instituto de biologia - unicamprepositorio.unicamp.br/bitstream/reposip/336215/1/marco...apresenta...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Instituto de Biologia
EMÍLIO MARCONATO JÚNIOR
EFEITOS DO TREINAMENTO FÍSICO E DA METFORMINA SOBRE A
FUNÇÃO DA CÉLULA BETA PANCREÁTICA
CAMPINAS
2019
EMÍLIO MARCONATO JÚNIOR
EFEITOS DO TREINAMENTO FÍSICO E DA METFORMINA SOBRE A
FUNÇÃO DA CÉLULA BETA PANCREÁTICA
Dissertação apresentada ao Instituto de
Biologia da Universidade Estadual de
Campinas como parte dos requisitos
exigidos para a obtenção do título de Mestre
em Biologia Funcional e Molecular, na área
de Fisiologia
Orientador: Helena Cristina de Lima Barbosa Sampaio
CAMPINAS
2019
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À
VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA
PELO ALUNO EMÍLIO MARCONATO JÚNIOR E
ORIENTADO PELA HELENA CRISTINA DE LIMA
BARBOSA SAMPAIO
Campinas, 02 de Agosto de 2019
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. (a) Dra. Helena Cristina de Lima Barbosa Sampaio
Prof. (a) Dr. Cesar Renato Sartori
Prof. (a) Dra. Marta García-Arévalo Provencio
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no
SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa de Pós
Graduação de Biolgia Funcional e Molecular do Instituto de Biologia.
AGRADECIMENTOS
O presente trabalho foi realizado com apoio da Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico – BRASIL (CNPq) – Processo Nº
134603/2017-6 – fornecendo a bolsa de estudos de Mestrado.
À Fundação de Amparo À Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), processos
Nº 2012/14993-9, 2015/12611-0 e CEPID-OCRC, pelo financiamento do projeto de
pesquisa, tornando possível a produção dessa Dissertação.
O presente trabalho foi relaizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento
de Pessoal de Nivel Superior – Brasil (CAPES) – Codigo de finacioamento 001.
Aos professores, colaboradores, colegas de laboratório, funcionários e todos os
demais que possibilitaram e participaram dessa minha etapa de formação.
RESUMO
Introdução: A obesidade é caracterizada pela expansão do tecido adiposo acarretada pela
sobrecarga calórica, caracterizando um estado inflamatório crônico de baixo grau. Este
ambiente inflamatório influencia os tecidos periféricos, levando à resistência à insulina,
além de levar a uma hipersecreção de insulina pelas células beta pancreáticas. O estresse
de retículo endoplasmático (RE) é um dos mecanismos relacionados ao declínio
progressivo da função e massa da célula beta no diabetes mellitus tipo 2 (DM2). O
treinamento físico tem mostrado melhora da ação da insulina em humanos, além de
diminuir a hipersecreção de insulina estimulada por glicose, com melhora de vários
aspectos relacionados à função da célula beta e da ilhota pancreática. A metformina, uma
droga muito utilizada para o tratamento de diversos distúrbios do metabolismo glicêmico,
apresenta ações na célula beta pancreática, porém pouco se sabe sobre seus efeitos.
Metodologia: Para isto, camundongos C57BL/6 foram divididos em 4 grupos:
alimentados com dieta padrão; alimentados com dieta padrão e que foram submetidos ao
treinamento físico; grupo de animais alimentados com dieta hiperlipídica; e o grupo que
recebeu dieta hiperlipídica e foram submetidos ao treinamento. O tempo de dieta e
treinamento foi de 16 semanas. Nos tratamentos in vitro, células INS-1E foram expostas
a droga estressora CPA e tratadas com metformina. Foram avaliados a homeostase
glicêmica dos camundongos, bem como os transdutores de estresse de RE, os quais
também foram avaliados nas células INS-1E. Resultado: Neste trabalho, observamos a
melhora da homeostase glicêmica e diminuição dos transdutores canônicos do estresse de
RE em camundongos que foram submetidos a uma dieta hiperlipídica e ao treinamento
em esteira, comparados com camundongos obesos, que receberam a dieta hiperlipídica.
O tratamento com metformina em células INS-1E expostas ao CPA foi capaz de prevenir
o estresse de RE, com aumento de expressão gênica e proteica do fator de transcrição
PDX-1. Conclusão: Concluímos que nosso programa de treinamento físico se mostrou
pelo menos parcialmente eficaz contra os efeitos deletérios da obesidade, bem como da
disfunção da ilhota pancreática, através da prevenção do estresse de RE. Ainda, o uso da
metformina preveniu o estresse de RE em células INS-1E devido, em parte, ao aumento
da expressão de Pdx-1, sugerindo que o mecanismo de ação desta droga em células betas
pancreáticas deve envolver este fator de transcrição.
ABSTRACT
Background: Obesity is characterized by the expansion of adipose tissue caused by
caloric overload, characterizing a low-grade chronic inflammatory state. This
inflammatory environment influences the peripheral tissues, leading to insulin resistance,
in addition to leading to a hypersecretion of insulin by pancreatic beta cells. Endoplasmic
reticulum (ER) stress is one of the mechanisms related to the progressive decline of
function and beta cell mass in type 2 diabetes mellitus (DM2). Physical training has been
shown to improve insulin action in humans, as well as to decrease glucose-stimulated
insulin hypersecretion, with improvement of several aspects related to beta-cell and
pancreatic islet function. Metformin, a widely used drug for the treatment of various
disorders of glycemic metabolism, presents actions in the pancreatic beta cell, but little is
known about its effects. Methods: For this, C57BL/6 mice were divided in 4 groups: fed
with standard diet; fed with standard diet and who underwent physical training; group of
animals fed a high fat diet; and the group that received a high fat diet and were submitted
to training. Diet and training time was 16 weeks. For in vitro treatments, INS-1E cells
were exposed to the CPA, a stress drug, and treated with metformin. We analyzed the
glucose homeostasis of mice, as well as the ER stress transducers in pancreatic islets; ER
stress signaling was also evaluated in INS-1E cells. Results: In this study, we observed
the improvement of glucose homeostasis and reduction of canonical stress transducers of
RE stress in mice that were submitted to a high fat diet and to treadmill training, compared
to obese mice, who received the high fat diet. Treatment with metformin in INS-1E cells
exposed to CPA was able to prevent the stress of RE, with increased gene and protein
expression of the transcription factor Pdx-1. Conclusion: We concluded that our physical
training program was, at least partially, effective against the deleterious effects of obesity,
as well as pancreatic islet dysfunction, through the prevention of ER stress. Furthermore,
the use of metformin prevented ER stress in INS-1E cells due, in part, to increase in Pdx-
1 expression, suggesting that the mechanism of action of this drug in pancreatic beta cells
should involve this transcription factor.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Transdução de sinal de estresse de RE...........................................................17
Figura 2: Evolução do peso corporal, área sob a curva do peso corporal e ganho de
peso..................................................................................................................................26
Figura 3: Peso do tecido adiposo retroperitoneal, Inguinal, Perigonadal e Marrom. Peso
do musculo gastrocnêmio................................................................................................27
Figura 4: Curva glicêmica do teste de tolerância à glicose e área sob a curva. Curva
glicêmica do teste de tolerância a insulina, área sob curva e cálculo da constante de
decaimento da glicose......................................................................................................29
Figura 5: Glicemia e insulinemia de jejum. Secreção estática de insulina em ilhotas
isoladas e conteúdo total de Insulina...............................................................................30
Figura 6: Análise da expressão gênica de Chop, Xbp1, Atf4, Bip, Ins2 e Pdx-1............32
Figura 7: Expressão gênica de Chop e Bip em células INS-1E expostas a CPA...........33
Figura 8: Expressão proteica de CHOP e PDX-1 em células INS-1E expostas ao CPA
tratadas com metformina e AICAR.................................................................................35
Figura 9: Expressão genica de Chop, Xbp1, Atf4, Bip, Serca2b e Pdx-1, em células INS-
1E na exposição ao CPA e tratadas com a droga metformina.................................37
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 11
1.1. Ilhota pancreática e célula beta ................................................................................... 11
1.2. Homeostase glicêmica ................................................................................................. 11
1.3. Obesidade e resistência à insulina..............................................................................11
1.4. Estresse de retículo endoplasmático ............................................................................ 14
1.5. Estresse de retículo endoplasmático e célula beta pancreática .................................... 18
1.6. Estresse de retículo e Pdx-1 ........................................................................................ 18
1.7. AICAR, metformina e célula beta ............................................................................... 18
1.8. Treinamento físico....................................................................................................... 20
2. OBJETIVOS ........................................................................................................................... 21
3. METODOLOGIA .................................................................................................................... 22
3.1. Animais ....................................................................................................................... 22
3.2. High Fat-Diet .............................................................................................................. 22
3.3. Exercício ..................................................................................................................... 22
3.4. Isolamento de ilhota pancreática e secreção estática de insulina ................................ 22
3.5. Teste intraperitoneal de tolerância à glicose (ipGTT) ................................................. 23
3.6. Teste intraperitoneal de tolerância à insulina (ipITT) ................................................. 23
3.7. Cultura de células INS-1E ........................................................................................... 23
3.8. Western Blotting ......................................................................................................... 24
3.9. PCR quantitativo ......................................................................................................... 24
3.10. Análise estatística ........................................................................................................ 24
4. RESULTADOS ....................................................................................................................... 25
4.1. O treinamento reduz o ganho de peso de animais alimentados com dieta hiperlipídica
25
4.2. O treinamento reduz o peso de tecidos adiposos em animais alimentados com dieta
hiperlipídica ............................................................................................................................. 26
4.3. Melhora da homeostase glicêmica em animais obesos treinados ................................ 28
4.4. Treinamento físico reduz glicemia de jejum e secreção e conteúdo de insulina em
camundongos obesos ............................................................................................................... 30
4.5. Avaliação da expressão de marcadores de estresse de RE, insulina e Pdx-1 em ilhotas
pancreáticas ............................................................................................................................. 31
4.6. Curva Dose-Resposta de exposição ao CPA em células INS-1E ................................ 33
4.7. Expressão proteica de CHOP e PDX-1 com a exposição ao CPA e tratamento com
metformina e AICAR .............................................................................................................. 34
4.8. Marcadores de estresse de RE em células INS-1E expostas ao CPA e tratadas com
metformina .............................................................................................................................. 36
5. DISCUSSÃO .......................................................................................................................... 38
5.1. Treinamento físico....................................................................................................... 38
5.2. Tratamento de células INS-1E com metformina ......................................................... 41
6. CONCLUSÕES ....................................................................................................................... 43
7. REFERENCIAS ....................................................................................................................... 44
Anexo 1 ........................................................................................................................................ 50
Ingredientes ............................................................................................................................. 50
Dieta controle .......................................................................................................................... 50
Dieta hiperlipídica ................................................................................................................... 50
Caseína (84% de proteína)* ................................................................................................ 50
Mistura de sais AIN93G** .................................................................................................. 50
Anexo 2 ........................................................................................................................................ 51
Anexo 3 ........................................................................................................................................ 52
11
1. INTRODUÇÃO
1.1. Ilhota pancreática e célula beta
As ilhotas pancreáticas são aglomerados de células que foram descobertas pelo
Dr. Paul Langerhans 1. Cada ilhota é composta por milhares de células endócrinas e juntas
elas consistem em 2% da massa pancreática total, esses aglomerados de células na ilhota
incluem as células Alfa, células beta, células delta, células épsilon e células do
polipeptídio pancreático. Cada célula libera um hormônio específico em respostas aos
diversos sinais que o organismo pode emitir 2. Em roedores, cada ilhota é composta em
sua maior parte por células betas, que se encontram no núcleo da ilhota, cercado por uma
camada de células alfa, delta, épsilon e polipeptídio pancreático, porém existem variações
entre ilhotas de diferentes tamanhos. Em geral as células betas constituem 60% da massa
das ilhotas, já as células alfas comportam 30%, e as células épsilon e polipeptídio
pancreático 10%. As ilhotas pancreáticas se conectam a um feixe neurovascular que as
irriga e as enerva, através do núcleo central, onde estão as células beta 3.
