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INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA - INPA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE ÁGUA DOCE E

PESCA INTERIOR

Mapeamento cromossômico comparativo de ciclídeos amazônicos utilizando sequências repetitivas de DNA

Carlos Henrique Schneider

Manaus, Amazonas Fevereiro, 2013

ii

CARLOS HENRIQUE SCHNEIDER

Mapeamento cromossômico comparativo de ciclídeos amazônicos utilizando sequências repetitivas de DNA

Orientador: Eliana Feldberg, Dra.

Co-orientador: Cesar Martins, Dr. Unesp/Botucatu-SP

Tese apresentada ao Instituto

Nacional de Pesquisas da

Amazônia como parte dos

requisitos para obtenção do título

de Doutor em Biologia de Água

Doce e Pesca Interior.

Manaus, Amazonas Fevereiro, 2013

iii

FICHA CATALOGRÁFICA

S358 Schneider, Carlos Henrique

Mapeamento cromossômico comparativo de ciclídeos amazônicos utilizando sequências repetitivas de DNA / Carlos Henrique Schneider. --- Manaus : [s.n.], 2013.

xviii, 121 f. : il. color.

Tese (doutorado) --- INPA, Manaus, 2013.

Orientadora : Eliana Feldberg

Coorientador : Cesar Martins

Área de Concentração : Biologia de Água Doce e Pesca Interior

1. Evolução genômica – Ciclídeos – Amazônia. I. Título.

CDD 19. ed. 597.580415

Sinopse:

Análise da organização genômica comparativa de cinco espécies de

cinco tribos de ciclídeos neotropicais foram realizadas com uma

abordagem citogenética clássica (coloração convencional, detecção da

heterocromatina e regiões organizadoras de nucléolo) e molecular (DNAr

18 e 5S, sequência telomérica, retrotransposons Rex1, 3 e 6, sequências

microssatélites e fração repetitiva Cot-1 DNA). As análises evidenciaram

ampla diversidade genômica e cariotípica existente em ciclídeos

neotropicais e sugerem que grande parte desta ocorre em função de

sequências repetitivas.

Palavras-chave: FISH, retrotransposons, composição genômica,

evolução cariotípica

iv

Dedico esta Tese aos meus pais João Carlos e Edite, às minhas irmãs Marielle e Silvia e especialmente a minha esposa Maria Claudia Gross.

v

“O primeiro pecado da humanidade foi

a fé; a primeira virtude foi a dúvida.”

Carl Sagan

“Uma vida não questionada não

merece ser vivida.”

Platão

vi

A realização deste projeto foi possível devido:

Ao Programa de Pós-graduação em Biologia de Água Doce e Pesca

Interior, do INPA.

Ao laboratório de Genética Animal do INPA, Coordenação de Pesquisas

em Biodiversidade, onde a maior parte deste trabalho foi desenvolvido, com

financiamento proporcionado pelos Projetos de Pesquisas Institucionais (PPIs),

Fundação de Amparo à Pesquisa do Amazonas/Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Técnológico (PRONEX FAPEAM/CNPq

003/2009) e convênios entre estas agências e o Ministério de Ciências e

Tecnologia (INCT ADAPTA, FAPEAM/CNPq 573976/2008-2).

Aos laboratórios Genômica Integrativa da Universidade Estadual

Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – Botucatu/SP, Genética Animal da

Universidade Estadual de Ponta Grossa – Ponta Grossa/PR onde análises da

FISH foram realizadas, e ao Laboratório de Tecnologias de DNA da

Universidade Federal do Amazonas – Manaus/AM, onde as clonagens dos

DNAs repetitivos foram desenvolvidas.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

(CNPq) pela concessão da bolsa de estudo e pela taxa de bancada (processo

140816/2009-7) durante a realização deste trabalho.

vii

Agradecimentos Agradeço a todas as pessoas, colegas e amigos que, direta ou

indiretamente, possibilitaram a realização deste trabalho.

À Dra Eliana Feldberg, minha orientadora, que possibilitou a minha vinda

à Manaus, sempre deixou seu laboratório de portas abertas e topou encarar

este trabalho. Muito obrigado pelos inúmeros ensinamentos, apoio, conselhos,

atenção, críticas, sugestões, incentivo e amizade. Obrigado também por estar

sempre pronta a sanar dúvidas, ensinar, ler e reler rapidamente tudo que é

necessário para o bom andamento do trabalho.

Ao Dr Cesar Martins, meu co-orientador, que mesmo distante me

ensinou muito. Obrigado pela amizade, discussões, críticas, sugestões

agilidade nas correções, e também pelos momentos de descontração e muitas

risadas comendo costelas de tambaqui.

Ao Dr Jorge Ivan Rebelo Porto, por sua amizade pelos estímulos,

atenção, por sanar minhas dúvidas e por plantar muitas outras dúvidas na

minha cabeça que possibilitaram uma outra visão do meu trabalho.

Aos amigos do Laboratório de Genética Animal do INPA: Leandra, Leila,

Eduardo “Belugão”, Érica, Heidi, Carlos Faresin, Maelin, Lucas, Denise, Patrick,

Marajó, Masseo, Vanessa Susan, Cebola e tantos os outros que passaram por

lá. Valeu pelo bate-papo (científico ou não), pelas críticas e sugestões, bem

como pelo convívio diário e festas. Em especial aos amigos Leandra, Edu

(Belugão) e Leilinha, sem os vocês o Laboratório seria mais triste.

Aos amigos do Laboratório de Citogenômica da UFAM: Claudia, Natália,

Rafael, Renan, Ana Carolina “Fotula”, Thais, Francy, Marilia, Camila, Karol e a

agregada Jennifer “Janafa”, por me acolherem no reta final da tese. A família

LACA é demais.

À Carminha e Elany, super secretárias do BADPI. Sem elas os alunos

iriam sofrer muito.

Ao Robertão, Mara, Marcelo, Vivi, Leonardo, Miguel e demais colegas do

Laboratório de Citogenética Animal da Universidade Estadual de Ponta Grossa,

por me iniciarem na vida científica e pela imensa ajuda na reta final deste

trabalho.

viii

Ao MSc Edson Junior do Carmo, “o cara”, pela grande ajuda em todas

as clonagens. Edson, você é muito gente fina, sempre achando tempo para

ajudar todo mundo que te procura. Valeu mesmo.

A Leandra, minha parceira de bancada, amiga e nossa família aqui em

Manaus. Valeu pela paciência (desde a graduação), pelas inúmeras risadas e

pelos momentos de tensão divididos (que não foram poucos). Sempre esteve

presente em todas as conquistas e fracassos científicos desde a UEPG, rindo

ou chorando junto e sempre largando uma que mata todo mundo de rir. Você

fará falta em Manaus. Valeu Lê, uma bolsa de PIBIC divida em quatro deu

resultado.

Ao Lineu Gross e Marilda Delfrate Gross, grandes amigos que mesmo

longe estão sempre perto. É bom fazer parte da vida de vocês.

À Dra Maria Claudia Gross, pelo exemplo profissional, pela orientação,

pelo apoio, pelas críticas e sugestões, pela inúmeras revisões em todos os

capítulos e na versão final da tese, bem como pela acolhida na UFAM. E à

minha esposa Claudinha, obrigado pelo companheirismo e amizade nas horas

alegres e tristes, por aguentar a choradeira e os inúmeros estresses quando eu

achava que nada daria certo. Sempre com seu amor e carinho me incentivou a

seguir adiante e mostrou o ponto positivo de tudo. Claudinha: “Diante da

vastidão do tempo e da imensidão do universo, é um imenso prazer para mim

viver uma época e compartilhar a vida com você”. É maravilhoso ter você ao

meu lado. Amo você.

As minhas irmãs, Marielle e Silvia, pelo incentivo, apoio e momentos de

descontração nos finais de ano no Paraná. É ótimo ser irmão e amigo de

vocês.

Aos meus pais João Carlos Schneider (in memorian) e Edite Maria

Schneider, que sempre serão meus exemplos de vida. Obrigado pelo esforço e

ajuda que me fizeram chegar até aqui. Pai, cada dia sem você é triste, cada

volta ao Paraná, sem ter você para conversar e dar risadas é horrível. Obrigado

por você ter feito parte da minha vida. Mãe, obrigado por tudo, broncas e

palavras de apoio. Mãe, Mari e Silvinha passei os melhores dias da minha vida

com vocês e, depois que vim para Manaus, valorizo muito mais cada momento

que passamos juntos. Sem o apoio e incentivo de vocês, eu não teria crescido

pessoal e profissionalmente. Por isso esta conquista é nossa! Amo vocês!

ix

Resumo Os ciclídeos, além de serem explorados na pesca, no comércio ornamental e

na aquicultura, são considerados modelos para estudos de genética e

evolução. Distribuem-se nas Américas Central e do Sul, África, Madagascar e

sul da Índia. Os ciclídeos neotropicais, todos pertencem à subfamília Cichlinae,

que é subdividida em sete tribos: Cichlini, Retroculini, Astronotini,

Chaetobranchini, Geophagini, Cichlasomatini, e Heroini. Abordagens

citogenéticas clássicas têm sido realizadas no grupo neotropical, contudo

faltam informações sobre a mapeamento físico cromossômico, bem como

análise comparativa de sequências repetitivas, sendo que estas abordagens

são fundamentais para a identificação de rearranjos cromossômicos e melhor

interpretação da organização genômica deste grupo de peixes. O presente

estudo investigou de maneira comparativa, a organização genômica de

exemplares de tribos basais (Cichlini e Astronotini), intermediária (Geophagini)

e derivadas (Heroini) com uma abordagem citogenética clássica e molecular,

utilizando DNAr 18 e 5S, sequências teloméricas, retrotransposons Rex1, 3 e 6,

sequências microssatélites e fração repetitiva Cot-1 DNA, para mapeamento

cromossômico. Análises das sequências nucleotídicas foram realizadas.

Variações nos diversos marcadores citogenéticos foram evidenciadas, porém

nenhuma tendência com relação a aumento, diminuição ou manutenção do

número diploide basal de 2n=48 foi verificada nestas tribos. Algumas espécies

possuem dupliçações gênicas do DNAr 18S, bem como, sítios simples ou

múltiplos. Na maioria dos táxons analisados o DNAr 5S foi localizado na região

intersticial de um par de cromossomos homólogos, porém variações neste

padrão foram verificadas. Sítios teloméricos intersticiais (ITS) estão presentes

em cromossomos de algumas espécies, os quais foram relacionados com

eventos de rearranjos cromossômicos. O mapeamento físico dos

retroelementos evidenciou abundantes marcações dispersas nos cromossomos

da maioria das espécies. Algumas espécies apresentaram marcações

conspícuas em porções terminais e centroméricas, que estão marcações estão

associadas à regiões heterocromáticas, e às porções cromossômicas

eucromáticas. O elemento Rex1 apresentou maior quantidade de marcações

em espécies derivadas. As sequências nucleotídicas de Rex1 e 3 foram mais

conservadas em espécies basais que em derivadas, entretanto este padrão

x

não foi verificado em Rex6. Ainda, a presença de diferentes linhagens foram

observadas em Rex1, bem como possíveis eventos de transferência horizontal

marcaram a evolução de Rex1 e 3 no genoma de ciclídeos neotropicais. O

mapeamento do Cot-1 DNA e de sequências microssatélites evidenciou sinais

em porções centroméricas e teloméricas em algumas espécies e dispersos em

outras. Foi possível verificar ainda para as análises de Cot-1 DNA, que

espécies mais próximas filogeneticamente apresentam maior similaridade na

organização da fração repetitiva nos cromossomos. Os dados demonstram

ampla diversidade genômica e cariotípica existente em ciclídeos neotropicais e

sugerem que grande parte desta ocorre em função de sequências repetitivas,

as quais parecem estar influenciando a evolução destes peixes.

xi

Abstract In addition to their importance as food sources and for ornamental purposes

and aquiculture, cichlids are considered models in genetic and evolutionary

studies. These fish are distributed throughout Central and South America,

Africa, Madagascar, and southern India. All of the neotropical cichlids belonging

to the subfamily Cichlinae, which is in turn subdivided into seven tribes: Cichlini,

Retroculini, Astronotini, Chaetobranchini, Geophagini, Cichlasomatini, and

Heroini. Classical cytogenetic investigations have focused on the neotropical

group, but more information is still needed concerning their physical

chromosomal mapping as well as comparative analyses of their repetitive

sequences – fundamental approaches for the identification of chromosomal

rearrangements and for more precise interpretations of the genomic

organization of this group of fish. In that sense, the present study undertook a

comparative study of the genomic organization of specimens of the basal

(Cichlini and Astronotini), intermediate (Geophagini), and derived (Heroini)

tribes of Cichlinae using both classical and molecular cytogenetic techniques,

utilizing 18 and 5S DNAr, telomeric sequences, retrotransposons Rex1, 3 and

6, microsatellite sequences, and repetitive Cot-1 DNA fractions as probes for

chromosomal mapping. Analyses of nucleotide sequences were also

performed. Variations were seen in diverse cytogenetic markers, although no

tendency was confirmed in these tribes in terms of increasing, decreasing, or

maintaining the basal diploid number 2n=48. Some species demonstrated

genetic duplications of 18S DNAr, as well as simple or multiple sites. 5S DNAr

was located in the interstitial region of a homologous chromosome pair in most

of the taxa analyzed, although variations on this pattern were seen. Interstitial

telomeric sites (ITS) were observed on the chromosomes of some species and

were related to chromosomal rearrangement events. In terms of retroelements,

physical mapping indicated abundant markers dispersed along the

chromosomes of most species. Some species demonstrated conspicuous

markings in their terminal and centromeric portions that were associated with

heterochromatic as well as euchromatic chromosomal regions. The Rex1

element demonstrated greater numbers of markings in derived species. The

nucleotide sequences of Rex1 and 3 were more conserved in basal species

than in derived species, although this same pattern was not observed for Rex6.

xii

Evidence for different lineages was observed in Rex1, as well as possible

horizontal transfer events marking the evolution of Rex1 and 3 in the cichlid

genome. The mapping of the Cot-1 DNA repetitive fraction and microsatellite

sequences indicated centromeric and telomeric sites in some species but

dispersed sites in others. It was also possible to determine through Cot-1 DNA

analyses that the phylogenetically more closely related species demonstrated

greater similarity in the organizations of the repetitive fractions of their

chromosomes. Our data indicated ample genomic and karyotypic diversity

among Neotropical cichlids, suggesting that most of this diversity occurred due

to repetitive sequences that influenced the evolution of these fish.

xiii

SUMÁRIO

1 Introdução ..................................................................................................... 19

1.1 Objetivos ................................................................................................. 26

1.1.1 Objetivo Geral ................................................................................... 26

1.1.2 Objetivos específicos ........................................................................ 26

2 Material e Métodos........................................................................................ 27

2.1 Material ................................................................................................... 27

2.2 Métodos .................................................................................................. 29

2.2.1 Indução de mitoses........................................................................... 29

2.2.2 Obtenção de cromossomos mitóticos ............................................... 29

2.2.3 Detecção da heterocromatina constitutiva (Banda C)....................... 30

2.2.4 Detecção das regiões organizadoras de nucléolo – RONs............... 30

2.2.5 Extração de DNA .............................................................................. 31

2.2.6 Isolamento de sequências repetitivas por PCR (Polymerase Chain

Reaction) ................................................................................................... 31

2.2.7 Isolamento de sequências repetitivas através da técnica de Cot-1

DNA ........................................................................................................... 32

2.2.8 Clonagem ......................................................................................... 33

2.2.9 Sequenciamento dos fragmentos de DNA repetitivo ........................ 33

2.2.10 Hibridação in situ por fluorescência - FISH..................................... 34

2.2.11 Análise das Sequências.................................................................. 35

3. Resultados e Discussão............................................................................... 36

3.1 Artigo 1 – Evolução cromossômica de ciclídeos Neotropicais: o papel das

sequências de DNA repetitivo na organização e estrutura do cariótipo. ....... 37

3.1.1 Introdução......................................................................................... 39

3.1.2 Material e Métodos ........................................................................... 40

3.1.3 Resultados........................................................................................ 43

3.1.4 Discussão ......................................................................................... 52

xiv

3.2 Artigo 2 - Dinâmica evolutiva de elementos retrotransponíveis Rex1, Rex3

e Rex6 no genoma de ciclídeos Neotropicais. .............................................. 57

3.2.1 Introdução......................................................................................... 58


3.2.3 Resultados........................................................................................ 62

3.2.4 Discussão ......................................................................................... 73

3.3 Artigo 3 - Mapeamento cromossômico e sequenciamento nucleotídico de

DNAs repetitivos de ciclídeos Neotropicais................................................... 78

3.3.1 Introdução......................................................................................... 79


3.3.3 Resultados........................................................................................ 83

3.3.4 Discussão ......................................................................................... 89

3.4 Artigo 4 – Distribuição de sequências microssatélites em cromossomos

de ciclídeos amazônicas. .............................................................................. 95

3.4.1 Introdução......................................................................................... 96


3.4.3 Resultados........................................................................................ 98

3.4.4 Discussão ....................................................................................... 101

4 Conclusões Gerais ...................................................................................... 104

5 Referências bibliográficas ........................................................................... 105

xv

Lista de figuras

Introdução

Figura 1 Árvore de máxima parcimônia, com base dados genéticos e

morfológicos proposta por Smith et al. 2008. ................................................... 21

Figura 2 Imagem de satélite da região da bacia amazônica central,

evidenciando os pontos de coleta; 1=Barcelos; 2=rio Branco; 3=Anavilhanas;

4=rio Manacapuru; 5=lago Catalão; 6=Careiro; 7=lago de Balbina.................. 28

Capítulo 1

Figura 1 Cariótipos das espécies pertencentes as tribos de Cichlinae (Cichlini,

Astronotini, Geophagini, Cichlasomatini e Heroini) em banda-C. Os

cromossomos portadores da RON são mostrados na caixa. ........................... 45

Figura 2 Cariótipos das espécies pertencentes as tribos de Cichlinae (Heroini)

em banda-C. Os cromossomos portadores da RON são mostrados na caixa. 46

Figura 3 Cariótipos das espécies pertencentes as tribos da subfamília

Cichlinae, mostrando os sítios de DNAr 18S (vermelho) e 5S (verde). Os

cromossomos foram contra corados com DAPI. .............................................. 48

Figura 4 Cariótipos das espécies pertencentes as tribos da subfamília



Figura 5 Cariótipos das espécie pertencentes as tribos de Cichlinae,

mostrando sinais de hibridização com sonda telomérica (vermelho). Os


Figura 6 Cariótipos das espécie pertencentes as tribos de Cichlinae,



Capítulo 2

Figura 1 Alinhamento das sequências de aminoácidos dos diferentes

retroelementos entre ciclideos: A) Região correspondente a transcriptase

xvi

reversa de Rex1 das espécies analisadas em comparação com O. niloticus

(GenBank: AJ288473); B) Região correspondente a transcriptase reversa de

Rex3 em comparação com O. niloticus (GenBank: AJ400370) e C) Região da

endonuclease de Rex6 das espécies analisadas em comparação com O.

niloticus (GenBank: AJ293545). ....................................................................... 64

Figura 2 Árvore de máxima verossimilhança dos 49 clones de Rex1, revelando

duas linhages monofiléticas deste retroelemento. Valores de bootstrap maiores

que 60 são mostrado sobre os ramos. ............................................................. 65

Figura 3 Árvore de máxima verossimilhança dos 50 clones do retroelemento

Rex3. Valores de bootstrap maiores que 60 são mostrado sobre os ramos. ... 67

Figura 4 Árvore de máxima verossimilhança dos 59 clones do retroelemento

Rex6. Valores de bootstrap maiores que 60 são mostrado sobre os ramos. ... 69

Figura 5 Mapeamento cromossômico do retrotransposon Rex1 (sinais em

vermelho). Os cromossomos foram contra corados com DAPI........................ 71





Capítulo 3

Figura 1 Hibridização da fração Cot-1 DNA em quatro espécies de Cichlinae;

(A, E, I, M) cromossomos contra corados com DAPI das espécies C.

monoculus, A. ocellatus, G. proximus e S. discus, respectivamente; (B, F, J, N)

Sonda Cot-1 DNA isolada do genoma de C. monoculus hibridizada em seus

próprios cromossomos e contra os cromossomos das demais espécies, em (F)

cabeça de seta evidencia par sem sinais de hibridização, e alguns sinais

restringem-se a regiões teloméricas (seta); (C, G, K, O) Sonda Cot-1 DNA

isolada do genoma de S. discus hibridizada contra os cromossomos das

espécies analisadas e em seus próprios cromossomos, em (O) seta evidencia

cromossomos sem sinais de hibridização; (D, H, L, P) Double FISH da fração

Cot-1 DNA. ....................................................................................................... 88

Capítulo 4

xvii

Figura 1 Cromossomos metafásicos de C. monoculus, P. scalare e S. discus

hibridizados com sequências microssatélites (a – m). Setas evidenciam

ausência de sinais de hibridizações. Os cromossomos foram contra corados

com DAPI. ...................................................................................................... 101

xviii

Lista de tabelas Capítulo 1

Tabela 1 Espécies de Cichlinae analisadas..................................................... 41

Capítulo 3

Tabela 1 Similaridade entre sequências da fração Cot-1 DNA de C. monoculus

e sequências conhecidas em banco de dados públicos................................... 84

Tabela 2 Similaridade entre sequências da fração Cot-1 DNA de S. discus e

sequências conhecidas em banco de dados públicos...................................... 85

Capítulo 4

Tabela 1 Sequências dos microssatélites hibridizados nos cromossomos dos

ciclideos. (+) presença de sinal de hibridização; (-) ausência de sinal de

hibridização. ..................................................................................................... 99

19

1 Introdução

Biologia e citogenética de ciclídeos Sul Americanos

A família Cichlidae pertence à ordem Perciformes e é uma das mais

ricas em espécies de peixes de água doce do mundo, com aproximadamente

3.000 espécies. Possui ampla distribuição geográfica, sendo encontrada nas

Américas Central e do Sul, África, Madagascar e sul da Índia. Sua maior

diversidade ocorre nos lagos do leste africano, seguida da região Neotropical,

onde a região amazônica é a principal responsável por esta riqueza de

espécies (Kullander 2003).

