infiltrado celular e lesões cutâneas na orelha de cães … · moderadas do processo...
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Infiltrado celular e lesões cutâneas na orelha de cães naturalmente infectados
por Leishmania infantum
Cellular infiltrate and cutaneous lesions in the ear of dogs naturally infected with
Leishmania infantum
Társsila Mara Vieira FERREIRA1, Stephanie Caroline Bezerra SOUZA2, Emmanuel
Teles SALES1, Camila Goersh BARROSO1, Belarmino Eugênio LOPES-NETO1,
Virgínia Cláudia Carneiro GIRÃO3, Diana Célia Sousa NUNES-PINHEIRO4
1 Médico Veterinário e Pós-graduando do Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV). Faculdade de Veterinária (FAVET), Universidade Estadual do Ceará (UECE). 2Graduando em Medicina Veterinária / FAVET/ UECE, [email protected]. 3Professora do Programa de Pós-graduação em Ciências Morfofuncionais. Universidade Federal do Ceará (UFC). 4 Professora do Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias e Graduação em Medicina Veterinária. FAVET/ UECE. Av.Dr. Silas Munguba, 1700, Campus do Itaperi, Fortaleza-CE. CEP:60.714-903.
RESUMO
A pele é o sítio de entrada de muitos patógenos, dentre eles o protozoário
Leishmania infantum, que é inoculado por meio da picada de vetores flebotomíneos
infectados. A infecção induz a uma resposta imune cutânea, resultando no
recrutamento de células imunes e liberação de mediadores inflamatórios o que pode
levar ao desenvolvimento de alterações na pele. O objetivo desse estudo foi
caracterizar o padrão celular inflamatório e as lesões cutâneas presentes na orelha
de cães naturalmente infectados por L. infantum. Para tanto, cães (n=18)
naturalmente infectados por L. infantum foram subdivididos, com base na presença
ou ausência de lesões cutâneas na orelha, em grupo sintomático (SD, n = 12) e
grupo assintomático (AD, n = 6), respectivamente. Cinco cães não infectados (CD)
foram incluídos como controle. As amostras de biópsias de pele foram coletadas do
terço superior da orelha e processadas por histologia de rotina, coradas por HE e
azul de toluidina, e imunoistoquímica. A dermatite ulcerativa e alopecia foram as
dermatopatias mais frequentes nos cães. A maioria dos fragmentos apresentou
intensidade inflamatória discreta a moderada com distribuição multifocal do infiltrado
celular na derme superficial e profunda, composto principalmente por macrófagos,
plasmócitos e linfócitos. Observaram-se correlações e influências positivas
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moderadas do processo inflamatório sobre a alopecia e dermatite ulcerativa,
respectivamente. Presença discreta dos mastócitos foi observada nos cães
naturalmente infectados, havendo maior expressão de mastócitos em SD com
infiltrado intenso e AD sem infiltrado celular. Nesse contexto, concluiu-se que na
leishmaniose canina, o infiltrado celular inflamatório influencia diretamente no
aparecimento de lesões cutâneas na pele, tais como dermatite ulcerativa e alopecia,
contudo não foi observada associação entre os mastócitos e a evolução clínica
dessa enfermidade.
Palavras-chave: Leishmaniose visceral canina, aspectos dermatológicos, pele da
orelha, sistema imunológico cutâneo, inflamação.
Keywords: Canine visceral leishmaniasis, dermatological aspects, ear skin,
cutaneous immune system, inflammation.
1. Introdução
A pele corresponde a primeira barreira de defesa física e imunológica à
entrada de substâncias ambientais e microorganismos potencialmente prejudicais
ao organismo. A epiderme e a derme estão relacionadas com o sistema imune
cutâneo através das células imunes especializadas presentes, que são
responsáveis por iniciar e regular a resposta imunológica a fim de restaurar e manter
a homeostase da pele (NESTLE et al., 2009; PASPARAKIS et al., 2014).
Esse tecido está em constante agressão pelos antígenos exógenos que
podem desregular a resposta imunológica e levar ao desenvolvimento de reações
inflamatórias. A invasão dos antígenos na pele causa dano tecidual, promovendo a
ativação das células residentes na epiderme, como os queratinócitos e as células de
Langerhans, através do reconhecimento de padrões moleculares associados ao
dano (DAMPs) e proteínas moleculares associadas aos patógenos (PAMPs). A
interação entre os PAMPs e os receptores toll-like (TLRs) expressos nessas células
estimulam a liberação de citocinas, incluindo o fator de necrose tumoral (TNF-ɑ ) e
quimiocinas pró-inflamatórias, as quais promovem a ativação e o recrutamento de
células efetoras, como as células dendríticas, os mastócitos, os macrófagos, os
monócitos e as células linfóides, para o sítio da infecção. Então, um processo
inflamatório se estabelece no local promovendo alterações teciduais (NESTLE et al.,
2009; PASPARAKIS et al., 2014; BELKAID & TAMOUTOUNOUR, 2016).
