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DANIELA AGUIAR DE SOUZA

ESTUDO MOLECULAR DOS DISTÚRBIOS DO

DESENVOLVIMENTO DO CÓRTEX CEREBRAL

CAMPINAS

2013

iii

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

DANIELA AGUIAR DE SOUZA

“ESTUDO MOLECULAR DOS DISTÚRBIOS DO DESENVOLVIMENTO DO CÓRTEX CEREBRAL”

Orientador(a): Profa. Dra. Iscia Teresinha Lopes Cendes

Co-Orientador: Prof. Dr. Fábio Rossi Torres

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós Graduação em Fisiopatologia

Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas para obtenção do título de Doutora em Ciências.

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA DANIELA AGUIAR DE SOUZA E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. ISCIA TERESINHA LOPES CENDES

Assinatura do Orientador

____________________

vii

Dedicatória

Essa tese é dedicada aos meus pais, Jorge e Ivonete, pelo amor e pelos ensinamentos que

serviram de base para me tornar quem sou hoje.

ix

AGRADECIMENTOS

Agradeço à FAPESP e à Capes pelo suporte financeiro;

À minha orientadora Iscia Lopes Cendes, por todo apoio e estrutura fornecida e pe-

la confiança em mim depositada;

À todos os amigos do Laboratório de Genética Molecular, os velhos e os novos, pe-

la ajuda nos momentos de desespero no laboratório e principalmente pela amizade: Ro-

mênia, Zé Bola, Karina, Thaty, Alexandre, Marina, Dany, Secolin, Milena, Simoni... enfim

todos que passaram pela minha vida durante o doutorado e deixaram sua contribuição

especial; às técnicas Marilza e Madá, pela grande ajuda com os experimentos e pela diver-

são da convivência;

À Luciana Bonadia pelos variados conselhos, desde os científicos até os amorosos e

por sua grande amizade, sempre me ensinando as verdades da vida! À Simone Tsuneda e

família, pela ajuda, pelo abrigo em Brasília e pela amizade de sempre;

À todo o pessoal da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Rogério, Marcos,

Irene, Silas pela compreensão e apoio para a finalização do trabalho;

Aos meus pais, Ivonete e Jorge, pela ajuda em todos os momentos e pelo carinho e

amor que sempre me deram forças para continuar; aos meus irmãos Danilo e Daniel, às

minhas cunhadas, Carla e Cristina, meu sobrinho Danielzinho e à toda a minha família pela

torcida e confiança;

À minha segunda família, Marinez, Francisco e Renan, pelo apoio e suporte que

sempre me deram;

Ao meu noivo, Renê de Lima Barbosa, pelo seu amor, carinho, paciência e especi-

almente pelos seus ensinamentos em Word 2010. Sem você, meu amor, minha vida não

seria completa e minha tese não teria formatação;

Um agradecimento especial ao meu pai do laboratório, aquele que me ensinou

desde as primeiras pipetagens na IC até os arrays do doutorado, Fábio Rossi Torres, obri-

gada por tudo, essa tese não existiria sem você!

xi

SUMÁRIO

Agradecimentos .................................................................................................................................. ix

Lista de Figuras ................................................................................................................................. xvii

Lista de Tabelas ............................................................................................................................... xxiii

Lista de Abreviaturas ........................................................................................................................ xxv

Resumo ............................................................................................................................................ xxix

Abstract ........................................................................................................................................... xxxi

1. Introdução ................................................................................................................................. 33

1.1. O desenvolvimento do córtex cerebral ............................................................................. 33

1.2. Malformações do desenvolvimento cortical ..................................................................... 35

1.2.1. Malformações devido a anormalidades na migração neuronal (Grupo 2) ............... 36

1.2.1.1. Heterotopia Nodular Periventricular ................................................................ 36

1.2.1.2. Espectro da Lissencefalia e Heterotopia Subcortical em Banda ....................... 38

1.2.1.3. Gene LIS1 e o espectro LIS/HSB ........................................................................ 41

1.2.1.4. Gene DCX e o espectro LIS/HSB ........................................................................ 41

1.2.1.5. Interação LIS1 e DCX .......................................................................................... 42

1.2.1.6. Gene TUBA1A e a lissencefalia .......................................................................... 42

1.2.2. Malformações devido a distúrbios pós migracionais (Grupo 3) ............................... 43

1.2.2.1. Esquizencefalias ................................................................................................ 43

1.3. Separação de fases: um conceito defasado? .................................................................... 44

1.3.1. Gene TUBA1A ............................................................................................................ 45

1.3.2. Gene TUBB2B ............................................................................................................ 45

xii

1.3.3. Gene TUBA8 .............................................................................................................. 45

1.4. Novas descobertas em distúrbios do SNC ......................................................................... 46

2. Objetivos ................................................................................................................................... 49

2.1. Objetivos Gerais ................................................................................................................ 49

2.2. Objetivos Específicos ......................................................................................................... 49

3. Materiais e Métodos ................................................................................................................. 51

3.1. Casuística ........................................................................................................................... 51

3.1.1. Caracterização da amostra ........................................................................................ 52

3.2. Extração de DNA................................................................................................................ 65

3.3. Detecção de Mutações de Ponto e Pequenas Inserções/Deleções em Genes Candidatos

65

3.3.1. Amplificação por PCR ................................................................................................ 66

3.3.2. Sequenciamento (Sanger) ......................................................................................... 72

3.3.3. Clonagem em vetor ................................................................................................... 72

3.3.3.1. Ligação dos fragmentos de DNA ....................................................................... 72

3.3.3.2. Transformação bacteriana ................................................................................ 73

3.3.3.3. Extração de DNA plasmidial (Mini-Prep) ........................................................... 73

3.3.4. Análise das alterações encontradas: ......................................................................... 74

3.3.4.1. Softwares para predições in sílico de mutações ............................................... 74

3.3.4.2. Software para análise in sílico tridimensional da proteína ............................... 75

3.3.4.3. Software para busca in sílico de regiões de microRNA ..................................... 75

3.3.4.4. Software para busca in sílico de regiões de splicing alternativo ....................... 76

3.3.4.5. Triagem das alterações com potencial patogênico em grupo controle ............ 76

3.4. Detecção de Inserções/Deleções em Genes Candidatos .................................................. 76

3.4.1. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification - MLPA ...................................... 76

3.4.1.1. Desnaturação do DNA ....................................................................................... 77

xiii

3.4.1.2. Reação de Hibridação ........................................................................................ 77

3.4.1.3. Reação de ligação das sondas ........................................................................... 77

3.4.1.4. Reação de PCR ................................................................................................... 77

3.4.1.5. Eletroforese capilar ........................................................................................... 78

3.4.1.6. Análise dos resultados ....................................................................................... 78

3.5. Detecção de Novas CNVs .................................................................................................. 78

3.5.1. Seleção dos pacientes ............................................................................................... 78

3.5.2. Purificação das Amostras de DNA ............................................................................. 79

3.5.3. Digestão das amostras de DNA com a enzima NspI .................................................. 79

3.5.4. Reação de ligação com adaptadores ......................................................................... 79

3.5.5. Amplificação dos fragmentos por PCR ...................................................................... 79

3.5.6. Purificação ................................................................................................................. 80

3.5.7. Quantificação ............................................................................................................ 80

3.5.8. Fragmentação ............................................................................................................ 80

3.5.9. Marcação do DNA ..................................................................................................... 81

3.5.10. Hibridação ................................................................................................................. 81

3.5.11. Lavagem .................................................................................................................... 81

3.5.12. Escaneamento ........................................................................................................... 81

3.5.13. Análise ....................................................................................................................... 81

4. Resultados ................................................................................................................................. 83

4.1. Sequenciamento dos genes candidatos ............................................................................ 83

4.1.1. Parte I- Variantes com Potencial Patogênico ............................................................ 83

4.1.1.1. Gene FLNA: Variante c.4543C>T ....................................................................... 83

4.1.1.2. Gene FLNA: Variante c.1286C>T ....................................................................... 84

4.1.1.3. Gene DCX: Variante c.993A>T ........................................................................... 86

4.1.1.4. Gene DCX: Variante c.1047T>C ......................................................................... 87

xiv

4.1.1.5. Gene TUBA8: Variante c.1513A>T ..................................................................... 89

4.1.1.6. Gene TUBA8: Variante c.562C>T ....................................................................... 91

4.1.1.7. Gene TUBA8: Variante c.323C>T ....................................................................... 92

4.1.2. Parte II- Variantes neutras ........................................................................................ 94

4.1.2.1. Gene FLNA ......................................................................................................... 94

4.1.2.2. Gene LIS1 ........................................................................................................... 96

4.1.2.3. Gene DCX ........................................................................................................... 96

4.1.2.4. Gene TUBA1A .................................................................................................... 97

4.1.2.5. Gene TUBB2B .................................................................................................... 98

4.1.2.6. Gene TUBA8 .................................................................................................... 101

4.1.2.7. Gene EMX2 ...................................................................................................... 102

4.1.3. Regiões de microRNA .............................................................................................. 103

4.1.4. Regiões de splicing alternativo ................................................................................ 103

4.1.5. Resumo das alterações de ponto identificadas ...................................................... 104

4.2. MLPA ............................................................................................................................... 108

4.2.1. Alterações em LIS1 .................................................................................................. 108

4.2.2. Alterações em FLNA ................................................................................................ 110

4.2.3. Alterações em DCX .................................................................................................. 110

4.3. SNP-Array ........................................................................................................................ 112

4.3.1. Seleção de pacientes ............................................................................................... 112

4.3.2. Resultados do SNP-Array ......................................................................................... 112

4.3.2.1. Caso 239/08 ..................................................................................................... 116

4.3.2.2. Caso 904/01 ..................................................................................................... 117

4.3.2.3. Caso 302/01 ..................................................................................................... 117

4.3.2.4. Caso 283/01 ..................................................................................................... 118

4.3.2.5. Caso 524/09 ..................................................................................................... 119

xv

4.3.2.6. Caso 271/09 ..................................................................................................... 122

4.3.2.7. Caso 1324/06 ................................................................................................... 122

4.3.2.8. Caso 523/01 ..................................................................................................... 125

4.4. Resumo das alterações encontradas .............................................................................. 127

5. Discussão ................................................................................................................................. 131

5.1. Heterotopia Nodular Periventricular .............................................................................. 131

5.1.1. Paciente P3 .............................................................................................................. 131

5.1.2. Paciente 524/09 ...................................................................................................... 132

5.1.3. HNP e gene FLNA ..................................................................................................... 134

5.2. O Espectro da Lissencefalia/Heterotopia Subcortical em Banda .................................... 135

5.2.1. Gene LIS1 ................................................................................................................. 135

5.2.2. Gene DCX ................................................................................................................. 136

5.2.2.1. Paciente 643/08 .............................................................................................. 136

5.2.2.2. Paciente 491/09 .............................................................................................. 137

5.2.2.3. Alterações estruturais no gene DCX ................................................................ 138

5.2.3. Espectro LIS/HSB e a frequência de alterações encontradas .................................. 138

5.3. Esquizencefalia e o gene EMX2 ....................................................................................... 139

5.4. Família das tubulinas e as MDC ....................................................................................... 140

5.5. A técnica de SNP-Array .................................................................................................... 142

5.5.1. Gene NCAPG2 .......................................................................................................... 144

5.5.2. Gene HAUS7 ............................................................................................................ 144

5.5.3. Gene PLXNA1 ........................................................................................................... 145

5.5.4. Gene TSNARE1 ......................................................................................................... 145

5.5.5. Gene DAAM1 ........................................................................................................... 146

5.5.6. Gene ARX ................................................................................................................. 146

5.6. Outros casos estudados por SNP-ARRAY ........................................................................ 147

xvi

5.6.1. Paciente 271/09 ...................................................................................................... 147

5.6.2. Paciente 1324/06 .................................................................................................... 148

5.6.3. Paciente 523/01 ...................................................................................................... 149

5.7. SNP-ARRAY: Perspectivas ................................................................................................ 149

6. Conclusão ................................................................................................................................ 151

6.1. HNP e FLNA ..................................................................................................................... 151

6.2. Espectro LIS/HSB, LIS1 e DCX .......................................................................................... 151

6.3. Achados nos genes da família das tubulinas ................................................................... 152

6.4. Relação esquizencefalia e gene EMX2 ............................................................................ 152

6.5. Análise de CNV ................................................................................................................ 152

7. Referências .............................................................................................................................. 153

8. Anexos ..................................................................................................................................... 165

8.1. Anexo 1: Cromatogramas dos sequenciamentos mostrando variantes neutras ............ 165

8.2. Anexo 2: Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas da

UNICAMP ..................................................................................................................................... 178

8.3. Anexo 3: Formulário de consentimento ......................................................................... 180

8.4. Anexo 4: Sondas utilizadas na técnica de MLPA ............................................................. 183

xvii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Padrão inside out de migração neuronal e transição morfológica dos neurônios. Os

neurônios recém-chegados à placa cortical [2] ultrapassam os neurônios mais antigos [1],

acumulando-se progressivamente em camadas mais superficiais [3]. Os estágios multipolar e

bipolar [4] mostram a transição morfológica sofrida pelas células no início da migração (adaptado

de Riken (6)). ..................................................................................................................................... 34

Figura 2: A- indivíduo normal. B- paciente com HNP (setas) (cedido por Cendes, F). ...................... 36

Figura 3: A- indivíduo normal. B- paciente com agiria. C- paciente com paquigiria. D- paciente com

HSB (cedido por Cendes, F). .............................................................................................................. 39

Figura 4: A- corte histológico de uma paciente com lissencefalia. Esquema da laminação de um

córtex com lissencefalia (B), mostrando as 4 camadas: camada I composta por neurônios Caja-

Retzius, camada II composta por neurônios piramidais desorganizados, camada III composta por

células variadas, camada IV composta por neurônios médios e pequenos. Esquema de um córtex

normal (C) com 6 camadas: camada molecular (I), camada granular externa (II), camada piramidal

externa (III), camada granular interna (IV), camada piramidal interna (V), camada fusiforme (VI).

(adaptado de Guerrini, (16)). ............................................................................................................ 40

Figura 5: A- Paciente com esquizencefalia de lábios abertos. B- Paciente com esquizencefalia de

lábios fechados (seta preta) e heterotopia periventricular (cabeça de seta branca) (A- Cedido por

Cendes, F; B- Adaptado de Merello et al. (42)). ................................................................................ 43

Figura 6: A- Paciente P3 com HNP bilateral (setas). B- Cromatograma do sequenciamento

mostrando a alteração c.4543C>T (círculo vermelho) no exon 27 do gene FLNA. ........................... 84

Figura 7: A- Paciente 524/09 com HNP (seta). B- Cromatograma do sequenciamento mostrando a

alteração c.1286C>T (círculo vermelho) no exon 9 do gene FLNA. .................................................. 85

Figura 8: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a substituição de uma

adenina por uma timina (círculo vermelho) no exon 2 do gene DCX, A- em hemizigose no paciente,

B- em heterozigose na mãe do paciente, C- individuo controle sem a substituição. ...................... 86

Figura 9: A- interações da lisina (posição 274) na proteína DCX. B- Ausência de interações da

metionina (posição 274) na proteína DCX. ....................................................................................... 87

xviii


timina por uma citosina (círculo vermelho) no exon 2 do gene DCX. ............................................... 88

Figura 11: Digestão enzimática de controles com a enzima MnlI para o exon 2 do gene DCX (M=

marcador 1kb plus; 1=paciente heterozigoto para a mutação c.1047T>C; 2, 3, 4 e 5= indivíduos

sem a mutação). ................................................................................................................................ 89

Figura 12: A- interações da leucina (posição 292) na proteína DCX. B- interações da prolina

(posição 292) na proteína DCX. ......................................................................................................... 89

Figura 13: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando troca uma adenina por uma

timina no exon 5 do gene TUBA8 (círculo vermelho). ...................................................................... 90

Figura 14: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando troca uma citosina por uma

timina no exon 4 do gene TUBA8 (círculo vermelho). ...................................................................... 91

Figura 15: A- interações da alanina (posição 128) na proteína TUBA8. B- interações da valina

(posição 128) na proteína TUBA8. .................................................................................................... 92

Figura 16: A- Paciente 2364/04 com lissencefalia incompleta. B- Cromatograma do

sequenciamento mostrando a troca de uma citosina por uma timina no gene TUBA8 (SNP

rs115847686). ................................................................................................................................... 93

Figura 17: A- interações da arginina (posição 84) na proteína TUBA8. B- interações da cisteína

(posição 84) na proteína TUBA8. ...................................................................................................... 94

Figura 18: A- Imagem de ressonância magnética do paciente 500/09. Notar a presença de sulcos

mais rasos nas regiões posteriores. B- Sondas (vermelho) abaixo da linha normal mostrando a

deleção no exon 1 do gene LIS1. ..................................................................................................... 108

Figura 19: A- Imagem de ressonância magnética do paciente 185/09. Notar a agiria de predomínio

posterior. B- Sondas (vermelho) abaixo da linha normal mostrando a deleção nos exons 6 e 7 do

gene LIS1. ........................................................................................................................................ 109

Figura 20: Sondas (pontos vermelhos) abaixo da linha normal mostrando a deleção em todos os

exons do gene LIS1. ......................................................................................................................... 109

Figura 21: A- Imagem de ressonância magnética do paciente 271/09. B- Sondas (vermelho) acima

da linha normal mostrando a duplicação no exon 4 do gene FLNA................................................ 110

Figura 22: A- Imagem de ressonância magnética do paciente 415/03. B- Sondas (pontos

vermelhos) abaixo da linha normal mostrando a deleção em todos os exons do gene DCX. ........ 111

Figura 23: Sondas (pontos vermelhos) acima da linha normal mostrando a duplicação no exon 3 do

gene DCX. ........................................................................................................................................ 111

xix

Figura 27: A- Paciente com esquizencefalia unilateral de lábios abertos, com a fenda localizada na

região frontal direita (seta). B- Resultado do microarranjo do paciente 239/08 mostrando a

duplicação no cromossomo 7q36.3 (barra azul representa a região duplicada, em rosa estão os

genes envolvidos nesta região). ...................................................................................................... 116

Figura 28: A- Paciente com esquizencefalia bilateral de lábios fechados com fendas de localização

parieto occipital (seta). B- Resultado do microarranjo do paciente 904/01 mostrando a duplicação

no cromossomo Xq28 (barra azul representa a região duplicada, em rosa estão os genes

envolvidos nesta região). ................................................................................................................ 117

Figura 29: A- Paciente com heterotopia nodular periventricular assimétrica a esquerda (seta). B-

Resultado do microarranjo do paciente 302/01 mostrando a duplicação no cromossomo 8q24.3

(barra azul representa a região duplicada, em rosa estão os genes envolvidos nesta região). ..... 118

Figura 30: A- Paciente com heterotopia nodular periventricular à direita (seta). Resultado do

microarranjo do paciente 283/01 mostrando: B- a duplicação no cromossomo 3q21.3 e C- a

duplicação no cromossomo Xq28 (barra azul representa a região duplicada, em rosa estão os

genes envolvidos nesta região). ...................................................................................................... 119

Figura 31: A- Paciente (524/09) com heterotopia nodular periventricular (seta). Resultado do

microarranjo do paciente 524/09 mostrando: B- duplicação no cromossomo 14q23.1 e C- deleção

no cromossomo Xp22.11(barra azul representa a região duplicada, barra vermelha representa a

região deletada, em rosa estão os genes envolvidos nestas regiões). ........................................... 121

Figura 32: A- Paciente com heterotopia subcortical em banda. B- Resultado do microarranjo do

paciente 271/09 mostrando a duplicação no cromossomo X, que afeta os genes FLNA e EMD

(barra azul representa a região duplicada, em rosa estão os genes envolvidos nesta região). ..... 122

Figura 33: Resultado do microarranjo do paciente 1324/06 mostrando a deleção no cromossomo

1p36 (barra vermelha representa a região deletada, em rosa estão os genes envolvidos nesta

região). ............................................................................................................................................ 123

Figura 34: Resultado do microarranjo do paciente 1324/06 mostrando a duplicação no

cromossomo 4p16.3 (barra azul representa a região duplicada, em rosa estão os genes envolvidos

nesta região).................................................................................................................................... 124

Figura 35: Esquema mostrando CNVs patogênicas descritas dentro da região de 14Mb identificada

no paciente 1324/06. ...................................................................................................................... 124

xx

Figura 36: A- Paciente com heterotopia subcortical em banda. B- Resultado do microarranjo do

paciente 523/01 mostrando a deleção no cromossomo 3q29 que afeta 25 genes (barra vermelha

representa a região deletada, em rosa estão os genes envolvidos nesta região). ......................... 127

Figura 37: Mutações descritas no gene FLNA (adaptado de Parrini et al. (14)). ............................ 131

Figura 35: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a alteração c.374-19G>A

(círculo vermelho) no intron 2 do gene FLNA. ................................................................................ 165

Figura 36: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando as alterações c.869-41C>T e

c.869-28C>G (círculos vermelhos) no intron 5 do gene FLNA. ....................................................... 165

Figura 37: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de uma citosina por

uma timina, c.7732+11C>T, (círculo vermelho) no intron 47 do gene FLNA. ................................. 166


uma timina, c.1998C>T, (círculo vermelho) no exon 13 do gene FLNA. ......................................... 166

Figura 39: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de uma guanina por

uma adenina, c.4920G>A, (círculo vermelho) no exon 29 do gene FLNA. ..................................... 166

Figura 40: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de uma timina por

uma citosina, c.6075T>C (círculo vermelho) no exon 36 do gene FLNA. ........................................ 167

Figura 41: Cromatograma do sequenciamento automático mostando a substituição de uma

citosina por uma timina (círculo vermelho) no intron 6 do gene LIS1, c.568+27C>T. .................... 167

Figura 42:Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a substituição de uma

citosina por uma timina, c.1805C>T, (círculo vermelho) no exon 11 do gene LIS1. ....................... 168

Figura 43: Cromatograma mostrando a substituição de uma guanina por uma adenina,

c.948+29G>A, (círculo vermelho) no intron 2 do gene DCX. .......................................................... 168

Figura 44: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de guanina para

citosina, c.453G>C, (círculo vermelho) no exon 4 do gene TUBA1A. ............................................. 168

Figura 45: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de adenina por uma

guanina, c.288A>G (círculo vermelho) no exon 3 do gene TUBA1A. .............................................. 169

Figura 46: A - Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de uma timina

por uma citosina, c.510T>C, (círculo vermelho) e a troca de uma guanina por uma adenina,

c.522G>A, (círculo azul) no exon 4 do gene TUBA1A. B- Cromatograma de um indivíduo que possui

a sequencia considerada normal. ................................................................................................... 169


uma timina, c.73C>T, (círculo vermelho) no exon 1 do gene TUBB2B. .......................................... 169

xxi


uma citosina, c.93T>C, (círculo vermelho) no exon 1 do gene TUBB2B. ........................................ 170


uma citosina, c.141T>C, (círculo vermelho) no exon 1 do gene TUBB2B. ...................................... 170


uma citosina, c.20T>C, (círculo vermelho) na região que precede o gene TUBB2B. ...................... 170


uma guanina, g.1338C>G, (círculo vermelho) no intron 1do gene TUBB2B. ................................. 171

Figura 52: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de uma guanina por

uma citosina, g.1373G>C, (círculo vermelho) no intron 1do gene TUBB2B. .................................. 171

Figura 53: A- Cromatograma do sequenciamento automático mostrando um indivíduo com a

deleção g.3784_3785delTG e B- Sequencia normal, sem a deleção dos nucleotídeos TG. ........... 171

Figura 54: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando troca de uma guanina por

uma adenina, c.58-70G>A, no intron 3 do gene TUBB2B. .............................................................. 172

Figura 55: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando troca de uma citosina por

uma timina, c.166+22C>T, no intron 4 do gene TUBB2B. ............................................................... 172

Figura 56: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando troca de uma guanina por

uma timina, c.564G>T, no exon 6 do gene TUBB2B. ...................................................................... 172

Figura 57: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a deleção de uma timina,

g.8144delT, (círculo mostra a presença de 8 timinas ao invés de 9) no exon 6 do gene TUBB2B. 173

Figura 58: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a inserção de um CG,

g.8341_8342insCG, e a mudança no quadro de leitura da sequencia no exon 6 do gene TUBB2B.

......................................................................................................................................................... 173

Figura 59: inserção de CC no gene TUBB2B, g.833_834insCC. ....................................................... 174

Figura 60: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando deleção de três nucleotídeos

(GGA), g.18639_18641delGGA, no intron 3 do gene TUBA8 e a mudança no quadro de leitura da

sequencia. ....................................................................................................................................... 174


timina, c.2071C>T, no exon 5 do gene TUBA8 (círculo vermelho).................................................. 175


timina, c.1969C>T, no exon 5 do gene TUBA8 (círculo vermelho).................................................. 175

xxii

Figura 63: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a alteração c.1613C>T no

exon 5 do gene TUBA8 (círculo vermelho). ..................................................................................... 175


guanina por uma adenina (círculo vermelho) no exon 1 do gene EMX2, c.865G>A. ..................... 176

Figura 65: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a substituição c.1290C>A no

exon 2 do gene EMX2 ...................................................................................................................... 176

Figura 66: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a substituição c.1370C>A no

exon 2 do gene EMX2 ...................................................................................................................... 176

Figura 67: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a alteração c.592-10T>A

(círculo vermelho) no intron 2 do gene EMX2. ............................................................................... 177

xxiii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Característica Clínicas do pacientes com Heterotopia Nodular Periventricular. .............. 53

Tabela 2: Características Clínicas dos pacientes com o espectro da LIS/HSB. .................................. 56

Tabela 3: Características Clínicas dos pacientes com Esquizencefalia .............................................. 60

Tabela 4: Resumo dos genes analisados para cada malformação cortical ....................................... 66

Tabela 5: Primers utilizados para amplificação do gene FLNA (* uso de DMSO, **PCR touchdown).