Cada célula da ilhota pancreática secreta um hormônio específico. As células alfa
secretam o glucagon, um hormônio que aumenta as concentrações de glicose e ácidos
graxos na corrente sanguínea, sendo o principal hormônio catabólico do organismo. As
células beta secretam o hormônio insulina, que diminui as concentrações de glicose pelo
fígado, músculo esquelético e tecido adiposo pela sua sinalização de receptores
específicos. As células delta liberam o hormônio somatostatina, ele inibe a secreção de
glucagon e insulina pelas células alfa e beta. As células épsilon secretam um hormônio
chamado grelina, que estimula o apetite, aumenta a estocagem de gordura e sinaliza a
pituitária para a secreção do hormônio do crescimento. As células do polipeptídio
pancreático secretam seu hormônio, o qual tem seus efeitos sobre a saciedade, além de
diminuir a secreção de ácido gástrico, o esvaziamento gástrico e motilidade intestinal. A
comunicação dessas células é fundamental para geração das repostas celulares, e se dá
através de espaços extracelulares e junções comunicantes, que influenciam na secreção
dos diversos hormônios 4.
1.2. Homeostase glicêmica
Como já mencionado, é o conjunto de células que regulam e ajudam a controlar
as concentrações de glicose no sangue através da secreção de seus hormônios. Portanto
uma disfunção das mesmas pode resultar em um prejuízo na homeostase glicêmica,
12
podendo levar ao desenvolvimento do Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) 5 6. Merece
destaque o hormônio insulina, sua secreção é controlada constantemente de acordo com
os sinais neurais, hormonais e principalmente pela concentração de glicose plasmática 7
8. A glicose que esta no sangue é absorvida pelo transportador de glicose do tipo 2
(GLUT2) que se encontra na superfice da membrana plasmática das células beta 9. No
interior da célula, a glicose é fosforilada pela enzima glicoquinase (GCK) em glicose-6-
fosfato e metabolizada gerando ATP, levando ao aumento da razão ATP/ADP
intracelular. Esse aumento da razão leva o fechamento de canais de K+ sensíveis ao ATP,
presentes na membrana da célula beta 10. Em condições basais, esses transportadores estão
abertos, mantendo o potencial elétrico de repouso da membrana celular, atraves do efluxo
de ions K+. Com o fechamento desses canais, e consequentemente a diminuição do efluxo
de K+, o potencial de repouso é alterado, levando à despolarização da membrana celular.
Com isso, ocorre a abertura de canais de Ca2+ dependentes de voltagem, facilitando e
permitindo o influxo de Ca2+. O aumento de concentrações de Ca2+ intracelular
desencadeia maior atividade da maquinaria exocítica, levando a fusão de grânulos
contendo insulina com a membrana plasmática e subsequente liberação de seu conteúdo
no meio extracelular e na corrente sanguínea 11 9.
A insulina transportada pelo sangue se liga às células alvo ativando um receptor
proteico de membrana. O receptor da insulina é constituído de quatro subunidades que
são unidas por meio de ligações dissulfeto, contendo duas subunidades alfa externas à
membrana celular e duas subunidades beta que adentram através da membrana,
projetando-se no citoplasma celular 12 13. As subunidades alfa do lado externo da célula
compreendem a região em que a insulina se liga, promovendo a autofosforilação das
subunidades beta. A autofosforilação do receptor leva à sua ativação tirosina quinase,
recrutando outras moléculas intracelulares, incluindo os substratos do receptor da insulina
(IRS) 14. A fosforilação do IRS irá promover ativação duas outras proteínas a
fosfatidilinositol 3-kinase (PI3K) e a proteína quinase B (PKB) ou AKT. A AKT ativa é
capaz de fosforilar vários outros substratos em resíduos de serina ou treonina, como o
fator de transcrição Forkhead box O (FOXO), Tuberous Sclerosis Complex 2 (TSC2) ,
Glycogen synthase kinase 3 beta (GSK3-beta) e TBC1 domain family member 4
(TBC1D4) também conhecida como proteína substrato da AKT de 160 kDa (AS160) 15.
Essas proteínas promovem os efeitos da insulina na produção, utilização e captação de
glicose, síntese de glicogênio, de proteínas e lipídeos. Outra via através da qual a insulina
13
atua é a da Ras-mitogen-activated protein kinase (MAPK), exercendo efeitos sobre o
mecanismo de controle do crescimento e diferenciação celular 16.
A insulina age em diversos tecidos, incluindo músculo, fígado e tecido adiposo,
estabelecendo o controle glicêmico do organismo. No fígado, a insulina tem como
principal função inibir produção de glicose hepática, inibindo as enzimas glicose-6-
fosfatase (G6P) e fosfoenolpiruvato carboxilase (PEPCK). Já no músculo e no tecido
adiposo, o efeito final da sinalização da insulina leva à translocação do transportador de
glicose do tipo 4 (GLUT4), levando para a membrana celular, permitindo assim, a
captação de glicose, e seu armazenamento na forma de substrato energético 17 18. Além
disso, a insulina apresenta um importante papel central, agindo no hipotálamo, resultando
na redução do consumo alimentar e na inibição de neurônios orexígenos 19; esses efeitos
estão associados à ativação de duas vias de sinalização, a AKT/FOXO1 e Janus kinase
2/Signal transducer and activator of transcription 3 (JAK2/STAT3) 20.
1.3. Obesidade e resistência à insulina
A obesidade é caracterizada pela expansão do tecido adiposo frente à sobrecarga
calórica, levando, ainda, ao desenvolvimento de um estado inflamatório crônico de baixo
grau, associado à infiltração de células imunes. As citocinas pró-inflamatórias liberadas
geram um ambiente inflamatório, que afeta os tecidos periféricos, repercutindo em uma
série de fenômenos que levam à resistência a insulina 21. A sobrecarga calórica é um fator
que leva, ainda, à hipersecreção de insulina pelas células beta pancreáticas. Esse aumento
exacerbado de secreção de insulina contribui para as disfunções associadas à célula beta
pancreática, levando à apoptose. As disfunções e morte da célula beta, associadas com a
resistência periférica à insulina, resultam no desenvolvimento do DM2 22 23. A resistência
à insulina é reconhecida como uma das principais causas do DM2 e há evidências de que
esta ocorre muitos anos antes do início do DM2 em humanos. Vários fatores têm sido
relatados para explicar o mecanismo de resistência à insulina, incluindo: obesidade,
inflamação, disfunção mitocondrial, lipotoxicidade, hiperlipidemia, estresse de retículo
endoplasmático, envelhecimento, estresse oxidativo, esteatose hepática, gravidez, dentre
outros. Estas condições podem estar associadas à obesidade, podendo predispor à
resistência à insulina 24.
1.4. Estresse de retículo endoplasmático
O reticulo endoplasmático (RE) é uma estrutura membranosa, sendo o local
principal de montagem (enovelamento) para quase todas as proteínas 25. A
14
disponibilidade de chaperonas moleculares no RE faz com que este seja um meio ideal
para tal função. Além disso, também compreende um sítio de identificação e sinalização
de eventuais proteínas enoveladas indevidamente, direcionando-as para degradação 26.
Como o enovelamento de proteínas é um processo complexo e sujeito a erros, a
capacidade de montagem das proteínas do RE pode ser facilmente saturada sob vários
disfunções fisiológicas, como a privação de glicose, regulação anormal de Ca2+, hipóxia,
estresse oxidativo, hipoglicemia, expressão de proteínas mutantes, envelhecimento e
aumento da síntese de proteínas 26. Para diminuir o estresse de RE e organizar a
recuperação de sua função, as células diminuem sua capacidade de tradução de proteínas
por algumas horas, diminuindo assim a carga de proteínas preparadas para o RE. Este
processo é de médio a longo prazo, e persiste até que os componentes principais do
mecanismo de unfolded protein response (UPR) sejam processados 27. A UPR
compreende um conjunto de respostas de um mecanismo adaptativo, especialmente
importante em células secretoras, que levam à expansão tanto do tamanho do RE quanto
da sua capacidade, de acordo com a exigência funcional da via exocítica. A UPR também
sinaliza um processo de degradação associada ao RE (ERAD) de proteínas com defeitos
de enovelamento 26.
Há três ramos distintos de transdutores de estresse de RE, cada ramo define uma
via da UPR, mediada por 1) inositol-requiring protein-1 (IRE1), 2) activating
transcription factor-6 (ATF6) e 3) protein kinase RNA (PKR)-like ER kinase (PERK).
Assim, a sinalização da UPR é iniciada por essas proteínas transmembrana do RE; elas
apresentam porções luminais que detectam o ambiente de enovelamento de proteínas no
RE, bem como porções efetoras citoplasmáticas que interagem com a maquinaria
transcricional e/ou translacional da célula 28. A seguir, uma breve descrição de cada ramo
da UPR.
- IRE1
15
Em resposta às proteínas mal enoveladas, IRE1 oligomeriza no plano da
membrana permitindo sua trans-autofosforilação de domínios quinases próximos. Essa
oligomerização pode acontecer por ligação de proteínas mal enoveladas ao domínio
luminal de IRE1, ou através da liberação de chaperonas repressoras de oligomerização,
ou ambos. Porém, a cascata de sinalização de IRE1 não tem um parâmetro convencional
de ativação sequencial de quinases, pois o único substrato conhecido da IRE1 quinase é
a própria IRE1. Além disso, sua ativação leva a uma função efetora incomum, que causa
a clivagem endonucleolítica precisa de um único substrato, um RNA mensageiro de um
fator de transcrição denominado X-box binding protein-1 (XBP1). Assim, a IRE1 consiste
em uma enzima bifuncional, apresentando tanto atividade de proteína quinase tanto de
endoribonuclease específica, a qual é regulada pelo seu módulo intrínseco de quinase 28.
Após clivagem pela IRE1, ocorre então tradução de XBP1. Este induz produção
de chaperonas do RE e degradação de proteínas associadas ao RE, além de promover
biossíntese de fosfolipídios, que contribuem para a expansão da membrana do RE 29.
Ainda, XBP1 estimula a degradação de RNA mensageiros, o que alivia a carga funcional
do RE 30. Outra resposta celular que envolve o XBP1 é o recrutamento de tumour necrosis
factor receptor-associated factor 2 (TRAF2) e ASK1 (apoptosis signal- regulating kinase
1), as quais ativam c-Jun N-terminal kinase (JNK) 31. Caso as resposta não sejam
suficientes para restaurar a homeostase do RE, essa ativação prolongada do estresse
acentua as ações tanto do ramo da IRE1 quanto da PERK, e desencadeia vias pró-
apoptóticas, que incluem ativação de C/EBP homologous protein (CHOP) da e JNK,
inibindo expressão de Bcl-2 e aumentando a clivagem de caspase 12 32.
- ATF6
O ATF6 é um precursor inativo, preso à membrana do RE por um segmento
transmembrana, e apresenta uma porção sensível ao estresse que se projeta no lúmen do
RE. Na condição de estresse de RE, o ATF6 é transportado da membrana do RE para o
aparelho de Golgi, onde é clivado por proteases residentes no Golgi. Primeiro é clivado
pela site 1 protease (S1P) no lúmen do Golgi, e depois pela site 2 protease (S2P) em uma
região intramembrana. Estas clivagens liberam no citosol a porção de ligação ao DNA. O
ATF6 clivado modula a expressão gênica no núcleo, podendo ativar transcrição Bip e de
outras chaperonas 33. De forma geral, com a ativação da UPR, o tráfego do precursor
inativo do ATF6 para o aparelho de Golgi precede as etapas proteolíticas subsequentes.
16
- PERK
Outra via transdutora de estresse de RE compreende ao ramo da PERK.