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Na leishmaniose canina, o envolvimento cutâneo possui grande importância
uma vez que a infecção inicia-se nesse órgão através da picada de vetores
flebotomíneos. Esses agentes transmissores promovem dano à barreira cutânea por
meio da injeção intradérmica da probóscide a fim de inocular as formas
promastigotas correspondente ao estágio infectante do protozoário L. infantum, cujo
é parasita intracelular do sistema fagocítico mononuclear (PAPADOGIANNAKIS &
KOUTINAS, 2015; SCOTT & NOVAIS, 2016).
Tendo em vista a importância da pele como porta de entrada de patógenos e
as manifestações clínicas dermatológicas nos cães com leishmaniose, esse estudo
visa caracterizar o padrão celular inflamatório e as lesões cutâneas presentes na
orelha de cães naturalmente infectados por L. infantum.
2. Metodologia
Cães adultos (n=23) capturados pelo Centro de Controle de Zoonoses em
Fortaleza (Ceará, Brasil), foram incluídos nesse estudo. O diagnóstico de
Leishmaniose Visceral Canina (LVC) foi baseado no teste rápido DPP LVC Bio-
Manguinhos® associado ao teste sorológico ELISA. Dezoito cães naturalmente
infectados por Leishmania infantum foram subdivididos, com base na presença ou
ausência de alterações clinico-dermatológicas na orelha, em: grupo assintomático
(AD, n = 5), sem lesões cutâneas; e grupo sintomático (SD, n = 13), com lesões
cutâneas, incluindo alopecia, descamação, eritema, edema, despigmentação,
hiperqueratose, liquenificação, úlceras e crostas. Cães sem manifestações clínico-
dermatológicas e que apresentaram resultados negativos nesses testes foram
considerados não infectados e incluídos como o grupo controle (CD, n = 5).
Os cães foram anestesiados e eutanasiados, em seguida amostras de tecido
da pele foram colhidas do terço superior da orelha, íntegra ou com lesões. Quanto
aos cães do grupo controle, o local biopsiado foi anestesiado com lidocaína a 2% e
realizada a colheita do fragmento da orelha.
As amostras coletadas foram fixadas em formalina tamponada a 10%, e
posteriormente submetidas ao processamento histológico e imunohistoquímico. Os
cortes histológicos foram corados pelas técnicas rotineiras de Hematoxilina e Eosina
(HE) para análise das alterações histológicas e Azul de Toluidina para identificação
dos mastócitos. Foram avaliados o grau de infiltração celular (ausente, discreta,
moderada e intensa) na derme e o tipo do infiltrado, bem como a intensidade de
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coloração de mastócitos (ausente, discreta, moderada e intensa). Secções cutâneas
foram imunomarcadas para formas amastigotas de L. infantum cuja intensidade de
coloração foram classificadas em nenhuma, leve, moderada e intensa. As análises
foram realizadas sob um microscópio óptico com aumento de 200x.
As análises foram realizadas no programa estatístico computacional
GraphPadPrism 5.0. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão,
adotando um nível de significância de p < 0,05. As alterações clínicas foram
expressas em percentagem. O infiltrado inflamatório e as alterações dermatológicas
foram classificados em escores: 0 (ausente), 1 (discreto), 2 (moderado) e 3
(intenso), para aplicação do teste de correlação de Spearman (ρ).
O protocolo experimental foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em
Uso de Animais (CEUA) da Universidade Estadual do Ceará (UECE) sob protocolo
nº6459434/2015.
3. Resultados e Discussão
Os achados clínicos dermatológicos na orelha são mostrados nas Figuras 1
e 2. Entre as lesões cutâneas, dermatite ulcerativa e alopecia foram as
dermatopatias mais frequentes nos cães, observadas em 44,4% (8/18) e 61,1%
(11/18) dos animais respectivamente (Fig. 2). Todos os sinais clínicos
dermatológicos observados para SD foram relatados para cães infectados por L.
infantum (REIS et al., 2009; SARIDOMICHELAKIS & KOUTINAS, 2014).
A maioria dos fragmentos de orelha dos cães SD apresentou intensidade
inflamatória moderada a intensa (Fig.3C e 3A). A reação inflamatória foi
caracterizada por um infiltrado celular com distribuição multifocal na derme
superficial e profunda composto por células mononucleares como macrófagos,
plasmócitos e linfócitos. Neutrófilos e hemácias extravasculares também foram
observados nesse cenário. Foram detectadas amastigostas de L. infantum
imunomarcadas em SD e AD (Fig. 4). Esses achados consistem com estudos
realizados previamente associando o parasitismo cutâneo e o padrão inflamatório na
derme da orelha de cães com leishmaniose visceral (DOS-SANTOS et al., 2004;
GIUNCHETTI et al., 2006; FIGUEIREDO et al., 2010; MENEZES-SOUZA et al.
