuten alcanzaacutendose el valor maacutes
alto de eficiencia (529) a las 879 h de incubacioacuten En contraste en el segundo cultivo
por lote alimentado (alimentado repetido) la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute
continuamente conforme transcurrioacute el tiempo de cultivo Al final del cultivo por lote
alimentado repetido la eficiencia de reduccioacuten del metal fue del 43 (figura 33)
99
Figura 33 Variacioacuten de la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) de Candida sp cuando se
utilizoacute una carga maacutesica del metal de 105 mgh
En estos experimentos tambieacuten se observoacute que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de
Cr(VI) disminuyoacute continuamente durante todo el periodo de incubacioacuten desde 0226
hasta 0099 mgLh (figura 34)
0
10
20
30
40
50
60
0 50 100 150 200 250
Tiempo [h]
Efi
cie
ncia
de
re
du
ccioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
CPLA1 CPLA2
100
Figura 34 Variacioacuten de la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Candida sp
en el cultivo por lote alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) llevados a
cabo con una carga maacutesica del metal de 105 mgh
Las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) que se obtuvieron con una carga maacutesica
del metal de 105 mgh fueron inferiores a las logradas con una carga de 0514 mgh y
esto podriacutea deberse a que el tiempo de contacto entre la levadura y el medio de cultivo
fue menor En contraste las velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) fueron
ligeramente superiores a una carga maacutesica de 105 mgh
Con las dos cargas maacutesicas de Cr(VI) que se ensayaron en este trabajo se observoacute una
variacioacuten semejante en el pH de los medios de cultivo Los cultivos por lote alimentado
se iniciaron con un pH de 302-306 (estos valores corresponden al pH que se obtuvo al
final de los cultivos por lote que precedioacute a los cultivos por lote alimentado) El pH se
000
004
008
012
016
020
024
0 50 100 150 200 250
Tiempo [h]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica g
lob
al d
e r
ed
uccioacute
n
de
Cr(V
I) [
mg
de
Cr(V
I)L
h]
CPLA1 CPLA2
101
incrementoacute ligeramente durante el curso de los primeros cultivos por lote alimentado y al
final de eacutestos se tuvieron valores de 355 y de 345 cuando se emplearon cargas maacutesicas
de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh respectivamente En los cultivos por lote alimentado
repetido el pH se mantuvo praacutecticamente constante durante todo el periodo de
incubacioacuten
A pesar de que el cultivo por lote alimentado es muy recomendable para trabajar con
compuestos toacutexicos ha sido poco explorado para el tratamiento de aguas contaminadas
con cromo hexavalente Fujii y col (1990) utilizaron el cultivo por lote alimentado para
investigar la reduccioacuten de Cr(VI) por la bacteria anaerobia Enterobacter cloacae cepa
HO1 En este estudio una solucioacuten de cromato se alimentoacute continuamente en pequentildeas
dosis para minimizar el efecto toacutexico del metal Los investigadores encontraron que la
reduccioacuten de Cr(VI) fue fuertemente afectada por la velocidad especiacutefica de alimentacioacuten
de cromato Cuando esta velocidad fue inferior a 25 mmol de CrO42-g de biomasah
todo el cromo adicionado fue reducido A velocidades de alimentacioacuten superiores se
observoacute que la concentracioacuten de Cr(VI) residual en el medio de cultivo se incrementaba a
medida que aumentaba la velocidad de alimentacioacuten Asimismo encontraron que la
actividad reductora de la bacteria era fuertemente inhibida cuando la concentracioacuten de
Cr(VI) del medio de cultivo era mayor a 07 mM (3639 mgL)
Posteriormente Fujie y col (1996) realizaron la simulacioacuten de un cultivo por lote
alimentado utilizando datos cineacuteticos obtenidos en cultivo por lote y un modelo
matemaacutetico que describe el comportamiento de la bacteria antes mencionada Los
resultados experimentales y los predichos por el simulador fueron semejantes
102
En la tabla 11 se presentan los valores de velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
obtenidos en el presente trabajo en los diferentes sistemas de reaccioacuten ensayados La
mayor velocidad se obtuvo en el cultivo por lote realizado en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso por lo que eacuteste seriacutea el sistema maacutes adecuado para la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp
103
Tabla 11 Velocidades volumeacutetricas globales de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas en diferentes sistemas de reaccioacuten
CPL
Matraz
CPL Reactor
airlift con
tubo liso
CPL Reactor
airlift con
malla metaacutelica
CC Reactor
airlift con
tubo liso
CPLR Reactor
airlift con
tubo liso
CPL Reactor
airlift con tubo
perforado
CPLA Reactor
airlift con
tubo perforado
CPLAR Reactor
airlift con
tubo perforado
10
Vvm
05
vvm
10
vvm
10
vvm
10
vvm
05
vvm
10
vvm
05
vvm
05
vvm
f=08 f=06 f=04
CM1 CM2 CM1 CM2
098 151 ndash178 031 056 024 045 046 035 084 035 0092-0181
0163-0195
0063-0083
0099-0145
CPL = Cultivo por lote CC = Cultivo continuo CPLR = Cultivo por lote repetido CPLA = Cultivo por lote alimentado CPLAR = Cultivo por lote alimentado repetido f = relacioacuten de recambio CM = Carga maacutesica de Cr(VI)
CM1 = 0514 mg Cr(VI)h CM2 = 105 mg Cr(VI)h
104
5 CONCLUSIONES
El sulfato desempentildea un papel importante en la tolerancia al Cr(VI) y en la reduccioacuten
del mismo en la cepa de Candida sp utilizada en este trabajo
El efecto modulador del sulfato sobre el crecimiento celular y la reduccioacuten del Cr(VI)
depende de las concentraciones de los oxianiones sulfato y cromato
El mecanismo principal de remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp es la biotransformacioacuten
del altamente toacutexico Cr(VI) al menos toacutexico Cr(III)
El cultivo por lote en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso es el sistema de
reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
La velocidad de aireacioacuten no tiene un efecto significativo sobre la reduccioacuten de Cr(VI)
por Candida sp
105
6 REFERENCIAS
1 Acevedo-Aguilar FJ Espino-Saldantildea AE Leoacuten-Rodriacuteguez IL Rivera-Cano ME Avila-Rodriguez M Wrobel K et al 2006 Hexavalent chromium removal in vitro and from industrial wastes using chromate-resistant strains of filamentous
fungi indigenous to contaminated wastes Can J Microbiol 52 809-815
2 Ali-Awan M Baig MA Iqbal J Aslam MR amp Ijaz N 2003 Recovery of chromium (III) from tannery wastewater J App Sci amp Environ Management 7 (2) 5-8
3 Aacutelvarez SG Maldonado M Gerth A amp Kuschk P 2004 Characterization of
tannery effluents and study of the water Hyacinth in chromium recovery Informacioacuten Tecnoloacutegica 15 (3) 75-80
4 Aravindhan BM Madani B Rao JR Nair BU amp Ramasami T 2004 Bioaccumulation of Chromium from Tannery Wastewater An Approach for chrome
recovery and reuse Environ Sci Technol 38 300-306
5 Atkinson B amp Mavituna F 1983 Biochemical engineering and biotechnology handbook United Kingom Nature Press
6 Badar U Ahmed N Beswick AJ Pattanapipitpaisal P amp Macaskie LE 2000 Reduction of chromate by microorganisms isolated from metal contaminated sites of
Karachi Pakistan Biotechnol Lett 22 829-836 7 Bae WC Kang TG Kang IK Won YJ amp Jeong BC 2000 Reduction of
hexavalent chromium by Escherichia coli ATCC 33456 in batch and continuous cultures J Microbiol 38(1) 36-39
8 Balasubramanian S amp Pugalenthi V 1999 Determination of total chromium in
tannery wastewater by inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry
flame atomic absorption spectrometry and uv-visible spectrophotometric methods Talanta 50 (3) 457-467
9 Baldi F Vaughan AM amp Olson GJ 1990 Chromium(VI)-resistant yeast
isolated from a sewage treatment plant receiving tannery wastes Appl Environ
Microbiol 56 (4) 913-918
10 Barnhart J 1997 Occurrences uses and properties of chromium Regulatory Toxicology and Pharmacology 26 S3-S7
11 Beleza VM Boaventura RA amp Almeida MF 2001 Kinetics of chromium removal from spent tanning liquors using acetylene production sludge Environ
Sci Technol 35 (21) 4379-4383 12 Bhide JV Dhakephalkar PK amp Paknikar KM 1996 Microbiological process for
the removal of Cr(VI) from chromate-bearing cooling tower effluent Biotechnol Lett 18 (6)667-672
106
13 Bopp LH amp Ehrlich HL 1988 Chromate resistance and reduction in
Pseudomonas fluorescens strain LB300 Archives of Microbiology 150 426-431
14 Branco R Alpoim MC amp Morais PV 2004 Ochrobactrum tritici strain 5bvI1 ndash characterization of a Cr(VI)-resistant and Cr(VI)-reducing strain Can J Microbiol
50 697-703 15 Camargo FAO Bento FM Okeke BC amp Frankenberger WT 2002 Chromate
reduction by chromium-resistant bacteria isolated from soils contaminated with dichromate Journal of Environmental Quality 32 1228-1233
16 Camargo FAO Okeke BC Bento FM amp Frankenberger WT 2003 In vitro
reduction of hexavalent chromium by a cell-free extract of Bacillus sp ES 29
stimulated by Cu2+ Appl Microbiol Biotechnol 62 569-573
17 Cantildeizares-Villanueva R 2000 Biosorcioacuten de metales pesados mediante el uso de biomasa microbiana Rev Latinoam Microbiol 42 131-143
18 Cervantes C Campos-Garciacutea J Devars S Gutieacuterrez-Corona F Loza-Tavera H Torres-Guzmaacuten JC amp Moreno-Saacutenchez R 2001 Interactions of chromium with
microorganisms and plants FEMS Microbio Rev 25 335-347 19 Chardin B Dolla A Chaspoul F Fardeau ML Gallice P amp Bruschi M 2002
Bioremediation of chromate thermodynamic analysis of the effects of Cr(VI) on sulfate-reducing bacteria Appl Microbiol Biotechnol 60 352-360
20 Chardin B Giudici-Orticoni MT De Luca G Guigliarelli B amp Bruschi M 2003
Hydrogenases in sulfate-reducing bacteria function as chromium reductase Appl
Microbiol Biotechnol 63 315-321
21 Cheung Y amp Gu G 2003 Reduction of chromate (CrO42-) by an enrichment
consortium and an isolate of marine sulfate-reducing bacteria Chemosphere 52 1523-1529
22 Cheung KH amp Gu JD 2005 Chromate reduction by Bacillus megaterium TKW3
isolated from marine sediments World Journal of Microbiology amp Biotechnology 21 213-219
23 Cheung KH amp Gu JD 2007 Mechanism of hexavalent chromium detoxification
by microorganisms and bioremediation application potential a review International
Biodeterioration amp Biodegradation 59 8-15
24 Chirwa EMN amp Wang YT 1997 Hexavalent chromium reduction by Bacillus sp in a packed-bed bioreactor Environ Sci Technol 31 1446-1451
25 Cristiani-Urbina E Netzahuatl-Muntildeoz AR Manriquez-Rojas FJ Juaacuterez-Ramiacuterez C Ruiz-Ordaz N amp Galiacutendez-Mayer J 2000 Batch and fed-batch
cultures for the treatment of whey with mixed yeast cultures Process Biochemistry 35 649-657
107
26 Czakoacute-Veacuter K Batiegrave M Raspor P Sipiczki M amp Pesti M 1999 Hexavalent
chromium uptake by sensitive and tolerant mutants of Schizosaccharomyces pombe FEMS Microbiology Letters 178 109-115
27 DeLeo PC amp Ehrlich HL 1994 Reduction of hexavalent chromium by
Pseudomonas fluorescens LB300 in batch and continuous cultures Appl Microbiol Biotechnol 40 756-759
28 Desjardin V Bayard R Lejeune P amp Gourdon R 2003 Utilization of supernatant of pure cultures of Streptomyces thermocarboxydus NH50 to reduce
chromium toxicity and mobility in contaminated soils Water Air and Soil Pollut 3 153-160
29 Eccles H 1999 Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process TIBTECH 17 462-465
30 Faisal M amp Hasnain S 2004 Comparative study of Cr(VI) uptake and reduction in
industrial effluent by Ochrobactrum intermedium and Brevibacterium sp
Biotechnology Letters 26 1623-1628
31 Fruchter J 2002 In situ treatment of chromium-contaminated groundwater Environ Sci amp Technol pp 464-472
32 Fujie K Hu H Huang X Tanaka Y Urano K amp Ohtake H 1996 Optimal operation of bioreactor system developed for the treatment of chromate wastewater
using Enterobacter cloacae HO-1 Wat Sci Tech 33 (5-6) 173-182 33 Fujii E Toda K amp Ohtake H 1990 Bacterial reduction of toxic hexavalent
chromium using a fed-batch culture of Enterobacter cloacae strain HO1 J Ferment Bioeng 69 (6) 365-367
34 Gaballah I Goy D Kilbertus G amp Thauront J 1994 Decontamination of
industrial effluents for environment protection and recycling of metals Resources
Conservation and Recycling 10 (1-2) 97-106
35 Galiacutendez-Mayer J Saacutenchez-Teja O Cristiani-Urbina E amp Ruiz-Ordaz N 2001 A novel split-cylinder airlift reactor for fed-batch cultures Bioprocess and Biosystems
Engineering 24 171-177 36 Ganguli A amp Tripathi AK 1999 Survival and chromate reducing ability of
Pseudomonas aeruginosa in industrial effluents Lett Appl Microbiol 28 76-80
37 Garbisu C Alkorta I Llama MJ amp Serra JL 1998 Aerobic chromate reduction by Bacillus subtilis Biodegradation 9 133-141
38 Gonzaacutelez AR Ndungrsquou K amp Flegal AR 2005 Natural occurrence of hexavalent chromium in the Aromas Red Sands Aquifer California Environ Sci Technol 39
(15) 5505-5511
108
39 Gopalan R amp Veeramani H 1994 Studies on microbial chromate reduction by
Pseudomonas sp in aerobic continuous suspended growth cultures Biotechnology and Bioengineering 43 471-476
40 Guertin J Jacobs JA amp Avakian CP 2005 Chromium(VI) Handbook 1st
edition CRC Press USA 41 Hach Water Analysis Handbook 2002 Hach Company Colorado USA 4th ed
pp 433-444 1210-1211
42 Hafez AI El-Manharawy MS amp Khedr MA 2002 RO membrane removal of unreacted chromium from spent tanning effluent A pilot-scale study Part 2 Desalination 144 (1-3) 237-242
43 Hagino H Odagiri H amp Okutani J 1982 Draft device for a bubble column US
Patent 4327042 44 Horitsu H Futo S Miyazawa Y Ogai S amp Kawai K 1987 Enzymatic
reduction of hexavalent chromium by hexavalent chromium tolerant Pseudomonas ambigua G-1 Agric Biol Chem 51 (9) 2417-2420
45 Ishibashi Y Cervantes C amp Silver S 1990 Chromium reduction in Pseudomonas
putida Appl Environ Microb 56 (7) 2268-2270
46 Jianlong W Zeyu M amp Xuan Z 2004 Response of Saccharomyces cerevisiae to
chromium stress Process Biochem 39 1231-1235 47 Juvera-Espinosa J Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2006 Isolation and
characterization of a yeast strain capable of removing Cr(VI) Enzyme and Microbial Technology 40 114-121
48 Kaszycki P Fedorovych D Ksheminska H Babyak L Gonchar MV Jaglarz
A amp Koloczek H 2003 Modulation of chromium(VI) and (III) tolerance and
accumulation in yeast by sulfate-containing salts European Journal of Biochemistry 1 (1) P49-53
49 Komori K Wang P Toda K amp Ohtake H 1989 Factors affecting chromate
reduction in Enterobacter cloacae Strain HO1 Appl Microbiol Biotechnol 31 567-570
50 Ksheminska H Fedorovych D Babyak L Yanovych D Kaszycki P amp Koloczek H 2005 Chromium(III) and (VI) tolerance and bioaccumulation in
yeast a survey of cellular chromium content in selected strains of representative genera Process Biochem 40 1565-1572
51 Ksheminska HP Honchar TM Gayda GZ amp Gonchar MV 2006 Extra-cellular chromate-reducing activity of the yeast cultures Central European Journal of
Biology 1 (1)137-149
109
52 Kurniawan TA Chan GYS Lo W amp Babel S 2006 Physico-chemical
treatment techniques for wastewater laden with heavy metals Chemical Engineering Journal 118 83-98
53 Labra M Grassi F Imazio S Di Fabio T Citterio S Sgorbati S amp Agradi E
2004 Genetic and DNA-methylation changes induced by potassium dichromate in Brassica napus L Chemosphere 54 1049-1058
54 Laxman RS amp More S 2002 Reduction of hexavalent chromium by Streptomyces griseus Minerals Engineering 15 831-837
55 Leustek T 2002 Sulfate metabolism The Arabidopsis Book American Society of
Plant Biologists
56 Liu YG Xu WH Zeng GM Li X and Gao H 2006 Cr(VI) reduction by
Bacillus sp isolated from chromium landfill Process Biochemistry 41 1981-1986 57 Llovera S Bonet R Simon-Pujol MD amp Congregado F 1993 Effect of culture
medium ions on chromate reduction by resting cells of Agrobacterium radiobacter Appl Microbiol Biotechnol 39 424-426
58 Lloyd JR 2003 Microbial reduction of metals and radionuclides FEMS Microbiol
Rev 27 411-425
59 Marsh TL amp McInerney MJ 2001 Relationship of hydrogen bioavailability to
chromate reduction in aquifer sediments Appl Environ Microb 67 (4) 1517-1521
60 McLean J amp Beveridge TJ 2001 Chromate reduction by a pseudomonad isolated from a site contaminated with chromated copper arsenate Applied and
Environmental Microbiology 67 (3)1076-1084 61 Megharaj M Avudainayagam S amp Naidu R 2003 Toxicity of hexavalent
chromium and its reduction by bacteria isolated from soil contaminated with tannery waste Current Microbiology 47 51-54
62 Middleton SS Latmani RB Mackey MR Ellisman MH Tebo BM amp Criddle
CS 2003 Cometabolism of Cr(VI) by Shewanella oneidensis MR-1 produces cell-associated reduced chromium and inhibits growth Biotechnol Bioeng 83 627-637
63 Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2006 Removal of hexavalent chromium
by Trichoderma viride in an airlift bioreactor Enzyme and Microbial Technology 40 107-113
64 Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2008 Hexavalent chromium removal by Trichoderma inhamatum fungal strain isolated from tannery effluent Enzyme and
Microbial Technology 40 107-113
110
65 Morales B L 2005 Aislamiento de microorganismos y estudio de su capacidad
para remover cromo hexavalente Tesis de Maestriacutea Escuela Nacional de Ciencias Bioloacutegicas IPN Meacutexico
66 Muter O Patmalnieks A amp Rapoport A 2001 Interrelations of the yeast Candida
utilis and Cr(VI) metal reduction and its distribution in the cell and medium Process Biochem 36 963-970
67 Ohtake H Cervantes C amp Silver S 1987 Decreased chromate uptake in Pseudomonas fluorescens carrying a chromate resistance plasmid J Bacteriol 169
3853-3856 68 Pal N 1997 Reduction of hexavalent chromium to trivalent chromium by
Phanerochaete chrysosporium pp 511-517 En Alleman BC amp Leeson A In Situ and On-Site Bioremediation Vol 2 Battelle Press Ohio USA
69 Pattanapipitpaisal P Brown NL amp Macaskie LE 2001 Chromate reduction by
Microbacterium liquefaciens immobilised in polyvinyl alcohol Biotechnol Lett 23
61-65
70 Pepi M amp Baldi F 1992 Modulation of chromium(VI) toxicity by organic and inorganic sulfur species in yeasts from industrial wastes BioMetals 5 179-185
71 Quintana M Curutchet G amp Donati E 2001 Factors affecting chromium(VI) reduction by Thiobacillus ferrooxidans Biochemical Engineering Journal 9 11-15
72 Ramiacuterez-Ramiacuterez R Calvo-Meacutendez C Aacutevila-Rodriacuteguez M Lappe P Ulloa M
Vaacutezquez-Juaacuterez R amp Gutieacuterrez-Corona JF 2004 Cr(VI) reduction in a chromate-
resistant strain of Candida maltosa isolated from the leather industry Antonie van Leeuwenhoek 85 63-68
73 Rege MA Petersen JN Johnstone DL Turick CE Yonge DR amp Apel WA
1997 Bacterial reduction of hexavalent chromium by Enterobacter cloacae strain
HO1 grown on sucrose Biotechnol Lett 19 (7) 691-694
74 Roukas T 1993 Ethanol production from nonsterilized carob pod extract by free and immobilized Saccharomyces cerevisiae cells using fed-batch culture
Biotechnol Bioeng 43 189-194 75 Ruiacutez MA 2000 Recuperacioacuten de metales pesados de soluciones diluidas por
biosorcioacuten con bacteria En Medrano RH Galan WL Biotecnologiacutea de Minerales CONACYT Meacutexico pp 235-262
76 Saxena D Levin R amp Firer MA 2000 Removal of chromate from industrial
effluent by a new isolate of Staphylococcus cohnii Wat Sci Technol 42 (1-2)
93-98
77 Secretariacutea de Comercio y Fomento Industrial NMX-AA-74-1981 Anaacutelisis de Agua ndash Determinacioacuten del Ioacuten Sulfato
111
78 Secretariacutea de Economiacutea NMX-AA-051-SCFI-2001 Anaacutelisis de Agua -
Determinacioacuten de Metales por Absorcioacuten Atoacutemica en Aguas Naturales Potables Residuales y Residuales Tratadas - Meacutetodo de Prueba
79 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NMX-AA-044-SCFI-
2001 Anaacutelisis de Aguas - Determinacioacuten de Cromo Hexavalente en Aguas Naturales Potables Residuales y Residuales Tratadas - Meacutetodo de Prueba En Diario Oficial de la Federacioacuten 1 de agosto 2001
80 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996
Liacutemites Maacuteximos Permisibles de Contaminantes en las Descargas de Aguas Residuales en Aguas y Bienes Nacionales En Diario Oficial de la Federacioacuten 6 de enero 1997
81 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996
Liacutemites Maacuteximos Permisibles de Contaminantes en las Descargas de Aguas Residuales a los Sistemas de Alcantarillado Urbano o Municipal En Diario Oficial de la Federacioacuten 3 de junio 1998
82 Secretariacutea de Salud Proyecto de Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-
NOM-127-SSA1-1994 Salud Ambiental Agua para Uso y Consumo Humano - Liacutemites Permisibles de Calidad y Tratamientos a que debe Someterse el Agua para su Potabilizacioacuten En Diario Oficial de la Federacioacuten 20 de Octubre 2000
83 Shakoori AR Makhdoom M amp Haq RU 2000 Hexavalent chromium reduction
by a dichromate-resistant gram-positive bacterium isolated from effluents of tanneries Appl Microbiol amp Biotechnol 53 (3) 348-351
84 Shen H and Wang YT 1994 Biological reduction of chromium by E coli Journal of Environmental Engineering 120 560-572
85 Shen H amp Wang Y 1995 Hexavalent chromium removal in two-stage bioreactor
system J Environ Eng 121 (11) 798-804
86 Smith WA Apel WA Petersen JN amp Peyton BM 2002 Effect of carbon and
energy source on bacterial chromate reduction Bioremediation J 6 (3) 205-215
87 Smith WL amp Gadd GM 2000 Reduction and precipitation of chromate by mixed culture sulphate-reducing biofilms J Appl Microbiol 88 983-991
88 Song Z Williams CJ amp Edyvean RGJ 2004 Treatment of tannery wastewater by chemical coagulation Desalination 164 (3) 249-259
89 Srinath T Verma T Ramteke PW amp Garg SK 2002 Chromium (VI)
biosorption and bioaccumulation by chromate resistant bacteria Chemosphere 48
(4) 427-435
90 Stanbury PF amp Whitaker A ―Principles of Fermentation Technology Pergamon Press Ltd Great Britain 1984 First edition Pp 11-24
112
91 Stasinakis AS Mamais D Thomaidis NS amp Lekkas TD 2002 Effect of
chromium (VI) on bacterial kinetics of heterotrophic biomass of activated sludge Water Res 36 3341-3349
92 Stasinakis AS Thomaidis NS Mamais D Karivali M amp Lekkas TD 2003
Chromium species behaviour in the activated sludge process Chemosphere 52 1059-1067
93 Stephen JR amp Macnaughton SJ 1999 Developments in terrestrial bacterial remediation of metals Current Opinion in Biotechnology 10 230-233
94 Su C amp Ludwig RD 2005 Treatment of hexavalent chromium in chromite ore
processing solid waste using a mixed reductant solution of ferrous sulfate and
sodium dithionite Environ Sci Technol 39 (16) 6208-6216
95 Thacker U Parikh R Shouche Y amp Madamwar D 2006 Hexavalent chromium reduction by Providencia sp Process Biochem 41 1332-1337
96 Thacker U amp Madamwar D 2005 Reduction of toxic chromium and partial localization of chromium reductase activity in bacterial isolate DM1 Would Journal
of Microbiology amp Biotechnology 21 891-899 97 Tung HL Chiou SY Tu CC amp Wu WT 1997 An airlift reactor with double
net draft tubes and its application in fermentation Bioprocess Eng 171-5
98 Turick CE Apel WA amp Carmiol NS 1996 Isolation of hexavalent chromium-reducing anaerobes from hexavalent-chromium-contaminated and noncontaminated environments Applied Microbiol Biotechnol 44 683-688
99 Viamajala S Peyton BM Sani RK Apel WA amp Petersen JN 2004 Toxic
effects of chromium(VI) on anaerobic and aerobic growth of Shewanella oneidensis MR-1 Biotechnol Prog 20 87-95
100 Volesky B amp Vieira RHSF 2000 Biosorption a solution to pollution Internat Microbiol 3 17-24
101 Wang DIC Cooney CL Demain AL Dunnill P Humphrey AE amp Lilly MD
1979 ―Fermentation and Enzyme Technology John Wiley amp Sons Inc USA Pp 98-115
102 Wang YT and Shen H 1997 Modelling Cr(VI) reduction by pure bacterial cultures Water Research 31 727-732
103 Wang Y amp Xiao C 1995 Factors affecting hexavalent chromium reduction in pure
cultures of bacteria Water Res 29 (11) 2467-2474
104 Wang Y 2000 Microbial reduction of chromate En Lovley DR (Ed)
Environmental Microbe-Metal Interactions ASM Press Washington DC USA pp 225-235
113
105 Wilkin RT Su C Ford RG amp Paul CJ 2005 Chromium-removal processes
during groundwater remediation by a zerovalent iron permeable reactive barrier Environ Sci Technol 39 (12) 4599-4605
106 Worthington Biochemical Corporation 1972 Worthington Enzyme Manual
Enzymes Enzyme Reagents and Related Biochemicals Freehold New Jersey USA
107 Wu J amp Wu WT 1991 Fed-batch culture of Saccharomyces cerevisiae in an airlift reactor with net draft tube Biotechnol Prog 7 230-233
108 Wu WT amp Wu JY 1990 Airlift reactor with net draught tube J Ferm Bioeng
70 359-361
109 Wu WT Wu JY amp Jong JZ 1992 Mass transfer in an airlift reactor with a net
draft tube Biotechnol Prog 8 465-468 110 Zakaria ZA Zakaria Z Surif S amp Ahmad WA 2006 Hexavalent chromium
reduction by Acinetobacter haemolyticus isolated from heavy-metal contaminated wastewater J Hazard Mater 146 30-38
111 Zuacutentildeiga M 2005 Aislamiento de microorganismos con capacidad para remover
cromo hexavalente del agua Tesis de Licenciatura Escuela Nacional de Ciencias
Bioloacutegicas IPN Meacutexico
Referencias electroacutenicas
httpepagov httpesepagovtechpubs412304html
httpfaiunneeduarbiologiamicroindcultivo20y20biorreactoreshtm httpmineralserusgsgovmineralspubscommoditychromium180494pdf
httpuserpagesumbcedu gferre1bmcohtml
httpuserpagesumbcedu gferre1fedbatchhtml httpwwgemesmaterialdocument httpwwwatsdrcdcgovfacts7 html
httpwwwchemicalelementscomelementscrhtml httpwwwepagoviris
wwwclu-inorgdownloadstudentpapersbio_of_metals_paperpdf
114
7 Impacto
En este trabajo se identificaron algunas variables ambientales que afectan la
biorreduccioacuten de cromo hexavalente [Cr(VI)] La informacioacuten obtenida podriacutea ser de
utilidad para mejorar los procesos de reduccioacuten del metal asiacute como para disminuir los
tiempos y costos del tratamiento de los efluentes industriales contaminados con Cr(VI)
Los resultaron mostraron que el sulfato afecta la tolerancia de Candida sp al Cr(VI) y a
su capacidad para reducirlo Fue evidente que a medida que se incrementoacute la
concentracioacuten de sulfato aumentoacute el crecimiento de la levadura la eficiencia global y la
velocidad global de reduccioacuten de Cr(VI) Asimismo se encontroacute que la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp depende de la densidad celular de los cultivos de manera tal que
a mayor cantidad de biomasa producida mayor es la reduccioacuten del metal Aun cuando la
cepa de Candida sp es sensible a los efectos toacutexicos del Cr(VI) en ausencia del sulfato
esta levadura posee una notable capacidad para reducir muy altas concentraciones de
Cr(VI) en presencia de sulfato por lo que podriacutea ser potencialmente uacutetil para el
tratamiento de aguas industriales altaminadas con Cr(VI) y con iones sulfato
Hasta donde sabemos este es el primer trabajo en el que se demuestra que el sulfato
desempentildea un papel impotante tanto en la tolerancia al Cr(VI) como en la reduccioacuten
aeroacutebica del mismo en microorganismos Estos descubrimientos podriacutean tener
implicaciones importantes en el tratamiento de aguas residuales contaminadas con
Cr(VI)
Ademaacutes se encontroacute que los contactores gas-liacutequido son adecuados para la reduccioacuten
aeroacutebica de Cr(VI) por Candida sp Esto uacuteltimo es de vital importancia porque seriacutea
posible disminuir significativamente los costos de tratamiento ya que estos biorreactores
se caracterizan por su baja economiacutea de aireacioacuten Las velocidades volumeacutetrica y
especiacutefica asiacute como la capacidad de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por Candida sp en el
reactor airlift con tubo conceacutentrico fueron superiores a las obtenidas en matraz y eacutesto
podriacutea deberse a que en el reactor airlift la levadura tuvo una mayor cantidad de oxiacutegeno
disponible para su crecimiento y a que el mayor nuacutemero de ceacutelulas producidas fue la
responsable de reducir maacutes eficazmente el Cr(VI) presente en el medio de cultivo
115
Las caracteriacutesticas mostradas por Candida sp en el dispositivo airlift indican que este
tipo de reactor neumaacutetico es adecuado para el crecimiento y la reduccioacuten aeroacutebica del
Cr(VI) por la levadura Asimismo los paraacutemetros cineacuteticos del proceso de reduccioacuten de
Cr(VI) catalizado por Candida sp son superiores a los reportados para otros
microorganismos lo que sugiere que esta cepa de levadura tiene potencial biotecnoloacutegico
para ser utilizada en procesos de remediacioacuten de aguas residuales industriales
contaminadas con Cr(VI)
De los diferentes sistemas de reaccioacuten ensayados (cultivos por lote lote repetido
continuo de una etapa lote alimentado y lote alimentado repetido) el cultivo por lote es
el maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
Otra de las contribuciones de este trabajo fueron la formacioacuten de recursos humanos
tanto a nivel licenciatura como de posgrado Uno de los estudiantes de licenciatura ya
sustentoacute su examen profesional y la tesis de Maestriacutea de otra estudiante ya fue revisada
y aprobada por los sinodales por lo que el examen para obtener el grado se realizaraacute en
poco tiempo Actualmente estaacuten en proceso 1 tesis de licenciatura 2 de maestriacutea y 1 de
doctorado
Entre otros productos del proyecto de investigacioacuten se tienen la publicacioacuten de 2 artiacuteculos
en revistas internacionales incluidas en la base de datos del Journal of Citation Reports
del Institute for Scientific Information (ISI) la publicacioacuten de 2 artiacuteculos en extenso en
las memorias de Congresos Internacionales y la presentacioacuten de varios trabajos en
eventos acadeacutemicos nacionales e internacionales
4
transicioacuten de color gris que ocupa el nuacutemero 24 en la Tabla Perioacutedica y tiene un peso
atoacutemico de 52
Fue descubierto en 1797 por Louis Vauquelin y se utilizoacute primeramente como pigmento
Su nombre proviene de la palabra griega ―chrocircma que significa color como referencia a
los diferentes colores que presentan sus compuestos Su punto de fusioacuten es de 1857 degC y
el de ebullicioacuten es de 2672 degC Su densidad es de 719 gcm3 (Barnhart 1997
httpwwwchemicalelementscomelementscrhtml)
El cromo existe en varios estados de oxidacioacuten del -2 al +6 siendo los maacutes estables en
el medio ambiente natural el cromo metaacutelico [Cro o Cr(0)] el trivalente [Cr3+ o Cr(III)] y
el hexavalente [Cr6+ o Cr(VI)] los cuales presentan propiedades fisicoquiacutemicas diferentes
(Jianlong y col 2004 Viamajala y col 2004)
El cromo tiene una alta resistencia a la corrosioacuten al desgaste por friccioacuten y al impacto
asiacute como una gran dureza a alta temperatura (Barnhart 1997) entre otras propiedades
que lo hacen muy atractivo para su uso en diversos sectores industriales tales como en
la galvanoplastia en curtiduriacuteas de piel en la fabricacioacuten de tintes y pigmentos para
pinturas y textiles en la produccioacuten de acero inoxidable de productos refractarios de
inhibidores de la corrosioacuten de tintas para maacutequinas de copiado de conservadores de la
madera asiacute como para el pulido de metales (Smith y Gadd 2000
httpwwwatsdrcdcgovfacts7 html)
La principal fuente de cromo es el mineral conocido como cromita o ferrocromo
(FeCr2O4) Para el antildeo 2003 se reportoacute una produccioacuten mundial de cromita de 15500
5
millones de toneladas cuacutebicas de las cuales el 912 fue utilizada por la industria
metaluacutergica el 52 por la industria quiacutemica el 28 por la industria de la fundicioacuten y el
08 por la industria refractaria
(httpmineralserusgsgovmineralspubscommoditychromium180494pdf) Los
principales paiacuteses productores de cromita son Sudaacutefrica Kazakhstan India Zimbawe
Finlandia Brasil y Turquiacutea
(httpmineralserusqsgovmineralspubscommoditychromium180494pdf)
El cromo metaacutelico [Cr(0)] no se encuentra en forma natural en el medio ambiente sino
que es generado por procesos industriales Se le usa principalmente en la produccioacuten de
acero y de otras aleaciones metaacutelicas (httpwwwatsdrcdcgovfacts7html)
El cromo trivalente se encuentra en la naturaleza en minerales por ejemplo como
cromato de fierro (FeCr2O4) Este estado de oxidacioacuten del cromo forma precipitados de
oacutexidos hidroacutexidos o sulfatos y por consiguiente es menos moacutevil que la forma
hexavalente En el suelo se le encuentra unido principalmente a la materia orgaacutenica
(Jianlong y col 2004 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004 Cervantes y col 2001)
El cromo trivalente es un nutriente esencial tanto para los seres humanos como para los
animales ya que tiene un papel importante en el metabolismo de la glucosa de liacutepidos y
de proteiacutenas Asimismo se considera que potencia el reconocimiento de la insulina por
las ceacutelulas por lo que podriacutea tener aplicaciones para el tratamiento de la diabetes
(Garbisu y col 1998 Wang 2000 Lloyd 2003 Ksheminska y col 2005)
6
La FDA (Food and Drug Administration) ha propuesto un consumo diario (Reference Daily
Intake) de cromo de 120 gd en adultos (httpwwwepagoviris) Algunas fuentes de
cromo son el broacutecoli la levadura de cerveza el hiacutegado quesos granos integrales y
cereales (Guertin y col 2005)
No es comuacuten encontrar cromo hexavalente en forma natural en el medio ambiente y
cuando se le encuentra generalmente es como cromato de plomo PbCrO4
(httpwwwatsdrcdcgovfacts7html) Su presencia en el ambiente se debe
principalmente a las actividades realizadas por el hombre (wwwclu-
inorgdownloadstudentpapersbio_of_metals_paperpdf) En soluciones acuosas el
Cr(VI) generalmente se encuentra presente como oxianioacuten cromato [CrO42-] yo
dicromato [Cr2O72-] dependiendo del pH de la solucioacuten
Debido a su naturaleza fuertemente oxidante el cromo hexavalente puede reaccionar
con la materia orgaacutenica o con agentes reductores con lo que se forma cromo trivalente
Esta transformacioacuten ocurre maacutes raacutepidamente en ambientes aacutecidos tales como en suelos
con pH bajo (Cervantes y col 2001 Jianlong y col 2004)
En el aire el cromo hexavalente ocasionalmente reacciona con partiacuteculas de polvo o con
otros contaminantes con lo que se convierte en cromo trivalente En aguas superficiales
ricas en materia orgaacutenica el Cr(VI) exhibe un tiempo de vida corto en ese estado de
oxidacioacuten (httpwwwepagoviris)
7
13 Toxicidad del cromo
La EPA (Environmental Protection Agency) considera al cromo hexavalente - y a sus
derivados - como uno de los diecisiete agentes quiacutemicos de mayor peligrosidad para la
salud puacuteblica y para el medio ambiente (Marsh y McInerney 2001)
Al ser humano el cromo hexavalente le puede provocar dantildeo al rintildeoacuten e hiacutegado asiacute como
alteraciones neuroloacutegicas La inhalacioacuten de cromo hexavalente en niveles mayores a 2
microgm3 puede causar irritacioacuten de las mucosas comezoacuten hemorragias uacutelceras y
perforacioacuten del tabique nasal (httpwwwatsdrcdcgovfacts7html)
Se ha encontrado que algunas personas son extremadamente sensibles al contacto de su
piel con el cromo hexavalente Algunas de las reacciones aleacutergicas detectadas consisten
en el enrojecimiento marcado de la piel e hinchazoacuten
(httpwwwatsdrcdcgovfacts7html Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos
Naturales y Pesca NMX-AA-044-SCFI-2001 httpwwwepagoviris Ksheminska y
col 2005)
La EPA clasifica a los compuestos del cromo hexavalente en el grupo A el cual incluye a
los agentes carcinogeacutenicos para el hombre Ademaacutes el cromo hexavalente tiene efecto
mutageacutenico y teratogeacutenico en animales y humanos (Wang 2000
httpwwwatsdrcdcgovfacts7html Smith y col 2002)
El cromo hexavalente tambieacuten es toacutexico para la mayoriacutea de los microorganismos auacuten a
bajas concentraciones debido a que reduce su actividad enzimaacutetica afecta sus procesos
metaboacutelicos y les produce mutaciones (Wang 2000) Lo anterior tiene gran impacto en
8
los sistemas de tratamiento bioloacutegico de aguas residuales ya que reduce
significativamente la eficiencia de remocioacuten de los contaminantes y la calidad del efluente
(Stasinakis y col 2002 2003)
En las plantas el cromo hexavalente reduce la actividad de las enzimas fotosinteacuteticas y
en general de las proteiacutenas (Morales 2005) ocasiona enfermedades como la clorosis e
interfiere en diversos procesos metaboacutelicos que causan finalmente la muerte de estos
organismos Asimismo se ha demostrado que rompe la unioacuten azuacutecar-fosfato de la
cadena de aacutecido desoxirribonucleico (DNA) y produce una hiper-metilacioacuten de las bases
nitrogenadas lo que ocasiona mutaciones al azar (Labra y col 2004)
Diversos estudios han demostrado que el cromo hexavalente es cien veces maacutes toacutexico
(Garbisu y col 1998) y mil veces maacutes mutageacutenico que el estado trivalente (Wang
2000 Saxena y col 2000 Lloyd 2003)
14 Cantidad de cromo liberado al medio ambiente y legislacioacuten ambiental
Se estima que maacutes de 170000 toneladas de residuos que contienen cromo se descargan
al medio ambiente cada antildeo (Marsh y McInerney 2001) En la tabla 1 se muestran
algunos datos reportados sobre el contenido de cromo en algunos efluentes industriales
asiacute como en aguas superficiales y freaacuteticas Se puede apreciar que la concentracioacuten de
cromo de los efluentes variacutea considerablemente incluso en los del mismo sector
industrial
9
Tabla 1 Concentraciones de cromo total yo Cr(VI) de efluentes industriales y cuerpos
de agua
Fuente Concentracioacuten de cromo total
Concentracioacuten de Cr (VI)
Referencia
Industria galvanizadora ---
5000 mgL
Gaballah y col 1994
Industria galvanizadora (1) Industria galvanizadora (2)
---
---
127 mgL
3700 mgL
Fujie y col 1996
Acuiacutefero Aromas Red Sands (California)
---
6-36 gL
Gonzaacutelez y col 2005
Agua subterraacutenea contaminada (EEUU)
gt 1500 gL
---
Wilkin y col 2005
Riacuteo receptor de efluentes de la industria papelera
20-80 mgL
---
Cervantes y col 2001
Planta de tratamiento de desechos de produccioacuten de
ferrocromita
---
3-57 mgL
(fase disuelta)
Su y Ludwig 2005
Curtiduriacutea de pieles
(Grecia)
2000 ndash 3500
mgL
--- httpesepagovtechpubs41230
4html
Curtiduriacutea de pieles (tanque de sedimentacioacuten)
3500 gmL
40 gmL
Ganguli y Tripathi 1999
Curtiduriacutea de pieles (tanque de descarga)
5000 gmL
3000 gmL
Ganguli y Tripathi 1999
Curtiduriacutea de pieles (India) 200 - 2400 mgL ---
Balasubramanian y Pugalenthi 1999
Curtiduriacutea de pieles (Portugal)
2467 mgL
---
Beleza y col 2001
Efluente tratado de
curtiduriacutea de pieles (India)
---
096 mgL
Srinath y col 2002
Curtiduriacutea de pieles (Egipto)
---
1300-2500
mgL
Hafez y col 2002
Curtiduriacutea de pieles (1) (Pakistaacuten) Curtiduriacutea de pieles (2) (Pakistaacuten)
2877 mgL
220 mgL
---
---
Ali-Awan y col 2003
Curtiduriacutea de pieles 12 mgL --- Song y col 2004
Curtiduriacutea de pieles (Guanajuato Meacutexico)
250 gmL
---
Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004
Curtiduriacutea de pieles (India) 500-1000 mgL
---
Aravindhan y col 2004
Bantildeos de curtido al cromo
en curtiduriacuteas (Leoacuten Guanajuato Meacutexico)
3000 ndash10000 mgL
---
Aacutelvarez y col 2004
10
En Meacutexico no se tienen datos precisos sobre la cantidad y concentracioacuten de cromo total
o hexavalente de los residuos generados por las diversas industrias sin embargo se ha
informado que las industrias del curtido de pieles generan de 250 a 270 toneladas de
Cr2O3 al antildeo (Zuacutentildeiga 2005)
Debido a las grandes cantidades de cromo que se liberan al medio ambiente asiacute como a
los efectos indeseables que este metal ocasiona sobre los seres vivos en muchos paiacuteses
se han establecido Normas Ambientales que pretenden regular la concentracioacuten de cromo
total yo de Cr(VI) de los desechos liacutequidos soacutelidos o gaseosos que se descargan al
medio ambiente
En Meacutexico la Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca ha decretado
normas oficiales que establecen los liacutemites maacuteximos permisibles de contaminantes
incluido el cromo ya sea como cromo total o como cromo hexavalente de las aguas
residuales que se descargan en aguas y bienes nacionales (Secretariacutea de Medio
Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996) (tabla 2) asiacute como en los
sistemas de alcantarillado urbano o municipal (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos
Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996) (tabla 3)
En cuanto al agua para uso y consumo humano la Secretariacutea de Salud ha emitido la
Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-1994 (Secretariacutea de Salud Proyecto de
Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-1994) donde se indica
como liacutemite maacuteximo permisible una concentracioacuten de cromo total de 005 mgL
11
Tabla 2 Liacutemites maacuteximos permisibles de cromo total para las aguas residuales que se descargan en aguas y bienes
nacionales (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996)
Paraacutemetros
( )
Riacuteos Embalses
Naturales y
Artificiales
Aguas Costeras Suelo
(mgL) Uso en
riego
agriacutecola
(A)
Uso
puacuteblico
urbano
(B)
Proteccioacuten
de vida
acuaacutetica
( C )
Uso en
riego
agriacutecola
(B)
Uso
puacuteblico
urbano
( C )
Explotacioacuten
pesquera
navegacioacuten
y otros
usos (A)
Recreacioacuten
(B)
Estuarios
(B)
Uso en
riego
agriacutecola
(A)
Humedales
naturales
(B)
PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD
Cromo 1 15 05 10 05 10 1 15 05 10 05 10 1 15 05 10 05 10 05 10
() Medidos de manera total PD = Promedio diario PM = Promedio mensual (A) (B) y ( C ) Tipo de cuerpo receptor seguacuten la Ley Federal de Derechos
Tabla 3 Liacutemites maacuteximos permisibles de cromo hexavalente para los sistemas de alcantarillado urbano o municipal
(Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996)
Paraacutemetros (mgL) Promedio Mensual Promedio Diario Instantaacuteneo
Cromo hexavalente 05 075 1
12
Por su parte la EPA ha establecido como liacutemite una concentracioacuten de 01 mg de cromo
por litro de agua potable (httpwwwatsdrcdcgovfacts7html)
La Organizacioacuten Mundial para la Salud (OMS) y la Comunidad Econoacutemica Europea (CEE)
establecen una concentracioacuten de 005 mg de cromo totalL como paraacutemetro de calidad
para aguas destinadas a consumo humano (httpwwgemesmaterialdocument)
Algunos valores sentildealados por otras instancias internacionales se muestran en la tabla
4
Tabla 4 Liacutemites permisibles para cromo sentildealados por Directivas Internacionales
sobre agua potable y aguas embotelladas (Zuacutentildeiga 2005)
Paraacutemetro Canadaacute 1 Japoacuten 2 Aguas embotelladas Nivel de
Administracioacuten Federal sobre
Productos Farmaceacuteuticos de EEUU
Cromo
005 mgL
005 mgL
01 mgL
1 Liacutemite establecido por el Ministerio de Salud de Canadaacute
2 Liacutemite establecido por el Ministerio de Salud y Bienestar Social de Japoacuten
15 Meacutetodos para la remocioacuten de cromo de los efluentes industriales
Para disminuir los efectos toacutexicos del metal es conveniente aplicar alguacuten(os)
tratamiento(s) a los efluentes industriales que contienen cromo antes de descargarlos en
los cuerpos de agua o en el suelo asiacute como restaurar los ecosistemas contaminados En
la actualidad estaacuten disponibles varias tecnologiacuteas para estos propoacutesitos (Eccles 1999)
Estas tecnologiacuteas se han empleado para reducir la toxicidad del contaminante [mediante
la transformacioacuten quiacutemica o bioloacutegica del Cr(VI) a Cr(III)] para removerlo de un lugar
para disminuir la extensioacuten de la contaminacioacuten o para contenerlo en un aacuterea en
particular (Guertin y col 2005)
13
151 Procesos convencionales
Los meacutetodos convencionales para la remocioacuten de los metales pesados son de naturaleza
fisicoquiacutemica y pueden ser utilizados en varias etapas del tratamiento de aguas
residuales Los meacutetodos maacutes usuales para la remocioacuten de Cr(VI) de los efluentes
industriales son los siguientes 1) reduccioacuten quiacutemica ndash precipitacioacuten en donde el Cr(VI)
es reducido quiacutemicamente a Cr(III) a pH aacutecido utilizando alguacuten agente reductor (por
ejemplo el bisulfito de sodio) y posteriormente se adiciona cal o alguacuten otro compuesto
alcalino para formar hidroacutexido de cromo (III) el cual es separado por sedimentacioacuten y
2) coagulacioacuten-floculacioacuten En general estos meacutetodos tienen algunas desventajas tales
como 1) son costosos ya que el agente activo no puede ser recuperado para su
posterior reutilizacioacuten 2) algunos reactivos quiacutemicos son sumamente toacutexicos 3) su
selectividad es baja 4) generan lodos quiacutemicos con altas concentraciones de metales los
cuales son difiacuteciles de tratar 5) la remocioacuten de los metales es incompleta principalmente
cuando la concentracioacuten de eacutestos en los efluentes es inferior a 100 mgL y 6) las aguas
residuales resultantes no satisfacen los criterios de calidad establecidos en la legislacioacuten
ambiental (Cantildeizares-Villanueva 2000 Ruiacutez 2000 Saxena y col 2000 Cheung y Gu
2003)
Algunas otras tecnologiacuteas que se utilizan ocasionalmente para la remocioacuten del Cr(VI) son
el intercambio ioacutenico la adsorcioacuten el tratamiento electroquiacutemico la oacutesmosis inversa y la
evaporacioacuten (Garbisu y col 1998 Camargo y col 2003 Kurniawan y col 2006) Las
principales desventajas de estos meacutetodos son los altos costos fijos de operacioacuten y de
mantenimiento por lo que su aplicacioacuten a grandes voluacutemenes de agua o su uso por
pequentildeas y medianas empresas estaacute muy limitado
14
La EPA recomienda los siguientes meacutetodos para la remocioacuten de cromo del agua potable
en caso de que eacutesta exceda el liacutemite permisible para este metal coagulacioacuten-filtracioacuten
intercambio ioacutenico y oacutesmosis inversa (httpepagov)
En Meacutexico en caso de que el agua destinada a uso y consumo humano exceda el liacutemite
permisible de cromo total la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-1994
(Secretariacutea de Salud Proyecto de Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-
127-SSA1-1994) indica como tratamientos a aplicar el intercambio ioacutenico o la oacutesmosis
inversa
152 Procesos biotecnoloacutegicos
En las uacuteltimas dos deacutecadas se han llevado a cabo estudios con el fin de utilizar
microorganismos y plantas para la restauracioacuten de sitios y para el tratamiento de
efluentes industriales contaminados con metales toacutexicos (Stephen y Macnaughton 1999
Lloyd 2003)
En la actualidad se considera que los procesos microbioloacutegicos son la alternativa maacutes
atractiva para remover algunos metales toacutexicos de los sitios y efluentes contaminados
ya que estos procesos son ―amigables con el medio ambiente los subproductos que
generan son usualmente inocuos son muy eficientes en la remocioacuten de los metales
(particularmente cuando las concentraciones de eacutestos son bajas condiciones en las que
algunos procesos fisicoquiacutemicos son muy ineficientes) y son de bajo costo (Cheung y
Gu 2005 Chardin y col 2002 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004)
15
Dentro de los procesos biotecnoloacutegicos propuestos para la remocioacuten de Cr(VI) se
encuentran la biosorcioacuten y la reduccioacuten bioloacutegica en los cuales se han utilizado
principalmente microorganismos (Volesky y Vieira 2000 Fruchter 2002 Cheung y Gu
2003)
En la biosorcioacuten se utilizan ciertos tipos de adsorbentes bioloacutegicos por ejemplo biomasa
microbiana (viva o inactivada en suspensioacuten o inmovilizada) con los que no se requiere
energiacutea metaboacutelica para retener pasivamente al cromo hexavalente mediante procesos
fiacutesicos (adsorcioacuten fiacutesica principalmente por fuerzas de van Der Waals) o quiacutemicos
(quimisorcioacuten) (Cantildeizares-Villanueva 2000 Volesky y Vieira 2000 Aravindhan y col
2004) En algunos casos se ha observado que el metal es transportado activamente al
interior de las ceacutelulas (a expensas de energiacutea metaboacutelica) proceso al que se le denomina
como bioacumulacioacuten
En la biorreduccioacuten o reduccioacuten bioloacutegica el cromo hexavalente es transformado a la
forma trivalente este uacuteltimo puede ser faacutecilmente precipitado en una etapa posterior de
tratamiento ajustando el pH del agua residual a un valor cercano al neutro para
removerlo finalmente por meacutetodos fiacutesicos (Chardin y col 2002 Cheung y Gu 2003) Se
considera que este proceso es una alternativa tecnoloacutegica potencial para el tratamiento
de suelos cuerpos de agua y efluentes industriales contaminados ya que la reduccioacuten
del Cr(VI) disminuye significativamente la toxicidad (100 veces) solubilidad en agua y
movilidad del metal a traveacutes del medio ambiente (Cheung y Gu 2003 Lloyd 2003
Wang 2000)
16
Se han aislado varios microorganismos que pueden reducir el Cr(VI) a Cr(III) ya sea
como cultivos puros (Horitsu y col 1987 Wang 2000 Pattanapipitpaisal y col 2001
Chardin y col 2002 Cheung y Gu 2003 Middleton y col 2003 Morales-Barrera
2005 Pal 1997 Muter y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004 Thacker y col
2006) o como cultivos mixtos (Smith y col 2002 Cheung y Gu 2003) Las fuentes de
aislamiento han sido muy diversas como por ejemplo efluentes de curtiduriacuteas de la
industria metaluacutergica de mantos freaacuteticos de aguas superficiales contaminadas de
sedimentos anoacutexicos en lagos de plantas de tratamiento de aguas residuales entre
otros (Horitsu y col 1987 Fujii y col 1990 Ganguli y Tripathi 1999 Badar y col
2000 Saxena y col 2000 Pattanapipitpaisal y col 2001 Middleton y col 2003
Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004 Zuacutentildeiga 2005 Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
Entre los geacuteneros microbianos que son capaces de reducir Cr(VI) se tienen los
siguientes Achromobacter Aeromonas Agrobacterium Bacillus Desulfovibrio
Escherichia Enterobacter Micrococcus Pseudomonas (Horitsu y col 1987 Wang
2000) Staphylococcus (Saxena y col 2000) Microbacterium (Pattanapipitpaisal y col
2001) Pyrobaculum Streptomyces Deinococcus (Chardin y col 2002)
Desulfomicrobium Desulfotomaculum Pantoea (Cheung y Gu 2003) Shewanella
(Middleton y col 2003) Trichoderma (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
Phanerochaete (Pal 1997) y Candida (Muter y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col
2004)
De los estudios reportados en la literatura acerca de la reduccioacuten microbioloacutegica del
Cr(VI) sobresalen tres hechos 1) Las bacterias han sido los microorganismos maacutes
ampliamente estudiados y es muy escasa la informacioacuten disponible sobre la capacidad de
17
reduccioacuten del metal de las levaduras y de los hongos filamentosos 2) la mayoriacutea de los
microorganismos ensayados soacutelo son capaces de tolerar y reducir muy bajas
concentraciones de Cr(VI) usualmente dentro del intervalo de 0001 a 05 mM esto
uacuteltimo se ha atribuido a los efectos toacutexicos y mutageacutenicos del metal y 3) casi todos los
estudios se han realizado en cultivo por lote
1521 Transporte del cromo al interior de las ceacutelulas
Tanto en organismos procariotes como en muchos eucariotes los oxianiones cromato y
dicromato (fuentes de cromo hexavalente) ingresan principalmente a las ceacutelulas a traveacutes
de las membranas citoplaacutesmicas mediante el sistema de transporte del sulfato (Badar y
col 2000) lo cual se ha atribuido a la similitud en la carga y estructura de estos iones
(Smith y Gadd 2000) Esto fue demostrado primeramente en Salmonella typhimurium y
posteriormente en otras bacterias tales como en Escherichia coli Pseudomonas
fluorescens y Alcaligenes eutrophus Se ha comprobado que esto mismo ocurre en
algunas levaduras tales como en Candida (Muter y col 2001 Cervantes y col 2001)
Sin embargo en general el cromato penetra al interior de las levaduras por medio de un
transportador anioacutenico no especiacutefico (Czakoacute-Veacuter y col 1999 Cervantes y col 2001)
En algunos microorganismos se ha demostrado que el sulfato inhibe competitivamente el
transporte del cromato al interior de las ceacutelulas (Ohtake y col 1987 Pepi y Baldi 1992)
y que esta inhibicioacuten es maacutes marcada en ceacutelulas anaerobias que en aerobias (Zakaria y
col 2006) Tambieacuten se ha reportado el transporte del cromato por la viacutea de los fosfatos
aunque la viacutea del sulfato es la maacutes utilizada (Ohtake y col 1987)
18
El transporte del cromato al interior de las plantas tambieacuten es a traveacutes del sistema del
ioacuten sulfato Ya en el interior de la planta el cromo hexavalente se acumula en diversos
oacuterganos en cantidades diferentes El cromo hexavalente se acumula de 10 a 100 veces
maacutes en las raiacuteces que en los retontildeos o en otros tejidos (Cervantes y col 2001)
En contraste las membranas celulares de los organismos son praacutecticamente
impermeables al cromo trivalente y a sus compuestos (Ksheminska y col 2006)
1522 Mecanismos microbianos de resistencia al Cr(VI) y de reduccioacuten del
Cr(VI)
Una caracteriacutestica importante que deben tener los microorganismos que se van a utilizar
en procesos de tratamiento de efluentes contaminados con cromo hexavalente es que
sean tolerantes (resistentes) a eacuteste Esta propiedad ha sido descrita en bacterias hongos
y levaduras (Horitsu y col 1987 Cervantes y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004)
Entre los mecanismos de resistencia al cromo hexavalente que se han encontrado se
tienen los siguientes
Acumulacioacuten del metal en la superficie o en el interior de las ceacutelulas (Volesky y Vieira
2000 Saxena y col 2000)
Disminucioacuten yo impedimento en el transporte del cromo hexavalente al interior de
las ceacutelulas (Pepi y Baldi 1992)
Excrecioacuten del metal del interior de la ceacutelula al medio circundante (Cervantes y col
2001)
Reacciones de oacutexido-reduccioacuten en las que el cromo hexavalente es reducido a cromo
trivalente el cual es menos toacutexico (Baldi y col 1990 Muter y col 2001)
19
La resistencia al cromo hexavalente puede estar codificada en el genoacuteforo de las
bacterias o en plaacutesmidos Esto uacuteltimo se ha encontrado en Pseudomonas aeruginosa P
fluorescens P putida y en Alcaligenes eutrophus (Baldi y col 1990 Ishibashi y col
1990 Cervantes y col 2001) Sin embargo la tolerancia al metal no implica
necesariamente que los microorganismos seraacuten capaces de removerlo por alguacuten
mecanismo
En el interior de las ceacutelulas bacterianas los iones cromato [CrO42-] pueden ser reducidos
a cromo trivalente por ciertas enzimas (Ishibashi y col 1990 Horitsu y col 1987) En
condiciones de aerobiosis se han identificado las siguientes proteiacutenas que parecen ser las
responsables de la reduccioacuten del Cr(VI) reductasas flavoproteiacutenas enzimas
dependientes de NADH y NAD(P)H (Ishibashi y col 1990) en cambio en condiciones de
anaerobiosis los estudios indican que ciertas hidrogenasas y citocromos son los
responsables (Chardin y col 2003 Cheung y Gu 2007)
El cromo hexavalente tambieacuten puede ser reducido por compuestos quiacutemicos reductores
que son producidos durante el crecimiento de los microorganismos (Desjardin y col
2003) tales como el glutatioacuten y la cisteiacutena los cuales pueden actuar dentro o fuera de
los organismos (Zakaria y col 2006) En organismos superiores se ha identificado al
ascorbato como agente reductor del cromo hexavalente (Ksheminska y col 2006)
Casi no hay informacioacuten sobre el mecanismo responsable de la reduccioacuten del Cr(VI) en
ceacutelulas eucariotas especiacuteficamente en levaduras Con la finalidad de dilucidar dicho
20
mecanismo se han realizado estudios en los que se ha modificado la resistencia de las
levaduras al Cr(VI) o se ha inactivado alguna enzima en particular
En un trabajo llevado a cabo con algunas levaduras no convencionales se encontroacute que
algunas de eacutestas durante su crecimiento excretaron sustancias reductoras asiacute como
sustancias quelantes que formaron complejos con el cromo trivalente que fue generado
durante la transformacioacuten del cromo hexavalente (Ksheminska y col 2006)
1523 Factores que afectan la reduccioacuten bioloacutegica del Cr(VI)
En algunos microorganismos se ha estudiado el efecto que tienen las variables
ambientales tales como condiciones de aerobiosis yo de anaerobiosis donadores y
aceptores finales de electrones concentracioacuten de cromo hexavalente y potencial de
oacutexido-reduccioacuten entre algunas otras sobre la reduccioacuten del metal (Shen y Wang 1995
Shakoori y col 2000 Wang 2000 Smith y col 2002 Wang y Xiao 1995 Fujii y col
1990 Muter y col 2001 Smith y Gadd 2000 Lloyd 2003 Jianlong y col 2004
Viamajala y col 2004)
La reduccioacuten del Cr(VI) puede realizarse en ambiente aerobio yo anaerobio En
organismos aerobios y anaerobios facultativos se ha investigado el efecto del oxiacutegeno
disuelto en el medio sobre la reduccioacuten del metal (Wang 2000) Se ha encontrado que
la sensibilidad del proceso de reduccioacuten del Cr(VI) a la tensioacuten de oxiacutegeno es diferente
para cada microorganismo En cultivos de Enterobacter cloacae HO1 concentraciones
iniciales de oxiacutegeno mayores a 45 ppm inhibieron fuertemente la reduccioacuten del Cr(VI)
(Komori y col 1989) mientras que la reduccioacuten del metal fue maacutes lenta en condiciones
21
de anaerobiosis que en aerobiosis en el caso de Thiobacillus ferrooxidans (QuiIntana y
col 2001)
Asimismo se ha investigado el efecto de algunos iones sobre la reduccioacuten bioloacutegica del
Cr(VI) Con respecto al sulfato [SO42-] existe una analogiacutea estructural y de carga entre
este anioacuten [SO42-] y el ioacuten cromato [CrO4
2-] por lo que puede establecerse una
competencia entre ellos por los transportadores de sulfato existentes en las ceacutelulas
influyendo asiacute en la reduccioacuten del cromo hexavalente (Smith y Gadd 2000)
En cultivos aerobios no se ha reportado inhibicioacuten por sulfato en la reduccioacuten del cromo
hexavalente (Wang y Xiao 1995 Ishibashi y col 1990 Wang 2000) En contraste se
ha informado que en cultivos anaerobios el sulfato afecta la reduccioacuten del Cr(VI) debido
a que este anioacuten compite con el cromato como aceptor final de electrones (Garbisu y
col 1998)
Por otro lado en un estudio realizado con varios geacuteneros de levadura (Pichia Candida
Debaryomyces Saccharomyces Schwanniomyces Cryptococcus Hansenula) que tienen
capacidad para acumular cromo se encontroacute que el sulfato afectoacute la tolerancia de las
levaduras al Cr(VI) siendo mayor o menor el efecto en funcioacuten de la levadura en estudio
(Kaszycki y col 2003)
Otros iones que se han investigado son el Mg2+ Mn2+ Ca2+ y el Fe En cultivos con
ceacutelulas pasivas (resting cells) de Agrobacterium radiobacter se encontroacute que debe
controlarse principalmente la cantidad de fierro para incrementar la capacidad de
reduccioacuten del microorganismo (Llovera y col 1993)
22
Los donadores de electrones que se han utilizado principalmente en los estudios de
reduccioacuten del Cr(VI) son compuestos alifaacuteticos y aromaacuteticos carbohidratos de bajo peso
molecular aminoaacutecidos y aacutecidos orgaacutenicos (Wang y Xiao 1995 Wang 2000 Smith y
col 2002 Ksheminska y col 2006) El descubrimiento de microorganismos que son
capaces de reducir el cromo hexavalente utilizando una amplia variedad de fuentes de
carbono y energiacutea favorece su uso en procesos de remediacioacuten in situ (Smith y col
2002)
Para la reduccioacuten del cromo hexavalente es conveniente conocer el pH y la temperatura
oacuteptimos para el crecimiento de los microorganismos (Wang 2000 Shakoori y col 2000
Camargo y col 2002 Faisal y Hasnain 2004) En cultivos de Streptomyces griseus se
estudioacute la reduccioacuten del Cr(VI) en el intervalo de valores de pH de 4 a 8 y de
temperatura de 28 a 50 degC obtenieacutendose la mayor reduccioacuten a un pH de 6-7 y a una
temperatura de 28 degC (Laxman y More 2002)
En cultivos de Ochrobactrum sp se trabajoacute en el intervalo de temperatura de 30 a 45 degC
y de pH de 6 a 8 obtenieacutendose la mayor reduccioacuten del Cr(VI) y el crecimiento celular
maacutes alto a 35 degC y a un pH de 7 (Thacker y Madamwar 2005) En estudios realizados
con Escherichia coli ATCC 33456 se ensayoacute la reduccioacuten del Cr(VI) en el intervalo de
valores de pH de 3-8 y de temperatura de 40-60 degC encontraacutendose que el pH y la
temperatura de incubacioacuten oacuteptimos fueron de 7 y 37 degC respectivamente (Bae y col
2000)
Se ha observado que la concentracioacuten inicial de Cr(VI) influye en la velocidad de
reduccioacuten del metal (Wang 2000) La velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) exhibida por los
23
cultivos de Bacillus sp Pseudomonas fluorescens LB300 (Wang y Xiao 1995)
Ochrobactrum sp (Thacker y Madamwar 2005) y de Candida sp LBM2 (Juvera-Espinosa
y col 2006) se incrementoacute conforme aumentoacute la concentracioacuten inicial de Cr(VI) En
contraste la velocidad de reduccioacuten de Bacillus sp Arthrobacter sp (Megharaj y col
2003) y de Trichoderma viride (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006) disminuyoacute al
incrementar la concentracioacuten inicial de cromo hexavalente
Para obtener una reduccioacuten importante del Cr(VI) se requieren altas concentraciones de
biomasa (Wang 2000) La concentracioacuten inicial de biomasa tiene efecto sobre la
velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) de Bacillus sp y Pseudomonas fluorescens LB300 ya
que eacutesta aumentoacute al haber mayor cantidad de biomasa inicial (Wang y Xiao 1995) Este
mismo efecto se observoacute en cultivos de una cepa bacteriana gram positiva a la que se le
denominoacute como cepa ATCC 700729 (Shakoori y col 2000)
El potencial redox se ha medido en algunos estudios realizados con diferentes
microorganismos y condiciones de cultivo para determinar su efecto sobre la reduccioacuten
del Cr(VI) (Komori y col 1989 Turick y col 1996 McLean y Beveridge 2001) sin
embargo no se ha reportado un intervalo oacuteptimo de potencial redox para llevar a cabo la
reduccioacuten del Cr(VI) a su forma menos toacutexica (Wang 2000)
En algunos estudios se ha evaluado la influencia de algunos metales (Mn Ni Zn Pb Cu
Co As Se y Hg) sobre la reduccioacuten del Cr(VI) ya que las cepas microbianas que sean
resistentes a uno o varios metales y que sean capaces de reducir el Cr(VI) seriacutean de gran
utilidad en la biorremediacioacuten de efluentes industriales (Faisal y Hasnain 2004 Cheung
y Gu 2005 Thacker y col 2006) En estudios con Escherichia coli ATCC 33456 se
24
investigoacute el efecto de varios iones (Hg2+ Ag2+ Mn2+ Zn2+ Pb2+ Cd2+ Ca2+ y Mg2+) que
pueden estar presentes junto con el Cr(VI) en efluentes industriales Con el magnesio
se observoacute un ligero aumento en la actividad reductora del microorganismo mientras
que con el mercurio se inhibioacute por completo su capacidad de reduccioacuten (Bae y col
2000)
En el caso particular de microorganismos filamentosos los esfuerzos de corte pueden
causar dantildeo fiacutesico a las ceacutelulas y como consecuencia afectar su capacidad de reduccioacuten
de Cr(VI) En cultivos de Trichoderma viride realizados en matraz y en un reactor
agitado mecaacutenicamente con un impulsor se observoacute que los micelios eran de menor
tamantildeo cuando el hongo se cultivaba en el reactor Asimismo el incremento celular y la
eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidos en matraz fueron superiores a los alcanzados
en el reactor agitado con un impulsor Estos resultados sugirieron que las fuerzas de
cizalla creadas por el impulsor fragmentan el micelio y afectan la viabilidad celular y la
capacidad de reduccioacuten del microorganismo (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
16 Sistemas de reaccioacuten
En la mayoriacutea de los estudios sobre reduccioacuten de Cr(VI) el sistema de reaccioacuten que maacutes
se ha empleado es el cultivo por lote Este sistema es ampliamente utilizado en procesos
biotecnoloacutegicos para la produccioacuten de biomasa y de metabolitos de intereacutes industrial La
duracioacuten de este tipo de cultivo depende del tamantildeo del inoacuteculo de las condiciones
ambientales como el pH los componentes del medio de cultivo y la temperatura
Aunque su operacioacuten es sencilla ofrece pocas opciones de control de las variables
intensivas de intereacutes (concentracioacuten de biomasa sustrato producto) en comparacioacuten
con otros sistemas de reaccioacuten
25
(httpfaiunneeduarbiologiamicroindcultivo20y20biorreactoreshtm) Asimismo
despueacutes de un cultivo por lote se requiere de un periodo para la descarga limpieza y
esterilizacioacuten del equipo asiacute como para el arranque de un nuevo cultivo por lote lo que
disminuye la productividad global del proceso (Wang y col 1979)
Pocos son los estudios relacionados con la reduccioacuten del Cr(VI) en los que se ha
trabajado con otros sistemas de reaccioacuten tales como con el cultivo continuo (DeLeo y
Ehrlich 1994 Bhide y col 1996 Chirwa y Wang 1997 Bae y col 2000) y el cultivo
por lote alimentado o fed-batch (Fujii y col 1990 Fujie y col 1996)
El cultivo continuo permite alcanzar un estado estacionario independiente del tiempo en
el que los microorganismos presentan un crecimiento consumo de sustrato y produccioacuten
constantes por lo que es posible obtener una alta productividad o velocidad volumeacutetrica
(httpuserpagesumbcedu gferre1bmcohtml) En este sistema es posible controlar
la cantidad de biomasa utilizando un uacutenico nutriente limitante del crecimiento (Wang y
col 1979)
A pesar de que el cultivo continuo tiene la desventaja de ser susceptible de contaminarse
debido a los periodos prolongados de operacioacuten (Stanbury 1984) en estudios con Cr(VI)
se minimizariacutea lo anterior ya que este estado de oxidacioacuten del cromo es altamente toacutexico
para la mayoriacutea de los microorganismos auacuten a bajas concentraciones
El cultivo por lote alimentado se utiliza industrialmente para la produccioacuten de varios
productos bioloacutegicos de intereacutes (enzimas antibioacuteticos vitaminas aminoaacutecidos entre
otros) El sistema es uacutetil para obtener una alta concentracioacuten de metabolitos asociados
26
al crecimiento ya que es posible alcanzar una alta concentracioacuten de biomasa aunque
tambieacuten se emplea para la produccioacuten de compuestos no asociados al crecimiento como
por ejemplo de algunos antibioacuteticos Su uso tambieacuten se recomienda cuando se trabaja
con compuestos toacutexicos o de muy baja solubilidad y no requiere mayor equipo que el
utilizado en un cultivo por lote (httpuserpagesumbcedu gferre1fedbatchhtml)
Otras ventajas de este sistema son 1) los tiempos totales del proceso fermentativo son
menores y no requiere de un nuevo inoacuteculo cada vez que se repite el ciclo en
comparacioacuten con un cultivo por lote y 2) menor riesgo de contaminacioacuten que el cultivo
continuo (Roukas 1993)
27
2 OBJETIVOS
21 Objetivos generales
1) Determinar el efecto del ioacuten sulfato sobre el crecimiento celular consumo de glucosa y
reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
2) Realizar el estudio cineacutetico del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de
Cr(VI) de Candida sp en sistemas por lote y lote repetido en un reactor airlift
3) Seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten del Cr(VI) por
Candida sp
22 Objetivos especiacuteficos
a) Determinar el efecto de la concentracioacuten de sulfato de amonio sobre el crecimiento
celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
b) Evaluar el crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote y lote repetido
c) Realizar el estudio cineacutetico del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa
d) Evaluar el crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote alimentado repetido
e) Seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes conveniente para la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp
28
3 MATERIAL Y MEacuteTODOS
31 Microorganismo
Para el desarrollo del presente trabajo se utilizoacute una levadura que se aisloacute a partir del
agua residual de una industria curtidora de pieles que se encuentra ubicada en la Ciudad
de Leoacuten Guanajuato Mediante teacutecnicas morfoloacutegicas y bioquiacutemicas que fueron
realizadas en el Laboratorio de Micologiacutea de la Facultad de Medicina de la UNAM asiacute
como por teacutecnicas de biologiacutea molecular que fueron llevadas a cabo en el Laboratorio de
Microbiologiacutea General de la Escuela Nacional de Ciencias Bioloacutegicas se determinoacute que la
levadura pertenece al geacutenero Candida La amplificacioacuten y secuenciacioacuten del dominio
D1D2 del gen 26S rDNA de la levadura aislada reveloacute que estaacute relacionada con Candida
petrohuensis (GenBank accession number U45819) Candida acudensis (GenBank
accession number U45810) y Candida drimydis (GenBank accession number U45815)
con un nivel de confidencia del 896 La baja similitud de las secuencias parciales
conocidas del gen 26S rDNA y la de la cepa de levadura empleada en este trabajo podriacutea
sugerir que es una cepa no identificada no registrada en el GenBank por lo que se le
denominoacute como Candida sp La relacioacuten filogeneacutetica de la cepa de Candida usada en este
estudio y la de otras especies de levadura se muestra en la figura 1
29
Figura 1 Relaciones filogeneacuteticas de la levadura
AJ508572Cmucifera
AB041003Candida
AB041006Cmucifera
AB041005Stephanoascus
U45822Cchiropterorum
U40103Arxula
U40094Arxula
AY283605Sympodiomyces
AF017247Trichomonascus
U40110Blastobotrys
AY442294Sympodiomyces
U40096Sympodiomyces
AY559042Cmokoenaii
FGSFEP
U45819Cpetrohuensis
U45810Cancudensis
U45815Cdrimydis
U45806Cbondarzewiae
U45816Ctepae
U45812Candida
U45812Cantillancae
U45811Csantjacobensis
U76531Stephanoascus
AB196536Stephanoascus
U70245Cedax
AF017236Cbertae
U45835Cvaldiviana
AY618511Cnovakii
U45807Ccastrensis
U45826Cpaludigena
AF294910Cbituminiphila
U45829Pichia
U84241Zygozyma
U76350Myxozyma
U76527Lipomyces
U45804Debaryomyces
U75524Pichia
U68552Saccharomyces
AY545582Naumovia
AY007888Saccharomyces 100 100
43 100
100
100
43 100
100
72
100
86
95
95
100
91
58 69
99
98
84
92
60
63
54
40
56
37
49
21
39
61
16
002
30
32 Propagacioacuten del inoacuteculo
La composicioacuten quiacutemica del medio de cultivo basal que se utilizoacute en este trabajo para la
propagacioacuten del inoacuteculo y para los experimentos de remocioacuten de Cr(VI) en diferentes
sistemas de reaccioacuten los cuales fueron realizados en un reactor neumaacutetico se muestra
en la tabla 5
Tabla 5 Composicioacuten quiacutemica del medio de cultivo
Compuesto Concentracioacuten
(gL)
Glucosa 100
(NH4)2SO4 30
KH2PO4 10
MgSO4 7H2O 03
KCl 01
Extracto de levadura 01
CaCl2 005
FeCl3 0001
Para los experimentos en los que se determinoacute el efecto del sulfato sobre la tolerancia de
Candida sp al Cr(VI) y la reduccioacuten del mismo el inoacuteculo se propagoacute en el mismo medio
de cultivo pero el (NH4)2SO4 se reemplazoacute por NH4Cl (243 gL) y el MgSO47H2O por
MgCl26H2O (0247 gL)
31
El pH inicial de los medios de cultivo fue de aproximadamente 60 A matraces
Erlenmeyer de 1000 mL que conteniacutean 200 mL de medio de cultivo se les adicionoacute una
asada de Candida sp y posteriormente se incuboacute con agitacioacuten constante a 28-30 ordmC
durante 42 h A continuacioacuten la biomasa se separoacute por centrifugacioacuten a 1500 rpm a
4 degC durante 15 min bajo condiciones de asepsia El paquete celular resultante se lavoacute
dos veces con agua destilada esteacuteril para eliminar los componentes del medio de cultivo
y los residuos celulares El paquete celular se resuspendioacute en un pequentildeo volumen de
agua destilada esteacuteril y se homogeneizoacute La suspensioacuten celular resultante se utilizoacute como
inoacuteculo para los experimentos realizados en este trabajo
Para la conservacioacuten de la levadura se usaron viales con medio inclinado de YPG
(glucosa 2 peptona de caseiacutena 1 extracto de levadura 1 y agar bacterioloacutegico
2) los cuales se mantuvieron en refrigeracioacuten a 4 degC Las resiembras se realizaron
cada dos meses
33 Reactores airlift
Se utilizoacute un contactor gas-liacutequido (reactor agitado neumaacuteticamente) del tipo airlift con
tubo conceacutentrico (figuras 2a y 2b) con un volumen total de 52 litros y un posible
volumen de operacioacuten de 42 litros para realizar los estudios de remocioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en sistemas por lote lote repetido lote alimentado y lote alimentado
repetido El reactor estaacute hecho de vidrio Pyrex y consta de una base columna y una
tapa Entre la base y la columna asiacute como entre la columna y la tapa se colocaron
empaques de neopreno para evitar el contacto vidrio-vidrio asiacute como para evitar fugas
de aire yo de medio de cultivo Las secciones se unieron mediante bridas de Nylamid La
32
base del reactor tiene un difusor del tipo placa plana de vidrio poroso para el suministro
de aire
33
Oliva para
toma de muestra
Aire
Tubo conceacutentrico (liso con
perforaciones de
malla)
Filtro de aire
Venteo
Difusor de vidrio poroso(poro fino)
Difusor de vidrio
poroso (poro fino)
Aire
50deg
4
65
3 m
m
77 mm
11
5
mm
128 mm
88 mm
15
mm
70 mm
4
50
3 m
m
Figuras 2a y 2b Reactor del tipo airlift con tubo conceacutentrico
34
En el interior del reactor se colocoacute un tubo conceacutentrico liso (sin perforaciones) de vidrio
Pyrex un tubo conceacutentrico de vidrio Pyrex con perforaciones circulares (4 mm de
diaacutemetro) o un tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable No 316 (grado
alimentario nuacutemero de malla = 20 abertura = 3344 mm) los cuales tienen la misma
longitud y diaacutemetro El tipo de tubo que se utilizoacute para los experimentos de reduccioacuten
del Cr(VI) dependioacute del sistema de reaccioacuten que se ensayoacute el tubo conceacutentrico liso se
utilizoacute para llevar a cabo experimentos en cultivos por lote y lote repetido el tubo
conceacutentrico con perforaciones se empleoacute para realizar cultivos por lote lote alimentado y
lote alimentado repetido y el tubo de malla metaacutelica se usoacute para cultivos por lote
Para el cultivo continuo de una etapa se utilizoacute un reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
con un volumen total de 650 mL y un posible volumen de operacioacuten de 550 mL el cual
tiene las mismas relaciones geomeacutetricas que el reactor antes mencionado
En todos los sistemas de reaccioacuten ensayados se suministroacute aire en el interior del tubo
conceacutentrico El aire de entrada se controloacute mediante una vaacutelvula reguladora de presioacuten y
su velocidad de flujo se midioacute con un rotaacutemetro
34 Meacutetodos experimentales
341 Efecto de la concentracioacuten de sulfato sobre el crecimiento celular
consumo de glucosa remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp
Se evaluoacute el efecto de la concentracioacuten de sulfato sobre el crecimiento celular consumo
de glucosa remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivos por lote a
nivel matraz Para estos experimentos parte o todo del (NH4)2SO4 y del MgSO4 7H2O del
medio de cultivo basal (tabla 5) se reemplazoacute con NH4Cl y MgCl26H2O respectivamente
35
a fin de mantener las mismas concentraciones iniciales de nitroacutegeno (454 mM) y de
magnesio (1217 mM) en todos los medios de cultivo ensayados
Se prepararon tres series de matraces Erlenmeyer de 500 mL que conteniacutean 135 mL de
medio de cultivo con diferentes concentraciones iniciales de sulfato Las
concentraciones de sulfato ensayadas fueron las siguientes 00 1217 25 50 100
150 200 y 2392 mM (esta uacuteltima concentracioacuten corresponde a la del ioacuten sulfato
presente en el medio de cultivo basal) Estas concentraciones no incluyen la cantidad de
sulfato proporcionado por algunos otros componentes del medio de cultivo (provenientes
del extracto de levadura yo de sales inorgaacutenicas) ya que el Laboratorio Central de
Instrumentacioacuten del Departamento de Biofiacutesica de la Escuela Nacional de Ciencias
Bioloacutegicas IPN determinoacute que la concentracioacuten de este ioacuten en el medio de cultivo que
conteniacutea cloruro de amonio y cloruro de magnesio como uacutenicas fuentes de nitroacutegeno
inorgaacutenico y de magnesio respectivamente era de 23 mgL (002 mM) A este uacuteltimo
medio de cultivo es al que se le denominoacute en el presente trabajo como ―0 mM de ioacuten
sulfato Para la cuantificacioacuten del ioacuten sulfato se utilizoacute el meacutetodo recomendado por la
Norma Oficial Mexicana NMX-AA-74-1981 (Secretariacutea de Comercio y Fomento Industrial
1981) El pH inicial de todos los medios de cultivo ensayados fue de aproximadamente
60
A una serie de matraces con medio de cultivo no se le adicionoacute Cr(VI) con la finalidad de
determinar el efecto del sulfato sobre el crecimiento celular y consumo de glucosa por la
levadura en ausencia del metal (cultivos control) A los matraces de la segunda y tercera
serie se les adicionoacute un determinado volumen de una solucioacuten stock esteacuteril de cromato
de potasio (20 gL) para obtener concentraciones iniciales de Cr(VI) de 17 y 33 mM
36
respectivamente Los matraces fueron inoculados con un determinado volumen de
suspensioacuten celular concentrada a fin de que la concentracioacuten inicial de biomasa de todos
los cultivos fuera de aproximadamente 1 mgmL Los matraces se colocaron en un bantildeo
metaboacutelico con agitacioacuten constante a 28-30 degC Se recolectaron muestras a diferentes
tiempos de incubacioacuten a las que se les determinoacute la concentracioacuten de biomasa glucosa
Cr(VI) y cromo total residual asiacute como el pH
342 Controles abioacuteticos
Se utilizaron controles libres de ceacutelulas con el propoacutesito de determinar si el Cr(VI) era
reducido abioacuteticamente a Cr(III) por los componentes del medio de cultivo
Durante los experimentos de remocioacuten de Cr(VI) con ceacutelulas viables (cultivos problema)
se observoacute que el pH de los medios de cultivo disminuyoacute desde aproximadamente 6
hasta 25-42 dependiendo de la concentracioacuten de sulfato y de cromo utilizada Como
se sabe que los pHrsquos bajos favorecen que la materia orgaacutenica (donadores de electrones)
reduzca el Cr(VI) a Cr(III) en este trabajo se llevaron a cabo experimentos sin biomasa
de Candida sp (controles libres de ceacutelulas) a distintos valores de pH (25 3 4 5 y 6) y
a las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas (17 y 33 mM) para determinar
el grado de reduccioacuten causado por los constituyentes del medio de cultivo
Como controles libres de ceacutelulas se utilizaron matraces Erlenmeyer que conteniacutean medio
de cultivo a los que se les adicionoacute un volumen determinado de una solucioacuten stock
esteacuteril de cromato de potasio (20 gL) para obtener concentraciones iniciales de Cr(VI)
de 17 y 33 mM A continuacioacuten se ajustoacute el pH del medio de cultivo a alguno de los
37
valores antes mencionados La adicioacuten de la solucioacuten stock esteacuteril de cromato de potasio
y el ajuste del pH se realizoacute en condiciones de asepsia
Los controles abioacuteticos se incubaron a las mismas condiciones que los matraces
problema Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se les
determinoacute la concentracioacuten de Cr(VI)
343 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa
remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivo por lote en un
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Se realizoacute la evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa remocioacuten
de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso (sin perforaciones) El cultivo por lote se llevoacute a cabo con 4 litros de
medio de cultivo basal con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM [igual a 78
mgL de Cr(VI)] y con un pH inicial de aproximadamente 60 El reactor se inoculoacute con
un volumen determinado de suspensioacuten celular concentrada para obtener una
concentracioacuten inicial de biomasa cercana a 12 mgmL Se suministroacute aire con un flujo
volumeacutetrico de 4 litrosmin equivalente a 1 vvm (vvm = volumen de aire por volumen
de medio de cultivo por minuto)
El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que el nivel de Cr(VI) residual fue
despreciable Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se
les determinoacute la concentracioacuten de biomasa de glucosa Cr(VI) y cromo total residual asiacute
como el pH
38
344 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote repetido en un reactor
airlift con tubo conceacutentrico liso
Los sistemas por lote repetido se iniciaron con un cultivo por lote Cuando se alcanzaron
niveles bajos de Cr(VI) residual en el primer cultivo por lote se procedioacute a recolectar un
determinado volumen de medio y se reemplazoacute con medio fresco que teniacutea una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM A continuacioacuten el sistema se operoacute nuevamente por
lote (segundo cultivo por lote o cultivo por lote repetido) hasta que ya no se detectaron
variaciones considerables en la concentracioacuten de Cr(VI) residual
Se ensayaron tres diferentes relaciones de recambio de medio de cultivo (f = volumen de
medio recolectadovolumen inicial de medio liacutequido en el reactor) las cuales fueron de
04 06 y 08 Para las dos uacuteltimas relaciones se realizaron experimentos sin ajustar el
pH del medio al inicio del segundo cultivo por lote (lote repetido) asiacute como ajustando el
pH a 60 Para la primera relacioacuten (f = 04) soacutelo se realizoacute el experimento sin ajustar el
pH del medio al inicio del cultivo por lote repetido ya que los experimentos realizados a
las relaciones de recambio de 06 y 08 mostraron que la eficiencia y velocidad de
reduccioacuten de Cr(VI) de los cultivos por lote repetido eran mayores cuando no se ajustaba
el pH
Durante los cultivos por lote repetido se recolectaron muestras a diferentes tiempos de
incubacioacuten a las cuales se les determinoacute la concentracioacuten de biomasa glucosa Cr(VI) y
el pH Con los datos obtenidos se estimaron algunas variables cineacuteticas que se utilizaron
para seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para los fines que se persiguen en
este trabajo
39
345 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa en un
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Para el cultivo continuo de una etapa se utilizoacute un biorreactor airlift con tubo conceacutentrico
liso con un volumen de operacioacuten de 500 mL Al reactor se le suministroacute continuamente
medio de cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM por medio de una
bomba peristaacuteltica Se ensayaron dos flujos volumeacutetricos de medio de cultivo de 378 y
50 mLh que corresponden a velocidades de dilucioacuten de 00076 h-1 y de 00100 h-1
respectivamente
Con los datos obtenidos a la velocidad de dilucioacuten de 00076 h-1 se estimoacute la velocidad
volumeacutetrica global y la eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) las cuales se utilizaron
para seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp
346 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular y la remocioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo conceacutentrico de
malla de acero inoxidable y de vidrio perforado
Se realizaron cultivos por lote en el reactor airlift en el cual se colocoacute un tubo conceacutentrico
de malla de acero inoxidable No 316 (grado alimentario calibre No 20 abertura =
3344 mm) o un tubo conceacutentrico de vidrio con perforaciones circulares de
aproximadamente 4 mm de diaacutemetro Al reactor se le adicionaron 4 litros de medio de
cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM [igual a 78 mgL de Cr(VI)] y
un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada para obtener una
40
concentracioacuten inicial de biomasa de aproximadamente 12 mgmL El pH inicial del medio
fue de aproximadamente 60 Se ensayaron dos flujos de aire de 05 y 1 vvm
El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que el nivel de Cr(VI) residual fue bajo Se
recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se les determinoacute la
concentracioacuten de biomasa y de Cr(VI) residual Con los datos obtenidos se estimaron
algunas variables cineacuteticas que sirvieron como criterio de seleccioacuten para determinar el
tubo conceacutentrico maacutes adecuado para llevar a cabo los cultivos por lote alimentado y lote
alimentado repetido
347 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote
alimentado repetido en un reactor airlift
Para los cultivos por lote alimentado y lote alimentado repetido se utilizoacute el reactor airlift
con el tubo conceacutentrico seleccionado previamente Los cultivos por lote alimentado se
iniciaron con un cultivo por lote utilizando las condiciones iniciales mencionadas en el
inciso 446 y una aireacioacuten de 05 vvm El cultivo por lote se mantuvo en operacioacuten
hasta que la concentracioacuten de Cr(VI) residual fue baja
A continuacioacuten el reactor se drenoacute hasta alcanzar un volumen de liacutequido en el reactor de
25 litros y se inicioacute el suministro continuo de medio de alimentacioacuten con una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM La alimentacioacuten se mantuvo hasta que se alcanzoacute un
volumen de medio liacutequido en el reactor de 37 litros (primer cultivo por lote alimentado)
41
Posteriormente el reactor se volvioacute a drenar hasta obtener un volumen de medio de 25
litros y enseguida se volvioacute a suministrar continuamente medio de cultivo basal con una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM utilizando el mismo flujo de alimentacioacuten que para el
primer cultivo por lote alimentado El suministro de medio se mantuvo hasta alcanzar un
volumen de liacutequido en el reactor de 375-40 litros (segundo cultivo por lote alimentado o
cultivo por lote alimentado repetido)
Se ensayaron dos flujos de alimentacioacuten de 659 y 1343 mLh que representan cargas
maacutesicas de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh
Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las cuales se les
determinoacute la concentracioacuten de biomasa de glucosa y Cr(VI) residual asiacute como el pH
Con los datos obtenidos se estimaron las velocidades volumeacutetricas globales y las
eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI)
35 Meacutetodos analiacuteticos
351 Determinacioacuten de la concentracioacuten de biomasa
La concentracioacuten celular se determinoacute mediante el peso seco de la masa celular Las
muestras recolectadas se filtraron a traveacutes de membranas de fibra de vidrio (Whatman
GFA) con un diaacutemetro de poro de 16 m las cuales se colocaron previamente puestas a
peso constante Posteriormente las membranas se colocaron en una estufa a 95 degC
hasta alcanzar un peso constante Los filtrados se utilizaron para determinar la
concentracioacuten de glucosa Cr(VI) y cromo total residual asiacute como el pH
352 Determinacioacuten de la concentracioacuten de glucosa
42
Se determinoacute mediante un meacutetodo enzimaacutetico empleando a la glucosa oxidasa y
peroxidasa (Worthington Biochemical Corporation 1972)
Principio El meacutetodo se basa en que la glucosa es oxidada a aacutecido glucoacutenico por la
glucosa oxidasa la cual cataliza la siguiente reaccioacuten
-D-glucosa + H2O + O2 Aacutecido D-glucoacutenico + H2O2
El peroacutexido de hidroacutegeno generado reacciona con el sistema peroxidasa - orto-
dianisidina dando como resultado la oxidacioacuten de la orto-dianisidina y la produccioacuten de
agua de acuerdo con la siguiente reaccioacuten
H2O2 + orto-dianisidina (reducida) ortondashdianisidina (oxidada) + H2O
peroxidasa
La orto-dianisidina oxidada presenta un color pardo que en medio aacutecido vira a color
rosa la cual se lee a una longitud de onda de 540 nm (figura 3)
Figura 3 Orto-dianisidina (33rsquo ndash dimetoxidibencidina)
H2N NH2
OCH3
OCH3
43
353 Determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo hexavalente
La concentracioacuten de cromo hexavalente se determinoacute por la teacutecnica de la 15-
difenilcarbohidrazida siguiendo los procedimientos descritos en el meacutetodo 8023 del Hach
Water Analysis Handbook (2002) Este meacutetodo estaacute aprobado por la EPA (Environmental
Protection Agency) (Hach 2002) y por la Norma Oficial Mexicana NMX-AA-044-SCFI-
2001 (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NMX-AA-044-SCFI-
2001)
Principio Se utilizoacute un reactivo en polvo llamado ChromaVer3 el cual contiene una
solucioacuten buffer aacutecida combinada con la 15-difenilcarbohidrazida Este uacuteltimo compuesto
reacciona con el cromo hexavalente dando un compuesto de color puacuterpura (figura 4) El
meacutetodo es aplicable para el agua ya sea fresca o de muestras de agua residual La
intensidad del color es ldirectamente proporcional a la concentracioacuten de cromo
hexavalente presente
Figura 4 Reaccioacuten de la 15-difenilcarbohidrazida con el cromo hexavalente
+ Cr 6+
Compuesto colorido
puacuterpura
N N
Cr O
C R
O
N N
H H
C R
15-difenilcarbohidrazida
2 N N N
H H
N C
H O
H
44
354 Determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo total
La determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo total de los filtrados de las muestras
recolectadas (cromo total en solucioacuten) se realizoacute por espectroscopiacutea de absorcioacuten
atoacutemica con flama de acetileno-aire (SpectrAA220 FS Varian Inc)
Para determinar la cantidad de cromo retenido por la biomasa de Candida sp las ceacutelulas
fueron lavadas con agua desionizada deshidratadas y posteriormente fueron digeridas
con aacutecido niacutetrico concentrado La solucioacuten obtenida se enfrioacute a temperatura ambiente y
se le adicionoacute agua desionizada hasta obtener un volumen final de 50 mL Este
procedimiento estaacute descrito en la Norma Oficial Mexicana NMX-AA-051-SCFI-2001
(Secretariacutea de Economiacutea 2001) La concentracioacuten de cromo total de la solucioacuten
resultante se determinoacute en un espectrofotoacutemetro de absorcioacuten atoacutemica con un horno de
grafito (SpectrAA220 FS Varian Inc)
355 Determinacioacuten del pH
Se realizoacute con un potencioacutemetro marca Oakton
45
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Meta No 1 Determinar el efecto del ioacuten sulfato sobre la reduccioacuten
de Cr(VI)
41 Efecto del sulfato sobre el crecimiento celular consumo de glucosa
remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp
411 Evaluacioacuten de la influencia del sulfato sobre el crecimiento celular de
Candida sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
Se determinoacute el efecto de ocho concentraciones diferentes de sulfato (00 1217 25
50 100 150 200 y 2392 mM) sobre el crecimiento celular de Candida sp cuando
eacutesta se cultivoacute por lote a nivel matraz en medios de cultivo sin Cr(VI) y con
concentraciones iniciales del metal de 17 y 33 mM Para visualizar mejor el efecto las
curvas de crecimiento celular se construyeron utilizando la relacioacuten xxo (x =
concentracioacuten celular a un determinado tiempo de incubacioacuten xo = concentracioacuten inicial
de biomasa) como variable dependiente y el tiempo de incubacioacuten (t) como variable
independiente (graacuteficas de xxo vs t) En cada una de las curvas de crecimiento se trazoacute
una liacutenea horizontal a una relacioacuten xxo de 10 para observar si ocurriacutea crecimiento o
lisis celular
En la figura 5 se muestran las curvas de crecimiento celular de Candida sp cuando eacutesta
se cultivoacute en medios de cultivo con diferentes concentraciones de sulfato y sin Cr(VI) Se
observa que el crecimiento de Candida sp fue muy semejante a las diferentes
concentraciones de sulfato ensayadas La levadura fue capaz de crecer en el medio de
cultivo al que no se le adicionoacute sulfato de amonio y sulfato de magnesio (0 mM de
46
SO42-) lo cual sugiere que la cantidad de sulfato proporcionado por otros componentes
del medio de cultivo ndash por ejemplo provenientes del extracto de levadura yo de
impurezas contenidas en las sales inorgaacutenicas adicionadas al medio de cultivo (002
mM) mdash fue suficiente para permitir un adecuado crecimiento de la levadura Los
resultados tambieacuten mostraron que la adicioacuten de sulfato en forma de sales inorgaacutenicas
[(NH4)2SO4 o Mg(SO4)7H20] no tuvo alguacuten efecto inhibidor o estimulador del crecimiento
celular
Figura 5 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo sin Cr(VI)
En la figura 6 se presentan las curvas de crecimiento de Candida sp que se obtuvieron
cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo con una concentracioacuten inicial de
Cr(VI) de 17 mM a las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas En la figura se
aprecia lo siguiente 1) A una concentracioacuten de sulfato de 0 mM ocurrioacute lisis celular 2)
el crecimiento neto de la levadura fue praacutecticamente nulo a una concentracioacuten de sulfato
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
47
de 1217 mM 3) el crecimiento de la levadura fue evidente a partir de una
concentracioacuten de sulfato de 25 mM y 4) en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de
10 a 2392 mM el crecimiento de la levadura fue muy semejante y superior al alcanzado
a una concentracioacuten de sulfato de 5 mM Asimismo cuando se utilizaron concentraciones
de sulfato de 10 a 2392 mM se alcanzaron niveles de concentracioacuten de biomasa
similares a los obtenidos en ausencia del metal (cultivos control) (figuras 5 y 6) De
estos resultados es evidente que a medida que se incrementoacute la concentracioacuten de
sulfato los efectos toacutexicos del Cr(VI) sobre el crecimiento de la levadura disminuyeron
hasta que eacutestos fueron praacutecticamente nulos es decir la tolerancia de la levadura al
Cr(VI) aumentoacute conforme se incrementoacute la concentracioacuten de sulfato en el medio de
crecimiento de Candida sp
Figura 6 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo con 17 mM de Cr(VI)
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
48
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM ocurrioacute lisis celular
cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo con concentraciones de sulfato en el
intervalo de 0 a 5 mM (figura 7) en contraste el crecimiento celular de la levadura se
incrementoacute a medida que la concentracioacuten de sulfato aumentoacute de 10 a 2392 mM En
este uacuteltimo intervalo de concentracioacuten de sulfato se observoacute que a tiempos de
incubacioacuten superiores a las 150 h se presentoacute lisis celular A ninguna de las
concentraciones de sulfato ensayadas se alcanzaron densidades celulares semejantes a
las obtenidas en los cultivos sin Cr(VI) o con 17 mM de Cr(VI) lo cual podriacutea deberse a
la mayor toxicidad de los medios de cultivo
Figura 7 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo con 33 mM de Cr(VI)
En la figura 8 se muestra la variacioacuten de la velocidad especiacutefica de crecimiento ( ) y de
lisis celular (kd) de Candida sp en funcioacuten de la concentracioacuten de SO42- a las diferentes
concentraciones de Cr(VI) ensayadas [0 17 y 33 mM]
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
49
Figura 8 Variacioacuten de la velocidad especiacutefica de crecimiento o de lisis celular en funcioacuten
de la concentracioacuten de SO42- a las diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI)
ensayadas
-0002
0
0002
0004
0006
0008
001
0012
0014
0016
0018
0 5 10 15 20 25 30
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Ve
loc
ida
d e
sp
ec
iacutefic
a [
h-1
]
0 mM
17 mM
33 mM
Promedio
Sin Cr(VI)
50
Cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo sin Cr(VI) su velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento se mantuvo praacutecticamente constante en todo el intervalo de
concentracioacuten de sulfato ensayado con un valor promedio de 00144 h-1
A la concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la velocidad especiacutefica de crecimiento de
Candida sp aumentoacute casi linealmente con respecto a la concentracioacuten de sulfato en el
intervalo de concentracioacuten de 0 a 10 mM (r2 = 096) alcanzando un valor maacuteximo de
00142 h-1 a la uacuteltima concentracioacuten de sulfato Esta velocidad especiacutefica de crecimiento
es muy similar a las obtenidas en los cultivos sin Cr(VI) A concentraciones de sulfato
superiores a 5 mM la velocidad especiacutefica de crecimiento se mantuvo praacutecticamente
constante Estos resultados concuerdan con los perfiles de crecimiento celular mostrados
anteriormente
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM se obtuvieron
velocidades especiacuteficas de lisis celular (kd) de 00013 a 00003 h-1 ( = -00013 - 00003
h-1) en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de 0 a 5 mM (figura 8) A
concentraciones de sulfato superiores a 5 mM la velocidad neta de crecimiento fue
positiva La velocidad especiacutefica aumentoacute linealmente en todo el intervalo de
concentracioacuten de sulfato ensayado (r2 = 099) aunque las velocidades alcanzadas fueron
notoriamente inferiores a las obtenidas en los medios de cultivo sin Cr(VI) y con una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM
De los resultados anteriores se deduce que el sulfato desempentildea un papel importante en
la tolerancia (resistencia) de Candida sp a los efectos toacutexicos del Cr(VI) A medida que
se incrementoacute la concentracioacuten de sulfato la levadura fue maacutes tolerante (resistente) a
51
los efectos dantildeinos del Cr(VI) y por consiguiente su crecimiento celular fue menos
afectado Asimismo los resultados muestran que el ―efecto protector del sulfato sobre el
crecimiento de Candida sp dependioacute de la concentracioacuten inicial de Cr(VI)
Pepi y Baldi (1992) investigaron el efecto de diferentes aminoaacutecidos azufrados y del
sulfato sobre la tolerancia de algunas levaduras al Cr(VI) Estos investigadores
encontraron que en presencia de 02 mM de Cr(VI) se requirieron pequentildeas cantidades
de cisteiacutena [001ndash01 mM] para estimular significativamente [10-100] el crecimiento
de Rhodosporidium sp y que para incrementar el crecimiento de Candida sp en hasta
80 fue necesaria una concentracioacuten de cisteiacutena de 01 mM Un comportamiento similar
se observoacute en estas dos cepas cuando se adicionoacute metionina En contraste el
crecimiento celular de Candida famata fue inhibido cuando la levadura se cultivoacute en
medios con concentraciones de cisteiacutena superiores a 005 mM y con 02 mM de Cr(VI)
Por otra parte cuando Candida sp se cultivoacute en medios con diferentes concentraciones
de sulfato (4ndash160 mM) y de Cr(VI) (004ndash02 mM) se encontroacute que el ioacuten sulfato
incrementoacute la tolerancia de la levadura al Cr(VI) El mecanismo general de resistencia al
cromato en Candida sp se atribuyoacute a una reducida captacioacuten (incorporacioacuten) de cromo
(Pepi y Baldi 1992)
Ohtake y col (1987) encontraron que la adicioacuten de altas concentraciones de sulfato
incrementoacute el crecimiento celular de dos cepas de Pseudomonas fluorescens (LB300 y
LB303) en presencia de CrO42- Ademaacutes encontraron que el nivel de resistencia al CrO4
2-
en P fluorescens dependioacute de la fuente de azufre en el medio de cultivo ya que las
ceacutelulas bacterianas que crecieron con cisteiacutena fueron mucho maacutes resistentes al CrO42-
que las ceacutelulas que crecieron sobre sulfato Como el cromato es transportado al interior
52
de las ceacutelulas de Pseudomonas a traveacutes del sistema de transporte del sulfato la habilidad
del sulfato para proteger a las ceacutelulas de P fluorescens LB300 de los efectos inhibitorios
del Cr(VI) se atribuyoacute a que el sulfato inhibioacute competitivamente la captacioacuten del cromato
por las ceacutelulas bacterianas (Ohtake y col 1987)
En contraste la resistencia de Ochrobactrum tritici cepa 5bvI1 al Cr(VI) fue
independiente de la concentracioacuten de sulfato (Branco y col 2004)
412 Evaluacioacuten del efecto del sulfato sobre el consumo de glucosa por Candida
sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
La glucosa fue completamente consumida (eficiencia global de consumo de glucosa =
100) en aproximadamente 83 h de incubacioacuten cuando la levadura se cultivoacute en medios
que no conteniacutean Cr(VI) y con diferentes concentraciones de sulfato No se observoacute
diferencia considerable en el consumo de glucosa a ninguna de las concentraciones de
sulfato utilizadas (figura 9)
53
Figura 9 Variacioacuten en el consumo de glucosa por Candida sp cuando se utilizaron
medios de cultivo con diferentes concentraciones de sulfato y sin Cr(VI)
En los experimentos realizados con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM
(figura 10) se observoacute que la levadura fue capaz de consumir aproximadamente 30-
35 de la glucosa inicialmente adicionada a los medios que conteniacutean sulfato a
concentraciones de 0 y 1217 mM a pesar de que a estas condiciones de cultivo ocurrioacute
lisis celular [0 mM de SO42-] o el crecimiento celular de la levadura fue despreciable
[1217 mM de SO42-] (figura 6) Candida sp consumioacute todo el monosacaacuterido presente
en los medios de cultivo con concentraciones de sulfato superiores a 1217 mM
(eficiencia global de consumo de glucosa del 100) sin embargo el tiempo que se
requirioacute para que eacutesto sucediera disminuyoacute a medida que se incrementoacute la concentracioacuten
de sulfato (figura 10) Los perfiles de consumo de glucosa en los cultivos de Candida
sp fueron semejantes cuando se utilizaron concentraciones de sulfato de 10 a 2392
mM y eacutestos a su vez fueron similares a los obtenidos en los medios de cultivo que no
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa
re
sid
ua
l [
]0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
54
conteniacutean Cr(VI) (figuras 9 y 10) Lo anterior podriacutea deberse a que el crecimiento
celular de estos cultivos fue semejante (figura 6)
Figura 10 Variacioacuten del porcentaje de glucosa residual en los cultivos de Candida sp a
las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas y con 17 mM de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
55
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM los niveles de glucosa
residual disminuyeron a medida que aumentoacute la concentracioacuten de sulfato (figura 11)
Sin embargo estos niveles fueron superiores a los alcanzados a 17 mM de Cr(VI) a
todas las concentraciones de sulfato ensayadas La mayor eficiencia de consumo de
glucosa fue de aproximadamente 80 y se obtuvo a una concentracioacuten de sulfato de
2392 mM
Figura 11 Variacioacuten del porcentaje de glucosa residual en los cultivos por lote de
Candida sp a las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas y con 33 mM de
Cr(VI)
A las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas [17 y 33 mM] se observoacute que
en las primeras horas de incubacioacuten los cultivos de levadura en los que ocurrioacute lisis
celular consumieron una determinada cantidad de glucosa la cual probablemente se
utilizoacute para el mantenimiento de las ceacutelulas vivas
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa r
es
idu
al [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
56
Tanto en los experimentos realizados a 17 como a 33 mM de Cr(VI) se encontroacute que
los cultivos que alcanzaron mayores densidades celulares fueron los que consumieron
mayor cantidad de glucosa y esto ocurrioacute cuando se utilizaron concentraciones altas de
sulfato
413 Evaluacioacuten del efecto del sulfato sobre la variacioacuten del pH de los cultivos
de Candida sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
Los perfiles de variacioacuten del pH de los medios de cultivo fueron muy semejantes a las
diferentes concentraciones de sulfato ensayadas cuando la levadura se cultivoacute en los
medios de cultivo sin Cr(VI) (figura 12) A todas las concentraciones de sulfato
utilizadas el pH disminuyoacute desde aproximadamente 6 hasta 28 en las primeras once
horas de incubacioacuten En el periodo comprendido entre las 11 y las 60 h de incubacioacuten el
pH de los medios de cultivo disminuyoacute ligeramente hasta alcanzar valores cercanos a
25 A tiempos posteriores a 60 h el pH de los medios de cultivo se mantuvo
praacutecticamente constante
Figura 12 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo de Candida sp en ausencia de
Cr(VI) y a las diferentes concentraciones de SO42- ensayadas
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
57
En la figura 13 se muestran los perfiles de variacioacuten del pH de los medios de cultivo
cuando la levadura se cultivoacute a las diferentes concentraciones de sulfato y a una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM El pH de los cultivos disminuyoacute raacutepidamente
en las primeras 15 h de incubacioacuten a todas las concentraciones de sulfato ensayadas La
disminucioacuten del pH fue mayor en los cultivos con las concentraciones maacutes altas de
sulfato lo cual podriacutea deberse a que a estas condiciones la levadura consumioacute mayor
cantidad de glucosa y las densidades celulares alcanzadas fueron maacutes altas A tiempos
de incubacioacuten superiores a 15 h el pH continuoacute disminuyendo pero a menor velocidad
Los niveles de pH maacutes bajos se obtuvieron cuando se utilizaron concentraciones de
sulfato de 5 a 2392 mM alcanzaacutendose valores semejantes a los obtenidos en los medios
sin Cr(VI) (de aproximadamente 25)
Figura 13 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
58
Un comportamiento cualitativo similar se obtuvo cuando Candida sp se cultivoacute en medios
con diferentes concentraciones de sulfato y con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33
mM (figura 14) El pH maacutes bajo se alcanzoacute a concentraciones altas de sulfato [20 y
2392 mM] y fue de aproximadamente 36 el cual es superior a los valores maacutes bajos
que se obtuvieron en los cultivos sin Cr(VI) y con 17 mM de Cr(VI) Esto uacuteltimo podriacutea
deberse a que el incremento de la concentracioacuten celular y el consumo de glucosa fueron
inferiores a los alcanzados con las otras concentraciones de Cr(VI) [0 y 17 mM]
Figura 14 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
414 Efecto del sulfato sobre la remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp
En la figura 15 se muestran las variaciones del porcentaje de Cr(VI) residual de los
cultivos de Candida sp cuando se emplearon diferentes concentraciones de sulfato y
una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM A una concentracioacuten de sulfato de 0 mM
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
59
la remocioacuten de Cr(VI) fue muy baja (de aproximadamente 83) es conveniente
mencionar que a esta concentracioacuten de sulfato (0 mM) y de Cr(VI) (17 mM) ocurrioacute lisis
celular y la levadura consumioacute una pequentildea cantidad de glucosa en las primeras horas
de incubacioacuten La remocioacuten de Cr(VI) se incrementoacute a medida que aumentoacute la
concentracioacuten de sulfato de 0 a 10 mM A partir de esta uacuteltima concentracioacuten de sulfato
los perfiles de remocioacuten de Cr(VI) fueron muy similares y esto podriacutea deberse a que la
densidad celular de los cultivos fueron praacutecticamente iguales Todo o casi todo el Cr(VI)
inicialmente adicionado a los medios de cultivo fue removido cuando se empleoacute una
concentracioacuten de sulfato igual o superior a 25 mM (figura 15)
Figura 15 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
En contraste cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM la levadura
no fue capaz de remover todo el Cr(VI) inicialmente presente en los medios de cultivo a
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
60
ninguna de las concentraciones de sulfato ensayadas (figura 16) Sin embargo los
niveles de Cr(VI) residual disminuyeron a medida que se incrementoacute la concentracioacuten de
sulfato
Figura 16 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
A las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas los cultivos de levadura en los
que ocurrioacute lisis celular en las primeras horas de incubacioacuten [0 mm de SO42- 17 mM de
Cr(VI) y 0-5 mM de SO42- 33 mM de Cr(VI)] fueron capaces de remover una pequentildea
cantidad de Cr(VI) Estos resultados concuerdan con lo reportado por Wang y Shen
(1997) quienes encontraron que la densidad celular de los cultivos de Escherichia coli y
Bacillus sp disminuyoacute continuamente durante el curso de la remocioacuten de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
61
A las diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI) y de sulfato ensayadas se observoacute
que aunque los niveles de Cr(VI) residual disminuyeron a medida que la incubacioacuten
progresoacute las concentraciones de cromo total en solucioacuten permanecieron casi constantes
a lo largo de todo el periodo de incubacioacuten (aproximadamente el 97 del cromo
inicialmente adicionado a los medios de cultivo estuvo siempre presente en solucioacuten)
Maacutes auacuten el anaacutelisis del contenido de cromo en la biomasa de Candida sp (de muestras
recolectadas al final de los experimentos) reveloacute que uacutenicamente el 29 009 del
cromo total removido por los cultivos fue incorporado en la biomasa
Como se mostroacute anteriormente los cultivos con ceacutelulas viables se iniciaron con un pH de
aproximadamente 60 y eacuteste disminuyoacute durante el tiempo de incubacioacuten hasta valores de
25 ndash 36 dependiendo de la concentracioacuten de sulfato y de Cr(VI) utilizada Como se
sabe que los pHacutes bajos favorecen la reduccioacuten del Cr(VI) por la materia orgaacutenica
(donadores de electrones) en el presente trabajo se llevaron a cabo experimentos sin
biomasa de Candida sp (controles libres de ceacutelulas) a diferentes valores de pH (25 3
4 5 y 6) y a las dos diferentes concentraciones de Cr(VI) ensayadas (17 y 33 mM)
para determinar si los componentes presentes en los medios de cultivo pueden reducir el
Cr(VI) En las figuras 17 y 18 se muestran los perfiles de Cr(VI) residual que se
obtuvieron con los controles abioacuteticos ensayados
62
Figura 17 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los controles libres de
ceacutelulas llevados a cabo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y a diferentes
valores de pH
Figura 18 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los controles libres de
ceacutelulas realizados con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y a diferentes
valores de pH
00
200
400
600
800
1000
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
pH = 25
pH = 3
pH = 4
pH = 5
pH = 6
00
200
400
600
800
1000
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
pH = 25
pH = 3
pH = 4
pH = 5
pH = 6
63
A las dos concentraciones de Cr(VI) ensayadas se observoacute una reduccioacuten despreciable
del metal (inferior a 05) en el intervalo de valores de pH de 4 a 6 a un pH de 3 el
porcentaje de reduccioacuten fue de aproximadamente 12 y de 3 cuando el pH fue de
25 Estos resultados sugieren que los componentes de los medios de cultivo
praacutecticamente no redujeron el Cr(VI) a ninguno de los pHrsquos ensayados
En conjunto los resultados antes mostrados indican que el principal mecanismo de
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp fue la biotransformacioacuten (reduccioacuten) del Cr(VI) a
Cr(III) y que la reduccioacuten abioacutetica del Cr(VI) y la captacioacuten de cromo por la biomasa de
la levadura fueron despreciables Asimismo los resultados tambieacuten muestran que la
reduccioacuten del Cr(VI) por los cultivos se debioacute a la actividad metaboacutelica de las ceacutelulas de
Candida sp
En la figura 19 se presentan las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) que se
obtuvieron a las diferentes concentraciones iniciales de sulfato y de Cr(VI) ensayadas Se
aprecia que cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la eficiencia
de reduccioacuten se incrementoacute desde 179 hasta 986 a medida que la concentracioacuten
de sulfato aumentoacute de 0 a 25 mM a concentraciones de sulfato superiores la eficiencia
de reduccioacuten fue del 100 Asimismo en los experimentos realizados a 33 mM de
Cr(VI) la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) aumentoacute desde 83 hasta 84 conforme la
concentracioacuten de sulfato aumentoacute de 0 a 2392 mM
64
Figura 19 Eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por los cultivos de
Candida sp a las diferentes concentraciones de sulfato y de Cr(VI) ensayadas
La velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) tambieacuten fue afectada por la
concentracioacuten de sulfato y de Cr(VI) utilizada (figura 20) Cuando se empleoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten maacutes alta
fue de 098 mg de Cr(VI)Lh y se obtuvo en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de
10 a 2392 mM En cambio la velocidad maacutes alta que se alcanzoacute a 33 mM de Cr(VI) fue
de 044 mg de Cr(VI)Lh y se obtuvo a la maacutexima concentracioacuten de sulfato ensayada
(2392 mM)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 1217 25 5 10 15 20 2392
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Efi
cie
ncia
glo
bal d
e r
ed
uccioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
17 mM
33 mM
65
Figura 20 Velocidades volumeacutetricas globales de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas en los
cultivos de Candida sp a diferentes concentraciones de sulfato y de Cr(VI)
A todas las concentraciones de sulfato ensayadas la eficiencia y velocidad volumeacutetrica de
reduccioacuten de Cr(VI) alcanzadas a una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM fueron
superiores a las obtenidas a 33 mM de Cr(VI) y esto podriacutea deberse a que los efectos
toacutexicos del Cr(VI) sobre la levadura se incrementan a medida que aumenta la
concentracioacuten del metal
De los resultados anteriores es evidente que el sulfato afectoacute la reduccioacuten aeroacutebica de
Cr(VI) por Candida sp Estos resultados difieren con lo reportado por otros
investigadores quienes no han encontrado un efecto inhibidor ni estimulador del sulfato
sobre la reduccioacuten de Cr(VI) en cultivos aeroacutebicos
000
010
020
030
040
050
060
070
080
090
100
0 1217 25 5 10 15 20 2392
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica d
e r
ed
uccioacute
n d
e C
r(V
I)
[mg
de
Cr(
VI)
Lh
]
17 mM
33 mM
66
Ishibashi y col (1990) encontraron que concentraciones de sulfato de hasta 1 mM
incrementaron la resistencia de Pseudomonas putida al cromato pero no tuvieron efecto
sobre la reduccioacuten de eacuteste En cultivos de Bacillus sp (Wang y Xiao 1995) y de
Acinetobacter haemolyticus (Zakaria y col 2006) se observoacute que una concentracioacuten de
sulfato de 10 mM no afectoacute la reduccioacuten de Cr(VI) Liu y col (2006) reportaron que
concentraciones de sulfato de 40 y 80 mgL (0416 y 083 mM) no tuvieron efecto sobre
la reduccioacuten aeroacutebica de Cr(VI) por Bacillus sp XW-4
En contraste el sulfato generalmente tiene efecto sobre la reduccioacuten bacteriana del
cromato bajo condiciones de anaerobiosis lo cual podriacutea deberse a que el sulfato compite
con el cromato como aceptor final de electrones (Garbisu y col 1998 Liu y col 2006)
En cultivos anaeroacutebicos de Escherichia coli ATCC 33456 la velocidad de reduccioacuten de
Cr(VI) no fue afectada por hasta 416 mM de sulfato sin embargo la velocidad
disminuyoacute a 83 mM de sulfato (Shen y Wang 1994) La actividad de reduccioacuten de Cr(VI)
de Enterobacter cloacae HO1 bajo condiciones anaeroacutebicas fue inhibida en 32 en
presencia de tan soacutelo 25 M de sulfato (Komori y col 1989)
Como se mencionoacute anteriormente el sulfato incrementoacute la tolerancia al Cr(VI) de la cepa
de Candida sp aislada por Pepi y Baldi (1992) sin embargo esta cepa de levadura fue
incapaz de reducir el Cr(VI) Asimismo auacuten cuando se ha reportado que Pseudomonas
fluorescens LB300 es capaz de reducir el Cr(VI) a Cr(III) (Bopp y Ehrlich 1988) y que el
sulfato incrementa el crecimiento celular de esta bacteria en presencia de cromato
(Ohtake y col 1987) hasta donde sabemos no se ha reportado el efecto del sulfato
sobre la reduccioacuten de Cr(VI) por este microorganismo
67
Los resultados anteriores muestran claramente que el sulfato afectoacute la tolerancia de
Candida sp al Cr(VI) y a su capacidad para reducirlo Es evidente que a medida que se
incrementoacute la concentracioacuten de sulfato el crecimiento de la levadura fue mayor y su
eficiencia y velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) aumentaron Los resultados tambieacuten
muestran que la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp depende de la densidad celular de
los cultivos de manera tal que a mayor cantidad de biomasa generada mayor es la
reduccioacuten de Cr(VI) Aun cuando la cepa de Candida sp es muy sensible a los efectos
toacutexicos del Cr(VI) en ausencia de sulfato esta levadura posee una capacidad notable
para reducir muy altas concentraciones del metal en presencia de sulfato
Meta No 2 Determinar la capacidad de reduccioacuten de Cr(VI) en
diferentes sistemas de reaccioacuten
42 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso
Se utilizoacute un reactor airlift con tubo conceacutentrico liso (sin perforaciones) para el cultivo por
lote de Candida sp Para este sistema de reaccioacuten se utilizoacute un volumen de operacioacuten de
4 litros de medio basal con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM El biorreactor
se inoculoacute con un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada de tal
forma que la concentracioacuten inicial de biomasa fue de 12 mgmL El pH inicial fue de
aproximadamente 60 El reactor se operoacute por lote hasta que la concentracioacuten de Cr(VI)
residual fue despreciable
68
La concentracioacuten celular se incrementoacute gradualmente a medida que la incubacioacuten
progresoacute hasta que alcanzoacute un valor maacuteximo de aproximadamente 39 gL lo cual
ocurrioacute a las 42 h de incubacioacuten A tiempos posteriores la concentracioacuten de biomasa
disminuyoacute debido a que ocurrioacute lisis celular (figura 21) La velocidad especiacutefica maacutexima
de crecimiento de la levadura fue de 00244 h-1 la cual fue superior a la obtenida en
matraz cuando crecioacute con 17 mM de Cr(VI) (00142 h-1) esta diferencia podriacutea deberse
a que en el reactor airlift las ceacutelulas de Candida sp tuvieron una mayor cantidad de
oxiacutegeno disponible para su crecimiento
Figura 21 Variacioacuten de la concentracioacuten de biomasa y de glucosa en el cultivo por lote
de Candida sp en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM
La levadura consumioacute la principal fuente de carbono y energiacutea (glucosa) presente en el
medio de cultivo a lo largo de todo el tiempo de incubacioacuten incluso durante el periodo en
el que ocurrioacute lisis celular La glucosa no fue completamente consumida por la levadura
00
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo [h]
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e g
luc
os
a
res
idu
al [g
L]
00
05
10
15
20
25
30
35
40
45
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e b
iom
as
a [
gL
]Glucosa Biomasa
69
al final del experimento la concentracioacuten de glucosa residual fue de 17 gL (figura 21)
por lo que la eficiencia global de consumo del monosacaacuterido fue del 835
El pH del medio de cultivo disminuyoacute desde 60 hasta aproximadamente 25 Este uacuteltimo
valor se alcanzoacute a las 292 h de incubacioacuten y se mantuvo praacutecticamente constante a
tiempos posteriores (figura 22)
Figura 22 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) y del pH en el cultivo por lote de
Candida sp en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM
La concentracioacuten de Cr(VI) residual disminuyoacute progresivamente a medida que se
incrementoacute el tiempo de incubacioacuten hasta que a las 468 h ya no se detectoacute Cr(VI) en el
medio de cultivo por lo que la eficiencia global de remocioacuten de Cr(VI) fue del 100 Se
observoacute una ligera remocioacuten de Cr(VI) durante el periodo en el que ocurrioacute lisis celular
(figuras 21 y 22) En contraste la concentracioacuten de cromo total en solucioacuten se
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo [h]
Cr(
VI)
y C
rom
o t
ota
l re
sid
ua
l [m
gL
]
00
10
20
30
40
50
60
70
pH
[Cr(VI)] [Cromo total] pH
70
mantuvo casi constante a lo largo del tiempo de cultivo Lo anterior indica que la
levadura fue capaz de transformar el Cr(VI) a la forma trivalente menos toacutexica
En la tabla 6 se comparan los valores de algunas variables cineacuteticas obtenidas en
matraz (cuando se hizo crecer la levadura a una concentracioacuten de Cr(VI) inicial de 17
mM) y en el biorreactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando la levadura se cultivoacute en
medio de cultivo con concentraciones iniciales semejantes de Cr(VI) y de sulfato
Tabla 6 Variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote de Candida sp realizados
en matraz y en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Variable cineacutetica Matraz Reactor
Incremento celular maacuteximo [gL] 22 263
Velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento [h-1] 00142 00244
Eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) [] 100 100
Velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI)L h] 098 164
Velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI) g biomasa h] 045 095
Capacidad de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI) g biomasa] 400 443
El incremento celular maacuteximo y la velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento de
Candida sp obtenidos en el reactor airlift fueron 1955 y 718 superiores a los
alcanzados en matraz respectivamente Como se mencionoacute previamente eacutesto podriacutea
deberse a que en el reactor airlift la levadura tuvo una mayor cantidad de oxiacutegeno
disponible para su crecimiento
71
La levadura redujo todo el Cr(VI) inicialmente presente en el medio de cultivo [eficiencia
global de reduccioacuten de Cr(VI) del 100] tanto cuando se cultivoacute en matraz como en el
reactor airlift El hecho de que Candida sp sea capaz de reducir concentraciones de
Cr(VI) tan altas como 15 mM (e incluso superiores como se mostroacute en la seccioacuten
anterior) podriacutea ser de importancia praacutectica porque la mayoriacutea de los microorganismos
ensayados son capaces de reducir parcial o totalmente concentraciones maacutes bajas de
Cr(VI) (tabla 7)
Tabla 7 Datos sobre reduccioacuten de Cr(VI) por microorganismos
Microorganismo Cultivo
Modo de
operacioacuten
Concentra-
cioacuten de
Cr(VI)
[mM]
Velocidad
volumeacutetrica
de reduccioacuten
[mg de
CrLh]
Eficiencia
de
reduccioacuten
[]
Referencia
Acinetobacter
haemolitycus
Aerobio
CPL
067 128 88 Zakaria y col
2006
Aislado de
Pseudomonas
(CRB5)
Aerobio
CPL
043 014 100 McLean y
Beveridge 2000
Arthrobacter
sp
Aerobio
CPL
017 016 65 Megharaj y col
2003
Aspergillus sp Aerobio
CPL
096 0694 100 Acevedo-Aguilar
y col 2006
Bacillus
megaterium
TKW3
Aerobio
CPL
048 009 735 Cheung y Gu
2005
Bacillus sp Aerobio
CPL
007 007 65 Megharaj y col
2003
Bacteria J3 Aerobio
CPL
01 00057 21 Badar y col
2000
Brevibacterium
CrT-13
Aerobio
CPL
288 255 68 Faisal y Hasnain
2004
E coli AC80 Aerobio
CPL
002
065
9375
Ishibashi y col
1990
Ochrabactrum
sp
Aerobio
CPL
017
034
033
038
100
88
Thacker y
Madamwar 2005
72
Ochrobactrum
intermedium Cr-
T1
Aerobio
CPL
288 326 87 Faisal y Hasnain
2004
Penicillium sp Aerobio
CPL
096 066 95 Acevedo-Aguilar y
col 2006
Phanerochaete
chrysosporium
Aerobio
CPL
058 011 100 Pal 1997
Providencia
sp
Aerobio
CPL
102 10 100 Thacker y col
2006
Pseudomonas
ambigua G-1
Aerobio
CPL
288 347 83 Horitsu y col
1987
Streptomyces
griseus
Aerobio
CPL
017 025 100 Laxman y More
2002
Trichoderma
inhamatum
Aerobio
CPL
13
075 100 Morales-Barrera y
Cristiani-Urbina
2008
Trichoderma
viride
Aerobio
CPL
16
104 100 Morales-Barrera y
Cristiani-Urbina
2006
CPL = Cultivo por lote
La velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) obtenida en el reactor neumaacutetico
con Candida sp fue de 164 mg de Cr(VI)Lh la cual fue 6735 superior a la alcanzada
en matraz [098 mg de Cr(VI)Lh] (tabla 6) Esto uacuteltimo podriacutea deberse a la mayor
cantidad de biomasa generada en el reactor la cual redujo maacutes raacutepidamente el Cr(VI)
Acinetobacter haemolitycus fue capaz de reducir completamente 096 mM de Cr(VI) en
36 h por lo que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal de este microorganismo
fue de 139 mg de Cr(VI)Lh sin embargo cuando la concentracioacuten inicial de Cr(VI) se
incrementoacute a 135 mM la eficiencia y velocidad de reduccioacuten disminuyeron (Zakaria y
col 2006)
A una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 017 mM la eficiencia y velocidad volumeacutetrica
global de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por Ochrabactrum sp fue del 100 y 033 mg
de Cr(VI)Lh respectivamente Aunque la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal
73
se incrementoacute a 038 mg de Cr(VI)Lh cuando la concentracioacuten inicial de Cr(VI) fue de
034 mM la eficiencia de reduccioacuten disminuyoacute a 88 (Thacker y Madamwar 2005)
La eficiencia y velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas con Arthrobacter
sp a las 70 h de incubacioacuten fue de aproximadamente 65 y 016 mg de Cr(VI)Lh
cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial del metal de 017 mM (Megharaj y col 2003)
Con Providencia sp se obtuvo una eficiencia de reduccioacuten del 100 al cabo de 108 h de
incubacioacuten en medios de cultivo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 102 mM
siendo su velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal de 10 mg de Cr(VI)Lh (Thacker
y col 2006) La velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Streptomyces griseus
fue de 025 mg de Cr(VI)Lh cuando se cultivoacute en presencia de 017 mM de Cr(VI)
(Laxman y More 2002)
En el caso de eucariotes Acevedo-Aguilar y col (2006) reportaron que Penicillium sp y
Aspergillus sp fueron capaces de reducir por completo 096 mM de Cr(VI) en 72 h
obtenieacutendose una velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de 0694 mg de Cr(VI)Lh
Asimismo Trichoderma viride exhibioacute una eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) del 100 y
una velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de 104 mg de Cr(VI)Lh cuando se cultivoacute en
un reactor airlift en medio de cultivo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 16 mM
(Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006) Trichoderma inhamatum fue capaz de reducir
por completo 13 mM de Cr(VI) con una velocidad volumeacutetrica de 075 mg de Cr(VI)Lh
(Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2008)
En la tabla 7 se muestran los valores de eficiencia y velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten
de Cr(VI) obtenidas con otros microorganismos
74
La velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) que se obtuvo en el reactor airlift con
Candida sp fue de 095 mg de Cr(VI)g de biomasah (tabla 6) la cual fue 211 veces
mayor que la alcanzada en matraz [045 mg de Cr(VI)g de biomasah] Bae y col
(2000) reportaron que la velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) de Escherichia coli
ATCC 33456 se encontroacute en el intervalo de 031 a 07 mg de Cr(VI)g de biomasah
cuando este microorganismo se cultivoacute por lote en diferentes medios de cultivo con una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 096 mM A una concentracioacuten de Cr(VI) de 0096 mM
los lodos activados exhibieron una velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) de
aproximadamente 008 mg de Cr(VI)g de biomasah (Stasinakis y col 2003) El cultivo
por lote de Trichoderma inhamatum exhibioacute una velocidad especiacutefica de
aproximadamente 0584 mg de Cr(VI)g de biomasah cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 13 mM (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2008)
Asimismo en cultivos por lote de Providencia sp realizados con una concentracioacuten inicial
de Cr(VI) de 034 mM se obtuvo una velocidad especiacutefica de reduccioacuten del metal de
1302 mgg de biomasah (Thacker y col 2006)
En el presente trabajo se encontroacute que en el reactor airlift cada gramo (peso seco) de
biomasa producida de Candida sp pudo reducir 4438 mg de Cr(VI) (tabla 6) valor
ligeramente superior al encontrado en matraz [40 mg de Cr(VI)g de biomasa] y
semejante al reportado para Trichoderma inhamatum (Morales-Barrera y Cristiani-
Urbina 2008) Asimismo a las 60 h de incubacioacuten la capacidad de reduccioacuten de
Penicillium sp y Aspergillus sp fue de aproximadamente 082 y 042 mg de Cr(VI)g de
biomasa (Acevedo-Aguilar y col 2006) Wang y Shen (1997) reportaron que la
capacidad maacutexima de reduccioacuten de Cr(VI) de los cultivos aeroacutebicos de Bacillus sp y
75
Pseudomonas fluorescens LB300 fue de 208 x 10-12 y 310 x 10-12 mg de Cr(VI)ceacutelula
respectivamente si se toma en cuenta que el peso seco promedio de una ceacutelula
bacteriana tiacutepica es de aproximadamente 3 x 10-13 g (Atkinson y Mavituna 1983)
entonces la capacidad de reduccioacuten de Bacillus sp y P fluorescens LB300 seriacutea de 693 y
1033 mg de Cr(VI)g de biomasa respectivamente
43 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote repetido en el reactor airlift con
tubo conceacutentrico liso
Se realizaron algunos cultivos por lote repetido en el reactor airlift con tubo conceacutentrico
liso (sin perforaciones) En cada uno de los cultivos ensayados el reactor se inoculoacute
inicialmente con un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada de la
levadura para obtener una concentracioacuten inicial de biomasa de aproximadamente 12
mgmL La concentracioacuten inicial de Cr(VI) del medio de cultivo fue de aproximadamente
15 mM y el flujo de aire fue de 1 vvm El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que la
concentracioacuten de Cr(VI) residual en el medio fue baja (primer cultivo por lote) a
continuacioacuten una parte del medio de cultivo contenido en el reactor se drenoacute y se
adicionoacute medio fresco con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM Posteriormente el
reactor se operoacute nuevamente por lote (segundo cultivo por lote o cultivo por lote
repetido) Se ensayaron tres relaciones de recambio de medio de cultivo (f = volumen de
medio cosechadovolumen inicial de medio de cultivo) de 08 06 y 04
Debido a la importancia que tiene el pH del medio de cultivo en los procesos
microbioloacutegicos de reduccioacuten de Cr(VI) en el presente trabajo se llevaron a cabo cultivos
por lote repetido con relaciones de recambio de 06 y 08 en los que el pH del medio de
76
cultivo se ajustoacute a 60 al inicio del segundo cultivo por lote (cultivo por lote repetido) asiacute
como experimentos en los que el pH no se ajustoacute a 60 por lo que el pH inicial del cultivo
por lote repetido fue el alcanzado al final del primer cultivo por lote (cercano a 30) Es
conveniente mencionar que los valores bajos de pH inhiben el crecimiento de los
microorganismos pero favorecen la reduccioacuten del Cr(VI) a Cr(III) al ocurrir esto uacuteltimo
disminuye el efecto toacutexico de la forma hexavalente del metal
En estos experimentos se observoacute que el crecimiento de la levadura y la reduccioacuten de
Cr(VI) fueron adversamente afectados cuando el pH del medio de cultivo se ajustoacute a 60
al inicio de los cultivos por lote repetido En la figura 23 se muestra la variacioacuten de la
concentracioacuten de Cr(VI) residual en los cultivos por lote y lote repetido realizados con y
sin ajuste del pH al inicio de los cultivos por lote repetido cuando se utilizaron relaciones
de recambio de 06 y 08
77
Figura 23 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los cultivos por lote y lote
repetido realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizaron
00
100
200
300
400
500
600
700
800
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [m
gL
]
f = 08 spH
f = 08 cpH
CPL CPLR
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [m
gL
] f = 06 spH
f = 06 cpH
CPL CPLR
78
relaciones de recambio de 06 y 08 (spH = sin ajuste de pH del medio de cultivo al
inicio del cultivo por lote repetido cpH = con ajuste de pH del medio de cultivo a 60 al
inicio del cultivo por lote repetido)
En la figura se aprecia que en los primeros cultivos por lote el Cr(VI) fue totalmente o
casi completamente reducido en aproximadamente 45-49 h Sin embargo en los cultivos
por lote repetido el tiempo que se requirioacute para reducir el Cr(VI) fue mayor Asimismo es
evidente que se alcanzaron concentraciones de Cr(VI) residual maacutes bajas en los sistemas
por lote repetido en los que no se ajustoacute el pH al inicio de los cultivos
Los resultados anteriores sugieren que la levadura pierde parte de su capacidad de
reduccioacuten de Cr(VI) cuando se cultiva repetidamente en medios que contienen Cr(VI)
Estos resultados concuerdan con lo reportado por Wang y Shen (1997) quienes
encontraron que Bacillus sp Pseudomonas fluorescens LB300 y Escherichia coli ATCC
33456 pierden su capacidad para reducir Cr(VI) despueacutes de que han reducido 046-052
058 y 125 mM de Cr(VI) respectivamente Un comportamiento similar tambieacuten fue
reportado por Middleton y col (2003) para Shewanella oneidensis
Como los niveles maacutes altos de reduccioacuten de Cr(VI) se obtuvieron cuando no se ajustoacute el
pH a 60 al inicio de los cultivos por lote repetido el experimento en el que se ensayoacute
una relacioacuten de recambio de 04 uacutenicamente se llevoacute a cabo sin ajustar el pH
En la figura 24 se muestra la variacioacuten de la concentracioacuten celular en los sistemas por
lote y lote repetido a las tres diferentes relaciones de recambio ensayadas (04 06 y
08) cuando no se ajustoacute el pH al inicio de los cultivos por lote repetido Se aprecia que
en ninguno de los cultivos por lote repetido se alcanzaron densidades celulares cercanas
79
a las de los cultivos por lote que los precedioacute En los cultivos por lote repetido el
incremento celular y la velocidad especiacutefica de crecimiento maacutes altos se obtuvieron
cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 06 (tabla 8) sin embargo los valores
alcanzados fueron inferiores a los obtenidos en el cultivo por lote que los antecedioacute
Figura 24 Variacioacuten de la concentracioacuten de biomasa con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo ensayadas
00
05
10
15
20
25
30
35
40
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Co
nce
ntr
acioacute
n d
e b
iom
asa
[g
L]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
80
Tabla 8 Variables cineacuteticas del crecimiento celular y de la reduccioacuten de Cr(VI)
obtenidas en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp llevados a cabo en el
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Variable Cultivo por lote Cultivo por lote repetido
Relacioacuten de recambio
04 06 08
Incremento celular
maacuteximo [gL]
224 230 235 017 038 009
Velocidad especiacutefica maacutexima de
crecimiento [h-1]
00244 00227 00220 00044 00109 00017
Eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) []
999 980 973 96 93 36
Velocidad
volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI)Lh]
160 178 151 035 046 045
En los cultivos por lote repetido se necesitoacute de una mayor cantidad de tiempo para
consumir la glucosa presente en los medios en comparacioacuten con los cultivos por lote del
cual derivaron (figura 25) Asimismo en ninguno de los cultivos se consumioacute
totalmente la glucosa la mayor eficiencia de consumo del monosacaacuterido de los cultivos
por lote repetido se obtuvo cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 06 con un
valor de 783 el cual es cercano al obtenido en los primeros cultivos por lote
(aproximadamente 835)
81
Figura 25 Variacioacuten de la concentracioacuten de glucosa con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo utilizadas
En la figura 26 se muestran los perfiles de variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI)
residual en funcioacuten del tiempo de incubacioacuten a las diferentes relaciones de recambio de
medio de cultivo utilizadas Se aprecia que en los primeros cultivos por lote se alcanzaron
niveles de Cr(VI) residual maacutes bajos y en menor tiempo que en los cultivos por lote
repetido
00
20
40
60
80
100
120
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e g
luc
os
a r
es
idu
al [g
L]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
82
Figura 26 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo ensayadas
En los primeros cultivos por lote se alcanzaron eficiencias y velocidades volumeacutetricas
globales de reduccioacuten de Cr(VI) de 973 - 999 y de 151 - 178 mgLh
respectivamente (tabla 8) Estas velocidades son superiores a la alcanzada en el cultivo
por lote realizado en matraz [098 mg de Cr(VI)Lh] y semejantes a la obtenida
previamente en el reactor airlift [164 mg de Cr(VI)Lh]
En los cultivos por lote repetido la eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) maacutes baja se
obtuvo cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 08 y esto podriacutea deberse a que el
tiempo de incubacioacuten que se utilizoacute para este cultivo fue menor que para los otros A las
relaciones de recambio de 04 y 06 las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
[Cr(
VI)
] [m
gL
]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
83
fueron semejantes con valores de 96 y 93 respectivamente Estas uacuteltimas eficiencias
fueron ligeramente inferiores a las obtenidas en los cultivos por lote que los precedioacute
(973-999) Las mayores velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) se
obtuvieron a relaciones de recambio de 06 y 08 [aproximadamente 045 mgLh] sin
embargo fueron considerablemente inferiores a la de los cultivos por lote que los
antecedioacute
44 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa en un reactor airlift
con tubo conceacutentrico liso
Para este sistema el reactor se inoculoacute con 50 mL de inoacuteculo y se dejoacute operar por lote
durante 48 horas con el propoacutesito de incrementar la densidad celular A continuacioacuten se
suministroacute continuamente medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de
15 mM [78 mgL] y con un flujo volumeacutetrico de 378 mLh por lo que la velocidad de
dilucioacuten ensayada fue de 00076 h-1 Se permitioacute que el reactor alcanzara el estado
estacionario lo cual se corroboroacute mediante la determinacioacuten de la concentracioacuten de
biomasa asiacute como de glucosa y de Cr(VI) residual de muestras colectadas a diferentes
tiempos
En el estado estacionario los valores promedio de concentracioacuten de biomasa glucosa
Cr(VI) residual y de pH fueron de 016 gL 62 gL 46 mgL y 345 respectivamente
De estos resultados es evidente que la concentracioacuten de biomasa en el reactor fue muy
baja lo que probablemente ocasionoacute que se alcanzaran valores bajos de eficiencia de
consumo de glucosa (38) y de reduccioacuten de Cr(VI) (41) asiacute como de velocidad
volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) (024 mgLh)
84
Posteriormente se ensayoacute un flujo de alimentacioacuten de 5 mLh para operar con una
velocidad de dilucioacuten de 001 h-1 Sin embargo bajo estas condiciones se presentoacute el
fenoacutemeno de lavado celular en el cual no se detecta biomasa en el reactor Este
experimento se realizoacute varias veces y en todos los casos se obtuvo el mismo resultado
El lavado celular que ocurrioacute en el cultivo continuo de Candida sp podriacutea deberse a que
la velocidad de dilucioacuten que se utilizoacute (001 h-1) es muy cercana a la velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento de la levadura [de aproximadamente 00146 h-1 determinada en
cultivo por lote en medio de cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM]
por lo que la levadura no tuvo tiempo suficiente para duplicarse y fue desplazada del
reactor Ademaacutes el suministro continuo de medio de alimentacioacuten con Cr(VI) ocasiona
que la levadura esteacute constantemente sujeta a los efectos toacutexicos del metal Es decir la
baja velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento de la levadura y los efectos toacutexicos
continuos del metal fueron probablemente los factores que limitaron la eficiencia y
velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) en cultivo continuo
Debido a que ocurrioacute lavado celular a una velocidad de dilucioacuten de 001 h-1 ya no fue
posible ensayar velocidades maacutes altas Los resultados obtenidos en cultivo continuo de
una etapa indican que este sistema de reaccioacuten no es adecuado para la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp
En la tabla 9 se presentan datos sobre la reduccioacuten de Cr(VI) por microorganismos en
cultivos continuos en suspensioacuten o inmovilizados Hasta donde es de nuestro
85
conocimiento no hay informacioacuten disponible acerca de la reduccioacuten de Cr(VI) por
levaduras y hongos filamentosos en cultivo continuo
Tabla 9 Resumen de datos sobre la reduccioacuten microbiana de Cr(VI) en cultivo continuo
Microorganismo Cultivo Concentra-
cioacuten de
Cr(VI) [mM]
Velocidad
de
dilucioacuten
[h-1]
Velocidad
volumeacutetrica
de reduccioacuten
[mg de
CrLh]
Eficiencia
de
reduccioacuten
[]
Referencia
Pseudomonas
sp C7
Aerobio 12
12
0014
0017
073
093
88
91
Gopalan y
Veeramani
1994
Pseudomonas
fluorescens
LB300
Aerobio 011
009
009
002
005
009
016
017
022
57
39
28
DeLeo y
Ehrlich
1994
Escherichia coli
ATCC 33456
Aerobio 08 005
169 843 Bae y col
2000
Pseudomonas
mendocina
MCM B-180
Aerobio
05
15
20
022
014
011
57
108
113
99
99
99
Bhide y
col 1996
Microbacterium
liquefaciens
MP30
Aerobio
(ceacutelulas
inmovilizadas
en perlas de
polivinil
alcohol-
alginato)
005
0038
009
90
Pattanapip
it-paisal y
col 2001
Bacillus sp Aerobio
(ceacutelulas
inmovilizadas
en perlas de
vidrio Pyrex)
192
192
004
008
397
797
998
998
Chirwa y
Wang
1997
86
En un estudio realizado en cultivo continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de Pseudomonas
fluorescens LB300 se encontroacute que la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute desde
57 hasta 28 y que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal se incrementoacute de
016 a 022 mg de Cr(VI)Lh a medida que la velocidad de dilucioacuten se incrementoacute de
002 a 009 h-1 cuando se utilizoacute medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI)
de 009 mM (DeLeo y Ehrlich 1994)
Los resultados obtenidos en cultivo continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de otros
microorganismos han sido alentadores Gopalan y Veeramani (1994) ensayaron tres
velocidades de dilucioacuten de 0014 0017 y 0028 h-1 y encontraron que la maacutexima
eficiencia (91) y velocidad volumeacutetrica [093 mg de Cr(VI)Lh] de reduccioacuten de Cr(VI)
de Pseudomonas sp C7 se obteniacutea a una velocidad de dilucioacuten de 0017 h-1 cuando se
utilizoacute medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de 12 mM En el estudio
realizado por Bae y col (2000) con Escherichia coli ATCC 33456 la velocidad de dilucioacuten
se mantuvo constante a 005 h-1 y se obtuvo una eficiencia y una velocidad volumeacutetrica
de reduccioacuten de Cr(VI) de 843 y de 169 mg de Cr(VI)Lh respectivamente cuando
se utilizoacute una concentracioacuten de Cr(VI) de 08 mM en el medio de alimentacioacuten En cultivo
continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de Pseudomonas mendocina MCM B-180 Bhide y col
(1996) ensayaron el efecto de diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI) [de 05 a
20 mM] y de velocidades de dilucioacuten (011 a 022 h-1) sobre la reduccioacuten de Cr(VI)
Estos investigadores encontraron altas eficiencias (99) y velocidades de reduccioacuten [57
ndash 113 mg de Cr(VI)Lh]
Asimismo con la finalidad de reducir los efectos toacutexicos del Cr(VI) sobre los
microorganismos se ha propuesto el uso de ceacutelulas inmovilizadas en reactores continuos
87
de lecho fijo Las ceacutelulas de Microbacterium liquefaciens MP30 inmovilizadas en perlas de
alginato de calcio - polivinil alcohol fueron capaces de reducir el Cr(VI) con una
eficiencia del 90 y con una velocidad de 009 mg de Cr(VI)Lh cuando se utilizoacute medio
de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de 005 mM y una velocidad de dilucioacuten
de 0038 h-1 (Pattanapipitpaisal y col 2001) En un reactor de lecho fijo con ceacutelulas de
Bacillus sp inmovilizadas en perlas de vidrio Pyrex con un diaacutemetro de 3 mm se observoacute
que al incrementar la velocidad de dilucioacuten de 004 a 008 h-1 la eficiencia de reduccioacuten
de Cr(VI) se mantuvo constante (998) y que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de
Cr(VI) se incrementoacute de 397 a 797 mgLh (Chirwa y Wang 1997)
45 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular y la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo conceacutentrico de
malla de acero inoxidable y de vidrio perforado
Los reactores airlift con tubo conceacutentrico liso (reactores convencionales) no son
adecuados para llevar a cabo cultivos por lote alimentado (procesos con volumen
variable) ya que no es posible lograr una adecuada circulacioacuten del liacutequido a cualquier
volumen de medio de cultivo En los reactores airlift convencionales uacutenicamente se logra
una adecuada circulacioacuten del fluido cuando la altura del liacutequido es mayor que la del tubo
conceacutentrico Por ello para realizar cultivos por lote alimentado en reactores airlift es
necesario que existan diversos puntos de comunicacioacuten entre las secciones de ascenso y
descenso del reactor a lo largo de toda la longitud del tubo conceacutentrico En la literatura
se han descrito algunos reactores airlift que en su interior contienen dispositivos que
permiten la comunicacioacuten entre ambas secciones del reactor Los dispositivos maacutes
comunes son tubos de mallas metaacutelicas (net draft tube) (Tung y col 1997 Wu y Wu
1990 1991 Wu y col 1992) tubos conceacutentricos de vidrio con perforaciones
88
rectangulares (Cristiani-Urbina y col 2000) placas curvas colocadas coaxialmente
(Hagino y col 1982) y bafles (placas) perforados (Galiacutendez-Mayer y col 2001) Estos
dispositivos afectan las caracteriacutesticas hidrodinaacutemicas y de transferencia de masa y calor
de los reactores por lo que es conveniente evaluar su desempentildeo
En este trabajo se evaluoacute la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivos por lote
utilizando reactores airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable asiacute como de
vidrio con perforaciones circulares Estos cultivos se realizaron con dos flujos de aire de
05 y 1 vvm Estos experimentos tuvieron como propoacutesito principal el seleccionar el tubo
conceacutentrico maacutes adecuado para llevar a cabo posteriormente los cultivos por lote
alimentado y lote alimentado repetido
En la figura 27 se muestran las curvas de crecimiento celular cuando se utilizoacute el reactor
airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos de aire
ensayados El crecimiento celular de la levadura fue mayor cuando se utilizoacute un flujo de
aire de 1 vvm lo cual podriacutea deberse a una mayor oxigenacioacuten del medio de cultivo Los
niveles de Cr(VI) residual maacutes bajos tambieacuten se obtuvieron con un flujo de aire de 1 vvm
(figura 28) y eacutesto podriacutea deberse a la mayor densidad celular alcanzada bajo estas
condiciones
89
Figura 27 Curvas de crecimiento celular de Candida sp en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos de aire ensayados
Figura 28 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual en los cultivos por lote realizados
en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos
de aire ensayados
000
050
100
150
200
250
00 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Tiempo [h]
XX
O
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
00 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Tiempo [h]
Cr(
VI)
Re
sid
ual [
]
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
90
En los experimentos realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado se
observoacute un comportamiento opuesto al obtenido previamente con el tubo conceacutentrico de
malla metaacutelica El crecimiento celular (figura 29) y la reduccioacuten de Cr(VI) (figura 30)
en el reactor con tubo conceacutentrico perforado fueron mayores a un flujo de aire de 05
vvm
Figura 29 Curvas de crecimiento celular de Candida sp en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico de vidrio perforado a los dos flujos de aire ensayados
000
050
100
150
200
00 500 1000 1500 2000 2500
Tiempo [h]
XX
O
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
91
Figura 30 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual en los cultivos por lote realizados
en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de vidrio perforado a los dos flujos de aire
ensayados
En la tabla 10 se muestran algunas variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote
realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable y con
tubo conceacutentrico perforado de vidrio a los dos flujos de aire ensayados Ademaacutes la tabla
incluye los resultados obtenidos en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
00 500 1000 1500 2000 2500
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ual [
] Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
92
Tabla 10 Variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote realizados en el reactor
airlift con las diferentes configuraciones de tubo conceacutentrico
Cultivo por lote
Variable cineacutetica Tubo conceacutentrico
liso
Malla metaacutelica Tubo conceacutentrico perforado
10 vvm 05 vvm 10 vvm 05 vvm 05 vvm 10 vvm
Incremento celular
maacuteximo [gL]
263 072 142 123 106 082
Velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento [h-1]
00244 00059 00120 00149 00178 00093
Eficiencia global de
reduccioacuten de Cr(VI) ()
100 67 95 97 95 89
Velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) [mg de Cr(VI)Lh]
164 031 056 082 084 035
Comparando los resultados obtenidos en el reactor con tubo de malla metaacutelica y con el
de vidrio perforado la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) fue mayor cuando se
utilizoacute el tubo conceacutentrico perforado de vidrio y un flujo de aire de 05 vvm con un valor
promedio de dos experimentos independientes de 083 mgLh Sin embargo esta
velocidad es aproximadamente 494 inferior a la alcanzada con el tubo conceacutentrico liso
Los resultados de crecimiento celular (incremento celular maacuteximo y velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento) y de reduccioacuten de Cr(VI) (eficiencia y velocidad volumeacutetrica)
obtenidos en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable y de
vidrio perforado a los flujos de aire ensayados podriacutean sugerir que el grado de
oxigenacioacuten del medio de cultivo y la magnitud de los esfuerzos de corte que se alcanzan
durante la agitacioacuten neumaacutetica desempentildean un papel importante en la generacioacuten de
biomasa de Candida sp en los estados fisioloacutegicos de eacutesta y por consiguiente en la
93
reduccioacuten de Cr(VI) Debido a lo anterior seriacutea conveniente investigar la influencia de la
velocidad de aireacioacuten la cual afecta los patrones de flujo del fluido la magnitud de las
fuerzas de corte y la concentracioacuten del nutriente gaseoso en la fase fluida
Como las mayores eficiencias y velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) se
obtuvieron cuando se utilizoacute el tubo conceacutentrico perforado de vidrio y un flujo de aire de
05 vvm eacutestos fueron utilizados en los cultivos por lote alimentados que se llevaron a
cabo posteriormente
46 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote alimentado
repetido en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado
En los cultivos por lote alimentado el volumen de medio liacutequido en el reactor se
incrementa gradualmente a medida que aumenta el tiempo de incubacioacuten Este cambio
de volumen provoca una dilucioacuten de los componentes presentes en el medio de cultivo lo
cual dificulta la interpretacioacuten de los resultados Debido a lo anterior en los cultivos por
lote alimentado es conveniente expresar el cambio de las variables (biomasa sustrato
etc) en teacuterminos de masa y no de concentracioacuten y para ello es necesario conocer el
volumen de medio a los diferentes tiempos de incubacioacuten Por consiguiente en el
presente trabajo se estimaron las cantidades de biomasa glucosa y de Cr(VI) y se
expresaron en teacuterminos de masa A continuacioacuten se presentan las ecuaciones para
calcular la masa de las variables de intereacutes para este trabajo
Masa celular [g] = (concentracioacuten celular gL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
94
Masa de glucosa [g] = (concentracioacuten de glucosa gL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
Masa de Cr(VI) [mg] = (concentracioacuten de Cr(VI) mgL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
En los cultivos por lote alimentado y lote alimentado repetido se ensayaron dos flujos
volumeacutetricos de medio de alimentacioacuten de 659 y 1343 mLh que corresponden a
cargas maacutesicas de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh respectivamente Los cultivos por lote
alimentado realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado se iniciaron con
cultivos por lote (los resultados obtenidos en estos uacuteltimos cultivos se mostraron en la
seccioacuten anterior)
Cuando se utilizoacute una carga maacutesica de Cr(VI) de 0514 mgh en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) se observoacute que la masa celular
de la levadura en el primer cultivo por lote alimentado fue mayor que en la del segundo
cultivo Sin embargo a pesar de que la levadura tuvo un suministro constante de fuente
de carbono y energiacutea eacutesta praacutecticamente no crecioacute
Cuando se utilizoacute una carga maacutesica de Cr(VI) de 0514 mgh fue evidente que en los
cultivos por lote alimentado se fue acumulando glucosa en el medio de cultivo lo que
indica que las ceacutelulas casi no consumieron el monosacaacuterido que teniacutean disponible para su
crecimiento La cantidad de glucosa consumida por la levadura en el cultivo por lote
alimentado repetido (segundo cultivo por lote alimentado) fue considerablemente menor
que la consumida en el primer cultivo lo cual podriacutea deberse a que habiacutea una menor
cantidad de biomasa en el reactor En el segundo cultivo por lote alimentado se alcanzoacute
95
una eficiencia de consumo de glucosa del 68 en cambio en el primer cultivo fue del
263
Se observoacute que la levadura fue capaz de reducir parcialmente el Cr(VI) adicionado al
reactor y que en el primer cultivo por lote alimentado se lograron mayores niveles de
reduccioacuten
En el primer cultivo por lote alimentado las eficiencias de reduccioacuten de Cr(VI) maacutes altas
se alcanzaron durante el periodo de incubacioacuten de las 468 a las 967 h (7188-7292)
y disminuyeron ligeramente hasta el final de este cultivo (673-6945) En el segundo
cultivo por lote alimentado (lote alimentado repetido) las eficiencias disminuyeron
gradualmente a medida que se incrementoacute el tiempo de incubacioacuten (figura 31) La
eficiencia promedio de reduccioacuten de Cr(VI) del primer cultivo por lote alimentado fue de
689 y la del segundo cultivo alimentado fue de 56
96
Figura 31 Variacioacuten de la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) de Candida sp cuando se
utilizoacute una carga maacutesica del metal de 0514 mgh
La velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute progresivamente a medida
que transcurrieron los cultivos por lote alimentado desde 0181 hasta 0063 mgLh
(figura 32) estos valores son inferiores a los alcanzados en los cultivos por lote
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Efi
cie
nc
ia d
e r
ed
uc
cioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
CPLA1 CPLA2
97
Figura 32 Variacioacuten de la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Candida sp
en el cultivo por lote alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) llevados a
cabo con una carga maacutesica del metal de 0514 mgh
Posteriormente se realizoacute el cultivo por lote alimentado y lote alimentado repetido
utilizando una carga maacutesica de Cr(VI) de 105 mgh Se observoacute que en ambos cultivos