Na Amazônia, os ciclídeos destacam-se tanto como fonte protéica,

quanto para fins ornamentais e pesca esportiva. No que diz respeito à

alimentação, os peixes são a base alimentar em regiões ribeirinhas e nos

grandes centros amazônicos, sendo umas das espécies de ciclídeos mais

consumidas o acará-açu (Astronotus spp.), o papa-terra (Geophagus spp.) e o

tucunaré (Cichla spp.), onde dados pesqueiros chegam a registrar um

desembarque de mais de 5.000 toneladas por ano da última espécie (Cabral

Júnior e Almeida 2006).

Além disso, os tucunarés também vêm atraindo aficionados pela pesca

esportiva de todo o mundo devido ao seu comportamento agressivo. Este tipo

de pesca tem aumentado no decorrer dos anos, principalmente na região que

abrange o médio rio Negro e seus afluentes (Freitas e Rivas 2006). Nesta

mesma região ocorre a exploração de peixes ornamentais. Segundo Anjos et

al. (2007) foram exportados mais de 700.000 exemplares de ciclídeos no ano

de 2005, com destaque para o acará-bandeira (Pterophyllum spp.), com mais

de 6.000 exemplares exportados legalmente em 2007 e o acará-disco

(Symphysodon spp.), com mais de 42.000 exportações na mesma época

(IBAMA 2008). O destino da maioria destes peixes é a Ásia e a Europa.

Os ciclídeos são considerados um grupo monofilético (Kullander 1998;

Farias et al. 1999, Smith et al. 2008), que se destacam pelo grande sucesso

evolutivo e alta taxa de especiação e especialização (Lowe-McConnell 1969;

Thompson 1979). Farias et al. (2000), combinando caracteres morfológicos e

genéticos (sequências de DNA de genes mitocondriais e nucleares) sugeriram

que as subfamílias de ciclídeos africanos Heterochromidinae e

20

Pseudocrenilabrinae seria grupo irmão dos ciclídeos neotropicais. De acordo

com Kullander (1998), os ciclídeos neotropicais pertencem à família Cichlidae,

e esta é subdividida nas seguintes subfamílias: Retroculinae, Cichlinae,

Astronotinae, Geophaginae e Cichlasomatinae. Entretanto, um gênero africano

(Heterochromis) era agrupado com os ciclídeos neotropicais. Na última revisão

filogenética realizada neste grupo, baseada em diferentes marcadores

genéticos e morfológicos, todos os ciclídeos neotropicais foram agrupados na

subfamília Cichlinae subdividida em sete tribos: Cichlini, Retroculini, Astronotini,

Chaetobranchini, Geophagini, Cichlasomatini, e Heroini (Smith et al. 2008)

(Figura 1).

21

Figura 1 Árvore de máxima parcimônia, com base em dados genéticos e

morfológicos proposta por Smith et al. 2008.

O número diploide mais frequente para espécies da subfamília Cichlinae

é 2n=48 cromossomos, número considerado ancestral para esta subfamília e

também para a ordem Perciformes (Brum 1995; Feldberg et al. 2003). Porém,

de acordo com Feldberg et al. (2003), três tendências de evolução

cromossômica são evidenciadas nos ciclídeos: a primeira é a manutenção do

22

número diploide ancestral, a segunda é a diminuição do número cromossômico

chegando até 2n=32 e a terceira é o aumento do número diploide atingindo

2n=60 cromossomos.

Estas três tendências foram evidenciadas na tribo Cichlasomatini por

Santos (2006), creditadas à ocorrência de rearranjos Robertsonianos (fissão e

fusão cêntrica) e não Robertsonianos (inversão pericêntrica) durante a

evolução cariotípica dos ciclídeos amazônicos. Um exemplo de diminuição do

número diploide é visualizado no gênero Pterophyllum, onde P. scalare e P.

leopoldi apresentam número diploide igual a 48 cromossomos e a espécie P.

altum, 2n=46 cromossomos, diminuição esta que ocorreu devido à fusão de

quatro cromossomos. Além disso, inversões pericêntricas também são

evidentes no gênero e teriam modificado o número de braços cromossômicos.

Para o gênero Cichla, destaca-se o trabalho realizado por Alves-Brinn et

al. (2004), onde, analisando espécimes provenientes da Usina Hidroelétrica de

Balbina (bacia do rio Uatumã), evidenciaram uma possível hibridização natural

entre C. monoculus e C. temensis. Os indivíduos híbridos (Cichla sp.)

apresentaram características morfológicas e cariotípicas intermediárias. Todos

os indivíduos (C. monoculus, C. temensis e Cichla sp.) apresentavam cariótipo

com 2n=48 cromossomos acrocêntricos, porém com relação à região

organizadora de nucléolo (RON) os exemplares de C. monoculus e cinco

indivíduos híbridos apresentaram marcação no segundo par cromossômico,

enquanto para C. temensis e três híbridos esta foi evidenciada no terceiro par.

Como C. monoculus e C. temensis são encontrados em simpatria em muitos

locais da bacia amazônica, os autores sugerem que o ancestral de Cichla sp.

seria o resultado do cruzamento destas espécies.

Com objetivo de conhecer o cariótipo de ciclídeos neotropicais Felberg e

Bertollo (1985) analisaram Geophagus brasiliensis, G. surinamensis e

Astronotus ocellatus. Com relação à G. brasiliensis e G. surinamensis os

autores encontraram 2n=48 cromossomos para ambos, porém evidenciaram

uma diferença na morfologia cromossômica, onde a primeira espécie apresenta

apenas um par de metacêntrico enquanto a segunda dois pares. No que se

refere à Astronotus ocellatus, todos os espécimens apresentaram 2n=48

cromossomos, porém com seis pares de cromossomos meta-

submetacêntricos. Estes dados evidenciam novamente que, embora o número

23

cromossômico da subfamília seja conservado, algumas espécies tiveram

rearranjos estruturais durante a sua evolução cromossômica propiciando assim

a alteração da fórmula cariotípica.

Os acarás-discos do gênero Symphysodon foram analisados

citogeneticamente e revelaram dados interessantes. As três espécies do

gênero (S. aequifasciatus, S. discus e S. haraldi) apresentaram número

diploide igual a 2n=60 cromossomos, com a maioria dos cromossomos meta-

submetacêntricos (Mesquita et al. 2008; Gross et al. 2009a). Além desta

característica derivada, S. aequifasciatus apresentou também uma cadeia

cromossômica meiótica em anel contendo 20 elementos e mais 20 bivalentes

em células diplotênicas, provavelmente originada de translocações múltiplas e

seriadas, enquanto S. discus apresentou apenas 30 bivalentes, o que sugere

que S. aequifasciatus diferenciou-se cromossomicamente num período mais

recente que S. discus (Gross et al. 2009a).

DNAs repetitivos

Genes de cópia única ou de poucas cópias correspondem a uma

pequena parte do genoma dos vertebrados (2-10%), quando comparado às

regiões repetitivas (Horvath et al. 2001). Eucariotos têm dois tipos de DNA

altamente repetitivos: sequências de DNA repetitivos dispersas e sequências

de DNA repetidas em tandem. As sequências de DNA repetidas em tandem

incluem os DNAs satélite, enquanto as sequências repetitivas dispersas

englobam os elementos transponíveis (Phillips e Reed 1996; Martins 2007).

DNAs satélites podem variar de 1.000 a 100.000 cópias por genoma,

comumente com repetições entre 100 a 300 pares de bases. Estas sequências

são organizadas em grandes grupos, principalmente na região telomérica e

centromérica dos cromossomos e são os principais componentes das

heterocromatinas (Martins 2007). Esta classe de DNA repetitivo é uma

ferramenta útil no mapeamento físico do genoma, contribuindo para o

desenvolvimento de marcadores genéticos de fundamental importância para o

conhecimento da estrutura cromossômica e da evolução em muitas espécies

de peixes (Azevedo et al. 2005).

Os elementos transponíveis (transposons e retrotransposons) são

encontrados dispersos pelo genoma, com um número de cópias que pode

24

variar de 10 a milhares, dependendo do elemento transponível e da espécie

que se encontra (Tafalla et al. 2006). Com base na estrutura e em seu

mecanismo de transposição estes elementos são divididos em duas classes: a

primeira engloba os três tipos de transposons que têm um RNA como

intermediário (retrotransposon), sendo eles: elementos longos intercalados

(long interspersed elements-LINEs), elementos curtos intercalados (short

intersperser elements-SINEs) e os que possuem longas repetições terminais

(long terminal repeats-LTRs); a segunda inclui todos os que são transpostos

diretamente de DNA para DNA, ou seja, sem outra molécula intermediária (Van

Sluys et al. 2001; Tafalla et al. 2006; Martins 2007). Nos genomas dos peixes

são encontradas as duas classes de elementos transponíveis (Volff et al. 2003;

Tafalla et al. 2006).

Elementos transponíveis podem estar associados a regiões

heterocromáticas, como demonstrado por Capriglione et al. (2002), em

Chionodraco hamatus, família Channichthyidae da região Antártica. Os autores

estudaram o transposon Tc1 e evidenciaram que ele está localizado em

regiões heterocromáticas, particularmente no cromossomo sexual (Y)

sugerindo que este elemento transponível esteve envolvido na diferenciação

deste cromossomo.

Analisando retrotransposons (Rex1, Rex3, Rex6) em peixes da

Antártica, Ozouf-Costaz et al. (2004) sugeriram uma possível correlação entre

rearranjos cromossômicos e atividade dos retrotransposons (Rex3), tendo em

vista que a espécie que possui o cariótipo derivado tem um padrão de

hibridização mais compartimentalizada, com acúmulo destes elementos nas

regiões pericentroméricas dos cromossomos, enquanto as espécies basais

apresentam distribuição homogênea.

Mapeamento citogenético

Apesar da citogenética estar proporcionando dados interessantes a

respeito dos ciclídeos amazônicos, estudos envolvendo a localização de

sequências específicas de DNA em cromossomos são ainda incipientes nos

peixes desta região. A citogenética molecular é utilizada para identificação de

sequências de DNA específicas no cromossomo, consistindo basicamente no

25

pareamento de determinado segmento de DNA ou RNA com uma sequência de

nucleotídeos complementar situado na célula alvo (Guerra 2004).

Na citogenética de peixes a hibridização fluorescente in situ (FISH)

revela-se importante, pois tem permitido novas interpretações da diversidade

cariotípica, em particular sobre a origem de cromossomos sexuais e de

supranumerários, bem como sobre a organização genômica de segmentos

cromossômicos (Galetti Jr e Martins 2004).

As sequências repetitivas de DNA tem sido amplamente exploradas

como sondas para FISH uma vez que este tipo de DNA gera sinais de fácil

visualização nos cromossomos. Tais abordagens vem sendo aplicadas a

estudos que visam o entendimento da carioevolução e organização genômica

em peixes, uma vez que permite a localização de sequências específicas de

DNA no cariótipo de uma espécie e a comparação destas com grupos

relacionados. Tendo em vista que os ciclídeos amazônicos são altamente

explorados, estudos que visem o conhecimento do genoma destes peixes

fazem-se necessários. Dessa forma, o mapeamento cromossômico de

sequências repetitivas de DNA em ciclídeos pode propiciar uma melhor visão

da organização do genoma e, portanto, gerar subsídios para programas de

melhoramento genético assistido na piscicultura, além de ser um marcador

interessante para inferências sobre rearranjos cromossômicos que ocorreram

na evolução do grupo. Para tanto foram escolhidas espécies de ciclídeos

neotropicais de interesse econômico, englobando as diferentes tribos, desde

basais até derivadas, com ampla distribuição e elevada abundância na bacia

amazônica.

26

1.1 Objetivos

1.1.1 Objetivo Geral

Identificar e mapear sequências de DNA repetitivo em ciclídeos

amazônicos, englobando espécies consideradas basais e derivadas,

contribuindo para o entendimento da organização genômica dos ciclídeos

neotropicais e sua evolução cariotípica.

1.1.2 Objetivos específicos

Isolar e caracterizar sequências repetitivas de DNA presentes no genoma

das espécies de diferentes tribos de Cichlinae.

Comparar o mapeamento cromossômico destas espécies, utilizando as

sequências repetitivas isoladas.

Inferir quais foram os principais rearranjos que ocorreram na carioevolução

dos ciclídeos neotropicais.

Analisar comparativamente as sequências nucleotídicas entre as espécies

modelo.

27

2 Material e Métodos

2.1 Material

Foram estudados citogeneticamente 12 exemplares de Cichla

monoculus (Cichlini), 10 de Astronotus ocellatus (Astronotini), 12 Geophagus

proximus (Geophagini), 6 de Acaronia nassa e 1 de Bujurquina peregrinabunda

(Cichlasomatini), 6 de Hoplarchus psittacus, 4 de Hypselecara coryphaenoides,

5 de Hypselecara temporalis, 3 de Caquetaia spectabilis, 6 de Uaru

amphiacanthoides, 4 de Pterophyllum leopoldi, 12 de Pterophyllum scalare e 12

de Symphysodon discus (Heroini). Os indivíduos foram coletados em diferentes

localidades da bacia amazônica (Figura 2), com redes de pesca (malhas 70, 80

e 90), e seguindo as normatizações do IBAMA de acordo com a autorização

SISBIO 10609-1/2007.

Os peixes foram mantidos vivos em aquário aerado durante o transporte

até o laboratório de campo ou para o Laboratório de Genética Animal do

Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia - Manaus, onde foram realizadas

as análises.

Os exemplares foram anestesiados em água gelada. Para a obtenção de

preparações cromossômicas foram extraídos os órgãos hematopoiéticos e para

extração do DNA amostras de tecido muscular e fígado de todos os indivíduos,

sendo os animais numerados, registrados, fixados em formol 10% durante 24h

e acondicionados posteriormente em recipientes contendo álcool 70%.

Exemplares testemunhos foram depositados na Coleção Ictiológica do INPA

sob números: INPA 26451, INPA 26452, INPA 26453, INPA 26459, INPA

26462, INPA 26466

28

Figura 2 Imagem de satélite da região da bacia amazônica central, evidenciando os pontos de coleta; 1=Barcelos; 2=rio Branco;

3=Anavilhanas; 4=rio Manacapuru; 5=lago Catalão; 6=Careiro; 7=lago de Balbina.

29

2.2 Métodos

2.2.1 Indução de mitoses

Para se obter um maior número de células em metáfase, foi utilizada a

técnica para indução de mitoses, descrita por Oliveira et al. (1988), na qual

uma solução de fermento biológico foi aplicada nos espécimes.

A solução de fermento biológico foi preparada com 0,3 g de fermento

biológico comercial, 0,3 g de açúcar e 10 mL de água destilada, sendo esta

mantida em estufa (37 °C) por um período de 15-20 minutos, e posteriormente

injetada na região dorso-lateral do peixe, na proporção de 1mL para cada 100 g

de peso do animal. Os peixes submetidos ao tratamento com solução de

fermento biológico foram colocados em aquários bem aerados por 24 horas.

2.2.2 Obtenção de cromossomos mitóticos

As preparações citogenéticas foram obtidas seguindo-se a metodologia

descrita por Bertollo et al. (1978), com algumas modificações, que consiste em

injetar intraperitonealmente colchicina 0,0125% na proporção de 1 mL para

cada 100 g de peso do animal. Os peixes permaneceram em aquário bem

aerado por 40 minutos. Em seguida foram sacrificados por imersão em água

gelada e a porção anterior do rim foi retirada, sendo transferida para uma

solução hipotônica de KCL 0,075 M (6-8 mL). O tecido foi divulcionado com o

auxílio de uma seringa de vidro e o sobrenadante (suspensão celular) foi

transferido com o auxílio de uma pipeta Pasteur para um tubo de centrífuga. A

suspensão celular obtida foi incubada em estufa a 37 °C por 30 minutos.

Transcorrido este tempo a suspensão foi pré-fixada com 6 gotas de

metanol:ácido acético (3:1) e ressuspendida. Após 5 minutos, foi adicionado

fixador até encher o tubo. A suspensão foi centrifugada por 10 minutos a 900

rpm. O sobrenadante foi desprezado e 6 mL de fixador foi adicionado, sendo o

material ressuspendido novamente e centrifugado por 10 minutos a 900 rpm. O

sobrenadante foi desprezado e 6 mL de fixador foi adicionado, e essa lavagem

foi repetida por mais duas vezes. Após a última centrifugação e eliminação do

sobrenadante, 1,5 mL de fixador foram adicionados e o material foi

ressuspendido com cuidado. Essa suspensão celular foi então estocada em

micro tubo e mantida em freezer para posterior utilização.

30

Para a preparação das lâminas as mesmas foram lavadas, secas ao ar e

posteriormente imersas em água destilada a 55 ºC, em banho-maria. Após

cinco minutos, as lâminas foram retiradas da água de forma a manter uma

película de água sobre a sua superfície, na qual foi gotejada a suspensão

celular em diferentes regiões. As lâminas secaram diretamente ao ar.

2.2.3 Detecção da heterocromatina constitutiva (Banda C)

Para a detecção da heterocromatina constitutiva foi utilizada a técnica

descrita por Sumner (1972), com algumas modificações. As lâminas com a

suspensão celular foram tratadas em solução de HCl 0,2N a 45 °C, por 2

minutos e lavadas rapidamente em água destilada à temperatura ambiente.

Após secas as lâminas foram incubadas por 1 minuto e 20 segundos em

solução de hidróxido de bário a 5%, a 42 °C, recém preparada e filtrada. A

ação do hidróxido de bário foi interrompida imergindo-se rapidamente a lâmina

em solução de HCl 0,2N, lavada em água destilada e deixada secar ao ar.

Após secas, as lâminas foram incubadas em solução 2xSSC (cloreto de sódio

0,3M e citrato trisódico 0,03M, pH 6,8) em banho-maria a 60 °C, por 15

minutos. Em seguida, as lâminas foram lavadas várias vezes em água

destilada e secas ao ar, sendo posteriormente coradas com solução de Giemsa

(diluída a 5% em tampão fosfato 0,06M e pH 6,8) durante 10 minutos, lavadas

em água destilada e secas.

2.2.4 Detecção das regiões organizadoras de nucléolo – RONs

Para a detecção das regiões organizadoras de nucléolo (RONs) foi

utilizada a técnica descrita por Howell e Black (1980), com modificações. Sobre

as lâminas com a suspensão foram adicionadas 2 gotas de uma solução

coloidal de gelatina (2 g de gelatina comercial sem sabor, dissolvida em 100

mL de água destilada, acrescida de 1 mL de acido fórmico) e, sobre cada gota

de gelatina, duas gotas de solução aquosa de nitrato de Prata (AgNO3) a 50%,

agitando-se levemente a lâmina, que foi coberta com lamínula. A lâmina foi

colocada em câmara úmida, em banho-maria a 60 °C, até adquirir uma

coloração marrom dourada, sendo posteriormente lavada em água destilada.

31

2.2.5 Extração de DNA

Para extração do DNA foram descartadas as vísceras e as escamas,

utilizando-se somente o tecido muscular. O protocolo de extração de DNA

utilizado foi o descrito por Sambrook et al. (1989), com algumas modificações.

O tampão de lise utilizado foi (Tris-HCl pH 8,0 em 10 mM, NaCl 0,3 M, EDTA

10 mM), posteriormente foram acrescentados: 15 μL de proteinase K (10

mg/mL) e 6 μL de RNAse A (10 mg/mL). As amostras foram incubadas para

que o tecido fosse totalmente digerido.

