imunologia 2001/2002prof.doutor josé cabeda immunologia teoria clonal características dos epitopes...

2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda Imunologia

Immunologia

Teoria ClonalTeoria Clonal

Características dos Epitopes T e BCaracterísticas dos Epitopes T e B

Linfócitos B, Linfócitos TLinfócitos B, Linfócitos T

ImunoglobulinasImunoglobulinas

Recombinação somáticaRecombinação somática

2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda Imunologia

Os Linfócitos T e B

Características dos Epitopes T e BCaracterísticas dos Epitopes T e B A teoria clonalA teoria clonal Linfócitos BLinfócitos B

ImunoglobulinasImunoglobulinas Os linfócitos B na resposta ImunológicaOs linfócitos B na resposta Imunológica

Linfócitos TLinfócitos T Subtipos de Linfócitos TSubtipos de Linfócitos T


Propriedades dos epitopes B As características dos epitopes B são determinadas pela As características dos epitopes B são determinadas pela

conformação do epitope e do anticorpoconformação do epitope e do anticorpo Modelo da chave fechaduraModelo da chave fechadura Tamanho limitado pelo tamanho do anticorpoTamanho limitado pelo tamanho do anticorpo Dois modelosDois modelos

O epitope encaixa num “bolso” do anticorpoO epitope encaixa num “bolso” do anticorpo• Carbohidratos, oligonucleótidos, haptenosCarbohidratos, oligonucleótidos, haptenos

O epitope consiste numa superfície externa de uma O epitope consiste numa superfície externa de uma estrutura mais complexa, a qual é complementar da estrutura mais complexa, a qual é complementar da do anticorpodo anticorpo

• Proteínas globularesProteínas globulares O epitope é sempre uma zona externa e acessívelO epitope é sempre uma zona externa e acessível Numa proteína o epitope pode conter a.a. não sequenciaisNuma proteína o epitope pode conter a.a. não sequenciais Os epitopes B tendem a consistir em regiões flexíveis dos Os epitopes B tendem a consistir em regiões flexíveis dos

imunogéniosimunogénios Proteínas complexas têm múltiplos epitopes B, alguns dos Proteínas complexas têm múltiplos epitopes B, alguns dos

quais são imunodominantesquais são imunodominantes


Propriedades dos epitopes T Se a imunização for feita com epitopes nativosSe a imunização for feita com epitopes nativos

A memória B é restrita a epitopes nativosA memória B é restrita a epitopes nativos A memória T inclui epitopes nativos e desnaturadosA memória T inclui epitopes nativos e desnaturados

As células T não reconhecem antigénios solúveis nativos, mas As células T não reconhecem antigénios solúveis nativos, mas antigénios processados pelas APC e apresentados pelo MHCantigénios processados pelas APC e apresentados pelo MHC

Péptidos antigénicos para as células T formam um complexo Péptidos antigénicos para as células T formam um complexo tripartido: MHC-Antigénio-TCRtripartido: MHC-Antigénio-TCR

Os Antigénios têm que ter:Os Antigénios têm que ter: zonas de afinidade ao MHC (a agregotope) zonas de afinidade ao MHC (a agregotope)

• Baixa selectividade (muitos péptidos ligam-se ao Baixa selectividade (muitos péptidos ligam-se ao mesmo MHC)mesmo MHC)

zonas de afinidade ao TCR( o epitope)zonas de afinidade ao TCR( o epitope)• Alta selectividade Alta selectividade

Os epitopes T são sempre sequenciaisOs epitopes T são sempre sequenciais Os epitopes T são frequentemente internos na moléculaOs epitopes T são frequentemente internos na molécula Os epitopes dominantes são determinados em parte pelo MHCOs epitopes dominantes são determinados em parte pelo MHC


A teoria clonal (I)


A teoria clonal (II)


A teoria clonal (III)


No. of cell divisions

No. ofcells with

usefulspecificity

Threshold ofprotective effectorfunction

Selecção clonal induz proliferação e aumenta a frequencia das células efectoras


Antigen receptors recognising self antigens can be individually purged from the antigen receptor REPERTOIRE before clonal expansion

!!!!Cells specific for self antigen!!!!