la masa celular de Candida sp se incrementoacute gradualmente a medida que se incrementoacute
el tiempo de incubacioacuten aunque al final de cada cultivo hubo una ligera disminucioacuten en la
cantidad de biomasa en el reactor En el primer cultivo por lote alimentado se alcanzoacute un
valor maacuteximo de 523 g de biomasa (incremento celular de 053 g) a las 637 h
mientras que en el segundo cultivo se alcanzoacute una cantidad maacutexima de biomasa de 435
g (incremento celular de 13 g) a las 1822 h totales de cultivo que corresponden a 893
h del cultivo por lote alimentado repetido
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica g
lob
al d
e
re
du
ccioacute
n d
e C
r(V
I) [
mg
de
Cr(V
I)L
h]
CPLA1 CPLA2
98
Asimismo se encontroacute que la levadura fue capaz de consumir parcialmente la glucosa
suministrada En el primer cultivo por lote alimentado se obtuvo una eficiencia de
consumo de glucosa del 299 mientras que en el segundo cultivo la eficiencia fue del
388 Estos resultados probablemente se deban a que el crecimiento de la levadura fue
mayor en el cultivo por lote alimentado repetido (incremento celular = 13 g) que en el
cultivo por lote alimentado que lo precedioacute (incremento celular = 053 g)
En los cultivos por lote alimentados llevados a cabo con una carga maacutesica de 105 mg de
Cr(VI) la levadura fue capaz de reducir parcialmente el Cr(VI) adicionado al reactor sin
embargo al final del primer cultivo por lote alimentado se lograron los niveles de
reduccioacuten maacutes altos
En el primer cultivo por lote alimentado la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) se
incrementoacute a medida que aumentoacute el tiempo de incubacioacuten alcanzaacutendose el valor maacutes
alto de eficiencia (529) a las 879 h de incubacioacuten En contraste en el segundo cultivo
por lote alimentado (alimentado repetido) la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute
continuamente conforme transcurrioacute el tiempo de cultivo Al final del cultivo por lote
alimentado repetido la eficiencia de reduccioacuten del metal fue del 43 (figura 33)
99
Figura 33 Variacioacuten de la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) de Candida sp cuando se
utilizoacute una carga maacutesica del metal de 105 mgh
En estos experimentos tambieacuten se observoacute que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de
Cr(VI) disminuyoacute continuamente durante todo el periodo de incubacioacuten desde 0226
hasta 0099 mgLh (figura 34)
0
10
20
30
40
50
60
0 50 100 150 200 250
Tiempo [h]
Efi
cie
ncia
de
re
du
ccioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
CPLA1 CPLA2
100
Figura 34 Variacioacuten de la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Candida sp
en el cultivo por lote alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) llevados a
cabo con una carga maacutesica del metal de 105 mgh
Las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) que se obtuvieron con una carga maacutesica
del metal de 105 mgh fueron inferiores a las logradas con una carga de 0514 mgh y
esto podriacutea deberse a que el tiempo de contacto entre la levadura y el medio de cultivo
fue menor En contraste las velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) fueron
ligeramente superiores a una carga maacutesica de 105 mgh
Con las dos cargas maacutesicas de Cr(VI) que se ensayaron en este trabajo se observoacute una
variacioacuten semejante en el pH de los medios de cultivo Los cultivos por lote alimentado
se iniciaron con un pH de 302-306 (estos valores corresponden al pH que se obtuvo al
final de los cultivos por lote que precedioacute a los cultivos por lote alimentado) El pH se
000
004
008
012
016
020
024
0 50 100 150 200 250
Tiempo [h]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica g
lob
al d
e r
ed
uccioacute
n
de
Cr(V
I) [
mg
de
Cr(V
I)L
h]
CPLA1 CPLA2
101
incrementoacute ligeramente durante el curso de los primeros cultivos por lote alimentado y al
final de eacutestos se tuvieron valores de 355 y de 345 cuando se emplearon cargas maacutesicas
de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh respectivamente En los cultivos por lote alimentado
repetido el pH se mantuvo praacutecticamente constante durante todo el periodo de
incubacioacuten
A pesar de que el cultivo por lote alimentado es muy recomendable para trabajar con
compuestos toacutexicos ha sido poco explorado para el tratamiento de aguas contaminadas
con cromo hexavalente Fujii y col (1990) utilizaron el cultivo por lote alimentado para
investigar la reduccioacuten de Cr(VI) por la bacteria anaerobia Enterobacter cloacae cepa
HO1 En este estudio una solucioacuten de cromato se alimentoacute continuamente en pequentildeas
dosis para minimizar el efecto toacutexico del metal Los investigadores encontraron que la
reduccioacuten de Cr(VI) fue fuertemente afectada por la velocidad especiacutefica de alimentacioacuten
de cromato Cuando esta velocidad fue inferior a 25 mmol de CrO42-g de biomasah
todo el cromo adicionado fue reducido A velocidades de alimentacioacuten superiores se
observoacute que la concentracioacuten de Cr(VI) residual en el medio de cultivo se incrementaba a
medida que aumentaba la velocidad de alimentacioacuten Asimismo encontraron que la
actividad reductora de la bacteria era fuertemente inhibida cuando la concentracioacuten de
Cr(VI) del medio de cultivo era mayor a 07 mM (3639 mgL)
Posteriormente Fujie y col (1996) realizaron la simulacioacuten de un cultivo por lote
alimentado utilizando datos cineacuteticos obtenidos en cultivo por lote y un modelo
matemaacutetico que describe el comportamiento de la bacteria antes mencionada Los
resultados experimentales y los predichos por el simulador fueron semejantes
102
En la tabla 11 se presentan los valores de velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
obtenidos en el presente trabajo en los diferentes sistemas de reaccioacuten ensayados La
mayor velocidad se obtuvo en el cultivo por lote realizado en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso por lo que eacuteste seriacutea el sistema maacutes adecuado para la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp
103
Tabla 11 Velocidades volumeacutetricas globales de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas en diferentes sistemas de reaccioacuten
CPL
Matraz
CPL Reactor
airlift con
tubo liso
CPL Reactor
airlift con
malla metaacutelica
CC Reactor
airlift con
tubo liso
CPLR Reactor
airlift con
tubo liso
CPL Reactor
airlift con tubo
perforado
CPLA Reactor
airlift con
tubo perforado
CPLAR Reactor
airlift con
tubo perforado
10
Vvm
05
vvm
10
vvm
10
vvm
10
vvm
05
vvm
10
vvm
05
vvm
05
vvm
f=08 f=06 f=04
CM1 CM2 CM1 CM2
098 151 ndash178 031 056 024 045 046 035 084 035 0092-0181
0163-0195
0063-0083
0099-0145
CPL = Cultivo por lote CC = Cultivo continuo CPLR = Cultivo por lote repetido CPLA = Cultivo por lote alimentado CPLAR = Cultivo por lote alimentado repetido f = relacioacuten de recambio CM = Carga maacutesica de Cr(VI)
CM1 = 0514 mg Cr(VI)h CM2 = 105 mg Cr(VI)h
104
5 CONCLUSIONES
El sulfato desempentildea un papel importante en la tolerancia al Cr(VI) y en la reduccioacuten
del mismo en la cepa de Candida sp utilizada en este trabajo
El efecto modulador del sulfato sobre el crecimiento celular y la reduccioacuten del Cr(VI)
depende de las concentraciones de los oxianiones sulfato y cromato
El mecanismo principal de remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp es la biotransformacioacuten
del altamente toacutexico Cr(VI) al menos toacutexico Cr(III)
El cultivo por lote en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso es el sistema de
reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
La velocidad de aireacioacuten no tiene un efecto significativo sobre la reduccioacuten de Cr(VI)
por Candida sp
105
6 REFERENCIAS
1 Acevedo-Aguilar FJ Espino-Saldantildea AE Leoacuten-Rodriacuteguez IL Rivera-Cano ME Avila-Rodriguez M Wrobel K et al 2006 Hexavalent chromium removal in vitro and from industrial wastes using chromate-resistant strains of filamentous
fungi indigenous to contaminated wastes Can J Microbiol 52 809-815
2 Ali-Awan M Baig MA Iqbal J Aslam MR amp Ijaz N 2003 Recovery of chromium (III) from tannery wastewater J App Sci amp Environ Management 7 (2) 5-8
3 Aacutelvarez SG Maldonado M Gerth A amp Kuschk P 2004 Characterization of
tannery effluents and study of the water Hyacinth in chromium recovery Informacioacuten Tecnoloacutegica 15 (3) 75-80
4 Aravindhan BM Madani B Rao JR Nair BU amp Ramasami T 2004 Bioaccumulation of Chromium from Tannery Wastewater An Approach for chrome
recovery and reuse Environ Sci Technol 38 300-306
5 Atkinson B amp Mavituna F 1983 Biochemical engineering and biotechnology handbook United Kingom Nature Press
6 Badar U Ahmed N Beswick AJ Pattanapipitpaisal P amp Macaskie LE 2000 Reduction of chromate by microorganisms isolated from metal contaminated sites of
Karachi Pakistan Biotechnol Lett 22 829-836 7 Bae WC Kang TG Kang IK Won YJ amp Jeong BC 2000 Reduction of
hexavalent chromium by Escherichia coli ATCC 33456 in batch and continuous cultures J Microbiol 38(1) 36-39
8 Balasubramanian S amp Pugalenthi V 1999 Determination of total chromium in
tannery wastewater by inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry
flame atomic absorption spectrometry and uv-visible spectrophotometric methods Talanta 50 (3) 457-467
9 Baldi F Vaughan AM amp Olson GJ 1990 Chromium(VI)-resistant yeast
isolated from a sewage treatment plant receiving tannery wastes Appl Environ
Microbiol 56 (4) 913-918
10 Barnhart J 1997 Occurrences uses and properties of chromium Regulatory Toxicology and Pharmacology 26 S3-S7
11 Beleza VM Boaventura RA amp Almeida MF 2001 Kinetics of chromium removal from spent tanning liquors using acetylene production sludge Environ
Sci Technol 35 (21) 4379-4383 12 Bhide JV Dhakephalkar PK amp Paknikar KM 1996 Microbiological process for
the removal of Cr(VI) from chromate-bearing cooling tower effluent Biotechnol Lett 18 (6)667-672
106
13 Bopp LH amp Ehrlich HL 1988 Chromate resistance and reduction in
Pseudomonas fluorescens strain LB300 Archives of Microbiology 150 426-431
14 Branco R Alpoim MC amp Morais PV 2004 Ochrobactrum tritici strain 5bvI1 ndash characterization of a Cr(VI)-resistant and Cr(VI)-reducing strain Can J Microbiol
50 697-703 15 Camargo FAO Bento FM Okeke BC amp Frankenberger WT 2002 Chromate
reduction by chromium-resistant bacteria isolated from soils contaminated with dichromate Journal of Environmental Quality 32 1228-1233
16 Camargo FAO Okeke BC Bento FM amp Frankenberger WT 2003 In vitro
reduction of hexavalent chromium by a cell-free extract of Bacillus sp ES 29
stimulated by Cu2+ Appl Microbiol Biotechnol 62 569-573
17 Cantildeizares-Villanueva R 2000 Biosorcioacuten de metales pesados mediante el uso de biomasa microbiana Rev Latinoam Microbiol 42 131-143
18 Cervantes C Campos-Garciacutea J Devars S Gutieacuterrez-Corona F Loza-Tavera H Torres-Guzmaacuten JC amp Moreno-Saacutenchez R 2001 Interactions of chromium with
microorganisms and plants FEMS Microbio Rev 25 335-347 19 Chardin B Dolla A Chaspoul F Fardeau ML Gallice P amp Bruschi M 2002
Bioremediation of chromate thermodynamic analysis of the effects of Cr(VI) on sulfate-reducing bacteria Appl Microbiol Biotechnol 60 352-360
20 Chardin B Giudici-Orticoni MT De Luca G Guigliarelli B amp Bruschi M 2003
Hydrogenases in sulfate-reducing bacteria function as chromium reductase Appl
Microbiol Biotechnol 63 315-321
21 Cheung Y amp Gu G 2003 Reduction of chromate (CrO42-) by an enrichment
consortium and an isolate of marine sulfate-reducing bacteria Chemosphere 52 1523-1529
22 Cheung KH amp Gu JD 2005 Chromate reduction by Bacillus megaterium TKW3
isolated from marine sediments World Journal of Microbiology amp Biotechnology 21 213-219
23 Cheung KH amp Gu JD 2007 Mechanism of hexavalent chromium detoxification
by microorganisms and bioremediation application potential a review International
Biodeterioration amp Biodegradation 59 8-15
24 Chirwa EMN amp Wang YT 1997 Hexavalent chromium reduction by Bacillus sp in a packed-bed bioreactor Environ Sci Technol 31 1446-1451
25 Cristiani-Urbina E Netzahuatl-Muntildeoz AR Manriquez-Rojas FJ Juaacuterez-Ramiacuterez C Ruiz-Ordaz N amp Galiacutendez-Mayer J 2000 Batch and fed-batch
cultures for the treatment of whey with mixed yeast cultures Process Biochemistry 35 649-657
107
26 Czakoacute-Veacuter K Batiegrave M Raspor P Sipiczki M amp Pesti M 1999 Hexavalent
chromium uptake by sensitive and tolerant mutants of Schizosaccharomyces pombe FEMS Microbiology Letters 178 109-115
27 DeLeo PC amp Ehrlich HL 1994 Reduction of hexavalent chromium by
Pseudomonas fluorescens LB300 in batch and continuous cultures Appl Microbiol Biotechnol 40 756-759
28 Desjardin V Bayard R Lejeune P amp Gourdon R 2003 Utilization of supernatant of pure cultures of Streptomyces thermocarboxydus NH50 to reduce
chromium toxicity and mobility in contaminated soils Water Air and Soil Pollut 3 153-160
29 Eccles H 1999 Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process TIBTECH 17 462-465
30 Faisal M amp Hasnain S 2004 Comparative study of Cr(VI) uptake and reduction in
industrial effluent by Ochrobactrum intermedium and Brevibacterium sp
Biotechnology Letters 26 1623-1628
31 Fruchter J 2002 In situ treatment of chromium-contaminated groundwater Environ Sci amp Technol pp 464-472
32 Fujie K Hu H Huang X Tanaka Y Urano K amp Ohtake H 1996 Optimal operation of bioreactor system developed for the treatment of chromate wastewater
using Enterobacter cloacae HO-1 Wat Sci Tech 33 (5-6) 173-182 33 Fujii E Toda K amp Ohtake H 1990 Bacterial reduction of toxic hexavalent
chromium using a fed-batch culture of Enterobacter cloacae strain HO1 J Ferment Bioeng 69 (6) 365-367
34 Gaballah I Goy D Kilbertus G amp Thauront J 1994 Decontamination of
industrial effluents for environment protection and recycling of metals Resources
Conservation and Recycling 10 (1-2) 97-106
35 Galiacutendez-Mayer J Saacutenchez-Teja O Cristiani-Urbina E amp Ruiz-Ordaz N 2001 A novel split-cylinder airlift reactor for fed-batch cultures Bioprocess and Biosystems
Engineering 24 171-177 36 Ganguli A amp Tripathi AK 1999 Survival and chromate reducing ability of
Pseudomonas aeruginosa in industrial effluents Lett Appl Microbiol 28 76-80
37 Garbisu C Alkorta I Llama MJ amp Serra JL 1998 Aerobic chromate reduction by Bacillus subtilis Biodegradation 9 133-141
38 Gonzaacutelez AR Ndungrsquou K amp Flegal AR 2005 Natural occurrence of hexavalent chromium in the Aromas Red Sands Aquifer California Environ Sci Technol 39
(15) 5505-5511
108
39 Gopalan R amp Veeramani H 1994 Studies on microbial chromate reduction by
Pseudomonas sp in aerobic continuous suspended growth cultures Biotechnology and Bioengineering 43 471-476
40 Guertin J Jacobs JA amp Avakian CP 2005 Chromium(VI) Handbook 1st
edition CRC Press USA 41 Hach Water Analysis Handbook 2002 Hach Company Colorado USA 4th ed
pp 433-444 1210-1211
42 Hafez AI El-Manharawy MS amp Khedr MA 2002 RO membrane removal of unreacted chromium from spent tanning effluent A pilot-scale study Part 2 Desalination 144 (1-3) 237-242
43 Hagino H Odagiri H amp Okutani J 1982 Draft device for a bubble column US
Patent 4327042 44 Horitsu H Futo S Miyazawa Y Ogai S amp Kawai K 1987 Enzymatic
reduction of hexavalent chromium by hexavalent chromium tolerant Pseudomonas ambigua G-1 Agric Biol Chem 51 (9) 2417-2420
45 Ishibashi Y Cervantes C amp Silver S 1990 Chromium reduction in Pseudomonas
putida Appl Environ Microb 56 (7) 2268-2270
46 Jianlong W Zeyu M amp Xuan Z 2004 Response of Saccharomyces cerevisiae to
chromium stress Process Biochem 39 1231-1235 47 Juvera-Espinosa J Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2006 Isolation and
characterization of a yeast strain capable of removing Cr(VI) Enzyme and Microbial Technology 40 114-121
48 Kaszycki P Fedorovych D Ksheminska H Babyak L Gonchar MV Jaglarz
A amp Koloczek H 2003 Modulation of chromium(VI) and (III) tolerance and
accumulation in yeast by sulfate-containing salts European Journal of Biochemistry 1 (1) P49-53
49 Komori K Wang P Toda K amp Ohtake H 1989 Factors affecting chromate
reduction in Enterobacter cloacae Strain HO1 Appl Microbiol Biotechnol 31 567-570
50 Ksheminska H Fedorovych D Babyak L Yanovych D Kaszycki P amp Koloczek H 2005 Chromium(III) and (VI) tolerance and bioaccumulation in
yeast a survey of cellular chromium content in selected strains of representative genera Process Biochem 40 1565-1572
51 Ksheminska HP Honchar TM Gayda GZ amp Gonchar MV 2006 Extra-cellular chromate-reducing activity of the yeast cultures Central European Journal of
Biology 1 (1)137-149
109
52 Kurniawan TA Chan GYS Lo W amp Babel S 2006 Physico-chemical
treatment techniques for wastewater laden with heavy metals Chemical Engineering Journal 118 83-98
53 Labra M Grassi F Imazio S Di Fabio T Citterio S Sgorbati S amp Agradi E
2004 Genetic and DNA-methylation changes induced by potassium dichromate in Brassica napus L Chemosphere 54 1049-1058
54 Laxman RS amp More S 2002 Reduction of hexavalent chromium by Streptomyces griseus Minerals Engineering 15 831-837
55 Leustek T 2002 Sulfate metabolism The Arabidopsis Book American Society of
Plant Biologists
56 Liu YG Xu WH Zeng GM Li X and Gao H 2006 Cr(VI) reduction by
Bacillus sp isolated from chromium landfill Process Biochemistry 41 1981-1986 57 Llovera S Bonet R Simon-Pujol MD amp Congregado F 1993 Effect of culture
medium ions on chromate reduction by resting cells of Agrobacterium radiobacter Appl Microbiol Biotechnol 39 424-426
58 Lloyd JR 2003 Microbial reduction of metals and radionuclides FEMS Microbiol
Rev 27 411-425
59 Marsh TL amp McInerney MJ 2001 Relationship of hydrogen bioavailability to
chromate reduction in aquifer sediments Appl Environ Microb 67 (4) 1517-1521
60 McLean J amp Beveridge TJ 2001 Chromate reduction by a pseudomonad isolated from a site contaminated with chromated copper arsenate Applied and
Environmental Microbiology 67 (3)1076-1084 61 Megharaj M Avudainayagam S amp Naidu R 2003 Toxicity of hexavalent
chromium and its reduction by bacteria isolated from soil contaminated with tannery waste Current Microbiology 47 51-54
62 Middleton SS Latmani RB Mackey MR Ellisman MH Tebo BM amp Criddle
CS 2003 Cometabolism of Cr(VI) by Shewanella oneidensis MR-1 produces cell-associated reduced chromium and inhibits growth Biotechnol Bioeng 83 627-637
63 Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2006 Removal of hexavalent chromium
by Trichoderma viride in an airlift bioreactor Enzyme and Microbial Technology 40 107-113
64 Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2008 Hexavalent chromium removal by Trichoderma inhamatum fungal strain isolated from tannery effluent Enzyme and
Microbial Technology 40 107-113
110
65 Morales B L 2005 Aislamiento de microorganismos y estudio de su capacidad
para remover cromo hexavalente Tesis de Maestriacutea Escuela Nacional de Ciencias Bioloacutegicas IPN Meacutexico
66 Muter O Patmalnieks A amp Rapoport A 2001 Interrelations of the yeast Candida
utilis and Cr(VI) metal reduction and its distribution in the cell and medium Process Biochem 36 963-970
67 Ohtake H Cervantes C amp Silver S 1987 Decreased chromate uptake in Pseudomonas fluorescens carrying a chromate resistance plasmid J Bacteriol 169
3853-3856 68 Pal N 1997 Reduction of hexavalent chromium to trivalent chromium by
Phanerochaete chrysosporium pp 511-517 En Alleman BC amp Leeson A In Situ and On-Site Bioremediation Vol 2 Battelle Press Ohio USA
69 Pattanapipitpaisal P Brown NL amp Macaskie LE 2001 Chromate reduction by
Microbacterium liquefaciens immobilised in polyvinyl alcohol Biotechnol Lett 23
61-65
70 Pepi M amp Baldi F 1992 Modulation of chromium(VI) toxicity by organic and inorganic sulfur species in yeasts from industrial wastes BioMetals 5 179-185
71 Quintana M Curutchet G amp Donati E 2001 Factors affecting chromium(VI) reduction by Thiobacillus ferrooxidans Biochemical Engineering Journal 9 11-15
72 Ramiacuterez-Ramiacuterez R Calvo-Meacutendez C Aacutevila-Rodriacuteguez M Lappe P Ulloa M
Vaacutezquez-Juaacuterez R amp Gutieacuterrez-Corona JF 2004 Cr(VI) reduction in a chromate-
resistant strain of Candida maltosa isolated from the leather industry Antonie van Leeuwenhoek 85 63-68
73 Rege MA Petersen JN Johnstone DL Turick CE Yonge DR amp Apel WA
1997 Bacterial reduction of hexavalent chromium by Enterobacter cloacae strain
HO1 grown on sucrose Biotechnol Lett 19 (7) 691-694
74 Roukas T 1993 Ethanol production from nonsterilized carob pod extract by free and immobilized Saccharomyces cerevisiae cells using fed-batch culture
Biotechnol Bioeng 43 189-194 75 Ruiacutez MA 2000 Recuperacioacuten de metales pesados de soluciones diluidas por
biosorcioacuten con bacteria En Medrano RH Galan WL Biotecnologiacutea de Minerales CONACYT Meacutexico pp 235-262
76 Saxena D Levin R amp Firer MA 2000 Removal of chromate from industrial
effluent by a new isolate of Staphylococcus cohnii Wat Sci Technol 42 (1-2)
93-98
77 Secretariacutea de Comercio y Fomento Industrial NMX-AA-74-1981 Anaacutelisis de Agua ndash Determinacioacuten del Ioacuten Sulfato
111
78 Secretariacutea de Economiacutea NMX-AA-051-SCFI-2001 Anaacutelisis de Agua -
Determinacioacuten de Metales por Absorcioacuten Atoacutemica en Aguas Naturales Potables Residuales y Residuales Tratadas - Meacutetodo de Prueba
79 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NMX-AA-044-SCFI-
2001 Anaacutelisis de Aguas - Determinacioacuten de Cromo Hexavalente en Aguas Naturales Potables Residuales y Residuales Tratadas - Meacutetodo de Prueba En Diario Oficial de la Federacioacuten 1 de agosto 2001
80 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996
Liacutemites Maacuteximos Permisibles de Contaminantes en las Descargas de Aguas Residuales en Aguas y Bienes Nacionales En Diario Oficial de la Federacioacuten 6 de enero 1997
81 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996
Liacutemites Maacuteximos Permisibles de Contaminantes en las Descargas de Aguas Residuales a los Sistemas de Alcantarillado Urbano o Municipal En Diario Oficial de la Federacioacuten 3 de junio 1998
82 Secretariacutea de Salud Proyecto de Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-
NOM-127-SSA1-1994 Salud Ambiental Agua para Uso y Consumo Humano - Liacutemites Permisibles de Calidad y Tratamientos a que debe Someterse el Agua para su Potabilizacioacuten En Diario Oficial de la Federacioacuten 20 de Octubre 2000
83 Shakoori AR Makhdoom M amp Haq RU 2000 Hexavalent chromium reduction
by a dichromate-resistant gram-positive bacterium isolated from effluents of tanneries Appl Microbiol amp Biotechnol 53 (3) 348-351
84 Shen H and Wang YT 1994 Biological reduction of chromium by E coli Journal of Environmental Engineering 120 560-572
85 Shen H amp Wang Y 1995 Hexavalent chromium removal in two-stage bioreactor
system J Environ Eng 121 (11) 798-804
86 Smith WA Apel WA Petersen JN amp Peyton BM 2002 Effect of carbon and
energy source on bacterial chromate reduction Bioremediation J 6 (3) 205-215
87 Smith WL amp Gadd GM 2000 Reduction and precipitation of chromate by mixed culture sulphate-reducing biofilms J Appl Microbiol 88 983-991
88 Song Z Williams CJ amp Edyvean RGJ 2004 Treatment of tannery wastewater by chemical coagulation Desalination 164 (3) 249-259
89 Srinath T Verma T Ramteke PW amp Garg SK 2002 Chromium (VI)
biosorption and bioaccumulation by chromate resistant bacteria Chemosphere 48
(4) 427-435
90 Stanbury PF amp Whitaker A ―Principles of Fermentation Technology Pergamon Press Ltd Great Britain 1984 First edition Pp 11-24
112
91 Stasinakis AS Mamais D Thomaidis NS amp Lekkas TD 2002 Effect of
chromium (VI) on bacterial kinetics of heterotrophic biomass of activated sludge Water Res 36 3341-3349
92 Stasinakis AS Thomaidis NS Mamais D Karivali M amp Lekkas TD 2003
Chromium species behaviour in the activated sludge process Chemosphere 52 1059-1067
93 Stephen JR amp Macnaughton SJ 1999 Developments in terrestrial bacterial remediation of metals Current Opinion in Biotechnology 10 230-233
94 Su C amp Ludwig RD 2005 Treatment of hexavalent chromium in chromite ore
processing solid waste using a mixed reductant solution of ferrous sulfate and
sodium dithionite Environ Sci Technol 39 (16) 6208-6216
95 Thacker U Parikh R Shouche Y amp Madamwar D 2006 Hexavalent chromium reduction by Providencia sp Process Biochem 41 1332-1337
96 Thacker U amp Madamwar D 2005 Reduction of toxic chromium and partial localization of chromium reductase activity in bacterial isolate DM1 Would Journal
of Microbiology amp Biotechnology 21 891-899 97 Tung HL Chiou SY Tu CC amp Wu WT 1997 An airlift reactor with double
net draft tubes and its application in fermentation Bioprocess Eng 171-5
98 Turick CE Apel WA amp Carmiol NS 1996 Isolation of hexavalent chromium-reducing anaerobes from hexavalent-chromium-contaminated and noncontaminated environments Applied Microbiol Biotechnol 44 683-688
99 Viamajala S Peyton BM Sani RK Apel WA amp Petersen JN 2004 Toxic
effects of chromium(VI) on anaerobic and aerobic growth of Shewanella oneidensis MR-1 Biotechnol Prog 20 87-95
100 Volesky B amp Vieira RHSF 2000 Biosorption a solution to pollution Internat Microbiol 3 17-24
101 Wang DIC Cooney CL Demain AL Dunnill P Humphrey AE amp Lilly MD
1979 ―Fermentation and Enzyme Technology John Wiley amp Sons Inc USA Pp 98-115
102 Wang YT and Shen H 1997 Modelling Cr(VI) reduction by pure bacterial cultures Water Research 31 727-732
103 Wang Y amp Xiao C 1995 Factors affecting hexavalent chromium reduction in pure
cultures of bacteria Water Res 29 (11) 2467-2474
104 Wang Y 2000 Microbial reduction of chromate En Lovley DR (Ed)
Environmental Microbe-Metal Interactions ASM Press Washington DC USA pp 225-235
113
105 Wilkin RT Su C Ford RG amp Paul CJ 2005 Chromium-removal processes
during groundwater remediation by a zerovalent iron permeable reactive barrier Environ Sci Technol 39 (12) 4599-4605
106 Worthington Biochemical Corporation 1972 Worthington Enzyme Manual
Enzymes Enzyme Reagents and Related Biochemicals Freehold New Jersey USA
107 Wu J amp Wu WT 1991 Fed-batch culture of Saccharomyces cerevisiae in an airlift reactor with net draft tube Biotechnol Prog 7 230-233
108 Wu WT amp Wu JY 1990 Airlift reactor with net draught tube J Ferm Bioeng
70 359-361
109 Wu WT Wu JY amp Jong JZ 1992 Mass transfer in an airlift reactor with a net
draft tube Biotechnol Prog 8 465-468 110 Zakaria ZA Zakaria Z Surif S amp Ahmad WA 2006 Hexavalent chromium
reduction by Acinetobacter haemolyticus isolated from heavy-metal contaminated wastewater J Hazard Mater 146 30-38
111 Zuacutentildeiga M 2005 Aislamiento de microorganismos con capacidad para remover
cromo hexavalente del agua Tesis de Licenciatura Escuela Nacional de Ciencias
Bioloacutegicas IPN Meacutexico
Referencias electroacutenicas
httpepagov httpesepagovtechpubs412304html
httpfaiunneeduarbiologiamicroindcultivo20y20biorreactoreshtm httpmineralserusgsgovmineralspubscommoditychromium180494pdf
httpuserpagesumbcedu gferre1bmcohtml
httpuserpagesumbcedu gferre1fedbatchhtml httpwwgemesmaterialdocument httpwwwatsdrcdcgovfacts7 html
httpwwwchemicalelementscomelementscrhtml httpwwwepagoviris
wwwclu-inorgdownloadstudentpapersbio_of_metals_paperpdf
114
7 Impacto
En este trabajo se identificaron algunas variables ambientales que afectan la
biorreduccioacuten de cromo hexavalente [Cr(VI)] La informacioacuten obtenida podriacutea ser de
utilidad para mejorar los procesos de reduccioacuten del metal asiacute como para disminuir los
tiempos y costos del tratamiento de los efluentes industriales contaminados con Cr(VI)
Los resultaron mostraron que el sulfato afecta la tolerancia de Candida sp al Cr(VI) y a
su capacidad para reducirlo Fue evidente que a medida que se incrementoacute la
concentracioacuten de sulfato aumentoacute el crecimiento de la levadura la eficiencia global y la
velocidad global de reduccioacuten de Cr(VI) Asimismo se encontroacute que la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp depende de la densidad celular de los cultivos de manera tal que
a mayor cantidad de biomasa producida mayor es la reduccioacuten del metal Aun cuando la
cepa de Candida sp es sensible a los efectos toacutexicos del Cr(VI) en ausencia del sulfato
esta levadura posee una notable capacidad para reducir muy altas concentraciones de
Cr(VI) en presencia de sulfato por lo que podriacutea ser potencialmente uacutetil para el
tratamiento de aguas industriales altaminadas con Cr(VI) y con iones sulfato
Hasta donde sabemos este es el primer trabajo en el que se demuestra que el sulfato
desempentildea un papel impotante tanto en la tolerancia al Cr(VI) como en la reduccioacuten
aeroacutebica del mismo en microorganismos Estos descubrimientos podriacutean tener
implicaciones importantes en el tratamiento de aguas residuales contaminadas con
Cr(VI)
Ademaacutes se encontroacute que los contactores gas-liacutequido son adecuados para la reduccioacuten
aeroacutebica de Cr(VI) por Candida sp Esto uacuteltimo es de vital importancia porque seriacutea
posible disminuir significativamente los costos de tratamiento ya que estos biorreactores
se caracterizan por su baja economiacutea de aireacioacuten Las velocidades volumeacutetrica y
especiacutefica asiacute como la capacidad de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por Candida sp en el
reactor airlift con tubo conceacutentrico fueron superiores a las obtenidas en matraz y eacutesto
podriacutea deberse a que en el reactor airlift la levadura tuvo una mayor cantidad de oxiacutegeno
disponible para su crecimiento y a que el mayor nuacutemero de ceacutelulas producidas fue la
responsable de reducir maacutes eficazmente el Cr(VI) presente en el medio de cultivo
115
Las caracteriacutesticas mostradas por Candida sp en el dispositivo airlift indican que este
tipo de reactor neumaacutetico es adecuado para el crecimiento y la reduccioacuten aeroacutebica del
Cr(VI) por la levadura Asimismo los paraacutemetros cineacuteticos del proceso de reduccioacuten de
Cr(VI) catalizado por Candida sp son superiores a los reportados para otros
microorganismos lo que sugiere que esta cepa de levadura tiene potencial biotecnoloacutegico
para ser utilizada en procesos de remediacioacuten de aguas residuales industriales
contaminadas con Cr(VI)
De los diferentes sistemas de reaccioacuten ensayados (cultivos por lote lote repetido
continuo de una etapa lote alimentado y lote alimentado repetido) el cultivo por lote es
el maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
Otra de las contribuciones de este trabajo fueron la formacioacuten de recursos humanos
tanto a nivel licenciatura como de posgrado Uno de los estudiantes de licenciatura ya
sustentoacute su examen profesional y la tesis de Maestriacutea de otra estudiante ya fue revisada
y aprobada por los sinodales por lo que el examen para obtener el grado se realizaraacute en
poco tiempo Actualmente estaacuten en proceso 1 tesis de licenciatura 2 de maestriacutea y 1 de
doctorado
Entre otros productos del proyecto de investigacioacuten se tienen la publicacioacuten de 2 artiacuteculos
en revistas internacionales incluidas en la base de datos del Journal of Citation Reports
del Institute for Scientific Information (ISI) la publicacioacuten de 2 artiacuteculos en extenso en
las memorias de Congresos Internacionales y la presentacioacuten de varios trabajos en
eventos acadeacutemicos nacionales e internacionales
5
millones de toneladas cuacutebicas de las cuales el 912 fue utilizada por la industria
metaluacutergica el 52 por la industria quiacutemica el 28 por la industria de la fundicioacuten y el
08 por la industria refractaria
(httpmineralserusgsgovmineralspubscommoditychromium180494pdf) Los
principales paiacuteses productores de cromita son Sudaacutefrica Kazakhstan India Zimbawe
Finlandia Brasil y Turquiacutea
(httpmineralserusqsgovmineralspubscommoditychromium180494pdf)
El cromo metaacutelico [Cr(0)] no se encuentra en forma natural en el medio ambiente sino
que es generado por procesos industriales Se le usa principalmente en la produccioacuten de
acero y de otras aleaciones metaacutelicas (httpwwwatsdrcdcgovfacts7html)
El cromo trivalente se encuentra en la naturaleza en minerales por ejemplo como
cromato de fierro (FeCr2O4) Este estado de oxidacioacuten del cromo forma precipitados de
oacutexidos hidroacutexidos o sulfatos y por consiguiente es menos moacutevil que la forma
hexavalente En el suelo se le encuentra unido principalmente a la materia orgaacutenica
(Jianlong y col 2004 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004 Cervantes y col 2001)
El cromo trivalente es un nutriente esencial tanto para los seres humanos como para los
animales ya que tiene un papel importante en el metabolismo de la glucosa de liacutepidos y
de proteiacutenas Asimismo se considera que potencia el reconocimiento de la insulina por
las ceacutelulas por lo que podriacutea tener aplicaciones para el tratamiento de la diabetes
(Garbisu y col 1998 Wang 2000 Lloyd 2003 Ksheminska y col 2005)
6
La FDA (Food and Drug Administration) ha propuesto un consumo diario (Reference Daily
Intake) de cromo de 120 gd en adultos (httpwwwepagoviris) Algunas fuentes de
cromo son el broacutecoli la levadura de cerveza el hiacutegado quesos granos integrales y
cereales (Guertin y col 2005)
No es comuacuten encontrar cromo hexavalente en forma natural en el medio ambiente y
cuando se le encuentra generalmente es como cromato de plomo PbCrO4
(httpwwwatsdrcdcgovfacts7html) Su presencia en el ambiente se debe
principalmente a las actividades realizadas por el hombre (wwwclu-
inorgdownloadstudentpapersbio_of_metals_paperpdf) En soluciones acuosas el
Cr(VI) generalmente se encuentra presente como oxianioacuten cromato [CrO42-] yo
dicromato [Cr2O72-] dependiendo del pH de la solucioacuten
Debido a su naturaleza fuertemente oxidante el cromo hexavalente puede reaccionar
con la materia orgaacutenica o con agentes reductores con lo que se forma cromo trivalente
Esta transformacioacuten ocurre maacutes raacutepidamente en ambientes aacutecidos tales como en suelos
con pH bajo (Cervantes y col 2001 Jianlong y col 2004)
En el aire el cromo hexavalente ocasionalmente reacciona con partiacuteculas de polvo o con
otros contaminantes con lo que se convierte en cromo trivalente En aguas superficiales
ricas en materia orgaacutenica el Cr(VI) exhibe un tiempo de vida corto en ese estado de
oxidacioacuten (httpwwwepagoviris)
7
13 Toxicidad del cromo
La EPA (Environmental Protection Agency) considera al cromo hexavalente - y a sus
derivados - como uno de los diecisiete agentes quiacutemicos de mayor peligrosidad para la
salud puacuteblica y para el medio ambiente (Marsh y McInerney 2001)
Al ser humano el cromo hexavalente le puede provocar dantildeo al rintildeoacuten e hiacutegado asiacute como
alteraciones neuroloacutegicas La inhalacioacuten de cromo hexavalente en niveles mayores a 2
microgm3 puede causar irritacioacuten de las mucosas comezoacuten hemorragias uacutelceras y
perforacioacuten del tabique nasal (httpwwwatsdrcdcgovfacts7html)
Se ha encontrado que algunas personas son extremadamente sensibles al contacto de su
piel con el cromo hexavalente Algunas de las reacciones aleacutergicas detectadas consisten
en el enrojecimiento marcado de la piel e hinchazoacuten
(httpwwwatsdrcdcgovfacts7html Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos
Naturales y Pesca NMX-AA-044-SCFI-2001 httpwwwepagoviris Ksheminska y
col 2005)
La EPA clasifica a los compuestos del cromo hexavalente en el grupo A el cual incluye a
los agentes carcinogeacutenicos para el hombre Ademaacutes el cromo hexavalente tiene efecto
mutageacutenico y teratogeacutenico en animales y humanos (Wang 2000
httpwwwatsdrcdcgovfacts7html Smith y col 2002)
El cromo hexavalente tambieacuten es toacutexico para la mayoriacutea de los microorganismos auacuten a
bajas concentraciones debido a que reduce su actividad enzimaacutetica afecta sus procesos
metaboacutelicos y les produce mutaciones (Wang 2000) Lo anterior tiene gran impacto en
8
los sistemas de tratamiento bioloacutegico de aguas residuales ya que reduce
significativamente la eficiencia de remocioacuten de los contaminantes y la calidad del efluente
(Stasinakis y col 2002 2003)
En las plantas el cromo hexavalente reduce la actividad de las enzimas fotosinteacuteticas y
en general de las proteiacutenas (Morales 2005) ocasiona enfermedades como la clorosis e
interfiere en diversos procesos metaboacutelicos que causan finalmente la muerte de estos
organismos Asimismo se ha demostrado que rompe la unioacuten azuacutecar-fosfato de la
cadena de aacutecido desoxirribonucleico (DNA) y produce una hiper-metilacioacuten de las bases
nitrogenadas lo que ocasiona mutaciones al azar (Labra y col 2004)
Diversos estudios han demostrado que el cromo hexavalente es cien veces maacutes toacutexico
(Garbisu y col 1998) y mil veces maacutes mutageacutenico que el estado trivalente (Wang
2000 Saxena y col 2000 Lloyd 2003)
14 Cantidad de cromo liberado al medio ambiente y legislacioacuten ambiental
Se estima que maacutes de 170000 toneladas de residuos que contienen cromo se descargan
al medio ambiente cada antildeo (Marsh y McInerney 2001) En la tabla 1 se muestran
algunos datos reportados sobre el contenido de cromo en algunos efluentes industriales
asiacute como en aguas superficiales y freaacuteticas Se puede apreciar que la concentracioacuten de
cromo de los efluentes variacutea considerablemente incluso en los del mismo sector
industrial
9
Tabla 1 Concentraciones de cromo total yo Cr(VI) de efluentes industriales y cuerpos
de agua
Fuente Concentracioacuten de cromo total
Concentracioacuten de Cr (VI)
Referencia
Industria galvanizadora ---
5000 mgL
Gaballah y col 1994
Industria galvanizadora (1) Industria galvanizadora (2)
---
---
127 mgL
3700 mgL
Fujie y col 1996
Acuiacutefero Aromas Red Sands (California)
---
6-36 gL
Gonzaacutelez y col 2005
Agua subterraacutenea contaminada (EEUU)
gt 1500 gL
---
Wilkin y col 2005
Riacuteo receptor de efluentes de la industria papelera
20-80 mgL
---
Cervantes y col 2001
Planta de tratamiento de desechos de produccioacuten de
ferrocromita
---
3-57 mgL
(fase disuelta)
Su y Ludwig 2005
Curtiduriacutea de pieles
(Grecia)
2000 ndash 3500
mgL
--- httpesepagovtechpubs41230
4html
Curtiduriacutea de pieles (tanque de sedimentacioacuten)
3500 gmL
40 gmL
Ganguli y Tripathi 1999
Curtiduriacutea de pieles (tanque de descarga)
5000 gmL
3000 gmL
Ganguli y Tripathi 1999
Curtiduriacutea de pieles (India) 200 - 2400 mgL ---
Balasubramanian y Pugalenthi 1999
Curtiduriacutea de pieles (Portugal)
2467 mgL
---
Beleza y col 2001
Efluente tratado de
curtiduriacutea de pieles (India)
---
096 mgL
Srinath y col 2002
Curtiduriacutea de pieles (Egipto)
---
1300-2500
mgL
Hafez y col 2002
Curtiduriacutea de pieles (1) (Pakistaacuten) Curtiduriacutea de pieles (2) (Pakistaacuten)
2877 mgL
220 mgL
---
---
Ali-Awan y col 2003
Curtiduriacutea de pieles 12 mgL --- Song y col 2004
Curtiduriacutea de pieles (Guanajuato Meacutexico)
250 gmL
---
Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004
Curtiduriacutea de pieles (India) 500-1000 mgL
---
Aravindhan y col 2004
Bantildeos de curtido al cromo
en curtiduriacuteas (Leoacuten Guanajuato Meacutexico)
3000 ndash10000 mgL
---
Aacutelvarez y col 2004
10
En Meacutexico no se tienen datos precisos sobre la cantidad y concentracioacuten de cromo total
o hexavalente de los residuos generados por las diversas industrias sin embargo se ha
informado que las industrias del curtido de pieles generan de 250 a 270 toneladas de
Cr2O3 al antildeo (Zuacutentildeiga 2005)
Debido a las grandes cantidades de cromo que se liberan al medio ambiente asiacute como a
los efectos indeseables que este metal ocasiona sobre los seres vivos en muchos paiacuteses
se han establecido Normas Ambientales que pretenden regular la concentracioacuten de cromo
total yo de Cr(VI) de los desechos liacutequidos soacutelidos o gaseosos que se descargan al
medio ambiente
En Meacutexico la Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca ha decretado
normas oficiales que establecen los liacutemites maacuteximos permisibles de contaminantes
incluido el cromo ya sea como cromo total o como cromo hexavalente de las aguas
residuales que se descargan en aguas y bienes nacionales (Secretariacutea de Medio
Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996) (tabla 2) asiacute como en los
sistemas de alcantarillado urbano o municipal (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos
Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996) (tabla 3)
En cuanto al agua para uso y consumo humano la Secretariacutea de Salud ha emitido la
Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-1994 (Secretariacutea de Salud Proyecto de
Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-1994) donde se indica
como liacutemite maacuteximo permisible una concentracioacuten de cromo total de 005 mgL
11
Tabla 2 Liacutemites maacuteximos permisibles de cromo total para las aguas residuales que se descargan en aguas y bienes
nacionales (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996)
Paraacutemetros
( )
Riacuteos Embalses
Naturales y
Artificiales
Aguas Costeras Suelo
(mgL) Uso en
riego
agriacutecola
(A)
Uso
puacuteblico
urbano
(B)
Proteccioacuten
de vida
acuaacutetica
( C )
Uso en
riego
agriacutecola
(B)
Uso
puacuteblico
urbano
( C )
Explotacioacuten
pesquera
navegacioacuten
y otros
usos (A)
Recreacioacuten
(B)
Estuarios
(B)
Uso en
riego
agriacutecola
(A)
Humedales
naturales
(B)
PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD
Cromo 1 15 05 10 05 10 1 15 05 10 05 10 1 15 05 10 05 10 05 10
() Medidos de manera total PD = Promedio diario PM = Promedio mensual (A) (B) y ( C ) Tipo de cuerpo receptor seguacuten la Ley Federal de Derechos
Tabla 3 Liacutemites maacuteximos permisibles de cromo hexavalente para los sistemas de alcantarillado urbano o municipal
(Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996)
Paraacutemetros (mgL) Promedio Mensual Promedio Diario Instantaacuteneo
Cromo hexavalente 05 075 1
12
Por su parte la EPA ha establecido como liacutemite una concentracioacuten de 01 mg de cromo
por litro de agua potable (httpwwwatsdrcdcgovfacts7html)
La Organizacioacuten Mundial para la Salud (OMS) y la Comunidad Econoacutemica Europea (CEE)
establecen una concentracioacuten de 005 mg de cromo totalL como paraacutemetro de calidad
para aguas destinadas a consumo humano (httpwwgemesmaterialdocument)
Algunos valores sentildealados por otras instancias internacionales se muestran en la tabla
4
Tabla 4 Liacutemites permisibles para cromo sentildealados por Directivas Internacionales
sobre agua potable y aguas embotelladas (Zuacutentildeiga 2005)
Paraacutemetro Canadaacute 1 Japoacuten 2 Aguas embotelladas Nivel de
Administracioacuten Federal sobre
Productos Farmaceacuteuticos de EEUU
Cromo
005 mgL
005 mgL
01 mgL
1 Liacutemite establecido por el Ministerio de Salud de Canadaacute
2 Liacutemite establecido por el Ministerio de Salud y Bienestar Social de Japoacuten
15 Meacutetodos para la remocioacuten de cromo de los efluentes industriales
Para disminuir los efectos toacutexicos del metal es conveniente aplicar alguacuten(os)
tratamiento(s) a los efluentes industriales que contienen cromo antes de descargarlos en
los cuerpos de agua o en el suelo asiacute como restaurar los ecosistemas contaminados En
la actualidad estaacuten disponibles varias tecnologiacuteas para estos propoacutesitos (Eccles 1999)
Estas tecnologiacuteas se han empleado para reducir la toxicidad del contaminante [mediante
la transformacioacuten quiacutemica o bioloacutegica del Cr(VI) a Cr(III)] para removerlo de un lugar
para disminuir la extensioacuten de la contaminacioacuten o para contenerlo en un aacuterea en
particular (Guertin y col 2005)
13
151 Procesos convencionales
Los meacutetodos convencionales para la remocioacuten de los metales pesados son de naturaleza
fisicoquiacutemica y pueden ser utilizados en varias etapas del tratamiento de aguas
residuales Los meacutetodos maacutes usuales para la remocioacuten de Cr(VI) de los efluentes
industriales son los siguientes 1) reduccioacuten quiacutemica ndash precipitacioacuten en donde el Cr(VI)
es reducido quiacutemicamente a Cr(III) a pH aacutecido utilizando alguacuten agente reductor (por
ejemplo el bisulfito de sodio) y posteriormente se adiciona cal o alguacuten otro compuesto
alcalino para formar hidroacutexido de cromo (III) el cual es separado por sedimentacioacuten y
2) coagulacioacuten-floculacioacuten En general estos meacutetodos tienen algunas desventajas tales
como 1) son costosos ya que el agente activo no puede ser recuperado para su
posterior reutilizacioacuten 2) algunos reactivos quiacutemicos son sumamente toacutexicos 3) su
selectividad es baja 4) generan lodos quiacutemicos con altas concentraciones de metales los
cuales son difiacuteciles de tratar 5) la remocioacuten de los metales es incompleta principalmente
cuando la concentracioacuten de eacutestos en los efluentes es inferior a 100 mgL y 6) las aguas
residuales resultantes no satisfacen los criterios de calidad establecidos en la legislacioacuten
ambiental (Cantildeizares-Villanueva 2000 Ruiacutez 2000 Saxena y col 2000 Cheung y Gu
2003)
Algunas otras tecnologiacuteas que se utilizan ocasionalmente para la remocioacuten del Cr(VI) son
el intercambio ioacutenico la adsorcioacuten el tratamiento electroquiacutemico la oacutesmosis inversa y la
evaporacioacuten (Garbisu y col 1998 Camargo y col 2003 Kurniawan y col 2006) Las
principales desventajas de estos meacutetodos son los altos costos fijos de operacioacuten y de
mantenimiento por lo que su aplicacioacuten a grandes voluacutemenes de agua o su uso por
pequentildeas y medianas empresas estaacute muy limitado
14
La EPA recomienda los siguientes meacutetodos para la remocioacuten de cromo del agua potable
en caso de que eacutesta exceda el liacutemite permisible para este metal coagulacioacuten-filtracioacuten
intercambio ioacutenico y oacutesmosis inversa (httpepagov)
En Meacutexico en caso de que el agua destinada a uso y consumo humano exceda el liacutemite
permisible de cromo total la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-1994
(Secretariacutea de Salud Proyecto de Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-
127-SSA1-1994) indica como tratamientos a aplicar el intercambio ioacutenico o la oacutesmosis
inversa
152 Procesos biotecnoloacutegicos
En las uacuteltimas dos deacutecadas se han llevado a cabo estudios con el fin de utilizar
microorganismos y plantas para la restauracioacuten de sitios y para el tratamiento de
efluentes industriales contaminados con metales toacutexicos (Stephen y Macnaughton 1999
Lloyd 2003)
En la actualidad se considera que los procesos microbioloacutegicos son la alternativa maacutes
atractiva para remover algunos metales toacutexicos de los sitios y efluentes contaminados
ya que estos procesos son ―amigables con el medio ambiente los subproductos que
generan son usualmente inocuos son muy eficientes en la remocioacuten de los metales
(particularmente cuando las concentraciones de eacutestos son bajas condiciones en las que
algunos procesos fisicoquiacutemicos son muy ineficientes) y son de bajo costo (Cheung y
Gu 2005 Chardin y col 2002 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004)
15
Dentro de los procesos biotecnoloacutegicos propuestos para la remocioacuten de Cr(VI) se
encuentran la biosorcioacuten y la reduccioacuten bioloacutegica en los cuales se han utilizado
principalmente microorganismos (Volesky y Vieira 2000 Fruchter 2002 Cheung y Gu
2003)
En la biosorcioacuten se utilizan ciertos tipos de adsorbentes bioloacutegicos por ejemplo biomasa
microbiana (viva o inactivada en suspensioacuten o inmovilizada) con los que no se requiere
energiacutea metaboacutelica para retener pasivamente al cromo hexavalente mediante procesos
fiacutesicos (adsorcioacuten fiacutesica principalmente por fuerzas de van Der Waals) o quiacutemicos
(quimisorcioacuten) (Cantildeizares-Villanueva 2000 Volesky y Vieira 2000 Aravindhan y col
2004) En algunos casos se ha observado que el metal es transportado activamente al
interior de las ceacutelulas (a expensas de energiacutea metaboacutelica) proceso al que se le denomina
como bioacumulacioacuten
En la biorreduccioacuten o reduccioacuten bioloacutegica el cromo hexavalente es transformado a la
forma trivalente este uacuteltimo puede ser faacutecilmente precipitado en una etapa posterior de
tratamiento ajustando el pH del agua residual a un valor cercano al neutro para
removerlo finalmente por meacutetodos fiacutesicos (Chardin y col 2002 Cheung y Gu 2003) Se
considera que este proceso es una alternativa tecnoloacutegica potencial para el tratamiento
de suelos cuerpos de agua y efluentes industriales contaminados ya que la reduccioacuten
del Cr(VI) disminuye significativamente la toxicidad (100 veces) solubilidad en agua y
movilidad del metal a traveacutes del medio ambiente (Cheung y Gu 2003 Lloyd 2003
Wang 2000)
16
Se han aislado varios microorganismos que pueden reducir el Cr(VI) a Cr(III) ya sea
como cultivos puros (Horitsu y col 1987 Wang 2000 Pattanapipitpaisal y col 2001
Chardin y col 2002 Cheung y Gu 2003 Middleton y col 2003 Morales-Barrera
2005 Pal 1997 Muter y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004 Thacker y col
2006) o como cultivos mixtos (Smith y col 2002 Cheung y Gu 2003) Las fuentes de
aislamiento han sido muy diversas como por ejemplo efluentes de curtiduriacuteas de la
industria metaluacutergica de mantos freaacuteticos de aguas superficiales contaminadas de
sedimentos anoacutexicos en lagos de plantas de tratamiento de aguas residuales entre
otros (Horitsu y col 1987 Fujii y col 1990 Ganguli y Tripathi 1999 Badar y col
2000 Saxena y col 2000 Pattanapipitpaisal y col 2001 Middleton y col 2003
Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004 Zuacutentildeiga 2005 Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
Entre los geacuteneros microbianos que son capaces de reducir Cr(VI) se tienen los
siguientes Achromobacter Aeromonas Agrobacterium Bacillus Desulfovibrio
Escherichia Enterobacter Micrococcus Pseudomonas (Horitsu y col 1987 Wang
2000) Staphylococcus (Saxena y col 2000) Microbacterium (Pattanapipitpaisal y col
2001) Pyrobaculum Streptomyces Deinococcus (Chardin y col 2002)
Desulfomicrobium Desulfotomaculum Pantoea (Cheung y Gu 2003) Shewanella
(Middleton y col 2003) Trichoderma (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
Phanerochaete (Pal 1997) y Candida (Muter y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col
2004)
De los estudios reportados en la literatura acerca de la reduccioacuten microbioloacutegica del
Cr(VI) sobresalen tres hechos 1) Las bacterias han sido los microorganismos maacutes
ampliamente estudiados y es muy escasa la informacioacuten disponible sobre la capacidad de
17
reduccioacuten del metal de las levaduras y de los hongos filamentosos 2) la mayoriacutea de los
microorganismos ensayados soacutelo son capaces de tolerar y reducir muy bajas
concentraciones de Cr(VI) usualmente dentro del intervalo de 0001 a 05 mM esto
uacuteltimo se ha atribuido a los efectos toacutexicos y mutageacutenicos del metal y 3) casi todos los
estudios se han realizado en cultivo por lote
1521 Transporte del cromo al interior de las ceacutelulas
Tanto en organismos procariotes como en muchos eucariotes los oxianiones cromato y
dicromato (fuentes de cromo hexavalente) ingresan principalmente a las ceacutelulas a traveacutes
de las membranas citoplaacutesmicas mediante el sistema de transporte del sulfato (Badar y
col 2000) lo cual se ha atribuido a la similitud en la carga y estructura de estos iones
(Smith y Gadd 2000) Esto fue demostrado primeramente en Salmonella typhimurium y
posteriormente en otras bacterias tales como en Escherichia coli Pseudomonas
fluorescens y Alcaligenes eutrophus Se ha comprobado que esto mismo ocurre en
algunas levaduras tales como en Candida (Muter y col 2001 Cervantes y col 2001)
Sin embargo en general el cromato penetra al interior de las levaduras por medio de un
transportador anioacutenico no especiacutefico (Czakoacute-Veacuter y col 1999 Cervantes y col 2001)
En algunos microorganismos se ha demostrado que el sulfato inhibe competitivamente el
transporte del cromato al interior de las ceacutelulas (Ohtake y col 1987 Pepi y Baldi 1992)
y que esta inhibicioacuten es maacutes marcada en ceacutelulas anaerobias que en aerobias (Zakaria y
col 2006) Tambieacuten se ha reportado el transporte del cromato por la viacutea de los fosfatos
aunque la viacutea del sulfato es la maacutes utilizada (Ohtake y col 1987)
18
El transporte del cromato al interior de las plantas tambieacuten es a traveacutes del sistema del
ioacuten sulfato Ya en el interior de la planta el cromo hexavalente se acumula en diversos
oacuterganos en cantidades diferentes El cromo hexavalente se acumula de 10 a 100 veces
maacutes en las raiacuteces que en los retontildeos o en otros tejidos (Cervantes y col 2001)
En contraste las membranas celulares de los organismos son praacutecticamente
impermeables al cromo trivalente y a sus compuestos (Ksheminska y col 2006)
1522 Mecanismos microbianos de resistencia al Cr(VI) y de reduccioacuten del
Cr(VI)
Una caracteriacutestica importante que deben tener los microorganismos que se van a utilizar
en procesos de tratamiento de efluentes contaminados con cromo hexavalente es que
sean tolerantes (resistentes) a eacuteste Esta propiedad ha sido descrita en bacterias hongos
y levaduras (Horitsu y col 1987 Cervantes y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004)
Entre los mecanismos de resistencia al cromo hexavalente que se han encontrado se
tienen los siguientes
Acumulacioacuten del metal en la superficie o en el interior de las ceacutelulas (Volesky y Vieira
2000 Saxena y col 2000)
Disminucioacuten yo impedimento en el transporte del cromo hexavalente al interior de
las ceacutelulas (Pepi y Baldi 1992)
Excrecioacuten del metal del interior de la ceacutelula al medio circundante (Cervantes y col
2001)
Reacciones de oacutexido-reduccioacuten en las que el cromo hexavalente es reducido a cromo
trivalente el cual es menos toacutexico (Baldi y col 1990 Muter y col 2001)
19
La resistencia al cromo hexavalente puede estar codificada en el genoacuteforo de las
bacterias o en plaacutesmidos Esto uacuteltimo se ha encontrado en Pseudomonas aeruginosa P
fluorescens P putida y en Alcaligenes eutrophus (Baldi y col 1990 Ishibashi y col
1990 Cervantes y col 2001) Sin embargo la tolerancia al metal no implica
necesariamente que los microorganismos seraacuten capaces de removerlo por alguacuten
mecanismo
En el interior de las ceacutelulas bacterianas los iones cromato [CrO42-] pueden ser reducidos
a cromo trivalente por ciertas enzimas (Ishibashi y col 1990 Horitsu y col 1987) En
condiciones de aerobiosis se han identificado las siguientes proteiacutenas que parecen ser las
responsables de la reduccioacuten del Cr(VI) reductasas flavoproteiacutenas enzimas
dependientes de NADH y NAD(P)H (Ishibashi y col 1990) en cambio en condiciones de
anaerobiosis los estudios indican que ciertas hidrogenasas y citocromos son los
responsables (Chardin y col 2003 Cheung y Gu 2007)
El cromo hexavalente tambieacuten puede ser reducido por compuestos quiacutemicos reductores
que son producidos durante el crecimiento de los microorganismos (Desjardin y col
2003) tales como el glutatioacuten y la cisteiacutena los cuales pueden actuar dentro o fuera de
los organismos (Zakaria y col 2006) En organismos superiores se ha identificado al
ascorbato como agente reductor del cromo hexavalente (Ksheminska y col 2006)
Casi no hay informacioacuten sobre el mecanismo responsable de la reduccioacuten del Cr(VI) en
ceacutelulas eucariotas especiacuteficamente en levaduras Con la finalidad de dilucidar dicho
20
mecanismo se han realizado estudios en los que se ha modificado la resistencia de las
levaduras al Cr(VI) o se ha inactivado alguna enzima en particular
En un trabajo llevado a cabo con algunas levaduras no convencionales se encontroacute que
algunas de eacutestas durante su crecimiento excretaron sustancias reductoras asiacute como
sustancias quelantes que formaron complejos con el cromo trivalente que fue generado
durante la transformacioacuten del cromo hexavalente (Ksheminska y col 2006)
1523 Factores que afectan la reduccioacuten bioloacutegica del Cr(VI)
En algunos microorganismos se ha estudiado el efecto que tienen las variables
ambientales tales como condiciones de aerobiosis yo de anaerobiosis donadores y
aceptores finales de electrones concentracioacuten de cromo hexavalente y potencial de
oacutexido-reduccioacuten entre algunas otras sobre la reduccioacuten del metal (Shen y Wang 1995
Shakoori y col 2000 Wang 2000 Smith y col 2002 Wang y Xiao 1995 Fujii y col
1990 Muter y col 2001 Smith y Gadd 2000 Lloyd 2003 Jianlong y col 2004
Viamajala y col 2004)
La reduccioacuten del Cr(VI) puede realizarse en ambiente aerobio yo anaerobio En
organismos aerobios y anaerobios facultativos se ha investigado el efecto del oxiacutegeno
disuelto en el medio sobre la reduccioacuten del metal (Wang 2000) Se ha encontrado que
la sensibilidad del proceso de reduccioacuten del Cr(VI) a la tensioacuten de oxiacutegeno es diferente
para cada microorganismo En cultivos de Enterobacter cloacae HO1 concentraciones
iniciales de oxiacutegeno mayores a 45 ppm inhibieron fuertemente la reduccioacuten del Cr(VI)
(Komori y col 1989) mientras que la reduccioacuten del metal fue maacutes lenta en condiciones
21
de anaerobiosis que en aerobiosis en el caso de Thiobacillus ferrooxidans (QuiIntana y
col 2001)
Asimismo se ha investigado el efecto de algunos iones sobre la reduccioacuten bioloacutegica del
Cr(VI) Con respecto al sulfato [SO42-] existe una analogiacutea estructural y de carga entre
este anioacuten [SO42-] y el ioacuten cromato [CrO4
2-] por lo que puede establecerse una
competencia entre ellos por los transportadores de sulfato existentes en las ceacutelulas
influyendo asiacute en la reduccioacuten del cromo hexavalente (Smith y Gadd 2000)
En cultivos aerobios no se ha reportado inhibicioacuten por sulfato en la reduccioacuten del cromo
hexavalente (Wang y Xiao 1995 Ishibashi y col 1990 Wang 2000) En contraste se
ha informado que en cultivos anaerobios el sulfato afecta la reduccioacuten del Cr(VI) debido
a que este anioacuten compite con el cromato como aceptor final de electrones (Garbisu y
col 1998)
Por otro lado en un estudio realizado con varios geacuteneros de levadura (Pichia Candida
Debaryomyces Saccharomyces Schwanniomyces Cryptococcus Hansenula) que tienen
capacidad para acumular cromo se encontroacute que el sulfato afectoacute la tolerancia de las
levaduras al Cr(VI) siendo mayor o menor el efecto en funcioacuten de la levadura en estudio
(Kaszycki y col 2003)
Otros iones que se han investigado son el Mg2+ Mn2+ Ca2+ y el Fe En cultivos con
ceacutelulas pasivas (resting cells) de Agrobacterium radiobacter se encontroacute que debe
controlarse principalmente la cantidad de fierro para incrementar la capacidad de
reduccioacuten del microorganismo (Llovera y col 1993)
22
Los donadores de electrones que se han utilizado principalmente en los estudios de
reduccioacuten del Cr(VI) son compuestos alifaacuteticos y aromaacuteticos carbohidratos de bajo peso
molecular aminoaacutecidos y aacutecidos orgaacutenicos (Wang y Xiao 1995 Wang 2000 Smith y
col 2002 Ksheminska y col 2006) El descubrimiento de microorganismos que son
capaces de reducir el cromo hexavalente utilizando una amplia variedad de fuentes de
carbono y energiacutea favorece su uso en procesos de remediacioacuten in situ (Smith y col
2002)
Para la reduccioacuten del cromo hexavalente es conveniente conocer el pH y la temperatura
oacuteptimos para el crecimiento de los microorganismos (Wang 2000 Shakoori y col 2000
Camargo y col 2002 Faisal y Hasnain 2004) En cultivos de Streptomyces griseus se
estudioacute la reduccioacuten del Cr(VI) en el intervalo de valores de pH de 4 a 8 y de
temperatura de 28 a 50 degC obtenieacutendose la mayor reduccioacuten a un pH de 6-7 y a una
temperatura de 28 degC (Laxman y More 2002)
En cultivos de Ochrobactrum sp se trabajoacute en el intervalo de temperatura de 30 a 45 degC
y de pH de 6 a 8 obtenieacutendose la mayor reduccioacuten del Cr(VI) y el crecimiento celular
maacutes alto a 35 degC y a un pH de 7 (Thacker y Madamwar 2005) En estudios realizados
con Escherichia coli ATCC 33456 se ensayoacute la reduccioacuten del Cr(VI) en el intervalo de
valores de pH de 3-8 y de temperatura de 40-60 degC encontraacutendose que el pH y la
temperatura de incubacioacuten oacuteptimos fueron de 7 y 37 degC respectivamente (Bae y col
2000)
Se ha observado que la concentracioacuten inicial de Cr(VI) influye en la velocidad de
reduccioacuten del metal (Wang 2000) La velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) exhibida por los
23
cultivos de Bacillus sp Pseudomonas fluorescens LB300 (Wang y Xiao 1995)
Ochrobactrum sp (Thacker y Madamwar 2005) y de Candida sp LBM2 (Juvera-Espinosa
y col 2006) se incrementoacute conforme aumentoacute la concentracioacuten inicial de Cr(VI) En
contraste la velocidad de reduccioacuten de Bacillus sp Arthrobacter sp (Megharaj y col
2003) y de Trichoderma viride (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006) disminuyoacute al
incrementar la concentracioacuten inicial de cromo hexavalente
Para obtener una reduccioacuten importante del Cr(VI) se requieren altas concentraciones de
biomasa (Wang 2000) La concentracioacuten inicial de biomasa tiene efecto sobre la
velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) de Bacillus sp y Pseudomonas fluorescens LB300 ya
que eacutesta aumentoacute al haber mayor cantidad de biomasa inicial (Wang y Xiao 1995) Este
mismo efecto se observoacute en cultivos de una cepa bacteriana gram positiva a la que se le
denominoacute como cepa ATCC 700729 (Shakoori y col 2000)
El potencial redox se ha medido en algunos estudios realizados con diferentes
microorganismos y condiciones de cultivo para determinar su efecto sobre la reduccioacuten
del Cr(VI) (Komori y col 1989 Turick y col 1996 McLean y Beveridge 2001) sin
embargo no se ha reportado un intervalo oacuteptimo de potencial redox para llevar a cabo la
reduccioacuten del Cr(VI) a su forma menos toacutexica (Wang 2000)
En algunos estudios se ha evaluado la influencia de algunos metales (Mn Ni Zn Pb Cu
Co As Se y Hg) sobre la reduccioacuten del Cr(VI) ya que las cepas microbianas que sean
resistentes a uno o varios metales y que sean capaces de reducir el Cr(VI) seriacutean de gran
utilidad en la biorremediacioacuten de efluentes industriales (Faisal y Hasnain 2004 Cheung
y Gu 2005 Thacker y col 2006) En estudios con Escherichia coli ATCC 33456 se
24
investigoacute el efecto de varios iones (Hg2+ Ag2+ Mn2+ Zn2+ Pb2+ Cd2+ Ca2+ y Mg2+) que
pueden estar presentes junto con el Cr(VI) en efluentes industriales Con el magnesio
se observoacute un ligero aumento en la actividad reductora del microorganismo mientras
que con el mercurio se inhibioacute por completo su capacidad de reduccioacuten (Bae y col
2000)
En el caso particular de microorganismos filamentosos los esfuerzos de corte pueden
causar dantildeo fiacutesico a las ceacutelulas y como consecuencia afectar su capacidad de reduccioacuten
de Cr(VI) En cultivos de Trichoderma viride realizados en matraz y en un reactor
agitado mecaacutenicamente con un impulsor se observoacute que los micelios eran de menor
tamantildeo cuando el hongo se cultivaba en el reactor Asimismo el incremento celular y la
eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidos en matraz fueron superiores a los alcanzados
en el reactor agitado con un impulsor Estos resultados sugirieron que las fuerzas de
cizalla creadas por el impulsor fragmentan el micelio y afectan la viabilidad celular y la
capacidad de reduccioacuten del microorganismo (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
16 Sistemas de reaccioacuten
En la mayoriacutea de los estudios sobre reduccioacuten de Cr(VI) el sistema de reaccioacuten que maacutes
se ha empleado es el cultivo por lote Este sistema es ampliamente utilizado en procesos
biotecnoloacutegicos para la produccioacuten de biomasa y de metabolitos de intereacutes industrial La
duracioacuten de este tipo de cultivo depende del tamantildeo del inoacuteculo de las condiciones
ambientales como el pH los componentes del medio de cultivo y la temperatura
Aunque su operacioacuten es sencilla ofrece pocas opciones de control de las variables
intensivas de intereacutes (concentracioacuten de biomasa sustrato producto) en comparacioacuten
con otros sistemas de reaccioacuten
25
(httpfaiunneeduarbiologiamicroindcultivo20y20biorreactoreshtm) Asimismo
despueacutes de un cultivo por lote se requiere de un periodo para la descarga limpieza y
esterilizacioacuten del equipo asiacute como para el arranque de un nuevo cultivo por lote lo que
disminuye la productividad global del proceso (Wang y col 1979)
Pocos son los estudios relacionados con la reduccioacuten del Cr(VI) en los que se ha
trabajado con otros sistemas de reaccioacuten tales como con el cultivo continuo (DeLeo y
Ehrlich 1994 Bhide y col 1996 Chirwa y Wang 1997 Bae y col 2000) y el cultivo
por lote alimentado o fed-batch (Fujii y col 1990 Fujie y col 1996)
El cultivo continuo permite alcanzar un estado estacionario independiente del tiempo en
el que los microorganismos presentan un crecimiento consumo de sustrato y produccioacuten
constantes por lo que es posible obtener una alta productividad o velocidad volumeacutetrica
(httpuserpagesumbcedu gferre1bmcohtml) En este sistema es posible controlar
la cantidad de biomasa utilizando un uacutenico nutriente limitante del crecimiento (Wang y
col 1979)
A pesar de que el cultivo continuo tiene la desventaja de ser susceptible de contaminarse
debido a los periodos prolongados de operacioacuten (Stanbury 1984) en estudios con Cr(VI)
se minimizariacutea lo anterior ya que este estado de oxidacioacuten del cromo es altamente toacutexico
para la mayoriacutea de los microorganismos auacuten a bajas concentraciones
El cultivo por lote alimentado se utiliza industrialmente para la produccioacuten de varios
productos bioloacutegicos de intereacutes (enzimas antibioacuteticos vitaminas aminoaacutecidos entre
otros) El sistema es uacutetil para obtener una alta concentracioacuten de metabolitos asociados
26
al crecimiento ya que es posible alcanzar una alta concentracioacuten de biomasa aunque
tambieacuten se emplea para la produccioacuten de compuestos no asociados al crecimiento como
por ejemplo de algunos antibioacuteticos Su uso tambieacuten se recomienda cuando se trabaja
con compuestos toacutexicos o de muy baja solubilidad y no requiere mayor equipo que el
utilizado en un cultivo por lote (httpuserpagesumbcedu gferre1fedbatchhtml)
Otras ventajas de este sistema son 1) los tiempos totales del proceso fermentativo son
menores y no requiere de un nuevo inoacuteculo cada vez que se repite el ciclo en
comparacioacuten con un cultivo por lote y 2) menor riesgo de contaminacioacuten que el cultivo
continuo (Roukas 1993)
27
2 OBJETIVOS
21 Objetivos generales
1) Determinar el efecto del ioacuten sulfato sobre el crecimiento celular consumo de glucosa y
reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
2) Realizar el estudio cineacutetico del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de
Cr(VI) de Candida sp en sistemas por lote y lote repetido en un reactor airlift
3) Seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten del Cr(VI) por
Candida sp
22 Objetivos especiacuteficos
a) Determinar el efecto de la concentracioacuten de sulfato de amonio sobre el crecimiento
celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
b) Evaluar el crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote y lote repetido
c) Realizar el estudio cineacutetico del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa
d) Evaluar el crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote alimentado repetido
e) Seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes conveniente para la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp
28
3 MATERIAL Y MEacuteTODOS
31 Microorganismo
Para el desarrollo del presente trabajo se utilizoacute una levadura que se aisloacute a partir del
agua residual de una industria curtidora de pieles que se encuentra ubicada en la Ciudad
de Leoacuten Guanajuato Mediante teacutecnicas morfoloacutegicas y bioquiacutemicas que fueron
realizadas en el Laboratorio de Micologiacutea de la Facultad de Medicina de la UNAM asiacute
como por teacutecnicas de biologiacutea molecular que fueron llevadas a cabo en el Laboratorio de
Microbiologiacutea General de la Escuela Nacional de Ciencias Bioloacutegicas se determinoacute que la
levadura pertenece al geacutenero Candida La amplificacioacuten y secuenciacioacuten del dominio
D1D2 del gen 26S rDNA de la levadura aislada reveloacute que estaacute relacionada con Candida
petrohuensis (GenBank accession number U45819) Candida acudensis (GenBank
accession number U45810) y Candida drimydis (GenBank accession number U45815)
con un nivel de confidencia del 896 La baja similitud de las secuencias parciales
conocidas del gen 26S rDNA y la de la cepa de levadura empleada en este trabajo podriacutea
sugerir que es una cepa no identificada no registrada en el GenBank por lo que se le
denominoacute como Candida sp La relacioacuten filogeneacutetica de la cepa de Candida usada en este
estudio y la de otras especies de levadura se muestra en la figura 1
29
Figura 1 Relaciones filogeneacuteticas de la levadura
AJ508572Cmucifera
AB041003Candida
AB041006Cmucifera
AB041005Stephanoascus
U45822Cchiropterorum
U40103Arxula
U40094Arxula
AY283605Sympodiomyces
AF017247Trichomonascus
U40110Blastobotrys
AY442294Sympodiomyces
U40096Sympodiomyces
AY559042Cmokoenaii
FGSFEP
U45819Cpetrohuensis
U45810Cancudensis
U45815Cdrimydis
U45806Cbondarzewiae
U45816Ctepae
U45812Candida
U45812Cantillancae
U45811Csantjacobensis
U76531Stephanoascus
AB196536Stephanoascus
U70245Cedax
AF017236Cbertae
U45835Cvaldiviana
AY618511Cnovakii
U45807Ccastrensis
U45826Cpaludigena
AF294910Cbituminiphila
U45829Pichia
U84241Zygozyma
U76350Myxozyma
U76527Lipomyces
U45804Debaryomyces
U75524Pichia
U68552Saccharomyces
AY545582Naumovia
AY007888Saccharomyces 100 100
43 100
100
100
43 100
100
72
100
86
95
95
100
91
58 69
99
98
84
92
60
63
54
40
56
37
49
21
39
61
16
002
30
32 Propagacioacuten del inoacuteculo
La composicioacuten quiacutemica del medio de cultivo basal que se utilizoacute en este trabajo para la
propagacioacuten del inoacuteculo y para los experimentos de remocioacuten de Cr(VI) en diferentes
sistemas de reaccioacuten los cuales fueron realizados en un reactor neumaacutetico se muestra
en la tabla 5
Tabla 5 Composicioacuten quiacutemica del medio de cultivo
Compuesto Concentracioacuten
(gL)
Glucosa 100
(NH4)2SO4 30
KH2PO4 10
MgSO4 7H2O 03
KCl 01
Extracto de levadura 01
CaCl2 005
FeCl3 0001
Para los experimentos en los que se determinoacute el efecto del sulfato sobre la tolerancia de
Candida sp al Cr(VI) y la reduccioacuten del mismo el inoacuteculo se propagoacute en el mismo medio
de cultivo pero el (NH4)2SO4 se reemplazoacute por NH4Cl (243 gL) y el MgSO47H2O por
MgCl26H2O (0247 gL)
31
El pH inicial de los medios de cultivo fue de aproximadamente 60 A matraces
Erlenmeyer de 1000 mL que conteniacutean 200 mL de medio de cultivo se les adicionoacute una
asada de Candida sp y posteriormente se incuboacute con agitacioacuten constante a 28-30 ordmC
durante 42 h A continuacioacuten la biomasa se separoacute por centrifugacioacuten a 1500 rpm a
4 degC durante 15 min bajo condiciones de asepsia El paquete celular resultante se lavoacute
dos veces con agua destilada esteacuteril para eliminar los componentes del medio de cultivo
y los residuos celulares El paquete celular se resuspendioacute en un pequentildeo volumen de
agua destilada esteacuteril y se homogeneizoacute La suspensioacuten celular resultante se utilizoacute como
inoacuteculo para los experimentos realizados en este trabajo
Para la conservacioacuten de la levadura se usaron viales con medio inclinado de YPG
(glucosa 2 peptona de caseiacutena 1 extracto de levadura 1 y agar bacterioloacutegico
2) los cuales se mantuvieron en refrigeracioacuten a 4 degC Las resiembras se realizaron
cada dos meses
33 Reactores airlift
Se utilizoacute un contactor gas-liacutequido (reactor agitado neumaacuteticamente) del tipo airlift con
tubo conceacutentrico (figuras 2a y 2b) con un volumen total de 52 litros y un posible
volumen de operacioacuten de 42 litros para realizar los estudios de remocioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en sistemas por lote lote repetido lote alimentado y lote alimentado
repetido El reactor estaacute hecho de vidrio Pyrex y consta de una base columna y una
tapa Entre la base y la columna asiacute como entre la columna y la tapa se colocaron
empaques de neopreno para evitar el contacto vidrio-vidrio asiacute como para evitar fugas
de aire yo de medio de cultivo Las secciones se unieron mediante bridas de Nylamid La
32
base del reactor tiene un difusor del tipo placa plana de vidrio poroso para el suministro
de aire
33
Oliva para
toma de muestra
Aire
Tubo conceacutentrico (liso con
perforaciones de
malla)
Filtro de aire
Venteo
Difusor de vidrio poroso(poro fino)
Difusor de vidrio
poroso (poro fino)
Aire
50deg
4
65
3 m
m
77 mm
11
5
mm
128 mm
88 mm
15
mm
70 mm
4
50
3 m
m
Figuras 2a y 2b Reactor del tipo airlift con tubo conceacutentrico
34
En el interior del reactor se colocoacute un tubo conceacutentrico liso (sin perforaciones) de vidrio
Pyrex un tubo conceacutentrico de vidrio Pyrex con perforaciones circulares (4 mm de
diaacutemetro) o un tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable No 316 (grado
alimentario nuacutemero de malla = 20 abertura = 3344 mm) los cuales tienen la misma
longitud y diaacutemetro El tipo de tubo que se utilizoacute para los experimentos de reduccioacuten
del Cr(VI) dependioacute del sistema de reaccioacuten que se ensayoacute el tubo conceacutentrico liso se
utilizoacute para llevar a cabo experimentos en cultivos por lote y lote repetido el tubo
conceacutentrico con perforaciones se empleoacute para realizar cultivos por lote lote alimentado y
lote alimentado repetido y el tubo de malla metaacutelica se usoacute para cultivos por lote
Para el cultivo continuo de una etapa se utilizoacute un reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
con un volumen total de 650 mL y un posible volumen de operacioacuten de 550 mL el cual
tiene las mismas relaciones geomeacutetricas que el reactor antes mencionado
En todos los sistemas de reaccioacuten ensayados se suministroacute aire en el interior del tubo
conceacutentrico El aire de entrada se controloacute mediante una vaacutelvula reguladora de presioacuten y
su velocidad de flujo se midioacute con un rotaacutemetro
34 Meacutetodos experimentales
341 Efecto de la concentracioacuten de sulfato sobre el crecimiento celular
consumo de glucosa remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp
Se evaluoacute el efecto de la concentracioacuten de sulfato sobre el crecimiento celular consumo
de glucosa remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivos por lote a
nivel matraz Para estos experimentos parte o todo del (NH4)2SO4 y del MgSO4 7H2O del
medio de cultivo basal (tabla 5) se reemplazoacute con NH4Cl y MgCl26H2O respectivamente
35
a fin de mantener las mismas concentraciones iniciales de nitroacutegeno (454 mM) y de
magnesio (1217 mM) en todos los medios de cultivo ensayados
Se prepararon tres series de matraces Erlenmeyer de 500 mL que conteniacutean 135 mL de
medio de cultivo con diferentes concentraciones iniciales de sulfato Las
concentraciones de sulfato ensayadas fueron las siguientes 00 1217 25 50 100
150 200 y 2392 mM (esta uacuteltima concentracioacuten corresponde a la del ioacuten sulfato
presente en el medio de cultivo basal) Estas concentraciones no incluyen la cantidad de
sulfato proporcionado por algunos otros componentes del medio de cultivo (provenientes
del extracto de levadura yo de sales inorgaacutenicas) ya que el Laboratorio Central de
Instrumentacioacuten del Departamento de Biofiacutesica de la Escuela Nacional de Ciencias
Bioloacutegicas IPN determinoacute que la concentracioacuten de este ioacuten en el medio de cultivo que
conteniacutea cloruro de amonio y cloruro de magnesio como uacutenicas fuentes de nitroacutegeno
inorgaacutenico y de magnesio respectivamente era de 23 mgL (002 mM) A este uacuteltimo
medio de cultivo es al que se le denominoacute en el presente trabajo como ―0 mM de ioacuten
sulfato Para la cuantificacioacuten del ioacuten sulfato se utilizoacute el meacutetodo recomendado por la
Norma Oficial Mexicana NMX-AA-74-1981 (Secretariacutea de Comercio y Fomento Industrial
1981) El pH inicial de todos los medios de cultivo ensayados fue de aproximadamente
60
A una serie de matraces con medio de cultivo no se le adicionoacute Cr(VI) con la finalidad de
determinar el efecto del sulfato sobre el crecimiento celular y consumo de glucosa por la
levadura en ausencia del metal (cultivos control) A los matraces de la segunda y tercera
serie se les adicionoacute un determinado volumen de una solucioacuten stock esteacuteril de cromato
de potasio (20 gL) para obtener concentraciones iniciales de Cr(VI) de 17 y 33 mM
36
respectivamente Los matraces fueron inoculados con un determinado volumen de
suspensioacuten celular concentrada a fin de que la concentracioacuten inicial de biomasa de todos
los cultivos fuera de aproximadamente 1 mgmL Los matraces se colocaron en un bantildeo
metaboacutelico con agitacioacuten constante a 28-30 degC Se recolectaron muestras a diferentes
tiempos de incubacioacuten a las que se les determinoacute la concentracioacuten de biomasa glucosa
Cr(VI) y cromo total residual asiacute como el pH
342 Controles abioacuteticos
Se utilizaron controles libres de ceacutelulas con el propoacutesito de determinar si el Cr(VI) era
reducido abioacuteticamente a Cr(III) por los componentes del medio de cultivo
Durante los experimentos de remocioacuten de Cr(VI) con ceacutelulas viables (cultivos problema)
se observoacute que el pH de los medios de cultivo disminuyoacute desde aproximadamente 6
hasta 25-42 dependiendo de la concentracioacuten de sulfato y de cromo utilizada Como
se sabe que los pHrsquos bajos favorecen que la materia orgaacutenica (donadores de electrones)
reduzca el Cr(VI) a Cr(III) en este trabajo se llevaron a cabo experimentos sin biomasa
de Candida sp (controles libres de ceacutelulas) a distintos valores de pH (25 3 4 5 y 6) y
a las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas (17 y 33 mM) para determinar
el grado de reduccioacuten causado por los constituyentes del medio de cultivo
Como controles libres de ceacutelulas se utilizaron matraces Erlenmeyer que conteniacutean medio
de cultivo a los que se les adicionoacute un volumen determinado de una solucioacuten stock
esteacuteril de cromato de potasio (20 gL) para obtener concentraciones iniciales de Cr(VI)
de 17 y 33 mM A continuacioacuten se ajustoacute el pH del medio de cultivo a alguno de los
37
valores antes mencionados La adicioacuten de la solucioacuten stock esteacuteril de cromato de potasio
y el ajuste del pH se realizoacute en condiciones de asepsia
Los controles abioacuteticos se incubaron a las mismas condiciones que los matraces
problema Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se les
determinoacute la concentracioacuten de Cr(VI)
343 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa
remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivo por lote en un
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Se realizoacute la evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa remocioacuten
de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso (sin perforaciones) El cultivo por lote se llevoacute a cabo con 4 litros de
medio de cultivo basal con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM [igual a 78
mgL de Cr(VI)] y con un pH inicial de aproximadamente 60 El reactor se inoculoacute con
un volumen determinado de suspensioacuten celular concentrada para obtener una
concentracioacuten inicial de biomasa cercana a 12 mgmL Se suministroacute aire con un flujo
volumeacutetrico de 4 litrosmin equivalente a 1 vvm (vvm = volumen de aire por volumen
de medio de cultivo por minuto)
El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que el nivel de Cr(VI) residual fue
despreciable Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se
les determinoacute la concentracioacuten de biomasa de glucosa Cr(VI) y cromo total residual asiacute
como el pH
38
344 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote repetido en un reactor
airlift con tubo conceacutentrico liso
Los sistemas por lote repetido se iniciaron con un cultivo por lote Cuando se alcanzaron
niveles bajos de Cr(VI) residual en el primer cultivo por lote se procedioacute a recolectar un
determinado volumen de medio y se reemplazoacute con medio fresco que teniacutea una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM A continuacioacuten el sistema se operoacute nuevamente por
lote (segundo cultivo por lote o cultivo por lote repetido) hasta que ya no se detectaron
variaciones considerables en la concentracioacuten de Cr(VI) residual
Se ensayaron tres diferentes relaciones de recambio de medio de cultivo (f = volumen de
medio recolectadovolumen inicial de medio liacutequido en el reactor) las cuales fueron de
04 06 y 08 Para las dos uacuteltimas relaciones se realizaron experimentos sin ajustar el
pH del medio al inicio del segundo cultivo por lote (lote repetido) asiacute como ajustando el
pH a 60 Para la primera relacioacuten (f = 04) soacutelo se realizoacute el experimento sin ajustar el
pH del medio al inicio del cultivo por lote repetido ya que los experimentos realizados a
las relaciones de recambio de 06 y 08 mostraron que la eficiencia y velocidad de
reduccioacuten de Cr(VI) de los cultivos por lote repetido eran mayores cuando no se ajustaba
el pH
Durante los cultivos por lote repetido se recolectaron muestras a diferentes tiempos de
incubacioacuten a las cuales se les determinoacute la concentracioacuten de biomasa glucosa Cr(VI) y
el pH Con los datos obtenidos se estimaron algunas variables cineacuteticas que se utilizaron
para seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para los fines que se persiguen en
este trabajo
39
345 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa en un
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Para el cultivo continuo de una etapa se utilizoacute un biorreactor airlift con tubo conceacutentrico
liso con un volumen de operacioacuten de 500 mL Al reactor se le suministroacute continuamente
medio de cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM por medio de una
bomba peristaacuteltica Se ensayaron dos flujos volumeacutetricos de medio de cultivo de 378 y
50 mLh que corresponden a velocidades de dilucioacuten de 00076 h-1 y de 00100 h-1
respectivamente
Con los datos obtenidos a la velocidad de dilucioacuten de 00076 h-1 se estimoacute la velocidad
volumeacutetrica global y la eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) las cuales se utilizaron
para seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp
346 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular y la remocioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo conceacutentrico de
malla de acero inoxidable y de vidrio perforado
Se realizaron cultivos por lote en el reactor airlift en el cual se colocoacute un tubo conceacutentrico
de malla de acero inoxidable No 316 (grado alimentario calibre No 20 abertura =
3344 mm) o un tubo conceacutentrico de vidrio con perforaciones circulares de
aproximadamente 4 mm de diaacutemetro Al reactor se le adicionaron 4 litros de medio de
cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM [igual a 78 mgL de Cr(VI)] y
un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada para obtener una
40
concentracioacuten inicial de biomasa de aproximadamente 12 mgmL El pH inicial del medio
fue de aproximadamente 60 Se ensayaron dos flujos de aire de 05 y 1 vvm
El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que el nivel de Cr(VI) residual fue bajo Se
recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se les determinoacute la
concentracioacuten de biomasa y de Cr(VI) residual Con los datos obtenidos se estimaron
algunas variables cineacuteticas que sirvieron como criterio de seleccioacuten para determinar el
tubo conceacutentrico maacutes adecuado para llevar a cabo los cultivos por lote alimentado y lote
alimentado repetido
347 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote
alimentado repetido en un reactor airlift
Para los cultivos por lote alimentado y lote alimentado repetido se utilizoacute el reactor airlift
con el tubo conceacutentrico seleccionado previamente Los cultivos por lote alimentado se
iniciaron con un cultivo por lote utilizando las condiciones iniciales mencionadas en el
inciso 446 y una aireacioacuten de 05 vvm El cultivo por lote se mantuvo en operacioacuten
hasta que la concentracioacuten de Cr(VI) residual fue baja
A continuacioacuten el reactor se drenoacute hasta alcanzar un volumen de liacutequido en el reactor de
25 litros y se inicioacute el suministro continuo de medio de alimentacioacuten con una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM La alimentacioacuten se mantuvo hasta que se alcanzoacute un
volumen de medio liacutequido en el reactor de 37 litros (primer cultivo por lote alimentado)
41
Posteriormente el reactor se volvioacute a drenar hasta obtener un volumen de medio de 25
litros y enseguida se volvioacute a suministrar continuamente medio de cultivo basal con una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM utilizando el mismo flujo de alimentacioacuten que para el
primer cultivo por lote alimentado El suministro de medio se mantuvo hasta alcanzar un
volumen de liacutequido en el reactor de 375-40 litros (segundo cultivo por lote alimentado o
cultivo por lote alimentado repetido)
Se ensayaron dos flujos de alimentacioacuten de 659 y 1343 mLh que representan cargas
maacutesicas de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh
Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las cuales se les
determinoacute la concentracioacuten de biomasa de glucosa y Cr(VI) residual asiacute como el pH
Con los datos obtenidos se estimaron las velocidades volumeacutetricas globales y las
eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI)
35 Meacutetodos analiacuteticos
351 Determinacioacuten de la concentracioacuten de biomasa
La concentracioacuten celular se determinoacute mediante el peso seco de la masa celular Las
muestras recolectadas se filtraron a traveacutes de membranas de fibra de vidrio (Whatman
GFA) con un diaacutemetro de poro de 16 m las cuales se colocaron previamente puestas a
peso constante Posteriormente las membranas se colocaron en una estufa a 95 degC
hasta alcanzar un peso constante Los filtrados se utilizaron para determinar la
concentracioacuten de glucosa Cr(VI) y cromo total residual asiacute como el pH
352 Determinacioacuten de la concentracioacuten de glucosa
42
Se determinoacute mediante un meacutetodo enzimaacutetico empleando a la glucosa oxidasa y
peroxidasa (Worthington Biochemical Corporation 1972)
Principio El meacutetodo se basa en que la glucosa es oxidada a aacutecido glucoacutenico por la
glucosa oxidasa la cual cataliza la siguiente reaccioacuten
-D-glucosa + H2O + O2 Aacutecido D-glucoacutenico + H2O2
El peroacutexido de hidroacutegeno generado reacciona con el sistema peroxidasa - orto-
dianisidina dando como resultado la oxidacioacuten de la orto-dianisidina y la produccioacuten de
agua de acuerdo con la siguiente reaccioacuten
H2O2 + orto-dianisidina (reducida) ortondashdianisidina (oxidada) + H2O
peroxidasa
La orto-dianisidina oxidada presenta un color pardo que en medio aacutecido vira a color
rosa la cual se lee a una longitud de onda de 540 nm (figura 3)
Figura 3 Orto-dianisidina (33rsquo ndash dimetoxidibencidina)
H2N NH2
OCH3
OCH3
43
353 Determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo hexavalente
La concentracioacuten de cromo hexavalente se determinoacute por la teacutecnica de la 15-
difenilcarbohidrazida siguiendo los procedimientos descritos en el meacutetodo 8023 del Hach
Water Analysis Handbook (2002) Este meacutetodo estaacute aprobado por la EPA (Environmental
Protection Agency) (Hach 2002) y por la Norma Oficial Mexicana NMX-AA-044-SCFI-
2001 (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NMX-AA-044-SCFI-
2001)
Principio Se utilizoacute un reactivo en polvo llamado ChromaVer3 el cual contiene una
solucioacuten buffer aacutecida combinada con la 15-difenilcarbohidrazida Este uacuteltimo compuesto
reacciona con el cromo hexavalente dando un compuesto de color puacuterpura (figura 4) El
meacutetodo es aplicable para el agua ya sea fresca o de muestras de agua residual La
intensidad del color es ldirectamente proporcional a la concentracioacuten de cromo
hexavalente presente
Figura 4 Reaccioacuten de la 15-difenilcarbohidrazida con el cromo hexavalente
+ Cr 6+
Compuesto colorido
puacuterpura
N N
Cr O
C R
O
N N
H H
C R
15-difenilcarbohidrazida
2 N N N
H H
N C
H O
H
44
354 Determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo total
La determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo total de los filtrados de las muestras
recolectadas (cromo total en solucioacuten) se realizoacute por espectroscopiacutea de absorcioacuten
atoacutemica con flama de acetileno-aire (SpectrAA220 FS Varian Inc)
Para determinar la cantidad de cromo retenido por la biomasa de Candida sp las ceacutelulas
fueron lavadas con agua desionizada deshidratadas y posteriormente fueron digeridas
con aacutecido niacutetrico concentrado La solucioacuten obtenida se enfrioacute a temperatura ambiente y
se le adicionoacute agua desionizada hasta obtener un volumen final de 50 mL Este
procedimiento estaacute descrito en la Norma Oficial Mexicana NMX-AA-051-SCFI-2001
(Secretariacutea de Economiacutea 2001) La concentracioacuten de cromo total de la solucioacuten
resultante se determinoacute en un espectrofotoacutemetro de absorcioacuten atoacutemica con un horno de
grafito (SpectrAA220 FS Varian Inc)
355 Determinacioacuten del pH
Se realizoacute con un potencioacutemetro marca Oakton
45
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Meta No 1 Determinar el efecto del ioacuten sulfato sobre la reduccioacuten
de Cr(VI)
41 Efecto del sulfato sobre el crecimiento celular consumo de glucosa
remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp
411 Evaluacioacuten de la influencia del sulfato sobre el crecimiento celular de
Candida sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
Se determinoacute el efecto de ocho concentraciones diferentes de sulfato (00 1217 25
50 100 150 200 y 2392 mM) sobre el crecimiento celular de Candida sp cuando
eacutesta se cultivoacute por lote a nivel matraz en medios de cultivo sin Cr(VI) y con
concentraciones iniciales del metal de 17 y 33 mM Para visualizar mejor el efecto las
curvas de crecimiento celular se construyeron utilizando la relacioacuten xxo (x =
concentracioacuten celular a un determinado tiempo de incubacioacuten xo = concentracioacuten inicial
de biomasa) como variable dependiente y el tiempo de incubacioacuten (t) como variable
independiente (graacuteficas de xxo vs t) En cada una de las curvas de crecimiento se trazoacute
una liacutenea horizontal a una relacioacuten xxo de 10 para observar si ocurriacutea crecimiento o
lisis celular
En la figura 5 se muestran las curvas de crecimiento celular de Candida sp cuando eacutesta
se cultivoacute en medios de cultivo con diferentes concentraciones de sulfato y sin Cr(VI) Se
observa que el crecimiento de Candida sp fue muy semejante a las diferentes
concentraciones de sulfato ensayadas La levadura fue capaz de crecer en el medio de
cultivo al que no se le adicionoacute sulfato de amonio y sulfato de magnesio (0 mM de
46
SO42-) lo cual sugiere que la cantidad de sulfato proporcionado por otros componentes
del medio de cultivo ndash por ejemplo provenientes del extracto de levadura yo de
impurezas contenidas en las sales inorgaacutenicas adicionadas al medio de cultivo (002
mM) mdash fue suficiente para permitir un adecuado crecimiento de la levadura Los
resultados tambieacuten mostraron que la adicioacuten de sulfato en forma de sales inorgaacutenicas
[(NH4)2SO4 o Mg(SO4)7H20] no tuvo alguacuten efecto inhibidor o estimulador del crecimiento
celular
Figura 5 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo sin Cr(VI)
En la figura 6 se presentan las curvas de crecimiento de Candida sp que se obtuvieron
cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo con una concentracioacuten inicial de
Cr(VI) de 17 mM a las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas En la figura se
aprecia lo siguiente 1) A una concentracioacuten de sulfato de 0 mM ocurrioacute lisis celular 2)
el crecimiento neto de la levadura fue praacutecticamente nulo a una concentracioacuten de sulfato
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
47
de 1217 mM 3) el crecimiento de la levadura fue evidente a partir de una
concentracioacuten de sulfato de 25 mM y 4) en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de
10 a 2392 mM el crecimiento de la levadura fue muy semejante y superior al alcanzado
a una concentracioacuten de sulfato de 5 mM Asimismo cuando se utilizaron concentraciones
de sulfato de 10 a 2392 mM se alcanzaron niveles de concentracioacuten de biomasa
similares a los obtenidos en ausencia del metal (cultivos control) (figuras 5 y 6) De
estos resultados es evidente que a medida que se incrementoacute la concentracioacuten de
sulfato los efectos toacutexicos del Cr(VI) sobre el crecimiento de la levadura disminuyeron
hasta que eacutestos fueron praacutecticamente nulos es decir la tolerancia de la levadura al
Cr(VI) aumentoacute conforme se incrementoacute la concentracioacuten de sulfato en el medio de
crecimiento de Candida sp
Figura 6 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo con 17 mM de Cr(VI)
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
48
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM ocurrioacute lisis celular
cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo con concentraciones de sulfato en el
intervalo de 0 a 5 mM (figura 7) en contraste el crecimiento celular de la levadura se
incrementoacute a medida que la concentracioacuten de sulfato aumentoacute de 10 a 2392 mM En
este uacuteltimo intervalo de concentracioacuten de sulfato se observoacute que a tiempos de
incubacioacuten superiores a las 150 h se presentoacute lisis celular A ninguna de las
concentraciones de sulfato ensayadas se alcanzaron densidades celulares semejantes a
las obtenidas en los cultivos sin Cr(VI) o con 17 mM de Cr(VI) lo cual podriacutea deberse a
la mayor toxicidad de los medios de cultivo
Figura 7 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo con 33 mM de Cr(VI)
En la figura 8 se muestra la variacioacuten de la velocidad especiacutefica de crecimiento ( ) y de
lisis celular (kd) de Candida sp en funcioacuten de la concentracioacuten de SO42- a las diferentes
concentraciones de Cr(VI) ensayadas [0 17 y 33 mM]
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
49
Figura 8 Variacioacuten de la velocidad especiacutefica de crecimiento o de lisis celular en funcioacuten
de la concentracioacuten de SO42- a las diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI)
ensayadas
-0002
0
0002
0004
0006
0008
001
0012
0014
0016
0018
0 5 10 15 20 25 30
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Ve
loc
ida
d e
sp
ec
iacutefic
a [
h-1
]
0 mM
17 mM
33 mM
Promedio
Sin Cr(VI)
50
Cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo sin Cr(VI) su velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento se mantuvo praacutecticamente constante en todo el intervalo de
concentracioacuten de sulfato ensayado con un valor promedio de 00144 h-1
A la concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la velocidad especiacutefica de crecimiento de
Candida sp aumentoacute casi linealmente con respecto a la concentracioacuten de sulfato en el
intervalo de concentracioacuten de 0 a 10 mM (r2 = 096) alcanzando un valor maacuteximo de
00142 h-1 a la uacuteltima concentracioacuten de sulfato Esta velocidad especiacutefica de crecimiento
es muy similar a las obtenidas en los cultivos sin Cr(VI) A concentraciones de sulfato
superiores a 5 mM la velocidad especiacutefica de crecimiento se mantuvo praacutecticamente
constante Estos resultados concuerdan con los perfiles de crecimiento celular mostrados
anteriormente
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM se obtuvieron
velocidades especiacuteficas de lisis celular (kd) de 00013 a 00003 h-1 ( = -00013 - 00003
h-1) en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de 0 a 5 mM (figura 8) A
concentraciones de sulfato superiores a 5 mM la velocidad neta de crecimiento fue
positiva La velocidad especiacutefica aumentoacute linealmente en todo el intervalo de
concentracioacuten de sulfato ensayado (r2 = 099) aunque las velocidades alcanzadas fueron
notoriamente inferiores a las obtenidas en los medios de cultivo sin Cr(VI) y con una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM
De los resultados anteriores se deduce que el sulfato desempentildea un papel importante en
la tolerancia (resistencia) de Candida sp a los efectos toacutexicos del Cr(VI) A medida que
se incrementoacute la concentracioacuten de sulfato la levadura fue maacutes tolerante (resistente) a
51
los efectos dantildeinos del Cr(VI) y por consiguiente su crecimiento celular fue menos
afectado Asimismo los resultados muestran que el ―efecto protector del sulfato sobre el
crecimiento de Candida sp dependioacute de la concentracioacuten inicial de Cr(VI)
Pepi y Baldi (1992) investigaron el efecto de diferentes aminoaacutecidos azufrados y del
sulfato sobre la tolerancia de algunas levaduras al Cr(VI) Estos investigadores
encontraron que en presencia de 02 mM de Cr(VI) se requirieron pequentildeas cantidades
de cisteiacutena [001ndash01 mM] para estimular significativamente [10-100] el crecimiento
de Rhodosporidium sp y que para incrementar el crecimiento de Candida sp en hasta
80 fue necesaria una concentracioacuten de cisteiacutena de 01 mM Un comportamiento similar
se observoacute en estas dos cepas cuando se adicionoacute metionina En contraste el
crecimiento celular de Candida famata fue inhibido cuando la levadura se cultivoacute en
medios con concentraciones de cisteiacutena superiores a 005 mM y con 02 mM de Cr(VI)
Por otra parte cuando Candida sp se cultivoacute en medios con diferentes concentraciones
de sulfato (4ndash160 mM) y de Cr(VI) (004ndash02 mM) se encontroacute que el ioacuten sulfato
incrementoacute la tolerancia de la levadura al Cr(VI) El mecanismo general de resistencia al
cromato en Candida sp se atribuyoacute a una reducida captacioacuten (incorporacioacuten) de cromo
(Pepi y Baldi 1992)
Ohtake y col (1987) encontraron que la adicioacuten de altas concentraciones de sulfato
incrementoacute el crecimiento celular de dos cepas de Pseudomonas fluorescens (LB300 y
LB303) en presencia de CrO42- Ademaacutes encontraron que el nivel de resistencia al CrO4
2-
en P fluorescens dependioacute de la fuente de azufre en el medio de cultivo ya que las
ceacutelulas bacterianas que crecieron con cisteiacutena fueron mucho maacutes resistentes al CrO42-
que las ceacutelulas que crecieron sobre sulfato Como el cromato es transportado al interior
52
de las ceacutelulas de Pseudomonas a traveacutes del sistema de transporte del sulfato la habilidad
del sulfato para proteger a las ceacutelulas de P fluorescens LB300 de los efectos inhibitorios
del Cr(VI) se atribuyoacute a que el sulfato inhibioacute competitivamente la captacioacuten del cromato
por las ceacutelulas bacterianas (Ohtake y col 1987)
En contraste la resistencia de Ochrobactrum tritici cepa 5bvI1 al Cr(VI) fue
independiente de la concentracioacuten de sulfato (Branco y col 2004)
412 Evaluacioacuten del efecto del sulfato sobre el consumo de glucosa por Candida
sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
La glucosa fue completamente consumida (eficiencia global de consumo de glucosa =
100) en aproximadamente 83 h de incubacioacuten cuando la levadura se cultivoacute en medios
que no conteniacutean Cr(VI) y con diferentes concentraciones de sulfato No se observoacute
diferencia considerable en el consumo de glucosa a ninguna de las concentraciones de
sulfato utilizadas (figura 9)
53
Figura 9 Variacioacuten en el consumo de glucosa por Candida sp cuando se utilizaron
medios de cultivo con diferentes concentraciones de sulfato y sin Cr(VI)
En los experimentos realizados con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM
(figura 10) se observoacute que la levadura fue capaz de consumir aproximadamente 30-
35 de la glucosa inicialmente adicionada a los medios que conteniacutean sulfato a
concentraciones de 0 y 1217 mM a pesar de que a estas condiciones de cultivo ocurrioacute
lisis celular [0 mM de SO42-] o el crecimiento celular de la levadura fue despreciable
[1217 mM de SO42-] (figura 6) Candida sp consumioacute todo el monosacaacuterido presente
en los medios de cultivo con concentraciones de sulfato superiores a 1217 mM
(eficiencia global de consumo de glucosa del 100) sin embargo el tiempo que se
requirioacute para que eacutesto sucediera disminuyoacute a medida que se incrementoacute la concentracioacuten
de sulfato (figura 10) Los perfiles de consumo de glucosa en los cultivos de Candida
sp fueron semejantes cuando se utilizaron concentraciones de sulfato de 10 a 2392
mM y eacutestos a su vez fueron similares a los obtenidos en los medios de cultivo que no
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa
re
sid
ua
l [
]0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
54
conteniacutean Cr(VI) (figuras 9 y 10) Lo anterior podriacutea deberse a que el crecimiento
celular de estos cultivos fue semejante (figura 6)
Figura 10 Variacioacuten del porcentaje de glucosa residual en los cultivos de Candida sp a
las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas y con 17 mM de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
55
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM los niveles de glucosa
residual disminuyeron a medida que aumentoacute la concentracioacuten de sulfato (figura 11)
Sin embargo estos niveles fueron superiores a los alcanzados a 17 mM de Cr(VI) a
todas las concentraciones de sulfato ensayadas La mayor eficiencia de consumo de
glucosa fue de aproximadamente 80 y se obtuvo a una concentracioacuten de sulfato de
2392 mM
Figura 11 Variacioacuten del porcentaje de glucosa residual en los cultivos por lote de
Candida sp a las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas y con 33 mM de
Cr(VI)
A las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas [17 y 33 mM] se observoacute que
en las primeras horas de incubacioacuten los cultivos de levadura en los que ocurrioacute lisis
celular consumieron una determinada cantidad de glucosa la cual probablemente se
utilizoacute para el mantenimiento de las ceacutelulas vivas
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa r
es
idu
al [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
56
Tanto en los experimentos realizados a 17 como a 33 mM de Cr(VI) se encontroacute que
los cultivos que alcanzaron mayores densidades celulares fueron los que consumieron
mayor cantidad de glucosa y esto ocurrioacute cuando se utilizaron concentraciones altas de
sulfato
413 Evaluacioacuten del efecto del sulfato sobre la variacioacuten del pH de los cultivos
de Candida sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
Los perfiles de variacioacuten del pH de los medios de cultivo fueron muy semejantes a las
diferentes concentraciones de sulfato ensayadas cuando la levadura se cultivoacute en los
medios de cultivo sin Cr(VI) (figura 12) A todas las concentraciones de sulfato
utilizadas el pH disminuyoacute desde aproximadamente 6 hasta 28 en las primeras once
horas de incubacioacuten En el periodo comprendido entre las 11 y las 60 h de incubacioacuten el
pH de los medios de cultivo disminuyoacute ligeramente hasta alcanzar valores cercanos a
25 A tiempos posteriores a 60 h el pH de los medios de cultivo se mantuvo
praacutecticamente constante
Figura 12 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo de Candida sp en ausencia de
Cr(VI) y a las diferentes concentraciones de SO42- ensayadas
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
57
En la figura 13 se muestran los perfiles de variacioacuten del pH de los medios de cultivo
cuando la levadura se cultivoacute a las diferentes concentraciones de sulfato y a una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM El pH de los cultivos disminuyoacute raacutepidamente
en las primeras 15 h de incubacioacuten a todas las concentraciones de sulfato ensayadas La
disminucioacuten del pH fue mayor en los cultivos con las concentraciones maacutes altas de
sulfato lo cual podriacutea deberse a que a estas condiciones la levadura consumioacute mayor
cantidad de glucosa y las densidades celulares alcanzadas fueron maacutes altas A tiempos
de incubacioacuten superiores a 15 h el pH continuoacute disminuyendo pero a menor velocidad
Los niveles de pH maacutes bajos se obtuvieron cuando se utilizaron concentraciones de
sulfato de 5 a 2392 mM alcanzaacutendose valores semejantes a los obtenidos en los medios
sin Cr(VI) (de aproximadamente 25)
Figura 13 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
58
Un comportamiento cualitativo similar se obtuvo cuando Candida sp se cultivoacute en medios
con diferentes concentraciones de sulfato y con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33
mM (figura 14) El pH maacutes bajo se alcanzoacute a concentraciones altas de sulfato [20 y
2392 mM] y fue de aproximadamente 36 el cual es superior a los valores maacutes bajos
que se obtuvieron en los cultivos sin Cr(VI) y con 17 mM de Cr(VI) Esto uacuteltimo podriacutea
deberse a que el incremento de la concentracioacuten celular y el consumo de glucosa fueron
inferiores a los alcanzados con las otras concentraciones de Cr(VI) [0 y 17 mM]
Figura 14 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
414 Efecto del sulfato sobre la remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp
En la figura 15 se muestran las variaciones del porcentaje de Cr(VI) residual de los
cultivos de Candida sp cuando se emplearon diferentes concentraciones de sulfato y
una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM A una concentracioacuten de sulfato de 0 mM
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
59
la remocioacuten de Cr(VI) fue muy baja (de aproximadamente 83) es conveniente
mencionar que a esta concentracioacuten de sulfato (0 mM) y de Cr(VI) (17 mM) ocurrioacute lisis
celular y la levadura consumioacute una pequentildea cantidad de glucosa en las primeras horas
de incubacioacuten La remocioacuten de Cr(VI) se incrementoacute a medida que aumentoacute la
concentracioacuten de sulfato de 0 a 10 mM A partir de esta uacuteltima concentracioacuten de sulfato
los perfiles de remocioacuten de Cr(VI) fueron muy similares y esto podriacutea deberse a que la
densidad celular de los cultivos fueron praacutecticamente iguales Todo o casi todo el Cr(VI)
inicialmente adicionado a los medios de cultivo fue removido cuando se empleoacute una
concentracioacuten de sulfato igual o superior a 25 mM (figura 15)
Figura 15 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
En contraste cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM la levadura
no fue capaz de remover todo el Cr(VI) inicialmente presente en los medios de cultivo a
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
60
ninguna de las concentraciones de sulfato ensayadas (figura 16) Sin embargo los
niveles de Cr(VI) residual disminuyeron a medida que se incrementoacute la concentracioacuten de
sulfato
Figura 16 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
A las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas los cultivos de levadura en los
que ocurrioacute lisis celular en las primeras horas de incubacioacuten [0 mm de SO42- 17 mM de
Cr(VI) y 0-5 mM de SO42- 33 mM de Cr(VI)] fueron capaces de remover una pequentildea
cantidad de Cr(VI) Estos resultados concuerdan con lo reportado por Wang y Shen
(1997) quienes encontraron que la densidad celular de los cultivos de Escherichia coli y
Bacillus sp disminuyoacute continuamente durante el curso de la remocioacuten de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
61
A las diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI) y de sulfato ensayadas se observoacute
que aunque los niveles de Cr(VI) residual disminuyeron a medida que la incubacioacuten
progresoacute las concentraciones de cromo total en solucioacuten permanecieron casi constantes
a lo largo de todo el periodo de incubacioacuten (aproximadamente el 97 del cromo
inicialmente adicionado a los medios de cultivo estuvo siempre presente en solucioacuten)
Maacutes auacuten el anaacutelisis del contenido de cromo en la biomasa de Candida sp (de muestras
recolectadas al final de los experimentos) reveloacute que uacutenicamente el 29 009 del
cromo total removido por los cultivos fue incorporado en la biomasa
Como se mostroacute anteriormente los cultivos con ceacutelulas viables se iniciaron con un pH de
aproximadamente 60 y eacuteste disminuyoacute durante el tiempo de incubacioacuten hasta valores de
25 ndash 36 dependiendo de la concentracioacuten de sulfato y de Cr(VI) utilizada Como se
sabe que los pHacutes bajos favorecen la reduccioacuten del Cr(VI) por la materia orgaacutenica
(donadores de electrones) en el presente trabajo se llevaron a cabo experimentos sin
biomasa de Candida sp (controles libres de ceacutelulas) a diferentes valores de pH (25 3
4 5 y 6) y a las dos diferentes concentraciones de Cr(VI) ensayadas (17 y 33 mM)
para determinar si los componentes presentes en los medios de cultivo pueden reducir el
Cr(VI) En las figuras 17 y 18 se muestran los perfiles de Cr(VI) residual que se
obtuvieron con los controles abioacuteticos ensayados
62
Figura 17 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los controles libres de
ceacutelulas llevados a cabo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y a diferentes
valores de pH
Figura 18 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los controles libres de
ceacutelulas realizados con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y a diferentes
valores de pH
00
200
400
600
800
1000
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
pH = 25
pH = 3
pH = 4
pH = 5
pH = 6
00
200
400
600
800
1000
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
pH = 25
pH = 3
pH = 4
pH = 5
pH = 6
63
A las dos concentraciones de Cr(VI) ensayadas se observoacute una reduccioacuten despreciable
del metal (inferior a 05) en el intervalo de valores de pH de 4 a 6 a un pH de 3 el
porcentaje de reduccioacuten fue de aproximadamente 12 y de 3 cuando el pH fue de
25 Estos resultados sugieren que los componentes de los medios de cultivo
praacutecticamente no redujeron el Cr(VI) a ninguno de los pHrsquos ensayados
En conjunto los resultados antes mostrados indican que el principal mecanismo de
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp fue la biotransformacioacuten (reduccioacuten) del Cr(VI) a
Cr(III) y que la reduccioacuten abioacutetica del Cr(VI) y la captacioacuten de cromo por la biomasa de
la levadura fueron despreciables Asimismo los resultados tambieacuten muestran que la
reduccioacuten del Cr(VI) por los cultivos se debioacute a la actividad metaboacutelica de las ceacutelulas de
Candida sp
En la figura 19 se presentan las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) que se
obtuvieron a las diferentes concentraciones iniciales de sulfato y de Cr(VI) ensayadas Se
aprecia que cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la eficiencia
de reduccioacuten se incrementoacute desde 179 hasta 986 a medida que la concentracioacuten
de sulfato aumentoacute de 0 a 25 mM a concentraciones de sulfato superiores la eficiencia
de reduccioacuten fue del 100 Asimismo en los experimentos realizados a 33 mM de
Cr(VI) la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) aumentoacute desde 83 hasta 84 conforme la
concentracioacuten de sulfato aumentoacute de 0 a 2392 mM
64
Figura 19 Eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por los cultivos de
Candida sp a las diferentes concentraciones de sulfato y de Cr(VI) ensayadas
La velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) tambieacuten fue afectada por la
concentracioacuten de sulfato y de Cr(VI) utilizada (figura 20) Cuando se empleoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten maacutes alta
fue de 098 mg de Cr(VI)Lh y se obtuvo en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de
10 a 2392 mM En cambio la velocidad maacutes alta que se alcanzoacute a 33 mM de Cr(VI) fue
de 044 mg de Cr(VI)Lh y se obtuvo a la maacutexima concentracioacuten de sulfato ensayada
(2392 mM)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 1217 25 5 10 15 20 2392
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Efi
cie
ncia
glo
bal d
e r
ed
uccioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
17 mM
33 mM
65
Figura 20 Velocidades volumeacutetricas globales de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas en los
cultivos de Candida sp a diferentes concentraciones de sulfato y de Cr(VI)
A todas las concentraciones de sulfato ensayadas la eficiencia y velocidad volumeacutetrica de
reduccioacuten de Cr(VI) alcanzadas a una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM fueron
superiores a las obtenidas a 33 mM de Cr(VI) y esto podriacutea deberse a que los efectos
toacutexicos del Cr(VI) sobre la levadura se incrementan a medida que aumenta la
concentracioacuten del metal
De los resultados anteriores es evidente que el sulfato afectoacute la reduccioacuten aeroacutebica de
Cr(VI) por Candida sp Estos resultados difieren con lo reportado por otros
investigadores quienes no han encontrado un efecto inhibidor ni estimulador del sulfato
sobre la reduccioacuten de Cr(VI) en cultivos aeroacutebicos
000
010
020
030
040
050
060
070
080
090
100
0 1217 25 5 10 15 20 2392
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica d
e r
ed
uccioacute
n d
e C
r(V
I)
[mg
de
Cr(
VI)
Lh
]
17 mM
33 mM
66
Ishibashi y col (1990) encontraron que concentraciones de sulfato de hasta 1 mM
incrementaron la resistencia de Pseudomonas putida al cromato pero no tuvieron efecto
sobre la reduccioacuten de eacuteste En cultivos de Bacillus sp (Wang y Xiao 1995) y de
Acinetobacter haemolyticus (Zakaria y col 2006) se observoacute que una concentracioacuten de
sulfato de 10 mM no afectoacute la reduccioacuten de Cr(VI) Liu y col (2006) reportaron que
concentraciones de sulfato de 40 y 80 mgL (0416 y 083 mM) no tuvieron efecto sobre
la reduccioacuten aeroacutebica de Cr(VI) por Bacillus sp XW-4
En contraste el sulfato generalmente tiene efecto sobre la reduccioacuten bacteriana del
cromato bajo condiciones de anaerobiosis lo cual podriacutea deberse a que el sulfato compite
con el cromato como aceptor final de electrones (Garbisu y col 1998 Liu y col 2006)
En cultivos anaeroacutebicos de Escherichia coli ATCC 33456 la velocidad de reduccioacuten de
Cr(VI) no fue afectada por hasta 416 mM de sulfato sin embargo la velocidad
disminuyoacute a 83 mM de sulfato (Shen y Wang 1994) La actividad de reduccioacuten de Cr(VI)
de Enterobacter cloacae HO1 bajo condiciones anaeroacutebicas fue inhibida en 32 en
presencia de tan soacutelo 25 M de sulfato (Komori y col 1989)
Como se mencionoacute anteriormente el sulfato incrementoacute la tolerancia al Cr(VI) de la cepa
de Candida sp aislada por Pepi y Baldi (1992) sin embargo esta cepa de levadura fue
incapaz de reducir el Cr(VI) Asimismo auacuten cuando se ha reportado que Pseudomonas
fluorescens LB300 es capaz de reducir el Cr(VI) a Cr(III) (Bopp y Ehrlich 1988) y que el
sulfato incrementa el crecimiento celular de esta bacteria en presencia de cromato
(Ohtake y col 1987) hasta donde sabemos no se ha reportado el efecto del sulfato
sobre la reduccioacuten de Cr(VI) por este microorganismo
67
Los resultados anteriores muestran claramente que el sulfato afectoacute la tolerancia de
Candida sp al Cr(VI) y a su capacidad para reducirlo Es evidente que a medida que se
incrementoacute la concentracioacuten de sulfato el crecimiento de la levadura fue mayor y su
eficiencia y velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) aumentaron Los resultados tambieacuten
muestran que la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp depende de la densidad celular de
los cultivos de manera tal que a mayor cantidad de biomasa generada mayor es la
reduccioacuten de Cr(VI) Aun cuando la cepa de Candida sp es muy sensible a los efectos
toacutexicos del Cr(VI) en ausencia de sulfato esta levadura posee una capacidad notable
para reducir muy altas concentraciones del metal en presencia de sulfato
Meta No 2 Determinar la capacidad de reduccioacuten de Cr(VI) en
diferentes sistemas de reaccioacuten
42 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso
Se utilizoacute un reactor airlift con tubo conceacutentrico liso (sin perforaciones) para el cultivo por
lote de Candida sp Para este sistema de reaccioacuten se utilizoacute un volumen de operacioacuten de
4 litros de medio basal con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM El biorreactor
se inoculoacute con un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada de tal
forma que la concentracioacuten inicial de biomasa fue de 12 mgmL El pH inicial fue de
aproximadamente 60 El reactor se operoacute por lote hasta que la concentracioacuten de Cr(VI)
residual fue despreciable
68
La concentracioacuten celular se incrementoacute gradualmente a medida que la incubacioacuten
progresoacute hasta que alcanzoacute un valor maacuteximo de aproximadamente 39 gL lo cual
ocurrioacute a las 42 h de incubacioacuten A tiempos posteriores la concentracioacuten de biomasa
disminuyoacute debido a que ocurrioacute lisis celular (figura 21) La velocidad especiacutefica maacutexima
de crecimiento de la levadura fue de 00244 h-1 la cual fue superior a la obtenida en
matraz cuando crecioacute con 17 mM de Cr(VI) (00142 h-1) esta diferencia podriacutea deberse
a que en el reactor airlift las ceacutelulas de Candida sp tuvieron una mayor cantidad de
oxiacutegeno disponible para su crecimiento
Figura 21 Variacioacuten de la concentracioacuten de biomasa y de glucosa en el cultivo por lote
de Candida sp en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM
La levadura consumioacute la principal fuente de carbono y energiacutea (glucosa) presente en el
medio de cultivo a lo largo de todo el tiempo de incubacioacuten incluso durante el periodo en
el que ocurrioacute lisis celular La glucosa no fue completamente consumida por la levadura
00
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo [h]
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e g
luc
os
a
res
idu
al [g
L]
00
05
10
15
20
25
30
35
40
45
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e b
iom
as
a [
gL
]Glucosa Biomasa
69
al final del experimento la concentracioacuten de glucosa residual fue de 17 gL (figura 21)
por lo que la eficiencia global de consumo del monosacaacuterido fue del 835
El pH del medio de cultivo disminuyoacute desde 60 hasta aproximadamente 25 Este uacuteltimo
valor se alcanzoacute a las 292 h de incubacioacuten y se mantuvo praacutecticamente constante a
tiempos posteriores (figura 22)
Figura 22 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) y del pH en el cultivo por lote de
Candida sp en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM
La concentracioacuten de Cr(VI) residual disminuyoacute progresivamente a medida que se
incrementoacute el tiempo de incubacioacuten hasta que a las 468 h ya no se detectoacute Cr(VI) en el
medio de cultivo por lo que la eficiencia global de remocioacuten de Cr(VI) fue del 100 Se
observoacute una ligera remocioacuten de Cr(VI) durante el periodo en el que ocurrioacute lisis celular
(figuras 21 y 22) En contraste la concentracioacuten de cromo total en solucioacuten se
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo [h]
Cr(
VI)
y C
rom
o t
ota
l re
sid
ua
l [m
gL
]
00
10
20
30
40
50
60
70
pH
[Cr(VI)] [Cromo total] pH
70
mantuvo casi constante a lo largo del tiempo de cultivo Lo anterior indica que la
levadura fue capaz de transformar el Cr(VI) a la forma trivalente menos toacutexica
En la tabla 6 se comparan los valores de algunas variables cineacuteticas obtenidas en
matraz (cuando se hizo crecer la levadura a una concentracioacuten de Cr(VI) inicial de 17
mM) y en el biorreactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando la levadura se cultivoacute en
medio de cultivo con concentraciones iniciales semejantes de Cr(VI) y de sulfato
Tabla 6 Variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote de Candida sp realizados
en matraz y en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Variable cineacutetica Matraz Reactor
Incremento celular maacuteximo [gL] 22 263
Velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento [h-1] 00142 00244
Eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) [] 100 100
Velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI)L h] 098 164
Velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI) g biomasa h] 045 095
Capacidad de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI) g biomasa] 400 443
El incremento celular maacuteximo y la velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento de
Candida sp obtenidos en el reactor airlift fueron 1955 y 718 superiores a los
alcanzados en matraz respectivamente Como se mencionoacute previamente eacutesto podriacutea
deberse a que en el reactor airlift la levadura tuvo una mayor cantidad de oxiacutegeno
disponible para su crecimiento
71
La levadura redujo todo el Cr(VI) inicialmente presente en el medio de cultivo [eficiencia
global de reduccioacuten de Cr(VI) del 100] tanto cuando se cultivoacute en matraz como en el
reactor airlift El hecho de que Candida sp sea capaz de reducir concentraciones de
Cr(VI) tan altas como 15 mM (e incluso superiores como se mostroacute en la seccioacuten
anterior) podriacutea ser de importancia praacutectica porque la mayoriacutea de los microorganismos
ensayados son capaces de reducir parcial o totalmente concentraciones maacutes bajas de
Cr(VI) (tabla 7)
Tabla 7 Datos sobre reduccioacuten de Cr(VI) por microorganismos
Microorganismo Cultivo
Modo de
operacioacuten
Concentra-
cioacuten de
Cr(VI)
[mM]
Velocidad
volumeacutetrica
de reduccioacuten
[mg de
CrLh]
Eficiencia
de
reduccioacuten
[]
Referencia
Acinetobacter
haemolitycus
Aerobio
CPL
067 128 88 Zakaria y col
2006
Aislado de
Pseudomonas
(CRB5)
Aerobio
CPL
043 014 100 McLean y
Beveridge 2000
Arthrobacter
sp
Aerobio
CPL
017 016 65 Megharaj y col
2003
Aspergillus sp Aerobio
CPL
096 0694 100 Acevedo-Aguilar
y col 2006
Bacillus
megaterium
TKW3
Aerobio
CPL
048 009 735 Cheung y Gu
2005
Bacillus sp Aerobio
CPL
007 007 65 Megharaj y col
2003
Bacteria J3 Aerobio
CPL
01 00057 21 Badar y col
2000
Brevibacterium
CrT-13
Aerobio
CPL
288 255 68 Faisal y Hasnain
2004
E coli AC80 Aerobio
CPL
002
065
9375
Ishibashi y col
1990
Ochrabactrum
sp
Aerobio
CPL
017
034
033
038
100
88
Thacker y
Madamwar 2005
72
Ochrobactrum
intermedium Cr-
T1
Aerobio
CPL
288 326 87 Faisal y Hasnain
2004
Penicillium sp Aerobio
CPL
096 066 95 Acevedo-Aguilar y
col 2006
Phanerochaete
chrysosporium
Aerobio
CPL
058 011 100 Pal 1997
Providencia
sp
Aerobio
CPL
102 10 100 Thacker y col
2006
Pseudomonas
ambigua G-1
Aerobio
CPL
288 347 83 Horitsu y col
1987
Streptomyces
griseus
Aerobio
CPL
017 025 100 Laxman y More
2002
Trichoderma
inhamatum
Aerobio
CPL
13
075 100 Morales-Barrera y
Cristiani-Urbina
2008
Trichoderma
viride
Aerobio
CPL
16
104 100 Morales-Barrera y
Cristiani-Urbina
2006
CPL = Cultivo por lote
La velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) obtenida en el reactor neumaacutetico
con Candida sp fue de 164 mg de Cr(VI)Lh la cual fue 6735 superior a la alcanzada
en matraz [098 mg de Cr(VI)Lh] (tabla 6) Esto uacuteltimo podriacutea deberse a la mayor
cantidad de biomasa generada en el reactor la cual redujo maacutes raacutepidamente el Cr(VI)
Acinetobacter haemolitycus fue capaz de reducir completamente 096 mM de Cr(VI) en
36 h por lo que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal de este microorganismo
fue de 139 mg de Cr(VI)Lh sin embargo cuando la concentracioacuten inicial de Cr(VI) se
incrementoacute a 135 mM la eficiencia y velocidad de reduccioacuten disminuyeron (Zakaria y
col 2006)
A una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 017 mM la eficiencia y velocidad volumeacutetrica
global de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por Ochrabactrum sp fue del 100 y 033 mg
de Cr(VI)Lh respectivamente Aunque la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal
73
se incrementoacute a 038 mg de Cr(VI)Lh cuando la concentracioacuten inicial de Cr(VI) fue de
034 mM la eficiencia de reduccioacuten disminuyoacute a 88 (Thacker y Madamwar 2005)
La eficiencia y velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas con Arthrobacter
sp a las 70 h de incubacioacuten fue de aproximadamente 65 y 016 mg de Cr(VI)Lh
cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial del metal de 017 mM (Megharaj y col 2003)
Con Providencia sp se obtuvo una eficiencia de reduccioacuten del 100 al cabo de 108 h de
incubacioacuten en medios de cultivo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 102 mM
siendo su velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal de 10 mg de Cr(VI)Lh (Thacker
y col 2006) La velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Streptomyces griseus
fue de 025 mg de Cr(VI)Lh cuando se cultivoacute en presencia de 017 mM de Cr(VI)
(Laxman y More 2002)
En el caso de eucariotes Acevedo-Aguilar y col (2006) reportaron que Penicillium sp y
Aspergillus sp fueron capaces de reducir por completo 096 mM de Cr(VI) en 72 h
obtenieacutendose una velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de 0694 mg de Cr(VI)Lh
Asimismo Trichoderma viride exhibioacute una eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) del 100 y
una velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de 104 mg de Cr(VI)Lh cuando se cultivoacute en
un reactor airlift en medio de cultivo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 16 mM
(Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006) Trichoderma inhamatum fue capaz de reducir
por completo 13 mM de Cr(VI) con una velocidad volumeacutetrica de 075 mg de Cr(VI)Lh
(Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2008)
En la tabla 7 se muestran los valores de eficiencia y velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten
de Cr(VI) obtenidas con otros microorganismos
74
La velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) que se obtuvo en el reactor airlift con
Candida sp fue de 095 mg de Cr(VI)g de biomasah (tabla 6) la cual fue 211 veces
mayor que la alcanzada en matraz [045 mg de Cr(VI)g de biomasah] Bae y col
(2000) reportaron que la velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) de Escherichia coli
ATCC 33456 se encontroacute en el intervalo de 031 a 07 mg de Cr(VI)g de biomasah
cuando este microorganismo se cultivoacute por lote en diferentes medios de cultivo con una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 096 mM A una concentracioacuten de Cr(VI) de 0096 mM
los lodos activados exhibieron una velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) de
aproximadamente 008 mg de Cr(VI)g de biomasah (Stasinakis y col 2003) El cultivo
por lote de Trichoderma inhamatum exhibioacute una velocidad especiacutefica de
aproximadamente 0584 mg de Cr(VI)g de biomasah cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 13 mM (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2008)
Asimismo en cultivos por lote de Providencia sp realizados con una concentracioacuten inicial
de Cr(VI) de 034 mM se obtuvo una velocidad especiacutefica de reduccioacuten del metal de
1302 mgg de biomasah (Thacker y col 2006)
En el presente trabajo se encontroacute que en el reactor airlift cada gramo (peso seco) de
biomasa producida de Candida sp pudo reducir 4438 mg de Cr(VI) (tabla 6) valor
ligeramente superior al encontrado en matraz [40 mg de Cr(VI)g de biomasa] y
semejante al reportado para Trichoderma inhamatum (Morales-Barrera y Cristiani-
Urbina 2008) Asimismo a las 60 h de incubacioacuten la capacidad de reduccioacuten de
Penicillium sp y Aspergillus sp fue de aproximadamente 082 y 042 mg de Cr(VI)g de
biomasa (Acevedo-Aguilar y col 2006) Wang y Shen (1997) reportaron que la
capacidad maacutexima de reduccioacuten de Cr(VI) de los cultivos aeroacutebicos de Bacillus sp y
75
Pseudomonas fluorescens LB300 fue de 208 x 10-12 y 310 x 10-12 mg de Cr(VI)ceacutelula
respectivamente si se toma en cuenta que el peso seco promedio de una ceacutelula
bacteriana tiacutepica es de aproximadamente 3 x 10-13 g (Atkinson y Mavituna 1983)
entonces la capacidad de reduccioacuten de Bacillus sp y P fluorescens LB300 seriacutea de 693 y
1033 mg de Cr(VI)g de biomasa respectivamente
43 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote repetido en el reactor airlift con
tubo conceacutentrico liso
Se realizaron algunos cultivos por lote repetido en el reactor airlift con tubo conceacutentrico
liso (sin perforaciones) En cada uno de los cultivos ensayados el reactor se inoculoacute
inicialmente con un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada de la
levadura para obtener una concentracioacuten inicial de biomasa de aproximadamente 12
mgmL La concentracioacuten inicial de Cr(VI) del medio de cultivo fue de aproximadamente
15 mM y el flujo de aire fue de 1 vvm El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que la
concentracioacuten de Cr(VI) residual en el medio fue baja (primer cultivo por lote) a
continuacioacuten una parte del medio de cultivo contenido en el reactor se drenoacute y se
adicionoacute medio fresco con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM Posteriormente el
reactor se operoacute nuevamente por lote (segundo cultivo por lote o cultivo por lote
repetido) Se ensayaron tres relaciones de recambio de medio de cultivo (f = volumen de
medio cosechadovolumen inicial de medio de cultivo) de 08 06 y 04
Debido a la importancia que tiene el pH del medio de cultivo en los procesos
microbioloacutegicos de reduccioacuten de Cr(VI) en el presente trabajo se llevaron a cabo cultivos
por lote repetido con relaciones de recambio de 06 y 08 en los que el pH del medio de
76
cultivo se ajustoacute a 60 al inicio del segundo cultivo por lote (cultivo por lote repetido) asiacute
como experimentos en los que el pH no se ajustoacute a 60 por lo que el pH inicial del cultivo
por lote repetido fue el alcanzado al final del primer cultivo por lote (cercano a 30) Es
conveniente mencionar que los valores bajos de pH inhiben el crecimiento de los
microorganismos pero favorecen la reduccioacuten del Cr(VI) a Cr(III) al ocurrir esto uacuteltimo
disminuye el efecto toacutexico de la forma hexavalente del metal
En estos experimentos se observoacute que el crecimiento de la levadura y la reduccioacuten de
Cr(VI) fueron adversamente afectados cuando el pH del medio de cultivo se ajustoacute a 60
al inicio de los cultivos por lote repetido En la figura 23 se muestra la variacioacuten de la
concentracioacuten de Cr(VI) residual en los cultivos por lote y lote repetido realizados con y
sin ajuste del pH al inicio de los cultivos por lote repetido cuando se utilizaron relaciones
de recambio de 06 y 08
77
Figura 23 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los cultivos por lote y lote
repetido realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizaron
00
100
200
300
400
500
600
700
800
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [m
gL
]
f = 08 spH
f = 08 cpH
CPL CPLR
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [m
gL
] f = 06 spH
f = 06 cpH
CPL CPLR
78
relaciones de recambio de 06 y 08 (spH = sin ajuste de pH del medio de cultivo al
inicio del cultivo por lote repetido cpH = con ajuste de pH del medio de cultivo a 60 al
inicio del cultivo por lote repetido)
En la figura se aprecia que en los primeros cultivos por lote el Cr(VI) fue totalmente o
casi completamente reducido en aproximadamente 45-49 h Sin embargo en los cultivos
por lote repetido el tiempo que se requirioacute para reducir el Cr(VI) fue mayor Asimismo es
evidente que se alcanzaron concentraciones de Cr(VI) residual maacutes bajas en los sistemas
por lote repetido en los que no se ajustoacute el pH al inicio de los cultivos
Los resultados anteriores sugieren que la levadura pierde parte de su capacidad de
reduccioacuten de Cr(VI) cuando se cultiva repetidamente en medios que contienen Cr(VI)
Estos resultados concuerdan con lo reportado por Wang y Shen (1997) quienes
encontraron que Bacillus sp Pseudomonas fluorescens LB300 y Escherichia coli ATCC
33456 pierden su capacidad para reducir Cr(VI) despueacutes de que han reducido 046-052
058 y 125 mM de Cr(VI) respectivamente Un comportamiento similar tambieacuten fue
reportado por Middleton y col (2003) para Shewanella oneidensis
Como los niveles maacutes altos de reduccioacuten de Cr(VI) se obtuvieron cuando no se ajustoacute el
pH a 60 al inicio de los cultivos por lote repetido el experimento en el que se ensayoacute
una relacioacuten de recambio de 04 uacutenicamente se llevoacute a cabo sin ajustar el pH
En la figura 24 se muestra la variacioacuten de la concentracioacuten celular en los sistemas por
lote y lote repetido a las tres diferentes relaciones de recambio ensayadas (04 06 y
08) cuando no se ajustoacute el pH al inicio de los cultivos por lote repetido Se aprecia que
en ninguno de los cultivos por lote repetido se alcanzaron densidades celulares cercanas
79
a las de los cultivos por lote que los precedioacute En los cultivos por lote repetido el
incremento celular y la velocidad especiacutefica de crecimiento maacutes altos se obtuvieron
cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 06 (tabla 8) sin embargo los valores
alcanzados fueron inferiores a los obtenidos en el cultivo por lote que los antecedioacute
Figura 24 Variacioacuten de la concentracioacuten de biomasa con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo ensayadas
00
05
10
15
20
25
30
35
40
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Co
nce
ntr
acioacute
n d
e b
iom
asa
[g
L]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
80
Tabla 8 Variables cineacuteticas del crecimiento celular y de la reduccioacuten de Cr(VI)
obtenidas en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp llevados a cabo en el
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Variable Cultivo por lote Cultivo por lote repetido
Relacioacuten de recambio
04 06 08
Incremento celular
maacuteximo [gL]
224 230 235 017 038 009
Velocidad especiacutefica maacutexima de
crecimiento [h-1]
00244 00227 00220 00044 00109 00017
Eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) []
999 980 973 96 93 36
Velocidad
volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI)Lh]
160 178 151 035 046 045
En los cultivos por lote repetido se necesitoacute de una mayor cantidad de tiempo para
consumir la glucosa presente en los medios en comparacioacuten con los cultivos por lote del
cual derivaron (figura 25) Asimismo en ninguno de los cultivos se consumioacute
totalmente la glucosa la mayor eficiencia de consumo del monosacaacuterido de los cultivos
por lote repetido se obtuvo cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 06 con un
valor de 783 el cual es cercano al obtenido en los primeros cultivos por lote
(aproximadamente 835)
81
Figura 25 Variacioacuten de la concentracioacuten de glucosa con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo utilizadas
En la figura 26 se muestran los perfiles de variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI)
residual en funcioacuten del tiempo de incubacioacuten a las diferentes relaciones de recambio de
medio de cultivo utilizadas Se aprecia que en los primeros cultivos por lote se alcanzaron
niveles de Cr(VI) residual maacutes bajos y en menor tiempo que en los cultivos por lote
repetido
00
20
40
60
80
100
120
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e g
luc
os
a r
es
idu
al [g
L]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
82
Figura 26 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo ensayadas
En los primeros cultivos por lote se alcanzaron eficiencias y velocidades volumeacutetricas
globales de reduccioacuten de Cr(VI) de 973 - 999 y de 151 - 178 mgLh
respectivamente (tabla 8) Estas velocidades son superiores a la alcanzada en el cultivo
por lote realizado en matraz [098 mg de Cr(VI)Lh] y semejantes a la obtenida
previamente en el reactor airlift [164 mg de Cr(VI)Lh]
En los cultivos por lote repetido la eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) maacutes baja se
obtuvo cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 08 y esto podriacutea deberse a que el
tiempo de incubacioacuten que se utilizoacute para este cultivo fue menor que para los otros A las
relaciones de recambio de 04 y 06 las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
[Cr(
VI)
] [m
gL
]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
83
fueron semejantes con valores de 96 y 93 respectivamente Estas uacuteltimas eficiencias
fueron ligeramente inferiores a las obtenidas en los cultivos por lote que los precedioacute
(973-999) Las mayores velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) se
obtuvieron a relaciones de recambio de 06 y 08 [aproximadamente 045 mgLh] sin
embargo fueron considerablemente inferiores a la de los cultivos por lote que los
antecedioacute
44 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa en un reactor airlift
con tubo conceacutentrico liso
Para este sistema el reactor se inoculoacute con 50 mL de inoacuteculo y se dejoacute operar por lote
durante 48 horas con el propoacutesito de incrementar la densidad celular A continuacioacuten se
suministroacute continuamente medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de
15 mM [78 mgL] y con un flujo volumeacutetrico de 378 mLh por lo que la velocidad de
dilucioacuten ensayada fue de 00076 h-1 Se permitioacute que el reactor alcanzara el estado
estacionario lo cual se corroboroacute mediante la determinacioacuten de la concentracioacuten de
biomasa asiacute como de glucosa y de Cr(VI) residual de muestras colectadas a diferentes
tiempos
En el estado estacionario los valores promedio de concentracioacuten de biomasa glucosa
Cr(VI) residual y de pH fueron de 016 gL 62 gL 46 mgL y 345 respectivamente
De estos resultados es evidente que la concentracioacuten de biomasa en el reactor fue muy
baja lo que probablemente ocasionoacute que se alcanzaran valores bajos de eficiencia de
consumo de glucosa (38) y de reduccioacuten de Cr(VI) (41) asiacute como de velocidad
volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) (024 mgLh)
84
Posteriormente se ensayoacute un flujo de alimentacioacuten de 5 mLh para operar con una
velocidad de dilucioacuten de 001 h-1 Sin embargo bajo estas condiciones se presentoacute el
fenoacutemeno de lavado celular en el cual no se detecta biomasa en el reactor Este
experimento se realizoacute varias veces y en todos los casos se obtuvo el mismo resultado
El lavado celular que ocurrioacute en el cultivo continuo de Candida sp podriacutea deberse a que
la velocidad de dilucioacuten que se utilizoacute (001 h-1) es muy cercana a la velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento de la levadura [de aproximadamente 00146 h-1 determinada en
cultivo por lote en medio de cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM]
por lo que la levadura no tuvo tiempo suficiente para duplicarse y fue desplazada del
reactor Ademaacutes el suministro continuo de medio de alimentacioacuten con Cr(VI) ocasiona
que la levadura esteacute constantemente sujeta a los efectos toacutexicos del metal Es decir la
baja velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento de la levadura y los efectos toacutexicos
continuos del metal fueron probablemente los factores que limitaron la eficiencia y
velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) en cultivo continuo
Debido a que ocurrioacute lavado celular a una velocidad de dilucioacuten de 001 h-1 ya no fue
posible ensayar velocidades maacutes altas Los resultados obtenidos en cultivo continuo de
una etapa indican que este sistema de reaccioacuten no es adecuado para la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp
En la tabla 9 se presentan datos sobre la reduccioacuten de Cr(VI) por microorganismos en
cultivos continuos en suspensioacuten o inmovilizados Hasta donde es de nuestro
85
conocimiento no hay informacioacuten disponible acerca de la reduccioacuten de Cr(VI) por
levaduras y hongos filamentosos en cultivo continuo
Tabla 9 Resumen de datos sobre la reduccioacuten microbiana de Cr(VI) en cultivo continuo
Microorganismo Cultivo Concentra-
cioacuten de
Cr(VI) [mM]
Velocidad
de
dilucioacuten
[h-1]
Velocidad
volumeacutetrica
de reduccioacuten
[mg de
CrLh]
Eficiencia
de
reduccioacuten
[]
Referencia
Pseudomonas
sp C7
Aerobio 12
12
0014
0017
073
093
88
91
Gopalan y
Veeramani
1994
Pseudomonas
fluorescens
LB300
Aerobio 011
009
009
002
005
009
016
017
022
57
39
28
DeLeo y
Ehrlich
1994
Escherichia coli
ATCC 33456
Aerobio 08 005
169 843 Bae y col
2000
Pseudomonas
mendocina
MCM B-180
Aerobio
05
15
20
022
014
011
57
108
113
99
99
99
Bhide y
col 1996
Microbacterium
liquefaciens
MP30
Aerobio
(ceacutelulas
inmovilizadas
en perlas de
polivinil
alcohol-
alginato)
005
0038
009
90
Pattanapip
it-paisal y
col 2001
Bacillus sp Aerobio
(ceacutelulas
inmovilizadas
en perlas de
vidrio Pyrex)
192
192
004
008
397
797
998
998
Chirwa y
Wang
1997
86
En un estudio realizado en cultivo continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de Pseudomonas
fluorescens LB300 se encontroacute que la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute desde
57 hasta 28 y que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal se incrementoacute de
016 a 022 mg de Cr(VI)Lh a medida que la velocidad de dilucioacuten se incrementoacute de
002 a 009 h-1 cuando se utilizoacute medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI)
de 009 mM (DeLeo y Ehrlich 1994)
Los resultados obtenidos en cultivo continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de otros
microorganismos han sido alentadores Gopalan y Veeramani (1994) ensayaron tres
velocidades de dilucioacuten de 0014 0017 y 0028 h-1 y encontraron que la maacutexima
eficiencia (91) y velocidad volumeacutetrica [093 mg de Cr(VI)Lh] de reduccioacuten de Cr(VI)
de Pseudomonas sp C7 se obteniacutea a una velocidad de dilucioacuten de 0017 h-1 cuando se
utilizoacute medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de 12 mM En el estudio
realizado por Bae y col (2000) con Escherichia coli ATCC 33456 la velocidad de dilucioacuten
se mantuvo constante a 005 h-1 y se obtuvo una eficiencia y una velocidad volumeacutetrica
de reduccioacuten de Cr(VI) de 843 y de 169 mg de Cr(VI)Lh respectivamente cuando
se utilizoacute una concentracioacuten de Cr(VI) de 08 mM en el medio de alimentacioacuten En cultivo
continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de Pseudomonas mendocina MCM B-180 Bhide y col
(1996) ensayaron el efecto de diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI) [de 05 a
20 mM] y de velocidades de dilucioacuten (011 a 022 h-1) sobre la reduccioacuten de Cr(VI)
Estos investigadores encontraron altas eficiencias (99) y velocidades de reduccioacuten [57
ndash 113 mg de Cr(VI)Lh]
Asimismo con la finalidad de reducir los efectos toacutexicos del Cr(VI) sobre los
microorganismos se ha propuesto el uso de ceacutelulas inmovilizadas en reactores continuos
87
de lecho fijo Las ceacutelulas de Microbacterium liquefaciens MP30 inmovilizadas en perlas de
alginato de calcio - polivinil alcohol fueron capaces de reducir el Cr(VI) con una
eficiencia del 90 y con una velocidad de 009 mg de Cr(VI)Lh cuando se utilizoacute medio
de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de 005 mM y una velocidad de dilucioacuten
de 0038 h-1 (Pattanapipitpaisal y col 2001) En un reactor de lecho fijo con ceacutelulas de
Bacillus sp inmovilizadas en perlas de vidrio Pyrex con un diaacutemetro de 3 mm se observoacute
que al incrementar la velocidad de dilucioacuten de 004 a 008 h-1 la eficiencia de reduccioacuten
de Cr(VI) se mantuvo constante (998) y que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de
Cr(VI) se incrementoacute de 397 a 797 mgLh (Chirwa y Wang 1997)
45 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular y la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo conceacutentrico de
malla de acero inoxidable y de vidrio perforado
Los reactores airlift con tubo conceacutentrico liso (reactores convencionales) no son
adecuados para llevar a cabo cultivos por lote alimentado (procesos con volumen
variable) ya que no es posible lograr una adecuada circulacioacuten del liacutequido a cualquier
volumen de medio de cultivo En los reactores airlift convencionales uacutenicamente se logra
una adecuada circulacioacuten del fluido cuando la altura del liacutequido es mayor que la del tubo
conceacutentrico Por ello para realizar cultivos por lote alimentado en reactores airlift es
necesario que existan diversos puntos de comunicacioacuten entre las secciones de ascenso y
descenso del reactor a lo largo de toda la longitud del tubo conceacutentrico En la literatura
se han descrito algunos reactores airlift que en su interior contienen dispositivos que
permiten la comunicacioacuten entre ambas secciones del reactor Los dispositivos maacutes
comunes son tubos de mallas metaacutelicas (net draft tube) (Tung y col 1997 Wu y Wu
1990 1991 Wu y col 1992) tubos conceacutentricos de vidrio con perforaciones
88
rectangulares (Cristiani-Urbina y col 2000) placas curvas colocadas coaxialmente
(Hagino y col 1982) y bafles (placas) perforados (Galiacutendez-Mayer y col 2001) Estos
dispositivos afectan las caracteriacutesticas hidrodinaacutemicas y de transferencia de masa y calor
de los reactores por lo que es conveniente evaluar su desempentildeo
En este trabajo se evaluoacute la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivos por lote
utilizando reactores airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable asiacute como de
vidrio con perforaciones circulares Estos cultivos se realizaron con dos flujos de aire de
05 y 1 vvm Estos experimentos tuvieron como propoacutesito principal el seleccionar el tubo
conceacutentrico maacutes adecuado para llevar a cabo posteriormente los cultivos por lote
alimentado y lote alimentado repetido
En la figura 27 se muestran las curvas de crecimiento celular cuando se utilizoacute el reactor
airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos de aire
ensayados El crecimiento celular de la levadura fue mayor cuando se utilizoacute un flujo de
aire de 1 vvm lo cual podriacutea deberse a una mayor oxigenacioacuten del medio de cultivo Los
niveles de Cr(VI) residual maacutes bajos tambieacuten se obtuvieron con un flujo de aire de 1 vvm
(figura 28) y eacutesto podriacutea deberse a la mayor densidad celular alcanzada bajo estas
condiciones
89
Figura 27 Curvas de crecimiento celular de Candida sp en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos de aire ensayados
Figura 28 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual en los cultivos por lote realizados
en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos
de aire ensayados
000
050
100
150
200
250
00 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Tiempo [h]
XX
O
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
00 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Tiempo [h]
Cr(
VI)
Re
sid
ual [
]
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
90
En los experimentos realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado se
observoacute un comportamiento opuesto al obtenido previamente con el tubo conceacutentrico de
malla metaacutelica El crecimiento celular (figura 29) y la reduccioacuten de Cr(VI) (figura 30)
en el reactor con tubo conceacutentrico perforado fueron mayores a un flujo de aire de 05
vvm
Figura 29 Curvas de crecimiento celular de Candida sp en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico de vidrio perforado a los dos flujos de aire ensayados
000
050
100
150
200
00 500 1000 1500 2000 2500
Tiempo [h]
XX
O
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
91
Figura 30 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual en los cultivos por lote realizados
en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de vidrio perforado a los dos flujos de aire
ensayados
En la tabla 10 se muestran algunas variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote
realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable y con
tubo conceacutentrico perforado de vidrio a los dos flujos de aire ensayados Ademaacutes la tabla
incluye los resultados obtenidos en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
00 500 1000 1500 2000 2500
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ual [
] Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
92
Tabla 10 Variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote realizados en el reactor
airlift con las diferentes configuraciones de tubo conceacutentrico
Cultivo por lote
Variable cineacutetica Tubo conceacutentrico
liso
Malla metaacutelica Tubo conceacutentrico perforado
10 vvm 05 vvm 10 vvm 05 vvm 05 vvm 10 vvm
Incremento celular
maacuteximo [gL]
263 072 142 123 106 082
Velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento [h-1]
00244 00059 00120 00149 00178 00093
Eficiencia global de
reduccioacuten de Cr(VI) ()
100 67 95 97 95 89
Velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) [mg de Cr(VI)Lh]
164 031 056 082 084 035
Comparando los resultados obtenidos en el reactor con tubo de malla metaacutelica y con el
de vidrio perforado la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) fue mayor cuando se
utilizoacute el tubo conceacutentrico perforado de vidrio y un flujo de aire de 05 vvm con un valor
promedio de dos experimentos independientes de 083 mgLh Sin embargo esta
velocidad es aproximadamente 494 inferior a la alcanzada con el tubo conceacutentrico liso
Los resultados de crecimiento celular (incremento celular maacuteximo y velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento) y de reduccioacuten de Cr(VI) (eficiencia y velocidad volumeacutetrica)
obtenidos en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable y de
vidrio perforado a los flujos de aire ensayados podriacutean sugerir que el grado de
oxigenacioacuten del medio de cultivo y la magnitud de los esfuerzos de corte que se alcanzan
durante la agitacioacuten neumaacutetica desempentildean un papel importante en la generacioacuten de
biomasa de Candida sp en los estados fisioloacutegicos de eacutesta y por consiguiente en la
93
reduccioacuten de Cr(VI) Debido a lo anterior seriacutea conveniente investigar la influencia de la
velocidad de aireacioacuten la cual afecta los patrones de flujo del fluido la magnitud de las
fuerzas de corte y la concentracioacuten del nutriente gaseoso en la fase fluida
Como las mayores eficiencias y velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) se
obtuvieron cuando se utilizoacute el tubo conceacutentrico perforado de vidrio y un flujo de aire de
05 vvm eacutestos fueron utilizados en los cultivos por lote alimentados que se llevaron a
cabo posteriormente
46 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote alimentado
repetido en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado
En los cultivos por lote alimentado el volumen de medio liacutequido en el reactor se
incrementa gradualmente a medida que aumenta el tiempo de incubacioacuten Este cambio
de volumen provoca una dilucioacuten de los componentes presentes en el medio de cultivo lo
cual dificulta la interpretacioacuten de los resultados Debido a lo anterior en los cultivos por
lote alimentado es conveniente expresar el cambio de las variables (biomasa sustrato
etc) en teacuterminos de masa y no de concentracioacuten y para ello es necesario conocer el
volumen de medio a los diferentes tiempos de incubacioacuten Por consiguiente en el
presente trabajo se estimaron las cantidades de biomasa glucosa y de Cr(VI) y se
expresaron en teacuterminos de masa A continuacioacuten se presentan las ecuaciones para
calcular la masa de las variables de intereacutes para este trabajo
Masa celular [g] = (concentracioacuten celular gL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
94
Masa de glucosa [g] = (concentracioacuten de glucosa gL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
Masa de Cr(VI) [mg] = (concentracioacuten de Cr(VI) mgL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
En los cultivos por lote alimentado y lote alimentado repetido se ensayaron dos flujos
volumeacutetricos de medio de alimentacioacuten de 659 y 1343 mLh que corresponden a
cargas maacutesicas de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh respectivamente Los cultivos por lote
alimentado realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado se iniciaron con
cultivos por lote (los resultados obtenidos en estos uacuteltimos cultivos se mostraron en la
seccioacuten anterior)
Cuando se utilizoacute una carga maacutesica de Cr(VI) de 0514 mgh en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) se observoacute que la masa celular
de la levadura en el primer cultivo por lote alimentado fue mayor que en la del segundo
cultivo Sin embargo a pesar de que la levadura tuvo un suministro constante de fuente
de carbono y energiacutea eacutesta praacutecticamente no crecioacute
Cuando se utilizoacute una carga maacutesica de Cr(VI) de 0514 mgh fue evidente que en los
cultivos por lote alimentado se fue acumulando glucosa en el medio de cultivo lo que
indica que las ceacutelulas casi no consumieron el monosacaacuterido que teniacutean disponible para su
crecimiento La cantidad de glucosa consumida por la levadura en el cultivo por lote
alimentado repetido (segundo cultivo por lote alimentado) fue considerablemente menor
que la consumida en el primer cultivo lo cual podriacutea deberse a que habiacutea una menor
cantidad de biomasa en el reactor En el segundo cultivo por lote alimentado se alcanzoacute
95
una eficiencia de consumo de glucosa del 68 en cambio en el primer cultivo fue del
263
Se observoacute que la levadura fue capaz de reducir parcialmente el Cr(VI) adicionado al
reactor y que en el primer cultivo por lote alimentado se lograron mayores niveles de
reduccioacuten
En el primer cultivo por lote alimentado las eficiencias de reduccioacuten de Cr(VI) maacutes altas
se alcanzaron durante el periodo de incubacioacuten de las 468 a las 967 h (7188-7292)
y disminuyeron ligeramente hasta el final de este cultivo (673-6945) En el segundo
cultivo por lote alimentado (lote alimentado repetido) las eficiencias disminuyeron
gradualmente a medida que se incrementoacute el tiempo de incubacioacuten (figura 31) La
eficiencia promedio de reduccioacuten de Cr(VI) del primer cultivo por lote alimentado fue de
689 y la del segundo cultivo alimentado fue de 56
96
Figura 31 Variacioacuten de la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) de Candida sp cuando se
utilizoacute una carga maacutesica del metal de 0514 mgh
La velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute progresivamente a medida
que transcurrieron los cultivos por lote alimentado desde 0181 hasta 0063 mgLh
(figura 32) estos valores son inferiores a los alcanzados en los cultivos por lote
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Efi
cie
nc
ia d
e r
ed
uc
cioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
CPLA1 CPLA2
97
Figura 32 Variacioacuten de la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Candida sp
en el cultivo por lote alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) llevados a
cabo con una carga maacutesica del metal de 0514 mgh
Posteriormente se realizoacute el cultivo por lote alimentado y lote alimentado repetido
utilizando una carga maacutesica de Cr(VI) de 105 mgh Se observoacute que en ambos cultivos