Semelhante à IRE1, a PERK é uma proteína transmembrana, localizada na região do RE
com domínios sensíveis ao estresse localizados na parte luminal da organela, sendo,
inclusive, similar ao IRE1 em estrutura e função 34.
A porção citoplasmática de PERK também apresenta um domínio de proteína
quinase, que sofre ativação via trans- e autofosforilação, após oligomerização, em
resposta ao estresse de RE. Ao contrário do ramo da IRE1, em que seu único substrato é
ele mesmo, a PERK fosforila a subunidade alfa do fator de transcrição de iniciação da
tradução eucariótica-2 (eIF2α) em resíduo de serina (Ser51). Essa fosforilação inibe o
fator de troca de nucleotídeo guanina (eIF2B). O papel da eIF2B é converter o eIF2-GDP
inativo para o eIF2-GTP ativo. Assim, esta ativação é dificultada pela fosforilação da
subunidade alfa de eIF2 pela PERK, o que leva à formação de um complexo estável
eIF2α-P-GDP-eIF2B e, portanto, inibição da iniciação da tradução. Com isso, ocorre
redução da síntese proteica, e, portanto, redução da quantidade de proteínas recém-
sintetizadas que seriam destinadas ao lúmen do RE já estressado 35.
Além de diminuir a carga proteica mal enovelada no RE, a fosforilação da eIF2α
promove modulações na transcrição gênica da célula. Uma delas, é a síntese de activating
transcription factor 4 (ATF4) e do fator nuclear kB (NFkB) 36. Além disso, aumento de
ATF4 promove maior expressão de CHOP e de seus genes alvos, o growth arrest and
DNA damage-inducible protein-34 (GADD34) e da protein phosphatase 1 (PP1). A PP1
desfosforila o eIF2α, retomando o processo de síntese proteica na célula 37 38.
17
Figura 1: Transdução de sinal de estresse de RE. O estresse de RE resulta na ativação
dos transdutores de estresse, PERK (esquerda), IRE1 (centro) e ATF6 (direita) presentes
na membrana do ER. O aumento da ligação de Bip às proteínas mal enoveladas no lúmen
de RE leva a sua dissociação dos transdutores e sua ativação. A PERK fosforila o eIF2a
e atenua a tradução da proteína, aliviando a carga de trabalho do ER. Em paralelo, a
tradução do ATF4 é paradoxalmente facilitada, o que induz a expressão de CHOP e
GADD34; O GADD34 tem como alvo a PP1 a eIF2a para desfosforilação, aliviando a
inibição da tradução. A ativação de IRE1 resulta no processamento de RNAm de XBP1,
regulando no núcleo as chaperonas do RE, componentes da maquinaria ERAD e
biossíntese de fosfolipídios. O IRE1 também degrada RNAm localizado na membrana do
RE, reduzindo a importação de proteínas recém-sintetizadas no lúmen do RE. O ATF6
ativado transloca-se para o Golgi, onde é clivado por S1P e S2P. O domínio
citoplasmático clivado é um ativador transcricional dos genes da UPR envolvidos no
enrolamento de proteínas, incluindo Bip, ERAD, biossíntese lipídica e expansão do ER.
A atividade de ATF6 é inibida pela proteína WFS1 39. Adaptado de Cnop et al., 2012.
18
1.5. Estresse de retículo endoplasmático e célula beta pancreática
O estresse de RE consiste em um dos principais mecanismos relacionados ao
declínio progressivo da função e massa da célula beta durante a instalação do DM2 32. O
aumento crônico de ácidos graxos livres induz estresse de RE na célula beta 40. Os
mecanismos através dos quais os ácidos graxos induzem o estresse de RE incluem
depleção de Ca2+ do RE, prejuízo no tráfego de proteínas do RE para o Golgi (devido à
produção de ceramidas) 41 e degradação de carboxipeptidase E. Todos estes fenômenos
contribuem para falhas no processamento da proinsulina na via secretória 40. Ratos que
foram alimentados com dieta rica em lipídios apresentaram aumento da fosforilação de
PERK e da expressão de Bip na célula beta 42. Além disso, células beta são
particularmente sensíveis a agentes que depletam o Ca2+ do RE, tais como bloqueadores
da bomda sarco/retículo endoplasmático Ca2+-ATPase (SERCA), o ácido ciclopiazônico
(CPA) e tapsigargina 43. Exposição de células beta INS-1E ao CPA por 6 a 12h leva ao
estresse severo de RE, caracterizado pelo aumento de ATF4, Bip e XBP1 44
1.6. Estresse de retículo e Pdx-1
O Pdx-1, um fator de transcrição de suma importância para desenvolvimento e
sobrevivência da célula beta 45 regula a função do RE. O Pdx-1 controla genes envolvidos
na formação da ponte dissulfeto, enovelamento de proteínas e a UPR, ligando-se
diretamente aos promotores do ATF4 e do WFS1 (wolframin ER transmembrane
glycoprotein) 46. Além de induzir chaperonas, o ATF4 induz transcrição da CHOP. Esta
via constitui uma sinalização pro-apoptótica na célula beta tanto em modelos in vitro 47,
quanto em modelos in vivo 48.
A ativação prolongada de ATF6 inibe a atividade do promotor da insulina, através
da redução da expressão de Pdx-1 e de MafA 49, influenciando, assim, a transcrição de
componentes essenciais à função da célula beta. Outro estudo observou que agentes que
induzem o estresse de RE como CPA e tapsigargina foi capaz de inibir a expressão de
genes de grande importância em células beta como, insulina-1 (Ins1) e insulina-2 (Ins2)
43.
1.7. AICAR, metformina e célula beta
A metformina é um fármaco muito utilizado para o tratamento de DM2, porem
seus efeitos ainda não são totalmente definidos. Seus efeitos mais conhecidos é a
diminuição da produção hepática de glicose e aumento da captação de glicose pelo
19
musculo esquelético 50. O composto farmacológico 5-Aminoimidazol-4-carboxamida-1-
β-D-ribonucleósido (AICAR), quando metabolizado em ZMP é um análogo de AMP
assim aumentando a razão ATP/ADP nas células, além disso regula genes ligados ao
metabolismo oxidativo, angiogênese e preservação de glicose 51. AICAR e metformina
são drogas que ativam uma proteína chamada AMP-activated protein kinase (AMPK).
Esta é uma proteína quinase serina/treonina heterotrimérica ativada por várias situações
fisiológicas ou patológicas de estresse que resultam em uma razão diminuída de
ATP/ADP+AMP 52,53. A AMPK age reprimindo vias que consomem energia e ativando
vias catabólicas para produzir ATP 52,53. Ainda, diminui processos que utilizam ATP ou
biossíntese de ácido graxo e colesterol, através da fosforilação da acetil-Coa carboxilase
(ACC) e da 3-hidroxi-3-methyl-glutaril-CoA redutase (HMGR), respectivamente, com
isso repõe ATP disponível promovendo oxidação de ácido graxo. A AMPK também
exerce seus efeitos sobre o balanço energético celular, através de modificações na
expressão gênica e tradução de proteínas 54–56. Além disso, foi reportada interação da
AMPK com a sinalização da mTOR na célula beta, indicando que nutrientes como a
glicose ou aminoácidos podem representar componentes de um mecanismo que permite
a coordenação entre disponibilidade energética, síntese proteica e crescimento da célula
beta 57. Ainda, o aumento da atividade da AMPK induz aumento da transcrição de Pdx-
1, via PPar- α 54.
O papel do AICAR sobre a secreção de insulina ainda é controverso 57. O Efeito
do AICAR (500 µM) na secreção é notado apenas na presença de concentrações mais
elevadas de glicose (8, 10 e 15 mM) 58. Superexpressão de AMPK por adenovírus induziu
supressão da secreção de insulina em ilhotas isoladas de ratos e em células MIN6 56, No
entanto, a superexpressão da AMPK não resultou em alterações no conteúdo de insulina
em células beta 59. Apesar de algumas evidências sugerirem aumento de apoptose, via
ativação de JNK em células MIN6 60,61, há uma série de trabalhos que mostram que o
AICAR não influencia na morte das células beta MIN6N8 em 2 dias de tratamento (1
mM) 59. Ainda, outros trabalhos reportam que o tratamento com AICAR a 1 mM ou 2
mM de metformina protegeu células INS-1E do efeito apoptótico induzido por palmitato
(250 µM) 62. Corroborando este achado, AICAR reduziu os efeitos tóxicos dos ácidos
graxos via sua ação lipolítica, bem como a metformina (500 µM), diminuindo, assim, a
morte das células beta 63.
20
1.8. Treinamento físico
Os efeitos dos mais variados programas de treinamento físico são amplamente
estudados em humanos 64,65–67. O treinamento físico melhora o metabolismo energético,
sendo grande parte dessas adaptações atribuída ao músculo esquelético 68,69. No entanto,
o treinamento físico influencia outros órgãos ou tecidos, incluindo, pelo menos, fígado,
tecido adiposo, cérebro e pâncreas. O exercício produz melhoras na dislipidemia de
indivíduos afetados pela obesidade, através da restauração da expressão gênica de
enzimas relacionadas à oxidação de gordura e a lipogênese hepáticos 70,71, evidenciando
um cross-talk entre o músculo e outras células do organismo.
Mais particularmente na célula beta, trabalhos com roedores sugerem que o
treinamento físico melhora vários aspectos relacionados à função da célula beta e da ilhota
pancreática; tais como aumento do conteúdo de transportador GLUT2 72, melhora da
sinalização da Akt e a atividade da enzima glucoquinase 73,74, e aumento da respiração
mitocondrial na ilhota pancreática 73. Além disso, a contração muscular induz melhora na
sobrevivência da célula beta no diabetes tipo 1 através do IL-6; isso foi evidenciado
através do soro obtido de animais treinados ou meio condicionado de células C2C12,
previamente tratadas com AICAR, resultando na redução da morte de célula beta induzida
por IL-1β e IFN-γ em 15 e 38%, respectivamente 75.
Assim, neste trabalho nossa hipótese foi de que um programa de treinamento
físico de corrida em esteira, em camundongos C57BL/6 induzidos à obesidade por dieta
rica em lipídio, seria capaz de prevenir os efeitos deletérios da obesidade e o estresse de
RE em ilhotas pancreáticas. Ainda, utilizando uma abordagem in vitro, nossa hipótese foi
de que a metformina seria capaz de modular preventivamente as respostas em células beta
INS-1E, frente ao estresse de RE induzido pelo CPA.
21
2. OBJETIVOS
Avaliar os efeitos do treinamento físico e da metformina, in vivo e in vitro,
respectivamente, sobre o estresse de retículo endoplasmático na ilhota e na célula beta
pancreática INS-1E.
22
3. METODOLOGIA
3.1. Animais
Animais provenientes do CEMIB/Unicamp, camundongos C57BL/6Unib, com 21
dias, foram mantidos no biotério do Departamento de Biologia Estrutural e Funcional,
Fisiologia, do Instituto de Biologia/Unicamp, e acondicionados em gaiolas (4/gaiola) com
ração e água à vontade, fotoperíodo de 12h e temperatura de 23°C. Todos ss experimentos
conduzidos foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade
Estadual de Campinas, CEUA, número 5023-1/2018.
3.2. High Fat-Diet
Com 90 dias de idade, os camundongos foram separados em 4 grupos: controle
(Ctl), controle treinado (Tr), alimentado com dieta hiperlipídica (HFD), e alimentado com
a dieta rica em gordura e também submetido ao treinamento (HFD Tr). Os grupos Ctl e
Tr receberam ração com conteúdo normal de gordura (Nuvital, SP), enquanto os animais
HFD e HFD Tr foram alimentados com dieta rica em gordura (PragSoluções, SP) (Anexo
1).