Opportunity to remove harmful specificity at an early stage of

developmentIMMUNOLOGICAL TOLERANCE

Clonal nature of adaptive immune responseallows for removal of harmful cells


Estrutura das Imunoglobulinas (I)

Uma zona constante Uma zona constante que determina a função que determina a função efectoraefectora

Uma zona variável que Uma zona variável que determina a determina a especificidadeespecificidade


Estrutura das Imunoglobulinas (II)

Cada zona é formada Cada zona é formada por 2 cadeias por 2 cadeias polipeptidicas unidas polipeptidicas unidas por pontes disulfureto:por pontes disulfureto: Cadeia Leve (L)Cadeia Leve (L)

ou ou Cadeia Pesada (H)Cadeia Pesada (H)

ou ou


Estrutura das Imunoglobulinas (III)

Cada cadeia é formada Cada cadeia é formada por domínios:por domínios: Cadeia HCadeia H

VVHH, C, CHH1, C1, CHH2, C2, CHH33

Cadeia LCadeia LV, CV, CLL


Estrutura das Imunoglobulinas (IV)

Decomposição química Decomposição química das Igdas Ig FcFc FabFab F(ab’)F(ab’)22

Cadeias L e HCadeias L e H


Classes das Imunoglobulinas (I) A classe das A classe das

imunoglobulinas é imunoglobulinas é determinada pelo determinada pelo isotipo da respectiva isotipo da respectiva cadeia pesadacadeia pesada


Classes das Imunoglobulinas (II)


Domínios das imunoglobulinas

Cadeias Cadeias Estabilizadas por S-SEstabilizadas por S-S Domínios hipervariáveis nas Domínios hipervariáveis nas

zonas de ligação das cadeias bzonas de ligação das cadeias b


O domínio da região variável

Regiões hipervariáveis (HV)Regiões hipervariáveis (HV) Formam a zona de ligação ao antigénio Formam a zona de ligação ao antigénio

(Complementary Determining Region)(Complementary Determining Region) Situam-se nos “loops” entre as cadeias Situam-se nos “loops” entre as cadeias Flexíveis => modificações conformacionais Flexíveis => modificações conformacionais

após a ligação ao antigénioapós a ligação ao antigénio

Regiões Framework (FR)Regiões Framework (FR)


O domínio das regiões constantes CCLL e C e CHH11

Extendem os braços Fab, Extendem os braços Fab, aumentando sua rotação máximaaumentando sua rotação máxima

Mantêm juntos o VMantêm juntos o VHH e V e VL L (S-S)(S-S) Aumenta o número de combinações Aumenta o número de combinações

VVHH/V/VL L possíveis, estabilizando-aspossíveis, estabilizando-as ““HingeHinge” Region” Region

Cadeias Cadeias , , e e Rica em resíduos de prolinaRica em resíduos de prolina FlexívelFlexível Faz com que os braços fab assumam Faz com que os braços fab assumam

angulos variáveis, quando ligados ao angulos variáveis, quando ligados ao antigénioantigénio


O domínio das regiões constantes IgA, IgD, IgGIgA, IgD, IgG

CCHH1, Hinge, C1, Hinge, CHH2, C2, CHH33

IgE, IgMIgE, IgM CCHH1, C1, CHH2, C2, CHH3, C3, CHH44

Função desconhecida

Função desconhecida

•Cadeia paralela oligosacaridica•Mais acessível ao meio•Activação do complemento (IgG,IgM)

•Forma sIg e mIgTerminal COH

•Cel. Pré B -> mIgM•Resting -> mIgM ou mIgD•Memoria -> qualquer


Propriedades das Ig

•80% da Ig sérica•IgG1,IgG3,IgG4 atravessam a placenta•IgG3 é o + eficiente activador do complemento•IgG4 não activa o complemento•IgG1 e IgG3 ligam-se com alta afinidade ao receptor Fc, mediando a opsonização

•10-15% da Ig sérica•Ig predominante nas secreções (leite, saliva, lágrimas, muco boncrial, do tracto genitourinário e digestivo)

•5-10% Ig sérica•1ª Ig produzida na resp. Imune

•Mediador da hipersensibilidade

•0.2% Ig sérica•mIGD•sIgD função?