A seguir foram feitas lavagens sucessivas com fenol clorofórmio e

clorofórmio hidratado (500μL de cada um destes reagentes). Após a lise, o

DNA foi separado das proteínas por precipitação salina juntamente com

centrifugação a 14000 rpm. O sobrenadante foi então precipitado com 600 μL

de isopropanol 100% gelado, também com o auxílio de centrifugação. Ao final,

o DNA foi hidratado com aproximadamente 100 μL de água milli-Q,

dependendo do tamanho do pellet (DNA precipitado) formado.

Para possibilitar a análise da quantidade e integridade do material, o

DNA extraído foi quantificado por comparação com marcador de concentração

conhecida, em eletroforese padrão (com tampão Tris-Borato-EDTA 0,5X e

corrida a 70 V por 40 minutos) em gel de agarose 0,8% e corado com GelRed

Acid Gel Stain Biotium (1:500). A visualização e análise do DNA no gel foram

feitas no fotodocumentador Easy Doc 100 (BioAgency), o qual possui acoplado

um transluminador de luz ultravioleta (260 nM). Adicionalmente, quantificações

em espectrofotômetro NanoVue Plus (GE Healthcare) foram realizadas.

2.2.6 Isolamento de sequências repetitivas por PCR (Polymerase Chain

Reaction)

Elementos transponíveis Rex1, Rex3 e Rex6, bem como as sequências

teloméricas e os DNAs ribossomais 18S e 5S foram amplificados por PCR. Os

primers utilizados, as condições de PCR e os perfis encontram-se detalhados

nas seções Material e Métodos de cada capítulo. Depois de isolados, os

elementos transponíveis foram clonados e sequenciados. Os produtos de PCR

foram verificados e quantificados por comparação com o marcador Low Mass

DNA Ladder (Invitrogen) em eletroforese em gel de agarose 1,0% corado com

32

GelRed Acid Gel Stain (Biotium 1:500). A visualização e análise do DNA no gel

foram feitas no fotodocumentador Easy Doc 100 (BioAgency), o qual possui

acoplado um transluminador de luz ultravioleta (260 nM). Adicionalmente,

quantificações em espectrofotômetro NanoVue Plus (GE Healthcare) foram

realizadas.

Após isolados e caracterizados por sequenciamento, os elementos

foram utilizados como sondas para hibridização dos cromossomos metafásicos.

2.2.7 Isolamento de sequências repetitivas através da técnica de Cot-1 DNA

O isolamento de sequências repetitivas baseado na cinética de

reassociação do DNA foi conduzido segundo Zwick et al. (1997) e adaptado por

Ferreira e Martins (2008). O DNA genômico foi diluído a 100-500 ng/µl em NaCl

0,3 M. Em seguida, em tubos de 1,5 ml foi colocado 50 µl de DNA e

autoclavado por 3 minutos a 1.4 atm/120 oC. Foi aplicado 3 µl do DNA

autoclavado em gel de agarose 1% para checar o tamanho dos fragmentos

obtidos. Após, 3 alíquotas (tubos 0, 3 e 5) com 50 µl do DNA autoclavado foram

desnaturadas em banho a 95 oC por 10 minutos. Os tubos foram colocados em

gelo por 10 segundos. O tubo 0 foi tratado imediatamente com enzima S1

nuclease. Os tubos 1 e 5 foram colocados em banho a 65 oC para renaturação.

Após 3 minutos, foi retirado o tubo 1 e tratado com S1 nuclease e após 5

minutos, foi retirado o tubo 5 e tratado com a mesma enzima. Para o

tratamento com S1 nuclease, foi utilizado 1U da enzima para cada 1 µg de

DNA (5,5 µl tampão 10X para o volume final de 50 µl). As amostras foram

incubadas a 37 oC por 8 minutos e posteriormente congeladas imediatamente

em nitrogênio líquido. Foi adicionado volume igual de fenol/clorofórmio (1:1) e

centrífugado por 5 minutos a 13.000 rpm. Em seguida, as amostras foram

transferidas para um novo tubo e o DNA foi precipitado com 2,5 volumes de

etanol absoluto gelado. O material foi deixado no freezer a 80 oC negativos por

30 minutos e posteriormente centrifugado por 15 minutos a 15.000 rpm a 4 oC,

o álcool foi descartado e o pellet foi seco e estufa. O material foi ressuspendido

em 50 µl de água ultra-pura estéril autoclavada e o tamanho do fragmento foi

checado por comparação com marcador de Low Mass DNA 1 Kb, em

33

eletroforese padrão (com tampão Tris-Borato-EDTA 0,5X e corrida a 70 V por

40 minutos) em gel de agarose 0,8%, corado com GelRed Acid Gel Stain

(Biotium 1:500). A visualização e análise do DNA no gel foram feitas no

fotodocumentador Easy Doc 100 (BioAgency), o qual possui acoplado um

transluminador de luz ultravioleta (260 nM).

2.2.8 Clonagem

Os elementos transponíveis obtidos por PCR e as sequências repetitivas

obtidas por Cot-1 foram inseridos no vetor plasmidial pGem-T easy (Promega)

e pMOS (GE HealthCare) respectivamente. As construções recombinantes

obtidas foram utilizadas para transformar bactérias competentes de Escherichia

coli linhagem DH5α. Para isso foram pipetadas 50 µL de células competentes

em um tubo eppendorf; e adicionados 10 µL do produto obtido na ligação às

células competentes, misturando tudo suavemente. As células foram incubadas

no gelo por 30 minutos, e em seguida foram submetidas a um choque térmico

por 40 segundos no banho-maria a 42 ºC e colocadas no gelo por 2 minutos.

Foi adicionado 80 µL de meio cultura LB (Luria-Bertani) em cada tubo e os

mesmos foram colocados para agitar a 150 rpm por uma hora a 37 ºC.

Enquanto isso, 30 µL de X-Gal (50 mg/mL) e 50 µL IPTG (0,1 M) foram

espalhados em cada placa de meio de cultura sólido contendo ampicilina (100

mg/mL), para a seleção dos clones recombinantes. As bactérias foram

plaqueadas e incubadas a 37 ºC durante uma noite (aproximadamente 16

horas).

2.2.9 Sequenciamento dos fragmentos de DNA repetitivo

Para confirmar e identificar os produtos isolados os fragmentos foram

sequenciados pelo método de Sanger et al. (1977), com terminadores

marcados com fluorescência.

Para a realização do sequenciamento foram utilizados entre 150 e 300

ng de DNA, 5 pmol de cada primer em reações separadas; 4 μL do premix (kit)

e água mili-Q para completar o volume de 10 μL. Essas reações foram

processadas em um termociclador em 30 ciclos sendo: desnaturação a 95 °C

34

por 20 segundos, anelamento a 50 °C por 15 segundos e extensão a 72 °C por

1 minuto e 30 segundos. Os primers utilizados no sequenciamento foram

primers universais que se anelam nos plasmídios pMOS e pGEM-T utilizados

como vetores de clonagem. Depois de sequenciado, os fragmentos foram

submetidos a um tratamento de precipitação para a eliminação do produto não

incorporado durante a reação de sequenciamento e logo após foi realizada a

leitura automática do fragmento no sequenciador automático ABI 3130 XL

(Applied Biosystem) nas condições de injeção e corrida recomendadas pelo

fabricante.

2.2.10 Hibridização fluorescente in situ (FISH)

Foi realizada a técnica de hidridização fluorescente in situ (FISH)

descrita por Pinkel et al. (1986) com alguns ajustes.

Tratamento das lâminas:

As lâminas foram lavadas em tampão PBS 1x durante 5 minutos em

temperatura ambiente, sendo posteriormente desidratadas em série alcoólica

70, 85 e 100%, 5 minutos cada e secas ao ar. As lâminas foram incubadas em

90 μl de RNAse (0,4% RNAse/2xSSC) a 37 °C por 1h em câmara úmida.

Transcorrido este tempo, as lâminas foram lavadas três vezes em 2xSSC por 5

minutos cada e em PBS 1x pelo mesmo tempo. As lâminas foram fixadas em

formaldeídeo 1% em PBS 1x/50mM MgCl2 durante 10 minutos à temperatura

ambiente e em seguida lavadas em PBS 1x por 5 minutos, sendo então

desidratadas em série alcoólica gelada (70,85, 100 %) por 5 minutos cada.

Simultaneamente a desidratação da lâmina em série alcoólica, a solução de

hibridização contendo formamida 100% (concentração final 50%), sulfato de

dextrano 50%, 20xSSC (concentração final de 2xSSC), sondas marcadas e

água milli-Q foi desnaturada a 99 ºC por um período de 10 minutos, sendo

passada imediatamente ao gelo.

O DNA cromossômico foi desnaturado com formamida 70% em 2xSSC a 70

ºC por 5 minutos e desidratado em etanol gelado 70%, 85% e 100% por 5

minutos cada, secando ao ar. A solução de hibridização foi colocada sobre a

lâmina com os cromossomos desnaturados e incubada em câmara úmida a 37

oC por aproximadamente 18 horas.

35

Após o tempo de hibridização, as lâminas foram lavadas em formamida

15% a 42 oC durante 10 minutos e posteriormente lavadas em solução Tween

0,5%, por 5 minutos. Para detecção do sinal as lâminas foram incubadas em

tampão NFDM por 15 minutos e lavar 2 vezes com Tween 0,5% temperatura

ambiente por 5 minutos cada. As lâminas foram incubadas com o anticorpo

antidigoxigenina ou com estreptavidina, por 60 minutos em câmara úmida a 37 oC. Após este tempo as lâminas foram lavadas 3 vezes com Tween 0,5%

temperatura ambiente por 5 minutos cada, desidratadas em série alcoólica

gelada 70, 85 e 100% durante 5 minutos cada e após secas montadas com

antifade e DAPI, sendo cobertas com lamínulas.

2.2.11 Análise das Sequências

As amostras sequenciadas foram salvas (formato abd) e transferidas do

sequenciador para outro computador. Todas as sequências foram alinhadas

utilizando-se o programa de alinhamento múltiplo Clustal W (Thompson et al.

1994), que está incluso no BioEdit 7 (Hall 1999). Para identificação de

possíveis homologias, as sequências nucleotídicas obtidas foram submetidas a

buscas online BLAST (“Basic Local Alignment Search Tool”) (Altschul et al.

1990) através do National Center for Biotechnology Information (NCBI) (USA),

“website” (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) e na base de dados Repbase do

Genetic Information Research Institute (http://www.girinst.org/censor/) utilizando

o programa on-line Censor (Kohany et al. 2006). As sequências geradas foram

depositadas no banco de dados do GenBank e os números de acessos

encontram-se em cada capítulo no tópico Resultados e Discussão.

36

3. Resultados e Discussão

Os resultados obtidos com a análise cromossômica comparativa de

ciclídeos amazônicos e a discussão destes dados são apresentados na forma

de quatro artigos científicos, mencionado a seguir:

3.1 Artigo 1 – Evolução cromossômica de ciclídeos Neotropicais: o papel das

sequências de DNA repetitivo na organização e estrutura do cariótipo.

Publicado no periódico Reviews in Fish Biology and Fisheries, doi:

10.1007/s11160-012-9285-3.

3.2 Artigo 2 – Dinâmica evolutiva de elementos retrotransponíveis Rex1, Rex3

e Rex6 no genoma de ciclídeos Neotropicais. Enviado para publicação no

periódico BMC Evolutionary Biology, em 10/09/2012 (MS ID:

9875706468235423).

3.3 Artigo 3 – Mapeamento cromossômico e sequenciamento nucleotídico de

DNAs repetitivos de ciclídeos Neotropicais. Enviado para publicação no

periódico Genetica, em 14/11/2012 (MS ID: GENE-D-12-02244).

3.4 Artigo 4 – Distribuição de sequências microssatélites em cromossomos de

ciclídeos amazônicos. Enviado para publicação no periódico Hydrobiologia, em

27/12/2012 (MS ID: HYDR-D-12-08297)

37

3.1 Artigo 1 – Evolução cromossômica de ciclídeos Neotropicais: o papel das sequências de DNA repetitivo na organização e estrutura do cariótipo

38

RESEA RCH PA PER

Chromosomal evolution of neotropical cichlids: the roleof repetitive DNA sequences in the organizationand structure of karyotype

Car los Henr ique Schneider • Mar ia Claudia Gross •

Mar ia Leandra Terencio • Rober to Ferreira Ar toni •

Marcelo Ricardo Vicar i • Cesar Mar tins • Eliana Feldberg

Received: 15 June 2012 / Accepted: 20 August 2012Ó Springer Science+Business Media B.V. 2012

Abstract Cichlids are important in the aquacultureand ornamental fish trade and are considered modelsfor evolutionary biology. However, most studies ofcichlids have investigated African species, and theSouth American cichlids remain poorly characterized.Studies in neotropical regions have focused almostexclusively on classical cytogenetic approaches with-out investigating physical chromosomal mapping ofspecific sequences. The aim of the present study is toinvestigate the genomic organization of speciesbelonging to different tribes of the subfamilyCichlinae (Cichla monoculus, Astronotus ocellatus,

Geophagus proximus, Acaronia nassa, Bujurquinaperegrinabunda, Hoplarchus psittacus, Hypselecaracoryphaenoides, Hypselecara temporalis, Caquetaiaspectabilis, Uaru amphiacanthoides, Pterophyllumleopoldi , Pterophyl lum scalare, and Symphysodondiscus) and reexamine the karyotypic evolutionarypatterns proposed for this group. Variations in somecytogenetic markers were observed, although notrends were found in terms of the increase, decrease,or maintenance of the basal diploid chromosomenumber 2n = 48 in the tribes. Several species wereobserved to have 18S rDNA genetic duplications, aswell as multiple rDNA loci. In most of the taxaanalyzed, the 5S rDNA was located in the interstitialregion of a pair of homologous chromosomes,although variations from this pattern were observed.Interstitial telomere sites were also observed andappear to be involved in chromosomal rearrangementevents and the accumulation of repeat-rich satelli teDNA sequences. Our data demonstrated the karyo-typic diversity that exists among neotropical cichlids,suggesting that most of this diversity is due to therepetitive sequences present in heterochromaticregions and that repeat sequences have greatly influ-enced the karyotypic evolution of these fishes.

Keywor ds Karyotype evolutionInterstitial telomeric sitesFluorescent in situ hybridizationRibosomal DNA

C. H. Schneider (& ) M. L. Terencio E. FeldbergLaboratorio de Genetica Animal, Instituto Nacional dePesquisas da Amazonia (INPA), Av. Andre Araujo, 2936,Petropolis, Manaus, Amazonas 69011-970, Brazile-mail: [email protected]

M. C. GrossLaboratorio de Citogenomica, Departamento de Biologia,Instituto de Ciencias Biologicas, Universidade Federal doAmazonas, Manaus, AM, Brazil

R. F. Artoni M. R. VicariLaboratorio de Citogenetica e Evolucao, Departamento deBiologia Estrutural, Molecular e Genetica, UniversidadeEstadual de Ponta Grossa, Ponta Grossa, PR, Brazil

C. MartinsLaboratorio de Genomica Integrativa, Departamento deMorfologia, Instituto de Biociencias, UniversidadeEstadual Paulista Julio de Mesquita Filho (UNESP),Botucatu, SP, Brazil

123

Rev Fish Biol FisheriesDOI 10.1007/s11160-012-9285-3

Author's personal copy

39

3.1.1 Introdução

Ciclideos pertencem a uma das mais ricas famílias em número de

espécies, de peixes de água doce mundo e uma das principais famílias de

vertebrados, com mais de 3.000 espécies distribuídas nas Américas Central e

do Sul, na África, Madagascar e sul da Índia (Kullander 1998; Kocher 2004).

Muitas de suas espécies são importantes recursos para pesca e aquicultura e

bem como são amplamente explorados no comércio de peixes ornamentais.

A família Cichlidae é composta por quatro subfamílias: Etroplinae,

Ptychochrominae, Pseudocrenilabrinae e Cichlinae. Esta última subfamília é

restrita à região Neotropical e é composta por sete tribos: Cichlini, Retroculini,

Astronotini, Chaetobranchini, Geophagini, Cichlasomatini, e Heroini (Sparks e

Smith 2004; Smith et al. 2008).

Ciclídeos têm sido descritos como um excelente grupo para estudos

evolutivos devido a diversidade de nichos ecológicos ocupados, estratégias de

vida, adaptações morfológicas e comportamentais (Lowe-McConnell 1991;

López-Fernández et al. 2005). Muitos estudos genéticos estão sendo

realizados para investigar a história evolutiva dos ciclídeos e muitas espécies já

tiveram seu genoma sequenciado (Cichlid Genome Consortium Program em

http://cichlid.umd.edu/cichlidlabs/kocherlab/bouillabase.html). Estas

informações genômicas abrem oportunidades para integração entre sequências

nucleotídicas e dados cromossômicos (Cabral-de-Mello et al. 2012). A maioria

das informações disponíveis acerca da organização genômica em Cichlidae é

restrita a poucas espécies do Velho Mundo, entretanto diferentes classes de

DNAs repetitivos foram utilizadas para a compreensão da estrutura cariotípica

destes peixes (Oliveira et al. 1999; Martins et al. 2004; Ferreira e Martins 2008;

Poletto et al. 2010a). Por outro lado, muitos ciclídeos neotropicais apresentam

alguma informação citogenética, embora a maioria dos estudos enfoque

apenas descrições clássicas da macroestrutura cariotípica (Thompson 1979;

Feldberg e Bertollo 1985), faltando informações sobre a localização física

cromossômica de sequências de interesse. A maioria dos estudos de

citogenética molecular em ciclídeos Neotropicais tem mapeado genes de DNAr

45S (Gross et al. 2009b; Gross et al. 2010; Poletto et al. 2010b) e elementos

transponíveis para poucas espécies (Mazzuchelli e Martins 2009; Teixeira et al.

2009). Tendo em vista que muitas espécies de ciclídeos terão seu genoma

40

totalmente sequenciado nos próximos anos, o mapeamento físico

cromossômico de sequências de DNA pode contribuir para a identificação de

rearranjos cromossômicos, embasar estudos evolutivos e permitir melhor

interpretações do panorama genômico das espécies.

Assim, o objetivo do presente estudo foi analisar a organização

genômica dos DNAr 5S e 18S e sequências teloméricas em cromossomos

mitóticos de 13 espécies de ciclídeos Amazônicos, pertencentes a cinco tribos

da subfamília Cichlinae. Os resultados obtidos permitiram rediscutir os padrões

de evolução cariotípica propostos para o grupo, com uma abordagem

citogenética clássica e molecular, enfatizando o papel das sequências

repetitivas de DNA.

3.1.2 Material e Métodos

Foram analisados exemplares pertencentes a cinco tribos da subfamília

Cichlinae coletados na Amazônia Central (Tabela 1). Todos os espécimes

foram anestesiados por imersão em água gelada até a morte. Exemplares

testemunhos foram depositados na Coleção de Peixes do Instituto Nacional de

Pesquisas da Amazônia (INPA), Manaus, Amazonas, Brasil (números dos

exemplares INPA 26451, INPA 26452, INPA 26453, INPA 26459, INPA 26462

e INPA 26466).

3.1.2.1 Preparação cromossômica e localização da heterocromatina constitutiva e região organizadora de nucléolo (RON)

Cromossomos mitóticos foram obtidos a partir de células renais

utilizando o protocolo de “air drying” (Bertollo et al. 1978). A heterocromatina foi

analisada pela técnica de banda C (Sumner 1972), e RONs foram detectadas

pela impregnação pelo nitrato de prata (Howell e Black 1980).

41

Tabela 1 Espécies de Cichlinae analisadas e seus locais de coleta.