3.3. Exercício
Para o treinamento, os animais foram aclimatados à esteira, com baias individuais
sem choque. O protocolo foi composto por 16 semanas de duração onde os animais
correram a uma velocidade correspondente a 70% da sua capacidade máxima de esforço.
Iniciamos o protocolo com 10 min de duração, aumentando gradualmente até atingir 60
min por dia, 5 dias por semana. Sua capacidade máxima de esforço foi quantificada a
partir do teste de corrida na esteira, em que os animais começaram a correr em uma
velocidade de 5 centímetros por segundo e foram aumentados 3 centímetros a cada minuto
até o animal entrar em exaustão, o teste foi realizado antes do início, no meio e no final
do treinamento, avaliando o desempenho dos animais e obtendo reajustes na porcentagem
de velocidade ao decorrer do treinamento.
3.4. Isolamento de ilhota pancreática e secreção estática de insulina
Os camundongos foram eutanasiados por aprofundamento da anestesia seguido de
decapitação; após incisão abdominal foi injetado um volume de 2,5 ml de solução de
Hanks enriquecida com 0,8 mg/ml de Colagenase (Sigma) no pâncreas através do ducto
biliar comum, este foi dissecado e transferido para um tubo de 50 ml. O pâncreas foi
mantido em banho a 37ºC por 10 min. As ilhotas, então completamente separadas do
tecido acinar, foram coletadas uma a uma em lupa. Em seguida, as ilhotas purificadas
23
foram utilizadas para os protocolos de determinação de conteúdos gênico (Chop,
Grp78/Bip, Atf4, Xbp1, Ins2 e Pdx-1). Além disso, grupos de quatro ilhotas foram pré-
incubadas por 30 min em solução Krebs-bicarbonato (KB) pH 7,4 (NaCl 120 mM; KCl 5
mM; NaHCO3 25 mM; CaCl2 2,56 mM; MgCl2 1,13 mM), contendo 0,25% de albumina
bovina, na presença de 2,8 mM de glicose e de carbogênio (mistura de 95% de O2 e 5%
de CO2). Após, o meio foi descartado e as ilhotas foram incubadas com solução KB na
presença de diferentes concentrações de glicose, por 1h. Terminada a incubação foi
recolhida uma alíquota do sobrenadante a qual foi estocada a -20ºC para posterior
dosagem de insulina. Após os procedimentos de incubação, o conteúdo total de insulina
das ilhotas foi extraído utilizando-se solução de álcool ácido e a dosagem foi realizada
por radioemunoensaio.
3.5. Teste intraperitoneal de tolerância à glicose (ipGTT)
Os animais foram mantidos em jejum de 12 horas e a glicemia de jejum e foi
avaliada com aparelho Accu-Check Advantage II. Em seguida, foi administrada glicose
(1g/kg de peso do animal) via intraperitoneal e os valores de glicemia foram verificados
nos tempos 15, 30, 60, 90 e 120 minutos após o desafio glicêmico.
3.6. Teste intraperitoneal de tolerância à insulina (ipITT)
Cinco dias após o ipGTT foi realizado o ipITT. Os animais foram mantidos em
jejum de 4 horas e a verificação da glicemia foi realizada com o aparelho Accu-Check
Advantage II (tempo 0). Posteriormente, a insulina regular humana foi administrada via
intraperitoneal (1 U/kg de peso corporal). A glicemia foi verificada nos tempos 3, 6, 9,
12, 15 e 18. A taxa da constante de decaimento da glicose (kitt) foi calculada usando a
fórmula 0.693/t1/2. A glicose t1/2 foi calculada através da análise da queda do quadrado
da concentração de glicose plasmática durante o decaimento da fase linear.
3.7. Cultura de células INS-1E
Linhagens de células beta de rato, INS-1E, gentilmente cedidos pelo Prof Dr
Wolheim (Center Medical Universitaire, Geneva, Switzerland), foram mantidas em
cultura (37ºC, 5% CO2), em meio RPMI-1640 contendo 11 mM de glicose e
suplementado com 5% de soro fetal bovino, 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de
estreptomicina, 100 µg/ml de piruvato de sódio e 50 µmol/ml de mercaptoetanol. As
células previamente tratadas com CPA (500 µM) por 16h, foram testadas com diferentes
concentrações de AICAR (500 µM, 1mM, 2mM) e metformina (500 µM, 1 mM, 2mM)
24
por 16h, em seguida foram definidas as concentrações de CPA 12,5 µM e de metformina
500 µM.
3.8. Western Blotting
Extratos proteicos de células INS-1E tratadas com CPA, AICAR ou metformina,
foram quantificados utilizando-se reagente Bradford (BioRad), e tendo como base uma
curva padrão de albumina (BSA). As amostras foram então incubadas a 100°C por 3 min
em Tampão de Laemmli contendo DTT. Para corrida eletroforética foi aplicado um
volume correspondente a 20 a 30 µg de proteína em gel bifásico (gel de empilhamento e
gel de resolução). Após a corrida as amostras foram transferidas para uma membrana de
nitrocelulose (BioRad) com tampão de transferência. Após bloqueio (5% de albumina
bovina) as proteínas de interesse foram detectadas com anticorpo específico, seguida de
incubação com anticorpo secundário contendo peroxidase (HRP) e, finalmente, com
reagentes de quimioluminescência. As imagens foram capturadas em fotodocumentador
(Amersham™ Imager 600, Life Sciences) e a intensidade e quantificação das bandas
foram medidas por densitometria (ImageJ, Bethesda, USA), sendo os valores das bandas
normalizados pelos valores de densitometria do controle interno GAPDH.
3.9. PCR quantitativo
As amostras de RNA mensageiro (RNAm) foram obtidas a partir da técnica de
extração utilizando-se o Trizol (ThermoFisher Scientific), de acordo com instruções do
fabricante. O RNA obtido foi convertido em cDNA utilizando-se o kit High Capacity
(Applied Biosystems), de acordo com manual do fabricante. Em seguida, o cDNA foi
quantificado, diluído a 300 ng/µl e cerca de 600 ng das amostras foram aplicados em
placas de 96 poços, de modo a obter a quantificação relativa de cDNA ao final do PCR
quantitativo. A amplificação foi ainda normalizada pelo controle interno HPRT, e a
expressão gênica relativa foi determinada utilizando-se o método de 2-ΔΔCT 76. As reações
foram realizadas de acordo com o manual do fabricante (Applied Biosystems).
3.10. Análise estatística
Os grupos foram analisados pelo teste ANOVA two-way seguido de pós-teste de
Bonferroni. As análises foram realizadas no programa GraphPadPrism 5. O nível de
significância adotado para as análises foi de P< 0,05.
25
4. RESULTADOS
4.1. O treinamento reduz o ganho de peso de animais alimentados com dieta
hiperlipídica
Os animais tiveram seu peso corporal determinado semanalmente ao longo de 16
semanas a partir do início da administração da dieta hiper lipídica e do treinamento físico.
Ao longo desse período, como esperado, os animais do grupo controle (Ctl) e do grupo
treinado (Tr) apresentaram uma estabilidade no ganho de peso corporal, já os animais que
receberam a dieta hiper lipídica (HFD) e submetidos ao treinamento concomitantemente
com a dieta (HFD Tr), tiveram aumento de peso (Fig. 1A). Se observou um aumento do
peso corporal do grupo HFD e HFD Tr em relação ao grupo Ctl, representando pelo
aumento no valor da área sob a curva (AUC) deste grupo (Fig. 1B) em relação ao valor
de AUC do grupo Ctl. O treinamento não foi capaz de prevenir o peso dos animais como
demonstrado no gráfico da figura 1B. No entanto, quando avaliamos o ganho de peso
desses animais, o treinamento físico promoveu prevenção do ganho de peso nos animais
do Grupo HFD Tr, quando comparado ao grupo HFD (Fig. 1C). Além disso, os animais
que foram submetidos ao treinamento, tiveram sua capacidade máxima de esforço na
esteira avaliados, observamos uma menor capacidade de esforço máximo na decima sexta
semana de treinamento dos animais do grupo HFD Tr que receberam a dieta lipídica,
comparados com os animais que somente treinaram e receberam dieta padrão Tr (Fig 1D).
26
0 5 1 0 1 5 2 0
0
2 0
4 0
6 0 P
es
o C
orp
ora
l (g
) C tl
T r
H F D
H F D T r
Ctl T
r
HF
D
HF
D T
r
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
AU
C P
es
o C
orp
ora
l
**
Ctl T
r
HF
D
HF
D T
r
0
5
1 0
1 5
2 0
Ga
nh
o d
e P
es
o (
g)
*
#
1ª
Sem
an
a
5ª
Sem
an
a
16ª
Sem
an
a
0
2 0
4 0
6 0
Te
ste
de
Es
forç
o (
cm
/s)
T r
H F D T r*
#
#
A B
C D
Figura 2: Evolução do peso corporal (A), área sob a curva do peso corporal (B) e ganho
de peso (C) dos animais Ctl, Tr, HFD e HFD Tr. Teste de esforço (D) dos animais HFD
e HFD Tr. As barras representam a média ± EPM. O asterisco (*) representa o efeito da
dieta hiper lipídica (grupo HFD) em comparação à dieta padrão (grupo Ctl), e o cerquilha
(#) o efeito do exercício físico em animais obesos (grupo HFD Tr) em comparação ao
grupo obeso sedentário (grupo HFD). ANOVA de duas vias seguido pelo pós-teste de
Bonferroni. P<0,05, n= 6-7.
4.2. O treinamento reduz o peso de tecidos adiposos em animais alimentados
com dieta hiperlipídica
Após a eutanásia dos animais, diferentes depósitos de gordura e o músculo
gastrocnêmio foram dissecados e tiveram sua massa determinada. Observamos o aumento
de peso dos tecidos adiposo retroperitoneal, inguinal, perigonadal e marrom do grupo
HFD em comparação com Ctl (Fig. 2A, B, C e D). Já os animais do grupo HFD Tr
apresentaram menor peso do tecido adiposo retroperitoneal, inguinal e marrom (Fig. 2A,
B e D), em comparação aos animais HFD. Entretanto, o treinamento não foi capaz de
27
prevenir o ganho de peso do tecido adiposo perigonadal (Fig. 2C). Além disso, o peso do
musculo gastrocnêmio foi similar entre os grupos HFD e HFD Tr (Fig. 2E), sem
diferenças significativas.
Ctl T
r
HF
D
HF
D T
r
0 .0
0 .2
0 .4
0 .6
0 .8
1 .0
Te
cid
o A
dip
os
o
Re
tro
pe
rit
on
ea
l (g
)
#
*
Ctl T
r
HF
D
HF
D T
r
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
2 .0
Te
cid
o A
dip
os
o
In
gu
ina
l (g
)
#
*
Ctl T
r
HF
D
HF
D T
r
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
Te
cid
o A
dip
os
o
Pe
rig
on
ad
al
(g)
*
*
Ctl T
r
HF
D
HF
D T
r
0 .0
0 .2
0 .4
0 .6
0 .8
Te
cid
o A
dip
os
o
Ma
rro
m (
g)
#
*
Ctl T
r
HF
D
HF
D T
r
0 .0 0
0 .0 5
0 .1 0
0 .1 5
0 .2 0
Mu
sc
ulo
Ga
str
oc
nê
mio
(g
)
A B
C D
E
Figura 3: Peso do tecido adiposo retroperitoneal (A), Inguinal (B), Perigonadal (C), e
Marrom (D). Peso do musculo gastrocnêmio (E) dos animais Ctl, Tr, HFD e HFD Tr. As
28
barras representam a média ± EPM. O asterisco (*) representa o efeito da dieta hiper
lipídica (grupo HFD) em comparação à dieta padrão (grupo Ctl), e o cerquilha (#) o efeito
do exercício físico em animais obesos (grupo HFD Tr) em comparação ao grupo obeso
sedentário (grupo HFD). ANOVA de duas vias seguido pelo pós-teste de Bonferroni.
P<0,05, n= 6-7.