........................................................................................................................................................... 67

Tabela 6: Primers utilizados para amplificação do gene DCX. .......................................................... 69

Tabela 7: Primers utilizados para amplificação do gene LIS1. .......................................................... 69

Tabela 8: Primers utilizados para amplificação do gene EMX2 (* uso de DMSO). ........................... 70

Tabela 9: Primers utilizados para amplificação do gene TUBA1A. .................................................... 71

Tabela 10: Primers utilizados para amplificação do gene TUBA8. .................................................... 71

Tabela 11: Primers utilizados para amplificação do gene TUBB2B. .................................................. 71

Tabela 12: Algoritmos utilizados para a análise in sílico das alterações detectadas. ....................... 74

Tabela 13: Interpretação da confiança da hipótese do MutPred®. .................................................. 75

Tabela 14: Classificação de valores para escala Grantham. .............................................................. 75

Tabela 15: Algoritmos utilizados para a análise das CNVs identificadas. ......................................... 82

Tabela 16: Resultados das predições in sílico da mutação p.Thr429Met encontrada no exon 9 do

gene FLNA. ........................................................................................................................................ 85

Tabela 17: Predições in sílico da variante c.993A>T encontrada no exon 2 do gene DCX. ............... 86

Tabela 18: Resultados das predições in sílico da variante c.1047T>C encontrada no exon 2 do gene

DCX. ................................................................................................................................................... 88

Tabela 19: Predições in sílico da variante c.1513A>T encontrada no exon 5 do gene TUBA8. ........ 90

Tabela 20: Predições in sílico da variante c.562C>T encontrada no exon 4 do gene TUBA8............ 92

Tabela 21: Predições in sílico da variante c.323C>T encontrada no exon 3 do gene TUBA8............ 93

Tabela 22: Análise de sítios de microRNA. ...................................................................................... 103

Tabela 23: Alterações analisadas in sílico para regiões de splicing................................................. 104

Tabela 24: Resumo das alterações encontradas. ............................................................................ 105

xxiv

Tabela 25: CNVs com potencial patogênico encontrados em pacientes com MDC. ...................... 114

Tabela 26: Resumo das funções dos genes relacionados à CNV encontrada na região 3q29 ........ 125

Tabela 27: Resumo das alterações patogênicas encontradas ........................................................ 128

Tabela 28: Sondas presentes no kit "Salsa MLPA P061 Lissencephaly probemix" ......................... 183

xxv

LISTA DE ABREVIATURAS

ARFGEF2: gene adenosine diphosphate-ribosylation factor guanine exchange factor 2

ARX: gene homeobox aristaless-related ligado ao X

ASD: autism spectrum disorder

CNV: Copy Number Variation

CTCG: crise tônico-clônica generalizada

DAAM1: gene dishevelled-associated activator of morphogenesis 1

DAEs: drogas antiepiléticas

DCX: gene doublecortina

DGV: Database of Genomic Variants

DMSO: dimetil sulfoxido

DNA: ácido desoxiribonucleico

EMX2: gene Empty Spiracles 2

FLNA: gene Filamina A

GO: Gene Ontology

GTP: guanosina trifosfato

HAUS7: gene subunidade 7 do complexo augmin-like

HNP: Heterotopia Nodular Periventricular

HSB: Heterotopia Subcortical em Banda

IG: imunoglobulina

ISCA: The International Standards for Cytogenomic Arrays Consortium

LIS: Lissencefalia

LIS/HSB: Espectro Lissencefalia/Heterotopia Subcortical em Banda

LIS1: gene lissencefalia 1

LNLS: Laboratório Nacional de Luz Sincrotron

MCPH1: gene microcefalina 1

xxvi

MDC: Malformações do Desenvolvimento Cortical

MLPA: Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

NCAPG2: gene subunidade não-SMS 2 do complexo condensina II

NCBI: National Center for Biotechnology Information

NRP1: gene Neuropilina 1

OMIM: Online Mendelian Inheritance in Man

OPD1: Síndrome Otopalatodigital tipo1

OPD2: Síndrome Otopalatodigital tipo2

PAFAH1b1: gene platelet-activating factor acetylhydrolase

Panther: Protein Analysis Through Evolutionary Relationships

PCR: polymerase chain reaction

PLXNA1: gene plexina A1

Polyphen: Polymorphism Phenotyping

RFLP: Restriction fragment length polymorphism

RM: ressonância magnética

RNA: ácido ribonucleico

RNAm: RNA mensageiro

SDS: dodecilsulfato de sódio

SEMA3A: gene Semaphorina III

SNAP: Screening for Non-Acceptable Polymorphisms

SNC: sistema nervoso central

SNP: single nucleotide polymorphism

TSNARE1: gene t-snare domain-containing protein 1

TUBA1A: gene tubulina alpha 1A

TUBA8: gene tubulina alpha 8

TUBB2B: gene tubulina beta 2B

UTR: untranslated region

WD: triptofano-aspartato

WDR62: gene WD Repeat-Containing Protein 62

xxvii

WHS: síndrome de Wolf Hirschhorn

xxviii

Resumo xxix

RESUMO

As malformações do desenvolvimento cortical (MDC) são distúrbios resultantes de defei-

tos na embriogênese do córtex cerebral e estão entre as principais causas conhecidas de

atraso do desenvolvimento e epilepsia. Dentre os principais tipos de MDC podemos citar a

heterotopia nodular periventricular (HNP), o espectro lissencefalia/heterotopia subcorti-

cal em banda (LIS/HSB) e a esquizencefalia. Alterações moleculares em genes que atuam

em mecanismos que vão desde o controle da divisão celular até a migração neuronal fo-

ram identificadas como responsáveis pela etiologia de vários tipos de MDC. Tais descober-

tas, além de auxiliar na compreensão dos mecanismos envolvidos no desenvolvimento do

córtex cerebral e doenças relacionadas, fornecem informações importantes para um me-

lhor diagnóstico e tratamento dos pacientes. Neste contexto, o principal objetivo deste

trabalho foi analisar do ponto de vista molecular um grande grupo de pacientes com MDC.

A casuística foi composta por um grupo de 107 pacientes: 27 possuem HNP, 33 são afeta-

dos por LIS/HSB e 47 possuem esquizencefalia. Em um primeiro momento, foi realizada

triagem de mutações de ponto em genes candidatos (FLNA, DCX, LIS1, EMX2, TUBA1A,

TUBB2B e TUBA8) por sequenciamento (Sanger). Posteriormente, a técnica de MLPA (Mul-

tiplex Ligation-dependent Probe Amplification) foi utilizada para detectar variações estru-

turais em regiões candidatas, incluindo os genes FLNA, DCX e LIS1. Finalmente, a técnica

de SNP-Array foi utilizada para análise das variações no número de cópias alélicas em re-

giões genômicas de alguns pacientes (copy number variation - CNV). Todas as mutações de

ponto encontradas nas sequencias de DNA foram verificadas em um grupo de 200 indiví-

duos controles. Através do sequenciamento, foram identificadas três alterações patogêni-

cas localizadas nos genes FLNA e DCX, através do MLPA foram encontradas seis alterações

estruturais patogênicas nos genes FLNA, DCX e LIS1. Os ensaios de SNP-Array permitiram a

identificação de vários CNVs com potencial deletério, incluindo 12 pacientes com 17 novas

CNVs ainda não descritas na literatura. Tais CNVs envolvem vários potenciais genes candi-

Resumo xxx

datos para as MDC, incluindo os genes TSNARE, DAAM1, ARX, PLXNA1 e HAUS7. Concluin-

do, nossos resultados mostram uma baixa frequência de mutações em genes candidatos

previamente relacionados às MDC, somente 2.8% (n=3/107) dos pacientes possuem vari-

antes deletérias nas sequencias dos genes analisados e 18% (n=6/33 testados) dos pacien-

tes analisados possuem alterações estruturais em regiões candidatas. Porém, através da

abordagem genômica para identificação de variações estruturais, foram identificadas vá-

rias regiões/genes candidatos potencialmente envolvidos com a etiologia das MDC

(12/40= 30%). Nossos dados mostram que as MDC apresentam grande heterogeneidade

genética, porém uma proporção significativa dos pacientes possuem variações estruturais

que podem ser identificadas pela técnica de SNP-Array.

Abstract xxxi

ABSTRACT

Malformations of cortical development (MCD) are disorders resulting from defects in the

embryogenesis of the cerebral cortex and are one of the most important causes of devel-

opmental delay and epilepsy. The main types of MCDs are periventricular nodular hetero-

topia (PNH), lissencephaly/subcortical band heterotopia spectrum (LIS/SBH) and schizen-

cephaly. Mutations in genes acting in mechanisms ranging from control of cell division to

neuronal migration were identified as responsible for several types of MCDs. These ad-

vances not only improved our understanding about the mechanisms involved in the de-

velopment of the cerebral cortex but have also provided relevant information that can be

used for better diagnosis and management of patients. In this scenario, the main objective

of this study was to access and perform a comprehensive molecular genetics study in a

large cohort of patients with MCD. We have studied a total of 107 patients with MCDs

divided in the following groups: 27 with PNH, 33 with LIS/SBH and 47 with schizencephaly.

We first searched for sequence variations in candidate genes (FNLA, DCX, LIS1, EMX2, TU-

BA1A, TUBB2B and TUBA8) using the Sanger sequencing method. Subsequently, we

checked for structural variants in FLNA, DCX and LIS1 using Multiplex Ligation-dependent

Probe Amplification (MLPA) technique. Finally, we took a genomic approach by using sin-

gle nucleotide polymorphism (SNP)-array technology to studied copy number variations

(CNV) in some patients. All sequence variants found were subsequently verified in a group

of 200 control individuals. Our results showed 3 pathogenic sequence variants in FNLA and

DCX, as well as 6 pathogenic structural variants detected by MLPA in FLNA, LIS1 and DCX.

SNP-array technique detected 17 genomic regions, in 12 patients, containing new CNVs.

These CNVs involve a number of potential new candidate genes for MCDs, including:

TSNARE, DAAM1, ARX, PLXNA1 and HAUS7. In conclusion, our results show a low frequen-

cy of mutations in candidate genes previously associated with MCDs, only 2.8% (n=3/107)

of our patients have deleterious sequence variants and 18% (n=6/33) have abnormal

Abstract xxxii

structural variants in candidate regions. However, by using a genomic approach to look for

CNVs we were able to identify several candidate regions/genes that have the potential to

be involved in MCDs (12/40= 30%). Our data show that MCDs are genetic heterogeneous;

however, it seems that a significant proportion of patients have structural abnormalities

that can be identified by SNP-array technology.

Introdução 33

1. INTRODUÇÃO

Com aproximadamente 100 bilhões de neurônios que migram pelo encéfalo e se orga-

nizam em um quadrilhão de sinapses, o desenvolvimento do córtex cerebral é um meca-

nismo complexo que pode ser prejudicado por fatores genéticos e ambientais levando aos

distúrbios do desenvolvimento cortical (1).

Tais malformações do desenvolvimento cortical (MDC) estão entre as principais causas

de epilepsia e atraso de desenvolvimento. Os avanços nas técnicas de imagens de resso-

nância magnética (RM) tem possibilitado a identificação de grandes grupos de indivíduos

com malformações corticais. É estimado que mais de 40% de crianças com epilepsia refra-

tária, possuam algum tipo de MDC (2).

Para analisar as causas das malformações corticais é importante entender as fases do

desenvolvimento cortical.

1.1. O desenvolvimento do córtex cerebral

O córtex cerebral é uma estrutura modular cuja formação se dá por indução de gru-

pos de neurônios na camada neuroepitelial. Estes neurônios irão se diferenciar, migrar e

se organizar no córtex adulto (3). Desse modo, a formação do córtex cerebral pode ser

dividida didaticamente em três estágios que se sobrepõem: proliferação, migração e or-

ganização.

A fase de proliferação tem início na 5ª - 6ª semanas, ocorrendo até a 6ª - 20ª semanas

de gestação. No início da corticogênese, células neuroepiteliais sofrem sucessivas divisões

simétricas, aumentando a quantidade de células progenitoras. Posteriormente, as células

neuroepiteliais se diferenciam em células da glia que, por sua vez, sofrem divisões assimé-

tricas originando novas células gliais e progenitores intermediários. Estes últimos se divi-

dem simetricamente para dar origem aos neurônios (4).

Introdução 34

Os neurônios recém-formados devem migrar para seus destinos finais, caracterizando

a fase de migração, que ocorre da 6ª - 7ª a 20ª - 24ª semanas de gestação. A migração

celular ocorre através da movimentação dos neurônios corticais, tanto radialmente pelas

fibras radiais gliais, quanto tangencialmente paralelo à superfície pial. Durante os estágios

iniciais da migração, as células passam por um estágio chamado de multipolar. Posterior-

mente, os neurônios passam a adotar uma conformação bipolar e migram através das

fibras radiais gliais. As primeiras células que migram formarão a pré-placa. As demais on-

das migratórias de neurônios irão, então, formar a placa cortical que irá dividir a pré-placa

em uma camada mais externa denominada de zona marginal e uma camada mais interna

chamada de sub-placa. Ao chegarem à placa cortical, os neurônios se organizam em ca-

madas que irão se desenvolver no córtex adulto. Este processo segue um padrão chamado

de “inside-out”, no qual os neurônios recém-chegados à placa cortical ultrapassam os neu-

rônios mais antigos, acumulando-se progressivamente em camadas mais superficiais

(Figura 1) (5).

Figura 1: Padrão inside out de migração neuronal e transição morfológica dos neurônios. Os neu-rônios recém-chegados à placa cortical [2] ultrapassam os neurônios mais antigos [1], acumulan-

do-se progressivamente em camadas mais superficiais [3]. Os estágios multipolar e bipolar [4] mostram a transição morfológica sofrida pelas células no início da migração (adaptado de Riken

(6)).

Introdução 35

A fase de organização tem início na 16ª semana de gestação e ocorre mesmo após o

nascimento (2). Nesta fase os neurônios atingem seus destinos finais e realizam suas co-

nexões sinápticas pela extensão de seus axônios e dendritos, completando a organização

das seis camadas.

O posicionamento correto dos neurônios é essencial para a função neocortical nor-

mal, desta forma defeitos em qualquer uma das fases da embriogênese do córtex cerebral

podem levar às MDC.

1.2. Malformações do desenvolvimento cortical

O termo malformações do desenvolvimento cortical foi introduzido inicialmente em

1996 por Barkovich et al. (7) e agrupava crianças com retardo mental e epilepsia.

Atualmente as malformações do desenvolvimento cortical formam um grupo hetero-

gêneo, com anormalidades anatômicas focais ou difusas, determinadas por diferentes

causas, que se desenvolvem durante períodos críticos da formação do córtex. Em muitos

casos a etiologia das MDC continua desconhecida, porém avanços nas áreas da biologia

molecular e genética humana têm contribuído para a identificação de causas específicas

de alguns tipos de MDC (8).

Desse modo, os aspectos genéticos das MDC tem ganhado importância nas classifica-

ções propostas e, devido aos avanços nas pesquisas, as atualizações das classificações são

realizadas constantemente (3).

Segundo a última classificação proposta por Barkovich et al., em 2012, (3) as malfor-

mações do desenvolvimento cortical podem ser divididas em três grandes grupos, de

acordo com a fase de desenvolvimento afetada. O grupo 1 contempla as malformações

devido a proliferação ou apoptose anormais de neurônios e células da glia. O grupo 2

agrupa as malformações da fase de migração neuronal e o grupo 3 contém as malforma-

ções devido a anormalidades pós-migracionais.

No primeiro grupo encontram-se as microcefalias congênitas, megalencefalias e dis-

genesias corticais com anormalidades na proliferação (Ex: esclerose tuberosa e displasia

cortical focal tipo II).

Introdução 36

No grupo 2 estão incluídas as heterotopias, lissencefalias clássicas, heterotopias sub-

corticais, lissencefalia coblestone e displasia sublobar.

No grupo 3 estão descritas as esquizencefalias, polimicrogirias, as displasias corticais

focais tipo I e as microcefalias pós-migracionas.

Em seguida, iremos nos concentrar na descrição das malformações corticais que fo-

ram alvo desta tese de doutorado.

1.2.1. Malformações devido a anormalidades na migração neuronal (Gru-

po 2)

Os principais distúrbios da fase de migração neuronal estudados foram: a Heterotopia

Nodular Periventricular (HNP) e o espectro da Lissencefalia/Heterotopia Subcortical em

Banda (LIS/HSB).

1.2.1.1. Heterotopia Nodular Periventricular

As heterotopias são malformações corticais nas quais os neurônios falham em migrar

para seus destinos finais, se estabelecendo em regiões inapropriadas do encéfalo.

Dentro das heterotopias, a HNP é a forma mais comum, sendo caracterizada pela pre-

sença de nódulos de neurônios, de tamanhos variáveis, ao longo dos ventrículos laterais

(Figura 2) e um córtex aparentemente normal.

Figura 2: A- indivíduo normal. B- paciente com HNP (setas) (cedido por Cendes, F).

A B

Introdução 37

A principal manifestação neurológica da HNP é a epilepsia, geralmente não havendo

nenhuma deficiência grave nas funções cognitivas. Nos casos familiares ocorre um padrão

de herança ligado ao cromossomo X, no qual as mulheres são afetadas e os homens afe-

tados normalmente não sobrevivem.

A região Xq28 foi identificada como responsável por HNP (9) e o gene foi identificado

como FLNA (filamina) (10).

O gene FLNA codifica uma grande fosfoproteína (280kDa) que se liga com a actina ex-

pressa no sistema nervoso e em outros tecidos. A proteína FLNA interage com mais de 30

proteínas, mas o processo fisiológico de boa parte destas ligações ainda é desconhecido.

Devido à quantidade de interações, a FLNA participa de cascatas de sinalizações de quina-

ses e fosfatases, interage com receptores transmembrana e moléculas de sinalizações,

auxiliando no tráfego de vesículas devido a sua associação com o complexo de Golgi (11).

A ligação da FLNA com a actina promove estabilização do citoesqueleto, formando uma

rede de filamentos supostamente importantes para a migração celular.

Algumas formas muito raras de HNP associadas à microcefalia e grave atraso do de-

senvolvimento estão relacionadas a alterações no gene ARFGEF2 (adenosine diphosphate-

ribosylation factor guanine exchange factor 2 ) (12).

Ferland et al., em 2009, (13) identificaram alterações na camada neuroepitelial ao

longo da zona ventricular em tecidos pós-morte de pacientes com HNP. Os nódulos de

neurônios analisados eram formados em grande parte por neurônios gerados mais tardi-

amente no desenvolvimento, sugerindo que problemas externos às células, ocorridos mais

tardiamente no desenvolvimento, estariam prejudicando a migração e levando a forma-

ção dos nódulos, enquanto os primeiros grupos de neurônios formados migrariam nor-

malmente para suas posições finais.

Camundongos expressando construções dominante-negativas que prejudicam a fun-

cionalidade do gene FLNA e camundongos com inibição do gene ARFGEF2 apresentaram

alterações na camada neuroepitelial, próxima aos ventrículos, indicando as interações dos

produtos proteicos destes genes com o transporte de vesículas e sua relação com a ade-

são celular. Desse modo foi sugerido que alterações nos genes FLNA e ARFGEF2 prejudica-

Introdução 38

riam o transporte de vesículas envolvidas na adesão celular, o que traria problemas a in-

tegridade da camada neuroepitelial próxima aos ventrículos, prejudicando a migração

neuronal e levando à formação de nódulos (13).

A HNP é uma desordem clínica heterogênea, apesar de o gene FLNA ser responsável

por 100% dos casos familiares, apenas 26% dos casos esporádicos são explicados por alte-

rações nesse gene (14).

1.2.1.2. Espectro da Lissencefalia e Heterotopia Subcortical em Banda

A Lissencefalia (LIS) é uma malformação causada por falhas na migração neuronal. O

termo lissencefalia se refere à condição na qual os sulcos da superfície do córtex estão

diminuídos ou ausentes, dando ao córtex uma aparência “lisa”. A ausência das circunvolu-

ções caracteriza a forma mais grave de lissencefalia chamada de agiria (Figura 3b). Quando

os giros estão reduzidos é caracterizada a forma intermediária da malformação chamada

de paquigiria (Figura 3c) (15). A lissencefalia clássica (tipo I) é caracterizada pela presença

de um córtex espesso (10-20mm vs 4mm - normal) sem outras malformações cerebrais

associadas. O córtex apresenta quatro camadas: a camada I com neurônios de Cajal-

Retzius, a camada II formada por neurônios piramidais desorganizados, a camada III que

possui tipos celulares variados e espaçados e a camada IV, mais espessa e com neurônios

pequenos e médios, estendendo-se profundamente no encéfalo (Figura 4) (16).

A lissencefalia clássica está associada a profundo retardo mental e crises epilépticas

intratáveis (17).

A heterotopia subcortical em banda (HSB) é considerada a forma mais branda do es-

pectro LIS/HSB, sendo caracterizada pela presença de uma banda anormal de neurônios

em meio a substancia branca, e um córtex aparentemente normal (Figura 3d). Esta banda

de neurônios forma um “segundo córtex”, abaixo do córtex normal, por isso tal malforma-

ção é também conhecida como “duplo córtex”.

Introdução 39

Figura 3: A- indivíduo normal. B- paciente com agiria. C- paciente com paquigiria. D- paciente com HSB (cedido por Cendes, F).

A B

C D

Introdução 40

Figura 4: A- corte histológico de uma paciente com lissencefalia. Esquema da laminação de um córtex com lissencefalia (B), mostrando as 4 camadas: camada I composta por neurônios Caja-

Retzius, camada II composta por neurônios piramidais desorganizados, camada III composta por células variadas, camada IV composta por neurônios médios e pequenos. Esquema de um córtex normal (C) com 6 camadas: camada molecular (I), camada granular externa (II), camada piramidal externa (III), camada granular interna (IV), camada piramidal interna (V), camada fusiforme (VI).

(adaptado de Guerrini, (16)).

Pacientes com HSB possuem geralmente atraso no desenvolvimento de leve a mode-

rado e epilepsia refratária, porém alguns pacientes apresentam manifestações clínicas

leves (18).

Reiner et al. (19) isolaram o gene LIS1 como responsável pela forma autossômica

dominante de lissencefalia clássica. O gene LIS1 está localizado no cromossomo 17p13.3 e

codifica a subunidade β da isoforma cerebral de uma acetil-hidrolase ativadora de plaque-

tas (PAFAH1b1).

O espectro LIS/HSB também pode ser causado por alterações em um gene ligado ao

cromossomo X: a doublecortina (DCX) (20). O gene DCX está localizado na região Xq22.3-

q23 e possui 9 exons (6 codificantes).

Embora as características de neuroimagem dos pacientes com mutações patogênicas

em LIS1 e DCX sejam similares, foi observado que indivíduos com alteração no gene LIS1

Lissencefalia Córtex normal

Introdução 41

possuem a região posterior do córtex mais afetada, enquanto pacientes com alteração no

gene DCX possuem a região anterior mais afetada (21).

Geralmente mulheres com alteração no gene DCX desenvolvem HSB, e os homens lis-

sencefalia. Porém, já foram relatados homens com HSB com mutações no gene DCX.

D’Agostinho et al. (22) identificaram mutações no gene DCX em 29% de homens com HSB.

Casos raros de deleção no gene DCX foram descritos em homens com o mesmo fenótipo

(23). Ambos os casos sugerem mosaicismo somático para a explicação dos fenótipos en-

contrados, e, no trabalho de D’Agostinho (22), há também a possibilidade de existir uma

função residual da proteína mutada.

1.2.1.3. Gene LIS1 e o espectro LIS/HSB

A proteína LIS1 forma um complexo com a proteína Nude1 regulando a atividade da

dineína e consequentemente dos microtúbulos durante a migração neuronal (24).

Mei et al. (25) identificaram mutações no gene LIS1 em 44% de pacientes com lissen-

cefalia com a região posterior do cérebro mais afetada que a anterior. Duplicações e dele-

ções no gene LIS1 são encontradas em 35% a 50% dos pacientes com lissencefalia (26)

(25).

Camundongos heterozigotos para mutação no gene LIS1 apresentaram desorganiza-

ção laminar do córtex e defeitos no córtex hipocampal e cerebelar (27). Foram encontra-

dos neurônios corticais e glia com morfologia alterada, além de defeitos na migração neu-

ronal, em camundongos heterozigotos para deleção de parte do gene LIS1 (28).

1.2.1.4. Gene DCX e o espectro LIS/HSB

A proteína DCX tem alta expressão nas células neuronais do córtex em desenvolvi-

mento, possui domínios de ligação com as tubulinas, sendo responsável pela organização

e estabilização dos microtúbulos, afetando diretamente a migração celular (29).

Mutações no gene DCX são encontradas em 80% de mulheres e em aproximadamente

25% de homens com HSB (30). Alterações no número de cópias do gene DCX são encon-

tradas em 33% de mulheres com HSB (26).

Introdução 42

Estudos com RNA de interferência para o gene DCX durante o desenvolvimento de ra-

tos bloquearam a migração radial de neurônios, levando a um fenótipo similar ao de hu-

manos com mutações no gene DCX, alguns neurônios interromperam a migração gerando

HSB, enquanto outros migraram para locais inapropriados do córtex (31).

1.2.1.5. Interação LIS1 e DCX

As proteínas LIS1 e DCX são co-expressas no cérebro em desenvolvimento e além de

se ligarem aos microtúbulos, elas interagem entre si, sugerindo um importante papel no

desenvolvimento cortical (32).

Mutações e alterações no número de cópias envolvendo os genes DCX e LIS1 são res-

ponsáveis por aproximadamente 85% dos pacientes com LIS/HSB (26). A maioria dos paci-

entes com lissencefalia possuem alteração no gene LIS1 (25) enquanto a maioria dos paci-

entes com HSB possuem alteração no gene DCX (30).

Como as proteínas LIS1 e DCX tem relação direta com os microtúbulos, não é surpresa

que alterações nos genes das famílias das tubulinas, componentes dos microtúbulos, tam-

bém sejam responsáveis por malformações do córtex cerebral.

1.2.1.6. Gene TUBA1A e a lissencefalia

O primeiro gene da família das tubulinas a ser implicado com malformações do córtex

cerebral foi o gene TUBA1A. Este gene se encontra na região 12q13.12 e codifica uma su-

bunidade estrutural de microtúbulos, que tem alta expressão no SNC (33). Estudos em

modelos animais (34) mostraram que alterações no gene TUBA1A, componente de mi-

crotúbulos, acarretavam em anormalidades hipocampais, além de problemas na migração

neuronal em camundongos, sugerindo um novo gene candidato para as malformações do

córtex cerebral.

Pacientes com diferentes graus de lissencefalia foram identificados com mutação no

gene TUBA1A (33) (34) (35) (36). Fallet-Bianco et al., em 2008 (37), e Leucortois et al., em

2010 (38), descreveram casos de fetos portadores de mutações no gene TUBA1A que

apresentaram quadros graves de lissencefalia que resultaram em aborto. Geralmente,

pacientes com mutações no gene TUBA1A apresentam, além da malformação cortical,

Introdução 43

outras malformações associadas, como anormalidades cerebelares, hipocampais e do cor-

po caloso (33) (39).

1.2.2. Malformações devido a distúrbios pós migracionais (Grupo 3)

1.2.2.1. Esquizencefalias

A Esquizencefalia é caracterizada pela presença de fendas unilaterais ou bilaterais nos

hemisférios cerebrais, com comunicação entre os ventrículos e o espaço extra-axial suba-

racnóide (2). As fendas podem possuir as paredes separadas ou fechadas, caracterizando

respectivamente a esquizencefalia de lábios abertos e a esquizencefalia de lábio fechados

(Figura 5). Grandes porções dos hemisférios podem estar ausentes e substituídas por líqui-

do cérebro-espinhal (40). É comum as fendas apresentarem polimicrogiria em suas pare-

des, justificando a classificação da esquizencefalia como um distúrbio pós-migracional

(fase de organização) (41).

Figura 5: A- Paciente com esquizencefalia de lábios abertos. B- Paciente com esquizencefalia de lábios fechados (seta preta) e heterotopia periventricular (cabeça de seta branca) (A- Cedido por

Cendes, F; B- Adaptado de Merello et al. (42)).

A esquizencefalia pode resultar de insultos ambientais como: traumas maternos, uso

de drogas, infecções virais e problemas vasculares intra-uterinos (43). Geralmente a es-

quizencefalia ocorre esporadicamente, mas já foram relatados casos familiares (44). Evi-

A B

Introdução 44

dências de um comprometimento genético foram apresentadas por alguns estudos. Em

1996, Brunelli et al. (40) identificaram três pacientes com esquizencefalia que eram hete-

rozigotos para mutações no gene EMX2. Em 1997, Faiella et al. (45) e Granata et al. (46)

identificaram mutações no gene EMX2 em irmãos com esquizencefalia bilateral grave.

O gene EMX2 se localiza no cromossomo 10q25.3-q26.1, possui três exons e é consi-

derado um gene homeobox, que codifica um fator de transcrição capaz de regular outros

genes (47).