Y`

`

Immune effector mechanisms against extracellular pathogens & toxins

NEUTRALISATION

Y ``

Y` `

Y` `

Toxin releaseblocked

Preventstoxicity

NEUTRALISING ANTIBODIES

Adhesion tohost cells blocked

Preventsinvasion


Effector mechanisms against extracellular pathogens

OPSONISATION

OPSONISATION Phagocytosis

Bacteria in extracellular space

Ab

+

bindingFc receptor


Effector mechanisms against extracellular pathogens

COMPLEMENTBacteria in plasma

Ab & COMPLEMENT

+

PhagocytosisOpsonisation

binding

Complement &Fc receptor

Lysis


Timo: Amadurecimento de Linf.T

Células progenitoras entram e Células progenitoras entram e localizam-se no córtex do localizam-se no córtex do timotimo

Dividem, e amadurecem, ao Dividem, e amadurecem, ao longo de 3 semanaslongo de 3 semanas

Rearranjam os genes TCRRearranjam os genes TCR

Sofrem selecção pos./neg.Sofrem selecção pos./neg.


A selecção timica do repertório

Rearranjos aleatórios originam especificidades aleatóriasRearranjos aleatórios originam especificidades aleatórias 10101515 e 10 e 101818

Só alguns rearranjos são úteisSó alguns rearranjos são úteis Alguns são auto-reactivosAlguns são auto-reactivos Alguns não reconhecem o MHC próprioAlguns não reconhecem o MHC próprio Alguns não são funcionaisAlguns não são funcionais

Os timócitos sofrem 2 tipos de selecçãoOs timócitos sofrem 2 tipos de selecção Positiva (As células que reconhecem o MHC próprio)Positiva (As células que reconhecem o MHC próprio) Negativa Negativa

Rearranjos não funcionaisRearranjos não funcionais Alguns rearranjos auto-reactivosAlguns rearranjos auto-reactivos


A Activação das

células T Complexas vias de Complexas vias de

transdução de sinaltransdução de sinal Vários receptores Vários receptores

envolvidosenvolvidos Estimulação via TCR Estimulação via TCR

sem co-estimulação sem co-estimulação induz anergiainduz anergia


Superantigénios

Proliferação policlonalProliferação policlonal Delecção policlonalDelecção policlonal


Subtipos de Linfócitos T

Células EfectorasCélulas Efectoras ThTh

Th1Th1(secretam IL2, IFN-(secretam IL2, IFN-, TNF-, TNF-; promovem a inflamação e ; promovem a inflamação e hipersensibilidade e estimulam linfócitos Tc)hipersensibilidade e estimulam linfócitos Tc)

Th2 Th2 (secretam IL4, IL5, IL6, IL10; estimulam a resposta B)(secretam IL4, IL5, IL6, IL10; estimulam a resposta B)

TcTc Linf. T Memória Linf. T Memória (fenotipicamente semelhantes às células efectoras)(fenotipicamente semelhantes às células efectoras)

(a maioria em circulação)(a maioria em circulação)

(proporção significativa no intestino; combate aos tumores?)(proporção significativa no intestino; combate aos tumores?)


Effector mechanisms against intracellular bacteria

MACROPHAGE ACTIVATION

InflammatoryT cell Th

Resting Macrophage

Cytokines

Th

Activated macrophage

Activation of killing mechanisms


CTL

Effector mechanisms against intracellular pathogens

CYTOXICITY

Viral infection

CTL

Lethal hit

Target celldeath

CTL

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Immunologia

Curso de Análises ClinicasCurso de Análises Clinicas

Aula Teórica Nº 5Aula Teórica Nº 5

Recombinação V(D)J:Recombinação V(D)J:

Os genes das Ig e TCROs genes das Ig e TCR


A teoria clonal centra-se na existência de receptores do

antigénio clonotípicos :

Linf. B : mIgLinf. T: TCR


Similaridades e diferenças entre o TCR e as Ig


A codificação genética do TCR e Ig NECESSIDADE BIOLÓGICA:NECESSIDADE BIOLÓGICA:

Criar um número ilimitado de TCRCriar um número ilimitado de TCR

LIMITAÇÃO PRÁTICA:LIMITAÇÃO PRÁTICA: O Genoma é limitado, pelo que pode codificar um O Genoma é limitado, pelo que pode codificar um

número limitado de Proteínasnúmero limitado de Proteínas

RESPOSTA BIOLÓGICA:RESPOSTA BIOLÓGICA: O mecanismo de recombinação somática cria uma O mecanismo de recombinação somática cria uma

diversidade ilimitada a partir de um número limitado diversidade ilimitada a partir de um número limitado de elementos genéticos basede elementos genéticos base