la masa celular de Candida sp se incrementoacute gradualmente a medida que se incrementoacute
el tiempo de incubacioacuten aunque al final de cada cultivo hubo una ligera disminucioacuten en la
cantidad de biomasa en el reactor En el primer cultivo por lote alimentado se alcanzoacute un
valor maacuteximo de 523 g de biomasa (incremento celular de 053 g) a las 637 h
mientras que en el segundo cultivo se alcanzoacute una cantidad maacutexima de biomasa de 435
g (incremento celular de 13 g) a las 1822 h totales de cultivo que corresponden a 893
h del cultivo por lote alimentado repetido
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica g
lob
al d
e
re
du
ccioacute
n d
e C
r(V
I) [
mg
de
Cr(V
I)L
h]
CPLA1 CPLA2
98
Asimismo se encontroacute que la levadura fue capaz de consumir parcialmente la glucosa
suministrada En el primer cultivo por lote alimentado se obtuvo una eficiencia de
consumo de glucosa del 299 mientras que en el segundo cultivo la eficiencia fue del
388 Estos resultados probablemente se deban a que el crecimiento de la levadura fue
mayor en el cultivo por lote alimentado repetido (incremento celular = 13 g) que en el
cultivo por lote alimentado que lo precedioacute (incremento celular = 053 g)
En los cultivos por lote alimentados llevados a cabo con una carga maacutesica de 105 mg de
Cr(VI) la levadura fue capaz de reducir parcialmente el Cr(VI) adicionado al reactor sin
embargo al final del primer cultivo por lote alimentado se lograron los niveles de
reduccioacuten maacutes altos
En el primer cultivo por lote alimentado la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) se
incrementoacute a medida que aumentoacute el tiempo de incubacioacuten alcanzaacutendose el valor maacutes
alto de eficiencia (529) a las 879 h de incubacioacuten En contraste en el segundo cultivo
por lote alimentado (alimentado repetido) la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute
continuamente conforme transcurrioacute el tiempo de cultivo Al final del cultivo por lote
alimentado repetido la eficiencia de reduccioacuten del metal fue del 43 (figura 33)
99
Figura 33 Variacioacuten de la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) de Candida sp cuando se
utilizoacute una carga maacutesica del metal de 105 mgh
En estos experimentos tambieacuten se observoacute que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de
Cr(VI) disminuyoacute continuamente durante todo el periodo de incubacioacuten desde 0226
hasta 0099 mgLh (figura 34)
0
10
20
30
40
50
60
0 50 100 150 200 250
Tiempo [h]
Efi
cie
ncia
de
re
du
ccioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
CPLA1 CPLA2
100
Figura 34 Variacioacuten de la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Candida sp
en el cultivo por lote alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) llevados a
cabo con una carga maacutesica del metal de 105 mgh
Las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) que se obtuvieron con una carga maacutesica
del metal de 105 mgh fueron inferiores a las logradas con una carga de 0514 mgh y
esto podriacutea deberse a que el tiempo de contacto entre la levadura y el medio de cultivo
fue menor En contraste las velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) fueron
ligeramente superiores a una carga maacutesica de 105 mgh
Con las dos cargas maacutesicas de Cr(VI) que se ensayaron en este trabajo se observoacute una
variacioacuten semejante en el pH de los medios de cultivo Los cultivos por lote alimentado
se iniciaron con un pH de 302-306 (estos valores corresponden al pH que se obtuvo al
final de los cultivos por lote que precedioacute a los cultivos por lote alimentado) El pH se
000
004
008
012
016
020
024
0 50 100 150 200 250
Tiempo [h]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica g
lob
al d
e r
ed
uccioacute
n
de
Cr(V
I) [
mg
de
Cr(V
I)L
h]
CPLA1 CPLA2
101
incrementoacute ligeramente durante el curso de los primeros cultivos por lote alimentado y al
final de eacutestos se tuvieron valores de 355 y de 345 cuando se emplearon cargas maacutesicas
de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh respectivamente En los cultivos por lote alimentado
repetido el pH se mantuvo praacutecticamente constante durante todo el periodo de
incubacioacuten
A pesar de que el cultivo por lote alimentado es muy recomendable para trabajar con
compuestos toacutexicos ha sido poco explorado para el tratamiento de aguas contaminadas
con cromo hexavalente Fujii y col (1990) utilizaron el cultivo por lote alimentado para
investigar la reduccioacuten de Cr(VI) por la bacteria anaerobia Enterobacter cloacae cepa
HO1 En este estudio una solucioacuten de cromato se alimentoacute continuamente en pequentildeas
dosis para minimizar el efecto toacutexico del metal Los investigadores encontraron que la
reduccioacuten de Cr(VI) fue fuertemente afectada por la velocidad especiacutefica de alimentacioacuten
de cromato Cuando esta velocidad fue inferior a 25 mmol de CrO42-g de biomasah
todo el cromo adicionado fue reducido A velocidades de alimentacioacuten superiores se
observoacute que la concentracioacuten de Cr(VI) residual en el medio de cultivo se incrementaba a
medida que aumentaba la velocidad de alimentacioacuten Asimismo encontraron que la
actividad reductora de la bacteria era fuertemente inhibida cuando la concentracioacuten de
Cr(VI) del medio de cultivo era mayor a 07 mM (3639 mgL)
Posteriormente Fujie y col (1996) realizaron la simulacioacuten de un cultivo por lote
alimentado utilizando datos cineacuteticos obtenidos en cultivo por lote y un modelo
matemaacutetico que describe el comportamiento de la bacteria antes mencionada Los
resultados experimentales y los predichos por el simulador fueron semejantes
102
En la tabla 11 se presentan los valores de velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
obtenidos en el presente trabajo en los diferentes sistemas de reaccioacuten ensayados La
mayor velocidad se obtuvo en el cultivo por lote realizado en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso por lo que eacuteste seriacutea el sistema maacutes adecuado para la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp
103
Tabla 11 Velocidades volumeacutetricas globales de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas en diferentes sistemas de reaccioacuten
CPL
Matraz
CPL Reactor
airlift con
tubo liso
CPL Reactor
airlift con
malla metaacutelica
CC Reactor
airlift con
tubo liso
CPLR Reactor
airlift con
tubo liso
CPL Reactor
airlift con tubo
perforado
CPLA Reactor
airlift con
tubo perforado
CPLAR Reactor
airlift con
tubo perforado
10
Vvm
05
vvm
10
vvm
10
vvm
10
vvm
05
vvm
10
vvm
05
vvm
05
vvm
f=08 f=06 f=04
CM1 CM2 CM1 CM2
098 151 ndash178 031 056 024 045 046 035 084 035 0092-0181
0163-0195
0063-0083
0099-0145
CPL = Cultivo por lote CC = Cultivo continuo CPLR = Cultivo por lote repetido CPLA = Cultivo por lote alimentado CPLAR = Cultivo por lote alimentado repetido f = relacioacuten de recambio CM = Carga maacutesica de Cr(VI)
CM1 = 0514 mg Cr(VI)h CM2 = 105 mg Cr(VI)h
104
5 CONCLUSIONES
El sulfato desempentildea un papel importante en la tolerancia al Cr(VI) y en la reduccioacuten
del mismo en la cepa de Candida sp utilizada en este trabajo
El efecto modulador del sulfato sobre el crecimiento celular y la reduccioacuten del Cr(VI)
depende de las concentraciones de los oxianiones sulfato y cromato
El mecanismo principal de remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp es la biotransformacioacuten
del altamente toacutexico Cr(VI) al menos toacutexico Cr(III)
El cultivo por lote en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso es el sistema de
reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
La velocidad de aireacioacuten no tiene un efecto significativo sobre la reduccioacuten de Cr(VI)
por Candida sp
105
6 REFERENCIAS
1 Acevedo-Aguilar FJ Espino-Saldantildea AE Leoacuten-Rodriacuteguez IL Rivera-Cano ME Avila-Rodriguez M Wrobel K et al 2006 Hexavalent chromium removal in vitro and from industrial wastes using chromate-resistant strains of filamentous
fungi indigenous to contaminated wastes Can J Microbiol 52 809-815
2 Ali-Awan M Baig MA Iqbal J Aslam MR amp Ijaz N 2003 Recovery of chromium (III) from tannery wastewater J App Sci amp Environ Management 7 (2) 5-8
3 Aacutelvarez SG Maldonado M Gerth A amp Kuschk P 2004 Characterization of
tannery effluents and study of the water Hyacinth in chromium recovery Informacioacuten Tecnoloacutegica 15 (3) 75-80
4 Aravindhan BM Madani B Rao JR Nair BU amp Ramasami T 2004 Bioaccumulation of Chromium from Tannery Wastewater An Approach for chrome
recovery and reuse Environ Sci Technol 38 300-306
5 Atkinson B amp Mavituna F 1983 Biochemical engineering and biotechnology handbook United Kingom Nature Press
6 Badar U Ahmed N Beswick AJ Pattanapipitpaisal P amp Macaskie LE 2000 Reduction of chromate by microorganisms isolated from metal contaminated sites of
Karachi Pakistan Biotechnol Lett 22 829-836 7 Bae WC Kang TG Kang IK Won YJ amp Jeong BC 2000 Reduction of
hexavalent chromium by Escherichia coli ATCC 33456 in batch and continuous cultures J Microbiol 38(1) 36-39
8 Balasubramanian S amp Pugalenthi V 1999 Determination of total chromium in
tannery wastewater by inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry
flame atomic absorption spectrometry and uv-visible spectrophotometric methods Talanta 50 (3) 457-467
9 Baldi F Vaughan AM amp Olson GJ 1990 Chromium(VI)-resistant yeast
isolated from a sewage treatment plant receiving tannery wastes Appl Environ
Microbiol 56 (4) 913-918
10 Barnhart J 1997 Occurrences uses and properties of chromium Regulatory Toxicology and Pharmacology 26 S3-S7
11 Beleza VM Boaventura RA amp Almeida MF 2001 Kinetics of chromium removal from spent tanning liquors using acetylene production sludge Environ
Sci Technol 35 (21) 4379-4383 12 Bhide JV Dhakephalkar PK amp Paknikar KM 1996 Microbiological process for
the removal of Cr(VI) from chromate-bearing cooling tower effluent Biotechnol Lett 18 (6)667-672
106
13 Bopp LH amp Ehrlich HL 1988 Chromate resistance and reduction in
Pseudomonas fluorescens strain LB300 Archives of Microbiology 150 426-431
14 Branco R Alpoim MC amp Morais PV 2004 Ochrobactrum tritici strain 5bvI1 ndash characterization of a Cr(VI)-resistant and Cr(VI)-reducing strain Can J Microbiol
50 697-703 15 Camargo FAO Bento FM Okeke BC amp Frankenberger WT 2002 Chromate
reduction by chromium-resistant bacteria isolated from soils contaminated with dichromate Journal of Environmental Quality 32 1228-1233
16 Camargo FAO Okeke BC Bento FM amp Frankenberger WT 2003 In vitro
reduction of hexavalent chromium by a cell-free extract of Bacillus sp ES 29
stimulated by Cu2+ Appl Microbiol Biotechnol 62 569-573
17 Cantildeizares-Villanueva R 2000 Biosorcioacuten de metales pesados mediante el uso de biomasa microbiana Rev Latinoam Microbiol 42 131-143
18 Cervantes C Campos-Garciacutea J Devars S Gutieacuterrez-Corona F Loza-Tavera H Torres-Guzmaacuten JC amp Moreno-Saacutenchez R 2001 Interactions of chromium with
microorganisms and plants FEMS Microbio Rev 25 335-347 19 Chardin B Dolla A Chaspoul F Fardeau ML Gallice P amp Bruschi M 2002
Bioremediation of chromate thermodynamic analysis of the effects of Cr(VI) on sulfate-reducing bacteria Appl Microbiol Biotechnol 60 352-360
20 Chardin B Giudici-Orticoni MT De Luca G Guigliarelli B amp Bruschi M 2003
Hydrogenases in sulfate-reducing bacteria function as chromium reductase Appl
Microbiol Biotechnol 63 315-321
21 Cheung Y amp Gu G 2003 Reduction of chromate (CrO42-) by an enrichment
consortium and an isolate of marine sulfate-reducing bacteria Chemosphere 52 1523-1529
22 Cheung KH amp Gu JD 2005 Chromate reduction by Bacillus megaterium TKW3
isolated from marine sediments World Journal of Microbiology amp Biotechnology 21 213-219
23 Cheung KH amp Gu JD 2007 Mechanism of hexavalent chromium detoxification
by microorganisms and bioremediation application potential a review International
Biodeterioration amp Biodegradation 59 8-15
24 Chirwa EMN amp Wang YT 1997 Hexavalent chromium reduction by Bacillus sp in a packed-bed bioreactor Environ Sci Technol 31 1446-1451
25 Cristiani-Urbina E Netzahuatl-Muntildeoz AR Manriquez-Rojas FJ Juaacuterez-Ramiacuterez C Ruiz-Ordaz N amp Galiacutendez-Mayer J 2000 Batch and fed-batch
cultures for the treatment of whey with mixed yeast cultures Process Biochemistry 35 649-657
107
26 Czakoacute-Veacuter K Batiegrave M Raspor P Sipiczki M amp Pesti M 1999 Hexavalent
chromium uptake by sensitive and tolerant mutants of Schizosaccharomyces pombe FEMS Microbiology Letters 178 109-115
27 DeLeo PC amp Ehrlich HL 1994 Reduction of hexavalent chromium by
Pseudomonas fluorescens LB300 in batch and continuous cultures Appl Microbiol Biotechnol 40 756-759
28 Desjardin V Bayard R Lejeune P amp Gourdon R 2003 Utilization of supernatant of pure cultures of Streptomyces thermocarboxydus NH50 to reduce
chromium toxicity and mobility in contaminated soils Water Air and Soil Pollut 3 153-160
29 Eccles H 1999 Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process TIBTECH 17 462-465
30 Faisal M amp Hasnain S 2004 Comparative study of Cr(VI) uptake and reduction in
industrial effluent by Ochrobactrum intermedium and Brevibacterium sp
Biotechnology Letters 26 1623-1628
31 Fruchter J 2002 In situ treatment of chromium-contaminated groundwater Environ Sci amp Technol pp 464-472
32 Fujie K Hu H Huang X Tanaka Y Urano K amp Ohtake H 1996 Optimal operation of bioreactor system developed for the treatment of chromate wastewater
using Enterobacter cloacae HO-1 Wat Sci Tech 33 (5-6) 173-182 33 Fujii E Toda K amp Ohtake H 1990 Bacterial reduction of toxic hexavalent
chromium using a fed-batch culture of Enterobacter cloacae strain HO1 J Ferment Bioeng 69 (6) 365-367
34 Gaballah I Goy D Kilbertus G amp Thauront J 1994 Decontamination of
industrial effluents for environment protection and recycling of metals Resources
Conservation and Recycling 10 (1-2) 97-106
35 Galiacutendez-Mayer J Saacutenchez-Teja O Cristiani-Urbina E amp Ruiz-Ordaz N 2001 A novel split-cylinder airlift reactor for fed-batch cultures Bioprocess and Biosystems
Engineering 24 171-177 36 Ganguli A amp Tripathi AK 1999 Survival and chromate reducing ability of
Pseudomonas aeruginosa in industrial effluents Lett Appl Microbiol 28 76-80
37 Garbisu C Alkorta I Llama MJ amp Serra JL 1998 Aerobic chromate reduction by Bacillus subtilis Biodegradation 9 133-141
38 Gonzaacutelez AR Ndungrsquou K amp Flegal AR 2005 Natural occurrence of hexavalent chromium in the Aromas Red Sands Aquifer California Environ Sci Technol 39
(15) 5505-5511
108
39 Gopalan R amp Veeramani H 1994 Studies on microbial chromate reduction by
Pseudomonas sp in aerobic continuous suspended growth cultures Biotechnology and Bioengineering 43 471-476
40 Guertin J Jacobs JA amp Avakian CP 2005 Chromium(VI) Handbook 1st
edition CRC Press USA 41 Hach Water Analysis Handbook 2002 Hach Company Colorado USA 4th ed
pp 433-444 1210-1211
42 Hafez AI El-Manharawy MS amp Khedr MA 2002 RO membrane removal of unreacted chromium from spent tanning effluent A pilot-scale study Part 2 Desalination 144 (1-3) 237-242
43 Hagino H Odagiri H amp Okutani J 1982 Draft device for a bubble column US
Patent 4327042 44 Horitsu H Futo S Miyazawa Y Ogai S amp Kawai K 1987 Enzymatic
reduction of hexavalent chromium by hexavalent chromium tolerant Pseudomonas ambigua G-1 Agric Biol Chem 51 (9) 2417-2420
45 Ishibashi Y Cervantes C amp Silver S 1990 Chromium reduction in Pseudomonas
putida Appl Environ Microb 56 (7) 2268-2270
46 Jianlong W Zeyu M amp Xuan Z 2004 Response of Saccharomyces cerevisiae to
chromium stress Process Biochem 39 1231-1235 47 Juvera-Espinosa J Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2006 Isolation and
characterization of a yeast strain capable of removing Cr(VI) Enzyme and Microbial Technology 40 114-121
48 Kaszycki P Fedorovych D Ksheminska H Babyak L Gonchar MV Jaglarz
A amp Koloczek H 2003 Modulation of chromium(VI) and (III) tolerance and
accumulation in yeast by sulfate-containing salts European Journal of Biochemistry 1 (1) P49-53
49 Komori K Wang P Toda K amp Ohtake H 1989 Factors affecting chromate
reduction in Enterobacter cloacae Strain HO1 Appl Microbiol Biotechnol 31 567-570
50 Ksheminska H Fedorovych D Babyak L Yanovych D Kaszycki P amp Koloczek H 2005 Chromium(III) and (VI) tolerance and bioaccumulation in
yeast a survey of cellular chromium content in selected strains of representative genera Process Biochem 40 1565-1572
51 Ksheminska HP Honchar TM Gayda GZ amp Gonchar MV 2006 Extra-cellular chromate-reducing activity of the yeast cultures Central European Journal of
Biology 1 (1)137-149
109
52 Kurniawan TA Chan GYS Lo W amp Babel S 2006 Physico-chemical
treatment techniques for wastewater laden with heavy metals Chemical Engineering Journal 118 83-98
53 Labra M Grassi F Imazio S Di Fabio T Citterio S Sgorbati S amp Agradi E
2004 Genetic and DNA-methylation changes induced by potassium dichromate in Brassica napus L Chemosphere 54 1049-1058
54 Laxman RS amp More S 2002 Reduction of hexavalent chromium by Streptomyces griseus Minerals Engineering 15 831-837
55 Leustek T 2002 Sulfate metabolism The Arabidopsis Book American Society of
Plant Biologists
56 Liu YG Xu WH Zeng GM Li X and Gao H 2006 Cr(VI) reduction by
Bacillus sp isolated from chromium landfill Process Biochemistry 41 1981-1986 57 Llovera S Bonet R Simon-Pujol MD amp Congregado F 1993 Effect of culture
medium ions on chromate reduction by resting cells of Agrobacterium radiobacter Appl Microbiol Biotechnol 39 424-426
58 Lloyd JR 2003 Microbial reduction of metals and radionuclides FEMS Microbiol
Rev 27 411-425
59 Marsh TL amp McInerney MJ 2001 Relationship of hydrogen bioavailability to
chromate reduction in aquifer sediments Appl Environ Microb 67 (4) 1517-1521
60 McLean J amp Beveridge TJ 2001 Chromate reduction by a pseudomonad isolated from a site contaminated with chromated copper arsenate Applied and
Environmental Microbiology 67 (3)1076-1084 61 Megharaj M Avudainayagam S amp Naidu R 2003 Toxicity of hexavalent
chromium and its reduction by bacteria isolated from soil contaminated with tannery waste Current Microbiology 47 51-54
62 Middleton SS Latmani RB Mackey MR Ellisman MH Tebo BM amp Criddle
CS 2003 Cometabolism of Cr(VI) by Shewanella oneidensis MR-1 produces cell-associated reduced chromium and inhibits growth Biotechnol Bioeng 83 627-637
63 Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2006 Removal of hexavalent chromium
by Trichoderma viride in an airlift bioreactor Enzyme and Microbial Technology 40 107-113
64 Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2008 Hexavalent chromium removal by Trichoderma inhamatum fungal strain isolated from tannery effluent Enzyme and
Microbial Technology 40 107-113
110
65 Morales B L 2005 Aislamiento de microorganismos y estudio de su capacidad
para remover cromo hexavalente Tesis de Maestriacutea Escuela Nacional de Ciencias Bioloacutegicas IPN Meacutexico
66 Muter O Patmalnieks A amp Rapoport A 2001 Interrelations of the yeast Candida
utilis and Cr(VI) metal reduction and its distribution in the cell and medium Process Biochem 36 963-970
67 Ohtake H Cervantes C amp Silver S 1987 Decreased chromate uptake in Pseudomonas fluorescens carrying a chromate resistance plasmid J Bacteriol 169
3853-3856 68 Pal N 1997 Reduction of hexavalent chromium to trivalent chromium by
Phanerochaete chrysosporium pp 511-517 En Alleman BC amp Leeson A In Situ and On-Site Bioremediation Vol 2 Battelle Press Ohio USA
69 Pattanapipitpaisal P Brown NL amp Macaskie LE 2001 Chromate reduction by
Microbacterium liquefaciens immobilised in polyvinyl alcohol Biotechnol Lett 23
61-65
70 Pepi M amp Baldi F 1992 Modulation of chromium(VI) toxicity by organic and inorganic sulfur species in yeasts from industrial wastes BioMetals 5 179-185
71 Quintana M Curutchet G amp Donati E 2001 Factors affecting chromium(VI) reduction by Thiobacillus ferrooxidans Biochemical Engineering Journal 9 11-15
72 Ramiacuterez-Ramiacuterez R Calvo-Meacutendez C Aacutevila-Rodriacuteguez M Lappe P Ulloa M
Vaacutezquez-Juaacuterez R amp Gutieacuterrez-Corona JF 2004 Cr(VI) reduction in a chromate-
resistant strain of Candida maltosa isolated from the leather industry Antonie van Leeuwenhoek 85 63-68
73 Rege MA Petersen JN Johnstone DL Turick CE Yonge DR amp Apel WA
1997 Bacterial reduction of hexavalent chromium by Enterobacter cloacae strain
HO1 grown on sucrose Biotechnol Lett 19 (7) 691-694
74 Roukas T 1993 Ethanol production from nonsterilized carob pod extract by free and immobilized Saccharomyces cerevisiae cells using fed-batch culture
Biotechnol Bioeng 43 189-194 75 Ruiacutez MA 2000 Recuperacioacuten de metales pesados de soluciones diluidas por
biosorcioacuten con bacteria En Medrano RH Galan WL Biotecnologiacutea de Minerales CONACYT Meacutexico pp 235-262
76 Saxena D Levin R amp Firer MA 2000 Removal of chromate from industrial
effluent by a new isolate of Staphylococcus cohnii Wat Sci Technol 42 (1-2)
93-98
77 Secretariacutea de Comercio y Fomento Industrial NMX-AA-74-1981 Anaacutelisis de Agua ndash Determinacioacuten del Ioacuten Sulfato
111
78 Secretariacutea de Economiacutea NMX-AA-051-SCFI-2001 Anaacutelisis de Agua -
Determinacioacuten de Metales por Absorcioacuten Atoacutemica en Aguas Naturales Potables Residuales y Residuales Tratadas - Meacutetodo de Prueba
79 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NMX-AA-044-SCFI-
2001 Anaacutelisis de Aguas - Determinacioacuten de Cromo Hexavalente en Aguas Naturales Potables Residuales y Residuales Tratadas - Meacutetodo de Prueba En Diario Oficial de la Federacioacuten 1 de agosto 2001
80 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996
Liacutemites Maacuteximos Permisibles de Contaminantes en las Descargas de Aguas Residuales en Aguas y Bienes Nacionales En Diario Oficial de la Federacioacuten 6 de enero 1997
81 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996
Liacutemites Maacuteximos Permisibles de Contaminantes en las Descargas de Aguas Residuales a los Sistemas de Alcantarillado Urbano o Municipal En Diario Oficial de la Federacioacuten 3 de junio 1998
82 Secretariacutea de Salud Proyecto de Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-
NOM-127-SSA1-1994 Salud Ambiental Agua para Uso y Consumo Humano - Liacutemites Permisibles de Calidad y Tratamientos a que debe Someterse el Agua para su Potabilizacioacuten En Diario Oficial de la Federacioacuten 20 de Octubre 2000
83 Shakoori AR Makhdoom M amp Haq RU 2000 Hexavalent chromium reduction
by a dichromate-resistant gram-positive bacterium isolated from effluents of tanneries Appl Microbiol amp Biotechnol 53 (3) 348-351
84 Shen H and Wang YT 1994 Biological reduction of chromium by E coli Journal of Environmental Engineering 120 560-572
85 Shen H amp Wang Y 1995 Hexavalent chromium removal in two-stage bioreactor
system J Environ Eng 121 (11) 798-804
86 Smith WA Apel WA Petersen JN amp Peyton BM 2002 Effect of carbon and
energy source on bacterial chromate reduction Bioremediation J 6 (3) 205-215
87 Smith WL amp Gadd GM 2000 Reduction and precipitation of chromate by mixed culture sulphate-reducing biofilms J Appl Microbiol 88 983-991
88 Song Z Williams CJ amp Edyvean RGJ 2004 Treatment of tannery wastewater by chemical coagulation Desalination 164 (3) 249-259
89 Srinath T Verma T Ramteke PW amp Garg SK 2002 Chromium (VI)
biosorption and bioaccumulation by chromate resistant bacteria Chemosphere 48
(4) 427-435
90 Stanbury PF amp Whitaker A ―Principles of Fermentation Technology Pergamon Press Ltd Great Britain 1984 First edition Pp 11-24
112
91 Stasinakis AS Mamais D Thomaidis NS amp Lekkas TD 2002 Effect of
chromium (VI) on bacterial kinetics of heterotrophic biomass of activated sludge Water Res 36 3341-3349
92 Stasinakis AS Thomaidis NS Mamais D Karivali M amp Lekkas TD 2003
Chromium species behaviour in the activated sludge process Chemosphere 52 1059-1067
93 Stephen JR amp Macnaughton SJ 1999 Developments in terrestrial bacterial remediation of metals Current Opinion in Biotechnology 10 230-233
94 Su C amp Ludwig RD 2005 Treatment of hexavalent chromium in chromite ore
processing solid waste using a mixed reductant solution of ferrous sulfate and
sodium dithionite Environ Sci Technol 39 (16) 6208-6216
95 Thacker U Parikh R Shouche Y amp Madamwar D 2006 Hexavalent chromium reduction by Providencia sp Process Biochem 41 1332-1337
96 Thacker U amp Madamwar D 2005 Reduction of toxic chromium and partial localization of chromium reductase activity in bacterial isolate DM1 Would Journal
of Microbiology amp Biotechnology 21 891-899 97 Tung HL Chiou SY Tu CC amp Wu WT 1997 An airlift reactor with double
net draft tubes and its application in fermentation Bioprocess Eng 171-5
98 Turick CE Apel WA amp Carmiol NS 1996 Isolation of hexavalent chromium-reducing anaerobes from hexavalent-chromium-contaminated and noncontaminated environments Applied Microbiol Biotechnol 44 683-688
99 Viamajala S Peyton BM Sani RK Apel WA amp Petersen JN 2004 Toxic
effects of chromium(VI) on anaerobic and aerobic growth of Shewanella oneidensis MR-1 Biotechnol Prog 20 87-95
100 Volesky B amp Vieira RHSF 2000 Biosorption a solution to pollution Internat Microbiol 3 17-24
101 Wang DIC Cooney CL Demain AL Dunnill P Humphrey AE amp Lilly MD
1979 ―Fermentation and Enzyme Technology John Wiley amp Sons Inc USA Pp 98-115
102 Wang YT and Shen H 1997 Modelling Cr(VI) reduction by pure bacterial cultures Water Research 31 727-732
103 Wang Y amp Xiao C 1995 Factors affecting hexavalent chromium reduction in pure
cultures of bacteria Water Res 29 (11) 2467-2474
104 Wang Y 2000 Microbial reduction of chromate En Lovley DR (Ed)
Environmental Microbe-Metal Interactions ASM Press Washington DC USA pp 225-235
113
105 Wilkin RT Su C Ford RG amp Paul CJ 2005 Chromium-removal processes
during groundwater remediation by a zerovalent iron permeable reactive barrier Environ Sci Technol 39 (12) 4599-4605
106 Worthington Biochemical Corporation 1972 Worthington Enzyme Manual
Enzymes Enzyme Reagents and Related Biochemicals Freehold New Jersey USA
107 Wu J amp Wu WT 1991 Fed-batch culture of Saccharomyces cerevisiae in an airlift reactor with net draft tube Biotechnol Prog 7 230-233
108 Wu WT amp Wu JY 1990 Airlift reactor with net draught tube J Ferm Bioeng
70 359-361
109 Wu WT Wu JY amp Jong JZ 1992 Mass transfer in an airlift reactor with a net
draft tube Biotechnol Prog 8 465-468 110 Zakaria ZA Zakaria Z Surif S amp Ahmad WA 2006 Hexavalent chromium
reduction by Acinetobacter haemolyticus isolated from heavy-metal contaminated wastewater J Hazard Mater 146 30-38
111 Zuacutentildeiga M 2005 Aislamiento de microorganismos con capacidad para remover
cromo hexavalente del agua Tesis de Licenciatura Escuela Nacional de Ciencias
Bioloacutegicas IPN Meacutexico
Referencias electroacutenicas
httpepagov httpesepagovtechpubs412304html
httpfaiunneeduarbiologiamicroindcultivo20y20biorreactoreshtm httpmineralserusgsgovmineralspubscommoditychromium180494pdf
httpuserpagesumbcedu gferre1bmcohtml
httpuserpagesumbcedu gferre1fedbatchhtml httpwwgemesmaterialdocument httpwwwatsdrcdcgovfacts7 html
httpwwwchemicalelementscomelementscrhtml httpwwwepagoviris
wwwclu-inorgdownloadstudentpapersbio_of_metals_paperpdf
114
7 Impacto
En este trabajo se identificaron algunas variables ambientales que afectan la
biorreduccioacuten de cromo hexavalente [Cr(VI)] La informacioacuten obtenida podriacutea ser de
utilidad para mejorar los procesos de reduccioacuten del metal asiacute como para disminuir los
tiempos y costos del tratamiento de los efluentes industriales contaminados con Cr(VI)
Los resultaron mostraron que el sulfato afecta la tolerancia de Candida sp al Cr(VI) y a
su capacidad para reducirlo Fue evidente que a medida que se incrementoacute la
concentracioacuten de sulfato aumentoacute el crecimiento de la levadura la eficiencia global y la
velocidad global de reduccioacuten de Cr(VI) Asimismo se encontroacute que la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp depende de la densidad celular de los cultivos de manera tal que
a mayor cantidad de biomasa producida mayor es la reduccioacuten del metal Aun cuando la
cepa de Candida sp es sensible a los efectos toacutexicos del Cr(VI) en ausencia del sulfato
esta levadura posee una notable capacidad para reducir muy altas concentraciones de
Cr(VI) en presencia de sulfato por lo que podriacutea ser potencialmente uacutetil para el
tratamiento de aguas industriales altaminadas con Cr(VI) y con iones sulfato
Hasta donde sabemos este es el primer trabajo en el que se demuestra que el sulfato
desempentildea un papel impotante tanto en la tolerancia al Cr(VI) como en la reduccioacuten
aeroacutebica del mismo en microorganismos Estos descubrimientos podriacutean tener
implicaciones importantes en el tratamiento de aguas residuales contaminadas con
Cr(VI)
Ademaacutes se encontroacute que los contactores gas-liacutequido son adecuados para la reduccioacuten
aeroacutebica de Cr(VI) por Candida sp Esto uacuteltimo es de vital importancia porque seriacutea
posible disminuir significativamente los costos de tratamiento ya que estos biorreactores
se caracterizan por su baja economiacutea de aireacioacuten Las velocidades volumeacutetrica y
especiacutefica asiacute como la capacidad de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por Candida sp en el
reactor airlift con tubo conceacutentrico fueron superiores a las obtenidas en matraz y eacutesto
podriacutea deberse a que en el reactor airlift la levadura tuvo una mayor cantidad de oxiacutegeno
disponible para su crecimiento y a que el mayor nuacutemero de ceacutelulas producidas fue la
responsable de reducir maacutes eficazmente el Cr(VI) presente en el medio de cultivo
115
Las caracteriacutesticas mostradas por Candida sp en el dispositivo airlift indican que este
tipo de reactor neumaacutetico es adecuado para el crecimiento y la reduccioacuten aeroacutebica del
Cr(VI) por la levadura Asimismo los paraacutemetros cineacuteticos del proceso de reduccioacuten de
Cr(VI) catalizado por Candida sp son superiores a los reportados para otros
microorganismos lo que sugiere que esta cepa de levadura tiene potencial biotecnoloacutegico
para ser utilizada en procesos de remediacioacuten de aguas residuales industriales
contaminadas con Cr(VI)
De los diferentes sistemas de reaccioacuten ensayados (cultivos por lote lote repetido
continuo de una etapa lote alimentado y lote alimentado repetido) el cultivo por lote es
el maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
Otra de las contribuciones de este trabajo fueron la formacioacuten de recursos humanos
tanto a nivel licenciatura como de posgrado Uno de los estudiantes de licenciatura ya
sustentoacute su examen profesional y la tesis de Maestriacutea de otra estudiante ya fue revisada
y aprobada por los sinodales por lo que el examen para obtener el grado se realizaraacute en
poco tiempo Actualmente estaacuten en proceso 1 tesis de licenciatura 2 de maestriacutea y 1 de
doctorado
Entre otros productos del proyecto de investigacioacuten se tienen la publicacioacuten de 2 artiacuteculos
en revistas internacionales incluidas en la base de datos del Journal of Citation Reports
del Institute for Scientific Information (ISI) la publicacioacuten de 2 artiacuteculos en extenso en
las memorias de Congresos Internacionales y la presentacioacuten de varios trabajos en
eventos acadeacutemicos nacionales e internacionales
6
La FDA (Food and Drug Administration) ha propuesto un consumo diario (Reference Daily
Intake) de cromo de 120 gd en adultos (httpwwwepagoviris) Algunas fuentes de
cromo son el broacutecoli la levadura de cerveza el hiacutegado quesos granos integrales y
cereales (Guertin y col 2005)
No es comuacuten encontrar cromo hexavalente en forma natural en el medio ambiente y
cuando se le encuentra generalmente es como cromato de plomo PbCrO4
(httpwwwatsdrcdcgovfacts7html) Su presencia en el ambiente se debe
principalmente a las actividades realizadas por el hombre (wwwclu-
inorgdownloadstudentpapersbio_of_metals_paperpdf) En soluciones acuosas el
Cr(VI) generalmente se encuentra presente como oxianioacuten cromato [CrO42-] yo
dicromato [Cr2O72-] dependiendo del pH de la solucioacuten
Debido a su naturaleza fuertemente oxidante el cromo hexavalente puede reaccionar
con la materia orgaacutenica o con agentes reductores con lo que se forma cromo trivalente
Esta transformacioacuten ocurre maacutes raacutepidamente en ambientes aacutecidos tales como en suelos
con pH bajo (Cervantes y col 2001 Jianlong y col 2004)
En el aire el cromo hexavalente ocasionalmente reacciona con partiacuteculas de polvo o con
otros contaminantes con lo que se convierte en cromo trivalente En aguas superficiales
ricas en materia orgaacutenica el Cr(VI) exhibe un tiempo de vida corto en ese estado de
oxidacioacuten (httpwwwepagoviris)
7
13 Toxicidad del cromo
La EPA (Environmental Protection Agency) considera al cromo hexavalente - y a sus
derivados - como uno de los diecisiete agentes quiacutemicos de mayor peligrosidad para la
salud puacuteblica y para el medio ambiente (Marsh y McInerney 2001)
Al ser humano el cromo hexavalente le puede provocar dantildeo al rintildeoacuten e hiacutegado asiacute como
alteraciones neuroloacutegicas La inhalacioacuten de cromo hexavalente en niveles mayores a 2
microgm3 puede causar irritacioacuten de las mucosas comezoacuten hemorragias uacutelceras y
perforacioacuten del tabique nasal (httpwwwatsdrcdcgovfacts7html)
Se ha encontrado que algunas personas son extremadamente sensibles al contacto de su
piel con el cromo hexavalente Algunas de las reacciones aleacutergicas detectadas consisten
en el enrojecimiento marcado de la piel e hinchazoacuten
(httpwwwatsdrcdcgovfacts7html Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos
Naturales y Pesca NMX-AA-044-SCFI-2001 httpwwwepagoviris Ksheminska y
col 2005)
La EPA clasifica a los compuestos del cromo hexavalente en el grupo A el cual incluye a
los agentes carcinogeacutenicos para el hombre Ademaacutes el cromo hexavalente tiene efecto
mutageacutenico y teratogeacutenico en animales y humanos (Wang 2000
httpwwwatsdrcdcgovfacts7html Smith y col 2002)
El cromo hexavalente tambieacuten es toacutexico para la mayoriacutea de los microorganismos auacuten a
bajas concentraciones debido a que reduce su actividad enzimaacutetica afecta sus procesos
metaboacutelicos y les produce mutaciones (Wang 2000) Lo anterior tiene gran impacto en
8
los sistemas de tratamiento bioloacutegico de aguas residuales ya que reduce
significativamente la eficiencia de remocioacuten de los contaminantes y la calidad del efluente
(Stasinakis y col 2002 2003)
En las plantas el cromo hexavalente reduce la actividad de las enzimas fotosinteacuteticas y
en general de las proteiacutenas (Morales 2005) ocasiona enfermedades como la clorosis e
interfiere en diversos procesos metaboacutelicos que causan finalmente la muerte de estos
organismos Asimismo se ha demostrado que rompe la unioacuten azuacutecar-fosfato de la
cadena de aacutecido desoxirribonucleico (DNA) y produce una hiper-metilacioacuten de las bases
nitrogenadas lo que ocasiona mutaciones al azar (Labra y col 2004)
Diversos estudios han demostrado que el cromo hexavalente es cien veces maacutes toacutexico
(Garbisu y col 1998) y mil veces maacutes mutageacutenico que el estado trivalente (Wang
2000 Saxena y col 2000 Lloyd 2003)
14 Cantidad de cromo liberado al medio ambiente y legislacioacuten ambiental
Se estima que maacutes de 170000 toneladas de residuos que contienen cromo se descargan
al medio ambiente cada antildeo (Marsh y McInerney 2001) En la tabla 1 se muestran
algunos datos reportados sobre el contenido de cromo en algunos efluentes industriales
asiacute como en aguas superficiales y freaacuteticas Se puede apreciar que la concentracioacuten de
cromo de los efluentes variacutea considerablemente incluso en los del mismo sector
industrial
9
Tabla 1 Concentraciones de cromo total yo Cr(VI) de efluentes industriales y cuerpos
de agua
Fuente Concentracioacuten de cromo total
Concentracioacuten de Cr (VI)
Referencia
Industria galvanizadora ---
5000 mgL
Gaballah y col 1994
Industria galvanizadora (1) Industria galvanizadora (2)
---
---
127 mgL
3700 mgL
Fujie y col 1996
Acuiacutefero Aromas Red Sands (California)
---
6-36 gL
Gonzaacutelez y col 2005
Agua subterraacutenea contaminada (EEUU)
gt 1500 gL
---
Wilkin y col 2005
Riacuteo receptor de efluentes de la industria papelera
20-80 mgL
---
Cervantes y col 2001
Planta de tratamiento de desechos de produccioacuten de
ferrocromita
---
3-57 mgL
(fase disuelta)
Su y Ludwig 2005
Curtiduriacutea de pieles
(Grecia)
2000 ndash 3500
mgL
--- httpesepagovtechpubs41230
4html
Curtiduriacutea de pieles (tanque de sedimentacioacuten)
3500 gmL
40 gmL
Ganguli y Tripathi 1999
Curtiduriacutea de pieles (tanque de descarga)
5000 gmL
3000 gmL
Ganguli y Tripathi 1999
Curtiduriacutea de pieles (India) 200 - 2400 mgL ---
Balasubramanian y Pugalenthi 1999
Curtiduriacutea de pieles (Portugal)
2467 mgL
---
Beleza y col 2001
Efluente tratado de
curtiduriacutea de pieles (India)
---
096 mgL
Srinath y col 2002
Curtiduriacutea de pieles (Egipto)
---
1300-2500
mgL
Hafez y col 2002
Curtiduriacutea de pieles (1) (Pakistaacuten) Curtiduriacutea de pieles (2) (Pakistaacuten)
2877 mgL
220 mgL
---
---
Ali-Awan y col 2003
Curtiduriacutea de pieles 12 mgL --- Song y col 2004
Curtiduriacutea de pieles (Guanajuato Meacutexico)
250 gmL
---
Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004
Curtiduriacutea de pieles (India) 500-1000 mgL
---
Aravindhan y col 2004
Bantildeos de curtido al cromo
en curtiduriacuteas (Leoacuten Guanajuato Meacutexico)
3000 ndash10000 mgL
---
Aacutelvarez y col 2004
10
En Meacutexico no se tienen datos precisos sobre la cantidad y concentracioacuten de cromo total
o hexavalente de los residuos generados por las diversas industrias sin embargo se ha
informado que las industrias del curtido de pieles generan de 250 a 270 toneladas de
Cr2O3 al antildeo (Zuacutentildeiga 2005)
Debido a las grandes cantidades de cromo que se liberan al medio ambiente asiacute como a
los efectos indeseables que este metal ocasiona sobre los seres vivos en muchos paiacuteses
se han establecido Normas Ambientales que pretenden regular la concentracioacuten de cromo
total yo de Cr(VI) de los desechos liacutequidos soacutelidos o gaseosos que se descargan al
medio ambiente
En Meacutexico la Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca ha decretado
normas oficiales que establecen los liacutemites maacuteximos permisibles de contaminantes
incluido el cromo ya sea como cromo total o como cromo hexavalente de las aguas
residuales que se descargan en aguas y bienes nacionales (Secretariacutea de Medio
Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996) (tabla 2) asiacute como en los
sistemas de alcantarillado urbano o municipal (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos
Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996) (tabla 3)
En cuanto al agua para uso y consumo humano la Secretariacutea de Salud ha emitido la
Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-1994 (Secretariacutea de Salud Proyecto de
Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-1994) donde se indica
como liacutemite maacuteximo permisible una concentracioacuten de cromo total de 005 mgL
11
Tabla 2 Liacutemites maacuteximos permisibles de cromo total para las aguas residuales que se descargan en aguas y bienes
nacionales (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996)
Paraacutemetros
( )
Riacuteos Embalses
Naturales y
Artificiales
Aguas Costeras Suelo
(mgL) Uso en
riego
agriacutecola
(A)
Uso
puacuteblico
urbano
(B)
Proteccioacuten
de vida
acuaacutetica
( C )
Uso en
riego
agriacutecola
(B)
Uso
puacuteblico
urbano
( C )
Explotacioacuten
pesquera
navegacioacuten
y otros
usos (A)
Recreacioacuten
(B)
Estuarios
(B)
Uso en
riego
agriacutecola
(A)
Humedales
naturales
(B)
PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD
Cromo 1 15 05 10 05 10 1 15 05 10 05 10 1 15 05 10 05 10 05 10
() Medidos de manera total PD = Promedio diario PM = Promedio mensual (A) (B) y ( C ) Tipo de cuerpo receptor seguacuten la Ley Federal de Derechos
Tabla 3 Liacutemites maacuteximos permisibles de cromo hexavalente para los sistemas de alcantarillado urbano o municipal
(Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996)
Paraacutemetros (mgL) Promedio Mensual Promedio Diario Instantaacuteneo
Cromo hexavalente 05 075 1
12
Por su parte la EPA ha establecido como liacutemite una concentracioacuten de 01 mg de cromo
por litro de agua potable (httpwwwatsdrcdcgovfacts7html)
La Organizacioacuten Mundial para la Salud (OMS) y la Comunidad Econoacutemica Europea (CEE)
establecen una concentracioacuten de 005 mg de cromo totalL como paraacutemetro de calidad
para aguas destinadas a consumo humano (httpwwgemesmaterialdocument)
Algunos valores sentildealados por otras instancias internacionales se muestran en la tabla
4
Tabla 4 Liacutemites permisibles para cromo sentildealados por Directivas Internacionales
sobre agua potable y aguas embotelladas (Zuacutentildeiga 2005)
Paraacutemetro Canadaacute 1 Japoacuten 2 Aguas embotelladas Nivel de
Administracioacuten Federal sobre
Productos Farmaceacuteuticos de EEUU
Cromo
005 mgL
005 mgL
01 mgL
1 Liacutemite establecido por el Ministerio de Salud de Canadaacute
2 Liacutemite establecido por el Ministerio de Salud y Bienestar Social de Japoacuten
15 Meacutetodos para la remocioacuten de cromo de los efluentes industriales
Para disminuir los efectos toacutexicos del metal es conveniente aplicar alguacuten(os)
tratamiento(s) a los efluentes industriales que contienen cromo antes de descargarlos en
los cuerpos de agua o en el suelo asiacute como restaurar los ecosistemas contaminados En
la actualidad estaacuten disponibles varias tecnologiacuteas para estos propoacutesitos (Eccles 1999)
Estas tecnologiacuteas se han empleado para reducir la toxicidad del contaminante [mediante
la transformacioacuten quiacutemica o bioloacutegica del Cr(VI) a Cr(III)] para removerlo de un lugar
para disminuir la extensioacuten de la contaminacioacuten o para contenerlo en un aacuterea en
particular (Guertin y col 2005)
13
151 Procesos convencionales
Los meacutetodos convencionales para la remocioacuten de los metales pesados son de naturaleza
fisicoquiacutemica y pueden ser utilizados en varias etapas del tratamiento de aguas
residuales Los meacutetodos maacutes usuales para la remocioacuten de Cr(VI) de los efluentes
industriales son los siguientes 1) reduccioacuten quiacutemica ndash precipitacioacuten en donde el Cr(VI)
es reducido quiacutemicamente a Cr(III) a pH aacutecido utilizando alguacuten agente reductor (por
ejemplo el bisulfito de sodio) y posteriormente se adiciona cal o alguacuten otro compuesto
alcalino para formar hidroacutexido de cromo (III) el cual es separado por sedimentacioacuten y
2) coagulacioacuten-floculacioacuten En general estos meacutetodos tienen algunas desventajas tales
como 1) son costosos ya que el agente activo no puede ser recuperado para su
posterior reutilizacioacuten 2) algunos reactivos quiacutemicos son sumamente toacutexicos 3) su
selectividad es baja 4) generan lodos quiacutemicos con altas concentraciones de metales los
cuales son difiacuteciles de tratar 5) la remocioacuten de los metales es incompleta principalmente
cuando la concentracioacuten de eacutestos en los efluentes es inferior a 100 mgL y 6) las aguas
residuales resultantes no satisfacen los criterios de calidad establecidos en la legislacioacuten
ambiental (Cantildeizares-Villanueva 2000 Ruiacutez 2000 Saxena y col 2000 Cheung y Gu
2003)
Algunas otras tecnologiacuteas que se utilizan ocasionalmente para la remocioacuten del Cr(VI) son
el intercambio ioacutenico la adsorcioacuten el tratamiento electroquiacutemico la oacutesmosis inversa y la
evaporacioacuten (Garbisu y col 1998 Camargo y col 2003 Kurniawan y col 2006) Las
principales desventajas de estos meacutetodos son los altos costos fijos de operacioacuten y de
mantenimiento por lo que su aplicacioacuten a grandes voluacutemenes de agua o su uso por
pequentildeas y medianas empresas estaacute muy limitado
14
La EPA recomienda los siguientes meacutetodos para la remocioacuten de cromo del agua potable
en caso de que eacutesta exceda el liacutemite permisible para este metal coagulacioacuten-filtracioacuten
intercambio ioacutenico y oacutesmosis inversa (httpepagov)
En Meacutexico en caso de que el agua destinada a uso y consumo humano exceda el liacutemite
permisible de cromo total la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-1994
(Secretariacutea de Salud Proyecto de Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-
127-SSA1-1994) indica como tratamientos a aplicar el intercambio ioacutenico o la oacutesmosis
inversa
152 Procesos biotecnoloacutegicos
En las uacuteltimas dos deacutecadas se han llevado a cabo estudios con el fin de utilizar
microorganismos y plantas para la restauracioacuten de sitios y para el tratamiento de
efluentes industriales contaminados con metales toacutexicos (Stephen y Macnaughton 1999
Lloyd 2003)
En la actualidad se considera que los procesos microbioloacutegicos son la alternativa maacutes
atractiva para remover algunos metales toacutexicos de los sitios y efluentes contaminados
ya que estos procesos son ―amigables con el medio ambiente los subproductos que
generan son usualmente inocuos son muy eficientes en la remocioacuten de los metales
(particularmente cuando las concentraciones de eacutestos son bajas condiciones en las que
algunos procesos fisicoquiacutemicos son muy ineficientes) y son de bajo costo (Cheung y
Gu 2005 Chardin y col 2002 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004)
15
Dentro de los procesos biotecnoloacutegicos propuestos para la remocioacuten de Cr(VI) se
encuentran la biosorcioacuten y la reduccioacuten bioloacutegica en los cuales se han utilizado
principalmente microorganismos (Volesky y Vieira 2000 Fruchter 2002 Cheung y Gu
2003)
En la biosorcioacuten se utilizan ciertos tipos de adsorbentes bioloacutegicos por ejemplo biomasa
microbiana (viva o inactivada en suspensioacuten o inmovilizada) con los que no se requiere
energiacutea metaboacutelica para retener pasivamente al cromo hexavalente mediante procesos
fiacutesicos (adsorcioacuten fiacutesica principalmente por fuerzas de van Der Waals) o quiacutemicos
(quimisorcioacuten) (Cantildeizares-Villanueva 2000 Volesky y Vieira 2000 Aravindhan y col
2004) En algunos casos se ha observado que el metal es transportado activamente al
interior de las ceacutelulas (a expensas de energiacutea metaboacutelica) proceso al que se le denomina
como bioacumulacioacuten
En la biorreduccioacuten o reduccioacuten bioloacutegica el cromo hexavalente es transformado a la
forma trivalente este uacuteltimo puede ser faacutecilmente precipitado en una etapa posterior de
tratamiento ajustando el pH del agua residual a un valor cercano al neutro para
removerlo finalmente por meacutetodos fiacutesicos (Chardin y col 2002 Cheung y Gu 2003) Se
considera que este proceso es una alternativa tecnoloacutegica potencial para el tratamiento
de suelos cuerpos de agua y efluentes industriales contaminados ya que la reduccioacuten
del Cr(VI) disminuye significativamente la toxicidad (100 veces) solubilidad en agua y
movilidad del metal a traveacutes del medio ambiente (Cheung y Gu 2003 Lloyd 2003
Wang 2000)
16
Se han aislado varios microorganismos que pueden reducir el Cr(VI) a Cr(III) ya sea
como cultivos puros (Horitsu y col 1987 Wang 2000 Pattanapipitpaisal y col 2001
Chardin y col 2002 Cheung y Gu 2003 Middleton y col 2003 Morales-Barrera
2005 Pal 1997 Muter y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004 Thacker y col
2006) o como cultivos mixtos (Smith y col 2002 Cheung y Gu 2003) Las fuentes de
aislamiento han sido muy diversas como por ejemplo efluentes de curtiduriacuteas de la
industria metaluacutergica de mantos freaacuteticos de aguas superficiales contaminadas de
sedimentos anoacutexicos en lagos de plantas de tratamiento de aguas residuales entre
otros (Horitsu y col 1987 Fujii y col 1990 Ganguli y Tripathi 1999 Badar y col
2000 Saxena y col 2000 Pattanapipitpaisal y col 2001 Middleton y col 2003
Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004 Zuacutentildeiga 2005 Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
Entre los geacuteneros microbianos que son capaces de reducir Cr(VI) se tienen los
siguientes Achromobacter Aeromonas Agrobacterium Bacillus Desulfovibrio
Escherichia Enterobacter Micrococcus Pseudomonas (Horitsu y col 1987 Wang
2000) Staphylococcus (Saxena y col 2000) Microbacterium (Pattanapipitpaisal y col
2001) Pyrobaculum Streptomyces Deinococcus (Chardin y col 2002)
Desulfomicrobium Desulfotomaculum Pantoea (Cheung y Gu 2003) Shewanella
(Middleton y col 2003) Trichoderma (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
Phanerochaete (Pal 1997) y Candida (Muter y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col
2004)
De los estudios reportados en la literatura acerca de la reduccioacuten microbioloacutegica del
Cr(VI) sobresalen tres hechos 1) Las bacterias han sido los microorganismos maacutes
ampliamente estudiados y es muy escasa la informacioacuten disponible sobre la capacidad de
17
reduccioacuten del metal de las levaduras y de los hongos filamentosos 2) la mayoriacutea de los
microorganismos ensayados soacutelo son capaces de tolerar y reducir muy bajas
concentraciones de Cr(VI) usualmente dentro del intervalo de 0001 a 05 mM esto
uacuteltimo se ha atribuido a los efectos toacutexicos y mutageacutenicos del metal y 3) casi todos los
estudios se han realizado en cultivo por lote
1521 Transporte del cromo al interior de las ceacutelulas
Tanto en organismos procariotes como en muchos eucariotes los oxianiones cromato y
dicromato (fuentes de cromo hexavalente) ingresan principalmente a las ceacutelulas a traveacutes
de las membranas citoplaacutesmicas mediante el sistema de transporte del sulfato (Badar y
col 2000) lo cual se ha atribuido a la similitud en la carga y estructura de estos iones
(Smith y Gadd 2000) Esto fue demostrado primeramente en Salmonella typhimurium y
posteriormente en otras bacterias tales como en Escherichia coli Pseudomonas
fluorescens y Alcaligenes eutrophus Se ha comprobado que esto mismo ocurre en
algunas levaduras tales como en Candida (Muter y col 2001 Cervantes y col 2001)
Sin embargo en general el cromato penetra al interior de las levaduras por medio de un
transportador anioacutenico no especiacutefico (Czakoacute-Veacuter y col 1999 Cervantes y col 2001)
En algunos microorganismos se ha demostrado que el sulfato inhibe competitivamente el
transporte del cromato al interior de las ceacutelulas (Ohtake y col 1987 Pepi y Baldi 1992)
y que esta inhibicioacuten es maacutes marcada en ceacutelulas anaerobias que en aerobias (Zakaria y
col 2006) Tambieacuten se ha reportado el transporte del cromato por la viacutea de los fosfatos
aunque la viacutea del sulfato es la maacutes utilizada (Ohtake y col 1987)
18
El transporte del cromato al interior de las plantas tambieacuten es a traveacutes del sistema del
ioacuten sulfato Ya en el interior de la planta el cromo hexavalente se acumula en diversos
oacuterganos en cantidades diferentes El cromo hexavalente se acumula de 10 a 100 veces
maacutes en las raiacuteces que en los retontildeos o en otros tejidos (Cervantes y col 2001)
En contraste las membranas celulares de los organismos son praacutecticamente
impermeables al cromo trivalente y a sus compuestos (Ksheminska y col 2006)
1522 Mecanismos microbianos de resistencia al Cr(VI) y de reduccioacuten del
Cr(VI)
Una caracteriacutestica importante que deben tener los microorganismos que se van a utilizar
en procesos de tratamiento de efluentes contaminados con cromo hexavalente es que
sean tolerantes (resistentes) a eacuteste Esta propiedad ha sido descrita en bacterias hongos
y levaduras (Horitsu y col 1987 Cervantes y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004)
Entre los mecanismos de resistencia al cromo hexavalente que se han encontrado se
tienen los siguientes
Acumulacioacuten del metal en la superficie o en el interior de las ceacutelulas (Volesky y Vieira
2000 Saxena y col 2000)
Disminucioacuten yo impedimento en el transporte del cromo hexavalente al interior de
las ceacutelulas (Pepi y Baldi 1992)
Excrecioacuten del metal del interior de la ceacutelula al medio circundante (Cervantes y col
2001)
Reacciones de oacutexido-reduccioacuten en las que el cromo hexavalente es reducido a cromo
trivalente el cual es menos toacutexico (Baldi y col 1990 Muter y col 2001)
19
La resistencia al cromo hexavalente puede estar codificada en el genoacuteforo de las
bacterias o en plaacutesmidos Esto uacuteltimo se ha encontrado en Pseudomonas aeruginosa P
fluorescens P putida y en Alcaligenes eutrophus (Baldi y col 1990 Ishibashi y col
1990 Cervantes y col 2001) Sin embargo la tolerancia al metal no implica
necesariamente que los microorganismos seraacuten capaces de removerlo por alguacuten
mecanismo
En el interior de las ceacutelulas bacterianas los iones cromato [CrO42-] pueden ser reducidos
a cromo trivalente por ciertas enzimas (Ishibashi y col 1990 Horitsu y col 1987) En
condiciones de aerobiosis se han identificado las siguientes proteiacutenas que parecen ser las
responsables de la reduccioacuten del Cr(VI) reductasas flavoproteiacutenas enzimas
dependientes de NADH y NAD(P)H (Ishibashi y col 1990) en cambio en condiciones de
anaerobiosis los estudios indican que ciertas hidrogenasas y citocromos son los
responsables (Chardin y col 2003 Cheung y Gu 2007)
El cromo hexavalente tambieacuten puede ser reducido por compuestos quiacutemicos reductores
que son producidos durante el crecimiento de los microorganismos (Desjardin y col
2003) tales como el glutatioacuten y la cisteiacutena los cuales pueden actuar dentro o fuera de
los organismos (Zakaria y col 2006) En organismos superiores se ha identificado al
ascorbato como agente reductor del cromo hexavalente (Ksheminska y col 2006)
Casi no hay informacioacuten sobre el mecanismo responsable de la reduccioacuten del Cr(VI) en
ceacutelulas eucariotas especiacuteficamente en levaduras Con la finalidad de dilucidar dicho
20
mecanismo se han realizado estudios en los que se ha modificado la resistencia de las
levaduras al Cr(VI) o se ha inactivado alguna enzima en particular
En un trabajo llevado a cabo con algunas levaduras no convencionales se encontroacute que
algunas de eacutestas durante su crecimiento excretaron sustancias reductoras asiacute como
sustancias quelantes que formaron complejos con el cromo trivalente que fue generado
durante la transformacioacuten del cromo hexavalente (Ksheminska y col 2006)
1523 Factores que afectan la reduccioacuten bioloacutegica del Cr(VI)
En algunos microorganismos se ha estudiado el efecto que tienen las variables
ambientales tales como condiciones de aerobiosis yo de anaerobiosis donadores y
aceptores finales de electrones concentracioacuten de cromo hexavalente y potencial de
oacutexido-reduccioacuten entre algunas otras sobre la reduccioacuten del metal (Shen y Wang 1995
Shakoori y col 2000 Wang 2000 Smith y col 2002 Wang y Xiao 1995 Fujii y col
1990 Muter y col 2001 Smith y Gadd 2000 Lloyd 2003 Jianlong y col 2004
Viamajala y col 2004)
La reduccioacuten del Cr(VI) puede realizarse en ambiente aerobio yo anaerobio En
organismos aerobios y anaerobios facultativos se ha investigado el efecto del oxiacutegeno
disuelto en el medio sobre la reduccioacuten del metal (Wang 2000) Se ha encontrado que
la sensibilidad del proceso de reduccioacuten del Cr(VI) a la tensioacuten de oxiacutegeno es diferente
para cada microorganismo En cultivos de Enterobacter cloacae HO1 concentraciones
iniciales de oxiacutegeno mayores a 45 ppm inhibieron fuertemente la reduccioacuten del Cr(VI)
(Komori y col 1989) mientras que la reduccioacuten del metal fue maacutes lenta en condiciones
21
de anaerobiosis que en aerobiosis en el caso de Thiobacillus ferrooxidans (QuiIntana y
col 2001)
Asimismo se ha investigado el efecto de algunos iones sobre la reduccioacuten bioloacutegica del
Cr(VI) Con respecto al sulfato [SO42-] existe una analogiacutea estructural y de carga entre
este anioacuten [SO42-] y el ioacuten cromato [CrO4
2-] por lo que puede establecerse una
competencia entre ellos por los transportadores de sulfato existentes en las ceacutelulas
influyendo asiacute en la reduccioacuten del cromo hexavalente (Smith y Gadd 2000)
En cultivos aerobios no se ha reportado inhibicioacuten por sulfato en la reduccioacuten del cromo
hexavalente (Wang y Xiao 1995 Ishibashi y col 1990 Wang 2000) En contraste se
ha informado que en cultivos anaerobios el sulfato afecta la reduccioacuten del Cr(VI) debido
a que este anioacuten compite con el cromato como aceptor final de electrones (Garbisu y
col 1998)
Por otro lado en un estudio realizado con varios geacuteneros de levadura (Pichia Candida
Debaryomyces Saccharomyces Schwanniomyces Cryptococcus Hansenula) que tienen
capacidad para acumular cromo se encontroacute que el sulfato afectoacute la tolerancia de las
levaduras al Cr(VI) siendo mayor o menor el efecto en funcioacuten de la levadura en estudio
(Kaszycki y col 2003)
Otros iones que se han investigado son el Mg2+ Mn2+ Ca2+ y el Fe En cultivos con
ceacutelulas pasivas (resting cells) de Agrobacterium radiobacter se encontroacute que debe
controlarse principalmente la cantidad de fierro para incrementar la capacidad de
reduccioacuten del microorganismo (Llovera y col 1993)
22
Los donadores de electrones que se han utilizado principalmente en los estudios de
reduccioacuten del Cr(VI) son compuestos alifaacuteticos y aromaacuteticos carbohidratos de bajo peso
molecular aminoaacutecidos y aacutecidos orgaacutenicos (Wang y Xiao 1995 Wang 2000 Smith y
col 2002 Ksheminska y col 2006) El descubrimiento de microorganismos que son
capaces de reducir el cromo hexavalente utilizando una amplia variedad de fuentes de
carbono y energiacutea favorece su uso en procesos de remediacioacuten in situ (Smith y col
2002)
Para la reduccioacuten del cromo hexavalente es conveniente conocer el pH y la temperatura
oacuteptimos para el crecimiento de los microorganismos (Wang 2000 Shakoori y col 2000
Camargo y col 2002 Faisal y Hasnain 2004) En cultivos de Streptomyces griseus se
estudioacute la reduccioacuten del Cr(VI) en el intervalo de valores de pH de 4 a 8 y de
temperatura de 28 a 50 degC obtenieacutendose la mayor reduccioacuten a un pH de 6-7 y a una
temperatura de 28 degC (Laxman y More 2002)
En cultivos de Ochrobactrum sp se trabajoacute en el intervalo de temperatura de 30 a 45 degC
y de pH de 6 a 8 obtenieacutendose la mayor reduccioacuten del Cr(VI) y el crecimiento celular
maacutes alto a 35 degC y a un pH de 7 (Thacker y Madamwar 2005) En estudios realizados
con Escherichia coli ATCC 33456 se ensayoacute la reduccioacuten del Cr(VI) en el intervalo de
valores de pH de 3-8 y de temperatura de 40-60 degC encontraacutendose que el pH y la
temperatura de incubacioacuten oacuteptimos fueron de 7 y 37 degC respectivamente (Bae y col
2000)
Se ha observado que la concentracioacuten inicial de Cr(VI) influye en la velocidad de
reduccioacuten del metal (Wang 2000) La velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) exhibida por los
23
cultivos de Bacillus sp Pseudomonas fluorescens LB300 (Wang y Xiao 1995)
Ochrobactrum sp (Thacker y Madamwar 2005) y de Candida sp LBM2 (Juvera-Espinosa
y col 2006) se incrementoacute conforme aumentoacute la concentracioacuten inicial de Cr(VI) En
contraste la velocidad de reduccioacuten de Bacillus sp Arthrobacter sp (Megharaj y col
2003) y de Trichoderma viride (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006) disminuyoacute al
incrementar la concentracioacuten inicial de cromo hexavalente
Para obtener una reduccioacuten importante del Cr(VI) se requieren altas concentraciones de
biomasa (Wang 2000) La concentracioacuten inicial de biomasa tiene efecto sobre la
velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) de Bacillus sp y Pseudomonas fluorescens LB300 ya
que eacutesta aumentoacute al haber mayor cantidad de biomasa inicial (Wang y Xiao 1995) Este
mismo efecto se observoacute en cultivos de una cepa bacteriana gram positiva a la que se le
denominoacute como cepa ATCC 700729 (Shakoori y col 2000)
El potencial redox se ha medido en algunos estudios realizados con diferentes
microorganismos y condiciones de cultivo para determinar su efecto sobre la reduccioacuten
del Cr(VI) (Komori y col 1989 Turick y col 1996 McLean y Beveridge 2001) sin
embargo no se ha reportado un intervalo oacuteptimo de potencial redox para llevar a cabo la
reduccioacuten del Cr(VI) a su forma menos toacutexica (Wang 2000)
En algunos estudios se ha evaluado la influencia de algunos metales (Mn Ni Zn Pb Cu
Co As Se y Hg) sobre la reduccioacuten del Cr(VI) ya que las cepas microbianas que sean
resistentes a uno o varios metales y que sean capaces de reducir el Cr(VI) seriacutean de gran
utilidad en la biorremediacioacuten de efluentes industriales (Faisal y Hasnain 2004 Cheung
y Gu 2005 Thacker y col 2006) En estudios con Escherichia coli ATCC 33456 se
24
investigoacute el efecto de varios iones (Hg2+ Ag2+ Mn2+ Zn2+ Pb2+ Cd2+ Ca2+ y Mg2+) que
pueden estar presentes junto con el Cr(VI) en efluentes industriales Con el magnesio
se observoacute un ligero aumento en la actividad reductora del microorganismo mientras
que con el mercurio se inhibioacute por completo su capacidad de reduccioacuten (Bae y col
2000)
En el caso particular de microorganismos filamentosos los esfuerzos de corte pueden
causar dantildeo fiacutesico a las ceacutelulas y como consecuencia afectar su capacidad de reduccioacuten
de Cr(VI) En cultivos de Trichoderma viride realizados en matraz y en un reactor
agitado mecaacutenicamente con un impulsor se observoacute que los micelios eran de menor
tamantildeo cuando el hongo se cultivaba en el reactor Asimismo el incremento celular y la
eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidos en matraz fueron superiores a los alcanzados
en el reactor agitado con un impulsor Estos resultados sugirieron que las fuerzas de
cizalla creadas por el impulsor fragmentan el micelio y afectan la viabilidad celular y la
capacidad de reduccioacuten del microorganismo (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
16 Sistemas de reaccioacuten
En la mayoriacutea de los estudios sobre reduccioacuten de Cr(VI) el sistema de reaccioacuten que maacutes
se ha empleado es el cultivo por lote Este sistema es ampliamente utilizado en procesos
biotecnoloacutegicos para la produccioacuten de biomasa y de metabolitos de intereacutes industrial La
duracioacuten de este tipo de cultivo depende del tamantildeo del inoacuteculo de las condiciones
ambientales como el pH los componentes del medio de cultivo y la temperatura
Aunque su operacioacuten es sencilla ofrece pocas opciones de control de las variables
intensivas de intereacutes (concentracioacuten de biomasa sustrato producto) en comparacioacuten
con otros sistemas de reaccioacuten
25
(httpfaiunneeduarbiologiamicroindcultivo20y20biorreactoreshtm) Asimismo
despueacutes de un cultivo por lote se requiere de un periodo para la descarga limpieza y
esterilizacioacuten del equipo asiacute como para el arranque de un nuevo cultivo por lote lo que
disminuye la productividad global del proceso (Wang y col 1979)
Pocos son los estudios relacionados con la reduccioacuten del Cr(VI) en los que se ha
trabajado con otros sistemas de reaccioacuten tales como con el cultivo continuo (DeLeo y
Ehrlich 1994 Bhide y col 1996 Chirwa y Wang 1997 Bae y col 2000) y el cultivo
por lote alimentado o fed-batch (Fujii y col 1990 Fujie y col 1996)
El cultivo continuo permite alcanzar un estado estacionario independiente del tiempo en
el que los microorganismos presentan un crecimiento consumo de sustrato y produccioacuten
constantes por lo que es posible obtener una alta productividad o velocidad volumeacutetrica
(httpuserpagesumbcedu gferre1bmcohtml) En este sistema es posible controlar
la cantidad de biomasa utilizando un uacutenico nutriente limitante del crecimiento (Wang y
col 1979)
A pesar de que el cultivo continuo tiene la desventaja de ser susceptible de contaminarse
debido a los periodos prolongados de operacioacuten (Stanbury 1984) en estudios con Cr(VI)
se minimizariacutea lo anterior ya que este estado de oxidacioacuten del cromo es altamente toacutexico
para la mayoriacutea de los microorganismos auacuten a bajas concentraciones
El cultivo por lote alimentado se utiliza industrialmente para la produccioacuten de varios
productos bioloacutegicos de intereacutes (enzimas antibioacuteticos vitaminas aminoaacutecidos entre
otros) El sistema es uacutetil para obtener una alta concentracioacuten de metabolitos asociados
26
al crecimiento ya que es posible alcanzar una alta concentracioacuten de biomasa aunque
tambieacuten se emplea para la produccioacuten de compuestos no asociados al crecimiento como
por ejemplo de algunos antibioacuteticos Su uso tambieacuten se recomienda cuando se trabaja
con compuestos toacutexicos o de muy baja solubilidad y no requiere mayor equipo que el
utilizado en un cultivo por lote (httpuserpagesumbcedu gferre1fedbatchhtml)
Otras ventajas de este sistema son 1) los tiempos totales del proceso fermentativo son
menores y no requiere de un nuevo inoacuteculo cada vez que se repite el ciclo en
comparacioacuten con un cultivo por lote y 2) menor riesgo de contaminacioacuten que el cultivo
continuo (Roukas 1993)
27
2 OBJETIVOS
21 Objetivos generales
1) Determinar el efecto del ioacuten sulfato sobre el crecimiento celular consumo de glucosa y
reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
2) Realizar el estudio cineacutetico del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de
Cr(VI) de Candida sp en sistemas por lote y lote repetido en un reactor airlift
3) Seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten del Cr(VI) por
Candida sp
22 Objetivos especiacuteficos
a) Determinar el efecto de la concentracioacuten de sulfato de amonio sobre el crecimiento
celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
b) Evaluar el crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote y lote repetido
c) Realizar el estudio cineacutetico del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa
d) Evaluar el crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote alimentado repetido
e) Seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes conveniente para la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp
28
3 MATERIAL Y MEacuteTODOS
31 Microorganismo
Para el desarrollo del presente trabajo se utilizoacute una levadura que se aisloacute a partir del
agua residual de una industria curtidora de pieles que se encuentra ubicada en la Ciudad
de Leoacuten Guanajuato Mediante teacutecnicas morfoloacutegicas y bioquiacutemicas que fueron
realizadas en el Laboratorio de Micologiacutea de la Facultad de Medicina de la UNAM asiacute
como por teacutecnicas de biologiacutea molecular que fueron llevadas a cabo en el Laboratorio de
Microbiologiacutea General de la Escuela Nacional de Ciencias Bioloacutegicas se determinoacute que la
levadura pertenece al geacutenero Candida La amplificacioacuten y secuenciacioacuten del dominio
D1D2 del gen 26S rDNA de la levadura aislada reveloacute que estaacute relacionada con Candida
petrohuensis (GenBank accession number U45819) Candida acudensis (GenBank
accession number U45810) y Candida drimydis (GenBank accession number U45815)
con un nivel de confidencia del 896 La baja similitud de las secuencias parciales
conocidas del gen 26S rDNA y la de la cepa de levadura empleada en este trabajo podriacutea
sugerir que es una cepa no identificada no registrada en el GenBank por lo que se le
denominoacute como Candida sp La relacioacuten filogeneacutetica de la cepa de Candida usada en este
estudio y la de otras especies de levadura se muestra en la figura 1
29
Figura 1 Relaciones filogeneacuteticas de la levadura
AJ508572Cmucifera
AB041003Candida
AB041006Cmucifera
AB041005Stephanoascus
U45822Cchiropterorum
U40103Arxula
U40094Arxula
AY283605Sympodiomyces
AF017247Trichomonascus
U40110Blastobotrys
AY442294Sympodiomyces
U40096Sympodiomyces
AY559042Cmokoenaii
FGSFEP
U45819Cpetrohuensis
U45810Cancudensis
U45815Cdrimydis
U45806Cbondarzewiae
U45816Ctepae
U45812Candida
U45812Cantillancae
U45811Csantjacobensis
U76531Stephanoascus
AB196536Stephanoascus
U70245Cedax
AF017236Cbertae
U45835Cvaldiviana
AY618511Cnovakii
U45807Ccastrensis
U45826Cpaludigena
AF294910Cbituminiphila
U45829Pichia
U84241Zygozyma
U76350Myxozyma
U76527Lipomyces
U45804Debaryomyces
U75524Pichia
U68552Saccharomyces
AY545582Naumovia
AY007888Saccharomyces 100 100
43 100
100
100
43 100
100
72
100
86
95
95
100
91
58 69
99
98
84
92
60
63
54
40
56
37
49
21
39
61
16
002
30
32 Propagacioacuten del inoacuteculo
La composicioacuten quiacutemica del medio de cultivo basal que se utilizoacute en este trabajo para la
propagacioacuten del inoacuteculo y para los experimentos de remocioacuten de Cr(VI) en diferentes
sistemas de reaccioacuten los cuales fueron realizados en un reactor neumaacutetico se muestra
en la tabla 5
Tabla 5 Composicioacuten quiacutemica del medio de cultivo
Compuesto Concentracioacuten
(gL)
Glucosa 100
(NH4)2SO4 30
KH2PO4 10
MgSO4 7H2O 03
KCl 01
Extracto de levadura 01
CaCl2 005
FeCl3 0001
Para los experimentos en los que se determinoacute el efecto del sulfato sobre la tolerancia de
Candida sp al Cr(VI) y la reduccioacuten del mismo el inoacuteculo se propagoacute en el mismo medio
de cultivo pero el (NH4)2SO4 se reemplazoacute por NH4Cl (243 gL) y el MgSO47H2O por
MgCl26H2O (0247 gL)
31
El pH inicial de los medios de cultivo fue de aproximadamente 60 A matraces
Erlenmeyer de 1000 mL que conteniacutean 200 mL de medio de cultivo se les adicionoacute una
asada de Candida sp y posteriormente se incuboacute con agitacioacuten constante a 28-30 ordmC
durante 42 h A continuacioacuten la biomasa se separoacute por centrifugacioacuten a 1500 rpm a
4 degC durante 15 min bajo condiciones de asepsia El paquete celular resultante se lavoacute
dos veces con agua destilada esteacuteril para eliminar los componentes del medio de cultivo
y los residuos celulares El paquete celular se resuspendioacute en un pequentildeo volumen de
agua destilada esteacuteril y se homogeneizoacute La suspensioacuten celular resultante se utilizoacute como
inoacuteculo para los experimentos realizados en este trabajo
Para la conservacioacuten de la levadura se usaron viales con medio inclinado de YPG
(glucosa 2 peptona de caseiacutena 1 extracto de levadura 1 y agar bacterioloacutegico
2) los cuales se mantuvieron en refrigeracioacuten a 4 degC Las resiembras se realizaron
cada dos meses
33 Reactores airlift
Se utilizoacute un contactor gas-liacutequido (reactor agitado neumaacuteticamente) del tipo airlift con
tubo conceacutentrico (figuras 2a y 2b) con un volumen total de 52 litros y un posible
volumen de operacioacuten de 42 litros para realizar los estudios de remocioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en sistemas por lote lote repetido lote alimentado y lote alimentado
repetido El reactor estaacute hecho de vidrio Pyrex y consta de una base columna y una
tapa Entre la base y la columna asiacute como entre la columna y la tapa se colocaron
empaques de neopreno para evitar el contacto vidrio-vidrio asiacute como para evitar fugas
de aire yo de medio de cultivo Las secciones se unieron mediante bridas de Nylamid La
32
base del reactor tiene un difusor del tipo placa plana de vidrio poroso para el suministro
de aire
33
Oliva para
toma de muestra
Aire
Tubo conceacutentrico (liso con
perforaciones de
malla)
Filtro de aire
Venteo
Difusor de vidrio poroso(poro fino)
Difusor de vidrio
poroso (poro fino)
Aire
50deg
4
65
3 m
m
77 mm
11
5
mm
128 mm
88 mm
15
mm
70 mm
4
50
3 m
m
Figuras 2a y 2b Reactor del tipo airlift con tubo conceacutentrico
34
En el interior del reactor se colocoacute un tubo conceacutentrico liso (sin perforaciones) de vidrio
Pyrex un tubo conceacutentrico de vidrio Pyrex con perforaciones circulares (4 mm de
diaacutemetro) o un tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable No 316 (grado
alimentario nuacutemero de malla = 20 abertura = 3344 mm) los cuales tienen la misma
longitud y diaacutemetro El tipo de tubo que se utilizoacute para los experimentos de reduccioacuten
del Cr(VI) dependioacute del sistema de reaccioacuten que se ensayoacute el tubo conceacutentrico liso se
utilizoacute para llevar a cabo experimentos en cultivos por lote y lote repetido el tubo
conceacutentrico con perforaciones se empleoacute para realizar cultivos por lote lote alimentado y
lote alimentado repetido y el tubo de malla metaacutelica se usoacute para cultivos por lote
Para el cultivo continuo de una etapa se utilizoacute un reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
con un volumen total de 650 mL y un posible volumen de operacioacuten de 550 mL el cual
tiene las mismas relaciones geomeacutetricas que el reactor antes mencionado
En todos los sistemas de reaccioacuten ensayados se suministroacute aire en el interior del tubo
conceacutentrico El aire de entrada se controloacute mediante una vaacutelvula reguladora de presioacuten y
su velocidad de flujo se midioacute con un rotaacutemetro
34 Meacutetodos experimentales
341 Efecto de la concentracioacuten de sulfato sobre el crecimiento celular
consumo de glucosa remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp
Se evaluoacute el efecto de la concentracioacuten de sulfato sobre el crecimiento celular consumo
de glucosa remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivos por lote a
nivel matraz Para estos experimentos parte o todo del (NH4)2SO4 y del MgSO4 7H2O del
medio de cultivo basal (tabla 5) se reemplazoacute con NH4Cl y MgCl26H2O respectivamente
35
a fin de mantener las mismas concentraciones iniciales de nitroacutegeno (454 mM) y de
magnesio (1217 mM) en todos los medios de cultivo ensayados
Se prepararon tres series de matraces Erlenmeyer de 500 mL que conteniacutean 135 mL de
medio de cultivo con diferentes concentraciones iniciales de sulfato Las
concentraciones de sulfato ensayadas fueron las siguientes 00 1217 25 50 100
150 200 y 2392 mM (esta uacuteltima concentracioacuten corresponde a la del ioacuten sulfato
presente en el medio de cultivo basal) Estas concentraciones no incluyen la cantidad de
sulfato proporcionado por algunos otros componentes del medio de cultivo (provenientes
del extracto de levadura yo de sales inorgaacutenicas) ya que el Laboratorio Central de
Instrumentacioacuten del Departamento de Biofiacutesica de la Escuela Nacional de Ciencias
Bioloacutegicas IPN determinoacute que la concentracioacuten de este ioacuten en el medio de cultivo que
conteniacutea cloruro de amonio y cloruro de magnesio como uacutenicas fuentes de nitroacutegeno
inorgaacutenico y de magnesio respectivamente era de 23 mgL (002 mM) A este uacuteltimo
medio de cultivo es al que se le denominoacute en el presente trabajo como ―0 mM de ioacuten
sulfato Para la cuantificacioacuten del ioacuten sulfato se utilizoacute el meacutetodo recomendado por la
Norma Oficial Mexicana NMX-AA-74-1981 (Secretariacutea de Comercio y Fomento Industrial
1981) El pH inicial de todos los medios de cultivo ensayados fue de aproximadamente
60
A una serie de matraces con medio de cultivo no se le adicionoacute Cr(VI) con la finalidad de
determinar el efecto del sulfato sobre el crecimiento celular y consumo de glucosa por la
levadura en ausencia del metal (cultivos control) A los matraces de la segunda y tercera
serie se les adicionoacute un determinado volumen de una solucioacuten stock esteacuteril de cromato
de potasio (20 gL) para obtener concentraciones iniciales de Cr(VI) de 17 y 33 mM
36
respectivamente Los matraces fueron inoculados con un determinado volumen de
suspensioacuten celular concentrada a fin de que la concentracioacuten inicial de biomasa de todos
los cultivos fuera de aproximadamente 1 mgmL Los matraces se colocaron en un bantildeo
metaboacutelico con agitacioacuten constante a 28-30 degC Se recolectaron muestras a diferentes
tiempos de incubacioacuten a las que se les determinoacute la concentracioacuten de biomasa glucosa
Cr(VI) y cromo total residual asiacute como el pH
342 Controles abioacuteticos
Se utilizaron controles libres de ceacutelulas con el propoacutesito de determinar si el Cr(VI) era
reducido abioacuteticamente a Cr(III) por los componentes del medio de cultivo
Durante los experimentos de remocioacuten de Cr(VI) con ceacutelulas viables (cultivos problema)
se observoacute que el pH de los medios de cultivo disminuyoacute desde aproximadamente 6
hasta 25-42 dependiendo de la concentracioacuten de sulfato y de cromo utilizada Como
se sabe que los pHrsquos bajos favorecen que la materia orgaacutenica (donadores de electrones)
reduzca el Cr(VI) a Cr(III) en este trabajo se llevaron a cabo experimentos sin biomasa
de Candida sp (controles libres de ceacutelulas) a distintos valores de pH (25 3 4 5 y 6) y
a las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas (17 y 33 mM) para determinar
el grado de reduccioacuten causado por los constituyentes del medio de cultivo
Como controles libres de ceacutelulas se utilizaron matraces Erlenmeyer que conteniacutean medio
de cultivo a los que se les adicionoacute un volumen determinado de una solucioacuten stock
esteacuteril de cromato de potasio (20 gL) para obtener concentraciones iniciales de Cr(VI)
de 17 y 33 mM A continuacioacuten se ajustoacute el pH del medio de cultivo a alguno de los
37
valores antes mencionados La adicioacuten de la solucioacuten stock esteacuteril de cromato de potasio
y el ajuste del pH se realizoacute en condiciones de asepsia
Los controles abioacuteticos se incubaron a las mismas condiciones que los matraces
problema Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se les
determinoacute la concentracioacuten de Cr(VI)
343 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa
remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivo por lote en un
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Se realizoacute la evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa remocioacuten
de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso (sin perforaciones) El cultivo por lote se llevoacute a cabo con 4 litros de
medio de cultivo basal con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM [igual a 78
mgL de Cr(VI)] y con un pH inicial de aproximadamente 60 El reactor se inoculoacute con
un volumen determinado de suspensioacuten celular concentrada para obtener una
concentracioacuten inicial de biomasa cercana a 12 mgmL Se suministroacute aire con un flujo
volumeacutetrico de 4 litrosmin equivalente a 1 vvm (vvm = volumen de aire por volumen
de medio de cultivo por minuto)
El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que el nivel de Cr(VI) residual fue
despreciable Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se
les determinoacute la concentracioacuten de biomasa de glucosa Cr(VI) y cromo total residual asiacute
como el pH
38
344 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote repetido en un reactor
airlift con tubo conceacutentrico liso
Los sistemas por lote repetido se iniciaron con un cultivo por lote Cuando se alcanzaron
niveles bajos de Cr(VI) residual en el primer cultivo por lote se procedioacute a recolectar un
determinado volumen de medio y se reemplazoacute con medio fresco que teniacutea una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM A continuacioacuten el sistema se operoacute nuevamente por
lote (segundo cultivo por lote o cultivo por lote repetido) hasta que ya no se detectaron
variaciones considerables en la concentracioacuten de Cr(VI) residual
Se ensayaron tres diferentes relaciones de recambio de medio de cultivo (f = volumen de
medio recolectadovolumen inicial de medio liacutequido en el reactor) las cuales fueron de
04 06 y 08 Para las dos uacuteltimas relaciones se realizaron experimentos sin ajustar el
pH del medio al inicio del segundo cultivo por lote (lote repetido) asiacute como ajustando el
pH a 60 Para la primera relacioacuten (f = 04) soacutelo se realizoacute el experimento sin ajustar el
pH del medio al inicio del cultivo por lote repetido ya que los experimentos realizados a
las relaciones de recambio de 06 y 08 mostraron que la eficiencia y velocidad de
reduccioacuten de Cr(VI) de los cultivos por lote repetido eran mayores cuando no se ajustaba
el pH
Durante los cultivos por lote repetido se recolectaron muestras a diferentes tiempos de
incubacioacuten a las cuales se les determinoacute la concentracioacuten de biomasa glucosa Cr(VI) y
el pH Con los datos obtenidos se estimaron algunas variables cineacuteticas que se utilizaron
para seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para los fines que se persiguen en
este trabajo
39
345 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa en un
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Para el cultivo continuo de una etapa se utilizoacute un biorreactor airlift con tubo conceacutentrico
liso con un volumen de operacioacuten de 500 mL Al reactor se le suministroacute continuamente
medio de cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM por medio de una
bomba peristaacuteltica Se ensayaron dos flujos volumeacutetricos de medio de cultivo de 378 y
50 mLh que corresponden a velocidades de dilucioacuten de 00076 h-1 y de 00100 h-1
respectivamente
Con los datos obtenidos a la velocidad de dilucioacuten de 00076 h-1 se estimoacute la velocidad
volumeacutetrica global y la eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) las cuales se utilizaron
para seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp
346 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular y la remocioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo conceacutentrico de
malla de acero inoxidable y de vidrio perforado
Se realizaron cultivos por lote en el reactor airlift en el cual se colocoacute un tubo conceacutentrico
de malla de acero inoxidable No 316 (grado alimentario calibre No 20 abertura =
3344 mm) o un tubo conceacutentrico de vidrio con perforaciones circulares de
aproximadamente 4 mm de diaacutemetro Al reactor se le adicionaron 4 litros de medio de
cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM [igual a 78 mgL de Cr(VI)] y
un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada para obtener una
40
concentracioacuten inicial de biomasa de aproximadamente 12 mgmL El pH inicial del medio
fue de aproximadamente 60 Se ensayaron dos flujos de aire de 05 y 1 vvm
El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que el nivel de Cr(VI) residual fue bajo Se
recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se les determinoacute la
concentracioacuten de biomasa y de Cr(VI) residual Con los datos obtenidos se estimaron
algunas variables cineacuteticas que sirvieron como criterio de seleccioacuten para determinar el
tubo conceacutentrico maacutes adecuado para llevar a cabo los cultivos por lote alimentado y lote
alimentado repetido
347 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote
alimentado repetido en un reactor airlift
Para los cultivos por lote alimentado y lote alimentado repetido se utilizoacute el reactor airlift
con el tubo conceacutentrico seleccionado previamente Los cultivos por lote alimentado se
iniciaron con un cultivo por lote utilizando las condiciones iniciales mencionadas en el
inciso 446 y una aireacioacuten de 05 vvm El cultivo por lote se mantuvo en operacioacuten
hasta que la concentracioacuten de Cr(VI) residual fue baja
A continuacioacuten el reactor se drenoacute hasta alcanzar un volumen de liacutequido en el reactor de
25 litros y se inicioacute el suministro continuo de medio de alimentacioacuten con una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM La alimentacioacuten se mantuvo hasta que se alcanzoacute un
volumen de medio liacutequido en el reactor de 37 litros (primer cultivo por lote alimentado)
41
Posteriormente el reactor se volvioacute a drenar hasta obtener un volumen de medio de 25
litros y enseguida se volvioacute a suministrar continuamente medio de cultivo basal con una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM utilizando el mismo flujo de alimentacioacuten que para el
primer cultivo por lote alimentado El suministro de medio se mantuvo hasta alcanzar un
volumen de liacutequido en el reactor de 375-40 litros (segundo cultivo por lote alimentado o
cultivo por lote alimentado repetido)
Se ensayaron dos flujos de alimentacioacuten de 659 y 1343 mLh que representan cargas
maacutesicas de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh
Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las cuales se les
determinoacute la concentracioacuten de biomasa de glucosa y Cr(VI) residual asiacute como el pH
Con los datos obtenidos se estimaron las velocidades volumeacutetricas globales y las
eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI)
35 Meacutetodos analiacuteticos
351 Determinacioacuten de la concentracioacuten de biomasa
La concentracioacuten celular se determinoacute mediante el peso seco de la masa celular Las
muestras recolectadas se filtraron a traveacutes de membranas de fibra de vidrio (Whatman
GFA) con un diaacutemetro de poro de 16 m las cuales se colocaron previamente puestas a
peso constante Posteriormente las membranas se colocaron en una estufa a 95 degC
hasta alcanzar un peso constante Los filtrados se utilizaron para determinar la
concentracioacuten de glucosa Cr(VI) y cromo total residual asiacute como el pH
352 Determinacioacuten de la concentracioacuten de glucosa
42
Se determinoacute mediante un meacutetodo enzimaacutetico empleando a la glucosa oxidasa y
peroxidasa (Worthington Biochemical Corporation 1972)
Principio El meacutetodo se basa en que la glucosa es oxidada a aacutecido glucoacutenico por la
glucosa oxidasa la cual cataliza la siguiente reaccioacuten
-D-glucosa + H2O + O2 Aacutecido D-glucoacutenico + H2O2
El peroacutexido de hidroacutegeno generado reacciona con el sistema peroxidasa - orto-
dianisidina dando como resultado la oxidacioacuten de la orto-dianisidina y la produccioacuten de
agua de acuerdo con la siguiente reaccioacuten
H2O2 + orto-dianisidina (reducida) ortondashdianisidina (oxidada) + H2O
peroxidasa
La orto-dianisidina oxidada presenta un color pardo que en medio aacutecido vira a color
rosa la cual se lee a una longitud de onda de 540 nm (figura 3)
Figura 3 Orto-dianisidina (33rsquo ndash dimetoxidibencidina)
H2N NH2
OCH3
OCH3
43
353 Determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo hexavalente
La concentracioacuten de cromo hexavalente se determinoacute por la teacutecnica de la 15-
difenilcarbohidrazida siguiendo los procedimientos descritos en el meacutetodo 8023 del Hach
Water Analysis Handbook (2002) Este meacutetodo estaacute aprobado por la EPA (Environmental
Protection Agency) (Hach 2002) y por la Norma Oficial Mexicana NMX-AA-044-SCFI-
2001 (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NMX-AA-044-SCFI-
2001)
Principio Se utilizoacute un reactivo en polvo llamado ChromaVer3 el cual contiene una
solucioacuten buffer aacutecida combinada con la 15-difenilcarbohidrazida Este uacuteltimo compuesto
reacciona con el cromo hexavalente dando un compuesto de color puacuterpura (figura 4) El
meacutetodo es aplicable para el agua ya sea fresca o de muestras de agua residual La
intensidad del color es ldirectamente proporcional a la concentracioacuten de cromo
hexavalente presente
Figura 4 Reaccioacuten de la 15-difenilcarbohidrazida con el cromo hexavalente
+ Cr 6+
Compuesto colorido
puacuterpura
N N
Cr O
C R
O
N N
H H
C R
15-difenilcarbohidrazida
2 N N N
H H
N C
H O
H
44
354 Determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo total
La determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo total de los filtrados de las muestras
recolectadas (cromo total en solucioacuten) se realizoacute por espectroscopiacutea de absorcioacuten
atoacutemica con flama de acetileno-aire (SpectrAA220 FS Varian Inc)
Para determinar la cantidad de cromo retenido por la biomasa de Candida sp las ceacutelulas
fueron lavadas con agua desionizada deshidratadas y posteriormente fueron digeridas
con aacutecido niacutetrico concentrado La solucioacuten obtenida se enfrioacute a temperatura ambiente y
se le adicionoacute agua desionizada hasta obtener un volumen final de 50 mL Este
procedimiento estaacute descrito en la Norma Oficial Mexicana NMX-AA-051-SCFI-2001
(Secretariacutea de Economiacutea 2001) La concentracioacuten de cromo total de la solucioacuten
resultante se determinoacute en un espectrofotoacutemetro de absorcioacuten atoacutemica con un horno de
grafito (SpectrAA220 FS Varian Inc)
355 Determinacioacuten del pH
Se realizoacute con un potencioacutemetro marca Oakton
45
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Meta No 1 Determinar el efecto del ioacuten sulfato sobre la reduccioacuten
de Cr(VI)
41 Efecto del sulfato sobre el crecimiento celular consumo de glucosa
remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp
411 Evaluacioacuten de la influencia del sulfato sobre el crecimiento celular de
Candida sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
Se determinoacute el efecto de ocho concentraciones diferentes de sulfato (00 1217 25
50 100 150 200 y 2392 mM) sobre el crecimiento celular de Candida sp cuando
eacutesta se cultivoacute por lote a nivel matraz en medios de cultivo sin Cr(VI) y con
concentraciones iniciales del metal de 17 y 33 mM Para visualizar mejor el efecto las
curvas de crecimiento celular se construyeron utilizando la relacioacuten xxo (x =
concentracioacuten celular a un determinado tiempo de incubacioacuten xo = concentracioacuten inicial
de biomasa) como variable dependiente y el tiempo de incubacioacuten (t) como variable
independiente (graacuteficas de xxo vs t) En cada una de las curvas de crecimiento se trazoacute
una liacutenea horizontal a una relacioacuten xxo de 10 para observar si ocurriacutea crecimiento o
lisis celular
En la figura 5 se muestran las curvas de crecimiento celular de Candida sp cuando eacutesta
se cultivoacute en medios de cultivo con diferentes concentraciones de sulfato y sin Cr(VI) Se
observa que el crecimiento de Candida sp fue muy semejante a las diferentes
concentraciones de sulfato ensayadas La levadura fue capaz de crecer en el medio de
cultivo al que no se le adicionoacute sulfato de amonio y sulfato de magnesio (0 mM de
46
SO42-) lo cual sugiere que la cantidad de sulfato proporcionado por otros componentes
del medio de cultivo ndash por ejemplo provenientes del extracto de levadura yo de
impurezas contenidas en las sales inorgaacutenicas adicionadas al medio de cultivo (002
mM) mdash fue suficiente para permitir un adecuado crecimiento de la levadura Los
resultados tambieacuten mostraron que la adicioacuten de sulfato en forma de sales inorgaacutenicas
[(NH4)2SO4 o Mg(SO4)7H20] no tuvo alguacuten efecto inhibidor o estimulador del crecimiento
celular
Figura 5 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo sin Cr(VI)
En la figura 6 se presentan las curvas de crecimiento de Candida sp que se obtuvieron
cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo con una concentracioacuten inicial de
Cr(VI) de 17 mM a las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas En la figura se
aprecia lo siguiente 1) A una concentracioacuten de sulfato de 0 mM ocurrioacute lisis celular 2)
el crecimiento neto de la levadura fue praacutecticamente nulo a una concentracioacuten de sulfato
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
47
de 1217 mM 3) el crecimiento de la levadura fue evidente a partir de una
concentracioacuten de sulfato de 25 mM y 4) en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de
10 a 2392 mM el crecimiento de la levadura fue muy semejante y superior al alcanzado
a una concentracioacuten de sulfato de 5 mM Asimismo cuando se utilizaron concentraciones
de sulfato de 10 a 2392 mM se alcanzaron niveles de concentracioacuten de biomasa
similares a los obtenidos en ausencia del metal (cultivos control) (figuras 5 y 6) De
estos resultados es evidente que a medida que se incrementoacute la concentracioacuten de
sulfato los efectos toacutexicos del Cr(VI) sobre el crecimiento de la levadura disminuyeron
hasta que eacutestos fueron praacutecticamente nulos es decir la tolerancia de la levadura al
Cr(VI) aumentoacute conforme se incrementoacute la concentracioacuten de sulfato en el medio de
crecimiento de Candida sp
Figura 6 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo con 17 mM de Cr(VI)
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
48
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM ocurrioacute lisis celular
cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo con concentraciones de sulfato en el
intervalo de 0 a 5 mM (figura 7) en contraste el crecimiento celular de la levadura se
incrementoacute a medida que la concentracioacuten de sulfato aumentoacute de 10 a 2392 mM En
este uacuteltimo intervalo de concentracioacuten de sulfato se observoacute que a tiempos de
incubacioacuten superiores a las 150 h se presentoacute lisis celular A ninguna de las
concentraciones de sulfato ensayadas se alcanzaron densidades celulares semejantes a
las obtenidas en los cultivos sin Cr(VI) o con 17 mM de Cr(VI) lo cual podriacutea deberse a
la mayor toxicidad de los medios de cultivo
Figura 7 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo con 33 mM de Cr(VI)
En la figura 8 se muestra la variacioacuten de la velocidad especiacutefica de crecimiento ( ) y de
lisis celular (kd) de Candida sp en funcioacuten de la concentracioacuten de SO42- a las diferentes
concentraciones de Cr(VI) ensayadas [0 17 y 33 mM]
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
49
Figura 8 Variacioacuten de la velocidad especiacutefica de crecimiento o de lisis celular en funcioacuten
de la concentracioacuten de SO42- a las diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI)
ensayadas
-0002
0
0002
0004
0006
0008
001
0012
0014
0016
0018
0 5 10 15 20 25 30
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Ve
loc
ida
d e
sp
ec
iacutefic
a [
h-1
]
0 mM
17 mM
33 mM
Promedio
Sin Cr(VI)
50
Cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo sin Cr(VI) su velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento se mantuvo praacutecticamente constante en todo el intervalo de
concentracioacuten de sulfato ensayado con un valor promedio de 00144 h-1
A la concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la velocidad especiacutefica de crecimiento de
Candida sp aumentoacute casi linealmente con respecto a la concentracioacuten de sulfato en el
intervalo de concentracioacuten de 0 a 10 mM (r2 = 096) alcanzando un valor maacuteximo de
00142 h-1 a la uacuteltima concentracioacuten de sulfato Esta velocidad especiacutefica de crecimiento
es muy similar a las obtenidas en los cultivos sin Cr(VI) A concentraciones de sulfato
superiores a 5 mM la velocidad especiacutefica de crecimiento se mantuvo praacutecticamente
constante Estos resultados concuerdan con los perfiles de crecimiento celular mostrados
anteriormente
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM se obtuvieron
velocidades especiacuteficas de lisis celular (kd) de 00013 a 00003 h-1 ( = -00013 - 00003
h-1) en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de 0 a 5 mM (figura 8) A
concentraciones de sulfato superiores a 5 mM la velocidad neta de crecimiento fue
positiva La velocidad especiacutefica aumentoacute linealmente en todo el intervalo de
concentracioacuten de sulfato ensayado (r2 = 099) aunque las velocidades alcanzadas fueron
notoriamente inferiores a las obtenidas en los medios de cultivo sin Cr(VI) y con una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM
De los resultados anteriores se deduce que el sulfato desempentildea un papel importante en
la tolerancia (resistencia) de Candida sp a los efectos toacutexicos del Cr(VI) A medida que
se incrementoacute la concentracioacuten de sulfato la levadura fue maacutes tolerante (resistente) a
51
los efectos dantildeinos del Cr(VI) y por consiguiente su crecimiento celular fue menos
afectado Asimismo los resultados muestran que el ―efecto protector del sulfato sobre el
crecimiento de Candida sp dependioacute de la concentracioacuten inicial de Cr(VI)
Pepi y Baldi (1992) investigaron el efecto de diferentes aminoaacutecidos azufrados y del
sulfato sobre la tolerancia de algunas levaduras al Cr(VI) Estos investigadores
encontraron que en presencia de 02 mM de Cr(VI) se requirieron pequentildeas cantidades
de cisteiacutena [001ndash01 mM] para estimular significativamente [10-100] el crecimiento
de Rhodosporidium sp y que para incrementar el crecimiento de Candida sp en hasta
80 fue necesaria una concentracioacuten de cisteiacutena de 01 mM Un comportamiento similar
se observoacute en estas dos cepas cuando se adicionoacute metionina En contraste el
crecimiento celular de Candida famata fue inhibido cuando la levadura se cultivoacute en
medios con concentraciones de cisteiacutena superiores a 005 mM y con 02 mM de Cr(VI)
Por otra parte cuando Candida sp se cultivoacute en medios con diferentes concentraciones
de sulfato (4ndash160 mM) y de Cr(VI) (004ndash02 mM) se encontroacute que el ioacuten sulfato
incrementoacute la tolerancia de la levadura al Cr(VI) El mecanismo general de resistencia al
cromato en Candida sp se atribuyoacute a una reducida captacioacuten (incorporacioacuten) de cromo
(Pepi y Baldi 1992)
Ohtake y col (1987) encontraron que la adicioacuten de altas concentraciones de sulfato
incrementoacute el crecimiento celular de dos cepas de Pseudomonas fluorescens (LB300 y
LB303) en presencia de CrO42- Ademaacutes encontraron que el nivel de resistencia al CrO4
2-
en P fluorescens dependioacute de la fuente de azufre en el medio de cultivo ya que las
ceacutelulas bacterianas que crecieron con cisteiacutena fueron mucho maacutes resistentes al CrO42-
que las ceacutelulas que crecieron sobre sulfato Como el cromato es transportado al interior
52
de las ceacutelulas de Pseudomonas a traveacutes del sistema de transporte del sulfato la habilidad
del sulfato para proteger a las ceacutelulas de P fluorescens LB300 de los efectos inhibitorios
del Cr(VI) se atribuyoacute a que el sulfato inhibioacute competitivamente la captacioacuten del cromato
por las ceacutelulas bacterianas (Ohtake y col 1987)
En contraste la resistencia de Ochrobactrum tritici cepa 5bvI1 al Cr(VI) fue
independiente de la concentracioacuten de sulfato (Branco y col 2004)
412 Evaluacioacuten del efecto del sulfato sobre el consumo de glucosa por Candida
sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
La glucosa fue completamente consumida (eficiencia global de consumo de glucosa =
100) en aproximadamente 83 h de incubacioacuten cuando la levadura se cultivoacute en medios
que no conteniacutean Cr(VI) y con diferentes concentraciones de sulfato No se observoacute
diferencia considerable en el consumo de glucosa a ninguna de las concentraciones de
sulfato utilizadas (figura 9)
53
Figura 9 Variacioacuten en el consumo de glucosa por Candida sp cuando se utilizaron
medios de cultivo con diferentes concentraciones de sulfato y sin Cr(VI)
En los experimentos realizados con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM
(figura 10) se observoacute que la levadura fue capaz de consumir aproximadamente 30-
35 de la glucosa inicialmente adicionada a los medios que conteniacutean sulfato a
concentraciones de 0 y 1217 mM a pesar de que a estas condiciones de cultivo ocurrioacute
lisis celular [0 mM de SO42-] o el crecimiento celular de la levadura fue despreciable
[1217 mM de SO42-] (figura 6) Candida sp consumioacute todo el monosacaacuterido presente
en los medios de cultivo con concentraciones de sulfato superiores a 1217 mM
(eficiencia global de consumo de glucosa del 100) sin embargo el tiempo que se
requirioacute para que eacutesto sucediera disminuyoacute a medida que se incrementoacute la concentracioacuten
de sulfato (figura 10) Los perfiles de consumo de glucosa en los cultivos de Candida
sp fueron semejantes cuando se utilizaron concentraciones de sulfato de 10 a 2392
mM y eacutestos a su vez fueron similares a los obtenidos en los medios de cultivo que no
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa
re
sid
ua
l [
]0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
54
conteniacutean Cr(VI) (figuras 9 y 10) Lo anterior podriacutea deberse a que el crecimiento
celular de estos cultivos fue semejante (figura 6)
Figura 10 Variacioacuten del porcentaje de glucosa residual en los cultivos de Candida sp a
las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas y con 17 mM de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
55
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM los niveles de glucosa
residual disminuyeron a medida que aumentoacute la concentracioacuten de sulfato (figura 11)
Sin embargo estos niveles fueron superiores a los alcanzados a 17 mM de Cr(VI) a
todas las concentraciones de sulfato ensayadas La mayor eficiencia de consumo de
glucosa fue de aproximadamente 80 y se obtuvo a una concentracioacuten de sulfato de
2392 mM
Figura 11 Variacioacuten del porcentaje de glucosa residual en los cultivos por lote de
Candida sp a las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas y con 33 mM de
Cr(VI)
A las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas [17 y 33 mM] se observoacute que
en las primeras horas de incubacioacuten los cultivos de levadura en los que ocurrioacute lisis
celular consumieron una determinada cantidad de glucosa la cual probablemente se
utilizoacute para el mantenimiento de las ceacutelulas vivas
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa r
es
idu
al [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
56
Tanto en los experimentos realizados a 17 como a 33 mM de Cr(VI) se encontroacute que
los cultivos que alcanzaron mayores densidades celulares fueron los que consumieron
mayor cantidad de glucosa y esto ocurrioacute cuando se utilizaron concentraciones altas de
sulfato
413 Evaluacioacuten del efecto del sulfato sobre la variacioacuten del pH de los cultivos
de Candida sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
Los perfiles de variacioacuten del pH de los medios de cultivo fueron muy semejantes a las
diferentes concentraciones de sulfato ensayadas cuando la levadura se cultivoacute en los
medios de cultivo sin Cr(VI) (figura 12) A todas las concentraciones de sulfato
utilizadas el pH disminuyoacute desde aproximadamente 6 hasta 28 en las primeras once
horas de incubacioacuten En el periodo comprendido entre las 11 y las 60 h de incubacioacuten el
pH de los medios de cultivo disminuyoacute ligeramente hasta alcanzar valores cercanos a
25 A tiempos posteriores a 60 h el pH de los medios de cultivo se mantuvo
praacutecticamente constante
Figura 12 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo de Candida sp en ausencia de
Cr(VI) y a las diferentes concentraciones de SO42- ensayadas
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
57
En la figura 13 se muestran los perfiles de variacioacuten del pH de los medios de cultivo
cuando la levadura se cultivoacute a las diferentes concentraciones de sulfato y a una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM El pH de los cultivos disminuyoacute raacutepidamente
en las primeras 15 h de incubacioacuten a todas las concentraciones de sulfato ensayadas La
disminucioacuten del pH fue mayor en los cultivos con las concentraciones maacutes altas de
sulfato lo cual podriacutea deberse a que a estas condiciones la levadura consumioacute mayor
cantidad de glucosa y las densidades celulares alcanzadas fueron maacutes altas A tiempos
de incubacioacuten superiores a 15 h el pH continuoacute disminuyendo pero a menor velocidad
Los niveles de pH maacutes bajos se obtuvieron cuando se utilizaron concentraciones de
sulfato de 5 a 2392 mM alcanzaacutendose valores semejantes a los obtenidos en los medios
sin Cr(VI) (de aproximadamente 25)
Figura 13 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
58
Un comportamiento cualitativo similar se obtuvo cuando Candida sp se cultivoacute en medios
con diferentes concentraciones de sulfato y con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33
mM (figura 14) El pH maacutes bajo se alcanzoacute a concentraciones altas de sulfato [20 y
2392 mM] y fue de aproximadamente 36 el cual es superior a los valores maacutes bajos
que se obtuvieron en los cultivos sin Cr(VI) y con 17 mM de Cr(VI) Esto uacuteltimo podriacutea
deberse a que el incremento de la concentracioacuten celular y el consumo de glucosa fueron
inferiores a los alcanzados con las otras concentraciones de Cr(VI) [0 y 17 mM]
Figura 14 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
414 Efecto del sulfato sobre la remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp
En la figura 15 se muestran las variaciones del porcentaje de Cr(VI) residual de los
cultivos de Candida sp cuando se emplearon diferentes concentraciones de sulfato y
una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM A una concentracioacuten de sulfato de 0 mM
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
59
la remocioacuten de Cr(VI) fue muy baja (de aproximadamente 83) es conveniente
mencionar que a esta concentracioacuten de sulfato (0 mM) y de Cr(VI) (17 mM) ocurrioacute lisis
celular y la levadura consumioacute una pequentildea cantidad de glucosa en las primeras horas
de incubacioacuten La remocioacuten de Cr(VI) se incrementoacute a medida que aumentoacute la
concentracioacuten de sulfato de 0 a 10 mM A partir de esta uacuteltima concentracioacuten de sulfato
los perfiles de remocioacuten de Cr(VI) fueron muy similares y esto podriacutea deberse a que la
densidad celular de los cultivos fueron praacutecticamente iguales Todo o casi todo el Cr(VI)
inicialmente adicionado a los medios de cultivo fue removido cuando se empleoacute una
concentracioacuten de sulfato igual o superior a 25 mM (figura 15)
Figura 15 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
En contraste cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM la levadura
no fue capaz de remover todo el Cr(VI) inicialmente presente en los medios de cultivo a
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
60
ninguna de las concentraciones de sulfato ensayadas (figura 16) Sin embargo los
niveles de Cr(VI) residual disminuyeron a medida que se incrementoacute la concentracioacuten de
sulfato
Figura 16 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
A las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas los cultivos de levadura en los
que ocurrioacute lisis celular en las primeras horas de incubacioacuten [0 mm de SO42- 17 mM de
Cr(VI) y 0-5 mM de SO42- 33 mM de Cr(VI)] fueron capaces de remover una pequentildea
cantidad de Cr(VI) Estos resultados concuerdan con lo reportado por Wang y Shen
(1997) quienes encontraron que la densidad celular de los cultivos de Escherichia coli y
Bacillus sp disminuyoacute continuamente durante el curso de la remocioacuten de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
61
A las diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI) y de sulfato ensayadas se observoacute
que aunque los niveles de Cr(VI) residual disminuyeron a medida que la incubacioacuten
progresoacute las concentraciones de cromo total en solucioacuten permanecieron casi constantes
a lo largo de todo el periodo de incubacioacuten (aproximadamente el 97 del cromo
inicialmente adicionado a los medios de cultivo estuvo siempre presente en solucioacuten)
Maacutes auacuten el anaacutelisis del contenido de cromo en la biomasa de Candida sp (de muestras
recolectadas al final de los experimentos) reveloacute que uacutenicamente el 29 009 del
cromo total removido por los cultivos fue incorporado en la biomasa
Como se mostroacute anteriormente los cultivos con ceacutelulas viables se iniciaron con un pH de
aproximadamente 60 y eacuteste disminuyoacute durante el tiempo de incubacioacuten hasta valores de
25 ndash 36 dependiendo de la concentracioacuten de sulfato y de Cr(VI) utilizada Como se
sabe que los pHacutes bajos favorecen la reduccioacuten del Cr(VI) por la materia orgaacutenica
(donadores de electrones) en el presente trabajo se llevaron a cabo experimentos sin
biomasa de Candida sp (controles libres de ceacutelulas) a diferentes valores de pH (25 3
4 5 y 6) y a las dos diferentes concentraciones de Cr(VI) ensayadas (17 y 33 mM)
para determinar si los componentes presentes en los medios de cultivo pueden reducir el
Cr(VI) En las figuras 17 y 18 se muestran los perfiles de Cr(VI) residual que se
obtuvieron con los controles abioacuteticos ensayados
62
Figura 17 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los controles libres de
ceacutelulas llevados a cabo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y a diferentes
valores de pH
Figura 18 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los controles libres de
ceacutelulas realizados con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y a diferentes
valores de pH
00
200
400
600
800
1000
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
pH = 25
pH = 3
pH = 4
pH = 5
pH = 6
00
200
400
600
800
1000
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
pH = 25
pH = 3
pH = 4
pH = 5
pH = 6
63
A las dos concentraciones de Cr(VI) ensayadas se observoacute una reduccioacuten despreciable
del metal (inferior a 05) en el intervalo de valores de pH de 4 a 6 a un pH de 3 el
porcentaje de reduccioacuten fue de aproximadamente 12 y de 3 cuando el pH fue de
25 Estos resultados sugieren que los componentes de los medios de cultivo
praacutecticamente no redujeron el Cr(VI) a ninguno de los pHrsquos ensayados
En conjunto los resultados antes mostrados indican que el principal mecanismo de
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp fue la biotransformacioacuten (reduccioacuten) del Cr(VI) a
Cr(III) y que la reduccioacuten abioacutetica del Cr(VI) y la captacioacuten de cromo por la biomasa de
la levadura fueron despreciables Asimismo los resultados tambieacuten muestran que la
reduccioacuten del Cr(VI) por los cultivos se debioacute a la actividad metaboacutelica de las ceacutelulas de
Candida sp
En la figura 19 se presentan las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) que se
obtuvieron a las diferentes concentraciones iniciales de sulfato y de Cr(VI) ensayadas Se
aprecia que cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la eficiencia
de reduccioacuten se incrementoacute desde 179 hasta 986 a medida que la concentracioacuten
de sulfato aumentoacute de 0 a 25 mM a concentraciones de sulfato superiores la eficiencia
de reduccioacuten fue del 100 Asimismo en los experimentos realizados a 33 mM de
Cr(VI) la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) aumentoacute desde 83 hasta 84 conforme la
concentracioacuten de sulfato aumentoacute de 0 a 2392 mM
64
Figura 19 Eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por los cultivos de
Candida sp a las diferentes concentraciones de sulfato y de Cr(VI) ensayadas
La velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) tambieacuten fue afectada por la
concentracioacuten de sulfato y de Cr(VI) utilizada (figura 20) Cuando se empleoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten maacutes alta
fue de 098 mg de Cr(VI)Lh y se obtuvo en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de
10 a 2392 mM En cambio la velocidad maacutes alta que se alcanzoacute a 33 mM de Cr(VI) fue
de 044 mg de Cr(VI)Lh y se obtuvo a la maacutexima concentracioacuten de sulfato ensayada
(2392 mM)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 1217 25 5 10 15 20 2392
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Efi
cie
ncia
glo
bal d
e r
ed
uccioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
17 mM
33 mM
65
Figura 20 Velocidades volumeacutetricas globales de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas en los
cultivos de Candida sp a diferentes concentraciones de sulfato y de Cr(VI)
A todas las concentraciones de sulfato ensayadas la eficiencia y velocidad volumeacutetrica de
reduccioacuten de Cr(VI) alcanzadas a una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM fueron
superiores a las obtenidas a 33 mM de Cr(VI) y esto podriacutea deberse a que los efectos
toacutexicos del Cr(VI) sobre la levadura se incrementan a medida que aumenta la
concentracioacuten del metal
De los resultados anteriores es evidente que el sulfato afectoacute la reduccioacuten aeroacutebica de
Cr(VI) por Candida sp Estos resultados difieren con lo reportado por otros
investigadores quienes no han encontrado un efecto inhibidor ni estimulador del sulfato
sobre la reduccioacuten de Cr(VI) en cultivos aeroacutebicos
000
010
020
030
040
050
060
070
080
090
100
0 1217 25 5 10 15 20 2392
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica d
e r
ed
uccioacute
n d
e C
r(V
I)
[mg
de
Cr(
VI)
Lh
]
17 mM
33 mM
66
Ishibashi y col (1990) encontraron que concentraciones de sulfato de hasta 1 mM
incrementaron la resistencia de Pseudomonas putida al cromato pero no tuvieron efecto
sobre la reduccioacuten de eacuteste En cultivos de Bacillus sp (Wang y Xiao 1995) y de
Acinetobacter haemolyticus (Zakaria y col 2006) se observoacute que una concentracioacuten de
sulfato de 10 mM no afectoacute la reduccioacuten de Cr(VI) Liu y col (2006) reportaron que
concentraciones de sulfato de 40 y 80 mgL (0416 y 083 mM) no tuvieron efecto sobre
la reduccioacuten aeroacutebica de Cr(VI) por Bacillus sp XW-4
En contraste el sulfato generalmente tiene efecto sobre la reduccioacuten bacteriana del
cromato bajo condiciones de anaerobiosis lo cual podriacutea deberse a que el sulfato compite
con el cromato como aceptor final de electrones (Garbisu y col 1998 Liu y col 2006)
En cultivos anaeroacutebicos de Escherichia coli ATCC 33456 la velocidad de reduccioacuten de
Cr(VI) no fue afectada por hasta 416 mM de sulfato sin embargo la velocidad
disminuyoacute a 83 mM de sulfato (Shen y Wang 1994) La actividad de reduccioacuten de Cr(VI)
de Enterobacter cloacae HO1 bajo condiciones anaeroacutebicas fue inhibida en 32 en
presencia de tan soacutelo 25 M de sulfato (Komori y col 1989)
Como se mencionoacute anteriormente el sulfato incrementoacute la tolerancia al Cr(VI) de la cepa
de Candida sp aislada por Pepi y Baldi (1992) sin embargo esta cepa de levadura fue
incapaz de reducir el Cr(VI) Asimismo auacuten cuando se ha reportado que Pseudomonas
fluorescens LB300 es capaz de reducir el Cr(VI) a Cr(III) (Bopp y Ehrlich 1988) y que el
sulfato incrementa el crecimiento celular de esta bacteria en presencia de cromato
(Ohtake y col 1987) hasta donde sabemos no se ha reportado el efecto del sulfato
sobre la reduccioacuten de Cr(VI) por este microorganismo
67
Los resultados anteriores muestran claramente que el sulfato afectoacute la tolerancia de
Candida sp al Cr(VI) y a su capacidad para reducirlo Es evidente que a medida que se
incrementoacute la concentracioacuten de sulfato el crecimiento de la levadura fue mayor y su
eficiencia y velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) aumentaron Los resultados tambieacuten
muestran que la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp depende de la densidad celular de
los cultivos de manera tal que a mayor cantidad de biomasa generada mayor es la
reduccioacuten de Cr(VI) Aun cuando la cepa de Candida sp es muy sensible a los efectos
toacutexicos del Cr(VI) en ausencia de sulfato esta levadura posee una capacidad notable
para reducir muy altas concentraciones del metal en presencia de sulfato
Meta No 2 Determinar la capacidad de reduccioacuten de Cr(VI) en
diferentes sistemas de reaccioacuten
42 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso
Se utilizoacute un reactor airlift con tubo conceacutentrico liso (sin perforaciones) para el cultivo por
lote de Candida sp Para este sistema de reaccioacuten se utilizoacute un volumen de operacioacuten de
4 litros de medio basal con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM El biorreactor
se inoculoacute con un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada de tal
forma que la concentracioacuten inicial de biomasa fue de 12 mgmL El pH inicial fue de
aproximadamente 60 El reactor se operoacute por lote hasta que la concentracioacuten de Cr(VI)
residual fue despreciable
68
La concentracioacuten celular se incrementoacute gradualmente a medida que la incubacioacuten
progresoacute hasta que alcanzoacute un valor maacuteximo de aproximadamente 39 gL lo cual
ocurrioacute a las 42 h de incubacioacuten A tiempos posteriores la concentracioacuten de biomasa
disminuyoacute debido a que ocurrioacute lisis celular (figura 21) La velocidad especiacutefica maacutexima
de crecimiento de la levadura fue de 00244 h-1 la cual fue superior a la obtenida en
matraz cuando crecioacute con 17 mM de Cr(VI) (00142 h-1) esta diferencia podriacutea deberse
a que en el reactor airlift las ceacutelulas de Candida sp tuvieron una mayor cantidad de
oxiacutegeno disponible para su crecimiento
Figura 21 Variacioacuten de la concentracioacuten de biomasa y de glucosa en el cultivo por lote
de Candida sp en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM
La levadura consumioacute la principal fuente de carbono y energiacutea (glucosa) presente en el
medio de cultivo a lo largo de todo el tiempo de incubacioacuten incluso durante el periodo en
el que ocurrioacute lisis celular La glucosa no fue completamente consumida por la levadura
00
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo [h]
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e g
luc
os
a
res
idu
al [g
L]
00
05
10
15
20
25
30
35
40
45
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e b
iom
as
a [
gL
]Glucosa Biomasa
69
al final del experimento la concentracioacuten de glucosa residual fue de 17 gL (figura 21)
por lo que la eficiencia global de consumo del monosacaacuterido fue del 835
El pH del medio de cultivo disminuyoacute desde 60 hasta aproximadamente 25 Este uacuteltimo
valor se alcanzoacute a las 292 h de incubacioacuten y se mantuvo praacutecticamente constante a
tiempos posteriores (figura 22)
Figura 22 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) y del pH en el cultivo por lote de
Candida sp en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM
La concentracioacuten de Cr(VI) residual disminuyoacute progresivamente a medida que se
incrementoacute el tiempo de incubacioacuten hasta que a las 468 h ya no se detectoacute Cr(VI) en el
medio de cultivo por lo que la eficiencia global de remocioacuten de Cr(VI) fue del 100 Se
observoacute una ligera remocioacuten de Cr(VI) durante el periodo en el que ocurrioacute lisis celular
(figuras 21 y 22) En contraste la concentracioacuten de cromo total en solucioacuten se
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo [h]
Cr(
VI)
y C
rom
o t
ota
l re
sid
ua
l [m
gL
]
00
10
20
30
40
50
60
70
pH
[Cr(VI)] [Cromo total] pH
70
mantuvo casi constante a lo largo del tiempo de cultivo Lo anterior indica que la
levadura fue capaz de transformar el Cr(VI) a la forma trivalente menos toacutexica
En la tabla 6 se comparan los valores de algunas variables cineacuteticas obtenidas en
matraz (cuando se hizo crecer la levadura a una concentracioacuten de Cr(VI) inicial de 17
mM) y en el biorreactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando la levadura se cultivoacute en
medio de cultivo con concentraciones iniciales semejantes de Cr(VI) y de sulfato
Tabla 6 Variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote de Candida sp realizados
en matraz y en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Variable cineacutetica Matraz Reactor
Incremento celular maacuteximo [gL] 22 263
Velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento [h-1] 00142 00244
Eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) [] 100 100
Velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI)L h] 098 164
Velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI) g biomasa h] 045 095
Capacidad de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI) g biomasa] 400 443
El incremento celular maacuteximo y la velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento de
Candida sp obtenidos en el reactor airlift fueron 1955 y 718 superiores a los
alcanzados en matraz respectivamente Como se mencionoacute previamente eacutesto podriacutea
deberse a que en el reactor airlift la levadura tuvo una mayor cantidad de oxiacutegeno
disponible para su crecimiento
71
La levadura redujo todo el Cr(VI) inicialmente presente en el medio de cultivo [eficiencia
global de reduccioacuten de Cr(VI) del 100] tanto cuando se cultivoacute en matraz como en el
reactor airlift El hecho de que Candida sp sea capaz de reducir concentraciones de
Cr(VI) tan altas como 15 mM (e incluso superiores como se mostroacute en la seccioacuten
anterior) podriacutea ser de importancia praacutectica porque la mayoriacutea de los microorganismos
ensayados son capaces de reducir parcial o totalmente concentraciones maacutes bajas de
Cr(VI) (tabla 7)
Tabla 7 Datos sobre reduccioacuten de Cr(VI) por microorganismos
Microorganismo Cultivo
Modo de
operacioacuten
Concentra-
cioacuten de
Cr(VI)
[mM]
Velocidad
volumeacutetrica
de reduccioacuten
[mg de
CrLh]
Eficiencia
de
reduccioacuten
[]
Referencia
Acinetobacter
haemolitycus
Aerobio
CPL
067 128 88 Zakaria y col
2006
Aislado de
Pseudomonas
(CRB5)
Aerobio
CPL
043 014 100 McLean y
Beveridge 2000
Arthrobacter
sp
Aerobio
CPL
017 016 65 Megharaj y col
2003
Aspergillus sp Aerobio
CPL
096 0694 100 Acevedo-Aguilar
y col 2006
Bacillus
megaterium
TKW3
Aerobio
CPL
048 009 735 Cheung y Gu
2005
Bacillus sp Aerobio
CPL
007 007 65 Megharaj y col
2003
Bacteria J3 Aerobio
CPL
01 00057 21 Badar y col
2000
Brevibacterium
CrT-13
Aerobio
CPL
288 255 68 Faisal y Hasnain
2004
E coli AC80 Aerobio
CPL
002
065
9375
Ishibashi y col
1990
Ochrabactrum
sp
Aerobio
CPL
017
034
033
038
100
88
Thacker y
Madamwar 2005
72
Ochrobactrum
intermedium Cr-
T1
Aerobio
CPL
288 326 87 Faisal y Hasnain
2004
Penicillium sp Aerobio
CPL
096 066 95 Acevedo-Aguilar y
col 2006
Phanerochaete
chrysosporium
Aerobio
CPL
058 011 100 Pal 1997
Providencia
sp
Aerobio
CPL
102 10 100 Thacker y col
2006
Pseudomonas
ambigua G-1
Aerobio
CPL
288 347 83 Horitsu y col
1987
Streptomyces
griseus
Aerobio
CPL
017 025 100 Laxman y More
2002
Trichoderma
inhamatum
Aerobio
CPL
13
075 100 Morales-Barrera y
Cristiani-Urbina
2008
Trichoderma
viride
Aerobio
CPL
16
104 100 Morales-Barrera y
Cristiani-Urbina
2006
CPL = Cultivo por lote
La velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) obtenida en el reactor neumaacutetico
con Candida sp fue de 164 mg de Cr(VI)Lh la cual fue 6735 superior a la alcanzada
en matraz [098 mg de Cr(VI)Lh] (tabla 6) Esto uacuteltimo podriacutea deberse a la mayor
cantidad de biomasa generada en el reactor la cual redujo maacutes raacutepidamente el Cr(VI)
Acinetobacter haemolitycus fue capaz de reducir completamente 096 mM de Cr(VI) en
36 h por lo que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal de este microorganismo
fue de 139 mg de Cr(VI)Lh sin embargo cuando la concentracioacuten inicial de Cr(VI) se
incrementoacute a 135 mM la eficiencia y velocidad de reduccioacuten disminuyeron (Zakaria y
col 2006)
A una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 017 mM la eficiencia y velocidad volumeacutetrica
global de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por Ochrabactrum sp fue del 100 y 033 mg
de Cr(VI)Lh respectivamente Aunque la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal
73
se incrementoacute a 038 mg de Cr(VI)Lh cuando la concentracioacuten inicial de Cr(VI) fue de
034 mM la eficiencia de reduccioacuten disminuyoacute a 88 (Thacker y Madamwar 2005)
La eficiencia y velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas con Arthrobacter
sp a las 70 h de incubacioacuten fue de aproximadamente 65 y 016 mg de Cr(VI)Lh
cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial del metal de 017 mM (Megharaj y col 2003)
Con Providencia sp se obtuvo una eficiencia de reduccioacuten del 100 al cabo de 108 h de
incubacioacuten en medios de cultivo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 102 mM
siendo su velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal de 10 mg de Cr(VI)Lh (Thacker
y col 2006) La velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Streptomyces griseus
fue de 025 mg de Cr(VI)Lh cuando se cultivoacute en presencia de 017 mM de Cr(VI)
(Laxman y More 2002)
En el caso de eucariotes Acevedo-Aguilar y col (2006) reportaron que Penicillium sp y
Aspergillus sp fueron capaces de reducir por completo 096 mM de Cr(VI) en 72 h
obtenieacutendose una velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de 0694 mg de Cr(VI)Lh
Asimismo Trichoderma viride exhibioacute una eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) del 100 y
una velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de 104 mg de Cr(VI)Lh cuando se cultivoacute en
un reactor airlift en medio de cultivo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 16 mM
(Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006) Trichoderma inhamatum fue capaz de reducir
por completo 13 mM de Cr(VI) con una velocidad volumeacutetrica de 075 mg de Cr(VI)Lh
(Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2008)
En la tabla 7 se muestran los valores de eficiencia y velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten
de Cr(VI) obtenidas con otros microorganismos
74
La velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) que se obtuvo en el reactor airlift con
Candida sp fue de 095 mg de Cr(VI)g de biomasah (tabla 6) la cual fue 211 veces
mayor que la alcanzada en matraz [045 mg de Cr(VI)g de biomasah] Bae y col
(2000) reportaron que la velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) de Escherichia coli
ATCC 33456 se encontroacute en el intervalo de 031 a 07 mg de Cr(VI)g de biomasah
cuando este microorganismo se cultivoacute por lote en diferentes medios de cultivo con una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 096 mM A una concentracioacuten de Cr(VI) de 0096 mM
los lodos activados exhibieron una velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) de
aproximadamente 008 mg de Cr(VI)g de biomasah (Stasinakis y col 2003) El cultivo
por lote de Trichoderma inhamatum exhibioacute una velocidad especiacutefica de
aproximadamente 0584 mg de Cr(VI)g de biomasah cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 13 mM (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2008)
Asimismo en cultivos por lote de Providencia sp realizados con una concentracioacuten inicial
de Cr(VI) de 034 mM se obtuvo una velocidad especiacutefica de reduccioacuten del metal de
1302 mgg de biomasah (Thacker y col 2006)
En el presente trabajo se encontroacute que en el reactor airlift cada gramo (peso seco) de
biomasa producida de Candida sp pudo reducir 4438 mg de Cr(VI) (tabla 6) valor
ligeramente superior al encontrado en matraz [40 mg de Cr(VI)g de biomasa] y
semejante al reportado para Trichoderma inhamatum (Morales-Barrera y Cristiani-
Urbina 2008) Asimismo a las 60 h de incubacioacuten la capacidad de reduccioacuten de
Penicillium sp y Aspergillus sp fue de aproximadamente 082 y 042 mg de Cr(VI)g de
biomasa (Acevedo-Aguilar y col 2006) Wang y Shen (1997) reportaron que la
capacidad maacutexima de reduccioacuten de Cr(VI) de los cultivos aeroacutebicos de Bacillus sp y
75
Pseudomonas fluorescens LB300 fue de 208 x 10-12 y 310 x 10-12 mg de Cr(VI)ceacutelula
respectivamente si se toma en cuenta que el peso seco promedio de una ceacutelula
bacteriana tiacutepica es de aproximadamente 3 x 10-13 g (Atkinson y Mavituna 1983)
entonces la capacidad de reduccioacuten de Bacillus sp y P fluorescens LB300 seriacutea de 693 y
1033 mg de Cr(VI)g de biomasa respectivamente
43 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote repetido en el reactor airlift con
tubo conceacutentrico liso
Se realizaron algunos cultivos por lote repetido en el reactor airlift con tubo conceacutentrico
liso (sin perforaciones) En cada uno de los cultivos ensayados el reactor se inoculoacute
inicialmente con un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada de la
levadura para obtener una concentracioacuten inicial de biomasa de aproximadamente 12
mgmL La concentracioacuten inicial de Cr(VI) del medio de cultivo fue de aproximadamente
15 mM y el flujo de aire fue de 1 vvm El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que la
concentracioacuten de Cr(VI) residual en el medio fue baja (primer cultivo por lote) a
continuacioacuten una parte del medio de cultivo contenido en el reactor se drenoacute y se
adicionoacute medio fresco con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM Posteriormente el
reactor se operoacute nuevamente por lote (segundo cultivo por lote o cultivo por lote
repetido) Se ensayaron tres relaciones de recambio de medio de cultivo (f = volumen de
medio cosechadovolumen inicial de medio de cultivo) de 08 06 y 04
Debido a la importancia que tiene el pH del medio de cultivo en los procesos
microbioloacutegicos de reduccioacuten de Cr(VI) en el presente trabajo se llevaron a cabo cultivos
por lote repetido con relaciones de recambio de 06 y 08 en los que el pH del medio de
76
cultivo se ajustoacute a 60 al inicio del segundo cultivo por lote (cultivo por lote repetido) asiacute
como experimentos en los que el pH no se ajustoacute a 60 por lo que el pH inicial del cultivo
por lote repetido fue el alcanzado al final del primer cultivo por lote (cercano a 30) Es
conveniente mencionar que los valores bajos de pH inhiben el crecimiento de los
microorganismos pero favorecen la reduccioacuten del Cr(VI) a Cr(III) al ocurrir esto uacuteltimo
disminuye el efecto toacutexico de la forma hexavalente del metal
En estos experimentos se observoacute que el crecimiento de la levadura y la reduccioacuten de
Cr(VI) fueron adversamente afectados cuando el pH del medio de cultivo se ajustoacute a 60
al inicio de los cultivos por lote repetido En la figura 23 se muestra la variacioacuten de la
concentracioacuten de Cr(VI) residual en los cultivos por lote y lote repetido realizados con y
sin ajuste del pH al inicio de los cultivos por lote repetido cuando se utilizaron relaciones
de recambio de 06 y 08
77
Figura 23 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los cultivos por lote y lote
repetido realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizaron
00
100
200
300
400
500
600
700
800
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [m
gL
]
f = 08 spH
f = 08 cpH
CPL CPLR
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [m
gL
] f = 06 spH
f = 06 cpH
CPL CPLR
78
relaciones de recambio de 06 y 08 (spH = sin ajuste de pH del medio de cultivo al
inicio del cultivo por lote repetido cpH = con ajuste de pH del medio de cultivo a 60 al
inicio del cultivo por lote repetido)
En la figura se aprecia que en los primeros cultivos por lote el Cr(VI) fue totalmente o
casi completamente reducido en aproximadamente 45-49 h Sin embargo en los cultivos
por lote repetido el tiempo que se requirioacute para reducir el Cr(VI) fue mayor Asimismo es
evidente que se alcanzaron concentraciones de Cr(VI) residual maacutes bajas en los sistemas
por lote repetido en los que no se ajustoacute el pH al inicio de los cultivos
Los resultados anteriores sugieren que la levadura pierde parte de su capacidad de
reduccioacuten de Cr(VI) cuando se cultiva repetidamente en medios que contienen Cr(VI)
Estos resultados concuerdan con lo reportado por Wang y Shen (1997) quienes
encontraron que Bacillus sp Pseudomonas fluorescens LB300 y Escherichia coli ATCC
33456 pierden su capacidad para reducir Cr(VI) despueacutes de que han reducido 046-052
058 y 125 mM de Cr(VI) respectivamente Un comportamiento similar tambieacuten fue
reportado por Middleton y col (2003) para Shewanella oneidensis
Como los niveles maacutes altos de reduccioacuten de Cr(VI) se obtuvieron cuando no se ajustoacute el
pH a 60 al inicio de los cultivos por lote repetido el experimento en el que se ensayoacute
una relacioacuten de recambio de 04 uacutenicamente se llevoacute a cabo sin ajustar el pH
En la figura 24 se muestra la variacioacuten de la concentracioacuten celular en los sistemas por
lote y lote repetido a las tres diferentes relaciones de recambio ensayadas (04 06 y
08) cuando no se ajustoacute el pH al inicio de los cultivos por lote repetido Se aprecia que
en ninguno de los cultivos por lote repetido se alcanzaron densidades celulares cercanas
79
a las de los cultivos por lote que los precedioacute En los cultivos por lote repetido el
incremento celular y la velocidad especiacutefica de crecimiento maacutes altos se obtuvieron
cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 06 (tabla 8) sin embargo los valores
alcanzados fueron inferiores a los obtenidos en el cultivo por lote que los antecedioacute
Figura 24 Variacioacuten de la concentracioacuten de biomasa con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo ensayadas
00
05
10
15
20
25
30
35
40
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Co
nce
ntr
acioacute
n d
e b
iom
asa
[g
L]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
80
Tabla 8 Variables cineacuteticas del crecimiento celular y de la reduccioacuten de Cr(VI)
obtenidas en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp llevados a cabo en el
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Variable Cultivo por lote Cultivo por lote repetido
Relacioacuten de recambio
04 06 08
Incremento celular
maacuteximo [gL]
224 230 235 017 038 009
Velocidad especiacutefica maacutexima de
crecimiento [h-1]
00244 00227 00220 00044 00109 00017
Eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) []
999 980 973 96 93 36
Velocidad
volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI)Lh]
160 178 151 035 046 045
En los cultivos por lote repetido se necesitoacute de una mayor cantidad de tiempo para
consumir la glucosa presente en los medios en comparacioacuten con los cultivos por lote del
cual derivaron (figura 25) Asimismo en ninguno de los cultivos se consumioacute
totalmente la glucosa la mayor eficiencia de consumo del monosacaacuterido de los cultivos
por lote repetido se obtuvo cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 06 con un
valor de 783 el cual es cercano al obtenido en los primeros cultivos por lote
(aproximadamente 835)
81
Figura 25 Variacioacuten de la concentracioacuten de glucosa con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo utilizadas
En la figura 26 se muestran los perfiles de variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI)
residual en funcioacuten del tiempo de incubacioacuten a las diferentes relaciones de recambio de
medio de cultivo utilizadas Se aprecia que en los primeros cultivos por lote se alcanzaron
niveles de Cr(VI) residual maacutes bajos y en menor tiempo que en los cultivos por lote
repetido
00
20
40
60
80
100
120
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e g
luc
os
a r
es
idu
al [g
L]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
82
Figura 26 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo ensayadas
En los primeros cultivos por lote se alcanzaron eficiencias y velocidades volumeacutetricas
globales de reduccioacuten de Cr(VI) de 973 - 999 y de 151 - 178 mgLh
respectivamente (tabla 8) Estas velocidades son superiores a la alcanzada en el cultivo
por lote realizado en matraz [098 mg de Cr(VI)Lh] y semejantes a la obtenida
previamente en el reactor airlift [164 mg de Cr(VI)Lh]
En los cultivos por lote repetido la eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) maacutes baja se
obtuvo cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 08 y esto podriacutea deberse a que el
tiempo de incubacioacuten que se utilizoacute para este cultivo fue menor que para los otros A las
relaciones de recambio de 04 y 06 las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
[Cr(
VI)
] [m
gL
]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
83
fueron semejantes con valores de 96 y 93 respectivamente Estas uacuteltimas eficiencias
fueron ligeramente inferiores a las obtenidas en los cultivos por lote que los precedioacute
(973-999) Las mayores velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) se
obtuvieron a relaciones de recambio de 06 y 08 [aproximadamente 045 mgLh] sin
embargo fueron considerablemente inferiores a la de los cultivos por lote que los
antecedioacute
44 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa en un reactor airlift
con tubo conceacutentrico liso
Para este sistema el reactor se inoculoacute con 50 mL de inoacuteculo y se dejoacute operar por lote
durante 48 horas con el propoacutesito de incrementar la densidad celular A continuacioacuten se
suministroacute continuamente medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de
15 mM [78 mgL] y con un flujo volumeacutetrico de 378 mLh por lo que la velocidad de
dilucioacuten ensayada fue de 00076 h-1 Se permitioacute que el reactor alcanzara el estado
estacionario lo cual se corroboroacute mediante la determinacioacuten de la concentracioacuten de
biomasa asiacute como de glucosa y de Cr(VI) residual de muestras colectadas a diferentes
tiempos
En el estado estacionario los valores promedio de concentracioacuten de biomasa glucosa
Cr(VI) residual y de pH fueron de 016 gL 62 gL 46 mgL y 345 respectivamente
De estos resultados es evidente que la concentracioacuten de biomasa en el reactor fue muy
baja lo que probablemente ocasionoacute que se alcanzaran valores bajos de eficiencia de
consumo de glucosa (38) y de reduccioacuten de Cr(VI) (41) asiacute como de velocidad
volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) (024 mgLh)
84
Posteriormente se ensayoacute un flujo de alimentacioacuten de 5 mLh para operar con una
velocidad de dilucioacuten de 001 h-1 Sin embargo bajo estas condiciones se presentoacute el
fenoacutemeno de lavado celular en el cual no se detecta biomasa en el reactor Este
experimento se realizoacute varias veces y en todos los casos se obtuvo el mismo resultado
El lavado celular que ocurrioacute en el cultivo continuo de Candida sp podriacutea deberse a que
la velocidad de dilucioacuten que se utilizoacute (001 h-1) es muy cercana a la velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento de la levadura [de aproximadamente 00146 h-1 determinada en
cultivo por lote en medio de cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM]
por lo que la levadura no tuvo tiempo suficiente para duplicarse y fue desplazada del
reactor Ademaacutes el suministro continuo de medio de alimentacioacuten con Cr(VI) ocasiona
que la levadura esteacute constantemente sujeta a los efectos toacutexicos del metal Es decir la
baja velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento de la levadura y los efectos toacutexicos
continuos del metal fueron probablemente los factores que limitaron la eficiencia y
velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) en cultivo continuo
Debido a que ocurrioacute lavado celular a una velocidad de dilucioacuten de 001 h-1 ya no fue
posible ensayar velocidades maacutes altas Los resultados obtenidos en cultivo continuo de
una etapa indican que este sistema de reaccioacuten no es adecuado para la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp
En la tabla 9 se presentan datos sobre la reduccioacuten de Cr(VI) por microorganismos en
cultivos continuos en suspensioacuten o inmovilizados Hasta donde es de nuestro
85
conocimiento no hay informacioacuten disponible acerca de la reduccioacuten de Cr(VI) por
levaduras y hongos filamentosos en cultivo continuo
Tabla 9 Resumen de datos sobre la reduccioacuten microbiana de Cr(VI) en cultivo continuo
Microorganismo Cultivo Concentra-
cioacuten de
Cr(VI) [mM]
Velocidad
de
dilucioacuten
[h-1]
Velocidad
volumeacutetrica
de reduccioacuten
[mg de
CrLh]
Eficiencia
de
reduccioacuten
[]
Referencia
Pseudomonas
sp C7
Aerobio 12
12
0014
0017
073
093
88
91
Gopalan y
Veeramani
1994
Pseudomonas
fluorescens
LB300
Aerobio 011
009
009
002
005
009
016
017
022
57
39
28
DeLeo y
Ehrlich
1994
Escherichia coli
ATCC 33456
Aerobio 08 005
169 843 Bae y col
2000
Pseudomonas
mendocina
MCM B-180
Aerobio
05
15
20
022
014
011
57
108
113
99
99
99
Bhide y
col 1996
Microbacterium
liquefaciens
MP30
Aerobio
(ceacutelulas
inmovilizadas
en perlas de
polivinil
alcohol-
alginato)
005
0038
009
90
Pattanapip
it-paisal y
col 2001
Bacillus sp Aerobio
(ceacutelulas
inmovilizadas
en perlas de
vidrio Pyrex)
192
192
004
008
397
797
998
998
Chirwa y
Wang
1997
86
En un estudio realizado en cultivo continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de Pseudomonas
fluorescens LB300 se encontroacute que la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute desde
57 hasta 28 y que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal se incrementoacute de
016 a 022 mg de Cr(VI)Lh a medida que la velocidad de dilucioacuten se incrementoacute de
002 a 009 h-1 cuando se utilizoacute medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI)
de 009 mM (DeLeo y Ehrlich 1994)
Los resultados obtenidos en cultivo continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de otros
microorganismos han sido alentadores Gopalan y Veeramani (1994) ensayaron tres
velocidades de dilucioacuten de 0014 0017 y 0028 h-1 y encontraron que la maacutexima
eficiencia (91) y velocidad volumeacutetrica [093 mg de Cr(VI)Lh] de reduccioacuten de Cr(VI)
de Pseudomonas sp C7 se obteniacutea a una velocidad de dilucioacuten de 0017 h-1 cuando se
utilizoacute medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de 12 mM En el estudio
realizado por Bae y col (2000) con Escherichia coli ATCC 33456 la velocidad de dilucioacuten
se mantuvo constante a 005 h-1 y se obtuvo una eficiencia y una velocidad volumeacutetrica
de reduccioacuten de Cr(VI) de 843 y de 169 mg de Cr(VI)Lh respectivamente cuando
se utilizoacute una concentracioacuten de Cr(VI) de 08 mM en el medio de alimentacioacuten En cultivo
continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de Pseudomonas mendocina MCM B-180 Bhide y col
(1996) ensayaron el efecto de diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI) [de 05 a
20 mM] y de velocidades de dilucioacuten (011 a 022 h-1) sobre la reduccioacuten de Cr(VI)
Estos investigadores encontraron altas eficiencias (99) y velocidades de reduccioacuten [57
ndash 113 mg de Cr(VI)Lh]
Asimismo con la finalidad de reducir los efectos toacutexicos del Cr(VI) sobre los
microorganismos se ha propuesto el uso de ceacutelulas inmovilizadas en reactores continuos
87
de lecho fijo Las ceacutelulas de Microbacterium liquefaciens MP30 inmovilizadas en perlas de
alginato de calcio - polivinil alcohol fueron capaces de reducir el Cr(VI) con una
eficiencia del 90 y con una velocidad de 009 mg de Cr(VI)Lh cuando se utilizoacute medio
de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de 005 mM y una velocidad de dilucioacuten
de 0038 h-1 (Pattanapipitpaisal y col 2001) En un reactor de lecho fijo con ceacutelulas de
Bacillus sp inmovilizadas en perlas de vidrio Pyrex con un diaacutemetro de 3 mm se observoacute
que al incrementar la velocidad de dilucioacuten de 004 a 008 h-1 la eficiencia de reduccioacuten
de Cr(VI) se mantuvo constante (998) y que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de
Cr(VI) se incrementoacute de 397 a 797 mgLh (Chirwa y Wang 1997)
45 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular y la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo conceacutentrico de
malla de acero inoxidable y de vidrio perforado
Los reactores airlift con tubo conceacutentrico liso (reactores convencionales) no son
adecuados para llevar a cabo cultivos por lote alimentado (procesos con volumen
variable) ya que no es posible lograr una adecuada circulacioacuten del liacutequido a cualquier
volumen de medio de cultivo En los reactores airlift convencionales uacutenicamente se logra
una adecuada circulacioacuten del fluido cuando la altura del liacutequido es mayor que la del tubo
conceacutentrico Por ello para realizar cultivos por lote alimentado en reactores airlift es
necesario que existan diversos puntos de comunicacioacuten entre las secciones de ascenso y
descenso del reactor a lo largo de toda la longitud del tubo conceacutentrico En la literatura
se han descrito algunos reactores airlift que en su interior contienen dispositivos que
permiten la comunicacioacuten entre ambas secciones del reactor Los dispositivos maacutes
comunes son tubos de mallas metaacutelicas (net draft tube) (Tung y col 1997 Wu y Wu
1990 1991 Wu y col 1992) tubos conceacutentricos de vidrio con perforaciones
88
rectangulares (Cristiani-Urbina y col 2000) placas curvas colocadas coaxialmente
(Hagino y col 1982) y bafles (placas) perforados (Galiacutendez-Mayer y col 2001) Estos
dispositivos afectan las caracteriacutesticas hidrodinaacutemicas y de transferencia de masa y calor
de los reactores por lo que es conveniente evaluar su desempentildeo
En este trabajo se evaluoacute la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivos por lote
utilizando reactores airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable asiacute como de
vidrio con perforaciones circulares Estos cultivos se realizaron con dos flujos de aire de
05 y 1 vvm Estos experimentos tuvieron como propoacutesito principal el seleccionar el tubo
conceacutentrico maacutes adecuado para llevar a cabo posteriormente los cultivos por lote
alimentado y lote alimentado repetido
En la figura 27 se muestran las curvas de crecimiento celular cuando se utilizoacute el reactor
airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos de aire
ensayados El crecimiento celular de la levadura fue mayor cuando se utilizoacute un flujo de
aire de 1 vvm lo cual podriacutea deberse a una mayor oxigenacioacuten del medio de cultivo Los
niveles de Cr(VI) residual maacutes bajos tambieacuten se obtuvieron con un flujo de aire de 1 vvm
(figura 28) y eacutesto podriacutea deberse a la mayor densidad celular alcanzada bajo estas
condiciones
89
Figura 27 Curvas de crecimiento celular de Candida sp en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos de aire ensayados
Figura 28 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual en los cultivos por lote realizados
en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos
de aire ensayados
000
050
100
150
200
250
00 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Tiempo [h]
XX
O
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
00 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Tiempo [h]
Cr(
VI)
Re
sid
ual [
]
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
90
En los experimentos realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado se
observoacute un comportamiento opuesto al obtenido previamente con el tubo conceacutentrico de
malla metaacutelica El crecimiento celular (figura 29) y la reduccioacuten de Cr(VI) (figura 30)
en el reactor con tubo conceacutentrico perforado fueron mayores a un flujo de aire de 05
vvm
Figura 29 Curvas de crecimiento celular de Candida sp en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico de vidrio perforado a los dos flujos de aire ensayados
000
050
100
150
200
00 500 1000 1500 2000 2500
Tiempo [h]
XX
O
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
91
Figura 30 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual en los cultivos por lote realizados
en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de vidrio perforado a los dos flujos de aire
ensayados
En la tabla 10 se muestran algunas variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote
realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable y con
tubo conceacutentrico perforado de vidrio a los dos flujos de aire ensayados Ademaacutes la tabla
incluye los resultados obtenidos en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
00 500 1000 1500 2000 2500
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ual [
] Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
92
Tabla 10 Variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote realizados en el reactor
airlift con las diferentes configuraciones de tubo conceacutentrico
Cultivo por lote
Variable cineacutetica Tubo conceacutentrico
liso
Malla metaacutelica Tubo conceacutentrico perforado
10 vvm 05 vvm 10 vvm 05 vvm 05 vvm 10 vvm
Incremento celular
maacuteximo [gL]
263 072 142 123 106 082
Velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento [h-1]
00244 00059 00120 00149 00178 00093
Eficiencia global de
reduccioacuten de Cr(VI) ()
100 67 95 97 95 89
Velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) [mg de Cr(VI)Lh]
164 031 056 082 084 035
Comparando los resultados obtenidos en el reactor con tubo de malla metaacutelica y con el
de vidrio perforado la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) fue mayor cuando se
utilizoacute el tubo conceacutentrico perforado de vidrio y un flujo de aire de 05 vvm con un valor
promedio de dos experimentos independientes de 083 mgLh Sin embargo esta
velocidad es aproximadamente 494 inferior a la alcanzada con el tubo conceacutentrico liso
Los resultados de crecimiento celular (incremento celular maacuteximo y velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento) y de reduccioacuten de Cr(VI) (eficiencia y velocidad volumeacutetrica)
obtenidos en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable y de
vidrio perforado a los flujos de aire ensayados podriacutean sugerir que el grado de
oxigenacioacuten del medio de cultivo y la magnitud de los esfuerzos de corte que se alcanzan
durante la agitacioacuten neumaacutetica desempentildean un papel importante en la generacioacuten de
biomasa de Candida sp en los estados fisioloacutegicos de eacutesta y por consiguiente en la
93
reduccioacuten de Cr(VI) Debido a lo anterior seriacutea conveniente investigar la influencia de la
velocidad de aireacioacuten la cual afecta los patrones de flujo del fluido la magnitud de las
fuerzas de corte y la concentracioacuten del nutriente gaseoso en la fase fluida
Como las mayores eficiencias y velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) se
obtuvieron cuando se utilizoacute el tubo conceacutentrico perforado de vidrio y un flujo de aire de
05 vvm eacutestos fueron utilizados en los cultivos por lote alimentados que se llevaron a
cabo posteriormente
46 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote alimentado
repetido en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado
En los cultivos por lote alimentado el volumen de medio liacutequido en el reactor se
incrementa gradualmente a medida que aumenta el tiempo de incubacioacuten Este cambio
de volumen provoca una dilucioacuten de los componentes presentes en el medio de cultivo lo
cual dificulta la interpretacioacuten de los resultados Debido a lo anterior en los cultivos por
lote alimentado es conveniente expresar el cambio de las variables (biomasa sustrato
etc) en teacuterminos de masa y no de concentracioacuten y para ello es necesario conocer el
volumen de medio a los diferentes tiempos de incubacioacuten Por consiguiente en el
presente trabajo se estimaron las cantidades de biomasa glucosa y de Cr(VI) y se
expresaron en teacuterminos de masa A continuacioacuten se presentan las ecuaciones para
calcular la masa de las variables de intereacutes para este trabajo
Masa celular [g] = (concentracioacuten celular gL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
94
Masa de glucosa [g] = (concentracioacuten de glucosa gL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
Masa de Cr(VI) [mg] = (concentracioacuten de Cr(VI) mgL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
En los cultivos por lote alimentado y lote alimentado repetido se ensayaron dos flujos
volumeacutetricos de medio de alimentacioacuten de 659 y 1343 mLh que corresponden a
cargas maacutesicas de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh respectivamente Los cultivos por lote
alimentado realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado se iniciaron con
cultivos por lote (los resultados obtenidos en estos uacuteltimos cultivos se mostraron en la
seccioacuten anterior)
Cuando se utilizoacute una carga maacutesica de Cr(VI) de 0514 mgh en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) se observoacute que la masa celular
de la levadura en el primer cultivo por lote alimentado fue mayor que en la del segundo
cultivo Sin embargo a pesar de que la levadura tuvo un suministro constante de fuente
de carbono y energiacutea eacutesta praacutecticamente no crecioacute
Cuando se utilizoacute una carga maacutesica de Cr(VI) de 0514 mgh fue evidente que en los
cultivos por lote alimentado se fue acumulando glucosa en el medio de cultivo lo que
indica que las ceacutelulas casi no consumieron el monosacaacuterido que teniacutean disponible para su
crecimiento La cantidad de glucosa consumida por la levadura en el cultivo por lote
alimentado repetido (segundo cultivo por lote alimentado) fue considerablemente menor
que la consumida en el primer cultivo lo cual podriacutea deberse a que habiacutea una menor
cantidad de biomasa en el reactor En el segundo cultivo por lote alimentado se alcanzoacute
95
una eficiencia de consumo de glucosa del 68 en cambio en el primer cultivo fue del
263
Se observoacute que la levadura fue capaz de reducir parcialmente el Cr(VI) adicionado al
reactor y que en el primer cultivo por lote alimentado se lograron mayores niveles de
reduccioacuten
En el primer cultivo por lote alimentado las eficiencias de reduccioacuten de Cr(VI) maacutes altas
se alcanzaron durante el periodo de incubacioacuten de las 468 a las 967 h (7188-7292)
y disminuyeron ligeramente hasta el final de este cultivo (673-6945) En el segundo
cultivo por lote alimentado (lote alimentado repetido) las eficiencias disminuyeron
gradualmente a medida que se incrementoacute el tiempo de incubacioacuten (figura 31) La
eficiencia promedio de reduccioacuten de Cr(VI) del primer cultivo por lote alimentado fue de
689 y la del segundo cultivo alimentado fue de 56
96
Figura 31 Variacioacuten de la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) de Candida sp cuando se
utilizoacute una carga maacutesica del metal de 0514 mgh
La velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute progresivamente a medida
que transcurrieron los cultivos por lote alimentado desde 0181 hasta 0063 mgLh
(figura 32) estos valores son inferiores a los alcanzados en los cultivos por lote
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Efi
cie
nc
ia d
e r
ed
uc
cioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
CPLA1 CPLA2
97
Figura 32 Variacioacuten de la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Candida sp
en el cultivo por lote alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) llevados a
cabo con una carga maacutesica del metal de 0514 mgh
Posteriormente se realizoacute el cultivo por lote alimentado y lote alimentado repetido
utilizando una carga maacutesica de Cr(VI) de 105 mgh Se observoacute que en ambos cultivos
la masa celular de Candida sp se incrementoacute gradualmente a medida que se incrementoacute
el tiempo de incubacioacuten aunque al final de cada cultivo hubo una ligera disminucioacuten en la
cantidad de biomasa en el reactor En el primer cultivo por lote alimentado se alcanzoacute un
valor maacuteximo de 523 g de biomasa (incremento celular de 053 g) a las 637 h
mientras que en el segundo cultivo se alcanzoacute una cantidad maacutexima de biomasa de 435
g (incremento celular de 13 g) a las 1822 h totales de cultivo que corresponden a 893
h del cultivo por lote alimentado repetido
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica g
lob
al d
e
re
du
ccioacute
n d
e C
r(V
I) [
mg
de
Cr(V
I)L
h]
CPLA1 CPLA2
98
Asimismo se encontroacute que la levadura fue capaz de consumir parcialmente la glucosa
suministrada En el primer cultivo por lote alimentado se obtuvo una eficiencia de
consumo de glucosa del 299 mientras que en el segundo cultivo la eficiencia fue del
388 Estos resultados probablemente se deban a que el crecimiento de la levadura fue
mayor en el cultivo por lote alimentado repetido (incremento celular = 13 g) que en el
cultivo por lote alimentado que lo precedioacute (incremento celular = 053 g)
En los cultivos por lote alimentados llevados a cabo con una carga maacutesica de 105 mg de
Cr(VI) la levadura fue capaz de reducir parcialmente el Cr(VI) adicionado al reactor sin
embargo al final del primer cultivo por lote alimentado se lograron los niveles de
reduccioacuten maacutes altos