Bayatti et al. (48) mostraram um gradiente de expressão do RNAm do gene EMX2 no

desenvolvimento do córtex humano, iniciando com alta expressão na zona ventricular e

subventricular (oito semanas pós concepção), e depois passando a predominar na região

da placa cortical (12 semanas pós concepção). Estudos em animais transgênicos com dife-

rentes padrões de expressão do gene EMX2 apresentaram áreas primárias, motoras e sen-

sitivas alteradas em tamanho e deslocadas rostrolateralmente (49) sugerindo que o gene

EMX2, junto com outros genes, é responsável pela definição da posição e do tamanho das

áreas corticais primárias.

Apesar dos trabalhos antigos sugerirem a relação do gene EMX2 com a esquizencefa-

lia, trabalhos atuais não corroboram esta hipótese. Estudos recentes em grandes grupos

de pacientes com esquizencefalia não identificaram alterações patogênicas no gene EMX2

(43) (42) (50). Tais achados além de questionar a validade dos trabalhos antigos, questio-

nam a real importância do gene EMX2 para as malformações corticais.

1.3. Separação de fases: um conceito defasado?

A separação tradicional em que um gene estava relacionado a somente uma malfor-

mação cortical, relacionada a um estágio do desenvolvimento, tem se tornado defasada

atualmente. Trabalhos recentes mostram que um mesmo gene pode levar a malforma-

ções corticais de “fases” diferentes. Novos genes têm sido identificados e a heterogenei-

dade dos fenótipos pode ser explicada por um mesmo gene que afeta múltiplos estágios

do desenvolvimento ou por vários genes que participam de um mesmo mecanismo (51).

Introdução 45

Recentemente, mutações no gene WDR62 foram identificadas como responsáveis por

um amplo espectro de malformações corticais. Alterações no mesmo gene, e em alguns

casos até a mesma mutação, causaram fenótipos diversos nos pacientes, como microcefa-

lia, lissencefalia, polimicrogiria, esquizencefalia e hipoplasia cerebelar e do corpo caloso

(52).

Outro exemplo da complexidade dos mecanismos do desenvolvimento cortical são os

genes da família das tubulinas (TUBA1A, TUBB2B, TUBA8) que recentemente foram relaci-

onados a diversos tipos de MDC.

1.3.1. Gene TUBA1A

Os pacientes com mutações no gene TUBA1A frequentemente eram identificados

com lissencefalia, possuindo geralmente outras malformações associadas (33) (39). Po-

rém, recentemente, este gene foi relacionado a outras formas de MDC. Jansen et al. (53)

identificaram duas novas mutações no gene TUBA1A, uma delas em um paciente com

lissencefalia e a outra em três pacientes de uma família, dois deles com quadro de polimi-

crogiria perisilviana.

1.3.2. Gene TUBB2B

O gene TUBB2B, localizado no cromossomo 6p25.2, faz parte da família de genes das

β tubulinas, subunidade formadora da proteína tubulina. Assim como nos outros genes de

tubulinas (α e β), recentemente mutações nesse gene foram relacionadas a malformações

corticais. Romaniello et al. (54) identificaram uma mutação no gene TUBB2B no sítio de

ligação com GTP da molécula de tubulina em um paciente portador de esquizencefalia e

polimicrogiria. Jaglin et al. (55) encontraram mutações nesse gene em pacientes com po-

limicrogiria.

1.3.3. Gene TUBA8

O gene TUBA8, localizado no cromossomo 22q11.21, apesar de pouco expresso no

SNC, pode ter importante papel no desenvolvimento cortical. Abdollahi et al. (56) identi-

ficaram um caso de síndrome autossômica recessiva causada por uma deleção de 14pb no

Introdução 46

gene TUBA8, encontrada em pacientes com polimicrogiria generalizada associada a hipo-

plasia do nervo óptico.

1.4. Novas descobertas em distúrbios do SNC

As variações do genoma humano são fundamentais para se entender a diversidade de

fenótipos. Estudos anteriores mostravam que os SNPs (single nucleotide polymorphism)

eram a principal fonte de variação no genoma humano (57). Com os projetos genoma (58)

e outras iniciativas (59) (60) foram identificados cerca de 12 milhões de SNPs, depositados

em bancos de dados públicos.

Porém, com o avanço das tecnologias de triagem do genoma, tem se descoberto um

grande grupo de alterações estruturais com tamanho variável, sendo muitas vezes altera-

ções submicroscópicas, não detectadas por métodos de citogenética e/ou sequenciamen-

tos tradicionais. Evidencias indicam que as alterações estruturais podem compreender

milhões de nucleotídeos polimórficos em cada genoma, contribuindo para a diversidade

humana e a susceptibilidade a doenças (57).

As variações do número de cópias (copy number variation – CNV) são as alterações

estruturais mais prevalentes no genoma humano, e têm sido encontradas em alta fre-

quência na população (61).

Apesar de ainda não numerosa, a literatura existente tem mostrado a relação das

CNVs com distúrbios do sistema nervoso central (SNC). CNVs patogênicos são encontrados

em 14-18% de pacientes com retardo mental e outros distúrbios relacionadas ao SNC (62).

Um grande grupo de pacientes com diversos tipos de malformação cerebral, incluindo

lissencefalia, polimicrogiria, displasia cortical focal e agenesia do corpo caloso foram anali-

sados para detecção de CNVs. Foi encontrado pelo menos um CNV novo em 22.5% dos

pacientes, e análises dessas regiões sugeriram novos genes candidatos para as malforma-

ções (63).

Valduga et al. (64) analisaram fetos com malformações congênitas diversas e encon-

trou CNVs patogênicas em 10% dos casos. CNVs foram encontradas em fetos com agene-

Introdução 47

sia do corpo caloso, dimorfismos faciais, retardo do crescimento e complexas malforma-

ções cerebrais.

Griswold et al. (65) estudaram grandes grupos de pacientes com autismo (ASD – Au-

tism spectrum disorder) e controles caucasianos e, através de análises de CNVs, identifica-

ram novos genes candidatos para a doença.

Como as malformações corticais são caracterizadas por heterogeneidade genética,

um número significativo de indivíduos afetados permanece sem etiologia molecular de-

terminada. Deste modo, a identificação de variações estruturais (CNV) pode resultar na

descoberta de regiões e genes candidatos, fornecendo pistas sobre os mecanismos mole-

culares de malformações corticais de causa desconhecida.

Introdução 48

Objetivos 49

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivos Gerais

Traçar um perfil molecular de um grupo de pacientes com algumas malformações

do córtex cerebral,

2.2. Objetivos Específicos

Identificar a presença de mutações de ponto deletérias nos principais genes candi-

datos para cada malformação,

Pesquisar alterações estruturais em regiões candidatas em pacientes com lissence-

falia / heterotopia subcortical em banda,

Identificar alterações estruturais (“variações no número de cópias” - CNV) inéditas

e com potencial patológico para a etiologia molecular das malformações corticais.

Objetivos 50

Materiais e Métodos 51

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Casuística

Os pacientes para esse estudo foram recrutados nos ambulatórios dos serviços de

Neurologia do HC-UNICAMP e do HC-USP-RP pelos Profs. Drs.: Fernando Cendes, Marilisa

M. Guerreiro, Maria Augusta Montenegro, Vera Terra, Antonio Carlos dos Santos e Améri-

co Sakamoto. Os exames de neuroimagem dos pacientes foram analisados no Laboratório

de Neuroimagem do Departamento de Neurologia da FCM-UNICAMP e no serviço de Ra-

diologia do HC-USP-RP.

Um questionário foi utilizado para obter informações detalhadas sobre a história fa-

miliar de epilepsia ou a presença de déficit neurológico em parentes de primeiro, segundo

e terceiro grau e a ocorrência de qualquer evento pré-natal durante as primeiras 24 se-

manas de gestação. Eventos pré-natais significantes incluem qualquer anormalidade re-

portada pela mãe ou familiares durante as primeiras 24 semanas de gestação, como ten-

tativa de aborto, uso de drogas, abuso físico, queda com trauma abdominal, hipertensão,

febre, diabetes mellitus, exposição a raios X, infecção por citomegalovírus e gestação ge-

melar.

Foram coletadas amostras de sangue de pacientes afetados por diferentes formas de

MDC e que tiveram confirmação do diagnóstico por exames de neuroimagem. Sempre

que possível os pais ou irmãos destes indivíduos também eram avaliados clinicamente e as

amostras coletadas.

O grupo controle foi formado por cerca de 200 indivíduos normais não relacionados.

A ausência de malformações no córtex cerebral nos indivíduos deste grupo foi confirmada

por exames de RM quando possível.


3.1.1. Caracterização da amostra

A casuística foi composta por um total de 107 pacientes com malformações corticais.

Este total de pacientes foi dividido em três grupos: I) pacientes com HNP, II) pacientes

com o espectro LIS/HSB e III) pacientes com esquizencefalia.

O grupo de HNP (grupo I) possui 27 pacientes (Tabela 1), sendo 15 mulheres e 12 ho-

mens. Dentre eles 9 possuem HNP bilateral (4 homens e 5 mulheres), 25 pacientes possu-

em epilepsia, sendo predominante as crises parciais simples e complexas, com idade de

início das crises variando de 10 dias de vida a 35 anos. O exame neurológico foi considera-

do normal em 11 casos.


Tabela 1: Característica Clínicas do pacientes com Heterotopia Nodular Periventricular.

Registro-Gênero

Data nasci-mento

Neuroimagem Exame neu-rológico

Início das crises Tipo de crise Frequência

283\01 - F 15/02/1981 HNP à direita, heterotopias focais, polimicrogiria normal 12 anos parciais 5 vezes por semana

302\01 - M 24/08/1948 HNP assimétrica à esquerda, lobos cerebrais assimétricos com leve redução à esquerda

normal 17 anos CPC, raramente CTCG

controlada

373\01 - F nd heterotopia transmanto normal 10 anos parciais semanal

521\01 - F nd HNP bilateral normal 2 anos parciais, CTCG uma vez por mês

680\01 - F 22/07/1948 HNP à direita, assimetria hipocampal c/ diminui-ção do hipocampo direito, agenesia do corpo

caloso e polimicrogiria

normal 35 anos parciais uma vez a cada três meses

1032\01 - M

20/12/1965 HNP em corno temporal direito normal 20 anos parciais, CTCG 8 a 10 vezes por mês

173\02 - F 07/08/1965 HNP bilateral, colpocefalia e heterotopias na substância branca

normal 29 anos parciais três vezes por mês

874\02 - F 08/01/1980 HNP bilateral mais posterior em corno temporal, nódulos bilaterais, porém não contíguos

normal 3 anos CPS, CPC, CTCG controlada

975\02 - M 21/04/1980 HNP bilateral normal 2 anos nd nd

160\03 - F 10/10/1962 HNP normal 13 anos CPS, CPC, CTCG uma vez por mês

607\03 - F nd heterotopia mais lateralizada, posterior a es-querda e subcortical

normal 5 anos parciais simples e complexas

uma vez por semana

258\08 - F nd HNP nos cornos posteriores dos ventrículos late-rais

nd não têm crises não têm crises não têm crises

497\08 - M 10/12/2008 HNP nd 14 anos ausência, parciais e CTCG

5 crises por mês

537\08 - M 01/02/1991 HNP, agenesia parcial de corpo caloso, atrofia cerebral, hidrocefalia

tetraparesia espastica

20 dias CPC e CTCG nd


Registro-Gênero

Data nasci-mento

Neuroimagem Exame neu-rológico

Início das crises Tipo de crise Frequência

77\09 - M 09/03/1985 HNP nd 20 anos CPC, CTCG Uma ou duas por mês

143\09 - F 04/12/1956 HNP à esquerda nd 1 ano CPC, CTCG Uma ou duas por mês

P1 - F nd HNP nd 17 anos CPS, CTCG anual

P2 - M nd HNP nd 23 anos CPS, CPC uma por mês a duas por ano

P3 - F nd HNP bilateral, hipoplasia do vermis, focos ines-pecíficos em T2

nd 20 anos CPS, CPC, CTCG mensal a se-manal

P4 - F nd HNP bilateral nd 5 anos CPS, CPC, CTCG uma a duas por mês

P5 - M nd HNP nd 16 anos CPS, CPC mensal

P6 - F nd HNP nd 18 anos CPS, CPC, CTCG anual

898/02 – M nd HNP bilateral Déficit grave 4 meses Típicas da síndrome de West

controladas

899/02 – M 10/07/1998 HNP bilateral Déficit grave 4 meses Típicas da síndrome de West

controladas

900/02 – M nd HNP bilateral Déficit grave 4 meses Típicas da síndrome de West

controladas

524/09 - F 05/04/2002 HN subEpendimária à esquerda, duas fendas de esquizencefalia de lábios fechados

Distúrbio de aprendiza-

gem

1 ano CPS, CPC, CTCG variada

579/09 – M nd HNP (possui síndrome Cerebro-Fronto-Facial) nd nd nd nd

F=Feminino, M= masculino, HNP= heterotopia nodular periventricular, CTCG= crise tônico-clônica generalizada, CPC= crise parcial complexa, CPS= crise parcial simples, nd=não disponível.


O grupo do espectro LIS/HSB (grupo II) foi composto por 33 pacientes (Tabela 2), sen-

do 21 com lissencefalia (13 homens e 8 mulheres) e 12 com HSB (4 homens e 8 mulheres).

Vinte e cinco pacientes do grupo possuem epilepsia, sendo predominante as crises parci-

ais, com idade de início variando de 10 dias de vida a 25 anos. O exame neurológico dos

pacientes variou de leve a grave retardo mental, sendo diagnosticado como normal em

dois pacientes.


Tabela 2: Características Clínicas dos pacientes com o espectro da LIS/HSB.

Registro-Gênero

Data nasci-mento

Neuroimagem Exame neurológico Início das crises

Tipo de crise Frequência

60/01 - M 14/02/1959 HSB com bandas finas difusas mais acentuadas frontalmente e

mais finas posteriormente

normal 18 anos possivelmente atoni-cas

2 x por dia

66/01 - M 11/09/1991 paquigira difusa com predomí-nio anterior

retardo mental leve 2 anos parciais diárias

420/01 - F 23/02/1999 lissencefalia incompleta retardo do desenvolvimento neu-ropsicomotor

1 ano mioclônicas nd

457/01 - F 28/09/1980 paquigiria posterior e HSB ante-rior

retardo do desenvolvimento neu-ropsicomotor

7 anos parcial 2 x por mês

473/01 - M 18/01/1966 paquigiria difusa com predomí-nio posterior bilateral


6 meses parcial nd, não controladas

523/01 - F nd HSB mais anterior, difusa conti-nua e grossa

hemiparesia leve à esquerda e sd de liberação piramidal à esquerda

4 anos parcial diárias

599/01 - M 23/04/1997 agiria posterior e paquigiria anterior

sd de liberação piramidal, hipoto-nia, visão subnormal

3 meses parcial, CTCG diárias

868/01 - M 05/03/1995 lissencefalia incompleta tipo 1 retardo do desenvolvimento neu-ropsicomotor e síndrome de libe-

ração piramidal

2 meses vários tipos, Lennox-Gastaut

diárias

903/01 - F 25/05/1974 HSB difusa e descontínua mais à direita

normal 7 anos parcial 2 x por mês

1004/01 - M

26/09/1998 paquigiria difusa com predomí-nio posterior

tetraparesia não tem não tem não tem

1158/01 - F

23/10/1989 paquigira difusa com predomí-nio posterior


2 anos vários tipos, Lennox-Gastaut

diárias

1184/01 - F

09/09/1987 lisencefalia incompleta tipo 1 retardo do desenvolvimento neu-ropsicomotor e síndrome de libe-

ração piramidal global

5 meses espasmos infantis (West), vários tipos (Lennox-Gastaut)

diárias


Registro-Gênero

Data nasci-mento



20/02 - F 19/05/2001 suspeita de HSB com bandas finas e anteriores

nd 30 dias tônicas e mioclônicas diárias (4 a 5 por dia)

415/03 - F 04/11/1995 HSB retardo mental leve 7 meses parcial, CTCG diárias

652/03 - F 17/04/1995 HSB retardo do desenvolvimento neu-ropsicomotor, inteligência limítro-

fe na média

6 anos CPC e CTCG diárias

1450/03 - M

19/02/2003 agiria difusa, hipoplasia cerebe-lar, agenesia de corpo caloso,

(Dandy-Walker)

hipotônico, dupla hemiparesia 4 meses espasmos infantis (West)

1 x por se-mana

2364/04 - F

05/12/2001 lissencefalia incompleta retardo do desenvolvimento neu-ropsicomotor

não têm crises

não têm crises não têm crises

1324/06 - F

06/02/2002 sugestivo de HSB, síndrome 1p16

atraso global do desenvolvimento, hipotonia

3 anos nd diárias

1467/06 - F

nd LIS nd nd nd nd

60/07 - M nd sugestivo de lissencefalia tipo IV (suspeita de microcefalia vera)

nd nd nd nd

61/07 - F 24/01/2003 paquigiria de lobos frontais, formação cistica inter-hemisférica à esquerda

hipertonia não têm crises


159/08 - M 29/11/2006 microlissencefalia, microcalcifi-cações talâmicas bilaterais e disgenesia do corpo caloso

nd nd nd nd

255/08 - M 28/05/2005 agiria/paquigiria nd 3 a 4 meses nd diárias

527/08 - F 29/04/2001 paquigiria nd nd nd nd

563/08 - M 28/11/2002 agiria/paquigiria tetraparesia 1 ano Lennox-Gastaut variável

643/08 - M 09/12/1987 paquigiria bifrontal, HSB nas regiões posteriores

retardo mental severo 1 ano e 8 meses

tônicas, CTCG nd

112/09 - F 07/05/2002 agiria/paquigiria nd 7 a 8 meses nd 3 a 4 crises por dia


Registro-Gênero

Data nasci-mento



185/09 - M 10/07/2001 agiria de predomínio posterior, poupando parcialmente os lo-

bos frontais

tetraparesia espastica 2 meses tônica bilateral 6 a 8 crises por dia

271/09 - M 24/12/1983 HSB retardo mental grave 25 anos CTCG, drop attacks não contro-ladas

350/09 - M 29/09/2008 lissencefalia, HSB, colpocefalia retardo do desenvolvimento neu-ropsicomotor

antes do dia 10

parciais complexas não contro-ladas

461/09 - M 07/03/1993 paquigiria bifrontal retardo do desenvolvimento neu-ropsicomotor

7 anos tônicas nd

491/09 - F 17/08/1971 HSB nd 7 anos CTCG nd

500/09 - M 13/11/1995 paquigiria de predomínio poste-rior, poupando parcialmente

apenas os lobos frontais

nd nd nd nd

F=Feminino, M= masculino, HSB= heterotopia subcortical em banda, CPC=crise parcial complexa, CTCG= crise tônico-clônica generalizada, sd= síndrome, nd=não disponível.


O grupo das esquizencefalias (grupo III) foi composto por 47 pacientes (Tabela 3), sen-

do 27 mulheres e 20 homens. A maioria dos pacientes deste grupo possui esquizencefalia

unilateral, sendo 11 pacientes com esquizencefalia unilateral de lábios abertos e 8 pacien-

tes com esquizencefalia unilateral de lábios fechados. Dois pacientes possuem esquizence-

falia bilateral de lábios abertos e quatro pacientes possuem esquizencefalia bilateral de

lábios fechados. O grupo possui 37 pacientes com epilepsia de idade de inicio variando

entre 4 meses e 37 anos de idade. O exame neurológico foi considerado normal somente

em 1 paciente, sendo frequente o diagnóstico de hemiparesia e tetraparesia.


Tabela 3: Características Clínicas dos pacientes com Esquizencefalia

Registro- Gênero

Data nasci-mento

Neuroimagem Localização das fendas

Exame neurológico Início das crises


698/01 - M 19/08/2001 Esquizencefalia uni-lateral de lábios

fechados

frontal direito hemiatrofia esquerda, lentifica-ção dos movimentos, dificulda-

de de marcha a esquerda

7 anos CPS, CPC e CTCG duas vezes por semana

896/01- F 09/12/1993 Esquizencefalia uni-lateral de lábios

abertos

temporo parietal esquerda

tetraparesia espastica com predomínio direito

2 anos nd não infor-mado


fechados

parietal direita hemiparesia esquerda 1 ano CTCG uma vez a cada dois

meses 904/01 - M 11/01/1981 Esquizencefalia bila-

teral de lábios fe-chados

parieto occipital tetraparesia com predomínio direito

4 anos ausência atípicas e CTCG

controladas

905/01 - F 04/01/1999 Esquizencefalia bila-teral de lábios aber-

tos a direita e de lábios fechados a

esquerda

frontal tetraparesia nd mioclônicas apenas uma ou duas

crises

1002/01 - M

08/07/1990 Esquizencefalia uni-lateral

temporal parie-tal direita

hemiparesia esquerda 5 anos CPC, CTCG, ausên-cia atípica

controladas

1123/01 - F

23/05/1990 Esquizencefalia uni-lateral de lábios

abertos


hemiparesia direita 5 anos CPC controlada (uma a duas

por ano) 1181/01 -

F 25/11/1988 Esquizencefalia bila-

teral de lábios aber-tos

fronto parietal tetraparesia não têm crises


17/02 - F 10/05/1993 Esquizencefalia uni-lateral de lábios

frontal, parieto occipital, tempo-

tetraparesia com predomínio direito

não têm crises



Registro- Gênero

Data nasci-mento




abertos e fechados ral esquerdo

50/02 - F 21/02/1997 Esquizencefalia de lábio abertos

não determinado paresia do braço esquerdo não têm crises


52/02- M 04/02/2002 Esquizencefalia uni-lateral de lábios

abertos


hemiparesia a direita 1 ano e três meses

CTCG controlada

71/02 - F 05/01/1995 Esquizencefalia bila-teral de lábios fe-chados a direita e

abertos a esquerda

fronto temporo parietal

tetraparesia espastica seis meses CPS, mioclônica pouco fre-quentes

116/02 - M 11/12/1960 Esquizencefalia uni-lateral direita

não especificado déficit em hemicorpo direito 15 anos CPS, CPC, CTCG três crises por semana


abertos esquerda

frontal hemiparesia direita não têm crises



abertos

parietal direita hemiparesia esquerda não têm crises


151/02 - M 17/04/1963 Esquizencefalia uni-lateral

parietal direita normal 37 anos CPC, CTCG duas a três por semana


abertos

frontal esquerda canhoto patológico 12 anos CPC, CTCG várias por semana


abertos

parietal direita hemiparesia esquerda 18 anos CPS, CTCG duas a cinco por semana

458/02 - F 22/06/1958 Esquizencefalia bila-teral de lábios fe-

chados

frontal hemiparesia direita 14 anos CPS, CTCG uma por mês

122/04 - F 05/06/1998 Esquizencefalia uni- occipital direita atraso de fala 7 meses CPC, CTCG poucas cri-


Registro- Gênero

Data nasci-mento




lateral de lábios fechados

ses (nd)


fechados

parietal direita hemiparesia esquerda nd CPC controladas


fechados

fronto temporal direito

hemiparesia esquerda 8 anos "desmaios" uma por ano

126/04 - F nd Esquizencefalia uni-lateral de lábios

fechados

frontal direito hemiparesia esquerda 4 anos ausência, CTCG mais de 10 por semana


fechados

fronto parietal direito

hemiparesia esquerda não têm crises


128/04 - M nd Esquizencefalia uni-lateral de lábios

abertos

fronto temporal direito

nd nd nd nd

371/04 - F 09/07/1967 Esquizencefalia bila-teral de lábios aber-tos a direita e lábios fechados a esquerda

temporo - parie-tal frontal

anda com dificuldade, paresia na perna esquerda

20 anos CPS, CPC, CTCG 3 a 4 vezes por semana


fechados

frontal tetraparesia 25 anos CPS, CPC controlada

374/04 - F 11/06/1999 Esquizencefalia bila-teral de lábios aber-

tos a direita e de lábios fechados a

esquerda

frontal tetraparesia e hipertonia não têm crises


428/04 - M 11/03/1999 Esquizencefalia bila- fronto temporal hemiparesia do braço esquerdo 5 meses nd 5 crises por


Registro- Gênero

Data nasci-mento




teral de lábios aber-tos a direita e in-

completa a esquerda

parietal dia


abertos


tetraparesia, maior a esquerda com predomínio braquial

nd nd controladas

599/04 - F 11/02/1997 Esquizencefalia bila-teral de lábios fe-

chados

parietal tetraparesia maior a direita 21 dias (crise úni-

ca)


51/08 - M 04/10/1985 Esquizencefalia com Hidrocefalia

nd nd 7 anos nd controlado


abertos

frontal direito nd nd CPC duas por dia (agora con-

trolado) 541/08 - F 23/06/2010 Esquizencefalia uni-

lateral de lábio aber-tos

parietal direita tetraparesia 5 meses CPS, CPC e CTCG nd


abertos

nd hemiparesia esquerda 1 ano CPS, CPC, tônicas nd

639/08 - F 26/11/2008 Esquizencefalia bila-teral

nd tetraparesia 2 meses espasmos infantis, tônicas

nd

641/08 - F 03/01/1997 Esquizencefalia de lábio abertos bilate-

ral

nd retardo mental moderado a acentuado

5 meses CPC, CTCG nd

645/08 - F 24/11/1998 Esquizencefalia uni-lateral a direita

nd retardo mental grave 6 meses espasmos infantis nd

669/08 - M 11/02/1986 Esquizencefalia bila-teral de lábios fe-

chados

nd retardo mental leve 6 a 8 meses CPS nd


Registro- Gênero

Data nasci-mento




671/08 - M 03/05/1999 Esquizencefalia nd tetraespastico 5 meses tônicas nd

190/09 - M 13/08/2001 Esquizencefalia uni-lateral direita


retardo mental 2 anos e 9 meses

tônicas, ausência atípica, secundari-amente generali-

zada

uma crise a cada três

meses

353/09 - M 30/03/1974 Esquizencefalia nd nd 31 anos CPC, CTCG uma crise por mês

459/09 - M 13/08/1998 Esquizencefalia nd retardo mental grave 4 meses tônica nd

516/09 - F 05/05/2006 Esquizencefalia nd nd 6 meses controlada

536/09 - F 17/08/1997 Esquizencefalia bila-teral

perisilviana retardo mental leve a modera-do

3 anos CPS, CTCG controlada

538/09- F 21/11/2002 Esquizencefalia bila-teral

nd retardo mental grave 9 meses tônicas nd

521/10 – F 06/05/2010 Esquizencefalia, polimicrogiria fronto temporal e perisilvi-

ana bilateral

nd hemiparesia a esquerda não têm crises


F=Feminino, M= masculino, CPC=crise parcial complexa, CPS= crise parcial simples, CTCG= crise tônico-clônica generalizada, nd=não disponível.