4.3. Melhora da homeostase glicêmica em animais obesos treinados
Os animais foram mantidos em jejum overnight e tiveram sua glicemia de jejum
obtida (tempo 0). Em seguida, receberam uma dose de glicose intraperitoneal, e a
glicemia foi verificada nos tempos 15, 30, 60, 90 e 120 min (Fig. 3A). Foi observada
intolerância à glicose no grupo HFD em relação ao grupo Ctl, representado pelo aumento
no valor da área sob a curva (AUC) deste grupo (Fig. 3B) em relação ao valor de AUC
do grupo Ctl. No entanto, animais HFD Tr, foram mais tolerante à glicose que os animais
HFD (Fig.3A-B). Para avaliarmos a resistência à insulina, os animais foram mantidos em
jejum por 6 horas e tiveram sua glicemia de jejum obtida (tempo 0). Em seguida,
receberam uma administração intraperitoneal de insulina, e a glicemia foi verificada nos
tempos 3, 6, 9, 12, 15 e 18 min (Fig. 3C). Neste teste, se observou resistência à insulina
no grupo HFD em relação ao grupo Ctl, representado pelo aumento no valor da AUC
deste grupo (Fig. 3D) em relação com o grupo Ctl. No entanto, os animais HFD Tr,
apresentaram maior sensibilidade à insulina que os animais HFD (Fig. 3C-D). Estes dados
corroboram com o resultado do cálculo da constância de decaimento da glicemia (kITT)
(Fig. 3E).
29
0 5 0 1 0 0 1 5 0
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0G
TT
C tl
T r
H F D
H F D T r
Ctl T
r
HF
D
HF
D T
r
0
2 0 0 0 0
4 0 0 0 0
6 0 0 0 0
AU
C G
TT
*
#
0 5 1 0 1 5 2 0
0
5 0
1 0 0
1 5 0
ITT
No
rm
ali
za
do
C tl
T r
H F D
H F D T r
Ctl T
r
HF
D
HF
D T
r
0
5 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
2 0 0 0
2 5 0 0
AU
C I
TT
No
rm
ali
za
do *
#
Ctl T
r
HF
D
HF
D T
r
0
2
4
6
8
KIT
T
(cá
lcu
lo d
a c
on
sta
nte
de
de
ca
ime
nto
da
gli
co
se
)
*
#
A B
C D
E
Figura 4: Curva glicêmica do teste de tolerância à glicose (A) e área sob a curva (B).
Curva glicêmica do teste de tolerância a insulina (C), área sob curva (D) e cálculo da
constante de decaimento da glicose (E) dos animais Ctl, Tr, HFD e HFD Tr. As barras
representam a média ± EPM. O asterisco (*) representa o efeito da dieta hiper lipídica
(grupo HFD) em comparação à dieta padrão (grupo Ctl), e o cerquilha (#) o efeito do
exercício físico em animais obesos (grupo HFD Tr) em comparação ao grupo obeso
sedentário (grupo HFD). ANOVA de duas vias seguido pelo pós-teste de Bonferroni.
P<0,05, n= 8.
30
4.4. Treinamento físico reduz glicemia de jejum e secreção e conteúdo de
insulina em camundongos obesos
Na avaliação da glicemia de jejum dos animais, observamos que o grupo HFD
apresentou valores maiores de glicemia que os animais do grupo Ctl (Fig. 4A), no entanto,
os animais HFD Tr apresentaram valores inferiores de glicemia comparados com animais
HFD. Além disso, avaliamos a insulinemia em jejum (Fig. 4B), estes dados corroboram
com os valores de glicemia de jejum, evidenciado pelo aumento nos camundongos HFD,
conforme esperado. Também foi avaliada a secreção e conteúdo de insulina em ilhotas
pancreática isoladas, e observado aumento da secreção e conteúdo de insulina no grupo
HFD, comparado com o grupo Ctl, e menor secreção e conteúdo do hormônio em ilhotas
do grupo HFD Tr, comparado com o grupo HFD (Fig. 4C). A secreção foi estimulada
pela glicose em ensaio de secreção estática de insulina.
Ctl T
r
HF
D
HF
D T
r
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
2 5 0
Gli
ce
mia
de
Je
jum
(n
g/m
L)
*
#
Ctl T
r
HF
D
HF
D T
r
0
2
4
6
8
Ins
uli
ne
mia
de
Je
jum
(n
g/m
L)
*
#
Ctl T
r
HF
D
HF
D T
rC
tl Tr
HF
D
HF
D T
r
0 .0
0 .2
0 .4
0 .6
Se
cre
çã
o d
e I
ns
uli
na
(n
g/m
L)
*
#
2 ,8 m M 1 6 m M
A B
C
Co
nte
úd
o t
ota
l d
e i
ns
uli
na
(ng
/ilh
ota
)
CT
L Tr
HF
D
HF
D T
r
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
*
#
D
Figura 5: Glicemia (A) e insulinemia de jejum (B). Secreção estática de insulina em
ilhotas isoladas na presença de 2.8 e 16 mM de glicose (C). conteúdo total de Insulina (D)
dos animais Ctl, Tr, HFD e HFD Tr. As barras representam a média ± EPM. O asterisco
(*) representa o efeito da dieta hiper lipídica (grupo HFD) em comparação à dieta padrão
31
(grupo Ctl), e o cerquilha (#) o efeito do exercício físico em animais obesos (grupo HFD
Tr) em comparação ao grupo obeso sedentário (grupo HFD). ANOVA de duas vias
seguido pelo pós-teste de Bonferroni. P<0,05, n= 4-7.
4.5. Avaliação da expressão de marcadores de estresse de RE, insulina e Pdx-1
em ilhotas pancreáticas
Foi realizada análise gênica através de PCR quantitativo para avaliação de
marcadores de estresse de RE. Um marcador importante, o ATF4 apresentou expressão
aumentada no grupo HFD, comparado com o grupo Ctl (Fig. 5A). Já para os marcadores
Chop, XBP1 e Bip (Fig. A, B e D) não houve diferença estatística entre o grupo HFD e
Ctl. O treinamento físico preveniu aumento do conteúdo gênico de Chop, ATF4 e Bip,
conforme observado no grupo de animais HFD Tr, quando comparados aos grupos
alimentados com HFD (Fig. 5A, C e D). Como já descrito na literatura, observamos um
aumento na expressão gênica de insulina (Ins2) na ilhota pancreática nos animais HFD
em comparação com o grupo Ctl, e menor expressão de Ins2 nas ilhotas dos animais do
grupo HFD Tr, comparados com o grupo HFD (Fig. 5E). Estes resultados estão de acordo
com a secreção do hormônio no grupo HFD Tr, estimulado pela glicose em ilhotas
isoladas, e com a concentração de insulina plasmática (Fig. 4B-C).
Além disso, na avaliação do conteúdo gênico do fator de transcrição Pdx-1 foi
observada menor a expressão em ilhotas de camundongos treinados, comparada ao grupo
HFD, sem diferenças significativas do grupo HFD, quando comparado ao grupo Ctl (Fig.
5F).
32
Ctl
Tr
HF
D
HF
D T
r
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5R
ela
çã
o R
NA
mC
ho
p/H
prt
#
Ctl T
r
HF
D
HF
D T
r
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
2 .0
Re
laç
ão
RN
Am
Xb
p1
/Hp
rt
Ctl
Tr
HF
D
HF
D T
r
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
Re
laç
ão
RN
Am
Atf
4/H
prt *
#
Ctl
Tr
HF
D
HF
D T
r
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
Re
laç
ão
RN
Am
Bip
/Hp
rt
#
Ctl
Tr
HF
D
HF
D T
r
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
2 .0
Re
laç
ão
RN
Am
Ins
2/H
prt
*
#
Ctl
Tr
HF
D
HF
D T
r
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
Re
laç
ão
RN
Am
Pd
x1
/Hp
rt
#
A B
C D
E F
Figura 6: Análise da expressão gênica de Chop (A), Xbp1 (B), Atf4 (C), Bip (D), Ins2
(E) e Pdx-1 (F) em ilhotas pancreáticas dos animais Ctl, Tr, HFD e HFD Tr. Todas as
amostras foram normalizadas pelo gene controle interno Hprt. As barras representam a
média ± EPM. O asterisco (*) representa o efeito da dieta hiper lipídica (grupo HFD) em
comparação à dieta padrão (grupo Ctl), e o cerquilha (#) o efeito do exercício físico em
33
animais obesos (grupo HFD Tr) em comparação ao grupo obeso sedentário (grupo HFD).
ANOVA de duas vias seguido pelo pós-teste de Bonferroni. P<0,05, n= 6-8.
4.6. Curva Dose-Resposta de exposição ao CPA em células INS-1E
Células INS-1E foram expostas a diferentes concentrações de CPA (6µM, 12µM
e 25µM) durante 16 horas, para padronizar nosso modelo de estresse de retículo in vitro.
Em seguida, avaliamos a expressão gênica dos marcadores de estresse de retículo e
observamos um aumento da expressão gênica de Chop, dependente da dose (Fig. 5A).
Além disso, doses elevadas de CPA (12 e 25µM) levaram ao aumento da expressão de
Bip (Fig. 5B).
6
M
12
M
25
M
0
5
1 0
1 5
Re
laç
ão
RN
Am
Ch
op
/Hp
rt
C tl
C P A
*
*
P < 0 ,0 0 0 1
6
M
12
M
25
M
0
1
2
3
4
Re
laç
ão
RN
Am
Bip
/Hp
rt C tl
C P A
**
A
B
Figura 7: Expressão gênica de Chop (A) e Bip (B) em células INS-1E expostas a 6, 12 e
25µM de CPA. Todas as amostras foram normalizadas pelo gene controle interno Hprt.
As barras representam a média ± EPM. O asterisco (*) representa o efeito do CPA em
34
comparação com o grupo controle, com diferenças estatísticas entre os grupos. ANOVA
de duas via seguido pelo pós-teste de Bonferroni. P<0,05, n= 5.
4.7. Expressão proteica de CHOP e PDX-1 com a exposição ao CPA e
tratamento com metformina e AICAR
Células INS-1E expostas a 12µM de CPA apresentaram aumento no conteúdo
proteico de Chop (Fig. 7A), juntamente com diminuição da expressão de PDX-1 (Fig.
7C). Além disso, as diferentes concentrações de metformina não foram totalmente
eficazes em reverter esses parâmetros. Podemos observar um aumento da expressão de
Chop nas concentrações de 1µM e 2µM de metformina (Fig. 7A), associadas à diminuição
da expressão de PDX-1 (Fig. 7C), sugerindo um aumento de estresse de retículo nesses
grupos. Já no grupo tratado com 0,5µM de metformina podemos observar uma reversão
parcial do conteúdo proteico de Chop (Fig. 7A), além do aumento da expressão de PDX-
1 (Fig. 7C), sugerindo um papel protetor da metformina em reduzir os efeitos deletérios
do estresse de RE, em células INS-1E tratadas com a droga. Os grupos expostos ao CPA
e tratados com doses de 0,5µM, 1µM e 2µM de AICAR, apresentaram alta toxicidade,
uma vez que a expressão proteica de CHOP se manteve igual e/ou aumentada em
comparação com a exposição isolada ao CPA (Fig. 7B), além da diminuição da expressão
de PDX-1 (Fig. 7D) nesses grupos.