En el primer cultivo por lote alimentado la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) se
incrementoacute a medida que aumentoacute el tiempo de incubacioacuten alcanzaacutendose el valor maacutes
alto de eficiencia (529) a las 879 h de incubacioacuten En contraste en el segundo cultivo
por lote alimentado (alimentado repetido) la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute
continuamente conforme transcurrioacute el tiempo de cultivo Al final del cultivo por lote
alimentado repetido la eficiencia de reduccioacuten del metal fue del 43 (figura 33)
99
Figura 33 Variacioacuten de la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) de Candida sp cuando se
utilizoacute una carga maacutesica del metal de 105 mgh
En estos experimentos tambieacuten se observoacute que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de
Cr(VI) disminuyoacute continuamente durante todo el periodo de incubacioacuten desde 0226
hasta 0099 mgLh (figura 34)
0
10
20
30
40
50
60
0 50 100 150 200 250
Tiempo [h]
Efi
cie
ncia
de
re
du
ccioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
CPLA1 CPLA2
100
Figura 34 Variacioacuten de la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Candida sp
en el cultivo por lote alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) llevados a
cabo con una carga maacutesica del metal de 105 mgh
Las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) que se obtuvieron con una carga maacutesica
del metal de 105 mgh fueron inferiores a las logradas con una carga de 0514 mgh y
esto podriacutea deberse a que el tiempo de contacto entre la levadura y el medio de cultivo
fue menor En contraste las velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) fueron
ligeramente superiores a una carga maacutesica de 105 mgh
Con las dos cargas maacutesicas de Cr(VI) que se ensayaron en este trabajo se observoacute una
variacioacuten semejante en el pH de los medios de cultivo Los cultivos por lote alimentado
se iniciaron con un pH de 302-306 (estos valores corresponden al pH que se obtuvo al
final de los cultivos por lote que precedioacute a los cultivos por lote alimentado) El pH se
000
004
008
012
016
020
024
0 50 100 150 200 250
Tiempo [h]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica g
lob
al d
e r
ed
uccioacute
n
de
Cr(V
I) [
mg
de
Cr(V
I)L
h]
CPLA1 CPLA2
101
incrementoacute ligeramente durante el curso de los primeros cultivos por lote alimentado y al
final de eacutestos se tuvieron valores de 355 y de 345 cuando se emplearon cargas maacutesicas
de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh respectivamente En los cultivos por lote alimentado
repetido el pH se mantuvo praacutecticamente constante durante todo el periodo de
incubacioacuten
A pesar de que el cultivo por lote alimentado es muy recomendable para trabajar con
compuestos toacutexicos ha sido poco explorado para el tratamiento de aguas contaminadas
con cromo hexavalente Fujii y col (1990) utilizaron el cultivo por lote alimentado para
investigar la reduccioacuten de Cr(VI) por la bacteria anaerobia Enterobacter cloacae cepa
HO1 En este estudio una solucioacuten de cromato se alimentoacute continuamente en pequentildeas
dosis para minimizar el efecto toacutexico del metal Los investigadores encontraron que la
reduccioacuten de Cr(VI) fue fuertemente afectada por la velocidad especiacutefica de alimentacioacuten
de cromato Cuando esta velocidad fue inferior a 25 mmol de CrO42-g de biomasah
todo el cromo adicionado fue reducido A velocidades de alimentacioacuten superiores se
observoacute que la concentracioacuten de Cr(VI) residual en el medio de cultivo se incrementaba a
medida que aumentaba la velocidad de alimentacioacuten Asimismo encontraron que la
actividad reductora de la bacteria era fuertemente inhibida cuando la concentracioacuten de
Cr(VI) del medio de cultivo era mayor a 07 mM (3639 mgL)
Posteriormente Fujie y col (1996) realizaron la simulacioacuten de un cultivo por lote
alimentado utilizando datos cineacuteticos obtenidos en cultivo por lote y un modelo
matemaacutetico que describe el comportamiento de la bacteria antes mencionada Los
resultados experimentales y los predichos por el simulador fueron semejantes
102
En la tabla 11 se presentan los valores de velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
obtenidos en el presente trabajo en los diferentes sistemas de reaccioacuten ensayados La
mayor velocidad se obtuvo en el cultivo por lote realizado en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso por lo que eacuteste seriacutea el sistema maacutes adecuado para la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp
103
Tabla 11 Velocidades volumeacutetricas globales de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas en diferentes sistemas de reaccioacuten
CPL
Matraz
CPL Reactor
airlift con
tubo liso
CPL Reactor
airlift con
malla metaacutelica
CC Reactor
airlift con
tubo liso
CPLR Reactor
airlift con
tubo liso
CPL Reactor
airlift con tubo
perforado
CPLA Reactor
airlift con
tubo perforado
CPLAR Reactor
airlift con
tubo perforado
10
Vvm
05
vvm
10
vvm
10
vvm
10
vvm
05
vvm
10
vvm
05
vvm
05
vvm
f=08 f=06 f=04
CM1 CM2 CM1 CM2
098 151 ndash178 031 056 024 045 046 035 084 035 0092-0181
0163-0195
0063-0083
0099-0145
CPL = Cultivo por lote CC = Cultivo continuo CPLR = Cultivo por lote repetido CPLA = Cultivo por lote alimentado CPLAR = Cultivo por lote alimentado repetido f = relacioacuten de recambio CM = Carga maacutesica de Cr(VI)
CM1 = 0514 mg Cr(VI)h CM2 = 105 mg Cr(VI)h
104
5 CONCLUSIONES
El sulfato desempentildea un papel importante en la tolerancia al Cr(VI) y en la reduccioacuten
del mismo en la cepa de Candida sp utilizada en este trabajo
El efecto modulador del sulfato sobre el crecimiento celular y la reduccioacuten del Cr(VI)
depende de las concentraciones de los oxianiones sulfato y cromato
El mecanismo principal de remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp es la biotransformacioacuten
del altamente toacutexico Cr(VI) al menos toacutexico Cr(III)
El cultivo por lote en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso es el sistema de
reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
La velocidad de aireacioacuten no tiene un efecto significativo sobre la reduccioacuten de Cr(VI)
por Candida sp
105
6 REFERENCIAS
1 Acevedo-Aguilar FJ Espino-Saldantildea AE Leoacuten-Rodriacuteguez IL Rivera-Cano ME Avila-Rodriguez M Wrobel K et al 2006 Hexavalent chromium removal in vitro and from industrial wastes using chromate-resistant strains of filamentous
fungi indigenous to contaminated wastes Can J Microbiol 52 809-815
2 Ali-Awan M Baig MA Iqbal J Aslam MR amp Ijaz N 2003 Recovery of chromium (III) from tannery wastewater J App Sci amp Environ Management 7 (2) 5-8
3 Aacutelvarez SG Maldonado M Gerth A amp Kuschk P 2004 Characterization of
tannery effluents and study of the water Hyacinth in chromium recovery Informacioacuten Tecnoloacutegica 15 (3) 75-80
4 Aravindhan BM Madani B Rao JR Nair BU amp Ramasami T 2004 Bioaccumulation of Chromium from Tannery Wastewater An Approach for chrome
recovery and reuse Environ Sci Technol 38 300-306
5 Atkinson B amp Mavituna F 1983 Biochemical engineering and biotechnology handbook United Kingom Nature Press
6 Badar U Ahmed N Beswick AJ Pattanapipitpaisal P amp Macaskie LE 2000 Reduction of chromate by microorganisms isolated from metal contaminated sites of
Karachi Pakistan Biotechnol Lett 22 829-836 7 Bae WC Kang TG Kang IK Won YJ amp Jeong BC 2000 Reduction of
hexavalent chromium by Escherichia coli ATCC 33456 in batch and continuous cultures J Microbiol 38(1) 36-39
8 Balasubramanian S amp Pugalenthi V 1999 Determination of total chromium in
tannery wastewater by inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry
flame atomic absorption spectrometry and uv-visible spectrophotometric methods Talanta 50 (3) 457-467
9 Baldi F Vaughan AM amp Olson GJ 1990 Chromium(VI)-resistant yeast
isolated from a sewage treatment plant receiving tannery wastes Appl Environ
Microbiol 56 (4) 913-918
10 Barnhart J 1997 Occurrences uses and properties of chromium Regulatory Toxicology and Pharmacology 26 S3-S7
11 Beleza VM Boaventura RA amp Almeida MF 2001 Kinetics of chromium removal from spent tanning liquors using acetylene production sludge Environ
Sci Technol 35 (21) 4379-4383 12 Bhide JV Dhakephalkar PK amp Paknikar KM 1996 Microbiological process for
the removal of Cr(VI) from chromate-bearing cooling tower effluent Biotechnol Lett 18 (6)667-672
106
13 Bopp LH amp Ehrlich HL 1988 Chromate resistance and reduction in
Pseudomonas fluorescens strain LB300 Archives of Microbiology 150 426-431
14 Branco R Alpoim MC amp Morais PV 2004 Ochrobactrum tritici strain 5bvI1 ndash characterization of a Cr(VI)-resistant and Cr(VI)-reducing strain Can J Microbiol
50 697-703 15 Camargo FAO Bento FM Okeke BC amp Frankenberger WT 2002 Chromate
reduction by chromium-resistant bacteria isolated from soils contaminated with dichromate Journal of Environmental Quality 32 1228-1233
16 Camargo FAO Okeke BC Bento FM amp Frankenberger WT 2003 In vitro
reduction of hexavalent chromium by a cell-free extract of Bacillus sp ES 29
stimulated by Cu2+ Appl Microbiol Biotechnol 62 569-573
17 Cantildeizares-Villanueva R 2000 Biosorcioacuten de metales pesados mediante el uso de biomasa microbiana Rev Latinoam Microbiol 42 131-143
18 Cervantes C Campos-Garciacutea J Devars S Gutieacuterrez-Corona F Loza-Tavera H Torres-Guzmaacuten JC amp Moreno-Saacutenchez R 2001 Interactions of chromium with
microorganisms and plants FEMS Microbio Rev 25 335-347 19 Chardin B Dolla A Chaspoul F Fardeau ML Gallice P amp Bruschi M 2002
Bioremediation of chromate thermodynamic analysis of the effects of Cr(VI) on sulfate-reducing bacteria Appl Microbiol Biotechnol 60 352-360
20 Chardin B Giudici-Orticoni MT De Luca G Guigliarelli B amp Bruschi M 2003
Hydrogenases in sulfate-reducing bacteria function as chromium reductase Appl
Microbiol Biotechnol 63 315-321
21 Cheung Y amp Gu G 2003 Reduction of chromate (CrO42-) by an enrichment
consortium and an isolate of marine sulfate-reducing bacteria Chemosphere 52 1523-1529
22 Cheung KH amp Gu JD 2005 Chromate reduction by Bacillus megaterium TKW3
isolated from marine sediments World Journal of Microbiology amp Biotechnology 21 213-219
23 Cheung KH amp Gu JD 2007 Mechanism of hexavalent chromium detoxification
by microorganisms and bioremediation application potential a review International
Biodeterioration amp Biodegradation 59 8-15
24 Chirwa EMN amp Wang YT 1997 Hexavalent chromium reduction by Bacillus sp in a packed-bed bioreactor Environ Sci Technol 31 1446-1451
25 Cristiani-Urbina E Netzahuatl-Muntildeoz AR Manriquez-Rojas FJ Juaacuterez-Ramiacuterez C Ruiz-Ordaz N amp Galiacutendez-Mayer J 2000 Batch and fed-batch
cultures for the treatment of whey with mixed yeast cultures Process Biochemistry 35 649-657
107
26 Czakoacute-Veacuter K Batiegrave M Raspor P Sipiczki M amp Pesti M 1999 Hexavalent
chromium uptake by sensitive and tolerant mutants of Schizosaccharomyces pombe FEMS Microbiology Letters 178 109-115
27 DeLeo PC amp Ehrlich HL 1994 Reduction of hexavalent chromium by
Pseudomonas fluorescens LB300 in batch and continuous cultures Appl Microbiol Biotechnol 40 756-759
28 Desjardin V Bayard R Lejeune P amp Gourdon R 2003 Utilization of supernatant of pure cultures of Streptomyces thermocarboxydus NH50 to reduce
chromium toxicity and mobility in contaminated soils Water Air and Soil Pollut 3 153-160
29 Eccles H 1999 Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process TIBTECH 17 462-465
30 Faisal M amp Hasnain S 2004 Comparative study of Cr(VI) uptake and reduction in
industrial effluent by Ochrobactrum intermedium and Brevibacterium sp
Biotechnology Letters 26 1623-1628
31 Fruchter J 2002 In situ treatment of chromium-contaminated groundwater Environ Sci amp Technol pp 464-472
32 Fujie K Hu H Huang X Tanaka Y Urano K amp Ohtake H 1996 Optimal operation of bioreactor system developed for the treatment of chromate wastewater
using Enterobacter cloacae HO-1 Wat Sci Tech 33 (5-6) 173-182 33 Fujii E Toda K amp Ohtake H 1990 Bacterial reduction of toxic hexavalent
chromium using a fed-batch culture of Enterobacter cloacae strain HO1 J Ferment Bioeng 69 (6) 365-367
34 Gaballah I Goy D Kilbertus G amp Thauront J 1994 Decontamination of
industrial effluents for environment protection and recycling of metals Resources
Conservation and Recycling 10 (1-2) 97-106
35 Galiacutendez-Mayer J Saacutenchez-Teja O Cristiani-Urbina E amp Ruiz-Ordaz N 2001 A novel split-cylinder airlift reactor for fed-batch cultures Bioprocess and Biosystems
Engineering 24 171-177 36 Ganguli A amp Tripathi AK 1999 Survival and chromate reducing ability of
Pseudomonas aeruginosa in industrial effluents Lett Appl Microbiol 28 76-80
37 Garbisu C Alkorta I Llama MJ amp Serra JL 1998 Aerobic chromate reduction by Bacillus subtilis Biodegradation 9 133-141
38 Gonzaacutelez AR Ndungrsquou K amp Flegal AR 2005 Natural occurrence of hexavalent chromium in the Aromas Red Sands Aquifer California Environ Sci Technol 39
(15) 5505-5511
108
39 Gopalan R amp Veeramani H 1994 Studies on microbial chromate reduction by
Pseudomonas sp in aerobic continuous suspended growth cultures Biotechnology and Bioengineering 43 471-476
40 Guertin J Jacobs JA amp Avakian CP 2005 Chromium(VI) Handbook 1st
edition CRC Press USA 41 Hach Water Analysis Handbook 2002 Hach Company Colorado USA 4th ed
pp 433-444 1210-1211
42 Hafez AI El-Manharawy MS amp Khedr MA 2002 RO membrane removal of unreacted chromium from spent tanning effluent A pilot-scale study Part 2 Desalination 144 (1-3) 237-242
43 Hagino H Odagiri H amp Okutani J 1982 Draft device for a bubble column US
Patent 4327042 44 Horitsu H Futo S Miyazawa Y Ogai S amp Kawai K 1987 Enzymatic
reduction of hexavalent chromium by hexavalent chromium tolerant Pseudomonas ambigua G-1 Agric Biol Chem 51 (9) 2417-2420
45 Ishibashi Y Cervantes C amp Silver S 1990 Chromium reduction in Pseudomonas
putida Appl Environ Microb 56 (7) 2268-2270
46 Jianlong W Zeyu M amp Xuan Z 2004 Response of Saccharomyces cerevisiae to
chromium stress Process Biochem 39 1231-1235 47 Juvera-Espinosa J Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2006 Isolation and
characterization of a yeast strain capable of removing Cr(VI) Enzyme and Microbial Technology 40 114-121
48 Kaszycki P Fedorovych D Ksheminska H Babyak L Gonchar MV Jaglarz
A amp Koloczek H 2003 Modulation of chromium(VI) and (III) tolerance and
accumulation in yeast by sulfate-containing salts European Journal of Biochemistry 1 (1) P49-53
49 Komori K Wang P Toda K amp Ohtake H 1989 Factors affecting chromate
reduction in Enterobacter cloacae Strain HO1 Appl Microbiol Biotechnol 31 567-570
50 Ksheminska H Fedorovych D Babyak L Yanovych D Kaszycki P amp Koloczek H 2005 Chromium(III) and (VI) tolerance and bioaccumulation in
yeast a survey of cellular chromium content in selected strains of representative genera Process Biochem 40 1565-1572
51 Ksheminska HP Honchar TM Gayda GZ amp Gonchar MV 2006 Extra-cellular chromate-reducing activity of the yeast cultures Central European Journal of
Biology 1 (1)137-149
109
52 Kurniawan TA Chan GYS Lo W amp Babel S 2006 Physico-chemical
treatment techniques for wastewater laden with heavy metals Chemical Engineering Journal 118 83-98
53 Labra M Grassi F Imazio S Di Fabio T Citterio S Sgorbati S amp Agradi E
2004 Genetic and DNA-methylation changes induced by potassium dichromate in Brassica napus L Chemosphere 54 1049-1058
54 Laxman RS amp More S 2002 Reduction of hexavalent chromium by Streptomyces griseus Minerals Engineering 15 831-837
55 Leustek T 2002 Sulfate metabolism The Arabidopsis Book American Society of
Plant Biologists
56 Liu YG Xu WH Zeng GM Li X and Gao H 2006 Cr(VI) reduction by
Bacillus sp isolated from chromium landfill Process Biochemistry 41 1981-1986 57 Llovera S Bonet R Simon-Pujol MD amp Congregado F 1993 Effect of culture
medium ions on chromate reduction by resting cells of Agrobacterium radiobacter Appl Microbiol Biotechnol 39 424-426
58 Lloyd JR 2003 Microbial reduction of metals and radionuclides FEMS Microbiol
Rev 27 411-425
59 Marsh TL amp McInerney MJ 2001 Relationship of hydrogen bioavailability to
chromate reduction in aquifer sediments Appl Environ Microb 67 (4) 1517-1521
60 McLean J amp Beveridge TJ 2001 Chromate reduction by a pseudomonad isolated from a site contaminated with chromated copper arsenate Applied and
Environmental Microbiology 67 (3)1076-1084 61 Megharaj M Avudainayagam S amp Naidu R 2003 Toxicity of hexavalent
chromium and its reduction by bacteria isolated from soil contaminated with tannery waste Current Microbiology 47 51-54
62 Middleton SS Latmani RB Mackey MR Ellisman MH Tebo BM amp Criddle
CS 2003 Cometabolism of Cr(VI) by Shewanella oneidensis MR-1 produces cell-associated reduced chromium and inhibits growth Biotechnol Bioeng 83 627-637
63 Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2006 Removal of hexavalent chromium
by Trichoderma viride in an airlift bioreactor Enzyme and Microbial Technology 40 107-113
64 Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2008 Hexavalent chromium removal by Trichoderma inhamatum fungal strain isolated from tannery effluent Enzyme and
Microbial Technology 40 107-113
110
65 Morales B L 2005 Aislamiento de microorganismos y estudio de su capacidad
para remover cromo hexavalente Tesis de Maestriacutea Escuela Nacional de Ciencias Bioloacutegicas IPN Meacutexico
66 Muter O Patmalnieks A amp Rapoport A 2001 Interrelations of the yeast Candida
utilis and Cr(VI) metal reduction and its distribution in the cell and medium Process Biochem 36 963-970
67 Ohtake H Cervantes C amp Silver S 1987 Decreased chromate uptake in Pseudomonas fluorescens carrying a chromate resistance plasmid J Bacteriol 169
3853-3856 68 Pal N 1997 Reduction of hexavalent chromium to trivalent chromium by
Phanerochaete chrysosporium pp 511-517 En Alleman BC amp Leeson A In Situ and On-Site Bioremediation Vol 2 Battelle Press Ohio USA
69 Pattanapipitpaisal P Brown NL amp Macaskie LE 2001 Chromate reduction by
Microbacterium liquefaciens immobilised in polyvinyl alcohol Biotechnol Lett 23
61-65
70 Pepi M amp Baldi F 1992 Modulation of chromium(VI) toxicity by organic and inorganic sulfur species in yeasts from industrial wastes BioMetals 5 179-185
71 Quintana M Curutchet G amp Donati E 2001 Factors affecting chromium(VI) reduction by Thiobacillus ferrooxidans Biochemical Engineering Journal 9 11-15
72 Ramiacuterez-Ramiacuterez R Calvo-Meacutendez C Aacutevila-Rodriacuteguez M Lappe P Ulloa M
Vaacutezquez-Juaacuterez R amp Gutieacuterrez-Corona JF 2004 Cr(VI) reduction in a chromate-
resistant strain of Candida maltosa isolated from the leather industry Antonie van Leeuwenhoek 85 63-68
73 Rege MA Petersen JN Johnstone DL Turick CE Yonge DR amp Apel WA
1997 Bacterial reduction of hexavalent chromium by Enterobacter cloacae strain
HO1 grown on sucrose Biotechnol Lett 19 (7) 691-694
74 Roukas T 1993 Ethanol production from nonsterilized carob pod extract by free and immobilized Saccharomyces cerevisiae cells using fed-batch culture
Biotechnol Bioeng 43 189-194 75 Ruiacutez MA 2000 Recuperacioacuten de metales pesados de soluciones diluidas por
biosorcioacuten con bacteria En Medrano RH Galan WL Biotecnologiacutea de Minerales CONACYT Meacutexico pp 235-262
76 Saxena D Levin R amp Firer MA 2000 Removal of chromate from industrial
effluent by a new isolate of Staphylococcus cohnii Wat Sci Technol 42 (1-2)
93-98
77 Secretariacutea de Comercio y Fomento Industrial NMX-AA-74-1981 Anaacutelisis de Agua ndash Determinacioacuten del Ioacuten Sulfato
111
78 Secretariacutea de Economiacutea NMX-AA-051-SCFI-2001 Anaacutelisis de Agua -
Determinacioacuten de Metales por Absorcioacuten Atoacutemica en Aguas Naturales Potables Residuales y Residuales Tratadas - Meacutetodo de Prueba
79 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NMX-AA-044-SCFI-
2001 Anaacutelisis de Aguas - Determinacioacuten de Cromo Hexavalente en Aguas Naturales Potables Residuales y Residuales Tratadas - Meacutetodo de Prueba En Diario Oficial de la Federacioacuten 1 de agosto 2001
80 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996
Liacutemites Maacuteximos Permisibles de Contaminantes en las Descargas de Aguas Residuales en Aguas y Bienes Nacionales En Diario Oficial de la Federacioacuten 6 de enero 1997
81 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996
Liacutemites Maacuteximos Permisibles de Contaminantes en las Descargas de Aguas Residuales a los Sistemas de Alcantarillado Urbano o Municipal En Diario Oficial de la Federacioacuten 3 de junio 1998
82 Secretariacutea de Salud Proyecto de Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-
NOM-127-SSA1-1994 Salud Ambiental Agua para Uso y Consumo Humano - Liacutemites Permisibles de Calidad y Tratamientos a que debe Someterse el Agua para su Potabilizacioacuten En Diario Oficial de la Federacioacuten 20 de Octubre 2000
83 Shakoori AR Makhdoom M amp Haq RU 2000 Hexavalent chromium reduction
by a dichromate-resistant gram-positive bacterium isolated from effluents of tanneries Appl Microbiol amp Biotechnol 53 (3) 348-351
84 Shen H and Wang YT 1994 Biological reduction of chromium by E coli Journal of Environmental Engineering 120 560-572
85 Shen H amp Wang Y 1995 Hexavalent chromium removal in two-stage bioreactor
system J Environ Eng 121 (11) 798-804
86 Smith WA Apel WA Petersen JN amp Peyton BM 2002 Effect of carbon and
energy source on bacterial chromate reduction Bioremediation J 6 (3) 205-215
87 Smith WL amp Gadd GM 2000 Reduction and precipitation of chromate by mixed culture sulphate-reducing biofilms J Appl Microbiol 88 983-991
88 Song Z Williams CJ amp Edyvean RGJ 2004 Treatment of tannery wastewater by chemical coagulation Desalination 164 (3) 249-259
89 Srinath T Verma T Ramteke PW amp Garg SK 2002 Chromium (VI)
biosorption and bioaccumulation by chromate resistant bacteria Chemosphere 48
(4) 427-435
90 Stanbury PF amp Whitaker A ―Principles of Fermentation Technology Pergamon Press Ltd Great Britain 1984 First edition Pp 11-24
112
91 Stasinakis AS Mamais D Thomaidis NS amp Lekkas TD 2002 Effect of
chromium (VI) on bacterial kinetics of heterotrophic biomass of activated sludge Water Res 36 3341-3349
92 Stasinakis AS Thomaidis NS Mamais D Karivali M amp Lekkas TD 2003
Chromium species behaviour in the activated sludge process Chemosphere 52 1059-1067
93 Stephen JR amp Macnaughton SJ 1999 Developments in terrestrial bacterial remediation of metals Current Opinion in Biotechnology 10 230-233
94 Su C amp Ludwig RD 2005 Treatment of hexavalent chromium in chromite ore
processing solid waste using a mixed reductant solution of ferrous sulfate and
sodium dithionite Environ Sci Technol 39 (16) 6208-6216
95 Thacker U Parikh R Shouche Y amp Madamwar D 2006 Hexavalent chromium reduction by Providencia sp Process Biochem 41 1332-1337
96 Thacker U amp Madamwar D 2005 Reduction of toxic chromium and partial localization of chromium reductase activity in bacterial isolate DM1 Would Journal
of Microbiology amp Biotechnology 21 891-899 97 Tung HL Chiou SY Tu CC amp Wu WT 1997 An airlift reactor with double
net draft tubes and its application in fermentation Bioprocess Eng 171-5
98 Turick CE Apel WA amp Carmiol NS 1996 Isolation of hexavalent chromium-reducing anaerobes from hexavalent-chromium-contaminated and noncontaminated environments Applied Microbiol Biotechnol 44 683-688
99 Viamajala S Peyton BM Sani RK Apel WA amp Petersen JN 2004 Toxic
effects of chromium(VI) on anaerobic and aerobic growth of Shewanella oneidensis MR-1 Biotechnol Prog 20 87-95
100 Volesky B amp Vieira RHSF 2000 Biosorption a solution to pollution Internat Microbiol 3 17-24
101 Wang DIC Cooney CL Demain AL Dunnill P Humphrey AE amp Lilly MD
1979 ―Fermentation and Enzyme Technology John Wiley amp Sons Inc USA Pp 98-115
102 Wang YT and Shen H 1997 Modelling Cr(VI) reduction by pure bacterial cultures Water Research 31 727-732
103 Wang Y amp Xiao C 1995 Factors affecting hexavalent chromium reduction in pure
cultures of bacteria Water Res 29 (11) 2467-2474
104 Wang Y 2000 Microbial reduction of chromate En Lovley DR (Ed)
Environmental Microbe-Metal Interactions ASM Press Washington DC USA pp 225-235
113
105 Wilkin RT Su C Ford RG amp Paul CJ 2005 Chromium-removal processes
during groundwater remediation by a zerovalent iron permeable reactive barrier Environ Sci Technol 39 (12) 4599-4605
106 Worthington Biochemical Corporation 1972 Worthington Enzyme Manual
Enzymes Enzyme Reagents and Related Biochemicals Freehold New Jersey USA
107 Wu J amp Wu WT 1991 Fed-batch culture of Saccharomyces cerevisiae in an airlift reactor with net draft tube Biotechnol Prog 7 230-233
108 Wu WT amp Wu JY 1990 Airlift reactor with net draught tube J Ferm Bioeng
70 359-361
109 Wu WT Wu JY amp Jong JZ 1992 Mass transfer in an airlift reactor with a net
draft tube Biotechnol Prog 8 465-468 110 Zakaria ZA Zakaria Z Surif S amp Ahmad WA 2006 Hexavalent chromium
reduction by Acinetobacter haemolyticus isolated from heavy-metal contaminated wastewater J Hazard Mater 146 30-38
111 Zuacutentildeiga M 2005 Aislamiento de microorganismos con capacidad para remover
cromo hexavalente del agua Tesis de Licenciatura Escuela Nacional de Ciencias
Bioloacutegicas IPN Meacutexico
Referencias electroacutenicas
httpepagov httpesepagovtechpubs412304html
httpfaiunneeduarbiologiamicroindcultivo20y20biorreactoreshtm httpmineralserusgsgovmineralspubscommoditychromium180494pdf
httpuserpagesumbcedu gferre1bmcohtml
httpuserpagesumbcedu gferre1fedbatchhtml httpwwgemesmaterialdocument httpwwwatsdrcdcgovfacts7 html
httpwwwchemicalelementscomelementscrhtml httpwwwepagoviris
wwwclu-inorgdownloadstudentpapersbio_of_metals_paperpdf
114
7 Impacto
En este trabajo se identificaron algunas variables ambientales que afectan la
biorreduccioacuten de cromo hexavalente [Cr(VI)] La informacioacuten obtenida podriacutea ser de
utilidad para mejorar los procesos de reduccioacuten del metal asiacute como para disminuir los
tiempos y costos del tratamiento de los efluentes industriales contaminados con Cr(VI)
Los resultaron mostraron que el sulfato afecta la tolerancia de Candida sp al Cr(VI) y a
su capacidad para reducirlo Fue evidente que a medida que se incrementoacute la
concentracioacuten de sulfato aumentoacute el crecimiento de la levadura la eficiencia global y la
velocidad global de reduccioacuten de Cr(VI) Asimismo se encontroacute que la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp depende de la densidad celular de los cultivos de manera tal que
a mayor cantidad de biomasa producida mayor es la reduccioacuten del metal Aun cuando la
cepa de Candida sp es sensible a los efectos toacutexicos del Cr(VI) en ausencia del sulfato
esta levadura posee una notable capacidad para reducir muy altas concentraciones de
Cr(VI) en presencia de sulfato por lo que podriacutea ser potencialmente uacutetil para el
tratamiento de aguas industriales altaminadas con Cr(VI) y con iones sulfato
Hasta donde sabemos este es el primer trabajo en el que se demuestra que el sulfato
desempentildea un papel impotante tanto en la tolerancia al Cr(VI) como en la reduccioacuten
aeroacutebica del mismo en microorganismos Estos descubrimientos podriacutean tener
implicaciones importantes en el tratamiento de aguas residuales contaminadas con
Cr(VI)
Ademaacutes se encontroacute que los contactores gas-liacutequido son adecuados para la reduccioacuten
aeroacutebica de Cr(VI) por Candida sp Esto uacuteltimo es de vital importancia porque seriacutea
posible disminuir significativamente los costos de tratamiento ya que estos biorreactores
se caracterizan por su baja economiacutea de aireacioacuten Las velocidades volumeacutetrica y
especiacutefica asiacute como la capacidad de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por Candida sp en el
reactor airlift con tubo conceacutentrico fueron superiores a las obtenidas en matraz y eacutesto
podriacutea deberse a que en el reactor airlift la levadura tuvo una mayor cantidad de oxiacutegeno
disponible para su crecimiento y a que el mayor nuacutemero de ceacutelulas producidas fue la
responsable de reducir maacutes eficazmente el Cr(VI) presente en el medio de cultivo
115
Las caracteriacutesticas mostradas por Candida sp en el dispositivo airlift indican que este
tipo de reactor neumaacutetico es adecuado para el crecimiento y la reduccioacuten aeroacutebica del
Cr(VI) por la levadura Asimismo los paraacutemetros cineacuteticos del proceso de reduccioacuten de
Cr(VI) catalizado por Candida sp son superiores a los reportados para otros
microorganismos lo que sugiere que esta cepa de levadura tiene potencial biotecnoloacutegico
para ser utilizada en procesos de remediacioacuten de aguas residuales industriales
contaminadas con Cr(VI)
De los diferentes sistemas de reaccioacuten ensayados (cultivos por lote lote repetido
continuo de una etapa lote alimentado y lote alimentado repetido) el cultivo por lote es
el maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
Otra de las contribuciones de este trabajo fueron la formacioacuten de recursos humanos
tanto a nivel licenciatura como de posgrado Uno de los estudiantes de licenciatura ya
sustentoacute su examen profesional y la tesis de Maestriacutea de otra estudiante ya fue revisada
y aprobada por los sinodales por lo que el examen para obtener el grado se realizaraacute en
poco tiempo Actualmente estaacuten en proceso 1 tesis de licenciatura 2 de maestriacutea y 1 de
doctorado
Entre otros productos del proyecto de investigacioacuten se tienen la publicacioacuten de 2 artiacuteculos
en revistas internacionales incluidas en la base de datos del Journal of Citation Reports
del Institute for Scientific Information (ISI) la publicacioacuten de 2 artiacuteculos en extenso en
las memorias de Congresos Internacionales y la presentacioacuten de varios trabajos en
eventos acadeacutemicos nacionales e internacionales
7
13 Toxicidad del cromo
La EPA (Environmental Protection Agency) considera al cromo hexavalente - y a sus
derivados - como uno de los diecisiete agentes quiacutemicos de mayor peligrosidad para la
salud puacuteblica y para el medio ambiente (Marsh y McInerney 2001)
Al ser humano el cromo hexavalente le puede provocar dantildeo al rintildeoacuten e hiacutegado asiacute como
alteraciones neuroloacutegicas La inhalacioacuten de cromo hexavalente en niveles mayores a 2
microgm3 puede causar irritacioacuten de las mucosas comezoacuten hemorragias uacutelceras y
perforacioacuten del tabique nasal (httpwwwatsdrcdcgovfacts7html)
Se ha encontrado que algunas personas son extremadamente sensibles al contacto de su
piel con el cromo hexavalente Algunas de las reacciones aleacutergicas detectadas consisten
en el enrojecimiento marcado de la piel e hinchazoacuten
(httpwwwatsdrcdcgovfacts7html Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos
Naturales y Pesca NMX-AA-044-SCFI-2001 httpwwwepagoviris Ksheminska y
col 2005)
La EPA clasifica a los compuestos del cromo hexavalente en el grupo A el cual incluye a
los agentes carcinogeacutenicos para el hombre Ademaacutes el cromo hexavalente tiene efecto
mutageacutenico y teratogeacutenico en animales y humanos (Wang 2000
httpwwwatsdrcdcgovfacts7html Smith y col 2002)
El cromo hexavalente tambieacuten es toacutexico para la mayoriacutea de los microorganismos auacuten a
bajas concentraciones debido a que reduce su actividad enzimaacutetica afecta sus procesos
metaboacutelicos y les produce mutaciones (Wang 2000) Lo anterior tiene gran impacto en
8
los sistemas de tratamiento bioloacutegico de aguas residuales ya que reduce
significativamente la eficiencia de remocioacuten de los contaminantes y la calidad del efluente
(Stasinakis y col 2002 2003)
En las plantas el cromo hexavalente reduce la actividad de las enzimas fotosinteacuteticas y
en general de las proteiacutenas (Morales 2005) ocasiona enfermedades como la clorosis e
interfiere en diversos procesos metaboacutelicos que causan finalmente la muerte de estos
organismos Asimismo se ha demostrado que rompe la unioacuten azuacutecar-fosfato de la
cadena de aacutecido desoxirribonucleico (DNA) y produce una hiper-metilacioacuten de las bases
nitrogenadas lo que ocasiona mutaciones al azar (Labra y col 2004)
Diversos estudios han demostrado que el cromo hexavalente es cien veces maacutes toacutexico
(Garbisu y col 1998) y mil veces maacutes mutageacutenico que el estado trivalente (Wang
2000 Saxena y col 2000 Lloyd 2003)
14 Cantidad de cromo liberado al medio ambiente y legislacioacuten ambiental
Se estima que maacutes de 170000 toneladas de residuos que contienen cromo se descargan
al medio ambiente cada antildeo (Marsh y McInerney 2001) En la tabla 1 se muestran
algunos datos reportados sobre el contenido de cromo en algunos efluentes industriales
asiacute como en aguas superficiales y freaacuteticas Se puede apreciar que la concentracioacuten de
cromo de los efluentes variacutea considerablemente incluso en los del mismo sector
industrial
9
Tabla 1 Concentraciones de cromo total yo Cr(VI) de efluentes industriales y cuerpos
de agua
Fuente Concentracioacuten de cromo total
Concentracioacuten de Cr (VI)
Referencia
Industria galvanizadora ---
5000 mgL
Gaballah y col 1994
Industria galvanizadora (1) Industria galvanizadora (2)
---
---
127 mgL
3700 mgL
Fujie y col 1996
Acuiacutefero Aromas Red Sands (California)
---
6-36 gL
Gonzaacutelez y col 2005
Agua subterraacutenea contaminada (EEUU)
gt 1500 gL
---
Wilkin y col 2005
Riacuteo receptor de efluentes de la industria papelera
20-80 mgL
---
Cervantes y col 2001
Planta de tratamiento de desechos de produccioacuten de
ferrocromita
---
3-57 mgL
(fase disuelta)
Su y Ludwig 2005
Curtiduriacutea de pieles
(Grecia)
2000 ndash 3500
mgL
--- httpesepagovtechpubs41230
4html
Curtiduriacutea de pieles (tanque de sedimentacioacuten)
3500 gmL
40 gmL
Ganguli y Tripathi 1999
Curtiduriacutea de pieles (tanque de descarga)
5000 gmL
3000 gmL
Ganguli y Tripathi 1999
Curtiduriacutea de pieles (India) 200 - 2400 mgL ---
Balasubramanian y Pugalenthi 1999
Curtiduriacutea de pieles (Portugal)
2467 mgL
---
Beleza y col 2001
Efluente tratado de
curtiduriacutea de pieles (India)
---
096 mgL
Srinath y col 2002
Curtiduriacutea de pieles (Egipto)
---
1300-2500
mgL
Hafez y col 2002
Curtiduriacutea de pieles (1) (Pakistaacuten) Curtiduriacutea de pieles (2) (Pakistaacuten)
2877 mgL
220 mgL
---
---
Ali-Awan y col 2003
Curtiduriacutea de pieles 12 mgL --- Song y col 2004
Curtiduriacutea de pieles (Guanajuato Meacutexico)
250 gmL
---
Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004
Curtiduriacutea de pieles (India) 500-1000 mgL
---
Aravindhan y col 2004
Bantildeos de curtido al cromo
en curtiduriacuteas (Leoacuten Guanajuato Meacutexico)
3000 ndash10000 mgL
---
Aacutelvarez y col 2004
10
En Meacutexico no se tienen datos precisos sobre la cantidad y concentracioacuten de cromo total
o hexavalente de los residuos generados por las diversas industrias sin embargo se ha
informado que las industrias del curtido de pieles generan de 250 a 270 toneladas de
Cr2O3 al antildeo (Zuacutentildeiga 2005)
Debido a las grandes cantidades de cromo que se liberan al medio ambiente asiacute como a
los efectos indeseables que este metal ocasiona sobre los seres vivos en muchos paiacuteses
se han establecido Normas Ambientales que pretenden regular la concentracioacuten de cromo
total yo de Cr(VI) de los desechos liacutequidos soacutelidos o gaseosos que se descargan al
medio ambiente
En Meacutexico la Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca ha decretado
normas oficiales que establecen los liacutemites maacuteximos permisibles de contaminantes
incluido el cromo ya sea como cromo total o como cromo hexavalente de las aguas
residuales que se descargan en aguas y bienes nacionales (Secretariacutea de Medio
Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996) (tabla 2) asiacute como en los
sistemas de alcantarillado urbano o municipal (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos
Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996) (tabla 3)
En cuanto al agua para uso y consumo humano la Secretariacutea de Salud ha emitido la
Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-1994 (Secretariacutea de Salud Proyecto de
Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-1994) donde se indica
como liacutemite maacuteximo permisible una concentracioacuten de cromo total de 005 mgL
11
Tabla 2 Liacutemites maacuteximos permisibles de cromo total para las aguas residuales que se descargan en aguas y bienes
nacionales (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996)
Paraacutemetros
( )
Riacuteos Embalses
Naturales y
Artificiales
Aguas Costeras Suelo
(mgL) Uso en
riego
agriacutecola
(A)
Uso
puacuteblico
urbano
(B)
Proteccioacuten
de vida
acuaacutetica
( C )
Uso en
riego
agriacutecola
(B)
Uso
puacuteblico
urbano
( C )
Explotacioacuten
pesquera
navegacioacuten
y otros
usos (A)
Recreacioacuten
(B)
Estuarios
(B)
Uso en
riego
agriacutecola
(A)
Humedales
naturales
(B)
PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD
Cromo 1 15 05 10 05 10 1 15 05 10 05 10 1 15 05 10 05 10 05 10
() Medidos de manera total PD = Promedio diario PM = Promedio mensual (A) (B) y ( C ) Tipo de cuerpo receptor seguacuten la Ley Federal de Derechos
Tabla 3 Liacutemites maacuteximos permisibles de cromo hexavalente para los sistemas de alcantarillado urbano o municipal
(Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996)
Paraacutemetros (mgL) Promedio Mensual Promedio Diario Instantaacuteneo
Cromo hexavalente 05 075 1
12
Por su parte la EPA ha establecido como liacutemite una concentracioacuten de 01 mg de cromo
por litro de agua potable (httpwwwatsdrcdcgovfacts7html)
La Organizacioacuten Mundial para la Salud (OMS) y la Comunidad Econoacutemica Europea (CEE)
establecen una concentracioacuten de 005 mg de cromo totalL como paraacutemetro de calidad
para aguas destinadas a consumo humano (httpwwgemesmaterialdocument)
Algunos valores sentildealados por otras instancias internacionales se muestran en la tabla
4
Tabla 4 Liacutemites permisibles para cromo sentildealados por Directivas Internacionales
sobre agua potable y aguas embotelladas (Zuacutentildeiga 2005)
Paraacutemetro Canadaacute 1 Japoacuten 2 Aguas embotelladas Nivel de
Administracioacuten Federal sobre
Productos Farmaceacuteuticos de EEUU
Cromo
005 mgL
005 mgL
01 mgL
1 Liacutemite establecido por el Ministerio de Salud de Canadaacute
2 Liacutemite establecido por el Ministerio de Salud y Bienestar Social de Japoacuten
15 Meacutetodos para la remocioacuten de cromo de los efluentes industriales
Para disminuir los efectos toacutexicos del metal es conveniente aplicar alguacuten(os)
tratamiento(s) a los efluentes industriales que contienen cromo antes de descargarlos en
los cuerpos de agua o en el suelo asiacute como restaurar los ecosistemas contaminados En
la actualidad estaacuten disponibles varias tecnologiacuteas para estos propoacutesitos (Eccles 1999)
Estas tecnologiacuteas se han empleado para reducir la toxicidad del contaminante [mediante
la transformacioacuten quiacutemica o bioloacutegica del Cr(VI) a Cr(III)] para removerlo de un lugar
para disminuir la extensioacuten de la contaminacioacuten o para contenerlo en un aacuterea en
particular (Guertin y col 2005)
13
151 Procesos convencionales
Los meacutetodos convencionales para la remocioacuten de los metales pesados son de naturaleza
fisicoquiacutemica y pueden ser utilizados en varias etapas del tratamiento de aguas
residuales Los meacutetodos maacutes usuales para la remocioacuten de Cr(VI) de los efluentes
industriales son los siguientes 1) reduccioacuten quiacutemica ndash precipitacioacuten en donde el Cr(VI)
es reducido quiacutemicamente a Cr(III) a pH aacutecido utilizando alguacuten agente reductor (por
ejemplo el bisulfito de sodio) y posteriormente se adiciona cal o alguacuten otro compuesto
alcalino para formar hidroacutexido de cromo (III) el cual es separado por sedimentacioacuten y
2) coagulacioacuten-floculacioacuten En general estos meacutetodos tienen algunas desventajas tales
como 1) son costosos ya que el agente activo no puede ser recuperado para su
posterior reutilizacioacuten 2) algunos reactivos quiacutemicos son sumamente toacutexicos 3) su
selectividad es baja 4) generan lodos quiacutemicos con altas concentraciones de metales los
cuales son difiacuteciles de tratar 5) la remocioacuten de los metales es incompleta principalmente
cuando la concentracioacuten de eacutestos en los efluentes es inferior a 100 mgL y 6) las aguas
residuales resultantes no satisfacen los criterios de calidad establecidos en la legislacioacuten
ambiental (Cantildeizares-Villanueva 2000 Ruiacutez 2000 Saxena y col 2000 Cheung y Gu
2003)
Algunas otras tecnologiacuteas que se utilizan ocasionalmente para la remocioacuten del Cr(VI) son
el intercambio ioacutenico la adsorcioacuten el tratamiento electroquiacutemico la oacutesmosis inversa y la
evaporacioacuten (Garbisu y col 1998 Camargo y col 2003 Kurniawan y col 2006) Las
principales desventajas de estos meacutetodos son los altos costos fijos de operacioacuten y de
mantenimiento por lo que su aplicacioacuten a grandes voluacutemenes de agua o su uso por
pequentildeas y medianas empresas estaacute muy limitado
14
La EPA recomienda los siguientes meacutetodos para la remocioacuten de cromo del agua potable
en caso de que eacutesta exceda el liacutemite permisible para este metal coagulacioacuten-filtracioacuten
intercambio ioacutenico y oacutesmosis inversa (httpepagov)
En Meacutexico en caso de que el agua destinada a uso y consumo humano exceda el liacutemite
permisible de cromo total la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-1994
(Secretariacutea de Salud Proyecto de Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-
127-SSA1-1994) indica como tratamientos a aplicar el intercambio ioacutenico o la oacutesmosis
inversa
152 Procesos biotecnoloacutegicos
En las uacuteltimas dos deacutecadas se han llevado a cabo estudios con el fin de utilizar
microorganismos y plantas para la restauracioacuten de sitios y para el tratamiento de
efluentes industriales contaminados con metales toacutexicos (Stephen y Macnaughton 1999
Lloyd 2003)
En la actualidad se considera que los procesos microbioloacutegicos son la alternativa maacutes
atractiva para remover algunos metales toacutexicos de los sitios y efluentes contaminados
ya que estos procesos son ―amigables con el medio ambiente los subproductos que
generan son usualmente inocuos son muy eficientes en la remocioacuten de los metales
(particularmente cuando las concentraciones de eacutestos son bajas condiciones en las que
algunos procesos fisicoquiacutemicos son muy ineficientes) y son de bajo costo (Cheung y
Gu 2005 Chardin y col 2002 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004)
15
Dentro de los procesos biotecnoloacutegicos propuestos para la remocioacuten de Cr(VI) se
encuentran la biosorcioacuten y la reduccioacuten bioloacutegica en los cuales se han utilizado
principalmente microorganismos (Volesky y Vieira 2000 Fruchter 2002 Cheung y Gu
2003)
En la biosorcioacuten se utilizan ciertos tipos de adsorbentes bioloacutegicos por ejemplo biomasa
microbiana (viva o inactivada en suspensioacuten o inmovilizada) con los que no se requiere
energiacutea metaboacutelica para retener pasivamente al cromo hexavalente mediante procesos
fiacutesicos (adsorcioacuten fiacutesica principalmente por fuerzas de van Der Waals) o quiacutemicos
(quimisorcioacuten) (Cantildeizares-Villanueva 2000 Volesky y Vieira 2000 Aravindhan y col
2004) En algunos casos se ha observado que el metal es transportado activamente al
interior de las ceacutelulas (a expensas de energiacutea metaboacutelica) proceso al que se le denomina
como bioacumulacioacuten
En la biorreduccioacuten o reduccioacuten bioloacutegica el cromo hexavalente es transformado a la
forma trivalente este uacuteltimo puede ser faacutecilmente precipitado en una etapa posterior de
tratamiento ajustando el pH del agua residual a un valor cercano al neutro para
removerlo finalmente por meacutetodos fiacutesicos (Chardin y col 2002 Cheung y Gu 2003) Se
considera que este proceso es una alternativa tecnoloacutegica potencial para el tratamiento
de suelos cuerpos de agua y efluentes industriales contaminados ya que la reduccioacuten
del Cr(VI) disminuye significativamente la toxicidad (100 veces) solubilidad en agua y
movilidad del metal a traveacutes del medio ambiente (Cheung y Gu 2003 Lloyd 2003
Wang 2000)
16
Se han aislado varios microorganismos que pueden reducir el Cr(VI) a Cr(III) ya sea
como cultivos puros (Horitsu y col 1987 Wang 2000 Pattanapipitpaisal y col 2001
Chardin y col 2002 Cheung y Gu 2003 Middleton y col 2003 Morales-Barrera
2005 Pal 1997 Muter y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004 Thacker y col
2006) o como cultivos mixtos (Smith y col 2002 Cheung y Gu 2003) Las fuentes de
aislamiento han sido muy diversas como por ejemplo efluentes de curtiduriacuteas de la
industria metaluacutergica de mantos freaacuteticos de aguas superficiales contaminadas de
sedimentos anoacutexicos en lagos de plantas de tratamiento de aguas residuales entre
otros (Horitsu y col 1987 Fujii y col 1990 Ganguli y Tripathi 1999 Badar y col
2000 Saxena y col 2000 Pattanapipitpaisal y col 2001 Middleton y col 2003
Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004 Zuacutentildeiga 2005 Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
Entre los geacuteneros microbianos que son capaces de reducir Cr(VI) se tienen los
siguientes Achromobacter Aeromonas Agrobacterium Bacillus Desulfovibrio
Escherichia Enterobacter Micrococcus Pseudomonas (Horitsu y col 1987 Wang
2000) Staphylococcus (Saxena y col 2000) Microbacterium (Pattanapipitpaisal y col
2001) Pyrobaculum Streptomyces Deinococcus (Chardin y col 2002)
Desulfomicrobium Desulfotomaculum Pantoea (Cheung y Gu 2003) Shewanella
(Middleton y col 2003) Trichoderma (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
Phanerochaete (Pal 1997) y Candida (Muter y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col
2004)
De los estudios reportados en la literatura acerca de la reduccioacuten microbioloacutegica del
Cr(VI) sobresalen tres hechos 1) Las bacterias han sido los microorganismos maacutes
ampliamente estudiados y es muy escasa la informacioacuten disponible sobre la capacidad de
17
reduccioacuten del metal de las levaduras y de los hongos filamentosos 2) la mayoriacutea de los
microorganismos ensayados soacutelo son capaces de tolerar y reducir muy bajas
concentraciones de Cr(VI) usualmente dentro del intervalo de 0001 a 05 mM esto
uacuteltimo se ha atribuido a los efectos toacutexicos y mutageacutenicos del metal y 3) casi todos los
estudios se han realizado en cultivo por lote
1521 Transporte del cromo al interior de las ceacutelulas
Tanto en organismos procariotes como en muchos eucariotes los oxianiones cromato y
dicromato (fuentes de cromo hexavalente) ingresan principalmente a las ceacutelulas a traveacutes
de las membranas citoplaacutesmicas mediante el sistema de transporte del sulfato (Badar y
col 2000) lo cual se ha atribuido a la similitud en la carga y estructura de estos iones
(Smith y Gadd 2000) Esto fue demostrado primeramente en Salmonella typhimurium y
posteriormente en otras bacterias tales como en Escherichia coli Pseudomonas
fluorescens y Alcaligenes eutrophus Se ha comprobado que esto mismo ocurre en
algunas levaduras tales como en Candida (Muter y col 2001 Cervantes y col 2001)
Sin embargo en general el cromato penetra al interior de las levaduras por medio de un
transportador anioacutenico no especiacutefico (Czakoacute-Veacuter y col 1999 Cervantes y col 2001)
En algunos microorganismos se ha demostrado que el sulfato inhibe competitivamente el
transporte del cromato al interior de las ceacutelulas (Ohtake y col 1987 Pepi y Baldi 1992)
y que esta inhibicioacuten es maacutes marcada en ceacutelulas anaerobias que en aerobias (Zakaria y
col 2006) Tambieacuten se ha reportado el transporte del cromato por la viacutea de los fosfatos
aunque la viacutea del sulfato es la maacutes utilizada (Ohtake y col 1987)
18
El transporte del cromato al interior de las plantas tambieacuten es a traveacutes del sistema del
ioacuten sulfato Ya en el interior de la planta el cromo hexavalente se acumula en diversos
oacuterganos en cantidades diferentes El cromo hexavalente se acumula de 10 a 100 veces
maacutes en las raiacuteces que en los retontildeos o en otros tejidos (Cervantes y col 2001)
En contraste las membranas celulares de los organismos son praacutecticamente
impermeables al cromo trivalente y a sus compuestos (Ksheminska y col 2006)
1522 Mecanismos microbianos de resistencia al Cr(VI) y de reduccioacuten del
Cr(VI)
Una caracteriacutestica importante que deben tener los microorganismos que se van a utilizar
en procesos de tratamiento de efluentes contaminados con cromo hexavalente es que
sean tolerantes (resistentes) a eacuteste Esta propiedad ha sido descrita en bacterias hongos
y levaduras (Horitsu y col 1987 Cervantes y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004)
Entre los mecanismos de resistencia al cromo hexavalente que se han encontrado se
tienen los siguientes
Acumulacioacuten del metal en la superficie o en el interior de las ceacutelulas (Volesky y Vieira
2000 Saxena y col 2000)
Disminucioacuten yo impedimento en el transporte del cromo hexavalente al interior de
las ceacutelulas (Pepi y Baldi 1992)
Excrecioacuten del metal del interior de la ceacutelula al medio circundante (Cervantes y col
2001)
Reacciones de oacutexido-reduccioacuten en las que el cromo hexavalente es reducido a cromo
trivalente el cual es menos toacutexico (Baldi y col 1990 Muter y col 2001)
19
La resistencia al cromo hexavalente puede estar codificada en el genoacuteforo de las
bacterias o en plaacutesmidos Esto uacuteltimo se ha encontrado en Pseudomonas aeruginosa P
fluorescens P putida y en Alcaligenes eutrophus (Baldi y col 1990 Ishibashi y col
1990 Cervantes y col 2001) Sin embargo la tolerancia al metal no implica
necesariamente que los microorganismos seraacuten capaces de removerlo por alguacuten
mecanismo
En el interior de las ceacutelulas bacterianas los iones cromato [CrO42-] pueden ser reducidos
a cromo trivalente por ciertas enzimas (Ishibashi y col 1990 Horitsu y col 1987) En
condiciones de aerobiosis se han identificado las siguientes proteiacutenas que parecen ser las
responsables de la reduccioacuten del Cr(VI) reductasas flavoproteiacutenas enzimas
dependientes de NADH y NAD(P)H (Ishibashi y col 1990) en cambio en condiciones de
anaerobiosis los estudios indican que ciertas hidrogenasas y citocromos son los
responsables (Chardin y col 2003 Cheung y Gu 2007)
El cromo hexavalente tambieacuten puede ser reducido por compuestos quiacutemicos reductores
que son producidos durante el crecimiento de los microorganismos (Desjardin y col
2003) tales como el glutatioacuten y la cisteiacutena los cuales pueden actuar dentro o fuera de
los organismos (Zakaria y col 2006) En organismos superiores se ha identificado al
ascorbato como agente reductor del cromo hexavalente (Ksheminska y col 2006)
Casi no hay informacioacuten sobre el mecanismo responsable de la reduccioacuten del Cr(VI) en
ceacutelulas eucariotas especiacuteficamente en levaduras Con la finalidad de dilucidar dicho
20
mecanismo se han realizado estudios en los que se ha modificado la resistencia de las
levaduras al Cr(VI) o se ha inactivado alguna enzima en particular
En un trabajo llevado a cabo con algunas levaduras no convencionales se encontroacute que
algunas de eacutestas durante su crecimiento excretaron sustancias reductoras asiacute como
sustancias quelantes que formaron complejos con el cromo trivalente que fue generado
durante la transformacioacuten del cromo hexavalente (Ksheminska y col 2006)
1523 Factores que afectan la reduccioacuten bioloacutegica del Cr(VI)
En algunos microorganismos se ha estudiado el efecto que tienen las variables
ambientales tales como condiciones de aerobiosis yo de anaerobiosis donadores y
aceptores finales de electrones concentracioacuten de cromo hexavalente y potencial de
oacutexido-reduccioacuten entre algunas otras sobre la reduccioacuten del metal (Shen y Wang 1995
Shakoori y col 2000 Wang 2000 Smith y col 2002 Wang y Xiao 1995 Fujii y col
1990 Muter y col 2001 Smith y Gadd 2000 Lloyd 2003 Jianlong y col 2004
Viamajala y col 2004)
La reduccioacuten del Cr(VI) puede realizarse en ambiente aerobio yo anaerobio En
organismos aerobios y anaerobios facultativos se ha investigado el efecto del oxiacutegeno
disuelto en el medio sobre la reduccioacuten del metal (Wang 2000) Se ha encontrado que
la sensibilidad del proceso de reduccioacuten del Cr(VI) a la tensioacuten de oxiacutegeno es diferente
para cada microorganismo En cultivos de Enterobacter cloacae HO1 concentraciones
iniciales de oxiacutegeno mayores a 45 ppm inhibieron fuertemente la reduccioacuten del Cr(VI)
(Komori y col 1989) mientras que la reduccioacuten del metal fue maacutes lenta en condiciones
21
de anaerobiosis que en aerobiosis en el caso de Thiobacillus ferrooxidans (QuiIntana y
col 2001)
Asimismo se ha investigado el efecto de algunos iones sobre la reduccioacuten bioloacutegica del
Cr(VI) Con respecto al sulfato [SO42-] existe una analogiacutea estructural y de carga entre
este anioacuten [SO42-] y el ioacuten cromato [CrO4
2-] por lo que puede establecerse una
competencia entre ellos por los transportadores de sulfato existentes en las ceacutelulas
influyendo asiacute en la reduccioacuten del cromo hexavalente (Smith y Gadd 2000)
En cultivos aerobios no se ha reportado inhibicioacuten por sulfato en la reduccioacuten del cromo
hexavalente (Wang y Xiao 1995 Ishibashi y col 1990 Wang 2000) En contraste se
ha informado que en cultivos anaerobios el sulfato afecta la reduccioacuten del Cr(VI) debido
a que este anioacuten compite con el cromato como aceptor final de electrones (Garbisu y
col 1998)
Por otro lado en un estudio realizado con varios geacuteneros de levadura (Pichia Candida
Debaryomyces Saccharomyces Schwanniomyces Cryptococcus Hansenula) que tienen
capacidad para acumular cromo se encontroacute que el sulfato afectoacute la tolerancia de las
levaduras al Cr(VI) siendo mayor o menor el efecto en funcioacuten de la levadura en estudio
(Kaszycki y col 2003)
Otros iones que se han investigado son el Mg2+ Mn2+ Ca2+ y el Fe En cultivos con
ceacutelulas pasivas (resting cells) de Agrobacterium radiobacter se encontroacute que debe
controlarse principalmente la cantidad de fierro para incrementar la capacidad de
reduccioacuten del microorganismo (Llovera y col 1993)
22
Los donadores de electrones que se han utilizado principalmente en los estudios de
reduccioacuten del Cr(VI) son compuestos alifaacuteticos y aromaacuteticos carbohidratos de bajo peso
molecular aminoaacutecidos y aacutecidos orgaacutenicos (Wang y Xiao 1995 Wang 2000 Smith y
col 2002 Ksheminska y col 2006) El descubrimiento de microorganismos que son
capaces de reducir el cromo hexavalente utilizando una amplia variedad de fuentes de
carbono y energiacutea favorece su uso en procesos de remediacioacuten in situ (Smith y col
2002)
Para la reduccioacuten del cromo hexavalente es conveniente conocer el pH y la temperatura
oacuteptimos para el crecimiento de los microorganismos (Wang 2000 Shakoori y col 2000
Camargo y col 2002 Faisal y Hasnain 2004) En cultivos de Streptomyces griseus se
estudioacute la reduccioacuten del Cr(VI) en el intervalo de valores de pH de 4 a 8 y de
temperatura de 28 a 50 degC obtenieacutendose la mayor reduccioacuten a un pH de 6-7 y a una
temperatura de 28 degC (Laxman y More 2002)
En cultivos de Ochrobactrum sp se trabajoacute en el intervalo de temperatura de 30 a 45 degC
y de pH de 6 a 8 obtenieacutendose la mayor reduccioacuten del Cr(VI) y el crecimiento celular
maacutes alto a 35 degC y a un pH de 7 (Thacker y Madamwar 2005) En estudios realizados
con Escherichia coli ATCC 33456 se ensayoacute la reduccioacuten del Cr(VI) en el intervalo de
valores de pH de 3-8 y de temperatura de 40-60 degC encontraacutendose que el pH y la
temperatura de incubacioacuten oacuteptimos fueron de 7 y 37 degC respectivamente (Bae y col
2000)
Se ha observado que la concentracioacuten inicial de Cr(VI) influye en la velocidad de
reduccioacuten del metal (Wang 2000) La velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) exhibida por los
23
cultivos de Bacillus sp Pseudomonas fluorescens LB300 (Wang y Xiao 1995)
Ochrobactrum sp (Thacker y Madamwar 2005) y de Candida sp LBM2 (Juvera-Espinosa
y col 2006) se incrementoacute conforme aumentoacute la concentracioacuten inicial de Cr(VI) En
contraste la velocidad de reduccioacuten de Bacillus sp Arthrobacter sp (Megharaj y col
2003) y de Trichoderma viride (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006) disminuyoacute al
incrementar la concentracioacuten inicial de cromo hexavalente
Para obtener una reduccioacuten importante del Cr(VI) se requieren altas concentraciones de
biomasa (Wang 2000) La concentracioacuten inicial de biomasa tiene efecto sobre la
velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) de Bacillus sp y Pseudomonas fluorescens LB300 ya
que eacutesta aumentoacute al haber mayor cantidad de biomasa inicial (Wang y Xiao 1995) Este
mismo efecto se observoacute en cultivos de una cepa bacteriana gram positiva a la que se le
denominoacute como cepa ATCC 700729 (Shakoori y col 2000)
El potencial redox se ha medido en algunos estudios realizados con diferentes
microorganismos y condiciones de cultivo para determinar su efecto sobre la reduccioacuten
del Cr(VI) (Komori y col 1989 Turick y col 1996 McLean y Beveridge 2001) sin
embargo no se ha reportado un intervalo oacuteptimo de potencial redox para llevar a cabo la
reduccioacuten del Cr(VI) a su forma menos toacutexica (Wang 2000)
En algunos estudios se ha evaluado la influencia de algunos metales (Mn Ni Zn Pb Cu
Co As Se y Hg) sobre la reduccioacuten del Cr(VI) ya que las cepas microbianas que sean
resistentes a uno o varios metales y que sean capaces de reducir el Cr(VI) seriacutean de gran
utilidad en la biorremediacioacuten de efluentes industriales (Faisal y Hasnain 2004 Cheung
y Gu 2005 Thacker y col 2006) En estudios con Escherichia coli ATCC 33456 se
24
investigoacute el efecto de varios iones (Hg2+ Ag2+ Mn2+ Zn2+ Pb2+ Cd2+ Ca2+ y Mg2+) que
pueden estar presentes junto con el Cr(VI) en efluentes industriales Con el magnesio
se observoacute un ligero aumento en la actividad reductora del microorganismo mientras
que con el mercurio se inhibioacute por completo su capacidad de reduccioacuten (Bae y col
2000)
En el caso particular de microorganismos filamentosos los esfuerzos de corte pueden
causar dantildeo fiacutesico a las ceacutelulas y como consecuencia afectar su capacidad de reduccioacuten
de Cr(VI) En cultivos de Trichoderma viride realizados en matraz y en un reactor
agitado mecaacutenicamente con un impulsor se observoacute que los micelios eran de menor
tamantildeo cuando el hongo se cultivaba en el reactor Asimismo el incremento celular y la
eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidos en matraz fueron superiores a los alcanzados
en el reactor agitado con un impulsor Estos resultados sugirieron que las fuerzas de
cizalla creadas por el impulsor fragmentan el micelio y afectan la viabilidad celular y la
capacidad de reduccioacuten del microorganismo (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
16 Sistemas de reaccioacuten
En la mayoriacutea de los estudios sobre reduccioacuten de Cr(VI) el sistema de reaccioacuten que maacutes
se ha empleado es el cultivo por lote Este sistema es ampliamente utilizado en procesos
biotecnoloacutegicos para la produccioacuten de biomasa y de metabolitos de intereacutes industrial La
duracioacuten de este tipo de cultivo depende del tamantildeo del inoacuteculo de las condiciones
ambientales como el pH los componentes del medio de cultivo y la temperatura
Aunque su operacioacuten es sencilla ofrece pocas opciones de control de las variables
intensivas de intereacutes (concentracioacuten de biomasa sustrato producto) en comparacioacuten
con otros sistemas de reaccioacuten
25
(httpfaiunneeduarbiologiamicroindcultivo20y20biorreactoreshtm) Asimismo
despueacutes de un cultivo por lote se requiere de un periodo para la descarga limpieza y
esterilizacioacuten del equipo asiacute como para el arranque de un nuevo cultivo por lote lo que
disminuye la productividad global del proceso (Wang y col 1979)
Pocos son los estudios relacionados con la reduccioacuten del Cr(VI) en los que se ha
trabajado con otros sistemas de reaccioacuten tales como con el cultivo continuo (DeLeo y
Ehrlich 1994 Bhide y col 1996 Chirwa y Wang 1997 Bae y col 2000) y el cultivo
por lote alimentado o fed-batch (Fujii y col 1990 Fujie y col 1996)
El cultivo continuo permite alcanzar un estado estacionario independiente del tiempo en
el que los microorganismos presentan un crecimiento consumo de sustrato y produccioacuten
constantes por lo que es posible obtener una alta productividad o velocidad volumeacutetrica
(httpuserpagesumbcedu gferre1bmcohtml) En este sistema es posible controlar
la cantidad de biomasa utilizando un uacutenico nutriente limitante del crecimiento (Wang y
col 1979)
A pesar de que el cultivo continuo tiene la desventaja de ser susceptible de contaminarse
debido a los periodos prolongados de operacioacuten (Stanbury 1984) en estudios con Cr(VI)
se minimizariacutea lo anterior ya que este estado de oxidacioacuten del cromo es altamente toacutexico
para la mayoriacutea de los microorganismos auacuten a bajas concentraciones
El cultivo por lote alimentado se utiliza industrialmente para la produccioacuten de varios
productos bioloacutegicos de intereacutes (enzimas antibioacuteticos vitaminas aminoaacutecidos entre
otros) El sistema es uacutetil para obtener una alta concentracioacuten de metabolitos asociados
26
al crecimiento ya que es posible alcanzar una alta concentracioacuten de biomasa aunque
tambieacuten se emplea para la produccioacuten de compuestos no asociados al crecimiento como
por ejemplo de algunos antibioacuteticos Su uso tambieacuten se recomienda cuando se trabaja
con compuestos toacutexicos o de muy baja solubilidad y no requiere mayor equipo que el
utilizado en un cultivo por lote (httpuserpagesumbcedu gferre1fedbatchhtml)
Otras ventajas de este sistema son 1) los tiempos totales del proceso fermentativo son
menores y no requiere de un nuevo inoacuteculo cada vez que se repite el ciclo en
comparacioacuten con un cultivo por lote y 2) menor riesgo de contaminacioacuten que el cultivo
continuo (Roukas 1993)
27
2 OBJETIVOS
21 Objetivos generales
1) Determinar el efecto del ioacuten sulfato sobre el crecimiento celular consumo de glucosa y
reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
2) Realizar el estudio cineacutetico del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de
Cr(VI) de Candida sp en sistemas por lote y lote repetido en un reactor airlift
3) Seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten del Cr(VI) por
Candida sp
22 Objetivos especiacuteficos
a) Determinar el efecto de la concentracioacuten de sulfato de amonio sobre el crecimiento
celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
b) Evaluar el crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote y lote repetido
c) Realizar el estudio cineacutetico del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa
d) Evaluar el crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote alimentado repetido
e) Seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes conveniente para la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp
28
3 MATERIAL Y MEacuteTODOS
31 Microorganismo
Para el desarrollo del presente trabajo se utilizoacute una levadura que se aisloacute a partir del
agua residual de una industria curtidora de pieles que se encuentra ubicada en la Ciudad
de Leoacuten Guanajuato Mediante teacutecnicas morfoloacutegicas y bioquiacutemicas que fueron
realizadas en el Laboratorio de Micologiacutea de la Facultad de Medicina de la UNAM asiacute
como por teacutecnicas de biologiacutea molecular que fueron llevadas a cabo en el Laboratorio de
Microbiologiacutea General de la Escuela Nacional de Ciencias Bioloacutegicas se determinoacute que la
levadura pertenece al geacutenero Candida La amplificacioacuten y secuenciacioacuten del dominio
D1D2 del gen 26S rDNA de la levadura aislada reveloacute que estaacute relacionada con Candida
petrohuensis (GenBank accession number U45819) Candida acudensis (GenBank
accession number U45810) y Candida drimydis (GenBank accession number U45815)
con un nivel de confidencia del 896 La baja similitud de las secuencias parciales
conocidas del gen 26S rDNA y la de la cepa de levadura empleada en este trabajo podriacutea
sugerir que es una cepa no identificada no registrada en el GenBank por lo que se le
denominoacute como Candida sp La relacioacuten filogeneacutetica de la cepa de Candida usada en este
estudio y la de otras especies de levadura se muestra en la figura 1
29
Figura 1 Relaciones filogeneacuteticas de la levadura
AJ508572Cmucifera
AB041003Candida
AB041006Cmucifera
AB041005Stephanoascus
U45822Cchiropterorum
U40103Arxula
U40094Arxula
AY283605Sympodiomyces
AF017247Trichomonascus
U40110Blastobotrys
AY442294Sympodiomyces
U40096Sympodiomyces
AY559042Cmokoenaii
FGSFEP
U45819Cpetrohuensis
U45810Cancudensis
U45815Cdrimydis
U45806Cbondarzewiae
U45816Ctepae
U45812Candida
U45812Cantillancae
U45811Csantjacobensis
U76531Stephanoascus
AB196536Stephanoascus
U70245Cedax
AF017236Cbertae
U45835Cvaldiviana
AY618511Cnovakii
U45807Ccastrensis
U45826Cpaludigena
AF294910Cbituminiphila
U45829Pichia
U84241Zygozyma
U76350Myxozyma
U76527Lipomyces
U45804Debaryomyces
U75524Pichia
U68552Saccharomyces
AY545582Naumovia
AY007888Saccharomyces 100 100
43 100
100
100
43 100
100
72
100
86
95
95
100
91
58 69
99
98
84
92
60
63
54
40
56
37
49
21
39
61
16
002
30
32 Propagacioacuten del inoacuteculo
La composicioacuten quiacutemica del medio de cultivo basal que se utilizoacute en este trabajo para la
propagacioacuten del inoacuteculo y para los experimentos de remocioacuten de Cr(VI) en diferentes
sistemas de reaccioacuten los cuales fueron realizados en un reactor neumaacutetico se muestra
en la tabla 5
Tabla 5 Composicioacuten quiacutemica del medio de cultivo
Compuesto Concentracioacuten
(gL)
Glucosa 100
(NH4)2SO4 30
KH2PO4 10
MgSO4 7H2O 03
KCl 01
Extracto de levadura 01
CaCl2 005
FeCl3 0001
Para los experimentos en los que se determinoacute el efecto del sulfato sobre la tolerancia de
Candida sp al Cr(VI) y la reduccioacuten del mismo el inoacuteculo se propagoacute en el mismo medio
de cultivo pero el (NH4)2SO4 se reemplazoacute por NH4Cl (243 gL) y el MgSO47H2O por
MgCl26H2O (0247 gL)
31
El pH inicial de los medios de cultivo fue de aproximadamente 60 A matraces
Erlenmeyer de 1000 mL que conteniacutean 200 mL de medio de cultivo se les adicionoacute una
asada de Candida sp y posteriormente se incuboacute con agitacioacuten constante a 28-30 ordmC
durante 42 h A continuacioacuten la biomasa se separoacute por centrifugacioacuten a 1500 rpm a
4 degC durante 15 min bajo condiciones de asepsia El paquete celular resultante se lavoacute
dos veces con agua destilada esteacuteril para eliminar los componentes del medio de cultivo
y los residuos celulares El paquete celular se resuspendioacute en un pequentildeo volumen de
agua destilada esteacuteril y se homogeneizoacute La suspensioacuten celular resultante se utilizoacute como
inoacuteculo para los experimentos realizados en este trabajo
Para la conservacioacuten de la levadura se usaron viales con medio inclinado de YPG
(glucosa 2 peptona de caseiacutena 1 extracto de levadura 1 y agar bacterioloacutegico
2) los cuales se mantuvieron en refrigeracioacuten a 4 degC Las resiembras se realizaron
cada dos meses
33 Reactores airlift
Se utilizoacute un contactor gas-liacutequido (reactor agitado neumaacuteticamente) del tipo airlift con
tubo conceacutentrico (figuras 2a y 2b) con un volumen total de 52 litros y un posible
volumen de operacioacuten de 42 litros para realizar los estudios de remocioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en sistemas por lote lote repetido lote alimentado y lote alimentado
repetido El reactor estaacute hecho de vidrio Pyrex y consta de una base columna y una
tapa Entre la base y la columna asiacute como entre la columna y la tapa se colocaron
empaques de neopreno para evitar el contacto vidrio-vidrio asiacute como para evitar fugas
de aire yo de medio de cultivo Las secciones se unieron mediante bridas de Nylamid La
32
base del reactor tiene un difusor del tipo placa plana de vidrio poroso para el suministro
de aire
33
Oliva para
toma de muestra
Aire
Tubo conceacutentrico (liso con
perforaciones de
malla)
Filtro de aire
Venteo
Difusor de vidrio poroso(poro fino)
Difusor de vidrio
poroso (poro fino)
Aire
50deg
4
65
3 m
m
77 mm
11
5
mm
128 mm
88 mm
15
mm
70 mm
4
50
3 m
m
Figuras 2a y 2b Reactor del tipo airlift con tubo conceacutentrico
34
En el interior del reactor se colocoacute un tubo conceacutentrico liso (sin perforaciones) de vidrio
Pyrex un tubo conceacutentrico de vidrio Pyrex con perforaciones circulares (4 mm de
diaacutemetro) o un tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable No 316 (grado
alimentario nuacutemero de malla = 20 abertura = 3344 mm) los cuales tienen la misma
longitud y diaacutemetro El tipo de tubo que se utilizoacute para los experimentos de reduccioacuten
del Cr(VI) dependioacute del sistema de reaccioacuten que se ensayoacute el tubo conceacutentrico liso se
utilizoacute para llevar a cabo experimentos en cultivos por lote y lote repetido el tubo
conceacutentrico con perforaciones se empleoacute para realizar cultivos por lote lote alimentado y
lote alimentado repetido y el tubo de malla metaacutelica se usoacute para cultivos por lote
Para el cultivo continuo de una etapa se utilizoacute un reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
con un volumen total de 650 mL y un posible volumen de operacioacuten de 550 mL el cual
tiene las mismas relaciones geomeacutetricas que el reactor antes mencionado
En todos los sistemas de reaccioacuten ensayados se suministroacute aire en el interior del tubo
conceacutentrico El aire de entrada se controloacute mediante una vaacutelvula reguladora de presioacuten y
su velocidad de flujo se midioacute con un rotaacutemetro
34 Meacutetodos experimentales
341 Efecto de la concentracioacuten de sulfato sobre el crecimiento celular
consumo de glucosa remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp
Se evaluoacute el efecto de la concentracioacuten de sulfato sobre el crecimiento celular consumo
de glucosa remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivos por lote a
nivel matraz Para estos experimentos parte o todo del (NH4)2SO4 y del MgSO4 7H2O del
medio de cultivo basal (tabla 5) se reemplazoacute con NH4Cl y MgCl26H2O respectivamente
35
a fin de mantener las mismas concentraciones iniciales de nitroacutegeno (454 mM) y de
magnesio (1217 mM) en todos los medios de cultivo ensayados
Se prepararon tres series de matraces Erlenmeyer de 500 mL que conteniacutean 135 mL de
medio de cultivo con diferentes concentraciones iniciales de sulfato Las
concentraciones de sulfato ensayadas fueron las siguientes 00 1217 25 50 100
150 200 y 2392 mM (esta uacuteltima concentracioacuten corresponde a la del ioacuten sulfato
presente en el medio de cultivo basal) Estas concentraciones no incluyen la cantidad de
sulfato proporcionado por algunos otros componentes del medio de cultivo (provenientes
del extracto de levadura yo de sales inorgaacutenicas) ya que el Laboratorio Central de
Instrumentacioacuten del Departamento de Biofiacutesica de la Escuela Nacional de Ciencias
Bioloacutegicas IPN determinoacute que la concentracioacuten de este ioacuten en el medio de cultivo que
conteniacutea cloruro de amonio y cloruro de magnesio como uacutenicas fuentes de nitroacutegeno
inorgaacutenico y de magnesio respectivamente era de 23 mgL (002 mM) A este uacuteltimo
medio de cultivo es al que se le denominoacute en el presente trabajo como ―0 mM de ioacuten
sulfato Para la cuantificacioacuten del ioacuten sulfato se utilizoacute el meacutetodo recomendado por la
Norma Oficial Mexicana NMX-AA-74-1981 (Secretariacutea de Comercio y Fomento Industrial
1981) El pH inicial de todos los medios de cultivo ensayados fue de aproximadamente
60
A una serie de matraces con medio de cultivo no se le adicionoacute Cr(VI) con la finalidad de
determinar el efecto del sulfato sobre el crecimiento celular y consumo de glucosa por la
levadura en ausencia del metal (cultivos control) A los matraces de la segunda y tercera
serie se les adicionoacute un determinado volumen de una solucioacuten stock esteacuteril de cromato
de potasio (20 gL) para obtener concentraciones iniciales de Cr(VI) de 17 y 33 mM
36
respectivamente Los matraces fueron inoculados con un determinado volumen de
suspensioacuten celular concentrada a fin de que la concentracioacuten inicial de biomasa de todos
los cultivos fuera de aproximadamente 1 mgmL Los matraces se colocaron en un bantildeo
metaboacutelico con agitacioacuten constante a 28-30 degC Se recolectaron muestras a diferentes
tiempos de incubacioacuten a las que se les determinoacute la concentracioacuten de biomasa glucosa
Cr(VI) y cromo total residual asiacute como el pH
342 Controles abioacuteticos
Se utilizaron controles libres de ceacutelulas con el propoacutesito de determinar si el Cr(VI) era
reducido abioacuteticamente a Cr(III) por los componentes del medio de cultivo
Durante los experimentos de remocioacuten de Cr(VI) con ceacutelulas viables (cultivos problema)
se observoacute que el pH de los medios de cultivo disminuyoacute desde aproximadamente 6
hasta 25-42 dependiendo de la concentracioacuten de sulfato y de cromo utilizada Como
se sabe que los pHrsquos bajos favorecen que la materia orgaacutenica (donadores de electrones)
reduzca el Cr(VI) a Cr(III) en este trabajo se llevaron a cabo experimentos sin biomasa
de Candida sp (controles libres de ceacutelulas) a distintos valores de pH (25 3 4 5 y 6) y
a las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas (17 y 33 mM) para determinar
el grado de reduccioacuten causado por los constituyentes del medio de cultivo
Como controles libres de ceacutelulas se utilizaron matraces Erlenmeyer que conteniacutean medio
de cultivo a los que se les adicionoacute un volumen determinado de una solucioacuten stock
esteacuteril de cromato de potasio (20 gL) para obtener concentraciones iniciales de Cr(VI)
de 17 y 33 mM A continuacioacuten se ajustoacute el pH del medio de cultivo a alguno de los
37
valores antes mencionados La adicioacuten de la solucioacuten stock esteacuteril de cromato de potasio
y el ajuste del pH se realizoacute en condiciones de asepsia
Los controles abioacuteticos se incubaron a las mismas condiciones que los matraces
problema Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se les
determinoacute la concentracioacuten de Cr(VI)
343 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa
remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivo por lote en un
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Se realizoacute la evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa remocioacuten
de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso (sin perforaciones) El cultivo por lote se llevoacute a cabo con 4 litros de
medio de cultivo basal con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM [igual a 78
mgL de Cr(VI)] y con un pH inicial de aproximadamente 60 El reactor se inoculoacute con
un volumen determinado de suspensioacuten celular concentrada para obtener una
concentracioacuten inicial de biomasa cercana a 12 mgmL Se suministroacute aire con un flujo
volumeacutetrico de 4 litrosmin equivalente a 1 vvm (vvm = volumen de aire por volumen
de medio de cultivo por minuto)
El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que el nivel de Cr(VI) residual fue
despreciable Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se
les determinoacute la concentracioacuten de biomasa de glucosa Cr(VI) y cromo total residual asiacute
como el pH
38
344 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote repetido en un reactor
airlift con tubo conceacutentrico liso
Los sistemas por lote repetido se iniciaron con un cultivo por lote Cuando se alcanzaron
niveles bajos de Cr(VI) residual en el primer cultivo por lote se procedioacute a recolectar un
determinado volumen de medio y se reemplazoacute con medio fresco que teniacutea una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM A continuacioacuten el sistema se operoacute nuevamente por
lote (segundo cultivo por lote o cultivo por lote repetido) hasta que ya no se detectaron
variaciones considerables en la concentracioacuten de Cr(VI) residual
Se ensayaron tres diferentes relaciones de recambio de medio de cultivo (f = volumen de
medio recolectadovolumen inicial de medio liacutequido en el reactor) las cuales fueron de
04 06 y 08 Para las dos uacuteltimas relaciones se realizaron experimentos sin ajustar el
pH del medio al inicio del segundo cultivo por lote (lote repetido) asiacute como ajustando el
pH a 60 Para la primera relacioacuten (f = 04) soacutelo se realizoacute el experimento sin ajustar el
pH del medio al inicio del cultivo por lote repetido ya que los experimentos realizados a
las relaciones de recambio de 06 y 08 mostraron que la eficiencia y velocidad de
reduccioacuten de Cr(VI) de los cultivos por lote repetido eran mayores cuando no se ajustaba
el pH
Durante los cultivos por lote repetido se recolectaron muestras a diferentes tiempos de
incubacioacuten a las cuales se les determinoacute la concentracioacuten de biomasa glucosa Cr(VI) y
el pH Con los datos obtenidos se estimaron algunas variables cineacuteticas que se utilizaron
para seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para los fines que se persiguen en
este trabajo
39
345 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa en un
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Para el cultivo continuo de una etapa se utilizoacute un biorreactor airlift con tubo conceacutentrico
liso con un volumen de operacioacuten de 500 mL Al reactor se le suministroacute continuamente
medio de cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM por medio de una
bomba peristaacuteltica Se ensayaron dos flujos volumeacutetricos de medio de cultivo de 378 y
50 mLh que corresponden a velocidades de dilucioacuten de 00076 h-1 y de 00100 h-1
respectivamente
Con los datos obtenidos a la velocidad de dilucioacuten de 00076 h-1 se estimoacute la velocidad
volumeacutetrica global y la eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) las cuales se utilizaron
para seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp
346 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular y la remocioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo conceacutentrico de
malla de acero inoxidable y de vidrio perforado
Se realizaron cultivos por lote en el reactor airlift en el cual se colocoacute un tubo conceacutentrico
de malla de acero inoxidable No 316 (grado alimentario calibre No 20 abertura =
3344 mm) o un tubo conceacutentrico de vidrio con perforaciones circulares de
aproximadamente 4 mm de diaacutemetro Al reactor se le adicionaron 4 litros de medio de
cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM [igual a 78 mgL de Cr(VI)] y
un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada para obtener una
40
concentracioacuten inicial de biomasa de aproximadamente 12 mgmL El pH inicial del medio
fue de aproximadamente 60 Se ensayaron dos flujos de aire de 05 y 1 vvm
El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que el nivel de Cr(VI) residual fue bajo Se
recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se les determinoacute la
concentracioacuten de biomasa y de Cr(VI) residual Con los datos obtenidos se estimaron
algunas variables cineacuteticas que sirvieron como criterio de seleccioacuten para determinar el
tubo conceacutentrico maacutes adecuado para llevar a cabo los cultivos por lote alimentado y lote
alimentado repetido
347 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote
alimentado repetido en un reactor airlift
Para los cultivos por lote alimentado y lote alimentado repetido se utilizoacute el reactor airlift
con el tubo conceacutentrico seleccionado previamente Los cultivos por lote alimentado se
iniciaron con un cultivo por lote utilizando las condiciones iniciales mencionadas en el
inciso 446 y una aireacioacuten de 05 vvm El cultivo por lote se mantuvo en operacioacuten
hasta que la concentracioacuten de Cr(VI) residual fue baja
A continuacioacuten el reactor se drenoacute hasta alcanzar un volumen de liacutequido en el reactor de
25 litros y se inicioacute el suministro continuo de medio de alimentacioacuten con una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM La alimentacioacuten se mantuvo hasta que se alcanzoacute un
volumen de medio liacutequido en el reactor de 37 litros (primer cultivo por lote alimentado)
41
Posteriormente el reactor se volvioacute a drenar hasta obtener un volumen de medio de 25
litros y enseguida se volvioacute a suministrar continuamente medio de cultivo basal con una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM utilizando el mismo flujo de alimentacioacuten que para el
primer cultivo por lote alimentado El suministro de medio se mantuvo hasta alcanzar un
volumen de liacutequido en el reactor de 375-40 litros (segundo cultivo por lote alimentado o
cultivo por lote alimentado repetido)
Se ensayaron dos flujos de alimentacioacuten de 659 y 1343 mLh que representan cargas
maacutesicas de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh
Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las cuales se les
determinoacute la concentracioacuten de biomasa de glucosa y Cr(VI) residual asiacute como el pH
Con los datos obtenidos se estimaron las velocidades volumeacutetricas globales y las
eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI)
35 Meacutetodos analiacuteticos
351 Determinacioacuten de la concentracioacuten de biomasa
La concentracioacuten celular se determinoacute mediante el peso seco de la masa celular Las
muestras recolectadas se filtraron a traveacutes de membranas de fibra de vidrio (Whatman
GFA) con un diaacutemetro de poro de 16 m las cuales se colocaron previamente puestas a
peso constante Posteriormente las membranas se colocaron en una estufa a 95 degC
hasta alcanzar un peso constante Los filtrados se utilizaron para determinar la
concentracioacuten de glucosa Cr(VI) y cromo total residual asiacute como el pH
352 Determinacioacuten de la concentracioacuten de glucosa
42
Se determinoacute mediante un meacutetodo enzimaacutetico empleando a la glucosa oxidasa y
peroxidasa (Worthington Biochemical Corporation 1972)
Principio El meacutetodo se basa en que la glucosa es oxidada a aacutecido glucoacutenico por la
glucosa oxidasa la cual cataliza la siguiente reaccioacuten
-D-glucosa + H2O + O2 Aacutecido D-glucoacutenico + H2O2
El peroacutexido de hidroacutegeno generado reacciona con el sistema peroxidasa - orto-
dianisidina dando como resultado la oxidacioacuten de la orto-dianisidina y la produccioacuten de
agua de acuerdo con la siguiente reaccioacuten
H2O2 + orto-dianisidina (reducida) ortondashdianisidina (oxidada) + H2O
peroxidasa
La orto-dianisidina oxidada presenta un color pardo que en medio aacutecido vira a color
rosa la cual se lee a una longitud de onda de 540 nm (figura 3)
Figura 3 Orto-dianisidina (33rsquo ndash dimetoxidibencidina)
H2N NH2
OCH3
OCH3
43
353 Determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo hexavalente
La concentracioacuten de cromo hexavalente se determinoacute por la teacutecnica de la 15-
difenilcarbohidrazida siguiendo los procedimientos descritos en el meacutetodo 8023 del Hach
Water Analysis Handbook (2002) Este meacutetodo estaacute aprobado por la EPA (Environmental
Protection Agency) (Hach 2002) y por la Norma Oficial Mexicana NMX-AA-044-SCFI-
2001 (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NMX-AA-044-SCFI-
2001)
Principio Se utilizoacute un reactivo en polvo llamado ChromaVer3 el cual contiene una
solucioacuten buffer aacutecida combinada con la 15-difenilcarbohidrazida Este uacuteltimo compuesto
reacciona con el cromo hexavalente dando un compuesto de color puacuterpura (figura 4) El
meacutetodo es aplicable para el agua ya sea fresca o de muestras de agua residual La
intensidad del color es ldirectamente proporcional a la concentracioacuten de cromo
hexavalente presente
Figura 4 Reaccioacuten de la 15-difenilcarbohidrazida con el cromo hexavalente
+ Cr 6+
Compuesto colorido
puacuterpura
N N
Cr O
C R
O
N N
H H
C R
15-difenilcarbohidrazida
2 N N N
H H
N C
H O
H
44
354 Determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo total
La determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo total de los filtrados de las muestras
recolectadas (cromo total en solucioacuten) se realizoacute por espectroscopiacutea de absorcioacuten
atoacutemica con flama de acetileno-aire (SpectrAA220 FS Varian Inc)
Para determinar la cantidad de cromo retenido por la biomasa de Candida sp las ceacutelulas
fueron lavadas con agua desionizada deshidratadas y posteriormente fueron digeridas
con aacutecido niacutetrico concentrado La solucioacuten obtenida se enfrioacute a temperatura ambiente y
se le adicionoacute agua desionizada hasta obtener un volumen final de 50 mL Este
procedimiento estaacute descrito en la Norma Oficial Mexicana NMX-AA-051-SCFI-2001
(Secretariacutea de Economiacutea 2001) La concentracioacuten de cromo total de la solucioacuten
resultante se determinoacute en un espectrofotoacutemetro de absorcioacuten atoacutemica con un horno de
grafito (SpectrAA220 FS Varian Inc)
355 Determinacioacuten del pH
Se realizoacute con un potencioacutemetro marca Oakton
45
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Meta No 1 Determinar el efecto del ioacuten sulfato sobre la reduccioacuten
de Cr(VI)
41 Efecto del sulfato sobre el crecimiento celular consumo de glucosa
remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp
411 Evaluacioacuten de la influencia del sulfato sobre el crecimiento celular de
Candida sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
Se determinoacute el efecto de ocho concentraciones diferentes de sulfato (00 1217 25
50 100 150 200 y 2392 mM) sobre el crecimiento celular de Candida sp cuando
eacutesta se cultivoacute por lote a nivel matraz en medios de cultivo sin Cr(VI) y con
concentraciones iniciales del metal de 17 y 33 mM Para visualizar mejor el efecto las
curvas de crecimiento celular se construyeron utilizando la relacioacuten xxo (x =
concentracioacuten celular a un determinado tiempo de incubacioacuten xo = concentracioacuten inicial
de biomasa) como variable dependiente y el tiempo de incubacioacuten (t) como variable
independiente (graacuteficas de xxo vs t) En cada una de las curvas de crecimiento se trazoacute
una liacutenea horizontal a una relacioacuten xxo de 10 para observar si ocurriacutea crecimiento o
lisis celular
En la figura 5 se muestran las curvas de crecimiento celular de Candida sp cuando eacutesta
se cultivoacute en medios de cultivo con diferentes concentraciones de sulfato y sin Cr(VI) Se
observa que el crecimiento de Candida sp fue muy semejante a las diferentes
concentraciones de sulfato ensayadas La levadura fue capaz de crecer en el medio de
cultivo al que no se le adicionoacute sulfato de amonio y sulfato de magnesio (0 mM de
46
SO42-) lo cual sugiere que la cantidad de sulfato proporcionado por otros componentes
del medio de cultivo ndash por ejemplo provenientes del extracto de levadura yo de
impurezas contenidas en las sales inorgaacutenicas adicionadas al medio de cultivo (002
mM) mdash fue suficiente para permitir un adecuado crecimiento de la levadura Los
resultados tambieacuten mostraron que la adicioacuten de sulfato en forma de sales inorgaacutenicas
[(NH4)2SO4 o Mg(SO4)7H20] no tuvo alguacuten efecto inhibidor o estimulador del crecimiento
celular
Figura 5 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo sin Cr(VI)
En la figura 6 se presentan las curvas de crecimiento de Candida sp que se obtuvieron
cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo con una concentracioacuten inicial de
Cr(VI) de 17 mM a las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas En la figura se
aprecia lo siguiente 1) A una concentracioacuten de sulfato de 0 mM ocurrioacute lisis celular 2)
el crecimiento neto de la levadura fue praacutecticamente nulo a una concentracioacuten de sulfato
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
47
de 1217 mM 3) el crecimiento de la levadura fue evidente a partir de una
concentracioacuten de sulfato de 25 mM y 4) en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de
10 a 2392 mM el crecimiento de la levadura fue muy semejante y superior al alcanzado
a una concentracioacuten de sulfato de 5 mM Asimismo cuando se utilizaron concentraciones
de sulfato de 10 a 2392 mM se alcanzaron niveles de concentracioacuten de biomasa
similares a los obtenidos en ausencia del metal (cultivos control) (figuras 5 y 6) De
estos resultados es evidente que a medida que se incrementoacute la concentracioacuten de
sulfato los efectos toacutexicos del Cr(VI) sobre el crecimiento de la levadura disminuyeron
hasta que eacutestos fueron praacutecticamente nulos es decir la tolerancia de la levadura al
Cr(VI) aumentoacute conforme se incrementoacute la concentracioacuten de sulfato en el medio de
crecimiento de Candida sp
Figura 6 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo con 17 mM de Cr(VI)
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
48
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM ocurrioacute lisis celular
cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo con concentraciones de sulfato en el
intervalo de 0 a 5 mM (figura 7) en contraste el crecimiento celular de la levadura se
incrementoacute a medida que la concentracioacuten de sulfato aumentoacute de 10 a 2392 mM En
este uacuteltimo intervalo de concentracioacuten de sulfato se observoacute que a tiempos de
incubacioacuten superiores a las 150 h se presentoacute lisis celular A ninguna de las
concentraciones de sulfato ensayadas se alcanzaron densidades celulares semejantes a
las obtenidas en los cultivos sin Cr(VI) o con 17 mM de Cr(VI) lo cual podriacutea deberse a
la mayor toxicidad de los medios de cultivo
Figura 7 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo con 33 mM de Cr(VI)
En la figura 8 se muestra la variacioacuten de la velocidad especiacutefica de crecimiento ( ) y de
lisis celular (kd) de Candida sp en funcioacuten de la concentracioacuten de SO42- a las diferentes
concentraciones de Cr(VI) ensayadas [0 17 y 33 mM]
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
49
Figura 8 Variacioacuten de la velocidad especiacutefica de crecimiento o de lisis celular en funcioacuten
de la concentracioacuten de SO42- a las diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI)
ensayadas
-0002
0
0002
0004
0006
0008
001
0012
0014
0016
0018
0 5 10 15 20 25 30
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Ve
loc
ida
d e
sp
ec
iacutefic
a [
h-1
]
0 mM
17 mM
33 mM
Promedio
Sin Cr(VI)
50
Cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo sin Cr(VI) su velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento se mantuvo praacutecticamente constante en todo el intervalo de
concentracioacuten de sulfato ensayado con un valor promedio de 00144 h-1
A la concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la velocidad especiacutefica de crecimiento de
Candida sp aumentoacute casi linealmente con respecto a la concentracioacuten de sulfato en el
intervalo de concentracioacuten de 0 a 10 mM (r2 = 096) alcanzando un valor maacuteximo de
00142 h-1 a la uacuteltima concentracioacuten de sulfato Esta velocidad especiacutefica de crecimiento
es muy similar a las obtenidas en los cultivos sin Cr(VI) A concentraciones de sulfato
superiores a 5 mM la velocidad especiacutefica de crecimiento se mantuvo praacutecticamente
constante Estos resultados concuerdan con los perfiles de crecimiento celular mostrados
anteriormente
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM se obtuvieron
velocidades especiacuteficas de lisis celular (kd) de 00013 a 00003 h-1 ( = -00013 - 00003
h-1) en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de 0 a 5 mM (figura 8) A
concentraciones de sulfato superiores a 5 mM la velocidad neta de crecimiento fue
positiva La velocidad especiacutefica aumentoacute linealmente en todo el intervalo de
concentracioacuten de sulfato ensayado (r2 = 099) aunque las velocidades alcanzadas fueron
notoriamente inferiores a las obtenidas en los medios de cultivo sin Cr(VI) y con una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM
De los resultados anteriores se deduce que el sulfato desempentildea un papel importante en
la tolerancia (resistencia) de Candida sp a los efectos toacutexicos del Cr(VI) A medida que
se incrementoacute la concentracioacuten de sulfato la levadura fue maacutes tolerante (resistente) a
51
los efectos dantildeinos del Cr(VI) y por consiguiente su crecimiento celular fue menos
afectado Asimismo los resultados muestran que el ―efecto protector del sulfato sobre el
crecimiento de Candida sp dependioacute de la concentracioacuten inicial de Cr(VI)
Pepi y Baldi (1992) investigaron el efecto de diferentes aminoaacutecidos azufrados y del
sulfato sobre la tolerancia de algunas levaduras al Cr(VI) Estos investigadores
encontraron que en presencia de 02 mM de Cr(VI) se requirieron pequentildeas cantidades
de cisteiacutena [001ndash01 mM] para estimular significativamente [10-100] el crecimiento
de Rhodosporidium sp y que para incrementar el crecimiento de Candida sp en hasta
80 fue necesaria una concentracioacuten de cisteiacutena de 01 mM Un comportamiento similar
se observoacute en estas dos cepas cuando se adicionoacute metionina En contraste el
crecimiento celular de Candida famata fue inhibido cuando la levadura se cultivoacute en
medios con concentraciones de cisteiacutena superiores a 005 mM y con 02 mM de Cr(VI)
Por otra parte cuando Candida sp se cultivoacute en medios con diferentes concentraciones
de sulfato (4ndash160 mM) y de Cr(VI) (004ndash02 mM) se encontroacute que el ioacuten sulfato
incrementoacute la tolerancia de la levadura al Cr(VI) El mecanismo general de resistencia al
cromato en Candida sp se atribuyoacute a una reducida captacioacuten (incorporacioacuten) de cromo
(Pepi y Baldi 1992)
Ohtake y col (1987) encontraron que la adicioacuten de altas concentraciones de sulfato
incrementoacute el crecimiento celular de dos cepas de Pseudomonas fluorescens (LB300 y
LB303) en presencia de CrO42- Ademaacutes encontraron que el nivel de resistencia al CrO4
2-
en P fluorescens dependioacute de la fuente de azufre en el medio de cultivo ya que las
ceacutelulas bacterianas que crecieron con cisteiacutena fueron mucho maacutes resistentes al CrO42-
que las ceacutelulas que crecieron sobre sulfato Como el cromato es transportado al interior
52
de las ceacutelulas de Pseudomonas a traveacutes del sistema de transporte del sulfato la habilidad
del sulfato para proteger a las ceacutelulas de P fluorescens LB300 de los efectos inhibitorios
del Cr(VI) se atribuyoacute a que el sulfato inhibioacute competitivamente la captacioacuten del cromato
por las ceacutelulas bacterianas (Ohtake y col 1987)
En contraste la resistencia de Ochrobactrum tritici cepa 5bvI1 al Cr(VI) fue
independiente de la concentracioacuten de sulfato (Branco y col 2004)
412 Evaluacioacuten del efecto del sulfato sobre el consumo de glucosa por Candida
sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
La glucosa fue completamente consumida (eficiencia global de consumo de glucosa =
100) en aproximadamente 83 h de incubacioacuten cuando la levadura se cultivoacute en medios
que no conteniacutean Cr(VI) y con diferentes concentraciones de sulfato No se observoacute
diferencia considerable en el consumo de glucosa a ninguna de las concentraciones de
sulfato utilizadas (figura 9)
53
Figura 9 Variacioacuten en el consumo de glucosa por Candida sp cuando se utilizaron
medios de cultivo con diferentes concentraciones de sulfato y sin Cr(VI)
En los experimentos realizados con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM
(figura 10) se observoacute que la levadura fue capaz de consumir aproximadamente 30-
35 de la glucosa inicialmente adicionada a los medios que conteniacutean sulfato a
concentraciones de 0 y 1217 mM a pesar de que a estas condiciones de cultivo ocurrioacute
lisis celular [0 mM de SO42-] o el crecimiento celular de la levadura fue despreciable
[1217 mM de SO42-] (figura 6) Candida sp consumioacute todo el monosacaacuterido presente
en los medios de cultivo con concentraciones de sulfato superiores a 1217 mM
(eficiencia global de consumo de glucosa del 100) sin embargo el tiempo que se
requirioacute para que eacutesto sucediera disminuyoacute a medida que se incrementoacute la concentracioacuten
de sulfato (figura 10) Los perfiles de consumo de glucosa en los cultivos de Candida
sp fueron semejantes cuando se utilizaron concentraciones de sulfato de 10 a 2392
mM y eacutestos a su vez fueron similares a los obtenidos en los medios de cultivo que no
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa
re
sid
ua
l [
]0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
54
conteniacutean Cr(VI) (figuras 9 y 10) Lo anterior podriacutea deberse a que el crecimiento
celular de estos cultivos fue semejante (figura 6)
Figura 10 Variacioacuten del porcentaje de glucosa residual en los cultivos de Candida sp a
las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas y con 17 mM de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
55
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM los niveles de glucosa
residual disminuyeron a medida que aumentoacute la concentracioacuten de sulfato (figura 11)
Sin embargo estos niveles fueron superiores a los alcanzados a 17 mM de Cr(VI) a
todas las concentraciones de sulfato ensayadas La mayor eficiencia de consumo de
glucosa fue de aproximadamente 80 y se obtuvo a una concentracioacuten de sulfato de
2392 mM
Figura 11 Variacioacuten del porcentaje de glucosa residual en los cultivos por lote de
Candida sp a las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas y con 33 mM de
Cr(VI)
A las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas [17 y 33 mM] se observoacute que
en las primeras horas de incubacioacuten los cultivos de levadura en los que ocurrioacute lisis
celular consumieron una determinada cantidad de glucosa la cual probablemente se
utilizoacute para el mantenimiento de las ceacutelulas vivas
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa r
es
idu
al [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
56
Tanto en los experimentos realizados a 17 como a 33 mM de Cr(VI) se encontroacute que
los cultivos que alcanzaron mayores densidades celulares fueron los que consumieron
mayor cantidad de glucosa y esto ocurrioacute cuando se utilizaron concentraciones altas de
sulfato
413 Evaluacioacuten del efecto del sulfato sobre la variacioacuten del pH de los cultivos
de Candida sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
Los perfiles de variacioacuten del pH de los medios de cultivo fueron muy semejantes a las
diferentes concentraciones de sulfato ensayadas cuando la levadura se cultivoacute en los
medios de cultivo sin Cr(VI) (figura 12) A todas las concentraciones de sulfato
utilizadas el pH disminuyoacute desde aproximadamente 6 hasta 28 en las primeras once
horas de incubacioacuten En el periodo comprendido entre las 11 y las 60 h de incubacioacuten el
pH de los medios de cultivo disminuyoacute ligeramente hasta alcanzar valores cercanos a
25 A tiempos posteriores a 60 h el pH de los medios de cultivo se mantuvo
praacutecticamente constante
Figura 12 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo de Candida sp en ausencia de
Cr(VI) y a las diferentes concentraciones de SO42- ensayadas
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
57
En la figura 13 se muestran los perfiles de variacioacuten del pH de los medios de cultivo
cuando la levadura se cultivoacute a las diferentes concentraciones de sulfato y a una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM El pH de los cultivos disminuyoacute raacutepidamente
en las primeras 15 h de incubacioacuten a todas las concentraciones de sulfato ensayadas La
disminucioacuten del pH fue mayor en los cultivos con las concentraciones maacutes altas de
sulfato lo cual podriacutea deberse a que a estas condiciones la levadura consumioacute mayor
cantidad de glucosa y las densidades celulares alcanzadas fueron maacutes altas A tiempos
de incubacioacuten superiores a 15 h el pH continuoacute disminuyendo pero a menor velocidad
Los niveles de pH maacutes bajos se obtuvieron cuando se utilizaron concentraciones de
sulfato de 5 a 2392 mM alcanzaacutendose valores semejantes a los obtenidos en los medios
sin Cr(VI) (de aproximadamente 25)
Figura 13 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
58
Un comportamiento cualitativo similar se obtuvo cuando Candida sp se cultivoacute en medios
con diferentes concentraciones de sulfato y con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33
mM (figura 14) El pH maacutes bajo se alcanzoacute a concentraciones altas de sulfato [20 y
2392 mM] y fue de aproximadamente 36 el cual es superior a los valores maacutes bajos
que se obtuvieron en los cultivos sin Cr(VI) y con 17 mM de Cr(VI) Esto uacuteltimo podriacutea
deberse a que el incremento de la concentracioacuten celular y el consumo de glucosa fueron
inferiores a los alcanzados con las otras concentraciones de Cr(VI) [0 y 17 mM]
Figura 14 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
414 Efecto del sulfato sobre la remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp
En la figura 15 se muestran las variaciones del porcentaje de Cr(VI) residual de los
cultivos de Candida sp cuando se emplearon diferentes concentraciones de sulfato y
una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM A una concentracioacuten de sulfato de 0 mM
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
59
la remocioacuten de Cr(VI) fue muy baja (de aproximadamente 83) es conveniente
mencionar que a esta concentracioacuten de sulfato (0 mM) y de Cr(VI) (17 mM) ocurrioacute lisis
celular y la levadura consumioacute una pequentildea cantidad de glucosa en las primeras horas
de incubacioacuten La remocioacuten de Cr(VI) se incrementoacute a medida que aumentoacute la
concentracioacuten de sulfato de 0 a 10 mM A partir de esta uacuteltima concentracioacuten de sulfato
los perfiles de remocioacuten de Cr(VI) fueron muy similares y esto podriacutea deberse a que la
densidad celular de los cultivos fueron praacutecticamente iguales Todo o casi todo el Cr(VI)
inicialmente adicionado a los medios de cultivo fue removido cuando se empleoacute una
concentracioacuten de sulfato igual o superior a 25 mM (figura 15)
Figura 15 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
En contraste cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM la levadura
no fue capaz de remover todo el Cr(VI) inicialmente presente en los medios de cultivo a
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
60
ninguna de las concentraciones de sulfato ensayadas (figura 16) Sin embargo los
niveles de Cr(VI) residual disminuyeron a medida que se incrementoacute la concentracioacuten de
sulfato
Figura 16 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
A las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas los cultivos de levadura en los
que ocurrioacute lisis celular en las primeras horas de incubacioacuten [0 mm de SO42- 17 mM de
Cr(VI) y 0-5 mM de SO42- 33 mM de Cr(VI)] fueron capaces de remover una pequentildea
cantidad de Cr(VI) Estos resultados concuerdan con lo reportado por Wang y Shen
(1997) quienes encontraron que la densidad celular de los cultivos de Escherichia coli y
Bacillus sp disminuyoacute continuamente durante el curso de la remocioacuten de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
61
A las diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI) y de sulfato ensayadas se observoacute
que aunque los niveles de Cr(VI) residual disminuyeron a medida que la incubacioacuten
progresoacute las concentraciones de cromo total en solucioacuten permanecieron casi constantes
a lo largo de todo el periodo de incubacioacuten (aproximadamente el 97 del cromo
inicialmente adicionado a los medios de cultivo estuvo siempre presente en solucioacuten)
Maacutes auacuten el anaacutelisis del contenido de cromo en la biomasa de Candida sp (de muestras
recolectadas al final de los experimentos) reveloacute que uacutenicamente el 29 009 del
cromo total removido por los cultivos fue incorporado en la biomasa
Como se mostroacute anteriormente los cultivos con ceacutelulas viables se iniciaron con un pH de
aproximadamente 60 y eacuteste disminuyoacute durante el tiempo de incubacioacuten hasta valores de
25 ndash 36 dependiendo de la concentracioacuten de sulfato y de Cr(VI) utilizada Como se
sabe que los pHacutes bajos favorecen la reduccioacuten del Cr(VI) por la materia orgaacutenica
(donadores de electrones) en el presente trabajo se llevaron a cabo experimentos sin
biomasa de Candida sp (controles libres de ceacutelulas) a diferentes valores de pH (25 3
4 5 y 6) y a las dos diferentes concentraciones de Cr(VI) ensayadas (17 y 33 mM)
para determinar si los componentes presentes en los medios de cultivo pueden reducir el
Cr(VI) En las figuras 17 y 18 se muestran los perfiles de Cr(VI) residual que se
obtuvieron con los controles abioacuteticos ensayados
62
Figura 17 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los controles libres de
ceacutelulas llevados a cabo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y a diferentes
valores de pH
Figura 18 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los controles libres de
ceacutelulas realizados con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y a diferentes
valores de pH
00
200
400
600
800
1000
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
pH = 25
pH = 3
pH = 4
pH = 5
pH = 6
00
200
400
600
800
1000
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
pH = 25
pH = 3
pH = 4
pH = 5
pH = 6
63
A las dos concentraciones de Cr(VI) ensayadas se observoacute una reduccioacuten despreciable
del metal (inferior a 05) en el intervalo de valores de pH de 4 a 6 a un pH de 3 el
porcentaje de reduccioacuten fue de aproximadamente 12 y de 3 cuando el pH fue de
25 Estos resultados sugieren que los componentes de los medios de cultivo
praacutecticamente no redujeron el Cr(VI) a ninguno de los pHrsquos ensayados
En conjunto los resultados antes mostrados indican que el principal mecanismo de
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp fue la biotransformacioacuten (reduccioacuten) del Cr(VI) a
Cr(III) y que la reduccioacuten abioacutetica del Cr(VI) y la captacioacuten de cromo por la biomasa de
la levadura fueron despreciables Asimismo los resultados tambieacuten muestran que la
reduccioacuten del Cr(VI) por los cultivos se debioacute a la actividad metaboacutelica de las ceacutelulas de
Candida sp
En la figura 19 se presentan las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) que se
obtuvieron a las diferentes concentraciones iniciales de sulfato y de Cr(VI) ensayadas Se
aprecia que cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la eficiencia
de reduccioacuten se incrementoacute desde 179 hasta 986 a medida que la concentracioacuten
de sulfato aumentoacute de 0 a 25 mM a concentraciones de sulfato superiores la eficiencia
de reduccioacuten fue del 100 Asimismo en los experimentos realizados a 33 mM de
Cr(VI) la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) aumentoacute desde 83 hasta 84 conforme la
concentracioacuten de sulfato aumentoacute de 0 a 2392 mM
64
Figura 19 Eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por los cultivos de
Candida sp a las diferentes concentraciones de sulfato y de Cr(VI) ensayadas
La velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) tambieacuten fue afectada por la
concentracioacuten de sulfato y de Cr(VI) utilizada (figura 20) Cuando se empleoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten maacutes alta
fue de 098 mg de Cr(VI)Lh y se obtuvo en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de
10 a 2392 mM En cambio la velocidad maacutes alta que se alcanzoacute a 33 mM de Cr(VI) fue
de 044 mg de Cr(VI)Lh y se obtuvo a la maacutexima concentracioacuten de sulfato ensayada
(2392 mM)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 1217 25 5 10 15 20 2392
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Efi
cie
ncia
glo
bal d
e r
ed
uccioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
17 mM
33 mM
65
Figura 20 Velocidades volumeacutetricas globales de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas en los
cultivos de Candida sp a diferentes concentraciones de sulfato y de Cr(VI)
A todas las concentraciones de sulfato ensayadas la eficiencia y velocidad volumeacutetrica de
reduccioacuten de Cr(VI) alcanzadas a una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM fueron
superiores a las obtenidas a 33 mM de Cr(VI) y esto podriacutea deberse a que los efectos
toacutexicos del Cr(VI) sobre la levadura se incrementan a medida que aumenta la
concentracioacuten del metal
De los resultados anteriores es evidente que el sulfato afectoacute la reduccioacuten aeroacutebica de
Cr(VI) por Candida sp Estos resultados difieren con lo reportado por otros
investigadores quienes no han encontrado un efecto inhibidor ni estimulador del sulfato
sobre la reduccioacuten de Cr(VI) en cultivos aeroacutebicos
000
010
020
030
040
050
060
070
080
090
100
0 1217 25 5 10 15 20 2392
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica d
e r
ed
uccioacute
n d
e C
r(V
I)
[mg
de
Cr(
VI)
Lh
]
17 mM
33 mM
66
Ishibashi y col (1990) encontraron que concentraciones de sulfato de hasta 1 mM
incrementaron la resistencia de Pseudomonas putida al cromato pero no tuvieron efecto
sobre la reduccioacuten de eacuteste En cultivos de Bacillus sp (Wang y Xiao 1995) y de
Acinetobacter haemolyticus (Zakaria y col 2006) se observoacute que una concentracioacuten de
sulfato de 10 mM no afectoacute la reduccioacuten de Cr(VI) Liu y col (2006) reportaron que
concentraciones de sulfato de 40 y 80 mgL (0416 y 083 mM) no tuvieron efecto sobre
la reduccioacuten aeroacutebica de Cr(VI) por Bacillus sp XW-4
En contraste el sulfato generalmente tiene efecto sobre la reduccioacuten bacteriana del
cromato bajo condiciones de anaerobiosis lo cual podriacutea deberse a que el sulfato compite
con el cromato como aceptor final de electrones (Garbisu y col 1998 Liu y col 2006)
En cultivos anaeroacutebicos de Escherichia coli ATCC 33456 la velocidad de reduccioacuten de
Cr(VI) no fue afectada por hasta 416 mM de sulfato sin embargo la velocidad
disminuyoacute a 83 mM de sulfato (Shen y Wang 1994) La actividad de reduccioacuten de Cr(VI)
de Enterobacter cloacae HO1 bajo condiciones anaeroacutebicas fue inhibida en 32 en
presencia de tan soacutelo 25 M de sulfato (Komori y col 1989)
Como se mencionoacute anteriormente el sulfato incrementoacute la tolerancia al Cr(VI) de la cepa
de Candida sp aislada por Pepi y Baldi (1992) sin embargo esta cepa de levadura fue
incapaz de reducir el Cr(VI) Asimismo auacuten cuando se ha reportado que Pseudomonas
fluorescens LB300 es capaz de reducir el Cr(VI) a Cr(III) (Bopp y Ehrlich 1988) y que el
sulfato incrementa el crecimiento celular de esta bacteria en presencia de cromato
(Ohtake y col 1987) hasta donde sabemos no se ha reportado el efecto del sulfato
sobre la reduccioacuten de Cr(VI) por este microorganismo
67
Los resultados anteriores muestran claramente que el sulfato afectoacute la tolerancia de
Candida sp al Cr(VI) y a su capacidad para reducirlo Es evidente que a medida que se
incrementoacute la concentracioacuten de sulfato el crecimiento de la levadura fue mayor y su
eficiencia y velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) aumentaron Los resultados tambieacuten
muestran que la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp depende de la densidad celular de
los cultivos de manera tal que a mayor cantidad de biomasa generada mayor es la
reduccioacuten de Cr(VI) Aun cuando la cepa de Candida sp es muy sensible a los efectos
toacutexicos del Cr(VI) en ausencia de sulfato esta levadura posee una capacidad notable
para reducir muy altas concentraciones del metal en presencia de sulfato
Meta No 2 Determinar la capacidad de reduccioacuten de Cr(VI) en
diferentes sistemas de reaccioacuten
42 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso
Se utilizoacute un reactor airlift con tubo conceacutentrico liso (sin perforaciones) para el cultivo por
lote de Candida sp Para este sistema de reaccioacuten se utilizoacute un volumen de operacioacuten de
4 litros de medio basal con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM El biorreactor
se inoculoacute con un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada de tal
forma que la concentracioacuten inicial de biomasa fue de 12 mgmL El pH inicial fue de
aproximadamente 60 El reactor se operoacute por lote hasta que la concentracioacuten de Cr(VI)
residual fue despreciable
68
La concentracioacuten celular se incrementoacute gradualmente a medida que la incubacioacuten
progresoacute hasta que alcanzoacute un valor maacuteximo de aproximadamente 39 gL lo cual
ocurrioacute a las 42 h de incubacioacuten A tiempos posteriores la concentracioacuten de biomasa
disminuyoacute debido a que ocurrioacute lisis celular (figura 21) La velocidad especiacutefica maacutexima
de crecimiento de la levadura fue de 00244 h-1 la cual fue superior a la obtenida en
matraz cuando crecioacute con 17 mM de Cr(VI) (00142 h-1) esta diferencia podriacutea deberse
a que en el reactor airlift las ceacutelulas de Candida sp tuvieron una mayor cantidad de
oxiacutegeno disponible para su crecimiento
Figura 21 Variacioacuten de la concentracioacuten de biomasa y de glucosa en el cultivo por lote
de Candida sp en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM
La levadura consumioacute la principal fuente de carbono y energiacutea (glucosa) presente en el
medio de cultivo a lo largo de todo el tiempo de incubacioacuten incluso durante el periodo en
el que ocurrioacute lisis celular La glucosa no fue completamente consumida por la levadura
00
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo [h]
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e g
luc
os
a
res
idu
al [g
L]
00
05
10
15
20
25
30
35
40
45
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e b
iom
as
a [
gL
]Glucosa Biomasa
69
al final del experimento la concentracioacuten de glucosa residual fue de 17 gL (figura 21)
por lo que la eficiencia global de consumo del monosacaacuterido fue del 835
El pH del medio de cultivo disminuyoacute desde 60 hasta aproximadamente 25 Este uacuteltimo
valor se alcanzoacute a las 292 h de incubacioacuten y se mantuvo praacutecticamente constante a
tiempos posteriores (figura 22)
Figura 22 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) y del pH en el cultivo por lote de
Candida sp en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM
La concentracioacuten de Cr(VI) residual disminuyoacute progresivamente a medida que se
incrementoacute el tiempo de incubacioacuten hasta que a las 468 h ya no se detectoacute Cr(VI) en el
medio de cultivo por lo que la eficiencia global de remocioacuten de Cr(VI) fue del 100 Se
observoacute una ligera remocioacuten de Cr(VI) durante el periodo en el que ocurrioacute lisis celular
(figuras 21 y 22) En contraste la concentracioacuten de cromo total en solucioacuten se
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo [h]
Cr(
VI)
y C
rom
o t
ota
l re
sid
ua
l [m
gL
]
00
10
20
30
40
50
60
70
pH
[Cr(VI)] [Cromo total] pH
70
mantuvo casi constante a lo largo del tiempo de cultivo Lo anterior indica que la
levadura fue capaz de transformar el Cr(VI) a la forma trivalente menos toacutexica
En la tabla 6 se comparan los valores de algunas variables cineacuteticas obtenidas en
matraz (cuando se hizo crecer la levadura a una concentracioacuten de Cr(VI) inicial de 17
mM) y en el biorreactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando la levadura se cultivoacute en
medio de cultivo con concentraciones iniciales semejantes de Cr(VI) y de sulfato
Tabla 6 Variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote de Candida sp realizados
en matraz y en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Variable cineacutetica Matraz Reactor
Incremento celular maacuteximo [gL] 22 263
Velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento [h-1] 00142 00244
Eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) [] 100 100
Velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI)L h] 098 164
Velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI) g biomasa h] 045 095
Capacidad de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI) g biomasa] 400 443
El incremento celular maacuteximo y la velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento de
Candida sp obtenidos en el reactor airlift fueron 1955 y 718 superiores a los
alcanzados en matraz respectivamente Como se mencionoacute previamente eacutesto podriacutea
deberse a que en el reactor airlift la levadura tuvo una mayor cantidad de oxiacutegeno
disponible para su crecimiento
71
La levadura redujo todo el Cr(VI) inicialmente presente en el medio de cultivo [eficiencia
global de reduccioacuten de Cr(VI) del 100] tanto cuando se cultivoacute en matraz como en el
reactor airlift El hecho de que Candida sp sea capaz de reducir concentraciones de
Cr(VI) tan altas como 15 mM (e incluso superiores como se mostroacute en la seccioacuten
anterior) podriacutea ser de importancia praacutectica porque la mayoriacutea de los microorganismos
ensayados son capaces de reducir parcial o totalmente concentraciones maacutes bajas de
Cr(VI) (tabla 7)
Tabla 7 Datos sobre reduccioacuten de Cr(VI) por microorganismos
Microorganismo Cultivo
Modo de
operacioacuten
Concentra-
cioacuten de
Cr(VI)
[mM]
Velocidad
volumeacutetrica
de reduccioacuten
[mg de
CrLh]
Eficiencia
de
reduccioacuten
[]
Referencia
Acinetobacter
haemolitycus
Aerobio
CPL
067 128 88 Zakaria y col
2006
Aislado de
Pseudomonas
(CRB5)
Aerobio
CPL
043 014 100 McLean y
Beveridge 2000
Arthrobacter
sp
Aerobio
CPL
017 016 65 Megharaj y col
2003
Aspergillus sp Aerobio
CPL
096 0694 100 Acevedo-Aguilar
y col 2006
Bacillus
megaterium
TKW3
Aerobio
CPL
048 009 735 Cheung y Gu
2005
Bacillus sp Aerobio
CPL
007 007 65 Megharaj y col
2003
Bacteria J3 Aerobio
CPL
01 00057 21 Badar y col
2000
Brevibacterium
CrT-13
Aerobio
CPL
288 255 68 Faisal y Hasnain
2004
E coli AC80 Aerobio
CPL
002
065
9375
Ishibashi y col
1990
Ochrabactrum
sp
Aerobio
CPL
017
034
033
038
100
88
Thacker y
Madamwar 2005
72
Ochrobactrum
intermedium Cr-
T1
Aerobio
CPL
288 326 87 Faisal y Hasnain
2004
Penicillium sp Aerobio
CPL
096 066 95 Acevedo-Aguilar y
col 2006
Phanerochaete
chrysosporium
Aerobio
CPL
058 011 100 Pal 1997
Providencia
sp
Aerobio
CPL
102 10 100 Thacker y col
2006
Pseudomonas
ambigua G-1
Aerobio
CPL
288 347 83 Horitsu y col
1987
Streptomyces
griseus
Aerobio
CPL
017 025 100 Laxman y More
2002
Trichoderma
inhamatum
Aerobio
CPL
13
075 100 Morales-Barrera y
Cristiani-Urbina
2008
Trichoderma
viride
Aerobio
CPL
16
104 100 Morales-Barrera y
Cristiani-Urbina
2006
CPL = Cultivo por lote
La velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) obtenida en el reactor neumaacutetico
con Candida sp fue de 164 mg de Cr(VI)Lh la cual fue 6735 superior a la alcanzada
en matraz [098 mg de Cr(VI)Lh] (tabla 6) Esto uacuteltimo podriacutea deberse a la mayor
cantidad de biomasa generada en el reactor la cual redujo maacutes raacutepidamente el Cr(VI)
Acinetobacter haemolitycus fue capaz de reducir completamente 096 mM de Cr(VI) en
36 h por lo que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal de este microorganismo
fue de 139 mg de Cr(VI)Lh sin embargo cuando la concentracioacuten inicial de Cr(VI) se
incrementoacute a 135 mM la eficiencia y velocidad de reduccioacuten disminuyeron (Zakaria y
col 2006)
A una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 017 mM la eficiencia y velocidad volumeacutetrica
global de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por Ochrabactrum sp fue del 100 y 033 mg
de Cr(VI)Lh respectivamente Aunque la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal
73
se incrementoacute a 038 mg de Cr(VI)Lh cuando la concentracioacuten inicial de Cr(VI) fue de
034 mM la eficiencia de reduccioacuten disminuyoacute a 88 (Thacker y Madamwar 2005)
La eficiencia y velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas con Arthrobacter
sp a las 70 h de incubacioacuten fue de aproximadamente 65 y 016 mg de Cr(VI)Lh
cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial del metal de 017 mM (Megharaj y col 2003)
Con Providencia sp se obtuvo una eficiencia de reduccioacuten del 100 al cabo de 108 h de
incubacioacuten en medios de cultivo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 102 mM
siendo su velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal de 10 mg de Cr(VI)Lh (Thacker
y col 2006) La velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Streptomyces griseus
fue de 025 mg de Cr(VI)Lh cuando se cultivoacute en presencia de 017 mM de Cr(VI)
(Laxman y More 2002)
En el caso de eucariotes Acevedo-Aguilar y col (2006) reportaron que Penicillium sp y
Aspergillus sp fueron capaces de reducir por completo 096 mM de Cr(VI) en 72 h
obtenieacutendose una velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de 0694 mg de Cr(VI)Lh
Asimismo Trichoderma viride exhibioacute una eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) del 100 y
una velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de 104 mg de Cr(VI)Lh cuando se cultivoacute en
un reactor airlift en medio de cultivo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 16 mM
(Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006) Trichoderma inhamatum fue capaz de reducir
por completo 13 mM de Cr(VI) con una velocidad volumeacutetrica de 075 mg de Cr(VI)Lh
(Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2008)
En la tabla 7 se muestran los valores de eficiencia y velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten
de Cr(VI) obtenidas con otros microorganismos
74
La velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) que se obtuvo en el reactor airlift con
Candida sp fue de 095 mg de Cr(VI)g de biomasah (tabla 6) la cual fue 211 veces
mayor que la alcanzada en matraz [045 mg de Cr(VI)g de biomasah] Bae y col
(2000) reportaron que la velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) de Escherichia coli
ATCC 33456 se encontroacute en el intervalo de 031 a 07 mg de Cr(VI)g de biomasah
cuando este microorganismo se cultivoacute por lote en diferentes medios de cultivo con una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 096 mM A una concentracioacuten de Cr(VI) de 0096 mM
los lodos activados exhibieron una velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) de
aproximadamente 008 mg de Cr(VI)g de biomasah (Stasinakis y col 2003) El cultivo
por lote de Trichoderma inhamatum exhibioacute una velocidad especiacutefica de
aproximadamente 0584 mg de Cr(VI)g de biomasah cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 13 mM (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2008)
Asimismo en cultivos por lote de Providencia sp realizados con una concentracioacuten inicial
de Cr(VI) de 034 mM se obtuvo una velocidad especiacutefica de reduccioacuten del metal de
1302 mgg de biomasah (Thacker y col 2006)
En el presente trabajo se encontroacute que en el reactor airlift cada gramo (peso seco) de
biomasa producida de Candida sp pudo reducir 4438 mg de Cr(VI) (tabla 6) valor
ligeramente superior al encontrado en matraz [40 mg de Cr(VI)g de biomasa] y
semejante al reportado para Trichoderma inhamatum (Morales-Barrera y Cristiani-
Urbina 2008) Asimismo a las 60 h de incubacioacuten la capacidad de reduccioacuten de
Penicillium sp y Aspergillus sp fue de aproximadamente 082 y 042 mg de Cr(VI)g de
biomasa (Acevedo-Aguilar y col 2006) Wang y Shen (1997) reportaron que la
capacidad maacutexima de reduccioacuten de Cr(VI) de los cultivos aeroacutebicos de Bacillus sp y
75
Pseudomonas fluorescens LB300 fue de 208 x 10-12 y 310 x 10-12 mg de Cr(VI)ceacutelula
respectivamente si se toma en cuenta que el peso seco promedio de una ceacutelula
bacteriana tiacutepica es de aproximadamente 3 x 10-13 g (Atkinson y Mavituna 1983)
entonces la capacidad de reduccioacuten de Bacillus sp y P fluorescens LB300 seriacutea de 693 y
1033 mg de Cr(VI)g de biomasa respectivamente
43 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote repetido en el reactor airlift con
tubo conceacutentrico liso
Se realizaron algunos cultivos por lote repetido en el reactor airlift con tubo conceacutentrico
liso (sin perforaciones) En cada uno de los cultivos ensayados el reactor se inoculoacute
inicialmente con un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada de la
levadura para obtener una concentracioacuten inicial de biomasa de aproximadamente 12
mgmL La concentracioacuten inicial de Cr(VI) del medio de cultivo fue de aproximadamente
15 mM y el flujo de aire fue de 1 vvm El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que la
concentracioacuten de Cr(VI) residual en el medio fue baja (primer cultivo por lote) a
continuacioacuten una parte del medio de cultivo contenido en el reactor se drenoacute y se
adicionoacute medio fresco con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM Posteriormente el
reactor se operoacute nuevamente por lote (segundo cultivo por lote o cultivo por lote
repetido) Se ensayaron tres relaciones de recambio de medio de cultivo (f = volumen de
medio cosechadovolumen inicial de medio de cultivo) de 08 06 y 04
Debido a la importancia que tiene el pH del medio de cultivo en los procesos
microbioloacutegicos de reduccioacuten de Cr(VI) en el presente trabajo se llevaron a cabo cultivos
por lote repetido con relaciones de recambio de 06 y 08 en los que el pH del medio de
76
cultivo se ajustoacute a 60 al inicio del segundo cultivo por lote (cultivo por lote repetido) asiacute
como experimentos en los que el pH no se ajustoacute a 60 por lo que el pH inicial del cultivo
por lote repetido fue el alcanzado al final del primer cultivo por lote (cercano a 30) Es
conveniente mencionar que los valores bajos de pH inhiben el crecimiento de los
microorganismos pero favorecen la reduccioacuten del Cr(VI) a Cr(III) al ocurrir esto uacuteltimo
disminuye el efecto toacutexico de la forma hexavalente del metal
En estos experimentos se observoacute que el crecimiento de la levadura y la reduccioacuten de
Cr(VI) fueron adversamente afectados cuando el pH del medio de cultivo se ajustoacute a 60
al inicio de los cultivos por lote repetido En la figura 23 se muestra la variacioacuten de la
concentracioacuten de Cr(VI) residual en los cultivos por lote y lote repetido realizados con y
sin ajuste del pH al inicio de los cultivos por lote repetido cuando se utilizaron relaciones
de recambio de 06 y 08
77
Figura 23 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los cultivos por lote y lote
repetido realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizaron
00
100
200
300
400
500
600
700
800
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [m
gL
]
f = 08 spH
f = 08 cpH
CPL CPLR
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [m
gL
] f = 06 spH
f = 06 cpH
CPL CPLR
78
relaciones de recambio de 06 y 08 (spH = sin ajuste de pH del medio de cultivo al
inicio del cultivo por lote repetido cpH = con ajuste de pH del medio de cultivo a 60 al
inicio del cultivo por lote repetido)
En la figura se aprecia que en los primeros cultivos por lote el Cr(VI) fue totalmente o
casi completamente reducido en aproximadamente 45-49 h Sin embargo en los cultivos
por lote repetido el tiempo que se requirioacute para reducir el Cr(VI) fue mayor Asimismo es
evidente que se alcanzaron concentraciones de Cr(VI) residual maacutes bajas en los sistemas
por lote repetido en los que no se ajustoacute el pH al inicio de los cultivos
Los resultados anteriores sugieren que la levadura pierde parte de su capacidad de
reduccioacuten de Cr(VI) cuando se cultiva repetidamente en medios que contienen Cr(VI)
Estos resultados concuerdan con lo reportado por Wang y Shen (1997) quienes
encontraron que Bacillus sp Pseudomonas fluorescens LB300 y Escherichia coli ATCC
33456 pierden su capacidad para reducir Cr(VI) despueacutes de que han reducido 046-052
058 y 125 mM de Cr(VI) respectivamente Un comportamiento similar tambieacuten fue
reportado por Middleton y col (2003) para Shewanella oneidensis
Como los niveles maacutes altos de reduccioacuten de Cr(VI) se obtuvieron cuando no se ajustoacute el
pH a 60 al inicio de los cultivos por lote repetido el experimento en el que se ensayoacute
una relacioacuten de recambio de 04 uacutenicamente se llevoacute a cabo sin ajustar el pH
En la figura 24 se muestra la variacioacuten de la concentracioacuten celular en los sistemas por
lote y lote repetido a las tres diferentes relaciones de recambio ensayadas (04 06 y
08) cuando no se ajustoacute el pH al inicio de los cultivos por lote repetido Se aprecia que
en ninguno de los cultivos por lote repetido se alcanzaron densidades celulares cercanas
79
a las de los cultivos por lote que los precedioacute En los cultivos por lote repetido el
incremento celular y la velocidad especiacutefica de crecimiento maacutes altos se obtuvieron
cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 06 (tabla 8) sin embargo los valores
alcanzados fueron inferiores a los obtenidos en el cultivo por lote que los antecedioacute
Figura 24 Variacioacuten de la concentracioacuten de biomasa con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo ensayadas
00
05
10
15
20
25
30
35
40
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Co
nce
ntr
acioacute
n d
e b
iom
asa
[g
L]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
80
Tabla 8 Variables cineacuteticas del crecimiento celular y de la reduccioacuten de Cr(VI)
obtenidas en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp llevados a cabo en el
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Variable Cultivo por lote Cultivo por lote repetido
Relacioacuten de recambio
04 06 08
Incremento celular
maacuteximo [gL]
224 230 235 017 038 009
Velocidad especiacutefica maacutexima de
crecimiento [h-1]
00244 00227 00220 00044 00109 00017
Eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) []
999 980 973 96 93 36
Velocidad
volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI)Lh]
160 178 151 035 046 045
En los cultivos por lote repetido se necesitoacute de una mayor cantidad de tiempo para
consumir la glucosa presente en los medios en comparacioacuten con los cultivos por lote del
cual derivaron (figura 25) Asimismo en ninguno de los cultivos se consumioacute
totalmente la glucosa la mayor eficiencia de consumo del monosacaacuterido de los cultivos
por lote repetido se obtuvo cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 06 con un
valor de 783 el cual es cercano al obtenido en los primeros cultivos por lote
(aproximadamente 835)
81
Figura 25 Variacioacuten de la concentracioacuten de glucosa con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo utilizadas
En la figura 26 se muestran los perfiles de variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI)
residual en funcioacuten del tiempo de incubacioacuten a las diferentes relaciones de recambio de
medio de cultivo utilizadas Se aprecia que en los primeros cultivos por lote se alcanzaron
niveles de Cr(VI) residual maacutes bajos y en menor tiempo que en los cultivos por lote
repetido
00
20
40
60
80
100
120
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e g
luc
os
a r
es
idu
al [g
L]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
82
Figura 26 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo ensayadas
En los primeros cultivos por lote se alcanzaron eficiencias y velocidades volumeacutetricas
globales de reduccioacuten de Cr(VI) de 973 - 999 y de 151 - 178 mgLh
respectivamente (tabla 8) Estas velocidades son superiores a la alcanzada en el cultivo
por lote realizado en matraz [098 mg de Cr(VI)Lh] y semejantes a la obtenida
previamente en el reactor airlift [164 mg de Cr(VI)Lh]
En los cultivos por lote repetido la eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) maacutes baja se
obtuvo cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 08 y esto podriacutea deberse a que el
tiempo de incubacioacuten que se utilizoacute para este cultivo fue menor que para los otros A las
relaciones de recambio de 04 y 06 las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
[Cr(
VI)
] [m
gL
]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
83
fueron semejantes con valores de 96 y 93 respectivamente Estas uacuteltimas eficiencias
fueron ligeramente inferiores a las obtenidas en los cultivos por lote que los precedioacute
(973-999) Las mayores velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) se
obtuvieron a relaciones de recambio de 06 y 08 [aproximadamente 045 mgLh] sin
embargo fueron considerablemente inferiores a la de los cultivos por lote que los
antecedioacute
44 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa en un reactor airlift
con tubo conceacutentrico liso
Para este sistema el reactor se inoculoacute con 50 mL de inoacuteculo y se dejoacute operar por lote
durante 48 horas con el propoacutesito de incrementar la densidad celular A continuacioacuten se
suministroacute continuamente medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de
15 mM [78 mgL] y con un flujo volumeacutetrico de 378 mLh por lo que la velocidad de
dilucioacuten ensayada fue de 00076 h-1 Se permitioacute que el reactor alcanzara el estado
estacionario lo cual se corroboroacute mediante la determinacioacuten de la concentracioacuten de
biomasa asiacute como de glucosa y de Cr(VI) residual de muestras colectadas a diferentes
tiempos
En el estado estacionario los valores promedio de concentracioacuten de biomasa glucosa
Cr(VI) residual y de pH fueron de 016 gL 62 gL 46 mgL y 345 respectivamente
De estos resultados es evidente que la concentracioacuten de biomasa en el reactor fue muy
baja lo que probablemente ocasionoacute que se alcanzaran valores bajos de eficiencia de
consumo de glucosa (38) y de reduccioacuten de Cr(VI) (41) asiacute como de velocidad
volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) (024 mgLh)
84
Posteriormente se ensayoacute un flujo de alimentacioacuten de 5 mLh para operar con una
velocidad de dilucioacuten de 001 h-1 Sin embargo bajo estas condiciones se presentoacute el
fenoacutemeno de lavado celular en el cual no se detecta biomasa en el reactor Este
experimento se realizoacute varias veces y en todos los casos se obtuvo el mismo resultado
El lavado celular que ocurrioacute en el cultivo continuo de Candida sp podriacutea deberse a que
la velocidad de dilucioacuten que se utilizoacute (001 h-1) es muy cercana a la velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento de la levadura [de aproximadamente 00146 h-1 determinada en
cultivo por lote en medio de cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM]
por lo que la levadura no tuvo tiempo suficiente para duplicarse y fue desplazada del
reactor Ademaacutes el suministro continuo de medio de alimentacioacuten con Cr(VI) ocasiona
que la levadura esteacute constantemente sujeta a los efectos toacutexicos del metal Es decir la
baja velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento de la levadura y los efectos toacutexicos
continuos del metal fueron probablemente los factores que limitaron la eficiencia y
velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) en cultivo continuo
Debido a que ocurrioacute lavado celular a una velocidad de dilucioacuten de 001 h-1 ya no fue
posible ensayar velocidades maacutes altas Los resultados obtenidos en cultivo continuo de
una etapa indican que este sistema de reaccioacuten no es adecuado para la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp
En la tabla 9 se presentan datos sobre la reduccioacuten de Cr(VI) por microorganismos en
cultivos continuos en suspensioacuten o inmovilizados Hasta donde es de nuestro
85
conocimiento no hay informacioacuten disponible acerca de la reduccioacuten de Cr(VI) por
levaduras y hongos filamentosos en cultivo continuo
Tabla 9 Resumen de datos sobre la reduccioacuten microbiana de Cr(VI) en cultivo continuo
Microorganismo Cultivo Concentra-
cioacuten de
Cr(VI) [mM]
Velocidad
de
dilucioacuten
[h-1]
Velocidad
volumeacutetrica
de reduccioacuten
[mg de
CrLh]
Eficiencia
de
reduccioacuten
[]
Referencia
Pseudomonas
sp C7
Aerobio 12
12
0014
0017
073
093
88
91
Gopalan y
Veeramani
1994
Pseudomonas
fluorescens
LB300
Aerobio 011
009
009
002
005
009
016
017
022
57
39
28
DeLeo y
Ehrlich
1994
Escherichia coli
ATCC 33456
Aerobio 08 005
169 843 Bae y col
2000
Pseudomonas
mendocina
MCM B-180
Aerobio
05
15
20
022
014
011
57
108
113
99
99
99
Bhide y
col 1996
Microbacterium
liquefaciens
MP30
Aerobio
(ceacutelulas
inmovilizadas
en perlas de
polivinil
alcohol-
alginato)
005
0038
009
90
Pattanapip
it-paisal y
col 2001
Bacillus sp Aerobio
(ceacutelulas
inmovilizadas
en perlas de
vidrio Pyrex)
192
192
004
008
397
797
998
998
Chirwa y
Wang
1997
86
En un estudio realizado en cultivo continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de Pseudomonas
fluorescens LB300 se encontroacute que la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute desde
57 hasta 28 y que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal se incrementoacute de
016 a 022 mg de Cr(VI)Lh a medida que la velocidad de dilucioacuten se incrementoacute de
002 a 009 h-1 cuando se utilizoacute medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI)
de 009 mM (DeLeo y Ehrlich 1994)
Los resultados obtenidos en cultivo continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de otros
microorganismos han sido alentadores Gopalan y Veeramani (1994) ensayaron tres
velocidades de dilucioacuten de 0014 0017 y 0028 h-1 y encontraron que la maacutexima
eficiencia (91) y velocidad volumeacutetrica [093 mg de Cr(VI)Lh] de reduccioacuten de Cr(VI)
de Pseudomonas sp C7 se obteniacutea a una velocidad de dilucioacuten de 0017 h-1 cuando se
utilizoacute medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de 12 mM En el estudio
realizado por Bae y col (2000) con Escherichia coli ATCC 33456 la velocidad de dilucioacuten
se mantuvo constante a 005 h-1 y se obtuvo una eficiencia y una velocidad volumeacutetrica
de reduccioacuten de Cr(VI) de 843 y de 169 mg de Cr(VI)Lh respectivamente cuando
se utilizoacute una concentracioacuten de Cr(VI) de 08 mM en el medio de alimentacioacuten En cultivo
continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de Pseudomonas mendocina MCM B-180 Bhide y col
(1996) ensayaron el efecto de diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI) [de 05 a
20 mM] y de velocidades de dilucioacuten (011 a 022 h-1) sobre la reduccioacuten de Cr(VI)
Estos investigadores encontraron altas eficiencias (99) y velocidades de reduccioacuten [57
ndash 113 mg de Cr(VI)Lh]
Asimismo con la finalidad de reducir los efectos toacutexicos del Cr(VI) sobre los
microorganismos se ha propuesto el uso de ceacutelulas inmovilizadas en reactores continuos
87
de lecho fijo Las ceacutelulas de Microbacterium liquefaciens MP30 inmovilizadas en perlas de
alginato de calcio - polivinil alcohol fueron capaces de reducir el Cr(VI) con una
eficiencia del 90 y con una velocidad de 009 mg de Cr(VI)Lh cuando se utilizoacute medio
de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de 005 mM y una velocidad de dilucioacuten
de 0038 h-1 (Pattanapipitpaisal y col 2001) En un reactor de lecho fijo con ceacutelulas de
Bacillus sp inmovilizadas en perlas de vidrio Pyrex con un diaacutemetro de 3 mm se observoacute
que al incrementar la velocidad de dilucioacuten de 004 a 008 h-1 la eficiencia de reduccioacuten
de Cr(VI) se mantuvo constante (998) y que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de
Cr(VI) se incrementoacute de 397 a 797 mgLh (Chirwa y Wang 1997)
45 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular y la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo conceacutentrico de
malla de acero inoxidable y de vidrio perforado
Los reactores airlift con tubo conceacutentrico liso (reactores convencionales) no son
adecuados para llevar a cabo cultivos por lote alimentado (procesos con volumen
variable) ya que no es posible lograr una adecuada circulacioacuten del liacutequido a cualquier
volumen de medio de cultivo En los reactores airlift convencionales uacutenicamente se logra
una adecuada circulacioacuten del fluido cuando la altura del liacutequido es mayor que la del tubo
conceacutentrico Por ello para realizar cultivos por lote alimentado en reactores airlift es
necesario que existan diversos puntos de comunicacioacuten entre las secciones de ascenso y
descenso del reactor a lo largo de toda la longitud del tubo conceacutentrico En la literatura
se han descrito algunos reactores airlift que en su interior contienen dispositivos que
permiten la comunicacioacuten entre ambas secciones del reactor Los dispositivos maacutes
comunes son tubos de mallas metaacutelicas (net draft tube) (Tung y col 1997 Wu y Wu
1990 1991 Wu y col 1992) tubos conceacutentricos de vidrio con perforaciones
88
rectangulares (Cristiani-Urbina y col 2000) placas curvas colocadas coaxialmente
(Hagino y col 1982) y bafles (placas) perforados (Galiacutendez-Mayer y col 2001) Estos
dispositivos afectan las caracteriacutesticas hidrodinaacutemicas y de transferencia de masa y calor
de los reactores por lo que es conveniente evaluar su desempentildeo
En este trabajo se evaluoacute la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivos por lote
utilizando reactores airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable asiacute como de
vidrio con perforaciones circulares Estos cultivos se realizaron con dos flujos de aire de
05 y 1 vvm Estos experimentos tuvieron como propoacutesito principal el seleccionar el tubo
conceacutentrico maacutes adecuado para llevar a cabo posteriormente los cultivos por lote
alimentado y lote alimentado repetido
En la figura 27 se muestran las curvas de crecimiento celular cuando se utilizoacute el reactor
airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos de aire
ensayados El crecimiento celular de la levadura fue mayor cuando se utilizoacute un flujo de
aire de 1 vvm lo cual podriacutea deberse a una mayor oxigenacioacuten del medio de cultivo Los
niveles de Cr(VI) residual maacutes bajos tambieacuten se obtuvieron con un flujo de aire de 1 vvm
(figura 28) y eacutesto podriacutea deberse a la mayor densidad celular alcanzada bajo estas
condiciones
89
Figura 27 Curvas de crecimiento celular de Candida sp en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos de aire ensayados
Figura 28 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual en los cultivos por lote realizados
en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos
de aire ensayados
000
050
100
150
200
250
00 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Tiempo [h]
XX
O
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
00 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Tiempo [h]
Cr(
VI)
Re
sid
ual [
]
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
90
En los experimentos realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado se
observoacute un comportamiento opuesto al obtenido previamente con el tubo conceacutentrico de
malla metaacutelica El crecimiento celular (figura 29) y la reduccioacuten de Cr(VI) (figura 30)
en el reactor con tubo conceacutentrico perforado fueron mayores a un flujo de aire de 05
vvm
Figura 29 Curvas de crecimiento celular de Candida sp en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico de vidrio perforado a los dos flujos de aire ensayados
000
050
100
150
200
00 500 1000 1500 2000 2500
Tiempo [h]
XX
O
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
91
Figura 30 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual en los cultivos por lote realizados
en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de vidrio perforado a los dos flujos de aire
ensayados
En la tabla 10 se muestran algunas variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote
realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable y con
tubo conceacutentrico perforado de vidrio a los dos flujos de aire ensayados Ademaacutes la tabla
incluye los resultados obtenidos en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
00 500 1000 1500 2000 2500
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ual [
] Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
92
Tabla 10 Variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote realizados en el reactor
airlift con las diferentes configuraciones de tubo conceacutentrico
Cultivo por lote
Variable cineacutetica Tubo conceacutentrico
liso
Malla metaacutelica Tubo conceacutentrico perforado
10 vvm 05 vvm 10 vvm 05 vvm 05 vvm 10 vvm
Incremento celular
maacuteximo [gL]
263 072 142 123 106 082
Velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento [h-1]
00244 00059 00120 00149 00178 00093
Eficiencia global de
reduccioacuten de Cr(VI) ()
100 67 95 97 95 89
Velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) [mg de Cr(VI)Lh]
164 031 056 082 084 035
Comparando los resultados obtenidos en el reactor con tubo de malla metaacutelica y con el
de vidrio perforado la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) fue mayor cuando se
utilizoacute el tubo conceacutentrico perforado de vidrio y un flujo de aire de 05 vvm con un valor
promedio de dos experimentos independientes de 083 mgLh Sin embargo esta
velocidad es aproximadamente 494 inferior a la alcanzada con el tubo conceacutentrico liso
Los resultados de crecimiento celular (incremento celular maacuteximo y velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento) y de reduccioacuten de Cr(VI) (eficiencia y velocidad volumeacutetrica)
obtenidos en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable y de
vidrio perforado a los flujos de aire ensayados podriacutean sugerir que el grado de
oxigenacioacuten del medio de cultivo y la magnitud de los esfuerzos de corte que se alcanzan
durante la agitacioacuten neumaacutetica desempentildean un papel importante en la generacioacuten de
biomasa de Candida sp en los estados fisioloacutegicos de eacutesta y por consiguiente en la
93
reduccioacuten de Cr(VI) Debido a lo anterior seriacutea conveniente investigar la influencia de la
velocidad de aireacioacuten la cual afecta los patrones de flujo del fluido la magnitud de las
fuerzas de corte y la concentracioacuten del nutriente gaseoso en la fase fluida
Como las mayores eficiencias y velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) se
obtuvieron cuando se utilizoacute el tubo conceacutentrico perforado de vidrio y un flujo de aire de
05 vvm eacutestos fueron utilizados en los cultivos por lote alimentados que se llevaron a
cabo posteriormente
46 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote alimentado
repetido en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado
En los cultivos por lote alimentado el volumen de medio liacutequido en el reactor se
incrementa gradualmente a medida que aumenta el tiempo de incubacioacuten Este cambio
de volumen provoca una dilucioacuten de los componentes presentes en el medio de cultivo lo
cual dificulta la interpretacioacuten de los resultados Debido a lo anterior en los cultivos por
lote alimentado es conveniente expresar el cambio de las variables (biomasa sustrato
etc) en teacuterminos de masa y no de concentracioacuten y para ello es necesario conocer el
volumen de medio a los diferentes tiempos de incubacioacuten Por consiguiente en el
presente trabajo se estimaron las cantidades de biomasa glucosa y de Cr(VI) y se
expresaron en teacuterminos de masa A continuacioacuten se presentan las ecuaciones para
calcular la masa de las variables de intereacutes para este trabajo
Masa celular [g] = (concentracioacuten celular gL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
94
Masa de glucosa [g] = (concentracioacuten de glucosa gL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
Masa de Cr(VI) [mg] = (concentracioacuten de Cr(VI) mgL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
En los cultivos por lote alimentado y lote alimentado repetido se ensayaron dos flujos
volumeacutetricos de medio de alimentacioacuten de 659 y 1343 mLh que corresponden a
cargas maacutesicas de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh respectivamente Los cultivos por lote
alimentado realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado se iniciaron con
cultivos por lote (los resultados obtenidos en estos uacuteltimos cultivos se mostraron en la
seccioacuten anterior)
Cuando se utilizoacute una carga maacutesica de Cr(VI) de 0514 mgh en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) se observoacute que la masa celular
de la levadura en el primer cultivo por lote alimentado fue mayor que en la del segundo
cultivo Sin embargo a pesar de que la levadura tuvo un suministro constante de fuente
de carbono y energiacutea eacutesta praacutecticamente no crecioacute
Cuando se utilizoacute una carga maacutesica de Cr(VI) de 0514 mgh fue evidente que en los
cultivos por lote alimentado se fue acumulando glucosa en el medio de cultivo lo que
indica que las ceacutelulas casi no consumieron el monosacaacuterido que teniacutean disponible para su
crecimiento La cantidad de glucosa consumida por la levadura en el cultivo por lote
alimentado repetido (segundo cultivo por lote alimentado) fue considerablemente menor
que la consumida en el primer cultivo lo cual podriacutea deberse a que habiacutea una menor
cantidad de biomasa en el reactor En el segundo cultivo por lote alimentado se alcanzoacute
95
una eficiencia de consumo de glucosa del 68 en cambio en el primer cultivo fue del
263
Se observoacute que la levadura fue capaz de reducir parcialmente el Cr(VI) adicionado al
reactor y que en el primer cultivo por lote alimentado se lograron mayores niveles de
reduccioacuten
En el primer cultivo por lote alimentado las eficiencias de reduccioacuten de Cr(VI) maacutes altas
se alcanzaron durante el periodo de incubacioacuten de las 468 a las 967 h (7188-7292)
y disminuyeron ligeramente hasta el final de este cultivo (673-6945) En el segundo
cultivo por lote alimentado (lote alimentado repetido) las eficiencias disminuyeron
gradualmente a medida que se incrementoacute el tiempo de incubacioacuten (figura 31) La
eficiencia promedio de reduccioacuten de Cr(VI) del primer cultivo por lote alimentado fue de
689 y la del segundo cultivo alimentado fue de 56
96
Figura 31 Variacioacuten de la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) de Candida sp cuando se
utilizoacute una carga maacutesica del metal de 0514 mgh
La velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute progresivamente a medida
que transcurrieron los cultivos por lote alimentado desde 0181 hasta 0063 mgLh
(figura 32) estos valores son inferiores a los alcanzados en los cultivos por lote
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Efi
cie
nc
ia d
e r
ed
uc
cioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
CPLA1 CPLA2
97
Figura 32 Variacioacuten de la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Candida sp
en el cultivo por lote alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) llevados a
cabo con una carga maacutesica del metal de 0514 mgh
Posteriormente se realizoacute el cultivo por lote alimentado y lote alimentado repetido
utilizando una carga maacutesica de Cr(VI) de 105 mgh Se observoacute que en ambos cultivos
la masa celular de Candida sp se incrementoacute gradualmente a medida que se incrementoacute
el tiempo de incubacioacuten aunque al final de cada cultivo hubo una ligera disminucioacuten en la
cantidad de biomasa en el reactor En el primer cultivo por lote alimentado se alcanzoacute un
valor maacuteximo de 523 g de biomasa (incremento celular de 053 g) a las 637 h
mientras que en el segundo cultivo se alcanzoacute una cantidad maacutexima de biomasa de 435
g (incremento celular de 13 g) a las 1822 h totales de cultivo que corresponden a 893
h del cultivo por lote alimentado repetido
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica g
lob
al d
e
re
du
ccioacute
n d
e C
r(V
I) [
mg
de
Cr(V
I)L
h]
CPLA1 CPLA2
98
Asimismo se encontroacute que la levadura fue capaz de consumir parcialmente la glucosa
suministrada En el primer cultivo por lote alimentado se obtuvo una eficiencia de
consumo de glucosa del 299 mientras que en el segundo cultivo la eficiencia fue del
388 Estos resultados probablemente se deban a que el crecimiento de la levadura fue
mayor en el cultivo por lote alimentado repetido (incremento celular = 13 g) que en el
cultivo por lote alimentado que lo precedioacute (incremento celular = 053 g)
En los cultivos por lote alimentados llevados a cabo con una carga maacutesica de 105 mg de
Cr(VI) la levadura fue capaz de reducir parcialmente el Cr(VI) adicionado al reactor sin
embargo al final del primer cultivo por lote alimentado se lograron los niveles de
reduccioacuten maacutes altos
En el primer cultivo por lote alimentado la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) se
incrementoacute a medida que aumentoacute el tiempo de incubacioacuten alcanzaacutendose el valor maacutes
alto de eficiencia (529) a las 879 h de incubacioacuten En contraste en el segundo cultivo
por lote alimentado (alimentado repetido) la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute
continuamente conforme transcurrioacute el tiempo de cultivo Al final del cultivo por lote
alimentado repetido la eficiencia de reduccioacuten del metal fue del 43 (figura 33)
99
Figura 33 Variacioacuten de la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) de Candida sp cuando se
utilizoacute una carga maacutesica del metal de 105 mgh
En estos experimentos tambieacuten se observoacute que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de
Cr(VI) disminuyoacute continuamente durante todo el periodo de incubacioacuten desde 0226
hasta 0099 mgLh (figura 34)
0
10
20
30
40
50
60
0 50 100 150 200 250
Tiempo [h]
Efi
cie
ncia
de
re
du
ccioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
CPLA1 CPLA2
100
Figura 34 Variacioacuten de la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Candida sp
en el cultivo por lote alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) llevados a
cabo con una carga maacutesica del metal de 105 mgh
Las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) que se obtuvieron con una carga maacutesica
del metal de 105 mgh fueron inferiores a las logradas con una carga de 0514 mgh y
esto podriacutea deberse a que el tiempo de contacto entre la levadura y el medio de cultivo
fue menor En contraste las velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) fueron
ligeramente superiores a una carga maacutesica de 105 mgh
Con las dos cargas maacutesicas de Cr(VI) que se ensayaron en este trabajo se observoacute una
variacioacuten semejante en el pH de los medios de cultivo Los cultivos por lote alimentado
se iniciaron con un pH de 302-306 (estos valores corresponden al pH que se obtuvo al
final de los cultivos por lote que precedioacute a los cultivos por lote alimentado) El pH se
000
004
008
012
016
020
024
0 50 100 150 200 250
Tiempo [h]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica g
lob
al d
e r
ed
uccioacute
n
de
Cr(V
I) [
mg
de
Cr(V
I)L
h]
CPLA1 CPLA2
101
incrementoacute ligeramente durante el curso de los primeros cultivos por lote alimentado y al
final de eacutestos se tuvieron valores de 355 y de 345 cuando se emplearon cargas maacutesicas
de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh respectivamente En los cultivos por lote alimentado
repetido el pH se mantuvo praacutecticamente constante durante todo el periodo de
incubacioacuten
A pesar de que el cultivo por lote alimentado es muy recomendable para trabajar con
compuestos toacutexicos ha sido poco explorado para el tratamiento de aguas contaminadas
con cromo hexavalente Fujii y col (1990) utilizaron el cultivo por lote alimentado para