3.2. Extração de DNA

O DNA genômico dos pacientes foi extraído através do protocolo manual de extração

por fenol e clorofórmio: 20 a 30mL de sangue venoso foram colhidos dos indivíduos. As

amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 630G e a parte intermediária, onde se

localizam os leucócitos, foi transferida para um tubo de propileno de fundo cônico. Em

seguida foram adicionadas as soluções de RSB 1x até completar o volume de 11mL e 60µL

de Nonidet. Após ser homogeneizada, a solução foi centrifugada por 10 minutos a 630G e

o sobrenadante foi descartado. Adicionou-se 0,5mL de RSB 1x , 3mL de solução SDS a 10%

e 80µL de proteinase K (100mg/mL). As amostras foram incubadas a 37°C por 24h. Após a

incubação, foram acrescentados 3mL de fenol, seguido de homogenização e centrifugação

a 630G por 10 minutos. A parte inferior do tubo foi descartada e acrescentou-se 1.5mL de

fenol e 1.5mL de solução de clorofórmio álcool isoamílico, seguidos de homogenização e

centrifugação a 630G por 10 minutos, sendo a parte inferior do tubo descartada. Este pro-

cesso foi repetido com 3mL de solução de clorofórmio álcool isoamílico. O DNA genômico

foi então precipitado com 6mL de etanol absoluto. Em seguida o DNA foi transferido para

tubos cônicos de 1.5mL e diluídos em aproximadamente 200µL de TE 1x.

3.3. Detecção de Mutações de Ponto e Pequenas Inserções/Deleções em

Genes Candidatos

Os genes candidatos analisados foram: FLNA, LIS1, DCX, EMX2, TUBA1A, TUBB2B e

TUBA8. Os pacientes com HNP foram analisados para o gene FLNA, os pacientes com o

espectro LIS/HSB foram analisados para os genes LIS1, DCX, TUBA1A, TUBB2B e TUBA8 e

os pacientes com esquizencefalia foram analisados para os genes EMX2, TUBA1A, TUBB2B

e TUBA8 (Tabela 4) .


Tabela 4: Resumo dos genes analisados para cada malformação cortical

Malformação N Genes analisados

HNP 27 FLNA

LIS/HSB 33 LIS1, DCX, TUBA1A, TUBB2B e TUBA8

Esquizencefalia 47 EMX2, TUBA1A, TUBB2B e TUBA8

3.3.1. Amplificação por PCR

O DNA genômico foi amplificado pela técnica de PCR (polymerase chain reaction) uti-

lizando-se primers específicos para a amplificação de todos os exons codificantes e das

regiões intron/exon dos genes candidatos. As tabelas de 5 a 11 mostram as sequencias

dos primers, as temperaturas de anelamento específicas utilizadas (Ta) e o tamanho do

fragmento amplificado na reação para cada par de primers.

As reações de PCR foram realizadas para um volume final de 15µL, contendo 40ng de

DNA genômico; 3.5pmol de cada primer; 1.5µL de tampão 10x, 200µM de dGTP, dCTP,

dTTP e dATP; 0.5 unidades de Taq DNA polimerase e 1.5mM de MgCl2. Quando necessário

também foi acrescentado DMSO à reação de forma que o mesmo atingisse 10% do volu-

me total.

As condições da PCR foram: desnaturação inicial a 95°C por 4 minutos, seguido de 35

ciclos a 95°C por 30 segundos, temperatura de anelamento específica do primer por 30

segundos e 72°C por 1 minuto, seguido de extensão final a 72°C por 7 minutos. Quando

necessário, utilizou-se o protocolo de PCR touchdown, no qual a temperatura de anela-

mento começa a 66°C e cai 0,5°C a cada ciclo, após 20 ciclos a temperatura de anelamento

eleva-se a 60,5°C e o programa segue normalmente.


Tabela 5: Primers utilizados para amplificação do gene FLNA (* uso de DMSO, **PCR touchdown).

Primers

FLNA Sequencia do primer

Tamanho

(pb) Ta (°C)

2.1F

2.1R

5’-CCGCATTTAAAGGGCTCGCT-3’

5’-GCGTGAAAGTGTTCTGCTGGA-3’ 297 60*

2.2F

2.2R

5’-ACCGAGAAGGACCTGGCG-3’

5’-AGTGGGCCGCTGGTTGTG-3’ 204 63

2.3F

2.3R

5’-GGCTTATCGCGCTGTTGGAG-3’

5’-GGAGATGGAAGGACGCACG-3’ 210 63

3.1F

3.1R

5’-GTGCTGCCAGACCCTGACC-3’

5’-GCTTCTTGGCCTCCTCATCC-3’ 208 62

3.2F

3.2R

5’-ACCCTGATCCTGCACTACTCC-3’

5’-GTGACCCCAGCCCAGTCTC-3’ 237 60

4F

4R

5’-GGCGCAGAGGCAGGAGAG-3’

5’-GCCGATCCGGTCCCCTAC-3’ 239 59

5F

5R

5’-GGATCGGCAGTTGGGAGAG-3’

5’-GGAAGACGTTGGCACACGG-3’ 252 63

6F

6R

5’-AAGGGTGGAGGGGTGAGG-3’

5’-AAGAGCAGCCCCACTGAAAG-3’ 245 60

7F

7R

5’-CTTTCAGTGGGGCTGCTCTT-3’

5’-CCAGCCACTGCCTGAGGTC-3’ 178 63.1

8F

8R

5’-AGGCTTGTGACCTCAGGCAG-3’

5’-GGCTCTCCCCACAGACCAG-3’ 277 60

9F

9R

5’-CTGAGCAGGTGCCTCGTG-3’

5’-ACAGCAGAGGGCAGTCAGG-3’ 253 64.5

10F

11R

5’-CTCTGAGGGACCCACCAATC-3’

5’-AGAGCTGGGAGAGGGATGC-3’ 484 62*

12F

13R

5’-GTGGTGATCCTCGGTGTTCC-3’

5’-GCAGCAGGGCGAGACTTAGG-3’ 516 63

14F

15R

5’-GGTGGGGATGGCACTCTGT-3’

5’-ACTAAAGGCCGGTGGAGGTT-3’ 475 59

16F

16R

5’-TTGTGTGCCTGCCAGTGTAG-3’

5’-GAGGAGCGGAGGCTGAGA-3’ 279 59

17F

18R

5’-GGTGTCCCTGCGAGGTCT-3’

5’-AGCCCTCCTACCCTTGATGC-3’ 434 59

19F

19R

5’-GGGGCATCAAGGGTAGGA-3’

5’-CTGGGGACTCGGTGACTGTA-3’ 271 59

20F

20R

5’-GGGAGCAATTCTGGTGTCTCTAA-3’

5’-ACACCCAGCTCAGCCAATCC-3’ 236 60

21.1F 5’-GGATTGGCTGAGCTGGGTGT-3’ 408 62


Primers


Tamanho

(pb) Ta (°C)

21.2R 5’-TTTAGGGCAGGTCTGGAGAAG-3’

22.1F

22.1R

5’-TCTGGGATCGGGGCATAGTG-3’

5’-AGCGAAGAGGATGTTGATGTTGT-3’ 268 63

22.1aF

22.3R

5’-ACAACATCAACATCCTCTTCGCT-3’

5’-CCCTGTCCCCCGTCACATAC-3’ 445 60.7

23F

23R

5’-ACGGGGGACAGGGACCAG-3’

5’-CTGCCAGCCTGTGGGAGTC-3’ 262 61.5*

24F

25R

5’-CCTCCTGACCTGGCCTGC-3’

5’-AGGGTGGGGACGAGCAGA-3’ 482 61.5

26F

26R

5’-CGTCCCCACCCTGTCTCAT-3’

5’-GCCCTCAAACAGGACACTGC-3’ 278 63

27F

28R

5’-GAATGGAGGCCCAGGAGACTA-3’

5’-CCACCCGCAGCCCACACT-3’ 488 63

29F

30R

5’-TGCCTCCCCTGCCTCTGC-3’

5’-TCTGGGCAGGAGGGGCATT-3’ 443 62.2

31.1F

31.2R

5’-AGGCGGACGGGAACAACC-3’

5’-GCTGCTGGAGAGTCTGTTGTCA-3’ 411 62.9

32F

33R

5’-CAACAGACTCTCCAGCAGCTC-3’

5’-GCAGCTCATTGGCACAGTCT-3’ 431 63

34F

35R

5’-GCCAGACTGTGCCAATGAGC-3’

5’-GGGCACAGAGCAGGTCAAGA-3’ 464 63

36F

36R

5’-GAGTGTCCCCAGCATAGTTCC-3’

5’-ACCCTGCCACCCGTTTCTGT-3’ 262 58

37F

37R

5’-TGGCTGGACGCACACTGAT-3’

5’-AGGCTGCCTCCTTTCTGAAC-3’ 245 61**

38F

38R

5’-CATGCCCTCCCTGACTGACA-3’

5’-CCTGAGCCTCGGTGCTATGC-3’ 302 61.3*

39F

40R

5’-CCGAGGCTCAGGGGTATCC-3’

5’-CACCTCTTGGGGCTGCTTGA-3’ 458 66**

41.1F

41.2R

5’-CCCAGGGCTGCTGCTCAC-3’

5’-ACGCAGGAGAGCGAGCACT-3’ 345 62.3

42F

42R

5’-AGCAGCCTTCAGTGAGGACA-3’

5’-CCAGCCCTGGGTCCAATAC-3’ 240 61.3

43F

43R

5’-GCTGATGAGCCGGTCTTACAC-3’

5’-CGGTGGCTCTGGTCTGTCC-3’ 214 59

44F

44R

5’-CAAGCACCCCCATCTAACCAT-3’

5’-CCCGTCTTGGCTGCTTACA-3’ 269 61.3

45F

45R

5’-CCCAGGCCCACAGCATGA-3’

5’-CCTCCTGTTGTCACCAAGAGC-3’ 288 61.3


Primers


Tamanho

(pb) Ta (°C)

46F

46R

5’-AGTCTGGCTCTGCCTGACCT-3’

5’-GCTAAGAGGTGGCTGTGGTG-3’ 314 61*

47F

47R

5’-CCTCTTAGCCCCACCCACTC-3’

5’-TGGCCTCATTTTGGTGGGAAG-3’ 281 60.9*

48F

48R

5’-GGCTGGGACCTGGGACTGA-3’

5’-GCGGGGCTGCTTGGGTAG-3’ 285 60.9*

Tabela 6: Primers utilizados para amplificação do gene DCX.

Primers

DCX Sequencia do primer Tamanho (pb) Ta (°C)

1AF

1AR

5’-CTTCACCCCCATCCCTTTCT- 3’

5’-CAGCGTACACAATCCCCTTG- 3’ 267 56

1BF

1BR

5’-AGAACCTTGCAGGCACTGAG- 3’

5’-TAACCAATGATGCCACCTCC- 3’ 296 59.3

2AF

2AR

5’-CACCTAATCACTTATTTCTTGCCTTAG- 3’

5’-GCTCAAAAGAGTGGGCTGTC- 3’ 288 60

2BF

2BR

5’-AAGCTGGTTACCATCATCCG- 3’

5’-GAGTCCGTCAACAAGAAATGA- 3’ 259 55

3F

3R

5’-GAGGTTCATTGTCACAGGACCA- 3’

5’-AAGGGGAGAGAACAATGGAGC- 3’ 205 59

4F

4R

5’-TGTGTCCTTTTGCCCCAG- 3’

5’-TGTCCTCCATAAATGAAGTCAG- 3’ 206 58

5F

5R

5’-TTCCTTTTCTCTCTTGCTTTGGG- 3’

5’-AACCTTCACCAAGCCATTCAG- 3’ 187 57

6F

6R

5’-AGCAGACATTCCAGAGCTCAA- 3’

5’-GACTCTGAGCACTCTCCCCTC- 3’ 147 60

Tabela 7: Primers utilizados para amplificação do gene LIS1.

Primers

LIS1 Sequencia do primer Tamanho (pb) Ta (°C)

2F

2R

5’-TGTGGAAGACACTTAGTGGCATA-3’

5’-AAGAGACCTCCCAAAGCTGTA-3’ 234 62

3F

3R

5’-TGAAAAGAGTATCTTCAGGGTTAATG-3’

5’-AAATTGTGCGTAACTGTTAACTACA-3’ 274 57


Primers

LIS1 Sequencia do primer Tamanho (pb) Ta (°C)

4F

4R

5’-TTGTCTTGAGGATCATAGTTAAGCC-3’

5’-TGCAGAAGAATGTTATTTTCAGAA-3’ 207 56

5F

5R

5’-GAAATCTATCTGTACGTAACTAC-3’

5’-ATCACAGTTTCAGAGTACCTCC-3’ 477 56

6F

6R

5’-AAGGAGTGATGGAGTTGGTGTT-3’

5’-GGGACACTGTACACTGTTAG-3’ 302 59

7F

7R

5’-AACCCCATGGTAAAATCCCAT-3’

5’-GCCGCGTGATGCCTTTTCAACTA-3’ 226 57

8F

8R

5’-ACTTCTGGGAAGTGTCCTGATG-3’

5’-TTCAGATATCAGCAATAAAACCATG-3’ 337 57

9F

9R

5’-GTCCATACCTAACTTTCTTGTGTGG-3’

5’-CATAAAGCATTAATCCCAAAAGG-3’ 228 55.1

10F

10R

5’-AATAGATGCTATTTAAACATTTTGCC-3’

5’-GTTTGTCTGGCACTCCAAAATC-3’ 271 57

11F

11R

5’-GGTCTCACTATGTTTGTTGTCCA-3’

5’-GGTATCATCAGAGTGCATCCAG-3’ 198 58

Tabela 8: Primers utilizados para amplificação do gene EMX2 (* uso de DMSO).

Primers

EMX2 Sequencia do primer Tamanho (pb) Ta (°C)

2.1F

2.1R

5’-ACAAACGAGTCCCCAATTCTCGTCC-3’

5’-ACACCAAGTCCGGGTTGGAGTAGA-3’

323

63*

2.2F

2.2R

5’-AATCCGTTCTCAACGGCTTCCAC-3’

5’-CTTGGAAGCGATGACCCAGATATCG-3’ 274 63*

2.3F

2.3R

5’-CCTAATGGGATTTCTGCTGTGCTCC-3’

5’-TTGAGACATACATCCCGACCCCAG-3’ 371 63*

2.4F

2.4R

5’-AAGAACTAACGCACCCCATCTGCCT-3’

5’-TGCTCCATGTTGTCCGTTTCTGTGG-3’ 245 63*


Tabela 9: Primers utilizados para amplificação do gene TUBA1A.

Primers

TUBA1A Sequencia do primer

Tamanho

(pb) Ta (°C)

TUBA3-2F

TUBA3-2R

5' AGAGTGGGTGAGTGACCAG 3'

5' GCTGGGGATATGACCTC 3' 443 56

TUBA3-3F

TUBA3-3R

5' AACAGTTCAATTCTGTGTTTG 3'

5' CTGGTCACTCACCCACTC 3' 322 56

TUBA3-4AF TU-

BA3-4AR

5' AGAAAGCTGTTCATGGTAGG 3'

5' TCCTGGAAGATGTATGAAAAG 3' 583 56

TUBA3-4BF TU-

BA3-4BR

5' CAGACCACAACTTTTCAATG 3'

5' CCCTGAATGTTGACCTGAC 3' 691 56

TUBA3-4AR TU-

BA3-4BF

5' TCCTGGAAGATGTATGAAAAG 3'

5' CAGACCACAACTTTTCAATG 3' 1152 58

Tabela 10: Primers utilizados para amplificação do gene TUBA8.

Primers

TUBA8 Sequencia do primer

Tamanho

(pb) Ta (°C)

TUBA8.1F

TUBA8.1R

5'- AGGACCCGGAGATTTGAG -3'

5'- ACTCCTCGACCCTGAACTG -3' 368 56.7

TUBA8.2F

TUBA8.2R

5'- CCAGACTCTCTGACCTCGTTG -3'

5'- TCTGCAGTTTCGAGATGTTCTC -3' 311 62

TUBA8.3F

TUBA8.3R

5'- TGGGCAGTAGGACCTAATGG -3'

5'- GATGCCAACACAGAGGAAGG -3' 379 61

TUBA8.4F

TUBA8.4R

5'- TTTCTTCTCATGTCCTGCTCTC -3'

5'- TATCCTTGGTCACCTCCCTC -3' 773 62

TUBA8.5F

TUBA8.5R

5'- TGTATCTTCTTCTGTGGCTCCTC -3'

5'- CTTGACACCAGCTGACATGATC -3' 944 62

Tabela 11: Primers utilizados para amplificação do gene TUBB2B.

Primers

TUBB2B Sequencia do primer Tamanho (pb) Ta (°C)

TUBB2B_1F

TUBB2B_1R

5'- ATGTGTCCACCTGGATACGCAC -3'

5'- CCATACTGTGACTGCGGAAAGG -3' 956 64

TUBB2B_2F

TUBB2B_2R

5'- AAGAGACCAGTTCCTGCCTCAG -3'

5'- CCCAAGCCCGAGTAACAAAC -3' 227 62.5


Primers

TUBB2B Sequencia do primer Tamanho (pb) Ta (°C)

TUBB2B_3F

TUBB2B_3R

5'- GCTCGGAGCATTACGTCAG -3'

5'- GGAAGGTCTGCATTTGGC -3' 417 50

TUBB2B_4F

TUBB2B_4R

5'- TTGGGTTGTCGGAACTGAGTC -3'

5'- AGGAAGCCCAATGAAATACTGC -3' 355 62.5

TUBB2B_5F

TUBB2B_5R

5'- TTGCCTGAGGGTCTAAGTCAC -3'

5'- CACCAGGCACTCACCAAAC -3' 161 59.4

TUBB2B_6.1F

TUBB2B_6.1R

5'- TGCTAAGAGCTTGGTGTCCTG -3'

5'- CTTGAACAGCTCCTGGATGG -3' 1055 60.9

TUBB2B_6.2F

TUBB2B_6.2R

5'- ATGTCGGCCACCTTCATC -3'

5'- TGAAGACACACACTGTGCTTTC -3' 757 60.4

3.3.2. Sequenciamento (Sanger)

Após a reação de PCR, os fragmentos amplificados foram submetidos ao sequencia-

mento por eletroforese capilar pelo método de Sanger (66), utilizando o aparelho ABI

3500XL Genetic Analyser (Applied Biosystems). A reação submetida ao sequenciamento

consistiu de 1µL de solução pré-mix (Big Dye), 1µL de primer (5 pmol/µL), 2µL de tampão

(5X buffer), 2µL do produto de amplificação para um volume final de 10 µL. Essa reação

foi submetida a 35 ciclos de 95°C por 10 segundos, 57°C por 5 segundos, 60°C por 4 minu-

tos. A purificação foi realizada com etanol e EDTA a 125 mM, como sugerido pelo fabri-

cante.

3.3.3. Clonagem em vetor

Quando foram identificados cromatogramas sugerindo deleções ou inserções em he-

terozigose (alteração do quadro de leitura do sequenciamento), os fragmentos amplifica-

dos por PCR foram clonados em um vetor para que o sequenciamento dos alelos fosse

realizado separadamente. Esta estratégia tornou possível a identificação precisa das alte-

rações nas sequencias de DNA com suspeita de conter pequenas inserções ou deleções.

A clonagem foi realizada obedecendo ao seguinte protocolo:

3.3.3.1. Ligação dos fragmentos de DNA

Para a ligação dos fragmentos em pGEM-T Easy preparou-se uma solução composta

de cerca de 100ng do vetor, o inserto a ser ligado (3x a quantidade do vetor), 5µL do tam-


pão 2X da ligase (Promega) e 1µL da T4 DNA ligase (Promega, 3U/µL). Esta solução foi

mantida a 16°C por 12-16 horas e em seguida foi estocada a -20°C.

3.3.3.2. Transformação bacteriana

Células competentes da linhagem Escherechia coli DH5α que estavam armazenadas a

-80°C foram transferidas para o gelo. Adicionou-se a essas cerca de 10µL da reação de

ligação. A reação permaneceu em gelo por 30 minutos, em seguida foi transferida para

temperatura de 42°C pelo período de um minuto e 30 segundos e novamente transferida

para o gelo por um minuto. Em seguida adicionou-se de 400 a 800µL de meio LB às células

e a cultura foi submetida à agitação de 200rpm a 37°C por uma hora. Cerca de 200µL da

cultura foram plaqueadas em placas de Petri com LB-ágar contendo o antibiótico apropri-

ado (ampicilina 50µg/ml). As placas foram incubadas a 37 °C pelo período de 12-18 horas.

3.3.3.3. Extração de DNA plasmidial (Mini-Prep)

Foi utilizada a mini-preparação caseira, que consiste na adição de 300µl de solução I

(Tris-HCl 50mM, pH 8.0; EDTA 10mM, pH 8.0 e 6µl de RNase 1mg/mL), seguido da adição

de 300µl de solução II (NaOH 200mM, SDS 1%), agitação por inversão suave do tubo cinco

vezes, incubação a temperatura ambiente por cinco minutos, seguida de adição de 300µl

de solução III (acetato de potássio 3M, pH 5.5), agitação por inversão, centrifugação a

temperatura de 14°C (16000G) durante 10 minutos e transferência de 700-800µl do so-

brenadante para novo tubo. A etapa de precipitação teve início com a adição de 400µl de

isopropanol seguida de inversão e centrifugação a 16000G por 10 minutos a 4°C, descarte

do sobrenadante, nova precipitação com 500µl de álcool etílico 70%, inversão do tubo e

centrifugação durante cinco minutos a 16000G e descarte do sobrenadante. A eluição foi

realizada com 30µl de água deionizada.


3.3.4. Análise das alterações encontradas:

3.3.4.1. Softwares para predições in sílico de mutações

Foram utilizados cinco softwares para avaliar o impacto das alterações encontradas

na estrutura da proteína: Polyphen®, Panther®, MutPred®, SIFT® e SNAP® (Tabela 12).

Os softwares MutPred®, Polyphen® e SNAP® avaliam a substituição da base nitroge-

nada baseando-se numa combinação de parâmetros funcionais e estruturais das proteí-

nas, enquanto o SIFT® e o Panther® consideram informações evolutivas para tal (67).

O Polyphen® mostra resultados qualitativos, identificando a substituição de aminoá-

cido como “benigna”, “possivelmente prejudicial” ou “provavelmente prejudicial”. As fer-

ramentas SIFT® e SNAP® geram resultados similares, identificando as mutações como “to-

leradas” ou “prejudiciais” no primeiro, e “neutra” ou “não neutra” no segundo software.

O Panther® (Protein Analysis Through Evolutionary Relationships) gera um valor de-

nominado de Pdeleterious, que fornece a probabilidade da substituição do aminoácido

causar efeito deletério na função da proteína. Consideramos valores maiores de 0,75 co-

mo prejudiciais. Similar ao Panther®, o MutPred® fornece um valor que pode ser interpre-

tado como a probabilidade da mutação ser deletéria (g), trazendo também informações

sobre o nível de significância estatística desta hipótese (p) (Tabela 13).

Tabela 12: Algoritmos utilizados para a análise in sílico das alterações detectadas.

Algoritmo Endereço

Polyphen® http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/

Panther® http://www.pantherdb.org/

MutPred® http://mutpred.mutdb.org/

SIFT® http://sift.jcvi.org/

SNAP® http://rostlab.org/services/snap/

http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/

http://www.pantherdb.org/

http://mutpred.mutdb.org/

http://sift.jcvi.org/


Tabela 13: Interpretação da confiança da hipótese do MutPred®.

g p Valor da hipótese Interpretação

g>0,5 p<0,05 hipótese contestável neutra

g>0,75 p<0,05 hipótese confiável provavelmente prejudicial

g>0,75 p<0,01 hipótese muito confiável prejudicial

Além desses algoritmos, também foi utilizada a escala Grantham (68) (Tabela 14), um

método que avalia a troca de aminoácidos considerando sua composição, polaridade e

volume molecular. Essa escala oferece uma série de valores que pode ser classificada co-

mo:

Tabela 14: Classificação de valores para escala Grantham.

Score Predição

0 – 50 Conservativo

51 – 100 Moderadamente conservativo

101 – 150 Moderadamente radical

>150 Radical

3.3.4.2. Software para análise in sílico tridimensional da proteína

O software Sting Millennium (http://www.cbi.cnptia.embrapa.br/SMS/STINGm/) foi

utilizado para analisar as proteínas mutantes de modo tridimensional, possibilitando in-

vestigar as interações dos aminoácidos trocados na cadeia da proteína.

3.3.4.3. Software para busca in sílico de regiões de microRNA

O software DNA Intelligent Analysis – microT v3.0 (diana.cslab.ece.ntua.gr) foi utiliza-

do para busca in sílico de regiões de ancoragem para microRNA. Essa busca foi realizada

para mutações novas presentes em regiões 3’ e 5’ UTR (untranslated region) , para possí-

veis identificações de alterações em regiões alvo de microRNA.


3.3.4.4. Software para busca in sílico de regiões de splicing alternativo

O software NNSplice (www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html) foi utilizado para verifi-

car se alterações sinônimas não descritas nos bancos de dados, ou com frequência baixa

na população, poderiam estar alterando regiões de splicing alternativo.

3.3.4.5. Triagem das alterações com potencial patogênico em grupo

controle

As alterações identificadas foram investigadas em indivíduos controles. Quando pos-

sível, a triagem das alterações foi realizada pela técnica de Restriction fragment length

polymorphism (RFLP) com a enzima de restrição apropriada. Para tal, cinco microlitros do

produto de PCR foram tratados com tampões e enzimas específicas nas concentrações

sugeridas pelo fabricante, sendo incubadas em banho-maria na temperatura adequada

para cada enzima. O produto da digestão foi analisado em gel de agarose e corado com

SYBR® Safe. Nos casos em que o ensaio de RFLP não foi possível, o grupo controle foi

submetido ao sequenciamento por eletroforese capilar em um ABI 3500XL Genetic Analy-

ser (Applied Biosystems). Foram testados no mínimo 200 indivíduos controles para cada

alteração.

3.4. Detecção de Inserções/Deleções em Genes Candidatos

3.4.1. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification - MLPA

A técnica de MLPA consiste em um PCR multiplex, no qual ocorre a amplificação de

sondas que se ligam a regiões específicas do DNA. Após separação por eletroforese capi-

lar, a intensidade do sinal emitido pelas sondas é aferida e tem relação direta com a pre-

sença ou ausência da região do genoma no qual tal sonda foi ligada, identificando possí-

veis deleções ou duplicações de regiões específicas.

Foi utilizado o Kit “SALSA MLPA probemix P061-B2 Lissencephaly” da MRC-Holland.

Este kit possui aproximadamente 50 sondas (Tabela 28, em anexo), sendo várias delas


específicas para genes candidatos envolvidos com o espectro LIS/HSB e outras malforma-

ções corticais, além de algumas sondas controle.

A técnica foi realizada da seguinte maneira:

3.4.1.1. Desnaturação do DNA

Cada amostra de DNA (100 ng) foi desnaturada em um termociclador a 98°C por cinco

minutos e depois resfriada a 25°C.

3.4.1.2. Reação de Hibridação

Para cada amostra de DNA foi adicionado 1.5µL de tampão (MLPA buffer) e 1.5µL do

mix de sondas (probemix). As reações foram incubadas em um termociclador por um mi-

nuto a 95°C seguido de um período de 16 a 20 horas a 60°C para permitir a hibridação das

sondas.

3.4.1.3. Reação de ligação das sondas

Na técnica de MLPA é utilizado um par de sondas para cada região candidata. Quando

a hibridação ocorre, o par de sondas precisa ser ligado a fim de formar um fragmento úni-

co. Para a reação de ligação foi preparado um mix contendo: 25μL de água, 3.0μL de tam-

pão A de ligação (Ligase buffer A), 3.0 μL de tampão B de ligação (Ligase buffer B) e 1.0μL

da enzima ligase. Enquanto as amostras permaneciam incubadas a 54°C, o mix foi adicio-

nado a cada uma delas. As reações permaneceram no termociclador por mais 15 minutos

a 54°C seguido por um ciclo de cinco minutos a 98°C para inativação da enzima.