2012).
Também verificamos correlações (ρ = 0.31 e ρ = 0.33) e influências positivas
moderadas (y = 0.57 + 0.4x e y = 0.34 + 0.24x) do processo inflamatório sobre a
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alopecia e dermatite ulcerativa, respectivamente (Fig. 5). A infecção da pele por L.
infantum promove o recrutamento de células inflamatórias, que por sua vez liberam
mediadores que podem estar envolvidos com o desenvolvimento das alterações
cutâneas. Desse modo, a infiltração celular dérmica pode ser identificada em maior
intensidade em cães com infecção clínica, ou seja, que apresentam lesões
dermatológicas em decorrência do progresso da infecção (GIUNCHETTI et al., 2006;
MOREIRA et al. 2013, PAPADOGIANNAKIS & KOUTINAS, 2015).
Quanto à presença de mastócitos, foi observada uma intensidade de
coloração discreta nos cães naturalmente infectados (Fig. 3) quando comparado ao
CD (dado não mostrado) (MENEZES-SOUZA et al., 2012). Por outro lado, SD com
infiltrado intenso (Fig. 3B) e AD sem infiltrado celular (Fig. 3H) apresentaram uma
maior expressão de mastócitos em relação aos outros animais (Fig. D e F).
Resultado contraditório evidenciando uma maior expressão dessas células foi
relatado em outro estudo (CALABRESE et al.,2010).
Os mastócitos estão localizados ao redor dos pequenos vasos na pele e
atuam como células sentinelas contribuindo efetivamente na resposta imune inata à
parasitas. Na leishmaniose cutânea, a expressão tecidual dos mastócitos pode
variar em detrimento do perfil de citocinas no microambiente da infecção e espécies
diferentes de Leishmania spp. (TUON et al., 2008; ROMÃO et al., 2009; MENEZES-
SOUZA et al., 2012). Eles estão entre as primeiras células que interagem com o
protozoário Leishmania spp., liberando mediadores inflamatórios que estimulam a
inflamação e citocinas que modulam a imunidade mediada por células específica ao
patógeno. Nesse contexto, os padrões de citocinas liberados pelos mastócitos
variam de acordo com o seu estímulo de ativação (Kritas et al., 2013; Rodríguez &
Wilson, 2014).
4. Conclusão
Na leishmaniose canina, o infiltrado celular inflamatório influencia
diretamente no aparecimento de lesões cutâneas na pele, tais como dermatite
ulcerativa e alopecia, contudo não foi observada associação entre mastócitos e a
evolução clínica dessa enfermidade. Desse modo, faz-se necessário estudar a
participação dos mediadores liberados pelos mastócitos no microambiente avaliado.
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Figura 1. Lesões macroscópicas na orelha de cães com leishmaniose visceral. A,
orelha sem lesões; B, C, E e F, alopecia; B e D, úlceras; C, eritema e crostas; E,
liquenificação; F, úlceras, hiperpigmentação e crostas.
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Figura 2. Aspectos clínicos e dermatológicos da pele de orelha de cães naturalmente
infectados por Leishmania infantum .
33,3
44,4
11,1
5,6
61,1
5,6
5,6
5,6
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0
Dermatite crostosa
Dermatite ulcerativa
Dermatite esfoliativa seca
Deratite eritematosa
Alopecia
Hiperpigmentação
Liquenificação
Edema
Porcentagem (%)
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Figura 3. Imagens histológicas da pele da orelha de cães com leishmaniose visceral.
A e B, cães sintomáticos (SD) com infiltrado inflamatório intenso (I.I.); C e D, cães
sintomáticos (SD) com infiltrado inflamatório moderado (I.M); E e F, cães
sintomáticos (SD) com infiltrado inflamatório discreto (I.D.); G e H, cães
assintomáticos (AD) sem infiltrado celular infalmatório (I.C). HE 200x, A,C, E e G; AT
(Azul de Toluidina) 200x B, D, F e H.
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Figura 4. Imunohistoquímica da pele da orelha de cães com leishmaniose. A e C,
fotomicrografia dos cães assintomáticos (AD) sem infiltrado celular (I.C.) e discreta
coloração para Leishmania infantum+, respectivamente; B e D, fotomicrografia dos
cães sintomáticos (SD) com infiltrado inflamatório moderado (I.M) e moderada
coloração para L.infantum +, respectivamente. HE 200x, A e B; Estreptoavidina-
peroxidase contra-corada com Hematoxilina de Mayer, 200x, C e D.
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Figura 5. Alterações clínicas dermatológicas, alopecia (A) e dermatite ulcerative (B),
e o infiltrado celular inflamatório. Os índices de correlação de Spearman (valores ρ)
são mostrados nos gráficos.
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