investigar la reduccioacuten de Cr(VI) por la bacteria anaerobia Enterobacter cloacae cepa
HO1 En este estudio una solucioacuten de cromato se alimentoacute continuamente en pequentildeas
dosis para minimizar el efecto toacutexico del metal Los investigadores encontraron que la
reduccioacuten de Cr(VI) fue fuertemente afectada por la velocidad especiacutefica de alimentacioacuten
de cromato Cuando esta velocidad fue inferior a 25 mmol de CrO42-g de biomasah
todo el cromo adicionado fue reducido A velocidades de alimentacioacuten superiores se
observoacute que la concentracioacuten de Cr(VI) residual en el medio de cultivo se incrementaba a
medida que aumentaba la velocidad de alimentacioacuten Asimismo encontraron que la
actividad reductora de la bacteria era fuertemente inhibida cuando la concentracioacuten de
Cr(VI) del medio de cultivo era mayor a 07 mM (3639 mgL)
Posteriormente Fujie y col (1996) realizaron la simulacioacuten de un cultivo por lote
alimentado utilizando datos cineacuteticos obtenidos en cultivo por lote y un modelo
matemaacutetico que describe el comportamiento de la bacteria antes mencionada Los
resultados experimentales y los predichos por el simulador fueron semejantes
102
En la tabla 11 se presentan los valores de velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
obtenidos en el presente trabajo en los diferentes sistemas de reaccioacuten ensayados La
mayor velocidad se obtuvo en el cultivo por lote realizado en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso por lo que eacuteste seriacutea el sistema maacutes adecuado para la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp
103
Tabla 11 Velocidades volumeacutetricas globales de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas en diferentes sistemas de reaccioacuten
CPL
Matraz
CPL Reactor
airlift con
tubo liso
CPL Reactor
airlift con
malla metaacutelica
CC Reactor
airlift con
tubo liso
CPLR Reactor
airlift con
tubo liso
CPL Reactor
airlift con tubo
perforado
CPLA Reactor
airlift con
tubo perforado
CPLAR Reactor
airlift con
tubo perforado
10
Vvm
05
vvm
10
vvm
10
vvm
10
vvm
05
vvm
10
vvm
05
vvm
05
vvm
f=08 f=06 f=04
CM1 CM2 CM1 CM2
098 151 ndash178 031 056 024 045 046 035 084 035 0092-0181
0163-0195
0063-0083
0099-0145
CPL = Cultivo por lote CC = Cultivo continuo CPLR = Cultivo por lote repetido CPLA = Cultivo por lote alimentado CPLAR = Cultivo por lote alimentado repetido f = relacioacuten de recambio CM = Carga maacutesica de Cr(VI)
CM1 = 0514 mg Cr(VI)h CM2 = 105 mg Cr(VI)h
104
5 CONCLUSIONES
El sulfato desempentildea un papel importante en la tolerancia al Cr(VI) y en la reduccioacuten
del mismo en la cepa de Candida sp utilizada en este trabajo
El efecto modulador del sulfato sobre el crecimiento celular y la reduccioacuten del Cr(VI)
depende de las concentraciones de los oxianiones sulfato y cromato
El mecanismo principal de remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp es la biotransformacioacuten
del altamente toacutexico Cr(VI) al menos toacutexico Cr(III)
El cultivo por lote en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso es el sistema de
reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
La velocidad de aireacioacuten no tiene un efecto significativo sobre la reduccioacuten de Cr(VI)
por Candida sp
105
6 REFERENCIAS
1 Acevedo-Aguilar FJ Espino-Saldantildea AE Leoacuten-Rodriacuteguez IL Rivera-Cano ME Avila-Rodriguez M Wrobel K et al 2006 Hexavalent chromium removal in vitro and from industrial wastes using chromate-resistant strains of filamentous
fungi indigenous to contaminated wastes Can J Microbiol 52 809-815
2 Ali-Awan M Baig MA Iqbal J Aslam MR amp Ijaz N 2003 Recovery of chromium (III) from tannery wastewater J App Sci amp Environ Management 7 (2) 5-8
3 Aacutelvarez SG Maldonado M Gerth A amp Kuschk P 2004 Characterization of
tannery effluents and study of the water Hyacinth in chromium recovery Informacioacuten Tecnoloacutegica 15 (3) 75-80
4 Aravindhan BM Madani B Rao JR Nair BU amp Ramasami T 2004 Bioaccumulation of Chromium from Tannery Wastewater An Approach for chrome
recovery and reuse Environ Sci Technol 38 300-306
5 Atkinson B amp Mavituna F 1983 Biochemical engineering and biotechnology handbook United Kingom Nature Press
6 Badar U Ahmed N Beswick AJ Pattanapipitpaisal P amp Macaskie LE 2000 Reduction of chromate by microorganisms isolated from metal contaminated sites of
Karachi Pakistan Biotechnol Lett 22 829-836 7 Bae WC Kang TG Kang IK Won YJ amp Jeong BC 2000 Reduction of
hexavalent chromium by Escherichia coli ATCC 33456 in batch and continuous cultures J Microbiol 38(1) 36-39
8 Balasubramanian S amp Pugalenthi V 1999 Determination of total chromium in
tannery wastewater by inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry
flame atomic absorption spectrometry and uv-visible spectrophotometric methods Talanta 50 (3) 457-467
9 Baldi F Vaughan AM amp Olson GJ 1990 Chromium(VI)-resistant yeast
isolated from a sewage treatment plant receiving tannery wastes Appl Environ
Microbiol 56 (4) 913-918
10 Barnhart J 1997 Occurrences uses and properties of chromium Regulatory Toxicology and Pharmacology 26 S3-S7
11 Beleza VM Boaventura RA amp Almeida MF 2001 Kinetics of chromium removal from spent tanning liquors using acetylene production sludge Environ
Sci Technol 35 (21) 4379-4383 12 Bhide JV Dhakephalkar PK amp Paknikar KM 1996 Microbiological process for
the removal of Cr(VI) from chromate-bearing cooling tower effluent Biotechnol Lett 18 (6)667-672
106
13 Bopp LH amp Ehrlich HL 1988 Chromate resistance and reduction in
Pseudomonas fluorescens strain LB300 Archives of Microbiology 150 426-431
14 Branco R Alpoim MC amp Morais PV 2004 Ochrobactrum tritici strain 5bvI1 ndash characterization of a Cr(VI)-resistant and Cr(VI)-reducing strain Can J Microbiol
50 697-703 15 Camargo FAO Bento FM Okeke BC amp Frankenberger WT 2002 Chromate
reduction by chromium-resistant bacteria isolated from soils contaminated with dichromate Journal of Environmental Quality 32 1228-1233
16 Camargo FAO Okeke BC Bento FM amp Frankenberger WT 2003 In vitro
reduction of hexavalent chromium by a cell-free extract of Bacillus sp ES 29
stimulated by Cu2+ Appl Microbiol Biotechnol 62 569-573
17 Cantildeizares-Villanueva R 2000 Biosorcioacuten de metales pesados mediante el uso de biomasa microbiana Rev Latinoam Microbiol 42 131-143
18 Cervantes C Campos-Garciacutea J Devars S Gutieacuterrez-Corona F Loza-Tavera H Torres-Guzmaacuten JC amp Moreno-Saacutenchez R 2001 Interactions of chromium with
microorganisms and plants FEMS Microbio Rev 25 335-347 19 Chardin B Dolla A Chaspoul F Fardeau ML Gallice P amp Bruschi M 2002
Bioremediation of chromate thermodynamic analysis of the effects of Cr(VI) on sulfate-reducing bacteria Appl Microbiol Biotechnol 60 352-360
20 Chardin B Giudici-Orticoni MT De Luca G Guigliarelli B amp Bruschi M 2003
Hydrogenases in sulfate-reducing bacteria function as chromium reductase Appl
Microbiol Biotechnol 63 315-321
21 Cheung Y amp Gu G 2003 Reduction of chromate (CrO42-) by an enrichment
consortium and an isolate of marine sulfate-reducing bacteria Chemosphere 52 1523-1529
22 Cheung KH amp Gu JD 2005 Chromate reduction by Bacillus megaterium TKW3
isolated from marine sediments World Journal of Microbiology amp Biotechnology 21 213-219
23 Cheung KH amp Gu JD 2007 Mechanism of hexavalent chromium detoxification
by microorganisms and bioremediation application potential a review International
Biodeterioration amp Biodegradation 59 8-15
24 Chirwa EMN amp Wang YT 1997 Hexavalent chromium reduction by Bacillus sp in a packed-bed bioreactor Environ Sci Technol 31 1446-1451
25 Cristiani-Urbina E Netzahuatl-Muntildeoz AR Manriquez-Rojas FJ Juaacuterez-Ramiacuterez C Ruiz-Ordaz N amp Galiacutendez-Mayer J 2000 Batch and fed-batch
cultures for the treatment of whey with mixed yeast cultures Process Biochemistry 35 649-657
107
26 Czakoacute-Veacuter K Batiegrave M Raspor P Sipiczki M amp Pesti M 1999 Hexavalent
chromium uptake by sensitive and tolerant mutants of Schizosaccharomyces pombe FEMS Microbiology Letters 178 109-115
27 DeLeo PC amp Ehrlich HL 1994 Reduction of hexavalent chromium by
Pseudomonas fluorescens LB300 in batch and continuous cultures Appl Microbiol Biotechnol 40 756-759
28 Desjardin V Bayard R Lejeune P amp Gourdon R 2003 Utilization of supernatant of pure cultures of Streptomyces thermocarboxydus NH50 to reduce
chromium toxicity and mobility in contaminated soils Water Air and Soil Pollut 3 153-160
29 Eccles H 1999 Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process TIBTECH 17 462-465
30 Faisal M amp Hasnain S 2004 Comparative study of Cr(VI) uptake and reduction in
industrial effluent by Ochrobactrum intermedium and Brevibacterium sp
Biotechnology Letters 26 1623-1628
31 Fruchter J 2002 In situ treatment of chromium-contaminated groundwater Environ Sci amp Technol pp 464-472
32 Fujie K Hu H Huang X Tanaka Y Urano K amp Ohtake H 1996 Optimal operation of bioreactor system developed for the treatment of chromate wastewater
using Enterobacter cloacae HO-1 Wat Sci Tech 33 (5-6) 173-182 33 Fujii E Toda K amp Ohtake H 1990 Bacterial reduction of toxic hexavalent
chromium using a fed-batch culture of Enterobacter cloacae strain HO1 J Ferment Bioeng 69 (6) 365-367
34 Gaballah I Goy D Kilbertus G amp Thauront J 1994 Decontamination of
industrial effluents for environment protection and recycling of metals Resources
Conservation and Recycling 10 (1-2) 97-106
35 Galiacutendez-Mayer J Saacutenchez-Teja O Cristiani-Urbina E amp Ruiz-Ordaz N 2001 A novel split-cylinder airlift reactor for fed-batch cultures Bioprocess and Biosystems
Engineering 24 171-177 36 Ganguli A amp Tripathi AK 1999 Survival and chromate reducing ability of
Pseudomonas aeruginosa in industrial effluents Lett Appl Microbiol 28 76-80
37 Garbisu C Alkorta I Llama MJ amp Serra JL 1998 Aerobic chromate reduction by Bacillus subtilis Biodegradation 9 133-141
38 Gonzaacutelez AR Ndungrsquou K amp Flegal AR 2005 Natural occurrence of hexavalent chromium in the Aromas Red Sands Aquifer California Environ Sci Technol 39
(15) 5505-5511
108
39 Gopalan R amp Veeramani H 1994 Studies on microbial chromate reduction by
Pseudomonas sp in aerobic continuous suspended growth cultures Biotechnology and Bioengineering 43 471-476
40 Guertin J Jacobs JA amp Avakian CP 2005 Chromium(VI) Handbook 1st
edition CRC Press USA 41 Hach Water Analysis Handbook 2002 Hach Company Colorado USA 4th ed
pp 433-444 1210-1211
42 Hafez AI El-Manharawy MS amp Khedr MA 2002 RO membrane removal of unreacted chromium from spent tanning effluent A pilot-scale study Part 2 Desalination 144 (1-3) 237-242
43 Hagino H Odagiri H amp Okutani J 1982 Draft device for a bubble column US
Patent 4327042 44 Horitsu H Futo S Miyazawa Y Ogai S amp Kawai K 1987 Enzymatic
reduction of hexavalent chromium by hexavalent chromium tolerant Pseudomonas ambigua G-1 Agric Biol Chem 51 (9) 2417-2420
45 Ishibashi Y Cervantes C amp Silver S 1990 Chromium reduction in Pseudomonas
putida Appl Environ Microb 56 (7) 2268-2270
46 Jianlong W Zeyu M amp Xuan Z 2004 Response of Saccharomyces cerevisiae to
chromium stress Process Biochem 39 1231-1235 47 Juvera-Espinosa J Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2006 Isolation and
characterization of a yeast strain capable of removing Cr(VI) Enzyme and Microbial Technology 40 114-121
48 Kaszycki P Fedorovych D Ksheminska H Babyak L Gonchar MV Jaglarz
A amp Koloczek H 2003 Modulation of chromium(VI) and (III) tolerance and
accumulation in yeast by sulfate-containing salts European Journal of Biochemistry 1 (1) P49-53
49 Komori K Wang P Toda K amp Ohtake H 1989 Factors affecting chromate
reduction in Enterobacter cloacae Strain HO1 Appl Microbiol Biotechnol 31 567-570
50 Ksheminska H Fedorovych D Babyak L Yanovych D Kaszycki P amp Koloczek H 2005 Chromium(III) and (VI) tolerance and bioaccumulation in
yeast a survey of cellular chromium content in selected strains of representative genera Process Biochem 40 1565-1572
51 Ksheminska HP Honchar TM Gayda GZ amp Gonchar MV 2006 Extra-cellular chromate-reducing activity of the yeast cultures Central European Journal of
Biology 1 (1)137-149
109
52 Kurniawan TA Chan GYS Lo W amp Babel S 2006 Physico-chemical
treatment techniques for wastewater laden with heavy metals Chemical Engineering Journal 118 83-98
53 Labra M Grassi F Imazio S Di Fabio T Citterio S Sgorbati S amp Agradi E
2004 Genetic and DNA-methylation changes induced by potassium dichromate in Brassica napus L Chemosphere 54 1049-1058
54 Laxman RS amp More S 2002 Reduction of hexavalent chromium by Streptomyces griseus Minerals Engineering 15 831-837
55 Leustek T 2002 Sulfate metabolism The Arabidopsis Book American Society of
Plant Biologists
56 Liu YG Xu WH Zeng GM Li X and Gao H 2006 Cr(VI) reduction by
Bacillus sp isolated from chromium landfill Process Biochemistry 41 1981-1986 57 Llovera S Bonet R Simon-Pujol MD amp Congregado F 1993 Effect of culture
medium ions on chromate reduction by resting cells of Agrobacterium radiobacter Appl Microbiol Biotechnol 39 424-426
58 Lloyd JR 2003 Microbial reduction of metals and radionuclides FEMS Microbiol
Rev 27 411-425
59 Marsh TL amp McInerney MJ 2001 Relationship of hydrogen bioavailability to
chromate reduction in aquifer sediments Appl Environ Microb 67 (4) 1517-1521
60 McLean J amp Beveridge TJ 2001 Chromate reduction by a pseudomonad isolated from a site contaminated with chromated copper arsenate Applied and
Environmental Microbiology 67 (3)1076-1084 61 Megharaj M Avudainayagam S amp Naidu R 2003 Toxicity of hexavalent
chromium and its reduction by bacteria isolated from soil contaminated with tannery waste Current Microbiology 47 51-54
62 Middleton SS Latmani RB Mackey MR Ellisman MH Tebo BM amp Criddle
CS 2003 Cometabolism of Cr(VI) by Shewanella oneidensis MR-1 produces cell-associated reduced chromium and inhibits growth Biotechnol Bioeng 83 627-637
63 Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2006 Removal of hexavalent chromium
by Trichoderma viride in an airlift bioreactor Enzyme and Microbial Technology 40 107-113
64 Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2008 Hexavalent chromium removal by Trichoderma inhamatum fungal strain isolated from tannery effluent Enzyme and
Microbial Technology 40 107-113
110
65 Morales B L 2005 Aislamiento de microorganismos y estudio de su capacidad
para remover cromo hexavalente Tesis de Maestriacutea Escuela Nacional de Ciencias Bioloacutegicas IPN Meacutexico
66 Muter O Patmalnieks A amp Rapoport A 2001 Interrelations of the yeast Candida
utilis and Cr(VI) metal reduction and its distribution in the cell and medium Process Biochem 36 963-970
67 Ohtake H Cervantes C amp Silver S 1987 Decreased chromate uptake in Pseudomonas fluorescens carrying a chromate resistance plasmid J Bacteriol 169
3853-3856 68 Pal N 1997 Reduction of hexavalent chromium to trivalent chromium by
Phanerochaete chrysosporium pp 511-517 En Alleman BC amp Leeson A In Situ and On-Site Bioremediation Vol 2 Battelle Press Ohio USA
69 Pattanapipitpaisal P Brown NL amp Macaskie LE 2001 Chromate reduction by
Microbacterium liquefaciens immobilised in polyvinyl alcohol Biotechnol Lett 23
61-65
70 Pepi M amp Baldi F 1992 Modulation of chromium(VI) toxicity by organic and inorganic sulfur species in yeasts from industrial wastes BioMetals 5 179-185
71 Quintana M Curutchet G amp Donati E 2001 Factors affecting chromium(VI) reduction by Thiobacillus ferrooxidans Biochemical Engineering Journal 9 11-15
72 Ramiacuterez-Ramiacuterez R Calvo-Meacutendez C Aacutevila-Rodriacuteguez M Lappe P Ulloa M
Vaacutezquez-Juaacuterez R amp Gutieacuterrez-Corona JF 2004 Cr(VI) reduction in a chromate-
resistant strain of Candida maltosa isolated from the leather industry Antonie van Leeuwenhoek 85 63-68
73 Rege MA Petersen JN Johnstone DL Turick CE Yonge DR amp Apel WA
1997 Bacterial reduction of hexavalent chromium by Enterobacter cloacae strain
HO1 grown on sucrose Biotechnol Lett 19 (7) 691-694
74 Roukas T 1993 Ethanol production from nonsterilized carob pod extract by free and immobilized Saccharomyces cerevisiae cells using fed-batch culture
Biotechnol Bioeng 43 189-194 75 Ruiacutez MA 2000 Recuperacioacuten de metales pesados de soluciones diluidas por
biosorcioacuten con bacteria En Medrano RH Galan WL Biotecnologiacutea de Minerales CONACYT Meacutexico pp 235-262
76 Saxena D Levin R amp Firer MA 2000 Removal of chromate from industrial
effluent by a new isolate of Staphylococcus cohnii Wat Sci Technol 42 (1-2)
93-98
77 Secretariacutea de Comercio y Fomento Industrial NMX-AA-74-1981 Anaacutelisis de Agua ndash Determinacioacuten del Ioacuten Sulfato
111
78 Secretariacutea de Economiacutea NMX-AA-051-SCFI-2001 Anaacutelisis de Agua -
Determinacioacuten de Metales por Absorcioacuten Atoacutemica en Aguas Naturales Potables Residuales y Residuales Tratadas - Meacutetodo de Prueba
79 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NMX-AA-044-SCFI-
2001 Anaacutelisis de Aguas - Determinacioacuten de Cromo Hexavalente en Aguas Naturales Potables Residuales y Residuales Tratadas - Meacutetodo de Prueba En Diario Oficial de la Federacioacuten 1 de agosto 2001
80 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996
Liacutemites Maacuteximos Permisibles de Contaminantes en las Descargas de Aguas Residuales en Aguas y Bienes Nacionales En Diario Oficial de la Federacioacuten 6 de enero 1997
81 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996
Liacutemites Maacuteximos Permisibles de Contaminantes en las Descargas de Aguas Residuales a los Sistemas de Alcantarillado Urbano o Municipal En Diario Oficial de la Federacioacuten 3 de junio 1998
82 Secretariacutea de Salud Proyecto de Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-
NOM-127-SSA1-1994 Salud Ambiental Agua para Uso y Consumo Humano - Liacutemites Permisibles de Calidad y Tratamientos a que debe Someterse el Agua para su Potabilizacioacuten En Diario Oficial de la Federacioacuten 20 de Octubre 2000
83 Shakoori AR Makhdoom M amp Haq RU 2000 Hexavalent chromium reduction
by a dichromate-resistant gram-positive bacterium isolated from effluents of tanneries Appl Microbiol amp Biotechnol 53 (3) 348-351
84 Shen H and Wang YT 1994 Biological reduction of chromium by E coli Journal of Environmental Engineering 120 560-572
85 Shen H amp Wang Y 1995 Hexavalent chromium removal in two-stage bioreactor
system J Environ Eng 121 (11) 798-804
86 Smith WA Apel WA Petersen JN amp Peyton BM 2002 Effect of carbon and
energy source on bacterial chromate reduction Bioremediation J 6 (3) 205-215
87 Smith WL amp Gadd GM 2000 Reduction and precipitation of chromate by mixed culture sulphate-reducing biofilms J Appl Microbiol 88 983-991
88 Song Z Williams CJ amp Edyvean RGJ 2004 Treatment of tannery wastewater by chemical coagulation Desalination 164 (3) 249-259
89 Srinath T Verma T Ramteke PW amp Garg SK 2002 Chromium (VI)
biosorption and bioaccumulation by chromate resistant bacteria Chemosphere 48
(4) 427-435
90 Stanbury PF amp Whitaker A ―Principles of Fermentation Technology Pergamon Press Ltd Great Britain 1984 First edition Pp 11-24
112
91 Stasinakis AS Mamais D Thomaidis NS amp Lekkas TD 2002 Effect of
chromium (VI) on bacterial kinetics of heterotrophic biomass of activated sludge Water Res 36 3341-3349
92 Stasinakis AS Thomaidis NS Mamais D Karivali M amp Lekkas TD 2003
Chromium species behaviour in the activated sludge process Chemosphere 52 1059-1067
93 Stephen JR amp Macnaughton SJ 1999 Developments in terrestrial bacterial remediation of metals Current Opinion in Biotechnology 10 230-233
94 Su C amp Ludwig RD 2005 Treatment of hexavalent chromium in chromite ore
processing solid waste using a mixed reductant solution of ferrous sulfate and
sodium dithionite Environ Sci Technol 39 (16) 6208-6216
95 Thacker U Parikh R Shouche Y amp Madamwar D 2006 Hexavalent chromium reduction by Providencia sp Process Biochem 41 1332-1337
96 Thacker U amp Madamwar D 2005 Reduction of toxic chromium and partial localization of chromium reductase activity in bacterial isolate DM1 Would Journal
of Microbiology amp Biotechnology 21 891-899 97 Tung HL Chiou SY Tu CC amp Wu WT 1997 An airlift reactor with double
net draft tubes and its application in fermentation Bioprocess Eng 171-5
98 Turick CE Apel WA amp Carmiol NS 1996 Isolation of hexavalent chromium-reducing anaerobes from hexavalent-chromium-contaminated and noncontaminated environments Applied Microbiol Biotechnol 44 683-688
99 Viamajala S Peyton BM Sani RK Apel WA amp Petersen JN 2004 Toxic
effects of chromium(VI) on anaerobic and aerobic growth of Shewanella oneidensis MR-1 Biotechnol Prog 20 87-95
100 Volesky B amp Vieira RHSF 2000 Biosorption a solution to pollution Internat Microbiol 3 17-24
101 Wang DIC Cooney CL Demain AL Dunnill P Humphrey AE amp Lilly MD
1979 ―Fermentation and Enzyme Technology John Wiley amp Sons Inc USA Pp 98-115
102 Wang YT and Shen H 1997 Modelling Cr(VI) reduction by pure bacterial cultures Water Research 31 727-732
103 Wang Y amp Xiao C 1995 Factors affecting hexavalent chromium reduction in pure
cultures of bacteria Water Res 29 (11) 2467-2474
104 Wang Y 2000 Microbial reduction of chromate En Lovley DR (Ed)
Environmental Microbe-Metal Interactions ASM Press Washington DC USA pp 225-235
113
105 Wilkin RT Su C Ford RG amp Paul CJ 2005 Chromium-removal processes
during groundwater remediation by a zerovalent iron permeable reactive barrier Environ Sci Technol 39 (12) 4599-4605
106 Worthington Biochemical Corporation 1972 Worthington Enzyme Manual
Enzymes Enzyme Reagents and Related Biochemicals Freehold New Jersey USA
107 Wu J amp Wu WT 1991 Fed-batch culture of Saccharomyces cerevisiae in an airlift reactor with net draft tube Biotechnol Prog 7 230-233
108 Wu WT amp Wu JY 1990 Airlift reactor with net draught tube J Ferm Bioeng
70 359-361
109 Wu WT Wu JY amp Jong JZ 1992 Mass transfer in an airlift reactor with a net
draft tube Biotechnol Prog 8 465-468 110 Zakaria ZA Zakaria Z Surif S amp Ahmad WA 2006 Hexavalent chromium
reduction by Acinetobacter haemolyticus isolated from heavy-metal contaminated wastewater J Hazard Mater 146 30-38
111 Zuacutentildeiga M 2005 Aislamiento de microorganismos con capacidad para remover
cromo hexavalente del agua Tesis de Licenciatura Escuela Nacional de Ciencias
Bioloacutegicas IPN Meacutexico
Referencias electroacutenicas
httpepagov httpesepagovtechpubs412304html
httpfaiunneeduarbiologiamicroindcultivo20y20biorreactoreshtm httpmineralserusgsgovmineralspubscommoditychromium180494pdf
httpuserpagesumbcedu gferre1bmcohtml
httpuserpagesumbcedu gferre1fedbatchhtml httpwwgemesmaterialdocument httpwwwatsdrcdcgovfacts7 html
httpwwwchemicalelementscomelementscrhtml httpwwwepagoviris
wwwclu-inorgdownloadstudentpapersbio_of_metals_paperpdf
114
7 Impacto
En este trabajo se identificaron algunas variables ambientales que afectan la
biorreduccioacuten de cromo hexavalente [Cr(VI)] La informacioacuten obtenida podriacutea ser de
utilidad para mejorar los procesos de reduccioacuten del metal asiacute como para disminuir los
tiempos y costos del tratamiento de los efluentes industriales contaminados con Cr(VI)
Los resultaron mostraron que el sulfato afecta la tolerancia de Candida sp al Cr(VI) y a
su capacidad para reducirlo Fue evidente que a medida que se incrementoacute la
concentracioacuten de sulfato aumentoacute el crecimiento de la levadura la eficiencia global y la
velocidad global de reduccioacuten de Cr(VI) Asimismo se encontroacute que la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp depende de la densidad celular de los cultivos de manera tal que
a mayor cantidad de biomasa producida mayor es la reduccioacuten del metal Aun cuando la
cepa de Candida sp es sensible a los efectos toacutexicos del Cr(VI) en ausencia del sulfato
esta levadura posee una notable capacidad para reducir muy altas concentraciones de
Cr(VI) en presencia de sulfato por lo que podriacutea ser potencialmente uacutetil para el
tratamiento de aguas industriales altaminadas con Cr(VI) y con iones sulfato
Hasta donde sabemos este es el primer trabajo en el que se demuestra que el sulfato
desempentildea un papel impotante tanto en la tolerancia al Cr(VI) como en la reduccioacuten
aeroacutebica del mismo en microorganismos Estos descubrimientos podriacutean tener
implicaciones importantes en el tratamiento de aguas residuales contaminadas con
Cr(VI)
Ademaacutes se encontroacute que los contactores gas-liacutequido son adecuados para la reduccioacuten
aeroacutebica de Cr(VI) por Candida sp Esto uacuteltimo es de vital importancia porque seriacutea
posible disminuir significativamente los costos de tratamiento ya que estos biorreactores
se caracterizan por su baja economiacutea de aireacioacuten Las velocidades volumeacutetrica y
especiacutefica asiacute como la capacidad de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por Candida sp en el
reactor airlift con tubo conceacutentrico fueron superiores a las obtenidas en matraz y eacutesto
podriacutea deberse a que en el reactor airlift la levadura tuvo una mayor cantidad de oxiacutegeno
disponible para su crecimiento y a que el mayor nuacutemero de ceacutelulas producidas fue la
responsable de reducir maacutes eficazmente el Cr(VI) presente en el medio de cultivo
115
Las caracteriacutesticas mostradas por Candida sp en el dispositivo airlift indican que este
tipo de reactor neumaacutetico es adecuado para el crecimiento y la reduccioacuten aeroacutebica del
Cr(VI) por la levadura Asimismo los paraacutemetros cineacuteticos del proceso de reduccioacuten de
Cr(VI) catalizado por Candida sp son superiores a los reportados para otros
microorganismos lo que sugiere que esta cepa de levadura tiene potencial biotecnoloacutegico
para ser utilizada en procesos de remediacioacuten de aguas residuales industriales
contaminadas con Cr(VI)
De los diferentes sistemas de reaccioacuten ensayados (cultivos por lote lote repetido
continuo de una etapa lote alimentado y lote alimentado repetido) el cultivo por lote es
el maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
Otra de las contribuciones de este trabajo fueron la formacioacuten de recursos humanos
tanto a nivel licenciatura como de posgrado Uno de los estudiantes de licenciatura ya
sustentoacute su examen profesional y la tesis de Maestriacutea de otra estudiante ya fue revisada
y aprobada por los sinodales por lo que el examen para obtener el grado se realizaraacute en
poco tiempo Actualmente estaacuten en proceso 1 tesis de licenciatura 2 de maestriacutea y 1 de
doctorado
Entre otros productos del proyecto de investigacioacuten se tienen la publicacioacuten de 2 artiacuteculos
en revistas internacionales incluidas en la base de datos del Journal of Citation Reports
del Institute for Scientific Information (ISI) la publicacioacuten de 2 artiacuteculos en extenso en
las memorias de Congresos Internacionales y la presentacioacuten de varios trabajos en
eventos acadeacutemicos nacionales e internacionales
8
los sistemas de tratamiento bioloacutegico de aguas residuales ya que reduce
significativamente la eficiencia de remocioacuten de los contaminantes y la calidad del efluente
(Stasinakis y col 2002 2003)
En las plantas el cromo hexavalente reduce la actividad de las enzimas fotosinteacuteticas y
en general de las proteiacutenas (Morales 2005) ocasiona enfermedades como la clorosis e
interfiere en diversos procesos metaboacutelicos que causan finalmente la muerte de estos
organismos Asimismo se ha demostrado que rompe la unioacuten azuacutecar-fosfato de la
cadena de aacutecido desoxirribonucleico (DNA) y produce una hiper-metilacioacuten de las bases
nitrogenadas lo que ocasiona mutaciones al azar (Labra y col 2004)
Diversos estudios han demostrado que el cromo hexavalente es cien veces maacutes toacutexico
(Garbisu y col 1998) y mil veces maacutes mutageacutenico que el estado trivalente (Wang
2000 Saxena y col 2000 Lloyd 2003)
14 Cantidad de cromo liberado al medio ambiente y legislacioacuten ambiental
Se estima que maacutes de 170000 toneladas de residuos que contienen cromo se descargan
al medio ambiente cada antildeo (Marsh y McInerney 2001) En la tabla 1 se muestran
algunos datos reportados sobre el contenido de cromo en algunos efluentes industriales
asiacute como en aguas superficiales y freaacuteticas Se puede apreciar que la concentracioacuten de
cromo de los efluentes variacutea considerablemente incluso en los del mismo sector
industrial
9
Tabla 1 Concentraciones de cromo total yo Cr(VI) de efluentes industriales y cuerpos
de agua
Fuente Concentracioacuten de cromo total
Concentracioacuten de Cr (VI)
Referencia
Industria galvanizadora ---
5000 mgL
Gaballah y col 1994
Industria galvanizadora (1) Industria galvanizadora (2)
---
---
127 mgL
3700 mgL
Fujie y col 1996
Acuiacutefero Aromas Red Sands (California)
---
6-36 gL
Gonzaacutelez y col 2005
Agua subterraacutenea contaminada (EEUU)
gt 1500 gL
---
Wilkin y col 2005
Riacuteo receptor de efluentes de la industria papelera
20-80 mgL
---
Cervantes y col 2001
Planta de tratamiento de desechos de produccioacuten de
ferrocromita
---
3-57 mgL
(fase disuelta)
Su y Ludwig 2005
Curtiduriacutea de pieles
(Grecia)
2000 ndash 3500
mgL
--- httpesepagovtechpubs41230
4html
Curtiduriacutea de pieles (tanque de sedimentacioacuten)
3500 gmL
40 gmL
Ganguli y Tripathi 1999
Curtiduriacutea de pieles (tanque de descarga)
5000 gmL
3000 gmL
Ganguli y Tripathi 1999
Curtiduriacutea de pieles (India) 200 - 2400 mgL ---
Balasubramanian y Pugalenthi 1999
Curtiduriacutea de pieles (Portugal)
2467 mgL
---
Beleza y col 2001
Efluente tratado de
curtiduriacutea de pieles (India)
---
096 mgL
Srinath y col 2002
Curtiduriacutea de pieles (Egipto)
---
1300-2500
mgL
Hafez y col 2002
Curtiduriacutea de pieles (1) (Pakistaacuten) Curtiduriacutea de pieles (2) (Pakistaacuten)
2877 mgL
220 mgL
---
---
Ali-Awan y col 2003
Curtiduriacutea de pieles 12 mgL --- Song y col 2004
Curtiduriacutea de pieles (Guanajuato Meacutexico)
250 gmL
---
Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004
Curtiduriacutea de pieles (India) 500-1000 mgL
---
Aravindhan y col 2004
Bantildeos de curtido al cromo
en curtiduriacuteas (Leoacuten Guanajuato Meacutexico)
3000 ndash10000 mgL
---
Aacutelvarez y col 2004
10
En Meacutexico no se tienen datos precisos sobre la cantidad y concentracioacuten de cromo total
o hexavalente de los residuos generados por las diversas industrias sin embargo se ha
informado que las industrias del curtido de pieles generan de 250 a 270 toneladas de
Cr2O3 al antildeo (Zuacutentildeiga 2005)
Debido a las grandes cantidades de cromo que se liberan al medio ambiente asiacute como a
los efectos indeseables que este metal ocasiona sobre los seres vivos en muchos paiacuteses
se han establecido Normas Ambientales que pretenden regular la concentracioacuten de cromo
total yo de Cr(VI) de los desechos liacutequidos soacutelidos o gaseosos que se descargan al
medio ambiente
En Meacutexico la Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca ha decretado
normas oficiales que establecen los liacutemites maacuteximos permisibles de contaminantes
incluido el cromo ya sea como cromo total o como cromo hexavalente de las aguas
residuales que se descargan en aguas y bienes nacionales (Secretariacutea de Medio
Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996) (tabla 2) asiacute como en los
sistemas de alcantarillado urbano o municipal (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos
Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996) (tabla 3)
En cuanto al agua para uso y consumo humano la Secretariacutea de Salud ha emitido la
Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-1994 (Secretariacutea de Salud Proyecto de
Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-1994) donde se indica
como liacutemite maacuteximo permisible una concentracioacuten de cromo total de 005 mgL
11
Tabla 2 Liacutemites maacuteximos permisibles de cromo total para las aguas residuales que se descargan en aguas y bienes
nacionales (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996)
Paraacutemetros
( )
Riacuteos Embalses
Naturales y
Artificiales
Aguas Costeras Suelo
(mgL) Uso en
riego
agriacutecola
(A)
Uso
puacuteblico
urbano
(B)
Proteccioacuten
de vida
acuaacutetica
( C )
Uso en
riego
agriacutecola
(B)
Uso
puacuteblico
urbano
( C )
Explotacioacuten
pesquera
navegacioacuten
y otros
usos (A)
Recreacioacuten
(B)
Estuarios
(B)
Uso en
riego
agriacutecola
(A)
Humedales
naturales
(B)
PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD
Cromo 1 15 05 10 05 10 1 15 05 10 05 10 1 15 05 10 05 10 05 10
() Medidos de manera total PD = Promedio diario PM = Promedio mensual (A) (B) y ( C ) Tipo de cuerpo receptor seguacuten la Ley Federal de Derechos
Tabla 3 Liacutemites maacuteximos permisibles de cromo hexavalente para los sistemas de alcantarillado urbano o municipal
(Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996)
Paraacutemetros (mgL) Promedio Mensual Promedio Diario Instantaacuteneo
Cromo hexavalente 05 075 1
12
Por su parte la EPA ha establecido como liacutemite una concentracioacuten de 01 mg de cromo
por litro de agua potable (httpwwwatsdrcdcgovfacts7html)
La Organizacioacuten Mundial para la Salud (OMS) y la Comunidad Econoacutemica Europea (CEE)
establecen una concentracioacuten de 005 mg de cromo totalL como paraacutemetro de calidad
para aguas destinadas a consumo humano (httpwwgemesmaterialdocument)
Algunos valores sentildealados por otras instancias internacionales se muestran en la tabla
4
Tabla 4 Liacutemites permisibles para cromo sentildealados por Directivas Internacionales
sobre agua potable y aguas embotelladas (Zuacutentildeiga 2005)
Paraacutemetro Canadaacute 1 Japoacuten 2 Aguas embotelladas Nivel de
Administracioacuten Federal sobre
Productos Farmaceacuteuticos de EEUU
Cromo
005 mgL
005 mgL
01 mgL
1 Liacutemite establecido por el Ministerio de Salud de Canadaacute
2 Liacutemite establecido por el Ministerio de Salud y Bienestar Social de Japoacuten
15 Meacutetodos para la remocioacuten de cromo de los efluentes industriales
Para disminuir los efectos toacutexicos del metal es conveniente aplicar alguacuten(os)
tratamiento(s) a los efluentes industriales que contienen cromo antes de descargarlos en
los cuerpos de agua o en el suelo asiacute como restaurar los ecosistemas contaminados En
la actualidad estaacuten disponibles varias tecnologiacuteas para estos propoacutesitos (Eccles 1999)
Estas tecnologiacuteas se han empleado para reducir la toxicidad del contaminante [mediante
la transformacioacuten quiacutemica o bioloacutegica del Cr(VI) a Cr(III)] para removerlo de un lugar
para disminuir la extensioacuten de la contaminacioacuten o para contenerlo en un aacuterea en
particular (Guertin y col 2005)
13
151 Procesos convencionales
Los meacutetodos convencionales para la remocioacuten de los metales pesados son de naturaleza
fisicoquiacutemica y pueden ser utilizados en varias etapas del tratamiento de aguas
residuales Los meacutetodos maacutes usuales para la remocioacuten de Cr(VI) de los efluentes
industriales son los siguientes 1) reduccioacuten quiacutemica ndash precipitacioacuten en donde el Cr(VI)
es reducido quiacutemicamente a Cr(III) a pH aacutecido utilizando alguacuten agente reductor (por
ejemplo el bisulfito de sodio) y posteriormente se adiciona cal o alguacuten otro compuesto
alcalino para formar hidroacutexido de cromo (III) el cual es separado por sedimentacioacuten y
2) coagulacioacuten-floculacioacuten En general estos meacutetodos tienen algunas desventajas tales
como 1) son costosos ya que el agente activo no puede ser recuperado para su
posterior reutilizacioacuten 2) algunos reactivos quiacutemicos son sumamente toacutexicos 3) su
selectividad es baja 4) generan lodos quiacutemicos con altas concentraciones de metales los
cuales son difiacuteciles de tratar 5) la remocioacuten de los metales es incompleta principalmente
cuando la concentracioacuten de eacutestos en los efluentes es inferior a 100 mgL y 6) las aguas
residuales resultantes no satisfacen los criterios de calidad establecidos en la legislacioacuten
ambiental (Cantildeizares-Villanueva 2000 Ruiacutez 2000 Saxena y col 2000 Cheung y Gu
2003)
Algunas otras tecnologiacuteas que se utilizan ocasionalmente para la remocioacuten del Cr(VI) son
el intercambio ioacutenico la adsorcioacuten el tratamiento electroquiacutemico la oacutesmosis inversa y la
evaporacioacuten (Garbisu y col 1998 Camargo y col 2003 Kurniawan y col 2006) Las
principales desventajas de estos meacutetodos son los altos costos fijos de operacioacuten y de
mantenimiento por lo que su aplicacioacuten a grandes voluacutemenes de agua o su uso por
pequentildeas y medianas empresas estaacute muy limitado
14
La EPA recomienda los siguientes meacutetodos para la remocioacuten de cromo del agua potable
en caso de que eacutesta exceda el liacutemite permisible para este metal coagulacioacuten-filtracioacuten
intercambio ioacutenico y oacutesmosis inversa (httpepagov)
En Meacutexico en caso de que el agua destinada a uso y consumo humano exceda el liacutemite
permisible de cromo total la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-1994
(Secretariacutea de Salud Proyecto de Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-
127-SSA1-1994) indica como tratamientos a aplicar el intercambio ioacutenico o la oacutesmosis
inversa
152 Procesos biotecnoloacutegicos
En las uacuteltimas dos deacutecadas se han llevado a cabo estudios con el fin de utilizar
microorganismos y plantas para la restauracioacuten de sitios y para el tratamiento de
efluentes industriales contaminados con metales toacutexicos (Stephen y Macnaughton 1999
Lloyd 2003)
En la actualidad se considera que los procesos microbioloacutegicos son la alternativa maacutes
atractiva para remover algunos metales toacutexicos de los sitios y efluentes contaminados
ya que estos procesos son ―amigables con el medio ambiente los subproductos que
generan son usualmente inocuos son muy eficientes en la remocioacuten de los metales
(particularmente cuando las concentraciones de eacutestos son bajas condiciones en las que
algunos procesos fisicoquiacutemicos son muy ineficientes) y son de bajo costo (Cheung y
Gu 2005 Chardin y col 2002 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004)
15
Dentro de los procesos biotecnoloacutegicos propuestos para la remocioacuten de Cr(VI) se
encuentran la biosorcioacuten y la reduccioacuten bioloacutegica en los cuales se han utilizado
principalmente microorganismos (Volesky y Vieira 2000 Fruchter 2002 Cheung y Gu
2003)
En la biosorcioacuten se utilizan ciertos tipos de adsorbentes bioloacutegicos por ejemplo biomasa
microbiana (viva o inactivada en suspensioacuten o inmovilizada) con los que no se requiere
energiacutea metaboacutelica para retener pasivamente al cromo hexavalente mediante procesos
fiacutesicos (adsorcioacuten fiacutesica principalmente por fuerzas de van Der Waals) o quiacutemicos
(quimisorcioacuten) (Cantildeizares-Villanueva 2000 Volesky y Vieira 2000 Aravindhan y col
2004) En algunos casos se ha observado que el metal es transportado activamente al
interior de las ceacutelulas (a expensas de energiacutea metaboacutelica) proceso al que se le denomina
como bioacumulacioacuten
En la biorreduccioacuten o reduccioacuten bioloacutegica el cromo hexavalente es transformado a la
forma trivalente este uacuteltimo puede ser faacutecilmente precipitado en una etapa posterior de
tratamiento ajustando el pH del agua residual a un valor cercano al neutro para
removerlo finalmente por meacutetodos fiacutesicos (Chardin y col 2002 Cheung y Gu 2003) Se
considera que este proceso es una alternativa tecnoloacutegica potencial para el tratamiento
de suelos cuerpos de agua y efluentes industriales contaminados ya que la reduccioacuten
del Cr(VI) disminuye significativamente la toxicidad (100 veces) solubilidad en agua y
movilidad del metal a traveacutes del medio ambiente (Cheung y Gu 2003 Lloyd 2003
Wang 2000)
16
Se han aislado varios microorganismos que pueden reducir el Cr(VI) a Cr(III) ya sea
como cultivos puros (Horitsu y col 1987 Wang 2000 Pattanapipitpaisal y col 2001
Chardin y col 2002 Cheung y Gu 2003 Middleton y col 2003 Morales-Barrera
2005 Pal 1997 Muter y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004 Thacker y col
2006) o como cultivos mixtos (Smith y col 2002 Cheung y Gu 2003) Las fuentes de
aislamiento han sido muy diversas como por ejemplo efluentes de curtiduriacuteas de la
industria metaluacutergica de mantos freaacuteticos de aguas superficiales contaminadas de
sedimentos anoacutexicos en lagos de plantas de tratamiento de aguas residuales entre
otros (Horitsu y col 1987 Fujii y col 1990 Ganguli y Tripathi 1999 Badar y col
2000 Saxena y col 2000 Pattanapipitpaisal y col 2001 Middleton y col 2003
Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004 Zuacutentildeiga 2005 Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
Entre los geacuteneros microbianos que son capaces de reducir Cr(VI) se tienen los
siguientes Achromobacter Aeromonas Agrobacterium Bacillus Desulfovibrio
Escherichia Enterobacter Micrococcus Pseudomonas (Horitsu y col 1987 Wang
2000) Staphylococcus (Saxena y col 2000) Microbacterium (Pattanapipitpaisal y col
2001) Pyrobaculum Streptomyces Deinococcus (Chardin y col 2002)
Desulfomicrobium Desulfotomaculum Pantoea (Cheung y Gu 2003) Shewanella
(Middleton y col 2003) Trichoderma (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
Phanerochaete (Pal 1997) y Candida (Muter y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col
2004)
De los estudios reportados en la literatura acerca de la reduccioacuten microbioloacutegica del
Cr(VI) sobresalen tres hechos 1) Las bacterias han sido los microorganismos maacutes
ampliamente estudiados y es muy escasa la informacioacuten disponible sobre la capacidad de
17
reduccioacuten del metal de las levaduras y de los hongos filamentosos 2) la mayoriacutea de los
microorganismos ensayados soacutelo son capaces de tolerar y reducir muy bajas
concentraciones de Cr(VI) usualmente dentro del intervalo de 0001 a 05 mM esto
uacuteltimo se ha atribuido a los efectos toacutexicos y mutageacutenicos del metal y 3) casi todos los
estudios se han realizado en cultivo por lote
1521 Transporte del cromo al interior de las ceacutelulas
Tanto en organismos procariotes como en muchos eucariotes los oxianiones cromato y
dicromato (fuentes de cromo hexavalente) ingresan principalmente a las ceacutelulas a traveacutes
de las membranas citoplaacutesmicas mediante el sistema de transporte del sulfato (Badar y
col 2000) lo cual se ha atribuido a la similitud en la carga y estructura de estos iones
(Smith y Gadd 2000) Esto fue demostrado primeramente en Salmonella typhimurium y
posteriormente en otras bacterias tales como en Escherichia coli Pseudomonas
fluorescens y Alcaligenes eutrophus Se ha comprobado que esto mismo ocurre en
algunas levaduras tales como en Candida (Muter y col 2001 Cervantes y col 2001)
Sin embargo en general el cromato penetra al interior de las levaduras por medio de un
transportador anioacutenico no especiacutefico (Czakoacute-Veacuter y col 1999 Cervantes y col 2001)
En algunos microorganismos se ha demostrado que el sulfato inhibe competitivamente el
transporte del cromato al interior de las ceacutelulas (Ohtake y col 1987 Pepi y Baldi 1992)
y que esta inhibicioacuten es maacutes marcada en ceacutelulas anaerobias que en aerobias (Zakaria y
col 2006) Tambieacuten se ha reportado el transporte del cromato por la viacutea de los fosfatos
aunque la viacutea del sulfato es la maacutes utilizada (Ohtake y col 1987)
18
El transporte del cromato al interior de las plantas tambieacuten es a traveacutes del sistema del
ioacuten sulfato Ya en el interior de la planta el cromo hexavalente se acumula en diversos
oacuterganos en cantidades diferentes El cromo hexavalente se acumula de 10 a 100 veces
maacutes en las raiacuteces que en los retontildeos o en otros tejidos (Cervantes y col 2001)
En contraste las membranas celulares de los organismos son praacutecticamente
impermeables al cromo trivalente y a sus compuestos (Ksheminska y col 2006)
1522 Mecanismos microbianos de resistencia al Cr(VI) y de reduccioacuten del
Cr(VI)
Una caracteriacutestica importante que deben tener los microorganismos que se van a utilizar
en procesos de tratamiento de efluentes contaminados con cromo hexavalente es que
sean tolerantes (resistentes) a eacuteste Esta propiedad ha sido descrita en bacterias hongos
y levaduras (Horitsu y col 1987 Cervantes y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004)
Entre los mecanismos de resistencia al cromo hexavalente que se han encontrado se
tienen los siguientes
Acumulacioacuten del metal en la superficie o en el interior de las ceacutelulas (Volesky y Vieira
2000 Saxena y col 2000)
Disminucioacuten yo impedimento en el transporte del cromo hexavalente al interior de
las ceacutelulas (Pepi y Baldi 1992)
Excrecioacuten del metal del interior de la ceacutelula al medio circundante (Cervantes y col
2001)
Reacciones de oacutexido-reduccioacuten en las que el cromo hexavalente es reducido a cromo
trivalente el cual es menos toacutexico (Baldi y col 1990 Muter y col 2001)
19
La resistencia al cromo hexavalente puede estar codificada en el genoacuteforo de las
bacterias o en plaacutesmidos Esto uacuteltimo se ha encontrado en Pseudomonas aeruginosa P
fluorescens P putida y en Alcaligenes eutrophus (Baldi y col 1990 Ishibashi y col
1990 Cervantes y col 2001) Sin embargo la tolerancia al metal no implica
necesariamente que los microorganismos seraacuten capaces de removerlo por alguacuten
mecanismo
En el interior de las ceacutelulas bacterianas los iones cromato [CrO42-] pueden ser reducidos
a cromo trivalente por ciertas enzimas (Ishibashi y col 1990 Horitsu y col 1987) En
condiciones de aerobiosis se han identificado las siguientes proteiacutenas que parecen ser las
responsables de la reduccioacuten del Cr(VI) reductasas flavoproteiacutenas enzimas
dependientes de NADH y NAD(P)H (Ishibashi y col 1990) en cambio en condiciones de
anaerobiosis los estudios indican que ciertas hidrogenasas y citocromos son los
responsables (Chardin y col 2003 Cheung y Gu 2007)
El cromo hexavalente tambieacuten puede ser reducido por compuestos quiacutemicos reductores
que son producidos durante el crecimiento de los microorganismos (Desjardin y col
2003) tales como el glutatioacuten y la cisteiacutena los cuales pueden actuar dentro o fuera de
los organismos (Zakaria y col 2006) En organismos superiores se ha identificado al
ascorbato como agente reductor del cromo hexavalente (Ksheminska y col 2006)
Casi no hay informacioacuten sobre el mecanismo responsable de la reduccioacuten del Cr(VI) en
ceacutelulas eucariotas especiacuteficamente en levaduras Con la finalidad de dilucidar dicho
20
mecanismo se han realizado estudios en los que se ha modificado la resistencia de las
levaduras al Cr(VI) o se ha inactivado alguna enzima en particular
En un trabajo llevado a cabo con algunas levaduras no convencionales se encontroacute que
algunas de eacutestas durante su crecimiento excretaron sustancias reductoras asiacute como
sustancias quelantes que formaron complejos con el cromo trivalente que fue generado
durante la transformacioacuten del cromo hexavalente (Ksheminska y col 2006)
1523 Factores que afectan la reduccioacuten bioloacutegica del Cr(VI)
En algunos microorganismos se ha estudiado el efecto que tienen las variables
ambientales tales como condiciones de aerobiosis yo de anaerobiosis donadores y
aceptores finales de electrones concentracioacuten de cromo hexavalente y potencial de
oacutexido-reduccioacuten entre algunas otras sobre la reduccioacuten del metal (Shen y Wang 1995
Shakoori y col 2000 Wang 2000 Smith y col 2002 Wang y Xiao 1995 Fujii y col
1990 Muter y col 2001 Smith y Gadd 2000 Lloyd 2003 Jianlong y col 2004
Viamajala y col 2004)
La reduccioacuten del Cr(VI) puede realizarse en ambiente aerobio yo anaerobio En
organismos aerobios y anaerobios facultativos se ha investigado el efecto del oxiacutegeno
disuelto en el medio sobre la reduccioacuten del metal (Wang 2000) Se ha encontrado que
la sensibilidad del proceso de reduccioacuten del Cr(VI) a la tensioacuten de oxiacutegeno es diferente
para cada microorganismo En cultivos de Enterobacter cloacae HO1 concentraciones
iniciales de oxiacutegeno mayores a 45 ppm inhibieron fuertemente la reduccioacuten del Cr(VI)
(Komori y col 1989) mientras que la reduccioacuten del metal fue maacutes lenta en condiciones
21
de anaerobiosis que en aerobiosis en el caso de Thiobacillus ferrooxidans (QuiIntana y
col 2001)
Asimismo se ha investigado el efecto de algunos iones sobre la reduccioacuten bioloacutegica del
Cr(VI) Con respecto al sulfato [SO42-] existe una analogiacutea estructural y de carga entre
este anioacuten [SO42-] y el ioacuten cromato [CrO4
2-] por lo que puede establecerse una
competencia entre ellos por los transportadores de sulfato existentes en las ceacutelulas
influyendo asiacute en la reduccioacuten del cromo hexavalente (Smith y Gadd 2000)
En cultivos aerobios no se ha reportado inhibicioacuten por sulfato en la reduccioacuten del cromo
hexavalente (Wang y Xiao 1995 Ishibashi y col 1990 Wang 2000) En contraste se
ha informado que en cultivos anaerobios el sulfato afecta la reduccioacuten del Cr(VI) debido
a que este anioacuten compite con el cromato como aceptor final de electrones (Garbisu y
col 1998)
Por otro lado en un estudio realizado con varios geacuteneros de levadura (Pichia Candida
Debaryomyces Saccharomyces Schwanniomyces Cryptococcus Hansenula) que tienen
capacidad para acumular cromo se encontroacute que el sulfato afectoacute la tolerancia de las
levaduras al Cr(VI) siendo mayor o menor el efecto en funcioacuten de la levadura en estudio
(Kaszycki y col 2003)
Otros iones que se han investigado son el Mg2+ Mn2+ Ca2+ y el Fe En cultivos con
ceacutelulas pasivas (resting cells) de Agrobacterium radiobacter se encontroacute que debe
controlarse principalmente la cantidad de fierro para incrementar la capacidad de
reduccioacuten del microorganismo (Llovera y col 1993)
22
Los donadores de electrones que se han utilizado principalmente en los estudios de
reduccioacuten del Cr(VI) son compuestos alifaacuteticos y aromaacuteticos carbohidratos de bajo peso
molecular aminoaacutecidos y aacutecidos orgaacutenicos (Wang y Xiao 1995 Wang 2000 Smith y
col 2002 Ksheminska y col 2006) El descubrimiento de microorganismos que son
capaces de reducir el cromo hexavalente utilizando una amplia variedad de fuentes de
carbono y energiacutea favorece su uso en procesos de remediacioacuten in situ (Smith y col
2002)
Para la reduccioacuten del cromo hexavalente es conveniente conocer el pH y la temperatura
oacuteptimos para el crecimiento de los microorganismos (Wang 2000 Shakoori y col 2000
Camargo y col 2002 Faisal y Hasnain 2004) En cultivos de Streptomyces griseus se
estudioacute la reduccioacuten del Cr(VI) en el intervalo de valores de pH de 4 a 8 y de
temperatura de 28 a 50 degC obtenieacutendose la mayor reduccioacuten a un pH de 6-7 y a una
temperatura de 28 degC (Laxman y More 2002)
En cultivos de Ochrobactrum sp se trabajoacute en el intervalo de temperatura de 30 a 45 degC
y de pH de 6 a 8 obtenieacutendose la mayor reduccioacuten del Cr(VI) y el crecimiento celular
maacutes alto a 35 degC y a un pH de 7 (Thacker y Madamwar 2005) En estudios realizados
con Escherichia coli ATCC 33456 se ensayoacute la reduccioacuten del Cr(VI) en el intervalo de
valores de pH de 3-8 y de temperatura de 40-60 degC encontraacutendose que el pH y la
temperatura de incubacioacuten oacuteptimos fueron de 7 y 37 degC respectivamente (Bae y col
2000)
Se ha observado que la concentracioacuten inicial de Cr(VI) influye en la velocidad de
reduccioacuten del metal (Wang 2000) La velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) exhibida por los
23
cultivos de Bacillus sp Pseudomonas fluorescens LB300 (Wang y Xiao 1995)
Ochrobactrum sp (Thacker y Madamwar 2005) y de Candida sp LBM2 (Juvera-Espinosa
y col 2006) se incrementoacute conforme aumentoacute la concentracioacuten inicial de Cr(VI) En
contraste la velocidad de reduccioacuten de Bacillus sp Arthrobacter sp (Megharaj y col
2003) y de Trichoderma viride (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006) disminuyoacute al
incrementar la concentracioacuten inicial de cromo hexavalente
Para obtener una reduccioacuten importante del Cr(VI) se requieren altas concentraciones de
biomasa (Wang 2000) La concentracioacuten inicial de biomasa tiene efecto sobre la
velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) de Bacillus sp y Pseudomonas fluorescens LB300 ya
que eacutesta aumentoacute al haber mayor cantidad de biomasa inicial (Wang y Xiao 1995) Este
mismo efecto se observoacute en cultivos de una cepa bacteriana gram positiva a la que se le
denominoacute como cepa ATCC 700729 (Shakoori y col 2000)
El potencial redox se ha medido en algunos estudios realizados con diferentes
microorganismos y condiciones de cultivo para determinar su efecto sobre la reduccioacuten
del Cr(VI) (Komori y col 1989 Turick y col 1996 McLean y Beveridge 2001) sin
embargo no se ha reportado un intervalo oacuteptimo de potencial redox para llevar a cabo la
reduccioacuten del Cr(VI) a su forma menos toacutexica (Wang 2000)
En algunos estudios se ha evaluado la influencia de algunos metales (Mn Ni Zn Pb Cu
Co As Se y Hg) sobre la reduccioacuten del Cr(VI) ya que las cepas microbianas que sean
resistentes a uno o varios metales y que sean capaces de reducir el Cr(VI) seriacutean de gran
utilidad en la biorremediacioacuten de efluentes industriales (Faisal y Hasnain 2004 Cheung
y Gu 2005 Thacker y col 2006) En estudios con Escherichia coli ATCC 33456 se
24
investigoacute el efecto de varios iones (Hg2+ Ag2+ Mn2+ Zn2+ Pb2+ Cd2+ Ca2+ y Mg2+) que
pueden estar presentes junto con el Cr(VI) en efluentes industriales Con el magnesio
se observoacute un ligero aumento en la actividad reductora del microorganismo mientras
que con el mercurio se inhibioacute por completo su capacidad de reduccioacuten (Bae y col
2000)
En el caso particular de microorganismos filamentosos los esfuerzos de corte pueden
causar dantildeo fiacutesico a las ceacutelulas y como consecuencia afectar su capacidad de reduccioacuten
de Cr(VI) En cultivos de Trichoderma viride realizados en matraz y en un reactor
agitado mecaacutenicamente con un impulsor se observoacute que los micelios eran de menor
tamantildeo cuando el hongo se cultivaba en el reactor Asimismo el incremento celular y la
eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidos en matraz fueron superiores a los alcanzados
en el reactor agitado con un impulsor Estos resultados sugirieron que las fuerzas de
cizalla creadas por el impulsor fragmentan el micelio y afectan la viabilidad celular y la
capacidad de reduccioacuten del microorganismo (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
16 Sistemas de reaccioacuten
En la mayoriacutea de los estudios sobre reduccioacuten de Cr(VI) el sistema de reaccioacuten que maacutes
se ha empleado es el cultivo por lote Este sistema es ampliamente utilizado en procesos
biotecnoloacutegicos para la produccioacuten de biomasa y de metabolitos de intereacutes industrial La
duracioacuten de este tipo de cultivo depende del tamantildeo del inoacuteculo de las condiciones
ambientales como el pH los componentes del medio de cultivo y la temperatura
Aunque su operacioacuten es sencilla ofrece pocas opciones de control de las variables
intensivas de intereacutes (concentracioacuten de biomasa sustrato producto) en comparacioacuten
con otros sistemas de reaccioacuten
25
(httpfaiunneeduarbiologiamicroindcultivo20y20biorreactoreshtm) Asimismo
despueacutes de un cultivo por lote se requiere de un periodo para la descarga limpieza y
esterilizacioacuten del equipo asiacute como para el arranque de un nuevo cultivo por lote lo que
disminuye la productividad global del proceso (Wang y col 1979)
Pocos son los estudios relacionados con la reduccioacuten del Cr(VI) en los que se ha
trabajado con otros sistemas de reaccioacuten tales como con el cultivo continuo (DeLeo y
Ehrlich 1994 Bhide y col 1996 Chirwa y Wang 1997 Bae y col 2000) y el cultivo
por lote alimentado o fed-batch (Fujii y col 1990 Fujie y col 1996)
El cultivo continuo permite alcanzar un estado estacionario independiente del tiempo en
el que los microorganismos presentan un crecimiento consumo de sustrato y produccioacuten
constantes por lo que es posible obtener una alta productividad o velocidad volumeacutetrica
(httpuserpagesumbcedu gferre1bmcohtml) En este sistema es posible controlar
la cantidad de biomasa utilizando un uacutenico nutriente limitante del crecimiento (Wang y
col 1979)
A pesar de que el cultivo continuo tiene la desventaja de ser susceptible de contaminarse
debido a los periodos prolongados de operacioacuten (Stanbury 1984) en estudios con Cr(VI)
se minimizariacutea lo anterior ya que este estado de oxidacioacuten del cromo es altamente toacutexico
para la mayoriacutea de los microorganismos auacuten a bajas concentraciones
El cultivo por lote alimentado se utiliza industrialmente para la produccioacuten de varios
productos bioloacutegicos de intereacutes (enzimas antibioacuteticos vitaminas aminoaacutecidos entre
otros) El sistema es uacutetil para obtener una alta concentracioacuten de metabolitos asociados
26
al crecimiento ya que es posible alcanzar una alta concentracioacuten de biomasa aunque
tambieacuten se emplea para la produccioacuten de compuestos no asociados al crecimiento como
por ejemplo de algunos antibioacuteticos Su uso tambieacuten se recomienda cuando se trabaja
con compuestos toacutexicos o de muy baja solubilidad y no requiere mayor equipo que el
utilizado en un cultivo por lote (httpuserpagesumbcedu gferre1fedbatchhtml)
Otras ventajas de este sistema son 1) los tiempos totales del proceso fermentativo son
menores y no requiere de un nuevo inoacuteculo cada vez que se repite el ciclo en
comparacioacuten con un cultivo por lote y 2) menor riesgo de contaminacioacuten que el cultivo
continuo (Roukas 1993)
27
2 OBJETIVOS
21 Objetivos generales
1) Determinar el efecto del ioacuten sulfato sobre el crecimiento celular consumo de glucosa y
reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
2) Realizar el estudio cineacutetico del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de
Cr(VI) de Candida sp en sistemas por lote y lote repetido en un reactor airlift
3) Seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten del Cr(VI) por
Candida sp
22 Objetivos especiacuteficos
a) Determinar el efecto de la concentracioacuten de sulfato de amonio sobre el crecimiento
celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
b) Evaluar el crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote y lote repetido
c) Realizar el estudio cineacutetico del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa
d) Evaluar el crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote alimentado repetido
e) Seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes conveniente para la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp
28
3 MATERIAL Y MEacuteTODOS
31 Microorganismo
Para el desarrollo del presente trabajo se utilizoacute una levadura que se aisloacute a partir del
agua residual de una industria curtidora de pieles que se encuentra ubicada en la Ciudad
de Leoacuten Guanajuato Mediante teacutecnicas morfoloacutegicas y bioquiacutemicas que fueron
realizadas en el Laboratorio de Micologiacutea de la Facultad de Medicina de la UNAM asiacute
como por teacutecnicas de biologiacutea molecular que fueron llevadas a cabo en el Laboratorio de
Microbiologiacutea General de la Escuela Nacional de Ciencias Bioloacutegicas se determinoacute que la
levadura pertenece al geacutenero Candida La amplificacioacuten y secuenciacioacuten del dominio
D1D2 del gen 26S rDNA de la levadura aislada reveloacute que estaacute relacionada con Candida
petrohuensis (GenBank accession number U45819) Candida acudensis (GenBank
accession number U45810) y Candida drimydis (GenBank accession number U45815)
con un nivel de confidencia del 896 La baja similitud de las secuencias parciales
conocidas del gen 26S rDNA y la de la cepa de levadura empleada en este trabajo podriacutea
sugerir que es una cepa no identificada no registrada en el GenBank por lo que se le
denominoacute como Candida sp La relacioacuten filogeneacutetica de la cepa de Candida usada en este
estudio y la de otras especies de levadura se muestra en la figura 1
29
Figura 1 Relaciones filogeneacuteticas de la levadura
AJ508572Cmucifera
AB041003Candida
AB041006Cmucifera
AB041005Stephanoascus
U45822Cchiropterorum
U40103Arxula
U40094Arxula
AY283605Sympodiomyces
AF017247Trichomonascus
U40110Blastobotrys
AY442294Sympodiomyces
U40096Sympodiomyces
AY559042Cmokoenaii
FGSFEP
U45819Cpetrohuensis
U45810Cancudensis
U45815Cdrimydis
U45806Cbondarzewiae
U45816Ctepae
U45812Candida
U45812Cantillancae
U45811Csantjacobensis
U76531Stephanoascus
AB196536Stephanoascus
U70245Cedax
AF017236Cbertae
U45835Cvaldiviana
AY618511Cnovakii
U45807Ccastrensis
U45826Cpaludigena
AF294910Cbituminiphila
U45829Pichia
U84241Zygozyma
U76350Myxozyma
U76527Lipomyces
U45804Debaryomyces
U75524Pichia
U68552Saccharomyces
AY545582Naumovia
AY007888Saccharomyces 100 100
43 100
100
100
43 100
100
72
100
86
95
95
100
91
58 69
99
98
84
92
60
63
54
40
56
37
49
21
39
61
16
002
30
32 Propagacioacuten del inoacuteculo
La composicioacuten quiacutemica del medio de cultivo basal que se utilizoacute en este trabajo para la
propagacioacuten del inoacuteculo y para los experimentos de remocioacuten de Cr(VI) en diferentes
sistemas de reaccioacuten los cuales fueron realizados en un reactor neumaacutetico se muestra
en la tabla 5
Tabla 5 Composicioacuten quiacutemica del medio de cultivo
Compuesto Concentracioacuten
(gL)
Glucosa 100
(NH4)2SO4 30
KH2PO4 10
MgSO4 7H2O 03
KCl 01
Extracto de levadura 01
CaCl2 005
FeCl3 0001
Para los experimentos en los que se determinoacute el efecto del sulfato sobre la tolerancia de
Candida sp al Cr(VI) y la reduccioacuten del mismo el inoacuteculo se propagoacute en el mismo medio
de cultivo pero el (NH4)2SO4 se reemplazoacute por NH4Cl (243 gL) y el MgSO47H2O por
MgCl26H2O (0247 gL)
31
El pH inicial de los medios de cultivo fue de aproximadamente 60 A matraces
Erlenmeyer de 1000 mL que conteniacutean 200 mL de medio de cultivo se les adicionoacute una
asada de Candida sp y posteriormente se incuboacute con agitacioacuten constante a 28-30 ordmC
durante 42 h A continuacioacuten la biomasa se separoacute por centrifugacioacuten a 1500 rpm a
4 degC durante 15 min bajo condiciones de asepsia El paquete celular resultante se lavoacute
dos veces con agua destilada esteacuteril para eliminar los componentes del medio de cultivo
y los residuos celulares El paquete celular se resuspendioacute en un pequentildeo volumen de
agua destilada esteacuteril y se homogeneizoacute La suspensioacuten celular resultante se utilizoacute como
inoacuteculo para los experimentos realizados en este trabajo
Para la conservacioacuten de la levadura se usaron viales con medio inclinado de YPG
(glucosa 2 peptona de caseiacutena 1 extracto de levadura 1 y agar bacterioloacutegico
2) los cuales se mantuvieron en refrigeracioacuten a 4 degC Las resiembras se realizaron
cada dos meses
33 Reactores airlift
Se utilizoacute un contactor gas-liacutequido (reactor agitado neumaacuteticamente) del tipo airlift con
tubo conceacutentrico (figuras 2a y 2b) con un volumen total de 52 litros y un posible
volumen de operacioacuten de 42 litros para realizar los estudios de remocioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en sistemas por lote lote repetido lote alimentado y lote alimentado
repetido El reactor estaacute hecho de vidrio Pyrex y consta de una base columna y una
tapa Entre la base y la columna asiacute como entre la columna y la tapa se colocaron
empaques de neopreno para evitar el contacto vidrio-vidrio asiacute como para evitar fugas
de aire yo de medio de cultivo Las secciones se unieron mediante bridas de Nylamid La
32
base del reactor tiene un difusor del tipo placa plana de vidrio poroso para el suministro
de aire
33
Oliva para
toma de muestra
Aire
Tubo conceacutentrico (liso con
perforaciones de
malla)
Filtro de aire
Venteo
Difusor de vidrio poroso(poro fino)
Difusor de vidrio
poroso (poro fino)
Aire
50deg
4
65
3 m
m
77 mm
11
5
mm
128 mm
88 mm
15
mm
70 mm
4
50
3 m
m
Figuras 2a y 2b Reactor del tipo airlift con tubo conceacutentrico
34
En el interior del reactor se colocoacute un tubo conceacutentrico liso (sin perforaciones) de vidrio
Pyrex un tubo conceacutentrico de vidrio Pyrex con perforaciones circulares (4 mm de
diaacutemetro) o un tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable No 316 (grado
alimentario nuacutemero de malla = 20 abertura = 3344 mm) los cuales tienen la misma
longitud y diaacutemetro El tipo de tubo que se utilizoacute para los experimentos de reduccioacuten
del Cr(VI) dependioacute del sistema de reaccioacuten que se ensayoacute el tubo conceacutentrico liso se
utilizoacute para llevar a cabo experimentos en cultivos por lote y lote repetido el tubo
conceacutentrico con perforaciones se empleoacute para realizar cultivos por lote lote alimentado y
lote alimentado repetido y el tubo de malla metaacutelica se usoacute para cultivos por lote
Para el cultivo continuo de una etapa se utilizoacute un reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
con un volumen total de 650 mL y un posible volumen de operacioacuten de 550 mL el cual
tiene las mismas relaciones geomeacutetricas que el reactor antes mencionado
En todos los sistemas de reaccioacuten ensayados se suministroacute aire en el interior del tubo
conceacutentrico El aire de entrada se controloacute mediante una vaacutelvula reguladora de presioacuten y
su velocidad de flujo se midioacute con un rotaacutemetro
34 Meacutetodos experimentales
341 Efecto de la concentracioacuten de sulfato sobre el crecimiento celular
consumo de glucosa remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp
Se evaluoacute el efecto de la concentracioacuten de sulfato sobre el crecimiento celular consumo
de glucosa remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivos por lote a
nivel matraz Para estos experimentos parte o todo del (NH4)2SO4 y del MgSO4 7H2O del
medio de cultivo basal (tabla 5) se reemplazoacute con NH4Cl y MgCl26H2O respectivamente
35
a fin de mantener las mismas concentraciones iniciales de nitroacutegeno (454 mM) y de
magnesio (1217 mM) en todos los medios de cultivo ensayados
Se prepararon tres series de matraces Erlenmeyer de 500 mL que conteniacutean 135 mL de
medio de cultivo con diferentes concentraciones iniciales de sulfato Las
concentraciones de sulfato ensayadas fueron las siguientes 00 1217 25 50 100
150 200 y 2392 mM (esta uacuteltima concentracioacuten corresponde a la del ioacuten sulfato
presente en el medio de cultivo basal) Estas concentraciones no incluyen la cantidad de
sulfato proporcionado por algunos otros componentes del medio de cultivo (provenientes
del extracto de levadura yo de sales inorgaacutenicas) ya que el Laboratorio Central de
Instrumentacioacuten del Departamento de Biofiacutesica de la Escuela Nacional de Ciencias
Bioloacutegicas IPN determinoacute que la concentracioacuten de este ioacuten en el medio de cultivo que
conteniacutea cloruro de amonio y cloruro de magnesio como uacutenicas fuentes de nitroacutegeno
inorgaacutenico y de magnesio respectivamente era de 23 mgL (002 mM) A este uacuteltimo
medio de cultivo es al que se le denominoacute en el presente trabajo como ―0 mM de ioacuten
sulfato Para la cuantificacioacuten del ioacuten sulfato se utilizoacute el meacutetodo recomendado por la
Norma Oficial Mexicana NMX-AA-74-1981 (Secretariacutea de Comercio y Fomento Industrial
1981) El pH inicial de todos los medios de cultivo ensayados fue de aproximadamente
60
A una serie de matraces con medio de cultivo no se le adicionoacute Cr(VI) con la finalidad de
determinar el efecto del sulfato sobre el crecimiento celular y consumo de glucosa por la
levadura en ausencia del metal (cultivos control) A los matraces de la segunda y tercera
serie se les adicionoacute un determinado volumen de una solucioacuten stock esteacuteril de cromato
de potasio (20 gL) para obtener concentraciones iniciales de Cr(VI) de 17 y 33 mM
36
respectivamente Los matraces fueron inoculados con un determinado volumen de
suspensioacuten celular concentrada a fin de que la concentracioacuten inicial de biomasa de todos
los cultivos fuera de aproximadamente 1 mgmL Los matraces se colocaron en un bantildeo
metaboacutelico con agitacioacuten constante a 28-30 degC Se recolectaron muestras a diferentes
tiempos de incubacioacuten a las que se les determinoacute la concentracioacuten de biomasa glucosa
Cr(VI) y cromo total residual asiacute como el pH
342 Controles abioacuteticos
Se utilizaron controles libres de ceacutelulas con el propoacutesito de determinar si el Cr(VI) era
reducido abioacuteticamente a Cr(III) por los componentes del medio de cultivo
Durante los experimentos de remocioacuten de Cr(VI) con ceacutelulas viables (cultivos problema)
se observoacute que el pH de los medios de cultivo disminuyoacute desde aproximadamente 6
hasta 25-42 dependiendo de la concentracioacuten de sulfato y de cromo utilizada Como
se sabe que los pHrsquos bajos favorecen que la materia orgaacutenica (donadores de electrones)
reduzca el Cr(VI) a Cr(III) en este trabajo se llevaron a cabo experimentos sin biomasa
de Candida sp (controles libres de ceacutelulas) a distintos valores de pH (25 3 4 5 y 6) y
a las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas (17 y 33 mM) para determinar
el grado de reduccioacuten causado por los constituyentes del medio de cultivo
Como controles libres de ceacutelulas se utilizaron matraces Erlenmeyer que conteniacutean medio
de cultivo a los que se les adicionoacute un volumen determinado de una solucioacuten stock
esteacuteril de cromato de potasio (20 gL) para obtener concentraciones iniciales de Cr(VI)
de 17 y 33 mM A continuacioacuten se ajustoacute el pH del medio de cultivo a alguno de los
37
valores antes mencionados La adicioacuten de la solucioacuten stock esteacuteril de cromato de potasio
y el ajuste del pH se realizoacute en condiciones de asepsia
Los controles abioacuteticos se incubaron a las mismas condiciones que los matraces
problema Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se les
determinoacute la concentracioacuten de Cr(VI)
343 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa
remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivo por lote en un
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Se realizoacute la evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa remocioacuten
de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso (sin perforaciones) El cultivo por lote se llevoacute a cabo con 4 litros de
medio de cultivo basal con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM [igual a 78
mgL de Cr(VI)] y con un pH inicial de aproximadamente 60 El reactor se inoculoacute con
un volumen determinado de suspensioacuten celular concentrada para obtener una
concentracioacuten inicial de biomasa cercana a 12 mgmL Se suministroacute aire con un flujo
volumeacutetrico de 4 litrosmin equivalente a 1 vvm (vvm = volumen de aire por volumen
de medio de cultivo por minuto)
El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que el nivel de Cr(VI) residual fue
despreciable Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se
les determinoacute la concentracioacuten de biomasa de glucosa Cr(VI) y cromo total residual asiacute
como el pH
38
344 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote repetido en un reactor
airlift con tubo conceacutentrico liso
Los sistemas por lote repetido se iniciaron con un cultivo por lote Cuando se alcanzaron
niveles bajos de Cr(VI) residual en el primer cultivo por lote se procedioacute a recolectar un
determinado volumen de medio y se reemplazoacute con medio fresco que teniacutea una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM A continuacioacuten el sistema se operoacute nuevamente por
lote (segundo cultivo por lote o cultivo por lote repetido) hasta que ya no se detectaron
variaciones considerables en la concentracioacuten de Cr(VI) residual
Se ensayaron tres diferentes relaciones de recambio de medio de cultivo (f = volumen de
medio recolectadovolumen inicial de medio liacutequido en el reactor) las cuales fueron de
04 06 y 08 Para las dos uacuteltimas relaciones se realizaron experimentos sin ajustar el
pH del medio al inicio del segundo cultivo por lote (lote repetido) asiacute como ajustando el
pH a 60 Para la primera relacioacuten (f = 04) soacutelo se realizoacute el experimento sin ajustar el
pH del medio al inicio del cultivo por lote repetido ya que los experimentos realizados a
las relaciones de recambio de 06 y 08 mostraron que la eficiencia y velocidad de
reduccioacuten de Cr(VI) de los cultivos por lote repetido eran mayores cuando no se ajustaba
el pH
Durante los cultivos por lote repetido se recolectaron muestras a diferentes tiempos de
incubacioacuten a las cuales se les determinoacute la concentracioacuten de biomasa glucosa Cr(VI) y
el pH Con los datos obtenidos se estimaron algunas variables cineacuteticas que se utilizaron
para seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para los fines que se persiguen en
este trabajo
39
345 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa en un
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Para el cultivo continuo de una etapa se utilizoacute un biorreactor airlift con tubo conceacutentrico
liso con un volumen de operacioacuten de 500 mL Al reactor se le suministroacute continuamente
medio de cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM por medio de una
bomba peristaacuteltica Se ensayaron dos flujos volumeacutetricos de medio de cultivo de 378 y
50 mLh que corresponden a velocidades de dilucioacuten de 00076 h-1 y de 00100 h-1
respectivamente
Con los datos obtenidos a la velocidad de dilucioacuten de 00076 h-1 se estimoacute la velocidad
volumeacutetrica global y la eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) las cuales se utilizaron
para seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp
346 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular y la remocioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo conceacutentrico de
malla de acero inoxidable y de vidrio perforado
Se realizaron cultivos por lote en el reactor airlift en el cual se colocoacute un tubo conceacutentrico
de malla de acero inoxidable No 316 (grado alimentario calibre No 20 abertura =
3344 mm) o un tubo conceacutentrico de vidrio con perforaciones circulares de
aproximadamente 4 mm de diaacutemetro Al reactor se le adicionaron 4 litros de medio de
cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM [igual a 78 mgL de Cr(VI)] y
un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada para obtener una
40
concentracioacuten inicial de biomasa de aproximadamente 12 mgmL El pH inicial del medio
fue de aproximadamente 60 Se ensayaron dos flujos de aire de 05 y 1 vvm
El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que el nivel de Cr(VI) residual fue bajo Se
recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se les determinoacute la
concentracioacuten de biomasa y de Cr(VI) residual Con los datos obtenidos se estimaron
algunas variables cineacuteticas que sirvieron como criterio de seleccioacuten para determinar el
tubo conceacutentrico maacutes adecuado para llevar a cabo los cultivos por lote alimentado y lote
alimentado repetido
347 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote
alimentado repetido en un reactor airlift
Para los cultivos por lote alimentado y lote alimentado repetido se utilizoacute el reactor airlift
con el tubo conceacutentrico seleccionado previamente Los cultivos por lote alimentado se
iniciaron con un cultivo por lote utilizando las condiciones iniciales mencionadas en el
inciso 446 y una aireacioacuten de 05 vvm El cultivo por lote se mantuvo en operacioacuten
hasta que la concentracioacuten de Cr(VI) residual fue baja
A continuacioacuten el reactor se drenoacute hasta alcanzar un volumen de liacutequido en el reactor de
25 litros y se inicioacute el suministro continuo de medio de alimentacioacuten con una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM La alimentacioacuten se mantuvo hasta que se alcanzoacute un
volumen de medio liacutequido en el reactor de 37 litros (primer cultivo por lote alimentado)
41
Posteriormente el reactor se volvioacute a drenar hasta obtener un volumen de medio de 25
litros y enseguida se volvioacute a suministrar continuamente medio de cultivo basal con una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM utilizando el mismo flujo de alimentacioacuten que para el
primer cultivo por lote alimentado El suministro de medio se mantuvo hasta alcanzar un
volumen de liacutequido en el reactor de 375-40 litros (segundo cultivo por lote alimentado o
cultivo por lote alimentado repetido)
Se ensayaron dos flujos de alimentacioacuten de 659 y 1343 mLh que representan cargas
maacutesicas de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh
Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las cuales se les
determinoacute la concentracioacuten de biomasa de glucosa y Cr(VI) residual asiacute como el pH
Con los datos obtenidos se estimaron las velocidades volumeacutetricas globales y las
eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI)
35 Meacutetodos analiacuteticos
351 Determinacioacuten de la concentracioacuten de biomasa
La concentracioacuten celular se determinoacute mediante el peso seco de la masa celular Las
muestras recolectadas se filtraron a traveacutes de membranas de fibra de vidrio (Whatman
GFA) con un diaacutemetro de poro de 16 m las cuales se colocaron previamente puestas a
peso constante Posteriormente las membranas se colocaron en una estufa a 95 degC
hasta alcanzar un peso constante Los filtrados se utilizaron para determinar la
concentracioacuten de glucosa Cr(VI) y cromo total residual asiacute como el pH
352 Determinacioacuten de la concentracioacuten de glucosa
42
Se determinoacute mediante un meacutetodo enzimaacutetico empleando a la glucosa oxidasa y
peroxidasa (Worthington Biochemical Corporation 1972)
Principio El meacutetodo se basa en que la glucosa es oxidada a aacutecido glucoacutenico por la
glucosa oxidasa la cual cataliza la siguiente reaccioacuten
-D-glucosa + H2O + O2 Aacutecido D-glucoacutenico + H2O2
El peroacutexido de hidroacutegeno generado reacciona con el sistema peroxidasa - orto-
dianisidina dando como resultado la oxidacioacuten de la orto-dianisidina y la produccioacuten de
agua de acuerdo con la siguiente reaccioacuten
H2O2 + orto-dianisidina (reducida) ortondashdianisidina (oxidada) + H2O
peroxidasa
La orto-dianisidina oxidada presenta un color pardo que en medio aacutecido vira a color
rosa la cual se lee a una longitud de onda de 540 nm (figura 3)
Figura 3 Orto-dianisidina (33rsquo ndash dimetoxidibencidina)
H2N NH2
OCH3
OCH3
43
353 Determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo hexavalente
La concentracioacuten de cromo hexavalente se determinoacute por la teacutecnica de la 15-
difenilcarbohidrazida siguiendo los procedimientos descritos en el meacutetodo 8023 del Hach
Water Analysis Handbook (2002) Este meacutetodo estaacute aprobado por la EPA (Environmental
Protection Agency) (Hach 2002) y por la Norma Oficial Mexicana NMX-AA-044-SCFI-
2001 (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NMX-AA-044-SCFI-
2001)
Principio Se utilizoacute un reactivo en polvo llamado ChromaVer3 el cual contiene una
solucioacuten buffer aacutecida combinada con la 15-difenilcarbohidrazida Este uacuteltimo compuesto
reacciona con el cromo hexavalente dando un compuesto de color puacuterpura (figura 4) El
meacutetodo es aplicable para el agua ya sea fresca o de muestras de agua residual La
intensidad del color es ldirectamente proporcional a la concentracioacuten de cromo
hexavalente presente
Figura 4 Reaccioacuten de la 15-difenilcarbohidrazida con el cromo hexavalente
+ Cr 6+
Compuesto colorido
puacuterpura
N N
Cr O
C R
O
N N
H H
C R
15-difenilcarbohidrazida
2 N N N
H H
N C
H O
H
44
354 Determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo total
La determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo total de los filtrados de las muestras
recolectadas (cromo total en solucioacuten) se realizoacute por espectroscopiacutea de absorcioacuten
atoacutemica con flama de acetileno-aire (SpectrAA220 FS Varian Inc)
Para determinar la cantidad de cromo retenido por la biomasa de Candida sp las ceacutelulas
fueron lavadas con agua desionizada deshidratadas y posteriormente fueron digeridas
con aacutecido niacutetrico concentrado La solucioacuten obtenida se enfrioacute a temperatura ambiente y
se le adicionoacute agua desionizada hasta obtener un volumen final de 50 mL Este
procedimiento estaacute descrito en la Norma Oficial Mexicana NMX-AA-051-SCFI-2001
(Secretariacutea de Economiacutea 2001) La concentracioacuten de cromo total de la solucioacuten
resultante se determinoacute en un espectrofotoacutemetro de absorcioacuten atoacutemica con un horno de
grafito (SpectrAA220 FS Varian Inc)
355 Determinacioacuten del pH
Se realizoacute con un potencioacutemetro marca Oakton
45
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Meta No 1 Determinar el efecto del ioacuten sulfato sobre la reduccioacuten
de Cr(VI)
41 Efecto del sulfato sobre el crecimiento celular consumo de glucosa
remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp
411 Evaluacioacuten de la influencia del sulfato sobre el crecimiento celular de
Candida sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
Se determinoacute el efecto de ocho concentraciones diferentes de sulfato (00 1217 25
50 100 150 200 y 2392 mM) sobre el crecimiento celular de Candida sp cuando
eacutesta se cultivoacute por lote a nivel matraz en medios de cultivo sin Cr(VI) y con
concentraciones iniciales del metal de 17 y 33 mM Para visualizar mejor el efecto las
curvas de crecimiento celular se construyeron utilizando la relacioacuten xxo (x =
concentracioacuten celular a un determinado tiempo de incubacioacuten xo = concentracioacuten inicial
de biomasa) como variable dependiente y el tiempo de incubacioacuten (t) como variable
independiente (graacuteficas de xxo vs t) En cada una de las curvas de crecimiento se trazoacute
una liacutenea horizontal a una relacioacuten xxo de 10 para observar si ocurriacutea crecimiento o
lisis celular
En la figura 5 se muestran las curvas de crecimiento celular de Candida sp cuando eacutesta
se cultivoacute en medios de cultivo con diferentes concentraciones de sulfato y sin Cr(VI) Se
observa que el crecimiento de Candida sp fue muy semejante a las diferentes
concentraciones de sulfato ensayadas La levadura fue capaz de crecer en el medio de
cultivo al que no se le adicionoacute sulfato de amonio y sulfato de magnesio (0 mM de
46
SO42-) lo cual sugiere que la cantidad de sulfato proporcionado por otros componentes
del medio de cultivo ndash por ejemplo provenientes del extracto de levadura yo de
impurezas contenidas en las sales inorgaacutenicas adicionadas al medio de cultivo (002
mM) mdash fue suficiente para permitir un adecuado crecimiento de la levadura Los
resultados tambieacuten mostraron que la adicioacuten de sulfato en forma de sales inorgaacutenicas
[(NH4)2SO4 o Mg(SO4)7H20] no tuvo alguacuten efecto inhibidor o estimulador del crecimiento
celular
Figura 5 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo sin Cr(VI)
En la figura 6 se presentan las curvas de crecimiento de Candida sp que se obtuvieron
cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo con una concentracioacuten inicial de
Cr(VI) de 17 mM a las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas En la figura se
aprecia lo siguiente 1) A una concentracioacuten de sulfato de 0 mM ocurrioacute lisis celular 2)
el crecimiento neto de la levadura fue praacutecticamente nulo a una concentracioacuten de sulfato
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
47
de 1217 mM 3) el crecimiento de la levadura fue evidente a partir de una
concentracioacuten de sulfato de 25 mM y 4) en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de
10 a 2392 mM el crecimiento de la levadura fue muy semejante y superior al alcanzado
a una concentracioacuten de sulfato de 5 mM Asimismo cuando se utilizaron concentraciones
de sulfato de 10 a 2392 mM se alcanzaron niveles de concentracioacuten de biomasa
similares a los obtenidos en ausencia del metal (cultivos control) (figuras 5 y 6) De
estos resultados es evidente que a medida que se incrementoacute la concentracioacuten de
sulfato los efectos toacutexicos del Cr(VI) sobre el crecimiento de la levadura disminuyeron
hasta que eacutestos fueron praacutecticamente nulos es decir la tolerancia de la levadura al
Cr(VI) aumentoacute conforme se incrementoacute la concentracioacuten de sulfato en el medio de
crecimiento de Candida sp
Figura 6 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo con 17 mM de Cr(VI)
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
48
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM ocurrioacute lisis celular
cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo con concentraciones de sulfato en el
intervalo de 0 a 5 mM (figura 7) en contraste el crecimiento celular de la levadura se
incrementoacute a medida que la concentracioacuten de sulfato aumentoacute de 10 a 2392 mM En
este uacuteltimo intervalo de concentracioacuten de sulfato se observoacute que a tiempos de
incubacioacuten superiores a las 150 h se presentoacute lisis celular A ninguna de las
concentraciones de sulfato ensayadas se alcanzaron densidades celulares semejantes a
las obtenidas en los cultivos sin Cr(VI) o con 17 mM de Cr(VI) lo cual podriacutea deberse a
la mayor toxicidad de los medios de cultivo
Figura 7 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo con 33 mM de Cr(VI)
En la figura 8 se muestra la variacioacuten de la velocidad especiacutefica de crecimiento ( ) y de
lisis celular (kd) de Candida sp en funcioacuten de la concentracioacuten de SO42- a las diferentes
concentraciones de Cr(VI) ensayadas [0 17 y 33 mM]
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
49
Figura 8 Variacioacuten de la velocidad especiacutefica de crecimiento o de lisis celular en funcioacuten
de la concentracioacuten de SO42- a las diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI)
ensayadas
-0002
0
0002
0004
0006
0008
001
0012
0014
0016
0018
0 5 10 15 20 25 30
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Ve
loc
ida
d e
sp
ec
iacutefic
a [
h-1
]
0 mM
17 mM
33 mM
Promedio
Sin Cr(VI)
50
Cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo sin Cr(VI) su velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento se mantuvo praacutecticamente constante en todo el intervalo de
concentracioacuten de sulfato ensayado con un valor promedio de 00144 h-1
A la concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la velocidad especiacutefica de crecimiento de
Candida sp aumentoacute casi linealmente con respecto a la concentracioacuten de sulfato en el
intervalo de concentracioacuten de 0 a 10 mM (r2 = 096) alcanzando un valor maacuteximo de
00142 h-1 a la uacuteltima concentracioacuten de sulfato Esta velocidad especiacutefica de crecimiento
es muy similar a las obtenidas en los cultivos sin Cr(VI) A concentraciones de sulfato
superiores a 5 mM la velocidad especiacutefica de crecimiento se mantuvo praacutecticamente
constante Estos resultados concuerdan con los perfiles de crecimiento celular mostrados
anteriormente
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM se obtuvieron
velocidades especiacuteficas de lisis celular (kd) de 00013 a 00003 h-1 ( = -00013 - 00003
h-1) en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de 0 a 5 mM (figura 8) A
concentraciones de sulfato superiores a 5 mM la velocidad neta de crecimiento fue
positiva La velocidad especiacutefica aumentoacute linealmente en todo el intervalo de
concentracioacuten de sulfato ensayado (r2 = 099) aunque las velocidades alcanzadas fueron
notoriamente inferiores a las obtenidas en los medios de cultivo sin Cr(VI) y con una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM
De los resultados anteriores se deduce que el sulfato desempentildea un papel importante en
la tolerancia (resistencia) de Candida sp a los efectos toacutexicos del Cr(VI) A medida que
se incrementoacute la concentracioacuten de sulfato la levadura fue maacutes tolerante (resistente) a
51
los efectos dantildeinos del Cr(VI) y por consiguiente su crecimiento celular fue menos
afectado Asimismo los resultados muestran que el ―efecto protector del sulfato sobre el
crecimiento de Candida sp dependioacute de la concentracioacuten inicial de Cr(VI)
Pepi y Baldi (1992) investigaron el efecto de diferentes aminoaacutecidos azufrados y del
sulfato sobre la tolerancia de algunas levaduras al Cr(VI) Estos investigadores
encontraron que en presencia de 02 mM de Cr(VI) se requirieron pequentildeas cantidades
de cisteiacutena [001ndash01 mM] para estimular significativamente [10-100] el crecimiento
de Rhodosporidium sp y que para incrementar el crecimiento de Candida sp en hasta
80 fue necesaria una concentracioacuten de cisteiacutena de 01 mM Un comportamiento similar
se observoacute en estas dos cepas cuando se adicionoacute metionina En contraste el
crecimiento celular de Candida famata fue inhibido cuando la levadura se cultivoacute en
medios con concentraciones de cisteiacutena superiores a 005 mM y con 02 mM de Cr(VI)
Por otra parte cuando Candida sp se cultivoacute en medios con diferentes concentraciones
de sulfato (4ndash160 mM) y de Cr(VI) (004ndash02 mM) se encontroacute que el ioacuten sulfato
incrementoacute la tolerancia de la levadura al Cr(VI) El mecanismo general de resistencia al
cromato en Candida sp se atribuyoacute a una reducida captacioacuten (incorporacioacuten) de cromo
(Pepi y Baldi 1992)
Ohtake y col (1987) encontraron que la adicioacuten de altas concentraciones de sulfato
incrementoacute el crecimiento celular de dos cepas de Pseudomonas fluorescens (LB300 y
LB303) en presencia de CrO42- Ademaacutes encontraron que el nivel de resistencia al CrO4
2-
en P fluorescens dependioacute de la fuente de azufre en el medio de cultivo ya que las
ceacutelulas bacterianas que crecieron con cisteiacutena fueron mucho maacutes resistentes al CrO42-
que las ceacutelulas que crecieron sobre sulfato Como el cromato es transportado al interior
52
de las ceacutelulas de Pseudomonas a traveacutes del sistema de transporte del sulfato la habilidad
del sulfato para proteger a las ceacutelulas de P fluorescens LB300 de los efectos inhibitorios
del Cr(VI) se atribuyoacute a que el sulfato inhibioacute competitivamente la captacioacuten del cromato
por las ceacutelulas bacterianas (Ohtake y col 1987)
En contraste la resistencia de Ochrobactrum tritici cepa 5bvI1 al Cr(VI) fue
independiente de la concentracioacuten de sulfato (Branco y col 2004)
412 Evaluacioacuten del efecto del sulfato sobre el consumo de glucosa por Candida
sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
La glucosa fue completamente consumida (eficiencia global de consumo de glucosa =
100) en aproximadamente 83 h de incubacioacuten cuando la levadura se cultivoacute en medios
que no conteniacutean Cr(VI) y con diferentes concentraciones de sulfato No se observoacute
diferencia considerable en el consumo de glucosa a ninguna de las concentraciones de
sulfato utilizadas (figura 9)
53
Figura 9 Variacioacuten en el consumo de glucosa por Candida sp cuando se utilizaron
medios de cultivo con diferentes concentraciones de sulfato y sin Cr(VI)
En los experimentos realizados con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM
(figura 10) se observoacute que la levadura fue capaz de consumir aproximadamente 30-
35 de la glucosa inicialmente adicionada a los medios que conteniacutean sulfato a
concentraciones de 0 y 1217 mM a pesar de que a estas condiciones de cultivo ocurrioacute
lisis celular [0 mM de SO42-] o el crecimiento celular de la levadura fue despreciable
[1217 mM de SO42-] (figura 6) Candida sp consumioacute todo el monosacaacuterido presente
en los medios de cultivo con concentraciones de sulfato superiores a 1217 mM
(eficiencia global de consumo de glucosa del 100) sin embargo el tiempo que se
requirioacute para que eacutesto sucediera disminuyoacute a medida que se incrementoacute la concentracioacuten
de sulfato (figura 10) Los perfiles de consumo de glucosa en los cultivos de Candida
sp fueron semejantes cuando se utilizaron concentraciones de sulfato de 10 a 2392
mM y eacutestos a su vez fueron similares a los obtenidos en los medios de cultivo que no
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa
re
sid
ua
l [
]0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
54
conteniacutean Cr(VI) (figuras 9 y 10) Lo anterior podriacutea deberse a que el crecimiento
celular de estos cultivos fue semejante (figura 6)
Figura 10 Variacioacuten del porcentaje de glucosa residual en los cultivos de Candida sp a
las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas y con 17 mM de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
55
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM los niveles de glucosa
residual disminuyeron a medida que aumentoacute la concentracioacuten de sulfato (figura 11)
Sin embargo estos niveles fueron superiores a los alcanzados a 17 mM de Cr(VI) a
todas las concentraciones de sulfato ensayadas La mayor eficiencia de consumo de
glucosa fue de aproximadamente 80 y se obtuvo a una concentracioacuten de sulfato de
2392 mM
Figura 11 Variacioacuten del porcentaje de glucosa residual en los cultivos por lote de
Candida sp a las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas y con 33 mM de
Cr(VI)
A las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas [17 y 33 mM] se observoacute que
en las primeras horas de incubacioacuten los cultivos de levadura en los que ocurrioacute lisis
celular consumieron una determinada cantidad de glucosa la cual probablemente se
utilizoacute para el mantenimiento de las ceacutelulas vivas
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa r
es
idu
al [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
56
Tanto en los experimentos realizados a 17 como a 33 mM de Cr(VI) se encontroacute que
los cultivos que alcanzaron mayores densidades celulares fueron los que consumieron
mayor cantidad de glucosa y esto ocurrioacute cuando se utilizaron concentraciones altas de
sulfato
413 Evaluacioacuten del efecto del sulfato sobre la variacioacuten del pH de los cultivos
de Candida sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
Los perfiles de variacioacuten del pH de los medios de cultivo fueron muy semejantes a las
diferentes concentraciones de sulfato ensayadas cuando la levadura se cultivoacute en los
medios de cultivo sin Cr(VI) (figura 12) A todas las concentraciones de sulfato
utilizadas el pH disminuyoacute desde aproximadamente 6 hasta 28 en las primeras once
horas de incubacioacuten En el periodo comprendido entre las 11 y las 60 h de incubacioacuten el
pH de los medios de cultivo disminuyoacute ligeramente hasta alcanzar valores cercanos a
25 A tiempos posteriores a 60 h el pH de los medios de cultivo se mantuvo
praacutecticamente constante
Figura 12 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo de Candida sp en ausencia de
Cr(VI) y a las diferentes concentraciones de SO42- ensayadas
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
57
En la figura 13 se muestran los perfiles de variacioacuten del pH de los medios de cultivo
cuando la levadura se cultivoacute a las diferentes concentraciones de sulfato y a una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM El pH de los cultivos disminuyoacute raacutepidamente
en las primeras 15 h de incubacioacuten a todas las concentraciones de sulfato ensayadas La
disminucioacuten del pH fue mayor en los cultivos con las concentraciones maacutes altas de
sulfato lo cual podriacutea deberse a que a estas condiciones la levadura consumioacute mayor
cantidad de glucosa y las densidades celulares alcanzadas fueron maacutes altas A tiempos
de incubacioacuten superiores a 15 h el pH continuoacute disminuyendo pero a menor velocidad
Los niveles de pH maacutes bajos se obtuvieron cuando se utilizaron concentraciones de
sulfato de 5 a 2392 mM alcanzaacutendose valores semejantes a los obtenidos en los medios
sin Cr(VI) (de aproximadamente 25)
Figura 13 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
58
Un comportamiento cualitativo similar se obtuvo cuando Candida sp se cultivoacute en medios
con diferentes concentraciones de sulfato y con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33
mM (figura 14) El pH maacutes bajo se alcanzoacute a concentraciones altas de sulfato [20 y
2392 mM] y fue de aproximadamente 36 el cual es superior a los valores maacutes bajos
que se obtuvieron en los cultivos sin Cr(VI) y con 17 mM de Cr(VI) Esto uacuteltimo podriacutea
deberse a que el incremento de la concentracioacuten celular y el consumo de glucosa fueron
inferiores a los alcanzados con las otras concentraciones de Cr(VI) [0 y 17 mM]
Figura 14 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
414 Efecto del sulfato sobre la remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp
En la figura 15 se muestran las variaciones del porcentaje de Cr(VI) residual de los
cultivos de Candida sp cuando se emplearon diferentes concentraciones de sulfato y
una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM A una concentracioacuten de sulfato de 0 mM
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
59
la remocioacuten de Cr(VI) fue muy baja (de aproximadamente 83) es conveniente
mencionar que a esta concentracioacuten de sulfato (0 mM) y de Cr(VI) (17 mM) ocurrioacute lisis
celular y la levadura consumioacute una pequentildea cantidad de glucosa en las primeras horas
de incubacioacuten La remocioacuten de Cr(VI) se incrementoacute a medida que aumentoacute la
concentracioacuten de sulfato de 0 a 10 mM A partir de esta uacuteltima concentracioacuten de sulfato
los perfiles de remocioacuten de Cr(VI) fueron muy similares y esto podriacutea deberse a que la
densidad celular de los cultivos fueron praacutecticamente iguales Todo o casi todo el Cr(VI)
inicialmente adicionado a los medios de cultivo fue removido cuando se empleoacute una
concentracioacuten de sulfato igual o superior a 25 mM (figura 15)
Figura 15 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
En contraste cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM la levadura
no fue capaz de remover todo el Cr(VI) inicialmente presente en los medios de cultivo a
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
60
ninguna de las concentraciones de sulfato ensayadas (figura 16) Sin embargo los
niveles de Cr(VI) residual disminuyeron a medida que se incrementoacute la concentracioacuten de
sulfato
Figura 16 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
A las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas los cultivos de levadura en los
que ocurrioacute lisis celular en las primeras horas de incubacioacuten [0 mm de SO42- 17 mM de
Cr(VI) y 0-5 mM de SO42- 33 mM de Cr(VI)] fueron capaces de remover una pequentildea
cantidad de Cr(VI) Estos resultados concuerdan con lo reportado por Wang y Shen
(1997) quienes encontraron que la densidad celular de los cultivos de Escherichia coli y
Bacillus sp disminuyoacute continuamente durante el curso de la remocioacuten de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
61
A las diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI) y de sulfato ensayadas se observoacute
que aunque los niveles de Cr(VI) residual disminuyeron a medida que la incubacioacuten
progresoacute las concentraciones de cromo total en solucioacuten permanecieron casi constantes
a lo largo de todo el periodo de incubacioacuten (aproximadamente el 97 del cromo
inicialmente adicionado a los medios de cultivo estuvo siempre presente en solucioacuten)
Maacutes auacuten el anaacutelisis del contenido de cromo en la biomasa de Candida sp (de muestras
recolectadas al final de los experimentos) reveloacute que uacutenicamente el 29 009 del
cromo total removido por los cultivos fue incorporado en la biomasa
Como se mostroacute anteriormente los cultivos con ceacutelulas viables se iniciaron con un pH de
aproximadamente 60 y eacuteste disminuyoacute durante el tiempo de incubacioacuten hasta valores de
25 ndash 36 dependiendo de la concentracioacuten de sulfato y de Cr(VI) utilizada Como se
sabe que los pHacutes bajos favorecen la reduccioacuten del Cr(VI) por la materia orgaacutenica
(donadores de electrones) en el presente trabajo se llevaron a cabo experimentos sin
biomasa de Candida sp (controles libres de ceacutelulas) a diferentes valores de pH (25 3
4 5 y 6) y a las dos diferentes concentraciones de Cr(VI) ensayadas (17 y 33 mM)
para determinar si los componentes presentes en los medios de cultivo pueden reducir el
Cr(VI) En las figuras 17 y 18 se muestran los perfiles de Cr(VI) residual que se
obtuvieron con los controles abioacuteticos ensayados
62
Figura 17 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los controles libres de
ceacutelulas llevados a cabo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y a diferentes
valores de pH
Figura 18 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los controles libres de
ceacutelulas realizados con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y a diferentes
valores de pH
00
200
400
600
800
1000
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
pH = 25
pH = 3
pH = 4
pH = 5
pH = 6
00
200
400
600
800
1000
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
pH = 25
pH = 3
pH = 4
pH = 5
pH = 6
63
A las dos concentraciones de Cr(VI) ensayadas se observoacute una reduccioacuten despreciable
del metal (inferior a 05) en el intervalo de valores de pH de 4 a 6 a un pH de 3 el
porcentaje de reduccioacuten fue de aproximadamente 12 y de 3 cuando el pH fue de
25 Estos resultados sugieren que los componentes de los medios de cultivo
praacutecticamente no redujeron el Cr(VI) a ninguno de los pHrsquos ensayados
En conjunto los resultados antes mostrados indican que el principal mecanismo de
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp fue la biotransformacioacuten (reduccioacuten) del Cr(VI) a
Cr(III) y que la reduccioacuten abioacutetica del Cr(VI) y la captacioacuten de cromo por la biomasa de
la levadura fueron despreciables Asimismo los resultados tambieacuten muestran que la
reduccioacuten del Cr(VI) por los cultivos se debioacute a la actividad metaboacutelica de las ceacutelulas de
Candida sp
En la figura 19 se presentan las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) que se
obtuvieron a las diferentes concentraciones iniciales de sulfato y de Cr(VI) ensayadas Se
aprecia que cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la eficiencia
de reduccioacuten se incrementoacute desde 179 hasta 986 a medida que la concentracioacuten
de sulfato aumentoacute de 0 a 25 mM a concentraciones de sulfato superiores la eficiencia
de reduccioacuten fue del 100 Asimismo en los experimentos realizados a 33 mM de
Cr(VI) la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) aumentoacute desde 83 hasta 84 conforme la
concentracioacuten de sulfato aumentoacute de 0 a 2392 mM
64
Figura 19 Eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por los cultivos de
Candida sp a las diferentes concentraciones de sulfato y de Cr(VI) ensayadas
La velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) tambieacuten fue afectada por la
concentracioacuten de sulfato y de Cr(VI) utilizada (figura 20) Cuando se empleoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten maacutes alta
fue de 098 mg de Cr(VI)Lh y se obtuvo en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de
10 a 2392 mM En cambio la velocidad maacutes alta que se alcanzoacute a 33 mM de Cr(VI) fue
de 044 mg de Cr(VI)Lh y se obtuvo a la maacutexima concentracioacuten de sulfato ensayada
(2392 mM)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 1217 25 5 10 15 20 2392
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Efi
cie
ncia
glo
bal d
e r
ed
uccioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
17 mM
33 mM
65
Figura 20 Velocidades volumeacutetricas globales de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas en los
cultivos de Candida sp a diferentes concentraciones de sulfato y de Cr(VI)
A todas las concentraciones de sulfato ensayadas la eficiencia y velocidad volumeacutetrica de
reduccioacuten de Cr(VI) alcanzadas a una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM fueron
superiores a las obtenidas a 33 mM de Cr(VI) y esto podriacutea deberse a que los efectos
toacutexicos del Cr(VI) sobre la levadura se incrementan a medida que aumenta la
concentracioacuten del metal
De los resultados anteriores es evidente que el sulfato afectoacute la reduccioacuten aeroacutebica de
Cr(VI) por Candida sp Estos resultados difieren con lo reportado por otros
investigadores quienes no han encontrado un efecto inhibidor ni estimulador del sulfato
sobre la reduccioacuten de Cr(VI) en cultivos aeroacutebicos
000
010
020
030
040
050
060
070
080
090
100
0 1217 25 5 10 15 20 2392
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica d
e r
ed
uccioacute
n d
e C
r(V
I)
[mg
de
Cr(
VI)
Lh
]
17 mM
33 mM
66
Ishibashi y col (1990) encontraron que concentraciones de sulfato de hasta 1 mM
incrementaron la resistencia de Pseudomonas putida al cromato pero no tuvieron efecto
sobre la reduccioacuten de eacuteste En cultivos de Bacillus sp (Wang y Xiao 1995) y de
Acinetobacter haemolyticus (Zakaria y col 2006) se observoacute que una concentracioacuten de
sulfato de 10 mM no afectoacute la reduccioacuten de Cr(VI) Liu y col (2006) reportaron que
concentraciones de sulfato de 40 y 80 mgL (0416 y 083 mM) no tuvieron efecto sobre
la reduccioacuten aeroacutebica de Cr(VI) por Bacillus sp XW-4
En contraste el sulfato generalmente tiene efecto sobre la reduccioacuten bacteriana del
cromato bajo condiciones de anaerobiosis lo cual podriacutea deberse a que el sulfato compite
con el cromato como aceptor final de electrones (Garbisu y col 1998 Liu y col 2006)
En cultivos anaeroacutebicos de Escherichia coli ATCC 33456 la velocidad de reduccioacuten de
Cr(VI) no fue afectada por hasta 416 mM de sulfato sin embargo la velocidad
disminuyoacute a 83 mM de sulfato (Shen y Wang 1994) La actividad de reduccioacuten de Cr(VI)
de Enterobacter cloacae HO1 bajo condiciones anaeroacutebicas fue inhibida en 32 en
presencia de tan soacutelo 25 M de sulfato (Komori y col 1989)
Como se mencionoacute anteriormente el sulfato incrementoacute la tolerancia al Cr(VI) de la cepa
de Candida sp aislada por Pepi y Baldi (1992) sin embargo esta cepa de levadura fue
incapaz de reducir el Cr(VI) Asimismo auacuten cuando se ha reportado que Pseudomonas
fluorescens LB300 es capaz de reducir el Cr(VI) a Cr(III) (Bopp y Ehrlich 1988) y que el
sulfato incrementa el crecimiento celular de esta bacteria en presencia de cromato
(Ohtake y col 1987) hasta donde sabemos no se ha reportado el efecto del sulfato
sobre la reduccioacuten de Cr(VI) por este microorganismo
67
Los resultados anteriores muestran claramente que el sulfato afectoacute la tolerancia de
Candida sp al Cr(VI) y a su capacidad para reducirlo Es evidente que a medida que se
incrementoacute la concentracioacuten de sulfato el crecimiento de la levadura fue mayor y su
eficiencia y velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) aumentaron Los resultados tambieacuten
muestran que la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp depende de la densidad celular de
los cultivos de manera tal que a mayor cantidad de biomasa generada mayor es la
reduccioacuten de Cr(VI) Aun cuando la cepa de Candida sp es muy sensible a los efectos
toacutexicos del Cr(VI) en ausencia de sulfato esta levadura posee una capacidad notable
para reducir muy altas concentraciones del metal en presencia de sulfato
Meta No 2 Determinar la capacidad de reduccioacuten de Cr(VI) en
diferentes sistemas de reaccioacuten
42 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso
Se utilizoacute un reactor airlift con tubo conceacutentrico liso (sin perforaciones) para el cultivo por
lote de Candida sp Para este sistema de reaccioacuten se utilizoacute un volumen de operacioacuten de
4 litros de medio basal con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM El biorreactor
se inoculoacute con un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada de tal
forma que la concentracioacuten inicial de biomasa fue de 12 mgmL El pH inicial fue de
aproximadamente 60 El reactor se operoacute por lote hasta que la concentracioacuten de Cr(VI)
residual fue despreciable
68
La concentracioacuten celular se incrementoacute gradualmente a medida que la incubacioacuten
progresoacute hasta que alcanzoacute un valor maacuteximo de aproximadamente 39 gL lo cual
ocurrioacute a las 42 h de incubacioacuten A tiempos posteriores la concentracioacuten de biomasa
disminuyoacute debido a que ocurrioacute lisis celular (figura 21) La velocidad especiacutefica maacutexima
de crecimiento de la levadura fue de 00244 h-1 la cual fue superior a la obtenida en
matraz cuando crecioacute con 17 mM de Cr(VI) (00142 h-1) esta diferencia podriacutea deberse
a que en el reactor airlift las ceacutelulas de Candida sp tuvieron una mayor cantidad de
oxiacutegeno disponible para su crecimiento
Figura 21 Variacioacuten de la concentracioacuten de biomasa y de glucosa en el cultivo por lote
de Candida sp en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM
La levadura consumioacute la principal fuente de carbono y energiacutea (glucosa) presente en el
medio de cultivo a lo largo de todo el tiempo de incubacioacuten incluso durante el periodo en
el que ocurrioacute lisis celular La glucosa no fue completamente consumida por la levadura
00
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo [h]
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e g
luc
os
a
res
idu
al [g
L]
00
05
10
15
20
25
30
35
40
45
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e b
iom
as
a [
gL
]Glucosa Biomasa
69
al final del experimento la concentracioacuten de glucosa residual fue de 17 gL (figura 21)
por lo que la eficiencia global de consumo del monosacaacuterido fue del 835
El pH del medio de cultivo disminuyoacute desde 60 hasta aproximadamente 25 Este uacuteltimo
valor se alcanzoacute a las 292 h de incubacioacuten y se mantuvo praacutecticamente constante a
tiempos posteriores (figura 22)
Figura 22 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) y del pH en el cultivo por lote de
Candida sp en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM
La concentracioacuten de Cr(VI) residual disminuyoacute progresivamente a medida que se
incrementoacute el tiempo de incubacioacuten hasta que a las 468 h ya no se detectoacute Cr(VI) en el
medio de cultivo por lo que la eficiencia global de remocioacuten de Cr(VI) fue del 100 Se
observoacute una ligera remocioacuten de Cr(VI) durante el periodo en el que ocurrioacute lisis celular
(figuras 21 y 22) En contraste la concentracioacuten de cromo total en solucioacuten se
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo [h]
Cr(
VI)
y C
rom
o t
ota
l re
sid
ua
l [m
gL
]
00
10
20
30
40
50
60
70
pH
[Cr(VI)] [Cromo total] pH
70
mantuvo casi constante a lo largo del tiempo de cultivo Lo anterior indica que la
levadura fue capaz de transformar el Cr(VI) a la forma trivalente menos toacutexica
En la tabla 6 se comparan los valores de algunas variables cineacuteticas obtenidas en
matraz (cuando se hizo crecer la levadura a una concentracioacuten de Cr(VI) inicial de 17
mM) y en el biorreactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando la levadura se cultivoacute en
medio de cultivo con concentraciones iniciales semejantes de Cr(VI) y de sulfato
Tabla 6 Variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote de Candida sp realizados
en matraz y en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Variable cineacutetica Matraz Reactor
Incremento celular maacuteximo [gL] 22 263
Velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento [h-1] 00142 00244
Eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) [] 100 100
Velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI)L h] 098 164
Velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI) g biomasa h] 045 095
Capacidad de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI) g biomasa] 400 443
El incremento celular maacuteximo y la velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento de
Candida sp obtenidos en el reactor airlift fueron 1955 y 718 superiores a los
alcanzados en matraz respectivamente Como se mencionoacute previamente eacutesto podriacutea
deberse a que en el reactor airlift la levadura tuvo una mayor cantidad de oxiacutegeno
disponible para su crecimiento
71
La levadura redujo todo el Cr(VI) inicialmente presente en el medio de cultivo [eficiencia
global de reduccioacuten de Cr(VI) del 100] tanto cuando se cultivoacute en matraz como en el
reactor airlift El hecho de que Candida sp sea capaz de reducir concentraciones de
Cr(VI) tan altas como 15 mM (e incluso superiores como se mostroacute en la seccioacuten
anterior) podriacutea ser de importancia praacutectica porque la mayoriacutea de los microorganismos
ensayados son capaces de reducir parcial o totalmente concentraciones maacutes bajas de
Cr(VI) (tabla 7)
Tabla 7 Datos sobre reduccioacuten de Cr(VI) por microorganismos
Microorganismo Cultivo
Modo de
operacioacuten
Concentra-
cioacuten de
Cr(VI)
[mM]
Velocidad
volumeacutetrica
de reduccioacuten
[mg de
CrLh]
Eficiencia
de
reduccioacuten
[]
Referencia
Acinetobacter
haemolitycus
Aerobio
CPL
067 128 88 Zakaria y col
2006
Aislado de
Pseudomonas
(CRB5)
Aerobio
CPL
043 014 100 McLean y
Beveridge 2000
Arthrobacter
sp
Aerobio
CPL
017 016 65 Megharaj y col
2003
Aspergillus sp Aerobio
CPL
096 0694 100 Acevedo-Aguilar
y col 2006
Bacillus
megaterium
TKW3
Aerobio
CPL
048 009 735 Cheung y Gu
2005
Bacillus sp Aerobio
CPL
007 007 65 Megharaj y col
2003
Bacteria J3 Aerobio
CPL
01 00057 21 Badar y col
2000
Brevibacterium
CrT-13
Aerobio
CPL
288 255 68 Faisal y Hasnain
2004
E coli AC80 Aerobio
CPL
002
065
9375
Ishibashi y col
1990
Ochrabactrum
sp
Aerobio
CPL
017
034
033
038
100
88
Thacker y
Madamwar 2005
72
Ochrobactrum
intermedium Cr-
T1
Aerobio
CPL
288 326 87 Faisal y Hasnain
2004
Penicillium sp Aerobio
CPL
096 066 95 Acevedo-Aguilar y
col 2006
Phanerochaete
chrysosporium
Aerobio
CPL
058 011 100 Pal 1997
Providencia
sp
Aerobio
CPL
102 10 100 Thacker y col
2006
Pseudomonas
ambigua G-1
Aerobio
CPL
288 347 83 Horitsu y col
1987
Streptomyces
griseus
Aerobio
CPL
017 025 100 Laxman y More
2002
Trichoderma
inhamatum
Aerobio
CPL
13
075 100 Morales-Barrera y
Cristiani-Urbina
2008
Trichoderma
viride
Aerobio
CPL
16
104 100 Morales-Barrera y
Cristiani-Urbina
2006
CPL = Cultivo por lote
La velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) obtenida en el reactor neumaacutetico
con Candida sp fue de 164 mg de Cr(VI)Lh la cual fue 6735 superior a la alcanzada
en matraz [098 mg de Cr(VI)Lh] (tabla 6) Esto uacuteltimo podriacutea deberse a la mayor
cantidad de biomasa generada en el reactor la cual redujo maacutes raacutepidamente el Cr(VI)
Acinetobacter haemolitycus fue capaz de reducir completamente 096 mM de Cr(VI) en
36 h por lo que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal de este microorganismo
fue de 139 mg de Cr(VI)Lh sin embargo cuando la concentracioacuten inicial de Cr(VI) se
incrementoacute a 135 mM la eficiencia y velocidad de reduccioacuten disminuyeron (Zakaria y
col 2006)
A una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 017 mM la eficiencia y velocidad volumeacutetrica
global de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por Ochrabactrum sp fue del 100 y 033 mg
de Cr(VI)Lh respectivamente Aunque la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal
73
se incrementoacute a 038 mg de Cr(VI)Lh cuando la concentracioacuten inicial de Cr(VI) fue de
034 mM la eficiencia de reduccioacuten disminuyoacute a 88 (Thacker y Madamwar 2005)
La eficiencia y velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas con Arthrobacter
sp a las 70 h de incubacioacuten fue de aproximadamente 65 y 016 mg de Cr(VI)Lh
cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial del metal de 017 mM (Megharaj y col 2003)
Con Providencia sp se obtuvo una eficiencia de reduccioacuten del 100 al cabo de 108 h de
incubacioacuten en medios de cultivo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 102 mM
siendo su velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal de 10 mg de Cr(VI)Lh (Thacker
y col 2006) La velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Streptomyces griseus
fue de 025 mg de Cr(VI)Lh cuando se cultivoacute en presencia de 017 mM de Cr(VI)
(Laxman y More 2002)
En el caso de eucariotes Acevedo-Aguilar y col (2006) reportaron que Penicillium sp y
Aspergillus sp fueron capaces de reducir por completo 096 mM de Cr(VI) en 72 h
obtenieacutendose una velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de 0694 mg de Cr(VI)Lh
Asimismo Trichoderma viride exhibioacute una eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) del 100 y
una velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de 104 mg de Cr(VI)Lh cuando se cultivoacute en
un reactor airlift en medio de cultivo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 16 mM
(Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006) Trichoderma inhamatum fue capaz de reducir
por completo 13 mM de Cr(VI) con una velocidad volumeacutetrica de 075 mg de Cr(VI)Lh
(Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2008)
En la tabla 7 se muestran los valores de eficiencia y velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten
de Cr(VI) obtenidas con otros microorganismos
74
La velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) que se obtuvo en el reactor airlift con
Candida sp fue de 095 mg de Cr(VI)g de biomasah (tabla 6) la cual fue 211 veces
mayor que la alcanzada en matraz [045 mg de Cr(VI)g de biomasah] Bae y col
(2000) reportaron que la velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) de Escherichia coli
ATCC 33456 se encontroacute en el intervalo de 031 a 07 mg de Cr(VI)g de biomasah
cuando este microorganismo se cultivoacute por lote en diferentes medios de cultivo con una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 096 mM A una concentracioacuten de Cr(VI) de 0096 mM
los lodos activados exhibieron una velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) de
aproximadamente 008 mg de Cr(VI)g de biomasah (Stasinakis y col 2003) El cultivo
por lote de Trichoderma inhamatum exhibioacute una velocidad especiacutefica de
aproximadamente 0584 mg de Cr(VI)g de biomasah cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 13 mM (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2008)
Asimismo en cultivos por lote de Providencia sp realizados con una concentracioacuten inicial
de Cr(VI) de 034 mM se obtuvo una velocidad especiacutefica de reduccioacuten del metal de
1302 mgg de biomasah (Thacker y col 2006)
En el presente trabajo se encontroacute que en el reactor airlift cada gramo (peso seco) de
biomasa producida de Candida sp pudo reducir 4438 mg de Cr(VI) (tabla 6) valor
ligeramente superior al encontrado en matraz [40 mg de Cr(VI)g de biomasa] y
semejante al reportado para Trichoderma inhamatum (Morales-Barrera y Cristiani-
Urbina 2008) Asimismo a las 60 h de incubacioacuten la capacidad de reduccioacuten de
Penicillium sp y Aspergillus sp fue de aproximadamente 082 y 042 mg de Cr(VI)g de
biomasa (Acevedo-Aguilar y col 2006) Wang y Shen (1997) reportaron que la
capacidad maacutexima de reduccioacuten de Cr(VI) de los cultivos aeroacutebicos de Bacillus sp y
75
Pseudomonas fluorescens LB300 fue de 208 x 10-12 y 310 x 10-12 mg de Cr(VI)ceacutelula
respectivamente si se toma en cuenta que el peso seco promedio de una ceacutelula
bacteriana tiacutepica es de aproximadamente 3 x 10-13 g (Atkinson y Mavituna 1983)
entonces la capacidad de reduccioacuten de Bacillus sp y P fluorescens LB300 seriacutea de 693 y
1033 mg de Cr(VI)g de biomasa respectivamente
43 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote repetido en el reactor airlift con
tubo conceacutentrico liso
Se realizaron algunos cultivos por lote repetido en el reactor airlift con tubo conceacutentrico
liso (sin perforaciones) En cada uno de los cultivos ensayados el reactor se inoculoacute
inicialmente con un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada de la
levadura para obtener una concentracioacuten inicial de biomasa de aproximadamente 12
mgmL La concentracioacuten inicial de Cr(VI) del medio de cultivo fue de aproximadamente
15 mM y el flujo de aire fue de 1 vvm El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que la
concentracioacuten de Cr(VI) residual en el medio fue baja (primer cultivo por lote) a
continuacioacuten una parte del medio de cultivo contenido en el reactor se drenoacute y se
adicionoacute medio fresco con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM Posteriormente el
reactor se operoacute nuevamente por lote (segundo cultivo por lote o cultivo por lote
repetido) Se ensayaron tres relaciones de recambio de medio de cultivo (f = volumen de
medio cosechadovolumen inicial de medio de cultivo) de 08 06 y 04
Debido a la importancia que tiene el pH del medio de cultivo en los procesos
microbioloacutegicos de reduccioacuten de Cr(VI) en el presente trabajo se llevaron a cabo cultivos
por lote repetido con relaciones de recambio de 06 y 08 en los que el pH del medio de
76
cultivo se ajustoacute a 60 al inicio del segundo cultivo por lote (cultivo por lote repetido) asiacute
como experimentos en los que el pH no se ajustoacute a 60 por lo que el pH inicial del cultivo
por lote repetido fue el alcanzado al final del primer cultivo por lote (cercano a 30) Es
conveniente mencionar que los valores bajos de pH inhiben el crecimiento de los
microorganismos pero favorecen la reduccioacuten del Cr(VI) a Cr(III) al ocurrir esto uacuteltimo
disminuye el efecto toacutexico de la forma hexavalente del metal
En estos experimentos se observoacute que el crecimiento de la levadura y la reduccioacuten de
Cr(VI) fueron adversamente afectados cuando el pH del medio de cultivo se ajustoacute a 60
al inicio de los cultivos por lote repetido En la figura 23 se muestra la variacioacuten de la
concentracioacuten de Cr(VI) residual en los cultivos por lote y lote repetido realizados con y
sin ajuste del pH al inicio de los cultivos por lote repetido cuando se utilizaron relaciones
de recambio de 06 y 08
77
Figura 23 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los cultivos por lote y lote
repetido realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizaron
00
100
200
300
400
500
600
700
800
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [m
gL
]
f = 08 spH
f = 08 cpH
CPL CPLR
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [m
gL
] f = 06 spH
f = 06 cpH
CPL CPLR
78
relaciones de recambio de 06 y 08 (spH = sin ajuste de pH del medio de cultivo al
inicio del cultivo por lote repetido cpH = con ajuste de pH del medio de cultivo a 60 al
inicio del cultivo por lote repetido)
En la figura se aprecia que en los primeros cultivos por lote el Cr(VI) fue totalmente o
casi completamente reducido en aproximadamente 45-49 h Sin embargo en los cultivos
por lote repetido el tiempo que se requirioacute para reducir el Cr(VI) fue mayor Asimismo es
evidente que se alcanzaron concentraciones de Cr(VI) residual maacutes bajas en los sistemas
por lote repetido en los que no se ajustoacute el pH al inicio de los cultivos
Los resultados anteriores sugieren que la levadura pierde parte de su capacidad de
reduccioacuten de Cr(VI) cuando se cultiva repetidamente en medios que contienen Cr(VI)
Estos resultados concuerdan con lo reportado por Wang y Shen (1997) quienes
encontraron que Bacillus sp Pseudomonas fluorescens LB300 y Escherichia coli ATCC
33456 pierden su capacidad para reducir Cr(VI) despueacutes de que han reducido 046-052
058 y 125 mM de Cr(VI) respectivamente Un comportamiento similar tambieacuten fue
reportado por Middleton y col (2003) para Shewanella oneidensis
Como los niveles maacutes altos de reduccioacuten de Cr(VI) se obtuvieron cuando no se ajustoacute el
pH a 60 al inicio de los cultivos por lote repetido el experimento en el que se ensayoacute
una relacioacuten de recambio de 04 uacutenicamente se llevoacute a cabo sin ajustar el pH
En la figura 24 se muestra la variacioacuten de la concentracioacuten celular en los sistemas por
lote y lote repetido a las tres diferentes relaciones de recambio ensayadas (04 06 y
08) cuando no se ajustoacute el pH al inicio de los cultivos por lote repetido Se aprecia que
en ninguno de los cultivos por lote repetido se alcanzaron densidades celulares cercanas
79
a las de los cultivos por lote que los precedioacute En los cultivos por lote repetido el
incremento celular y la velocidad especiacutefica de crecimiento maacutes altos se obtuvieron
cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 06 (tabla 8) sin embargo los valores
alcanzados fueron inferiores a los obtenidos en el cultivo por lote que los antecedioacute
Figura 24 Variacioacuten de la concentracioacuten de biomasa con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo ensayadas
00
05
10
15
20
25
30
35
40
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Co
nce
ntr
acioacute
n d
e b
iom
asa
[g
L]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
80
Tabla 8 Variables cineacuteticas del crecimiento celular y de la reduccioacuten de Cr(VI)
obtenidas en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp llevados a cabo en el
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Variable Cultivo por lote Cultivo por lote repetido
Relacioacuten de recambio
04 06 08
Incremento celular
maacuteximo [gL]
224 230 235 017 038 009
Velocidad especiacutefica maacutexima de
crecimiento [h-1]
00244 00227 00220 00044 00109 00017
Eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) []
999 980 973 96 93 36
Velocidad
volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI)Lh]
160 178 151 035 046 045
En los cultivos por lote repetido se necesitoacute de una mayor cantidad de tiempo para
consumir la glucosa presente en los medios en comparacioacuten con los cultivos por lote del
cual derivaron (figura 25) Asimismo en ninguno de los cultivos se consumioacute
totalmente la glucosa la mayor eficiencia de consumo del monosacaacuterido de los cultivos
por lote repetido se obtuvo cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 06 con un
valor de 783 el cual es cercano al obtenido en los primeros cultivos por lote
(aproximadamente 835)
81
Figura 25 Variacioacuten de la concentracioacuten de glucosa con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo utilizadas
En la figura 26 se muestran los perfiles de variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI)
residual en funcioacuten del tiempo de incubacioacuten a las diferentes relaciones de recambio de
medio de cultivo utilizadas Se aprecia que en los primeros cultivos por lote se alcanzaron
niveles de Cr(VI) residual maacutes bajos y en menor tiempo que en los cultivos por lote
repetido
00
20
40
60
80
100
120
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e g
luc
os
a r
es
idu
al [g
L]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
82
Figura 26 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo ensayadas
En los primeros cultivos por lote se alcanzaron eficiencias y velocidades volumeacutetricas
globales de reduccioacuten de Cr(VI) de 973 - 999 y de 151 - 178 mgLh
respectivamente (tabla 8) Estas velocidades son superiores a la alcanzada en el cultivo
por lote realizado en matraz [098 mg de Cr(VI)Lh] y semejantes a la obtenida
previamente en el reactor airlift [164 mg de Cr(VI)Lh]
En los cultivos por lote repetido la eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) maacutes baja se
obtuvo cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 08 y esto podriacutea deberse a que el
tiempo de incubacioacuten que se utilizoacute para este cultivo fue menor que para los otros A las
relaciones de recambio de 04 y 06 las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
[Cr(
VI)
] [m
gL
]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
83
fueron semejantes con valores de 96 y 93 respectivamente Estas uacuteltimas eficiencias
fueron ligeramente inferiores a las obtenidas en los cultivos por lote que los precedioacute
(973-999) Las mayores velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) se
obtuvieron a relaciones de recambio de 06 y 08 [aproximadamente 045 mgLh] sin
embargo fueron considerablemente inferiores a la de los cultivos por lote que los
antecedioacute
44 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa en un reactor airlift
con tubo conceacutentrico liso
Para este sistema el reactor se inoculoacute con 50 mL de inoacuteculo y se dejoacute operar por lote
durante 48 horas con el propoacutesito de incrementar la densidad celular A continuacioacuten se
suministroacute continuamente medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de
15 mM [78 mgL] y con un flujo volumeacutetrico de 378 mLh por lo que la velocidad de
dilucioacuten ensayada fue de 00076 h-1 Se permitioacute que el reactor alcanzara el estado
estacionario lo cual se corroboroacute mediante la determinacioacuten de la concentracioacuten de
biomasa asiacute como de glucosa y de Cr(VI) residual de muestras colectadas a diferentes
tiempos
En el estado estacionario los valores promedio de concentracioacuten de biomasa glucosa
Cr(VI) residual y de pH fueron de 016 gL 62 gL 46 mgL y 345 respectivamente
De estos resultados es evidente que la concentracioacuten de biomasa en el reactor fue muy
baja lo que probablemente ocasionoacute que se alcanzaran valores bajos de eficiencia de
consumo de glucosa (38) y de reduccioacuten de Cr(VI) (41) asiacute como de velocidad
volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) (024 mgLh)
84
Posteriormente se ensayoacute un flujo de alimentacioacuten de 5 mLh para operar con una
velocidad de dilucioacuten de 001 h-1 Sin embargo bajo estas condiciones se presentoacute el
fenoacutemeno de lavado celular en el cual no se detecta biomasa en el reactor Este
experimento se realizoacute varias veces y en todos los casos se obtuvo el mismo resultado
El lavado celular que ocurrioacute en el cultivo continuo de Candida sp podriacutea deberse a que
la velocidad de dilucioacuten que se utilizoacute (001 h-1) es muy cercana a la velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento de la levadura [de aproximadamente 00146 h-1 determinada en
cultivo por lote en medio de cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM]
por lo que la levadura no tuvo tiempo suficiente para duplicarse y fue desplazada del
reactor Ademaacutes el suministro continuo de medio de alimentacioacuten con Cr(VI) ocasiona
que la levadura esteacute constantemente sujeta a los efectos toacutexicos del metal Es decir la
baja velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento de la levadura y los efectos toacutexicos
continuos del metal fueron probablemente los factores que limitaron la eficiencia y
velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) en cultivo continuo
Debido a que ocurrioacute lavado celular a una velocidad de dilucioacuten de 001 h-1 ya no fue
posible ensayar velocidades maacutes altas Los resultados obtenidos en cultivo continuo de
una etapa indican que este sistema de reaccioacuten no es adecuado para la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp
En la tabla 9 se presentan datos sobre la reduccioacuten de Cr(VI) por microorganismos en
cultivos continuos en suspensioacuten o inmovilizados Hasta donde es de nuestro
85
conocimiento no hay informacioacuten disponible acerca de la reduccioacuten de Cr(VI) por
levaduras y hongos filamentosos en cultivo continuo
Tabla 9 Resumen de datos sobre la reduccioacuten microbiana de Cr(VI) en cultivo continuo
Microorganismo Cultivo Concentra-
cioacuten de
Cr(VI) [mM]
Velocidad
de
dilucioacuten
[h-1]
Velocidad
volumeacutetrica
de reduccioacuten
[mg de
CrLh]
Eficiencia
de
reduccioacuten
[]
Referencia
Pseudomonas
sp C7
Aerobio 12
12
0014
0017
073
093
88
91
Gopalan y
Veeramani
1994
Pseudomonas
fluorescens
LB300
Aerobio 011
009
009
002
005
009
016
017
022
57
39
28
DeLeo y
Ehrlich
1994
Escherichia coli
ATCC 33456
Aerobio 08 005
169 843 Bae y col
2000
Pseudomonas
mendocina
MCM B-180
Aerobio
05
15
20
022
014
011
57
108
113
99
99
99
Bhide y
col 1996
Microbacterium
liquefaciens
MP30
Aerobio
(ceacutelulas
inmovilizadas
en perlas de
polivinil
alcohol-
alginato)
005
0038
009
90
Pattanapip
it-paisal y
col 2001
Bacillus sp Aerobio
(ceacutelulas
inmovilizadas
en perlas de
vidrio Pyrex)
192
192
004
008
397
797
998
998
Chirwa y
Wang
1997
86
En un estudio realizado en cultivo continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de Pseudomonas
fluorescens LB300 se encontroacute que la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute desde
57 hasta 28 y que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal se incrementoacute de
016 a 022 mg de Cr(VI)Lh a medida que la velocidad de dilucioacuten se incrementoacute de
002 a 009 h-1 cuando se utilizoacute medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI)
de 009 mM (DeLeo y Ehrlich 1994)
Los resultados obtenidos en cultivo continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de otros
microorganismos han sido alentadores Gopalan y Veeramani (1994) ensayaron tres
velocidades de dilucioacuten de 0014 0017 y 0028 h-1 y encontraron que la maacutexima
eficiencia (91) y velocidad volumeacutetrica [093 mg de Cr(VI)Lh] de reduccioacuten de Cr(VI)
de Pseudomonas sp C7 se obteniacutea a una velocidad de dilucioacuten de 0017 h-1 cuando se
utilizoacute medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de 12 mM En el estudio
realizado por Bae y col (2000) con Escherichia coli ATCC 33456 la velocidad de dilucioacuten
se mantuvo constante a 005 h-1 y se obtuvo una eficiencia y una velocidad volumeacutetrica
de reduccioacuten de Cr(VI) de 843 y de 169 mg de Cr(VI)Lh respectivamente cuando
se utilizoacute una concentracioacuten de Cr(VI) de 08 mM en el medio de alimentacioacuten En cultivo
continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de Pseudomonas mendocina MCM B-180 Bhide y col
(1996) ensayaron el efecto de diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI) [de 05 a
20 mM] y de velocidades de dilucioacuten (011 a 022 h-1) sobre la reduccioacuten de Cr(VI)
Estos investigadores encontraron altas eficiencias (99) y velocidades de reduccioacuten [57
ndash 113 mg de Cr(VI)Lh]
Asimismo con la finalidad de reducir los efectos toacutexicos del Cr(VI) sobre los
microorganismos se ha propuesto el uso de ceacutelulas inmovilizadas en reactores continuos
87
de lecho fijo Las ceacutelulas de Microbacterium liquefaciens MP30 inmovilizadas en perlas de
alginato de calcio - polivinil alcohol fueron capaces de reducir el Cr(VI) con una
eficiencia del 90 y con una velocidad de 009 mg de Cr(VI)Lh cuando se utilizoacute medio
de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de 005 mM y una velocidad de dilucioacuten
de 0038 h-1 (Pattanapipitpaisal y col 2001) En un reactor de lecho fijo con ceacutelulas de
Bacillus sp inmovilizadas en perlas de vidrio Pyrex con un diaacutemetro de 3 mm se observoacute
que al incrementar la velocidad de dilucioacuten de 004 a 008 h-1 la eficiencia de reduccioacuten
de Cr(VI) se mantuvo constante (998) y que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de
Cr(VI) se incrementoacute de 397 a 797 mgLh (Chirwa y Wang 1997)
45 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular y la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo conceacutentrico de
malla de acero inoxidable y de vidrio perforado
Los reactores airlift con tubo conceacutentrico liso (reactores convencionales) no son
adecuados para llevar a cabo cultivos por lote alimentado (procesos con volumen
variable) ya que no es posible lograr una adecuada circulacioacuten del liacutequido a cualquier
volumen de medio de cultivo En los reactores airlift convencionales uacutenicamente se logra
una adecuada circulacioacuten del fluido cuando la altura del liacutequido es mayor que la del tubo
conceacutentrico Por ello para realizar cultivos por lote alimentado en reactores airlift es
necesario que existan diversos puntos de comunicacioacuten entre las secciones de ascenso y
descenso del reactor a lo largo de toda la longitud del tubo conceacutentrico En la literatura
se han descrito algunos reactores airlift que en su interior contienen dispositivos que
permiten la comunicacioacuten entre ambas secciones del reactor Los dispositivos maacutes
comunes son tubos de mallas metaacutelicas (net draft tube) (Tung y col 1997 Wu y Wu
1990 1991 Wu y col 1992) tubos conceacutentricos de vidrio con perforaciones
88
rectangulares (Cristiani-Urbina y col 2000) placas curvas colocadas coaxialmente
(Hagino y col 1982) y bafles (placas) perforados (Galiacutendez-Mayer y col 2001) Estos
dispositivos afectan las caracteriacutesticas hidrodinaacutemicas y de transferencia de masa y calor
de los reactores por lo que es conveniente evaluar su desempentildeo
En este trabajo se evaluoacute la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivos por lote
utilizando reactores airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable asiacute como de
vidrio con perforaciones circulares Estos cultivos se realizaron con dos flujos de aire de
05 y 1 vvm Estos experimentos tuvieron como propoacutesito principal el seleccionar el tubo
conceacutentrico maacutes adecuado para llevar a cabo posteriormente los cultivos por lote
alimentado y lote alimentado repetido
En la figura 27 se muestran las curvas de crecimiento celular cuando se utilizoacute el reactor
airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos de aire
ensayados El crecimiento celular de la levadura fue mayor cuando se utilizoacute un flujo de
aire de 1 vvm lo cual podriacutea deberse a una mayor oxigenacioacuten del medio de cultivo Los
niveles de Cr(VI) residual maacutes bajos tambieacuten se obtuvieron con un flujo de aire de 1 vvm
(figura 28) y eacutesto podriacutea deberse a la mayor densidad celular alcanzada bajo estas
condiciones
89
Figura 27 Curvas de crecimiento celular de Candida sp en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos de aire ensayados
Figura 28 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual en los cultivos por lote realizados
en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos
de aire ensayados
000
050
100
150
200
250
00 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Tiempo [h]
XX
O
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
00 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Tiempo [h]
Cr(
VI)
Re
sid
ual [
]
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
90
En los experimentos realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado se
observoacute un comportamiento opuesto al obtenido previamente con el tubo conceacutentrico de
malla metaacutelica El crecimiento celular (figura 29) y la reduccioacuten de Cr(VI) (figura 30)
en el reactor con tubo conceacutentrico perforado fueron mayores a un flujo de aire de 05
vvm
Figura 29 Curvas de crecimiento celular de Candida sp en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico de vidrio perforado a los dos flujos de aire ensayados
000
050
100
150
200
00 500 1000 1500 2000 2500
Tiempo [h]
XX
O
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
91
Figura 30 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual en los cultivos por lote realizados
en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de vidrio perforado a los dos flujos de aire
ensayados
En la tabla 10 se muestran algunas variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote
realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable y con
tubo conceacutentrico perforado de vidrio a los dos flujos de aire ensayados Ademaacutes la tabla
incluye los resultados obtenidos en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
00 500 1000 1500 2000 2500
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ual [
] Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
92
Tabla 10 Variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote realizados en el reactor
airlift con las diferentes configuraciones de tubo conceacutentrico
Cultivo por lote
Variable cineacutetica Tubo conceacutentrico
liso
Malla metaacutelica Tubo conceacutentrico perforado
10 vvm 05 vvm 10 vvm 05 vvm 05 vvm 10 vvm
Incremento celular
maacuteximo [gL]
263 072 142 123 106 082
Velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento [h-1]
00244 00059 00120 00149 00178 00093
Eficiencia global de
reduccioacuten de Cr(VI) ()
100 67 95 97 95 89
Velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) [mg de Cr(VI)Lh]
164 031 056 082 084 035
Comparando los resultados obtenidos en el reactor con tubo de malla metaacutelica y con el
de vidrio perforado la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) fue mayor cuando se
utilizoacute el tubo conceacutentrico perforado de vidrio y un flujo de aire de 05 vvm con un valor
promedio de dos experimentos independientes de 083 mgLh Sin embargo esta
velocidad es aproximadamente 494 inferior a la alcanzada con el tubo conceacutentrico liso
Los resultados de crecimiento celular (incremento celular maacuteximo y velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento) y de reduccioacuten de Cr(VI) (eficiencia y velocidad volumeacutetrica)
obtenidos en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable y de
vidrio perforado a los flujos de aire ensayados podriacutean sugerir que el grado de
oxigenacioacuten del medio de cultivo y la magnitud de los esfuerzos de corte que se alcanzan
durante la agitacioacuten neumaacutetica desempentildean un papel importante en la generacioacuten de
biomasa de Candida sp en los estados fisioloacutegicos de eacutesta y por consiguiente en la
93
reduccioacuten de Cr(VI) Debido a lo anterior seriacutea conveniente investigar la influencia de la
velocidad de aireacioacuten la cual afecta los patrones de flujo del fluido la magnitud de las
fuerzas de corte y la concentracioacuten del nutriente gaseoso en la fase fluida
Como las mayores eficiencias y velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) se
obtuvieron cuando se utilizoacute el tubo conceacutentrico perforado de vidrio y un flujo de aire de
05 vvm eacutestos fueron utilizados en los cultivos por lote alimentados que se llevaron a
cabo posteriormente
46 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote alimentado
repetido en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado
En los cultivos por lote alimentado el volumen de medio liacutequido en el reactor se
incrementa gradualmente a medida que aumenta el tiempo de incubacioacuten Este cambio
de volumen provoca una dilucioacuten de los componentes presentes en el medio de cultivo lo
cual dificulta la interpretacioacuten de los resultados Debido a lo anterior en los cultivos por
lote alimentado es conveniente expresar el cambio de las variables (biomasa sustrato
etc) en teacuterminos de masa y no de concentracioacuten y para ello es necesario conocer el
volumen de medio a los diferentes tiempos de incubacioacuten Por consiguiente en el
presente trabajo se estimaron las cantidades de biomasa glucosa y de Cr(VI) y se
expresaron en teacuterminos de masa A continuacioacuten se presentan las ecuaciones para
calcular la masa de las variables de intereacutes para este trabajo
Masa celular [g] = (concentracioacuten celular gL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
94
Masa de glucosa [g] = (concentracioacuten de glucosa gL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
Masa de Cr(VI) [mg] = (concentracioacuten de Cr(VI) mgL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
En los cultivos por lote alimentado y lote alimentado repetido se ensayaron dos flujos
volumeacutetricos de medio de alimentacioacuten de 659 y 1343 mLh que corresponden a
cargas maacutesicas de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh respectivamente Los cultivos por lote
alimentado realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado se iniciaron con
cultivos por lote (los resultados obtenidos en estos uacuteltimos cultivos se mostraron en la
seccioacuten anterior)
Cuando se utilizoacute una carga maacutesica de Cr(VI) de 0514 mgh en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) se observoacute que la masa celular
de la levadura en el primer cultivo por lote alimentado fue mayor que en la del segundo
cultivo Sin embargo a pesar de que la levadura tuvo un suministro constante de fuente
de carbono y energiacutea eacutesta praacutecticamente no crecioacute
Cuando se utilizoacute una carga maacutesica de Cr(VI) de 0514 mgh fue evidente que en los
cultivos por lote alimentado se fue acumulando glucosa en el medio de cultivo lo que
indica que las ceacutelulas casi no consumieron el monosacaacuterido que teniacutean disponible para su
crecimiento La cantidad de glucosa consumida por la levadura en el cultivo por lote
alimentado repetido (segundo cultivo por lote alimentado) fue considerablemente menor
que la consumida en el primer cultivo lo cual podriacutea deberse a que habiacutea una menor
cantidad de biomasa en el reactor En el segundo cultivo por lote alimentado se alcanzoacute
95
una eficiencia de consumo de glucosa del 68 en cambio en el primer cultivo fue del
263
Se observoacute que la levadura fue capaz de reducir parcialmente el Cr(VI) adicionado al
reactor y que en el primer cultivo por lote alimentado se lograron mayores niveles de
reduccioacuten
En el primer cultivo por lote alimentado las eficiencias de reduccioacuten de Cr(VI) maacutes altas
se alcanzaron durante el periodo de incubacioacuten de las 468 a las 967 h (7188-7292)
y disminuyeron ligeramente hasta el final de este cultivo (673-6945) En el segundo
cultivo por lote alimentado (lote alimentado repetido) las eficiencias disminuyeron
gradualmente a medida que se incrementoacute el tiempo de incubacioacuten (figura 31) La
eficiencia promedio de reduccioacuten de Cr(VI) del primer cultivo por lote alimentado fue de
689 y la del segundo cultivo alimentado fue de 56
96
Figura 31 Variacioacuten de la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) de Candida sp cuando se
utilizoacute una carga maacutesica del metal de 0514 mgh
La velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute progresivamente a medida
que transcurrieron los cultivos por lote alimentado desde 0181 hasta 0063 mgLh
(figura 32) estos valores son inferiores a los alcanzados en los cultivos por lote
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Efi
cie
nc
ia d
e r
ed
uc
cioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
CPLA1 CPLA2
97
Figura 32 Variacioacuten de la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Candida sp
en el cultivo por lote alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) llevados a
cabo con una carga maacutesica del metal de 0514 mgh
Posteriormente se realizoacute el cultivo por lote alimentado y lote alimentado repetido
utilizando una carga maacutesica de Cr(VI) de 105 mgh Se observoacute que en ambos cultivos
la masa celular de Candida sp se incrementoacute gradualmente a medida que se incrementoacute
el tiempo de incubacioacuten aunque al final de cada cultivo hubo una ligera disminucioacuten en la
cantidad de biomasa en el reactor En el primer cultivo por lote alimentado se alcanzoacute un
valor maacuteximo de 523 g de biomasa (incremento celular de 053 g) a las 637 h
mientras que en el segundo cultivo se alcanzoacute una cantidad maacutexima de biomasa de 435
g (incremento celular de 13 g) a las 1822 h totales de cultivo que corresponden a 893
h del cultivo por lote alimentado repetido
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica g
lob
al d
e
re
du
ccioacute
n d
e C
r(V
I) [
mg
de
Cr(V
I)L
h]
CPLA1 CPLA2
98
Asimismo se encontroacute que la levadura fue capaz de consumir parcialmente la glucosa
suministrada En el primer cultivo por lote alimentado se obtuvo una eficiencia de
consumo de glucosa del 299 mientras que en el segundo cultivo la eficiencia fue del
388 Estos resultados probablemente se deban a que el crecimiento de la levadura fue
mayor en el cultivo por lote alimentado repetido (incremento celular = 13 g) que en el
cultivo por lote alimentado que lo precedioacute (incremento celular = 053 g)
En los cultivos por lote alimentados llevados a cabo con una carga maacutesica de 105 mg de
Cr(VI) la levadura fue capaz de reducir parcialmente el Cr(VI) adicionado al reactor sin
embargo al final del primer cultivo por lote alimentado se lograron los niveles de
reduccioacuten maacutes altos
En el primer cultivo por lote alimentado la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) se
incrementoacute a medida que aumentoacute el tiempo de incubacioacuten alcanzaacutendose el valor maacutes
alto de eficiencia (529) a las 879 h de incubacioacuten En contraste en el segundo cultivo
por lote alimentado (alimentado repetido) la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute
continuamente conforme transcurrioacute el tiempo de cultivo Al final del cultivo por lote
alimentado repetido la eficiencia de reduccioacuten del metal fue del 43 (figura 33)
99
Figura 33 Variacioacuten de la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) de Candida sp cuando se
utilizoacute una carga maacutesica del metal de 105 mgh
En estos experimentos tambieacuten se observoacute que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de
Cr(VI) disminuyoacute continuamente durante todo el periodo de incubacioacuten desde 0226
hasta 0099 mgLh (figura 34)
0
10
20
30
40
50
60
0 50 100 150 200 250
Tiempo [h]
Efi
cie
ncia
de
re
du
ccioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
CPLA1 CPLA2
100
Figura 34 Variacioacuten de la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Candida sp
en el cultivo por lote alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) llevados a
cabo con una carga maacutesica del metal de 105 mgh
Las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) que se obtuvieron con una carga maacutesica
del metal de 105 mgh fueron inferiores a las logradas con una carga de 0514 mgh y
esto podriacutea deberse a que el tiempo de contacto entre la levadura y el medio de cultivo
fue menor En contraste las velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) fueron
ligeramente superiores a una carga maacutesica de 105 mgh
Con las dos cargas maacutesicas de Cr(VI) que se ensayaron en este trabajo se observoacute una
variacioacuten semejante en el pH de los medios de cultivo Los cultivos por lote alimentado
se iniciaron con un pH de 302-306 (estos valores corresponden al pH que se obtuvo al
final de los cultivos por lote que precedioacute a los cultivos por lote alimentado) El pH se
000
004
008
012
016
020
024
0 50 100 150 200 250
Tiempo [h]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica g
lob
al d
e r
ed
uccioacute
n
de
Cr(V
I) [
mg
de
Cr(V
I)L
h]
CPLA1 CPLA2
101
incrementoacute ligeramente durante el curso de los primeros cultivos por lote alimentado y al
final de eacutestos se tuvieron valores de 355 y de 345 cuando se emplearon cargas maacutesicas
de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh respectivamente En los cultivos por lote alimentado
repetido el pH se mantuvo praacutecticamente constante durante todo el periodo de
incubacioacuten
A pesar de que el cultivo por lote alimentado es muy recomendable para trabajar con
compuestos toacutexicos ha sido poco explorado para el tratamiento de aguas contaminadas
con cromo hexavalente Fujii y col (1990) utilizaron el cultivo por lote alimentado para
investigar la reduccioacuten de Cr(VI) por la bacteria anaerobia Enterobacter cloacae cepa
HO1 En este estudio una solucioacuten de cromato se alimentoacute continuamente en pequentildeas
dosis para minimizar el efecto toacutexico del metal Los investigadores encontraron que la
reduccioacuten de Cr(VI) fue fuertemente afectada por la velocidad especiacutefica de alimentacioacuten
de cromato Cuando esta velocidad fue inferior a 25 mmol de CrO42-g de biomasah
todo el cromo adicionado fue reducido A velocidades de alimentacioacuten superiores se
observoacute que la concentracioacuten de Cr(VI) residual en el medio de cultivo se incrementaba a
medida que aumentaba la velocidad de alimentacioacuten Asimismo encontraron que la
actividad reductora de la bacteria era fuertemente inhibida cuando la concentracioacuten de
Cr(VI) del medio de cultivo era mayor a 07 mM (3639 mgL)
Posteriormente Fujie y col (1996) realizaron la simulacioacuten de un cultivo por lote
alimentado utilizando datos cineacuteticos obtenidos en cultivo por lote y un modelo
matemaacutetico que describe el comportamiento de la bacteria antes mencionada Los
resultados experimentales y los predichos por el simulador fueron semejantes
102
En la tabla 11 se presentan los valores de velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
obtenidos en el presente trabajo en los diferentes sistemas de reaccioacuten ensayados La
mayor velocidad se obtuvo en el cultivo por lote realizado en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso por lo que eacuteste seriacutea el sistema maacutes adecuado para la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp
103
Tabla 11 Velocidades volumeacutetricas globales de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas en diferentes sistemas de reaccioacuten
CPL
Matraz
CPL Reactor
airlift con
tubo liso
CPL Reactor
airlift con
malla metaacutelica
CC Reactor
airlift con
tubo liso
CPLR Reactor
airlift con
tubo liso
CPL Reactor
airlift con tubo
perforado
CPLA Reactor
airlift con
tubo perforado
CPLAR Reactor
airlift con
tubo perforado
10
Vvm
05
vvm
10
vvm
10
vvm
10
vvm
05
vvm
10
vvm
05
vvm
05
vvm
f=08 f=06 f=04
CM1 CM2 CM1 CM2
098 151 ndash178 031 056 024 045 046 035 084 035 0092-0181
0163-0195
0063-0083
0099-0145
CPL = Cultivo por lote CC = Cultivo continuo CPLR = Cultivo por lote repetido CPLA = Cultivo por lote alimentado CPLAR = Cultivo por lote alimentado repetido f = relacioacuten de recambio CM = Carga maacutesica de Cr(VI)
CM1 = 0514 mg Cr(VI)h CM2 = 105 mg Cr(VI)h
104
5 CONCLUSIONES
El sulfato desempentildea un papel importante en la tolerancia al Cr(VI) y en la reduccioacuten
del mismo en la cepa de Candida sp utilizada en este trabajo
El efecto modulador del sulfato sobre el crecimiento celular y la reduccioacuten del Cr(VI)
depende de las concentraciones de los oxianiones sulfato y cromato
El mecanismo principal de remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp es la biotransformacioacuten
del altamente toacutexico Cr(VI) al menos toacutexico Cr(III)
El cultivo por lote en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso es el sistema de
reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
La velocidad de aireacioacuten no tiene un efecto significativo sobre la reduccioacuten de Cr(VI)
por Candida sp
105
6 REFERENCIAS
1 Acevedo-Aguilar FJ Espino-Saldantildea AE Leoacuten-Rodriacuteguez IL Rivera-Cano ME Avila-Rodriguez M Wrobel K et al 2006 Hexavalent chromium removal in vitro and from industrial wastes using chromate-resistant strains of filamentous
fungi indigenous to contaminated wastes Can J Microbiol 52 809-815
2 Ali-Awan M Baig MA Iqbal J Aslam MR amp Ijaz N 2003 Recovery of chromium (III) from tannery wastewater J App Sci amp Environ Management 7 (2) 5-8
3 Aacutelvarez SG Maldonado M Gerth A amp Kuschk P 2004 Characterization of
tannery effluents and study of the water Hyacinth in chromium recovery Informacioacuten Tecnoloacutegica 15 (3) 75-80
4 Aravindhan BM Madani B Rao JR Nair BU amp Ramasami T 2004 Bioaccumulation of Chromium from Tannery Wastewater An Approach for chrome
recovery and reuse Environ Sci Technol 38 300-306
5 Atkinson B amp Mavituna F 1983 Biochemical engineering and biotechnology handbook United Kingom Nature Press
6 Badar U Ahmed N Beswick AJ Pattanapipitpaisal P amp Macaskie LE 2000 Reduction of chromate by microorganisms isolated from metal contaminated sites of
Karachi Pakistan Biotechnol Lett 22 829-836 7 Bae WC Kang TG Kang IK Won YJ amp Jeong BC 2000 Reduction of
hexavalent chromium by Escherichia coli ATCC 33456 in batch and continuous cultures J Microbiol 38(1) 36-39