3.4.1.4. Reação de PCR

As reações de PCR foram compostas de: 7.5μL de água, 2.0μL de primer (SALSA PCR

primer mix) e 0.5μL da enzima polimerase (SALSA Polymerase). As condições do PCR fo-

ram 35 ciclos de 95 °C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos, 72°C por 60 segundos e um

ciclo de extensão final a 72°C por 20 minutos.


3.4.1.5. Eletroforese capilar

Para a eletroforese capilar foram pipetados 1.0μL de amostra, 0.2μL do padrão de

tamanho (LIZ size standard) e 9.0μL de formamida. A eletroforese capilar foi realizada no

equipamento ABI 3500XL.

3.4.1.6. Análise dos resultados

Os resultados foram analisados com o software Gene Marker, versão 2.4. Foram utili-

zados cinco controles para cada grupo contendo de 10 a 15 pacientes. É importante citar

que como vários genes candidatos do kit de MLPA estão localizados no cromossomo X, os

ensaios tiveram que ser realizados separadamente para homens e mulheres. Quando ho-

mens com LIS-HSB eram testados, foram utilizados apenas controles do sexo masculino, o

mesmo raciocínio valendo para pacientes do sexo feminino.

3.5. Detecção de Novas CNVs

A identificação das variações do número de cópias foi realizada através da técnica de

SNP-Array (microarranjo) utilizando o kit da Affymetrix CytoScan HD Array .

3.5.1. Seleção dos pacientes

A técnica de SNP-Array requer DNA de alta qualidade, sendo assim o DNA de todos os

pacientes foi selecionado e purificado. Na primeira etapa, os DNAs foram analisados após

eletroforese em gel de agarose 1.5% e marcados por SYBR® Safe. As amostras de DNA

muito fragmentadas não foram submetidas à análise.

Os DNAs foram quantificados em um Epoch (Biotek). O grau de pureza dos DNAs foi

aferido pelas razões de absorbância A260/280, A260/230 e A320. Consideramos como

aceitáveis as amostras com valores de absorbância A260/280 entre 1.5 e 2.0, A260/230

com valores maiores que 1.1 e A320 com valores menores que 0.1.


3.5.2. Purificação das Amostras de DNA

Os DNAs selecionados foram purificados em colunas da Millipore para remoção de

impurezas e traços de fenol-clorofórmio. Para tal, o DNA foi transferido para uma coluna

acoplada a um tubo coletor, completando-se o volume para 500µL com água ultrapura. As

amostras foram centrifugadas por 12 minutos a 14000G. Após a centrifugação, um novo

tubo coletor foi colocado e a coluna foi invertida. As amostras foram novamente centrifu-

gadas por 2 minutos a 1000G. As amostras captadas no tubo coletor foram diluídas com

tampão low TE-EDTA 1x (Affymetrix®) para concentração final de 45ng/µL a 60ng/µL.

3.5.3. Digestão das amostras de DNA com a enzima NspI

Cada amostra de DNA, a 50ng/µL, foi submetida a uma reação de digestão composta

por 1µL de enzima NspI, 2µL de tampão da enzima, 0,2µL de tampão BSA e 11,55µL de

água. As reações foram transferidas para um termociclador (Mastercicler Gradiente Ep-

pendorf®) onde permaneceram incubadas a 37°C por 120 minutos, seguida por nova incu-

bação a 65°C por 20 minutos.

3.5.4. Reação de ligação com adaptadores

Para a reação de ligação, foram adicionadas às amostras de DNA digeridas com NspI,

0,75µL de solução com adaptadores (50µM); 2,5µL de tampão T4 DNA Ligase 10x e 2µL de

enzima T4 DNA Ligase. Em seguida, as reações foram transferidas para um termociclador

(Mastercicler Gradiente Eppendorf®) para ciclagem a 16°C por 180 minutos e 70°C por 20

minutos.

3.5.5. Amplificação dos fragmentos por PCR

As amostras de DNA que foram digeridas e ligadas a adaptadores foram diluídas com

75µL de água. Para cada amostra, quatro alíquotas de 10µL foram transferidas para uma

nova placa. Estas alíquotas foram submetidas a uma reação de PCR seguindo o protocolo:

39,5µL de água, 10 µL de tampão TITANIUM Taq PCR 10x, 20µL de reagente GC-Melt, 14µL

de dNTP (2,5mM), 4,5µL de primer e 2µL de enzima TITANIUM Taq DNA Polimerase 50x. A

reação foi transferida para um termociclador (Mastercicler Gradiente Eppendorf®) sendo

submetida ao seguinte programa: 94°C por 3 minutos; trinta ciclos de 94°C por 30 segun-


dos, 60°C por 45 segundos e 68°C por 15 segundos e uma extensão final a 68°C por 7 mi-

nutos.

A reação foi avaliada por eletroforese em gel de agarose 2% para verificação do pa-

drão de amplificação dos fragmentos. Foram considerados aceitáveis os DNAs que apre-

sentaram a maioria dos fragmentos entre 150pb e 2000pb.

3.5.6. Purificação

Para a purificação das amostras, as quatro alíquotas foram transferidas para um único

tubo de 2,0 mL. Foram adicionados 720µL de beads magnéticas e a reação foi mantida a

temperatura ambiente por 10 minutos. Os tubos foram centrifugados por três minutos a

16100G e em seguida encaixados em um suporte magnético (MagnaRackTM). O sobrena-

dante foi descartado e, em seguida adicionou-se 1.0 mL do tampão de lavagem em cada

amostra. Os tubos foram vortexados por dois minutos e depois centrifugados por três mi-

nutos a 16100G. Os tubos foram novamente encaixados no suporte magnético e o sobre-

nadante foi totalmente descartado. Após a completa secagem das beads, 52µL do tampão

de eluição foram adicionados e os tubos foram vortexados por 10 minutos. Os tubos fo-

ram centrifugados por três minutos a 16100G e encaixados no suporte magnético. Após

10 minutos, 47µL do sobrenadante foram transferidos para uma nova placa.

3.5.7. Quantificação

As amostras purificadas foram avaliadas quanto à concentração ideal (acima de 3000

ng/µL) e sua pureza foi observada pelas relações de absorbância (A260/280 entre 1,8 e 2,0

e A320 < 0,1). As quantificações foram realizadas no aparelho Epoch (BioTek®).

3.5.8. Fragmentação

Os produtos da purificação foram fragmentados utilizando-se para cada amostra:

123.8µL de água, 158.4 µL de tampão de fragmentação e 5.8µL de enzima de fragmenta-

ção (2.5U/µL). Tais volumes podem variar de acordo com a concentração da enzima utili-

zada e o número do lote do produto. A reação foi transferida para um termociclador

(Mastercicler Gradiente Eppendorf®) e incubada a 37°C por 35 minutos e 95°C por 15 mi-

nutos, respectivamente. Em seguida, o padrão de fragmentação foi avaliado por eletrofo-


rese em gel de agarose 3%. Foram considerados aceitáveis os DNAs que apresentaram a

maioria dos fragmentos entre 25pb e 125pb.

3.5.9. Marcação do DNA

O próximo passo foi adicionar aos 51µL da reação de fragmentação para cada amos-

tra, 14µL de tampão TdT 5x, 2µL de DNA Labeling Reagent 30mM e 3.5µL de enzima TdT.

A reação foi incubada a 37°C por quatro horas e a 95°C por 15 minutos em um termocicla-

dor (Mastercicler Gradiente Eppendorf®).

3.5.10. Hibridação

Ao DNA marcado foram adicionados: 165µL de Hyb Buffer Part I, 15µL de Hyb Buffer

Part II, 7µL de Hyb Buffer Part III, 1µL de Hyb Buffer Part IV e 2µL de Oligo Control Reagent

0100. Em seguida, os fragmentos de DNA foram desnaturados em um termociclador (Mas-

tercicler Gradiente Eppendorf®) a 95°C por 10 minutos e posteriormente mantidos a 49°C.

Foram aplicados 200 µL de cada amostra em cada chip. Os chips foram incubados em um

forno de hibridação por 16 horas a temperatura de 50°C e rotação de 60rpm (Genechip®

Hibridization Oven 645, Affymetrix®).

3.5.11. Lavagem

Após a hibridação, os chips passaram pela estação de lavagem (GeneChip Fluidics Sta-

tion 450, Affymetrix®) que realiza automaticamente um processo de injeção de soluções

para a lavagem dos chips. Esta etapa foi realizada no Laboratório Nacional de Luz Sincro-

tron (LNLS).

3.5.12. Escaneamento

Os chips foram escaneados pelo GeneChip® Scanner 3000 7G (Affymetrix®) do LNLS.

3.5.13. Análise

A análise dos resultados foi realizada pelo software Chromosome Analysis Suite (Af-

fymetrix®).

Para a análise dos CNVs com possível potencial patogênico foram consultados bancos

de dados disponíveis na internet: DGV, ISCA, DECIPHER, GO e OMIM (Tabela 15).


O DGV (Database of Genomic Variants) contém variações estruturais identificadas

em indivíduos sadios. São variações do genoma consideradas como normais e de-

positadas por diversos trabalhos (69) (70).

O ISCA (The International Standards for Cytogenomic Arrays Consortium) e o DECI-

PHER (Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans using En-

sembl Resources) são bancos de dados públicos que possuem informações de cito-

genética molecular e reúne dados de CNVs com importância clínica já relatada.

O GO (Gene Ontology) é um software disponível na internet que descreve as fun-

ções dos genes e suas associações com processos biológicos celulares.

O OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) compreende informações de ge-

nes relacionados a doenças humanas, relacionando fenótipo e genótipo.

Tabela 15: Algoritmos utilizados para a análise das CNVs identificadas.

Algoritmo Endereço

DGV projects.tcag.ca/variation/

ISCA www.iscaconsortium.org

DECIPHER decipher.sanger.ac.uk

GO www.geneontology.org

OMIM www.ncbi.nlm.nih.gov/omim

Resultados 83

4. RESULTADOS

4.1. Sequenciamento dos genes candidatos

Foi identificado um grande número de alterações nos genes candidatos. A grande

maioria se trata de alterações neutras, porém foram encontradas algumas variantes com

alto potencial patogênico. Portanto, os resultados dos sequenciamentos serão divididos

em duas partes de acordo com a alteração encontrada: I) variantes com potencial patogê-

nico e II) variantes neutras.

4.1.1. Parte I- Variantes com Potencial Patogênico

4.1.1.1. Gene FLNA: Variante c.4543C>T

Um paciente do sexo feminino com HNP bilateral e hipoplasia do vermis (P3) (Figura

6a) possui uma alteração no exon 27 do gene FLNA. Esta paciente, atualmente com 55

anos, apresentou os primeiros episódios de crise aos 20 anos de idade e apresenta crises

parciais simples e complexas que evoluem para crises tônico-clônicas generalizadas. A

frequência de episódios varia entre semanal e mensal.

A mutação encontrada substitui uma citosina por uma timina (Figura 6b), o que leva a

troca de uma arginina por um códon de parada, gerando uma proteína truncada

(p.Arg1515X, NCBI Reference Sequence: NP_001447.2). Esta mutação já foi descrita como

patogênica por Parrini et al. (14) (CM067669).

Resultados 84

Figura 6: A- Paciente P3 com HNP bilateral (setas). B- Cromatograma do sequenciamento mos-trando a alteração c.4543C>T (círculo vermelho) no exon 27 do gene FLNA.

4.1.1.2. Gene FLNA: Variante c.1286C>T

Um paciente do sexo feminino com HNP (524/09) apresentou a troca de uma citosina

por uma timina (c.1286C>T) em heterozigose no exon 9 do gene FLNA (Figura 7b). A paci-

ente tem onze anos e apresentou os primeiros episódios de crise com aproximadamente

um ano de idade. A paciente apresenta crises parciais simples e complexas que evoluem

para crises tônico-clônicas generalizadas não controladas por drogas antiepiléticas (DAEs).

Episódios de estado de mal epilético já ocorreram cinco vezes e a paciente possui distúr-

bio de aprendizagem.

A alteração identificada leva a substituição de uma treonina por uma metionina na

proteína (p.Thr429Met, NCBI Reference Sequence: NP_001447.2). Tal alteração foi descrita

como uma variante patogênica (CM065185) por Masruha et al. (71).

A B

Resultados 85

Figura 7: A- Paciente 524/09 com HNP (seta). B- Cromatograma do sequenciamento mostrando a alteração c.1286C>T (círculo vermelho) no exon 9 do gene FLNA.

As predições in sílico do potencial patogênico desta variação encontram-se na Tabela

16.

Tabela 16: Resultados das predições in sílico da mutação p.Thr429Met encontrada no exon 9 do gene FLNA.

PolyPhen MutPred SIFT Panther SNAP Grantham

p.Thr429Met possivelmente

prejudicial neutra tolerada prejudicial

Não neutra

moderado

O fragmento amplificado possui três sítios de restrição para a enzima Bsp1286I. A mu-

tação c.1286C>T abole o primeiro sítio de restrição. Desse modo, enquanto a digestão

enzimática de um indivíduo normal gera quatro fragmentos (79pb, 90pb, 16pb e 68pb) a

digestão do fragmento com a variante gera apenas três fragmentos (169pb, 16pb e 68pb).

A triagem com enzima de restrição Bsp1286I em aproximadamente 200 controles

identificou a mesma variante (c.1286C>T) em dois indivíduos normais. Os indivíduos con-

troles tiveram a alteração confirmada por sequenciamento.

Não foi possível realizar a análise in sílico da mutação p.Thr429Met na estrutura tri-

dimensional da proteína FLNA com o programa Sting Millennium, pois ela ainda não foi

Resultados 86

completamente cristalizada e a porção relacionada à mutação não está disponível para

análises computacionais.

4.1.1.3. Gene DCX: Variante c.993A>T

Um paciente do sexo masculino (643/08) com paquigiria bifrontal e heterotopia em

banda nas regiões posteriores apresentou a troca de uma adenina por uma timina no

exon 2 do gene DCX (c.993A>T) (Figura 8a). Este paciente, atualmente com 25 anos, apre-

senta crises tônicas e tônico-clônicas generalizadas desde um ano e oito meses de idade,

grave déficit cognitivo e histórico familiar positivo para epilepsia e déficit intelectual.

A alteração identificada (c.993A>T) leva a troca de uma lisina por uma metionina na

posição 274 da proteína (p.Lys274Met, NCBI Reference Sequence: NP_000546.2). A mãe

do paciente é heterozigota para a variante (Figura 8b), enquanto o paciente é hemizigoto

por ser do sexo masculino. Tal alteração não está descrita nos bancos de dados consulta-

dos (dbSNP-NCBI e Ensembl). Foram também sequenciados 200 indivíduos controles e em

nenhum deles foi identificada a variante c.993A>T (Figura 8c).

Figura 8: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a substituição de uma adeni-na por uma timina (círculo vermelho) no exon 2 do gene DCX, A- em hemizigose no paciente, B-

em heterozigose na mãe do paciente, C- individuo controle sem a substituição.

As predições in sílico dessa variante mostraram potencial patogênico para alguns dos

algoritmos, como pode ser visualizado na Tabela 17.

Tabela 17: Predições in sílico da variante c.993A>T encontrada no exon 2 do gene DCX.

PolyPhen MutPred Panther SIFT SNAP Grantham

p.Lys274Met Provavelmente

prejudicial neutra neutra prejudicial neutra moderado

BA C

Resultados 87

A análise in sílico da estrutura tridimensional da proteína DCX com o software Sting

Millennium mostrou que o aminoácido substituído (metionina) perde as duas interações

hidrofóbicas que o aminoácido selvagem (lisina) faria (Figura 9).

Figura 9: A- interações da lisina (posição 274) na proteína DCX. B- Ausência de interações da meti-onina (posição 274) na proteína DCX.

4.1.1.4. Gene DCX: Variante c.1047T>C

Um paciente do sexo feminino com heterotopia subcortical em banda (491/09) apre-

sentou a troca de uma timina por uma citosina no exon 2 do gene DCX (c.1047T>C) (Figura

10). Esta paciente, atualmente com 41 anos, apresenta crises tônico-clônicas generaliza-

das com início aos sete anos de idade.

A alteração encontrada não está descrita nos bancos de dados analisados (NCBI-

dbSNP e Ensembl). Essa mutação leva a troca de uma leucina por uma prolina na posição

292 da proteína (p.Leu292Pro, NCBI Reference Sequence: NP_000546.2). A mãe da pacien-

te não possui a mutação.

A B

Resultados 88

Figura 10: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a substituição de uma timi-na por uma citosina (círculo vermelho) no exon 2 do gene DCX.

Os resultados das predições in sílico da patogenicidade desta variante estão descritos

na Tabela 18. A maioria dos algoritmos aponta para uma substituição com potencial pato-

gênico.

Tabela 18: Resultados das predições in sílico da variante c.1047T>C encontrada no exon 2 do gene DCX.

O fragmento amplificado do gene DCX (primers DCX 2BF/2BR, Tabela 6) possui dois sí-

tios de restrição para a enzima MnlI. A alteração c.1047T>C abole um dos sítios de restri-

ção, gerando dois fragmentos no alelo com a alteração (37pb e 222pb) ao invés dos três

fragmentos do alelo selvagem (37pb, 59pb e 163pb). Foram testados 200 indivíduos con-

troles e a variação c.1047T>C não foi identificada em nenhum deles (Figura 11).


p.Leu292Pro Provavelmente

prejudicial Provavelmente

prejudicial prejudicial prejudicial

Não neutra

moderado

Resultados 89

Figura 11: Digestão enzimática de controles com a enzima MnlI para o exon 2 do gene DCX (M= marcador 1kb plus; 1=paciente heterozigoto para a mutação c.1047T>C; 2, 3, 4 e 5= indivíduos

sem a mutação).

A análise in sílico da estrutura da proteína DCX com o software Sting Millennium mos-

trou que na alteração p.Leu292Pro, o aminoácido mutante (prolina) realiza mais intera-

ções do que o selvagem (leucina) (Figura 12). A prolina aumenta o número de interações

hidrofóbicas, passando a interagir com os aminoácidos tirosina (Y), arginina (R), asparagi-

na (N), e valina (V), além de modificar o tipo de interação, passando a realizar um maior

número de pontes de hidrogênio em comparação com o aminoácido selvagem.

Figura 12: A- interações da leucina (posição 292) na proteína DCX. B- interações da prolina (posi-ção 292) na proteína DCX.

4.1.1.5. Gene TUBA8: Variante c.1513A>T

Um paciente com esquizencefalia (671/08) apresentou a troca de uma adenina por

uma timina no exon 5 do gene TUBA8 (Figura 13). Trata-se de um paciente do sexo mascu-

222pb 163pb

M 1 2 3 4 5

A B

Resultados 90

lino de 13 anos de idade que apresenta crises tônicas não controladas que se iniciaram

aos sete meses de idade. O paciente possui tetraparesia.

A mutação encontrada leva a troca de um ácido glutâmico por uma valina na posição

445 da proteína. (p.Glu445Val, NCBI Reference Sequence: NP_061816.1). Esta alteração

está descrita como SNP rs138073466 e tem baixa frequência (0,04%) na população do

banco de dados consultado (dbSNP-NCBI e Ensembl). O sequenciamento automático da

região revelou a mesma alteração na mãe do paciente. O pai não foi sequenciado, pois a

amostra de DNA não estava disponível.

Figura 13: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando troca uma adenina por uma timina no exon 5 do gene TUBA8 (círculo vermelho).

Alguns dos softwares em que foram realizadas as predições in sílico da variante em

questão, indicaram um possível potencial patogênico para a mesma. Os resultados podem

ser visualizados na Tabela 19.

Tabela 19: Predições in sílico da variante c.1513A>T encontrada no exon 5 do gene TUBA8.

Foi realizado o sequenciamento automático de 200 indivíduos controles e a mesma

variação foi identificada em dois indivíduos.


p.Glu445Val benigna neutra prejudicial prejudicial - moderadamente

radical

Resultados 91

Não foi possível realizar a análise in sílico da mutação p.Glu445Va com o programa

Sting Millennium, já que a proteína TUBA8 não foi ainda completamente cristalizada e a

parte relacionada à mutação não está disponível para análises computacionais com este

programa.

4.1.1.6. Gene TUBA8: Variante c.562C>T

Um paciente com esquizencefalia bilateral de lábios fechados (669/08) possui uma al-

teração no exon 4 do gene TUBA8. Trata-se de um paciente do sexo masculino, atualmen-

te com 27 anos, com déficit intelectual leve e que apresenta crises parciais simples que

tiveram início aos seis anos e oito meses de idade.

A alteração identificada troca uma citosina por uma timina (Figura 14), levando a tro-

ca de uma alanina por uma valina na proteína (p.Ala128Val, NCBI Reference Sequence:

NP_ 061816.1). Esta variação é descrita como o SNP rs2234331 (NCBI-dbSNP) e está pre-

sente em 0,3% da população dos bancos de dados consultados (dbSNP-NCBI e Ensembl). O

sequenciamento automático da região revelou a mesma alteração na mãe do paciente. O

pai não foi sequenciado, pois a amostra de DNA não estava disponível.

Figura 14: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando troca uma citosina por uma timina no exon 4 do gene TUBA8 (círculo vermelho).

As predições do potencial patogênico desta variação encontram-se na Tabela 20. Al-

guns dos programas indicaram a mesma como deletéria, enquanto outros não confirma-

ram esta hipótese.

Resultados 92

Tabela 20: Predições in sílico da variante c.562C>T encontrada no exon 4 do gene TUBA8.

A análise in sílico da estrutura da proteína TUBA8 com o software Sting Millennium

mostrou que na alteração p.Ala128Val, o aminoácido mutante (valina) passa a realizar

interações hidrofóbicas, interagindo com o aminoácido arginina (Figura 15).

Figura 15: A- interações da alanina (posição 128) na proteína TUBA8. B- interações da valina (posi-ção 128) na proteína TUBA8.

Foram sequenciados 200 controles para o exon 4 do gene TUBA8 e a variante

c.562C>T foi identificada em cinco indivíduos.

4.1.1.7. Gene TUBA8: Variante c.323C>T

Um paciente com lissencefalia incompleta (2364/04) possui o SNP rs115847686 locali-

zado no exon 3 do gene TUBA8. Trata-se de um paciente do sexo feminino, atualmente

com 11 anos, com atraso do desenvolvimento neuropsicomotor e crises epilépticas pouco

frequentes.

A alteração identificada troca uma citosina por uma timina (Figura 16b), que leva a

troca de uma arginina por uma cisteína (p.Arg84Cys, NCBI Reference Sequence: NP_

061816.1) na proteína. Tal SNP ocorre em aproximadamente 0,7% da população nas bases

de dados consultadas (dbSNP-NCBI e Ensembl). O sequenciamento automático da região


p.Ala128Val benigna neutra neutra prejudicial Não

neutra moderado

A B

Resultados 93

revelou a mesma alteração na mãe do paciente, já o pai apresentou o alelo considerado

como selvagem.

Figura 16: A- Paciente 2364/04 com lissencefalia incompleta. B- Cromatograma do sequenciamen-to mostrando a troca de uma citosina por uma timina no gene TUBA8 (SNP rs115847686).

As predições da patogenicidade desta variante estão descritas na Tabela 21. Alguns

dos programas utilizados apontam a alteração como potencialmente deletéria.

Tabela 21: Predições in sílico da variante c.323C>T encontrada no exon 3 do gene TUBA8.

A análise in sílico da estrutura da proteína TUBA8 com o software Sting Millennium

mostrou que na alteração p.Arg84Cys, o aminoácido mutante (cisteína) perde alguns tipos

de interações, deixando de realizar algumas interações de carga e perdendo uma ponte de

hidrogênio. Além disso, ocorre alteração nas interações entre os aminoácidos, já que o

aminoácido trocado (cisteína) deixa de interagir com a alanina (A) e com a valina (V) e

passa a interagir com a leucina (L) e com a fenilalanina (F) (Figura 17).


p.Arg84Cys Provavelmente

prejudicial neutra prejudicial prejudicial neutra radical

A B

Resultados 94

Figura 17: A- interações da arginina (posição 84) na proteína TUBA8. B- interações da cisteína (po-sição 84) na proteína TUBA8.

Foram sequenciados 200 controles para o exon 3 do gene TUBA8 e a variante

c.323C>T foi identificada em três indivíduos.

4.1.2. Parte II- Variantes neutras

4.1.2.1. Gene FLNA

Sete alterações neutras foram encontradas no gene FLNA (NCBI Reference Sequence:

NM_001456.3) sendo quatro alterações intrônicas e três alterações sinônimas:

c.374-19G>A (Figura 35, pag165 em anexo): Alteração encontrada no intron 2 do

gene FLNA, em um paciente com HNP (283/01). Tal alteração troca uma guanina

por uma adenina, descrita como SNP rs2070817 e encontrada em 2% da população

das bases de dados consultadas (dbSNP-NCBI e Ensembl). Neste trabalho a fre-

quência deste polimorfismo foi 3,7%.

c.869-41C>T e c.869-28C>G (Figura 36, pag165 em anexo): Alterações encontradas

no intron 5 do gene FLNA em nove pacientes com HNP (373/01, 283/01, 607/03,

975/02, P1, P3, 258/08, 77/09, 579/09). A primeira (c.869-41C>T) troca uma citosi-

na por uma timina, é descrita como SNP rs4898479 e está presente em 18% da po-

pulação das bases de dados consultadas (dbSNP-NCBI e Ensembl). Neste trabalho,

A B

Resultados 95

a frequência deste polimorfismo foi 33%. A segunda (c.869-28C>G) troca uma cito-

sina por uma guanina, está descrita como o SNP rs4898478 e presente em 19% da

população das bases de dados consultadas (dbSNP-NCBI e Ensembl). O paciente

160/03 apresentou somente a alteração c.869-28C>G (rs4898478). Assim, neste

trabalho a frequência desta alteração foi de 37%.

c.7732+11C>T (Figura 37, pag166 em anexo): Alteração encontrada no intron 47 do

gene FLNA em três pacientes (1032/01, P4, e 258/08) com HNP. Tal alteração troca

uma citosina por uma timina, está descrita como SNP rs7063300 e presente em

21% da população das bases de dados consultadas (dbSNP-NCBI e Ensembl). Neste

trabalho a frequência deste polimorfismo foi de 11%.

c.1998C>T (Figura 38, pag166 em anexo): Alteração encontrada no exon 13 da

FLNA em um paciente com HNP (283/01). Tal alteração troca uma citosina por uma

timina e está descrita como uma variante sinônima (SNP rs34510365) que mantem

o aminoácido alanina na proteína (p.Ala666Ala). Esta alteração está presente em

0,1% da população das bases de dados consultadas (dbSNP-NCBI e Ensembl) e

apresentou neste trabalho uma frequência de 3,7%.

c.4920G>A (Figura 39, pag166 em anexo): Alteração encontrada no exon 29 do ge-

ne FLNA em dois pacientes (160/03, 258/08) com HNP. Tal alteração é descrita

como o polimorfismo SNP rs61741041, que troca uma guanina por uma adenina.

Trata-se de uma alteração sinônima, que mantem o aminoácido glicina na posição

1640 da proteína (p.Gly1640Gly) e, assim como neste trabalho, está presente em

7% da população das bases de dados consultadas (dbSNP-NCBI e Ensembl).

c.6075T>C (Figura 40, pag167 em anexo): Alteração encontrada no final do exon 36

do gene FLNA em três pacientes (283/01, 874/02, 975/02) com HNP. Esta alteração

troca uma timina por uma citosina e mantém a alanina na posição 1942 da proteí-

na (p.Ala1942Ala). Ela está descrita como o polimorfismo SNP rs2070825 e está

presente em 21% da população das bases de dados consultadas (dbSNP-NCBI e En-

sembl). Neste trabalho a frequência encontrada foi de 11%.