Tribos Espécies Locais de amostragem Número de exemplares analisados

Cichlini Cichla monoculus lago Catalão (confluência dos rios Negro/Solimões) 6 (3 machos e 3 fêmeas)

Astronotini Astronotus ocellatus lago Catalão (confluência dos rios Negro/Solimões) 8 (3 machos e 5 fêmeas)

Geophagini Geophagus proximus lago Catalão (confluência dos rios Negro/Solimões) 5 (2 machos e 3 fêmeas)

Acaronia nassa rio Negro, Barcelos AM 6 (4 machos e 2 fêmeas) Cichlasomatini

Bujurquina peregrinabunda rio Branco 1 macho

Hoplarchus psittacus rio Negro, Arquipélago de Anavilhanas 6 (3 machos e 3 fêmeas)

Hypselecara coryphaenoides rio Negro, Barcelos AM 4 (2 machos e 2 fêmeas)

Hypselecara temporalis lago Catalão (confluência dos rios Negro/Solimões) 5 (3 machos e 2 fêmeas)

Caquetaia spectabilis rio Branco 3 (2 machos e 1 fêmea)

Uaru amphiacanthoides rio Negro, Arquipélago de Anavilhanas 6 (3 machos e 3 fêmeas)

Pterophyllum leopoldi rio Solimões, Careiro AM 4 (3 machos e 1 fêmea)

Pterophyllum scalare lago Catalão (confluência dos rios Negro/Solimões) e rio Solimões, Manacapuru AM\

6 (3 machos e 3 fêmeas)

Heroini

Symphysodon discus rio Negro, Barcelos AM 4 (2 machos e 2 fêmeas)

42

3.1.2.2 Extração de DNA e reação em cadeia da polimerase (PCR)

O DNA total foi extraído do tecido muscular utilizando o protocolo de

fenol-clorofórmio descrito por Sambrook et al. (1989) e quantificado em gel de

agarose por comparação com marcador lambda padrão. As amplificações dos

genes de RNAr 18S e 5S foram realizadas por reação em cadeia da polimerase

(PCR) utilizando os oligonucleotídeos iniciadores (primers) 18Sf (5’-CCG CTT

TGG TGA CTC TTG AT-3’) e 18Sr (5’-CCG AGGACC TCA CTA AAC CA-3’)

(Gross et al. 2010), 5Sa (5’-TAC GCC CGA TCT CGT CCG ATC-3’) e 5Sb (5’-

CAGGCT GGT ATG GCC GTA AGC-3’) (Gross et al. 2010; Martins e Galetti

1999, respectivamente). As reações de PCR foram realizadas em um volume

final de 25 µL contendo DNA genômico (200 ng), tampão 10x com 1,5 mM de

MgCl2, Taq DNA polimerase (5 U/µL), dNTPs (1 mM), par de primers (5 mM), e

água Milli-Q. O perfil de reação para o DNAr 18S foi 1 min 95 °C; 35 ciclos de 1

min a 94 °C, 1 min a 56 °C e 1 min 30 s a 72 °C; seguidos por 5 min a 72 °C.

As condições para amplificação do DNAr 5S foram 1 min 95 °C; seguidos por

30 ciclos de 1 min a 94 °C, 1 min a 59 °C, e 1 min 30 s a 72 °C; e uma

extensão final de 5 min a 72 °C.

PCR da sequência telomérica (TTAGGG)n foi realizada em um volume

final de 25 µL contendo tampão 10x com 1,5 mM de MgCl2, dNTPs (1 mM), 0,2

µL primer (TTAGGG)5, 0.2 µL primer (CCCTAA)5 (Ijdo et al. 1991), e 2 U of Taq

DNA polymerase. A primeira parte da amplificação foi realizada com baixa

estringência (4 min a 94 °C; seguidos por 12 ciclos de 1 min a 94 °C, 45 s a 52

°C e 1 min 30 s a 72 °C), seguidos por 35 ciclos de alta estringência (1 min a

94 °C, 1 min 30 s a 60 °C e 1 min 30 s a 72 °C). Hibridizações de sequências

teloméricas em posições cromossômicas intersticiais foram consideradas ITS

(sítios teloméricos intersticiais) quando sinais estavam presentes em todas as

metáfases analisadas.

3.1.2.3 Hibridização fluorescente in situ (FISH)

Os produtos de PCR do DNAr 18S e das sequências teloméricas, foram

marcados com digoxigenina-11-dUTP (Dig Nick Translation mix; Roche)

enquanto o DNAr 5S foi marcado com biotina-14-dATP (Biotin Nick Translation

mix; Roche). Ambos por reações de nick translation de acordo com instruções

43

dos fabricantes. Os anticorpos Avidina-FITC (Sigma-Aldrich), anti-avidina

biotinilada (Sigma-Aldrich), e anti-digoxigenina rodamina (Roche) foram usados

para detectar e amplificar o sinal da sonda. Hibridizações homólogas e

heterólogas foram realizadas de acordo com o protocolo descrito por Pinkel et

al. (1986) em elevadas condições de estringência 77% (2,5 ng/µL de DNAr

18S, DNA 5S ou sondas teloméricas, 50% formamida, 10% sulfato de dextrano,

e 2x SSC a 37 °C por 18 h). Os cromossomos foram contra corados com DAPI

(2 mg/ml) em meio de montagem VectaShield (Vector).

3.1.2.4 Microscopia/Processamento das imagens

Os cromossomos foram analisados em microscópio de epifluorescência

Olympus BX51 e as imagens foram capturadas com câmera digital acoplada

(Olympus DP71) utilizando o software Image-Pro MC 6.3. As metáfases foram

processadas no programa Adobe Photoshop CS3 e os cromossomos foram

medidos no programa Image J. Os cromossomos foram classificados de acordo

com nomenclatura proposta por Levan et al. (1964).

3.1.3 Resultados

Nenhum cromossomo sexual diferenciado foi observado em qualquer um

dos exemplares analisados, embora variações interespecíficas em número

diploide, padrão de heterocromatina constitutiva, número e localização de sítios

ribossomais, bem com na localização das sequências foram observadas.

3.1.3.1 Número diploide, heterocromatina e RONs

O menor número diploide observado foi de 42 cromossomos (16

meta/submetacêntricos [m-sm] e 26 subtelo/acrocêntricos [st-a]) em

Hypselecara coryphaenoides. A única espécie que apresentou número diploide

de 46 cromossomos (16 [m-sm] + 30 [st-a]) foi Uaru amphiacanthoides.

Astronotus ocellatus, Cichla monoculus, Geophagus proximus, Hoplarchus

psittacus, Hypselecara temporalis, Pterophyllum leopoldi, e Pterophyllum

scalare apresentaram número diploide com 48 cromossomos, embora existam

44

diferenças na fórmula cariotípica. Cichla monoculus possui apenas

cromossomos st-a, enquanto A. ocellatus, H. psittacus, H. temporalis, P.

leopoldi, e P. scalare possuem cariótipo com 16 cromossomos m-sm + 32 st-a.

A fórmula cariotípica de Geophagus proximus é de 12 cromossomos m-sm + 36

st-a. Número diploide de 50 cromossomos foi observado em Acaronia nassa (4

m-sm + 46 st-a), Bujurquina peregrinabunda (20 m-sm + 30 st-a), e Caquetaia

spectabilis (12 m-sm+ 38 st-a). Symphysodon discus foi a espécie que

apresentou o maior número diploide de 2n=60 (50 m-sm+ 10 st-a) (Figuras 1 e

2).

Todas as espécies analisadas apresentaram heterocromatina localizada

predominantemente na região centromérica de todos os cromossomos.

Algumas bandas-C em porções intersticiais foram observadas em C.

monoculus e H. temporalis, bem como em regiões terminais em A. nassa, H.

temporalis e C. spectabilis, e em regiões pericentroméricas em P. leopoldi, A.

ocellatus, H. coryphaenoides, C. spectabilis e U. amphiacanthoides. Blocos

conspícuos de heterocromatina foram mais evidentes em cromossomos de

algumas espécies tais como em A. ocellatus, P. scalare, U. amphiacanthoides,

S. discus e B. peregrinabunda (Figuras 1 e 2).

Com exceção de Uaru amphiacanthoides, que possui múltiplas

marcações de RONs (região terminal do braço curto dos pares 7, 8, 16 e

intersticial do braço longo do par 14), as demais espécies possuem apenas um

par cromossômico marcado pela AgNO3. O primeiro par cromossômico foi o

portador da RON em B. peregrinabunda, P. scalare, A. ocellatus, G. proximus,

e H. psittacus, enquanto que em C. monoculus e H. temporalis foi o segundo

par cromossômico que carreou a RON. Ainda, em H. coryphaenoides, P.

leopoldi, C. spectabilis e S. discus as RONs foram localizadas nos pares 5, 9,

11 e 17, respectivamente. A. ocellatus, G. proximus, H. psittacus e A. nassa

apresentaram duplicação da RON em um homólogo do par. (Figura 1 e 2).

45

Figura 1 Cariótipos das espécies pertencentes às tribos de Cichlinae (Cichlini

Astronotini, Geophagini, Cichlasomatini e Heroini) em banda-C. Os

cromossomos portadores da RON são mostrados na caixa.

46

Figura 2 Cariótipos das espécies pertencentes às tribos de Cichlinae (Heroini)

em banda-C. Os cromossomos portadores da RON são mostrados na caixa.

3.1.3.2 Mapeamento dos DNAr 18S e 5S e sequências teloméricas

Os resultados das hibridizações fluorescentes in situ (FISH) utilizando a

sonda de DNAr 18S foram coincidentes com as RONs, entretanto em Uaru

amphiacanthoides, apenas dois pares de cromossomos (7 e 8) exibiram sinais

positivos de hibridização com esta sonda em contraste com os quatro pares

impregnados pelo nitrato de prata. P. leopoldi apresentou resultados

47

contrastantes com as demais espécies devido ao grande número de sítios de

DNAr 18S. Além do braço curto do par 9, o qual foi o portador da RON, outros

vinte pares de cromossomos apresentaram sinais de hibridização, tanto em

regiões teloméricas, quanto em regiões intersticiais (Figura 3 e 4).

Quanto aos sítios de DNAr 5S, apenas Caquetaia spectabilis possui

múltiplos sítios e eles foram localizados em regiões intersticiais (homólogos do

par 8) e terminais (homólogos do par 9). Ainda, sítios de DNAr 5S foram

observados nas regiões terminais dos cromossomos de Bujurquina

peregrinabunda (par 12), Hoplarchus psittacus (par 11), and Symphysodon

discus (par 18). As demais espécies exibiram sítios em porções terminais e

pericentroméricas, embora com variações nos pares que portaram estes sítios

(Figura 3 e 4).

Os telômeros de todos os cromossomos das 13 espécies de Cichlinae

apresentaram sinais de hibridização com a sonda telomérica, sendo que sítios

teloméricos intersticiais (ITS) foram observados em espécies com números

diploides de 42, 46, 48 e 50 cromossomos. Variações no número de ITS foram

observadas entre as espécies analisadas. Os ITS foram visualizados como

sinais pontuais em alguns cromossomos, ou em blocos em outros, podendo

marcar totalmente os braços curtos de alguns cromossomos porém, este

padrão de hibridização foi visualizado em todas as metáfases analisadas.

Alguns destes ITS foram localizados adjacentes aos sítios de DNAr 18S, como

em Astronotus ocellatus, Acaronia nassa, Bujurquina peregrinabunda e

Hypselecara temporalis. O menor número de ITS foi observado em

Hypselecara coryphaenoides (pares 4 e 19) e Uaru amphiacanthoides (pares

14 e 15), seguidos por Pterophyllum scalare (pares 13, 15 e 16), Astronotus

ocellatus (pares 1, 2, 3, 7 e 17), Bujurquina peregrinabunda (pares 1, 3, 4, 6, 8

e 9), Hypselecara temporalis (pares 1, 2, 3, 7, 8 e 12), e Acaronia nassa (pares

2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 22, 24 e 25). Todos os ITS foram coincidentes com blocos

heterocromáticos. Cichla monoculus, Geophagus proximus, Hoplarchus

psittacus, Symphysodon discus, Pterophyllum leopoldi, Caquetaia spectabilis

não mostraram evidência de ITS (Figuras 5 e 6).

48

Figura 3 Cariótipos das espécies pertencentes às tribos da subfamília


cromossomos foram contra corados com DAPI.

49

Figura 4 Cariótipos das espécies pertencentes às tribos da subfamília



50

Figura 5 Cariótipos das espécie pertencentes às tribos de Cichlinae,



51

Figura 6 Cariótipos das espécie pertencentes às tribos de Cichlinae,



52

3.1.4 Discussão Com base em dados sobre macroestrutura cariotípica, durante muito

tempo acreditou-se que os ciclídeos neotropicais eram um grupo conservado

do ponto de vista citogenético (Kornfield 1984; Feldberg e Bertollo 1985).

Contudo, com o avanço do conhecimento acerca do genoma de diferentes

espécies de Cichlinae, ficou evidente que o mesmo é composto por diferentes

classes de DNAs repetitivos e que estes tiveram um papel importante na

evolução cariotípica destes peixes, podendo inclusive ter favorecido rearranjos

cromossômicos (Gross et al. 2009b; Teixeira et al. 2009; Mazzuchelli e Martins

2009; Gross et al. 2010; Valente et al. 2011).

A presença de rearranjos cromossômicos robertsonianos e não

robertsonianos em Cichlinae proporcionou que três caminhos evolutivos

fossem sugeridos para este grupo: (i) manutenção do 2n=48 cromossomos

considerado basal, (ii) diminuição do 2n ou (iii) aumento do número diploide

(Feldberg et al. 2003). Porém, estes caminhos evolutivos parecem ser

adotados independentemente dentro das tribos, com exceção das tribos basais

(Cichlini, Astronotini e Chaetobanchini) onde todas as espécies analisadas

apresentam 2n=48 cromossomos. Nas demais tribos, os números diploides

variam de 38 a 60, não havendo uma tendência em aumento, redução ou

manutenção do número diploide, tais como visto em Cichlasomatini, variando

de 44 a 50 cromossomos e em Heroini, de 42 a 60 cromossomos (presente

estudo; para revisão de número diploide ver Feldberg et al. 2003; Poletto et al.

2010b). Além disso, se considerado o padrão de distribuição da

heterocromatina constitutiva, o número e localização de sítios ribossomais e a

presença de sequências teloméricas intersticiais, novamente não é possível

verificar tendências dentro das tribos.

Em uma revisão citogenética efetuada para os ciclídeos neotropicais foi

proposto que as espécies que possuem um menor número diploide têm mais

cromossomos meta-submetacêntricos, enquanto que as espécies com número

diploide igual a 48 cromossomos possuem poucos cromossomos de dois

braços. Rearranjos do tipo inversão cromossômica poderiam promover a

existência de diferentes fórmulas cariotípicas (Feldberg et al. 2003). Porém,

nossos dados não corroboram totalmente estas predições, pois tanto nas

espécies com 2n=48 (A. ocellatus, H. psittacus, H. temporalis, P. leopoldi, P.

53

scalare), quanto nas que possuem 2n=42 (H. coryphaenoides) e 46 (U.

amphiacanthoides), são visualizados oito pares de cromossomos

meta/submetacêntricos, com exceção de Geophagus proximus, que apresenta

2n=48 cromossomos, sendo seis pares meta-submetacêntricos. Contudo, a

descrição de diferentes fórmulas cariotípicas para uma mesma espécie é

comumente encontrada em ciclídeos, como Pterophyllum scalare, que tem

descritas as fórmulas: como possuindo 4 m-sm + 44 st-a (Thompson 1979), 12

m-sm + 36 st-a (Nascimento et al. 2006), 6 m-sm + 42 st-a (Poletto et al.

2010b) ou 16 m-sm +32 st-a (presente estudo). A maioria desta variação não é

devido a rearranjos cromossômicos que ocasionaram diferença intraespecífica,

mas provavelmente à qualidade da preparação cromossômica analisada, ao

padrão de compactação do DNA e erros na medida dos braços cromossômicos

que geram divergência na interpretação do cariótipo.

Contudo, inversões cromossômicas podem ter ocorrido em alguns

ciclídeos que mantiveram o número diploide basal (tais como A. ocellatus e H.

temporalis) uma vez que sítios teloméricos intersticiais (ITS) foram encontrados

em pares cromossômicos destas espécies. ITS também foram encontrados em

H. coryphaenoides (2n=42 cromossomos), sugerindo a presença de rearranjos

do tipo fusão neste grupo. Entretanto em Uaru amphiacanthoides que

apresenta 2n= 46 cromossomos, nenhum ITS foi observado. A ausência de ITS

em cromossomos que foram originados por eventos de fusões, pode indicar

que estes ITS foram perdidos devido a processos de erosão molecular de

sequências de DNA repetitivo, bem como pequenos sítios teloméricos podem

não ser detectados pela FISH (Mandrioli et al. 1999). Ainda, essas fusões são

devido a mecanismos de encurtamento do telômero, à inativação do telômero,

a regiões descompactadas de DNA ou a presença de sequências similares às

teloméricas no DNA repetitivo centromérico tais como transposons (Shampay

et al. 1995; Slijepcevic 1998).

Braços curtos inteiros foram marcados em FISH utilizando sondas

teloméricas, para diversas espécies analisadas. Provavelmente, outros DNAs

repetitivos podem estar associados às sequências teloméricas nestas

espécies. Este tipo de associação já foi relatado anteriormente em Drosophila,

onde foi caracterizada uma família de DNA satélite associada ao telômero com

repetições idênticas às encontradas na região centromérica (Bachmann et al.

54

1990). Este mesmo padrão foi identificado em algumas plantas (Navajas-Pérez

et al. 2009), refletindo a complexidade dos padrões evolutivos relacionados

com sequências de DNA repetitivo. Considerando esta associação entre

sequências teloméricas e DNA satélite, é possível que em algum momento

ambas foram carreadas para outras porções do genoma por meio de trocas

desiguais durante processos de crossing over, transposições ou duplicações

dessas sequências e que atualmente estão localizadas em regiões

heterocromáticas. Estas regiões heterocromáticas podem estar protegendo

DNAs repetitivos de pressões seletivas que atuam em regiões eucromáticas,

possibilitando uma evolução diferencial destas porções genômicas (Grewal e

Jia 2007).

A heterocromatina na maioria dos ciclídeos analisados apresenta-se

localizada na região centromérica ou pericentromérica da maioria dos

cromossomos, sendo o padrão de distribuição diferencial da mesma muitas

vezes utilizado como um marcador espécie-específico ou populacional

(Feldberg et al. 2003; Vicari et al. 2006; Benzaquem et al. 2008; Perazzo et al.

2011). Estudos recentes mostram que o centrômero é uma porção

cromossômica dinâmica que têm capacidade de reposicionar-se devido a

respostas epigenômicas, podendo assim modificar a fórmula cariotípica sem

reposicionamento de genes (Rocchi et al. 2012). Esta pode ser a explicação

para a existência de heteromorfismo cromossômico em alguns pares de

homólogos, comum em ciclídeos neotropicais, o que gera a descrição de

citótipos diferenciados para algumas espécies, como relatado para

Symphysodon (Mesquita et al. 2008), bem como pode ocasionar divergência na

fórmula cariotípica de indivíduos de uma mesma espécie, proveniente de

diferentes localidades. Atualmente, a heterocromatina é reconhecida por

desempenhar atividades importantes, tais como auxiliar na segregação

cromossômica, organização nuclear e regulação da expressão gênica

associada a respostas às mudanças no ambiente, também podendo afetar o

processo de recombinação gênica (Grewal e Jia 2007; Varriale et al. 2008;

Bühler 2009). Assim, a associação entre regiões heterocromáticas e sítios

ribossomais, como encontrada nos ciclídeos neotropicais bem como em

diversos outros grupos de peixes, pode estar relacionada com a variabilidade

na localização e número das RONs ativas.

55

Vários trabalhos que inferiram evolução cariotípica em ciclídeos levaram

em conta apenas dados da citogenética clássica, o que pode ter levado a

incongruências em alguns resultados, mascarando a real organização

genômica. Isso pode ser evidenciado em Satanoperca jurupari, onde quatro

sítios de NORs foram descritos por meio da impregnação com nitrato de prata

(Mendonça et al. 1999), porém apenas um par de homólogos apresentou sítios

de DNAr 18S (Poletto et al. 2010b). Ainda, estudos anteriores sugerem a

presença de região organizadora de nucléolo múltipla em Caquetaia spectabilis

(Salgado et al. 1995), porém dentre as espécies analisadas no presente

trabalho, tanto com impregnação por nitrato de prata quanto por localização

dos sítios ribossomais da família 45S, apenas Uaru amphiacanthoides

apresentou sítios múltiplos de RONs. Contudo, semelhante ao que foi

visualizado em Satanoperca jurupari, em U. amphiacanthoides oito sítios foram

evidenciados pela Ag-RON e apenas quatro sítios de DNAr 18S foram

detectados. Estes resultados divergentes entre os sítios Ag-RON positivos e os

de DNAr 18S, podem estar relacionados à afinidade que algumas regiões

heterocromáticas têm pelo nitrato de prata, mascarando assim o real número

de RONs (Sumner 2003). Em peixes, frequentemente ocorre associação entre

RONs e regiões heterocromáticas. Em S. discus, estudos anteriores indicaram

a presença de variações intra-específicas quanto à localização dos genes de

RNAr 18S. Estes puderam ser identificados entre dois a cinco sítios, sempre

envolvidos com regiões terminais dos braços curtos dos pares cromossômicos

6, 17 e 23 (Gross et al. 2010). Estas observações foram corroboradas no

presente estudo.

Vinte e um sítios de DNAr 18S foram observados em Pterophyllum

leopoldi. Este grande número de sítios de DNAr é incomum em peixes, embora

já tenha sido descrito em outros vertebrados (Cazaux et al. 2011). Artefatos de

técnica que implicariam em erros durante o processo podem ser descartados,

uma vez que as hibridizações foram feitas em condições de alta extringência e

com sondas homólogas. Estes múltiplos sítios ribossomais provavelmente são

derivados de segmentos de DNAr 18S que foram duplicados e dispersos no

genoma de Pterophyllum leopoldi, como evidenciado para o DNAr 5S em

outras espécies de peixes (Martins et al. 2006; Silva et al. 2011). Contudo,

podemos inferir que o sítio de DNAr 18S no par cromossômico nove apresenta

56

atividade transcricional, pois foram os únicos que impregnaram com o nitrato

de prata. Assim, os sítios adicionais de DNAr 18S podem estar relacionados a

processos naturais de nascimento e morte de sequências repetitivas no

genoma (Rooney e Ward 2005).