8 Balasubramanian S amp Pugalenthi V 1999 Determination of total chromium in
tannery wastewater by inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry
flame atomic absorption spectrometry and uv-visible spectrophotometric methods Talanta 50 (3) 457-467
9 Baldi F Vaughan AM amp Olson GJ 1990 Chromium(VI)-resistant yeast
isolated from a sewage treatment plant receiving tannery wastes Appl Environ
Microbiol 56 (4) 913-918
10 Barnhart J 1997 Occurrences uses and properties of chromium Regulatory Toxicology and Pharmacology 26 S3-S7
11 Beleza VM Boaventura RA amp Almeida MF 2001 Kinetics of chromium removal from spent tanning liquors using acetylene production sludge Environ
Sci Technol 35 (21) 4379-4383 12 Bhide JV Dhakephalkar PK amp Paknikar KM 1996 Microbiological process for
the removal of Cr(VI) from chromate-bearing cooling tower effluent Biotechnol Lett 18 (6)667-672
106
13 Bopp LH amp Ehrlich HL 1988 Chromate resistance and reduction in
Pseudomonas fluorescens strain LB300 Archives of Microbiology 150 426-431
14 Branco R Alpoim MC amp Morais PV 2004 Ochrobactrum tritici strain 5bvI1 ndash characterization of a Cr(VI)-resistant and Cr(VI)-reducing strain Can J Microbiol
50 697-703 15 Camargo FAO Bento FM Okeke BC amp Frankenberger WT 2002 Chromate
reduction by chromium-resistant bacteria isolated from soils contaminated with dichromate Journal of Environmental Quality 32 1228-1233
16 Camargo FAO Okeke BC Bento FM amp Frankenberger WT 2003 In vitro
reduction of hexavalent chromium by a cell-free extract of Bacillus sp ES 29
stimulated by Cu2+ Appl Microbiol Biotechnol 62 569-573
17 Cantildeizares-Villanueva R 2000 Biosorcioacuten de metales pesados mediante el uso de biomasa microbiana Rev Latinoam Microbiol 42 131-143
18 Cervantes C Campos-Garciacutea J Devars S Gutieacuterrez-Corona F Loza-Tavera H Torres-Guzmaacuten JC amp Moreno-Saacutenchez R 2001 Interactions of chromium with
microorganisms and plants FEMS Microbio Rev 25 335-347 19 Chardin B Dolla A Chaspoul F Fardeau ML Gallice P amp Bruschi M 2002
Bioremediation of chromate thermodynamic analysis of the effects of Cr(VI) on sulfate-reducing bacteria Appl Microbiol Biotechnol 60 352-360
20 Chardin B Giudici-Orticoni MT De Luca G Guigliarelli B amp Bruschi M 2003
Hydrogenases in sulfate-reducing bacteria function as chromium reductase Appl
Microbiol Biotechnol 63 315-321
21 Cheung Y amp Gu G 2003 Reduction of chromate (CrO42-) by an enrichment
consortium and an isolate of marine sulfate-reducing bacteria Chemosphere 52 1523-1529
22 Cheung KH amp Gu JD 2005 Chromate reduction by Bacillus megaterium TKW3
isolated from marine sediments World Journal of Microbiology amp Biotechnology 21 213-219
23 Cheung KH amp Gu JD 2007 Mechanism of hexavalent chromium detoxification
by microorganisms and bioremediation application potential a review International
Biodeterioration amp Biodegradation 59 8-15
24 Chirwa EMN amp Wang YT 1997 Hexavalent chromium reduction by Bacillus sp in a packed-bed bioreactor Environ Sci Technol 31 1446-1451
25 Cristiani-Urbina E Netzahuatl-Muntildeoz AR Manriquez-Rojas FJ Juaacuterez-Ramiacuterez C Ruiz-Ordaz N amp Galiacutendez-Mayer J 2000 Batch and fed-batch
cultures for the treatment of whey with mixed yeast cultures Process Biochemistry 35 649-657
107
26 Czakoacute-Veacuter K Batiegrave M Raspor P Sipiczki M amp Pesti M 1999 Hexavalent
chromium uptake by sensitive and tolerant mutants of Schizosaccharomyces pombe FEMS Microbiology Letters 178 109-115
27 DeLeo PC amp Ehrlich HL 1994 Reduction of hexavalent chromium by
Pseudomonas fluorescens LB300 in batch and continuous cultures Appl Microbiol Biotechnol 40 756-759
28 Desjardin V Bayard R Lejeune P amp Gourdon R 2003 Utilization of supernatant of pure cultures of Streptomyces thermocarboxydus NH50 to reduce
chromium toxicity and mobility in contaminated soils Water Air and Soil Pollut 3 153-160
29 Eccles H 1999 Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process TIBTECH 17 462-465
30 Faisal M amp Hasnain S 2004 Comparative study of Cr(VI) uptake and reduction in
industrial effluent by Ochrobactrum intermedium and Brevibacterium sp
Biotechnology Letters 26 1623-1628
31 Fruchter J 2002 In situ treatment of chromium-contaminated groundwater Environ Sci amp Technol pp 464-472
32 Fujie K Hu H Huang X Tanaka Y Urano K amp Ohtake H 1996 Optimal operation of bioreactor system developed for the treatment of chromate wastewater
using Enterobacter cloacae HO-1 Wat Sci Tech 33 (5-6) 173-182 33 Fujii E Toda K amp Ohtake H 1990 Bacterial reduction of toxic hexavalent
chromium using a fed-batch culture of Enterobacter cloacae strain HO1 J Ferment Bioeng 69 (6) 365-367
34 Gaballah I Goy D Kilbertus G amp Thauront J 1994 Decontamination of
industrial effluents for environment protection and recycling of metals Resources
Conservation and Recycling 10 (1-2) 97-106
35 Galiacutendez-Mayer J Saacutenchez-Teja O Cristiani-Urbina E amp Ruiz-Ordaz N 2001 A novel split-cylinder airlift reactor for fed-batch cultures Bioprocess and Biosystems
Engineering 24 171-177 36 Ganguli A amp Tripathi AK 1999 Survival and chromate reducing ability of
Pseudomonas aeruginosa in industrial effluents Lett Appl Microbiol 28 76-80
37 Garbisu C Alkorta I Llama MJ amp Serra JL 1998 Aerobic chromate reduction by Bacillus subtilis Biodegradation 9 133-141
38 Gonzaacutelez AR Ndungrsquou K amp Flegal AR 2005 Natural occurrence of hexavalent chromium in the Aromas Red Sands Aquifer California Environ Sci Technol 39
(15) 5505-5511
108
39 Gopalan R amp Veeramani H 1994 Studies on microbial chromate reduction by
Pseudomonas sp in aerobic continuous suspended growth cultures Biotechnology and Bioengineering 43 471-476
40 Guertin J Jacobs JA amp Avakian CP 2005 Chromium(VI) Handbook 1st
edition CRC Press USA 41 Hach Water Analysis Handbook 2002 Hach Company Colorado USA 4th ed
pp 433-444 1210-1211
42 Hafez AI El-Manharawy MS amp Khedr MA 2002 RO membrane removal of unreacted chromium from spent tanning effluent A pilot-scale study Part 2 Desalination 144 (1-3) 237-242
43 Hagino H Odagiri H amp Okutani J 1982 Draft device for a bubble column US
Patent 4327042 44 Horitsu H Futo S Miyazawa Y Ogai S amp Kawai K 1987 Enzymatic
reduction of hexavalent chromium by hexavalent chromium tolerant Pseudomonas ambigua G-1 Agric Biol Chem 51 (9) 2417-2420
45 Ishibashi Y Cervantes C amp Silver S 1990 Chromium reduction in Pseudomonas
putida Appl Environ Microb 56 (7) 2268-2270
46 Jianlong W Zeyu M amp Xuan Z 2004 Response of Saccharomyces cerevisiae to
chromium stress Process Biochem 39 1231-1235 47 Juvera-Espinosa J Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2006 Isolation and
characterization of a yeast strain capable of removing Cr(VI) Enzyme and Microbial Technology 40 114-121
48 Kaszycki P Fedorovych D Ksheminska H Babyak L Gonchar MV Jaglarz
A amp Koloczek H 2003 Modulation of chromium(VI) and (III) tolerance and
accumulation in yeast by sulfate-containing salts European Journal of Biochemistry 1 (1) P49-53
49 Komori K Wang P Toda K amp Ohtake H 1989 Factors affecting chromate
reduction in Enterobacter cloacae Strain HO1 Appl Microbiol Biotechnol 31 567-570
50 Ksheminska H Fedorovych D Babyak L Yanovych D Kaszycki P amp Koloczek H 2005 Chromium(III) and (VI) tolerance and bioaccumulation in
yeast a survey of cellular chromium content in selected strains of representative genera Process Biochem 40 1565-1572
51 Ksheminska HP Honchar TM Gayda GZ amp Gonchar MV 2006 Extra-cellular chromate-reducing activity of the yeast cultures Central European Journal of
Biology 1 (1)137-149
109
52 Kurniawan TA Chan GYS Lo W amp Babel S 2006 Physico-chemical
treatment techniques for wastewater laden with heavy metals Chemical Engineering Journal 118 83-98
53 Labra M Grassi F Imazio S Di Fabio T Citterio S Sgorbati S amp Agradi E
2004 Genetic and DNA-methylation changes induced by potassium dichromate in Brassica napus L Chemosphere 54 1049-1058
54 Laxman RS amp More S 2002 Reduction of hexavalent chromium by Streptomyces griseus Minerals Engineering 15 831-837
55 Leustek T 2002 Sulfate metabolism The Arabidopsis Book American Society of
Plant Biologists
56 Liu YG Xu WH Zeng GM Li X and Gao H 2006 Cr(VI) reduction by
Bacillus sp isolated from chromium landfill Process Biochemistry 41 1981-1986 57 Llovera S Bonet R Simon-Pujol MD amp Congregado F 1993 Effect of culture
medium ions on chromate reduction by resting cells of Agrobacterium radiobacter Appl Microbiol Biotechnol 39 424-426
58 Lloyd JR 2003 Microbial reduction of metals and radionuclides FEMS Microbiol
Rev 27 411-425
59 Marsh TL amp McInerney MJ 2001 Relationship of hydrogen bioavailability to
chromate reduction in aquifer sediments Appl Environ Microb 67 (4) 1517-1521
60 McLean J amp Beveridge TJ 2001 Chromate reduction by a pseudomonad isolated from a site contaminated with chromated copper arsenate Applied and
Environmental Microbiology 67 (3)1076-1084 61 Megharaj M Avudainayagam S amp Naidu R 2003 Toxicity of hexavalent
chromium and its reduction by bacteria isolated from soil contaminated with tannery waste Current Microbiology 47 51-54
62 Middleton SS Latmani RB Mackey MR Ellisman MH Tebo BM amp Criddle
CS 2003 Cometabolism of Cr(VI) by Shewanella oneidensis MR-1 produces cell-associated reduced chromium and inhibits growth Biotechnol Bioeng 83 627-637
63 Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2006 Removal of hexavalent chromium
by Trichoderma viride in an airlift bioreactor Enzyme and Microbial Technology 40 107-113
64 Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2008 Hexavalent chromium removal by Trichoderma inhamatum fungal strain isolated from tannery effluent Enzyme and
Microbial Technology 40 107-113
110
65 Morales B L 2005 Aislamiento de microorganismos y estudio de su capacidad
para remover cromo hexavalente Tesis de Maestriacutea Escuela Nacional de Ciencias Bioloacutegicas IPN Meacutexico
66 Muter O Patmalnieks A amp Rapoport A 2001 Interrelations of the yeast Candida
utilis and Cr(VI) metal reduction and its distribution in the cell and medium Process Biochem 36 963-970
67 Ohtake H Cervantes C amp Silver S 1987 Decreased chromate uptake in Pseudomonas fluorescens carrying a chromate resistance plasmid J Bacteriol 169
3853-3856 68 Pal N 1997 Reduction of hexavalent chromium to trivalent chromium by
Phanerochaete chrysosporium pp 511-517 En Alleman BC amp Leeson A In Situ and On-Site Bioremediation Vol 2 Battelle Press Ohio USA
69 Pattanapipitpaisal P Brown NL amp Macaskie LE 2001 Chromate reduction by
Microbacterium liquefaciens immobilised in polyvinyl alcohol Biotechnol Lett 23
61-65
70 Pepi M amp Baldi F 1992 Modulation of chromium(VI) toxicity by organic and inorganic sulfur species in yeasts from industrial wastes BioMetals 5 179-185
71 Quintana M Curutchet G amp Donati E 2001 Factors affecting chromium(VI) reduction by Thiobacillus ferrooxidans Biochemical Engineering Journal 9 11-15
72 Ramiacuterez-Ramiacuterez R Calvo-Meacutendez C Aacutevila-Rodriacuteguez M Lappe P Ulloa M
Vaacutezquez-Juaacuterez R amp Gutieacuterrez-Corona JF 2004 Cr(VI) reduction in a chromate-
resistant strain of Candida maltosa isolated from the leather industry Antonie van Leeuwenhoek 85 63-68
73 Rege MA Petersen JN Johnstone DL Turick CE Yonge DR amp Apel WA
1997 Bacterial reduction of hexavalent chromium by Enterobacter cloacae strain
HO1 grown on sucrose Biotechnol Lett 19 (7) 691-694
74 Roukas T 1993 Ethanol production from nonsterilized carob pod extract by free and immobilized Saccharomyces cerevisiae cells using fed-batch culture
Biotechnol Bioeng 43 189-194 75 Ruiacutez MA 2000 Recuperacioacuten de metales pesados de soluciones diluidas por
biosorcioacuten con bacteria En Medrano RH Galan WL Biotecnologiacutea de Minerales CONACYT Meacutexico pp 235-262
76 Saxena D Levin R amp Firer MA 2000 Removal of chromate from industrial
effluent by a new isolate of Staphylococcus cohnii Wat Sci Technol 42 (1-2)
93-98
77 Secretariacutea de Comercio y Fomento Industrial NMX-AA-74-1981 Anaacutelisis de Agua ndash Determinacioacuten del Ioacuten Sulfato
111
78 Secretariacutea de Economiacutea NMX-AA-051-SCFI-2001 Anaacutelisis de Agua -
Determinacioacuten de Metales por Absorcioacuten Atoacutemica en Aguas Naturales Potables Residuales y Residuales Tratadas - Meacutetodo de Prueba
79 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NMX-AA-044-SCFI-
2001 Anaacutelisis de Aguas - Determinacioacuten de Cromo Hexavalente en Aguas Naturales Potables Residuales y Residuales Tratadas - Meacutetodo de Prueba En Diario Oficial de la Federacioacuten 1 de agosto 2001
80 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996
Liacutemites Maacuteximos Permisibles de Contaminantes en las Descargas de Aguas Residuales en Aguas y Bienes Nacionales En Diario Oficial de la Federacioacuten 6 de enero 1997
81 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996
Liacutemites Maacuteximos Permisibles de Contaminantes en las Descargas de Aguas Residuales a los Sistemas de Alcantarillado Urbano o Municipal En Diario Oficial de la Federacioacuten 3 de junio 1998
82 Secretariacutea de Salud Proyecto de Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-
NOM-127-SSA1-1994 Salud Ambiental Agua para Uso y Consumo Humano - Liacutemites Permisibles de Calidad y Tratamientos a que debe Someterse el Agua para su Potabilizacioacuten En Diario Oficial de la Federacioacuten 20 de Octubre 2000
83 Shakoori AR Makhdoom M amp Haq RU 2000 Hexavalent chromium reduction
by a dichromate-resistant gram-positive bacterium isolated from effluents of tanneries Appl Microbiol amp Biotechnol 53 (3) 348-351
84 Shen H and Wang YT 1994 Biological reduction of chromium by E coli Journal of Environmental Engineering 120 560-572
85 Shen H amp Wang Y 1995 Hexavalent chromium removal in two-stage bioreactor
system J Environ Eng 121 (11) 798-804
86 Smith WA Apel WA Petersen JN amp Peyton BM 2002 Effect of carbon and
energy source on bacterial chromate reduction Bioremediation J 6 (3) 205-215
87 Smith WL amp Gadd GM 2000 Reduction and precipitation of chromate by mixed culture sulphate-reducing biofilms J Appl Microbiol 88 983-991
88 Song Z Williams CJ amp Edyvean RGJ 2004 Treatment of tannery wastewater by chemical coagulation Desalination 164 (3) 249-259
89 Srinath T Verma T Ramteke PW amp Garg SK 2002 Chromium (VI)
biosorption and bioaccumulation by chromate resistant bacteria Chemosphere 48
(4) 427-435
90 Stanbury PF amp Whitaker A ―Principles of Fermentation Technology Pergamon Press Ltd Great Britain 1984 First edition Pp 11-24
112
91 Stasinakis AS Mamais D Thomaidis NS amp Lekkas TD 2002 Effect of
chromium (VI) on bacterial kinetics of heterotrophic biomass of activated sludge Water Res 36 3341-3349
92 Stasinakis AS Thomaidis NS Mamais D Karivali M amp Lekkas TD 2003
Chromium species behaviour in the activated sludge process Chemosphere 52 1059-1067
93 Stephen JR amp Macnaughton SJ 1999 Developments in terrestrial bacterial remediation of metals Current Opinion in Biotechnology 10 230-233
94 Su C amp Ludwig RD 2005 Treatment of hexavalent chromium in chromite ore
processing solid waste using a mixed reductant solution of ferrous sulfate and
sodium dithionite Environ Sci Technol 39 (16) 6208-6216
95 Thacker U Parikh R Shouche Y amp Madamwar D 2006 Hexavalent chromium reduction by Providencia sp Process Biochem 41 1332-1337
96 Thacker U amp Madamwar D 2005 Reduction of toxic chromium and partial localization of chromium reductase activity in bacterial isolate DM1 Would Journal
of Microbiology amp Biotechnology 21 891-899 97 Tung HL Chiou SY Tu CC amp Wu WT 1997 An airlift reactor with double
net draft tubes and its application in fermentation Bioprocess Eng 171-5
98 Turick CE Apel WA amp Carmiol NS 1996 Isolation of hexavalent chromium-reducing anaerobes from hexavalent-chromium-contaminated and noncontaminated environments Applied Microbiol Biotechnol 44 683-688
99 Viamajala S Peyton BM Sani RK Apel WA amp Petersen JN 2004 Toxic
effects of chromium(VI) on anaerobic and aerobic growth of Shewanella oneidensis MR-1 Biotechnol Prog 20 87-95
100 Volesky B amp Vieira RHSF 2000 Biosorption a solution to pollution Internat Microbiol 3 17-24
101 Wang DIC Cooney CL Demain AL Dunnill P Humphrey AE amp Lilly MD
1979 ―Fermentation and Enzyme Technology John Wiley amp Sons Inc USA Pp 98-115
102 Wang YT and Shen H 1997 Modelling Cr(VI) reduction by pure bacterial cultures Water Research 31 727-732
103 Wang Y amp Xiao C 1995 Factors affecting hexavalent chromium reduction in pure
cultures of bacteria Water Res 29 (11) 2467-2474
104 Wang Y 2000 Microbial reduction of chromate En Lovley DR (Ed)
Environmental Microbe-Metal Interactions ASM Press Washington DC USA pp 225-235
113
105 Wilkin RT Su C Ford RG amp Paul CJ 2005 Chromium-removal processes
during groundwater remediation by a zerovalent iron permeable reactive barrier Environ Sci Technol 39 (12) 4599-4605
106 Worthington Biochemical Corporation 1972 Worthington Enzyme Manual
Enzymes Enzyme Reagents and Related Biochemicals Freehold New Jersey USA
107 Wu J amp Wu WT 1991 Fed-batch culture of Saccharomyces cerevisiae in an airlift reactor with net draft tube Biotechnol Prog 7 230-233
108 Wu WT amp Wu JY 1990 Airlift reactor with net draught tube J Ferm Bioeng
70 359-361
109 Wu WT Wu JY amp Jong JZ 1992 Mass transfer in an airlift reactor with a net
draft tube Biotechnol Prog 8 465-468 110 Zakaria ZA Zakaria Z Surif S amp Ahmad WA 2006 Hexavalent chromium
reduction by Acinetobacter haemolyticus isolated from heavy-metal contaminated wastewater J Hazard Mater 146 30-38
111 Zuacutentildeiga M 2005 Aislamiento de microorganismos con capacidad para remover
cromo hexavalente del agua Tesis de Licenciatura Escuela Nacional de Ciencias
Bioloacutegicas IPN Meacutexico
Referencias electroacutenicas
httpepagov httpesepagovtechpubs412304html
httpfaiunneeduarbiologiamicroindcultivo20y20biorreactoreshtm httpmineralserusgsgovmineralspubscommoditychromium180494pdf
httpuserpagesumbcedu gferre1bmcohtml
httpuserpagesumbcedu gferre1fedbatchhtml httpwwgemesmaterialdocument httpwwwatsdrcdcgovfacts7 html
httpwwwchemicalelementscomelementscrhtml httpwwwepagoviris
wwwclu-inorgdownloadstudentpapersbio_of_metals_paperpdf
114
7 Impacto
En este trabajo se identificaron algunas variables ambientales que afectan la
biorreduccioacuten de cromo hexavalente [Cr(VI)] La informacioacuten obtenida podriacutea ser de
utilidad para mejorar los procesos de reduccioacuten del metal asiacute como para disminuir los
tiempos y costos del tratamiento de los efluentes industriales contaminados con Cr(VI)
Los resultaron mostraron que el sulfato afecta la tolerancia de Candida sp al Cr(VI) y a
su capacidad para reducirlo Fue evidente que a medida que se incrementoacute la
concentracioacuten de sulfato aumentoacute el crecimiento de la levadura la eficiencia global y la
velocidad global de reduccioacuten de Cr(VI) Asimismo se encontroacute que la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp depende de la densidad celular de los cultivos de manera tal que
a mayor cantidad de biomasa producida mayor es la reduccioacuten del metal Aun cuando la
cepa de Candida sp es sensible a los efectos toacutexicos del Cr(VI) en ausencia del sulfato
esta levadura posee una notable capacidad para reducir muy altas concentraciones de
Cr(VI) en presencia de sulfato por lo que podriacutea ser potencialmente uacutetil para el
tratamiento de aguas industriales altaminadas con Cr(VI) y con iones sulfato
Hasta donde sabemos este es el primer trabajo en el que se demuestra que el sulfato
desempentildea un papel impotante tanto en la tolerancia al Cr(VI) como en la reduccioacuten
aeroacutebica del mismo en microorganismos Estos descubrimientos podriacutean tener
implicaciones importantes en el tratamiento de aguas residuales contaminadas con
Cr(VI)
Ademaacutes se encontroacute que los contactores gas-liacutequido son adecuados para la reduccioacuten
aeroacutebica de Cr(VI) por Candida sp Esto uacuteltimo es de vital importancia porque seriacutea
posible disminuir significativamente los costos de tratamiento ya que estos biorreactores
se caracterizan por su baja economiacutea de aireacioacuten Las velocidades volumeacutetrica y
especiacutefica asiacute como la capacidad de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por Candida sp en el
reactor airlift con tubo conceacutentrico fueron superiores a las obtenidas en matraz y eacutesto
podriacutea deberse a que en el reactor airlift la levadura tuvo una mayor cantidad de oxiacutegeno
disponible para su crecimiento y a que el mayor nuacutemero de ceacutelulas producidas fue la
responsable de reducir maacutes eficazmente el Cr(VI) presente en el medio de cultivo
115
Las caracteriacutesticas mostradas por Candida sp en el dispositivo airlift indican que este
tipo de reactor neumaacutetico es adecuado para el crecimiento y la reduccioacuten aeroacutebica del
Cr(VI) por la levadura Asimismo los paraacutemetros cineacuteticos del proceso de reduccioacuten de
Cr(VI) catalizado por Candida sp son superiores a los reportados para otros
microorganismos lo que sugiere que esta cepa de levadura tiene potencial biotecnoloacutegico
para ser utilizada en procesos de remediacioacuten de aguas residuales industriales
contaminadas con Cr(VI)
De los diferentes sistemas de reaccioacuten ensayados (cultivos por lote lote repetido
continuo de una etapa lote alimentado y lote alimentado repetido) el cultivo por lote es
el maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
Otra de las contribuciones de este trabajo fueron la formacioacuten de recursos humanos
tanto a nivel licenciatura como de posgrado Uno de los estudiantes de licenciatura ya
sustentoacute su examen profesional y la tesis de Maestriacutea de otra estudiante ya fue revisada
y aprobada por los sinodales por lo que el examen para obtener el grado se realizaraacute en
poco tiempo Actualmente estaacuten en proceso 1 tesis de licenciatura 2 de maestriacutea y 1 de
doctorado
Entre otros productos del proyecto de investigacioacuten se tienen la publicacioacuten de 2 artiacuteculos
en revistas internacionales incluidas en la base de datos del Journal of Citation Reports
del Institute for Scientific Information (ISI) la publicacioacuten de 2 artiacuteculos en extenso en
las memorias de Congresos Internacionales y la presentacioacuten de varios trabajos en
eventos acadeacutemicos nacionales e internacionales
9
Tabla 1 Concentraciones de cromo total yo Cr(VI) de efluentes industriales y cuerpos
de agua
Fuente Concentracioacuten de cromo total
Concentracioacuten de Cr (VI)
Referencia
Industria galvanizadora ---
5000 mgL
Gaballah y col 1994
Industria galvanizadora (1) Industria galvanizadora (2)
---
---
127 mgL
3700 mgL
Fujie y col 1996
Acuiacutefero Aromas Red Sands (California)
---
6-36 gL
Gonzaacutelez y col 2005
Agua subterraacutenea contaminada (EEUU)
gt 1500 gL
---
Wilkin y col 2005
Riacuteo receptor de efluentes de la industria papelera
20-80 mgL
---
Cervantes y col 2001
Planta de tratamiento de desechos de produccioacuten de
ferrocromita
---
3-57 mgL
(fase disuelta)
Su y Ludwig 2005
Curtiduriacutea de pieles
(Grecia)
2000 ndash 3500
mgL
--- httpesepagovtechpubs41230
4html
Curtiduriacutea de pieles (tanque de sedimentacioacuten)
3500 gmL
40 gmL
Ganguli y Tripathi 1999
Curtiduriacutea de pieles (tanque de descarga)
5000 gmL
3000 gmL
Ganguli y Tripathi 1999
Curtiduriacutea de pieles (India) 200 - 2400 mgL ---
Balasubramanian y Pugalenthi 1999
Curtiduriacutea de pieles (Portugal)
2467 mgL
---
Beleza y col 2001
Efluente tratado de
curtiduriacutea de pieles (India)
---
096 mgL
Srinath y col 2002
Curtiduriacutea de pieles (Egipto)
---
1300-2500
mgL
Hafez y col 2002
Curtiduriacutea de pieles (1) (Pakistaacuten) Curtiduriacutea de pieles (2) (Pakistaacuten)
2877 mgL
220 mgL
---
---
Ali-Awan y col 2003
Curtiduriacutea de pieles 12 mgL --- Song y col 2004
Curtiduriacutea de pieles (Guanajuato Meacutexico)
250 gmL
---
Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004
Curtiduriacutea de pieles (India) 500-1000 mgL
---
Aravindhan y col 2004
Bantildeos de curtido al cromo
en curtiduriacuteas (Leoacuten Guanajuato Meacutexico)
3000 ndash10000 mgL
---
Aacutelvarez y col 2004
10
En Meacutexico no se tienen datos precisos sobre la cantidad y concentracioacuten de cromo total
o hexavalente de los residuos generados por las diversas industrias sin embargo se ha
informado que las industrias del curtido de pieles generan de 250 a 270 toneladas de
Cr2O3 al antildeo (Zuacutentildeiga 2005)
Debido a las grandes cantidades de cromo que se liberan al medio ambiente asiacute como a
los efectos indeseables que este metal ocasiona sobre los seres vivos en muchos paiacuteses
se han establecido Normas Ambientales que pretenden regular la concentracioacuten de cromo
total yo de Cr(VI) de los desechos liacutequidos soacutelidos o gaseosos que se descargan al
medio ambiente
En Meacutexico la Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca ha decretado
normas oficiales que establecen los liacutemites maacuteximos permisibles de contaminantes
incluido el cromo ya sea como cromo total o como cromo hexavalente de las aguas
residuales que se descargan en aguas y bienes nacionales (Secretariacutea de Medio
Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996) (tabla 2) asiacute como en los
sistemas de alcantarillado urbano o municipal (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos
Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996) (tabla 3)
En cuanto al agua para uso y consumo humano la Secretariacutea de Salud ha emitido la
Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-1994 (Secretariacutea de Salud Proyecto de
Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-1994) donde se indica
como liacutemite maacuteximo permisible una concentracioacuten de cromo total de 005 mgL
11
Tabla 2 Liacutemites maacuteximos permisibles de cromo total para las aguas residuales que se descargan en aguas y bienes
nacionales (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996)
Paraacutemetros
( )
Riacuteos Embalses
Naturales y
Artificiales
Aguas Costeras Suelo
(mgL) Uso en
riego
agriacutecola
(A)
Uso
puacuteblico
urbano
(B)
Proteccioacuten
de vida
acuaacutetica
( C )
Uso en
riego
agriacutecola
(B)
Uso
puacuteblico
urbano
( C )
Explotacioacuten
pesquera
navegacioacuten
y otros
usos (A)
Recreacioacuten
(B)
Estuarios
(B)
Uso en
riego
agriacutecola
(A)
Humedales
naturales
(B)
PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD
Cromo 1 15 05 10 05 10 1 15 05 10 05 10 1 15 05 10 05 10 05 10
() Medidos de manera total PD = Promedio diario PM = Promedio mensual (A) (B) y ( C ) Tipo de cuerpo receptor seguacuten la Ley Federal de Derechos
Tabla 3 Liacutemites maacuteximos permisibles de cromo hexavalente para los sistemas de alcantarillado urbano o municipal
(Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996)
Paraacutemetros (mgL) Promedio Mensual Promedio Diario Instantaacuteneo
Cromo hexavalente 05 075 1
12
Por su parte la EPA ha establecido como liacutemite una concentracioacuten de 01 mg de cromo
por litro de agua potable (httpwwwatsdrcdcgovfacts7html)
La Organizacioacuten Mundial para la Salud (OMS) y la Comunidad Econoacutemica Europea (CEE)
establecen una concentracioacuten de 005 mg de cromo totalL como paraacutemetro de calidad
para aguas destinadas a consumo humano (httpwwgemesmaterialdocument)
Algunos valores sentildealados por otras instancias internacionales se muestran en la tabla
4
Tabla 4 Liacutemites permisibles para cromo sentildealados por Directivas Internacionales
sobre agua potable y aguas embotelladas (Zuacutentildeiga 2005)
Paraacutemetro Canadaacute 1 Japoacuten 2 Aguas embotelladas Nivel de
Administracioacuten Federal sobre
Productos Farmaceacuteuticos de EEUU
Cromo
005 mgL
005 mgL
01 mgL
1 Liacutemite establecido por el Ministerio de Salud de Canadaacute
2 Liacutemite establecido por el Ministerio de Salud y Bienestar Social de Japoacuten
15 Meacutetodos para la remocioacuten de cromo de los efluentes industriales
Para disminuir los efectos toacutexicos del metal es conveniente aplicar alguacuten(os)
tratamiento(s) a los efluentes industriales que contienen cromo antes de descargarlos en
los cuerpos de agua o en el suelo asiacute como restaurar los ecosistemas contaminados En
la actualidad estaacuten disponibles varias tecnologiacuteas para estos propoacutesitos (Eccles 1999)
Estas tecnologiacuteas se han empleado para reducir la toxicidad del contaminante [mediante
la transformacioacuten quiacutemica o bioloacutegica del Cr(VI) a Cr(III)] para removerlo de un lugar
para disminuir la extensioacuten de la contaminacioacuten o para contenerlo en un aacuterea en
particular (Guertin y col 2005)
13
151 Procesos convencionales
Los meacutetodos convencionales para la remocioacuten de los metales pesados son de naturaleza
fisicoquiacutemica y pueden ser utilizados en varias etapas del tratamiento de aguas
residuales Los meacutetodos maacutes usuales para la remocioacuten de Cr(VI) de los efluentes
industriales son los siguientes 1) reduccioacuten quiacutemica ndash precipitacioacuten en donde el Cr(VI)
es reducido quiacutemicamente a Cr(III) a pH aacutecido utilizando alguacuten agente reductor (por
ejemplo el bisulfito de sodio) y posteriormente se adiciona cal o alguacuten otro compuesto
alcalino para formar hidroacutexido de cromo (III) el cual es separado por sedimentacioacuten y
2) coagulacioacuten-floculacioacuten En general estos meacutetodos tienen algunas desventajas tales
como 1) son costosos ya que el agente activo no puede ser recuperado para su
posterior reutilizacioacuten 2) algunos reactivos quiacutemicos son sumamente toacutexicos 3) su
selectividad es baja 4) generan lodos quiacutemicos con altas concentraciones de metales los
cuales son difiacuteciles de tratar 5) la remocioacuten de los metales es incompleta principalmente
cuando la concentracioacuten de eacutestos en los efluentes es inferior a 100 mgL y 6) las aguas
residuales resultantes no satisfacen los criterios de calidad establecidos en la legislacioacuten
ambiental (Cantildeizares-Villanueva 2000 Ruiacutez 2000 Saxena y col 2000 Cheung y Gu
2003)
Algunas otras tecnologiacuteas que se utilizan ocasionalmente para la remocioacuten del Cr(VI) son
el intercambio ioacutenico la adsorcioacuten el tratamiento electroquiacutemico la oacutesmosis inversa y la
evaporacioacuten (Garbisu y col 1998 Camargo y col 2003 Kurniawan y col 2006) Las
principales desventajas de estos meacutetodos son los altos costos fijos de operacioacuten y de
mantenimiento por lo que su aplicacioacuten a grandes voluacutemenes de agua o su uso por
pequentildeas y medianas empresas estaacute muy limitado
14
La EPA recomienda los siguientes meacutetodos para la remocioacuten de cromo del agua potable
en caso de que eacutesta exceda el liacutemite permisible para este metal coagulacioacuten-filtracioacuten
intercambio ioacutenico y oacutesmosis inversa (httpepagov)
En Meacutexico en caso de que el agua destinada a uso y consumo humano exceda el liacutemite
permisible de cromo total la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-1994
(Secretariacutea de Salud Proyecto de Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-
127-SSA1-1994) indica como tratamientos a aplicar el intercambio ioacutenico o la oacutesmosis
inversa
152 Procesos biotecnoloacutegicos
En las uacuteltimas dos deacutecadas se han llevado a cabo estudios con el fin de utilizar
microorganismos y plantas para la restauracioacuten de sitios y para el tratamiento de
efluentes industriales contaminados con metales toacutexicos (Stephen y Macnaughton 1999
Lloyd 2003)
En la actualidad se considera que los procesos microbioloacutegicos son la alternativa maacutes
atractiva para remover algunos metales toacutexicos de los sitios y efluentes contaminados
ya que estos procesos son ―amigables con el medio ambiente los subproductos que
generan son usualmente inocuos son muy eficientes en la remocioacuten de los metales
(particularmente cuando las concentraciones de eacutestos son bajas condiciones en las que
algunos procesos fisicoquiacutemicos son muy ineficientes) y son de bajo costo (Cheung y
Gu 2005 Chardin y col 2002 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004)
15
Dentro de los procesos biotecnoloacutegicos propuestos para la remocioacuten de Cr(VI) se
encuentran la biosorcioacuten y la reduccioacuten bioloacutegica en los cuales se han utilizado
principalmente microorganismos (Volesky y Vieira 2000 Fruchter 2002 Cheung y Gu
2003)
En la biosorcioacuten se utilizan ciertos tipos de adsorbentes bioloacutegicos por ejemplo biomasa
microbiana (viva o inactivada en suspensioacuten o inmovilizada) con los que no se requiere
energiacutea metaboacutelica para retener pasivamente al cromo hexavalente mediante procesos
fiacutesicos (adsorcioacuten fiacutesica principalmente por fuerzas de van Der Waals) o quiacutemicos
(quimisorcioacuten) (Cantildeizares-Villanueva 2000 Volesky y Vieira 2000 Aravindhan y col
2004) En algunos casos se ha observado que el metal es transportado activamente al
interior de las ceacutelulas (a expensas de energiacutea metaboacutelica) proceso al que se le denomina
como bioacumulacioacuten
En la biorreduccioacuten o reduccioacuten bioloacutegica el cromo hexavalente es transformado a la
forma trivalente este uacuteltimo puede ser faacutecilmente precipitado en una etapa posterior de
tratamiento ajustando el pH del agua residual a un valor cercano al neutro para
removerlo finalmente por meacutetodos fiacutesicos (Chardin y col 2002 Cheung y Gu 2003) Se
considera que este proceso es una alternativa tecnoloacutegica potencial para el tratamiento
de suelos cuerpos de agua y efluentes industriales contaminados ya que la reduccioacuten
del Cr(VI) disminuye significativamente la toxicidad (100 veces) solubilidad en agua y
movilidad del metal a traveacutes del medio ambiente (Cheung y Gu 2003 Lloyd 2003
Wang 2000)
16
Se han aislado varios microorganismos que pueden reducir el Cr(VI) a Cr(III) ya sea
como cultivos puros (Horitsu y col 1987 Wang 2000 Pattanapipitpaisal y col 2001
Chardin y col 2002 Cheung y Gu 2003 Middleton y col 2003 Morales-Barrera
2005 Pal 1997 Muter y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004 Thacker y col
2006) o como cultivos mixtos (Smith y col 2002 Cheung y Gu 2003) Las fuentes de
aislamiento han sido muy diversas como por ejemplo efluentes de curtiduriacuteas de la
industria metaluacutergica de mantos freaacuteticos de aguas superficiales contaminadas de
sedimentos anoacutexicos en lagos de plantas de tratamiento de aguas residuales entre
otros (Horitsu y col 1987 Fujii y col 1990 Ganguli y Tripathi 1999 Badar y col
2000 Saxena y col 2000 Pattanapipitpaisal y col 2001 Middleton y col 2003
Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004 Zuacutentildeiga 2005 Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
Entre los geacuteneros microbianos que son capaces de reducir Cr(VI) se tienen los
siguientes Achromobacter Aeromonas Agrobacterium Bacillus Desulfovibrio
Escherichia Enterobacter Micrococcus Pseudomonas (Horitsu y col 1987 Wang
2000) Staphylococcus (Saxena y col 2000) Microbacterium (Pattanapipitpaisal y col
2001) Pyrobaculum Streptomyces Deinococcus (Chardin y col 2002)
Desulfomicrobium Desulfotomaculum Pantoea (Cheung y Gu 2003) Shewanella
(Middleton y col 2003) Trichoderma (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
Phanerochaete (Pal 1997) y Candida (Muter y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col
2004)
De los estudios reportados en la literatura acerca de la reduccioacuten microbioloacutegica del
Cr(VI) sobresalen tres hechos 1) Las bacterias han sido los microorganismos maacutes
ampliamente estudiados y es muy escasa la informacioacuten disponible sobre la capacidad de
17
reduccioacuten del metal de las levaduras y de los hongos filamentosos 2) la mayoriacutea de los
microorganismos ensayados soacutelo son capaces de tolerar y reducir muy bajas
concentraciones de Cr(VI) usualmente dentro del intervalo de 0001 a 05 mM esto
uacuteltimo se ha atribuido a los efectos toacutexicos y mutageacutenicos del metal y 3) casi todos los
estudios se han realizado en cultivo por lote
1521 Transporte del cromo al interior de las ceacutelulas
Tanto en organismos procariotes como en muchos eucariotes los oxianiones cromato y
dicromato (fuentes de cromo hexavalente) ingresan principalmente a las ceacutelulas a traveacutes
de las membranas citoplaacutesmicas mediante el sistema de transporte del sulfato (Badar y
col 2000) lo cual se ha atribuido a la similitud en la carga y estructura de estos iones
(Smith y Gadd 2000) Esto fue demostrado primeramente en Salmonella typhimurium y
posteriormente en otras bacterias tales como en Escherichia coli Pseudomonas
fluorescens y Alcaligenes eutrophus Se ha comprobado que esto mismo ocurre en
algunas levaduras tales como en Candida (Muter y col 2001 Cervantes y col 2001)
Sin embargo en general el cromato penetra al interior de las levaduras por medio de un
transportador anioacutenico no especiacutefico (Czakoacute-Veacuter y col 1999 Cervantes y col 2001)
En algunos microorganismos se ha demostrado que el sulfato inhibe competitivamente el
transporte del cromato al interior de las ceacutelulas (Ohtake y col 1987 Pepi y Baldi 1992)
y que esta inhibicioacuten es maacutes marcada en ceacutelulas anaerobias que en aerobias (Zakaria y
col 2006) Tambieacuten se ha reportado el transporte del cromato por la viacutea de los fosfatos
aunque la viacutea del sulfato es la maacutes utilizada (Ohtake y col 1987)
18
El transporte del cromato al interior de las plantas tambieacuten es a traveacutes del sistema del
ioacuten sulfato Ya en el interior de la planta el cromo hexavalente se acumula en diversos
oacuterganos en cantidades diferentes El cromo hexavalente se acumula de 10 a 100 veces
maacutes en las raiacuteces que en los retontildeos o en otros tejidos (Cervantes y col 2001)
En contraste las membranas celulares de los organismos son praacutecticamente
impermeables al cromo trivalente y a sus compuestos (Ksheminska y col 2006)
1522 Mecanismos microbianos de resistencia al Cr(VI) y de reduccioacuten del
Cr(VI)
Una caracteriacutestica importante que deben tener los microorganismos que se van a utilizar
en procesos de tratamiento de efluentes contaminados con cromo hexavalente es que
sean tolerantes (resistentes) a eacuteste Esta propiedad ha sido descrita en bacterias hongos
y levaduras (Horitsu y col 1987 Cervantes y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004)
Entre los mecanismos de resistencia al cromo hexavalente que se han encontrado se
tienen los siguientes
Acumulacioacuten del metal en la superficie o en el interior de las ceacutelulas (Volesky y Vieira
2000 Saxena y col 2000)
Disminucioacuten yo impedimento en el transporte del cromo hexavalente al interior de
las ceacutelulas (Pepi y Baldi 1992)
Excrecioacuten del metal del interior de la ceacutelula al medio circundante (Cervantes y col
2001)
Reacciones de oacutexido-reduccioacuten en las que el cromo hexavalente es reducido a cromo
trivalente el cual es menos toacutexico (Baldi y col 1990 Muter y col 2001)
19
La resistencia al cromo hexavalente puede estar codificada en el genoacuteforo de las
bacterias o en plaacutesmidos Esto uacuteltimo se ha encontrado en Pseudomonas aeruginosa P
fluorescens P putida y en Alcaligenes eutrophus (Baldi y col 1990 Ishibashi y col
1990 Cervantes y col 2001) Sin embargo la tolerancia al metal no implica
necesariamente que los microorganismos seraacuten capaces de removerlo por alguacuten
mecanismo
En el interior de las ceacutelulas bacterianas los iones cromato [CrO42-] pueden ser reducidos
a cromo trivalente por ciertas enzimas (Ishibashi y col 1990 Horitsu y col 1987) En
condiciones de aerobiosis se han identificado las siguientes proteiacutenas que parecen ser las
responsables de la reduccioacuten del Cr(VI) reductasas flavoproteiacutenas enzimas
dependientes de NADH y NAD(P)H (Ishibashi y col 1990) en cambio en condiciones de
anaerobiosis los estudios indican que ciertas hidrogenasas y citocromos son los
responsables (Chardin y col 2003 Cheung y Gu 2007)
El cromo hexavalente tambieacuten puede ser reducido por compuestos quiacutemicos reductores
que son producidos durante el crecimiento de los microorganismos (Desjardin y col
2003) tales como el glutatioacuten y la cisteiacutena los cuales pueden actuar dentro o fuera de
los organismos (Zakaria y col 2006) En organismos superiores se ha identificado al
ascorbato como agente reductor del cromo hexavalente (Ksheminska y col 2006)
Casi no hay informacioacuten sobre el mecanismo responsable de la reduccioacuten del Cr(VI) en
ceacutelulas eucariotas especiacuteficamente en levaduras Con la finalidad de dilucidar dicho
20
mecanismo se han realizado estudios en los que se ha modificado la resistencia de las
levaduras al Cr(VI) o se ha inactivado alguna enzima en particular
En un trabajo llevado a cabo con algunas levaduras no convencionales se encontroacute que
algunas de eacutestas durante su crecimiento excretaron sustancias reductoras asiacute como
sustancias quelantes que formaron complejos con el cromo trivalente que fue generado
durante la transformacioacuten del cromo hexavalente (Ksheminska y col 2006)
1523 Factores que afectan la reduccioacuten bioloacutegica del Cr(VI)
En algunos microorganismos se ha estudiado el efecto que tienen las variables
ambientales tales como condiciones de aerobiosis yo de anaerobiosis donadores y
aceptores finales de electrones concentracioacuten de cromo hexavalente y potencial de
oacutexido-reduccioacuten entre algunas otras sobre la reduccioacuten del metal (Shen y Wang 1995
Shakoori y col 2000 Wang 2000 Smith y col 2002 Wang y Xiao 1995 Fujii y col
1990 Muter y col 2001 Smith y Gadd 2000 Lloyd 2003 Jianlong y col 2004
Viamajala y col 2004)
La reduccioacuten del Cr(VI) puede realizarse en ambiente aerobio yo anaerobio En
organismos aerobios y anaerobios facultativos se ha investigado el efecto del oxiacutegeno
disuelto en el medio sobre la reduccioacuten del metal (Wang 2000) Se ha encontrado que
la sensibilidad del proceso de reduccioacuten del Cr(VI) a la tensioacuten de oxiacutegeno es diferente
para cada microorganismo En cultivos de Enterobacter cloacae HO1 concentraciones
iniciales de oxiacutegeno mayores a 45 ppm inhibieron fuertemente la reduccioacuten del Cr(VI)
(Komori y col 1989) mientras que la reduccioacuten del metal fue maacutes lenta en condiciones
21
de anaerobiosis que en aerobiosis en el caso de Thiobacillus ferrooxidans (QuiIntana y
col 2001)
Asimismo se ha investigado el efecto de algunos iones sobre la reduccioacuten bioloacutegica del
Cr(VI) Con respecto al sulfato [SO42-] existe una analogiacutea estructural y de carga entre
este anioacuten [SO42-] y el ioacuten cromato [CrO4
2-] por lo que puede establecerse una
competencia entre ellos por los transportadores de sulfato existentes en las ceacutelulas
influyendo asiacute en la reduccioacuten del cromo hexavalente (Smith y Gadd 2000)
En cultivos aerobios no se ha reportado inhibicioacuten por sulfato en la reduccioacuten del cromo
hexavalente (Wang y Xiao 1995 Ishibashi y col 1990 Wang 2000) En contraste se
ha informado que en cultivos anaerobios el sulfato afecta la reduccioacuten del Cr(VI) debido
a que este anioacuten compite con el cromato como aceptor final de electrones (Garbisu y
col 1998)
Por otro lado en un estudio realizado con varios geacuteneros de levadura (Pichia Candida
Debaryomyces Saccharomyces Schwanniomyces Cryptococcus Hansenula) que tienen
capacidad para acumular cromo se encontroacute que el sulfato afectoacute la tolerancia de las
levaduras al Cr(VI) siendo mayor o menor el efecto en funcioacuten de la levadura en estudio
(Kaszycki y col 2003)
Otros iones que se han investigado son el Mg2+ Mn2+ Ca2+ y el Fe En cultivos con
ceacutelulas pasivas (resting cells) de Agrobacterium radiobacter se encontroacute que debe
controlarse principalmente la cantidad de fierro para incrementar la capacidad de
reduccioacuten del microorganismo (Llovera y col 1993)
22
Los donadores de electrones que se han utilizado principalmente en los estudios de
reduccioacuten del Cr(VI) son compuestos alifaacuteticos y aromaacuteticos carbohidratos de bajo peso
molecular aminoaacutecidos y aacutecidos orgaacutenicos (Wang y Xiao 1995 Wang 2000 Smith y
col 2002 Ksheminska y col 2006) El descubrimiento de microorganismos que son
capaces de reducir el cromo hexavalente utilizando una amplia variedad de fuentes de
carbono y energiacutea favorece su uso en procesos de remediacioacuten in situ (Smith y col
2002)
Para la reduccioacuten del cromo hexavalente es conveniente conocer el pH y la temperatura
oacuteptimos para el crecimiento de los microorganismos (Wang 2000 Shakoori y col 2000
Camargo y col 2002 Faisal y Hasnain 2004) En cultivos de Streptomyces griseus se
estudioacute la reduccioacuten del Cr(VI) en el intervalo de valores de pH de 4 a 8 y de
temperatura de 28 a 50 degC obtenieacutendose la mayor reduccioacuten a un pH de 6-7 y a una
temperatura de 28 degC (Laxman y More 2002)
En cultivos de Ochrobactrum sp se trabajoacute en el intervalo de temperatura de 30 a 45 degC
y de pH de 6 a 8 obtenieacutendose la mayor reduccioacuten del Cr(VI) y el crecimiento celular
maacutes alto a 35 degC y a un pH de 7 (Thacker y Madamwar 2005) En estudios realizados
con Escherichia coli ATCC 33456 se ensayoacute la reduccioacuten del Cr(VI) en el intervalo de
valores de pH de 3-8 y de temperatura de 40-60 degC encontraacutendose que el pH y la
temperatura de incubacioacuten oacuteptimos fueron de 7 y 37 degC respectivamente (Bae y col
2000)
Se ha observado que la concentracioacuten inicial de Cr(VI) influye en la velocidad de
reduccioacuten del metal (Wang 2000) La velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) exhibida por los
23
cultivos de Bacillus sp Pseudomonas fluorescens LB300 (Wang y Xiao 1995)
Ochrobactrum sp (Thacker y Madamwar 2005) y de Candida sp LBM2 (Juvera-Espinosa
y col 2006) se incrementoacute conforme aumentoacute la concentracioacuten inicial de Cr(VI) En
contraste la velocidad de reduccioacuten de Bacillus sp Arthrobacter sp (Megharaj y col
2003) y de Trichoderma viride (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006) disminuyoacute al
incrementar la concentracioacuten inicial de cromo hexavalente
Para obtener una reduccioacuten importante del Cr(VI) se requieren altas concentraciones de
biomasa (Wang 2000) La concentracioacuten inicial de biomasa tiene efecto sobre la
velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) de Bacillus sp y Pseudomonas fluorescens LB300 ya
que eacutesta aumentoacute al haber mayor cantidad de biomasa inicial (Wang y Xiao 1995) Este
mismo efecto se observoacute en cultivos de una cepa bacteriana gram positiva a la que se le
denominoacute como cepa ATCC 700729 (Shakoori y col 2000)
El potencial redox se ha medido en algunos estudios realizados con diferentes
microorganismos y condiciones de cultivo para determinar su efecto sobre la reduccioacuten
del Cr(VI) (Komori y col 1989 Turick y col 1996 McLean y Beveridge 2001) sin
embargo no se ha reportado un intervalo oacuteptimo de potencial redox para llevar a cabo la
reduccioacuten del Cr(VI) a su forma menos toacutexica (Wang 2000)
En algunos estudios se ha evaluado la influencia de algunos metales (Mn Ni Zn Pb Cu
Co As Se y Hg) sobre la reduccioacuten del Cr(VI) ya que las cepas microbianas que sean
resistentes a uno o varios metales y que sean capaces de reducir el Cr(VI) seriacutean de gran
utilidad en la biorremediacioacuten de efluentes industriales (Faisal y Hasnain 2004 Cheung
y Gu 2005 Thacker y col 2006) En estudios con Escherichia coli ATCC 33456 se
24
investigoacute el efecto de varios iones (Hg2+ Ag2+ Mn2+ Zn2+ Pb2+ Cd2+ Ca2+ y Mg2+) que
pueden estar presentes junto con el Cr(VI) en efluentes industriales Con el magnesio
se observoacute un ligero aumento en la actividad reductora del microorganismo mientras
que con el mercurio se inhibioacute por completo su capacidad de reduccioacuten (Bae y col
2000)
En el caso particular de microorganismos filamentosos los esfuerzos de corte pueden
causar dantildeo fiacutesico a las ceacutelulas y como consecuencia afectar su capacidad de reduccioacuten
de Cr(VI) En cultivos de Trichoderma viride realizados en matraz y en un reactor
agitado mecaacutenicamente con un impulsor se observoacute que los micelios eran de menor
tamantildeo cuando el hongo se cultivaba en el reactor Asimismo el incremento celular y la
eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidos en matraz fueron superiores a los alcanzados
en el reactor agitado con un impulsor Estos resultados sugirieron que las fuerzas de
cizalla creadas por el impulsor fragmentan el micelio y afectan la viabilidad celular y la
capacidad de reduccioacuten del microorganismo (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
16 Sistemas de reaccioacuten
En la mayoriacutea de los estudios sobre reduccioacuten de Cr(VI) el sistema de reaccioacuten que maacutes
se ha empleado es el cultivo por lote Este sistema es ampliamente utilizado en procesos
biotecnoloacutegicos para la produccioacuten de biomasa y de metabolitos de intereacutes industrial La
duracioacuten de este tipo de cultivo depende del tamantildeo del inoacuteculo de las condiciones
ambientales como el pH los componentes del medio de cultivo y la temperatura
Aunque su operacioacuten es sencilla ofrece pocas opciones de control de las variables
intensivas de intereacutes (concentracioacuten de biomasa sustrato producto) en comparacioacuten
con otros sistemas de reaccioacuten
25
(httpfaiunneeduarbiologiamicroindcultivo20y20biorreactoreshtm) Asimismo
despueacutes de un cultivo por lote se requiere de un periodo para la descarga limpieza y
esterilizacioacuten del equipo asiacute como para el arranque de un nuevo cultivo por lote lo que
disminuye la productividad global del proceso (Wang y col 1979)
Pocos son los estudios relacionados con la reduccioacuten del Cr(VI) en los que se ha
trabajado con otros sistemas de reaccioacuten tales como con el cultivo continuo (DeLeo y
Ehrlich 1994 Bhide y col 1996 Chirwa y Wang 1997 Bae y col 2000) y el cultivo
por lote alimentado o fed-batch (Fujii y col 1990 Fujie y col 1996)
El cultivo continuo permite alcanzar un estado estacionario independiente del tiempo en
el que los microorganismos presentan un crecimiento consumo de sustrato y produccioacuten
constantes por lo que es posible obtener una alta productividad o velocidad volumeacutetrica
(httpuserpagesumbcedu gferre1bmcohtml) En este sistema es posible controlar
la cantidad de biomasa utilizando un uacutenico nutriente limitante del crecimiento (Wang y
col 1979)
A pesar de que el cultivo continuo tiene la desventaja de ser susceptible de contaminarse
debido a los periodos prolongados de operacioacuten (Stanbury 1984) en estudios con Cr(VI)
se minimizariacutea lo anterior ya que este estado de oxidacioacuten del cromo es altamente toacutexico
para la mayoriacutea de los microorganismos auacuten a bajas concentraciones
El cultivo por lote alimentado se utiliza industrialmente para la produccioacuten de varios
productos bioloacutegicos de intereacutes (enzimas antibioacuteticos vitaminas aminoaacutecidos entre
otros) El sistema es uacutetil para obtener una alta concentracioacuten de metabolitos asociados
26
al crecimiento ya que es posible alcanzar una alta concentracioacuten de biomasa aunque
tambieacuten se emplea para la produccioacuten de compuestos no asociados al crecimiento como
por ejemplo de algunos antibioacuteticos Su uso tambieacuten se recomienda cuando se trabaja
con compuestos toacutexicos o de muy baja solubilidad y no requiere mayor equipo que el
utilizado en un cultivo por lote (httpuserpagesumbcedu gferre1fedbatchhtml)
Otras ventajas de este sistema son 1) los tiempos totales del proceso fermentativo son
menores y no requiere de un nuevo inoacuteculo cada vez que se repite el ciclo en
comparacioacuten con un cultivo por lote y 2) menor riesgo de contaminacioacuten que el cultivo
continuo (Roukas 1993)
27
2 OBJETIVOS
21 Objetivos generales
1) Determinar el efecto del ioacuten sulfato sobre el crecimiento celular consumo de glucosa y
reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
2) Realizar el estudio cineacutetico del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de
Cr(VI) de Candida sp en sistemas por lote y lote repetido en un reactor airlift
3) Seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten del Cr(VI) por
Candida sp
22 Objetivos especiacuteficos
a) Determinar el efecto de la concentracioacuten de sulfato de amonio sobre el crecimiento
celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
b) Evaluar el crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote y lote repetido
c) Realizar el estudio cineacutetico del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa
d) Evaluar el crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote alimentado repetido
e) Seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes conveniente para la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp
28
3 MATERIAL Y MEacuteTODOS
31 Microorganismo
Para el desarrollo del presente trabajo se utilizoacute una levadura que se aisloacute a partir del
agua residual de una industria curtidora de pieles que se encuentra ubicada en la Ciudad
de Leoacuten Guanajuato Mediante teacutecnicas morfoloacutegicas y bioquiacutemicas que fueron
realizadas en el Laboratorio de Micologiacutea de la Facultad de Medicina de la UNAM asiacute
como por teacutecnicas de biologiacutea molecular que fueron llevadas a cabo en el Laboratorio de
Microbiologiacutea General de la Escuela Nacional de Ciencias Bioloacutegicas se determinoacute que la
levadura pertenece al geacutenero Candida La amplificacioacuten y secuenciacioacuten del dominio
D1D2 del gen 26S rDNA de la levadura aislada reveloacute que estaacute relacionada con Candida
petrohuensis (GenBank accession number U45819) Candida acudensis (GenBank
accession number U45810) y Candida drimydis (GenBank accession number U45815)
con un nivel de confidencia del 896 La baja similitud de las secuencias parciales
conocidas del gen 26S rDNA y la de la cepa de levadura empleada en este trabajo podriacutea
sugerir que es una cepa no identificada no registrada en el GenBank por lo que se le
denominoacute como Candida sp La relacioacuten filogeneacutetica de la cepa de Candida usada en este
estudio y la de otras especies de levadura se muestra en la figura 1
29
Figura 1 Relaciones filogeneacuteticas de la levadura
AJ508572Cmucifera
AB041003Candida
AB041006Cmucifera
AB041005Stephanoascus
U45822Cchiropterorum
U40103Arxula
U40094Arxula
AY283605Sympodiomyces
AF017247Trichomonascus
U40110Blastobotrys
AY442294Sympodiomyces
U40096Sympodiomyces
AY559042Cmokoenaii
FGSFEP
U45819Cpetrohuensis
U45810Cancudensis
U45815Cdrimydis
U45806Cbondarzewiae
U45816Ctepae
U45812Candida
U45812Cantillancae
U45811Csantjacobensis
U76531Stephanoascus
AB196536Stephanoascus
U70245Cedax
AF017236Cbertae
U45835Cvaldiviana
AY618511Cnovakii
U45807Ccastrensis
U45826Cpaludigena
AF294910Cbituminiphila
U45829Pichia
U84241Zygozyma
U76350Myxozyma
U76527Lipomyces
U45804Debaryomyces
U75524Pichia
U68552Saccharomyces
AY545582Naumovia
AY007888Saccharomyces 100 100
43 100
100
100
43 100
100
72
100
86
95
95
100
91
58 69
99
98
84
92
60
63
54
40
56
37
49
21
39
61
16
002
30
32 Propagacioacuten del inoacuteculo
La composicioacuten quiacutemica del medio de cultivo basal que se utilizoacute en este trabajo para la
propagacioacuten del inoacuteculo y para los experimentos de remocioacuten de Cr(VI) en diferentes
sistemas de reaccioacuten los cuales fueron realizados en un reactor neumaacutetico se muestra
en la tabla 5
Tabla 5 Composicioacuten quiacutemica del medio de cultivo
Compuesto Concentracioacuten
(gL)
Glucosa 100
(NH4)2SO4 30
KH2PO4 10
MgSO4 7H2O 03
KCl 01
Extracto de levadura 01
CaCl2 005
FeCl3 0001
Para los experimentos en los que se determinoacute el efecto del sulfato sobre la tolerancia de
Candida sp al Cr(VI) y la reduccioacuten del mismo el inoacuteculo se propagoacute en el mismo medio
de cultivo pero el (NH4)2SO4 se reemplazoacute por NH4Cl (243 gL) y el MgSO47H2O por
MgCl26H2O (0247 gL)
31
El pH inicial de los medios de cultivo fue de aproximadamente 60 A matraces
Erlenmeyer de 1000 mL que conteniacutean 200 mL de medio de cultivo se les adicionoacute una
asada de Candida sp y posteriormente se incuboacute con agitacioacuten constante a 28-30 ordmC
durante 42 h A continuacioacuten la biomasa se separoacute por centrifugacioacuten a 1500 rpm a
4 degC durante 15 min bajo condiciones de asepsia El paquete celular resultante se lavoacute
dos veces con agua destilada esteacuteril para eliminar los componentes del medio de cultivo
y los residuos celulares El paquete celular se resuspendioacute en un pequentildeo volumen de
agua destilada esteacuteril y se homogeneizoacute La suspensioacuten celular resultante se utilizoacute como
inoacuteculo para los experimentos realizados en este trabajo
Para la conservacioacuten de la levadura se usaron viales con medio inclinado de YPG
(glucosa 2 peptona de caseiacutena 1 extracto de levadura 1 y agar bacterioloacutegico
2) los cuales se mantuvieron en refrigeracioacuten a 4 degC Las resiembras se realizaron
cada dos meses
33 Reactores airlift
Se utilizoacute un contactor gas-liacutequido (reactor agitado neumaacuteticamente) del tipo airlift con
tubo conceacutentrico (figuras 2a y 2b) con un volumen total de 52 litros y un posible
volumen de operacioacuten de 42 litros para realizar los estudios de remocioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en sistemas por lote lote repetido lote alimentado y lote alimentado
repetido El reactor estaacute hecho de vidrio Pyrex y consta de una base columna y una
tapa Entre la base y la columna asiacute como entre la columna y la tapa se colocaron
empaques de neopreno para evitar el contacto vidrio-vidrio asiacute como para evitar fugas
de aire yo de medio de cultivo Las secciones se unieron mediante bridas de Nylamid La
32
base del reactor tiene un difusor del tipo placa plana de vidrio poroso para el suministro
de aire
33
Oliva para
toma de muestra
Aire
Tubo conceacutentrico (liso con
perforaciones de
malla)
Filtro de aire
Venteo
Difusor de vidrio poroso(poro fino)
Difusor de vidrio
poroso (poro fino)
Aire
50deg
4
65
3 m
m
77 mm
11
5
mm
128 mm
88 mm
15
mm
70 mm
4
50
3 m
m
Figuras 2a y 2b Reactor del tipo airlift con tubo conceacutentrico
34
En el interior del reactor se colocoacute un tubo conceacutentrico liso (sin perforaciones) de vidrio
Pyrex un tubo conceacutentrico de vidrio Pyrex con perforaciones circulares (4 mm de
diaacutemetro) o un tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable No 316 (grado
alimentario nuacutemero de malla = 20 abertura = 3344 mm) los cuales tienen la misma
longitud y diaacutemetro El tipo de tubo que se utilizoacute para los experimentos de reduccioacuten
del Cr(VI) dependioacute del sistema de reaccioacuten que se ensayoacute el tubo conceacutentrico liso se
utilizoacute para llevar a cabo experimentos en cultivos por lote y lote repetido el tubo
conceacutentrico con perforaciones se empleoacute para realizar cultivos por lote lote alimentado y
lote alimentado repetido y el tubo de malla metaacutelica se usoacute para cultivos por lote
Para el cultivo continuo de una etapa se utilizoacute un reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
con un volumen total de 650 mL y un posible volumen de operacioacuten de 550 mL el cual
tiene las mismas relaciones geomeacutetricas que el reactor antes mencionado
En todos los sistemas de reaccioacuten ensayados se suministroacute aire en el interior del tubo
conceacutentrico El aire de entrada se controloacute mediante una vaacutelvula reguladora de presioacuten y
su velocidad de flujo se midioacute con un rotaacutemetro
34 Meacutetodos experimentales
341 Efecto de la concentracioacuten de sulfato sobre el crecimiento celular
consumo de glucosa remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp
Se evaluoacute el efecto de la concentracioacuten de sulfato sobre el crecimiento celular consumo
de glucosa remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivos por lote a
nivel matraz Para estos experimentos parte o todo del (NH4)2SO4 y del MgSO4 7H2O del
medio de cultivo basal (tabla 5) se reemplazoacute con NH4Cl y MgCl26H2O respectivamente
35
a fin de mantener las mismas concentraciones iniciales de nitroacutegeno (454 mM) y de
magnesio (1217 mM) en todos los medios de cultivo ensayados
Se prepararon tres series de matraces Erlenmeyer de 500 mL que conteniacutean 135 mL de
medio de cultivo con diferentes concentraciones iniciales de sulfato Las
concentraciones de sulfato ensayadas fueron las siguientes 00 1217 25 50 100
150 200 y 2392 mM (esta uacuteltima concentracioacuten corresponde a la del ioacuten sulfato
presente en el medio de cultivo basal) Estas concentraciones no incluyen la cantidad de
sulfato proporcionado por algunos otros componentes del medio de cultivo (provenientes
del extracto de levadura yo de sales inorgaacutenicas) ya que el Laboratorio Central de
Instrumentacioacuten del Departamento de Biofiacutesica de la Escuela Nacional de Ciencias
Bioloacutegicas IPN determinoacute que la concentracioacuten de este ioacuten en el medio de cultivo que
conteniacutea cloruro de amonio y cloruro de magnesio como uacutenicas fuentes de nitroacutegeno
inorgaacutenico y de magnesio respectivamente era de 23 mgL (002 mM) A este uacuteltimo
medio de cultivo es al que se le denominoacute en el presente trabajo como ―0 mM de ioacuten
sulfato Para la cuantificacioacuten del ioacuten sulfato se utilizoacute el meacutetodo recomendado por la
Norma Oficial Mexicana NMX-AA-74-1981 (Secretariacutea de Comercio y Fomento Industrial
1981) El pH inicial de todos los medios de cultivo ensayados fue de aproximadamente
60
A una serie de matraces con medio de cultivo no se le adicionoacute Cr(VI) con la finalidad de
determinar el efecto del sulfato sobre el crecimiento celular y consumo de glucosa por la
levadura en ausencia del metal (cultivos control) A los matraces de la segunda y tercera
serie se les adicionoacute un determinado volumen de una solucioacuten stock esteacuteril de cromato
de potasio (20 gL) para obtener concentraciones iniciales de Cr(VI) de 17 y 33 mM
36
respectivamente Los matraces fueron inoculados con un determinado volumen de
suspensioacuten celular concentrada a fin de que la concentracioacuten inicial de biomasa de todos
los cultivos fuera de aproximadamente 1 mgmL Los matraces se colocaron en un bantildeo
metaboacutelico con agitacioacuten constante a 28-30 degC Se recolectaron muestras a diferentes
tiempos de incubacioacuten a las que se les determinoacute la concentracioacuten de biomasa glucosa
Cr(VI) y cromo total residual asiacute como el pH
342 Controles abioacuteticos
Se utilizaron controles libres de ceacutelulas con el propoacutesito de determinar si el Cr(VI) era
reducido abioacuteticamente a Cr(III) por los componentes del medio de cultivo
Durante los experimentos de remocioacuten de Cr(VI) con ceacutelulas viables (cultivos problema)
se observoacute que el pH de los medios de cultivo disminuyoacute desde aproximadamente 6
hasta 25-42 dependiendo de la concentracioacuten de sulfato y de cromo utilizada Como
se sabe que los pHrsquos bajos favorecen que la materia orgaacutenica (donadores de electrones)
reduzca el Cr(VI) a Cr(III) en este trabajo se llevaron a cabo experimentos sin biomasa
de Candida sp (controles libres de ceacutelulas) a distintos valores de pH (25 3 4 5 y 6) y
a las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas (17 y 33 mM) para determinar
el grado de reduccioacuten causado por los constituyentes del medio de cultivo
Como controles libres de ceacutelulas se utilizaron matraces Erlenmeyer que conteniacutean medio
de cultivo a los que se les adicionoacute un volumen determinado de una solucioacuten stock
esteacuteril de cromato de potasio (20 gL) para obtener concentraciones iniciales de Cr(VI)
de 17 y 33 mM A continuacioacuten se ajustoacute el pH del medio de cultivo a alguno de los
37
valores antes mencionados La adicioacuten de la solucioacuten stock esteacuteril de cromato de potasio
y el ajuste del pH se realizoacute en condiciones de asepsia
Los controles abioacuteticos se incubaron a las mismas condiciones que los matraces
problema Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se les
determinoacute la concentracioacuten de Cr(VI)
343 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa
remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivo por lote en un
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Se realizoacute la evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa remocioacuten
de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso (sin perforaciones) El cultivo por lote se llevoacute a cabo con 4 litros de
medio de cultivo basal con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM [igual a 78
mgL de Cr(VI)] y con un pH inicial de aproximadamente 60 El reactor se inoculoacute con
un volumen determinado de suspensioacuten celular concentrada para obtener una
concentracioacuten inicial de biomasa cercana a 12 mgmL Se suministroacute aire con un flujo
volumeacutetrico de 4 litrosmin equivalente a 1 vvm (vvm = volumen de aire por volumen
de medio de cultivo por minuto)
El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que el nivel de Cr(VI) residual fue
despreciable Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se
les determinoacute la concentracioacuten de biomasa de glucosa Cr(VI) y cromo total residual asiacute
como el pH
38
344 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote repetido en un reactor
airlift con tubo conceacutentrico liso
Los sistemas por lote repetido se iniciaron con un cultivo por lote Cuando se alcanzaron
niveles bajos de Cr(VI) residual en el primer cultivo por lote se procedioacute a recolectar un
determinado volumen de medio y se reemplazoacute con medio fresco que teniacutea una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM A continuacioacuten el sistema se operoacute nuevamente por
lote (segundo cultivo por lote o cultivo por lote repetido) hasta que ya no se detectaron
variaciones considerables en la concentracioacuten de Cr(VI) residual
Se ensayaron tres diferentes relaciones de recambio de medio de cultivo (f = volumen de
medio recolectadovolumen inicial de medio liacutequido en el reactor) las cuales fueron de
04 06 y 08 Para las dos uacuteltimas relaciones se realizaron experimentos sin ajustar el
pH del medio al inicio del segundo cultivo por lote (lote repetido) asiacute como ajustando el
pH a 60 Para la primera relacioacuten (f = 04) soacutelo se realizoacute el experimento sin ajustar el
pH del medio al inicio del cultivo por lote repetido ya que los experimentos realizados a
las relaciones de recambio de 06 y 08 mostraron que la eficiencia y velocidad de
reduccioacuten de Cr(VI) de los cultivos por lote repetido eran mayores cuando no se ajustaba
el pH
Durante los cultivos por lote repetido se recolectaron muestras a diferentes tiempos de
incubacioacuten a las cuales se les determinoacute la concentracioacuten de biomasa glucosa Cr(VI) y
el pH Con los datos obtenidos se estimaron algunas variables cineacuteticas que se utilizaron
para seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para los fines que se persiguen en
este trabajo
39
345 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa en un
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Para el cultivo continuo de una etapa se utilizoacute un biorreactor airlift con tubo conceacutentrico
liso con un volumen de operacioacuten de 500 mL Al reactor se le suministroacute continuamente
medio de cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM por medio de una
bomba peristaacuteltica Se ensayaron dos flujos volumeacutetricos de medio de cultivo de 378 y
50 mLh que corresponden a velocidades de dilucioacuten de 00076 h-1 y de 00100 h-1
respectivamente
Con los datos obtenidos a la velocidad de dilucioacuten de 00076 h-1 se estimoacute la velocidad
volumeacutetrica global y la eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) las cuales se utilizaron
para seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp
346 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular y la remocioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo conceacutentrico de
malla de acero inoxidable y de vidrio perforado
Se realizaron cultivos por lote en el reactor airlift en el cual se colocoacute un tubo conceacutentrico
de malla de acero inoxidable No 316 (grado alimentario calibre No 20 abertura =
3344 mm) o un tubo conceacutentrico de vidrio con perforaciones circulares de
aproximadamente 4 mm de diaacutemetro Al reactor se le adicionaron 4 litros de medio de
cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM [igual a 78 mgL de Cr(VI)] y
un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada para obtener una
40
concentracioacuten inicial de biomasa de aproximadamente 12 mgmL El pH inicial del medio
fue de aproximadamente 60 Se ensayaron dos flujos de aire de 05 y 1 vvm
El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que el nivel de Cr(VI) residual fue bajo Se
recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se les determinoacute la
concentracioacuten de biomasa y de Cr(VI) residual Con los datos obtenidos se estimaron
algunas variables cineacuteticas que sirvieron como criterio de seleccioacuten para determinar el
tubo conceacutentrico maacutes adecuado para llevar a cabo los cultivos por lote alimentado y lote
alimentado repetido
347 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote
alimentado repetido en un reactor airlift
Para los cultivos por lote alimentado y lote alimentado repetido se utilizoacute el reactor airlift
con el tubo conceacutentrico seleccionado previamente Los cultivos por lote alimentado se
iniciaron con un cultivo por lote utilizando las condiciones iniciales mencionadas en el
inciso 446 y una aireacioacuten de 05 vvm El cultivo por lote se mantuvo en operacioacuten
hasta que la concentracioacuten de Cr(VI) residual fue baja
A continuacioacuten el reactor se drenoacute hasta alcanzar un volumen de liacutequido en el reactor de
25 litros y se inicioacute el suministro continuo de medio de alimentacioacuten con una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM La alimentacioacuten se mantuvo hasta que se alcanzoacute un
volumen de medio liacutequido en el reactor de 37 litros (primer cultivo por lote alimentado)
41
Posteriormente el reactor se volvioacute a drenar hasta obtener un volumen de medio de 25
litros y enseguida se volvioacute a suministrar continuamente medio de cultivo basal con una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM utilizando el mismo flujo de alimentacioacuten que para el
primer cultivo por lote alimentado El suministro de medio se mantuvo hasta alcanzar un
volumen de liacutequido en el reactor de 375-40 litros (segundo cultivo por lote alimentado o
cultivo por lote alimentado repetido)
Se ensayaron dos flujos de alimentacioacuten de 659 y 1343 mLh que representan cargas
maacutesicas de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh
Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las cuales se les
determinoacute la concentracioacuten de biomasa de glucosa y Cr(VI) residual asiacute como el pH
Con los datos obtenidos se estimaron las velocidades volumeacutetricas globales y las
eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI)
35 Meacutetodos analiacuteticos
351 Determinacioacuten de la concentracioacuten de biomasa
La concentracioacuten celular se determinoacute mediante el peso seco de la masa celular Las
muestras recolectadas se filtraron a traveacutes de membranas de fibra de vidrio (Whatman
GFA) con un diaacutemetro de poro de 16 m las cuales se colocaron previamente puestas a
peso constante Posteriormente las membranas se colocaron en una estufa a 95 degC
hasta alcanzar un peso constante Los filtrados se utilizaron para determinar la
concentracioacuten de glucosa Cr(VI) y cromo total residual asiacute como el pH
352 Determinacioacuten de la concentracioacuten de glucosa
42
Se determinoacute mediante un meacutetodo enzimaacutetico empleando a la glucosa oxidasa y
peroxidasa (Worthington Biochemical Corporation 1972)
Principio El meacutetodo se basa en que la glucosa es oxidada a aacutecido glucoacutenico por la
glucosa oxidasa la cual cataliza la siguiente reaccioacuten
-D-glucosa + H2O + O2 Aacutecido D-glucoacutenico + H2O2
El peroacutexido de hidroacutegeno generado reacciona con el sistema peroxidasa - orto-
dianisidina dando como resultado la oxidacioacuten de la orto-dianisidina y la produccioacuten de
agua de acuerdo con la siguiente reaccioacuten
H2O2 + orto-dianisidina (reducida) ortondashdianisidina (oxidada) + H2O
peroxidasa
La orto-dianisidina oxidada presenta un color pardo que en medio aacutecido vira a color
rosa la cual se lee a una longitud de onda de 540 nm (figura 3)
Figura 3 Orto-dianisidina (33rsquo ndash dimetoxidibencidina)
H2N NH2
OCH3
OCH3
43
353 Determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo hexavalente
La concentracioacuten de cromo hexavalente se determinoacute por la teacutecnica de la 15-
difenilcarbohidrazida siguiendo los procedimientos descritos en el meacutetodo 8023 del Hach
Water Analysis Handbook (2002) Este meacutetodo estaacute aprobado por la EPA (Environmental
Protection Agency) (Hach 2002) y por la Norma Oficial Mexicana NMX-AA-044-SCFI-
2001 (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NMX-AA-044-SCFI-
2001)
Principio Se utilizoacute un reactivo en polvo llamado ChromaVer3 el cual contiene una
solucioacuten buffer aacutecida combinada con la 15-difenilcarbohidrazida Este uacuteltimo compuesto
reacciona con el cromo hexavalente dando un compuesto de color puacuterpura (figura 4) El
meacutetodo es aplicable para el agua ya sea fresca o de muestras de agua residual La
intensidad del color es ldirectamente proporcional a la concentracioacuten de cromo
hexavalente presente
Figura 4 Reaccioacuten de la 15-difenilcarbohidrazida con el cromo hexavalente
+ Cr 6+
Compuesto colorido
puacuterpura
N N
Cr O
C R
O
N N
H H
C R
15-difenilcarbohidrazida
2 N N N
H H
N C
H O
H
44
354 Determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo total
La determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo total de los filtrados de las muestras
recolectadas (cromo total en solucioacuten) se realizoacute por espectroscopiacutea de absorcioacuten
atoacutemica con flama de acetileno-aire (SpectrAA220 FS Varian Inc)
Para determinar la cantidad de cromo retenido por la biomasa de Candida sp las ceacutelulas
fueron lavadas con agua desionizada deshidratadas y posteriormente fueron digeridas
con aacutecido niacutetrico concentrado La solucioacuten obtenida se enfrioacute a temperatura ambiente y
se le adicionoacute agua desionizada hasta obtener un volumen final de 50 mL Este
procedimiento estaacute descrito en la Norma Oficial Mexicana NMX-AA-051-SCFI-2001
(Secretariacutea de Economiacutea 2001) La concentracioacuten de cromo total de la solucioacuten
resultante se determinoacute en un espectrofotoacutemetro de absorcioacuten atoacutemica con un horno de
grafito (SpectrAA220 FS Varian Inc)
355 Determinacioacuten del pH
Se realizoacute con un potencioacutemetro marca Oakton
45
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Meta No 1 Determinar el efecto del ioacuten sulfato sobre la reduccioacuten
de Cr(VI)
41 Efecto del sulfato sobre el crecimiento celular consumo de glucosa
remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp
411 Evaluacioacuten de la influencia del sulfato sobre el crecimiento celular de
Candida sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
Se determinoacute el efecto de ocho concentraciones diferentes de sulfato (00 1217 25
50 100 150 200 y 2392 mM) sobre el crecimiento celular de Candida sp cuando
eacutesta se cultivoacute por lote a nivel matraz en medios de cultivo sin Cr(VI) y con
concentraciones iniciales del metal de 17 y 33 mM Para visualizar mejor el efecto las
curvas de crecimiento celular se construyeron utilizando la relacioacuten xxo (x =
concentracioacuten celular a un determinado tiempo de incubacioacuten xo = concentracioacuten inicial
de biomasa) como variable dependiente y el tiempo de incubacioacuten (t) como variable
independiente (graacuteficas de xxo vs t) En cada una de las curvas de crecimiento se trazoacute
una liacutenea horizontal a una relacioacuten xxo de 10 para observar si ocurriacutea crecimiento o
lisis celular
En la figura 5 se muestran las curvas de crecimiento celular de Candida sp cuando eacutesta
se cultivoacute en medios de cultivo con diferentes concentraciones de sulfato y sin Cr(VI) Se
observa que el crecimiento de Candida sp fue muy semejante a las diferentes
concentraciones de sulfato ensayadas La levadura fue capaz de crecer en el medio de
cultivo al que no se le adicionoacute sulfato de amonio y sulfato de magnesio (0 mM de
46
SO42-) lo cual sugiere que la cantidad de sulfato proporcionado por otros componentes
del medio de cultivo ndash por ejemplo provenientes del extracto de levadura yo de
impurezas contenidas en las sales inorgaacutenicas adicionadas al medio de cultivo (002
mM) mdash fue suficiente para permitir un adecuado crecimiento de la levadura Los
resultados tambieacuten mostraron que la adicioacuten de sulfato en forma de sales inorgaacutenicas
[(NH4)2SO4 o Mg(SO4)7H20] no tuvo alguacuten efecto inhibidor o estimulador del crecimiento
celular
Figura 5 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo sin Cr(VI)
En la figura 6 se presentan las curvas de crecimiento de Candida sp que se obtuvieron
cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo con una concentracioacuten inicial de
Cr(VI) de 17 mM a las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas En la figura se
aprecia lo siguiente 1) A una concentracioacuten de sulfato de 0 mM ocurrioacute lisis celular 2)
el crecimiento neto de la levadura fue praacutecticamente nulo a una concentracioacuten de sulfato
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
47
de 1217 mM 3) el crecimiento de la levadura fue evidente a partir de una
concentracioacuten de sulfato de 25 mM y 4) en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de
10 a 2392 mM el crecimiento de la levadura fue muy semejante y superior al alcanzado
a una concentracioacuten de sulfato de 5 mM Asimismo cuando se utilizaron concentraciones
de sulfato de 10 a 2392 mM se alcanzaron niveles de concentracioacuten de biomasa
similares a los obtenidos en ausencia del metal (cultivos control) (figuras 5 y 6) De
estos resultados es evidente que a medida que se incrementoacute la concentracioacuten de
sulfato los efectos toacutexicos del Cr(VI) sobre el crecimiento de la levadura disminuyeron
hasta que eacutestos fueron praacutecticamente nulos es decir la tolerancia de la levadura al
Cr(VI) aumentoacute conforme se incrementoacute la concentracioacuten de sulfato en el medio de
crecimiento de Candida sp
Figura 6 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo con 17 mM de Cr(VI)
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
48
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM ocurrioacute lisis celular
cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo con concentraciones de sulfato en el
intervalo de 0 a 5 mM (figura 7) en contraste el crecimiento celular de la levadura se
incrementoacute a medida que la concentracioacuten de sulfato aumentoacute de 10 a 2392 mM En
este uacuteltimo intervalo de concentracioacuten de sulfato se observoacute que a tiempos de
incubacioacuten superiores a las 150 h se presentoacute lisis celular A ninguna de las
concentraciones de sulfato ensayadas se alcanzaron densidades celulares semejantes a
las obtenidas en los cultivos sin Cr(VI) o con 17 mM de Cr(VI) lo cual podriacutea deberse a
la mayor toxicidad de los medios de cultivo
Figura 7 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo con 33 mM de Cr(VI)
En la figura 8 se muestra la variacioacuten de la velocidad especiacutefica de crecimiento ( ) y de
lisis celular (kd) de Candida sp en funcioacuten de la concentracioacuten de SO42- a las diferentes
concentraciones de Cr(VI) ensayadas [0 17 y 33 mM]
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
49
Figura 8 Variacioacuten de la velocidad especiacutefica de crecimiento o de lisis celular en funcioacuten
de la concentracioacuten de SO42- a las diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI)
ensayadas
-0002
0
0002
0004
0006
0008
001
0012
0014
0016
0018
0 5 10 15 20 25 30
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Ve
loc
ida
d e
sp
ec
iacutefic
a [
h-1
]
0 mM
17 mM
33 mM
Promedio
Sin Cr(VI)
50
Cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo sin Cr(VI) su velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento se mantuvo praacutecticamente constante en todo el intervalo de
concentracioacuten de sulfato ensayado con un valor promedio de 00144 h-1
A la concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la velocidad especiacutefica de crecimiento de
Candida sp aumentoacute casi linealmente con respecto a la concentracioacuten de sulfato en el
intervalo de concentracioacuten de 0 a 10 mM (r2 = 096) alcanzando un valor maacuteximo de
00142 h-1 a la uacuteltima concentracioacuten de sulfato Esta velocidad especiacutefica de crecimiento
es muy similar a las obtenidas en los cultivos sin Cr(VI) A concentraciones de sulfato
superiores a 5 mM la velocidad especiacutefica de crecimiento se mantuvo praacutecticamente
constante Estos resultados concuerdan con los perfiles de crecimiento celular mostrados
anteriormente
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM se obtuvieron
velocidades especiacuteficas de lisis celular (kd) de 00013 a 00003 h-1 ( = -00013 - 00003
h-1) en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de 0 a 5 mM (figura 8) A
concentraciones de sulfato superiores a 5 mM la velocidad neta de crecimiento fue
positiva La velocidad especiacutefica aumentoacute linealmente en todo el intervalo de
concentracioacuten de sulfato ensayado (r2 = 099) aunque las velocidades alcanzadas fueron
notoriamente inferiores a las obtenidas en los medios de cultivo sin Cr(VI) y con una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM
De los resultados anteriores se deduce que el sulfato desempentildea un papel importante en
la tolerancia (resistencia) de Candida sp a los efectos toacutexicos del Cr(VI) A medida que
se incrementoacute la concentracioacuten de sulfato la levadura fue maacutes tolerante (resistente) a
51
los efectos dantildeinos del Cr(VI) y por consiguiente su crecimiento celular fue menos
afectado Asimismo los resultados muestran que el ―efecto protector del sulfato sobre el
crecimiento de Candida sp dependioacute de la concentracioacuten inicial de Cr(VI)
Pepi y Baldi (1992) investigaron el efecto de diferentes aminoaacutecidos azufrados y del
sulfato sobre la tolerancia de algunas levaduras al Cr(VI) Estos investigadores
encontraron que en presencia de 02 mM de Cr(VI) se requirieron pequentildeas cantidades
de cisteiacutena [001ndash01 mM] para estimular significativamente [10-100] el crecimiento
de Rhodosporidium sp y que para incrementar el crecimiento de Candida sp en hasta
80 fue necesaria una concentracioacuten de cisteiacutena de 01 mM Un comportamiento similar
se observoacute en estas dos cepas cuando se adicionoacute metionina En contraste el
crecimiento celular de Candida famata fue inhibido cuando la levadura se cultivoacute en
medios con concentraciones de cisteiacutena superiores a 005 mM y con 02 mM de Cr(VI)
Por otra parte cuando Candida sp se cultivoacute en medios con diferentes concentraciones
de sulfato (4ndash160 mM) y de Cr(VI) (004ndash02 mM) se encontroacute que el ioacuten sulfato
incrementoacute la tolerancia de la levadura al Cr(VI) El mecanismo general de resistencia al
cromato en Candida sp se atribuyoacute a una reducida captacioacuten (incorporacioacuten) de cromo
(Pepi y Baldi 1992)
Ohtake y col (1987) encontraron que la adicioacuten de altas concentraciones de sulfato
incrementoacute el crecimiento celular de dos cepas de Pseudomonas fluorescens (LB300 y
LB303) en presencia de CrO42- Ademaacutes encontraron que el nivel de resistencia al CrO4
2-
en P fluorescens dependioacute de la fuente de azufre en el medio de cultivo ya que las
ceacutelulas bacterianas que crecieron con cisteiacutena fueron mucho maacutes resistentes al CrO42-
que las ceacutelulas que crecieron sobre sulfato Como el cromato es transportado al interior
52
de las ceacutelulas de Pseudomonas a traveacutes del sistema de transporte del sulfato la habilidad
del sulfato para proteger a las ceacutelulas de P fluorescens LB300 de los efectos inhibitorios
del Cr(VI) se atribuyoacute a que el sulfato inhibioacute competitivamente la captacioacuten del cromato
por las ceacutelulas bacterianas (Ohtake y col 1987)
En contraste la resistencia de Ochrobactrum tritici cepa 5bvI1 al Cr(VI) fue
independiente de la concentracioacuten de sulfato (Branco y col 2004)
412 Evaluacioacuten del efecto del sulfato sobre el consumo de glucosa por Candida
sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
La glucosa fue completamente consumida (eficiencia global de consumo de glucosa =
100) en aproximadamente 83 h de incubacioacuten cuando la levadura se cultivoacute en medios
que no conteniacutean Cr(VI) y con diferentes concentraciones de sulfato No se observoacute
diferencia considerable en el consumo de glucosa a ninguna de las concentraciones de
sulfato utilizadas (figura 9)
53
Figura 9 Variacioacuten en el consumo de glucosa por Candida sp cuando se utilizaron
medios de cultivo con diferentes concentraciones de sulfato y sin Cr(VI)
En los experimentos realizados con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM
(figura 10) se observoacute que la levadura fue capaz de consumir aproximadamente 30-
35 de la glucosa inicialmente adicionada a los medios que conteniacutean sulfato a
concentraciones de 0 y 1217 mM a pesar de que a estas condiciones de cultivo ocurrioacute
lisis celular [0 mM de SO42-] o el crecimiento celular de la levadura fue despreciable
[1217 mM de SO42-] (figura 6) Candida sp consumioacute todo el monosacaacuterido presente
en los medios de cultivo con concentraciones de sulfato superiores a 1217 mM
(eficiencia global de consumo de glucosa del 100) sin embargo el tiempo que se
requirioacute para que eacutesto sucediera disminuyoacute a medida que se incrementoacute la concentracioacuten
de sulfato (figura 10) Los perfiles de consumo de glucosa en los cultivos de Candida
sp fueron semejantes cuando se utilizaron concentraciones de sulfato de 10 a 2392
mM y eacutestos a su vez fueron similares a los obtenidos en los medios de cultivo que no
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa
re
sid
ua
l [
]0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
54
conteniacutean Cr(VI) (figuras 9 y 10) Lo anterior podriacutea deberse a que el crecimiento
celular de estos cultivos fue semejante (figura 6)
Figura 10 Variacioacuten del porcentaje de glucosa residual en los cultivos de Candida sp a
las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas y con 17 mM de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
55
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM los niveles de glucosa
residual disminuyeron a medida que aumentoacute la concentracioacuten de sulfato (figura 11)
Sin embargo estos niveles fueron superiores a los alcanzados a 17 mM de Cr(VI) a
todas las concentraciones de sulfato ensayadas La mayor eficiencia de consumo de
glucosa fue de aproximadamente 80 y se obtuvo a una concentracioacuten de sulfato de
2392 mM
Figura 11 Variacioacuten del porcentaje de glucosa residual en los cultivos por lote de
Candida sp a las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas y con 33 mM de
Cr(VI)
A las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas [17 y 33 mM] se observoacute que
en las primeras horas de incubacioacuten los cultivos de levadura en los que ocurrioacute lisis
celular consumieron una determinada cantidad de glucosa la cual probablemente se
utilizoacute para el mantenimiento de las ceacutelulas vivas
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa r
es
idu
al [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
56
Tanto en los experimentos realizados a 17 como a 33 mM de Cr(VI) se encontroacute que
los cultivos que alcanzaron mayores densidades celulares fueron los que consumieron
mayor cantidad de glucosa y esto ocurrioacute cuando se utilizaron concentraciones altas de
sulfato
413 Evaluacioacuten del efecto del sulfato sobre la variacioacuten del pH de los cultivos
de Candida sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
Los perfiles de variacioacuten del pH de los medios de cultivo fueron muy semejantes a las
diferentes concentraciones de sulfato ensayadas cuando la levadura se cultivoacute en los
medios de cultivo sin Cr(VI) (figura 12) A todas las concentraciones de sulfato
utilizadas el pH disminuyoacute desde aproximadamente 6 hasta 28 en las primeras once
horas de incubacioacuten En el periodo comprendido entre las 11 y las 60 h de incubacioacuten el
pH de los medios de cultivo disminuyoacute ligeramente hasta alcanzar valores cercanos a
25 A tiempos posteriores a 60 h el pH de los medios de cultivo se mantuvo
praacutecticamente constante
Figura 12 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo de Candida sp en ausencia de
Cr(VI) y a las diferentes concentraciones de SO42- ensayadas
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
57
En la figura 13 se muestran los perfiles de variacioacuten del pH de los medios de cultivo
cuando la levadura se cultivoacute a las diferentes concentraciones de sulfato y a una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM El pH de los cultivos disminuyoacute raacutepidamente
en las primeras 15 h de incubacioacuten a todas las concentraciones de sulfato ensayadas La
disminucioacuten del pH fue mayor en los cultivos con las concentraciones maacutes altas de
sulfato lo cual podriacutea deberse a que a estas condiciones la levadura consumioacute mayor
cantidad de glucosa y las densidades celulares alcanzadas fueron maacutes altas A tiempos
de incubacioacuten superiores a 15 h el pH continuoacute disminuyendo pero a menor velocidad
Los niveles de pH maacutes bajos se obtuvieron cuando se utilizaron concentraciones de
sulfato de 5 a 2392 mM alcanzaacutendose valores semejantes a los obtenidos en los medios
sin Cr(VI) (de aproximadamente 25)
Figura 13 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
58
Un comportamiento cualitativo similar se obtuvo cuando Candida sp se cultivoacute en medios
con diferentes concentraciones de sulfato y con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33
mM (figura 14) El pH maacutes bajo se alcanzoacute a concentraciones altas de sulfato [20 y
2392 mM] y fue de aproximadamente 36 el cual es superior a los valores maacutes bajos
que se obtuvieron en los cultivos sin Cr(VI) y con 17 mM de Cr(VI) Esto uacuteltimo podriacutea
deberse a que el incremento de la concentracioacuten celular y el consumo de glucosa fueron
inferiores a los alcanzados con las otras concentraciones de Cr(VI) [0 y 17 mM]
Figura 14 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
414 Efecto del sulfato sobre la remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp
En la figura 15 se muestran las variaciones del porcentaje de Cr(VI) residual de los
cultivos de Candida sp cuando se emplearon diferentes concentraciones de sulfato y
una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM A una concentracioacuten de sulfato de 0 mM
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
59
la remocioacuten de Cr(VI) fue muy baja (de aproximadamente 83) es conveniente
mencionar que a esta concentracioacuten de sulfato (0 mM) y de Cr(VI) (17 mM) ocurrioacute lisis
celular y la levadura consumioacute una pequentildea cantidad de glucosa en las primeras horas
de incubacioacuten La remocioacuten de Cr(VI) se incrementoacute a medida que aumentoacute la
concentracioacuten de sulfato de 0 a 10 mM A partir de esta uacuteltima concentracioacuten de sulfato
los perfiles de remocioacuten de Cr(VI) fueron muy similares y esto podriacutea deberse a que la
densidad celular de los cultivos fueron praacutecticamente iguales Todo o casi todo el Cr(VI)
inicialmente adicionado a los medios de cultivo fue removido cuando se empleoacute una
concentracioacuten de sulfato igual o superior a 25 mM (figura 15)
Figura 15 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
En contraste cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM la levadura
no fue capaz de remover todo el Cr(VI) inicialmente presente en los medios de cultivo a
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
60
ninguna de las concentraciones de sulfato ensayadas (figura 16) Sin embargo los
niveles de Cr(VI) residual disminuyeron a medida que se incrementoacute la concentracioacuten de
sulfato
Figura 16 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
A las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas los cultivos de levadura en los
que ocurrioacute lisis celular en las primeras horas de incubacioacuten [0 mm de SO42- 17 mM de
Cr(VI) y 0-5 mM de SO42- 33 mM de Cr(VI)] fueron capaces de remover una pequentildea
cantidad de Cr(VI) Estos resultados concuerdan con lo reportado por Wang y Shen
(1997) quienes encontraron que la densidad celular de los cultivos de Escherichia coli y
Bacillus sp disminuyoacute continuamente durante el curso de la remocioacuten de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
61
A las diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI) y de sulfato ensayadas se observoacute
que aunque los niveles de Cr(VI) residual disminuyeron a medida que la incubacioacuten
progresoacute las concentraciones de cromo total en solucioacuten permanecieron casi constantes
a lo largo de todo el periodo de incubacioacuten (aproximadamente el 97 del cromo
inicialmente adicionado a los medios de cultivo estuvo siempre presente en solucioacuten)
Maacutes auacuten el anaacutelisis del contenido de cromo en la biomasa de Candida sp (de muestras
recolectadas al final de los experimentos) reveloacute que uacutenicamente el 29 009 del
cromo total removido por los cultivos fue incorporado en la biomasa
Como se mostroacute anteriormente los cultivos con ceacutelulas viables se iniciaron con un pH de
aproximadamente 60 y eacuteste disminuyoacute durante el tiempo de incubacioacuten hasta valores de
25 ndash 36 dependiendo de la concentracioacuten de sulfato y de Cr(VI) utilizada Como se
sabe que los pHacutes bajos favorecen la reduccioacuten del Cr(VI) por la materia orgaacutenica
(donadores de electrones) en el presente trabajo se llevaron a cabo experimentos sin
biomasa de Candida sp (controles libres de ceacutelulas) a diferentes valores de pH (25 3
4 5 y 6) y a las dos diferentes concentraciones de Cr(VI) ensayadas (17 y 33 mM)
para determinar si los componentes presentes en los medios de cultivo pueden reducir el
Cr(VI) En las figuras 17 y 18 se muestran los perfiles de Cr(VI) residual que se
obtuvieron con los controles abioacuteticos ensayados
62
Figura 17 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los controles libres de
ceacutelulas llevados a cabo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y a diferentes
valores de pH
Figura 18 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los controles libres de
ceacutelulas realizados con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y a diferentes
valores de pH
00
200
400
600
800
1000
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
pH = 25
pH = 3
pH = 4
pH = 5
pH = 6
00
200
400
600
800
1000
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
pH = 25
pH = 3
pH = 4
pH = 5
pH = 6
63
A las dos concentraciones de Cr(VI) ensayadas se observoacute una reduccioacuten despreciable
del metal (inferior a 05) en el intervalo de valores de pH de 4 a 6 a un pH de 3 el
porcentaje de reduccioacuten fue de aproximadamente 12 y de 3 cuando el pH fue de
25 Estos resultados sugieren que los componentes de los medios de cultivo
praacutecticamente no redujeron el Cr(VI) a ninguno de los pHrsquos ensayados
En conjunto los resultados antes mostrados indican que el principal mecanismo de
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp fue la biotransformacioacuten (reduccioacuten) del Cr(VI) a
Cr(III) y que la reduccioacuten abioacutetica del Cr(VI) y la captacioacuten de cromo por la biomasa de
la levadura fueron despreciables Asimismo los resultados tambieacuten muestran que la
reduccioacuten del Cr(VI) por los cultivos se debioacute a la actividad metaboacutelica de las ceacutelulas de
Candida sp
En la figura 19 se presentan las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) que se
obtuvieron a las diferentes concentraciones iniciales de sulfato y de Cr(VI) ensayadas Se
aprecia que cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la eficiencia
de reduccioacuten se incrementoacute desde 179 hasta 986 a medida que la concentracioacuten
de sulfato aumentoacute de 0 a 25 mM a concentraciones de sulfato superiores la eficiencia
de reduccioacuten fue del 100 Asimismo en los experimentos realizados a 33 mM de
Cr(VI) la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) aumentoacute desde 83 hasta 84 conforme la
concentracioacuten de sulfato aumentoacute de 0 a 2392 mM
64
Figura 19 Eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por los cultivos de
Candida sp a las diferentes concentraciones de sulfato y de Cr(VI) ensayadas
La velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) tambieacuten fue afectada por la
concentracioacuten de sulfato y de Cr(VI) utilizada (figura 20) Cuando se empleoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten maacutes alta
fue de 098 mg de Cr(VI)Lh y se obtuvo en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de
10 a 2392 mM En cambio la velocidad maacutes alta que se alcanzoacute a 33 mM de Cr(VI) fue
de 044 mg de Cr(VI)Lh y se obtuvo a la maacutexima concentracioacuten de sulfato ensayada
(2392 mM)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 1217 25 5 10 15 20 2392
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Efi
cie
ncia
glo
bal d
e r
ed
uccioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
17 mM
33 mM
65
Figura 20 Velocidades volumeacutetricas globales de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas en los
cultivos de Candida sp a diferentes concentraciones de sulfato y de Cr(VI)
A todas las concentraciones de sulfato ensayadas la eficiencia y velocidad volumeacutetrica de
reduccioacuten de Cr(VI) alcanzadas a una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM fueron
superiores a las obtenidas a 33 mM de Cr(VI) y esto podriacutea deberse a que los efectos
toacutexicos del Cr(VI) sobre la levadura se incrementan a medida que aumenta la
concentracioacuten del metal
De los resultados anteriores es evidente que el sulfato afectoacute la reduccioacuten aeroacutebica de
Cr(VI) por Candida sp Estos resultados difieren con lo reportado por otros
investigadores quienes no han encontrado un efecto inhibidor ni estimulador del sulfato
sobre la reduccioacuten de Cr(VI) en cultivos aeroacutebicos
000
010
020
030
040
050
060
070
080
090
100
0 1217 25 5 10 15 20 2392
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica d
e r
ed
uccioacute
n d
e C
r(V
I)
[mg
de
Cr(
VI)
Lh
]
17 mM
33 mM
66
Ishibashi y col (1990) encontraron que concentraciones de sulfato de hasta 1 mM
incrementaron la resistencia de Pseudomonas putida al cromato pero no tuvieron efecto
sobre la reduccioacuten de eacuteste En cultivos de Bacillus sp (Wang y Xiao 1995) y de
Acinetobacter haemolyticus (Zakaria y col 2006) se observoacute que una concentracioacuten de
sulfato de 10 mM no afectoacute la reduccioacuten de Cr(VI) Liu y col (2006) reportaron que
concentraciones de sulfato de 40 y 80 mgL (0416 y 083 mM) no tuvieron efecto sobre
la reduccioacuten aeroacutebica de Cr(VI) por Bacillus sp XW-4
En contraste el sulfato generalmente tiene efecto sobre la reduccioacuten bacteriana del
cromato bajo condiciones de anaerobiosis lo cual podriacutea deberse a que el sulfato compite
con el cromato como aceptor final de electrones (Garbisu y col 1998 Liu y col 2006)
En cultivos anaeroacutebicos de Escherichia coli ATCC 33456 la velocidad de reduccioacuten de
Cr(VI) no fue afectada por hasta 416 mM de sulfato sin embargo la velocidad
disminuyoacute a 83 mM de sulfato (Shen y Wang 1994) La actividad de reduccioacuten de Cr(VI)
de Enterobacter cloacae HO1 bajo condiciones anaeroacutebicas fue inhibida en 32 en
presencia de tan soacutelo 25 M de sulfato (Komori y col 1989)
Como se mencionoacute anteriormente el sulfato incrementoacute la tolerancia al Cr(VI) de la cepa
de Candida sp aislada por Pepi y Baldi (1992) sin embargo esta cepa de levadura fue
incapaz de reducir el Cr(VI) Asimismo auacuten cuando se ha reportado que Pseudomonas
fluorescens LB300 es capaz de reducir el Cr(VI) a Cr(III) (Bopp y Ehrlich 1988) y que el
sulfato incrementa el crecimiento celular de esta bacteria en presencia de cromato
(Ohtake y col 1987) hasta donde sabemos no se ha reportado el efecto del sulfato
sobre la reduccioacuten de Cr(VI) por este microorganismo
67
Los resultados anteriores muestran claramente que el sulfato afectoacute la tolerancia de
Candida sp al Cr(VI) y a su capacidad para reducirlo Es evidente que a medida que se
incrementoacute la concentracioacuten de sulfato el crecimiento de la levadura fue mayor y su
eficiencia y velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) aumentaron Los resultados tambieacuten
muestran que la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp depende de la densidad celular de
los cultivos de manera tal que a mayor cantidad de biomasa generada mayor es la
reduccioacuten de Cr(VI) Aun cuando la cepa de Candida sp es muy sensible a los efectos
toacutexicos del Cr(VI) en ausencia de sulfato esta levadura posee una capacidad notable
para reducir muy altas concentraciones del metal en presencia de sulfato
Meta No 2 Determinar la capacidad de reduccioacuten de Cr(VI) en
diferentes sistemas de reaccioacuten
42 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso
Se utilizoacute un reactor airlift con tubo conceacutentrico liso (sin perforaciones) para el cultivo por
lote de Candida sp Para este sistema de reaccioacuten se utilizoacute un volumen de operacioacuten de
4 litros de medio basal con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM El biorreactor
se inoculoacute con un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada de tal
forma que la concentracioacuten inicial de biomasa fue de 12 mgmL El pH inicial fue de
aproximadamente 60 El reactor se operoacute por lote hasta que la concentracioacuten de Cr(VI)
residual fue despreciable
68
La concentracioacuten celular se incrementoacute gradualmente a medida que la incubacioacuten
progresoacute hasta que alcanzoacute un valor maacuteximo de aproximadamente 39 gL lo cual
ocurrioacute a las 42 h de incubacioacuten A tiempos posteriores la concentracioacuten de biomasa
disminuyoacute debido a que ocurrioacute lisis celular (figura 21) La velocidad especiacutefica maacutexima
de crecimiento de la levadura fue de 00244 h-1 la cual fue superior a la obtenida en
matraz cuando crecioacute con 17 mM de Cr(VI) (00142 h-1) esta diferencia podriacutea deberse
a que en el reactor airlift las ceacutelulas de Candida sp tuvieron una mayor cantidad de
oxiacutegeno disponible para su crecimiento
Figura 21 Variacioacuten de la concentracioacuten de biomasa y de glucosa en el cultivo por lote
de Candida sp en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM
La levadura consumioacute la principal fuente de carbono y energiacutea (glucosa) presente en el
medio de cultivo a lo largo de todo el tiempo de incubacioacuten incluso durante el periodo en
el que ocurrioacute lisis celular La glucosa no fue completamente consumida por la levadura
00
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo [h]
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e g
luc
os
a
res
idu
al [g
L]
00
05
10
15
20
25
30
35
40
45
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e b
iom
as
a [
gL
]Glucosa Biomasa
69
al final del experimento la concentracioacuten de glucosa residual fue de 17 gL (figura 21)
por lo que la eficiencia global de consumo del monosacaacuterido fue del 835
El pH del medio de cultivo disminuyoacute desde 60 hasta aproximadamente 25 Este uacuteltimo
valor se alcanzoacute a las 292 h de incubacioacuten y se mantuvo praacutecticamente constante a
tiempos posteriores (figura 22)
Figura 22 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) y del pH en el cultivo por lote de
Candida sp en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM
La concentracioacuten de Cr(VI) residual disminuyoacute progresivamente a medida que se
incrementoacute el tiempo de incubacioacuten hasta que a las 468 h ya no se detectoacute Cr(VI) en el
medio de cultivo por lo que la eficiencia global de remocioacuten de Cr(VI) fue del 100 Se
observoacute una ligera remocioacuten de Cr(VI) durante el periodo en el que ocurrioacute lisis celular
(figuras 21 y 22) En contraste la concentracioacuten de cromo total en solucioacuten se
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo [h]
Cr(
VI)
y C
rom
o t
ota
l re
sid
ua
l [m
gL
]
00
10
20
30
40
50
60
70
pH
[Cr(VI)] [Cromo total] pH
70
mantuvo casi constante a lo largo del tiempo de cultivo Lo anterior indica que la
levadura fue capaz de transformar el Cr(VI) a la forma trivalente menos toacutexica
En la tabla 6 se comparan los valores de algunas variables cineacuteticas obtenidas en
matraz (cuando se hizo crecer la levadura a una concentracioacuten de Cr(VI) inicial de 17
mM) y en el biorreactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando la levadura se cultivoacute en
medio de cultivo con concentraciones iniciales semejantes de Cr(VI) y de sulfato
Tabla 6 Variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote de Candida sp realizados
en matraz y en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Variable cineacutetica Matraz Reactor
Incremento celular maacuteximo [gL] 22 263
Velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento [h-1] 00142 00244
Eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) [] 100 100
Velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI)L h] 098 164
Velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI) g biomasa h] 045 095
Capacidad de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI) g biomasa] 400 443
El incremento celular maacuteximo y la velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento de
Candida sp obtenidos en el reactor airlift fueron 1955 y 718 superiores a los
alcanzados en matraz respectivamente Como se mencionoacute previamente eacutesto podriacutea
deberse a que en el reactor airlift la levadura tuvo una mayor cantidad de oxiacutegeno
disponible para su crecimiento
71
La levadura redujo todo el Cr(VI) inicialmente presente en el medio de cultivo [eficiencia
global de reduccioacuten de Cr(VI) del 100] tanto cuando se cultivoacute en matraz como en el
reactor airlift El hecho de que Candida sp sea capaz de reducir concentraciones de
Cr(VI) tan altas como 15 mM (e incluso superiores como se mostroacute en la seccioacuten
anterior) podriacutea ser de importancia praacutectica porque la mayoriacutea de los microorganismos
ensayados son capaces de reducir parcial o totalmente concentraciones maacutes bajas de
Cr(VI) (tabla 7)
Tabla 7 Datos sobre reduccioacuten de Cr(VI) por microorganismos
Microorganismo Cultivo
Modo de
operacioacuten
Concentra-
cioacuten de
Cr(VI)
[mM]
Velocidad
volumeacutetrica
de reduccioacuten
[mg de
CrLh]
Eficiencia
de
reduccioacuten
[]
Referencia
Acinetobacter
haemolitycus
Aerobio
CPL
067 128 88 Zakaria y col
2006
Aislado de
Pseudomonas
(CRB5)
Aerobio
CPL
043 014 100 McLean y
Beveridge 2000
Arthrobacter
sp
Aerobio
CPL
017 016 65 Megharaj y col
2003
Aspergillus sp Aerobio
CPL
096 0694 100 Acevedo-Aguilar
y col 2006
Bacillus
megaterium
TKW3
Aerobio
CPL
048 009 735 Cheung y Gu
2005
Bacillus sp Aerobio
CPL
007 007 65 Megharaj y col
2003
Bacteria J3 Aerobio
CPL
01 00057 21 Badar y col
2000
Brevibacterium
CrT-13
Aerobio
CPL
288 255 68 Faisal y Hasnain
2004
E coli AC80 Aerobio
CPL
002
065
9375
Ishibashi y col
1990
Ochrabactrum
sp
Aerobio
CPL
017
034
033
038
100
88
Thacker y
Madamwar 2005
72
Ochrobactrum
intermedium Cr-
T1
Aerobio
CPL
288 326 87 Faisal y Hasnain
2004
Penicillium sp Aerobio
CPL
096 066 95 Acevedo-Aguilar y
col 2006
Phanerochaete
chrysosporium
Aerobio
CPL
058 011 100 Pal 1997
Providencia
sp
Aerobio
CPL
102 10 100 Thacker y col
2006
Pseudomonas
ambigua G-1
Aerobio
CPL
288 347 83 Horitsu y col
1987
Streptomyces
griseus
Aerobio
CPL
017 025 100 Laxman y More
2002
Trichoderma
inhamatum
Aerobio
CPL
13
075 100 Morales-Barrera y
Cristiani-Urbina
2008
Trichoderma
viride
Aerobio
CPL
16
104 100 Morales-Barrera y
Cristiani-Urbina
2006
CPL = Cultivo por lote
La velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) obtenida en el reactor neumaacutetico
con Candida sp fue de 164 mg de Cr(VI)Lh la cual fue 6735 superior a la alcanzada
en matraz [098 mg de Cr(VI)Lh] (tabla 6) Esto uacuteltimo podriacutea deberse a la mayor
cantidad de biomasa generada en el reactor la cual redujo maacutes raacutepidamente el Cr(VI)
Acinetobacter haemolitycus fue capaz de reducir completamente 096 mM de Cr(VI) en
36 h por lo que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal de este microorganismo
fue de 139 mg de Cr(VI)Lh sin embargo cuando la concentracioacuten inicial de Cr(VI) se
incrementoacute a 135 mM la eficiencia y velocidad de reduccioacuten disminuyeron (Zakaria y
col 2006)
A una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 017 mM la eficiencia y velocidad volumeacutetrica
global de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por Ochrabactrum sp fue del 100 y 033 mg
de Cr(VI)Lh respectivamente Aunque la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal
73
se incrementoacute a 038 mg de Cr(VI)Lh cuando la concentracioacuten inicial de Cr(VI) fue de
034 mM la eficiencia de reduccioacuten disminuyoacute a 88 (Thacker y Madamwar 2005)
La eficiencia y velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas con Arthrobacter
sp a las 70 h de incubacioacuten fue de aproximadamente 65 y 016 mg de Cr(VI)Lh
cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial del metal de 017 mM (Megharaj y col 2003)
Con Providencia sp se obtuvo una eficiencia de reduccioacuten del 100 al cabo de 108 h de
incubacioacuten en medios de cultivo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 102 mM
siendo su velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal de 10 mg de Cr(VI)Lh (Thacker
y col 2006) La velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Streptomyces griseus
fue de 025 mg de Cr(VI)Lh cuando se cultivoacute en presencia de 017 mM de Cr(VI)
(Laxman y More 2002)
En el caso de eucariotes Acevedo-Aguilar y col (2006) reportaron que Penicillium sp y
Aspergillus sp fueron capaces de reducir por completo 096 mM de Cr(VI) en 72 h
obtenieacutendose una velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de 0694 mg de Cr(VI)Lh
Asimismo Trichoderma viride exhibioacute una eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) del 100 y
una velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de 104 mg de Cr(VI)Lh cuando se cultivoacute en
un reactor airlift en medio de cultivo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 16 mM
(Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006) Trichoderma inhamatum fue capaz de reducir
por completo 13 mM de Cr(VI) con una velocidad volumeacutetrica de 075 mg de Cr(VI)Lh
(Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2008)
En la tabla 7 se muestran los valores de eficiencia y velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten
de Cr(VI) obtenidas con otros microorganismos
74
La velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) que se obtuvo en el reactor airlift con
Candida sp fue de 095 mg de Cr(VI)g de biomasah (tabla 6) la cual fue 211 veces
mayor que la alcanzada en matraz [045 mg de Cr(VI)g de biomasah] Bae y col
(2000) reportaron que la velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) de Escherichia coli
ATCC 33456 se encontroacute en el intervalo de 031 a 07 mg de Cr(VI)g de biomasah
cuando este microorganismo se cultivoacute por lote en diferentes medios de cultivo con una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 096 mM A una concentracioacuten de Cr(VI) de 0096 mM
los lodos activados exhibieron una velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) de
aproximadamente 008 mg de Cr(VI)g de biomasah (Stasinakis y col 2003) El cultivo
por lote de Trichoderma inhamatum exhibioacute una velocidad especiacutefica de
aproximadamente 0584 mg de Cr(VI)g de biomasah cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 13 mM (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2008)
Asimismo en cultivos por lote de Providencia sp realizados con una concentracioacuten inicial
de Cr(VI) de 034 mM se obtuvo una velocidad especiacutefica de reduccioacuten del metal de
1302 mgg de biomasah (Thacker y col 2006)
En el presente trabajo se encontroacute que en el reactor airlift cada gramo (peso seco) de
biomasa producida de Candida sp pudo reducir 4438 mg de Cr(VI) (tabla 6) valor
ligeramente superior al encontrado en matraz [40 mg de Cr(VI)g de biomasa] y
semejante al reportado para Trichoderma inhamatum (Morales-Barrera y Cristiani-
Urbina 2008) Asimismo a las 60 h de incubacioacuten la capacidad de reduccioacuten de
Penicillium sp y Aspergillus sp fue de aproximadamente 082 y 042 mg de Cr(VI)g de
biomasa (Acevedo-Aguilar y col 2006) Wang y Shen (1997) reportaron que la
capacidad maacutexima de reduccioacuten de Cr(VI) de los cultivos aeroacutebicos de Bacillus sp y
75
Pseudomonas fluorescens LB300 fue de 208 x 10-12 y 310 x 10-12 mg de Cr(VI)ceacutelula
respectivamente si se toma en cuenta que el peso seco promedio de una ceacutelula
bacteriana tiacutepica es de aproximadamente 3 x 10-13 g (Atkinson y Mavituna 1983)
entonces la capacidad de reduccioacuten de Bacillus sp y P fluorescens LB300 seriacutea de 693 y
1033 mg de Cr(VI)g de biomasa respectivamente
43 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote repetido en el reactor airlift con
tubo conceacutentrico liso
Se realizaron algunos cultivos por lote repetido en el reactor airlift con tubo conceacutentrico
liso (sin perforaciones) En cada uno de los cultivos ensayados el reactor se inoculoacute
inicialmente con un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada de la
levadura para obtener una concentracioacuten inicial de biomasa de aproximadamente 12
mgmL La concentracioacuten inicial de Cr(VI) del medio de cultivo fue de aproximadamente
15 mM y el flujo de aire fue de 1 vvm El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que la
concentracioacuten de Cr(VI) residual en el medio fue baja (primer cultivo por lote) a
continuacioacuten una parte del medio de cultivo contenido en el reactor se drenoacute y se
adicionoacute medio fresco con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM Posteriormente el
reactor se operoacute nuevamente por lote (segundo cultivo por lote o cultivo por lote
repetido) Se ensayaron tres relaciones de recambio de medio de cultivo (f = volumen de
medio cosechadovolumen inicial de medio de cultivo) de 08 06 y 04
Debido a la importancia que tiene el pH del medio de cultivo en los procesos
microbioloacutegicos de reduccioacuten de Cr(VI) en el presente trabajo se llevaron a cabo cultivos
por lote repetido con relaciones de recambio de 06 y 08 en los que el pH del medio de
76
cultivo se ajustoacute a 60 al inicio del segundo cultivo por lote (cultivo por lote repetido) asiacute
como experimentos en los que el pH no se ajustoacute a 60 por lo que el pH inicial del cultivo
por lote repetido fue el alcanzado al final del primer cultivo por lote (cercano a 30) Es
conveniente mencionar que los valores bajos de pH inhiben el crecimiento de los
microorganismos pero favorecen la reduccioacuten del Cr(VI) a Cr(III) al ocurrir esto uacuteltimo
disminuye el efecto toacutexico de la forma hexavalente del metal
En estos experimentos se observoacute que el crecimiento de la levadura y la reduccioacuten de
Cr(VI) fueron adversamente afectados cuando el pH del medio de cultivo se ajustoacute a 60
al inicio de los cultivos por lote repetido En la figura 23 se muestra la variacioacuten de la
concentracioacuten de Cr(VI) residual en los cultivos por lote y lote repetido realizados con y
sin ajuste del pH al inicio de los cultivos por lote repetido cuando se utilizaron relaciones
de recambio de 06 y 08
77
Figura 23 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los cultivos por lote y lote
repetido realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizaron
00
100
200
300
400
500
600
700
800
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [m
gL
]
f = 08 spH
f = 08 cpH
CPL CPLR
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [m
gL
] f = 06 spH
f = 06 cpH
CPL CPLR
78
relaciones de recambio de 06 y 08 (spH = sin ajuste de pH del medio de cultivo al
inicio del cultivo por lote repetido cpH = con ajuste de pH del medio de cultivo a 60 al
inicio del cultivo por lote repetido)
En la figura se aprecia que en los primeros cultivos por lote el Cr(VI) fue totalmente o
casi completamente reducido en aproximadamente 45-49 h Sin embargo en los cultivos
por lote repetido el tiempo que se requirioacute para reducir el Cr(VI) fue mayor Asimismo es
evidente que se alcanzaron concentraciones de Cr(VI) residual maacutes bajas en los sistemas
por lote repetido en los que no se ajustoacute el pH al inicio de los cultivos
Los resultados anteriores sugieren que la levadura pierde parte de su capacidad de
reduccioacuten de Cr(VI) cuando se cultiva repetidamente en medios que contienen Cr(VI)
Estos resultados concuerdan con lo reportado por Wang y Shen (1997) quienes
encontraron que Bacillus sp Pseudomonas fluorescens LB300 y Escherichia coli ATCC
33456 pierden su capacidad para reducir Cr(VI) despueacutes de que han reducido 046-052
058 y 125 mM de Cr(VI) respectivamente Un comportamiento similar tambieacuten fue
reportado por Middleton y col (2003) para Shewanella oneidensis
Como los niveles maacutes altos de reduccioacuten de Cr(VI) se obtuvieron cuando no se ajustoacute el
pH a 60 al inicio de los cultivos por lote repetido el experimento en el que se ensayoacute
una relacioacuten de recambio de 04 uacutenicamente se llevoacute a cabo sin ajustar el pH
En la figura 24 se muestra la variacioacuten de la concentracioacuten celular en los sistemas por
lote y lote repetido a las tres diferentes relaciones de recambio ensayadas (04 06 y
08) cuando no se ajustoacute el pH al inicio de los cultivos por lote repetido Se aprecia que
en ninguno de los cultivos por lote repetido se alcanzaron densidades celulares cercanas
79
a las de los cultivos por lote que los precedioacute En los cultivos por lote repetido el
incremento celular y la velocidad especiacutefica de crecimiento maacutes altos se obtuvieron
cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 06 (tabla 8) sin embargo los valores
alcanzados fueron inferiores a los obtenidos en el cultivo por lote que los antecedioacute
Figura 24 Variacioacuten de la concentracioacuten de biomasa con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo ensayadas
00
05
10
15
20
25
30
35
40
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Co
nce
ntr
acioacute
n d
e b
iom
asa
[g
L]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
80
Tabla 8 Variables cineacuteticas del crecimiento celular y de la reduccioacuten de Cr(VI)
obtenidas en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp llevados a cabo en el
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Variable Cultivo por lote Cultivo por lote repetido
Relacioacuten de recambio
04 06 08
Incremento celular
maacuteximo [gL]
224 230 235 017 038 009
Velocidad especiacutefica maacutexima de
crecimiento [h-1]
00244 00227 00220 00044 00109 00017
Eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) []
999 980 973 96 93 36
Velocidad
volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI)Lh]
160 178 151 035 046 045
En los cultivos por lote repetido se necesitoacute de una mayor cantidad de tiempo para
consumir la glucosa presente en los medios en comparacioacuten con los cultivos por lote del
cual derivaron (figura 25) Asimismo en ninguno de los cultivos se consumioacute
totalmente la glucosa la mayor eficiencia de consumo del monosacaacuterido de los cultivos
por lote repetido se obtuvo cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 06 con un
valor de 783 el cual es cercano al obtenido en los primeros cultivos por lote
(aproximadamente 835)
81
Figura 25 Variacioacuten de la concentracioacuten de glucosa con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo utilizadas
En la figura 26 se muestran los perfiles de variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI)
residual en funcioacuten del tiempo de incubacioacuten a las diferentes relaciones de recambio de
medio de cultivo utilizadas Se aprecia que en los primeros cultivos por lote se alcanzaron
niveles de Cr(VI) residual maacutes bajos y en menor tiempo que en los cultivos por lote
repetido
00
20
40
60
80
100
120
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e g
luc
os
a r
es
idu
al [g
L]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
82
Figura 26 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo ensayadas
En los primeros cultivos por lote se alcanzaron eficiencias y velocidades volumeacutetricas
globales de reduccioacuten de Cr(VI) de 973 - 999 y de 151 - 178 mgLh
respectivamente (tabla 8) Estas velocidades son superiores a la alcanzada en el cultivo
por lote realizado en matraz [098 mg de Cr(VI)Lh] y semejantes a la obtenida
previamente en el reactor airlift [164 mg de Cr(VI)Lh]
En los cultivos por lote repetido la eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) maacutes baja se
obtuvo cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 08 y esto podriacutea deberse a que el
tiempo de incubacioacuten que se utilizoacute para este cultivo fue menor que para los otros A las
relaciones de recambio de 04 y 06 las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
[Cr(
VI)
] [m
gL
]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
83
fueron semejantes con valores de 96 y 93 respectivamente Estas uacuteltimas eficiencias
fueron ligeramente inferiores a las obtenidas en los cultivos por lote que los precedioacute
(973-999) Las mayores velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) se
obtuvieron a relaciones de recambio de 06 y 08 [aproximadamente 045 mgLh] sin
embargo fueron considerablemente inferiores a la de los cultivos por lote que los
antecedioacute
44 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa en un reactor airlift
con tubo conceacutentrico liso
Para este sistema el reactor se inoculoacute con 50 mL de inoacuteculo y se dejoacute operar por lote
durante 48 horas con el propoacutesito de incrementar la densidad celular A continuacioacuten se
suministroacute continuamente medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de
15 mM [78 mgL] y con un flujo volumeacutetrico de 378 mLh por lo que la velocidad de
dilucioacuten ensayada fue de 00076 h-1 Se permitioacute que el reactor alcanzara el estado
estacionario lo cual se corroboroacute mediante la determinacioacuten de la concentracioacuten de
biomasa asiacute como de glucosa y de Cr(VI) residual de muestras colectadas a diferentes
tiempos
En el estado estacionario los valores promedio de concentracioacuten de biomasa glucosa
Cr(VI) residual y de pH fueron de 016 gL 62 gL 46 mgL y 345 respectivamente
De estos resultados es evidente que la concentracioacuten de biomasa en el reactor fue muy
baja lo que probablemente ocasionoacute que se alcanzaran valores bajos de eficiencia de
consumo de glucosa (38) y de reduccioacuten de Cr(VI) (41) asiacute como de velocidad
volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) (024 mgLh)
84
Posteriormente se ensayoacute un flujo de alimentacioacuten de 5 mLh para operar con una
velocidad de dilucioacuten de 001 h-1 Sin embargo bajo estas condiciones se presentoacute el
fenoacutemeno de lavado celular en el cual no se detecta biomasa en el reactor Este
experimento se realizoacute varias veces y en todos los casos se obtuvo el mismo resultado
El lavado celular que ocurrioacute en el cultivo continuo de Candida sp podriacutea deberse a que
la velocidad de dilucioacuten que se utilizoacute (001 h-1) es muy cercana a la velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento de la levadura [de aproximadamente 00146 h-1 determinada en
cultivo por lote en medio de cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM]
por lo que la levadura no tuvo tiempo suficiente para duplicarse y fue desplazada del
reactor Ademaacutes el suministro continuo de medio de alimentacioacuten con Cr(VI) ocasiona
que la levadura esteacute constantemente sujeta a los efectos toacutexicos del metal Es decir la
baja velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento de la levadura y los efectos toacutexicos
continuos del metal fueron probablemente los factores que limitaron la eficiencia y
velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) en cultivo continuo
Debido a que ocurrioacute lavado celular a una velocidad de dilucioacuten de 001 h-1 ya no fue
posible ensayar velocidades maacutes altas Los resultados obtenidos en cultivo continuo de
una etapa indican que este sistema de reaccioacuten no es adecuado para la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp
En la tabla 9 se presentan datos sobre la reduccioacuten de Cr(VI) por microorganismos en
cultivos continuos en suspensioacuten o inmovilizados Hasta donde es de nuestro
85
conocimiento no hay informacioacuten disponible acerca de la reduccioacuten de Cr(VI) por
levaduras y hongos filamentosos en cultivo continuo
Tabla 9 Resumen de datos sobre la reduccioacuten microbiana de Cr(VI) en cultivo continuo
Microorganismo Cultivo Concentra-
cioacuten de
Cr(VI) [mM]
Velocidad
de
dilucioacuten
[h-1]
Velocidad
volumeacutetrica
de reduccioacuten
[mg de
CrLh]
Eficiencia
de
reduccioacuten
[]
Referencia
Pseudomonas
sp C7
Aerobio 12
12
0014
0017
073
093
88
91
Gopalan y
Veeramani
1994
Pseudomonas
fluorescens
LB300
Aerobio 011
009
009
002
005
009
016
017
022
57
39
28
DeLeo y
Ehrlich
1994
Escherichia coli
ATCC 33456
Aerobio 08 005
169 843 Bae y col
2000
Pseudomonas
mendocina
MCM B-180
Aerobio
05
15
20
022
014
011
57
108
113
99
99
99
Bhide y
col 1996
Microbacterium
liquefaciens
MP30
Aerobio
(ceacutelulas
inmovilizadas
en perlas de
polivinil
alcohol-
alginato)
005
0038
009
90
Pattanapip
it-paisal y
col 2001
Bacillus sp Aerobio
(ceacutelulas
inmovilizadas
en perlas de
vidrio Pyrex)
192
192
004
008
397
797
998
998
Chirwa y
Wang
1997
86
En un estudio realizado en cultivo continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de Pseudomonas
fluorescens LB300 se encontroacute que la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute desde
57 hasta 28 y que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal se incrementoacute de
016 a 022 mg de Cr(VI)Lh a medida que la velocidad de dilucioacuten se incrementoacute de
002 a 009 h-1 cuando se utilizoacute medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI)
de 009 mM (DeLeo y Ehrlich 1994)
Los resultados obtenidos en cultivo continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de otros
microorganismos han sido alentadores Gopalan y Veeramani (1994) ensayaron tres
velocidades de dilucioacuten de 0014 0017 y 0028 h-1 y encontraron que la maacutexima
eficiencia (91) y velocidad volumeacutetrica [093 mg de Cr(VI)Lh] de reduccioacuten de Cr(VI)
de Pseudomonas sp C7 se obteniacutea a una velocidad de dilucioacuten de 0017 h-1 cuando se
utilizoacute medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de 12 mM En el estudio
realizado por Bae y col (2000) con Escherichia coli ATCC 33456 la velocidad de dilucioacuten
se mantuvo constante a 005 h-1 y se obtuvo una eficiencia y una velocidad volumeacutetrica
de reduccioacuten de Cr(VI) de 843 y de 169 mg de Cr(VI)Lh respectivamente cuando
se utilizoacute una concentracioacuten de Cr(VI) de 08 mM en el medio de alimentacioacuten En cultivo
continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de Pseudomonas mendocina MCM B-180 Bhide y col
(1996) ensayaron el efecto de diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI) [de 05 a
20 mM] y de velocidades de dilucioacuten (011 a 022 h-1) sobre la reduccioacuten de Cr(VI)
Estos investigadores encontraron altas eficiencias (99) y velocidades de reduccioacuten [57
ndash 113 mg de Cr(VI)Lh]
Asimismo con la finalidad de reducir los efectos toacutexicos del Cr(VI) sobre los
microorganismos se ha propuesto el uso de ceacutelulas inmovilizadas en reactores continuos
87
de lecho fijo Las ceacutelulas de Microbacterium liquefaciens MP30 inmovilizadas en perlas de
alginato de calcio - polivinil alcohol fueron capaces de reducir el Cr(VI) con una
eficiencia del 90 y con una velocidad de 009 mg de Cr(VI)Lh cuando se utilizoacute medio
de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de 005 mM y una velocidad de dilucioacuten
de 0038 h-1 (Pattanapipitpaisal y col 2001) En un reactor de lecho fijo con ceacutelulas de
Bacillus sp inmovilizadas en perlas de vidrio Pyrex con un diaacutemetro de 3 mm se observoacute
que al incrementar la velocidad de dilucioacuten de 004 a 008 h-1 la eficiencia de reduccioacuten
de Cr(VI) se mantuvo constante (998) y que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de
Cr(VI) se incrementoacute de 397 a 797 mgLh (Chirwa y Wang 1997)
45 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular y la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo conceacutentrico de
malla de acero inoxidable y de vidrio perforado
Los reactores airlift con tubo conceacutentrico liso (reactores convencionales) no son
adecuados para llevar a cabo cultivos por lote alimentado (procesos con volumen
variable) ya que no es posible lograr una adecuada circulacioacuten del liacutequido a cualquier
volumen de medio de cultivo En los reactores airlift convencionales uacutenicamente se logra
una adecuada circulacioacuten del fluido cuando la altura del liacutequido es mayor que la del tubo
conceacutentrico Por ello para realizar cultivos por lote alimentado en reactores airlift es
necesario que existan diversos puntos de comunicacioacuten entre las secciones de ascenso y
descenso del reactor a lo largo de toda la longitud del tubo conceacutentrico En la literatura
se han descrito algunos reactores airlift que en su interior contienen dispositivos que
permiten la comunicacioacuten entre ambas secciones del reactor Los dispositivos maacutes
comunes son tubos de mallas metaacutelicas (net draft tube) (Tung y col 1997 Wu y Wu
1990 1991 Wu y col 1992) tubos conceacutentricos de vidrio con perforaciones
88
rectangulares (Cristiani-Urbina y col 2000) placas curvas colocadas coaxialmente
(Hagino y col 1982) y bafles (placas) perforados (Galiacutendez-Mayer y col 2001) Estos
dispositivos afectan las caracteriacutesticas hidrodinaacutemicas y de transferencia de masa y calor
de los reactores por lo que es conveniente evaluar su desempentildeo
En este trabajo se evaluoacute la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivos por lote
utilizando reactores airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable asiacute como de
vidrio con perforaciones circulares Estos cultivos se realizaron con dos flujos de aire de
05 y 1 vvm Estos experimentos tuvieron como propoacutesito principal el seleccionar el tubo
conceacutentrico maacutes adecuado para llevar a cabo posteriormente los cultivos por lote
alimentado y lote alimentado repetido
En la figura 27 se muestran las curvas de crecimiento celular cuando se utilizoacute el reactor
airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos de aire
ensayados El crecimiento celular de la levadura fue mayor cuando se utilizoacute un flujo de
aire de 1 vvm lo cual podriacutea deberse a una mayor oxigenacioacuten del medio de cultivo Los
niveles de Cr(VI) residual maacutes bajos tambieacuten se obtuvieron con un flujo de aire de 1 vvm
(figura 28) y eacutesto podriacutea deberse a la mayor densidad celular alcanzada bajo estas
condiciones
89
Figura 27 Curvas de crecimiento celular de Candida sp en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos de aire ensayados
Figura 28 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual en los cultivos por lote realizados
en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos
de aire ensayados
000
050
100
150
200
250
00 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Tiempo [h]
XX
O
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
00 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Tiempo [h]
Cr(
VI)
Re
sid
ual [
]
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
90
En los experimentos realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado se
observoacute un comportamiento opuesto al obtenido previamente con el tubo conceacutentrico de
malla metaacutelica El crecimiento celular (figura 29) y la reduccioacuten de Cr(VI) (figura 30)
en el reactor con tubo conceacutentrico perforado fueron mayores a un flujo de aire de 05
vvm
Figura 29 Curvas de crecimiento celular de Candida sp en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico de vidrio perforado a los dos flujos de aire ensayados
000
050
100
150
200
00 500 1000 1500 2000 2500
Tiempo [h]
XX
O
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
91
Figura 30 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual en los cultivos por lote realizados
en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de vidrio perforado a los dos flujos de aire
ensayados
En la tabla 10 se muestran algunas variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote
realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable y con
tubo conceacutentrico perforado de vidrio a los dos flujos de aire ensayados Ademaacutes la tabla
incluye los resultados obtenidos en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
00 500 1000 1500 2000 2500
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ual [
] Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
92
Tabla 10 Variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote realizados en el reactor
airlift con las diferentes configuraciones de tubo conceacutentrico
Cultivo por lote
Variable cineacutetica Tubo conceacutentrico
liso
Malla metaacutelica Tubo conceacutentrico perforado
10 vvm 05 vvm 10 vvm 05 vvm 05 vvm 10 vvm
Incremento celular
maacuteximo [gL]
263 072 142 123 106 082
Velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento [h-1]
00244 00059 00120 00149 00178 00093
Eficiencia global de
reduccioacuten de Cr(VI) ()
100 67 95 97 95 89
Velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) [mg de Cr(VI)Lh]
164 031 056 082 084 035
Comparando los resultados obtenidos en el reactor con tubo de malla metaacutelica y con el
de vidrio perforado la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) fue mayor cuando se
utilizoacute el tubo conceacutentrico perforado de vidrio y un flujo de aire de 05 vvm con un valor
promedio de dos experimentos independientes de 083 mgLh Sin embargo esta
velocidad es aproximadamente 494 inferior a la alcanzada con el tubo conceacutentrico liso
Los resultados de crecimiento celular (incremento celular maacuteximo y velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento) y de reduccioacuten de Cr(VI) (eficiencia y velocidad volumeacutetrica)
obtenidos en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable y de
vidrio perforado a los flujos de aire ensayados podriacutean sugerir que el grado de
oxigenacioacuten del medio de cultivo y la magnitud de los esfuerzos de corte que se alcanzan
durante la agitacioacuten neumaacutetica desempentildean un papel importante en la generacioacuten de
biomasa de Candida sp en los estados fisioloacutegicos de eacutesta y por consiguiente en la
93
reduccioacuten de Cr(VI) Debido a lo anterior seriacutea conveniente investigar la influencia de la
velocidad de aireacioacuten la cual afecta los patrones de flujo del fluido la magnitud de las
fuerzas de corte y la concentracioacuten del nutriente gaseoso en la fase fluida
Como las mayores eficiencias y velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) se
obtuvieron cuando se utilizoacute el tubo conceacutentrico perforado de vidrio y un flujo de aire de
05 vvm eacutestos fueron utilizados en los cultivos por lote alimentados que se llevaron a
cabo posteriormente
46 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote alimentado
repetido en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado
En los cultivos por lote alimentado el volumen de medio liacutequido en el reactor se
incrementa gradualmente a medida que aumenta el tiempo de incubacioacuten Este cambio
de volumen provoca una dilucioacuten de los componentes presentes en el medio de cultivo lo
cual dificulta la interpretacioacuten de los resultados Debido a lo anterior en los cultivos por
lote alimentado es conveniente expresar el cambio de las variables (biomasa sustrato
etc) en teacuterminos de masa y no de concentracioacuten y para ello es necesario conocer el
volumen de medio a los diferentes tiempos de incubacioacuten Por consiguiente en el
presente trabajo se estimaron las cantidades de biomasa glucosa y de Cr(VI) y se
expresaron en teacuterminos de masa A continuacioacuten se presentan las ecuaciones para
calcular la masa de las variables de intereacutes para este trabajo
Masa celular [g] = (concentracioacuten celular gL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
94
Masa de glucosa [g] = (concentracioacuten de glucosa gL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
Masa de Cr(VI) [mg] = (concentracioacuten de Cr(VI) mgL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
En los cultivos por lote alimentado y lote alimentado repetido se ensayaron dos flujos
volumeacutetricos de medio de alimentacioacuten de 659 y 1343 mLh que corresponden a
cargas maacutesicas de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh respectivamente Los cultivos por lote
alimentado realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado se iniciaron con
cultivos por lote (los resultados obtenidos en estos uacuteltimos cultivos se mostraron en la
seccioacuten anterior)
Cuando se utilizoacute una carga maacutesica de Cr(VI) de 0514 mgh en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) se observoacute que la masa celular
de la levadura en el primer cultivo por lote alimentado fue mayor que en la del segundo
cultivo Sin embargo a pesar de que la levadura tuvo un suministro constante de fuente
de carbono y energiacutea eacutesta praacutecticamente no crecioacute
Cuando se utilizoacute una carga maacutesica de Cr(VI) de 0514 mgh fue evidente que en los
cultivos por lote alimentado se fue acumulando glucosa en el medio de cultivo lo que
indica que las ceacutelulas casi no consumieron el monosacaacuterido que teniacutean disponible para su
crecimiento La cantidad de glucosa consumida por la levadura en el cultivo por lote
alimentado repetido (segundo cultivo por lote alimentado) fue considerablemente menor
que la consumida en el primer cultivo lo cual podriacutea deberse a que habiacutea una menor
cantidad de biomasa en el reactor En el segundo cultivo por lote alimentado se alcanzoacute
95
una eficiencia de consumo de glucosa del 68 en cambio en el primer cultivo fue del
263
Se observoacute que la levadura fue capaz de reducir parcialmente el Cr(VI) adicionado al
reactor y que en el primer cultivo por lote alimentado se lograron mayores niveles de
reduccioacuten
En el primer cultivo por lote alimentado las eficiencias de reduccioacuten de Cr(VI) maacutes altas
se alcanzaron durante el periodo de incubacioacuten de las 468 a las 967 h (7188-7292)
y disminuyeron ligeramente hasta el final de este cultivo (673-6945) En el segundo
cultivo por lote alimentado (lote alimentado repetido) las eficiencias disminuyeron
gradualmente a medida que se incrementoacute el tiempo de incubacioacuten (figura 31) La
eficiencia promedio de reduccioacuten de Cr(VI) del primer cultivo por lote alimentado fue de
689 y la del segundo cultivo alimentado fue de 56
96
Figura 31 Variacioacuten de la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) de Candida sp cuando se
utilizoacute una carga maacutesica del metal de 0514 mgh
La velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute progresivamente a medida
que transcurrieron los cultivos por lote alimentado desde 0181 hasta 0063 mgLh
(figura 32) estos valores son inferiores a los alcanzados en los cultivos por lote
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Efi
cie
nc
ia d
e r
ed
uc
cioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
CPLA1 CPLA2
97
Figura 32 Variacioacuten de la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Candida sp
en el cultivo por lote alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) llevados a
cabo con una carga maacutesica del metal de 0514 mgh
Posteriormente se realizoacute el cultivo por lote alimentado y lote alimentado repetido
utilizando una carga maacutesica de Cr(VI) de 105 mgh Se observoacute que en ambos cultivos
la masa celular de Candida sp se incrementoacute gradualmente a medida que se incrementoacute
el tiempo de incubacioacuten aunque al final de cada cultivo hubo una ligera disminucioacuten en la
cantidad de biomasa en el reactor En el primer cultivo por lote alimentado se alcanzoacute un
valor maacuteximo de 523 g de biomasa (incremento celular de 053 g) a las 637 h
mientras que en el segundo cultivo se alcanzoacute una cantidad maacutexima de biomasa de 435
g (incremento celular de 13 g) a las 1822 h totales de cultivo que corresponden a 893
h del cultivo por lote alimentado repetido
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica g
lob
al d
e
re
du
ccioacute
n d
e C
r(V
I) [
mg
de
Cr(V
I)L
h]
CPLA1 CPLA2
98
Asimismo se encontroacute que la levadura fue capaz de consumir parcialmente la glucosa
suministrada En el primer cultivo por lote alimentado se obtuvo una eficiencia de
consumo de glucosa del 299 mientras que en el segundo cultivo la eficiencia fue del
388 Estos resultados probablemente se deban a que el crecimiento de la levadura fue
mayor en el cultivo por lote alimentado repetido (incremento celular = 13 g) que en el
cultivo por lote alimentado que lo precedioacute (incremento celular = 053 g)
En los cultivos por lote alimentados llevados a cabo con una carga maacutesica de 105 mg de
Cr(VI) la levadura fue capaz de reducir parcialmente el Cr(VI) adicionado al reactor sin
embargo al final del primer cultivo por lote alimentado se lograron los niveles de
reduccioacuten maacutes altos
En el primer cultivo por lote alimentado la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) se
incrementoacute a medida que aumentoacute el tiempo de incubacioacuten alcanzaacutendose el valor maacutes
alto de eficiencia (529) a las 879 h de incubacioacuten En contraste en el segundo cultivo
por lote alimentado (alimentado repetido) la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute
continuamente conforme transcurrioacute el tiempo de cultivo Al final del cultivo por lote
alimentado repetido la eficiencia de reduccioacuten del metal fue del 43 (figura 33)
99
Figura 33 Variacioacuten de la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) de Candida sp cuando se
utilizoacute una carga maacutesica del metal de 105 mgh
En estos experimentos tambieacuten se observoacute que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de
Cr(VI) disminuyoacute continuamente durante todo el periodo de incubacioacuten desde 0226
hasta 0099 mgLh (figura 34)
0
10
20
30
40
50
60
0 50 100 150 200 250
Tiempo [h]
Efi
cie
ncia
de
re
du
ccioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
CPLA1 CPLA2
100
Figura 34 Variacioacuten de la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Candida sp
en el cultivo por lote alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) llevados a
cabo con una carga maacutesica del metal de 105 mgh
Las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) que se obtuvieron con una carga maacutesica
del metal de 105 mgh fueron inferiores a las logradas con una carga de 0514 mgh y
esto podriacutea deberse a que el tiempo de contacto entre la levadura y el medio de cultivo
fue menor En contraste las velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) fueron
ligeramente superiores a una carga maacutesica de 105 mgh
Con las dos cargas maacutesicas de Cr(VI) que se ensayaron en este trabajo se observoacute una
variacioacuten semejante en el pH de los medios de cultivo Los cultivos por lote alimentado
se iniciaron con un pH de 302-306 (estos valores corresponden al pH que se obtuvo al
final de los cultivos por lote que precedioacute a los cultivos por lote alimentado) El pH se
000
004
008
012
016
020
024
0 50 100 150 200 250
Tiempo [h]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica g
lob
al d
e r
ed
uccioacute
n
de
Cr(V
I) [
mg
de
Cr(V
I)L
h]
CPLA1 CPLA2
101
incrementoacute ligeramente durante el curso de los primeros cultivos por lote alimentado y al
final de eacutestos se tuvieron valores de 355 y de 345 cuando se emplearon cargas maacutesicas
de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh respectivamente En los cultivos por lote alimentado
repetido el pH se mantuvo praacutecticamente constante durante todo el periodo de
incubacioacuten
A pesar de que el cultivo por lote alimentado es muy recomendable para trabajar con
compuestos toacutexicos ha sido poco explorado para el tratamiento de aguas contaminadas
con cromo hexavalente Fujii y col (1990) utilizaron el cultivo por lote alimentado para
investigar la reduccioacuten de Cr(VI) por la bacteria anaerobia Enterobacter cloacae cepa
HO1 En este estudio una solucioacuten de cromato se alimentoacute continuamente en pequentildeas
dosis para minimizar el efecto toacutexico del metal Los investigadores encontraron que la
reduccioacuten de Cr(VI) fue fuertemente afectada por la velocidad especiacutefica de alimentacioacuten
de cromato Cuando esta velocidad fue inferior a 25 mmol de CrO42-g de biomasah
todo el cromo adicionado fue reducido A velocidades de alimentacioacuten superiores se
observoacute que la concentracioacuten de Cr(VI) residual en el medio de cultivo se incrementaba a
medida que aumentaba la velocidad de alimentacioacuten Asimismo encontraron que la
actividad reductora de la bacteria era fuertemente inhibida cuando la concentracioacuten de
Cr(VI) del medio de cultivo era mayor a 07 mM (3639 mgL)
Posteriormente Fujie y col (1996) realizaron la simulacioacuten de un cultivo por lote
alimentado utilizando datos cineacuteticos obtenidos en cultivo por lote y un modelo
matemaacutetico que describe el comportamiento de la bacteria antes mencionada Los
resultados experimentales y los predichos por el simulador fueron semejantes
102
En la tabla 11 se presentan los valores de velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
obtenidos en el presente trabajo en los diferentes sistemas de reaccioacuten ensayados La
mayor velocidad se obtuvo en el cultivo por lote realizado en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso por lo que eacuteste seriacutea el sistema maacutes adecuado para la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp
103
Tabla 11 Velocidades volumeacutetricas globales de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas en diferentes sistemas de reaccioacuten
CPL
Matraz
CPL Reactor
airlift con
tubo liso
CPL Reactor
airlift con
malla metaacutelica
CC Reactor
airlift con
tubo liso
CPLR Reactor
airlift con
tubo liso
CPL Reactor
airlift con tubo
perforado
CPLA Reactor
airlift con
tubo perforado
CPLAR Reactor
airlift con
tubo perforado
10
Vvm
05
vvm
10
vvm
10
vvm
10
vvm
05
vvm
10
vvm
05
vvm
05
vvm
f=08 f=06 f=04
CM1 CM2 CM1 CM2
098 151 ndash178 031 056 024 045 046 035 084 035 0092-0181
0163-0195
0063-0083
0099-0145
CPL = Cultivo por lote CC = Cultivo continuo CPLR = Cultivo por lote repetido CPLA = Cultivo por lote alimentado CPLAR = Cultivo por lote alimentado repetido f = relacioacuten de recambio CM = Carga maacutesica de Cr(VI)
CM1 = 0514 mg Cr(VI)h CM2 = 105 mg Cr(VI)h
104
5 CONCLUSIONES
El sulfato desempentildea un papel importante en la tolerancia al Cr(VI) y en la reduccioacuten
del mismo en la cepa de Candida sp utilizada en este trabajo
El efecto modulador del sulfato sobre el crecimiento celular y la reduccioacuten del Cr(VI)
depende de las concentraciones de los oxianiones sulfato y cromato
El mecanismo principal de remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp es la biotransformacioacuten
del altamente toacutexico Cr(VI) al menos toacutexico Cr(III)
El cultivo por lote en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso es el sistema de
reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
La velocidad de aireacioacuten no tiene un efecto significativo sobre la reduccioacuten de Cr(VI)
por Candida sp
105
6 REFERENCIAS
1 Acevedo-Aguilar FJ Espino-Saldantildea AE Leoacuten-Rodriacuteguez IL Rivera-Cano ME Avila-Rodriguez M Wrobel K et al 2006 Hexavalent chromium removal in vitro and from industrial wastes using chromate-resistant strains of filamentous
fungi indigenous to contaminated wastes Can J Microbiol 52 809-815
2 Ali-Awan M Baig MA Iqbal J Aslam MR amp Ijaz N 2003 Recovery of chromium (III) from tannery wastewater J App Sci amp Environ Management 7 (2) 5-8
3 Aacutelvarez SG Maldonado M Gerth A amp Kuschk P 2004 Characterization of
tannery effluents and study of the water Hyacinth in chromium recovery Informacioacuten Tecnoloacutegica 15 (3) 75-80
4 Aravindhan BM Madani B Rao JR Nair BU amp Ramasami T 2004 Bioaccumulation of Chromium from Tannery Wastewater An Approach for chrome
recovery and reuse Environ Sci Technol 38 300-306
5 Atkinson B amp Mavituna F 1983 Biochemical engineering and biotechnology handbook United Kingom Nature Press
6 Badar U Ahmed N Beswick AJ Pattanapipitpaisal P amp Macaskie LE 2000 Reduction of chromate by microorganisms isolated from metal contaminated sites of
Karachi Pakistan Biotechnol Lett 22 829-836 7 Bae WC Kang TG Kang IK Won YJ amp Jeong BC 2000 Reduction of
hexavalent chromium by Escherichia coli ATCC 33456 in batch and continuous cultures J Microbiol 38(1) 36-39
8 Balasubramanian S amp Pugalenthi V 1999 Determination of total chromium in
tannery wastewater by inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry
flame atomic absorption spectrometry and uv-visible spectrophotometric methods Talanta 50 (3) 457-467
9 Baldi F Vaughan AM amp Olson GJ 1990 Chromium(VI)-resistant yeast
isolated from a sewage treatment plant receiving tannery wastes Appl Environ
Microbiol 56 (4) 913-918
10 Barnhart J 1997 Occurrences uses and properties of chromium Regulatory Toxicology and Pharmacology 26 S3-S7
11 Beleza VM Boaventura RA amp Almeida MF 2001 Kinetics of chromium removal from spent tanning liquors using acetylene production sludge Environ
Sci Technol 35 (21) 4379-4383 12 Bhide JV Dhakephalkar PK amp Paknikar KM 1996 Microbiological process for
the removal of Cr(VI) from chromate-bearing cooling tower effluent Biotechnol Lett 18 (6)667-672
106
13 Bopp LH amp Ehrlich HL 1988 Chromate resistance and reduction in
Pseudomonas fluorescens strain LB300 Archives of Microbiology 150 426-431
14 Branco R Alpoim MC amp Morais PV 2004 Ochrobactrum tritici strain 5bvI1 ndash characterization of a Cr(VI)-resistant and Cr(VI)-reducing strain Can J Microbiol
50 697-703 15 Camargo FAO Bento FM Okeke BC amp Frankenberger WT 2002 Chromate
reduction by chromium-resistant bacteria isolated from soils contaminated with dichromate Journal of Environmental Quality 32 1228-1233
16 Camargo FAO Okeke BC Bento FM amp Frankenberger WT 2003 In vitro
reduction of hexavalent chromium by a cell-free extract of Bacillus sp ES 29
stimulated by Cu2+ Appl Microbiol Biotechnol 62 569-573
17 Cantildeizares-Villanueva R 2000 Biosorcioacuten de metales pesados mediante el uso de biomasa microbiana Rev Latinoam Microbiol 42 131-143
18 Cervantes C Campos-Garciacutea J Devars S Gutieacuterrez-Corona F Loza-Tavera H Torres-Guzmaacuten JC amp Moreno-Saacutenchez R 2001 Interactions of chromium with
microorganisms and plants FEMS Microbio Rev 25 335-347 19 Chardin B Dolla A Chaspoul F Fardeau ML Gallice P amp Bruschi M 2002
Bioremediation of chromate thermodynamic analysis of the effects of Cr(VI) on sulfate-reducing bacteria Appl Microbiol Biotechnol 60 352-360
20 Chardin B Giudici-Orticoni MT De Luca G Guigliarelli B amp Bruschi M 2003
Hydrogenases in sulfate-reducing bacteria function as chromium reductase Appl
Microbiol Biotechnol 63 315-321
21 Cheung Y amp Gu G 2003 Reduction of chromate (CrO42-) by an enrichment
consortium and an isolate of marine sulfate-reducing bacteria Chemosphere 52 1523-1529
22 Cheung KH amp Gu JD 2005 Chromate reduction by Bacillus megaterium TKW3
isolated from marine sediments World Journal of Microbiology amp Biotechnology 21 213-219
23 Cheung KH amp Gu JD 2007 Mechanism of hexavalent chromium detoxification
by microorganisms and bioremediation application potential a review International
Biodeterioration amp Biodegradation 59 8-15
24 Chirwa EMN amp Wang YT 1997 Hexavalent chromium reduction by Bacillus sp in a packed-bed bioreactor Environ Sci Technol 31 1446-1451
25 Cristiani-Urbina E Netzahuatl-Muntildeoz AR Manriquez-Rojas FJ Juaacuterez-Ramiacuterez C Ruiz-Ordaz N amp Galiacutendez-Mayer J 2000 Batch and fed-batch
cultures for the treatment of whey with mixed yeast cultures Process Biochemistry 35 649-657
107
26 Czakoacute-Veacuter K Batiegrave M Raspor P Sipiczki M amp Pesti M 1999 Hexavalent
chromium uptake by sensitive and tolerant mutants of Schizosaccharomyces pombe FEMS Microbiology Letters 178 109-115
27 DeLeo PC amp Ehrlich HL 1994 Reduction of hexavalent chromium by
Pseudomonas fluorescens LB300 in batch and continuous cultures Appl Microbiol Biotechnol 40 756-759
28 Desjardin V Bayard R Lejeune P amp Gourdon R 2003 Utilization of supernatant of pure cultures of Streptomyces thermocarboxydus NH50 to reduce
chromium toxicity and mobility in contaminated soils Water Air and Soil Pollut 3 153-160
29 Eccles H 1999 Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process TIBTECH 17 462-465
30 Faisal M amp Hasnain S 2004 Comparative study of Cr(VI) uptake and reduction in
industrial effluent by Ochrobactrum intermedium and Brevibacterium sp
Biotechnology Letters 26 1623-1628
31 Fruchter J 2002 In situ treatment of chromium-contaminated groundwater Environ Sci amp Technol pp 464-472
32 Fujie K Hu H Huang X Tanaka Y Urano K amp Ohtake H 1996 Optimal operation of bioreactor system developed for the treatment of chromate wastewater
using Enterobacter cloacae HO-1 Wat Sci Tech 33 (5-6) 173-182 33 Fujii E Toda K amp Ohtake H 1990 Bacterial reduction of toxic hexavalent
chromium using a fed-batch culture of Enterobacter cloacae strain HO1 J Ferment Bioeng 69 (6) 365-367
34 Gaballah I Goy D Kilbertus G amp Thauront J 1994 Decontamination of
industrial effluents for environment protection and recycling of metals Resources
Conservation and Recycling 10 (1-2) 97-106
35 Galiacutendez-Mayer J Saacutenchez-Teja O Cristiani-Urbina E amp Ruiz-Ordaz N 2001 A novel split-cylinder airlift reactor for fed-batch cultures Bioprocess and Biosystems
Engineering 24 171-177 36 Ganguli A amp Tripathi AK 1999 Survival and chromate reducing ability of
Pseudomonas aeruginosa in industrial effluents Lett Appl Microbiol 28 76-80
37 Garbisu C Alkorta I Llama MJ amp Serra JL 1998 Aerobic chromate reduction by Bacillus subtilis Biodegradation 9 133-141
38 Gonzaacutelez AR Ndungrsquou K amp Flegal AR 2005 Natural occurrence of hexavalent chromium in the Aromas Red Sands Aquifer California Environ Sci Technol 39
(15) 5505-5511
108
39 Gopalan R amp Veeramani H 1994 Studies on microbial chromate reduction by
Pseudomonas sp in aerobic continuous suspended growth cultures Biotechnology and Bioengineering 43 471-476
40 Guertin J Jacobs JA amp Avakian CP 2005 Chromium(VI) Handbook 1st
edition CRC Press USA 41 Hach Water Analysis Handbook 2002 Hach Company Colorado USA 4th ed
pp 433-444 1210-1211
42 Hafez AI El-Manharawy MS amp Khedr MA 2002 RO membrane removal of unreacted chromium from spent tanning effluent A pilot-scale study Part 2 Desalination 144 (1-3) 237-242
43 Hagino H Odagiri H amp Okutani J 1982 Draft device for a bubble column US