Resultados 96

4.1.2.2. Gene LIS1

No gene LIS1 foram encontradas duas alterações em regiões não codificantes do gene

(NCBI Reference Sequence: NM_000430.3):

c.568+27C>T (Figura 41, pag167 em anexo): Alteração encontrada no intron 6 do

gene LIS1 em dezenove pacientes com o espectro LIS/HSB (60/01, 66/01, 473/01,

457/01, 20/02, 420/01, 1467/06, 2364/04, 159/08, 255/08, 527/08, 563/08,

643/08, 112/09, 185/09, 271/09, 350/09, 491/09, 500/09). Tal polimorfismo é bem

frequente (91%) na população das bases de dados consultadas (dbSNP-NCBI e En-

sembl) e é descrito como SNP rs3213696. Neste trabalho a frequência desta alte-

ração foi de 57%.

c.1805C>T (Figura 42, pag168 em anexo): Alteração encontrada na região não codi-

ficante do exon 11 do gene LIS1 em dezesseis pacientes (60/01, 1184/01, 1004/01,

599/01, 457/01, 20/02, 652/03, 1324/06, 61/07, 527/08, 563/08, 112/09, 185/09,

350/09, 491/09, 500/09) com o espectro LIS/HSB. Tal alteração leva a troca de uma

citosina por uma timina e está descrita como um SNP não patogênico (SNP rs6628)

presente em 15% da população das bases de dados consultadas (dbSNP-NCBI e En-

sembl). Neste trabalho a frequência desta alteração foi de 48%.

4.1.2.3. Gene DCX

No gene DCX foi encontrada somente uma alteração neutra (NCBI Reference Sequen-

ce: NM_000555.3):

c.948+29G>A (Figura 43, pag168 em anexo): Alteração encontrada no intron 2 do

gene DCX em um paciente (420/01) com lissencefalia incompleta. A alteração troca

uma guanina por uma adenina, está descrita nos bancos de dados como SNP

rs61036541 e presente em 1% da população das bases de dados consultadas

(dbSNP-NCBI e Ensembl). Neste trabalho a frequência desta alteração foi de 3%.

Resultados 97

4.1.2.4. Gene TUBA1A

No gene TUBA1A foram encontradas quatro alterações neutras (NCBI Reference Se-

quence: NM_006009.3):

c.453G>C (Figura 44, pag168 em anexo): Alteração encontrada no exon 4 do gene

TUBA1A em 18 pacientes com espectro LIS/HSB (60/01, 1158/01, 1184/01, 868/01,

523/01, 599/01, 457/01, 20/02, 415/03, 1450/03, 420/01, 159/08, 643/08, 185/09,

271/09, 350/09, 461/09, 491/09) e em 33 pacientes com esquizencefalia (127/04,

128/04, 122/04, 124/04, 371/04, 372/04, 428/04, 573/04, 17/02, 50/02, 52/02,

71/02, 116/02, 151/02, 131/02, 133/02, 316/02, 521/10, 408/02, 239/08, 458/02,

896/01, 1002/01, 1123/01, 541/08, 635/08, 639/08, 1181/01, 190/09, 353/09,

459/09, 516/09, 536/09). Esta alteração troca uma guanina por uma citosina e está

descrita como SNP rs697624, presente em 49% das bases de dados consultadas


c.288A>G (Figura 45, pag169 em anexo): Alteração encontrada no exon 3 do gene

TUBA1A em 18 pacientes com o espectro LIS/HSB (60/01, 1158/01, 1184/01,

868/01, 523/01, 1004/01, 599/01, 457/01, 20/02, 415/03, 1450/03, 420/01,

159/08, 563/08, 643/08, 185/09, 350/09, 461/09) e em 32 pacientes com esqui-

zencefalia (127/04, 122/04, 125/04, 371/04, 428/04, 573/04, 50/02, 52/02, 71/02,

116/02, 151/02, 131/02, 133/02, 316/02, 408/02, 239/08, 458/02, 896/01,

1002/01, 1123/01, 541/08, 635/08, 639/08, 641/08, 1181/01, 51/08, 671/08,

190/09, 353/09, 459/09, 516/09, 536/09). Esta alteração leva a substituição de

uma adenina por uma guanina e mantem o aminoácido lisina na proteína

(p.Lys96Lys). Ela está descrita como SNP rs1056875 e está presente em 49% da

população das bases de dados consultadas (dbSNP-NCBI e Ensembl). Neste traba-

lho a frequência desta alteração foi de 62%.

c.510T>C (Figura 46, pag169 em anexo): Alteração encontrada no exon 4 do gene

TUBA1A em um paciente com o espectro LIS/HSB (461/09) e em dois paciente com

esquizencefalia (125/04, 131/02). Esta alteração troca uma timina por uma citosi-

na, mantendo o aminoácido serina na proteína (p.Ser170Ser) é descrita como SNP

Resultados 98

rs112023543 e está presente em 2% da população das bases de dados consultadas

(dbSNP-NCBI e Ensembl). Neste trabalho, esta alteração apresentou frequência de

3,7%.

c.522G>A (Figura 46, pag169 em anexo): Alteração encontrada no exon 4 do gene

TUBA1A em um paciente com o espectro LIS/HSB (461/09) e em dois paciente com

esquizencefalia (125/04, 131/02). Esta alteração troca uma guanina por uma ade-

nina, mantendo o aminoácido alanina na proteína (p.Ala174Ala) é descrita como

SNP rs61730859 e está presente em 2% da população das bases de dados consul-

tadas (dbSNP-NCBI e Ensembl). Neste trabalho, esta alteração apresentou fre-

quência de 3,7%.

4.1.2.5. Gene TUBB2B

No gene TUBB2B foram encontradas 13 variantes (NCBI Reference Sequence:

NM_178012.4):

c.73C>T (Figura 47, pag169 em anexo): Alteração encontrada no exon 1 do gene

TUBB2B em todos os pacientes com esquizencefalia e em todos os pacientes com o

espectro LIS/HSB. Esta alteração troca uma citosina por uma timina na região não

transcrita do exon 1 e está descrita como SNP rs9503475, presente em 99% da po-

pulação das bases de dados consultadas (dbSNP-NCBI e Ensembl). Neste trabalho a

frequência deste polimorfismo foi de 100%.

c.93T>C (Figura 48, pag170 em anexo): Alteração encontrada na região não trans-

crita do exon 1 em dois pacientes com esquizencefalia (116/02 e 133/02) e em dois

pacientes com o espectro LIS/HSB (415/03, 491/09). Tal alteração troca uma timina

por uma citosina, está descrita como SNP rs9503474 e está presente em 3% da po-

pulação das bases de dados consultadas (dbSNP-NCBI e Ensembl). Neste trabalho a

frequência desta alteração foi de 5%.

c.141T>C (Figura 49, pag170 em anexo): Alteração encontrada na região não trans-

crita do exon 1 em dois pacientes com esquizencefalia (116/02 e 133/02) e em dois

Resultados 99

pacientes com lissencefalia (415/03, 491/09). Esta alteração troca uma timina por

uma citosina, está descrita como SNP rs9503473 e está presente em 3% da popula-

ção das bases de dados consultadas (dbSNP-NCBI e Ensembl). Neste trabalho a


c.20T>C (Figura 50, pag170 em anexo): Alteração encontrada em uma região que

precede o início do gene TUBB2B em um paciente com esquizencefalia (190/09) e

em um paciente com o espectro LIS/HSB (461/09). Tal alteração troca uma timina

por uma citosina e está descrita como uma variante do gene PSMG4 (NCBI Refe-

rence Sequence: NM_001128592.1 - SNP rs7748598) que está presente em 1% da



g.1338C>G (NCBI Reference Sequence: NG_016715.1) (Figura 51, pag171 em ane-

xo): Alteração encontrada no intron 1 em quatro pacientes com esquizencefalia

(116/02, 127/04, 190/09 e 521/10) e em um paciente com o espectro LIS/HSB

(461/09). A alteração troca uma citosina por uma guanina, está descrita como SNP

rs9503472 e está presente em 2% da população das bases de dados consultadas


g.1373G>C (NCBI Reference Sequence: NG_016715.1) (Figura 52, pag171 em ane-

xo): Alteração encontrada no intron 1 em um paciente com o espectro LIS/HSB

(491/09). A variante é descrita como SNP rs182605730 e está presente em 0,2% da



g.3784_3785delTG (Figura 53, pag171 em anexo): Deleção encontrada no intron 1

em sete pacientes com esquizencefalia (116/02, 133/02, 124/04, 126/04, 128/04,

239/08, 635/08) e em 5 pacientes com o espectro LIS/HSB (457/01, 415/03,

420/01, 255/08, 491/09). A deleção de um TG é descrita como SNP rs10553445 e

está presente em 14% da população das bases de dados consultadas (NCBI-

dbSNP). Neste trabalho a frequência desta alteração foi de 15%.

Resultados 100

c.58-70G>A (Figura 54, pag172 em anexo): Alteração de uma guanina por uma

adenina encontrada no intron 3 em um paciente (131/02) com esquizencefalia e

em três pacientes com o espectro LIS/HSB (652/03, 1324/06, 60/07). A alteração é

descrita como SNP rs41300841 e está presente em 2% da população das bases de

dados consultadas (dbSNP-NCBI e Ensembl). Neste trabalho a frequência desta al-

teração foi de 5%.

c.166+22C>T (Figura 55, pag172 em anexo): Alteração encontrada no intron 4 em

um paciente com o espectro LIS/HSB (903/01). A troca de uma citosina por uma

timina, está descrita como rs202182484 e está presente em menos de 0,1% da po-

pulação nos bancos de dados analisados (dbSNP-NCBI e Ensembl). Neste trabalho a


c.564G>T (Figura 56, pag172 em anexo): Alteração encontrada no exon 6 em um

paciente com o espectro LIS/HSB (415/03). Trata-se de uma alteração sinônima

que mantém o aminoácido serina na proteína (p.Ser188Ser). Essa alteração é des-

crita como SNP rs148302841 e está presente em 7% da população das bases de

dados consultadas (dbSNP-NCBI e Ensembl). Neste trabalho a frequência desta al-

teração foi de 1%.

g.8144delT (Figura 57, pag173 em anexo): Deleção de uma timina encontrada na

região não transcrita do exon 6 em todos os pacientes com esquizencefalia e em

todos os pacientes com LIS/HSB. Esta alteração está descrita como SNP

rs67130760. A frequência desta alteração é próxima a 100% nos bancos de dados

(dbSNP-NCBI e Ensembl) e neste trabalho foi de 100%.

g.8341_8342insCG (Figura 58, pag173 em anexo): Inserção de um CG encontrada

na região não transcrita do exon 6 em quatro pacientes com esquizencefalia

(124/04, 126/04, 239/08 e 635/08) e em um paciente com o espectro LIS/HSB

(255/08). Esta inserção é descrita como SNP rs141781106 e está presente em 2%

da população das bases de dados consultadas (dbSNP-NCBI e Ensembl). Neste tra-

balho a frequência desta alteração foi de 6%.

Resultados 101

g.833_834insCC (Figura 59, pag174 em anexo): Inserção de CC encontrada na regi-

ão que precede o gene TUBB2B (anterior ao exon 1) em um paciente com esqui-

zencefalia (126/04). Esta alteração encontra-se no gene PSMG4 e não está descrita

na literatura. Como a inserção encontra-se em heterozigose no paciente, os frag-

mentos amplificados foram clonados em vetor pGEM® e posteriormente sequenci-

ados para análise de somente uma cópia alélica. Neste trabalho a frequência desta

alteração foi de 1%.

4.1.2.6. Gene TUBA8

No gene TUBA8 foram encontradas quatro alterações neutras (NCBI Reference Se-

quence: NM_018943.2):

g.18639_18641delGGA (Figura 60, pag174 em anexo): Deleção de três nucleotí-

deos (GGA) encontrada no intron 3 em cinco pacientes com esquizencefalia

(901/01, 1123/01, 52/02, 131/02, 151/02) e em sete pacientes com o espectro

LIS/HSB (903/01, 1158/01, 1450/03, 1467/06, 112/09, 185/09, 461/09). Tal dele-

ção é descrita como SNP rs71703459 e está presente em 5% da população das ba-

ses de dados consultadas (dbSNP-NCBI e Ensembl). Neste trabalho a frequência

desta alteração foi de 15%.

c.2071C>T (Figura 61, pag175 em anexo): Alteração encontrada na região não

transcrita do exon 5 em três pacientes com esquizencefalia (1002/01, 17/02,

635/08) e em um paciente com o espectro LIS/HSB (2364/04). A troca de uma cito-

sina por uma timina é descrita como o SNP rs12159975 presente em 5% da popu-

lação das bases de dados consultadas (dbSNP-NCBI e Ensembl). Neste trabalho a



transcrita (UTR) do exon 5 em dois pacientes com esquizencefalia (541/08,

374/04). Esta alteração troca uma citosina por uma timina e não está descrita na li-

teratura. Neste trabalho a frequência desta alteração foi de 2%.

Resultados 102


transcrita (UTR) do exon 5 em um paciente com esquizencefalia (374/04). A altera-

ção troca uma citosina por uma timina e não está descrita na literatura. Neste tra-

balho a frequência desta alteração foi de 1%.

4.1.2.7. Gene EMX2

Foram encontradas quatro alterações no gene EMX2 (NCBI Reference Sequence:

NM_004098.3). Três delas são variantes sinônimas, isto é, que não alteram o aminoácido

trocado, e uma alteração é intrônica.

c.865G>A (Figura 64, pag176 em anexo): Alteração encontrada no exon 1 do gene

EMX2 em um paciente com esquizencefalia (671/08). A troca de uma guanina por

uma adenina mantém o aminoácido serina na posição 14 da proteína (p.Ser14Ser).

Tal alteração sinônima não está descrita nos bancos de dados consultados. Neste


c.1290C>A (Figura 65, pag176 em anexo): Alteração encontrada no exon 2 em dois

pacientes com esquizencefalia (905/01, 1002/01). A troca de uma citosina por uma

adenina e mantem o aminoácido arginina na proteína p.Arg156Arg. Esta alteração

sinônima está descrita como SNP rs8192642 e está presente em 1% da população

das bases de dados consultadas (dbSNP-NCBI e Ensembl). Neste trabalho a fre-

quência desta alteração foi de 4%.

c.1370C>A (Figura 66, pag176 em anexo): Alteração encontrada no exon 2 em dois

pacientes com esquizencefalia (573/04, 541/08). Trata-se de uma alteração sinô-

nima, pois apesar da substituição, o aminoácido alanina não é substituído

(p.Ala182Ala). Esta alteração é descrita como SNP rs4224112 e está presente em

3% da população das bases de dados consultadas (dbSNP-NCBI e Ensembl). Neste


c.592-10T>A (Figura 67, pag177 em anexo): Alteração encontrada no intron 2 em

um paciente com esquizencefalia (131/02). A troca de uma timina por uma adeni-

Resultados 103

na não está descrita nas bases de dados analisadas (dbSNP-NCBI e Ensembl). Neste


4.1.3. Regiões de microRNA

As variantes inéditas, isto é, não depositadas nos bancos de dados consultados, locali-

zadas em regiões 3’ e 5’ UTR foram analisadas quanto a uma possível alteração em sítios

de ancoragem de microRNAs, através do programa DIANA LAB (DNA Intelligent Analysis –

microT v3.0 diana.cslab.ece.ntua.gr).

Desse modo, foram analisadas regiões em que duas alterações no gene TUBA8,

(c.1969C>T e c.1613C>T) ambas na 3´UTR, foram identificadas (Tabela 22). No entanto,

nenhum sítio de ancoragem para microRNAs foi identificado na região analisada.

Tabela 22: Análise de sítios de microRNA.

Gene Alteração Local Banco de dados N

TUBA8 c.1969C>T 3’UTR (exon 5) Não descrito 2 TUBA8 c.1613C>T 3’UTR (exon 5) Não descrito 1

N: número de indivíduos com a mutação

4.1.4. Regiões de splicing alternativo

As mutações sinônimas e intrônicas (próximas aos sítios doadores e aceptores) com

baixa frequência populacional ou que não estão descritas na literatura, foram analisadas

para verificar se poderiam estar alterando o mecanismo de splicing.

Foi utilizado o software NNSplice (www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html) para a aná-

lise das alterações, porém, de acordo com essa ferramenta in sílico, nenhuma variante

analisada (Tabela 23) altera sítios que poderiam influenciar o mecanismo de splicing.

Resultados 104

Tabela 23: Alterações analisadas in sílico para regiões de splicing.

aa: aminoácido, N: número de indivíduos com a mutação, F: frequência da alteração nos bancos de dados consultados, *alteração encontrada em região anterior ao exon 1 do gene TUBB2B, per-tencente ao gene PSMG4.

4.1.5. Resumo das alterações de ponto identificadas

Na tabela abaixo, pode-se visualizar um resumo das alterações de ponto identificadas

(Tabela 24).

Gene Alteração Troca de aa Local Banco de

dados N F

FLNA c.1998G>A p.Ala666Ala Exon 13 rs34510365 1 0,1% TUBB2B g.1373G>C - Intron 1 rs182605730 1 0,2% TUBB2B c.166+22C>T - Intron 4 rs202182484 1 0,1%

TUBB2B* g.833_834insCC - Exon 1 - 1 - TUBA8 c.1969C>T - Exon 5 - 2 - TUBA8 c.1613C>T - Exon 5 - 1 - EMX2 c.865G>A p.Ser14Ser Exon 1 1 1 - EMX2 c.592-10T>A - Intron 2 - 1 -

Resultados 105

Tabela 24: Resumo das alterações encontradas.

Gene Alteração Local. Troca de aa Banco de dados

N PolyPhen MutPred Pan-ther

SIFT SNAP Gran-tham

FLNA c.374-19G>A Intron 2 - rs2070817 1/27 - - - - - - FLNA c.869-41C>T Intron 5 - rs4898479 9/27 - - - - - - FLNA c.869-28C>G Intron 5 - rs4898478 10/27 - - - - - - FLNA c.1286C>T Exon 9 p.Thr429Met CM065185 1/27 provavel-

mente pre-judicial

neutra preju-dicial

tolerada não neu-tra

modera-do

FLNA c.1998G>A Exon 13 p.Ala666Ala rs34510365 1/27 - - - - - - FLNA c.4543C>T Exon 27 p.Arg1515X CM067669 1/27 - - - - - - FLNA c.4920G>A Exon 29 p.Gly1640Gly rs61741041 2/27 - - - - - - FLNA c.6075T>C Exon 36 p.Ala1942Ala rs2070825 3/27 - - - - - - FLNA c.7732+11C>T Intron 47 - rs7063300 3/27 - - - - - - LIS1 c.568+27C>T Intron 6 - rs3213696 19/33 - - - - - - LIS1 c.1805C>T Exon 11 - rs6628 16/33 - - - - - - DCX c.948+29G>A Intron 2 - rs61036541 1/33 - - - - - - DCX c.993A>T Exon 2 p.Lys274Met não des-

crito 1/33 provavel-

mente pre-judicial

neutra neutra prejudici-al

neu-tra

modera-do

DCX c.1047T>C Exon2 p.Leu292Pro não des-crito

1/33 provavel-mente pre-

judicial

provavel-mente pre-

judicial

preju-dicial

prejudici-al

Não neu-tra

modera-do

TUBA1A c.453G>C Exon 4 p.Ser151Ser rs697624 51/80 - - - - - - TUBA1A c.288A>G Exon 3 p.Lys96Lys rs1056875 50/80 - - - - - - TUBA1A c.522G>A Exon 4 p.Ala174Ala rs61730859 3/80 - - - - - - TUBA1A c.510T>C Exon 4 p.Ser170Ser rs11202354

3 3/80 - - - - - -

TUBB2B c.73C>T Exon 1 - rs9503475 80/80 - - - - - - TUBB2B c.93T>C Exon 1 - rs9503474 4/80 - - - - - -

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/protein/NP_001447.2?report=graph&v=1892:1992&content=5&m=1942!&mn=rs2070825&dispmax=1&currpage=1

Resultados 106

TUBB2B c.141T>C Exon 1 - rs9503473 4/80 - - - - - - TUBB2B

* c.20T>C Exon 1 - rs7748598 2/80 - - - - - -

TUBB2B g.1338C>G Intron1 - rs9503472 5/80 - - - - - - TUBB2B g.1373G>C Intron 1 - rs18260573

0 1/80 - - - - - -

TUBB2B*

g.833_834insCC

Exon 1 - não des-crito

1/80 - - - - - -

TUBB2B g.3784_3785delTG

Intron 1 - rs10553445 12/80 - - - - - -

TUBB2B c.58-70G>A Intron 3 - rs41300841 4/80 - - - - - - TUBB2B c.166+22C>T Intron 4 - não des-

crito 1/80 - - - - - -

TUBB2B c.564G>T Exon 6 p.Ser188Ser rs111747273

1/80 - - - - - -

TUBB2B g.8144delT Exon 6 - rs67130760 80/80 - - - - - - TUBB2B g.8341_8342in

sCG Exon 6 - rs14178110

6 5/80 - - - - - -

TUBA8 g.18639_18641delGGA

Intron 3 - rs71703459 12/80 - - - - - -

TUBA8 c.562C>T Exon 4 p.Ala128Val rs2234331 1/80 benigna neutra neutra prejudici-al

não neu-tra

modera-do

TUBA8 c.2071C>T Exon 5 - rs12159975 4/80 - - - - - - TUBA8 c.1513A>T Exon 5 p.Glu445Val rs13807346

6 1/80 benigna neutra preju-

dicial prejudici-

al não neu-tra

modera-damente

radical TUBA8 c.1969C>T Exon 5 - não des-

crito 2/80 - - - - - -

TUBA8 c.1613C>T Exon 5 - não des-crito

1/80 - - - - - -

TUBA8 c.323C>T Exon 3 p.Arg84Cys rs11584768 1/80 provavel- neutra preju- prejudici- neu- radical

Resultados 107

Local.: localização da mutação, aa: aminoácido, N: número de indivíduos com a mutação/número total de indivíduos analisados, *alteração en-contrada em região anterior ao exon 1 do gene TUBB2B, pertencente ao gene PSMG4.

6 mente pre-judicial

dicial al tra

EMX2 c.865G>A Exon1 p.Ser14Ser não des-crito

1/47 - - - - - -

EMX2 c.1290C>A Exon 2 p.Arg156Arg rs8192642 2/47 - - - - - - EMX2 c.1370C>A Exon 2 p.Ala182Ala rs424112 2/47 - - - - - - EMX2 c.592-10T>A Intron 2 - não descri-

ta 1/47 - - - - - -

Resultados 108

4.2. MLPA

Os pacientes com o espectro LIS/HSB foram analisados pela técnica de MLPA para de-

tectar alterações estruturais (duplicações e deleções) em regiões candidatas. Dentre os 33

pacientes testados, seis apresentaram alteração estrutural sendo três no gene LIS1, dois

no gene DCX e um no gene FLNA. Abaixo estão descritos os dados clínicos e de MLPA dos

pacientes em que foram detectadas variações estruturais.

4.2.1. Alterações em LIS1

O paciente 500/09 apresentou deleção no exon 1 do gene LIS1 (Figura 18b). Trata-se

de um paciente do sexo masculino, atualmente com 17 anos, com paquigiria de predomí-

nio posterior, poupando parcialmente os lobos frontais (Figura 18a).

Figura 18: A- Imagem de ressonância magnética do paciente 500/09. Notar a presença de sulcos mais rasos nas regiões posteriores. B- Sondas (vermelho) abaixo da linha normal mostrando a de-

leção no exon 1 do gene LIS1.

O paciente 185/09 é do sexo masculino e apresentou deleção nos exons 6 e 7 do gene

LIS1 (Figura 19b). Esse paciente tem 11 anos e possui agiria de predomínio posterior (Figura

19a). Apresenta crises tônicas bilaterais com frequência de 6 a 8 vezes por dia e que tive-

500/09 A

B

Resultados 109

ram inicio aos dois meses de vida. O paciente em questão também apresenta tetraparesia

espástica e histórico familiar de epilepsia.

Figura 19: A- Imagem de ressonância magnética do paciente 185/09. Notar a agiria de predomínio posterior. B- Sondas (vermelho) abaixo da linha normal mostrando a deleção nos exons 6 e 7 do

gene LIS1.

Um paciente do sexo masculino (255/08), portador de agiria e paquigiria, possui dele-

ção completa no gene LIS1 (Figura 20). O paciente, atualmente com sete anos de idade,

tem crises diárias, refratárias ao tratamento com DAE e que tiveram início aos três meses

de idade.

Figura 20: Sondas (pontos vermelhos) abaixo da linha normal mostrando a deleção em todos os exons do gene LIS1.

185/09 A

B

255/08

Resultados 110

4.2.2. Alterações em FLNA

Um paciente do sexo masculino (271/09) portador de HSB apresentou duplicação em

uma sonda referente ao exon 4 do gene FLNA (Figura 21). O paciente, atualmente com 29

anos, apresenta crises não controladas do tipo tônico-clônicas generalizadas e drop at-

tacks, além de déficit mental grave. Esta duplicação foi confirmada pela técnica de micro-

arranjo e será enfatizada no item 4.3.

Figura 21: A- Imagem de ressonância magnética do paciente 271/09. B- Sondas (vermelho) acima da linha normal mostrando a duplicação no exon 4 do gene FLNA.

4.2.3. Alterações em DCX

Um paciente do sexo feminino com HSB (415/03) possui deleção completa do gene

DCX (Figura 22). O paciente possui 17 anos e têm crises desde os sete meses de idade. As

crises são do tipo parcial e tônico-clônicas generalizadas. O paciente apresenta déficit

mental leve e possui histórico familiar de epilepsia.

271/09

B

A

Resultados 111

Figura 22: A- Imagem de ressonância magnética do paciente 415/03. B- Sondas (pontos verme-lhos) abaixo da linha normal mostrando a deleção em todos os exons do gene DCX.

Um paciente do sexo feminino (652/03) com HSB possui uma duplicação no exon 3 do

gene DCX (Figura 23). Ela tem 17 anos e é acometida por crises parciais complexas e tôni-

co-clônicas generalizadas de frequência diária e que se iniciaram aos seis anos de idade.

Possui déficit de desenvolvimento neuropsicomotor e inteligência limítrofe. Há histórico

familiar para epilepsia.

Figura 23: Sondas (pontos vermelhos) acima da linha normal mostrando a duplicação no exon 3 do gene DCX.

415/03 A

B

652/03

Resultados 112

4.3. SNP-Array

4.3.1. Seleção de pacientes

Os pacientes foram selecionados pelos seguintes critérios: 1) integridade e padrão de

fragmentação dos DNAs em gel de eletroforese, 2) relação dos valores de absorbâncias

A260/230, A260/280, 3) valor absoluto de absorbância A320 e 4) casos potencialmente

interessantes (pacientes com recorrência familiar da malformação, casos negativos para

as outras estratégias de triagem de alterações patogênicas).

Desta forma, 40 pacientes foram submetidos à técnica de microarranjo. Dos 40 paci-

entes selecionados, 14 pacientes possuem HNP, 14 são afetados pelo espectro LIS/HSB e

12 possuem esquizencefalia.