Diferenças na localização do DNAr 5S foram observadas entre as tribos

de ciclídeos analisadas. Na maioria das espécies, os sítios de DNAr 5S foram

localizados em posição intersticial de um par de cromossomos, entretanto C.

spectabilis apresentou quatro sítios de DNAr 5S, dois na região intersticial e

dois na porção telomérica. Os DNAr 18S e 5S foram localizados em pares

cromossômicos distintos, e isto é um padrão comum para peixes (Martins e

Wasko 2004). Martins (2007) atribui este padrão a diferentes processos

transcricionais nos cístrons ribossomais, onde os genes de DNAr 45S (o qual

engloba entre outros o DNAr 18S) são transcritos pela RNA polimerase I,

enquanto o DNAr 5S é transcrito pela RNA polimerase III.

Dessa forma, nossos dados indicam que os ciclídeos neotropicais

possuem grande variação cariotípica, como evidenciado pela distinta

organização do cariótipo. Provavelmente, uma grande parte desta variação é

devido as diferentes classes de sequências repetitivas, que apresentam

diferentes quantidades e distribuição nos cromossomos. Estudos estão sendo

realizados para elucidar a composição da heterocromatina, para refinar ainda

mais a análise da organização genômica dos ciclídeos neotropicais, e mostrar

o real panorama evolutivo deste grupo.

57

3.2 Artigo 2 - Dinâmica evolutiva de elementos retrotransponíveis Rex1, Rex3 e Rex6 no genoma de ciclídeos Neotropicais

58

3.2.1 Introdução

Elementos transponíveis (TEs) têm potencial para produzir grandes

alterações no genoma de seus hospedeiros (Kidwell e Lisch 2000; 2001),

agindo como uma importante ferramenta evolutiva, gerando uma gama de

novas regiões regulatórias e sequências codificantes (Volff 2006; Bourque

2008). TEs tem o potencial de gerar biodiversidade, transições evolutivas

através de mutações, e domesticação molecular (Blass et al. 2012).

Eventualmente, TEs podem ser transferidos entre espécies isoladas

reprodutivamente, através de transferência horizontal, independente da

clássica herança de pais para prole, e também desempenha papel importante

na diversidade genômica entre espécies (Schaack et al. 2010).

Com base na estrutura e em seu mecanismo de transposição, os

elementos móveis são divididos em duas classes: classe I engloba os

elementos transponíveis que têm um RNA como intermediário

(retrotransposons) copiado em um cDNA por uma transcriptase reversa e

integrado em uma nova região genômica; classe II inclui todos os que são

transpostos diretamente de DNA para DNA, sem outra molécula intermediária

(Van Sluys et al. 2001; Tafalla et al. 2006; Martins 2007; Levin e Moran 2011).

Os retrotransposons podem ser agrupados de acordo com a presença ou

ausência de longas repetições terminais (LTR long terminal repeats). As LTRs

são necessárias para a transcrição e integração do cDNA depois da transcrição

reversa, sendo que são encontrados, na sequência dos LTRs domínios para

proteinase, integrase, transcriptase reversa e RNAse. Já, os retrotransposons

não-LTRs utilizam promotores internos para a sua transposição e codificam

uma transcriptase reversa e uma RNAse, sendo também conhecidos como

LINES (long interspersed elements) ou retrotransposons TP (target-primed).

Além disso, dentro da categoria dos não-LTRs, existem também os SINES

(short interspersed nucleotide elements), que não codificam a maquinaria

enzimática necessária para a transposição, mas obtém esta provavelmente por

meio dos elementos LINES (Böhne et al. 2008).

Diversos elementos transponíveis são encontrados nos genomas tanto

em níveis quantitativos como qualitativos e o mesmo tipo de TE pode ter

diferente sucesso em invadir diferentes espécies (Böhne et al. 2008). Acredita-

59

se que TEs possam estar associados à biodiversidade e especiação de peixes

teleósteos. A diversidade presente em teleósteos é também refletida na

diversidade do tamanho e estrutura de seu genoma, o qual foi

consideravelmente influenciado por retroelementos (Volff et al. 2003; Volff

2005). Todos os tipos de retroelementos já descritos foram encontrados nos

genomas de peixes (Okada et al. 1997, Poulter et al. 1999; Volff et al. 1999;

Aparicio et al. 2002) e entre os non-LTR retrotransposons destacam-se Rex1,

Rex3 e Rex6, os quais estiveram ativos durante a evolução deste grupo de

vertebrados (Volff et al. 1999; 2000; 2001a).

Os peixes da família Cichlidae (Perciformes) apresentam grande

importância na pesca de subsistência e esportiva, na aquicultura e aquariofilia

e se destacam como excelente modelo evolutivo devido a sua radiação

adaptativa, diversidade ecológica e comportamental (Kocher 2004; López-

Fernández et al. 2005). Dentre os ciclídeos, apenas a subfamília Cichlinae é

encontrada na região Neotropical. Análises, combinando caracteres

morfológicos e dados de sequências nucleotídicas, agrupam a subfamília

Cichlinae em um clado monofilético dividido em sete tribos: Astronotini,

Chaetobranchini, Cichlasomatini, Cichlini, Geophagini, Heroini, e Retroculini.

Chaetobranchini + Geophagini é grupo irmão de Heroini + Cichlasomatini.

Astronotini é uma tribo monogenérica e grupo irmão destas quatro tribos.

Finalmente, o clado que engloba Cichlini + Retroculini é o grupo basal, irmão

das demais tribos (Smith et al. 2008).

Diferentes classes de TEs foram mapeadas no genoma dos ciclídeos

neotropicais, tais como transposon Tc1 que foi mapeado em Cichla kelberi

evidenciando blocos conspícuos em regiões centroméricas e marcações

dispersas nos cromossomos (Teixeira et al. 2009). Três novas classes de

retroelementos foram descritas: RCk que apresenta marcações dispersas nos

cromossomos de C. kelberi; AoRex3 e AoLINE que são agrupados na

heterocromatina centromérica de todos os cromossomos de Astronotus

ocellatus (Mazzuchelli e Martins 2009). O mapeamento de diferentes classes

do retroelemento Rex também tem sido realizado neste grupo visando

compreender a organização genômica e os resultados têm mostrado um

padrão de distribuição compartimentalizado na heterocromatina

pericentromérica entretanto sinais dispersos e agrupados em regiões

60

eucromáticas também foram observados (Gross et al. 2009b; Mazzuchelli e

Martins 2009; Teixeira et al. 2009; Valente et al. 2011). Contudo, as

informações restringem-se ao mapeamento físico cromossômico, não sendo

conhecida a diversidade genética destes retroelementos. Portanto, análises

comparativas englobando espécies consideradas basais e derivadas, são de

particular interesse para o entendimento da dinâmica dos retroelementos na

evolução genômica dos ciclídeos do novo mundo. Assim, a organização

genômica dos non-LTR retrotransposons Rex1, Rex3 e Rex6 em cinco

espécies de ciclídeos amazônicos foi avaliada por meio do mapeamento físico

cromossômico e sequenciamento destes elementos móveis, o que permitiu o

entendimento de como estes retroelementos se comportam no genoma deste

grupo de peixes.


Foram analisados exemplares pertencentes a quatro tribos da subfamília

Cichlinae coletados na Amazônia Central. As espécies analisadas foram:

Cichla monoculus (3 machos e 3 fêmeas) tribo Cichlini, Astronotus ocellatus (3

machos e 5 fêmeas) Astronotini, Geophagus proximus (2 machos e 3 fêmeas)

Geophagini, Pterophyllum scalare (3 machos e 3 fêmeas) e Symphysodon

discus (2 machos e 2 fêmeas) Heroini. Os exemplares foram amostrados com

autorização de coleta ICMBio SISBIO 10609-1/2007. Todos os espécimes

foram anestesiados por imersão em água gelada até a morte. Os cromossomos

mitóticos foram obtidos de células renais utilizando o protocolo de “air drying”

(Bertollo et al. 1978).

3.2.2.1 Extração de DNA e reação em cadeia da polimerase (PCR)

O DNA total foi extraído do tecido muscular utilizando o protocolo de

fenol-clorofórmio descrito por Sambrook et al. (1989) e quantificado em

espectrofotômetro NanoVue Plus (GE Healthcare). A reação em cadeia da

polimerase (PCR) para amplificação dos retroelementos, foi realizada utilizando

os primers RTX1-F1 (5’-TTC TCC AGT GCC TTC AAC ACC-3’) e RTX1-R1 (5’-

TCC CTC AGC AGA AAG AGT CTG CTC-3’) para amplificação do segmento

61

que corresponde ao gene da transcriptase reversa do Rex1 (Volff et al. 2000);

os primers RTX3-F3 (5’-CGG TGA YAA AGG GCA GCC CTG-3’) e RTX3-R3

(5’-TGG CAG ACN GGG GTG GTG GT-3’) para amplificar a região que codifica

o gene da transcriptase reversa do retrotransposon Rex3 (Volff et al. 1999); e

os primers Rex6-Medf1 (5’-TAA AGC ATA CAT GGA GCG CCA C-3’) e Rex6-

Medr2 (5’-GGT CCT CTA CCA GAG GCC TGG G-3’) para amplificar a parte C-

terminal da endonuclease do retrotransposon Rex6 (Volff et al. 2001a).

As reações de PCR foram realizadas em um volume final de 25 μL

contendo DNA genômico (200 ng), tampão 10x com 1,5 mM de MgCl2, Taq

DNA polimerase (5 U/μL), dNTPs (1 mM), par de primers (5 mM), e água Milli-

Q. Os perfis das reações para o Rex1, Rex3, e Rex6 incluem os seguintes

passos: 95 °C por 5 min; 35 ciclos de 95 °C por 1 min, 55 °C por 40 s, e 72 °C

por 2 min; seguidos por uma extensão final de 72 °C por 5 min. Os produtos de

PCR foram checados em gel de agarose 1% quantificados em

espectrofotômetro NanoVue Plus (GE Healthcare) e utilizados para clonagem e

como sondas para a FISH.

3.2.2.2 Clonagem, sequenciamento e análise das sequências

Os produtos de amplificação dos retrotransposons Rex1, Rex3 e Rex6

foram inseridos em plasmídeo pGEM-T easy (Promega). Os produtos de

ligação foram inseridos em células competentes da linhagem DH5α de

Escherichia coli. Clones que possuíam o inserto foram sequenciados em

sequenciador automático de DNA ABI 3130 XL (Applied Biosystem). Cada

clone foi identificado por buscas na base de dados do NCBI

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) com a ferramenta BLASTn e na base do Repbase

(Jurka et al. 2005) no Genetic Information Research Institute (Giri)

(http://www.girinst.org/repbase) utilizando o software CENSOR (Kohany et al.

2006). As sequências obtidas foram depositadas no GenBank (NCBI) sob os

seguintes números de acessos: Rex1, GenBank: JX576302-JX576350; Rex3,

GenBank: JX576351-JX576400; e Rex6, GenBank: JX576401-JX576459. As

sequências nucleotídicas foram alinhadas utilizando o programa ClustalW

(Thompson et al. 1994) incluso no programa BioEdit 7 (Hall 1999). As árvores

filogenéticas dos retroelementos foram obtidas por busca heurística de máxima

62

verossimilhança. A robustez da topologia encontrada foi testada com 1000

replicatas de bootstrap. Estas análises foram realizadas utilizando o programa

MEGA5 (Tamura et al. 2011). Para análise de máxima verossimilhança foram

inseridas sequências de retroelementos Rex1, 3 e 6 de outros ciclídeos,

disponíveis no GenBank. As sequências dos aminoácidos foram deduzidas a

partir das sequências nucleotídicas utilizando o programa BioEdit 7 (Hall 1999).


Os produtos de PCR dos retroelementos (Rex1, 3 e 6) foram marcados

com digoxigenina-11-dUTP (Dig Nick Translation mix; Roche) por reações de

nick translation de acordo com instruções do fabricante e o anticorpo anti-

digoxigenina rodamina (Roche) foi usado para detectar o sinal da sonda.

Hibridizações homólogas e heterólogas foram realizadas de acordo com o

protocolo descrito por Pinkel et al. (1986) em condições de estringência de 77%

(2,5 ng/µL de DNA, 50% formamida, 10% sulfato de dextrano, e 2x SSC a 37

°C por 18 h). Os cromossomos foram contra corados com DAPI (2 mg/ml) em

meio de montagem VectaShield (Vector).




(Olympus DP71) utilizando o software Image-Pro MC 6.3. As metáfases foram

processadas no programa Adobe Photoshop CS3 e os cromossomos foram

medidos no programa Image J. Os cromossomos foram classificados de acordo

com nomenclatura proposta por Levan et al. (1964).

3.2.3 Resultados

3.2.3.1 Diversidade molecular dos TEs analisados

Um total de 49 clones de Rex1 foram sequenciados sendo 11 de C.

monoculus, 8 de A. ocellatus, 10 de G. proximus, 12 de P. scalare e 8 de S.

discus. Sequências de 573 a 575 pb (pares de bases) foram obtidas.

63

Substituições nucleotídicas foram mais frequentes em espécies derivadas (P.

scalare e S. discus) e em menor número em espécies basais (C. monoculus e

A. ocellatus). Nenhuma substituição foi observada em C. monoculus, enquanto

que nas demais espécies as substituições nucleotídicas foram: uma transição

em A. ocellatus, duas transições em G. proximus, duas transições e três

transversões em P. scalare e 18 transições, sete transversões e 4 indels

(insersões/deleções) em S. discus. Quando comparado com sequências de

Rex1 de outros ciclídeos disponíveis no Genbank observou-se 91% de

identidade genética com Hemichromis bimaculatus (GenBank: AJ288479) e

94% com Oreochromis niloticus (GenBank: AJ288473). Foi possível identificar

blocos conservados correspondentes à sequência da transcriptase reversa,

sendo a sequência de S. discus similar à de O. niloticus, assim como as

demais são semelhantes entre si (Figura 1a). A árvore filogenética dos clones

do elemento Rex1 indicou separação entre Symphysodon discus e as demais

espécies, evidenciada por dois ramos na árvore suportados por elevados

valores de bootstrap. Os clones de cada espécie foram agrupados em ramos

separados. O ramo que engloba os clones das espécies Cichla monoculus,

Astronotus ocellatus, Geophagus proximus e Pterophyllum scalare teve um

clone de P. scalare basal a todos os demais e os clados que englobam as

tribos Heroini, Cichlini, Astronotini e Geophagini apresentaram-se como grupos

irmãos (com exceção de S. discus) (Figura 2), não refletindo a relação

filogenética das espécies analisadas.

64

Figura 1 Alinhamento das sequências de aminoácidos dos diferentes

retroelementos entre ciclídeos: A) Região correspondente à transcriptase

reversa de Rex1 das espécies analisadas em comparação com O. niloticus

(GenBank: AJ288473); B) Região correspondente à transcriptase reversa de

Rex3 em comparação com O. niloticus (GenBank: AJ400370) e C) Região da

endonuclease de Rex6 das espécies analisadas em comparação com O.

niloticus (GenBank: AJ293545).

65

Figura 2 Árvore de máxima verossimilhança dos 49 clones de Rex1, revelando duas linhages monofiléticas deste retroelemento.

Valores de bootstrap maiores que 60 são mostrado sobre os ramos.

66

Sequências entre 418 e 475 pb foram obtidas entre os 50 clones de

Rex3 analisados. Ao total foram 6 clones de cada espécie (C. monoculus, A.

ocellatus, G. proximus e P. scalare) e 26 clones de S. discus. O retroelemento

Rex3 apresentou-se muito váriavel em todas as espécies analisadas, com

várias substituições nucleotídicas, sendo: 113 em C. monoculus (79 transições,

25 transversões e 9 indels), 159 em A. ocellatus (83 transições, 19

transversões e 57 indels), 215 em G. proximus (89 transições, 34 transversões

e 92 indels), 242 em P. scalare (130 transições, 58 transversões e 54 indels) e

245 em S. discus (133 transições, 58 transversões e 54 indels). Quando

comparado com sequências de Rex3 de outros ciclídeos disponíveis no

Genbank observou-se 87% de identidade genética com Oreochromis niloticus

(GenBank: AJ400370), 91% com Cichla kelberi (GenBank: FJ687588) e 92%

com Geophagus surinamensis (GenBank: HM535302). Mesmo com ampla

variação nas sequências dos clones, foi possivel identificar blocos conservados

correspondentes à sequência da transcriptase reversa de Rex3 (Figura 1b). A

árvore filogenética dos clones do elemento Rex3 não agrupou os clones por

espécie, com exceção de um clado que engloba clones de S. discus. As

demais tribos não foram separadas em clados exclusivos (Figura 3).

67

Figura 3 Árvore de máxima verossimilhança dos 50 clones do retroelemento Rex3. Valores de bootstrap maiores que 60 são

mostrado sobre os ramos.

68

Fragmentos entre 459 e 505 pb foram gerados para os 59 clones

sequenciados do retroelemento Rex6. Ao total foram sequenciados oito clones

de C. monoculus, sete clones de A. ocellatus, sete de G. proximus, cinco de P.

scalare e 32 de S. discus. C. monoculus e S. discus apresentaram elevada taxa

de substituição nucleotídica: 213 (80 transições, 63 transversões e 70 indels) e

214 (103 transições, 88 transversões e 23 indels) respectivamente. As

substituições nucleotídicas evidenciadas nas demais espécies foram: 62 (41

transições, 17 transversões e 4 indels) em A. ocellatus, 66 (47 transições, 19

transversões) em G. proximus e 34 (26 transições, 7 transversões e 1 indels)

em P. scalare. Quando comparado com sequências de Rex6 de outros

ciclídeos disponíveis no Genbank observou-se 81% de identidade genética

com Oreochromis niloticus (GenBank: AJ293545), 83% com Melanochromis

auratus (GenBank: HM535303) e 88% com Crenicichla sp. (GenBank:

HM535301). As sequências apresentaram região de homologia com a

endonuclease do Rex6 (Figura 1c). Os clones de cada espécie foram

agrupados em ramos distintos na árvore filogenética dos clones do elemento

Rex6, sendo que A. ocellatus aparece como grupo irmão de alguns clones de

C. monoculus. E todos os C. monoculus e A. ocellatus são grupo irmão das

demais espécies derivadas. Geophagus proximus aparece como grupo irmão

de Crenicichla sp., sendo este clado basal ao que engloba P. scalare e S.

discus (Figura 4). Estes dados apresentam similaridade com a árvore

filogenética proposta para as espécies.

69

Figura 4 Árvore de máxima verossimilhança dos 59 clones do retroelemento Rex6. Valores de bootstrap maiores que 60 são

mostrado sobre os ramos.

70

3.2.3.2 Mapeamento físico cromossômico dos TEs

O retroelemento Rex1 apresentou-se disperso nos cromossomos de

Cichla monoculus, Astronotus ocellatus, Geophagus proximus, Pterophyllum

scalare e Symphysodon discus. Ainda, Astronotus ocellatus apresentou os

pares 11, 17 e 23 com ampla distribuição deste retroelemento, assim como os

pares 1, 5, 7, 8, 15, 19 e 23 de Geophagus proximus e a maioria dos pares de

Symphysodon discus. Contudo, todas as espécies apresentaram marcações

mais conspícuas em regiões terminais e/ou centroméricas, havendo maior

quantidade de marcações em espécies derivadas, tais como Pterophyllum

scalare (Figura 5 – sinais em vermelho).

Múltiplos e intensos sinais de hibridização foram obtidos para o

retroelemento Rex3 nas cinco espécies analisadas. Estas marcações

conspícuas localizaram-se em regiões terminais da maioria dos cromossomos

das cinco espécies, bem como em regiões centroméricas, pericentroméricas e

intersticiais. Contudo, em ambos os homólogos do par 21 de Cichla monoculus

e pares 4, 5, 8, 9 e 12 de Symphysodon discus não foram evidenciados sinais

de hibridização (Figura 6 – sinais em vermelho). O Rex6 foi visualizado, de maneira geral, em marcações conspícuas na

maioria dos cromossomos de todas as espécies, em posições terminais,

intersticiais, centroméricas e/ou pericentroméricas. Em Geophagus proximus

ambos os homólogos dos pares 2, 21, 23 e 24 não apresentaram sinais de

hibridização, bem como os pares 2, 8, 13, 20 e 25 de Symphysodon discus

(Figura 7 – sinais em vermelho). Marcações de Rex1, 3 e 6 também foram

detectadas em regiões eucromáticas.