Patent 4327042 44 Horitsu H Futo S Miyazawa Y Ogai S amp Kawai K 1987 Enzymatic
reduction of hexavalent chromium by hexavalent chromium tolerant Pseudomonas ambigua G-1 Agric Biol Chem 51 (9) 2417-2420
45 Ishibashi Y Cervantes C amp Silver S 1990 Chromium reduction in Pseudomonas
putida Appl Environ Microb 56 (7) 2268-2270
46 Jianlong W Zeyu M amp Xuan Z 2004 Response of Saccharomyces cerevisiae to
chromium stress Process Biochem 39 1231-1235 47 Juvera-Espinosa J Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2006 Isolation and
characterization of a yeast strain capable of removing Cr(VI) Enzyme and Microbial Technology 40 114-121
48 Kaszycki P Fedorovych D Ksheminska H Babyak L Gonchar MV Jaglarz
A amp Koloczek H 2003 Modulation of chromium(VI) and (III) tolerance and
accumulation in yeast by sulfate-containing salts European Journal of Biochemistry 1 (1) P49-53
49 Komori K Wang P Toda K amp Ohtake H 1989 Factors affecting chromate
reduction in Enterobacter cloacae Strain HO1 Appl Microbiol Biotechnol 31 567-570
50 Ksheminska H Fedorovych D Babyak L Yanovych D Kaszycki P amp Koloczek H 2005 Chromium(III) and (VI) tolerance and bioaccumulation in
yeast a survey of cellular chromium content in selected strains of representative genera Process Biochem 40 1565-1572
51 Ksheminska HP Honchar TM Gayda GZ amp Gonchar MV 2006 Extra-cellular chromate-reducing activity of the yeast cultures Central European Journal of
Biology 1 (1)137-149
109
52 Kurniawan TA Chan GYS Lo W amp Babel S 2006 Physico-chemical
treatment techniques for wastewater laden with heavy metals Chemical Engineering Journal 118 83-98
53 Labra M Grassi F Imazio S Di Fabio T Citterio S Sgorbati S amp Agradi E
2004 Genetic and DNA-methylation changes induced by potassium dichromate in Brassica napus L Chemosphere 54 1049-1058
54 Laxman RS amp More S 2002 Reduction of hexavalent chromium by Streptomyces griseus Minerals Engineering 15 831-837
55 Leustek T 2002 Sulfate metabolism The Arabidopsis Book American Society of
Plant Biologists
56 Liu YG Xu WH Zeng GM Li X and Gao H 2006 Cr(VI) reduction by
Bacillus sp isolated from chromium landfill Process Biochemistry 41 1981-1986 57 Llovera S Bonet R Simon-Pujol MD amp Congregado F 1993 Effect of culture
medium ions on chromate reduction by resting cells of Agrobacterium radiobacter Appl Microbiol Biotechnol 39 424-426
58 Lloyd JR 2003 Microbial reduction of metals and radionuclides FEMS Microbiol
Rev 27 411-425
59 Marsh TL amp McInerney MJ 2001 Relationship of hydrogen bioavailability to
chromate reduction in aquifer sediments Appl Environ Microb 67 (4) 1517-1521
60 McLean J amp Beveridge TJ 2001 Chromate reduction by a pseudomonad isolated from a site contaminated with chromated copper arsenate Applied and
Environmental Microbiology 67 (3)1076-1084 61 Megharaj M Avudainayagam S amp Naidu R 2003 Toxicity of hexavalent
chromium and its reduction by bacteria isolated from soil contaminated with tannery waste Current Microbiology 47 51-54
62 Middleton SS Latmani RB Mackey MR Ellisman MH Tebo BM amp Criddle
CS 2003 Cometabolism of Cr(VI) by Shewanella oneidensis MR-1 produces cell-associated reduced chromium and inhibits growth Biotechnol Bioeng 83 627-637
63 Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2006 Removal of hexavalent chromium
by Trichoderma viride in an airlift bioreactor Enzyme and Microbial Technology 40 107-113
64 Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2008 Hexavalent chromium removal by Trichoderma inhamatum fungal strain isolated from tannery effluent Enzyme and
Microbial Technology 40 107-113
110
65 Morales B L 2005 Aislamiento de microorganismos y estudio de su capacidad
para remover cromo hexavalente Tesis de Maestriacutea Escuela Nacional de Ciencias Bioloacutegicas IPN Meacutexico
66 Muter O Patmalnieks A amp Rapoport A 2001 Interrelations of the yeast Candida
utilis and Cr(VI) metal reduction and its distribution in the cell and medium Process Biochem 36 963-970
67 Ohtake H Cervantes C amp Silver S 1987 Decreased chromate uptake in Pseudomonas fluorescens carrying a chromate resistance plasmid J Bacteriol 169
3853-3856 68 Pal N 1997 Reduction of hexavalent chromium to trivalent chromium by
Phanerochaete chrysosporium pp 511-517 En Alleman BC amp Leeson A In Situ and On-Site Bioremediation Vol 2 Battelle Press Ohio USA
69 Pattanapipitpaisal P Brown NL amp Macaskie LE 2001 Chromate reduction by
Microbacterium liquefaciens immobilised in polyvinyl alcohol Biotechnol Lett 23
61-65
70 Pepi M amp Baldi F 1992 Modulation of chromium(VI) toxicity by organic and inorganic sulfur species in yeasts from industrial wastes BioMetals 5 179-185
71 Quintana M Curutchet G amp Donati E 2001 Factors affecting chromium(VI) reduction by Thiobacillus ferrooxidans Biochemical Engineering Journal 9 11-15
72 Ramiacuterez-Ramiacuterez R Calvo-Meacutendez C Aacutevila-Rodriacuteguez M Lappe P Ulloa M
Vaacutezquez-Juaacuterez R amp Gutieacuterrez-Corona JF 2004 Cr(VI) reduction in a chromate-
resistant strain of Candida maltosa isolated from the leather industry Antonie van Leeuwenhoek 85 63-68
73 Rege MA Petersen JN Johnstone DL Turick CE Yonge DR amp Apel WA
1997 Bacterial reduction of hexavalent chromium by Enterobacter cloacae strain
HO1 grown on sucrose Biotechnol Lett 19 (7) 691-694
74 Roukas T 1993 Ethanol production from nonsterilized carob pod extract by free and immobilized Saccharomyces cerevisiae cells using fed-batch culture
Biotechnol Bioeng 43 189-194 75 Ruiacutez MA 2000 Recuperacioacuten de metales pesados de soluciones diluidas por
biosorcioacuten con bacteria En Medrano RH Galan WL Biotecnologiacutea de Minerales CONACYT Meacutexico pp 235-262
76 Saxena D Levin R amp Firer MA 2000 Removal of chromate from industrial
effluent by a new isolate of Staphylococcus cohnii Wat Sci Technol 42 (1-2)
93-98
77 Secretariacutea de Comercio y Fomento Industrial NMX-AA-74-1981 Anaacutelisis de Agua ndash Determinacioacuten del Ioacuten Sulfato
111
78 Secretariacutea de Economiacutea NMX-AA-051-SCFI-2001 Anaacutelisis de Agua -
Determinacioacuten de Metales por Absorcioacuten Atoacutemica en Aguas Naturales Potables Residuales y Residuales Tratadas - Meacutetodo de Prueba
79 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NMX-AA-044-SCFI-
2001 Anaacutelisis de Aguas - Determinacioacuten de Cromo Hexavalente en Aguas Naturales Potables Residuales y Residuales Tratadas - Meacutetodo de Prueba En Diario Oficial de la Federacioacuten 1 de agosto 2001
80 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996
Liacutemites Maacuteximos Permisibles de Contaminantes en las Descargas de Aguas Residuales en Aguas y Bienes Nacionales En Diario Oficial de la Federacioacuten 6 de enero 1997
81 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996
Liacutemites Maacuteximos Permisibles de Contaminantes en las Descargas de Aguas Residuales a los Sistemas de Alcantarillado Urbano o Municipal En Diario Oficial de la Federacioacuten 3 de junio 1998
82 Secretariacutea de Salud Proyecto de Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-
NOM-127-SSA1-1994 Salud Ambiental Agua para Uso y Consumo Humano - Liacutemites Permisibles de Calidad y Tratamientos a que debe Someterse el Agua para su Potabilizacioacuten En Diario Oficial de la Federacioacuten 20 de Octubre 2000
83 Shakoori AR Makhdoom M amp Haq RU 2000 Hexavalent chromium reduction
by a dichromate-resistant gram-positive bacterium isolated from effluents of tanneries Appl Microbiol amp Biotechnol 53 (3) 348-351
84 Shen H and Wang YT 1994 Biological reduction of chromium by E coli Journal of Environmental Engineering 120 560-572
85 Shen H amp Wang Y 1995 Hexavalent chromium removal in two-stage bioreactor
system J Environ Eng 121 (11) 798-804
86 Smith WA Apel WA Petersen JN amp Peyton BM 2002 Effect of carbon and
energy source on bacterial chromate reduction Bioremediation J 6 (3) 205-215
87 Smith WL amp Gadd GM 2000 Reduction and precipitation of chromate by mixed culture sulphate-reducing biofilms J Appl Microbiol 88 983-991
88 Song Z Williams CJ amp Edyvean RGJ 2004 Treatment of tannery wastewater by chemical coagulation Desalination 164 (3) 249-259
89 Srinath T Verma T Ramteke PW amp Garg SK 2002 Chromium (VI)
biosorption and bioaccumulation by chromate resistant bacteria Chemosphere 48
(4) 427-435
90 Stanbury PF amp Whitaker A ―Principles of Fermentation Technology Pergamon Press Ltd Great Britain 1984 First edition Pp 11-24
112
91 Stasinakis AS Mamais D Thomaidis NS amp Lekkas TD 2002 Effect of
chromium (VI) on bacterial kinetics of heterotrophic biomass of activated sludge Water Res 36 3341-3349
92 Stasinakis AS Thomaidis NS Mamais D Karivali M amp Lekkas TD 2003
Chromium species behaviour in the activated sludge process Chemosphere 52 1059-1067
93 Stephen JR amp Macnaughton SJ 1999 Developments in terrestrial bacterial remediation of metals Current Opinion in Biotechnology 10 230-233
94 Su C amp Ludwig RD 2005 Treatment of hexavalent chromium in chromite ore
processing solid waste using a mixed reductant solution of ferrous sulfate and
sodium dithionite Environ Sci Technol 39 (16) 6208-6216
95 Thacker U Parikh R Shouche Y amp Madamwar D 2006 Hexavalent chromium reduction by Providencia sp Process Biochem 41 1332-1337
96 Thacker U amp Madamwar D 2005 Reduction of toxic chromium and partial localization of chromium reductase activity in bacterial isolate DM1 Would Journal
of Microbiology amp Biotechnology 21 891-899 97 Tung HL Chiou SY Tu CC amp Wu WT 1997 An airlift reactor with double
net draft tubes and its application in fermentation Bioprocess Eng 171-5
98 Turick CE Apel WA amp Carmiol NS 1996 Isolation of hexavalent chromium-reducing anaerobes from hexavalent-chromium-contaminated and noncontaminated environments Applied Microbiol Biotechnol 44 683-688
99 Viamajala S Peyton BM Sani RK Apel WA amp Petersen JN 2004 Toxic
effects of chromium(VI) on anaerobic and aerobic growth of Shewanella oneidensis MR-1 Biotechnol Prog 20 87-95
100 Volesky B amp Vieira RHSF 2000 Biosorption a solution to pollution Internat Microbiol 3 17-24
101 Wang DIC Cooney CL Demain AL Dunnill P Humphrey AE amp Lilly MD
1979 ―Fermentation and Enzyme Technology John Wiley amp Sons Inc USA Pp 98-115
102 Wang YT and Shen H 1997 Modelling Cr(VI) reduction by pure bacterial cultures Water Research 31 727-732
103 Wang Y amp Xiao C 1995 Factors affecting hexavalent chromium reduction in pure
cultures of bacteria Water Res 29 (11) 2467-2474
104 Wang Y 2000 Microbial reduction of chromate En Lovley DR (Ed)
Environmental Microbe-Metal Interactions ASM Press Washington DC USA pp 225-235
113
105 Wilkin RT Su C Ford RG amp Paul CJ 2005 Chromium-removal processes
during groundwater remediation by a zerovalent iron permeable reactive barrier Environ Sci Technol 39 (12) 4599-4605
106 Worthington Biochemical Corporation 1972 Worthington Enzyme Manual
Enzymes Enzyme Reagents and Related Biochemicals Freehold New Jersey USA
107 Wu J amp Wu WT 1991 Fed-batch culture of Saccharomyces cerevisiae in an airlift reactor with net draft tube Biotechnol Prog 7 230-233
108 Wu WT amp Wu JY 1990 Airlift reactor with net draught tube J Ferm Bioeng
70 359-361
109 Wu WT Wu JY amp Jong JZ 1992 Mass transfer in an airlift reactor with a net
draft tube Biotechnol Prog 8 465-468 110 Zakaria ZA Zakaria Z Surif S amp Ahmad WA 2006 Hexavalent chromium
reduction by Acinetobacter haemolyticus isolated from heavy-metal contaminated wastewater J Hazard Mater 146 30-38
111 Zuacutentildeiga M 2005 Aislamiento de microorganismos con capacidad para remover
cromo hexavalente del agua Tesis de Licenciatura Escuela Nacional de Ciencias
Bioloacutegicas IPN Meacutexico
Referencias electroacutenicas
httpepagov httpesepagovtechpubs412304html
httpfaiunneeduarbiologiamicroindcultivo20y20biorreactoreshtm httpmineralserusgsgovmineralspubscommoditychromium180494pdf
httpuserpagesumbcedu gferre1bmcohtml
httpuserpagesumbcedu gferre1fedbatchhtml httpwwgemesmaterialdocument httpwwwatsdrcdcgovfacts7 html
httpwwwchemicalelementscomelementscrhtml httpwwwepagoviris
wwwclu-inorgdownloadstudentpapersbio_of_metals_paperpdf
114
7 Impacto
En este trabajo se identificaron algunas variables ambientales que afectan la
biorreduccioacuten de cromo hexavalente [Cr(VI)] La informacioacuten obtenida podriacutea ser de
utilidad para mejorar los procesos de reduccioacuten del metal asiacute como para disminuir los
tiempos y costos del tratamiento de los efluentes industriales contaminados con Cr(VI)
Los resultaron mostraron que el sulfato afecta la tolerancia de Candida sp al Cr(VI) y a
su capacidad para reducirlo Fue evidente que a medida que se incrementoacute la
concentracioacuten de sulfato aumentoacute el crecimiento de la levadura la eficiencia global y la
velocidad global de reduccioacuten de Cr(VI) Asimismo se encontroacute que la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp depende de la densidad celular de los cultivos de manera tal que
a mayor cantidad de biomasa producida mayor es la reduccioacuten del metal Aun cuando la
cepa de Candida sp es sensible a los efectos toacutexicos del Cr(VI) en ausencia del sulfato
esta levadura posee una notable capacidad para reducir muy altas concentraciones de
Cr(VI) en presencia de sulfato por lo que podriacutea ser potencialmente uacutetil para el
tratamiento de aguas industriales altaminadas con Cr(VI) y con iones sulfato
Hasta donde sabemos este es el primer trabajo en el que se demuestra que el sulfato
desempentildea un papel impotante tanto en la tolerancia al Cr(VI) como en la reduccioacuten
aeroacutebica del mismo en microorganismos Estos descubrimientos podriacutean tener
implicaciones importantes en el tratamiento de aguas residuales contaminadas con
Cr(VI)
Ademaacutes se encontroacute que los contactores gas-liacutequido son adecuados para la reduccioacuten
aeroacutebica de Cr(VI) por Candida sp Esto uacuteltimo es de vital importancia porque seriacutea
posible disminuir significativamente los costos de tratamiento ya que estos biorreactores
se caracterizan por su baja economiacutea de aireacioacuten Las velocidades volumeacutetrica y
especiacutefica asiacute como la capacidad de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por Candida sp en el
reactor airlift con tubo conceacutentrico fueron superiores a las obtenidas en matraz y eacutesto
podriacutea deberse a que en el reactor airlift la levadura tuvo una mayor cantidad de oxiacutegeno
disponible para su crecimiento y a que el mayor nuacutemero de ceacutelulas producidas fue la
responsable de reducir maacutes eficazmente el Cr(VI) presente en el medio de cultivo
115
Las caracteriacutesticas mostradas por Candida sp en el dispositivo airlift indican que este
tipo de reactor neumaacutetico es adecuado para el crecimiento y la reduccioacuten aeroacutebica del
Cr(VI) por la levadura Asimismo los paraacutemetros cineacuteticos del proceso de reduccioacuten de
Cr(VI) catalizado por Candida sp son superiores a los reportados para otros
microorganismos lo que sugiere que esta cepa de levadura tiene potencial biotecnoloacutegico
para ser utilizada en procesos de remediacioacuten de aguas residuales industriales
contaminadas con Cr(VI)
De los diferentes sistemas de reaccioacuten ensayados (cultivos por lote lote repetido
continuo de una etapa lote alimentado y lote alimentado repetido) el cultivo por lote es
el maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
Otra de las contribuciones de este trabajo fueron la formacioacuten de recursos humanos
tanto a nivel licenciatura como de posgrado Uno de los estudiantes de licenciatura ya
sustentoacute su examen profesional y la tesis de Maestriacutea de otra estudiante ya fue revisada
y aprobada por los sinodales por lo que el examen para obtener el grado se realizaraacute en
poco tiempo Actualmente estaacuten en proceso 1 tesis de licenciatura 2 de maestriacutea y 1 de
doctorado
Entre otros productos del proyecto de investigacioacuten se tienen la publicacioacuten de 2 artiacuteculos
en revistas internacionales incluidas en la base de datos del Journal of Citation Reports
del Institute for Scientific Information (ISI) la publicacioacuten de 2 artiacuteculos en extenso en
las memorias de Congresos Internacionales y la presentacioacuten de varios trabajos en
eventos acadeacutemicos nacionales e internacionales
10
En Meacutexico no se tienen datos precisos sobre la cantidad y concentracioacuten de cromo total
o hexavalente de los residuos generados por las diversas industrias sin embargo se ha
informado que las industrias del curtido de pieles generan de 250 a 270 toneladas de
Cr2O3 al antildeo (Zuacutentildeiga 2005)
Debido a las grandes cantidades de cromo que se liberan al medio ambiente asiacute como a
los efectos indeseables que este metal ocasiona sobre los seres vivos en muchos paiacuteses
se han establecido Normas Ambientales que pretenden regular la concentracioacuten de cromo
total yo de Cr(VI) de los desechos liacutequidos soacutelidos o gaseosos que se descargan al
medio ambiente
En Meacutexico la Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca ha decretado
normas oficiales que establecen los liacutemites maacuteximos permisibles de contaminantes
incluido el cromo ya sea como cromo total o como cromo hexavalente de las aguas
residuales que se descargan en aguas y bienes nacionales (Secretariacutea de Medio
Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996) (tabla 2) asiacute como en los
sistemas de alcantarillado urbano o municipal (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos
Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996) (tabla 3)
En cuanto al agua para uso y consumo humano la Secretariacutea de Salud ha emitido la
Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-1994 (Secretariacutea de Salud Proyecto de
Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-1994) donde se indica
como liacutemite maacuteximo permisible una concentracioacuten de cromo total de 005 mgL
11
Tabla 2 Liacutemites maacuteximos permisibles de cromo total para las aguas residuales que se descargan en aguas y bienes
nacionales (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996)
Paraacutemetros
( )
Riacuteos Embalses
Naturales y
Artificiales
Aguas Costeras Suelo
(mgL) Uso en
riego
agriacutecola
(A)
Uso
puacuteblico
urbano
(B)
Proteccioacuten
de vida
acuaacutetica
( C )
Uso en
riego
agriacutecola
(B)
Uso
puacuteblico
urbano
( C )
Explotacioacuten
pesquera
navegacioacuten
y otros
usos (A)
Recreacioacuten
(B)
Estuarios
(B)
Uso en
riego
agriacutecola
(A)
Humedales
naturales
(B)
PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD
Cromo 1 15 05 10 05 10 1 15 05 10 05 10 1 15 05 10 05 10 05 10
() Medidos de manera total PD = Promedio diario PM = Promedio mensual (A) (B) y ( C ) Tipo de cuerpo receptor seguacuten la Ley Federal de Derechos
Tabla 3 Liacutemites maacuteximos permisibles de cromo hexavalente para los sistemas de alcantarillado urbano o municipal
(Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996)
Paraacutemetros (mgL) Promedio Mensual Promedio Diario Instantaacuteneo
Cromo hexavalente 05 075 1
12
Por su parte la EPA ha establecido como liacutemite una concentracioacuten de 01 mg de cromo
por litro de agua potable (httpwwwatsdrcdcgovfacts7html)
La Organizacioacuten Mundial para la Salud (OMS) y la Comunidad Econoacutemica Europea (CEE)
establecen una concentracioacuten de 005 mg de cromo totalL como paraacutemetro de calidad
para aguas destinadas a consumo humano (httpwwgemesmaterialdocument)
Algunos valores sentildealados por otras instancias internacionales se muestran en la tabla
4
Tabla 4 Liacutemites permisibles para cromo sentildealados por Directivas Internacionales
sobre agua potable y aguas embotelladas (Zuacutentildeiga 2005)
Paraacutemetro Canadaacute 1 Japoacuten 2 Aguas embotelladas Nivel de
Administracioacuten Federal sobre
Productos Farmaceacuteuticos de EEUU
Cromo
005 mgL
005 mgL
01 mgL
1 Liacutemite establecido por el Ministerio de Salud de Canadaacute
2 Liacutemite establecido por el Ministerio de Salud y Bienestar Social de Japoacuten
15 Meacutetodos para la remocioacuten de cromo de los efluentes industriales
Para disminuir los efectos toacutexicos del metal es conveniente aplicar alguacuten(os)
tratamiento(s) a los efluentes industriales que contienen cromo antes de descargarlos en
los cuerpos de agua o en el suelo asiacute como restaurar los ecosistemas contaminados En
la actualidad estaacuten disponibles varias tecnologiacuteas para estos propoacutesitos (Eccles 1999)
Estas tecnologiacuteas se han empleado para reducir la toxicidad del contaminante [mediante
la transformacioacuten quiacutemica o bioloacutegica del Cr(VI) a Cr(III)] para removerlo de un lugar
para disminuir la extensioacuten de la contaminacioacuten o para contenerlo en un aacuterea en
particular (Guertin y col 2005)
13
151 Procesos convencionales
Los meacutetodos convencionales para la remocioacuten de los metales pesados son de naturaleza
fisicoquiacutemica y pueden ser utilizados en varias etapas del tratamiento de aguas
residuales Los meacutetodos maacutes usuales para la remocioacuten de Cr(VI) de los efluentes
industriales son los siguientes 1) reduccioacuten quiacutemica ndash precipitacioacuten en donde el Cr(VI)
es reducido quiacutemicamente a Cr(III) a pH aacutecido utilizando alguacuten agente reductor (por
ejemplo el bisulfito de sodio) y posteriormente se adiciona cal o alguacuten otro compuesto
alcalino para formar hidroacutexido de cromo (III) el cual es separado por sedimentacioacuten y
2) coagulacioacuten-floculacioacuten En general estos meacutetodos tienen algunas desventajas tales
como 1) son costosos ya que el agente activo no puede ser recuperado para su
posterior reutilizacioacuten 2) algunos reactivos quiacutemicos son sumamente toacutexicos 3) su
selectividad es baja 4) generan lodos quiacutemicos con altas concentraciones de metales los
cuales son difiacuteciles de tratar 5) la remocioacuten de los metales es incompleta principalmente
cuando la concentracioacuten de eacutestos en los efluentes es inferior a 100 mgL y 6) las aguas
residuales resultantes no satisfacen los criterios de calidad establecidos en la legislacioacuten
ambiental (Cantildeizares-Villanueva 2000 Ruiacutez 2000 Saxena y col 2000 Cheung y Gu
2003)
Algunas otras tecnologiacuteas que se utilizan ocasionalmente para la remocioacuten del Cr(VI) son
el intercambio ioacutenico la adsorcioacuten el tratamiento electroquiacutemico la oacutesmosis inversa y la
evaporacioacuten (Garbisu y col 1998 Camargo y col 2003 Kurniawan y col 2006) Las
principales desventajas de estos meacutetodos son los altos costos fijos de operacioacuten y de
mantenimiento por lo que su aplicacioacuten a grandes voluacutemenes de agua o su uso por
pequentildeas y medianas empresas estaacute muy limitado
14
La EPA recomienda los siguientes meacutetodos para la remocioacuten de cromo del agua potable
en caso de que eacutesta exceda el liacutemite permisible para este metal coagulacioacuten-filtracioacuten
intercambio ioacutenico y oacutesmosis inversa (httpepagov)
En Meacutexico en caso de que el agua destinada a uso y consumo humano exceda el liacutemite
permisible de cromo total la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-1994
(Secretariacutea de Salud Proyecto de Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-
127-SSA1-1994) indica como tratamientos a aplicar el intercambio ioacutenico o la oacutesmosis
inversa
152 Procesos biotecnoloacutegicos
En las uacuteltimas dos deacutecadas se han llevado a cabo estudios con el fin de utilizar
microorganismos y plantas para la restauracioacuten de sitios y para el tratamiento de
efluentes industriales contaminados con metales toacutexicos (Stephen y Macnaughton 1999
Lloyd 2003)
En la actualidad se considera que los procesos microbioloacutegicos son la alternativa maacutes
atractiva para remover algunos metales toacutexicos de los sitios y efluentes contaminados
ya que estos procesos son ―amigables con el medio ambiente los subproductos que
generan son usualmente inocuos son muy eficientes en la remocioacuten de los metales
(particularmente cuando las concentraciones de eacutestos son bajas condiciones en las que
algunos procesos fisicoquiacutemicos son muy ineficientes) y son de bajo costo (Cheung y
Gu 2005 Chardin y col 2002 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004)
15
Dentro de los procesos biotecnoloacutegicos propuestos para la remocioacuten de Cr(VI) se
encuentran la biosorcioacuten y la reduccioacuten bioloacutegica en los cuales se han utilizado
principalmente microorganismos (Volesky y Vieira 2000 Fruchter 2002 Cheung y Gu
2003)
En la biosorcioacuten se utilizan ciertos tipos de adsorbentes bioloacutegicos por ejemplo biomasa
microbiana (viva o inactivada en suspensioacuten o inmovilizada) con los que no se requiere
energiacutea metaboacutelica para retener pasivamente al cromo hexavalente mediante procesos
fiacutesicos (adsorcioacuten fiacutesica principalmente por fuerzas de van Der Waals) o quiacutemicos
(quimisorcioacuten) (Cantildeizares-Villanueva 2000 Volesky y Vieira 2000 Aravindhan y col
2004) En algunos casos se ha observado que el metal es transportado activamente al
interior de las ceacutelulas (a expensas de energiacutea metaboacutelica) proceso al que se le denomina
como bioacumulacioacuten
En la biorreduccioacuten o reduccioacuten bioloacutegica el cromo hexavalente es transformado a la
forma trivalente este uacuteltimo puede ser faacutecilmente precipitado en una etapa posterior de
tratamiento ajustando el pH del agua residual a un valor cercano al neutro para
removerlo finalmente por meacutetodos fiacutesicos (Chardin y col 2002 Cheung y Gu 2003) Se
considera que este proceso es una alternativa tecnoloacutegica potencial para el tratamiento
de suelos cuerpos de agua y efluentes industriales contaminados ya que la reduccioacuten
del Cr(VI) disminuye significativamente la toxicidad (100 veces) solubilidad en agua y
movilidad del metal a traveacutes del medio ambiente (Cheung y Gu 2003 Lloyd 2003
Wang 2000)
16
Se han aislado varios microorganismos que pueden reducir el Cr(VI) a Cr(III) ya sea
como cultivos puros (Horitsu y col 1987 Wang 2000 Pattanapipitpaisal y col 2001
Chardin y col 2002 Cheung y Gu 2003 Middleton y col 2003 Morales-Barrera
2005 Pal 1997 Muter y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004 Thacker y col
2006) o como cultivos mixtos (Smith y col 2002 Cheung y Gu 2003) Las fuentes de
aislamiento han sido muy diversas como por ejemplo efluentes de curtiduriacuteas de la
industria metaluacutergica de mantos freaacuteticos de aguas superficiales contaminadas de
sedimentos anoacutexicos en lagos de plantas de tratamiento de aguas residuales entre
otros (Horitsu y col 1987 Fujii y col 1990 Ganguli y Tripathi 1999 Badar y col
2000 Saxena y col 2000 Pattanapipitpaisal y col 2001 Middleton y col 2003
Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004 Zuacutentildeiga 2005 Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
Entre los geacuteneros microbianos que son capaces de reducir Cr(VI) se tienen los
siguientes Achromobacter Aeromonas Agrobacterium Bacillus Desulfovibrio
Escherichia Enterobacter Micrococcus Pseudomonas (Horitsu y col 1987 Wang
2000) Staphylococcus (Saxena y col 2000) Microbacterium (Pattanapipitpaisal y col
2001) Pyrobaculum Streptomyces Deinococcus (Chardin y col 2002)
Desulfomicrobium Desulfotomaculum Pantoea (Cheung y Gu 2003) Shewanella
(Middleton y col 2003) Trichoderma (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
Phanerochaete (Pal 1997) y Candida (Muter y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col
2004)
De los estudios reportados en la literatura acerca de la reduccioacuten microbioloacutegica del
Cr(VI) sobresalen tres hechos 1) Las bacterias han sido los microorganismos maacutes
ampliamente estudiados y es muy escasa la informacioacuten disponible sobre la capacidad de
17
reduccioacuten del metal de las levaduras y de los hongos filamentosos 2) la mayoriacutea de los
microorganismos ensayados soacutelo son capaces de tolerar y reducir muy bajas
concentraciones de Cr(VI) usualmente dentro del intervalo de 0001 a 05 mM esto
uacuteltimo se ha atribuido a los efectos toacutexicos y mutageacutenicos del metal y 3) casi todos los
estudios se han realizado en cultivo por lote
1521 Transporte del cromo al interior de las ceacutelulas
Tanto en organismos procariotes como en muchos eucariotes los oxianiones cromato y
dicromato (fuentes de cromo hexavalente) ingresan principalmente a las ceacutelulas a traveacutes
de las membranas citoplaacutesmicas mediante el sistema de transporte del sulfato (Badar y
col 2000) lo cual se ha atribuido a la similitud en la carga y estructura de estos iones
(Smith y Gadd 2000) Esto fue demostrado primeramente en Salmonella typhimurium y
posteriormente en otras bacterias tales como en Escherichia coli Pseudomonas
fluorescens y Alcaligenes eutrophus Se ha comprobado que esto mismo ocurre en
algunas levaduras tales como en Candida (Muter y col 2001 Cervantes y col 2001)
Sin embargo en general el cromato penetra al interior de las levaduras por medio de un
transportador anioacutenico no especiacutefico (Czakoacute-Veacuter y col 1999 Cervantes y col 2001)
En algunos microorganismos se ha demostrado que el sulfato inhibe competitivamente el
transporte del cromato al interior de las ceacutelulas (Ohtake y col 1987 Pepi y Baldi 1992)
y que esta inhibicioacuten es maacutes marcada en ceacutelulas anaerobias que en aerobias (Zakaria y
col 2006) Tambieacuten se ha reportado el transporte del cromato por la viacutea de los fosfatos
aunque la viacutea del sulfato es la maacutes utilizada (Ohtake y col 1987)
18
El transporte del cromato al interior de las plantas tambieacuten es a traveacutes del sistema del
ioacuten sulfato Ya en el interior de la planta el cromo hexavalente se acumula en diversos
oacuterganos en cantidades diferentes El cromo hexavalente se acumula de 10 a 100 veces
maacutes en las raiacuteces que en los retontildeos o en otros tejidos (Cervantes y col 2001)
En contraste las membranas celulares de los organismos son praacutecticamente
impermeables al cromo trivalente y a sus compuestos (Ksheminska y col 2006)
1522 Mecanismos microbianos de resistencia al Cr(VI) y de reduccioacuten del
Cr(VI)
Una caracteriacutestica importante que deben tener los microorganismos que se van a utilizar
en procesos de tratamiento de efluentes contaminados con cromo hexavalente es que
sean tolerantes (resistentes) a eacuteste Esta propiedad ha sido descrita en bacterias hongos
y levaduras (Horitsu y col 1987 Cervantes y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004)
Entre los mecanismos de resistencia al cromo hexavalente que se han encontrado se
tienen los siguientes
Acumulacioacuten del metal en la superficie o en el interior de las ceacutelulas (Volesky y Vieira
2000 Saxena y col 2000)
Disminucioacuten yo impedimento en el transporte del cromo hexavalente al interior de
las ceacutelulas (Pepi y Baldi 1992)
Excrecioacuten del metal del interior de la ceacutelula al medio circundante (Cervantes y col
2001)
Reacciones de oacutexido-reduccioacuten en las que el cromo hexavalente es reducido a cromo
trivalente el cual es menos toacutexico (Baldi y col 1990 Muter y col 2001)
19
La resistencia al cromo hexavalente puede estar codificada en el genoacuteforo de las
bacterias o en plaacutesmidos Esto uacuteltimo se ha encontrado en Pseudomonas aeruginosa P
fluorescens P putida y en Alcaligenes eutrophus (Baldi y col 1990 Ishibashi y col
1990 Cervantes y col 2001) Sin embargo la tolerancia al metal no implica
necesariamente que los microorganismos seraacuten capaces de removerlo por alguacuten
mecanismo
En el interior de las ceacutelulas bacterianas los iones cromato [CrO42-] pueden ser reducidos
a cromo trivalente por ciertas enzimas (Ishibashi y col 1990 Horitsu y col 1987) En
condiciones de aerobiosis se han identificado las siguientes proteiacutenas que parecen ser las
responsables de la reduccioacuten del Cr(VI) reductasas flavoproteiacutenas enzimas
dependientes de NADH y NAD(P)H (Ishibashi y col 1990) en cambio en condiciones de
anaerobiosis los estudios indican que ciertas hidrogenasas y citocromos son los
responsables (Chardin y col 2003 Cheung y Gu 2007)
El cromo hexavalente tambieacuten puede ser reducido por compuestos quiacutemicos reductores
que son producidos durante el crecimiento de los microorganismos (Desjardin y col
2003) tales como el glutatioacuten y la cisteiacutena los cuales pueden actuar dentro o fuera de
los organismos (Zakaria y col 2006) En organismos superiores se ha identificado al
ascorbato como agente reductor del cromo hexavalente (Ksheminska y col 2006)
Casi no hay informacioacuten sobre el mecanismo responsable de la reduccioacuten del Cr(VI) en
ceacutelulas eucariotas especiacuteficamente en levaduras Con la finalidad de dilucidar dicho
20
mecanismo se han realizado estudios en los que se ha modificado la resistencia de las
levaduras al Cr(VI) o se ha inactivado alguna enzima en particular
En un trabajo llevado a cabo con algunas levaduras no convencionales se encontroacute que
algunas de eacutestas durante su crecimiento excretaron sustancias reductoras asiacute como
sustancias quelantes que formaron complejos con el cromo trivalente que fue generado
durante la transformacioacuten del cromo hexavalente (Ksheminska y col 2006)
1523 Factores que afectan la reduccioacuten bioloacutegica del Cr(VI)
En algunos microorganismos se ha estudiado el efecto que tienen las variables
ambientales tales como condiciones de aerobiosis yo de anaerobiosis donadores y
aceptores finales de electrones concentracioacuten de cromo hexavalente y potencial de
oacutexido-reduccioacuten entre algunas otras sobre la reduccioacuten del metal (Shen y Wang 1995
Shakoori y col 2000 Wang 2000 Smith y col 2002 Wang y Xiao 1995 Fujii y col
1990 Muter y col 2001 Smith y Gadd 2000 Lloyd 2003 Jianlong y col 2004
Viamajala y col 2004)
La reduccioacuten del Cr(VI) puede realizarse en ambiente aerobio yo anaerobio En
organismos aerobios y anaerobios facultativos se ha investigado el efecto del oxiacutegeno
disuelto en el medio sobre la reduccioacuten del metal (Wang 2000) Se ha encontrado que
la sensibilidad del proceso de reduccioacuten del Cr(VI) a la tensioacuten de oxiacutegeno es diferente
para cada microorganismo En cultivos de Enterobacter cloacae HO1 concentraciones
iniciales de oxiacutegeno mayores a 45 ppm inhibieron fuertemente la reduccioacuten del Cr(VI)
(Komori y col 1989) mientras que la reduccioacuten del metal fue maacutes lenta en condiciones
21
de anaerobiosis que en aerobiosis en el caso de Thiobacillus ferrooxidans (QuiIntana y
col 2001)
Asimismo se ha investigado el efecto de algunos iones sobre la reduccioacuten bioloacutegica del
Cr(VI) Con respecto al sulfato [SO42-] existe una analogiacutea estructural y de carga entre
este anioacuten [SO42-] y el ioacuten cromato [CrO4
2-] por lo que puede establecerse una
competencia entre ellos por los transportadores de sulfato existentes en las ceacutelulas
influyendo asiacute en la reduccioacuten del cromo hexavalente (Smith y Gadd 2000)
En cultivos aerobios no se ha reportado inhibicioacuten por sulfato en la reduccioacuten del cromo
hexavalente (Wang y Xiao 1995 Ishibashi y col 1990 Wang 2000) En contraste se
ha informado que en cultivos anaerobios el sulfato afecta la reduccioacuten del Cr(VI) debido
a que este anioacuten compite con el cromato como aceptor final de electrones (Garbisu y
col 1998)
Por otro lado en un estudio realizado con varios geacuteneros de levadura (Pichia Candida
Debaryomyces Saccharomyces Schwanniomyces Cryptococcus Hansenula) que tienen
capacidad para acumular cromo se encontroacute que el sulfato afectoacute la tolerancia de las
levaduras al Cr(VI) siendo mayor o menor el efecto en funcioacuten de la levadura en estudio
(Kaszycki y col 2003)
Otros iones que se han investigado son el Mg2+ Mn2+ Ca2+ y el Fe En cultivos con
ceacutelulas pasivas (resting cells) de Agrobacterium radiobacter se encontroacute que debe
controlarse principalmente la cantidad de fierro para incrementar la capacidad de
reduccioacuten del microorganismo (Llovera y col 1993)
22
Los donadores de electrones que se han utilizado principalmente en los estudios de
reduccioacuten del Cr(VI) son compuestos alifaacuteticos y aromaacuteticos carbohidratos de bajo peso
molecular aminoaacutecidos y aacutecidos orgaacutenicos (Wang y Xiao 1995 Wang 2000 Smith y
col 2002 Ksheminska y col 2006) El descubrimiento de microorganismos que son
capaces de reducir el cromo hexavalente utilizando una amplia variedad de fuentes de
carbono y energiacutea favorece su uso en procesos de remediacioacuten in situ (Smith y col
2002)
Para la reduccioacuten del cromo hexavalente es conveniente conocer el pH y la temperatura
oacuteptimos para el crecimiento de los microorganismos (Wang 2000 Shakoori y col 2000
Camargo y col 2002 Faisal y Hasnain 2004) En cultivos de Streptomyces griseus se
estudioacute la reduccioacuten del Cr(VI) en el intervalo de valores de pH de 4 a 8 y de
temperatura de 28 a 50 degC obtenieacutendose la mayor reduccioacuten a un pH de 6-7 y a una
temperatura de 28 degC (Laxman y More 2002)
En cultivos de Ochrobactrum sp se trabajoacute en el intervalo de temperatura de 30 a 45 degC
y de pH de 6 a 8 obtenieacutendose la mayor reduccioacuten del Cr(VI) y el crecimiento celular
maacutes alto a 35 degC y a un pH de 7 (Thacker y Madamwar 2005) En estudios realizados
con Escherichia coli ATCC 33456 se ensayoacute la reduccioacuten del Cr(VI) en el intervalo de
valores de pH de 3-8 y de temperatura de 40-60 degC encontraacutendose que el pH y la
temperatura de incubacioacuten oacuteptimos fueron de 7 y 37 degC respectivamente (Bae y col
2000)
Se ha observado que la concentracioacuten inicial de Cr(VI) influye en la velocidad de
reduccioacuten del metal (Wang 2000) La velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) exhibida por los
23
cultivos de Bacillus sp Pseudomonas fluorescens LB300 (Wang y Xiao 1995)
Ochrobactrum sp (Thacker y Madamwar 2005) y de Candida sp LBM2 (Juvera-Espinosa
y col 2006) se incrementoacute conforme aumentoacute la concentracioacuten inicial de Cr(VI) En
contraste la velocidad de reduccioacuten de Bacillus sp Arthrobacter sp (Megharaj y col
2003) y de Trichoderma viride (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006) disminuyoacute al
incrementar la concentracioacuten inicial de cromo hexavalente
Para obtener una reduccioacuten importante del Cr(VI) se requieren altas concentraciones de
biomasa (Wang 2000) La concentracioacuten inicial de biomasa tiene efecto sobre la
velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) de Bacillus sp y Pseudomonas fluorescens LB300 ya
que eacutesta aumentoacute al haber mayor cantidad de biomasa inicial (Wang y Xiao 1995) Este
mismo efecto se observoacute en cultivos de una cepa bacteriana gram positiva a la que se le
denominoacute como cepa ATCC 700729 (Shakoori y col 2000)
El potencial redox se ha medido en algunos estudios realizados con diferentes
microorganismos y condiciones de cultivo para determinar su efecto sobre la reduccioacuten
del Cr(VI) (Komori y col 1989 Turick y col 1996 McLean y Beveridge 2001) sin
embargo no se ha reportado un intervalo oacuteptimo de potencial redox para llevar a cabo la
reduccioacuten del Cr(VI) a su forma menos toacutexica (Wang 2000)
En algunos estudios se ha evaluado la influencia de algunos metales (Mn Ni Zn Pb Cu
Co As Se y Hg) sobre la reduccioacuten del Cr(VI) ya que las cepas microbianas que sean
resistentes a uno o varios metales y que sean capaces de reducir el Cr(VI) seriacutean de gran
utilidad en la biorremediacioacuten de efluentes industriales (Faisal y Hasnain 2004 Cheung
y Gu 2005 Thacker y col 2006) En estudios con Escherichia coli ATCC 33456 se
24
investigoacute el efecto de varios iones (Hg2+ Ag2+ Mn2+ Zn2+ Pb2+ Cd2+ Ca2+ y Mg2+) que
pueden estar presentes junto con el Cr(VI) en efluentes industriales Con el magnesio
se observoacute un ligero aumento en la actividad reductora del microorganismo mientras
que con el mercurio se inhibioacute por completo su capacidad de reduccioacuten (Bae y col
2000)
En el caso particular de microorganismos filamentosos los esfuerzos de corte pueden
causar dantildeo fiacutesico a las ceacutelulas y como consecuencia afectar su capacidad de reduccioacuten
de Cr(VI) En cultivos de Trichoderma viride realizados en matraz y en un reactor
agitado mecaacutenicamente con un impulsor se observoacute que los micelios eran de menor
tamantildeo cuando el hongo se cultivaba en el reactor Asimismo el incremento celular y la
eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidos en matraz fueron superiores a los alcanzados
en el reactor agitado con un impulsor Estos resultados sugirieron que las fuerzas de
cizalla creadas por el impulsor fragmentan el micelio y afectan la viabilidad celular y la
capacidad de reduccioacuten del microorganismo (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
16 Sistemas de reaccioacuten
En la mayoriacutea de los estudios sobre reduccioacuten de Cr(VI) el sistema de reaccioacuten que maacutes
se ha empleado es el cultivo por lote Este sistema es ampliamente utilizado en procesos
biotecnoloacutegicos para la produccioacuten de biomasa y de metabolitos de intereacutes industrial La
duracioacuten de este tipo de cultivo depende del tamantildeo del inoacuteculo de las condiciones
ambientales como el pH los componentes del medio de cultivo y la temperatura
Aunque su operacioacuten es sencilla ofrece pocas opciones de control de las variables
intensivas de intereacutes (concentracioacuten de biomasa sustrato producto) en comparacioacuten
con otros sistemas de reaccioacuten
25
(httpfaiunneeduarbiologiamicroindcultivo20y20biorreactoreshtm) Asimismo
despueacutes de un cultivo por lote se requiere de un periodo para la descarga limpieza y
esterilizacioacuten del equipo asiacute como para el arranque de un nuevo cultivo por lote lo que
disminuye la productividad global del proceso (Wang y col 1979)
Pocos son los estudios relacionados con la reduccioacuten del Cr(VI) en los que se ha
trabajado con otros sistemas de reaccioacuten tales como con el cultivo continuo (DeLeo y
Ehrlich 1994 Bhide y col 1996 Chirwa y Wang 1997 Bae y col 2000) y el cultivo
por lote alimentado o fed-batch (Fujii y col 1990 Fujie y col 1996)
El cultivo continuo permite alcanzar un estado estacionario independiente del tiempo en
el que los microorganismos presentan un crecimiento consumo de sustrato y produccioacuten
constantes por lo que es posible obtener una alta productividad o velocidad volumeacutetrica
(httpuserpagesumbcedu gferre1bmcohtml) En este sistema es posible controlar
la cantidad de biomasa utilizando un uacutenico nutriente limitante del crecimiento (Wang y
col 1979)
A pesar de que el cultivo continuo tiene la desventaja de ser susceptible de contaminarse
debido a los periodos prolongados de operacioacuten (Stanbury 1984) en estudios con Cr(VI)
se minimizariacutea lo anterior ya que este estado de oxidacioacuten del cromo es altamente toacutexico
para la mayoriacutea de los microorganismos auacuten a bajas concentraciones
El cultivo por lote alimentado se utiliza industrialmente para la produccioacuten de varios
productos bioloacutegicos de intereacutes (enzimas antibioacuteticos vitaminas aminoaacutecidos entre
otros) El sistema es uacutetil para obtener una alta concentracioacuten de metabolitos asociados
26
al crecimiento ya que es posible alcanzar una alta concentracioacuten de biomasa aunque
tambieacuten se emplea para la produccioacuten de compuestos no asociados al crecimiento como
por ejemplo de algunos antibioacuteticos Su uso tambieacuten se recomienda cuando se trabaja
con compuestos toacutexicos o de muy baja solubilidad y no requiere mayor equipo que el
utilizado en un cultivo por lote (httpuserpagesumbcedu gferre1fedbatchhtml)
Otras ventajas de este sistema son 1) los tiempos totales del proceso fermentativo son
menores y no requiere de un nuevo inoacuteculo cada vez que se repite el ciclo en
comparacioacuten con un cultivo por lote y 2) menor riesgo de contaminacioacuten que el cultivo
continuo (Roukas 1993)
27
2 OBJETIVOS
21 Objetivos generales
1) Determinar el efecto del ioacuten sulfato sobre el crecimiento celular consumo de glucosa y
reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
2) Realizar el estudio cineacutetico del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de
Cr(VI) de Candida sp en sistemas por lote y lote repetido en un reactor airlift
3) Seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten del Cr(VI) por
Candida sp
22 Objetivos especiacuteficos
a) Determinar el efecto de la concentracioacuten de sulfato de amonio sobre el crecimiento
celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
b) Evaluar el crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote y lote repetido
c) Realizar el estudio cineacutetico del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa
d) Evaluar el crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote alimentado repetido
e) Seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes conveniente para la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp
28
3 MATERIAL Y MEacuteTODOS
31 Microorganismo
Para el desarrollo del presente trabajo se utilizoacute una levadura que se aisloacute a partir del
agua residual de una industria curtidora de pieles que se encuentra ubicada en la Ciudad
de Leoacuten Guanajuato Mediante teacutecnicas morfoloacutegicas y bioquiacutemicas que fueron
realizadas en el Laboratorio de Micologiacutea de la Facultad de Medicina de la UNAM asiacute
como por teacutecnicas de biologiacutea molecular que fueron llevadas a cabo en el Laboratorio de
Microbiologiacutea General de la Escuela Nacional de Ciencias Bioloacutegicas se determinoacute que la
levadura pertenece al geacutenero Candida La amplificacioacuten y secuenciacioacuten del dominio
D1D2 del gen 26S rDNA de la levadura aislada reveloacute que estaacute relacionada con Candida
petrohuensis (GenBank accession number U45819) Candida acudensis (GenBank
accession number U45810) y Candida drimydis (GenBank accession number U45815)
con un nivel de confidencia del 896 La baja similitud de las secuencias parciales
conocidas del gen 26S rDNA y la de la cepa de levadura empleada en este trabajo podriacutea
sugerir que es una cepa no identificada no registrada en el GenBank por lo que se le
denominoacute como Candida sp La relacioacuten filogeneacutetica de la cepa de Candida usada en este
estudio y la de otras especies de levadura se muestra en la figura 1
29
Figura 1 Relaciones filogeneacuteticas de la levadura
AJ508572Cmucifera
AB041003Candida
AB041006Cmucifera
AB041005Stephanoascus
U45822Cchiropterorum
U40103Arxula
U40094Arxula
AY283605Sympodiomyces
AF017247Trichomonascus
U40110Blastobotrys
AY442294Sympodiomyces
U40096Sympodiomyces
AY559042Cmokoenaii
FGSFEP
U45819Cpetrohuensis
U45810Cancudensis
U45815Cdrimydis
U45806Cbondarzewiae
U45816Ctepae
U45812Candida
U45812Cantillancae
U45811Csantjacobensis
U76531Stephanoascus
AB196536Stephanoascus
U70245Cedax
AF017236Cbertae
U45835Cvaldiviana
AY618511Cnovakii
U45807Ccastrensis
U45826Cpaludigena
AF294910Cbituminiphila
U45829Pichia
U84241Zygozyma
U76350Myxozyma
U76527Lipomyces
U45804Debaryomyces
U75524Pichia
U68552Saccharomyces
AY545582Naumovia
AY007888Saccharomyces 100 100
43 100
100
100
43 100
100
72
100
86
95
95
100
91
58 69
99
98
84
92
60
63
54
40
56
37
49
21
39
61
16
002
30
32 Propagacioacuten del inoacuteculo
La composicioacuten quiacutemica del medio de cultivo basal que se utilizoacute en este trabajo para la
propagacioacuten del inoacuteculo y para los experimentos de remocioacuten de Cr(VI) en diferentes
sistemas de reaccioacuten los cuales fueron realizados en un reactor neumaacutetico se muestra
en la tabla 5
Tabla 5 Composicioacuten quiacutemica del medio de cultivo
Compuesto Concentracioacuten
(gL)
Glucosa 100
(NH4)2SO4 30
KH2PO4 10
MgSO4 7H2O 03
KCl 01
Extracto de levadura 01
CaCl2 005
FeCl3 0001
Para los experimentos en los que se determinoacute el efecto del sulfato sobre la tolerancia de
Candida sp al Cr(VI) y la reduccioacuten del mismo el inoacuteculo se propagoacute en el mismo medio
de cultivo pero el (NH4)2SO4 se reemplazoacute por NH4Cl (243 gL) y el MgSO47H2O por
MgCl26H2O (0247 gL)
31
El pH inicial de los medios de cultivo fue de aproximadamente 60 A matraces
Erlenmeyer de 1000 mL que conteniacutean 200 mL de medio de cultivo se les adicionoacute una
asada de Candida sp y posteriormente se incuboacute con agitacioacuten constante a 28-30 ordmC
durante 42 h A continuacioacuten la biomasa se separoacute por centrifugacioacuten a 1500 rpm a
4 degC durante 15 min bajo condiciones de asepsia El paquete celular resultante se lavoacute
dos veces con agua destilada esteacuteril para eliminar los componentes del medio de cultivo
y los residuos celulares El paquete celular se resuspendioacute en un pequentildeo volumen de
agua destilada esteacuteril y se homogeneizoacute La suspensioacuten celular resultante se utilizoacute como
inoacuteculo para los experimentos realizados en este trabajo
Para la conservacioacuten de la levadura se usaron viales con medio inclinado de YPG
(glucosa 2 peptona de caseiacutena 1 extracto de levadura 1 y agar bacterioloacutegico
2) los cuales se mantuvieron en refrigeracioacuten a 4 degC Las resiembras se realizaron
cada dos meses
33 Reactores airlift
Se utilizoacute un contactor gas-liacutequido (reactor agitado neumaacuteticamente) del tipo airlift con
tubo conceacutentrico (figuras 2a y 2b) con un volumen total de 52 litros y un posible
volumen de operacioacuten de 42 litros para realizar los estudios de remocioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en sistemas por lote lote repetido lote alimentado y lote alimentado
repetido El reactor estaacute hecho de vidrio Pyrex y consta de una base columna y una
tapa Entre la base y la columna asiacute como entre la columna y la tapa se colocaron
empaques de neopreno para evitar el contacto vidrio-vidrio asiacute como para evitar fugas
de aire yo de medio de cultivo Las secciones se unieron mediante bridas de Nylamid La
32
base del reactor tiene un difusor del tipo placa plana de vidrio poroso para el suministro
de aire
33
Oliva para
toma de muestra
Aire
Tubo conceacutentrico (liso con
perforaciones de
malla)
Filtro de aire
Venteo
Difusor de vidrio poroso(poro fino)
Difusor de vidrio
poroso (poro fino)
Aire
50deg
4
65
3 m
m
77 mm
11
5
mm
128 mm
88 mm
15
mm
70 mm
4
50
3 m
m
Figuras 2a y 2b Reactor del tipo airlift con tubo conceacutentrico
34
En el interior del reactor se colocoacute un tubo conceacutentrico liso (sin perforaciones) de vidrio
Pyrex un tubo conceacutentrico de vidrio Pyrex con perforaciones circulares (4 mm de
diaacutemetro) o un tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable No 316 (grado
alimentario nuacutemero de malla = 20 abertura = 3344 mm) los cuales tienen la misma
longitud y diaacutemetro El tipo de tubo que se utilizoacute para los experimentos de reduccioacuten
del Cr(VI) dependioacute del sistema de reaccioacuten que se ensayoacute el tubo conceacutentrico liso se
utilizoacute para llevar a cabo experimentos en cultivos por lote y lote repetido el tubo
conceacutentrico con perforaciones se empleoacute para realizar cultivos por lote lote alimentado y
lote alimentado repetido y el tubo de malla metaacutelica se usoacute para cultivos por lote
Para el cultivo continuo de una etapa se utilizoacute un reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
con un volumen total de 650 mL y un posible volumen de operacioacuten de 550 mL el cual
tiene las mismas relaciones geomeacutetricas que el reactor antes mencionado
En todos los sistemas de reaccioacuten ensayados se suministroacute aire en el interior del tubo
conceacutentrico El aire de entrada se controloacute mediante una vaacutelvula reguladora de presioacuten y
su velocidad de flujo se midioacute con un rotaacutemetro
34 Meacutetodos experimentales
341 Efecto de la concentracioacuten de sulfato sobre el crecimiento celular
consumo de glucosa remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp
Se evaluoacute el efecto de la concentracioacuten de sulfato sobre el crecimiento celular consumo
de glucosa remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivos por lote a
nivel matraz Para estos experimentos parte o todo del (NH4)2SO4 y del MgSO4 7H2O del
medio de cultivo basal (tabla 5) se reemplazoacute con NH4Cl y MgCl26H2O respectivamente
35
a fin de mantener las mismas concentraciones iniciales de nitroacutegeno (454 mM) y de
magnesio (1217 mM) en todos los medios de cultivo ensayados
Se prepararon tres series de matraces Erlenmeyer de 500 mL que conteniacutean 135 mL de
medio de cultivo con diferentes concentraciones iniciales de sulfato Las
concentraciones de sulfato ensayadas fueron las siguientes 00 1217 25 50 100
150 200 y 2392 mM (esta uacuteltima concentracioacuten corresponde a la del ioacuten sulfato
presente en el medio de cultivo basal) Estas concentraciones no incluyen la cantidad de
sulfato proporcionado por algunos otros componentes del medio de cultivo (provenientes
del extracto de levadura yo de sales inorgaacutenicas) ya que el Laboratorio Central de
Instrumentacioacuten del Departamento de Biofiacutesica de la Escuela Nacional de Ciencias
Bioloacutegicas IPN determinoacute que la concentracioacuten de este ioacuten en el medio de cultivo que
conteniacutea cloruro de amonio y cloruro de magnesio como uacutenicas fuentes de nitroacutegeno
inorgaacutenico y de magnesio respectivamente era de 23 mgL (002 mM) A este uacuteltimo
medio de cultivo es al que se le denominoacute en el presente trabajo como ―0 mM de ioacuten
sulfato Para la cuantificacioacuten del ioacuten sulfato se utilizoacute el meacutetodo recomendado por la
Norma Oficial Mexicana NMX-AA-74-1981 (Secretariacutea de Comercio y Fomento Industrial
1981) El pH inicial de todos los medios de cultivo ensayados fue de aproximadamente
60
A una serie de matraces con medio de cultivo no se le adicionoacute Cr(VI) con la finalidad de
determinar el efecto del sulfato sobre el crecimiento celular y consumo de glucosa por la
levadura en ausencia del metal (cultivos control) A los matraces de la segunda y tercera
serie se les adicionoacute un determinado volumen de una solucioacuten stock esteacuteril de cromato
de potasio (20 gL) para obtener concentraciones iniciales de Cr(VI) de 17 y 33 mM
36
respectivamente Los matraces fueron inoculados con un determinado volumen de
suspensioacuten celular concentrada a fin de que la concentracioacuten inicial de biomasa de todos
los cultivos fuera de aproximadamente 1 mgmL Los matraces se colocaron en un bantildeo
metaboacutelico con agitacioacuten constante a 28-30 degC Se recolectaron muestras a diferentes
tiempos de incubacioacuten a las que se les determinoacute la concentracioacuten de biomasa glucosa
Cr(VI) y cromo total residual asiacute como el pH
342 Controles abioacuteticos
Se utilizaron controles libres de ceacutelulas con el propoacutesito de determinar si el Cr(VI) era
reducido abioacuteticamente a Cr(III) por los componentes del medio de cultivo
Durante los experimentos de remocioacuten de Cr(VI) con ceacutelulas viables (cultivos problema)
se observoacute que el pH de los medios de cultivo disminuyoacute desde aproximadamente 6
hasta 25-42 dependiendo de la concentracioacuten de sulfato y de cromo utilizada Como
se sabe que los pHrsquos bajos favorecen que la materia orgaacutenica (donadores de electrones)
reduzca el Cr(VI) a Cr(III) en este trabajo se llevaron a cabo experimentos sin biomasa
de Candida sp (controles libres de ceacutelulas) a distintos valores de pH (25 3 4 5 y 6) y
a las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas (17 y 33 mM) para determinar
el grado de reduccioacuten causado por los constituyentes del medio de cultivo
Como controles libres de ceacutelulas se utilizaron matraces Erlenmeyer que conteniacutean medio
de cultivo a los que se les adicionoacute un volumen determinado de una solucioacuten stock
esteacuteril de cromato de potasio (20 gL) para obtener concentraciones iniciales de Cr(VI)
de 17 y 33 mM A continuacioacuten se ajustoacute el pH del medio de cultivo a alguno de los
37
valores antes mencionados La adicioacuten de la solucioacuten stock esteacuteril de cromato de potasio
y el ajuste del pH se realizoacute en condiciones de asepsia
Los controles abioacuteticos se incubaron a las mismas condiciones que los matraces
problema Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se les
determinoacute la concentracioacuten de Cr(VI)
343 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa
remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivo por lote en un
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Se realizoacute la evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa remocioacuten
de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso (sin perforaciones) El cultivo por lote se llevoacute a cabo con 4 litros de
medio de cultivo basal con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM [igual a 78
mgL de Cr(VI)] y con un pH inicial de aproximadamente 60 El reactor se inoculoacute con
un volumen determinado de suspensioacuten celular concentrada para obtener una
concentracioacuten inicial de biomasa cercana a 12 mgmL Se suministroacute aire con un flujo
volumeacutetrico de 4 litrosmin equivalente a 1 vvm (vvm = volumen de aire por volumen
de medio de cultivo por minuto)
El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que el nivel de Cr(VI) residual fue
despreciable Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se
les determinoacute la concentracioacuten de biomasa de glucosa Cr(VI) y cromo total residual asiacute
como el pH
38
344 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote repetido en un reactor
airlift con tubo conceacutentrico liso
Los sistemas por lote repetido se iniciaron con un cultivo por lote Cuando se alcanzaron
niveles bajos de Cr(VI) residual en el primer cultivo por lote se procedioacute a recolectar un
determinado volumen de medio y se reemplazoacute con medio fresco que teniacutea una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM A continuacioacuten el sistema se operoacute nuevamente por
lote (segundo cultivo por lote o cultivo por lote repetido) hasta que ya no se detectaron
variaciones considerables en la concentracioacuten de Cr(VI) residual
Se ensayaron tres diferentes relaciones de recambio de medio de cultivo (f = volumen de
medio recolectadovolumen inicial de medio liacutequido en el reactor) las cuales fueron de
04 06 y 08 Para las dos uacuteltimas relaciones se realizaron experimentos sin ajustar el
pH del medio al inicio del segundo cultivo por lote (lote repetido) asiacute como ajustando el
pH a 60 Para la primera relacioacuten (f = 04) soacutelo se realizoacute el experimento sin ajustar el
pH del medio al inicio del cultivo por lote repetido ya que los experimentos realizados a
las relaciones de recambio de 06 y 08 mostraron que la eficiencia y velocidad de
reduccioacuten de Cr(VI) de los cultivos por lote repetido eran mayores cuando no se ajustaba
el pH
Durante los cultivos por lote repetido se recolectaron muestras a diferentes tiempos de
incubacioacuten a las cuales se les determinoacute la concentracioacuten de biomasa glucosa Cr(VI) y
el pH Con los datos obtenidos se estimaron algunas variables cineacuteticas que se utilizaron
para seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para los fines que se persiguen en
este trabajo
39
345 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa en un
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Para el cultivo continuo de una etapa se utilizoacute un biorreactor airlift con tubo conceacutentrico
liso con un volumen de operacioacuten de 500 mL Al reactor se le suministroacute continuamente
medio de cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM por medio de una
bomba peristaacuteltica Se ensayaron dos flujos volumeacutetricos de medio de cultivo de 378 y
50 mLh que corresponden a velocidades de dilucioacuten de 00076 h-1 y de 00100 h-1
respectivamente
Con los datos obtenidos a la velocidad de dilucioacuten de 00076 h-1 se estimoacute la velocidad
volumeacutetrica global y la eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) las cuales se utilizaron
para seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp
346 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular y la remocioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo conceacutentrico de
malla de acero inoxidable y de vidrio perforado
Se realizaron cultivos por lote en el reactor airlift en el cual se colocoacute un tubo conceacutentrico
de malla de acero inoxidable No 316 (grado alimentario calibre No 20 abertura =
3344 mm) o un tubo conceacutentrico de vidrio con perforaciones circulares de
aproximadamente 4 mm de diaacutemetro Al reactor se le adicionaron 4 litros de medio de
cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM [igual a 78 mgL de Cr(VI)] y
un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada para obtener una
40
concentracioacuten inicial de biomasa de aproximadamente 12 mgmL El pH inicial del medio
fue de aproximadamente 60 Se ensayaron dos flujos de aire de 05 y 1 vvm
El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que el nivel de Cr(VI) residual fue bajo Se
recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se les determinoacute la
concentracioacuten de biomasa y de Cr(VI) residual Con los datos obtenidos se estimaron
algunas variables cineacuteticas que sirvieron como criterio de seleccioacuten para determinar el
tubo conceacutentrico maacutes adecuado para llevar a cabo los cultivos por lote alimentado y lote
alimentado repetido
347 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote
alimentado repetido en un reactor airlift
Para los cultivos por lote alimentado y lote alimentado repetido se utilizoacute el reactor airlift
con el tubo conceacutentrico seleccionado previamente Los cultivos por lote alimentado se
iniciaron con un cultivo por lote utilizando las condiciones iniciales mencionadas en el
inciso 446 y una aireacioacuten de 05 vvm El cultivo por lote se mantuvo en operacioacuten
hasta que la concentracioacuten de Cr(VI) residual fue baja
A continuacioacuten el reactor se drenoacute hasta alcanzar un volumen de liacutequido en el reactor de
25 litros y se inicioacute el suministro continuo de medio de alimentacioacuten con una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM La alimentacioacuten se mantuvo hasta que se alcanzoacute un
volumen de medio liacutequido en el reactor de 37 litros (primer cultivo por lote alimentado)
41
Posteriormente el reactor se volvioacute a drenar hasta obtener un volumen de medio de 25
litros y enseguida se volvioacute a suministrar continuamente medio de cultivo basal con una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM utilizando el mismo flujo de alimentacioacuten que para el
primer cultivo por lote alimentado El suministro de medio se mantuvo hasta alcanzar un
volumen de liacutequido en el reactor de 375-40 litros (segundo cultivo por lote alimentado o
cultivo por lote alimentado repetido)
Se ensayaron dos flujos de alimentacioacuten de 659 y 1343 mLh que representan cargas
maacutesicas de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh
Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las cuales se les
determinoacute la concentracioacuten de biomasa de glucosa y Cr(VI) residual asiacute como el pH
Con los datos obtenidos se estimaron las velocidades volumeacutetricas globales y las
eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI)
35 Meacutetodos analiacuteticos
351 Determinacioacuten de la concentracioacuten de biomasa
La concentracioacuten celular se determinoacute mediante el peso seco de la masa celular Las
muestras recolectadas se filtraron a traveacutes de membranas de fibra de vidrio (Whatman
GFA) con un diaacutemetro de poro de 16 m las cuales se colocaron previamente puestas a
peso constante Posteriormente las membranas se colocaron en una estufa a 95 degC
hasta alcanzar un peso constante Los filtrados se utilizaron para determinar la
concentracioacuten de glucosa Cr(VI) y cromo total residual asiacute como el pH
352 Determinacioacuten de la concentracioacuten de glucosa
42
Se determinoacute mediante un meacutetodo enzimaacutetico empleando a la glucosa oxidasa y
peroxidasa (Worthington Biochemical Corporation 1972)
Principio El meacutetodo se basa en que la glucosa es oxidada a aacutecido glucoacutenico por la
glucosa oxidasa la cual cataliza la siguiente reaccioacuten
-D-glucosa + H2O + O2 Aacutecido D-glucoacutenico + H2O2
El peroacutexido de hidroacutegeno generado reacciona con el sistema peroxidasa - orto-
dianisidina dando como resultado la oxidacioacuten de la orto-dianisidina y la produccioacuten de
agua de acuerdo con la siguiente reaccioacuten
H2O2 + orto-dianisidina (reducida) ortondashdianisidina (oxidada) + H2O
peroxidasa
La orto-dianisidina oxidada presenta un color pardo que en medio aacutecido vira a color
rosa la cual se lee a una longitud de onda de 540 nm (figura 3)
Figura 3 Orto-dianisidina (33rsquo ndash dimetoxidibencidina)
H2N NH2
OCH3
OCH3
43
353 Determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo hexavalente
La concentracioacuten de cromo hexavalente se determinoacute por la teacutecnica de la 15-
difenilcarbohidrazida siguiendo los procedimientos descritos en el meacutetodo 8023 del Hach
Water Analysis Handbook (2002) Este meacutetodo estaacute aprobado por la EPA (Environmental
Protection Agency) (Hach 2002) y por la Norma Oficial Mexicana NMX-AA-044-SCFI-
2001 (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NMX-AA-044-SCFI-
2001)
Principio Se utilizoacute un reactivo en polvo llamado ChromaVer3 el cual contiene una
solucioacuten buffer aacutecida combinada con la 15-difenilcarbohidrazida Este uacuteltimo compuesto
reacciona con el cromo hexavalente dando un compuesto de color puacuterpura (figura 4) El
meacutetodo es aplicable para el agua ya sea fresca o de muestras de agua residual La
intensidad del color es ldirectamente proporcional a la concentracioacuten de cromo
hexavalente presente
Figura 4 Reaccioacuten de la 15-difenilcarbohidrazida con el cromo hexavalente
+ Cr 6+
Compuesto colorido
puacuterpura
N N
Cr O
C R
O
N N
H H
C R
15-difenilcarbohidrazida
2 N N N
H H
N C
H O
H
44
354 Determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo total
La determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo total de los filtrados de las muestras
recolectadas (cromo total en solucioacuten) se realizoacute por espectroscopiacutea de absorcioacuten
atoacutemica con flama de acetileno-aire (SpectrAA220 FS Varian Inc)
Para determinar la cantidad de cromo retenido por la biomasa de Candida sp las ceacutelulas
fueron lavadas con agua desionizada deshidratadas y posteriormente fueron digeridas
con aacutecido niacutetrico concentrado La solucioacuten obtenida se enfrioacute a temperatura ambiente y
se le adicionoacute agua desionizada hasta obtener un volumen final de 50 mL Este
procedimiento estaacute descrito en la Norma Oficial Mexicana NMX-AA-051-SCFI-2001
(Secretariacutea de Economiacutea 2001) La concentracioacuten de cromo total de la solucioacuten
resultante se determinoacute en un espectrofotoacutemetro de absorcioacuten atoacutemica con un horno de
grafito (SpectrAA220 FS Varian Inc)
355 Determinacioacuten del pH
Se realizoacute con un potencioacutemetro marca Oakton
45
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Meta No 1 Determinar el efecto del ioacuten sulfato sobre la reduccioacuten
de Cr(VI)
41 Efecto del sulfato sobre el crecimiento celular consumo de glucosa
remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp
411 Evaluacioacuten de la influencia del sulfato sobre el crecimiento celular de
Candida sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
Se determinoacute el efecto de ocho concentraciones diferentes de sulfato (00 1217 25
50 100 150 200 y 2392 mM) sobre el crecimiento celular de Candida sp cuando
eacutesta se cultivoacute por lote a nivel matraz en medios de cultivo sin Cr(VI) y con
concentraciones iniciales del metal de 17 y 33 mM Para visualizar mejor el efecto las
curvas de crecimiento celular se construyeron utilizando la relacioacuten xxo (x =
concentracioacuten celular a un determinado tiempo de incubacioacuten xo = concentracioacuten inicial
de biomasa) como variable dependiente y el tiempo de incubacioacuten (t) como variable
independiente (graacuteficas de xxo vs t) En cada una de las curvas de crecimiento se trazoacute
una liacutenea horizontal a una relacioacuten xxo de 10 para observar si ocurriacutea crecimiento o
lisis celular
En la figura 5 se muestran las curvas de crecimiento celular de Candida sp cuando eacutesta
se cultivoacute en medios de cultivo con diferentes concentraciones de sulfato y sin Cr(VI) Se
observa que el crecimiento de Candida sp fue muy semejante a las diferentes
concentraciones de sulfato ensayadas La levadura fue capaz de crecer en el medio de
cultivo al que no se le adicionoacute sulfato de amonio y sulfato de magnesio (0 mM de
46
SO42-) lo cual sugiere que la cantidad de sulfato proporcionado por otros componentes
del medio de cultivo ndash por ejemplo provenientes del extracto de levadura yo de
impurezas contenidas en las sales inorgaacutenicas adicionadas al medio de cultivo (002
mM) mdash fue suficiente para permitir un adecuado crecimiento de la levadura Los
resultados tambieacuten mostraron que la adicioacuten de sulfato en forma de sales inorgaacutenicas
[(NH4)2SO4 o Mg(SO4)7H20] no tuvo alguacuten efecto inhibidor o estimulador del crecimiento
celular
Figura 5 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo sin Cr(VI)
En la figura 6 se presentan las curvas de crecimiento de Candida sp que se obtuvieron
cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo con una concentracioacuten inicial de
Cr(VI) de 17 mM a las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas En la figura se
aprecia lo siguiente 1) A una concentracioacuten de sulfato de 0 mM ocurrioacute lisis celular 2)
el crecimiento neto de la levadura fue praacutecticamente nulo a una concentracioacuten de sulfato
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
47
de 1217 mM 3) el crecimiento de la levadura fue evidente a partir de una
concentracioacuten de sulfato de 25 mM y 4) en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de
10 a 2392 mM el crecimiento de la levadura fue muy semejante y superior al alcanzado
a una concentracioacuten de sulfato de 5 mM Asimismo cuando se utilizaron concentraciones
de sulfato de 10 a 2392 mM se alcanzaron niveles de concentracioacuten de biomasa
similares a los obtenidos en ausencia del metal (cultivos control) (figuras 5 y 6) De
estos resultados es evidente que a medida que se incrementoacute la concentracioacuten de
sulfato los efectos toacutexicos del Cr(VI) sobre el crecimiento de la levadura disminuyeron
hasta que eacutestos fueron praacutecticamente nulos es decir la tolerancia de la levadura al
Cr(VI) aumentoacute conforme se incrementoacute la concentracioacuten de sulfato en el medio de
crecimiento de Candida sp
Figura 6 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo con 17 mM de Cr(VI)
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
48
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM ocurrioacute lisis celular
cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo con concentraciones de sulfato en el
intervalo de 0 a 5 mM (figura 7) en contraste el crecimiento celular de la levadura se
incrementoacute a medida que la concentracioacuten de sulfato aumentoacute de 10 a 2392 mM En
este uacuteltimo intervalo de concentracioacuten de sulfato se observoacute que a tiempos de
incubacioacuten superiores a las 150 h se presentoacute lisis celular A ninguna de las
concentraciones de sulfato ensayadas se alcanzaron densidades celulares semejantes a
las obtenidas en los cultivos sin Cr(VI) o con 17 mM de Cr(VI) lo cual podriacutea deberse a
la mayor toxicidad de los medios de cultivo
Figura 7 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo con 33 mM de Cr(VI)
En la figura 8 se muestra la variacioacuten de la velocidad especiacutefica de crecimiento ( ) y de
lisis celular (kd) de Candida sp en funcioacuten de la concentracioacuten de SO42- a las diferentes
concentraciones de Cr(VI) ensayadas [0 17 y 33 mM]
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
49
Figura 8 Variacioacuten de la velocidad especiacutefica de crecimiento o de lisis celular en funcioacuten
de la concentracioacuten de SO42- a las diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI)
ensayadas
-0002
0
0002
0004
0006
0008
001
0012
0014
0016
0018
0 5 10 15 20 25 30
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Ve
loc
ida
d e
sp
ec
iacutefic
a [
h-1
]
0 mM
17 mM
33 mM
Promedio
Sin Cr(VI)
50
Cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo sin Cr(VI) su velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento se mantuvo praacutecticamente constante en todo el intervalo de
concentracioacuten de sulfato ensayado con un valor promedio de 00144 h-1
A la concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la velocidad especiacutefica de crecimiento de
Candida sp aumentoacute casi linealmente con respecto a la concentracioacuten de sulfato en el
intervalo de concentracioacuten de 0 a 10 mM (r2 = 096) alcanzando un valor maacuteximo de
00142 h-1 a la uacuteltima concentracioacuten de sulfato Esta velocidad especiacutefica de crecimiento
es muy similar a las obtenidas en los cultivos sin Cr(VI) A concentraciones de sulfato
superiores a 5 mM la velocidad especiacutefica de crecimiento se mantuvo praacutecticamente
constante Estos resultados concuerdan con los perfiles de crecimiento celular mostrados
anteriormente
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM se obtuvieron
velocidades especiacuteficas de lisis celular (kd) de 00013 a 00003 h-1 ( = -00013 - 00003
h-1) en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de 0 a 5 mM (figura 8) A
concentraciones de sulfato superiores a 5 mM la velocidad neta de crecimiento fue
positiva La velocidad especiacutefica aumentoacute linealmente en todo el intervalo de
concentracioacuten de sulfato ensayado (r2 = 099) aunque las velocidades alcanzadas fueron
notoriamente inferiores a las obtenidas en los medios de cultivo sin Cr(VI) y con una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM
De los resultados anteriores se deduce que el sulfato desempentildea un papel importante en
la tolerancia (resistencia) de Candida sp a los efectos toacutexicos del Cr(VI) A medida que
se incrementoacute la concentracioacuten de sulfato la levadura fue maacutes tolerante (resistente) a
51
los efectos dantildeinos del Cr(VI) y por consiguiente su crecimiento celular fue menos
afectado Asimismo los resultados muestran que el ―efecto protector del sulfato sobre el
crecimiento de Candida sp dependioacute de la concentracioacuten inicial de Cr(VI)
Pepi y Baldi (1992) investigaron el efecto de diferentes aminoaacutecidos azufrados y del
sulfato sobre la tolerancia de algunas levaduras al Cr(VI) Estos investigadores
encontraron que en presencia de 02 mM de Cr(VI) se requirieron pequentildeas cantidades
de cisteiacutena [001ndash01 mM] para estimular significativamente [10-100] el crecimiento
de Rhodosporidium sp y que para incrementar el crecimiento de Candida sp en hasta
80 fue necesaria una concentracioacuten de cisteiacutena de 01 mM Un comportamiento similar
se observoacute en estas dos cepas cuando se adicionoacute metionina En contraste el
crecimiento celular de Candida famata fue inhibido cuando la levadura se cultivoacute en
medios con concentraciones de cisteiacutena superiores a 005 mM y con 02 mM de Cr(VI)
Por otra parte cuando Candida sp se cultivoacute en medios con diferentes concentraciones
de sulfato (4ndash160 mM) y de Cr(VI) (004ndash02 mM) se encontroacute que el ioacuten sulfato
incrementoacute la tolerancia de la levadura al Cr(VI) El mecanismo general de resistencia al
cromato en Candida sp se atribuyoacute a una reducida captacioacuten (incorporacioacuten) de cromo
(Pepi y Baldi 1992)
Ohtake y col (1987) encontraron que la adicioacuten de altas concentraciones de sulfato
incrementoacute el crecimiento celular de dos cepas de Pseudomonas fluorescens (LB300 y
LB303) en presencia de CrO42- Ademaacutes encontraron que el nivel de resistencia al CrO4
2-
en P fluorescens dependioacute de la fuente de azufre en el medio de cultivo ya que las
ceacutelulas bacterianas que crecieron con cisteiacutena fueron mucho maacutes resistentes al CrO42-
que las ceacutelulas que crecieron sobre sulfato Como el cromato es transportado al interior
52
de las ceacutelulas de Pseudomonas a traveacutes del sistema de transporte del sulfato la habilidad
del sulfato para proteger a las ceacutelulas de P fluorescens LB300 de los efectos inhibitorios
del Cr(VI) se atribuyoacute a que el sulfato inhibioacute competitivamente la captacioacuten del cromato
por las ceacutelulas bacterianas (Ohtake y col 1987)
En contraste la resistencia de Ochrobactrum tritici cepa 5bvI1 al Cr(VI) fue
independiente de la concentracioacuten de sulfato (Branco y col 2004)
412 Evaluacioacuten del efecto del sulfato sobre el consumo de glucosa por Candida
sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
La glucosa fue completamente consumida (eficiencia global de consumo de glucosa =
100) en aproximadamente 83 h de incubacioacuten cuando la levadura se cultivoacute en medios
que no conteniacutean Cr(VI) y con diferentes concentraciones de sulfato No se observoacute
diferencia considerable en el consumo de glucosa a ninguna de las concentraciones de
sulfato utilizadas (figura 9)
53
Figura 9 Variacioacuten en el consumo de glucosa por Candida sp cuando se utilizaron
medios de cultivo con diferentes concentraciones de sulfato y sin Cr(VI)
En los experimentos realizados con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM
(figura 10) se observoacute que la levadura fue capaz de consumir aproximadamente 30-
35 de la glucosa inicialmente adicionada a los medios que conteniacutean sulfato a
concentraciones de 0 y 1217 mM a pesar de que a estas condiciones de cultivo ocurrioacute
lisis celular [0 mM de SO42-] o el crecimiento celular de la levadura fue despreciable
[1217 mM de SO42-] (figura 6) Candida sp consumioacute todo el monosacaacuterido presente
en los medios de cultivo con concentraciones de sulfato superiores a 1217 mM
(eficiencia global de consumo de glucosa del 100) sin embargo el tiempo que se
requirioacute para que eacutesto sucediera disminuyoacute a medida que se incrementoacute la concentracioacuten
de sulfato (figura 10) Los perfiles de consumo de glucosa en los cultivos de Candida
sp fueron semejantes cuando se utilizaron concentraciones de sulfato de 10 a 2392
mM y eacutestos a su vez fueron similares a los obtenidos en los medios de cultivo que no
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa
re
sid
ua
l [
]0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
54
conteniacutean Cr(VI) (figuras 9 y 10) Lo anterior podriacutea deberse a que el crecimiento
celular de estos cultivos fue semejante (figura 6)
Figura 10 Variacioacuten del porcentaje de glucosa residual en los cultivos de Candida sp a
las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas y con 17 mM de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
55
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM los niveles de glucosa
residual disminuyeron a medida que aumentoacute la concentracioacuten de sulfato (figura 11)
Sin embargo estos niveles fueron superiores a los alcanzados a 17 mM de Cr(VI) a
todas las concentraciones de sulfato ensayadas La mayor eficiencia de consumo de
glucosa fue de aproximadamente 80 y se obtuvo a una concentracioacuten de sulfato de
2392 mM
Figura 11 Variacioacuten del porcentaje de glucosa residual en los cultivos por lote de
Candida sp a las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas y con 33 mM de
Cr(VI)
A las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas [17 y 33 mM] se observoacute que
en las primeras horas de incubacioacuten los cultivos de levadura en los que ocurrioacute lisis
celular consumieron una determinada cantidad de glucosa la cual probablemente se
utilizoacute para el mantenimiento de las ceacutelulas vivas
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa r
es
idu
al [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
56
Tanto en los experimentos realizados a 17 como a 33 mM de Cr(VI) se encontroacute que
los cultivos que alcanzaron mayores densidades celulares fueron los que consumieron
mayor cantidad de glucosa y esto ocurrioacute cuando se utilizaron concentraciones altas de
sulfato
413 Evaluacioacuten del efecto del sulfato sobre la variacioacuten del pH de los cultivos
de Candida sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
Los perfiles de variacioacuten del pH de los medios de cultivo fueron muy semejantes a las
diferentes concentraciones de sulfato ensayadas cuando la levadura se cultivoacute en los
medios de cultivo sin Cr(VI) (figura 12) A todas las concentraciones de sulfato
utilizadas el pH disminuyoacute desde aproximadamente 6 hasta 28 en las primeras once
horas de incubacioacuten En el periodo comprendido entre las 11 y las 60 h de incubacioacuten el
pH de los medios de cultivo disminuyoacute ligeramente hasta alcanzar valores cercanos a
25 A tiempos posteriores a 60 h el pH de los medios de cultivo se mantuvo
praacutecticamente constante
Figura 12 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo de Candida sp en ausencia de
Cr(VI) y a las diferentes concentraciones de SO42- ensayadas
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
57
En la figura 13 se muestran los perfiles de variacioacuten del pH de los medios de cultivo
cuando la levadura se cultivoacute a las diferentes concentraciones de sulfato y a una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM El pH de los cultivos disminuyoacute raacutepidamente
en las primeras 15 h de incubacioacuten a todas las concentraciones de sulfato ensayadas La
disminucioacuten del pH fue mayor en los cultivos con las concentraciones maacutes altas de
sulfato lo cual podriacutea deberse a que a estas condiciones la levadura consumioacute mayor
cantidad de glucosa y las densidades celulares alcanzadas fueron maacutes altas A tiempos
de incubacioacuten superiores a 15 h el pH continuoacute disminuyendo pero a menor velocidad
Los niveles de pH maacutes bajos se obtuvieron cuando se utilizaron concentraciones de
sulfato de 5 a 2392 mM alcanzaacutendose valores semejantes a los obtenidos en los medios
sin Cr(VI) (de aproximadamente 25)
Figura 13 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
58
Un comportamiento cualitativo similar se obtuvo cuando Candida sp se cultivoacute en medios
con diferentes concentraciones de sulfato y con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33
mM (figura 14) El pH maacutes bajo se alcanzoacute a concentraciones altas de sulfato [20 y
2392 mM] y fue de aproximadamente 36 el cual es superior a los valores maacutes bajos
que se obtuvieron en los cultivos sin Cr(VI) y con 17 mM de Cr(VI) Esto uacuteltimo podriacutea
deberse a que el incremento de la concentracioacuten celular y el consumo de glucosa fueron
inferiores a los alcanzados con las otras concentraciones de Cr(VI) [0 y 17 mM]
Figura 14 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
414 Efecto del sulfato sobre la remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp
En la figura 15 se muestran las variaciones del porcentaje de Cr(VI) residual de los
cultivos de Candida sp cuando se emplearon diferentes concentraciones de sulfato y
una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM A una concentracioacuten de sulfato de 0 mM
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
59
la remocioacuten de Cr(VI) fue muy baja (de aproximadamente 83) es conveniente
mencionar que a esta concentracioacuten de sulfato (0 mM) y de Cr(VI) (17 mM) ocurrioacute lisis
celular y la levadura consumioacute una pequentildea cantidad de glucosa en las primeras horas
de incubacioacuten La remocioacuten de Cr(VI) se incrementoacute a medida que aumentoacute la
concentracioacuten de sulfato de 0 a 10 mM A partir de esta uacuteltima concentracioacuten de sulfato
los perfiles de remocioacuten de Cr(VI) fueron muy similares y esto podriacutea deberse a que la
densidad celular de los cultivos fueron praacutecticamente iguales Todo o casi todo el Cr(VI)
inicialmente adicionado a los medios de cultivo fue removido cuando se empleoacute una
concentracioacuten de sulfato igual o superior a 25 mM (figura 15)
Figura 15 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
En contraste cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM la levadura
no fue capaz de remover todo el Cr(VI) inicialmente presente en los medios de cultivo a
00
100
200
300
400
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600
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0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
60
ninguna de las concentraciones de sulfato ensayadas (figura 16) Sin embargo los
niveles de Cr(VI) residual disminuyeron a medida que se incrementoacute la concentracioacuten de
sulfato
Figura 16 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
A las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas los cultivos de levadura en los
que ocurrioacute lisis celular en las primeras horas de incubacioacuten [0 mm de SO42- 17 mM de
Cr(VI) y 0-5 mM de SO42- 33 mM de Cr(VI)] fueron capaces de remover una pequentildea
cantidad de Cr(VI) Estos resultados concuerdan con lo reportado por Wang y Shen
(1997) quienes encontraron que la densidad celular de los cultivos de Escherichia coli y
Bacillus sp disminuyoacute continuamente durante el curso de la remocioacuten de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
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1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
61
A las diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI) y de sulfato ensayadas se observoacute
que aunque los niveles de Cr(VI) residual disminuyeron a medida que la incubacioacuten
progresoacute las concentraciones de cromo total en solucioacuten permanecieron casi constantes
a lo largo de todo el periodo de incubacioacuten (aproximadamente el 97 del cromo
inicialmente adicionado a los medios de cultivo estuvo siempre presente en solucioacuten)
Maacutes auacuten el anaacutelisis del contenido de cromo en la biomasa de Candida sp (de muestras
recolectadas al final de los experimentos) reveloacute que uacutenicamente el 29 009 del
cromo total removido por los cultivos fue incorporado en la biomasa
Como se mostroacute anteriormente los cultivos con ceacutelulas viables se iniciaron con un pH de
aproximadamente 60 y eacuteste disminuyoacute durante el tiempo de incubacioacuten hasta valores de
25 ndash 36 dependiendo de la concentracioacuten de sulfato y de Cr(VI) utilizada Como se
sabe que los pHacutes bajos favorecen la reduccioacuten del Cr(VI) por la materia orgaacutenica
(donadores de electrones) en el presente trabajo se llevaron a cabo experimentos sin
biomasa de Candida sp (controles libres de ceacutelulas) a diferentes valores de pH (25 3
4 5 y 6) y a las dos diferentes concentraciones de Cr(VI) ensayadas (17 y 33 mM)
para determinar si los componentes presentes en los medios de cultivo pueden reducir el
Cr(VI) En las figuras 17 y 18 se muestran los perfiles de Cr(VI) residual que se
obtuvieron con los controles abioacuteticos ensayados
62
Figura 17 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los controles libres de
ceacutelulas llevados a cabo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y a diferentes
valores de pH
Figura 18 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los controles libres de
ceacutelulas realizados con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y a diferentes
valores de pH
00
200
400
600
800
1000
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
pH = 25
pH = 3
pH = 4
pH = 5
pH = 6
00
200
400
600
800
1000
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
pH = 25
pH = 3
pH = 4
pH = 5
pH = 6
63
A las dos concentraciones de Cr(VI) ensayadas se observoacute una reduccioacuten despreciable
del metal (inferior a 05) en el intervalo de valores de pH de 4 a 6 a un pH de 3 el
porcentaje de reduccioacuten fue de aproximadamente 12 y de 3 cuando el pH fue de
25 Estos resultados sugieren que los componentes de los medios de cultivo
praacutecticamente no redujeron el Cr(VI) a ninguno de los pHrsquos ensayados
En conjunto los resultados antes mostrados indican que el principal mecanismo de
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp fue la biotransformacioacuten (reduccioacuten) del Cr(VI) a
Cr(III) y que la reduccioacuten abioacutetica del Cr(VI) y la captacioacuten de cromo por la biomasa de
la levadura fueron despreciables Asimismo los resultados tambieacuten muestran que la
reduccioacuten del Cr(VI) por los cultivos se debioacute a la actividad metaboacutelica de las ceacutelulas de
Candida sp
En la figura 19 se presentan las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) que se
obtuvieron a las diferentes concentraciones iniciales de sulfato y de Cr(VI) ensayadas Se
aprecia que cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la eficiencia
de reduccioacuten se incrementoacute desde 179 hasta 986 a medida que la concentracioacuten
de sulfato aumentoacute de 0 a 25 mM a concentraciones de sulfato superiores la eficiencia
de reduccioacuten fue del 100 Asimismo en los experimentos realizados a 33 mM de
Cr(VI) la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) aumentoacute desde 83 hasta 84 conforme la
concentracioacuten de sulfato aumentoacute de 0 a 2392 mM
64
Figura 19 Eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por los cultivos de
Candida sp a las diferentes concentraciones de sulfato y de Cr(VI) ensayadas
La velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) tambieacuten fue afectada por la
concentracioacuten de sulfato y de Cr(VI) utilizada (figura 20) Cuando se empleoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten maacutes alta
fue de 098 mg de Cr(VI)Lh y se obtuvo en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de
10 a 2392 mM En cambio la velocidad maacutes alta que se alcanzoacute a 33 mM de Cr(VI) fue
de 044 mg de Cr(VI)Lh y se obtuvo a la maacutexima concentracioacuten de sulfato ensayada
(2392 mM)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 1217 25 5 10 15 20 2392
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Efi
cie
ncia
glo
bal d
e r
ed
uccioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
17 mM
33 mM
65
Figura 20 Velocidades volumeacutetricas globales de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas en los
cultivos de Candida sp a diferentes concentraciones de sulfato y de Cr(VI)
A todas las concentraciones de sulfato ensayadas la eficiencia y velocidad volumeacutetrica de
reduccioacuten de Cr(VI) alcanzadas a una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM fueron
superiores a las obtenidas a 33 mM de Cr(VI) y esto podriacutea deberse a que los efectos
toacutexicos del Cr(VI) sobre la levadura se incrementan a medida que aumenta la
concentracioacuten del metal
De los resultados anteriores es evidente que el sulfato afectoacute la reduccioacuten aeroacutebica de
Cr(VI) por Candida sp Estos resultados difieren con lo reportado por otros
investigadores quienes no han encontrado un efecto inhibidor ni estimulador del sulfato
sobre la reduccioacuten de Cr(VI) en cultivos aeroacutebicos
000
010
020
030
040
050
060
070
080
090
100
0 1217 25 5 10 15 20 2392
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica d
e r
ed
uccioacute
n d
e C
r(V
I)
[mg
de
Cr(
VI)
Lh
]
17 mM
33 mM
66
Ishibashi y col (1990) encontraron que concentraciones de sulfato de hasta 1 mM
incrementaron la resistencia de Pseudomonas putida al cromato pero no tuvieron efecto
sobre la reduccioacuten de eacuteste En cultivos de Bacillus sp (Wang y Xiao 1995) y de
Acinetobacter haemolyticus (Zakaria y col 2006) se observoacute que una concentracioacuten de
sulfato de 10 mM no afectoacute la reduccioacuten de Cr(VI) Liu y col (2006) reportaron que
concentraciones de sulfato de 40 y 80 mgL (0416 y 083 mM) no tuvieron efecto sobre
la reduccioacuten aeroacutebica de Cr(VI) por Bacillus sp XW-4
En contraste el sulfato generalmente tiene efecto sobre la reduccioacuten bacteriana del
cromato bajo condiciones de anaerobiosis lo cual podriacutea deberse a que el sulfato compite
con el cromato como aceptor final de electrones (Garbisu y col 1998 Liu y col 2006)
En cultivos anaeroacutebicos de Escherichia coli ATCC 33456 la velocidad de reduccioacuten de
Cr(VI) no fue afectada por hasta 416 mM de sulfato sin embargo la velocidad
disminuyoacute a 83 mM de sulfato (Shen y Wang 1994) La actividad de reduccioacuten de Cr(VI)
de Enterobacter cloacae HO1 bajo condiciones anaeroacutebicas fue inhibida en 32 en
presencia de tan soacutelo 25 M de sulfato (Komori y col 1989)
Como se mencionoacute anteriormente el sulfato incrementoacute la tolerancia al Cr(VI) de la cepa
de Candida sp aislada por Pepi y Baldi (1992) sin embargo esta cepa de levadura fue
incapaz de reducir el Cr(VI) Asimismo auacuten cuando se ha reportado que Pseudomonas
fluorescens LB300 es capaz de reducir el Cr(VI) a Cr(III) (Bopp y Ehrlich 1988) y que el
sulfato incrementa el crecimiento celular de esta bacteria en presencia de cromato
(Ohtake y col 1987) hasta donde sabemos no se ha reportado el efecto del sulfato
sobre la reduccioacuten de Cr(VI) por este microorganismo
67
Los resultados anteriores muestran claramente que el sulfato afectoacute la tolerancia de
Candida sp al Cr(VI) y a su capacidad para reducirlo Es evidente que a medida que se
incrementoacute la concentracioacuten de sulfato el crecimiento de la levadura fue mayor y su
eficiencia y velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) aumentaron Los resultados tambieacuten
muestran que la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp depende de la densidad celular de
los cultivos de manera tal que a mayor cantidad de biomasa generada mayor es la
reduccioacuten de Cr(VI) Aun cuando la cepa de Candida sp es muy sensible a los efectos
toacutexicos del Cr(VI) en ausencia de sulfato esta levadura posee una capacidad notable
para reducir muy altas concentraciones del metal en presencia de sulfato
Meta No 2 Determinar la capacidad de reduccioacuten de Cr(VI) en
diferentes sistemas de reaccioacuten
42 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso
Se utilizoacute un reactor airlift con tubo conceacutentrico liso (sin perforaciones) para el cultivo por
lote de Candida sp Para este sistema de reaccioacuten se utilizoacute un volumen de operacioacuten de
4 litros de medio basal con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM El biorreactor
se inoculoacute con un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada de tal
forma que la concentracioacuten inicial de biomasa fue de 12 mgmL El pH inicial fue de
aproximadamente 60 El reactor se operoacute por lote hasta que la concentracioacuten de Cr(VI)
residual fue despreciable
68
La concentracioacuten celular se incrementoacute gradualmente a medida que la incubacioacuten
progresoacute hasta que alcanzoacute un valor maacuteximo de aproximadamente 39 gL lo cual
ocurrioacute a las 42 h de incubacioacuten A tiempos posteriores la concentracioacuten de biomasa
disminuyoacute debido a que ocurrioacute lisis celular (figura 21) La velocidad especiacutefica maacutexima
de crecimiento de la levadura fue de 00244 h-1 la cual fue superior a la obtenida en
matraz cuando crecioacute con 17 mM de Cr(VI) (00142 h-1) esta diferencia podriacutea deberse
a que en el reactor airlift las ceacutelulas de Candida sp tuvieron una mayor cantidad de
oxiacutegeno disponible para su crecimiento
Figura 21 Variacioacuten de la concentracioacuten de biomasa y de glucosa en el cultivo por lote
de Candida sp en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM
La levadura consumioacute la principal fuente de carbono y energiacutea (glucosa) presente en el
medio de cultivo a lo largo de todo el tiempo de incubacioacuten incluso durante el periodo en
el que ocurrioacute lisis celular La glucosa no fue completamente consumida por la levadura
00
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo [h]
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e g
luc
os
a
res
idu
al [g
L]
00
05
10
15
20
25
30
35
40
45
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e b
iom
as
a [
gL
]Glucosa Biomasa
69
al final del experimento la concentracioacuten de glucosa residual fue de 17 gL (figura 21)
por lo que la eficiencia global de consumo del monosacaacuterido fue del 835
El pH del medio de cultivo disminuyoacute desde 60 hasta aproximadamente 25 Este uacuteltimo
valor se alcanzoacute a las 292 h de incubacioacuten y se mantuvo praacutecticamente constante a
tiempos posteriores (figura 22)
Figura 22 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) y del pH en el cultivo por lote de
Candida sp en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM
La concentracioacuten de Cr(VI) residual disminuyoacute progresivamente a medida que se
incrementoacute el tiempo de incubacioacuten hasta que a las 468 h ya no se detectoacute Cr(VI) en el
medio de cultivo por lo que la eficiencia global de remocioacuten de Cr(VI) fue del 100 Se
observoacute una ligera remocioacuten de Cr(VI) durante el periodo en el que ocurrioacute lisis celular
(figuras 21 y 22) En contraste la concentracioacuten de cromo total en solucioacuten se
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo [h]
Cr(
VI)
y C
rom
o t
ota
l re
sid
ua
l [m
gL
]
00
10
20
30
40
50
60
70
pH
[Cr(VI)] [Cromo total] pH
70
mantuvo casi constante a lo largo del tiempo de cultivo Lo anterior indica que la
levadura fue capaz de transformar el Cr(VI) a la forma trivalente menos toacutexica
En la tabla 6 se comparan los valores de algunas variables cineacuteticas obtenidas en
matraz (cuando se hizo crecer la levadura a una concentracioacuten de Cr(VI) inicial de 17
mM) y en el biorreactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando la levadura se cultivoacute en
medio de cultivo con concentraciones iniciales semejantes de Cr(VI) y de sulfato
Tabla 6 Variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote de Candida sp realizados
en matraz y en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Variable cineacutetica Matraz Reactor
Incremento celular maacuteximo [gL] 22 263
Velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento [h-1] 00142 00244
Eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) [] 100 100
Velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI)L h] 098 164
Velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI) g biomasa h] 045 095
Capacidad de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI) g biomasa] 400 443
El incremento celular maacuteximo y la velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento de
Candida sp obtenidos en el reactor airlift fueron 1955 y 718 superiores a los
alcanzados en matraz respectivamente Como se mencionoacute previamente eacutesto podriacutea
deberse a que en el reactor airlift la levadura tuvo una mayor cantidad de oxiacutegeno
disponible para su crecimiento
71
La levadura redujo todo el Cr(VI) inicialmente presente en el medio de cultivo [eficiencia
global de reduccioacuten de Cr(VI) del 100] tanto cuando se cultivoacute en matraz como en el
reactor airlift El hecho de que Candida sp sea capaz de reducir concentraciones de
Cr(VI) tan altas como 15 mM (e incluso superiores como se mostroacute en la seccioacuten
anterior) podriacutea ser de importancia praacutectica porque la mayoriacutea de los microorganismos
ensayados son capaces de reducir parcial o totalmente concentraciones maacutes bajas de
Cr(VI) (tabla 7)
Tabla 7 Datos sobre reduccioacuten de Cr(VI) por microorganismos
Microorganismo Cultivo
Modo de
operacioacuten
Concentra-
cioacuten de
Cr(VI)
[mM]
Velocidad
volumeacutetrica
de reduccioacuten
[mg de
CrLh]
Eficiencia
de
reduccioacuten
[]
Referencia
Acinetobacter
haemolitycus
Aerobio
CPL
067 128 88 Zakaria y col
2006
Aislado de
Pseudomonas
(CRB5)
Aerobio
CPL
043 014 100 McLean y
Beveridge 2000
Arthrobacter
sp
Aerobio
CPL
017 016 65 Megharaj y col
2003
Aspergillus sp Aerobio
CPL
096 0694 100 Acevedo-Aguilar
y col 2006
Bacillus
megaterium
TKW3
Aerobio
CPL
048 009 735 Cheung y Gu
2005
Bacillus sp Aerobio
CPL
007 007 65 Megharaj y col
2003
Bacteria J3 Aerobio
CPL
01 00057 21 Badar y col
2000
Brevibacterium
CrT-13
Aerobio
CPL
288 255 68 Faisal y Hasnain
2004
E coli AC80 Aerobio
CPL
002
065
9375
Ishibashi y col
1990
Ochrabactrum
sp
Aerobio
CPL
017
034
033
038
100
88
Thacker y
Madamwar 2005
72
Ochrobactrum
intermedium Cr-
T1
Aerobio
CPL
288 326 87 Faisal y Hasnain
2004
Penicillium sp Aerobio
CPL
096 066 95 Acevedo-Aguilar y
col 2006
Phanerochaete
chrysosporium
Aerobio
CPL
058 011 100 Pal 1997
Providencia
sp
Aerobio
CPL
102 10 100 Thacker y col
2006
Pseudomonas
ambigua G-1
Aerobio
CPL
288 347 83 Horitsu y col
1987
Streptomyces
griseus
Aerobio
CPL
017 025 100 Laxman y More
2002
Trichoderma
inhamatum
Aerobio
CPL
13
075 100 Morales-Barrera y
Cristiani-Urbina
2008
Trichoderma
viride
Aerobio
CPL
16
104 100 Morales-Barrera y
Cristiani-Urbina
2006
CPL = Cultivo por lote
La velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) obtenida en el reactor neumaacutetico
con Candida sp fue de 164 mg de Cr(VI)Lh la cual fue 6735 superior a la alcanzada
en matraz [098 mg de Cr(VI)Lh] (tabla 6) Esto uacuteltimo podriacutea deberse a la mayor
cantidad de biomasa generada en el reactor la cual redujo maacutes raacutepidamente el Cr(VI)
Acinetobacter haemolitycus fue capaz de reducir completamente 096 mM de Cr(VI) en
36 h por lo que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal de este microorganismo
fue de 139 mg de Cr(VI)Lh sin embargo cuando la concentracioacuten inicial de Cr(VI) se
incrementoacute a 135 mM la eficiencia y velocidad de reduccioacuten disminuyeron (Zakaria y
col 2006)
A una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 017 mM la eficiencia y velocidad volumeacutetrica
global de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por Ochrabactrum sp fue del 100 y 033 mg
de Cr(VI)Lh respectivamente Aunque la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal
73
se incrementoacute a 038 mg de Cr(VI)Lh cuando la concentracioacuten inicial de Cr(VI) fue de
034 mM la eficiencia de reduccioacuten disminuyoacute a 88 (Thacker y Madamwar 2005)
La eficiencia y velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas con Arthrobacter
sp a las 70 h de incubacioacuten fue de aproximadamente 65 y 016 mg de Cr(VI)Lh
cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial del metal de 017 mM (Megharaj y col 2003)
Con Providencia sp se obtuvo una eficiencia de reduccioacuten del 100 al cabo de 108 h de
incubacioacuten en medios de cultivo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 102 mM
siendo su velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal de 10 mg de Cr(VI)Lh (Thacker
y col 2006) La velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Streptomyces griseus
fue de 025 mg de Cr(VI)Lh cuando se cultivoacute en presencia de 017 mM de Cr(VI)
(Laxman y More 2002)
En el caso de eucariotes Acevedo-Aguilar y col (2006) reportaron que Penicillium sp y
Aspergillus sp fueron capaces de reducir por completo 096 mM de Cr(VI) en 72 h
obtenieacutendose una velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de 0694 mg de Cr(VI)Lh
Asimismo Trichoderma viride exhibioacute una eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) del 100 y
una velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de 104 mg de Cr(VI)Lh cuando se cultivoacute en
un reactor airlift en medio de cultivo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 16 mM
(Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006) Trichoderma inhamatum fue capaz de reducir
por completo 13 mM de Cr(VI) con una velocidad volumeacutetrica de 075 mg de Cr(VI)Lh
(Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2008)
En la tabla 7 se muestran los valores de eficiencia y velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten
de Cr(VI) obtenidas con otros microorganismos
74
La velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) que se obtuvo en el reactor airlift con
Candida sp fue de 095 mg de Cr(VI)g de biomasah (tabla 6) la cual fue 211 veces
mayor que la alcanzada en matraz [045 mg de Cr(VI)g de biomasah] Bae y col
(2000) reportaron que la velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) de Escherichia coli
ATCC 33456 se encontroacute en el intervalo de 031 a 07 mg de Cr(VI)g de biomasah
cuando este microorganismo se cultivoacute por lote en diferentes medios de cultivo con una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 096 mM A una concentracioacuten de Cr(VI) de 0096 mM
los lodos activados exhibieron una velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) de
aproximadamente 008 mg de Cr(VI)g de biomasah (Stasinakis y col 2003) El cultivo
por lote de Trichoderma inhamatum exhibioacute una velocidad especiacutefica de
aproximadamente 0584 mg de Cr(VI)g de biomasah cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 13 mM (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2008)
Asimismo en cultivos por lote de Providencia sp realizados con una concentracioacuten inicial
de Cr(VI) de 034 mM se obtuvo una velocidad especiacutefica de reduccioacuten del metal de
1302 mgg de biomasah (Thacker y col 2006)
En el presente trabajo se encontroacute que en el reactor airlift cada gramo (peso seco) de
biomasa producida de Candida sp pudo reducir 4438 mg de Cr(VI) (tabla 6) valor
ligeramente superior al encontrado en matraz [40 mg de Cr(VI)g de biomasa] y
semejante al reportado para Trichoderma inhamatum (Morales-Barrera y Cristiani-
Urbina 2008) Asimismo a las 60 h de incubacioacuten la capacidad de reduccioacuten de
Penicillium sp y Aspergillus sp fue de aproximadamente 082 y 042 mg de Cr(VI)g de
biomasa (Acevedo-Aguilar y col 2006) Wang y Shen (1997) reportaron que la
capacidad maacutexima de reduccioacuten de Cr(VI) de los cultivos aeroacutebicos de Bacillus sp y
75
Pseudomonas fluorescens LB300 fue de 208 x 10-12 y 310 x 10-12 mg de Cr(VI)ceacutelula
respectivamente si se toma en cuenta que el peso seco promedio de una ceacutelula
bacteriana tiacutepica es de aproximadamente 3 x 10-13 g (Atkinson y Mavituna 1983)
entonces la capacidad de reduccioacuten de Bacillus sp y P fluorescens LB300 seriacutea de 693 y
1033 mg de Cr(VI)g de biomasa respectivamente
43 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote repetido en el reactor airlift con
tubo conceacutentrico liso
Se realizaron algunos cultivos por lote repetido en el reactor airlift con tubo conceacutentrico
liso (sin perforaciones) En cada uno de los cultivos ensayados el reactor se inoculoacute
inicialmente con un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada de la
levadura para obtener una concentracioacuten inicial de biomasa de aproximadamente 12
mgmL La concentracioacuten inicial de Cr(VI) del medio de cultivo fue de aproximadamente
15 mM y el flujo de aire fue de 1 vvm El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que la
concentracioacuten de Cr(VI) residual en el medio fue baja (primer cultivo por lote) a
continuacioacuten una parte del medio de cultivo contenido en el reactor se drenoacute y se
adicionoacute medio fresco con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM Posteriormente el
reactor se operoacute nuevamente por lote (segundo cultivo por lote o cultivo por lote
repetido) Se ensayaron tres relaciones de recambio de medio de cultivo (f = volumen de
medio cosechadovolumen inicial de medio de cultivo) de 08 06 y 04
Debido a la importancia que tiene el pH del medio de cultivo en los procesos
microbioloacutegicos de reduccioacuten de Cr(VI) en el presente trabajo se llevaron a cabo cultivos
por lote repetido con relaciones de recambio de 06 y 08 en los que el pH del medio de
76
cultivo se ajustoacute a 60 al inicio del segundo cultivo por lote (cultivo por lote repetido) asiacute
como experimentos en los que el pH no se ajustoacute a 60 por lo que el pH inicial del cultivo
por lote repetido fue el alcanzado al final del primer cultivo por lote (cercano a 30) Es
conveniente mencionar que los valores bajos de pH inhiben el crecimiento de los
microorganismos pero favorecen la reduccioacuten del Cr(VI) a Cr(III) al ocurrir esto uacuteltimo
disminuye el efecto toacutexico de la forma hexavalente del metal
En estos experimentos se observoacute que el crecimiento de la levadura y la reduccioacuten de
Cr(VI) fueron adversamente afectados cuando el pH del medio de cultivo se ajustoacute a 60
al inicio de los cultivos por lote repetido En la figura 23 se muestra la variacioacuten de la
concentracioacuten de Cr(VI) residual en los cultivos por lote y lote repetido realizados con y
sin ajuste del pH al inicio de los cultivos por lote repetido cuando se utilizaron relaciones
de recambio de 06 y 08
77
Figura 23 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los cultivos por lote y lote
repetido realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizaron
00
100
200
300
400
500
600
700
800
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [m
gL
]
f = 08 spH
f = 08 cpH
CPL CPLR
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [m
gL
] f = 06 spH
f = 06 cpH
CPL CPLR
78
relaciones de recambio de 06 y 08 (spH = sin ajuste de pH del medio de cultivo al
inicio del cultivo por lote repetido cpH = con ajuste de pH del medio de cultivo a 60 al
inicio del cultivo por lote repetido)
En la figura se aprecia que en los primeros cultivos por lote el Cr(VI) fue totalmente o
casi completamente reducido en aproximadamente 45-49 h Sin embargo en los cultivos
por lote repetido el tiempo que se requirioacute para reducir el Cr(VI) fue mayor Asimismo es
evidente que se alcanzaron concentraciones de Cr(VI) residual maacutes bajas en los sistemas
por lote repetido en los que no se ajustoacute el pH al inicio de los cultivos
Los resultados anteriores sugieren que la levadura pierde parte de su capacidad de
reduccioacuten de Cr(VI) cuando se cultiva repetidamente en medios que contienen Cr(VI)
Estos resultados concuerdan con lo reportado por Wang y Shen (1997) quienes
encontraron que Bacillus sp Pseudomonas fluorescens LB300 y Escherichia coli ATCC
33456 pierden su capacidad para reducir Cr(VI) despueacutes de que han reducido 046-052
058 y 125 mM de Cr(VI) respectivamente Un comportamiento similar tambieacuten fue
reportado por Middleton y col (2003) para Shewanella oneidensis
Como los niveles maacutes altos de reduccioacuten de Cr(VI) se obtuvieron cuando no se ajustoacute el
pH a 60 al inicio de los cultivos por lote repetido el experimento en el que se ensayoacute
una relacioacuten de recambio de 04 uacutenicamente se llevoacute a cabo sin ajustar el pH
En la figura 24 se muestra la variacioacuten de la concentracioacuten celular en los sistemas por
lote y lote repetido a las tres diferentes relaciones de recambio ensayadas (04 06 y
08) cuando no se ajustoacute el pH al inicio de los cultivos por lote repetido Se aprecia que
en ninguno de los cultivos por lote repetido se alcanzaron densidades celulares cercanas
79
a las de los cultivos por lote que los precedioacute En los cultivos por lote repetido el
incremento celular y la velocidad especiacutefica de crecimiento maacutes altos se obtuvieron
cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 06 (tabla 8) sin embargo los valores
alcanzados fueron inferiores a los obtenidos en el cultivo por lote que los antecedioacute
Figura 24 Variacioacuten de la concentracioacuten de biomasa con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo ensayadas
00
05
10
15
20
25
30
35
40
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Co
nce
ntr
acioacute
n d
e b
iom
asa
[g
L]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
80
Tabla 8 Variables cineacuteticas del crecimiento celular y de la reduccioacuten de Cr(VI)
obtenidas en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp llevados a cabo en el
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Variable Cultivo por lote Cultivo por lote repetido
Relacioacuten de recambio
04 06 08
Incremento celular
maacuteximo [gL]
224 230 235 017 038 009
Velocidad especiacutefica maacutexima de
crecimiento [h-1]
00244 00227 00220 00044 00109 00017
Eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) []
999 980 973 96 93 36
Velocidad
volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI)Lh]
160 178 151 035 046 045
En los cultivos por lote repetido se necesitoacute de una mayor cantidad de tiempo para
consumir la glucosa presente en los medios en comparacioacuten con los cultivos por lote del
cual derivaron (figura 25) Asimismo en ninguno de los cultivos se consumioacute
totalmente la glucosa la mayor eficiencia de consumo del monosacaacuterido de los cultivos
por lote repetido se obtuvo cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 06 con un
valor de 783 el cual es cercano al obtenido en los primeros cultivos por lote
(aproximadamente 835)
81
Figura 25 Variacioacuten de la concentracioacuten de glucosa con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo utilizadas
En la figura 26 se muestran los perfiles de variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI)
residual en funcioacuten del tiempo de incubacioacuten a las diferentes relaciones de recambio de
medio de cultivo utilizadas Se aprecia que en los primeros cultivos por lote se alcanzaron
niveles de Cr(VI) residual maacutes bajos y en menor tiempo que en los cultivos por lote
repetido
00
20
40
60
80
100
120
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e g
luc
os
a r
es
idu
al [g
L]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
82
Figura 26 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo ensayadas
En los primeros cultivos por lote se alcanzaron eficiencias y velocidades volumeacutetricas
globales de reduccioacuten de Cr(VI) de 973 - 999 y de 151 - 178 mgLh
respectivamente (tabla 8) Estas velocidades son superiores a la alcanzada en el cultivo
por lote realizado en matraz [098 mg de Cr(VI)Lh] y semejantes a la obtenida
previamente en el reactor airlift [164 mg de Cr(VI)Lh]
En los cultivos por lote repetido la eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) maacutes baja se
obtuvo cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 08 y esto podriacutea deberse a que el
tiempo de incubacioacuten que se utilizoacute para este cultivo fue menor que para los otros A las
relaciones de recambio de 04 y 06 las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
[Cr(
VI)
] [m
gL
]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
83
fueron semejantes con valores de 96 y 93 respectivamente Estas uacuteltimas eficiencias
fueron ligeramente inferiores a las obtenidas en los cultivos por lote que los precedioacute
(973-999) Las mayores velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) se
obtuvieron a relaciones de recambio de 06 y 08 [aproximadamente 045 mgLh] sin
embargo fueron considerablemente inferiores a la de los cultivos por lote que los
antecedioacute
44 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa en un reactor airlift
con tubo conceacutentrico liso
Para este sistema el reactor se inoculoacute con 50 mL de inoacuteculo y se dejoacute operar por lote
durante 48 horas con el propoacutesito de incrementar la densidad celular A continuacioacuten se
suministroacute continuamente medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de
15 mM [78 mgL] y con un flujo volumeacutetrico de 378 mLh por lo que la velocidad de
dilucioacuten ensayada fue de 00076 h-1 Se permitioacute que el reactor alcanzara el estado
estacionario lo cual se corroboroacute mediante la determinacioacuten de la concentracioacuten de
biomasa asiacute como de glucosa y de Cr(VI) residual de muestras colectadas a diferentes
tiempos
En el estado estacionario los valores promedio de concentracioacuten de biomasa glucosa
Cr(VI) residual y de pH fueron de 016 gL 62 gL 46 mgL y 345 respectivamente
De estos resultados es evidente que la concentracioacuten de biomasa en el reactor fue muy
baja lo que probablemente ocasionoacute que se alcanzaran valores bajos de eficiencia de
consumo de glucosa (38) y de reduccioacuten de Cr(VI) (41) asiacute como de velocidad
volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) (024 mgLh)
84
Posteriormente se ensayoacute un flujo de alimentacioacuten de 5 mLh para operar con una
velocidad de dilucioacuten de 001 h-1 Sin embargo bajo estas condiciones se presentoacute el
fenoacutemeno de lavado celular en el cual no se detecta biomasa en el reactor Este
experimento se realizoacute varias veces y en todos los casos se obtuvo el mismo resultado
El lavado celular que ocurrioacute en el cultivo continuo de Candida sp podriacutea deberse a que
la velocidad de dilucioacuten que se utilizoacute (001 h-1) es muy cercana a la velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento de la levadura [de aproximadamente 00146 h-1 determinada en
cultivo por lote en medio de cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM]
por lo que la levadura no tuvo tiempo suficiente para duplicarse y fue desplazada del
reactor Ademaacutes el suministro continuo de medio de alimentacioacuten con Cr(VI) ocasiona
que la levadura esteacute constantemente sujeta a los efectos toacutexicos del metal Es decir la
baja velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento de la levadura y los efectos toacutexicos
continuos del metal fueron probablemente los factores que limitaron la eficiencia y
velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) en cultivo continuo
Debido a que ocurrioacute lavado celular a una velocidad de dilucioacuten de 001 h-1 ya no fue
posible ensayar velocidades maacutes altas Los resultados obtenidos en cultivo continuo de
una etapa indican que este sistema de reaccioacuten no es adecuado para la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp
En la tabla 9 se presentan datos sobre la reduccioacuten de Cr(VI) por microorganismos en
cultivos continuos en suspensioacuten o inmovilizados Hasta donde es de nuestro
85
conocimiento no hay informacioacuten disponible acerca de la reduccioacuten de Cr(VI) por
levaduras y hongos filamentosos en cultivo continuo
Tabla 9 Resumen de datos sobre la reduccioacuten microbiana de Cr(VI) en cultivo continuo
Microorganismo Cultivo Concentra-
cioacuten de
Cr(VI) [mM]
Velocidad
de
dilucioacuten
[h-1]
Velocidad
volumeacutetrica
de reduccioacuten
[mg de
CrLh]
Eficiencia
de
reduccioacuten
[]
Referencia
Pseudomonas
sp C7
Aerobio 12
12
0014
0017
073
093
88
91
Gopalan y
Veeramani
1994
Pseudomonas
fluorescens
LB300
Aerobio 011
009
009
002
005
009
016
017
022
57
39
28
DeLeo y
Ehrlich
1994
Escherichia coli
ATCC 33456
Aerobio 08 005
169 843 Bae y col
2000
Pseudomonas
mendocina
MCM B-180
Aerobio
05
15
20
022
014
011
57
108
113
99
99
99
Bhide y
col 1996
Microbacterium
liquefaciens
MP30
Aerobio
(ceacutelulas
inmovilizadas
en perlas de
polivinil
alcohol-
alginato)
005
0038
009
90
Pattanapip
it-paisal y
col 2001
Bacillus sp Aerobio
(ceacutelulas
inmovilizadas
en perlas de
vidrio Pyrex)
192
192
004
008
397
797
998
998
Chirwa y
Wang
1997
86
En un estudio realizado en cultivo continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de Pseudomonas
fluorescens LB300 se encontroacute que la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute desde
57 hasta 28 y que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal se incrementoacute de
016 a 022 mg de Cr(VI)Lh a medida que la velocidad de dilucioacuten se incrementoacute de
002 a 009 h-1 cuando se utilizoacute medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI)
de 009 mM (DeLeo y Ehrlich 1994)
Los resultados obtenidos en cultivo continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de otros
microorganismos han sido alentadores Gopalan y Veeramani (1994) ensayaron tres
velocidades de dilucioacuten de 0014 0017 y 0028 h-1 y encontraron que la maacutexima
eficiencia (91) y velocidad volumeacutetrica [093 mg de Cr(VI)Lh] de reduccioacuten de Cr(VI)
de Pseudomonas sp C7 se obteniacutea a una velocidad de dilucioacuten de 0017 h-1 cuando se
utilizoacute medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de 12 mM En el estudio
realizado por Bae y col (2000) con Escherichia coli ATCC 33456 la velocidad de dilucioacuten
se mantuvo constante a 005 h-1 y se obtuvo una eficiencia y una velocidad volumeacutetrica
de reduccioacuten de Cr(VI) de 843 y de 169 mg de Cr(VI)Lh respectivamente cuando
se utilizoacute una concentracioacuten de Cr(VI) de 08 mM en el medio de alimentacioacuten En cultivo
continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de Pseudomonas mendocina MCM B-180 Bhide y col
(1996) ensayaron el efecto de diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI) [de 05 a
20 mM] y de velocidades de dilucioacuten (011 a 022 h-1) sobre la reduccioacuten de Cr(VI)
Estos investigadores encontraron altas eficiencias (99) y velocidades de reduccioacuten [57
ndash 113 mg de Cr(VI)Lh]
Asimismo con la finalidad de reducir los efectos toacutexicos del Cr(VI) sobre los
microorganismos se ha propuesto el uso de ceacutelulas inmovilizadas en reactores continuos
87
de lecho fijo Las ceacutelulas de Microbacterium liquefaciens MP30 inmovilizadas en perlas de
alginato de calcio - polivinil alcohol fueron capaces de reducir el Cr(VI) con una
eficiencia del 90 y con una velocidad de 009 mg de Cr(VI)Lh cuando se utilizoacute medio
de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de 005 mM y una velocidad de dilucioacuten
de 0038 h-1 (Pattanapipitpaisal y col 2001) En un reactor de lecho fijo con ceacutelulas de
Bacillus sp inmovilizadas en perlas de vidrio Pyrex con un diaacutemetro de 3 mm se observoacute
que al incrementar la velocidad de dilucioacuten de 004 a 008 h-1 la eficiencia de reduccioacuten
de Cr(VI) se mantuvo constante (998) y que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de
Cr(VI) se incrementoacute de 397 a 797 mgLh (Chirwa y Wang 1997)
45 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular y la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo conceacutentrico de
malla de acero inoxidable y de vidrio perforado
Los reactores airlift con tubo conceacutentrico liso (reactores convencionales) no son
adecuados para llevar a cabo cultivos por lote alimentado (procesos con volumen
variable) ya que no es posible lograr una adecuada circulacioacuten del liacutequido a cualquier
volumen de medio de cultivo En los reactores airlift convencionales uacutenicamente se logra
una adecuada circulacioacuten del fluido cuando la altura del liacutequido es mayor que la del tubo
conceacutentrico Por ello para realizar cultivos por lote alimentado en reactores airlift es
necesario que existan diversos puntos de comunicacioacuten entre las secciones de ascenso y
descenso del reactor a lo largo de toda la longitud del tubo conceacutentrico En la literatura
se han descrito algunos reactores airlift que en su interior contienen dispositivos que
permiten la comunicacioacuten entre ambas secciones del reactor Los dispositivos maacutes
comunes son tubos de mallas metaacutelicas (net draft tube) (Tung y col 1997 Wu y Wu
1990 1991 Wu y col 1992) tubos conceacutentricos de vidrio con perforaciones
88
rectangulares (Cristiani-Urbina y col 2000) placas curvas colocadas coaxialmente
(Hagino y col 1982) y bafles (placas) perforados (Galiacutendez-Mayer y col 2001) Estos
dispositivos afectan las caracteriacutesticas hidrodinaacutemicas y de transferencia de masa y calor
de los reactores por lo que es conveniente evaluar su desempentildeo
En este trabajo se evaluoacute la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivos por lote
utilizando reactores airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable asiacute como de
vidrio con perforaciones circulares Estos cultivos se realizaron con dos flujos de aire de
05 y 1 vvm Estos experimentos tuvieron como propoacutesito principal el seleccionar el tubo
conceacutentrico maacutes adecuado para llevar a cabo posteriormente los cultivos por lote
alimentado y lote alimentado repetido
En la figura 27 se muestran las curvas de crecimiento celular cuando se utilizoacute el reactor
airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos de aire
ensayados El crecimiento celular de la levadura fue mayor cuando se utilizoacute un flujo de
aire de 1 vvm lo cual podriacutea deberse a una mayor oxigenacioacuten del medio de cultivo Los
niveles de Cr(VI) residual maacutes bajos tambieacuten se obtuvieron con un flujo de aire de 1 vvm
(figura 28) y eacutesto podriacutea deberse a la mayor densidad celular alcanzada bajo estas
condiciones
89
Figura 27 Curvas de crecimiento celular de Candida sp en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos de aire ensayados
Figura 28 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual en los cultivos por lote realizados
en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos
de aire ensayados
000
050
100
150
200
250
00 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Tiempo [h]
XX
O
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
00 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Tiempo [h]
Cr(
VI)
Re
sid
ual [
]
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
90
En los experimentos realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado se
observoacute un comportamiento opuesto al obtenido previamente con el tubo conceacutentrico de
malla metaacutelica El crecimiento celular (figura 29) y la reduccioacuten de Cr(VI) (figura 30)
en el reactor con tubo conceacutentrico perforado fueron mayores a un flujo de aire de 05
vvm
Figura 29 Curvas de crecimiento celular de Candida sp en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico de vidrio perforado a los dos flujos de aire ensayados
000
050
100
150
200
00 500 1000 1500 2000 2500
Tiempo [h]
XX
O
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
91
Figura 30 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual en los cultivos por lote realizados
en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de vidrio perforado a los dos flujos de aire
ensayados
En la tabla 10 se muestran algunas variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote
realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable y con
tubo conceacutentrico perforado de vidrio a los dos flujos de aire ensayados Ademaacutes la tabla
incluye los resultados obtenidos en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
00 500 1000 1500 2000 2500
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ual [
] Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
92
Tabla 10 Variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote realizados en el reactor
airlift con las diferentes configuraciones de tubo conceacutentrico
Cultivo por lote
Variable cineacutetica Tubo conceacutentrico
liso
Malla metaacutelica Tubo conceacutentrico perforado
10 vvm 05 vvm 10 vvm 05 vvm 05 vvm 10 vvm
Incremento celular
maacuteximo [gL]
263 072 142 123 106 082
Velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento [h-1]
00244 00059 00120 00149 00178 00093
Eficiencia global de
reduccioacuten de Cr(VI) ()
100 67 95 97 95 89
Velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) [mg de Cr(VI)Lh]
164 031 056 082 084 035
Comparando los resultados obtenidos en el reactor con tubo de malla metaacutelica y con el
de vidrio perforado la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) fue mayor cuando se
utilizoacute el tubo conceacutentrico perforado de vidrio y un flujo de aire de 05 vvm con un valor
promedio de dos experimentos independientes de 083 mgLh Sin embargo esta
velocidad es aproximadamente 494 inferior a la alcanzada con el tubo conceacutentrico liso
Los resultados de crecimiento celular (incremento celular maacuteximo y velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento) y de reduccioacuten de Cr(VI) (eficiencia y velocidad volumeacutetrica)
obtenidos en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable y de
vidrio perforado a los flujos de aire ensayados podriacutean sugerir que el grado de
oxigenacioacuten del medio de cultivo y la magnitud de los esfuerzos de corte que se alcanzan
durante la agitacioacuten neumaacutetica desempentildean un papel importante en la generacioacuten de
biomasa de Candida sp en los estados fisioloacutegicos de eacutesta y por consiguiente en la
93
reduccioacuten de Cr(VI) Debido a lo anterior seriacutea conveniente investigar la influencia de la
velocidad de aireacioacuten la cual afecta los patrones de flujo del fluido la magnitud de las
fuerzas de corte y la concentracioacuten del nutriente gaseoso en la fase fluida
Como las mayores eficiencias y velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) se
obtuvieron cuando se utilizoacute el tubo conceacutentrico perforado de vidrio y un flujo de aire de
05 vvm eacutestos fueron utilizados en los cultivos por lote alimentados que se llevaron a
cabo posteriormente
46 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote alimentado
repetido en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado
En los cultivos por lote alimentado el volumen de medio liacutequido en el reactor se
incrementa gradualmente a medida que aumenta el tiempo de incubacioacuten Este cambio
de volumen provoca una dilucioacuten de los componentes presentes en el medio de cultivo lo
cual dificulta la interpretacioacuten de los resultados Debido a lo anterior en los cultivos por
lote alimentado es conveniente expresar el cambio de las variables (biomasa sustrato
etc) en teacuterminos de masa y no de concentracioacuten y para ello es necesario conocer el
volumen de medio a los diferentes tiempos de incubacioacuten Por consiguiente en el
presente trabajo se estimaron las cantidades de biomasa glucosa y de Cr(VI) y se
expresaron en teacuterminos de masa A continuacioacuten se presentan las ecuaciones para
calcular la masa de las variables de intereacutes para este trabajo
Masa celular [g] = (concentracioacuten celular gL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
94
Masa de glucosa [g] = (concentracioacuten de glucosa gL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
Masa de Cr(VI) [mg] = (concentracioacuten de Cr(VI) mgL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
En los cultivos por lote alimentado y lote alimentado repetido se ensayaron dos flujos
volumeacutetricos de medio de alimentacioacuten de 659 y 1343 mLh que corresponden a
cargas maacutesicas de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh respectivamente Los cultivos por lote
alimentado realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado se iniciaron con
cultivos por lote (los resultados obtenidos en estos uacuteltimos cultivos se mostraron en la
seccioacuten anterior)
Cuando se utilizoacute una carga maacutesica de Cr(VI) de 0514 mgh en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) se observoacute que la masa celular
de la levadura en el primer cultivo por lote alimentado fue mayor que en la del segundo
cultivo Sin embargo a pesar de que la levadura tuvo un suministro constante de fuente
de carbono y energiacutea eacutesta praacutecticamente no crecioacute
Cuando se utilizoacute una carga maacutesica de Cr(VI) de 0514 mgh fue evidente que en los
cultivos por lote alimentado se fue acumulando glucosa en el medio de cultivo lo que
indica que las ceacutelulas casi no consumieron el monosacaacuterido que teniacutean disponible para su
crecimiento La cantidad de glucosa consumida por la levadura en el cultivo por lote
alimentado repetido (segundo cultivo por lote alimentado) fue considerablemente menor
que la consumida en el primer cultivo lo cual podriacutea deberse a que habiacutea una menor
cantidad de biomasa en el reactor En el segundo cultivo por lote alimentado se alcanzoacute
95
una eficiencia de consumo de glucosa del 68 en cambio en el primer cultivo fue del
263
Se observoacute que la levadura fue capaz de reducir parcialmente el Cr(VI) adicionado al
reactor y que en el primer cultivo por lote alimentado se lograron mayores niveles de
reduccioacuten
En el primer cultivo por lote alimentado las eficiencias de reduccioacuten de Cr(VI) maacutes altas
se alcanzaron durante el periodo de incubacioacuten de las 468 a las 967 h (7188-7292)
y disminuyeron ligeramente hasta el final de este cultivo (673-6945) En el segundo
cultivo por lote alimentado (lote alimentado repetido) las eficiencias disminuyeron
gradualmente a medida que se incrementoacute el tiempo de incubacioacuten (figura 31) La
eficiencia promedio de reduccioacuten de Cr(VI) del primer cultivo por lote alimentado fue de
689 y la del segundo cultivo alimentado fue de 56
96
Figura 31 Variacioacuten de la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) de Candida sp cuando se
utilizoacute una carga maacutesica del metal de 0514 mgh
La velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute progresivamente a medida
que transcurrieron los cultivos por lote alimentado desde 0181 hasta 0063 mgLh
(figura 32) estos valores son inferiores a los alcanzados en los cultivos por lote
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Efi
cie
nc
ia d
e r
ed
uc
cioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
CPLA1 CPLA2
97
Figura 32 Variacioacuten de la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Candida sp
en el cultivo por lote alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) llevados a
cabo con una carga maacutesica del metal de 0514 mgh
Posteriormente se realizoacute el cultivo por lote alimentado y lote alimentado repetido
utilizando una carga maacutesica de Cr(VI) de 105 mgh Se observoacute que en ambos cultivos
la masa celular de Candida sp se incrementoacute gradualmente a medida que se incrementoacute
el tiempo de incubacioacuten aunque al final de cada cultivo hubo una ligera disminucioacuten en la
cantidad de biomasa en el reactor En el primer cultivo por lote alimentado se alcanzoacute un
valor maacuteximo de 523 g de biomasa (incremento celular de 053 g) a las 637 h
mientras que en el segundo cultivo se alcanzoacute una cantidad maacutexima de biomasa de 435
g (incremento celular de 13 g) a las 1822 h totales de cultivo que corresponden a 893
h del cultivo por lote alimentado repetido
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica g
lob
al d
e
re
du
ccioacute
n d
e C
r(V
I) [
mg
de
Cr(V
I)L
h]
CPLA1 CPLA2
98
Asimismo se encontroacute que la levadura fue capaz de consumir parcialmente la glucosa
suministrada En el primer cultivo por lote alimentado se obtuvo una eficiencia de
consumo de glucosa del 299 mientras que en el segundo cultivo la eficiencia fue del
388 Estos resultados probablemente se deban a que el crecimiento de la levadura fue
mayor en el cultivo por lote alimentado repetido (incremento celular = 13 g) que en el
cultivo por lote alimentado que lo precedioacute (incremento celular = 053 g)
En los cultivos por lote alimentados llevados a cabo con una carga maacutesica de 105 mg de
Cr(VI) la levadura fue capaz de reducir parcialmente el Cr(VI) adicionado al reactor sin
embargo al final del primer cultivo por lote alimentado se lograron los niveles de
reduccioacuten maacutes altos
En el primer cultivo por lote alimentado la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) se
incrementoacute a medida que aumentoacute el tiempo de incubacioacuten alcanzaacutendose el valor maacutes
alto de eficiencia (529) a las 879 h de incubacioacuten En contraste en el segundo cultivo
por lote alimentado (alimentado repetido) la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute
continuamente conforme transcurrioacute el tiempo de cultivo Al final del cultivo por lote
alimentado repetido la eficiencia de reduccioacuten del metal fue del 43 (figura 33)
99
Figura 33 Variacioacuten de la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) de Candida sp cuando se
utilizoacute una carga maacutesica del metal de 105 mgh
En estos experimentos tambieacuten se observoacute que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de
Cr(VI) disminuyoacute continuamente durante todo el periodo de incubacioacuten desde 0226
hasta 0099 mgLh (figura 34)
0
10
20
30
40
50
60
0 50 100 150 200 250
Tiempo [h]
Efi
cie
ncia
de
re
du
ccioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
CPLA1 CPLA2
100
Figura 34 Variacioacuten de la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Candida sp
en el cultivo por lote alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) llevados a
cabo con una carga maacutesica del metal de 105 mgh
Las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) que se obtuvieron con una carga maacutesica
del metal de 105 mgh fueron inferiores a las logradas con una carga de 0514 mgh y
esto podriacutea deberse a que el tiempo de contacto entre la levadura y el medio de cultivo
fue menor En contraste las velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) fueron
ligeramente superiores a una carga maacutesica de 105 mgh
Con las dos cargas maacutesicas de Cr(VI) que se ensayaron en este trabajo se observoacute una
variacioacuten semejante en el pH de los medios de cultivo Los cultivos por lote alimentado
se iniciaron con un pH de 302-306 (estos valores corresponden al pH que se obtuvo al
final de los cultivos por lote que precedioacute a los cultivos por lote alimentado) El pH se
000
004
008
012
016
020
024
0 50 100 150 200 250
Tiempo [h]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica g
lob
al d
e r
ed
uccioacute
n
de
Cr(V
I) [
mg
de
Cr(V
I)L
h]
CPLA1 CPLA2
101
incrementoacute ligeramente durante el curso de los primeros cultivos por lote alimentado y al
final de eacutestos se tuvieron valores de 355 y de 345 cuando se emplearon cargas maacutesicas
de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh respectivamente En los cultivos por lote alimentado
repetido el pH se mantuvo praacutecticamente constante durante todo el periodo de
incubacioacuten
A pesar de que el cultivo por lote alimentado es muy recomendable para trabajar con
compuestos toacutexicos ha sido poco explorado para el tratamiento de aguas contaminadas
con cromo hexavalente Fujii y col (1990) utilizaron el cultivo por lote alimentado para
investigar la reduccioacuten de Cr(VI) por la bacteria anaerobia Enterobacter cloacae cepa
HO1 En este estudio una solucioacuten de cromato se alimentoacute continuamente en pequentildeas
dosis para minimizar el efecto toacutexico del metal Los investigadores encontraron que la
reduccioacuten de Cr(VI) fue fuertemente afectada por la velocidad especiacutefica de alimentacioacuten
de cromato Cuando esta velocidad fue inferior a 25 mmol de CrO42-g de biomasah
todo el cromo adicionado fue reducido A velocidades de alimentacioacuten superiores se
observoacute que la concentracioacuten de Cr(VI) residual en el medio de cultivo se incrementaba a
medida que aumentaba la velocidad de alimentacioacuten Asimismo encontraron que la
actividad reductora de la bacteria era fuertemente inhibida cuando la concentracioacuten de
Cr(VI) del medio de cultivo era mayor a 07 mM (3639 mgL)
Posteriormente Fujie y col (1996) realizaron la simulacioacuten de un cultivo por lote
alimentado utilizando datos cineacuteticos obtenidos en cultivo por lote y un modelo
matemaacutetico que describe el comportamiento de la bacteria antes mencionada Los
resultados experimentales y los predichos por el simulador fueron semejantes
102
En la tabla 11 se presentan los valores de velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
obtenidos en el presente trabajo en los diferentes sistemas de reaccioacuten ensayados La
mayor velocidad se obtuvo en el cultivo por lote realizado en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso por lo que eacuteste seriacutea el sistema maacutes adecuado para la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp
103
Tabla 11 Velocidades volumeacutetricas globales de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas en diferentes sistemas de reaccioacuten
CPL
Matraz
CPL Reactor
airlift con
tubo liso
CPL Reactor
airlift con
malla metaacutelica
CC Reactor
airlift con
tubo liso
CPLR Reactor
airlift con
tubo liso
CPL Reactor
airlift con tubo
perforado
CPLA Reactor
airlift con
tubo perforado
CPLAR Reactor
airlift con
tubo perforado
10
Vvm
05
vvm
10
vvm
10
vvm
10
vvm
05
vvm
10
vvm
05
vvm
05
vvm
f=08 f=06 f=04
CM1 CM2 CM1 CM2
098 151 ndash178 031 056 024 045 046 035 084 035 0092-0181
0163-0195
0063-0083
0099-0145
CPL = Cultivo por lote CC = Cultivo continuo CPLR = Cultivo por lote repetido CPLA = Cultivo por lote alimentado CPLAR = Cultivo por lote alimentado repetido f = relacioacuten de recambio CM = Carga maacutesica de Cr(VI)
CM1 = 0514 mg Cr(VI)h CM2 = 105 mg Cr(VI)h
104
5 CONCLUSIONES
El sulfato desempentildea un papel importante en la tolerancia al Cr(VI) y en la reduccioacuten
del mismo en la cepa de Candida sp utilizada en este trabajo
El efecto modulador del sulfato sobre el crecimiento celular y la reduccioacuten del Cr(VI)
depende de las concentraciones de los oxianiones sulfato y cromato
El mecanismo principal de remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp es la biotransformacioacuten
del altamente toacutexico Cr(VI) al menos toacutexico Cr(III)
El cultivo por lote en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso es el sistema de
reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
La velocidad de aireacioacuten no tiene un efecto significativo sobre la reduccioacuten de Cr(VI)
por Candida sp
105
6 REFERENCIAS
1 Acevedo-Aguilar FJ Espino-Saldantildea AE Leoacuten-Rodriacuteguez IL Rivera-Cano ME Avila-Rodriguez M Wrobel K et al 2006 Hexavalent chromium removal in vitro and from industrial wastes using chromate-resistant strains of filamentous
fungi indigenous to contaminated wastes Can J Microbiol 52 809-815
2 Ali-Awan M Baig MA Iqbal J Aslam MR amp Ijaz N 2003 Recovery of chromium (III) from tannery wastewater J App Sci amp Environ Management 7 (2) 5-8
3 Aacutelvarez SG Maldonado M Gerth A amp Kuschk P 2004 Characterization of
tannery effluents and study of the water Hyacinth in chromium recovery Informacioacuten Tecnoloacutegica 15 (3) 75-80
4 Aravindhan BM Madani B Rao JR Nair BU amp Ramasami T 2004 Bioaccumulation of Chromium from Tannery Wastewater An Approach for chrome
recovery and reuse Environ Sci Technol 38 300-306
5 Atkinson B amp Mavituna F 1983 Biochemical engineering and biotechnology handbook United Kingom Nature Press
6 Badar U Ahmed N Beswick AJ Pattanapipitpaisal P amp Macaskie LE 2000 Reduction of chromate by microorganisms isolated from metal contaminated sites of
Karachi Pakistan Biotechnol Lett 22 829-836 7 Bae WC Kang TG Kang IK Won YJ amp Jeong BC 2000 Reduction of
hexavalent chromium by Escherichia coli ATCC 33456 in batch and continuous cultures J Microbiol 38(1) 36-39
8 Balasubramanian S amp Pugalenthi V 1999 Determination of total chromium in
tannery wastewater by inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry
flame atomic absorption spectrometry and uv-visible spectrophotometric methods Talanta 50 (3) 457-467
9 Baldi F Vaughan AM amp Olson GJ 1990 Chromium(VI)-resistant yeast
isolated from a sewage treatment plant receiving tannery wastes Appl Environ
Microbiol 56 (4) 913-918
10 Barnhart J 1997 Occurrences uses and properties of chromium Regulatory Toxicology and Pharmacology 26 S3-S7
11 Beleza VM Boaventura RA amp Almeida MF 2001 Kinetics of chromium removal from spent tanning liquors using acetylene production sludge Environ
Sci Technol 35 (21) 4379-4383 12 Bhide JV Dhakephalkar PK amp Paknikar KM 1996 Microbiological process for
the removal of Cr(VI) from chromate-bearing cooling tower effluent Biotechnol Lett 18 (6)667-672
106
13 Bopp LH amp Ehrlich HL 1988 Chromate resistance and reduction in
Pseudomonas fluorescens strain LB300 Archives of Microbiology 150 426-431
14 Branco R Alpoim MC amp Morais PV 2004 Ochrobactrum tritici strain 5bvI1 ndash characterization of a Cr(VI)-resistant and Cr(VI)-reducing strain Can J Microbiol
50 697-703 15 Camargo FAO Bento FM Okeke BC amp Frankenberger WT 2002 Chromate
reduction by chromium-resistant bacteria isolated from soils contaminated with dichromate Journal of Environmental Quality 32 1228-1233
16 Camargo FAO Okeke BC Bento FM amp Frankenberger WT 2003 In vitro
reduction of hexavalent chromium by a cell-free extract of Bacillus sp ES 29
stimulated by Cu2+ Appl Microbiol Biotechnol 62 569-573
17 Cantildeizares-Villanueva R 2000 Biosorcioacuten de metales pesados mediante el uso de biomasa microbiana Rev Latinoam Microbiol 42 131-143
18 Cervantes C Campos-Garciacutea J Devars S Gutieacuterrez-Corona F Loza-Tavera H Torres-Guzmaacuten JC amp Moreno-Saacutenchez R 2001 Interactions of chromium with
microorganisms and plants FEMS Microbio Rev 25 335-347 19 Chardin B Dolla A Chaspoul F Fardeau ML Gallice P amp Bruschi M 2002
Bioremediation of chromate thermodynamic analysis of the effects of Cr(VI) on sulfate-reducing bacteria Appl Microbiol Biotechnol 60 352-360
20 Chardin B Giudici-Orticoni MT De Luca G Guigliarelli B amp Bruschi M 2003
Hydrogenases in sulfate-reducing bacteria function as chromium reductase Appl
Microbiol Biotechnol 63 315-321
21 Cheung Y amp Gu G 2003 Reduction of chromate (CrO42-) by an enrichment
consortium and an isolate of marine sulfate-reducing bacteria Chemosphere 52 1523-1529
22 Cheung KH amp Gu JD 2005 Chromate reduction by Bacillus megaterium TKW3
isolated from marine sediments World Journal of Microbiology amp Biotechnology 21 213-219
23 Cheung KH amp Gu JD 2007 Mechanism of hexavalent chromium detoxification
by microorganisms and bioremediation application potential a review International
Biodeterioration amp Biodegradation 59 8-15
24 Chirwa EMN amp Wang YT 1997 Hexavalent chromium reduction by Bacillus sp in a packed-bed bioreactor Environ Sci Technol 31 1446-1451
25 Cristiani-Urbina E Netzahuatl-Muntildeoz AR Manriquez-Rojas FJ Juaacuterez-Ramiacuterez C Ruiz-Ordaz N amp Galiacutendez-Mayer J 2000 Batch and fed-batch
cultures for the treatment of whey with mixed yeast cultures Process Biochemistry 35 649-657
107
26 Czakoacute-Veacuter K Batiegrave M Raspor P Sipiczki M amp Pesti M 1999 Hexavalent
chromium uptake by sensitive and tolerant mutants of Schizosaccharomyces pombe FEMS Microbiology Letters 178 109-115
27 DeLeo PC amp Ehrlich HL 1994 Reduction of hexavalent chromium by
Pseudomonas fluorescens LB300 in batch and continuous cultures Appl Microbiol Biotechnol 40 756-759
28 Desjardin V Bayard R Lejeune P amp Gourdon R 2003 Utilization of supernatant of pure cultures of Streptomyces thermocarboxydus NH50 to reduce
chromium toxicity and mobility in contaminated soils Water Air and Soil Pollut 3 153-160
29 Eccles H 1999 Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process TIBTECH 17 462-465
30 Faisal M amp Hasnain S 2004 Comparative study of Cr(VI) uptake and reduction in
industrial effluent by Ochrobactrum intermedium and Brevibacterium sp
Biotechnology Letters 26 1623-1628
31 Fruchter J 2002 In situ treatment of chromium-contaminated groundwater Environ Sci amp Technol pp 464-472
32 Fujie K Hu H Huang X Tanaka Y Urano K amp Ohtake H 1996 Optimal operation of bioreactor system developed for the treatment of chromate wastewater
using Enterobacter cloacae HO-1 Wat Sci Tech 33 (5-6) 173-182 33 Fujii E Toda K amp Ohtake H 1990 Bacterial reduction of toxic hexavalent
chromium using a fed-batch culture of Enterobacter cloacae strain HO1 J Ferment Bioeng 69 (6) 365-367
34 Gaballah I Goy D Kilbertus G amp Thauront J 1994 Decontamination of
industrial effluents for environment protection and recycling of metals Resources
Conservation and Recycling 10 (1-2) 97-106
35 Galiacutendez-Mayer J Saacutenchez-Teja O Cristiani-Urbina E amp Ruiz-Ordaz N 2001 A novel split-cylinder airlift reactor for fed-batch cultures Bioprocess and Biosystems
Engineering 24 171-177 36 Ganguli A amp Tripathi AK 1999 Survival and chromate reducing ability of
Pseudomonas aeruginosa in industrial effluents Lett Appl Microbiol 28 76-80
37 Garbisu C Alkorta I Llama MJ amp Serra JL 1998 Aerobic chromate reduction by Bacillus subtilis Biodegradation 9 133-141
38 Gonzaacutelez AR Ndungrsquou K amp Flegal AR 2005 Natural occurrence of hexavalent chromium in the Aromas Red Sands Aquifer California Environ Sci Technol 39
(15) 5505-5511
108
39 Gopalan R amp Veeramani H 1994 Studies on microbial chromate reduction by
Pseudomonas sp in aerobic continuous suspended growth cultures Biotechnology and Bioengineering 43 471-476
40 Guertin J Jacobs JA amp Avakian CP 2005 Chromium(VI) Handbook 1st
edition CRC Press USA 41 Hach Water Analysis Handbook 2002 Hach Company Colorado USA 4th ed
pp 433-444 1210-1211
42 Hafez AI El-Manharawy MS amp Khedr MA 2002 RO membrane removal of unreacted chromium from spent tanning effluent A pilot-scale study Part 2 Desalination 144 (1-3) 237-242
43 Hagino H Odagiri H amp Okutani J 1982 Draft device for a bubble column US
Patent 4327042 44 Horitsu H Futo S Miyazawa Y Ogai S amp Kawai K 1987 Enzymatic
reduction of hexavalent chromium by hexavalent chromium tolerant Pseudomonas ambigua G-1 Agric Biol Chem 51 (9) 2417-2420
45 Ishibashi Y Cervantes C amp Silver S 1990 Chromium reduction in Pseudomonas
putida Appl Environ Microb 56 (7) 2268-2270
46 Jianlong W Zeyu M amp Xuan Z 2004 Response of Saccharomyces cerevisiae to
chromium stress Process Biochem 39 1231-1235 47 Juvera-Espinosa J Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2006 Isolation and
characterization of a yeast strain capable of removing Cr(VI) Enzyme and Microbial Technology 40 114-121
48 Kaszycki P Fedorovych D Ksheminska H Babyak L Gonchar MV Jaglarz
A amp Koloczek H 2003 Modulation of chromium(VI) and (III) tolerance and
accumulation in yeast by sulfate-containing salts European Journal of Biochemistry 1 (1) P49-53
49 Komori K Wang P Toda K amp Ohtake H 1989 Factors affecting chromate
reduction in Enterobacter cloacae Strain HO1 Appl Microbiol Biotechnol 31 567-570
50 Ksheminska H Fedorovych D Babyak L Yanovych D Kaszycki P amp Koloczek H 2005 Chromium(III) and (VI) tolerance and bioaccumulation in
yeast a survey of cellular chromium content in selected strains of representative genera Process Biochem 40 1565-1572
51 Ksheminska HP Honchar TM Gayda GZ amp Gonchar MV 2006 Extra-cellular chromate-reducing activity of the yeast cultures Central European Journal of
Biology 1 (1)137-149
109
52 Kurniawan TA Chan GYS Lo W amp Babel S 2006 Physico-chemical
treatment techniques for wastewater laden with heavy metals Chemical Engineering Journal 118 83-98
53 Labra M Grassi F Imazio S Di Fabio T Citterio S Sgorbati S amp Agradi E
2004 Genetic and DNA-methylation changes induced by potassium dichromate in Brassica napus L Chemosphere 54 1049-1058
54 Laxman RS amp More S 2002 Reduction of hexavalent chromium by Streptomyces griseus Minerals Engineering 15 831-837
55 Leustek T 2002 Sulfate metabolism The Arabidopsis Book American Society of
Plant Biologists
56 Liu YG Xu WH Zeng GM Li X and Gao H 2006 Cr(VI) reduction by
Bacillus sp isolated from chromium landfill Process Biochemistry 41 1981-1986 57 Llovera S Bonet R Simon-Pujol MD amp Congregado F 1993 Effect of culture
medium ions on chromate reduction by resting cells of Agrobacterium radiobacter Appl Microbiol Biotechnol 39 424-426
58 Lloyd JR 2003 Microbial reduction of metals and radionuclides FEMS Microbiol
Rev 27 411-425
59 Marsh TL amp McInerney MJ 2001 Relationship of hydrogen bioavailability to
chromate reduction in aquifer sediments Appl Environ Microb 67 (4) 1517-1521
60 McLean J amp Beveridge TJ 2001 Chromate reduction by a pseudomonad isolated from a site contaminated with chromated copper arsenate Applied and
Environmental Microbiology 67 (3)1076-1084 61 Megharaj M Avudainayagam S amp Naidu R 2003 Toxicity of hexavalent
chromium and its reduction by bacteria isolated from soil contaminated with tannery waste Current Microbiology 47 51-54
62 Middleton SS Latmani RB Mackey MR Ellisman MH Tebo BM amp Criddle
CS 2003 Cometabolism of Cr(VI) by Shewanella oneidensis MR-1 produces cell-associated reduced chromium and inhibits growth Biotechnol Bioeng 83 627-637
63 Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2006 Removal of hexavalent chromium
by Trichoderma viride in an airlift bioreactor Enzyme and Microbial Technology 40 107-113
64 Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2008 Hexavalent chromium removal by Trichoderma inhamatum fungal strain isolated from tannery effluent Enzyme and
Microbial Technology 40 107-113
110
65 Morales B L 2005 Aislamiento de microorganismos y estudio de su capacidad
para remover cromo hexavalente Tesis de Maestriacutea Escuela Nacional de Ciencias Bioloacutegicas IPN Meacutexico
66 Muter O Patmalnieks A amp Rapoport A 2001 Interrelations of the yeast Candida
utilis and Cr(VI) metal reduction and its distribution in the cell and medium Process Biochem 36 963-970
67 Ohtake H Cervantes C amp Silver S 1987 Decreased chromate uptake in Pseudomonas fluorescens carrying a chromate resistance plasmid J Bacteriol 169
3853-3856 68 Pal N 1997 Reduction of hexavalent chromium to trivalent chromium by
Phanerochaete chrysosporium pp 511-517 En Alleman BC amp Leeson A In Situ and On-Site Bioremediation Vol 2 Battelle Press Ohio USA
69 Pattanapipitpaisal P Brown NL amp Macaskie LE 2001 Chromate reduction by
Microbacterium liquefaciens immobilised in polyvinyl alcohol Biotechnol Lett 23
61-65
70 Pepi M amp Baldi F 1992 Modulation of chromium(VI) toxicity by organic and inorganic sulfur species in yeasts from industrial wastes BioMetals 5 179-185
71 Quintana M Curutchet G amp Donati E 2001 Factors affecting chromium(VI) reduction by Thiobacillus ferrooxidans Biochemical Engineering Journal 9 11-15
72 Ramiacuterez-Ramiacuterez R Calvo-Meacutendez C Aacutevila-Rodriacuteguez M Lappe P Ulloa M
Vaacutezquez-Juaacuterez R amp Gutieacuterrez-Corona JF 2004 Cr(VI) reduction in a chromate-
resistant strain of Candida maltosa isolated from the leather industry Antonie van Leeuwenhoek 85 63-68
73 Rege MA Petersen JN Johnstone DL Turick CE Yonge DR amp Apel WA
1997 Bacterial reduction of hexavalent chromium by Enterobacter cloacae strain
HO1 grown on sucrose Biotechnol Lett 19 (7) 691-694
74 Roukas T 1993 Ethanol production from nonsterilized carob pod extract by free and immobilized Saccharomyces cerevisiae cells using fed-batch culture
Biotechnol Bioeng 43 189-194 75 Ruiacutez MA 2000 Recuperacioacuten de metales pesados de soluciones diluidas por
biosorcioacuten con bacteria En Medrano RH Galan WL Biotecnologiacutea de Minerales CONACYT Meacutexico pp 235-262
76 Saxena D Levin R amp Firer MA 2000 Removal of chromate from industrial
effluent by a new isolate of Staphylococcus cohnii Wat Sci Technol 42 (1-2)
93-98
77 Secretariacutea de Comercio y Fomento Industrial NMX-AA-74-1981 Anaacutelisis de Agua ndash Determinacioacuten del Ioacuten Sulfato
111
78 Secretariacutea de Economiacutea NMX-AA-051-SCFI-2001 Anaacutelisis de Agua -
Determinacioacuten de Metales por Absorcioacuten Atoacutemica en Aguas Naturales Potables Residuales y Residuales Tratadas - Meacutetodo de Prueba
79 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NMX-AA-044-SCFI-
2001 Anaacutelisis de Aguas - Determinacioacuten de Cromo Hexavalente en Aguas Naturales Potables Residuales y Residuales Tratadas - Meacutetodo de Prueba En Diario Oficial de la Federacioacuten 1 de agosto 2001
80 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996
Liacutemites Maacuteximos Permisibles de Contaminantes en las Descargas de Aguas Residuales en Aguas y Bienes Nacionales En Diario Oficial de la Federacioacuten 6 de enero 1997
81 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996
Liacutemites Maacuteximos Permisibles de Contaminantes en las Descargas de Aguas Residuales a los Sistemas de Alcantarillado Urbano o Municipal En Diario Oficial de la Federacioacuten 3 de junio 1998
82 Secretariacutea de Salud Proyecto de Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-
NOM-127-SSA1-1994 Salud Ambiental Agua para Uso y Consumo Humano - Liacutemites Permisibles de Calidad y Tratamientos a que debe Someterse el Agua para su Potabilizacioacuten En Diario Oficial de la Federacioacuten 20 de Octubre 2000
83 Shakoori AR Makhdoom M amp Haq RU 2000 Hexavalent chromium reduction
by a dichromate-resistant gram-positive bacterium isolated from effluents of tanneries Appl Microbiol amp Biotechnol 53 (3) 348-351
84 Shen H and Wang YT 1994 Biological reduction of chromium by E coli Journal of Environmental Engineering 120 560-572