4.3.2. Resultados do SNP-Array

Utilizamos um filtro para CNV maiores ou iguais a 100kpb, pois alterações com este

tamanho tem maior probabilidade de serem patogênicas (72). A segunda seleção se base-

ou na comparação com o banco de dados disponível na internet, o DGV, que contém vari-

antes do genoma descritas em indivíduos saudáveis (controles).

É importante citar que não incluímos em nossa tabela de pacientes portadores de

CNV potencialmente patogênicas indivíduos cujas alterações estão envolvidas com sín-

dromes estruturais já descritas. Estes pacientes serão tratados em separado.

Desta forma, foram identificamos um total de 55 CNVs nos pacientes analisados, sen-

do 25 variantes novas, isto é, não descritas na literatura ou em banco de dados, distribuí-

das em 17 pacientes. O tamanho das CNVs inéditas variou entre 108 kbp a 651 kbp, apre-

sentando tamanho médio de 235kpb. Esses CNVs afetam 53 genes, sendo em média 2

genes por CNV. Houve grande predominância de ganhos de regiões em relação às perdas,

foram encontrados 21 ganhos e apenas 4 perdas.

A análise dos CNVs não descritos foi também realizada nas bases de dados ISCA, Deci-

pher e dbVAR. Estas bases de dados possuem informações se as CNVs inéditas possuem

sobreposição com variantes já descritas como patogênicas ou se as mesmas estão associ-

Resultados 113

adas com síndromes bem caracterizadas do ponto de vista clínico. Esta triagem revelou 17

CNVs com potencial patogênico (Tabela 25) e que afetam, em sua totalidade, 41 diferentes

genes, uma média de 2 genes por CNV. Esses CNVs variam de 108kpb a 651kpb, apresen-

tando tamanho médio de 235kpb. Dos 17 CNVs com potencial patogênico, 14 tratam-se

de ganhos de regiões cromossômicas e apenas 3 tratam-se de perdas. As variações estão

distribuídas em 12 pacientes: sete com HNP, um paciente com LIS e quatro pacientes com

esquizencefalia.

É importante salientar que foram marcadas em azul, na Tabela 25, as CNVs já descritas

como patogênicas e com maior região de sobreposição com as CNVs identificadas pelo

nosso trabalho. Esta informação é importante, pois quanto maior é a área de sobreposi-

ção entre uma nova CNV e uma CNV já descrita como patogênica maior é a chance da

primeira também ter efeito deletério. Portanto, esta é uma característica importante utili-

zada para selecionar as alterações mais interessantes dentro do grupo de CNVs potenci-

almente deletérias.

Também foram utilizados os bancos de dados GO e OMIM para aferir os papéis de-

sempenhados pelos genes contidos dentro das CNVs e se os mesmos estão envolvidos

com alguma doença mendeliana. Os genes considerados mais interessantes estão marca-

dos em vermelho na Tabela 25. É importante citar que privilegiamos genes com funções

em processos biológicos sabidamente envolvidos com malformações do córtex cerebral

como divisão celular, transporte de vesículas, organização do citoesqueleto, orientação do

axônio e migração neuronal.

Todo processo de triagem resultou na seleção de 5 pacientes com maior potencial e

que serão descritos a seguir (casos: 239/08, 904/01, 302/01, 283/01 e 524/09). Outros 2

pacientes foram identificados com o diagnósticos de quadros sindrômicos já descritos na

literatura (casos 1324/06, 523/01) e um caso inédito na literatura também foi identificado

e será mostrado a seguir (271/09) .

Resultados 114

Tabela 25: CNVs com potencial patogênico encontrados em pacientes com MDC.

Paciente MDC Tipo Cromossomo Tamanho (kpb) Genes

Variantes Patogênicas Deposi-

tadas que possuem Sobreposi-

ção

Sinais Clínicos dos indivíduos

que portam variantes com

sobreposição

143/09 HNP Ganho 10p14 112,591 CELF2 nssv584407 (962,19 kbp)*

nssv1495400 (835 kbp)* Autismo, Atraso do desenvol-

vimento

975/02 HNP Ganho 11q24.2 137,025 KIRREL3 nssv1495425 (1,274.26 kbp)* Atraso do desenvolvimento

160/03 HNP

Ganho 3p25.2 124,919 C3orf31 nssv578939 (19,446.57kbp)**

Ganho 4q31.1 133,171 ELF2

nssv584240 (1,793.09 kbp)* Atraso do desenvolvimento,

microcefalia

Perda 12q23.1 131,253 UHRF1BP1L, GOLGA2B,

MIR1827, ACTR6 nssv578626 (195.4 kbp)** Atraso do desenvolvimento

373/01 HNP Ganho 8q24.21 276,659 FAM49B, ASAP1 nssv582760 (712,23kbp)**

nssv1495357 (626,4kbp)* nssv1601453 (642,49kbp)*

Atraso do desenvolvimento

302/01 HNP

Ganho 8q24.3 141,59 NCRNA00051, TSNARE1 nssv578295 (348,98kbp)* Atraso do desenvolvimento

Ganho 2p25.3 220,985 TPO, PXDN nssv580447( 339,57kbp)*

nssv580989 (742,96kbp)** nssv580991 (597,02kbp)**


524/09 HNP

Ganho

14q23.1 237,933 DAAM1

nssv577473 (713,71kbp)*

Anormalidades esqueléticas, agenesia do corpo caloso,

atraso do desenvolvimento, microcefalia, crises epiléticas

Perda Xp22.11 651,973 PDK3, PCYT1B, POLA1, SCAR-

NA23, ARX nssv581421 (289,24kbp)** Atraso do desenvolvimento

283/01 HNP Ganho 3q21.3 117,036 CHCHD6, PLXNA1 nssv1415291 (2,149.20kbp)* Atraso do desenvolvimento

Ganho Xq28 108,607 HAUS7, BGN, ATP2B3 nssv579256 (640,5kbp)** Atraso do desenvolvimento

457/01 LIS Ganho 10q26.3 370,265 MGMT, EBF3, MIR4297 nssv580760 (650,03kbp)**

nssv580335 (647,99kbp)* nssv1415181 (516,53kbp)**

Déficit intelectual, anormali-dades faciais, hipotonia, atraso

do desenvolvimento

Resultados 115

Paciente MDC Tipo Cromossomo Tamanho (kpb) Genes

Variantes Patogênicas Deposi-

tadas que possuem Sobreposi-

ção

Sinais Clínicos dos indivíduos

que portam variantes com

sobreposição

239/08 Esquizencefalia Ganho 7q36.3 456,024 PTPRN2, MIR595, NCAPG2,

ESYT2, WDR60 nssv578235 (981 kbp)*

nssv578236 (712,79 kbp)* nssv581304 (736,78 kbp)**

Atraso do desenvolvimento, microcefalia, hipotonia, crises

epiléticas

125/04 Esquizencefalia Ganho

7q11.23 432,423 CCDC146, FGL2, PION, PTPN12

nssv578201 (2,878.87 kbp)* nssv1415297(1,739.69kbp)**

Atraso do desenvolvimento, hipotonia, hipoplasia do corpo

caloso, crises epiléticas

904/01 Esquizencefalia Ganho

Xq28 113,765 HAUS7, BGN, ATP2B3,

FAM58A nssv579256 (640,5kbp)** Atraso do desenvolvimento

124/04 Esquizencefalia Perda

2p22.2 239,803 FAM82A1, CYP1B1, C2orf58 nssv1495210 (219,2kbp)* nssv1602344 (787,06kbp)**


* perda ** ganho

Resultados 116

4.3.2.1. Caso 239/08

Trata-se de um paciente do sexo masculino, atualmente com 29 anos, com esquizen-

cefalia unilateral de lábios abertos (Figura 24a). Esse paciente possui crises parciais com-

plexas de frequência diária. O individuo em questão possui duplicação de 456,024kpb no

cromossomo 7q36.3 (Figura 24b). Esta CNV envolve os genes NCAPG2, PTPRN2, ESYT2 e

WDR60. Os três últimos genes parecem não estar envolvidos no desenvolvimento neuro-

nal, o gene PTPRN2 está relacionado à secreção de insulina, o gene ESYT2 codifica uma

proteína componente de membrana e o gene WDR60 está relacionado provavelmente ao

componente celular do cílio. Já o gene NCAPG2 parece ter potencial patogênico relaciona-

do à malformação do paciente.

O gene NCAPG2 faz parte do complexo proteico da condensina II, que atua na con-

densação dos cromossomos durante a divisão celular. O complexo proteico da condensina

II interage diretamente com o gene MCPH1 (microcefalina 1), responsável pela microcefa-

lia, uma malformação cortical relacionada à proliferação neuronal (73).

Figura 24: A- Paciente com esquizencefalia unilateral de lábios abertos, com a fenda localizada na região frontal direita (seta). B- Resultado do microarranjo do paciente 239/08 mostrando a dupli-cação no cromossomo 7q36.3 (barra azul representa a região duplicada, em rosa estão os genes

envolvidos nesta região).

A B

Resultados 117

4.3.2.2. Caso 904/01

Trata-se de um paciente do sexo masculino, atualmente com 31 anos, com esquizen-

cefalia bilateral de lábios fechados (Figura 25a). O paciente sofre de crises de ausência atí-

picas e de crises tônico-clônicas generalizadas. Este paciente possui tetraparesia de pre-

domínio direito. O individuo em questão possui uma duplicação de 113,765kpb localizada

na região Xq28 (Figura 25b). Esta CNV envolve os genes HAUS7, BGN, ATP2B3 e FAM58A.

Os genes BGN, ATP2B3 e FAM58A estão relacionados respectivamente com matriz

extracelular (presente em tecidos conjuntivos), canal de cálcio e síndrome de STAR (com-

plexo de malformações envolvendo as regiões renal e genital).

O gene HAUS7 é uma das oito subunidades de um complexo proteico (complexo

HAUS) envolvido na organização dos microtúbulos, essencial na divisão celular (74).

Figura 25: A- Paciente com esquizencefalia bilateral de lábios fechados com fendas de localização parieto occipital (seta). B- Resultado do microarranjo do paciente 904/01 mostrando a duplicação no cromossomo Xq28 (barra azul representa a região duplicada, em rosa estão os genes envolvi-

dos nesta região).

4.3.2.3. Caso 302/01

Trata-se de um homem de 63 anos de idades, com heterotopia nodular periventricu-

lar assimétrica à esquerda (Figura 26a). O paciente é acometido por crises parciais comple-

xas que se iniciaram aos 17 anos. O individuo em questão possui uma duplicação de

A B

Resultados 118

141,59kb localizada no cromossomo 8q24.3 (Figura 26b). Esta CNV envolve os genes TSNA-

RE1 e NCRNA00051. Este último não codifica proteínas e ainda tem função desconhecida.

O gene TSNARE1 participa do transporte de vesículas, e mutações deletérias em ge-

nes relacionados a este tipo de função já foram descritas em pacientes com malformações

corticais (12).

Figura 26: A- Paciente com heterotopia nodular periventricular assimétrica a esquerda (seta). B- Resultado do microarranjo do paciente 302/01 mostrando a duplicação no cromossomo 8q24.3

(barra azul representa a região duplicada, em rosa estão os genes envolvidos nesta região).

4.3.2.4. Caso 283/01

Trata-se de um paciente do sexo feminino, atualmente com 31 anos, com um quadro

de heterotopias focais, apresentando heterotopia nodular periventricular à direita e poli-

microgiria (Figura 27a). A paciente apresenta crises parciais de inicio as 12 anos de idade.

Foram encontrados dois CNVs potencialmente deletérios nessa paciente, uma dupli-

cação no cromossomo 3q21.3 e uma duplicação na região Xq28.

O primeiro CNV possui 117,036kpb e encontra-se no cromossomo 3q21.3 (Figura 27b).

Os genes PLXNA1 e CHCHD6 são afetados por esse CNV. O gene CHCHD6 codifica uma pro-

teína relacionada à morfologia da crista mitocondrial. Já o gene PLXNA1 (Plexina 1) codifi-

ca uma proteína transmembrana, expressa predominantemente no cérebro, que desem-

penha um importante papel na orientação do axônio, no crescimento e na migração celu-

lar.

A B

Resultados 119

O segundo CNV trata-se de uma duplicação de 108,607kpb no cromossomo Xq28

(Figura 27c). Trata-se de um CNV muito próximo daquele encontrado no caso 904/01, afe-

tando também os genes HAUS7, BGN, ATP2B3. Porém, o CNV do paciente 283/01 é um

pouco menor, e não afeta o gene FAM58A.

Figura 27: A- Paciente com heterotopia nodular periventricular à direita (seta). Resultado do mi-croarranjo do paciente 283/01 mostrando: B- a duplicação no cromossomo 3q21.3 e C- a duplica-ção no cromossomo Xq28 (barra azul representa a região duplicada, em rosa estão os genes en-

volvidos nesta região).

4.3.2.5. Caso 524/09

Trata-se de um paciente do sexo feminino com heterotopia nodular periventricular

(Figura 28a), com onze anos e que apresentou os primeiros episódios de crise com aproxi-

madamente um ano de idade. A paciente apresenta crises parciais simples e complexas

A

B C

Resultados 120

que evoluem para crises tônico-clônicas generalizadas não controladas por drogas antiepi-

léticas. Episódios de estado de mal epilético já ocorreram cinco vezes e a paciente possui

distúrbio de aprendizagem.

A paciente em questão possui dois CNVs potencialmente deletérios. O primeiro deles,

trata-se de uma duplicação de 237,933kb localizada no cromossomo 14q23.1 (Figura 28b).

Este CNV envolve o gene DAAM1 (dishevelled-associated activator of morphogenesis 1). O

gene DAAM1 está envolvido na organização do citoesqueleto durante a migração celular e

tem domínios de ligação com a actina.

O segundo CNV encontrado trata-se de uma deleção de 651,973kpb no cromossomo

Xp22.11 (Figura 28c). Este CNV afeta os genes ARX, PDK3, PCYT1B, POLA1 e SCARNA23. Os

últimos quatro genes não parecem estar relacionados com o desenvolvimento neuronal: o

gene PDK3 está envolvido com a atividade mitocondrial, o gene PCYT1B participa de diver-

sos processos metabólicos, como o de fosfolipídios, o gene POLA1 está relacionado a ati-

vidade DNA polimerase e o gene SCARNA23 não codifica proteínas e seu RNA parece ter

papel de modificação de outros RNAs.

Já o gene ARX apresenta um grande potencial patogênico. Ele tem importante papel

na orientação do axônio, proliferação celular e migração neuronal e mutações deletéria

no mesmo já foram descritas como responsáveis por quadros de polimicrogiria e HNP

(75).

Resultados 121

Figura 28: A- Paciente (524/09) com heterotopia nodular periventricular (seta). Resultado do mi-croarranjo do paciente 524/09 mostrando: B- duplicação no cromossomo 14q23.1 e C- deleção no cromossomo Xp22.11(barra azul representa a região duplicada, barra vermelha representa a regi-

ão deletada, em rosa estão os genes envolvidos nestas regiões).

É importante citar que este mesmo paciente apresentou a mutação c.1286C>T no

exon 9 do gene FLNA, que apesar de descrita como patogênica (CM065185) por Masruha

et al., em 2006, foi encontrada em dois indivíduos do nosso grupo controle.

B C

A

Resultados 122

4.3.2.6. Caso 271/09

O paciente 271/09 é do sexo masculino e possui HSB (Figura 29a). Como já descrito,

uma duplicação no gene FLNA foi identificada através da técnica de MLPA. Devido ao pe-

queno número de sondas para o gene FLNA contidos no kit utilizado no MLPA identifica-

mos somente uma duplicação no exon 4. Sendo assim, submetemos o mesmo paciente à

analise pelo CytoScanHD (Affymetrix). Os resultados mostram uma região de 35kpb dupli-

cada na região Xq28 (Figura 29b), que afeta grande parte do gene FLNA (os 22 primeiros

exons são afetados), além de outro gene menor (EMD) localizado próximo ao mesmo.

Figura 29: A- Paciente com heterotopia subcortical em banda. B- Resultado do microarranjo do paciente 271/09 mostrando a duplicação no cromossomo X, que afeta os genes FLNA e EMD (bar-

ra azul representa a região duplicada, em rosa estão os genes envolvidos nesta região).

4.3.2.7. Caso 1324/06

O paciente em questão é do sexo feminino, tem 10 anos de idade e seu exame de res-

sonância magnética revelou a presença de heterotopia subcortical em banda. O indivíduo

tem crises de frequência diária desde os três anos de idade e atraso global do desenvolvi-

mento. A técnica de microarranjo identificou uma deleção no cromossomo 1p36 de

3154,617kb (Figura 30). Esta deleção afeta mais de 100 genes e é conhecida como a res-

A

B

Resultados 123

ponsável pela Síndrome da deleção do 1p36. Esta síndrome é caracterizada por múltiplas

anormalidades congênitas e déficit intelectual (76). Esta deleção foi também investigada

pelas técnicas de FISH e MLPA em nosso serviço, confirmando definitivamente o diagnós-

tico como Síndrome de deleção do 1p36 (dados não disponíveis).

Figura 30: Resultado do microarranjo do paciente 1324/06 mostrando a deleção no cromossomo 1p36 (barra vermelha representa a região deletada, em rosa estão os genes envolvidos nesta regi-ão).

Este paciente também possui uma duplicação na região 4p16.3 de 14137,937kbp

(Figura 31), envolvendo 128 genes. Esta região abrange totalmente a região crítica para a

síndrome de Wolf Hirschhorn (WHS), uma síndrome rara de microdeleção em 4p16.3 bem

caracterizada (regiões WHSCR1 e WHSCR2) (77) (78) (79). Além do mais, há várias outras

CNVs patogênicas descritas e que possuem sobreposição com esta região (Figura 32). Os

pacientes portadores destas CNVs são acometidos por diversas condições como autismo,

déficit intelectual, hipertelorismo, anormalidades faciais, defeitos cardíacos, entre outros.

Resultados 124

Figura 31: Resultado do microarranjo do paciente 1324/06 mostrando a duplicação no cromosso-mo 4p16.3 (barra azul representa a região duplicada, em rosa estão os genes envolvidos nesta região).

Figura 32: Esquema mostrando CNVs patogênicas descritas dentro da região de 14Mb identificada no paciente 1324/06.

Resultados 125

4.3.2.8. Caso 523/01

Trata–se de uma mulher com heterotopia subcortical em banda, com bandas hetero-

tópicas grossas e difusas, mas com predomínio ligeiramente anterior (Figura 33a). A paci-

ente apresenta episódios de crises parciais diariamente e a idade de inicio das mesmas foi

aos quatro anos de idade. O exame neurológico revelou hemiparesia leve a esquerda.

Esta paciente possui uma deleção de 1652,719kb na região 3q29 (Figura 33b). A CNV

em questão afeta um total de 25 genes: SDHAP1, TFRC, LOC401109, ZDHHC19, OSTalpha,

PCYT1A, TCTEX1D2, TM4SF19, UBXN7, RNF168, C3orf43, WDR53, FBXO45, LRRC33,

C3orf34, PIGX, PAK2, SENP5, NCBP2, LOC152217, PIGZ, MFI2, DLG1, BDH1 e LOC220729,

cujas funções estão resumidas na Tabela 26.

Tabela 26: Resumo das funções dos genes relacionados à CNV encontrada na região 3q29

Gene Função

SDHAP1 Não caracterizada

TFRC Receptor de transferrina, transporte de íons de ferro

LOC401109 Não caracterizada

ZDHHC19 Proteína de membrana, ligação com íon de zinco

OSTalpha Transporte de solutos orgânicos

PCYT1A Processos metabólicos (fosfatase)

TCTEX1D2 Proteína de ligação, pouco caracterizada

TM4SF19 Proteína transmembrana, pouco caracterizada

UBXN7 Ligação a ubiquitina

RNF168 Reparo do DNA (envolvido na síndrome de RIDDLE)

C3orf43 Proteína de membrana não caracterizada

WDR53 Proteína com domínios WD, ligação com ubiquitina

FBXO45 Desenvolvimento neuronal (relacionado a síndrome de deleção do 3q29)

LRRC33 Proteína de membrana, pouco caracterizada

Resultados 126

Gene Função

C3orf34 Componente do centríolo

PIGX Atividade manosiltransferase, proteína do RE, faz parte do complexo GPI

PAK2 Sinalização celular, apoptose, organização do citoesqueleto (relacionado a

síndrome de deleção do 3q29)

SENP5 Proteólise, divisão celular,

NCBP2 Processos de modificação de RNAm


PIGZ Atividade manosiltransferase, proteína do RE, faz parte do complexo GPI

MFI2 Transporte celular do íon de ferro

DLG1 Sinalização celular, proliferação celular, sinaptogênese (relacionado a sín-

drome de deleção do 3q29)

BDH1 Enzima mitocondrial, processos metabólicos


A alteração em questão, segundo o banco de dados Decipher, possui sobreposição

com alterações estruturais descritas na Síndrome de Microdeleção de 3q29. Esta condição

tem como característica uma grande variabilidade clínica que inclui desde indivíduos com

dismorfismos faciais (face longa e achatada, filtro curto e ponte nasal alta), autismo e mi-

crocefalia até pacientes com características cognitivas normais, porém portadores de alte-

rações cardíacas (80) (81).

Resultados 127

Figura 33: A- Paciente com heterotopia subcortical em banda. B- Resultado do microarranjo do paciente 523/01 mostrando a deleção no cromossomo 3q29 que afeta 25 genes (barra vermelha

representa a região deletada, em rosa estão os genes envolvidos nesta região).

4.4. Resumo das alterações encontradas

A tabela a seguir (Tabela 27) resume todas as alterações identificadas que foram conside-radas patogênicas.

A

B

Resultados 128

Tabela 27: Resumo das alterações patogênicas encontradas

Paciente -

sexo

Malformação Alteração encontrada Gene Técnicas

utilizadas

P3 - F HNP bilateral, hipoplasia do vermis,

focos inespecíficos em T2

c.4543C>T FLNA sequenciamento

524/09 -F HN subEpendimária à esquerda,

duas fendas de esquizencefalia de

lábios fechados

arr14q23.1(59,566,194-59,804,127)x3

arrXp22.11p21.3(24,411,721- 25,063,694)x1

DAAM1, ARX SNP-Array

643/08 -M paquigiria bifrontal, HSB nas regiões

posteriores

c.993A>T DCX sequenciamento

491/09 - F HSB c.1047T>C DCX sequenciamento

500/09 - M paquigiria de predomínio posterior,

poupando parcialmente os lobos

frontais

Deleção LIS1 MLPA

185/09 - M agiria de predomínio posterior, pou-

pando parcialmente os lobos frontais

Deleção LIS1 MLPA

255/08 M Agiria e paquigiria Deleção LIS1 MLPA

271/09 - M HSB arrXq28(153,432,288-153,575,625)x2

FLNA MLPA e SNP-Array

415/03 - F HSB Deleção DCX MLPA

Resultados 129

652/03 - F HSB Duplicação DCX MLPA

239/08 - M Esquizencefalia unilateral de lábios

abertos

arr7q36.3(158,198,277-158,654,301)x3 NCAPG2 SNP-Array

904/01 - M Esquizencefalia bilateral de lábios

fechados

arrXq28(152,735,088-152,848,853)x2

HAUS7 SNP-Array

302/01 HNP assimétrica à esquerda, lobos

cerebrais assimétricos com leve re-

dução à esquerda

arr8q24.3(143,169,754-143,311,344)x3

TSNARE1 SNP-Array

283/01 -F HNP à direita, heterotopias focais,

polimicrogiria

arrXq28(152,720,466-152,829,073)x3

arr3q21.3(126,667,428-126,784,464)x3

PLXNA1, HAUS7 SNP-Array

1324/06 - F sugestivo de HSB arr1p36.33(1,186,633-2,056,696)x1

arr1p36.33p36.32(2,103,939-5,258,556)x1

arr4p16.3p15.33(68,345-14,206,282)x3

Vários (Síndrome da

deleção do 1p36)

SNP-Array

523/01- F HSB mais anterior, difusa, continua e

grossa

arr3q29(195,703,615-197,356,334)x1

Vários (Síndrome da

deleção do 3q29)

SNP-Array

M: masculino, F: feminino, HNP: heterotopia nodular periventricular, HSB: heterotopia subcortical em banda.

Resultados 130

Discussão 131

5. DISCUSSÃO

5.1. Heterotopia Nodular Periventricular

Desde sua identificação, diversas mutações no gene FLNA foram relacionadas à hete-

rotopia nodular periventricular (Figura 34), porém muitos casos esporádicos permanecem

ainda sem resposta. A grande maioria das alterações descritas trata-se de mutações sem

sentido, de alteração de sítios de splicing, de deleções ou inserções, sendo todas elas mu-

tações que geram proteínas truncadas. Este fato comprova que a perda de função da

FLNA é a maior causa de HNP (14).

Figura 34: Mutações descritas no gene FLNA (adaptado de Parrini et al. (14)).

Neste trabalho foram identificados dois pacientes com HNP com alterações no gene

FLNA que já haviam sido descritas como mutações patogênicas.

5.1.1. Paciente P3

A primeira mutação foi identificada no paciente P3. Trata-se de uma mulher de 55

anos, com HNP bilateral. Foi identificada nessa paciente a mutação c.4543C>T que leva a

Discussão 132

troca uma arginina por um códon de parada (p.Arg1515X), gerando uma proteína trunca-

da. Esta mutação já foi descrita como patogênica por Parrini et al. (14) (CM067669) em

uma mulher com HNP bilateral clássica.

A identificação de mutações recorrentes em pacientes de diferentes origens (o paci-

ente P3 é argentino) pode indicar a presença de um hot-spot dentro do gene FLNA, além

disso, a localização desta mutação, assim como o fato de ser do tipo nonsense e de o qua-

dro fenotípico da paciente portadora ser praticamente idêntico ao do paciente descrito

por Parrini et al. (14) fornece ainda mais evidências de que classes de mutações distintas

em algumas regiões do gene FLNA estão associadas a síndromes específicas, por exemplo,

mutações missense dentro dos domínios CH2 e em bastão 3, 10 e 14/15 são observadas

apenas em homens com as síndromes OPD1 e OPD2 (82).

As mutações que geram proteínas truncadas resultam em perda de função para a

proteína e geralmente estão associadas a casos familiares de HNP, nos quais a mutação é

herdada da mãe e os homens normalmente não sobrevivem (10) (9) (83) (84).

No caso da paciente P3, foram relatados dois abortos pela mãe da paciente. Prova-

velmente a mãe é portadora da mutação deletéria e os dois abortos poderiam ser de fetos

masculinos que não sobreviveram à gestação. Porém, como o DNA da mãe da paciente

não foi coletado, esta hipótese não pode ser confirmada. A mãe da paciente, apesar de

hipoteticamente portadora da mutação, exibe um fenótipo aparentemente normal. Uma

possível explicação para esse fato seria a inativação preferencial do cromossomo X com a

mutação na mãe da paciente, fato que resultaria em um fenótipo suficientemente brando

para não ser diagnosticado. Casos cuja inativação preferencial do cromossomo X mutante

influenciou nas manifestações clínicas já foram relatados por nosso grupo (85). Exames de

neuroimagem (RM) da mãe da paciente e também de seu pai também seriam necessários

para auxiliar na comprovação de nossa hipótese.