Os receptores do antigénio são codificados por mais que um gene

IgIg Cadeias Pesadas: IgHCadeias Pesadas: IgH Cadeias Leves: IgCadeias Leves: Ig e Ig e Ig

TCRTCR Cadeia Cadeia Cadeia Cadeia Cadeia Cadeia Cadeia Cadeia


Os genes das Imunoglobulinas

Cromossoma 12

Cromossoma 6

Cromossoma 16


Os genes do TCR


Os genes do TCR são diferentes em células diferenciadas e células indiferenciadas


O rearranjo somático


Regulação da recombinação: as sequências sinal


A recombinação somática segue a regra:A recombinação somática segue a regra: “ “ só rearranjam elementos com espaçadores de só rearranjam elementos com espaçadores de

comprimentos diferentes”.comprimentos diferentes”.

Regulação da recombinação


Equação de recombinação

V

GTCCTCC.CACAGTG-12-ACAAAAACC

JGGTTTTTGT-23-CACTGTG.CTCAG

+

V J JUNÇÃO CODIFICANTE

JUNÇÃO SINAL

GTCCTCC GGTCAG

+

GGTTTTTGT-23-CACTGTG|CACAGTG-12-ACAAAAACC


Tipos de recombinação


As junções dos elementos V-D-J não são pré-definidas

Delecção de nucleótidos de cada elementoDelecção de nucleótidos de cada elemento Adição de novos nucleótidosAdição de novos nucleótidos

Nucleótidos P (origem numa estrutura Nucleótidos P (origem numa estrutura palindrómica)palindrómica)

Nucleótidos N (adicionados aleatoriamente pela Nucleótidos N (adicionados aleatoriamente pela enzima TdT)enzima TdT)

número potencial de 10número potencial de 101616-TCR e 10-TCR e 101818 -TCR-TCR


A origem dos nucleótidos PGTCA

GTCA

CATG

CATGGTAC

Nucleótidos "P"


A origem dos Nucleótidos N


Leitura dos segmentos D faz-se em 3 ordens de leitura


Diversidade combinatorial


Locais de diversidade de junção: os CDR


Os CDR na estrutura proteica


A recombinação origina novos genes e novos clones

Cada gene obtido é potencialmente diferente dos Cada gene obtido é potencialmente diferente dos restantesrestantes

Os genes do TCR de cada linfócito são diferentes Os genes do TCR de cada linfócito são diferentes dos de qualquer outra célula não linfóidedos de qualquer outra célula não linfóide

A recombinação V(D)J A recombinação V(D)J ocorre precocemente na ontogenia das célulasocorre precocemente na ontogenia das células determina a sua maturação na linhagem Tdetermina a sua maturação na linhagem T cada célula origina um clone de células Tcada célula origina um clone de células T


Estimativas da diversidade


Mutação somática dos genes das Ig

Ocorre no centros germinais dos Ocorre no centros germinais dos nódulos linfáticosnódulos linfáticos

Ocorre de forma aleatóriaOcorre de forma aleatória A selecção dirigida pelo antigénio A selecção dirigida pelo antigénio

causa predominância de mutações nos causa predominância de mutações nos CDRCDR

Resulta num aumento da afinidade dos Resulta num aumento da afinidade dos anticorposanticorpos


O TCR não sofre mutação somática


O Gene TCR no locus TCR


Aplicações no laboratório de análises clínicas


Necessidades Funcionais do TCR

Reconhecer o péptidoReconhecer o péptido Reconhecer o HLA do indivíduo como talReconhecer o HLA do indivíduo como tal Reconhecer HLAs estranhos como talReconhecer HLAs estranhos como tal Estar ancorado na membranaEstar ancorado na membrana enviar sinais para o interior da célula após enviar sinais para o interior da célula após

o reconhecimento do HLA/HLA+péptidoo reconhecimento do HLA/HLA+péptido


Estrutura do TCR (I) Heterodimero cujos polipéptidos se encontram unidos por Heterodimero cujos polipéptidos se encontram unidos por

ligações dissulfídricasligações dissulfídricas 2 formas diferentes, expressas em células diferentes2 formas diferentes, expressas em células diferentes

heterodimero heterodimero (a maioria dos linfócitos T circulantes) (a maioria dos linfócitos T circulantes) heterodimero heterodimero (5-10% dos linfócitos T circulantes) (5-10% dos linfócitos T circulantes)