71


vermelho). Os cromossomos foram contra corados com DAPI.

72



73



3.2.4 Discussão

3.2.4.1 Distribuição cromossômica dos TEs

Estudos recentes têm mostrado que ciclídeos possuem cariótipo

dinâmico, com variação na organização e estrutura do genoma destes peixes,

sendo que diversas classes de DNA repetitivos podem influenciar e propiciar

este dinamismo (Gross et al. 2009b; Poletto et al. 2010b; Valente et al. 2011;

Schneider et al. 2012a). Dentre estes elementos repetitivos destacam-se os

74

TEs, que podem conduzir a evolução de genomas por diferentes processos,

incluindo inativação gênica, combinando diferentes éxons e por conversão

gênica (para revisão ver Kazazian 2004). Ainda, a recombinação entre cópias

não homólogas de TEs pode conduzir a formação de deleções, duplicações,

inversões e translocações, bem como o próprio processo de transposição pode

ocasionar vários rearranjos (Volff 2005). Deste modo, TEs parecem ter papel

importante na diversificação cariotípica dos ciclídeos.

Elementos transponíveis acumulam-se principalmente em regiões

heterocromáticas do genoma em diversos grupos, incluindo peixes (Fischer et

al. 2004; Mazzuchelli e Martins 2009; Gross et al. 2009b; Valente et al. 2011).

Entretanto, em algumas espécies estes elementos transponíveis são

encontrados em regiões eucromáticas (Teixeira et al. 2009; Terencio et al.

2012a). As espécies de ciclídeos analisadas apresentam acúmulo de Rex1,

Rex3 e Rex6 em maior quantidade em regiões heterocromáticas, mas algumas

marcações também foram detectadas em porções eucromáticas. Estes

resultados indicam ao menos duas hipóteses: i) que a localização

cromossômica destes TEs é dirigida por outros mecanismos evolutivos

podendo evoluir de forma diferencial de outras sequências repetitivas

presentes na heterocromatina; ii) que estes TEs possuem alguma função

estrutural/regulatória e seu acúmulo em regiões eucromáticas pode trazer

vantagens para o genoma do hospedeiro.

O movimento e o acúmulo de TEs exercem grande influência na

trajetória evolutiva do hospedeiro e parece evidente que TEs são ferramentas

regulatórias do genoma, com papel importante no direcionamento da

expressão gênica (Brookfield 2005; Slotkin e Martienssen 2007), porém a

relação entre TEs e função regulatória nem sempre é direta e facilmente

visualizada. Contudo, correlação entre rearranjos cariotípicos e atividade de

retrotransposons foi evidenciada em Perciformes marinhos, onde distribuição

compartimentalizada com acúmulo em regiões pericentroméricas são

observadas em espécies derivadas, tais como Notothenia coriiceps (Ozouf-

Costaz et al. 2004).

Rearranjos cromossômicos são evidentes na evolução dos Cichlinae e

sítios teloméricos intersticiais (ITS) são reconhecidos em Astronotus ocellatus

(Schneider et al. 2012a). Estes ITS provavelmente estão associados a

75

diferentes classes de DNA repetitivo e possivelmente estes TEs podem ter

atuado nos rearranjos cromossômicos de A. ocellatus, uma vez que os

retroelementos Rex1, 3 e 6 estão nas mesmas porções dos cromossomos

onde os ITS são visualizados (Schneider et al. 2012a). O acúmulo de TEs em

regiões específicas do genoma de ciclídeos foi evidenciada e associada a

possíveis eventos de alterações cromossômicas (Teixeira et al. 2009;

Mazzucheli e Martins 2009; Gross et al. 2009b; Ferreira et al. 2010; Valente et

al. 2011).

Virtualmente os TEs podem inserir-se em qualquer porção do genoma

do hospedeiro, entretanto algumas insersões em porções preferenciais já foram

relatadas, tais como em genes ribossomais (Xiong e Eickbush 1993; Silva et al.

2011). Associação entre Rex1, Rex3 e Rex6 e sítios ribossomais 18S e 5S foi

evidenciada em todas as espécies analisadas no presente estudo. Esta

associação entre TE e DNAr em ciclídeos pode ser a causa dos múltiplos sítios

de DNAr 18S encontrados em P. scalare (Schneider et al. 2012a), bem como

pode estar relacionado à variabilidade de sítios de DNAr 18S em Symphysodon

aequifasciatus (Gross et al. 2010). Análise da distribuição do gene de RNAr

18S no genoma de Oreochromis niloticus tem demonstrado que algumas

cópias de 18S são sempre ladeadas por TEs, sugerindo que estes elementos

podem ter atuado na dispersão de cópias de 18S, gerando assim variabilidade

e um grande número de sítios (Nakajima et al. 2012).

3.2.4.2 Diversidade dos TEs

Apesar de pouco se saber sobre a evolução e o efeito genômico de

retroelementos em peixes, estes parecem ser responsáveis pelo dinamismo

cariotípico recentemente revelado para os ciclídeos (Gross et al. 2009b; Poletto

et al. 2010b; Valente et al. 2011; Schneider et al. 2012a). Este dinamismo

também pode ser notado com base nas sequências dos clones dos ciclídeos

neotropicais, onde Rex1 apresentou duas linhagens evolutivas. A presença de

diferentes linhagens de Rex1 já foi observada anteriormente em Oreochromis

niloticus, onde foi verificado a presença de quatro linhagens deste

retroelemento (Volff et al. 2000). Os clones analisados no presente estudo

correspondem à linhagem 4, a qual é amplamente detectada no genoma dos

76

peixes da superordem Acanthopterygii (Volff et al. 2000). O surgimento de

linhagens pode estar associado a resultados de perdas frequentes ou rápida

divergência destes retroelementos (Rouzic e Capy 2006). O elevado nível de

similaridade entre as sequências de Rex de algumas espécies de peixes

teleósteos sugere ainda atividade relativamente recente deste retroelemento

(Volff et al. 2001a).

A presença de stop codons nas sequências de aminoácidos indica que

estas correspondem a elementos inativos, porém foi possível observar blocos

conservados que correspondem ao fragmento da transcriptase reversa para

clones de Rex1 e 3 e da endonuclease em Rex6. As sequências nucleotídicas

de Rex1 e 3 foram mais conservadas em espécies basais (C. monoculus) que

em derivadas (S. discus). Possivelmente este fato está associado a forças

seletivas que tendem a estabilizar o genoma, em muitos casos eliminado

famílias de TEs do genoma de algumas espécies (Böhne et al. 2008), pois os

mecanismos de repressão em cada hospedeiro podem ser diferentes (Capy et

al. 1994). A evolução genômica de Symphysodon é complexa e engloba

eventos de hibridização entre as espécies (Amado et al. 2011), o que pode ter

causado instabilidade nos TEs, levando a eventos de transposição que

resultaram em vários rearranjos cromossômicos (Gross et al. 2009b). Por outro

lado, Rex6 apresentou elevadas taxas de substituições em C. monoculus

(basal) similares a de S. discus (derivado). Este acúmulo de mutações pode

estar associado à senescência do TE, que normalmente é caracterizada pelo

acúmulo de mutações seguida da provável perda estocástica do elemento pelo

genoma (Pinsker et al. 2001).

Estudos demostraram que as sequências de TEs evoluem de forma

independente no genoma de seus hospedeiros (Lerat et al. 2000; Lerat et al.

2002) e uma das principais razões é a possibilidade de transferência horizontal,

que ocasiona incongruência entre as filogenias do hospedeiro e do TE (Silva e

Kidwel 2000). Com relação às árvores filogenéticas dos Rex1 e Rex3, estas

não refletem a árvore filogenética das espécies (Smith et al. 2008) e

provavelmente eventos de transferência horizontal podem ter ocorrido nestes

retroelementos durante a história evolutiva das espécies analisadas.

Entretanto, polimorfismo ancestral e diferentes taxas de evolução de TEs

entre hospedeiros, incluindo perda de cópias de TEs, não podem ser

77

descartados. Por outro lado, para Rex6 as espécies formaram clados

monofiléticos e a árvore filogenética do elemento apresenta congruência com a

proposta para os ciclídeos neotropicais (Smith et al. 2008).

Assim, nossos dados mostram que os ciclideos são um grupo

particularmente interessante para estudos de evolução dos TEs, os quais

atuaram efetivamente na estruturação do genoma e do cariótipo. A distribuição

de Rex no genoma dos ciclídeos sugere que estes retroelementos estão sob

ação de mecanismos evolutivos que tendem a acumula-los em regiões

cromossômicas específicas (principalmente em heterocromatinas). Além disso,

nossos dados indicam que a presença de transferência horizontal, surgimento

ou eliminação de linhagens de TEs podem ter tido papel importante na história

evolutiva de Rex no genoma dos ciclídeos.

78

3.3 Artigo 3 - Mapeamento cromossômico e sequenciamento nucleotídico de DNAs repetitivos de ciclídeos Neotropicais

79

3.3.1 Introdução

Genes de cópia única ou de poucas cópias correspondem a uma

pequena parte do genoma dos vertebrados (2-10%), quando comparado às

regiões repetitivas (Horvath et al. 2001). Estes DNAs repetitivos podem

apresentar-se organizados em tandem ou dispersos pelo genoma

(Charlesworth et al. 1994), sendo que DNAs satélites, minisatélites e

microssatélites normalmente apresentam o primeiro padrão de organização. Os

DNAs satélites são organizados em repetições com centenas ou milhares de

cópias, localizados normalmente em porções cromossômicas

heterocromáticas, preferencialmente próximos aos centrômeros ou em regiões

subteloméricas ou intersticiais (Adega et al. 2009; Kunh et al. 2008). A

importância biológica dos DNAs satélites é intrigante e em muitos casos sem

explicação, pois alguns satélites são conservados evolutivamente por um longo

período de tempo. A presença de DNA satélites em sequências expressas,

bem como as interações com proteínas específicas dos centrômeros, sugere

um papel biológico para alguns destes satélites, embora isto não esteja

claramente elucidado (revisado por Ugarkovic 2005).

Com relação às sequências repetitivas que se encontram dispersas no

genoma destacam-se os elementos transponíveis (TEs), que podem ser

classificados em transposons ou retrotransposons. Estes TEs diferem de outras

sequências repetitivas pela sua capacidade de se mover no genoma do

hospedeiro, gerando uma gama de polimorfismos como consequência da

inserção, bem como pela variação do número de cópias destas sequências

dentro e entre espécies (Biémont e Vieira 2006; Biémont 2010). Devido a

dinâmica dos TEs, acredita-se que eles têm impulsionado a evolução do

genoma de diversas maneiras, incluindo inativação gênica, combinando

diferentes éxons, por conversão e duplicação gênica, além de transposições. A

recombinação entre cópias não homólogas de TEs pode ainda conduzir à

formação de deleções, duplicações, inversões e translocações no genoma do

hospedeiro (Volff et al. 2003; Kazazian 2004; Rebollo et al. 2012).

Estudos envolvendo sequências repetitivas de DNA em peixes ciclídeos

têm indicado a participação ativa destas na carioevolução das espécies, porém

a maioria das informações refere-se ao mapeamento físico de genes

80

ribossomais e alguns poucos estudos focam nos elementos transponíveis e

sequências teloméricas (Gross et al. 2009b; Gross et al. 2010; Polleto et al.

2010b; Valente et al. 2011; Schneider et al. 2012a). Assim, informações sobre

a composição genômica destas regiões repetitivas de DNA são escassas e

para ciclídeos focam principalmente nas espécies africanas (Ferreira e Martins

2008).

Entre as diferentes metodologias de isolamento de sequências

repetitivas a que utiliza cinética de reassociação do DNA (Cot-1 DNA) sido tem

sido empregada com sucesso em peixes (Ferreira e Martins 2008; Vicari et al.

2010). Para os ciclídeos africanos, a utilização desta técnica, aliada ao

mapeamento físico das sequências obtidas permitiu identificar principalmente

DNAs satélites, microssatélites e TEs na fração repetitiva do genoma, os quais

apresentaram-se distribuídos predominantemente em regiões centroméricas e

teloméricas, bem como ao longo do maior par cromossômico de diversas

espécies de ciclídeos africanos da subfamília Pseudocrenilabrinae (Ferreira e

Martins 2008; Ferreira et al. 2010; Fantinatti et al. 2011). Porém, o

conhecimento da porção repetitiva do genoma dos ciclídeos neotropicais ainda

representa uma lacuna que precisa ser elucidada para auxiliar na compreensão

acerca da evolução genômica deste grupo de peixes.

Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a composição genômica da

fração repetitiva de duas espécies pertencentes à sub-família Cichlinae, que

agrupa os ciclídeos neotropicais: uma espécie que é considerada basal e

apresenta heterocromatina restrita a blocos centroméricos (Cichla monoculus),

enquanto a outra é considerada uma espécie derivada e que apresenta blocos

heterocromáticos conspícuos (Symphysodon discus) (para relações

filogenéticas ver Smith et al. 2008; para dados cariotípicos ver Schneider et al.

2012a). A fração repetitiva foi acessada pela obtenção de Cot-1 DNA (DNA

enriquecido com sequências alta e moderadamente repetitivas), que foi

utilizada para avaliar a distribuição das mesmas em cromossomos metafásicos

de espécies de diferentes tribos de Cichlinae: C. monoculus (Cichlini),

Astronotus ocellatus (Astronotini), Geophagus proximus (Geophagini) e S.

discus (Heroini), o que permitiu o entendimento da organização destas na

carioevolução destes ciclideos. Além disso, o conteúdo genômico da fração

81

Cot-1 DNA foi determinado através de clonagem e sequenciamento

nucleotídico.


Foram analisados exemplares pertencentes a quatro tribos da subfamília

Cichlinae coletados na Amazônia Central. As espécies analisadas foram Cichla

monoculus (3 machos e 3 fêmeas), Astronotus ocellatus (3 machos e 5

fêmeas), Geophagus proximus (2 machos e 3 fêmeas), Pterophyllum scalare (3

machos e 3 fêmeas) e Symphysodon discus (2 machos e 2 fêmeas). Os

exemplares foram amostrados com autorização de coleta ICMBio SISBIO

10609-1/2007. Todos os espécimes foram anestesiados por imersão em água

gelada até a morte. Os cromossomos mitóticos foram obtidos de células renais

utilizando o protocolo de “air drying” (Bertollo et al. 1978).

3.3.2.1 Isolamento do DNA repetitivo por meio da cinética de reassociação Cot-1 DNA

Amostras de DNA enriquecido com sequências repetitivas de Cichla

monoculus e Symphysodon discus, foram obtidas por meio da cinética de

renaturação Cot-1 DNA (DNA enriquecido com sequências alta e

moderadamente repetitivas), de acordo com o protocolo descrito por Zwick et

al. (1997), e adaptado por Ferreira e Martins (2008). O DNA total foi extraído à

partir do tecido muscular utilizando o protocolo de fenol-clorofórmio de

Sambrook et al. (1989) e quantificado em espectrofotômetro NanoVue Plus (GE

Healthcare). As amostras de DNA (50 μl de DNA 100-500 ng/μl diluídos em

NaCl 0.3 M) foram autoclavadas (121 ºC) por 5 minutos para obter fragmentos

entre 100 a 2.000 pares de bases. Estas alíquotas de DNA foram desnaturados

por 10 minutos à 95 ºC, colocadas em gelo por 10 segundos e posteriormente

colocadas à 65 ºC por 3 minutos para renaturar. As amostras foram incubadas

por 8 minutos à 37 ºC com 1 U da enzima S1 nuclease, para digerir o DNA fita

simples. A fração repetitiva do DNA foi recuperada por congelamento em

nitrogênio líquido e em seguida re-extraída, utilizando o método e fenol-

82

clorofórmio (Sambrook et al. 1989). Os fragmentos de DNA resultantes, foram

utilizados como sondas para FISH e posteriormente clonados e sequenciados.

3.3.2.2 Clonagem e sequenciamento do DNA repetitivo

Os fragmentos da fração repetitiva Cot-1 DNA foram inseridos em

plasmídeo pMOS Blue Blunt Ended Cloning Kit (GE Healthcare) e os produtos

de ligação foram transformados em células competentes de Escherichia coli

linhagem DH5α. Os clones positivos foram sequenciados em sequenciador

automático de DNA ABI 3130 XL (Applied Biosystem). Cada clone foi

identificado por buscas na base de dados do NCBI

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) com a ferramenta BLASTn e na base do Repbase

(Jurka et al. 2005) no Genetic Information Research Institute (Giri)

(http://www.girinst.org/repbase/) utilizando o software CENSOR (Kohany et al.

2006). As sequências obtidas foram depositadas no banco de dados do NCBI

sob os números: GenBank JX993730 até JX993748. As sequências

nucleotídicas foram alinhadas utilizando o programa ClustalW (Thompson et al.

1994) incluso no programa BioEdit 7 (Hall 1999).


Os fragmentos da fração repetitiva Cot-1 DNA isolados do genoma de C.

monoculus e S. discus foram marcados com Digoxigenina-11-dUTP e Biotina-

16-dUTP (Dig-Nick Translation mix e Biotin-Nick Translation mix; Roche)

respectivamente, por reações de nick translation, conforme instruções do

fabricante. O anticorpo anti-digoxigenina rodamina (Roche) e a estreptavidina

(Life Technologies) foram utilizados para detectar o sinal da FISH (Pinkel et al.

1986). Hibridizações homólogas e heterólogas foram realizadas utilizando

estas sondas nas metáfases de Cichla monoculus, Astronotus ocellatus,

Geophagus proximus e Symphysodon discus. As hibridizações foram feitas

com 77% de estringência (2,5 ng/µL de DNA, 50% formamida, 10% sulfato de

dextrano, e 2x SSC a 37 °C por 18 h). Os cromossomos foram contra corados

com DAPI (2 mg/ml) em meio de montagem VectaShield (Vector).

83




(Olympus DP71) utilizando o software Image-Pro MC 6.3.

3.3.3 Resultados

3.3.3.1 Composição da fração repetitiva do genoma de S. discus e C.

monoculus

Foram sequenciados 77 clones de Cot-1 DNA de C. monoculus e estes

mostraram similaridade com diversas sequências depositadas no GenBank.

Diversos tipos de famílias de DNAs repetitivos foram identificados na fração

repetitiva do genoma de C. monoculus, dentre eles: 30 classes de non-LTR

retrotransposons, 21 de transposons, 6 de microssatélites, 5 de DNAs satélites.

Ainda, alguns fragmentos (15) apresentaram similaridade com genes ou

pseudogenes (Tabela 1).

Entre os 105 clones de Cot-1 DNA de S. discus sequenciados, foram

identificados 38 classes de non-LTR retrotransposons, 23 de transposons, 22

de microssatélites, 11 fragmentos de genes ou pseudogenes, 8 classes de

DNAs satélites e 3 de LTR retrotransposon (Tabela 2). Ainda, alguns clones de

C. monoculus e S. discus apresentaram similaridade a dois diferentes tipos de

sequência, dependendo do banco de dados em qual foi realizada a busca

(Tabela 1 e 2).