85 Shen H amp Wang Y 1995 Hexavalent chromium removal in two-stage bioreactor
system J Environ Eng 121 (11) 798-804
86 Smith WA Apel WA Petersen JN amp Peyton BM 2002 Effect of carbon and
energy source on bacterial chromate reduction Bioremediation J 6 (3) 205-215
87 Smith WL amp Gadd GM 2000 Reduction and precipitation of chromate by mixed culture sulphate-reducing biofilms J Appl Microbiol 88 983-991
88 Song Z Williams CJ amp Edyvean RGJ 2004 Treatment of tannery wastewater by chemical coagulation Desalination 164 (3) 249-259
89 Srinath T Verma T Ramteke PW amp Garg SK 2002 Chromium (VI)
biosorption and bioaccumulation by chromate resistant bacteria Chemosphere 48
(4) 427-435
90 Stanbury PF amp Whitaker A ―Principles of Fermentation Technology Pergamon Press Ltd Great Britain 1984 First edition Pp 11-24
112
91 Stasinakis AS Mamais D Thomaidis NS amp Lekkas TD 2002 Effect of
chromium (VI) on bacterial kinetics of heterotrophic biomass of activated sludge Water Res 36 3341-3349
92 Stasinakis AS Thomaidis NS Mamais D Karivali M amp Lekkas TD 2003
Chromium species behaviour in the activated sludge process Chemosphere 52 1059-1067
93 Stephen JR amp Macnaughton SJ 1999 Developments in terrestrial bacterial remediation of metals Current Opinion in Biotechnology 10 230-233
94 Su C amp Ludwig RD 2005 Treatment of hexavalent chromium in chromite ore
processing solid waste using a mixed reductant solution of ferrous sulfate and
sodium dithionite Environ Sci Technol 39 (16) 6208-6216
95 Thacker U Parikh R Shouche Y amp Madamwar D 2006 Hexavalent chromium reduction by Providencia sp Process Biochem 41 1332-1337
96 Thacker U amp Madamwar D 2005 Reduction of toxic chromium and partial localization of chromium reductase activity in bacterial isolate DM1 Would Journal
of Microbiology amp Biotechnology 21 891-899 97 Tung HL Chiou SY Tu CC amp Wu WT 1997 An airlift reactor with double
net draft tubes and its application in fermentation Bioprocess Eng 171-5
98 Turick CE Apel WA amp Carmiol NS 1996 Isolation of hexavalent chromium-reducing anaerobes from hexavalent-chromium-contaminated and noncontaminated environments Applied Microbiol Biotechnol 44 683-688
99 Viamajala S Peyton BM Sani RK Apel WA amp Petersen JN 2004 Toxic
effects of chromium(VI) on anaerobic and aerobic growth of Shewanella oneidensis MR-1 Biotechnol Prog 20 87-95
100 Volesky B amp Vieira RHSF 2000 Biosorption a solution to pollution Internat Microbiol 3 17-24
101 Wang DIC Cooney CL Demain AL Dunnill P Humphrey AE amp Lilly MD
1979 ―Fermentation and Enzyme Technology John Wiley amp Sons Inc USA Pp 98-115
102 Wang YT and Shen H 1997 Modelling Cr(VI) reduction by pure bacterial cultures Water Research 31 727-732
103 Wang Y amp Xiao C 1995 Factors affecting hexavalent chromium reduction in pure
cultures of bacteria Water Res 29 (11) 2467-2474
104 Wang Y 2000 Microbial reduction of chromate En Lovley DR (Ed)
Environmental Microbe-Metal Interactions ASM Press Washington DC USA pp 225-235
113
105 Wilkin RT Su C Ford RG amp Paul CJ 2005 Chromium-removal processes
during groundwater remediation by a zerovalent iron permeable reactive barrier Environ Sci Technol 39 (12) 4599-4605
106 Worthington Biochemical Corporation 1972 Worthington Enzyme Manual
Enzymes Enzyme Reagents and Related Biochemicals Freehold New Jersey USA
107 Wu J amp Wu WT 1991 Fed-batch culture of Saccharomyces cerevisiae in an airlift reactor with net draft tube Biotechnol Prog 7 230-233
108 Wu WT amp Wu JY 1990 Airlift reactor with net draught tube J Ferm Bioeng
70 359-361
109 Wu WT Wu JY amp Jong JZ 1992 Mass transfer in an airlift reactor with a net
draft tube Biotechnol Prog 8 465-468 110 Zakaria ZA Zakaria Z Surif S amp Ahmad WA 2006 Hexavalent chromium
reduction by Acinetobacter haemolyticus isolated from heavy-metal contaminated wastewater J Hazard Mater 146 30-38
111 Zuacutentildeiga M 2005 Aislamiento de microorganismos con capacidad para remover
cromo hexavalente del agua Tesis de Licenciatura Escuela Nacional de Ciencias
Bioloacutegicas IPN Meacutexico
Referencias electroacutenicas
httpepagov httpesepagovtechpubs412304html
httpfaiunneeduarbiologiamicroindcultivo20y20biorreactoreshtm httpmineralserusgsgovmineralspubscommoditychromium180494pdf
httpuserpagesumbcedu gferre1bmcohtml
httpuserpagesumbcedu gferre1fedbatchhtml httpwwgemesmaterialdocument httpwwwatsdrcdcgovfacts7 html
httpwwwchemicalelementscomelementscrhtml httpwwwepagoviris
wwwclu-inorgdownloadstudentpapersbio_of_metals_paperpdf
114
7 Impacto
En este trabajo se identificaron algunas variables ambientales que afectan la
biorreduccioacuten de cromo hexavalente [Cr(VI)] La informacioacuten obtenida podriacutea ser de
utilidad para mejorar los procesos de reduccioacuten del metal asiacute como para disminuir los
tiempos y costos del tratamiento de los efluentes industriales contaminados con Cr(VI)
Los resultaron mostraron que el sulfato afecta la tolerancia de Candida sp al Cr(VI) y a
su capacidad para reducirlo Fue evidente que a medida que se incrementoacute la
concentracioacuten de sulfato aumentoacute el crecimiento de la levadura la eficiencia global y la
velocidad global de reduccioacuten de Cr(VI) Asimismo se encontroacute que la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp depende de la densidad celular de los cultivos de manera tal que
a mayor cantidad de biomasa producida mayor es la reduccioacuten del metal Aun cuando la
cepa de Candida sp es sensible a los efectos toacutexicos del Cr(VI) en ausencia del sulfato
esta levadura posee una notable capacidad para reducir muy altas concentraciones de
Cr(VI) en presencia de sulfato por lo que podriacutea ser potencialmente uacutetil para el
tratamiento de aguas industriales altaminadas con Cr(VI) y con iones sulfato
Hasta donde sabemos este es el primer trabajo en el que se demuestra que el sulfato
desempentildea un papel impotante tanto en la tolerancia al Cr(VI) como en la reduccioacuten
aeroacutebica del mismo en microorganismos Estos descubrimientos podriacutean tener
implicaciones importantes en el tratamiento de aguas residuales contaminadas con
Cr(VI)
Ademaacutes se encontroacute que los contactores gas-liacutequido son adecuados para la reduccioacuten
aeroacutebica de Cr(VI) por Candida sp Esto uacuteltimo es de vital importancia porque seriacutea
posible disminuir significativamente los costos de tratamiento ya que estos biorreactores
se caracterizan por su baja economiacutea de aireacioacuten Las velocidades volumeacutetrica y
especiacutefica asiacute como la capacidad de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por Candida sp en el
reactor airlift con tubo conceacutentrico fueron superiores a las obtenidas en matraz y eacutesto
podriacutea deberse a que en el reactor airlift la levadura tuvo una mayor cantidad de oxiacutegeno
disponible para su crecimiento y a que el mayor nuacutemero de ceacutelulas producidas fue la
responsable de reducir maacutes eficazmente el Cr(VI) presente en el medio de cultivo
115
Las caracteriacutesticas mostradas por Candida sp en el dispositivo airlift indican que este
tipo de reactor neumaacutetico es adecuado para el crecimiento y la reduccioacuten aeroacutebica del
Cr(VI) por la levadura Asimismo los paraacutemetros cineacuteticos del proceso de reduccioacuten de
Cr(VI) catalizado por Candida sp son superiores a los reportados para otros
microorganismos lo que sugiere que esta cepa de levadura tiene potencial biotecnoloacutegico
para ser utilizada en procesos de remediacioacuten de aguas residuales industriales
contaminadas con Cr(VI)
De los diferentes sistemas de reaccioacuten ensayados (cultivos por lote lote repetido
continuo de una etapa lote alimentado y lote alimentado repetido) el cultivo por lote es
el maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
Otra de las contribuciones de este trabajo fueron la formacioacuten de recursos humanos
tanto a nivel licenciatura como de posgrado Uno de los estudiantes de licenciatura ya
sustentoacute su examen profesional y la tesis de Maestriacutea de otra estudiante ya fue revisada
y aprobada por los sinodales por lo que el examen para obtener el grado se realizaraacute en
poco tiempo Actualmente estaacuten en proceso 1 tesis de licenciatura 2 de maestriacutea y 1 de
doctorado
Entre otros productos del proyecto de investigacioacuten se tienen la publicacioacuten de 2 artiacuteculos
en revistas internacionales incluidas en la base de datos del Journal of Citation Reports
del Institute for Scientific Information (ISI) la publicacioacuten de 2 artiacuteculos en extenso en
las memorias de Congresos Internacionales y la presentacioacuten de varios trabajos en
eventos acadeacutemicos nacionales e internacionales
11
Tabla 2 Liacutemites maacuteximos permisibles de cromo total para las aguas residuales que se descargan en aguas y bienes
nacionales (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996)
Paraacutemetros
( )
Riacuteos Embalses
Naturales y
Artificiales
Aguas Costeras Suelo
(mgL) Uso en
riego
agriacutecola
(A)
Uso
puacuteblico
urbano
(B)
Proteccioacuten
de vida
acuaacutetica
( C )
Uso en
riego
agriacutecola
(B)
Uso
puacuteblico
urbano
( C )
Explotacioacuten
pesquera
navegacioacuten
y otros
usos (A)
Recreacioacuten
(B)
Estuarios
(B)
Uso en
riego
agriacutecola
(A)
Humedales
naturales
(B)
PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD PM PD
Cromo 1 15 05 10 05 10 1 15 05 10 05 10 1 15 05 10 05 10 05 10
() Medidos de manera total PD = Promedio diario PM = Promedio mensual (A) (B) y ( C ) Tipo de cuerpo receptor seguacuten la Ley Federal de Derechos
Tabla 3 Liacutemites maacuteximos permisibles de cromo hexavalente para los sistemas de alcantarillado urbano o municipal
(Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996)
Paraacutemetros (mgL) Promedio Mensual Promedio Diario Instantaacuteneo
Cromo hexavalente 05 075 1
12
Por su parte la EPA ha establecido como liacutemite una concentracioacuten de 01 mg de cromo
por litro de agua potable (httpwwwatsdrcdcgovfacts7html)
La Organizacioacuten Mundial para la Salud (OMS) y la Comunidad Econoacutemica Europea (CEE)
establecen una concentracioacuten de 005 mg de cromo totalL como paraacutemetro de calidad
para aguas destinadas a consumo humano (httpwwgemesmaterialdocument)
Algunos valores sentildealados por otras instancias internacionales se muestran en la tabla
4
Tabla 4 Liacutemites permisibles para cromo sentildealados por Directivas Internacionales
sobre agua potable y aguas embotelladas (Zuacutentildeiga 2005)
Paraacutemetro Canadaacute 1 Japoacuten 2 Aguas embotelladas Nivel de
Administracioacuten Federal sobre
Productos Farmaceacuteuticos de EEUU
Cromo
005 mgL
005 mgL
01 mgL
1 Liacutemite establecido por el Ministerio de Salud de Canadaacute
2 Liacutemite establecido por el Ministerio de Salud y Bienestar Social de Japoacuten
15 Meacutetodos para la remocioacuten de cromo de los efluentes industriales
Para disminuir los efectos toacutexicos del metal es conveniente aplicar alguacuten(os)
tratamiento(s) a los efluentes industriales que contienen cromo antes de descargarlos en
los cuerpos de agua o en el suelo asiacute como restaurar los ecosistemas contaminados En
la actualidad estaacuten disponibles varias tecnologiacuteas para estos propoacutesitos (Eccles 1999)
Estas tecnologiacuteas se han empleado para reducir la toxicidad del contaminante [mediante
la transformacioacuten quiacutemica o bioloacutegica del Cr(VI) a Cr(III)] para removerlo de un lugar
para disminuir la extensioacuten de la contaminacioacuten o para contenerlo en un aacuterea en
particular (Guertin y col 2005)
13
151 Procesos convencionales
Los meacutetodos convencionales para la remocioacuten de los metales pesados son de naturaleza
fisicoquiacutemica y pueden ser utilizados en varias etapas del tratamiento de aguas
residuales Los meacutetodos maacutes usuales para la remocioacuten de Cr(VI) de los efluentes
industriales son los siguientes 1) reduccioacuten quiacutemica ndash precipitacioacuten en donde el Cr(VI)
es reducido quiacutemicamente a Cr(III) a pH aacutecido utilizando alguacuten agente reductor (por
ejemplo el bisulfito de sodio) y posteriormente se adiciona cal o alguacuten otro compuesto
alcalino para formar hidroacutexido de cromo (III) el cual es separado por sedimentacioacuten y
2) coagulacioacuten-floculacioacuten En general estos meacutetodos tienen algunas desventajas tales
como 1) son costosos ya que el agente activo no puede ser recuperado para su
posterior reutilizacioacuten 2) algunos reactivos quiacutemicos son sumamente toacutexicos 3) su
selectividad es baja 4) generan lodos quiacutemicos con altas concentraciones de metales los
cuales son difiacuteciles de tratar 5) la remocioacuten de los metales es incompleta principalmente
cuando la concentracioacuten de eacutestos en los efluentes es inferior a 100 mgL y 6) las aguas
residuales resultantes no satisfacen los criterios de calidad establecidos en la legislacioacuten
ambiental (Cantildeizares-Villanueva 2000 Ruiacutez 2000 Saxena y col 2000 Cheung y Gu
2003)
Algunas otras tecnologiacuteas que se utilizan ocasionalmente para la remocioacuten del Cr(VI) son
el intercambio ioacutenico la adsorcioacuten el tratamiento electroquiacutemico la oacutesmosis inversa y la
evaporacioacuten (Garbisu y col 1998 Camargo y col 2003 Kurniawan y col 2006) Las
principales desventajas de estos meacutetodos son los altos costos fijos de operacioacuten y de
mantenimiento por lo que su aplicacioacuten a grandes voluacutemenes de agua o su uso por
pequentildeas y medianas empresas estaacute muy limitado
14
La EPA recomienda los siguientes meacutetodos para la remocioacuten de cromo del agua potable
en caso de que eacutesta exceda el liacutemite permisible para este metal coagulacioacuten-filtracioacuten
intercambio ioacutenico y oacutesmosis inversa (httpepagov)
En Meacutexico en caso de que el agua destinada a uso y consumo humano exceda el liacutemite
permisible de cromo total la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-1994
(Secretariacutea de Salud Proyecto de Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-
127-SSA1-1994) indica como tratamientos a aplicar el intercambio ioacutenico o la oacutesmosis
inversa
152 Procesos biotecnoloacutegicos
En las uacuteltimas dos deacutecadas se han llevado a cabo estudios con el fin de utilizar
microorganismos y plantas para la restauracioacuten de sitios y para el tratamiento de
efluentes industriales contaminados con metales toacutexicos (Stephen y Macnaughton 1999
Lloyd 2003)
En la actualidad se considera que los procesos microbioloacutegicos son la alternativa maacutes
atractiva para remover algunos metales toacutexicos de los sitios y efluentes contaminados
ya que estos procesos son ―amigables con el medio ambiente los subproductos que
generan son usualmente inocuos son muy eficientes en la remocioacuten de los metales
(particularmente cuando las concentraciones de eacutestos son bajas condiciones en las que
algunos procesos fisicoquiacutemicos son muy ineficientes) y son de bajo costo (Cheung y
Gu 2005 Chardin y col 2002 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004)
15
Dentro de los procesos biotecnoloacutegicos propuestos para la remocioacuten de Cr(VI) se
encuentran la biosorcioacuten y la reduccioacuten bioloacutegica en los cuales se han utilizado
principalmente microorganismos (Volesky y Vieira 2000 Fruchter 2002 Cheung y Gu
2003)
En la biosorcioacuten se utilizan ciertos tipos de adsorbentes bioloacutegicos por ejemplo biomasa
microbiana (viva o inactivada en suspensioacuten o inmovilizada) con los que no se requiere
energiacutea metaboacutelica para retener pasivamente al cromo hexavalente mediante procesos
fiacutesicos (adsorcioacuten fiacutesica principalmente por fuerzas de van Der Waals) o quiacutemicos
(quimisorcioacuten) (Cantildeizares-Villanueva 2000 Volesky y Vieira 2000 Aravindhan y col
2004) En algunos casos se ha observado que el metal es transportado activamente al
interior de las ceacutelulas (a expensas de energiacutea metaboacutelica) proceso al que se le denomina
como bioacumulacioacuten
En la biorreduccioacuten o reduccioacuten bioloacutegica el cromo hexavalente es transformado a la
forma trivalente este uacuteltimo puede ser faacutecilmente precipitado en una etapa posterior de
tratamiento ajustando el pH del agua residual a un valor cercano al neutro para
removerlo finalmente por meacutetodos fiacutesicos (Chardin y col 2002 Cheung y Gu 2003) Se
considera que este proceso es una alternativa tecnoloacutegica potencial para el tratamiento
de suelos cuerpos de agua y efluentes industriales contaminados ya que la reduccioacuten
del Cr(VI) disminuye significativamente la toxicidad (100 veces) solubilidad en agua y
movilidad del metal a traveacutes del medio ambiente (Cheung y Gu 2003 Lloyd 2003
Wang 2000)
16
Se han aislado varios microorganismos que pueden reducir el Cr(VI) a Cr(III) ya sea
como cultivos puros (Horitsu y col 1987 Wang 2000 Pattanapipitpaisal y col 2001
Chardin y col 2002 Cheung y Gu 2003 Middleton y col 2003 Morales-Barrera
2005 Pal 1997 Muter y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004 Thacker y col
2006) o como cultivos mixtos (Smith y col 2002 Cheung y Gu 2003) Las fuentes de
aislamiento han sido muy diversas como por ejemplo efluentes de curtiduriacuteas de la
industria metaluacutergica de mantos freaacuteticos de aguas superficiales contaminadas de
sedimentos anoacutexicos en lagos de plantas de tratamiento de aguas residuales entre
otros (Horitsu y col 1987 Fujii y col 1990 Ganguli y Tripathi 1999 Badar y col
2000 Saxena y col 2000 Pattanapipitpaisal y col 2001 Middleton y col 2003
Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004 Zuacutentildeiga 2005 Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
Entre los geacuteneros microbianos que son capaces de reducir Cr(VI) se tienen los
siguientes Achromobacter Aeromonas Agrobacterium Bacillus Desulfovibrio
Escherichia Enterobacter Micrococcus Pseudomonas (Horitsu y col 1987 Wang
2000) Staphylococcus (Saxena y col 2000) Microbacterium (Pattanapipitpaisal y col
2001) Pyrobaculum Streptomyces Deinococcus (Chardin y col 2002)
Desulfomicrobium Desulfotomaculum Pantoea (Cheung y Gu 2003) Shewanella
(Middleton y col 2003) Trichoderma (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
Phanerochaete (Pal 1997) y Candida (Muter y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col
2004)
De los estudios reportados en la literatura acerca de la reduccioacuten microbioloacutegica del
Cr(VI) sobresalen tres hechos 1) Las bacterias han sido los microorganismos maacutes
ampliamente estudiados y es muy escasa la informacioacuten disponible sobre la capacidad de
17
reduccioacuten del metal de las levaduras y de los hongos filamentosos 2) la mayoriacutea de los
microorganismos ensayados soacutelo son capaces de tolerar y reducir muy bajas
concentraciones de Cr(VI) usualmente dentro del intervalo de 0001 a 05 mM esto
uacuteltimo se ha atribuido a los efectos toacutexicos y mutageacutenicos del metal y 3) casi todos los
estudios se han realizado en cultivo por lote
1521 Transporte del cromo al interior de las ceacutelulas
Tanto en organismos procariotes como en muchos eucariotes los oxianiones cromato y
dicromato (fuentes de cromo hexavalente) ingresan principalmente a las ceacutelulas a traveacutes
de las membranas citoplaacutesmicas mediante el sistema de transporte del sulfato (Badar y
col 2000) lo cual se ha atribuido a la similitud en la carga y estructura de estos iones
(Smith y Gadd 2000) Esto fue demostrado primeramente en Salmonella typhimurium y
posteriormente en otras bacterias tales como en Escherichia coli Pseudomonas
fluorescens y Alcaligenes eutrophus Se ha comprobado que esto mismo ocurre en
algunas levaduras tales como en Candida (Muter y col 2001 Cervantes y col 2001)
Sin embargo en general el cromato penetra al interior de las levaduras por medio de un
transportador anioacutenico no especiacutefico (Czakoacute-Veacuter y col 1999 Cervantes y col 2001)
En algunos microorganismos se ha demostrado que el sulfato inhibe competitivamente el
transporte del cromato al interior de las ceacutelulas (Ohtake y col 1987 Pepi y Baldi 1992)
y que esta inhibicioacuten es maacutes marcada en ceacutelulas anaerobias que en aerobias (Zakaria y
col 2006) Tambieacuten se ha reportado el transporte del cromato por la viacutea de los fosfatos
aunque la viacutea del sulfato es la maacutes utilizada (Ohtake y col 1987)
18
El transporte del cromato al interior de las plantas tambieacuten es a traveacutes del sistema del
ioacuten sulfato Ya en el interior de la planta el cromo hexavalente se acumula en diversos
oacuterganos en cantidades diferentes El cromo hexavalente se acumula de 10 a 100 veces
maacutes en las raiacuteces que en los retontildeos o en otros tejidos (Cervantes y col 2001)
En contraste las membranas celulares de los organismos son praacutecticamente
impermeables al cromo trivalente y a sus compuestos (Ksheminska y col 2006)
1522 Mecanismos microbianos de resistencia al Cr(VI) y de reduccioacuten del
Cr(VI)
Una caracteriacutestica importante que deben tener los microorganismos que se van a utilizar
en procesos de tratamiento de efluentes contaminados con cromo hexavalente es que
sean tolerantes (resistentes) a eacuteste Esta propiedad ha sido descrita en bacterias hongos
y levaduras (Horitsu y col 1987 Cervantes y col 2001 Ramiacuterez-Ramiacuterez y col 2004)
Entre los mecanismos de resistencia al cromo hexavalente que se han encontrado se
tienen los siguientes
Acumulacioacuten del metal en la superficie o en el interior de las ceacutelulas (Volesky y Vieira
2000 Saxena y col 2000)
Disminucioacuten yo impedimento en el transporte del cromo hexavalente al interior de
las ceacutelulas (Pepi y Baldi 1992)
Excrecioacuten del metal del interior de la ceacutelula al medio circundante (Cervantes y col
2001)
Reacciones de oacutexido-reduccioacuten en las que el cromo hexavalente es reducido a cromo
trivalente el cual es menos toacutexico (Baldi y col 1990 Muter y col 2001)
19
La resistencia al cromo hexavalente puede estar codificada en el genoacuteforo de las
bacterias o en plaacutesmidos Esto uacuteltimo se ha encontrado en Pseudomonas aeruginosa P
fluorescens P putida y en Alcaligenes eutrophus (Baldi y col 1990 Ishibashi y col
1990 Cervantes y col 2001) Sin embargo la tolerancia al metal no implica
necesariamente que los microorganismos seraacuten capaces de removerlo por alguacuten
mecanismo
En el interior de las ceacutelulas bacterianas los iones cromato [CrO42-] pueden ser reducidos
a cromo trivalente por ciertas enzimas (Ishibashi y col 1990 Horitsu y col 1987) En
condiciones de aerobiosis se han identificado las siguientes proteiacutenas que parecen ser las
responsables de la reduccioacuten del Cr(VI) reductasas flavoproteiacutenas enzimas
dependientes de NADH y NAD(P)H (Ishibashi y col 1990) en cambio en condiciones de
anaerobiosis los estudios indican que ciertas hidrogenasas y citocromos son los
responsables (Chardin y col 2003 Cheung y Gu 2007)
El cromo hexavalente tambieacuten puede ser reducido por compuestos quiacutemicos reductores
que son producidos durante el crecimiento de los microorganismos (Desjardin y col
2003) tales como el glutatioacuten y la cisteiacutena los cuales pueden actuar dentro o fuera de
los organismos (Zakaria y col 2006) En organismos superiores se ha identificado al
ascorbato como agente reductor del cromo hexavalente (Ksheminska y col 2006)
Casi no hay informacioacuten sobre el mecanismo responsable de la reduccioacuten del Cr(VI) en
ceacutelulas eucariotas especiacuteficamente en levaduras Con la finalidad de dilucidar dicho
20
mecanismo se han realizado estudios en los que se ha modificado la resistencia de las
levaduras al Cr(VI) o se ha inactivado alguna enzima en particular
En un trabajo llevado a cabo con algunas levaduras no convencionales se encontroacute que
algunas de eacutestas durante su crecimiento excretaron sustancias reductoras asiacute como
sustancias quelantes que formaron complejos con el cromo trivalente que fue generado
durante la transformacioacuten del cromo hexavalente (Ksheminska y col 2006)
1523 Factores que afectan la reduccioacuten bioloacutegica del Cr(VI)
En algunos microorganismos se ha estudiado el efecto que tienen las variables
ambientales tales como condiciones de aerobiosis yo de anaerobiosis donadores y
aceptores finales de electrones concentracioacuten de cromo hexavalente y potencial de
oacutexido-reduccioacuten entre algunas otras sobre la reduccioacuten del metal (Shen y Wang 1995
Shakoori y col 2000 Wang 2000 Smith y col 2002 Wang y Xiao 1995 Fujii y col
1990 Muter y col 2001 Smith y Gadd 2000 Lloyd 2003 Jianlong y col 2004
Viamajala y col 2004)
La reduccioacuten del Cr(VI) puede realizarse en ambiente aerobio yo anaerobio En
organismos aerobios y anaerobios facultativos se ha investigado el efecto del oxiacutegeno
disuelto en el medio sobre la reduccioacuten del metal (Wang 2000) Se ha encontrado que
la sensibilidad del proceso de reduccioacuten del Cr(VI) a la tensioacuten de oxiacutegeno es diferente
para cada microorganismo En cultivos de Enterobacter cloacae HO1 concentraciones
iniciales de oxiacutegeno mayores a 45 ppm inhibieron fuertemente la reduccioacuten del Cr(VI)
(Komori y col 1989) mientras que la reduccioacuten del metal fue maacutes lenta en condiciones
21
de anaerobiosis que en aerobiosis en el caso de Thiobacillus ferrooxidans (QuiIntana y
col 2001)
Asimismo se ha investigado el efecto de algunos iones sobre la reduccioacuten bioloacutegica del
Cr(VI) Con respecto al sulfato [SO42-] existe una analogiacutea estructural y de carga entre
este anioacuten [SO42-] y el ioacuten cromato [CrO4
2-] por lo que puede establecerse una
competencia entre ellos por los transportadores de sulfato existentes en las ceacutelulas
influyendo asiacute en la reduccioacuten del cromo hexavalente (Smith y Gadd 2000)
En cultivos aerobios no se ha reportado inhibicioacuten por sulfato en la reduccioacuten del cromo
hexavalente (Wang y Xiao 1995 Ishibashi y col 1990 Wang 2000) En contraste se
ha informado que en cultivos anaerobios el sulfato afecta la reduccioacuten del Cr(VI) debido
a que este anioacuten compite con el cromato como aceptor final de electrones (Garbisu y
col 1998)
Por otro lado en un estudio realizado con varios geacuteneros de levadura (Pichia Candida
Debaryomyces Saccharomyces Schwanniomyces Cryptococcus Hansenula) que tienen
capacidad para acumular cromo se encontroacute que el sulfato afectoacute la tolerancia de las
levaduras al Cr(VI) siendo mayor o menor el efecto en funcioacuten de la levadura en estudio
(Kaszycki y col 2003)
Otros iones que se han investigado son el Mg2+ Mn2+ Ca2+ y el Fe En cultivos con
ceacutelulas pasivas (resting cells) de Agrobacterium radiobacter se encontroacute que debe
controlarse principalmente la cantidad de fierro para incrementar la capacidad de
reduccioacuten del microorganismo (Llovera y col 1993)
22
Los donadores de electrones que se han utilizado principalmente en los estudios de
reduccioacuten del Cr(VI) son compuestos alifaacuteticos y aromaacuteticos carbohidratos de bajo peso
molecular aminoaacutecidos y aacutecidos orgaacutenicos (Wang y Xiao 1995 Wang 2000 Smith y
col 2002 Ksheminska y col 2006) El descubrimiento de microorganismos que son
capaces de reducir el cromo hexavalente utilizando una amplia variedad de fuentes de
carbono y energiacutea favorece su uso en procesos de remediacioacuten in situ (Smith y col
2002)
Para la reduccioacuten del cromo hexavalente es conveniente conocer el pH y la temperatura
oacuteptimos para el crecimiento de los microorganismos (Wang 2000 Shakoori y col 2000
Camargo y col 2002 Faisal y Hasnain 2004) En cultivos de Streptomyces griseus se
estudioacute la reduccioacuten del Cr(VI) en el intervalo de valores de pH de 4 a 8 y de
temperatura de 28 a 50 degC obtenieacutendose la mayor reduccioacuten a un pH de 6-7 y a una
temperatura de 28 degC (Laxman y More 2002)
En cultivos de Ochrobactrum sp se trabajoacute en el intervalo de temperatura de 30 a 45 degC
y de pH de 6 a 8 obtenieacutendose la mayor reduccioacuten del Cr(VI) y el crecimiento celular
maacutes alto a 35 degC y a un pH de 7 (Thacker y Madamwar 2005) En estudios realizados
con Escherichia coli ATCC 33456 se ensayoacute la reduccioacuten del Cr(VI) en el intervalo de
valores de pH de 3-8 y de temperatura de 40-60 degC encontraacutendose que el pH y la
temperatura de incubacioacuten oacuteptimos fueron de 7 y 37 degC respectivamente (Bae y col
2000)
Se ha observado que la concentracioacuten inicial de Cr(VI) influye en la velocidad de
reduccioacuten del metal (Wang 2000) La velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) exhibida por los
23
cultivos de Bacillus sp Pseudomonas fluorescens LB300 (Wang y Xiao 1995)
Ochrobactrum sp (Thacker y Madamwar 2005) y de Candida sp LBM2 (Juvera-Espinosa
y col 2006) se incrementoacute conforme aumentoacute la concentracioacuten inicial de Cr(VI) En
contraste la velocidad de reduccioacuten de Bacillus sp Arthrobacter sp (Megharaj y col
2003) y de Trichoderma viride (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006) disminuyoacute al
incrementar la concentracioacuten inicial de cromo hexavalente
Para obtener una reduccioacuten importante del Cr(VI) se requieren altas concentraciones de
biomasa (Wang 2000) La concentracioacuten inicial de biomasa tiene efecto sobre la
velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) de Bacillus sp y Pseudomonas fluorescens LB300 ya
que eacutesta aumentoacute al haber mayor cantidad de biomasa inicial (Wang y Xiao 1995) Este
mismo efecto se observoacute en cultivos de una cepa bacteriana gram positiva a la que se le
denominoacute como cepa ATCC 700729 (Shakoori y col 2000)
El potencial redox se ha medido en algunos estudios realizados con diferentes
microorganismos y condiciones de cultivo para determinar su efecto sobre la reduccioacuten
del Cr(VI) (Komori y col 1989 Turick y col 1996 McLean y Beveridge 2001) sin
embargo no se ha reportado un intervalo oacuteptimo de potencial redox para llevar a cabo la
reduccioacuten del Cr(VI) a su forma menos toacutexica (Wang 2000)
En algunos estudios se ha evaluado la influencia de algunos metales (Mn Ni Zn Pb Cu
Co As Se y Hg) sobre la reduccioacuten del Cr(VI) ya que las cepas microbianas que sean
resistentes a uno o varios metales y que sean capaces de reducir el Cr(VI) seriacutean de gran
utilidad en la biorremediacioacuten de efluentes industriales (Faisal y Hasnain 2004 Cheung
y Gu 2005 Thacker y col 2006) En estudios con Escherichia coli ATCC 33456 se
24
investigoacute el efecto de varios iones (Hg2+ Ag2+ Mn2+ Zn2+ Pb2+ Cd2+ Ca2+ y Mg2+) que
pueden estar presentes junto con el Cr(VI) en efluentes industriales Con el magnesio
se observoacute un ligero aumento en la actividad reductora del microorganismo mientras
que con el mercurio se inhibioacute por completo su capacidad de reduccioacuten (Bae y col
2000)
En el caso particular de microorganismos filamentosos los esfuerzos de corte pueden
causar dantildeo fiacutesico a las ceacutelulas y como consecuencia afectar su capacidad de reduccioacuten
de Cr(VI) En cultivos de Trichoderma viride realizados en matraz y en un reactor
agitado mecaacutenicamente con un impulsor se observoacute que los micelios eran de menor
tamantildeo cuando el hongo se cultivaba en el reactor Asimismo el incremento celular y la
eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidos en matraz fueron superiores a los alcanzados
en el reactor agitado con un impulsor Estos resultados sugirieron que las fuerzas de
cizalla creadas por el impulsor fragmentan el micelio y afectan la viabilidad celular y la
capacidad de reduccioacuten del microorganismo (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006)
16 Sistemas de reaccioacuten
En la mayoriacutea de los estudios sobre reduccioacuten de Cr(VI) el sistema de reaccioacuten que maacutes
se ha empleado es el cultivo por lote Este sistema es ampliamente utilizado en procesos
biotecnoloacutegicos para la produccioacuten de biomasa y de metabolitos de intereacutes industrial La
duracioacuten de este tipo de cultivo depende del tamantildeo del inoacuteculo de las condiciones
ambientales como el pH los componentes del medio de cultivo y la temperatura
Aunque su operacioacuten es sencilla ofrece pocas opciones de control de las variables
intensivas de intereacutes (concentracioacuten de biomasa sustrato producto) en comparacioacuten
con otros sistemas de reaccioacuten
25
(httpfaiunneeduarbiologiamicroindcultivo20y20biorreactoreshtm) Asimismo
despueacutes de un cultivo por lote se requiere de un periodo para la descarga limpieza y
esterilizacioacuten del equipo asiacute como para el arranque de un nuevo cultivo por lote lo que
disminuye la productividad global del proceso (Wang y col 1979)
Pocos son los estudios relacionados con la reduccioacuten del Cr(VI) en los que se ha
trabajado con otros sistemas de reaccioacuten tales como con el cultivo continuo (DeLeo y
Ehrlich 1994 Bhide y col 1996 Chirwa y Wang 1997 Bae y col 2000) y el cultivo
por lote alimentado o fed-batch (Fujii y col 1990 Fujie y col 1996)
El cultivo continuo permite alcanzar un estado estacionario independiente del tiempo en
el que los microorganismos presentan un crecimiento consumo de sustrato y produccioacuten
constantes por lo que es posible obtener una alta productividad o velocidad volumeacutetrica
(httpuserpagesumbcedu gferre1bmcohtml) En este sistema es posible controlar
la cantidad de biomasa utilizando un uacutenico nutriente limitante del crecimiento (Wang y
col 1979)
A pesar de que el cultivo continuo tiene la desventaja de ser susceptible de contaminarse
debido a los periodos prolongados de operacioacuten (Stanbury 1984) en estudios con Cr(VI)
se minimizariacutea lo anterior ya que este estado de oxidacioacuten del cromo es altamente toacutexico
para la mayoriacutea de los microorganismos auacuten a bajas concentraciones
El cultivo por lote alimentado se utiliza industrialmente para la produccioacuten de varios
productos bioloacutegicos de intereacutes (enzimas antibioacuteticos vitaminas aminoaacutecidos entre
otros) El sistema es uacutetil para obtener una alta concentracioacuten de metabolitos asociados
26
al crecimiento ya que es posible alcanzar una alta concentracioacuten de biomasa aunque
tambieacuten se emplea para la produccioacuten de compuestos no asociados al crecimiento como
por ejemplo de algunos antibioacuteticos Su uso tambieacuten se recomienda cuando se trabaja
con compuestos toacutexicos o de muy baja solubilidad y no requiere mayor equipo que el
utilizado en un cultivo por lote (httpuserpagesumbcedu gferre1fedbatchhtml)
Otras ventajas de este sistema son 1) los tiempos totales del proceso fermentativo son
menores y no requiere de un nuevo inoacuteculo cada vez que se repite el ciclo en
comparacioacuten con un cultivo por lote y 2) menor riesgo de contaminacioacuten que el cultivo
continuo (Roukas 1993)
27
2 OBJETIVOS
21 Objetivos generales
1) Determinar el efecto del ioacuten sulfato sobre el crecimiento celular consumo de glucosa y
reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
2) Realizar el estudio cineacutetico del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de
Cr(VI) de Candida sp en sistemas por lote y lote repetido en un reactor airlift
3) Seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten del Cr(VI) por
Candida sp
22 Objetivos especiacuteficos
a) Determinar el efecto de la concentracioacuten de sulfato de amonio sobre el crecimiento
celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
b) Evaluar el crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote y lote repetido
c) Realizar el estudio cineacutetico del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa
d) Evaluar el crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote alimentado repetido
e) Seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes conveniente para la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp
28
3 MATERIAL Y MEacuteTODOS
31 Microorganismo
Para el desarrollo del presente trabajo se utilizoacute una levadura que se aisloacute a partir del
agua residual de una industria curtidora de pieles que se encuentra ubicada en la Ciudad
de Leoacuten Guanajuato Mediante teacutecnicas morfoloacutegicas y bioquiacutemicas que fueron
realizadas en el Laboratorio de Micologiacutea de la Facultad de Medicina de la UNAM asiacute
como por teacutecnicas de biologiacutea molecular que fueron llevadas a cabo en el Laboratorio de
Microbiologiacutea General de la Escuela Nacional de Ciencias Bioloacutegicas se determinoacute que la
levadura pertenece al geacutenero Candida La amplificacioacuten y secuenciacioacuten del dominio
D1D2 del gen 26S rDNA de la levadura aislada reveloacute que estaacute relacionada con Candida
petrohuensis (GenBank accession number U45819) Candida acudensis (GenBank
accession number U45810) y Candida drimydis (GenBank accession number U45815)
con un nivel de confidencia del 896 La baja similitud de las secuencias parciales
conocidas del gen 26S rDNA y la de la cepa de levadura empleada en este trabajo podriacutea
sugerir que es una cepa no identificada no registrada en el GenBank por lo que se le
denominoacute como Candida sp La relacioacuten filogeneacutetica de la cepa de Candida usada en este
estudio y la de otras especies de levadura se muestra en la figura 1
29
Figura 1 Relaciones filogeneacuteticas de la levadura
AJ508572Cmucifera
AB041003Candida
AB041006Cmucifera
AB041005Stephanoascus
U45822Cchiropterorum
U40103Arxula
U40094Arxula
AY283605Sympodiomyces
AF017247Trichomonascus
U40110Blastobotrys
AY442294Sympodiomyces
U40096Sympodiomyces
AY559042Cmokoenaii
FGSFEP
U45819Cpetrohuensis
U45810Cancudensis
U45815Cdrimydis
U45806Cbondarzewiae
U45816Ctepae
U45812Candida
U45812Cantillancae
U45811Csantjacobensis
U76531Stephanoascus
AB196536Stephanoascus
U70245Cedax
AF017236Cbertae
U45835Cvaldiviana
AY618511Cnovakii
U45807Ccastrensis
U45826Cpaludigena
AF294910Cbituminiphila
U45829Pichia
U84241Zygozyma
U76350Myxozyma
U76527Lipomyces
U45804Debaryomyces
U75524Pichia
U68552Saccharomyces
AY545582Naumovia
AY007888Saccharomyces 100 100
43 100
100
100
43 100
100
72
100
86
95
95
100
91
58 69
99
98
84
92
60
63
54
40
56
37
49
21
39
61
16
002
30
32 Propagacioacuten del inoacuteculo
La composicioacuten quiacutemica del medio de cultivo basal que se utilizoacute en este trabajo para la
propagacioacuten del inoacuteculo y para los experimentos de remocioacuten de Cr(VI) en diferentes
sistemas de reaccioacuten los cuales fueron realizados en un reactor neumaacutetico se muestra
en la tabla 5
Tabla 5 Composicioacuten quiacutemica del medio de cultivo
Compuesto Concentracioacuten
(gL)
Glucosa 100
(NH4)2SO4 30
KH2PO4 10
MgSO4 7H2O 03
KCl 01
Extracto de levadura 01
CaCl2 005
FeCl3 0001
Para los experimentos en los que se determinoacute el efecto del sulfato sobre la tolerancia de
Candida sp al Cr(VI) y la reduccioacuten del mismo el inoacuteculo se propagoacute en el mismo medio
de cultivo pero el (NH4)2SO4 se reemplazoacute por NH4Cl (243 gL) y el MgSO47H2O por
MgCl26H2O (0247 gL)
31
El pH inicial de los medios de cultivo fue de aproximadamente 60 A matraces
Erlenmeyer de 1000 mL que conteniacutean 200 mL de medio de cultivo se les adicionoacute una
asada de Candida sp y posteriormente se incuboacute con agitacioacuten constante a 28-30 ordmC
durante 42 h A continuacioacuten la biomasa se separoacute por centrifugacioacuten a 1500 rpm a
4 degC durante 15 min bajo condiciones de asepsia El paquete celular resultante se lavoacute
dos veces con agua destilada esteacuteril para eliminar los componentes del medio de cultivo
y los residuos celulares El paquete celular se resuspendioacute en un pequentildeo volumen de
agua destilada esteacuteril y se homogeneizoacute La suspensioacuten celular resultante se utilizoacute como
inoacuteculo para los experimentos realizados en este trabajo
Para la conservacioacuten de la levadura se usaron viales con medio inclinado de YPG
(glucosa 2 peptona de caseiacutena 1 extracto de levadura 1 y agar bacterioloacutegico
2) los cuales se mantuvieron en refrigeracioacuten a 4 degC Las resiembras se realizaron
cada dos meses
33 Reactores airlift
Se utilizoacute un contactor gas-liacutequido (reactor agitado neumaacuteticamente) del tipo airlift con
tubo conceacutentrico (figuras 2a y 2b) con un volumen total de 52 litros y un posible
volumen de operacioacuten de 42 litros para realizar los estudios de remocioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en sistemas por lote lote repetido lote alimentado y lote alimentado
repetido El reactor estaacute hecho de vidrio Pyrex y consta de una base columna y una
tapa Entre la base y la columna asiacute como entre la columna y la tapa se colocaron
empaques de neopreno para evitar el contacto vidrio-vidrio asiacute como para evitar fugas
de aire yo de medio de cultivo Las secciones se unieron mediante bridas de Nylamid La
32
base del reactor tiene un difusor del tipo placa plana de vidrio poroso para el suministro
de aire
33
Oliva para
toma de muestra
Aire
Tubo conceacutentrico (liso con
perforaciones de
malla)
Filtro de aire
Venteo
Difusor de vidrio poroso(poro fino)
Difusor de vidrio
poroso (poro fino)
Aire
50deg
4
65
3 m
m
77 mm
11
5
mm
128 mm
88 mm
15
mm
70 mm
4
50
3 m
m
Figuras 2a y 2b Reactor del tipo airlift con tubo conceacutentrico
34
En el interior del reactor se colocoacute un tubo conceacutentrico liso (sin perforaciones) de vidrio
Pyrex un tubo conceacutentrico de vidrio Pyrex con perforaciones circulares (4 mm de
diaacutemetro) o un tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable No 316 (grado
alimentario nuacutemero de malla = 20 abertura = 3344 mm) los cuales tienen la misma
longitud y diaacutemetro El tipo de tubo que se utilizoacute para los experimentos de reduccioacuten
del Cr(VI) dependioacute del sistema de reaccioacuten que se ensayoacute el tubo conceacutentrico liso se
utilizoacute para llevar a cabo experimentos en cultivos por lote y lote repetido el tubo
conceacutentrico con perforaciones se empleoacute para realizar cultivos por lote lote alimentado y
lote alimentado repetido y el tubo de malla metaacutelica se usoacute para cultivos por lote
Para el cultivo continuo de una etapa se utilizoacute un reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
con un volumen total de 650 mL y un posible volumen de operacioacuten de 550 mL el cual
tiene las mismas relaciones geomeacutetricas que el reactor antes mencionado
En todos los sistemas de reaccioacuten ensayados se suministroacute aire en el interior del tubo
conceacutentrico El aire de entrada se controloacute mediante una vaacutelvula reguladora de presioacuten y
su velocidad de flujo se midioacute con un rotaacutemetro
34 Meacutetodos experimentales
341 Efecto de la concentracioacuten de sulfato sobre el crecimiento celular
consumo de glucosa remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp
Se evaluoacute el efecto de la concentracioacuten de sulfato sobre el crecimiento celular consumo
de glucosa remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivos por lote a
nivel matraz Para estos experimentos parte o todo del (NH4)2SO4 y del MgSO4 7H2O del
medio de cultivo basal (tabla 5) se reemplazoacute con NH4Cl y MgCl26H2O respectivamente
35
a fin de mantener las mismas concentraciones iniciales de nitroacutegeno (454 mM) y de
magnesio (1217 mM) en todos los medios de cultivo ensayados
Se prepararon tres series de matraces Erlenmeyer de 500 mL que conteniacutean 135 mL de
medio de cultivo con diferentes concentraciones iniciales de sulfato Las
concentraciones de sulfato ensayadas fueron las siguientes 00 1217 25 50 100
150 200 y 2392 mM (esta uacuteltima concentracioacuten corresponde a la del ioacuten sulfato
presente en el medio de cultivo basal) Estas concentraciones no incluyen la cantidad de
sulfato proporcionado por algunos otros componentes del medio de cultivo (provenientes
del extracto de levadura yo de sales inorgaacutenicas) ya que el Laboratorio Central de
Instrumentacioacuten del Departamento de Biofiacutesica de la Escuela Nacional de Ciencias
Bioloacutegicas IPN determinoacute que la concentracioacuten de este ioacuten en el medio de cultivo que
conteniacutea cloruro de amonio y cloruro de magnesio como uacutenicas fuentes de nitroacutegeno
inorgaacutenico y de magnesio respectivamente era de 23 mgL (002 mM) A este uacuteltimo
medio de cultivo es al que se le denominoacute en el presente trabajo como ―0 mM de ioacuten
sulfato Para la cuantificacioacuten del ioacuten sulfato se utilizoacute el meacutetodo recomendado por la
Norma Oficial Mexicana NMX-AA-74-1981 (Secretariacutea de Comercio y Fomento Industrial
1981) El pH inicial de todos los medios de cultivo ensayados fue de aproximadamente
60
A una serie de matraces con medio de cultivo no se le adicionoacute Cr(VI) con la finalidad de
determinar el efecto del sulfato sobre el crecimiento celular y consumo de glucosa por la
levadura en ausencia del metal (cultivos control) A los matraces de la segunda y tercera
serie se les adicionoacute un determinado volumen de una solucioacuten stock esteacuteril de cromato
de potasio (20 gL) para obtener concentraciones iniciales de Cr(VI) de 17 y 33 mM
36
respectivamente Los matraces fueron inoculados con un determinado volumen de
suspensioacuten celular concentrada a fin de que la concentracioacuten inicial de biomasa de todos
los cultivos fuera de aproximadamente 1 mgmL Los matraces se colocaron en un bantildeo
metaboacutelico con agitacioacuten constante a 28-30 degC Se recolectaron muestras a diferentes
tiempos de incubacioacuten a las que se les determinoacute la concentracioacuten de biomasa glucosa
Cr(VI) y cromo total residual asiacute como el pH
342 Controles abioacuteticos
Se utilizaron controles libres de ceacutelulas con el propoacutesito de determinar si el Cr(VI) era
reducido abioacuteticamente a Cr(III) por los componentes del medio de cultivo
Durante los experimentos de remocioacuten de Cr(VI) con ceacutelulas viables (cultivos problema)
se observoacute que el pH de los medios de cultivo disminuyoacute desde aproximadamente 6
hasta 25-42 dependiendo de la concentracioacuten de sulfato y de cromo utilizada Como
se sabe que los pHrsquos bajos favorecen que la materia orgaacutenica (donadores de electrones)
reduzca el Cr(VI) a Cr(III) en este trabajo se llevaron a cabo experimentos sin biomasa
de Candida sp (controles libres de ceacutelulas) a distintos valores de pH (25 3 4 5 y 6) y
a las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas (17 y 33 mM) para determinar
el grado de reduccioacuten causado por los constituyentes del medio de cultivo
Como controles libres de ceacutelulas se utilizaron matraces Erlenmeyer que conteniacutean medio
de cultivo a los que se les adicionoacute un volumen determinado de una solucioacuten stock
esteacuteril de cromato de potasio (20 gL) para obtener concentraciones iniciales de Cr(VI)
de 17 y 33 mM A continuacioacuten se ajustoacute el pH del medio de cultivo a alguno de los
37
valores antes mencionados La adicioacuten de la solucioacuten stock esteacuteril de cromato de potasio
y el ajuste del pH se realizoacute en condiciones de asepsia
Los controles abioacuteticos se incubaron a las mismas condiciones que los matraces
problema Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se les
determinoacute la concentracioacuten de Cr(VI)
343 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa
remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivo por lote en un
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Se realizoacute la evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa remocioacuten
de Cr(VI) y cromo total por Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso (sin perforaciones) El cultivo por lote se llevoacute a cabo con 4 litros de
medio de cultivo basal con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM [igual a 78
mgL de Cr(VI)] y con un pH inicial de aproximadamente 60 El reactor se inoculoacute con
un volumen determinado de suspensioacuten celular concentrada para obtener una
concentracioacuten inicial de biomasa cercana a 12 mgmL Se suministroacute aire con un flujo
volumeacutetrico de 4 litrosmin equivalente a 1 vvm (vvm = volumen de aire por volumen
de medio de cultivo por minuto)
El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que el nivel de Cr(VI) residual fue
despreciable Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se
les determinoacute la concentracioacuten de biomasa de glucosa Cr(VI) y cromo total residual asiacute
como el pH
38
344 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote repetido en un reactor
airlift con tubo conceacutentrico liso
Los sistemas por lote repetido se iniciaron con un cultivo por lote Cuando se alcanzaron
niveles bajos de Cr(VI) residual en el primer cultivo por lote se procedioacute a recolectar un
determinado volumen de medio y se reemplazoacute con medio fresco que teniacutea una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM A continuacioacuten el sistema se operoacute nuevamente por
lote (segundo cultivo por lote o cultivo por lote repetido) hasta que ya no se detectaron
variaciones considerables en la concentracioacuten de Cr(VI) residual
Se ensayaron tres diferentes relaciones de recambio de medio de cultivo (f = volumen de
medio recolectadovolumen inicial de medio liacutequido en el reactor) las cuales fueron de
04 06 y 08 Para las dos uacuteltimas relaciones se realizaron experimentos sin ajustar el
pH del medio al inicio del segundo cultivo por lote (lote repetido) asiacute como ajustando el
pH a 60 Para la primera relacioacuten (f = 04) soacutelo se realizoacute el experimento sin ajustar el
pH del medio al inicio del cultivo por lote repetido ya que los experimentos realizados a
las relaciones de recambio de 06 y 08 mostraron que la eficiencia y velocidad de
reduccioacuten de Cr(VI) de los cultivos por lote repetido eran mayores cuando no se ajustaba
el pH
Durante los cultivos por lote repetido se recolectaron muestras a diferentes tiempos de
incubacioacuten a las cuales se les determinoacute la concentracioacuten de biomasa glucosa Cr(VI) y
el pH Con los datos obtenidos se estimaron algunas variables cineacuteticas que se utilizaron
para seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para los fines que se persiguen en
este trabajo
39
345 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa en un
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Para el cultivo continuo de una etapa se utilizoacute un biorreactor airlift con tubo conceacutentrico
liso con un volumen de operacioacuten de 500 mL Al reactor se le suministroacute continuamente
medio de cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM por medio de una
bomba peristaacuteltica Se ensayaron dos flujos volumeacutetricos de medio de cultivo de 378 y
50 mLh que corresponden a velocidades de dilucioacuten de 00076 h-1 y de 00100 h-1
respectivamente
Con los datos obtenidos a la velocidad de dilucioacuten de 00076 h-1 se estimoacute la velocidad
volumeacutetrica global y la eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) las cuales se utilizaron
para seleccionar el sistema de reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp
346 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular y la remocioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo conceacutentrico de
malla de acero inoxidable y de vidrio perforado
Se realizaron cultivos por lote en el reactor airlift en el cual se colocoacute un tubo conceacutentrico
de malla de acero inoxidable No 316 (grado alimentario calibre No 20 abertura =
3344 mm) o un tubo conceacutentrico de vidrio con perforaciones circulares de
aproximadamente 4 mm de diaacutemetro Al reactor se le adicionaron 4 litros de medio de
cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM [igual a 78 mgL de Cr(VI)] y
un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada para obtener una
40
concentracioacuten inicial de biomasa de aproximadamente 12 mgmL El pH inicial del medio
fue de aproximadamente 60 Se ensayaron dos flujos de aire de 05 y 1 vvm
El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que el nivel de Cr(VI) residual fue bajo Se
recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las que se les determinoacute la
concentracioacuten de biomasa y de Cr(VI) residual Con los datos obtenidos se estimaron
algunas variables cineacuteticas que sirvieron como criterio de seleccioacuten para determinar el
tubo conceacutentrico maacutes adecuado para llevar a cabo los cultivos por lote alimentado y lote
alimentado repetido
347 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote
alimentado repetido en un reactor airlift
Para los cultivos por lote alimentado y lote alimentado repetido se utilizoacute el reactor airlift
con el tubo conceacutentrico seleccionado previamente Los cultivos por lote alimentado se
iniciaron con un cultivo por lote utilizando las condiciones iniciales mencionadas en el
inciso 446 y una aireacioacuten de 05 vvm El cultivo por lote se mantuvo en operacioacuten
hasta que la concentracioacuten de Cr(VI) residual fue baja
A continuacioacuten el reactor se drenoacute hasta alcanzar un volumen de liacutequido en el reactor de
25 litros y se inicioacute el suministro continuo de medio de alimentacioacuten con una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM La alimentacioacuten se mantuvo hasta que se alcanzoacute un
volumen de medio liacutequido en el reactor de 37 litros (primer cultivo por lote alimentado)
41
Posteriormente el reactor se volvioacute a drenar hasta obtener un volumen de medio de 25
litros y enseguida se volvioacute a suministrar continuamente medio de cultivo basal con una
concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM utilizando el mismo flujo de alimentacioacuten que para el
primer cultivo por lote alimentado El suministro de medio se mantuvo hasta alcanzar un
volumen de liacutequido en el reactor de 375-40 litros (segundo cultivo por lote alimentado o
cultivo por lote alimentado repetido)
Se ensayaron dos flujos de alimentacioacuten de 659 y 1343 mLh que representan cargas
maacutesicas de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh
Se recolectaron muestras a diferentes tiempos de incubacioacuten a las cuales se les
determinoacute la concentracioacuten de biomasa de glucosa y Cr(VI) residual asiacute como el pH
Con los datos obtenidos se estimaron las velocidades volumeacutetricas globales y las
eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI)
35 Meacutetodos analiacuteticos
351 Determinacioacuten de la concentracioacuten de biomasa
La concentracioacuten celular se determinoacute mediante el peso seco de la masa celular Las
muestras recolectadas se filtraron a traveacutes de membranas de fibra de vidrio (Whatman
GFA) con un diaacutemetro de poro de 16 m las cuales se colocaron previamente puestas a
peso constante Posteriormente las membranas se colocaron en una estufa a 95 degC
hasta alcanzar un peso constante Los filtrados se utilizaron para determinar la
concentracioacuten de glucosa Cr(VI) y cromo total residual asiacute como el pH
352 Determinacioacuten de la concentracioacuten de glucosa
42
Se determinoacute mediante un meacutetodo enzimaacutetico empleando a la glucosa oxidasa y
peroxidasa (Worthington Biochemical Corporation 1972)
Principio El meacutetodo se basa en que la glucosa es oxidada a aacutecido glucoacutenico por la
glucosa oxidasa la cual cataliza la siguiente reaccioacuten
-D-glucosa + H2O + O2 Aacutecido D-glucoacutenico + H2O2
El peroacutexido de hidroacutegeno generado reacciona con el sistema peroxidasa - orto-
dianisidina dando como resultado la oxidacioacuten de la orto-dianisidina y la produccioacuten de
agua de acuerdo con la siguiente reaccioacuten
H2O2 + orto-dianisidina (reducida) ortondashdianisidina (oxidada) + H2O
peroxidasa
La orto-dianisidina oxidada presenta un color pardo que en medio aacutecido vira a color
rosa la cual se lee a una longitud de onda de 540 nm (figura 3)
Figura 3 Orto-dianisidina (33rsquo ndash dimetoxidibencidina)
H2N NH2
OCH3
OCH3
43
353 Determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo hexavalente
La concentracioacuten de cromo hexavalente se determinoacute por la teacutecnica de la 15-
difenilcarbohidrazida siguiendo los procedimientos descritos en el meacutetodo 8023 del Hach
Water Analysis Handbook (2002) Este meacutetodo estaacute aprobado por la EPA (Environmental
Protection Agency) (Hach 2002) y por la Norma Oficial Mexicana NMX-AA-044-SCFI-
2001 (Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NMX-AA-044-SCFI-
2001)
Principio Se utilizoacute un reactivo en polvo llamado ChromaVer3 el cual contiene una
solucioacuten buffer aacutecida combinada con la 15-difenilcarbohidrazida Este uacuteltimo compuesto
reacciona con el cromo hexavalente dando un compuesto de color puacuterpura (figura 4) El
meacutetodo es aplicable para el agua ya sea fresca o de muestras de agua residual La
intensidad del color es ldirectamente proporcional a la concentracioacuten de cromo
hexavalente presente
Figura 4 Reaccioacuten de la 15-difenilcarbohidrazida con el cromo hexavalente
+ Cr 6+
Compuesto colorido
puacuterpura
N N
Cr O
C R
O
N N
H H
C R
15-difenilcarbohidrazida
2 N N N
H H
N C
H O
H
44
354 Determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo total
La determinacioacuten de la concentracioacuten de cromo total de los filtrados de las muestras
recolectadas (cromo total en solucioacuten) se realizoacute por espectroscopiacutea de absorcioacuten
atoacutemica con flama de acetileno-aire (SpectrAA220 FS Varian Inc)
Para determinar la cantidad de cromo retenido por la biomasa de Candida sp las ceacutelulas
fueron lavadas con agua desionizada deshidratadas y posteriormente fueron digeridas
con aacutecido niacutetrico concentrado La solucioacuten obtenida se enfrioacute a temperatura ambiente y
se le adicionoacute agua desionizada hasta obtener un volumen final de 50 mL Este
procedimiento estaacute descrito en la Norma Oficial Mexicana NMX-AA-051-SCFI-2001
(Secretariacutea de Economiacutea 2001) La concentracioacuten de cromo total de la solucioacuten
resultante se determinoacute en un espectrofotoacutemetro de absorcioacuten atoacutemica con un horno de
grafito (SpectrAA220 FS Varian Inc)
355 Determinacioacuten del pH
Se realizoacute con un potencioacutemetro marca Oakton
45
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Meta No 1 Determinar el efecto del ioacuten sulfato sobre la reduccioacuten
de Cr(VI)
41 Efecto del sulfato sobre el crecimiento celular consumo de glucosa
remocioacuten de Cr(VI) y cromo total por Candida sp
411 Evaluacioacuten de la influencia del sulfato sobre el crecimiento celular de
Candida sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
Se determinoacute el efecto de ocho concentraciones diferentes de sulfato (00 1217 25
50 100 150 200 y 2392 mM) sobre el crecimiento celular de Candida sp cuando
eacutesta se cultivoacute por lote a nivel matraz en medios de cultivo sin Cr(VI) y con
concentraciones iniciales del metal de 17 y 33 mM Para visualizar mejor el efecto las
curvas de crecimiento celular se construyeron utilizando la relacioacuten xxo (x =
concentracioacuten celular a un determinado tiempo de incubacioacuten xo = concentracioacuten inicial
de biomasa) como variable dependiente y el tiempo de incubacioacuten (t) como variable
independiente (graacuteficas de xxo vs t) En cada una de las curvas de crecimiento se trazoacute
una liacutenea horizontal a una relacioacuten xxo de 10 para observar si ocurriacutea crecimiento o
lisis celular
En la figura 5 se muestran las curvas de crecimiento celular de Candida sp cuando eacutesta
se cultivoacute en medios de cultivo con diferentes concentraciones de sulfato y sin Cr(VI) Se
observa que el crecimiento de Candida sp fue muy semejante a las diferentes
concentraciones de sulfato ensayadas La levadura fue capaz de crecer en el medio de
cultivo al que no se le adicionoacute sulfato de amonio y sulfato de magnesio (0 mM de
46
SO42-) lo cual sugiere que la cantidad de sulfato proporcionado por otros componentes
del medio de cultivo ndash por ejemplo provenientes del extracto de levadura yo de
impurezas contenidas en las sales inorgaacutenicas adicionadas al medio de cultivo (002
mM) mdash fue suficiente para permitir un adecuado crecimiento de la levadura Los
resultados tambieacuten mostraron que la adicioacuten de sulfato en forma de sales inorgaacutenicas
[(NH4)2SO4 o Mg(SO4)7H20] no tuvo alguacuten efecto inhibidor o estimulador del crecimiento
celular
Figura 5 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo sin Cr(VI)
En la figura 6 se presentan las curvas de crecimiento de Candida sp que se obtuvieron
cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo con una concentracioacuten inicial de
Cr(VI) de 17 mM a las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas En la figura se
aprecia lo siguiente 1) A una concentracioacuten de sulfato de 0 mM ocurrioacute lisis celular 2)
el crecimiento neto de la levadura fue praacutecticamente nulo a una concentracioacuten de sulfato
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
47
de 1217 mM 3) el crecimiento de la levadura fue evidente a partir de una
concentracioacuten de sulfato de 25 mM y 4) en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de
10 a 2392 mM el crecimiento de la levadura fue muy semejante y superior al alcanzado
a una concentracioacuten de sulfato de 5 mM Asimismo cuando se utilizaron concentraciones
de sulfato de 10 a 2392 mM se alcanzaron niveles de concentracioacuten de biomasa
similares a los obtenidos en ausencia del metal (cultivos control) (figuras 5 y 6) De
estos resultados es evidente que a medida que se incrementoacute la concentracioacuten de
sulfato los efectos toacutexicos del Cr(VI) sobre el crecimiento de la levadura disminuyeron
hasta que eacutestos fueron praacutecticamente nulos es decir la tolerancia de la levadura al
Cr(VI) aumentoacute conforme se incrementoacute la concentracioacuten de sulfato en el medio de
crecimiento de Candida sp
Figura 6 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo con 17 mM de Cr(VI)
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
48
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM ocurrioacute lisis celular
cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo con concentraciones de sulfato en el
intervalo de 0 a 5 mM (figura 7) en contraste el crecimiento celular de la levadura se
incrementoacute a medida que la concentracioacuten de sulfato aumentoacute de 10 a 2392 mM En
este uacuteltimo intervalo de concentracioacuten de sulfato se observoacute que a tiempos de
incubacioacuten superiores a las 150 h se presentoacute lisis celular A ninguna de las
concentraciones de sulfato ensayadas se alcanzaron densidades celulares semejantes a
las obtenidas en los cultivos sin Cr(VI) o con 17 mM de Cr(VI) lo cual podriacutea deberse a
la mayor toxicidad de los medios de cultivo
Figura 7 Efecto del SO42-
sobre el crecimiento celular de Candida sp en medios de
cultivo con 33 mM de Cr(VI)
En la figura 8 se muestra la variacioacuten de la velocidad especiacutefica de crecimiento ( ) y de
lisis celular (kd) de Candida sp en funcioacuten de la concentracioacuten de SO42- a las diferentes
concentraciones de Cr(VI) ensayadas [0 17 y 33 mM]
000
050
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
XX
o
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
49
Figura 8 Variacioacuten de la velocidad especiacutefica de crecimiento o de lisis celular en funcioacuten
de la concentracioacuten de SO42- a las diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI)
ensayadas
-0002
0
0002
0004
0006
0008
001
0012
0014
0016
0018
0 5 10 15 20 25 30
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Ve
loc
ida
d e
sp
ec
iacutefic
a [
h-1
]
0 mM
17 mM
33 mM
Promedio
Sin Cr(VI)
50
Cuando la levadura se cultivoacute en medios de cultivo sin Cr(VI) su velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento se mantuvo praacutecticamente constante en todo el intervalo de
concentracioacuten de sulfato ensayado con un valor promedio de 00144 h-1
A la concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la velocidad especiacutefica de crecimiento de
Candida sp aumentoacute casi linealmente con respecto a la concentracioacuten de sulfato en el
intervalo de concentracioacuten de 0 a 10 mM (r2 = 096) alcanzando un valor maacuteximo de
00142 h-1 a la uacuteltima concentracioacuten de sulfato Esta velocidad especiacutefica de crecimiento
es muy similar a las obtenidas en los cultivos sin Cr(VI) A concentraciones de sulfato
superiores a 5 mM la velocidad especiacutefica de crecimiento se mantuvo praacutecticamente
constante Estos resultados concuerdan con los perfiles de crecimiento celular mostrados
anteriormente
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM se obtuvieron
velocidades especiacuteficas de lisis celular (kd) de 00013 a 00003 h-1 ( = -00013 - 00003
h-1) en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de 0 a 5 mM (figura 8) A
concentraciones de sulfato superiores a 5 mM la velocidad neta de crecimiento fue
positiva La velocidad especiacutefica aumentoacute linealmente en todo el intervalo de
concentracioacuten de sulfato ensayado (r2 = 099) aunque las velocidades alcanzadas fueron
notoriamente inferiores a las obtenidas en los medios de cultivo sin Cr(VI) y con una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM
De los resultados anteriores se deduce que el sulfato desempentildea un papel importante en
la tolerancia (resistencia) de Candida sp a los efectos toacutexicos del Cr(VI) A medida que
se incrementoacute la concentracioacuten de sulfato la levadura fue maacutes tolerante (resistente) a
51
los efectos dantildeinos del Cr(VI) y por consiguiente su crecimiento celular fue menos
afectado Asimismo los resultados muestran que el ―efecto protector del sulfato sobre el
crecimiento de Candida sp dependioacute de la concentracioacuten inicial de Cr(VI)
Pepi y Baldi (1992) investigaron el efecto de diferentes aminoaacutecidos azufrados y del
sulfato sobre la tolerancia de algunas levaduras al Cr(VI) Estos investigadores
encontraron que en presencia de 02 mM de Cr(VI) se requirieron pequentildeas cantidades
de cisteiacutena [001ndash01 mM] para estimular significativamente [10-100] el crecimiento
de Rhodosporidium sp y que para incrementar el crecimiento de Candida sp en hasta
80 fue necesaria una concentracioacuten de cisteiacutena de 01 mM Un comportamiento similar
se observoacute en estas dos cepas cuando se adicionoacute metionina En contraste el
crecimiento celular de Candida famata fue inhibido cuando la levadura se cultivoacute en
medios con concentraciones de cisteiacutena superiores a 005 mM y con 02 mM de Cr(VI)
Por otra parte cuando Candida sp se cultivoacute en medios con diferentes concentraciones
de sulfato (4ndash160 mM) y de Cr(VI) (004ndash02 mM) se encontroacute que el ioacuten sulfato
incrementoacute la tolerancia de la levadura al Cr(VI) El mecanismo general de resistencia al
cromato en Candida sp se atribuyoacute a una reducida captacioacuten (incorporacioacuten) de cromo
(Pepi y Baldi 1992)
Ohtake y col (1987) encontraron que la adicioacuten de altas concentraciones de sulfato
incrementoacute el crecimiento celular de dos cepas de Pseudomonas fluorescens (LB300 y
LB303) en presencia de CrO42- Ademaacutes encontraron que el nivel de resistencia al CrO4
2-
en P fluorescens dependioacute de la fuente de azufre en el medio de cultivo ya que las
ceacutelulas bacterianas que crecieron con cisteiacutena fueron mucho maacutes resistentes al CrO42-
que las ceacutelulas que crecieron sobre sulfato Como el cromato es transportado al interior
52
de las ceacutelulas de Pseudomonas a traveacutes del sistema de transporte del sulfato la habilidad
del sulfato para proteger a las ceacutelulas de P fluorescens LB300 de los efectos inhibitorios
del Cr(VI) se atribuyoacute a que el sulfato inhibioacute competitivamente la captacioacuten del cromato
por las ceacutelulas bacterianas (Ohtake y col 1987)
En contraste la resistencia de Ochrobactrum tritici cepa 5bvI1 al Cr(VI) fue
independiente de la concentracioacuten de sulfato (Branco y col 2004)
412 Evaluacioacuten del efecto del sulfato sobre el consumo de glucosa por Candida
sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
La glucosa fue completamente consumida (eficiencia global de consumo de glucosa =
100) en aproximadamente 83 h de incubacioacuten cuando la levadura se cultivoacute en medios
que no conteniacutean Cr(VI) y con diferentes concentraciones de sulfato No se observoacute
diferencia considerable en el consumo de glucosa a ninguna de las concentraciones de
sulfato utilizadas (figura 9)
53
Figura 9 Variacioacuten en el consumo de glucosa por Candida sp cuando se utilizaron
medios de cultivo con diferentes concentraciones de sulfato y sin Cr(VI)
En los experimentos realizados con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM
(figura 10) se observoacute que la levadura fue capaz de consumir aproximadamente 30-
35 de la glucosa inicialmente adicionada a los medios que conteniacutean sulfato a
concentraciones de 0 y 1217 mM a pesar de que a estas condiciones de cultivo ocurrioacute
lisis celular [0 mM de SO42-] o el crecimiento celular de la levadura fue despreciable
[1217 mM de SO42-] (figura 6) Candida sp consumioacute todo el monosacaacuterido presente
en los medios de cultivo con concentraciones de sulfato superiores a 1217 mM
(eficiencia global de consumo de glucosa del 100) sin embargo el tiempo que se
requirioacute para que eacutesto sucediera disminuyoacute a medida que se incrementoacute la concentracioacuten
de sulfato (figura 10) Los perfiles de consumo de glucosa en los cultivos de Candida
sp fueron semejantes cuando se utilizaron concentraciones de sulfato de 10 a 2392
mM y eacutestos a su vez fueron similares a los obtenidos en los medios de cultivo que no
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa
re
sid
ua
l [
]0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
54
conteniacutean Cr(VI) (figuras 9 y 10) Lo anterior podriacutea deberse a que el crecimiento
celular de estos cultivos fue semejante (figura 6)
Figura 10 Variacioacuten del porcentaje de glucosa residual en los cultivos de Candida sp a
las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas y con 17 mM de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
55
Cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM los niveles de glucosa
residual disminuyeron a medida que aumentoacute la concentracioacuten de sulfato (figura 11)
Sin embargo estos niveles fueron superiores a los alcanzados a 17 mM de Cr(VI) a
todas las concentraciones de sulfato ensayadas La mayor eficiencia de consumo de
glucosa fue de aproximadamente 80 y se obtuvo a una concentracioacuten de sulfato de
2392 mM
Figura 11 Variacioacuten del porcentaje de glucosa residual en los cultivos por lote de
Candida sp a las diferentes concentraciones de sulfato ensayadas y con 33 mM de
Cr(VI)
A las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas [17 y 33 mM] se observoacute que
en las primeras horas de incubacioacuten los cultivos de levadura en los que ocurrioacute lisis
celular consumieron una determinada cantidad de glucosa la cual probablemente se
utilizoacute para el mantenimiento de las ceacutelulas vivas
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Glu
co
sa r
es
idu
al [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
56
Tanto en los experimentos realizados a 17 como a 33 mM de Cr(VI) se encontroacute que
los cultivos que alcanzaron mayores densidades celulares fueron los que consumieron
mayor cantidad de glucosa y esto ocurrioacute cuando se utilizaron concentraciones altas de
sulfato
413 Evaluacioacuten del efecto del sulfato sobre la variacioacuten del pH de los cultivos
de Candida sp en ausencia y presencia de Cr(VI)
Los perfiles de variacioacuten del pH de los medios de cultivo fueron muy semejantes a las
diferentes concentraciones de sulfato ensayadas cuando la levadura se cultivoacute en los
medios de cultivo sin Cr(VI) (figura 12) A todas las concentraciones de sulfato
utilizadas el pH disminuyoacute desde aproximadamente 6 hasta 28 en las primeras once
horas de incubacioacuten En el periodo comprendido entre las 11 y las 60 h de incubacioacuten el
pH de los medios de cultivo disminuyoacute ligeramente hasta alcanzar valores cercanos a
25 A tiempos posteriores a 60 h el pH de los medios de cultivo se mantuvo
praacutecticamente constante
Figura 12 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo de Candida sp en ausencia de
Cr(VI) y a las diferentes concentraciones de SO42- ensayadas
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
57
En la figura 13 se muestran los perfiles de variacioacuten del pH de los medios de cultivo
cuando la levadura se cultivoacute a las diferentes concentraciones de sulfato y a una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM El pH de los cultivos disminuyoacute raacutepidamente
en las primeras 15 h de incubacioacuten a todas las concentraciones de sulfato ensayadas La
disminucioacuten del pH fue mayor en los cultivos con las concentraciones maacutes altas de
sulfato lo cual podriacutea deberse a que a estas condiciones la levadura consumioacute mayor
cantidad de glucosa y las densidades celulares alcanzadas fueron maacutes altas A tiempos
de incubacioacuten superiores a 15 h el pH continuoacute disminuyendo pero a menor velocidad
Los niveles de pH maacutes bajos se obtuvieron cuando se utilizaron concentraciones de
sulfato de 5 a 2392 mM alcanzaacutendose valores semejantes a los obtenidos en los medios
sin Cr(VI) (de aproximadamente 25)
Figura 13 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
58
Un comportamiento cualitativo similar se obtuvo cuando Candida sp se cultivoacute en medios
con diferentes concentraciones de sulfato y con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33
mM (figura 14) El pH maacutes bajo se alcanzoacute a concentraciones altas de sulfato [20 y
2392 mM] y fue de aproximadamente 36 el cual es superior a los valores maacutes bajos
que se obtuvieron en los cultivos sin Cr(VI) y con 17 mM de Cr(VI) Esto uacuteltimo podriacutea
deberse a que el incremento de la concentracioacuten celular y el consumo de glucosa fueron
inferiores a los alcanzados con las otras concentraciones de Cr(VI) [0 y 17 mM]
Figura 14 Variacioacuten del pH de los medios de cultivo con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
414 Efecto del sulfato sobre la remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp
En la figura 15 se muestran las variaciones del porcentaje de Cr(VI) residual de los
cultivos de Candida sp cuando se emplearon diferentes concentraciones de sulfato y
una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM A una concentracioacuten de sulfato de 0 mM
00
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
pH
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
59
la remocioacuten de Cr(VI) fue muy baja (de aproximadamente 83) es conveniente
mencionar que a esta concentracioacuten de sulfato (0 mM) y de Cr(VI) (17 mM) ocurrioacute lisis
celular y la levadura consumioacute una pequentildea cantidad de glucosa en las primeras horas
de incubacioacuten La remocioacuten de Cr(VI) se incrementoacute a medida que aumentoacute la
concentracioacuten de sulfato de 0 a 10 mM A partir de esta uacuteltima concentracioacuten de sulfato
los perfiles de remocioacuten de Cr(VI) fueron muy similares y esto podriacutea deberse a que la
densidad celular de los cultivos fueron praacutecticamente iguales Todo o casi todo el Cr(VI)
inicialmente adicionado a los medios de cultivo fue removido cuando se empleoacute una
concentracioacuten de sulfato igual o superior a 25 mM (figura 15)
Figura 15 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
En contraste cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM la levadura
no fue capaz de remover todo el Cr(VI) inicialmente presente en los medios de cultivo a
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
60
ninguna de las concentraciones de sulfato ensayadas (figura 16) Sin embargo los
niveles de Cr(VI) residual disminuyeron a medida que se incrementoacute la concentracioacuten de
sulfato
Figura 16 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y diferentes
concentraciones de sulfato
A las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas los cultivos de levadura en los
que ocurrioacute lisis celular en las primeras horas de incubacioacuten [0 mm de SO42- 17 mM de
Cr(VI) y 0-5 mM de SO42- 33 mM de Cr(VI)] fueron capaces de remover una pequentildea
cantidad de Cr(VI) Estos resultados concuerdan con lo reportado por Wang y Shen
(1997) quienes encontraron que la densidad celular de los cultivos de Escherichia coli y
Bacillus sp disminuyoacute continuamente durante el curso de la remocioacuten de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
0 mM
1217 mM
25 mM
5 mM
10 mM
15 mM
20 mM
2392 mM
61
A las diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI) y de sulfato ensayadas se observoacute
que aunque los niveles de Cr(VI) residual disminuyeron a medida que la incubacioacuten
progresoacute las concentraciones de cromo total en solucioacuten permanecieron casi constantes
a lo largo de todo el periodo de incubacioacuten (aproximadamente el 97 del cromo
inicialmente adicionado a los medios de cultivo estuvo siempre presente en solucioacuten)
Maacutes auacuten el anaacutelisis del contenido de cromo en la biomasa de Candida sp (de muestras
recolectadas al final de los experimentos) reveloacute que uacutenicamente el 29 009 del
cromo total removido por los cultivos fue incorporado en la biomasa
Como se mostroacute anteriormente los cultivos con ceacutelulas viables se iniciaron con un pH de
aproximadamente 60 y eacuteste disminuyoacute durante el tiempo de incubacioacuten hasta valores de
25 ndash 36 dependiendo de la concentracioacuten de sulfato y de Cr(VI) utilizada Como se
sabe que los pHacutes bajos favorecen la reduccioacuten del Cr(VI) por la materia orgaacutenica
(donadores de electrones) en el presente trabajo se llevaron a cabo experimentos sin
biomasa de Candida sp (controles libres de ceacutelulas) a diferentes valores de pH (25 3
4 5 y 6) y a las dos diferentes concentraciones de Cr(VI) ensayadas (17 y 33 mM)
para determinar si los componentes presentes en los medios de cultivo pueden reducir el
Cr(VI) En las figuras 17 y 18 se muestran los perfiles de Cr(VI) residual que se
obtuvieron con los controles abioacuteticos ensayados
62
Figura 17 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los controles libres de
ceacutelulas llevados a cabo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM y a diferentes
valores de pH
Figura 18 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los controles libres de
ceacutelulas realizados con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 33 mM y a diferentes
valores de pH
00
200
400
600
800
1000
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
pH = 25
pH = 3
pH = 4
pH = 5
pH = 6
00
200
400
600
800
1000
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [
]
pH = 25
pH = 3
pH = 4
pH = 5
pH = 6
63
A las dos concentraciones de Cr(VI) ensayadas se observoacute una reduccioacuten despreciable
del metal (inferior a 05) en el intervalo de valores de pH de 4 a 6 a un pH de 3 el
porcentaje de reduccioacuten fue de aproximadamente 12 y de 3 cuando el pH fue de
25 Estos resultados sugieren que los componentes de los medios de cultivo
praacutecticamente no redujeron el Cr(VI) a ninguno de los pHrsquos ensayados
En conjunto los resultados antes mostrados indican que el principal mecanismo de
remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp fue la biotransformacioacuten (reduccioacuten) del Cr(VI) a
Cr(III) y que la reduccioacuten abioacutetica del Cr(VI) y la captacioacuten de cromo por la biomasa de
la levadura fueron despreciables Asimismo los resultados tambieacuten muestran que la
reduccioacuten del Cr(VI) por los cultivos se debioacute a la actividad metaboacutelica de las ceacutelulas de
Candida sp
En la figura 19 se presentan las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) que se
obtuvieron a las diferentes concentraciones iniciales de sulfato y de Cr(VI) ensayadas Se
aprecia que cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la eficiencia
de reduccioacuten se incrementoacute desde 179 hasta 986 a medida que la concentracioacuten
de sulfato aumentoacute de 0 a 25 mM a concentraciones de sulfato superiores la eficiencia
de reduccioacuten fue del 100 Asimismo en los experimentos realizados a 33 mM de
Cr(VI) la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) aumentoacute desde 83 hasta 84 conforme la
concentracioacuten de sulfato aumentoacute de 0 a 2392 mM
64
Figura 19 Eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por los cultivos de
Candida sp a las diferentes concentraciones de sulfato y de Cr(VI) ensayadas
La velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) tambieacuten fue afectada por la
concentracioacuten de sulfato y de Cr(VI) utilizada (figura 20) Cuando se empleoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten maacutes alta
fue de 098 mg de Cr(VI)Lh y se obtuvo en el intervalo de concentracioacuten de sulfato de
10 a 2392 mM En cambio la velocidad maacutes alta que se alcanzoacute a 33 mM de Cr(VI) fue
de 044 mg de Cr(VI)Lh y se obtuvo a la maacutexima concentracioacuten de sulfato ensayada
(2392 mM)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 1217 25 5 10 15 20 2392
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Efi
cie
ncia
glo
bal d
e r
ed
uccioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
17 mM
33 mM
65
Figura 20 Velocidades volumeacutetricas globales de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas en los
cultivos de Candida sp a diferentes concentraciones de sulfato y de Cr(VI)
A todas las concentraciones de sulfato ensayadas la eficiencia y velocidad volumeacutetrica de
reduccioacuten de Cr(VI) alcanzadas a una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 17 mM fueron
superiores a las obtenidas a 33 mM de Cr(VI) y esto podriacutea deberse a que los efectos
toacutexicos del Cr(VI) sobre la levadura se incrementan a medida que aumenta la
concentracioacuten del metal
De los resultados anteriores es evidente que el sulfato afectoacute la reduccioacuten aeroacutebica de
Cr(VI) por Candida sp Estos resultados difieren con lo reportado por otros
investigadores quienes no han encontrado un efecto inhibidor ni estimulador del sulfato
sobre la reduccioacuten de Cr(VI) en cultivos aeroacutebicos
000
010
020
030
040
050
060
070
080
090
100
0 1217 25 5 10 15 20 2392
Concentracioacuten de SO42-
[mM]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica d
e r
ed
uccioacute
n d
e C
r(V
I)
[mg
de
Cr(
VI)
Lh
]
17 mM
33 mM
66
Ishibashi y col (1990) encontraron que concentraciones de sulfato de hasta 1 mM
incrementaron la resistencia de Pseudomonas putida al cromato pero no tuvieron efecto
sobre la reduccioacuten de eacuteste En cultivos de Bacillus sp (Wang y Xiao 1995) y de
Acinetobacter haemolyticus (Zakaria y col 2006) se observoacute que una concentracioacuten de
sulfato de 10 mM no afectoacute la reduccioacuten de Cr(VI) Liu y col (2006) reportaron que
concentraciones de sulfato de 40 y 80 mgL (0416 y 083 mM) no tuvieron efecto sobre
la reduccioacuten aeroacutebica de Cr(VI) por Bacillus sp XW-4
En contraste el sulfato generalmente tiene efecto sobre la reduccioacuten bacteriana del
cromato bajo condiciones de anaerobiosis lo cual podriacutea deberse a que el sulfato compite
con el cromato como aceptor final de electrones (Garbisu y col 1998 Liu y col 2006)
En cultivos anaeroacutebicos de Escherichia coli ATCC 33456 la velocidad de reduccioacuten de
Cr(VI) no fue afectada por hasta 416 mM de sulfato sin embargo la velocidad
disminuyoacute a 83 mM de sulfato (Shen y Wang 1994) La actividad de reduccioacuten de Cr(VI)
de Enterobacter cloacae HO1 bajo condiciones anaeroacutebicas fue inhibida en 32 en
presencia de tan soacutelo 25 M de sulfato (Komori y col 1989)
Como se mencionoacute anteriormente el sulfato incrementoacute la tolerancia al Cr(VI) de la cepa
de Candida sp aislada por Pepi y Baldi (1992) sin embargo esta cepa de levadura fue
incapaz de reducir el Cr(VI) Asimismo auacuten cuando se ha reportado que Pseudomonas
fluorescens LB300 es capaz de reducir el Cr(VI) a Cr(III) (Bopp y Ehrlich 1988) y que el
sulfato incrementa el crecimiento celular de esta bacteria en presencia de cromato
(Ohtake y col 1987) hasta donde sabemos no se ha reportado el efecto del sulfato
sobre la reduccioacuten de Cr(VI) por este microorganismo
67
Los resultados anteriores muestran claramente que el sulfato afectoacute la tolerancia de
Candida sp al Cr(VI) y a su capacidad para reducirlo Es evidente que a medida que se
incrementoacute la concentracioacuten de sulfato el crecimiento de la levadura fue mayor y su
eficiencia y velocidad de reduccioacuten de Cr(VI) aumentaron Los resultados tambieacuten
muestran que la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp depende de la densidad celular de
los cultivos de manera tal que a mayor cantidad de biomasa generada mayor es la
reduccioacuten de Cr(VI) Aun cuando la cepa de Candida sp es muy sensible a los efectos
toacutexicos del Cr(VI) en ausencia de sulfato esta levadura posee una capacidad notable
para reducir muy altas concentraciones del metal en presencia de sulfato
Meta No 2 Determinar la capacidad de reduccioacuten de Cr(VI) en
diferentes sistemas de reaccioacuten
42 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso
Se utilizoacute un reactor airlift con tubo conceacutentrico liso (sin perforaciones) para el cultivo por
lote de Candida sp Para este sistema de reaccioacuten se utilizoacute un volumen de operacioacuten de
4 litros de medio basal con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM El biorreactor
se inoculoacute con un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada de tal
forma que la concentracioacuten inicial de biomasa fue de 12 mgmL El pH inicial fue de
aproximadamente 60 El reactor se operoacute por lote hasta que la concentracioacuten de Cr(VI)
residual fue despreciable
68
La concentracioacuten celular se incrementoacute gradualmente a medida que la incubacioacuten
progresoacute hasta que alcanzoacute un valor maacuteximo de aproximadamente 39 gL lo cual
ocurrioacute a las 42 h de incubacioacuten A tiempos posteriores la concentracioacuten de biomasa
disminuyoacute debido a que ocurrioacute lisis celular (figura 21) La velocidad especiacutefica maacutexima
de crecimiento de la levadura fue de 00244 h-1 la cual fue superior a la obtenida en
matraz cuando crecioacute con 17 mM de Cr(VI) (00142 h-1) esta diferencia podriacutea deberse
a que en el reactor airlift las ceacutelulas de Candida sp tuvieron una mayor cantidad de
oxiacutegeno disponible para su crecimiento
Figura 21 Variacioacuten de la concentracioacuten de biomasa y de glucosa en el cultivo por lote
de Candida sp en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM
La levadura consumioacute la principal fuente de carbono y energiacutea (glucosa) presente en el
medio de cultivo a lo largo de todo el tiempo de incubacioacuten incluso durante el periodo en
el que ocurrioacute lisis celular La glucosa no fue completamente consumida por la levadura
00
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo [h]
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e g
luc
os
a
res
idu
al [g
L]
00
05
10
15
20
25
30
35
40
45
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e b
iom
as
a [
gL
]Glucosa Biomasa
69
al final del experimento la concentracioacuten de glucosa residual fue de 17 gL (figura 21)
por lo que la eficiencia global de consumo del monosacaacuterido fue del 835
El pH del medio de cultivo disminuyoacute desde 60 hasta aproximadamente 25 Este uacuteltimo
valor se alcanzoacute a las 292 h de incubacioacuten y se mantuvo praacutecticamente constante a
tiempos posteriores (figura 22)
Figura 22 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) y del pH en el cultivo por lote de
Candida sp en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 15 mM
La concentracioacuten de Cr(VI) residual disminuyoacute progresivamente a medida que se
incrementoacute el tiempo de incubacioacuten hasta que a las 468 h ya no se detectoacute Cr(VI) en el
medio de cultivo por lo que la eficiencia global de remocioacuten de Cr(VI) fue del 100 Se
observoacute una ligera remocioacuten de Cr(VI) durante el periodo en el que ocurrioacute lisis celular
(figuras 21 y 22) En contraste la concentracioacuten de cromo total en solucioacuten se
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo [h]
Cr(
VI)
y C
rom
o t
ota
l re
sid
ua
l [m
gL
]
00
10
20
30
40
50
60
70
pH
[Cr(VI)] [Cromo total] pH
70
mantuvo casi constante a lo largo del tiempo de cultivo Lo anterior indica que la
levadura fue capaz de transformar el Cr(VI) a la forma trivalente menos toacutexica
En la tabla 6 se comparan los valores de algunas variables cineacuteticas obtenidas en
matraz (cuando se hizo crecer la levadura a una concentracioacuten de Cr(VI) inicial de 17
mM) y en el biorreactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando la levadura se cultivoacute en
medio de cultivo con concentraciones iniciales semejantes de Cr(VI) y de sulfato
Tabla 6 Variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote de Candida sp realizados
en matraz y en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Variable cineacutetica Matraz Reactor
Incremento celular maacuteximo [gL] 22 263
Velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento [h-1] 00142 00244
Eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) [] 100 100
Velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI)L h] 098 164
Velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI) g biomasa h] 045 095
Capacidad de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI) g biomasa] 400 443
El incremento celular maacuteximo y la velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento de
Candida sp obtenidos en el reactor airlift fueron 1955 y 718 superiores a los
alcanzados en matraz respectivamente Como se mencionoacute previamente eacutesto podriacutea
deberse a que en el reactor airlift la levadura tuvo una mayor cantidad de oxiacutegeno
disponible para su crecimiento
71
La levadura redujo todo el Cr(VI) inicialmente presente en el medio de cultivo [eficiencia
global de reduccioacuten de Cr(VI) del 100] tanto cuando se cultivoacute en matraz como en el
reactor airlift El hecho de que Candida sp sea capaz de reducir concentraciones de
Cr(VI) tan altas como 15 mM (e incluso superiores como se mostroacute en la seccioacuten
anterior) podriacutea ser de importancia praacutectica porque la mayoriacutea de los microorganismos
ensayados son capaces de reducir parcial o totalmente concentraciones maacutes bajas de
Cr(VI) (tabla 7)
Tabla 7 Datos sobre reduccioacuten de Cr(VI) por microorganismos
Microorganismo Cultivo
Modo de
operacioacuten
Concentra-
cioacuten de
Cr(VI)
[mM]
Velocidad
volumeacutetrica
de reduccioacuten
[mg de
CrLh]
Eficiencia
de
reduccioacuten
[]
Referencia
Acinetobacter
haemolitycus
Aerobio
CPL
067 128 88 Zakaria y col
2006
Aislado de
Pseudomonas
(CRB5)
Aerobio
CPL
043 014 100 McLean y
Beveridge 2000
Arthrobacter
sp
Aerobio
CPL
017 016 65 Megharaj y col
2003
Aspergillus sp Aerobio
CPL
096 0694 100 Acevedo-Aguilar
y col 2006
Bacillus
megaterium
TKW3
Aerobio
CPL
048 009 735 Cheung y Gu
2005
Bacillus sp Aerobio
CPL
007 007 65 Megharaj y col
2003
Bacteria J3 Aerobio
CPL
01 00057 21 Badar y col
2000
Brevibacterium
CrT-13
Aerobio
CPL
288 255 68 Faisal y Hasnain
2004
E coli AC80 Aerobio
CPL
002
065
9375
Ishibashi y col
1990
Ochrabactrum
sp
Aerobio
CPL
017
034
033
038
100
88
Thacker y
Madamwar 2005
72
Ochrobactrum
intermedium Cr-
T1
Aerobio
CPL
288 326 87 Faisal y Hasnain
2004
Penicillium sp Aerobio
CPL
096 066 95 Acevedo-Aguilar y
col 2006
Phanerochaete
chrysosporium
Aerobio
CPL
058 011 100 Pal 1997
Providencia
sp
Aerobio
CPL
102 10 100 Thacker y col
2006
Pseudomonas
ambigua G-1
Aerobio
CPL
288 347 83 Horitsu y col
1987
Streptomyces
griseus
Aerobio
CPL
017 025 100 Laxman y More
2002
Trichoderma
inhamatum
Aerobio
CPL
13
075 100 Morales-Barrera y
Cristiani-Urbina
2008
Trichoderma
viride
Aerobio
CPL
16
104 100 Morales-Barrera y
Cristiani-Urbina
2006
CPL = Cultivo por lote
La velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) obtenida en el reactor neumaacutetico
con Candida sp fue de 164 mg de Cr(VI)Lh la cual fue 6735 superior a la alcanzada
en matraz [098 mg de Cr(VI)Lh] (tabla 6) Esto uacuteltimo podriacutea deberse a la mayor
cantidad de biomasa generada en el reactor la cual redujo maacutes raacutepidamente el Cr(VI)
Acinetobacter haemolitycus fue capaz de reducir completamente 096 mM de Cr(VI) en
36 h por lo que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal de este microorganismo
fue de 139 mg de Cr(VI)Lh sin embargo cuando la concentracioacuten inicial de Cr(VI) se
incrementoacute a 135 mM la eficiencia y velocidad de reduccioacuten disminuyeron (Zakaria y
col 2006)
A una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 017 mM la eficiencia y velocidad volumeacutetrica
global de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por Ochrabactrum sp fue del 100 y 033 mg
de Cr(VI)Lh respectivamente Aunque la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal
73
se incrementoacute a 038 mg de Cr(VI)Lh cuando la concentracioacuten inicial de Cr(VI) fue de
034 mM la eficiencia de reduccioacuten disminuyoacute a 88 (Thacker y Madamwar 2005)
La eficiencia y velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas con Arthrobacter
sp a las 70 h de incubacioacuten fue de aproximadamente 65 y 016 mg de Cr(VI)Lh
cuando se utilizoacute una concentracioacuten inicial del metal de 017 mM (Megharaj y col 2003)
Con Providencia sp se obtuvo una eficiencia de reduccioacuten del 100 al cabo de 108 h de
incubacioacuten en medios de cultivo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 102 mM
siendo su velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal de 10 mg de Cr(VI)Lh (Thacker
y col 2006) La velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Streptomyces griseus
fue de 025 mg de Cr(VI)Lh cuando se cultivoacute en presencia de 017 mM de Cr(VI)
(Laxman y More 2002)
En el caso de eucariotes Acevedo-Aguilar y col (2006) reportaron que Penicillium sp y
Aspergillus sp fueron capaces de reducir por completo 096 mM de Cr(VI) en 72 h
obtenieacutendose una velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de 0694 mg de Cr(VI)Lh
Asimismo Trichoderma viride exhibioacute una eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) del 100 y
una velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de 104 mg de Cr(VI)Lh cuando se cultivoacute en
un reactor airlift en medio de cultivo con una concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 16 mM
(Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2006) Trichoderma inhamatum fue capaz de reducir
por completo 13 mM de Cr(VI) con una velocidad volumeacutetrica de 075 mg de Cr(VI)Lh
(Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2008)
En la tabla 7 se muestran los valores de eficiencia y velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten
de Cr(VI) obtenidas con otros microorganismos
74
La velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) que se obtuvo en el reactor airlift con
Candida sp fue de 095 mg de Cr(VI)g de biomasah (tabla 6) la cual fue 211 veces
mayor que la alcanzada en matraz [045 mg de Cr(VI)g de biomasah] Bae y col
(2000) reportaron que la velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) de Escherichia coli
ATCC 33456 se encontroacute en el intervalo de 031 a 07 mg de Cr(VI)g de biomasah
cuando este microorganismo se cultivoacute por lote en diferentes medios de cultivo con una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 096 mM A una concentracioacuten de Cr(VI) de 0096 mM
los lodos activados exhibieron una velocidad especiacutefica de reduccioacuten de Cr(VI) de
aproximadamente 008 mg de Cr(VI)g de biomasah (Stasinakis y col 2003) El cultivo
por lote de Trichoderma inhamatum exhibioacute una velocidad especiacutefica de
aproximadamente 0584 mg de Cr(VI)g de biomasah cuando se utilizoacute una
concentracioacuten inicial de Cr(VI) de 13 mM (Morales-Barrera y Cristiani-Urbina 2008)
Asimismo en cultivos por lote de Providencia sp realizados con una concentracioacuten inicial
de Cr(VI) de 034 mM se obtuvo una velocidad especiacutefica de reduccioacuten del metal de
1302 mgg de biomasah (Thacker y col 2006)
En el presente trabajo se encontroacute que en el reactor airlift cada gramo (peso seco) de
biomasa producida de Candida sp pudo reducir 4438 mg de Cr(VI) (tabla 6) valor
ligeramente superior al encontrado en matraz [40 mg de Cr(VI)g de biomasa] y
semejante al reportado para Trichoderma inhamatum (Morales-Barrera y Cristiani-
Urbina 2008) Asimismo a las 60 h de incubacioacuten la capacidad de reduccioacuten de
Penicillium sp y Aspergillus sp fue de aproximadamente 082 y 042 mg de Cr(VI)g de
biomasa (Acevedo-Aguilar y col 2006) Wang y Shen (1997) reportaron que la
capacidad maacutexima de reduccioacuten de Cr(VI) de los cultivos aeroacutebicos de Bacillus sp y
75
Pseudomonas fluorescens LB300 fue de 208 x 10-12 y 310 x 10-12 mg de Cr(VI)ceacutelula
respectivamente si se toma en cuenta que el peso seco promedio de una ceacutelula
bacteriana tiacutepica es de aproximadamente 3 x 10-13 g (Atkinson y Mavituna 1983)
entonces la capacidad de reduccioacuten de Bacillus sp y P fluorescens LB300 seriacutea de 693 y
1033 mg de Cr(VI)g de biomasa respectivamente
43 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote repetido en el reactor airlift con
tubo conceacutentrico liso
Se realizaron algunos cultivos por lote repetido en el reactor airlift con tubo conceacutentrico
liso (sin perforaciones) En cada uno de los cultivos ensayados el reactor se inoculoacute
inicialmente con un volumen determinado de una suspensioacuten celular concentrada de la
levadura para obtener una concentracioacuten inicial de biomasa de aproximadamente 12
mgmL La concentracioacuten inicial de Cr(VI) del medio de cultivo fue de aproximadamente
15 mM y el flujo de aire fue de 1 vvm El reactor se mantuvo en operacioacuten hasta que la
concentracioacuten de Cr(VI) residual en el medio fue baja (primer cultivo por lote) a
continuacioacuten una parte del medio de cultivo contenido en el reactor se drenoacute y se
adicionoacute medio fresco con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM Posteriormente el
reactor se operoacute nuevamente por lote (segundo cultivo por lote o cultivo por lote
repetido) Se ensayaron tres relaciones de recambio de medio de cultivo (f = volumen de
medio cosechadovolumen inicial de medio de cultivo) de 08 06 y 04
Debido a la importancia que tiene el pH del medio de cultivo en los procesos
microbioloacutegicos de reduccioacuten de Cr(VI) en el presente trabajo se llevaron a cabo cultivos
por lote repetido con relaciones de recambio de 06 y 08 en los que el pH del medio de
76
cultivo se ajustoacute a 60 al inicio del segundo cultivo por lote (cultivo por lote repetido) asiacute
como experimentos en los que el pH no se ajustoacute a 60 por lo que el pH inicial del cultivo
por lote repetido fue el alcanzado al final del primer cultivo por lote (cercano a 30) Es
conveniente mencionar que los valores bajos de pH inhiben el crecimiento de los
microorganismos pero favorecen la reduccioacuten del Cr(VI) a Cr(III) al ocurrir esto uacuteltimo
disminuye el efecto toacutexico de la forma hexavalente del metal
En estos experimentos se observoacute que el crecimiento de la levadura y la reduccioacuten de
Cr(VI) fueron adversamente afectados cuando el pH del medio de cultivo se ajustoacute a 60
al inicio de los cultivos por lote repetido En la figura 23 se muestra la variacioacuten de la
concentracioacuten de Cr(VI) residual en los cultivos por lote y lote repetido realizados con y
sin ajuste del pH al inicio de los cultivos por lote repetido cuando se utilizaron relaciones
de recambio de 06 y 08
77
Figura 23 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual en los cultivos por lote y lote
repetido realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso cuando se utilizaron
00
100
200
300
400
500
600
700
800
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [m
gL
]
f = 08 spH
f = 08 cpH
CPL CPLR
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ua
l [m
gL
] f = 06 spH
f = 06 cpH
CPL CPLR
78
relaciones de recambio de 06 y 08 (spH = sin ajuste de pH del medio de cultivo al
inicio del cultivo por lote repetido cpH = con ajuste de pH del medio de cultivo a 60 al
inicio del cultivo por lote repetido)
En la figura se aprecia que en los primeros cultivos por lote el Cr(VI) fue totalmente o
casi completamente reducido en aproximadamente 45-49 h Sin embargo en los cultivos
por lote repetido el tiempo que se requirioacute para reducir el Cr(VI) fue mayor Asimismo es
evidente que se alcanzaron concentraciones de Cr(VI) residual maacutes bajas en los sistemas
por lote repetido en los que no se ajustoacute el pH al inicio de los cultivos
Los resultados anteriores sugieren que la levadura pierde parte de su capacidad de
reduccioacuten de Cr(VI) cuando se cultiva repetidamente en medios que contienen Cr(VI)
Estos resultados concuerdan con lo reportado por Wang y Shen (1997) quienes
encontraron que Bacillus sp Pseudomonas fluorescens LB300 y Escherichia coli ATCC
33456 pierden su capacidad para reducir Cr(VI) despueacutes de que han reducido 046-052
058 y 125 mM de Cr(VI) respectivamente Un comportamiento similar tambieacuten fue
reportado por Middleton y col (2003) para Shewanella oneidensis
Como los niveles maacutes altos de reduccioacuten de Cr(VI) se obtuvieron cuando no se ajustoacute el
pH a 60 al inicio de los cultivos por lote repetido el experimento en el que se ensayoacute
una relacioacuten de recambio de 04 uacutenicamente se llevoacute a cabo sin ajustar el pH
En la figura 24 se muestra la variacioacuten de la concentracioacuten celular en los sistemas por
lote y lote repetido a las tres diferentes relaciones de recambio ensayadas (04 06 y
08) cuando no se ajustoacute el pH al inicio de los cultivos por lote repetido Se aprecia que
en ninguno de los cultivos por lote repetido se alcanzaron densidades celulares cercanas
79
a las de los cultivos por lote que los precedioacute En los cultivos por lote repetido el
incremento celular y la velocidad especiacutefica de crecimiento maacutes altos se obtuvieron
cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 06 (tabla 8) sin embargo los valores
alcanzados fueron inferiores a los obtenidos en el cultivo por lote que los antecedioacute
Figura 24 Variacioacuten de la concentracioacuten de biomasa con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo ensayadas
00
05
10
15
20
25
30
35
40
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Co
nce
ntr
acioacute
n d
e b
iom
asa
[g
L]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
80
Tabla 8 Variables cineacuteticas del crecimiento celular y de la reduccioacuten de Cr(VI)
obtenidas en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp llevados a cabo en el
reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
Variable Cultivo por lote Cultivo por lote repetido
Relacioacuten de recambio
04 06 08
Incremento celular
maacuteximo [gL]
224 230 235 017 038 009
Velocidad especiacutefica maacutexima de
crecimiento [h-1]
00244 00227 00220 00044 00109 00017
Eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) []
999 980 973 96 93 36
Velocidad
volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
[mg de Cr(VI)Lh]
160 178 151 035 046 045
En los cultivos por lote repetido se necesitoacute de una mayor cantidad de tiempo para
consumir la glucosa presente en los medios en comparacioacuten con los cultivos por lote del
cual derivaron (figura 25) Asimismo en ninguno de los cultivos se consumioacute
totalmente la glucosa la mayor eficiencia de consumo del monosacaacuterido de los cultivos
por lote repetido se obtuvo cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 06 con un
valor de 783 el cual es cercano al obtenido en los primeros cultivos por lote
(aproximadamente 835)
81
Figura 25 Variacioacuten de la concentracioacuten de glucosa con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo utilizadas
En la figura 26 se muestran los perfiles de variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI)
residual en funcioacuten del tiempo de incubacioacuten a las diferentes relaciones de recambio de
medio de cultivo utilizadas Se aprecia que en los primeros cultivos por lote se alcanzaron
niveles de Cr(VI) residual maacutes bajos y en menor tiempo que en los cultivos por lote
repetido
00
20
40
60
80
100
120
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
Co
nc
en
tra
cioacute
n d
e g
luc
os
a r
es
idu
al [g
L]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
82
Figura 26 Variacioacuten de la concentracioacuten de Cr(VI) residual con respecto al tiempo de
incubacioacuten en los cultivos por lote y lote repetido de Candida sp a las diferentes
relaciones de recambio de medio de cultivo ensayadas
En los primeros cultivos por lote se alcanzaron eficiencias y velocidades volumeacutetricas
globales de reduccioacuten de Cr(VI) de 973 - 999 y de 151 - 178 mgLh
respectivamente (tabla 8) Estas velocidades son superiores a la alcanzada en el cultivo
por lote realizado en matraz [098 mg de Cr(VI)Lh] y semejantes a la obtenida
previamente en el reactor airlift [164 mg de Cr(VI)Lh]
En los cultivos por lote repetido la eficiencia global de reduccioacuten de Cr(VI) maacutes baja se
obtuvo cuando se utilizoacute una relacioacuten de recambio de 08 y esto podriacutea deberse a que el
tiempo de incubacioacuten que se utilizoacute para este cultivo fue menor que para los otros A las
relaciones de recambio de 04 y 06 las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI)
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo [h]
[Cr(
VI)
] [m
gL
]
f = 08
f = 06
f = 04
CPL CPLR
83
fueron semejantes con valores de 96 y 93 respectivamente Estas uacuteltimas eficiencias
fueron ligeramente inferiores a las obtenidas en los cultivos por lote que los precedioacute
(973-999) Las mayores velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) se
obtuvieron a relaciones de recambio de 06 y 08 [aproximadamente 045 mgLh] sin
embargo fueron considerablemente inferiores a la de los cultivos por lote que los
antecedioacute
44 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo continuo de una etapa en un reactor airlift
con tubo conceacutentrico liso
Para este sistema el reactor se inoculoacute con 50 mL de inoacuteculo y se dejoacute operar por lote
durante 48 horas con el propoacutesito de incrementar la densidad celular A continuacioacuten se
suministroacute continuamente medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de
15 mM [78 mgL] y con un flujo volumeacutetrico de 378 mLh por lo que la velocidad de
dilucioacuten ensayada fue de 00076 h-1 Se permitioacute que el reactor alcanzara el estado
estacionario lo cual se corroboroacute mediante la determinacioacuten de la concentracioacuten de
biomasa asiacute como de glucosa y de Cr(VI) residual de muestras colectadas a diferentes
tiempos
En el estado estacionario los valores promedio de concentracioacuten de biomasa glucosa
Cr(VI) residual y de pH fueron de 016 gL 62 gL 46 mgL y 345 respectivamente
De estos resultados es evidente que la concentracioacuten de biomasa en el reactor fue muy
baja lo que probablemente ocasionoacute que se alcanzaran valores bajos de eficiencia de
consumo de glucosa (38) y de reduccioacuten de Cr(VI) (41) asiacute como de velocidad
volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) (024 mgLh)
84
Posteriormente se ensayoacute un flujo de alimentacioacuten de 5 mLh para operar con una
velocidad de dilucioacuten de 001 h-1 Sin embargo bajo estas condiciones se presentoacute el
fenoacutemeno de lavado celular en el cual no se detecta biomasa en el reactor Este
experimento se realizoacute varias veces y en todos los casos se obtuvo el mismo resultado
El lavado celular que ocurrioacute en el cultivo continuo de Candida sp podriacutea deberse a que
la velocidad de dilucioacuten que se utilizoacute (001 h-1) es muy cercana a la velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento de la levadura [de aproximadamente 00146 h-1 determinada en
cultivo por lote en medio de cultivo basal con una concentracioacuten de Cr(VI) de 15 mM]
por lo que la levadura no tuvo tiempo suficiente para duplicarse y fue desplazada del
reactor Ademaacutes el suministro continuo de medio de alimentacioacuten con Cr(VI) ocasiona
que la levadura esteacute constantemente sujeta a los efectos toacutexicos del metal Es decir la
baja velocidad especiacutefica maacutexima de crecimiento de la levadura y los efectos toacutexicos
continuos del metal fueron probablemente los factores que limitaron la eficiencia y
velocidad volumeacutetrica global de reduccioacuten de Cr(VI) en cultivo continuo
Debido a que ocurrioacute lavado celular a una velocidad de dilucioacuten de 001 h-1 ya no fue
posible ensayar velocidades maacutes altas Los resultados obtenidos en cultivo continuo de
una etapa indican que este sistema de reaccioacuten no es adecuado para la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp
En la tabla 9 se presentan datos sobre la reduccioacuten de Cr(VI) por microorganismos en
cultivos continuos en suspensioacuten o inmovilizados Hasta donde es de nuestro
85
conocimiento no hay informacioacuten disponible acerca de la reduccioacuten de Cr(VI) por
levaduras y hongos filamentosos en cultivo continuo
Tabla 9 Resumen de datos sobre la reduccioacuten microbiana de Cr(VI) en cultivo continuo
Microorganismo Cultivo Concentra-
cioacuten de
Cr(VI) [mM]
Velocidad
de
dilucioacuten
[h-1]
Velocidad
volumeacutetrica
de reduccioacuten
[mg de
CrLh]
Eficiencia
de
reduccioacuten
[]
Referencia
Pseudomonas
sp C7
Aerobio 12
12
0014
0017
073
093
88
91
Gopalan y
Veeramani
1994
Pseudomonas
fluorescens
LB300
Aerobio 011
009
009
002
005
009
016
017
022
57
39
28
DeLeo y
Ehrlich
1994
Escherichia coli
ATCC 33456
Aerobio 08 005
169 843 Bae y col
2000
Pseudomonas
mendocina
MCM B-180
Aerobio
05
15
20
022
014
011
57
108
113
99
99
99
Bhide y
col 1996
Microbacterium
liquefaciens
MP30
Aerobio
(ceacutelulas
inmovilizadas
en perlas de
polivinil
alcohol-
alginato)
005
0038
009
90
Pattanapip
it-paisal y
col 2001
Bacillus sp Aerobio
(ceacutelulas
inmovilizadas
en perlas de
vidrio Pyrex)
192
192
004
008
397
797
998
998
Chirwa y
Wang
1997
86
En un estudio realizado en cultivo continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de Pseudomonas
fluorescens LB300 se encontroacute que la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute desde
57 hasta 28 y que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten del metal se incrementoacute de
016 a 022 mg de Cr(VI)Lh a medida que la velocidad de dilucioacuten se incrementoacute de
002 a 009 h-1 cuando se utilizoacute medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI)
de 009 mM (DeLeo y Ehrlich 1994)
Los resultados obtenidos en cultivo continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de otros
microorganismos han sido alentadores Gopalan y Veeramani (1994) ensayaron tres
velocidades de dilucioacuten de 0014 0017 y 0028 h-1 y encontraron que la maacutexima
eficiencia (91) y velocidad volumeacutetrica [093 mg de Cr(VI)Lh] de reduccioacuten de Cr(VI)
de Pseudomonas sp C7 se obteniacutea a una velocidad de dilucioacuten de 0017 h-1 cuando se
utilizoacute medio de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de 12 mM En el estudio
realizado por Bae y col (2000) con Escherichia coli ATCC 33456 la velocidad de dilucioacuten
se mantuvo constante a 005 h-1 y se obtuvo una eficiencia y una velocidad volumeacutetrica
de reduccioacuten de Cr(VI) de 843 y de 169 mg de Cr(VI)Lh respectivamente cuando
se utilizoacute una concentracioacuten de Cr(VI) de 08 mM en el medio de alimentacioacuten En cultivo
continuo con ceacutelulas en suspensioacuten de Pseudomonas mendocina MCM B-180 Bhide y col
(1996) ensayaron el efecto de diferentes concentraciones iniciales de Cr(VI) [de 05 a
20 mM] y de velocidades de dilucioacuten (011 a 022 h-1) sobre la reduccioacuten de Cr(VI)
Estos investigadores encontraron altas eficiencias (99) y velocidades de reduccioacuten [57
ndash 113 mg de Cr(VI)Lh]
Asimismo con la finalidad de reducir los efectos toacutexicos del Cr(VI) sobre los
microorganismos se ha propuesto el uso de ceacutelulas inmovilizadas en reactores continuos
87
de lecho fijo Las ceacutelulas de Microbacterium liquefaciens MP30 inmovilizadas en perlas de
alginato de calcio - polivinil alcohol fueron capaces de reducir el Cr(VI) con una
eficiencia del 90 y con una velocidad de 009 mg de Cr(VI)Lh cuando se utilizoacute medio
de alimentacioacuten con una concentracioacuten de Cr(VI) de 005 mM y una velocidad de dilucioacuten
de 0038 h-1 (Pattanapipitpaisal y col 2001) En un reactor de lecho fijo con ceacutelulas de
Bacillus sp inmovilizadas en perlas de vidrio Pyrex con un diaacutemetro de 3 mm se observoacute
que al incrementar la velocidad de dilucioacuten de 004 a 008 h-1 la eficiencia de reduccioacuten
de Cr(VI) se mantuvo constante (998) y que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de
Cr(VI) se incrementoacute de 397 a 797 mgLh (Chirwa y Wang 1997)
45 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular y la reduccioacuten de Cr(VI) por
Candida sp en cultivo por lote en un reactor airlift con tubo conceacutentrico de
malla de acero inoxidable y de vidrio perforado
Los reactores airlift con tubo conceacutentrico liso (reactores convencionales) no son
adecuados para llevar a cabo cultivos por lote alimentado (procesos con volumen
variable) ya que no es posible lograr una adecuada circulacioacuten del liacutequido a cualquier
volumen de medio de cultivo En los reactores airlift convencionales uacutenicamente se logra
una adecuada circulacioacuten del fluido cuando la altura del liacutequido es mayor que la del tubo
conceacutentrico Por ello para realizar cultivos por lote alimentado en reactores airlift es
necesario que existan diversos puntos de comunicacioacuten entre las secciones de ascenso y
descenso del reactor a lo largo de toda la longitud del tubo conceacutentrico En la literatura
se han descrito algunos reactores airlift que en su interior contienen dispositivos que
permiten la comunicacioacuten entre ambas secciones del reactor Los dispositivos maacutes
comunes son tubos de mallas metaacutelicas (net draft tube) (Tung y col 1997 Wu y Wu
1990 1991 Wu y col 1992) tubos conceacutentricos de vidrio con perforaciones
88
rectangulares (Cristiani-Urbina y col 2000) placas curvas colocadas coaxialmente
(Hagino y col 1982) y bafles (placas) perforados (Galiacutendez-Mayer y col 2001) Estos
dispositivos afectan las caracteriacutesticas hidrodinaacutemicas y de transferencia de masa y calor
de los reactores por lo que es conveniente evaluar su desempentildeo
En este trabajo se evaluoacute la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp en cultivos por lote
utilizando reactores airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable asiacute como de
vidrio con perforaciones circulares Estos cultivos se realizaron con dos flujos de aire de
05 y 1 vvm Estos experimentos tuvieron como propoacutesito principal el seleccionar el tubo
conceacutentrico maacutes adecuado para llevar a cabo posteriormente los cultivos por lote
alimentado y lote alimentado repetido
En la figura 27 se muestran las curvas de crecimiento celular cuando se utilizoacute el reactor
airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos de aire
ensayados El crecimiento celular de la levadura fue mayor cuando se utilizoacute un flujo de
aire de 1 vvm lo cual podriacutea deberse a una mayor oxigenacioacuten del medio de cultivo Los
niveles de Cr(VI) residual maacutes bajos tambieacuten se obtuvieron con un flujo de aire de 1 vvm
(figura 28) y eacutesto podriacutea deberse a la mayor densidad celular alcanzada bajo estas
condiciones
89
Figura 27 Curvas de crecimiento celular de Candida sp en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos de aire ensayados
Figura 28 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual en los cultivos por lote realizados
en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable a los dos flujos
de aire ensayados
000
050
100
150
200
250
00 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Tiempo [h]
XX
O
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
00 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Tiempo [h]
Cr(
VI)
Re
sid
ual [
]
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
90
En los experimentos realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado se
observoacute un comportamiento opuesto al obtenido previamente con el tubo conceacutentrico de
malla metaacutelica El crecimiento celular (figura 29) y la reduccioacuten de Cr(VI) (figura 30)
en el reactor con tubo conceacutentrico perforado fueron mayores a un flujo de aire de 05
vvm
Figura 29 Curvas de crecimiento celular de Candida sp en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico de vidrio perforado a los dos flujos de aire ensayados
000
050
100
150
200
00 500 1000 1500 2000 2500
Tiempo [h]
XX
O
Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
91
Figura 30 Variacioacuten del porcentaje de Cr(VI) residual en los cultivos por lote realizados
en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de vidrio perforado a los dos flujos de aire
ensayados
En la tabla 10 se muestran algunas variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote
realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable y con
tubo conceacutentrico perforado de vidrio a los dos flujos de aire ensayados Ademaacutes la tabla
incluye los resultados obtenidos en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
00 500 1000 1500 2000 2500
Tiempo [h]
Cr(
VI)
re
sid
ual [
] Aire = 10 vvm
Aire = 05 vvm
92
Tabla 10 Variables cineacuteticas obtenidas en los cultivos por lote realizados en el reactor
airlift con las diferentes configuraciones de tubo conceacutentrico
Cultivo por lote
Variable cineacutetica Tubo conceacutentrico
liso
Malla metaacutelica Tubo conceacutentrico perforado
10 vvm 05 vvm 10 vvm 05 vvm 05 vvm 10 vvm
Incremento celular
maacuteximo [gL]
263 072 142 123 106 082
Velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento [h-1]
00244 00059 00120 00149 00178 00093
Eficiencia global de
reduccioacuten de Cr(VI) ()
100 67 95 97 95 89
Velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) [mg de Cr(VI)Lh]
164 031 056 082 084 035
Comparando los resultados obtenidos en el reactor con tubo de malla metaacutelica y con el
de vidrio perforado la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) fue mayor cuando se
utilizoacute el tubo conceacutentrico perforado de vidrio y un flujo de aire de 05 vvm con un valor
promedio de dos experimentos independientes de 083 mgLh Sin embargo esta
velocidad es aproximadamente 494 inferior a la alcanzada con el tubo conceacutentrico liso
Los resultados de crecimiento celular (incremento celular maacuteximo y velocidad especiacutefica
maacutexima de crecimiento) y de reduccioacuten de Cr(VI) (eficiencia y velocidad volumeacutetrica)
obtenidos en el reactor airlift con tubo conceacutentrico de malla de acero inoxidable y de
vidrio perforado a los flujos de aire ensayados podriacutean sugerir que el grado de
oxigenacioacuten del medio de cultivo y la magnitud de los esfuerzos de corte que se alcanzan
durante la agitacioacuten neumaacutetica desempentildean un papel importante en la generacioacuten de
biomasa de Candida sp en los estados fisioloacutegicos de eacutesta y por consiguiente en la
93
reduccioacuten de Cr(VI) Debido a lo anterior seriacutea conveniente investigar la influencia de la
velocidad de aireacioacuten la cual afecta los patrones de flujo del fluido la magnitud de las
fuerzas de corte y la concentracioacuten del nutriente gaseoso en la fase fluida
Como las mayores eficiencias y velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) se
obtuvieron cuando se utilizoacute el tubo conceacutentrico perforado de vidrio y un flujo de aire de
05 vvm eacutestos fueron utilizados en los cultivos por lote alimentados que se llevaron a
cabo posteriormente
46 Evaluacioacuten cineacutetica del crecimiento celular consumo de glucosa y reduccioacuten
de Cr(VI) por Candida sp en cultivo por lote alimentado y lote alimentado
repetido en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado
En los cultivos por lote alimentado el volumen de medio liacutequido en el reactor se
incrementa gradualmente a medida que aumenta el tiempo de incubacioacuten Este cambio
de volumen provoca una dilucioacuten de los componentes presentes en el medio de cultivo lo
cual dificulta la interpretacioacuten de los resultados Debido a lo anterior en los cultivos por
lote alimentado es conveniente expresar el cambio de las variables (biomasa sustrato
etc) en teacuterminos de masa y no de concentracioacuten y para ello es necesario conocer el
volumen de medio a los diferentes tiempos de incubacioacuten Por consiguiente en el
presente trabajo se estimaron las cantidades de biomasa glucosa y de Cr(VI) y se
expresaron en teacuterminos de masa A continuacioacuten se presentan las ecuaciones para
calcular la masa de las variables de intereacutes para este trabajo
Masa celular [g] = (concentracioacuten celular gL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
94
Masa de glucosa [g] = (concentracioacuten de glucosa gL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
Masa de Cr(VI) [mg] = (concentracioacuten de Cr(VI) mgL)(volumen de liacutequido en el
reactor L)
En los cultivos por lote alimentado y lote alimentado repetido se ensayaron dos flujos
volumeacutetricos de medio de alimentacioacuten de 659 y 1343 mLh que corresponden a
cargas maacutesicas de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh respectivamente Los cultivos por lote
alimentado realizados en el reactor airlift con tubo conceacutentrico perforado se iniciaron con
cultivos por lote (los resultados obtenidos en estos uacuteltimos cultivos se mostraron en la
seccioacuten anterior)
Cuando se utilizoacute una carga maacutesica de Cr(VI) de 0514 mgh en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) se observoacute que la masa celular
de la levadura en el primer cultivo por lote alimentado fue mayor que en la del segundo
cultivo Sin embargo a pesar de que la levadura tuvo un suministro constante de fuente
de carbono y energiacutea eacutesta praacutecticamente no crecioacute
Cuando se utilizoacute una carga maacutesica de Cr(VI) de 0514 mgh fue evidente que en los
cultivos por lote alimentado se fue acumulando glucosa en el medio de cultivo lo que
indica que las ceacutelulas casi no consumieron el monosacaacuterido que teniacutean disponible para su
crecimiento La cantidad de glucosa consumida por la levadura en el cultivo por lote
alimentado repetido (segundo cultivo por lote alimentado) fue considerablemente menor
que la consumida en el primer cultivo lo cual podriacutea deberse a que habiacutea una menor
cantidad de biomasa en el reactor En el segundo cultivo por lote alimentado se alcanzoacute
95
una eficiencia de consumo de glucosa del 68 en cambio en el primer cultivo fue del
263
Se observoacute que la levadura fue capaz de reducir parcialmente el Cr(VI) adicionado al
reactor y que en el primer cultivo por lote alimentado se lograron mayores niveles de
reduccioacuten
En el primer cultivo por lote alimentado las eficiencias de reduccioacuten de Cr(VI) maacutes altas
se alcanzaron durante el periodo de incubacioacuten de las 468 a las 967 h (7188-7292)
y disminuyeron ligeramente hasta el final de este cultivo (673-6945) En el segundo
cultivo por lote alimentado (lote alimentado repetido) las eficiencias disminuyeron
gradualmente a medida que se incrementoacute el tiempo de incubacioacuten (figura 31) La
eficiencia promedio de reduccioacuten de Cr(VI) del primer cultivo por lote alimentado fue de
689 y la del segundo cultivo alimentado fue de 56
96
Figura 31 Variacioacuten de la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) de Candida sp cuando se
utilizoacute una carga maacutesica del metal de 0514 mgh
La velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute progresivamente a medida
que transcurrieron los cultivos por lote alimentado desde 0181 hasta 0063 mgLh
(figura 32) estos valores son inferiores a los alcanzados en los cultivos por lote
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Efi
cie
nc
ia d
e r
ed
uc
cioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
CPLA1 CPLA2
97
Figura 32 Variacioacuten de la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Candida sp
en el cultivo por lote alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) llevados a
cabo con una carga maacutesica del metal de 0514 mgh
Posteriormente se realizoacute el cultivo por lote alimentado y lote alimentado repetido
utilizando una carga maacutesica de Cr(VI) de 105 mgh Se observoacute que en ambos cultivos
la masa celular de Candida sp se incrementoacute gradualmente a medida que se incrementoacute
el tiempo de incubacioacuten aunque al final de cada cultivo hubo una ligera disminucioacuten en la
cantidad de biomasa en el reactor En el primer cultivo por lote alimentado se alcanzoacute un
valor maacuteximo de 523 g de biomasa (incremento celular de 053 g) a las 637 h
mientras que en el segundo cultivo se alcanzoacute una cantidad maacutexima de biomasa de 435
g (incremento celular de 13 g) a las 1822 h totales de cultivo que corresponden a 893
h del cultivo por lote alimentado repetido
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo [h]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica g
lob
al d
e
re
du
ccioacute
n d
e C
r(V
I) [
mg
de
Cr(V
I)L
h]
CPLA1 CPLA2
98
Asimismo se encontroacute que la levadura fue capaz de consumir parcialmente la glucosa
suministrada En el primer cultivo por lote alimentado se obtuvo una eficiencia de
consumo de glucosa del 299 mientras que en el segundo cultivo la eficiencia fue del
388 Estos resultados probablemente se deban a que el crecimiento de la levadura fue
mayor en el cultivo por lote alimentado repetido (incremento celular = 13 g) que en el
cultivo por lote alimentado que lo precedioacute (incremento celular = 053 g)
En los cultivos por lote alimentados llevados a cabo con una carga maacutesica de 105 mg de
Cr(VI) la levadura fue capaz de reducir parcialmente el Cr(VI) adicionado al reactor sin
embargo al final del primer cultivo por lote alimentado se lograron los niveles de
reduccioacuten maacutes altos
En el primer cultivo por lote alimentado la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) se
incrementoacute a medida que aumentoacute el tiempo de incubacioacuten alcanzaacutendose el valor maacutes
alto de eficiencia (529) a las 879 h de incubacioacuten En contraste en el segundo cultivo
por lote alimentado (alimentado repetido) la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) disminuyoacute
continuamente conforme transcurrioacute el tiempo de cultivo Al final del cultivo por lote
alimentado repetido la eficiencia de reduccioacuten del metal fue del 43 (figura 33)
99
Figura 33 Variacioacuten de la eficiencia de reduccioacuten de Cr(VI) en el cultivo por lote
alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) de Candida sp cuando se
utilizoacute una carga maacutesica del metal de 105 mgh
En estos experimentos tambieacuten se observoacute que la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de
Cr(VI) disminuyoacute continuamente durante todo el periodo de incubacioacuten desde 0226
hasta 0099 mgLh (figura 34)
0
10
20
30
40
50
60
0 50 100 150 200 250
Tiempo [h]
Efi
cie
ncia
de
re
du
ccioacute
n d
e C
r(V
I) [
]
CPLA1 CPLA2
100
Figura 34 Variacioacuten de la velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI) de Candida sp
en el cultivo por lote alimentado (CPLA1) y lote alimentado repetido (CPLA2) llevados a
cabo con una carga maacutesica del metal de 105 mgh
Las eficiencias globales de reduccioacuten de Cr(VI) que se obtuvieron con una carga maacutesica
del metal de 105 mgh fueron inferiores a las logradas con una carga de 0514 mgh y
esto podriacutea deberse a que el tiempo de contacto entre la levadura y el medio de cultivo
fue menor En contraste las velocidades volumeacutetricas de reduccioacuten de Cr(VI) fueron
ligeramente superiores a una carga maacutesica de 105 mgh
Con las dos cargas maacutesicas de Cr(VI) que se ensayaron en este trabajo se observoacute una
variacioacuten semejante en el pH de los medios de cultivo Los cultivos por lote alimentado
se iniciaron con un pH de 302-306 (estos valores corresponden al pH que se obtuvo al
final de los cultivos por lote que precedioacute a los cultivos por lote alimentado) El pH se
000
004
008
012
016
020
024
0 50 100 150 200 250
Tiempo [h]
Ve
locid
ad
vo
lum
eacutetr
ica g
lob
al d
e r
ed
uccioacute
n
de
Cr(V
I) [
mg
de
Cr(V
I)L
h]
CPLA1 CPLA2
101
incrementoacute ligeramente durante el curso de los primeros cultivos por lote alimentado y al
final de eacutestos se tuvieron valores de 355 y de 345 cuando se emplearon cargas maacutesicas
de Cr(VI) de 0514 y 105 mgh respectivamente En los cultivos por lote alimentado
repetido el pH se mantuvo praacutecticamente constante durante todo el periodo de
incubacioacuten
A pesar de que el cultivo por lote alimentado es muy recomendable para trabajar con
compuestos toacutexicos ha sido poco explorado para el tratamiento de aguas contaminadas
con cromo hexavalente Fujii y col (1990) utilizaron el cultivo por lote alimentado para
investigar la reduccioacuten de Cr(VI) por la bacteria anaerobia Enterobacter cloacae cepa
HO1 En este estudio una solucioacuten de cromato se alimentoacute continuamente en pequentildeas
dosis para minimizar el efecto toacutexico del metal Los investigadores encontraron que la
reduccioacuten de Cr(VI) fue fuertemente afectada por la velocidad especiacutefica de alimentacioacuten
de cromato Cuando esta velocidad fue inferior a 25 mmol de CrO42-g de biomasah
todo el cromo adicionado fue reducido A velocidades de alimentacioacuten superiores se
observoacute que la concentracioacuten de Cr(VI) residual en el medio de cultivo se incrementaba a
medida que aumentaba la velocidad de alimentacioacuten Asimismo encontraron que la
actividad reductora de la bacteria era fuertemente inhibida cuando la concentracioacuten de
Cr(VI) del medio de cultivo era mayor a 07 mM (3639 mgL)
Posteriormente Fujie y col (1996) realizaron la simulacioacuten de un cultivo por lote
alimentado utilizando datos cineacuteticos obtenidos en cultivo por lote y un modelo
matemaacutetico que describe el comportamiento de la bacteria antes mencionada Los
resultados experimentales y los predichos por el simulador fueron semejantes
102
En la tabla 11 se presentan los valores de velocidad volumeacutetrica de reduccioacuten de Cr(VI)
obtenidos en el presente trabajo en los diferentes sistemas de reaccioacuten ensayados La
mayor velocidad se obtuvo en el cultivo por lote realizado en el reactor airlift con tubo
conceacutentrico liso por lo que eacuteste seriacutea el sistema maacutes adecuado para la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp
103
Tabla 11 Velocidades volumeacutetricas globales de reduccioacuten de Cr(VI) obtenidas en diferentes sistemas de reaccioacuten
CPL
Matraz
CPL Reactor
airlift con
tubo liso
CPL Reactor
airlift con
malla metaacutelica
CC Reactor
airlift con
tubo liso
CPLR Reactor
airlift con
tubo liso
CPL Reactor
airlift con tubo
perforado
CPLA Reactor
airlift con
tubo perforado
CPLAR Reactor
airlift con
tubo perforado
10
Vvm
05
vvm
10
vvm
10
vvm
10
vvm
05
vvm
10
vvm
05
vvm
05
vvm
f=08 f=06 f=04
CM1 CM2 CM1 CM2
098 151 ndash178 031 056 024 045 046 035 084 035 0092-0181
0163-0195
0063-0083
0099-0145
CPL = Cultivo por lote CC = Cultivo continuo CPLR = Cultivo por lote repetido CPLA = Cultivo por lote alimentado CPLAR = Cultivo por lote alimentado repetido f = relacioacuten de recambio CM = Carga maacutesica de Cr(VI)
CM1 = 0514 mg Cr(VI)h CM2 = 105 mg Cr(VI)h
104
5 CONCLUSIONES
El sulfato desempentildea un papel importante en la tolerancia al Cr(VI) y en la reduccioacuten
del mismo en la cepa de Candida sp utilizada en este trabajo
El efecto modulador del sulfato sobre el crecimiento celular y la reduccioacuten del Cr(VI)
depende de las concentraciones de los oxianiones sulfato y cromato
El mecanismo principal de remocioacuten de Cr(VI) por Candida sp es la biotransformacioacuten
del altamente toacutexico Cr(VI) al menos toacutexico Cr(III)
El cultivo por lote en el reactor airlift con tubo conceacutentrico liso es el sistema de
reaccioacuten maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
La velocidad de aireacioacuten no tiene un efecto significativo sobre la reduccioacuten de Cr(VI)
por Candida sp
105
6 REFERENCIAS
1 Acevedo-Aguilar FJ Espino-Saldantildea AE Leoacuten-Rodriacuteguez IL Rivera-Cano ME Avila-Rodriguez M Wrobel K et al 2006 Hexavalent chromium removal in vitro and from industrial wastes using chromate-resistant strains of filamentous
fungi indigenous to contaminated wastes Can J Microbiol 52 809-815
2 Ali-Awan M Baig MA Iqbal J Aslam MR amp Ijaz N 2003 Recovery of chromium (III) from tannery wastewater J App Sci amp Environ Management 7 (2) 5-8
3 Aacutelvarez SG Maldonado M Gerth A amp Kuschk P 2004 Characterization of
tannery effluents and study of the water Hyacinth in chromium recovery Informacioacuten Tecnoloacutegica 15 (3) 75-80
4 Aravindhan BM Madani B Rao JR Nair BU amp Ramasami T 2004 Bioaccumulation of Chromium from Tannery Wastewater An Approach for chrome
recovery and reuse Environ Sci Technol 38 300-306
5 Atkinson B amp Mavituna F 1983 Biochemical engineering and biotechnology handbook United Kingom Nature Press
6 Badar U Ahmed N Beswick AJ Pattanapipitpaisal P amp Macaskie LE 2000 Reduction of chromate by microorganisms isolated from metal contaminated sites of
Karachi Pakistan Biotechnol Lett 22 829-836 7 Bae WC Kang TG Kang IK Won YJ amp Jeong BC 2000 Reduction of
hexavalent chromium by Escherichia coli ATCC 33456 in batch and continuous cultures J Microbiol 38(1) 36-39
8 Balasubramanian S amp Pugalenthi V 1999 Determination of total chromium in
tannery wastewater by inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry
flame atomic absorption spectrometry and uv-visible spectrophotometric methods Talanta 50 (3) 457-467
9 Baldi F Vaughan AM amp Olson GJ 1990 Chromium(VI)-resistant yeast
isolated from a sewage treatment plant receiving tannery wastes Appl Environ
Microbiol 56 (4) 913-918
10 Barnhart J 1997 Occurrences uses and properties of chromium Regulatory Toxicology and Pharmacology 26 S3-S7
11 Beleza VM Boaventura RA amp Almeida MF 2001 Kinetics of chromium removal from spent tanning liquors using acetylene production sludge Environ
Sci Technol 35 (21) 4379-4383 12 Bhide JV Dhakephalkar PK amp Paknikar KM 1996 Microbiological process for
the removal of Cr(VI) from chromate-bearing cooling tower effluent Biotechnol Lett 18 (6)667-672
106
13 Bopp LH amp Ehrlich HL 1988 Chromate resistance and reduction in
Pseudomonas fluorescens strain LB300 Archives of Microbiology 150 426-431
14 Branco R Alpoim MC amp Morais PV 2004 Ochrobactrum tritici strain 5bvI1 ndash characterization of a Cr(VI)-resistant and Cr(VI)-reducing strain Can J Microbiol
50 697-703 15 Camargo FAO Bento FM Okeke BC amp Frankenberger WT 2002 Chromate
reduction by chromium-resistant bacteria isolated from soils contaminated with dichromate Journal of Environmental Quality 32 1228-1233
16 Camargo FAO Okeke BC Bento FM amp Frankenberger WT 2003 In vitro
reduction of hexavalent chromium by a cell-free extract of Bacillus sp ES 29
stimulated by Cu2+ Appl Microbiol Biotechnol 62 569-573
17 Cantildeizares-Villanueva R 2000 Biosorcioacuten de metales pesados mediante el uso de biomasa microbiana Rev Latinoam Microbiol 42 131-143
18 Cervantes C Campos-Garciacutea J Devars S Gutieacuterrez-Corona F Loza-Tavera H Torres-Guzmaacuten JC amp Moreno-Saacutenchez R 2001 Interactions of chromium with
microorganisms and plants FEMS Microbio Rev 25 335-347 19 Chardin B Dolla A Chaspoul F Fardeau ML Gallice P amp Bruschi M 2002
Bioremediation of chromate thermodynamic analysis of the effects of Cr(VI) on sulfate-reducing bacteria Appl Microbiol Biotechnol 60 352-360
20 Chardin B Giudici-Orticoni MT De Luca G Guigliarelli B amp Bruschi M 2003
Hydrogenases in sulfate-reducing bacteria function as chromium reductase Appl
Microbiol Biotechnol 63 315-321
21 Cheung Y amp Gu G 2003 Reduction of chromate (CrO42-) by an enrichment
consortium and an isolate of marine sulfate-reducing bacteria Chemosphere 52 1523-1529
22 Cheung KH amp Gu JD 2005 Chromate reduction by Bacillus megaterium TKW3
isolated from marine sediments World Journal of Microbiology amp Biotechnology 21 213-219
23 Cheung KH amp Gu JD 2007 Mechanism of hexavalent chromium detoxification
by microorganisms and bioremediation application potential a review International
Biodeterioration amp Biodegradation 59 8-15
24 Chirwa EMN amp Wang YT 1997 Hexavalent chromium reduction by Bacillus sp in a packed-bed bioreactor Environ Sci Technol 31 1446-1451
25 Cristiani-Urbina E Netzahuatl-Muntildeoz AR Manriquez-Rojas FJ Juaacuterez-Ramiacuterez C Ruiz-Ordaz N amp Galiacutendez-Mayer J 2000 Batch and fed-batch
cultures for the treatment of whey with mixed yeast cultures Process Biochemistry 35 649-657
107
26 Czakoacute-Veacuter K Batiegrave M Raspor P Sipiczki M amp Pesti M 1999 Hexavalent
chromium uptake by sensitive and tolerant mutants of Schizosaccharomyces pombe FEMS Microbiology Letters 178 109-115
27 DeLeo PC amp Ehrlich HL 1994 Reduction of hexavalent chromium by
Pseudomonas fluorescens LB300 in batch and continuous cultures Appl Microbiol Biotechnol 40 756-759
28 Desjardin V Bayard R Lejeune P amp Gourdon R 2003 Utilization of supernatant of pure cultures of Streptomyces thermocarboxydus NH50 to reduce
chromium toxicity and mobility in contaminated soils Water Air and Soil Pollut 3 153-160
29 Eccles H 1999 Treatment of metal-contaminated wastes why select a biological process TIBTECH 17 462-465
30 Faisal M amp Hasnain S 2004 Comparative study of Cr(VI) uptake and reduction in
industrial effluent by Ochrobactrum intermedium and Brevibacterium sp
Biotechnology Letters 26 1623-1628
31 Fruchter J 2002 In situ treatment of chromium-contaminated groundwater Environ Sci amp Technol pp 464-472
32 Fujie K Hu H Huang X Tanaka Y Urano K amp Ohtake H 1996 Optimal operation of bioreactor system developed for the treatment of chromate wastewater
using Enterobacter cloacae HO-1 Wat Sci Tech 33 (5-6) 173-182 33 Fujii E Toda K amp Ohtake H 1990 Bacterial reduction of toxic hexavalent
chromium using a fed-batch culture of Enterobacter cloacae strain HO1 J Ferment Bioeng 69 (6) 365-367
34 Gaballah I Goy D Kilbertus G amp Thauront J 1994 Decontamination of
industrial effluents for environment protection and recycling of metals Resources
Conservation and Recycling 10 (1-2) 97-106
35 Galiacutendez-Mayer J Saacutenchez-Teja O Cristiani-Urbina E amp Ruiz-Ordaz N 2001 A novel split-cylinder airlift reactor for fed-batch cultures Bioprocess and Biosystems
Engineering 24 171-177 36 Ganguli A amp Tripathi AK 1999 Survival and chromate reducing ability of
Pseudomonas aeruginosa in industrial effluents Lett Appl Microbiol 28 76-80
37 Garbisu C Alkorta I Llama MJ amp Serra JL 1998 Aerobic chromate reduction by Bacillus subtilis Biodegradation 9 133-141
38 Gonzaacutelez AR Ndungrsquou K amp Flegal AR 2005 Natural occurrence of hexavalent chromium in the Aromas Red Sands Aquifer California Environ Sci Technol 39
(15) 5505-5511
108
39 Gopalan R amp Veeramani H 1994 Studies on microbial chromate reduction by
Pseudomonas sp in aerobic continuous suspended growth cultures Biotechnology and Bioengineering 43 471-476
40 Guertin J Jacobs JA amp Avakian CP 2005 Chromium(VI) Handbook 1st
edition CRC Press USA 41 Hach Water Analysis Handbook 2002 Hach Company Colorado USA 4th ed
pp 433-444 1210-1211
42 Hafez AI El-Manharawy MS amp Khedr MA 2002 RO membrane removal of unreacted chromium from spent tanning effluent A pilot-scale study Part 2 Desalination 144 (1-3) 237-242
43 Hagino H Odagiri H amp Okutani J 1982 Draft device for a bubble column US
Patent 4327042 44 Horitsu H Futo S Miyazawa Y Ogai S amp Kawai K 1987 Enzymatic
reduction of hexavalent chromium by hexavalent chromium tolerant Pseudomonas ambigua G-1 Agric Biol Chem 51 (9) 2417-2420
45 Ishibashi Y Cervantes C amp Silver S 1990 Chromium reduction in Pseudomonas
putida Appl Environ Microb 56 (7) 2268-2270
46 Jianlong W Zeyu M amp Xuan Z 2004 Response of Saccharomyces cerevisiae to
chromium stress Process Biochem 39 1231-1235 47 Juvera-Espinosa J Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2006 Isolation and
characterization of a yeast strain capable of removing Cr(VI) Enzyme and Microbial Technology 40 114-121
48 Kaszycki P Fedorovych D Ksheminska H Babyak L Gonchar MV Jaglarz
A amp Koloczek H 2003 Modulation of chromium(VI) and (III) tolerance and
accumulation in yeast by sulfate-containing salts European Journal of Biochemistry 1 (1) P49-53
49 Komori K Wang P Toda K amp Ohtake H 1989 Factors affecting chromate
reduction in Enterobacter cloacae Strain HO1 Appl Microbiol Biotechnol 31 567-570
50 Ksheminska H Fedorovych D Babyak L Yanovych D Kaszycki P amp Koloczek H 2005 Chromium(III) and (VI) tolerance and bioaccumulation in
yeast a survey of cellular chromium content in selected strains of representative genera Process Biochem 40 1565-1572
51 Ksheminska HP Honchar TM Gayda GZ amp Gonchar MV 2006 Extra-cellular chromate-reducing activity of the yeast cultures Central European Journal of
Biology 1 (1)137-149
109
52 Kurniawan TA Chan GYS Lo W amp Babel S 2006 Physico-chemical
treatment techniques for wastewater laden with heavy metals Chemical Engineering Journal 118 83-98
53 Labra M Grassi F Imazio S Di Fabio T Citterio S Sgorbati S amp Agradi E
2004 Genetic and DNA-methylation changes induced by potassium dichromate in Brassica napus L Chemosphere 54 1049-1058
54 Laxman RS amp More S 2002 Reduction of hexavalent chromium by Streptomyces griseus Minerals Engineering 15 831-837
55 Leustek T 2002 Sulfate metabolism The Arabidopsis Book American Society of
Plant Biologists
56 Liu YG Xu WH Zeng GM Li X and Gao H 2006 Cr(VI) reduction by
Bacillus sp isolated from chromium landfill Process Biochemistry 41 1981-1986 57 Llovera S Bonet R Simon-Pujol MD amp Congregado F 1993 Effect of culture
medium ions on chromate reduction by resting cells of Agrobacterium radiobacter Appl Microbiol Biotechnol 39 424-426
58 Lloyd JR 2003 Microbial reduction of metals and radionuclides FEMS Microbiol
Rev 27 411-425
59 Marsh TL amp McInerney MJ 2001 Relationship of hydrogen bioavailability to
chromate reduction in aquifer sediments Appl Environ Microb 67 (4) 1517-1521
60 McLean J amp Beveridge TJ 2001 Chromate reduction by a pseudomonad isolated from a site contaminated with chromated copper arsenate Applied and
Environmental Microbiology 67 (3)1076-1084 61 Megharaj M Avudainayagam S amp Naidu R 2003 Toxicity of hexavalent
chromium and its reduction by bacteria isolated from soil contaminated with tannery waste Current Microbiology 47 51-54
62 Middleton SS Latmani RB Mackey MR Ellisman MH Tebo BM amp Criddle
CS 2003 Cometabolism of Cr(VI) by Shewanella oneidensis MR-1 produces cell-associated reduced chromium and inhibits growth Biotechnol Bioeng 83 627-637
63 Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2006 Removal of hexavalent chromium
by Trichoderma viride in an airlift bioreactor Enzyme and Microbial Technology 40 107-113
64 Morales-Barrera L amp Cristiani-Urbina E 2008 Hexavalent chromium removal by Trichoderma inhamatum fungal strain isolated from tannery effluent Enzyme and
Microbial Technology 40 107-113
110
65 Morales B L 2005 Aislamiento de microorganismos y estudio de su capacidad
para remover cromo hexavalente Tesis de Maestriacutea Escuela Nacional de Ciencias Bioloacutegicas IPN Meacutexico
66 Muter O Patmalnieks A amp Rapoport A 2001 Interrelations of the yeast Candida
utilis and Cr(VI) metal reduction and its distribution in the cell and medium Process Biochem 36 963-970
67 Ohtake H Cervantes C amp Silver S 1987 Decreased chromate uptake in Pseudomonas fluorescens carrying a chromate resistance plasmid J Bacteriol 169
3853-3856 68 Pal N 1997 Reduction of hexavalent chromium to trivalent chromium by
Phanerochaete chrysosporium pp 511-517 En Alleman BC amp Leeson A In Situ and On-Site Bioremediation Vol 2 Battelle Press Ohio USA
69 Pattanapipitpaisal P Brown NL amp Macaskie LE 2001 Chromate reduction by
Microbacterium liquefaciens immobilised in polyvinyl alcohol Biotechnol Lett 23
61-65
70 Pepi M amp Baldi F 1992 Modulation of chromium(VI) toxicity by organic and inorganic sulfur species in yeasts from industrial wastes BioMetals 5 179-185
71 Quintana M Curutchet G amp Donati E 2001 Factors affecting chromium(VI) reduction by Thiobacillus ferrooxidans Biochemical Engineering Journal 9 11-15
72 Ramiacuterez-Ramiacuterez R Calvo-Meacutendez C Aacutevila-Rodriacuteguez M Lappe P Ulloa M
Vaacutezquez-Juaacuterez R amp Gutieacuterrez-Corona JF 2004 Cr(VI) reduction in a chromate-
resistant strain of Candida maltosa isolated from the leather industry Antonie van Leeuwenhoek 85 63-68
73 Rege MA Petersen JN Johnstone DL Turick CE Yonge DR amp Apel WA
1997 Bacterial reduction of hexavalent chromium by Enterobacter cloacae strain
HO1 grown on sucrose Biotechnol Lett 19 (7) 691-694
74 Roukas T 1993 Ethanol production from nonsterilized carob pod extract by free and immobilized Saccharomyces cerevisiae cells using fed-batch culture
Biotechnol Bioeng 43 189-194 75 Ruiacutez MA 2000 Recuperacioacuten de metales pesados de soluciones diluidas por
biosorcioacuten con bacteria En Medrano RH Galan WL Biotecnologiacutea de Minerales CONACYT Meacutexico pp 235-262
76 Saxena D Levin R amp Firer MA 2000 Removal of chromate from industrial
effluent by a new isolate of Staphylococcus cohnii Wat Sci Technol 42 (1-2)
93-98
77 Secretariacutea de Comercio y Fomento Industrial NMX-AA-74-1981 Anaacutelisis de Agua ndash Determinacioacuten del Ioacuten Sulfato
111
78 Secretariacutea de Economiacutea NMX-AA-051-SCFI-2001 Anaacutelisis de Agua -
Determinacioacuten de Metales por Absorcioacuten Atoacutemica en Aguas Naturales Potables Residuales y Residuales Tratadas - Meacutetodo de Prueba
79 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NMX-AA-044-SCFI-
2001 Anaacutelisis de Aguas - Determinacioacuten de Cromo Hexavalente en Aguas Naturales Potables Residuales y Residuales Tratadas - Meacutetodo de Prueba En Diario Oficial de la Federacioacuten 1 de agosto 2001
80 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-001-ECOL-1996
Liacutemites Maacuteximos Permisibles de Contaminantes en las Descargas de Aguas Residuales en Aguas y Bienes Nacionales En Diario Oficial de la Federacioacuten 6 de enero 1997
81 Secretariacutea de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca NOM-002-ECOL-1996
Liacutemites Maacuteximos Permisibles de Contaminantes en las Descargas de Aguas Residuales a los Sistemas de Alcantarillado Urbano o Municipal En Diario Oficial de la Federacioacuten 3 de junio 1998
82 Secretariacutea de Salud Proyecto de Modificacioacuten a la Norma Oficial Mexicana PROY-
NOM-127-SSA1-1994 Salud Ambiental Agua para Uso y Consumo Humano - Liacutemites Permisibles de Calidad y Tratamientos a que debe Someterse el Agua para su Potabilizacioacuten En Diario Oficial de la Federacioacuten 20 de Octubre 2000
83 Shakoori AR Makhdoom M amp Haq RU 2000 Hexavalent chromium reduction
by a dichromate-resistant gram-positive bacterium isolated from effluents of tanneries Appl Microbiol amp Biotechnol 53 (3) 348-351
84 Shen H and Wang YT 1994 Biological reduction of chromium by E coli Journal of Environmental Engineering 120 560-572
85 Shen H amp Wang Y 1995 Hexavalent chromium removal in two-stage bioreactor
system J Environ Eng 121 (11) 798-804
86 Smith WA Apel WA Petersen JN amp Peyton BM 2002 Effect of carbon and
energy source on bacterial chromate reduction Bioremediation J 6 (3) 205-215
87 Smith WL amp Gadd GM 2000 Reduction and precipitation of chromate by mixed culture sulphate-reducing biofilms J Appl Microbiol 88 983-991
88 Song Z Williams CJ amp Edyvean RGJ 2004 Treatment of tannery wastewater by chemical coagulation Desalination 164 (3) 249-259
89 Srinath T Verma T Ramteke PW amp Garg SK 2002 Chromium (VI)
biosorption and bioaccumulation by chromate resistant bacteria Chemosphere 48
(4) 427-435
90 Stanbury PF amp Whitaker A ―Principles of Fermentation Technology Pergamon Press Ltd Great Britain 1984 First edition Pp 11-24
112
91 Stasinakis AS Mamais D Thomaidis NS amp Lekkas TD 2002 Effect of
chromium (VI) on bacterial kinetics of heterotrophic biomass of activated sludge Water Res 36 3341-3349
92 Stasinakis AS Thomaidis NS Mamais D Karivali M amp Lekkas TD 2003
Chromium species behaviour in the activated sludge process Chemosphere 52 1059-1067
93 Stephen JR amp Macnaughton SJ 1999 Developments in terrestrial bacterial remediation of metals Current Opinion in Biotechnology 10 230-233
94 Su C amp Ludwig RD 2005 Treatment of hexavalent chromium in chromite ore
processing solid waste using a mixed reductant solution of ferrous sulfate and
sodium dithionite Environ Sci Technol 39 (16) 6208-6216
95 Thacker U Parikh R Shouche Y amp Madamwar D 2006 Hexavalent chromium reduction by Providencia sp Process Biochem 41 1332-1337
96 Thacker U amp Madamwar D 2005 Reduction of toxic chromium and partial localization of chromium reductase activity in bacterial isolate DM1 Would Journal
of Microbiology amp Biotechnology 21 891-899 97 Tung HL Chiou SY Tu CC amp Wu WT 1997 An airlift reactor with double
net draft tubes and its application in fermentation Bioprocess Eng 171-5
98 Turick CE Apel WA amp Carmiol NS 1996 Isolation of hexavalent chromium-reducing anaerobes from hexavalent-chromium-contaminated and noncontaminated environments Applied Microbiol Biotechnol 44 683-688
99 Viamajala S Peyton BM Sani RK Apel WA amp Petersen JN 2004 Toxic
effects of chromium(VI) on anaerobic and aerobic growth of Shewanella oneidensis MR-1 Biotechnol Prog 20 87-95
100 Volesky B amp Vieira RHSF 2000 Biosorption a solution to pollution Internat Microbiol 3 17-24
101 Wang DIC Cooney CL Demain AL Dunnill P Humphrey AE amp Lilly MD
1979 ―Fermentation and Enzyme Technology John Wiley amp Sons Inc USA Pp 98-115
102 Wang YT and Shen H 1997 Modelling Cr(VI) reduction by pure bacterial cultures Water Research 31 727-732
103 Wang Y amp Xiao C 1995 Factors affecting hexavalent chromium reduction in pure
cultures of bacteria Water Res 29 (11) 2467-2474
104 Wang Y 2000 Microbial reduction of chromate En Lovley DR (Ed)
Environmental Microbe-Metal Interactions ASM Press Washington DC USA pp 225-235
113
105 Wilkin RT Su C Ford RG amp Paul CJ 2005 Chromium-removal processes
during groundwater remediation by a zerovalent iron permeable reactive barrier Environ Sci Technol 39 (12) 4599-4605
106 Worthington Biochemical Corporation 1972 Worthington Enzyme Manual
Enzymes Enzyme Reagents and Related Biochemicals Freehold New Jersey USA
107 Wu J amp Wu WT 1991 Fed-batch culture of Saccharomyces cerevisiae in an airlift reactor with net draft tube Biotechnol Prog 7 230-233
108 Wu WT amp Wu JY 1990 Airlift reactor with net draught tube J Ferm Bioeng
70 359-361
109 Wu WT Wu JY amp Jong JZ 1992 Mass transfer in an airlift reactor with a net
draft tube Biotechnol Prog 8 465-468 110 Zakaria ZA Zakaria Z Surif S amp Ahmad WA 2006 Hexavalent chromium
reduction by Acinetobacter haemolyticus isolated from heavy-metal contaminated wastewater J Hazard Mater 146 30-38
111 Zuacutentildeiga M 2005 Aislamiento de microorganismos con capacidad para remover
cromo hexavalente del agua Tesis de Licenciatura Escuela Nacional de Ciencias
Bioloacutegicas IPN Meacutexico
Referencias electroacutenicas
httpepagov httpesepagovtechpubs412304html
httpfaiunneeduarbiologiamicroindcultivo20y20biorreactoreshtm httpmineralserusgsgovmineralspubscommoditychromium180494pdf
httpuserpagesumbcedu gferre1bmcohtml
httpuserpagesumbcedu gferre1fedbatchhtml httpwwgemesmaterialdocument httpwwwatsdrcdcgovfacts7 html
httpwwwchemicalelementscomelementscrhtml httpwwwepagoviris
wwwclu-inorgdownloadstudentpapersbio_of_metals_paperpdf
114
7 Impacto
En este trabajo se identificaron algunas variables ambientales que afectan la
biorreduccioacuten de cromo hexavalente [Cr(VI)] La informacioacuten obtenida podriacutea ser de
utilidad para mejorar los procesos de reduccioacuten del metal asiacute como para disminuir los
tiempos y costos del tratamiento de los efluentes industriales contaminados con Cr(VI)
Los resultaron mostraron que el sulfato afecta la tolerancia de Candida sp al Cr(VI) y a
su capacidad para reducirlo Fue evidente que a medida que se incrementoacute la
concentracioacuten de sulfato aumentoacute el crecimiento de la levadura la eficiencia global y la
velocidad global de reduccioacuten de Cr(VI) Asimismo se encontroacute que la reduccioacuten de
Cr(VI) por Candida sp depende de la densidad celular de los cultivos de manera tal que
a mayor cantidad de biomasa producida mayor es la reduccioacuten del metal Aun cuando la
cepa de Candida sp es sensible a los efectos toacutexicos del Cr(VI) en ausencia del sulfato
esta levadura posee una notable capacidad para reducir muy altas concentraciones de
Cr(VI) en presencia de sulfato por lo que podriacutea ser potencialmente uacutetil para el
tratamiento de aguas industriales altaminadas con Cr(VI) y con iones sulfato
Hasta donde sabemos este es el primer trabajo en el que se demuestra que el sulfato
desempentildea un papel impotante tanto en la tolerancia al Cr(VI) como en la reduccioacuten
aeroacutebica del mismo en microorganismos Estos descubrimientos podriacutean tener
implicaciones importantes en el tratamiento de aguas residuales contaminadas con
Cr(VI)
Ademaacutes se encontroacute que los contactores gas-liacutequido son adecuados para la reduccioacuten
aeroacutebica de Cr(VI) por Candida sp Esto uacuteltimo es de vital importancia porque seriacutea
posible disminuir significativamente los costos de tratamiento ya que estos biorreactores
se caracterizan por su baja economiacutea de aireacioacuten Las velocidades volumeacutetrica y
especiacutefica asiacute como la capacidad de reduccioacuten de Cr(VI) exhibidas por Candida sp en el
reactor airlift con tubo conceacutentrico fueron superiores a las obtenidas en matraz y eacutesto
podriacutea deberse a que en el reactor airlift la levadura tuvo una mayor cantidad de oxiacutegeno
disponible para su crecimiento y a que el mayor nuacutemero de ceacutelulas producidas fue la
responsable de reducir maacutes eficazmente el Cr(VI) presente en el medio de cultivo
115
Las caracteriacutesticas mostradas por Candida sp en el dispositivo airlift indican que este
tipo de reactor neumaacutetico es adecuado para el crecimiento y la reduccioacuten aeroacutebica del
Cr(VI) por la levadura Asimismo los paraacutemetros cineacuteticos del proceso de reduccioacuten de
Cr(VI) catalizado por Candida sp son superiores a los reportados para otros
microorganismos lo que sugiere que esta cepa de levadura tiene potencial biotecnoloacutegico
para ser utilizada en procesos de remediacioacuten de aguas residuales industriales
contaminadas con Cr(VI)
De los diferentes sistemas de reaccioacuten ensayados (cultivos por lote lote repetido
continuo de una etapa lote alimentado y lote alimentado repetido) el cultivo por lote es
el maacutes adecuado para la reduccioacuten de Cr(VI) por Candida sp
Otra de las contribuciones de este trabajo fueron la formacioacuten de recursos humanos
tanto a nivel licenciatura como de posgrado Uno de los estudiantes de licenciatura ya
sustentoacute su examen profesional y la tesis de Maestriacutea de otra estudiante ya fue revisada
y aprobada por los sinodales por lo que el examen para obtener el grado se realizaraacute en
poco tiempo Actualmente estaacuten en proceso 1 tesis de licenciatura 2 de maestriacutea y 1 de
doctorado
Entre otros productos del proyecto de investigacioacuten se tienen la publicacioacuten de 2 artiacuteculos
en revistas internacionales incluidas en la base de datos del Journal of Citation Reports
del Institute for Scientific Information (ISI) la publicacioacuten de 2 artiacuteculos en extenso en
las memorias de Congresos Internacionales y la presentacioacuten de varios trabajos en
eventos acadeacutemicos nacionales e internacionales