35
Ctl
CP
A
CP
A +
Met
0,5
M
CP
A +
Met
1
M
CP
A +
Met
2
M
0
5
1 0
1 5
2 0
CH
OP
/GA
PD
H
*
*
#
Ctl
CP
A
CP
A +
AIC
AR
0,5
M
CP
A +
AIC
AR
1
M
CP
A +
AIC
AR
2
M
0
5
1 0
1 5
CH
OP
/GA
PD
H
* *
*
*
Ctl
CP
A
CP
A +
Met
0,5
M
CP
A +
Met
1
M
CP
A +
Met
2
M
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
PD
X1
/GA
PD
H
*
#
* *
Ctl
CP
A
CP
A +
AIC
AR
0,5
M
CP
A +
AIC
AR
1
M
CP
A +
AIC
AR
2
M
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
PD
X1
/GA
PD
H
* **
*
A B
C D
Figura 8: Expressão proteica de CHOP (A e B) e PDX-1 (C e D) em células INS-1E
expostas ao CPA na concentração de 12µM, além disso tratadas com 0,5µM, 1µM e 2µM
de metformina e AICAR. As barras representam a média ± EPM. O asterisco (*)
GAPDH
PDX-1
CHOP
CPA 12,5µM - + + + + + + +
Metformina 0,5µM - - + - - - - -
Metformina 1µM - - - + - - - -
AICAR 1µM - - - - - - + -
AICAR 2µM - - - - - - - +
Metformina 2µM - - - - + - - -
AICAR 0,5µM - - - - - + - -
36
representa o efeito do CPA em comparação com o grupo controle, e o cerquilha (#) o
efeito do tratamento com metformina em comparação com o grupo foram expostos ao
CPA, com diferente estatísticas entre os grupos. ANOVA de duas via seguida pelo pós-
teste de Bonferroni. P<0,05, n= 3
4.8. Marcadores de estresse de RE em células INS-1E expostas ao CPA e
tratadas com metformina
O estresse induzido pela exposição ao CPA levou ao aumento da expressão gênica
de marcadores como Chop (Fig. 8A), Bip (Fig. 8B), Atf4 (Fig. 8C), Xbp1 (Fig. 8D) e
Serca2b (Fig. 8E). Além disso, foi observado um menor conteúdo gênico de Pdx-1 (Fig.
8F). Já o tratamento com metformina levou a uma prevenção do aumento conteúdo gênico
de Pdx-1, sugerindo um papel protetor da metformina em reduzir os efeitos deletérios do
estresse de RE, considerando a redução parcial do conteúdo proteico de Chop (Fig. 7A),
e do conteúdo gênico de Bip, Atf4, Xbp1 e Serca2b (Fig. B, C, D e E) observados no grupo
tratado. As alterações na expressão de genes importantes para a produção de insulina e
sobrevivência da célula beta pancreática podem ocorrer devido ao aumento do fator de
transcrição Pdx-1, em INS-1E tratadas com metformina.
37
Ctl
Met
CP
A
CP
A +
Met
0
2
4
6
8
1 0
Re
laç
ão
RN
Am
Ch
op
/Hp
rt
**
Ctl
Met
CP
A
CP
A +
Met
0
1
2
3
Re
laç
ão
RN
Am
Bip
/Hp
rt *
#
Ctl
Met
CP
A
CP
A +
Met
0
2
4
6
8
Re
laç
ão
RN
Am
Atf
4/H
prt
*
#
Ctl
Met
CP
A
CP
A +
Met
0
1
2
3
4
Re
laç
ão
RN
Am
Xb
p1
/Hp
rt
*
#
Ctl
Met
CP
A
CP
A +
Met
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
2 .0
2 .5
Re
laç
ão
RN
Am
Se
rc
a2
b/H
prt
*
#
Ctl
Met
CP
A
CP
A +
Met
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
Re
laç
ão
RN
Am
Pd
x1
/Hp
rt
*
#
A B
C D
E F
Figura 9: Expressão genica de Chop (A), Xbp1 (B), Atf4 (C), Bip (D), Serca2b (E) e Pdx-
1 (F), na exposição ao CPA a 12µM e tratados com a droga metformina a 0,5µM. As
barras representam a média ± EPM. O asterisco (*) representa o efeito do CPA em
comparação com o grupo controle, e o cerquilha (#) o efeito do tratamento com
metformina em comparação com o grupo foram expostos ao CPA, com diferente
38
estatísticas entre os grupos. ANOVA de duas vias seguidas pelo pós-teste de Bonferroni.
P<0,05, n= 4-5.
5. DISCUSSÃO
No presente estudo avaliamos o potencial do treinamento físico, em ilhotas de
camundongos obesos C57/BL6, bem como da metformina em células INS-1E, em
reverter o estresse de RE. Nossos dados sugerem papel protetor, tanto do treinamento
quanto da metformina, sobre os mecanismos que levam à disfunção da célula beta
pancreática durante a progressão do DM2.
5.1. Treinamento físico
Quanto ao treinamento físico, são inúmeros os benefícios à saúde promovidos pela
sua prática, porém pouco se sabe sobre como o treinamento é capaz de induzi-los. Há
evidências de que o meio condicionado com soro de animais treinados melhora as
disfunções em células beta pancreáticas tratadas, reduzindo a morte celular induzida por
citocinas inflamatórias 75. Ainda, foi reportado que ilhotas isoladas de camundongos
treinados, que foram expostas a citocinas inflamatórias, apresentaram redução dos efeitos
deletérios induzidos pelas mesmas, evidenciada pela diminuição de caspase-3 clivada.
Em estudos em que células INS-1E e ilhota pancreática de camundongo foram expostas
a citocinas inflamatórias ou CPA, para indução de apoptose, e em seguida tratadas com
meio condicionado com soro de animais treinados, se observou uma atenuação de
apoptose, bem como da expressão de marcadores de estresse de RE, como Chop e Xbp1
77. Nesse sentido, nosso estudo se propôs a avaliar in vivo o possível efeito do exercício
sobre a função da ilhota pancreática em camundongos obesos. Nossos dados mostraram
que o exercício é capaz de proteger as ilhotas pancreáticas, diminuindo a expressão de
genes da UPR como Atf4, Chop e Bip, em camundongos obesos, corroborando com os
poucos estudos que avaliaram a célula beta ou ilhota pancreática 75,77.
Nós observamos que o treinamento preveniu aumento da expressão dos
marcadores canônicos de estresse de RE em animais obesos, mesmo quando a dieta
hiperlipídica não foi capaz de induzir o aumento dos mesmos no grupo HFD, conforme
já é reportado 42. Ainda que a HFD não tenha induzido aumento de alguns marcadores da
UPR na ilhota, todos os outros parâmetros avaliados, como ganho de peso, adiposidade,
hiperinsulinemia, intolerância à glicose e à insulina, indicaram que a dieta induziu os
efeitos deletérios. Efeitos estes, que foram atenuados pelo treinamento. Em animais que
39
foram alimentados com HFD e submetidos ao treinamento houve diminuição de
expressão dos marcadores de estresse de RE, evidenciando o efeito protetor do exercício
sobre marcadores da UPR. Destaca-se em nosso estudo, aumento da expressão gênica de
ATF4 induzido pela HFD, indicando um possível estresse metabólico moderado para a
ilhota pancreática, já que levou à ativação de somente um ramo da UPR. Assim, podemos
inferir que a ativação de uma das vias associadas ao estresse de RE, pôde ser prevenida
pelo programa de treinamento baseado em corrida em esteira que estabelecemos em nosso
trabalho. Segundo estudos, a UPR pode ser ativada de forma gradativa, levando, no fim,
a uma disfunção da célula beta e à incapacidade de sustentar a secreção de insulina. Isso
é evidenciado pela redução de ATF6, XBP1 e p-eIF2α em ilhotas isoladas de pacientes
com DM2 78. Em camundongos obesos ob/ob, com 8 semanas de vida, foi observada
redução de ATF6 e de XBP1, associadas à hiperglicemia e à hiperinsulinemia, sem
alterações dramáticas da massa de célula beta, indicando um menor grau de estresse de
RE 78. É interessante observar que a ilhota apresentou uma resposta compensatória, o que
é evidenciado pelo estado euglicêmico do camundongo obeso ob/ob, após 18 semanas.
Assim, parece que a transição para a euglicemia pode ser resultante da ação efetiva da
UPR para minimizar a morte celular, e permitir este mecanismo compensatório da célula
beta, frente à hiperglicemia 78. Estes mecanismos foram associados à normalização de
Atf6, Xbp1 e p-eIF2α, comparado ao camundongo controle, indicando um baixo grau de
estresse de RE neste modelo.
Em camundongos C57/BL6 alimentados com HFD, após 13 semanas, foi
observado aumento de p-eIF2α, sem modulações de XBP1. O que é consistente com
nossos dados, já que em nosso modelo houve aumento de Atf4, que é um ramo de p-
eIF2α; isso foi associado ao aumento da insulinemia, conteúdo de insulina e da glicemia
de jejum, o que indicaria um estado pré-diabético, conforme reportado 78. Já em outro
estudo, que comparou camundongos db/db e ob/ob, observou-se diferenças importantes
quanto a expressão de Xbp1, com aumento de sua expressão gênica em db/db com 6
semanas, e normalização após 16 semanas de vida, comparado ao controle 79. Porém, em
camundongos ob/ob foi observado aumento de Xbp1 tanto em 6 semanas quanto em 16
semanas de vida, contrastando com os dados do trabalho discutido anteriormente 78. É
importante ressaltar que a Xbp1 compreende uma via de ativação da UPR que induz
aumento da síntese de proteínas antioxidantes e chaperonas, e aumento da sua expressão
é associada à redução de apoptose 40. Não encontramos diferenças significativas de Xbp1
em nosso modelo, corroborando com dados já reportados 78.
40
Assim, é possível que uma forma branda de estresse de RE, através de um único
ramo da UPR, p-eIF2α-Atf4, e com menor expressão da Chop, seja acarretada pela HFD
em nosso modelo. Vale ressaltar, que este tratamento com HFD, leva ao aumento da
massa de célula beta na ilhota pancreática e hiperinsulinemia em jejum 42. A julgar pela
hiperinsulinemia, conteúdo de insulina e pelo aumento da expressão de Ins2 é possível
que em nosso modelo de obesidade ocorra mecanismo compensatório da ilhota em
resposta à hiperglicemia de jejum, mantendo a via p-eIF2α-ATF4 aumentada, e com
normalização da expressão de Xbp1 no final do tratamento com HFD, assim como
reportado em outro estudo 78. Nossa estratégia abordada neste estudo procurou entender
se o exercício seria capaz de prevenir ou atenuar os efeitos deletérios da HFD. Assim,
avaliamos tais marcadores da UPR em camundongos que treinaram em esteira 1h por dia,
5 vezes na semana. Observamos que o treinamento foi capaz de prevenir o aumento da
expressão de Chop, Atf4 e Bip, ao final de 16 semanas de HFD, associados à menor
glicemia de jejum, insulinemia, conteúdo de insulina, expressão de Pdx-1 e Ins2
reduzidas, assim como da secreção de insulina estimulada por glicose em ilhotas isoladas.
Algumas reflexões podem explicar tal efeito preventivo do exercício sobre os
efeitos da dieta hiperlipídica. Os camundongos treinados que receberam HFD
apresentaram maior sensibilidade à insulina no ITT, comparados aos animais HFD. Esta
melhor sensibilidade leva à melhora da homeostase glicêmica nos animais HFD Tr,
prevenindo o mecanismo compensatório da ilhota pancreática e, portanto, levando à
insulinemia normal nestes animais. Assim, seria possível concluir que o treinamento é
capaz de prevenir a instalação do estresse de RE pela melhora do metabolismo glicêmico.