84

Tabela 1 Similaridade entre sequências da fração Cot-1 DNA de C. monoculus e sequências conhecidas em banco de dados

públicos

Clone Homologia Similaridade IdentidadeCm1 DNA satélite SATB de Tilapiinae e Haplochrominae (RepBase/GIRI*) 85% Cm2 retrotransposon não-LTR LINE de Oreochromis niloticus (GenBank AF016498.1) 97% Cm3 retrotransposon não-LTR MAUI de Takifugu rubripes (RepBase/GIRI*) 72% Cm4 retrotransposon não-LTR Rex6 (RepBase/GIRI*) 79% Cm5 Transposon Tc1 de Labeo rohita (Genbank AY083617.1) 83% Cm6 retrotransposon não-LTR MAUI de Takifugu rubripes (RepBase/GIRI*) 70% Cm7 retrotransposon não-LTR LINE de Astronotus ocellatus (GenBank FJ164043.1) 84% Cm8 retrotransposon não-LTR EXPANDER (RepBase/GIRI*) 82% Cm9 retrotransposon não-LTR LINE de Oreochromis niloticus (GenBank AF074486.1) 85%

Cm10 Transposon transposon da superfamília P (RepBase/GIRI*) 78% Cm11 retrotransposon não-LTR Rck de Cichla kelberi (GenBank FJ687586.1) 94% Cm12 Transposon Tc1 Mariner de pufferfish (RepBase/GIRI*) 90% Cm13 retrotransposon não-LTR LTR 1 de Xiphophorus (GenBank S77502.1) 88% Cm14 Microssatélite Cyprinus carpio (GenBank JN764809.1) 77% Cm15 retrotransposon não-LTR MAUI de Haplochromis (GenBank AB601486.1) 92% Cm16 retrotransposon não-LTR EXPANDER2 de Takifugu rubripes (RepBase/GIRI*) 81% Cm17 retrotransposon não-LTR Rex3 de Cichla kelberi (GenBank FJ687588.1) 92% Cm18 Microssatélite Parambassis siamensis (GenBank AB720623.1) 100% Cm19 Transposon Tc1 from Takifugu rubripes (RepBase/GIRI*) 84% Cm19 Gene gene Hox de Astatotilapia (GenBank EF594313.1) 90% Cm20 Transposon Tc1 de Rana pipiens (RepBase/GIRI*) 76% Cm20 sequência desconhecida sequência desconhecida de Oreochromis niloticus (GenBank AF533976.1) 83% Cm21 Microssatélite Eleutheronema tetradactylum (GenBank AB697180.1) 96% Cm22 Transposon Tc1 Pogo de Takifugu rubripes (RepBase/GIRI*) 80% Cm22 Gene gene da opsina de Oreochromis niloticus (GenBank JF262086.1) 83% Cm23 Microssatélite Astronotus ocellatus (GenBank GQ302874.1) 90% Cm24 Transposon Tc1 Mariner de Xenopus tropicalis (RepBase/GIRI*) 94% Cm24 Pseudogene Histone H3 pseudogene de Salmo salar (GenBank HM159473.1) 96% Cm25 Satélite DNA satélite de Astronotus ocellatus (GenBank FJ164040.1) 77% Cm26 Satélite DNA satélite de Astronotus ocellatus (GenBank FJ164039.1) 77% Cm27 Satélite DNA satélite de Astronotus ocellatus (GenBank FJ164035.1) 85% Cm28 retrotransposon não-LTR EXPANDER (RepBase/GIRI*) 93% Cm29 Transposon Mariner1 (RepBase/GIRI*) 88% Cm29 Pseudogene Gene da proteína ribosomal de Cyprinus carpio (GenBank AY115478.1) 89% Cm30 Transposon Tc1 DR3 (RepBase/GIRI*) 88% Cm31 retrotransposon não-LTR EXPANDER1 DR de Danio rerio (RepBase/GIRI*) 93% Cm32 retrotransposon não-LTR locus para inserção SINE Tilapia rendalli (GenBank AB100537.1) 85% Cm33 Transposon Helitron2 de Danio rerio (RepBase/GIRI*) 86%

85

Tabela 2 Similaridade entre sequências da fração Cot-1 DNA de S. discus e sequências conhecidas em banco de dados públicos

Clone Homologia Similaridade IdentidadeSd1 Microssatélite Symphysodon discus (GenBank EU109271.1) 100% Sd2 Transposon Mariner de Takifugu rupripes (RepBase/GIRI*) 83% Sd3 Retrovírus ERV3 de Echinops telfairi (RepBase/GIRI*) 85% Sd3 receptor de lipoproteína receptor de lipoproteína deletedo em tumor de D. rerio (GenBank XM001920004.3) 96% Sd4 retrotransposon não-LTR MAUI de Takifugu rupripes (RepBase/GIRI*) 76% Sd4 Gene GnRH1 de Oreochromis niloticus (GenBank AF467291.1) 85% Sd5 Microssatélite Cyprinus carpio (GenBank JN779151.1) 86% Sd6 Microssatélite Symphodus melops (GenBank GQ922115.1) 95% Sd7 Transposon Tc1 de Xenopus tropicalis (RepBase/GIRI*) 92% Sd8 Microssatélite Cyprinus carpio (GenBank JN777259.1) 100% Sd9 Satélite Hinfl 10 de Astronotus ocellatus (GenBank FJ164040.1) 88%

Sd10 Satélite Hinfl 8 de Astronotus ocellatus (GenBank FJ164039.1) 88% Sd11 Microssatélite Cyprinus carpio (GenBank JN782703.1) 100% Sd12 retrotransposon não-LTR Coprina Cc1 (RepBase/GIRI*) 73% Sd13 retrotransposon não-LTR MAUI de Haplochromis chilotes (GenBank AB601474.1) 100% Sd14 Transposon RNAm da transposase Tcb1 de Salmo salar (GenBank BT059762.1) 77% Sd15 Transposon Tc1 Pogo de Takifugu rubripens (RepBase/GIRI*) 86% Sd16 Gene Proteina fosfatase de Oreochromis niloticus (GenBank XM003451427.1) 91% Sd17 retrotransposon não-LTR Rex1 de Cichlasoma labridens (GenBank AJ288469.1) 97% Sd18 retrotransposon não-LTR Rex3 de Tetraodon nigroviridis (GenBank AJ621035.1) 86% Sd19 retrotransposon não-LTR EXPANDER de Haplochromis chilotes (GenBank AB601473.1) 88% Sd20 retrotransposon não-LTR AoRex3 de Astronotus ocellatus (GenBank FJ164041.1) 86% Sd21 retrotransposon não-LTR Rex1 de Haplochomis chilotes (GenBank AB6073.1) 86% Sd22 Transposon Helitron8 de Drosophila rhopaloa (RepBase/GIRI*) 75% Sd23 retrotransposon não-LTR CiLINE de Oreochromis niloticus (GenBank AF016499.1) 93% Sd24 retrotransposon não-LTR LINE de Haplotaxodon microlepis (GenBank AB017056.1) 92% Sd25 retrotransposon não-LTR Rex1 de lampréia marinha (RepBase/GIRI*) 76% Sd25 Gene gene vasa de Oreochromis niloticus (GenBank AB649033.1) 84% Sd26 Gene 18S de Dictyosoma burger (GenBank AB375573.1) 96% Sd27 Microssatélite Pristipomoides filamentosus (GenBank GQ998938.1) 91% Sd28 retrotransposon não-LTR Copia8 de pêssego (RepBase/GIRI*) 87% Sd28 Gene Histone desacetilase 1-B de Salmo salar 92% Sd29 Microssatélite Pangasius (GenBank AF378285.1) 85% Sd30 Satélite ONSAT de tilapia (RepBase/GIRI*) 70% Sd31 retrotransposon não-LTR retrotransposon Penelope de ciclídeos do lago Malawi (RepBase/GIRI*) 80% Sd32 retrotransposon não-LTR Poseidon de Tetraodon nigroviridis (GenBank AJ621377.1) 74% Sd33 Pseudogene LSU rRNA (RepBase/GIRI*) 94% Sd33 Gene Gene ribossomal 28S de Centropristis striata (GenBank EF120947.1) 98% Sd34 Satélite SATA de Sarotherodon galilaeus (GenBank SGU02717) 74%

86

Tabela 2 Continuação

Clone Homologia Similaridade IdentidadeSd35 retrotransposon não-LTR SINE2 de ciclídeos do lago Malawi (RepBase/GIRI*) 90% Sd36 Transposon Mariner3 de musgo (RepBase/GIRI*) 93% Sd37 Gene gene da Opsina de Oreochromis niloticus (GenBank JF262087.1) 85% Sd38 Microssatélite Trachinotus ovatus (GenBank JF964929.1) 97% Sd39 Gene Anoctamina 1 de Oreochromis niloticus (GenBank XM003455720.1) 100% Sd40 retrotransposon não-LTR EXPANDER2 de Takifugu rubripes (RepBase/GIRI*) 82% Sd41 retrotransposon não-LTR Rex1 de Haplochromis chilotes (GenBank AB601473.1) 83% Sd42 Transposon Tc1 de Labeo rohita (GenBank AY083617.1) 86% Sd43 Transposon Helitron N1 de Danio rerio (RepBase/GIRI*) 89% Sd44 Satellite SATB de Oreochromis niloticus (GenBank S57288.1) 88% Sd45 Gene proteina zinc finger de Oreochromis niloticus (GenBank XM003448688.1) 86% Sd46 Transposon Tc1-4Xt (RepBase/GIRI*) 88% Sd47 Microssatélite Gobiocypris rarus (GenBank DQ490152.1) 76% Sd48 retrotransposon não-LTR Rex3 de Xiphophorus maculatus (GenBank AY298859.1) 92% Sd49 retrotransposon LTR Copia 21 de pêssego (RepBase/GIRI*) 77% Sd50 Transposon Mariner 1 de Danio rerio (RepBase/GIRI*) 94% Sd51 retrotransposon não-LTR SINE de Hypophthalmichthys molitrix (GenBank FJ171630.1) 97%

87

3.3.3.2 Mapeamento físico cromossômico da fração repetitiva Cot-1 DNA

Cichla monoculus (Cichlini), Astronotus ocellatus (Astronotini) e

Geophagus proximus (Geophagini) apresentaram número diploide igual a 48

cromossomos (Figura 1A, 1E, 1L, respectivamente) e S. discus (Heroini)

apresentou 60 cromossomos (Figura 1M). A hibridização da sonda Cot-1 DNA

de Cichla monoculus nos cromossomos da própria espécie evidenciou que a

fração repetitiva do genoma encontra-se localizada na região centromérica e

terminal de todos os cromossomos (Figura 1B). A hibridização heteróloga desta

sonda em A. ocellatus (Figura 1F), G. proximus (Figura 1J) e S. discus (Figura

1N) evidenciou sinais centroméricos, teloméricos e dispersos na maioria dos

cromossomos. Contudo em A. ocellatus um par cromossômico não apresentou

nenhuma região de homologia e em outro as mesmas restringiram-se a sítios

teloméricos.

Hibridização com sonda enriquecida com fração repetitiva do DNA de S.

discus (Cot-1 DNA) na própria espécie evidenciou que a fração repetitiva do

genoma encontra-se localizada em grandes blocos na região centromérica de

todos os cromossomos (Figura 1O), com exceção dos dois menores

cromossomos do complemento que não apresentaram nenhuma região de

homologia. A hibridização cruzada da sonda Cot-1 DNA de S. discus nos

cromossomos de C. monoculus (Figura 1C), A. ocellatus (Figura 1G), G.

proximus (Figura 1K) revelou sítios dispersos, com algumas marcações

conspícuas na região centromérica e telomérica de alguns pares de

cromossomos.

A sobreposição de ambas as sondas nos cromossomos de todas as

espécies ressaltou que regiões teloméricas e centroméricas apresentam

grande quantidade de regiões repetitivas de DNA, havendo homologia entre as

espécies (Fig 1D, 1H, 1L, 1P). Contudo, estas regiões repetitivas não são

exclusivas destas regiões, sendo observadas dispersas ao longo dos braços

cromossômicos, especialmente nas hibridações heterólogas.

88

Figura 1 Hibridização da fração Cot-1 DNA em quatro espécies de Cichlinae;

(A, E, I, M) cromossomos contra corados com DAPI das espécies C.

monoculus, A. ocellatus, G. proximus e S. discus, respectivamente; (B, F, J, N)

Sonda Cot-1 DNA isolada do genoma de C. monoculus hibridizada em seus

próprios cromossomos e contra os cromossomos das demais espécies, em (F)

cabeça de seta evidencia par sem sinais de hibridização, e alguns sinais

restringem-se a regiões teloméricas (seta); (C, G, K, O) Sonda Cot-1 DNA

isolada do genoma de S. discus hibridizada contra os cromossomos das

espécies analisadas e em seus próprios cromossomos, em (O) seta evidencia

cromossomos sem sinais de hibridização; (D, H, L, P) Double FISH da fração

Cot-1 DNA.

89

3.3.4 Discussão

3.3.4.1 Organização do DNA repetitivo nos cromossomos dos ciclídeos

Diversas classes de DNAs compõem a fração repetitiva do genoma de

C. monoculus e S. discus, tais como DNAs satélites, microssatélites,

retrotransposons, transposons, genes e pseudogenes. Assim, como na maioria

dos organismos, se compararmos o mapeamento físico cromossômico destes

elementos repetitivos que foram isolados de C. monoculus e S. discus com o

padrão heterocromático descrito para as mesmas, a maior parte destes está

alocado em regiões de heterocromatina (Schneider et al. 2012a).

As regiões heterocromáticas tendem a ser mais conspícuas e

proeminentes em espécies derivadas quando comparadas com espécies

basais de ciclídeos neotropicais, estando predominantemente alocadas em

regiões centroméricas e pericentroméricas (Schneider et al. 2012a). Contudo,

algumas bandas heterocromáticas são visualizadas em C. monoculus, que é

um táxon basal e grupo irmão do ramo que engloba A. ocellatus. O clado que

abriga G. proximus tem posição intermediária e S. discus é agrupado em um

clado derivado (Smith et al. 2008).

O mapeamento físico cromossômico comparativo do Cot-1 DNA

utilizando sondas homólogas em C. monoculus e S. discus revelou que a

espécie basal apresenta a maior parte dos seus elementos repetitivos alocados

em pequenos blocos teloméricos e centroméricos, enquanto que a espécie

derivada apresenta grandes blocos centroméricos. Ou seja, as regiões

repetitivas isoladas da própria espécie não estão restritas às regiões

heterocromáticas em C. monoculus.

Ainda, a hibridização da fração repetitiva do DNA de C. monoculus nos

cromossomos das outras espécies mostrou o mesmo padrão encontrado na

hibridização homóloga, sugerindo que esta parte do genoma deve apresentar-

se conservada ao longo da evolução mantendo possíveis papéis funcionais. Já

a hibridização da fração repetitiva do DNA de S. discus nos cromossomos das

outras espécies mostrou que a compartimentalização destas sequências na

região centromérica ou pericentromérica é uma característica derivada, uma

vez que nas demais espécies estas sequências repetitivas apresentam-se

predominantemente dispersas nos cromossomos, ficando evidente que

90

espécies mais próximas filogeneticamente apresentam maior similaridade na

organização da fração repetitiva do genoma e que as sequências repetitivas

não são exclusivas de regiões heterocromáticas.

Processos de formação de heterocromatina são influenciados por

diversos fatores, entre eles a presença e quantidade de elementos repetitivos

de DNA, como clusters de DNA satélite e elementos transponíveis (Weiler e

Wakimoto 1995; Birchler et al. 2000; Grewal e Jia 2007). Contudo as

sequências repetitivas de DNA alocadas nesta região, provavelmente

desempenham papel relevante na biologia celular, estrutura genômica,

regulação da expressão gênica e evolução adaptativa (Ganley e Kobayashi

2007; Varriale et al. 2008; Bühler 2009; Schneider et al. 2012a). Porém, as

sequências repetitivas não estão restritas às regiões heterocromáticas e já

foram localizadas anteriormente em porções eucromáticas do genoma de

ciclídeos neotropicais (Teixeira et al. 2009; Schneider et al. 2012b), o que não

significa que estas estão sendo constantemente expressas, uma vez que

outras formas de inativação podem ocorrer, tais como RNA de interferência

(RNAi) onde pequenos RNAs agem silenciando a expressão pós-transcricional

(Fire et al. 1998; Djupedal et al. 2005; Jinek e Doudna 2009; Moazed 2009).

3.3.4.2 Diversidade dos DNAs repetitivos em ciclídeos

Independente das sequências repetitivas estarem alocadas em regiões

heterocromáticas ou eucromáticas, estas possivelmente estão envolvidas na

evolução dos grupos, tais como os DNAs satélites SATA e SATB, que foram

isolados do genoma de Oreochromis niloticus, espécie esta que pertence à

subfamília Pseudocrenilabrinae, clado irmão dos ciclídeos Neotropicais (Franck

e Wright 1993; Franck et al. 1994; Smith et al. 2008). O SATB não é tão

abundante no genoma de O. niloticus quanto o SATA, mas havia sido

encontrado apenas em espécies africanas proximamente relacionadas,

estando ausente no genoma de ciclídeos neotropicais (Franck e Wright 1993;

Franck et al. 1994). Entretanto, um clone de C. monoculus apresentou 85% de

identidade genética com este DNA satélite, mostrando assim uma conservação

de SATB com espécies basais dos ciclídeos neotropicais.

91

Dentre os ciclídeos neotropicais também foi possível verificar

similaridades entre DNAs satélites de espécies distantes filogeneticamente, tais

como clones isolados de S. discus (espécie derivada) que possuem

similaridade ao DNA satélite AoSAT isolado de A. ocellatus (Mazzuchelli e

Martins 2009), uma espécie que ocupa uma posição basal na filogenia dos

ciclídeos (Smith et al. 2008). Ainda, estes AoSAT apresentam similaridades

com famílias de satélites centroméricos de outras espécies de peixes,

evidenciando assim uma interessante conservação desta porção genômica. A

conservação de alguns DNAs satélites, em diferentes grupos ao longo do

tempo evolutivo, corrobora a hipótese que esta classe de DNA possa ter papel

regulatório em eucariotos. Entretanto, para compreender a complexa evolução

dos DNAs satélites é necessário a elucidação das bases moleculares que

afetam as mudanças nestas classes de DNA (Ugarkovic e Plohl 2002;

Ugarkovic 2005).

Além dos DNAs satélites, também foram encontrados microssatélites na

porção repetitiva do genoma das espécies estudadas. Os microssatélites

identificados apresentaram similaridade com sequências isoladas de diversas

espécies, entre elas A. ocellatus e S. discus (Amado et al. 2008; Sousa et al.

2009). Devido ao elevado grau de polimorfismo, sequências microssatélites são

comumente utilizadas em estudos populacionais, entretanto nos últimos anos,

o emprego destas sequências tem possibilitado inferências acerca da evolução

cariotípica (Schmidt e Heslop-Harrison 1996; Fillon et al. 1998; Jiang et al.

2011). Estudos futuros que visem mapear microssatélites nos cromossomos de

ciclídeos neotropicais, poderão auxiliar a compreender o papel destas

sequências na evolução cromossômica deste grupo de peixes.

Além dos DNAs repetidos em tandem, os que normalmente se

apresentam dispersos no genoma também têm sido mapeados no genoma dos

ciclídeos neotropicais. Entretanto, a maior parte dos estudos é focado em

retrotransposons não-LTR da família Rex (Mazzuchelli e Martins 2009; Gross et

al. 2009b; Teixeira et al. 2009; Valente et al. 2011; Schneider et al. 2012b). No

presente estudo diversas classes de TEs foram identificadas no genoma de C.

monoculus e S. discus e para ambas espécies as sequências mais abundantes

correspondem a retrotransposons não-LTR. Provavelmente, isto se deve ao

método de transposição destes elementos, pois transposons são excisados de

92

um sítio genômico e integrado a outro, por um processo de “corta e cola”,

enquanto retrotransposons são transcritos em um RNA intermediário copiado

em um cDNA por uma transcriptase reversa e integrado em uma nova região

genômica, dessa forma duplicando o elemento (Burt e Trivers 2006). Ainda, a

maior abundância de retrotransposons não-LTR pode estar associada ao fato

de que o mecanismo de retrotransposição é mais simples, se comparado aos

complexos processos dos retrotransposons LTR (para revisão veja Kazazian

2004).

Diferentes classes de retrotransposons não-LTR foram identificadas no

genoma de C. monoculus e de S. discus, tais como: MAUI, Expander, LINEs,

SINEs, Penelope, Poseidon e Rex. O retroelemento Rex vem sendo

amplamente estudado em peixes, onde diferentes linhagens foram descritas

(Volff et al. 2000). Em ciclídeos neotropicais estes TEs estão associados à

mobilização de sequências não autônomas, e eventos de transferência

horizontal parecem ter ocorrido durante a evolução destes peixes (Schneider et

al. 2012b). Por outro lado, esta é a primeira descrição do retroelemento MAUI

em ciclídeos neotropicais. Este TE foi descrito no genoma de Takifugu rubripes

e pertence ao grupo dos CR1 LINEs (long interspersed elements) (Poulter et al.

1999).

Uma classe específica do elemento LINE denominada CiLINE2 foi

isolada do genoma de Oreochromis niloticus e mapeamentos comparativos

entre os gêneros Oreochromis, Tilapia, e Sarotherodon mostraram padrão

diferencial de localização cromossômica (Oliveira et al. 1999). No presente

estudo foram identificadas sequências isoladas de S. discus que apresentaram

93% de similaridade com CiLINE2 de O. niloticus, mostrando uma manutenção

de sequências repetitivas mesmo em espécies distantes filogeneticamente.

Ainda, este mesmo padrão foi observado para as demais classes de DNAs

repetitivos isoladas, onde o genoma de S.discus apresentou maior quantidade

e diversidade de sequências repetitivas.

Os retrotransposons Penelope e Poseidon foram detectados na fração

repetitiva do genoma de S. discus, porém parecem estar ausentes em C.

monoculus. Contudo, esses retroelementos podem estar presentes no genoma

de C. monoculus e não terem sido amostrados, ou então terem sido eliminados

do genoma desta espécie. Ambos retroelementos, Penelope e Poseidon, são

93

formas ancestrais de retrotransposons presentes em diferentes espécies de

peixes. Penelope foi primeiramente identificado no genoma de Drosophila virilis

na qual apresenta papel importante na evolução cromossômica, onde os sítios

de inserções estão significativamente associados a rearranjos cromossômicos.

Entretanto, este retroelemento está ausente em espécies próximas como

Drosophila melanogaster (Evgen’ev et al. 2000; Volff et al. 2001b; Evgen’ev e

Arkhipova 2004).