Ambos os heterodimeros são proteínas constitucionais da Ambos os heterodimeros são proteínas constitucionais da membrana citoplasmáticamembrana citoplasmática

Ambos os heterodimeros se associam a um complexo proteico Ambos os heterodimeros se associam a um complexo proteico denominado CD3denominado CD3

A maioria encontra-se no exterior da célula, possuindo ainda uma A maioria encontra-se no exterior da célula, possuindo ainda uma zona transmembranar, e uma muito curta cauda citoplasmáticazona transmembranar, e uma muito curta cauda citoplasmática


Estrutura do TCR (II) Existem 4 regiões de hipervaria-Existem 4 regiões de hipervaria-

bilidade na sequência dos a.a. :bilidade na sequência dos a.a. : 3 zonas análogas às observadas nas 3 zonas análogas às observadas nas

imunoglobulinas, sendo por isso imunoglobulinas, sendo por isso referidas com nomes análogos (CDR1 a referidas com nomes análogos (CDR1 a CDR3 - complementary determining CDR3 - complementary determining region).region).

1 zona denominada HV4 1 zona denominada HV4 (Hypervariable region 4)(Hypervariable region 4)

O CDR1, CDR2 e HV4 são codificados O CDR1, CDR2 e HV4 são codificados pelos “genes” Vpelos “genes” V

O CDR3 é codificado pela junção O CDR3 é codificado pela junção V(D)JV(D)J

312

43

12 4


312

4 31 2

4


Descobrindo especificidades de ligação

Mutações no péptido seleccionam mutações Mutações no péptido seleccionam mutações complementares no CDR3complementares no CDR3


Mutações nos resíduos das -hélices do HLA não induzem selecção nas V utilizadas:

A mesma mutação tem efeito diverso, A mesma mutação tem efeito diverso, dependendo do péptidodependendo do péptido

I

II

I

Semestimulação

20-102 X

20- 102 X

102-103 X

>103

Sem efeito

MCC(99K)

MCC(99E)



TCR diferentes são diferentemente afectados pelas TCR diferentes são diferentemente afectados pelas mesmas mutaçõesmesmas mutações

I

I

Semestimulação

20-102 X

20- 102 X

102-103 X

>103

Sem efeito



Não se observou nenhum Não se observou nenhum padrão de comportamento do padrão de comportamento do tipo mut. X-hélice - mut. tipo mut. X-hélice - mut. CDR 1/CDR 2 CDR 1/CDR 2


O CDR 3 é a principal força que governa a especificidade, sendo o HLA reconhecido como parte do todo, e não separadamente

NOTA: verificar no NOTA: verificar no diagrama que diagrama que efectivamente o CDR efectivamente o CDR 3 é a zona do TCR que 3 é a zona do TCR que mais contacta o mais contacta o péptido / HLApéptido / HLA


O H4 está O H4 está particularmente particularmente envolvido nas ligações envolvido nas ligações tipo super antigénio.tipo super antigénio.


Factores que influenciam a diversidade do TCR

ToleranciaTolerancia Rearranjos constructivosRearranjos constructivos Selecção negativaSelecção negativa Selecção PositivaSelecção Positiva

Estrutura do péptidoEstrutura do péptido péptidos c/ a.a. volumosos nos péptidos c/ a.a. volumosos nos

resíduos expostos originam resíduos expostos originam repertórios mais diversosrepertórios mais diversos

Concentração/densidade do ligandoConcentração/densidade do ligando [] estimula apenas os TCR de [] estimula apenas os TCR de

maior afinidademaior afinidade

Repertório de TCR limitadoRepertório de TCR limitado relatos contraditórios sobre a relatos contraditórios sobre a

influencia de delecções de Vß influencia de delecções de Vß na diversidade do repertório na diversidade do repertório especificoespecifico

SuperantigéniosSuperantigénios Não especificos p/ péptido mas Não especificos p/ péptido mas

p/ Vßp/ Vß activação policlonalactivação policlonal superantigénios endógenos superantigénios endógenos

originam delecção de expressão originam delecção de expressão de Vß à periferiade Vß à periferia

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