Outra observação importante é que moléculas conhecidas como miocinas são
liberadas durante o treinamento físico pelo tecido muscular esquelético 75,77,80. Há
evidências de que estas moléculas podem reduzir apoptose na célula beta pancreática. Um
estudo mostrou que a irisina, uma miocina secretada em reposta ao exercício, protege as
células beta pancreáticas, através da ativação de ERK1/2, aumentando a expressão de
membros da família anti-apoptótica Bcl2, levando à redução da expressão de caspase 9 e
3 clivada 81. Ainda, há estudos que mostram m papel da IL-6, uma citocina liberada pelo
músculo esquelético em camundongos treinados, promovendo redução de morte celular
in vitro em células INS-1E expostas à IL-1β e ao IFN-γ, em modelo de DM1 75. Em outro
estudo, a IL-6 promoveu redução de apoptose, in vitro, através do uso de meio
condicionado, com soro de camundongos e humanos treinados, tanto em células INS-1E
quanto em células beta humanas EndoC-βH1. Nas células INS-1E houve redução de Chop
41
e Xbp1 nas células expostas à IL-1β e ao IFN-γ e que foram tratadas com o meio
condicionado. Neste trabalho, a ação específica da IL-6 foi demonstrada através do uso
de anticorpo contra esta citocina, e através da inibição de STAT-3, a principal via de ação
da IL-6 77. Dessa forma, é possível que estas, dentre outras possíveis miocinas que foram
liberadas no plasma, em nosso modelo treinado, poderiam prevenir o estresse de RE no
camundongo obeso, como observamos em nosso estudo. A limitação do nosso trabalho
foi a não avaliação dos efeitos de miocinas liberadas pelo exercício, estes experimentos
serão realizados futuramente.
5.2. Tratamento de células INS-1E com metformina
Outra particularidade deste estudo, na avaliação do estresse de RE em células beta
pancreáticas, foi o uso in vitro de metformina, como possível agente protetor. A
metformina se destaca como um dos medicamentos amplamente utilizados para o
tratamento de distúrbios do metabolismo glicêmico. Considerando o impacto de tais
distúrbios sobre a sobrevivência da célula beta pancreática, encontrar terapias que
resultem na diminuição da morte celular, impedindo consequente a instalação do DM2, é
de grande importância. Tem sido reportado o papel da metformina em inibir marcadores
apoptóticos da UPR em diversos tipos celulares 82,83. Apesar de poucos estudos
disponíveis sobre o efeito da metformina na ilhota e na célula beta, pois seu principal alvo
é o hepatócito, há evidências de que a droga pode modular a função insular 62,84.
Nós observamos que o tratamento com metformina levou à prevenção do aumento
dos marcadores canônicos de estresse de RE em células beta INS-1E, quando expostas a
droga estressora CPA. Os marcadores avaliados que apresentaram menor expressão de
RNAm foram Bip, Atf4 e Xbp1, porém não foi observada diferença significativa no
RNAm de Chop, comparados com células expostas ao CPA. Além disso, o tratamento
com metformina induziu aumento da transcrição do RNAm de Pdx-1. Estes dados
indicam que as possíveis vias moduladas pela metformina e que atenuaram os efeitos
danosos do ER foram as vias da PERK, a julgar pela menor expressão de Atf4, e o ramo
da IRE1, já que observamos diminuição de RNAm de Xbp1. Ainda, há relatos de que o
fator de transcrição Pdx-1 forma complexos com Atf4 e controla expressão gênica para
respostas apoptóticas e anti-apoptóticas, dependendo do tipo de estresse a que a célula é
exposta 85. Dentre as funções do Pdx-1 destaca-se seu papel na regulação de genes
envolvidos no enovelamento e no processamento da insulina, além de controlar a
expressão do próprio Atf4 46. Dessa forma, é possível que um aumento na expressão de
42
RNAm, nas células expostas ao CPA, de Chop, Bip, Atf4 e Xbp1, tendo em vista que os
ramos transdutores de resposta da UPR estão ativos, haja assim, uma compensação do
mecanismo de resposta ao estresse de RE. No entanto, a diminuição da expressão do
conteúdo proteico e do conteúdo de RNAm de Pdx-1 com a exposição ao CPA, sugere
uma progressão para falha das células INS-1E. Com o tratamento com metformina
observamos uma menor transcrição de RNAm pró-apoptóticos, exceto da Chop, e uma
maior expressão do conteúdo proteico e RNAm de Pdx-1, sugerindo uma possível
modulação via Pdx-1, na prevenção dos efeitos danosos da UPR. É importante salientar
que esta melhora do estado de estresse de RE mais severo (como na instalação do DM2,
por exemplo 72), com menor conteúdo proteico de CHOP no tratamento com metformina,
parece ser fundamental para que repostas anti-apoptóticas prevaleçam, mantendo
expressão de PDX-1 e, possivelmente, da insulina. Uma limitação do nosso estudo é falta
de informação quanto às modulações na secreção e expressão da insulina (serão
realizados futuramente) e uma avaliação mais precisa quanto ao papel do Pdx-1 dentre os
efeitos promovidos pela metformina.
Vale salientar que, em concentrações elevadas, a metformina potencializou o
efeito do CPA em induzir marcadores da UPR. Isso deve ser avaliado com cuidado,
quando comparado com os efeitos in vivo da metformina, pois há diferenças relevantes
quanto às doses utilizadas, em diversos modelos de animais estudados, já que o tratamento
das células beta no nosso estudo foi in vitro, por um período prolongado de tratamento
(16h). Ainda, a metformina tem como principal órgão o fígado, assim é possível que os
efeitos in vivo da metformina na célula beta possam ser indiretamente influenciados pela
função hepática, como melhora da sensibilidade à insulina, por exemplo 86.
43
6. CONCLUSÕES
Concluímos que o treinamento físico foi capaz de prevenir o estresse de RE em
ilhotas pancreáticas, bem como outros efeitos deletérios da obesidade em camundongos
C57BL/6. Ainda, o tratamento com metformina em células INS-1E expostas ao CPA,
preveniu parcialmente a indução do estresse de RE, possivelmente, pelo aumento da
expressão de Pdx-1, impedindo a progressão para um estresse severo, como no DM2.
44
7. REFERENCIAS
1. Paul Langerhans. 1888 (1888).
2. Ionescu-Tirgoviste, C. et al. A 3D map of the islet routes throughout the healthy
human pancreas. Sci. Rep. (2015). doi:10.1038/srep14634
3. Bonner-Weir, S., Sullivan, B. A. & Weir, G. C. Human Islet Morphology
Revisited: Human and Rodent Islets Are Not So Different After All. J.
Histochem. Cytochem. (2015). doi:10.1369/0022155415570969
4. Da Silva Xavier, G. The Cells of the Islets of Langerhans. J. Clin. Med. 7, 54
(2018).
5. Campos, C. Chronic hyperglycemia and glucose toxicity: Pathology and clinical
sequelae. Postgrad. Med. (2012). doi:10.3810/pgm.2012.11.2615
6. Srinivasan, V. A. R., Raghavan, V. A. & Parthasarathy, S. Biochemical Basis and
Clinical Consequences of Glucolipotoxicity. Heart Fail. Clin. 8, 501–511 (2012).
7. Komatsu, M., Takei, M., Ishii, H. & Sato, Y. Glucose-stimulated insulin
secretion: A newer perspective. J. Diabetes Investig. 4, 511–516 (2013).
8. Röder, P. V., Wu, B., Liu, Y. & Han, W. Pancreatic regulation of glucose
homeostasis. Exp. Mol. Med. 48, e219–e219 (2016).
9. Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J. & Martinez-Sanchez, A. Pancreatic β-
cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion. Biochem. J.
466, 203–218 (2015).
10. Ashcroft, F. M., Harrison, D. E. & Ashcroft, S. J. H. Glucose induces closure of
single potassium channels in isolated rat pancreatic β-cells. Nature 312, 446–448
(1984).
11. Rorsman, P. The pancreatic beta-cell as a fuel sensor: an electrophysiologist’s
viewpoint. Diabetologia 40, 487–495 (1997).
12. Mosthaf, L. et al. Functionally distinct insulin receptors generated by tissue-
specific alternative splicing. EMBO J. (1990).
13. Pessin, J. E. & Saltiel, A. R. Signaling pathways in insulin action: molecular
targets of insulin resistance. J. Clin. Invest. 106, 165–169 (2000).
14. Patti, M. E. & Kahn, C. R. The Insulin Receptor- A Critical Link In Glucose
Homeostasis And Insulin Action. J. Basic Clin. Physiol. Pharmacol. 10, 1–14
(1999).
15. Haeusler, R. A., McGraw, T. E. & Accili, D. Metabolic Signalling: Biochemical
and cellular properties of insulin receptor signalling. Nature Reviews Molecular
Cell Biology (2018). doi:10.1038/nrm.2017.89
16. Avruch, J. Insulin signal transduction through protein kinase cascades. Molecular
and Cellular Biochemistry (1998). doi:10.1023/A:1006823109415
17. Yamauchi, T. et al. Insulin signalling and insulin actions in the muscles and
livers of insulin-resistant, insulin receptor substrate 1-deficient mice. Mol. Cell.
Biol. (1996).
45
18. Rask-Madsen, C. & Kahn, C. R. Tissue-specific insulin signaling, metabolic
syndrome, and cardiovascular disease. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. (2012).
doi:10.1161/ATVBAHA.111.241919
19. Sisley, S. & Sandoval, D. Hypothalamic control of energy and glucose
metabolism. Rev. Endocr. Metab. Disord. 12, 219–233 (2011).
20. Saad, M. J. A., Carvalho, C. R. O., Thirone, A. C. P. & Velloso, L. A. Insulin
Induces Tyrosine Phosphorylation of JAK2 in Insulin-sensitive Tissues of the
Intact Rat. J. Biol. Chem. 271, 22100–22104 (1996).
21. Gregor, M. F. & Hotamisligil, G. S. Inflammatory Mechanisms in Obesity. Annu.
Rev. Immunol. 29, 415–445 (2011).
22. Glucose and Lipid Metabolism. in Glucose Homeostasis and Insulin Resistance
(2012). doi:10.2174/978160805189211101010001
23. Catalano, K. J. et al. Insulin resistance induced by hyperinsulinemia coincides
with a persistent alteration at the insulin receptor tyrosine kinase domain. PLoS
One (2014). doi:10.1371/journal.pone.0108693
24. Ye, J. Mechanisms of insulin resistance in obesity. Frontiers of Medicine in
China (2013). doi:10.1007/s11684-013-0262-6
25. Wickner, W. & Schekman, R. Protein translocation across biological membranes.
Science (2005). doi:10.1126/science.1113752
26. Rashid, H.-O., Yadav, R. K., Kim, H.-R. & Chae, H.-J. ER stress: Autophagy
induction, inhibition and selection. Autophagy 11, 1956–1977 (2015).
27. Schröder, M. & Kaufman, R. J. ER stress and the unfolded protein response.
Mutat. Res. Mol. Mech. Mutagen. 569, 29–63 (2005).
28. Ron, D. & Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded
protein response. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 519–529 (2007).
29. Lee, A.-H., Iwakoshi, N. N. & Glimcher, L. H. XBP-1 regulates a subset of
endoplasmic reticulum resident chaperone genes in the unfolded protein
response. Mol. Cell. Biol. (2003).
30. Hollien, J. & Weissman, J. S. Decay of Endoplasmic Reticulum-Localized
mRNAs During the Unfolded Protein Response. Science (80-. ). 313, 104–107
(2006).
31. Urano, F. Coupling of Stress in the ER to Activation of JNK Protein Kinases by
Transmembrane Protein Kinase IRE1. Science (80-. ). 287, 664–666 (2000).
32. Eizirik, D. L., Cardozo, A. K. & Cnop, M. The role for endoplasmic reticulum
stress in diabetes mellitus. Endocr. Rev. 29, 42–61 (2008).
33. Haze, K., Yoshida, H., Yanagi, H., Yura, T. & Mori, K. Mammalian
Transcription Factor ATF6 Is Synthesized as a Transmembrane Protein and
Activated by Proteolysis in Response to Endoplasmic Reticulum Stress. Mol.
Biol. Cell 10, 3787–3799 (1999).
34. Bertolotti, A., Zhang, Y., Hendershot, L. M., Harding, H. P. & Ron, D. Dynamic
interaction of BiP and ER stress transducers in the unfolded-protein response.
46
Nat. Cell Biol. 2, 326–332 (2000).