As classes de transposons isolados do genoma de S. discus e C.

monoculus foram em sua maioria variantes de Tc1/mariner. Esta superfamília

de transposons é amplamente encontrada no genoma de diversas espécies de

peixes (Radice et al. 1994). A distribuição deste elemento em diferentes

espécies parece ter sido marcada por eventos de transferência horizontal,

devido a incongruências entre relações filogenéticas das espécies e do

transposon. Ainda, a maioria destes elementos é defeituosa em seu gene de

transposase devido a deleções, inserções ou substituições de bases levando a

terminação da matriz de leitura. Isto causa inativação do transposon, então

este elemento será um componente permanente do genoma do hospedeiro,

como um fóssil genético, acumulando diversas mutações (Ivics et al. 1996;

Leaver 2001; Pocwierz-Kotus et al. 2007). Provavelmente esta deve ser a

explicação para a grande diversidade do transposon Tc1, que foi isolados da

fração repetitiva de S. discus e C. monoculus. Ainda, em Cichla kelberi Tc1 foi

localizado em porções centroméricas e análises de sequências mostraram que

no genoma desta espécie estão presentes Tc1 e MITEs (miniature inverted

repeat transposable elements), os quais são um variantes deste transposon

(Teixeira et al. 2009).

Alguns clones de S. discus e de C. monoculus apresentaram

similaridade a dois tipos de sequência, tais como o clone Cm19 que mostrou

84% de identidade com Tc1 de Takigugu rubripes, quando feita a busca no

banco de dados Repbase (Jurka et al. 2005) e 90% de similaridade com parte

do gene Hox de Astatotilapia, quando feita a busca com sequências

depositadas no GenBank. O gene Hox codifica fatores de transcrição que em

metazoários, irão especificar segmentos do corpo ao longo do eixo antero-

posterior. Este gene ocorre em clusters, os quais foram gerados por séries de

duplicações em tandem em um gene ancestral (Stellwag 1999; Ravi et al.

94

2009). Estudos indicam que muitas espécies de peixes apresentam cópias não

funcionais deste gene, com presença de stop códons em alguns clusters

(Hoegg et al. 2007). Por outro lado, a participação de TEs na evolução do gene

Hox já foi descrita em vertebrados (Di-Poï et al. 2009), mostrando assim

complexa relação entre TEs e o genoma do hospedeiro.

Ainda, o clone de S. discus Sd25 apresentou similaridade tanto com

Rex1 em busca realizada no Repbase, quanto com segmento do gene vasa em

busca no GenBank. Este gene desempenha um papel essencial no

desenvolvimento de linhagens de células germinativas (Raz 2000) e

acreditava-se, que em Oreochromis niloticus, este gene era cópia única com

diferentes isoformas geradas por splicing alternativos (Kobayashi et al. 2002).

Entretanto, estudos recentes têm mostrado que o gene vasa é composto ao

menos por três cópias: uma original que foi duplicada gerando duas cópias

adicionais. Ainda, foi encontrado um fragmento de um Expander, um

retrotranspon não-LTR junto a uma destas cópias, o qual pode ter mediado a

duplicação de um locus do gene vasa em O. niloticus (Fujimura et al. 2011).

Assim, é possivel que o retrotransposon não-LTR Rex1 possa ter atuado na

evolução do gene vasa em S. discus, tal qual Expander atuou em O. niloticus,

porém análises adicionais são necessárias.

A utilização Cot-1 DNA foi eficiente para estudar a fração repetitiva do

genoma de C. monoculus e S. discus e evidenciou uma ampla gama de

sequências repetitivas inéditas para ciclídeos neotropicais, bem como, foi

possível verificar que espécies mais próximas filogeneticamente, apresentam

maior similaridade na organização da fração repetitiva nos cromossomos.

Ainda, foi possível verificar a interessante similaridade entre sequências

gênicas e elementos transponíveis, cuja interpretação é complexa. Entretanto,

podemos inferir que estes elementos repetitivos tiveram papel fundamental na

evolução genômica deste grupo de peixes e estudos futuros que venham a

sequenciar o genoma total de ciclídeos neotropicais poderão gerar subsídios

para avançar no entendimento da composição, organização e evolução

genômica deste grupo de peixes.

95

3.4 Artigo 4 – Distribuição de sequências microssatélites em cromossomos de ciclídeos amazônicos

\

96

3.4.1 Introdução

Cichlidae é uma das famílias mais ricas em espécies de peixes de todo

mundo, com aproximadamente 3.000 espécies distribuídas na América Central

e do Sul, África, Madagascar e sul da Índia (Kullander 1998; Kocher 2004). A

evolução deste grupo é marcada por repetidos eventos de radiação adaptativa

e especiações simpátricas (Schliewen et al. 1994; Seehausen 2006) e estes

peixes são reconhecidos como excelente modelo para estudos evolutivos

devido a diversidade de nichos explorados, bem como adaptações

morfológicas e comportamentais (Lowe-McConnell 1991). Na região

Neotropical cerca de 400 espécies já foram descritas e estas se distribuem por

uma gama de hábitats, sendo que a maior diversidade encontra-se na região

Amazônica, com mais de 300 espécies descritas (Kullander 2003).

Em ciclídeos neotropicais a diversidade de formas e adaptações

morfológicas não é reflexo de variações no número diploide, uma vez que a

grande maioria possui 48 cromossomos (Feldberg et al. 2003). Contudo, as

espécies deste grupo apresentam um genoma dinâmico, com variação na sua

estrutura, composição e organização cariotípica evidenciadas pelo

sequenciamento de DNA e mapeamento físico cromossômico de diferentes

sequências de DNA repetitivo, tais como sequências teloméricas,

retrotransposons Rex1, Rex3, Rex6, AoRex3, AoLINE e RCk, transposons Tc1

e sequências gênicas de RNAs ribossomais 18 e 5S, bem como U1 snRNAs

(Vicari et al. 2006; Gross et al. 2009b; Mazzuchelli e Martins, 2009; Teixeira et

al. 2009; Gross et al. 2010; Poletto et al. 2010b; Cabral-de-Mello et al. 2011;

Valente et al. 2011; Schneider et al. 2012a; Schneider et al. 2012b). Além

disso, DNAs repetitivos, tais como elementos transponíveis, estão co-

localizados ou associados com DNAs ribossomais neste grupo de peixes e

parecem estar atuando em processos de duplicação e dispersão das

repetições de DNAr (Gross et al. 2010; Schneider et al. 2012a; Schneider et al.

2012b; Nakajima et al. 2012).

As sequências de DNA repetitivo apresentam um elevado grau de

polimorfismo devido a variação no número de unidades de repetição,

consequência da sua particular dinâmica evolutiva. Contudo, dentre estes

elementos os microssatélites (ou Short Tandem Repeat) são os mais

97

polimórficos, sendo estes formados por pequenas sequências com 1 a 6

nucleotídeos, repetidas em tandem e encontradas ao longo do DNA (Tautz e

Renz 1984). Estes marcadores moleculares têm sido muito utilizados em

genética de populações, na identificação de limites taxonômicos e casos de

hibridização, bem como na análise forense devido a uma suposição implícita de

que estes evoluem de forma neutra (Goldstein e Pollock 1997; Filcek et al.

2005; Racey et al. 2007; McCusker et al. 2008). No entanto, estudos recentes

têm identificado que alguns microssatélites são funcionais e podem afetar a

regulação de genes (Kashi e King 2006; Gemayel et al. 2010), assim como

estarem envolvidos com rearranjos cromossômicos (Kamali et al. 2011).

A utilização do mapeamento físico de sequências microssatélites em

cromossomos tem sido pouco explorada, sendo esta abordagem

principalmente aplicada para o entendimento da evolução de diferentes

sistemas cromossômicos de determinação sexual (Li et al. 2010; Pokorná et al.

2011; Terencio et al. 2012b). Levando-se em conta que microssatélites

representam o componente mais dinâmico do genoma, o entendimento da sua

organização nos cromossomos mostra-se promissora, no sentido de avançar

no conhecimento do papel dos elementos repetitivos de DNA nos mecanismos

de evolução cromossômica. Dessa forma, sequências microssatélites foram

mapeadas em cromossomos de três espécies de ciclídeos neotropicais (Cichla

monoculus, Pterophyllum scalare e Symphysodon discus) que ocupam

diferentes posições filogenéticas visando uma melhor compreensão da

organização e evolução cromossômica neste grupo de peixes.


Foram analisados exemplares de Cichla monoculus (4 machos e 4

fêmeas), Pterophyllum scalare (3 machos e 3 fêmeas) e Symphysodon discus

(2 machos e 3 fêmeas) coletados no rio Negro. As coletas foram realizadas

com autorização do ICMBio SISBIO 10609-1/2007. Todos os indivíduos foram

anestesiados em água gelada até a morte. Os cromossomos mitóticos foram

obtidos pela técnica de “air drying” (Bertollo et al. 1978).

98


Oito microssatélites (Amado et al. 2008; Passos et al. 2010) foram

mapeados por hibridização fluorescente in situ (FISH) em metáfases mitóticas

de Cichla monoculus, Pterophyllum scalare e Symphysodon discus (Tabela 1).

As sequências microssatélites foram marcadas com Digoxigenina-11-dUTP e

Biotina-16-dUTP (Dig-Nick Translation mix e Biotin-Nick Translation mix;

Roche), por reações de nick translation, conforme instruções do fabricante. O

anticorpo anti-digoxigenina rodamina (Roche) e a estreptavidina (Life

Technologies) foram utilizados para detectar o sinal da FISH, realizada

seguindo o protocolo de Pinkel et al. 1986. As hibridizações foram feitas com

77% de estringência (2,5 ng/µL de DNA, 50% formamida, 10% sulfato de

dextrano, e 2x SSC a 37 °C por 18 h). Os cromossomos foram contra corados

com DAPI (2 mg/ml) em meio de montagem VectaShield (Vector).

3.4.3 Resultados

Quatro microssatélites apresentaram marcações positivas no genoma de

Cichla monoculus, sendo quatro dinucleotídicos e um pentanucleotídico

(Tabela 1). Hibridizações com o microssatélite pentanucleotídico (GAATA)8

mostraram sinais dispersos em todos os cromossomos e marcações

conspícuas foram verificadas em alguns pares. Contudo, um par não

apresentou nenhuma homologia com a sonda (Figura 1a). O microssatélite

(CA)16 apresentou-se distribuído em todos os cromossomos de C. monoculus,

com exceção de um par. A maioria dos cromossomos apresentou o

microssatélite distribuído de forma dispersa, sendo que em alguns

cromossomos as marcações foram conspícuas (Figura 1b). Padrão disperso foi

verificado quando foi hibridizado o microssatélite (GT)13, entretanto sinais fortes

em porções teloméricas, intersticiais e/ou centroméricas foram visualizadas nos

cromossomos (Figura 1c). Por outro lado, hibridizações utilizando o

microssatélite (AC)7 evidenciaram apenas dois pares marcados, um com

marcações na região telomérica do braço curto e na região intersticial do braço

longo e o outro com ambas regiões teloméricas marcadas (Figura 1d).

99

Tabela 1 Sequências dos microssatélites hibridizados nos cromossomos dos

ciclídeos. (+) presença de sinal de hibridização; (-) ausência de sinal de

hibridização.

Motivo de repetição C. monoculus P. scalare S. discus (CA)16 + + + (AC)7 + - - (GT)13 + + - (GA)12 - + -

(GAATA)8 + + + (GAGAA)12 - + -

(GT)9CA(GT)7CG(GT)19 - - + (CT)14GT(GT)5(CG)2(CT)9 - - +

Com relação a Pterophyllum scalare, cinco microssatélites foram

mapeados no genoma desta espécie: três dinucletídicos e dois

pentanucleotídicos (Tabela 1). Os microssatélites (GAATA)8, (CA)16 e (GT)13,

que se apresentaram dispersos em C. monoculus, apresentaram sinais

compartimentalizados em P. scalare. O microssatélite (CA)16 foi mapeado em

blocos centroméricos de cinco pares cromossômicos (Figura 1f), enquanto os

demais foram localizados em porções teloméricas, centroméricas e intersticiais

na maioria dos cromossomos (Figura 1e e 1g). Ainda, os microssatélites (GA)12

e o (GAGAA)12 apresentaram padrões semelhantes com marcações

conspícuas nos centrômeros, entretanto com (GAGAA)12 um par cromossômico

não apresentou marcação (Figura 1h e 2i).

Quatro microssatélites foram mapeados em Symphysodon discus. Os

microssatélites (GAATA)8 e (CA)16 apresentaram padrões similares a C.

monoculus, com sinais dispersos e com algumas marcações conspícuas na

região centromérica (Figura 1j e 1k). Apenas um par cromossômico apresentou

marcações com os microssatélites (GT)9CA(GT)7CG(GT)19 e

(CT)14GT(GT)5(CG)2(CT)9, entretanto o primeiro foi localizado na região

telomérica do braço longo e o segundo em regiões centroméricas e teloméricas

(Figura 1l e 1m).

101

Figura 1 Cromossomos metafásicos de C. monoculus, P. scalare e S. discus

hibridizados com sequências microssatélites (a – m). Setas evidenciam

ausência de sinais de hibridizações. Os cromossomos foram contra corados

com DAPI.

3.4.4 Discussão

A fração repetitiva do genoma normalmente escapa da pressão seletiva

que atua sobre os segmentos não-repetitivos e a maior parte das sequências

microssatélites evolui de forma neutra, não afetando o fenótipo dos indivíduos

(Schlötterer 2000). No entanto, estudos recentes têm identificado

microssatélites funcionais que afetam a forma física de um indivíduo (Kashi e

King 2006; Gemayel et al. 2010). Estes microssatélites putativamente

funcionais estão localizados principalmente em regiões gênicas ou perto delas

e há alteração do número de vezes que o motivo é repetido, estando esta

repetição relacionada à capacidade de modificar a expressão do gene ou

ocasionar uma mudança na sequência de proteínas (Wren et al. 2000; Li et al.

2004; Vinces et al. 2009; Gemayel et al. 2010). Além deste aspecto funcional,

os variantes de DNAs repetitivos incluindo microssatélites podem ser agentes

eficientes de evolução adaptativa (King e Kashi 2009).

Para todas as classes de DNA repetitivo, parece haver uma tendência

geral para o aumento no comprimento da matriz no tempo evolutivo. As

sequências altamente repetitivas tendem ainda a acumular-se nas regiões de

baixa recombinação, como centrômeros e telômeros, enquanto que as

repetições que ocorrem na eucromatina são muito mais susceptíveis a

crossing-over (Pathak e Ali 2012).

De maneira geral, a hibridização cromossômica dos microssatélites

evidenciou padrões contrastantes de abundância e localização destas

sequências nos cromossomos de Cichla monoculus, Pterophyllum scalare e

Symphysodon discus, ficando evidente que estas sequências repetitivas se

acumularam diferencialmente no genoma destas espécies.

Apesar das três espécies apresentarem ampla distribuição dos

microssatélites (GAATA)8 e (CA)16 no seu genoma, maior

102

compartimentalização destes marcadores foi evidenciada em P. scalare, que é

uma espécie derivada na filogenia de Cichlinae (Smith et al. 2008). Esta

compartimentalização de sequências repetitivas em espécies derivadas

também foi evidenciada em elementos transponíveis para este grupo de peixes

(Gross et al. 2009b; Valente et al. 2011; Schneider et al. 2012b). A associação

entre microssatélites e abundância de elementos retrotransponíveis já foi

proposta como um dos mecanismos que pode gerar aumento nos

microssatélites (Nadir et al. 1996), entretanto, em muitos organismos, não há

uma relação entre alta densidade de elementos transponíveis e elevada taxa

de microssatélites.

As sequências microssatélites mapeadas no presente trabalho,

apresentaram localização similar ao padrão descrito para retroelementos nas

mesmas espécies, com algumas marcações dispersas ao longo dos

cromossomos e outras compartimentalizadas em regiões terminais e

centroméricas (Schneider et al. 2012b), o que indica que estas sequências

podem estar envolvidas na formação estrutural do centrômero e telômero. Além

disso, os microssatélites presentes nas regiões centroméricas e subteloméricas

são diferentes entre as espécies de ciclídeos, o que ressalta a importância

destas sequências na evolução deste grupo.

O centrômero é uma estrutura essencial, que tem vários papéis

funcionais para a segregação dos cromossomos replicados para as células

filhas. Esses papéis incluem marcação genética/epigenética e montagem do

complexo proteico do cinetócoro durante o ciclo celular, pontos de controle da

mitose, coesão e liberação das cromátides irmãs, migração cromossômica para

os pólos celulares e citocinese (Santaguida e Musacchio 2009; Allshire e

Karpen 2008; Perpelescu e Fukagawa 2011). Centrômeros são compostos por

longos trechos de repetições em tandem de DNA satélites e microssatélites,

fundamentais para ligação com complexos proteicos (Verdaasdonk e Bloom

2011; Kalitsis e Choo 2012). A região centromérica dos cromossomos de P.

scalare é rica em sequências microssatélites e a composição desta região

cromossômica é variável, uma vez que todos os centrômeros desta espécie

apresentaram sinais de hibridização com o microssatélite (GA)12, mas quando

foi utilizada a sonda (GAGAA)12 um par não apresentou sinal de hibridização.

Ainda, em Cichla monoculus e Symphysodon discus a região centromérica não

103

é rica em (GA)12 e (GAGAA)12. Isso ocorre porque as sequências de DNA

centromérico normalmente possuem elevada taxa de evolução e é comum a

variação entre espécies e até mesmo entre cromossomos da mesma espécie

(Plohl et al. 2008).

Outra região cromossômica que apresenta alta taxa de evolução é a

subterminal dos cromossomos. Normalmente esta região é formada por

diferentes classes de DNA repetitivo, as quais podem auxiliar na estabilização

da porção final dos cromossomos devido a possibilidade de amplificação

destas sequências, mesmo na ausência de telomerase (Jain et al. 2010; Torres

et al. 2011). Em S. discus, são evidenciados na região subterminal de dois

pares de cromossomos os microssatélites (GT)9CA(GT)7CG(GT)19 e

(CT)14GT(GT)5(CG)2(CT)9, os quais não são verificados nos cromossomos de

C. monoculus e P. scalare. O mesmo ocorre com o microssatélite (AC)7 que é

evidenciado apenas em C. monoculus. Já os microssatélites (GAATA)8 e (GT)13

aparecem em regiões subterminais de Cichla monoculus e P. scalare, mas não

são encontrados nesta região em Symphysodon discus. Ainda, em P. scalare,

uma marcação conspícua do microssatélite (GT)13 foi evidenciada na região

terminal no maior par cromossômico, local onde fica localizado o sítio do gene

ribossomal 18S (Schneider et al. 2012a), mostrando assim sintenia entre esta

duas classes de DNA repetitivo.

Além das diferentes sequências que compõem as regiões centroméricas

e teloméricas nos ciclídeos neotropicais, ressalta-se que as sequências

repetitivas não são exclusivas de regiões heterocromáticas (Schneider et al.

2012c). Muitas marcações em regiões eucromáticas foram verificadas com

vários microssatélites, sugerindo que estas podem ter desempenhado papel na

evolução deste grupo de peixes, bem como pode ser possível que estas

sequências tenham alguma função no genoma dos ciclídeos neotropicais.

Nossos dados de mapeamentos comparativos geraram novas informações

acerca da estrutura e organização da porção repetitiva do genoma dos

ciclídeos, contribuindo ainda para o entendimento da composição genômica

destes peixes.

104

4 Conclusões Gerais

A evolução cromossômica dos ciclídeos neotropicais é marcada por

eventos de rearranjos cromossômicos, entretanto nenhuma tendência quanto

aumento, manutenção ou diminuição do número diploide foi verificada, pois

estes eventos ocorrem independentemente nas diferentes tribos de Cichlinae.

A distribuição dos retroelementos Rex1, 3 e 6 no genoma dos ciclídeos

sugere que estes retroelementos estão sob mecanismos evolutivos que tendem

à acumula-los em regiões cromossômicas específicas, principalmente em

heterocromatinas.

Duas linhagens evolutivas de Rex1 foram evidenciadas no genoma dos

exemplares analisados.

As sequências nucleotídicas de Rex1 e 3 foram mais conservadas em

espécies basais como C. monoculus, que em derivadas como S. discus.

Elevadas taxas de substituições nucleotídicas foram verificadas no

retroelemento Rex6 nas espécies analisadas.

A evolução genômica dos ciclídeos neotropicais foi marcada por eventos

de transferência horizontal, surgimento ou eliminação de linhagens de

elementos transponíveis.

Espécies mais próximas filogeneticamente apresentam maior

similaridade na organização da fração repetitiva nos cromossomos.

A fração repetitiva do genoma de S. discus (espécie derivada) apresenta

maior diversidade de sequências quando comparada à de uma espécie basal

(C. monoculus).

105

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