35. Harding, H. P., Zhang, Y. & Ron, D. Protein translation and folding are coupled
by an endoplasmic- reticulum-resident kinase. Nature (1999). doi:10.1038/16729
36. Harding, H. P. et al. Regulated Translation Initiation Controls Stress-Induced
Gene Expression in Mammalian Cells. Mol. Cell 6, 1099–1108 (2000).
37. Jousse, C. et al. Inhibition of a constitutive translation initiation factor 2α
phosphatase, CReP, promotes survival of stressed cells. J. Cell Biol. (2003).
doi:10.1083/jcb.200308075
38. Marciniak, S. J. et al. CHOP induces death by promoting protein synthesis and
oxidation in the stressed endoplasmic reticulum. Genes Dev. (2004).
doi:10.1101/gad.1250704
39. Cnop, M., Foufelle, F. & Velloso, L. A. Endoplasmic reticulum stress, obesity
and diabetes. Trends Mol. Med. 18, 59–68 (2012).
40. Cnop, M., Ladrière, L., Igoillo-Esteve, M., Moura, R. F. & Cunha, D. A. Causes
and cures for endoplasmic reticulum stress in lipotoxic β-cell dysfunction.
Diabetes, Obes. Metab. 12, 76–82 (2010).
41. Boslem, E. et al. A lipidomic screen of palmitate-treated MIN6 β-cells links
sphingolipid metabolites with endoplasmic reticulum (ER) stress and impaired
protein trafficking. Biochem. J. 439, 517–518 (2011).
42. Matveyenko, A. V., Gurlo, T., Daval, M., Butler, A. E. & Butler, P. C.
Successful versus failed adaptation to high-fat diet-induced insulin resistance:
The role of IAPP-induced β-cell endoplasmic reticulum stress. Diabetes (2009).
doi:10.2337/db08-1464
43. Pirot, P. et al. Global profiling of genes modified by endoplasmic reticulum
stress in pancreatic beta cells reveals the early degradation of insulin mRNAs.
Diabetologia 50, 1006–1014 (2007).
44. Pirot, P., Eizirik, D. L. & Cardozo, A. K. Interferon-γ potentiates endoplasmic
reticulum stress-induced death by reducing pancreatic beta cell defence
mechanisms. Diabetologia 49, 1229–1236 (2006).
45. Melloul, D. Transcription factors in islet development and physiology: Role of
PDX-1 in beta-cell function. Annals of the New York Academy of Sciences
(2004). doi:10.1196/annals.1294.003
46. Sachdeva, M. M. et al. Pdx1 ( MODY4 ) regulates pancreatic beta cell
susceptibility to ER stress. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 19090–19095 (2009).
47. Cunha, D. A. et al. Initiation and execution of lipotoxic ER stress in pancreatic -
cells. J. Cell Sci. 121, 2308–2318 (2008).
48. Song, B., Scheuner, D., Ron, D., Pennathur, S. & Kaufman, R. J. Chop deletion
reduces oxidative stress, improves β cell function, and promotes cell survival in
multiple mouse models of diabetes. J. Clin. Invest. 118, 3378–3389 (2008).
49. Seo, H.-Y. et al. Endoplasmic Reticulum Stress-Induced Activation of Activating
Transcription Factor 6 Decreases Insulin Gene Expression via Up-Regulation of
Orphan Nuclear Receptor Small Heterodimer Partner. Endocrinology 149, 3832–
47
3841 (2008).
50. Stumvoll, M., Nurjhan, N., Perriello, G., Dailey, G. & Gerich, J. E. Metabolic
Effects of Metformin in Non-Insulin-Dependent Diabetes Mellitus. N. Engl. J.
Med. 333, 550–554 (1995).
51. Viollet, B. Targeting the AMPK pathway for the treatment of Type 2 diabetes.
Front. Biosci. Volume, 3380 (2009).
52. Carling, D. The AMP-activated protein kinase cascade – a unifying system for
energy control. Trends Biochem. Sci. 29, 18–24 (2004).
53. Hardie, D. G., Carling, D. & Carlson, M. The AMP-activated/SNF1 protein
kinase subfamily: metabolic sensors of the eukaryotic cell? Annu. Rev. Biochem.
(1998). doi:10.1146/annurev.biochem.67.1.821
54. Guo, H. et al. AMPK enhances the expression of pancreatic duodenal homeobox-
1 via PPARα, but not PPARγ, in rat insulinoma cell line INS-1. Acta Pharmacol.
Sin. 31, 963–969 (2010).
55. Inoki, K., Ouyang, H., Li, Y. & Guan, K.-L. Signaling by Target of Rapamycin
Proteins in Cell Growth Control. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 69, 79–100 (2005).
56. RUTTER, G. A., da SILVA XAVIER, G. & LECLERC, I. Roles of 5′-AMP-
activated protein kinase (AMPK) in mammalian glucose homoeostasis. Biochem.
J. (2003). doi:10.1042/bj20030048
57. Gleason, C. E., Lu, D., Witters, L. A., Newgard, C. B. & Birnbaum, M. J. The
role of AMPK and mTOR in nutrient sensing in pancreatic β-cells. J. Biol. Chem.
(2007). doi:10.1074/jbc.M610631200
58. Düfer, M., Noack, K., Krippeit-Drews, P. & Drews, G. Activation of the AMP-
activated protein kinase enhances glucose-stimulated insulin secretion in mouse
beta-cells. Islets (2010).
59. Kim, W.-H. et al. AICAR potentiates ROS production induced by chronic high
glucose: Roles of AMPK in pancreatic β-cell apoptosis. Cell. Signal. 19, 791–805
(2007).
60. Kefas, B. A. et al. AICA-riboside induces apoptosis of pancreatic beta cells
through stimulation of AMP-activated protein kinase. Diabetologia (2003).
doi:10.1007/s00125-002-1030-3
61. Kefas, B. et al. AMP-activated protein kinase can induce apoptosis of insulin-
producing MIN6 cells through stimulation of c-Jun-N-terminal kinase. J. Mol.
Endocrinol. 151–161 (2003). doi:10.1677/jme.0.0300151
62. Dai, Y.-L., Huang, S.-L. & Leng, Y. AICAR and Metformin Exert AMPK-
dependent Effects on INS-1E Pancreatic β-cell Apoptosis via Differential
Downstream Mechanisms. Int. J. Biol. Sci. 11, 1272–1280 (2015).
63. El-Assaad, W. et al. Saturated fatty acids synergize with elevated glucose to
cause pancreatic β-cell death. Endocrinology (2003). doi:10.1210/en.2003-0410
64. Mikines, K. J., Sonne, B., Farrell, P. A., Tronier, B. & Galbo, H. Effect of
training on the dose-response relationship for insulin action in men. J. Appl.
Physiol. 66, 695–703 (1989).
48
65. Tjønna, A. E. et al. Aerobic Interval Training Versus Continuous Moderate
Exercise as a Treatment for the Metabolic Syndrome. Circulation 118, 346–354
(2008).
66. Tjønna, A. E. et al. Aerobic interval training reduces cardiovascular risk factors
more than a multitreatment approach in overweight adolescents. Clin. Sci. 116,
317–326 (2009).
67. Corte de Araujo, A. C. et al. Similar health benefits of endurance and high-
intensity interval training in obese children. PLoS One (2012).
doi:10.1371/journal.pone.0042747
68. Little, J. P. et al. Low-volume high-intensity interval training reduces
hyperglycemia and increases muscle mitochondrial capacity in patients with type
2 diabetes. J. Appl. Physiol. (2011). doi:10.1152/japplphysiol.00921.2011
69. Frøsig, C. et al. Effects of Endurance Exercise Training on Insulin Signaling in
Human Skeletal Muscle. Diabetes 56, 2093–2102 (2007).
70. Johnson, N. A. et al. Aerobic exercise training reduces hepatic and visceral lipids
in obese individuals without weight loss. Hepatology (2009).
doi:10.1002/hep.23129
71. Jordy, A. B. et al. Analysis of the liver lipidome reveals insights into the
protective effect of exercise on high-fat diet-induced hepatosteatosis in mice. Am.
J. Physiol. Metab. 308, E778–E791 (2015).
72. Király, M. A. et al. Swim training prevents hyperglycemia in ZDF rats:
mechanisms involved in the partial maintenance of β-cell function. Am. J.
Physiol. Metab. 294, E271–E283 (2008).
73. Delghingaro-Augusto, V. et al. Voluntary running exercise prevents β-cell failure
in susceptible islets of the Zucker diabetic fatty rat. Am. J. Physiol. Metab.
(2011). doi:10.1152/ajpendo.00360.2011
74. L.I., K., R.E., B., C.A., S., J.O., H. & M.A., P. Coordinate reduction of rat
pancreatic islet glucokinase and proinsulin mRNA by exercise training. Diabetes
40, 401–404 (1991).
75. Paula, F. M. M. et al. Exercise increases pancreatic β -cell viability in a model of
type 1 diabetes through IL-6 signaling. FASEB J. 29, 1805–1816 (2015).
76. Livak, K. J. & Schmittgen, T. D. Analysis of Relative Gene Expression Data
Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method. Methods 25, 402–
408 (2001).
77. Paula, F. M. M. et al. Exercise training protects human and rodent β cells against
endoplasmic reticulum stress and apoptosis. FASEB J. 32, 1524–1536 (2018).
78. Engin, F., Nguyen, T., Yermalovich, A. & Hotamisligil, G. S. Aberrant islet
unfolded protein response in type 2 diabetes. Sci. Rep. 4, 4054 (2015).
79. Chan, J. Y., Luzuriaga, J., Bensellam, M., Biden, T. J. & Laybutt, D. R. Failure
of the Adaptive Unfolded Protein Response in Islets of Obese Mice Is Linked
With Abnormalities in -Cell Gene Expression and Progression to Diabetes.
Diabetes 62, 1557–1568 (2013).
49
80. Calegari, V. C. et al. Endurance training stimulates growth and survival pathways
and the redox balance in rat pancreatic islets. J. Appl. Physiol. 112, 711–718
(2012).
81. Liu, S. et al. Effects and underlying mechanisms of irisin on the proliferation and
apoptosis of pancreatic β cells. PLoS One 12, e0175498 (2017).
82. Thériault, J. R., Palmer, H. J. & Pittman, D. D. Inhibition of the Unfolded Protein
Response by metformin in renal proximal tubular epithelial cells. Biochem.
Biophys. Res. Commun. 409, 500–505 (2011).
83. Terai, K. et al. AMP-Activated Protein Kinase Protects Cardiomyocytes against
Hypoxic Injury through Attenuation of Endoplasmic Reticulum Stress. Mol. Cell.
Biol. 25, 9554–9575 (2005).
84. Langelueddecke, C. et al. Effect of the AMP-Kinase Modulators AICAR,
Metformin and Compound C on Insulin Secretion of INS-1E Rat Insulinoma
Cells under Standard Cell Culture Conditions. Cell. Physiol. Biochem. 29, 75–86
(2012).
85. Juliana, C. A. et al. A PDX1-ATF transcriptional complex governs β cell survival
during stress. Mol. Metab. 17, 39–48 (2018).
86. Rena, G., Hardie, D. G. & Pearson, E. R. The mechanisms of action of
metformin. Diabetologia 60, 1577–1585 (2017).
50
Anexo 1
Dietas controle e hiperlipídica
Ingredientes Dieta controle
g/Kg
Dieta hiperlipídica
g/Kg
Caseína (84% de
proteína)*
140 140
Amido 465,7 208,7
Dextrina 155 100
Sacarose 100 100
L-cistina 1,8 1,8
Fibra pH 101 ou pH102
(microcelulose)
50 50
Óleo de soja 40 40
Mistura de sais AIN93G** 35 35
Mistura de vitaminas
AIN93G**
10 10
Cloridrato de Colina ou
Bitartarato de Colina
2,5 2,5
Banha Animal ----- 312
Fornecedor: PragSoluções, Jaú, São Paulo
51
Anexo 2
52
Anexo 3