5.1.2. Paciente 524/09

A segunda alteração na FLNA foi identificada no paciente 524/09. Este paciente possui

a mutação c.1286C>T em heterozigose no exon 9 do gene FLNA. Tal alteração leva a troca

de uma treonina por uma metionina (p.Thr429Met) o que prejudicaria a funcionalidade da

Discussão 133

proteína FLNA. Das seis análises in sílico realizadas, três indicaram potencial patogênico

(Polyphen, Panther e SNAP) e as outras três classificaram a substituição como uma altera-

ção que pode ser tolerada (MutPred, SIFT e Grantham).

Masruha et al. (71) descreveram essa mesma mutação (CM065185) em uma família

com três irmãos afetados, sendo dois deles gêmeos. A mutação está presente nos três

irmãos afetados e em heterozigose na mãe dos pacientes que não possui HNP, fato que

pode ser atribuído ou a um fenômeno de mosaicismo somático ou a uma proteína mutan-

te com atividade residual que poderia levar a viabilidade de desenvolvimento embriológi-

co em homens e ao nascimento de mulheres sem malformações típicas da HNP. No traba-

lho de Masruha et al. (71) foram testados 100 indivíduos controles, todos eles negativos

para a alteração CM065185. Sendo assim, a variante CM065185 no gene FLNA foi conside-

rada como a causadora de HNP nesta família.

No entanto, o achado de Masruha et al. (71) é controverso. A mutação identificada se

encontra nas repetições IG (immunoglobulin like) da proteína, um sítio conhecido por con-

ter mutações missenses que resultam nas síndromes OPD1 e OPD2 (82). Além disso, os

pais dos irmãos afetados são primos em primeiro grau, fato que nos levaria a acreditar em

um padrão autossômico recessivo de herança.

A hipótese de que a mutação CM065185 não seria patogênica é reforçada com nossos

achados, pois identificamos essa mesma alteração em 2 indivíduos de um grupo de con-

troles normais. Porém, os indivíduos controles que possuem a mutação CM065185 são

todos do sexo feminino, portanto há a possibilidade de que a variante seja realmente pa-

togênica, mas os indivíduos controles inativariam preferencialmente o cromossomo X mu-

tante e por este motivo seriam clinicamente normais. Para comprovar esta hipótese será

necessário coletar amostras de RNA destes pacientes e provar por experimentos funcio-

nais (Ex: Real Time com uma sonda específica para a mutação) qual alelo é o mais expres-

so.

Existem outras evidencias que mostram que a mutação em questão não seria patogê-

nica e que a HNP do paciente 524/09 e da família descrita na literatura pode não estar

relacionada ao gene FLNA. Por exemplo, tanto os pacientes descritos por Masruha et al.

Discussão 134

(71), quanto o paciente 524/09 possuem padrões atípicos de HNP, como Síndrome de

West, presente nos irmãos descritos na literatura e heterotopia transmanto, presente em

nosso paciente. Tais padrões atípicos normalmente não estão relacionados com altera-

ções no gene FLNA. Sheen et al. (83) analisaram um grande grupo de pacientes com HNP e

nenhum paciente com padrões atípicos de malformação possuía alterações no gene FLNA.

A análise de microarranjo do paciente 524/09 identificou duas CNVs importantes:

uma deleção no cromossomo Xp22.11, que afeta o gene ARX e uma duplicação no cro-

mossomo 14q23.1 que afeta o gene DAAM1. Tais genes tem importante papel no desen-

volvimento neuronal e serão discutidos mais posteriormente. Este achado reforça a hipó-

tese de que, provavelmente, a malformação do paciente 524/09 foi causada por uma alte-

ração estrutural em outro gene, e não pela mutação CM065185 do gene FLNA.

5.1.3. HNP e gene FLNA

Supondo que a mutação CM065185 seja uma variante não deletéria, identificamos no

presente estudo apenas uma mutação patogênica no gene FLNA em um grupo de 27 paci-

entes com HNP, isto é, uma frequência de 3.7%. Os relatos da literatura apontam para

frequências maiores de mutações em FLNA em pacientes com HNP. Sheen et al. (83) iden-

tificaram 19% de mutações em casos esporádicos de HNP em mulheres e 9% de mutações

em casos esporádicos de HNP em homens. Quando ambos os sexos foram contemplados,

o mesmo trabalho identificou um total de 14% dos pacientes esporádicos com mutações

no gene FLNA. Em outro relato, Parrini et al. (14) identificaram alterações na FLNA em

26% dos pacientes esporádicos com a forma de HNP clássica bilateral.

Uma explicação para essa discordância seria que, diferente do presente estudo, a

maioria dos pacientes analisados na literatura possui HNP clássica bilateral. Das mulheres

estudadas por Sheen et al. (83), 77% possuem HNP clássica e no trabalho de Parrini et al.

(14), os padrões clássicos de HNP são analisados separadamente dos pacientes com outras

malformações associadas. Fica claro que a literatura seleciona os pacientes para os estu-

dos de mutações, fornecendo frequências de mutações que não correspondem à realida-

de dos pacientes atendidos nos ambulatórios de neurologia.

Discussão 135

Todas as variantes não deletérias identificadas já foram depositadas em bases de da-

dos. Quatro alterações estão presentes em introns com frequência acima de 1% na popu-

lação. Três alterações são sinônimas, ou seja, não alteram o resíduo de aminoácido.

5.2. O Espectro da Lissencefalia/Heterotopia Subcortical em Banda

5.2.1. Gene LIS1

O gene LIS1 é o principal gene relacionado à lissencefalia. Já foram descritas 42 muta-

ções de ponto (missense/nonsense/splicing) na sequencia do gene no banco de dados

HGMD (The Human Gene Mutation Database).

A grande maioria das alterações no gene LIS1 é descrita em pacientes com lissencefa-

lia isolada, sem outras malformações associadas.

No presente estudo não foram identificadas mutações de ponto deletérias na se-

quencia do gene LIS1 no grupo de pacientes analisados. Este grupo possui diferentes tipos

de lissencefalia, HSB, e pacientes com outras malformações associadas (Tabela 2).

A literatura relata que mutações pontuais no gene LIS1 são encontradas em 44% de

pacientes com lissencefalia com a região posterior mais afetada que a anterior (p>a), no

entanto, pequenas deleções e duplicações nesse gene são a maior causa de LIS p>a (25)

(26). Até hoje, já foram descritas 77 diferentes variações estruturais em banco de dados

(HGMD).

Portanto o pequeno número de pacientes com lissencefalia isolada do tipo p>a em

nossa casuística e a identificação de alterações estruturais (deleções e duplicações) en-

contradas através da técnica de MLPA podem explicar a ausência de mutações pontuais

deletérias na sequencia de DNA do gene LIS1.

Identificamos pela técnica de MLPA três alterações estruturais no gene LIS1. Todos os

pacientes que tiveram alterações detectadas possuem o típico padrão de neuroimagem

de portadores de mutações deletérias no LIS1, ou seja, regiões posteriores mais acometi-

das (86). Os pacientes por nós analisados possuem deleções intragênicas (exons 6 e 7),

deleções apenas do primeiro exon ou perda completa do gene LIS1, mas em decorrência

Discussão 136

do pequeno número de indivíduos positivos para este tipo de alteração, não foi possível

fazer uma correlação entre a gravidade do quadro clínico e a porção deletada do gene

LIS1, além do mais, as informações disponíveis na literatura são controversas em relação a

este ponto, com alguns trabalhos indicando que mutações de ponto e deleções menores

localizadas mais distalmente levariam a fenótipos mais leves e por sua vez grandes dele-

ções ou deleções proximais resultariam em quadros graves (87), enquanto outros traba-

lhos indicam que a gravidade não está relacionada ao tipo alteração (88) (89). Sobre a alta

frequência dos casos negativos para alterações estruturais em LIS1, vale a mesma argu-

mentação que realizamos em relação a padrões atípicos e mutações pontuais, já descrita.

5.2.2. Gene DCX

O DCX é um dos mais importantes genes envolvidos com o espectro LIS/ HSB. Desde

1998, já foram descritas 70 mutações na sequencia deste gene em pacientes com o espec-

tro LIS/HSB, sendo a grande maioria de pacientes com HSB (HGMD).

Foram identificadas, em nossa amostra de pacientes, duas mutações de ponto deleté-

rias no gene DCX:

5.2.2.1. Paciente 643/08

A mutação c.993A>T p.Lys274Met foi identificada em um paciente (643/08) do se-

xo masculino com paquigiria bifrontal e heterotopia em banda nas regiões posteriores. O

paciente é hemizigoto para a mutação, pois o gene mutado encontra-se no cromossomo

X. A mutação, ainda não descrita na literatura, foi herdada da mãe do paciente, que é he-

terozigota para a alteração. Esta mutação não foi encontrada em 200 indivíduos do grupo

de controles normais, o que reforça a hipótese de patogenicidade da alteração. Casos co-

mo esse são raros, mas Pilz et al. (90) e D’agostinho et al. (22), relataram casos de homens

com fenótipos de HSB e paquigiria com mutações missense no gene DCX.

O grau de impacto da troca de aminoácido na proteína poderia ser o responsável pela

mediana gravidade do fenótipo do paciente. As predições da patogenicidade da mutação

p.Lys274Met identificaram potencial patogênico para 2 dos 5 algoritmos analisados

Discussão 137

(PolyPhen e SIFT) e a análise tridimensional da proteína mostrou a perda de duas intera-

ções devido a substituição do aminoácido. A mutação encontra-se fora dos dois principais

domínios de ligação com microtúbulos (N-DC: aminoácidos 46-139 e C-DC: aminoácidos

173-263) e, além disso, a literatura relata que mutações herdadas levam a fenótipos mais

brandos nos pacientes, quando comparados a mutações de novo (91).

Desse modo, o aminoácido trocado poderia levar a algumas alterações nas interações

da proteína, prejudicando a funcionalidade normal da doublecortina, mas deixando uma

função residual, permitindo a migração de grupos de neurônios. Assim, a mutação traria

um fenótipo de paquigiria e heterotopia em banda ao paciente e sintomas quase imper-

ceptíveis na mãe heterozigota. A ausência de sintomas clínicos na mãe não exclui a possi-

bilidade da mesma possuir um grau brando de heterotopia subcortical em banda, portan-

to seria necessária a realização da RM para confirmar ou refutar esta hipótese. Além disso,

existe a possibilidade da mãe ser mosaico para a mutação p.Lys274Met, isto é: a mutação

estaria presente na linhagem dos linfócitos, mas ausente nos folhetos germinativos que

originaram o córtex cerebral e finalmente, poderia haver a influência da inativação prefe-

rencial do cromossomo X mutante, levando a uma diminuição do efeito do alelo mutado.

5.2.2.2. Paciente 491/09

A segunda mutação encontrada foi a c.1047T>C p.Leu292Pro. Um caso típico de

mutação no DCX e HSB. Trata-se de uma mulher (491/09) atualmente com 41 anos com

heterotopia subcortical em banda. A alteração não é descrita na literatura e aparente-

mente é uma mutação de novo, já que não foi encontrada na mãe da paciente. Todos os

algoritmos para predição de patogenicidade indicaram um alto potencial patogênico da

mutação. As diferenças nas interações dos aminoácidos trocados são consideráveis. Como

esperado, por estar em heterozigose, a mutação, deletéria para a proteína, resultou em

um fenótipo mais brando para a paciente que apresenta HSB. A mutação não foi encon-

trada no grupo controle, o que fortalece a hipótese de mutação deletéria.

Discussão 138

5.2.2.3. Alterações estruturais no gene DCX

Através da técnica de MLPA identificamos alterações estruturais em duas mulheres

com HSB. Uma delas possui o padrão clássico, com bandas mais acentuadas nas porções

frontais (415/03) e apresentou deleção de todo o gene DCX, tal deleção foi confirmada

pela técnica de microarranjo. Enquanto a outra paciente (652/03) apresentou duplicação

no exon 3 do gene DCX. Ela possui HSB, porém não tivemos acesso aos exames de neu-

roimagem.

5.2.3. Espectro LIS/HSB e a frequência de alterações encontradas

Somando alterações pontuais na sequencia do DNA e alterações estruturais (duplica-

ções e deleções), os genes DCX e LIS1 foram responsáveis por apenas 21% (7/33) do es-

pectro LIS/HSB da nossa amostra. A literatura geralmente relata valores maiores, respon-

sabilizando os genes DCX e LIS1 por até 85% dos casos de LIS/HSB (26).

Aproximadamente 6% de nossos pacientes com o espectro LIS/HSB apresentaram

mutações pontuais no gene DCX, representando 12,5% da amostra de mulheres com HSB.

A literatura geralmente mostra frequências maiores de mutações nesse gene em mulhe-

res. Matsumoto et al. (30) identificaram mutações no gene DCX em 84% dos casos espo-

rádicos de mulheres com HSB e em 100% dos casos familiares de LIS/HSB ligados ao X. A

nossa baixa frequência quando comparada à literatura poderia ser devido ao nosso pe-

queno N amostral, além disso, os casos selecionados para estudo no trabalho de Matsu-

moto et al. (30) são casos clássicos de HSB com bandas heterotópicas de predomínio ante-

rior.

D’agostinho et al. (22) identificaram 29% de homens com HSB com mutação no gene

DCX. Recentemente, um trabalho envolvendo um grande grupo de pacientes com o espec-

tro LIS/HSB encontrou 23% de mutações de novo no gene DCX em um grupo de 60 ho-

mens esporádicos com o espectro, e em todos os casos familiares (24 mulheres e 22 ho-

mens) (91). Nosso trabalho identificou 25% de mutação em homens com HSB. Nossa

amostra apesar de pequena mostrou resultados parecidos com o da literatura, mostrando

Discussão 139

que parece haver heterogeneidade genética significativa nos pacientes do sexo masculino

com HSB.

Mei et al. (25) identificaram alterações estruturais no gene LIS1 (duplicações e dele-

ções) em 76% dos pacientes com lissencefalia com a região posterior mais afetada (p>a).

Sendo que deleções são muito mais frequentes que duplicações (72% de deleções e 4% de

duplicações). A alta frequência de alterações deletérias relatada no trabalho de Mei et al.

(25), ocorre, provavelmente, devido a uma seleção preferencial de pacientes com padrões

“clássicos” envolvidos com LIS (p>a) e do número amostral relativamente pequeno

(N=45). Isso pode ser confirmado com um trabalho com maior N amostral: Haverfield et

al. (26) analisaram 83 pacientes com o espectro LIS/HSB e encontrou 35% de alterações

estruturais no gene LIS1 em pacientes com LIS isolada (sendo todos com LIS p>a) e 33% de

deleções no gene DCX em mulheres com HSB.

Em nosso grupo de pacientes com LIS/HSB, somente oito possuem o padrão LIS p>a,

sendo assim, 37% dos pacientes com LIS p>a analisados possuem deleção no gene LIS1.

Seguindo essa mesma lógica, nossa casuística contem oito mulheres com HSB, portanto

25% das pacientes com HSB possuem alteração estrutural no gene DCX.

Desse modo, nossos achados em relação a variações estruturais (deleções e duplica-

ções) estão próximos dos relatos da literatura. A frequência de alterações nos genes DCX e

LIS1 tendem a aumentar muito, conforme os fenótipos dos pacientes são selecionados

para análise (26). Nossos dados corroboram relatos da literatura nos quais pacientes com

LIS com a região posterior mais afetada, tem maiores chances de apresentar alterações

estruturais no gene LIS1 enquanto mulheres com HSB têm maiores chances de apresentar

alterações no gene DCX (17) (92) (93) (94) (20).

5.3. Esquizencefalia e o gene EMX2

O gene EMX2 foi relacionado à esquizencefalia somente em três trabalhos (40) (46)

(45) e, além disso, algumas das alterações descritas como patogênicas por estes relatos

são alvo de controvérsia. Desde então, não foram identificados pacientes com esquizence-

falia com mutações patogênicas no gene EMX2. Até mesmo trabalhos envolvendo grupos

Discussão 140

numerosos de pacientes com esquizencefalia, não relataram alterações patogênicas no

gene EMX2 (43) (42) (50). Desse modo, nossos resultados concordam com a literatura

atual, pois não encontramos alterações patogênicas no gene EMX2 nos pacientes com

esquizencefalia analisados.

Além de possíveis insultos pré-natais, a esquizencefalia pode ser causada por muta-

ções em outros genes. Hehr et al. (50) relataram alguns traços fenotípicos presentes em

pacientes com esquizencefalia que são também comuns a pacientes com holoprosencefa-

lia. Desse modo, analisando genes relacionados à formação do prosencéfalo, Hehr et al.

(50) identificaram mutações nos genes SIX3 e SHH em pacientes com esquizencefalia. Es-

tes genes são futuros candidatos a serem estudados em nossos projetos de triagem de

mutações deletérias em malformações do córtex cerebral.

5.4. Família das tubulinas e as MDC

Recentemente, a literatura tem apontado a família das tubulinas como uma impor-

tante peça para o entendimento da etiologia molecular das MDC. As tubulinas são as uni-

dades formadoras dos microtúbulos, envolvidas diretamente na nucleocinese, e têm sido

relacionadas a diversos tipos de malformações corticais (33).

No entanto, os pacientes com LIS/HSB e os pacientes com esquizencefalia, analisados

no presente trabalho, não possuem mutações de ponto patogênicas nos três genes da

família das tubulinas estudados (TUBA1A, TUBB2B e TUBA8).

No gene TUBA8 foram identificadas três alterações que em um primeiro momento

pareciam ter algum potencial patogênico, mas, depois de analisadas, essa hipótese foi

refutada.

A mutação c.1513A>T leva a troca de um ácido glutâmico por uma valina na posição

445 da proteína (p.Glu445Val) e que apesar de já descrita na população (rs138073466), foi

identificada com frequência muito pequena (0.04%), fato que nos levou a uma investiga-

ção mais detalhada em grupo controle. As ferramentas de análise in sílico mostraram que

a mutação tem potencial patogênico em 3 das 5 análises. Porém, no teste realizado com

200 controles, foram encontrados dois indivíduos com a mutação, representando 1% dos

Discussão 141

alelos na população analisada. Outro achado que reforça a hipótese de que essa mutação

não é patogênica foi a presença dessa mesma alteração na mãe do paciente, que é assin-

tomática. Portanto, provavelmente a mutação c.1513A>T não tem potencial deletério.

A mutação c.562C>T encontrada no exon 4 do gene TUBA8, em um paciente com es-

quizencefalia, leva a troca de uma alanina por uma valina na proteína (p.Ala128Val). Esta

mutação, apesar de já descrita nos bancos de dados (SNP rs2234331) está presente em

apenas 0,3% da população. Dois softwares (SIFT e SNAP), dos cinco analisados, mostraram

algum potencial patogênico, mas a tabela Grantham não descreveu a troca de aminoáci-

dos como significativa. Os testes em 200 controles normais identificaram essa alteração

em cinco indivíduos, ou seja, encontramos essa alteração com frequência de 2.5% na po-

pulação testada. Além disso, essa mesma alteração foi encontrada na mãe do paciente.

Este achado reforça a ideia de que a mutação c.562C>T é, na realidade, uma alteração não

deletéria.

A mutação c.323C>T encontrada no exon 3 do gene TUBA8, em um paciente com lis-

sencefalia incompleta, leva a troca de uma arginina por uma cisteína (p.Arg84Cys) e é des-

crita como SNP rs115847686 encontrado em 0.7% da população do banco de dados. Três

dos cinco softwares analisados identificaram potencial patogênico para esta mutação e a

tabela Grantham também descreveu essa troca de aminoácidos como radical. Porém os

testes em 200 controles identificaram essa mesma alteração em três indivíduos normais,

ou seja, ela está presente em 1.5% dos indivíduos do grupo controle analisados. Além dis-

so, essa mesma alteração foi encontrada na mãe do paciente. Concluímos, portanto, que a

alteração c.323C>T trata-se provavelmente de uma variante não deletéria.

As diferenças nas frequências das alterações não patogênicas poderiam ser atribuídas

à heterogeneidade e diferenças na estrutura genética da população brasileira quando

comparado à população das bases de dados. Mesmo sendo necessários estudos em gru-

pos populacionais maiores e mais variados para que a assertiva do parágrafo anterior seja

realmente comprovada, não há como negar a importância de testes em grupos controles

com grande número de indivíduos e de mesma origem étnico-geográfica para a validação

de possíveis mutações patogênicas.

Discussão 142

A ausência de mutações deletérias nos genes das tubulinas em nossa amostra de pa-

cientes não é algo totalmente inesperado, pois apesar da crescente importância desta

família gênica, os relatos ainda mostram baixa frequência de alterações patogênicas nes-

ses genes em pacientes com diferentes espectros de malformações corticais. Guerrini et

al. (95) analisaram um grande grupo de pacientes com malformações corticais (incluindo

polimicrogiria e paquigiria, N=128) e identificou mutações no gene TUBB2B em apenas

2.3% dos pacientes. Além disso, pacientes com alterações nos genes das tubulinas possu-

em diversas outras malformações associadas junto à malformação principal (37). Por

exemplo, já foram descritos na literatura 19 casos de lissencefalia associadas a mutações

no gene TUBA1A (35) (39) (53) (33) (34) (96). Em todos os casos há outro tipo de malfor-

mação associada, como disgenesia do corpo caloso, displasia do cerebelo e do tronco en-

cefálico (96).

Pacientes com mutação no gene TUBA8 apresentaram polimicrogiria generalizada

com hipoplasia do nervo óptico (56). Duplicação de uma região de 614kbp que engloba o

gene TUBA8 foi relatada em um paciente com amioplasia (97).

Mutações no gene TUBB2B foram encontradas em pacientes com diversos fenótipos,

incluindo esquizencefalia, polimicrogiria e lissencefalia, sempre com outras malformações

associadas como agenesia do corpo caloso e displasias cerebelares (54) (55) (98) (99).

A maioria dos pacientes presentes em nossa amostra não possui esta associação

complexa de malformações (especialmente o grupo de indivíduos com o espectro LIS-HSB)

fato que, provavelmente, influenciou na ausência de mutações de ponto deletérias identi-

ficadas em nossa amostra de pacientes. Também não foram investigadas variantes nas

regiões regulatórias e alterações estruturais como inserções e deleções menores que

100Kb.

5.5. A técnica de SNP-Array

A frequência de mutações encontradas nos genes e regiões candidatas analisadas foi

baixa, desse modo, as malformações corticais estudadas demonstraram ter grande hete-

rogeneidade genética. Além disso, o grupo das esquizencefalias possui etiologia molecular

Discussão 143

ainda pouco conhecida. Somando esses fatores, justificou-se o uso da técnica de SNP-

Array (microarranjo) como uma tentativa de esclarecer muitos casos ainda sem resposta,

e ajudar na compreensão dos mecanismos do desenvolvimento cortical.

Desse modo, a técnica de microarranjo possibilitou a identificação de um número sig-

nificativo de alterações estruturais. Grande parte dessas alterações é nova, isto é, não

descritas na literatura, e algumas delas foram importantes na confirmação dos resultados

obtidos pelo MLPA (pacientes 415/03 e 271/09), além da confirmação de um diagnóstico

(paciente 1324/06 descrito mais abaixo) e a provável identificação de uma síndrome (pa-

ciente 523/01 descrito mais abaixo).

Estudos recentes mostram que as CNVs são os tipos mais frequentes de variantes no

genoma humano (61). Desse modo a distinção entre variantes normais e patogênicas é de

grande importância para o real entendimento do papel destas alterações nos estados pa-

tológicos, incluído aí as malformações do córtex cerebral.

Os bancos de dados disponíveis na internet, como o DGV (Database of Genomic Vari-

ants), contem variações estruturais de indivíduos saudáveis. Até o momento são 291.801

CNVs depositadas nesse banco de dados. Desse modo, a utilização dessa ferramenta foi de

grande importância para a seleção inicial dos CNVs com potencial patogênico. Seleciona-

mos 25 variações, não descritas nesse banco de dados, para análise.

Os banco de dados ISCA, Decipher e dbVAR Databases descrevem variações identifi-

cadas como patogênicas. Assim, a comparação dos CNVs encontrados com esses bancos

de dados possibilitou a seleção de 17 variações com potencial patogênico. As duplicações

foram muito mais frequentes que a deleções (14 duplicações x 3 deleções).

Dentro do grupo de variações potencialmente patogênicas, utilizamos as bases de da-

dos GO e OMIM para analisar as funções dos genes contidos dentro destas CNVs. Estas

análises possibilitaram a identificação de seis genes candidatos (NCAPG2, HAUS7, TSNA-

RE1, PLXNA1, DAAM1 e ARX) que estão envolvidos com o desenvolvimento do sistema

nervoso e têm potencial para se tornarem genes candidatos envolvidos na etiologia mole-

cular das malformações corticais.

Discussão 144

5.5.1. Gene NCAPG2

O gene NCAPG2 foi identificado duplicado no paciente 239/08 que possui esquizence-

falia.

Esse gene é uma subunidade do complexo proteico da condensina II. Ele se localiza no

cromossomo 7q36.3 e produz uma proteína de 1143 aminoácidos com massa molecular

de 125kD. A expressão dessa proteína é alta durante o inicio do desenvolvimento embrio-

nário. A proteína NCAPG2 tem papel importante na manutenção da forma dos cromosso-

mos durante a divisão celular.

O gene MCPH1 é um dos genes responsáveis pela microcefalia vera, uma malforma-

ção cortical (100). Pacientes com microcefalia vera apresentam retardo mental, expressiva

redução do perímetro cefálico e as células desses pacientes possuem cromossomos con-

densados anormais. Wood et al. (73) identificaram que a principal interação da MCPH1

ocorre com o complexo da condensina II, através da subunidade NCAPG2. Tal interação

seria importante nos reparos do DNA durante a recombinação dos cromossomos homólo-

gos e na própria condensação dos cromossomos durante a mitose.

A relação direta do gene NCAPG2 com malformações corticais ainda não foi descrita,

mas devido a sua importante interação com o gene MCPH1, e a identificação de uma du-

plicação nesse gene em um paciente com esquizencefalia (Caso 239/08), ele se tornou um

potencial gene candidato às MDC.

5.5.2. Gene HAUS7

O gene HAUS7 é uma subunidade do complexo proteico de 390kD denominado com-

plexo HAUS e está localizado no cromossomo Xq28.

Esse complexo está envolvido diretamente com a geração e o desenvolvimento dos

microtúbulos, essenciais na organização do fuso mitótico.

Trabalhos com RNA de interferência mostram que a subunidade HAUS7 tem grande

importância no complexo proteico, e sua inibição causa desestabilização dos microtúbu-

los, fragmentação e aumento do tamanho dos centrossomos (101). Os microtúbulos são

de fundamental importância na manutenção do citoesqueleto e na migração celular, fato

Discussão 145

já comprovado através das recentes identificações de alterações nos genes da família das

tubulinas e sua relação com as malformações corticais (33).

O gene HAUS7 foi encontrado duplicado em dois pacientes com malformações corti-

cais, um com esquizencefalia bilateral de lábios fechados (Caso 904/01) e outro com HNP

e polimicrogiria (Caso 283/01). O paciente com esquizencefalia apresenta uma menor par-

te do gene duplicada, enquanto o paciente com HNP, além de apresentar grande parte do

gene HAUS7 duplicado, ainda apresenta uma duplicação no gene PLXNA1. As diferenças

das variações em relação ao gene HAUS7 e a presença de alterações em outros genes

(PLXNA1) poderiam explicar a grande diferença dos fenótipos dos pacientes.

5.5.3. Gene PLXNA1

Como mencionado acima, este gene foi identificado duplicado em um paciente com

HNP e polimicrogiria (Caso 283/01).

O gene PLXNA1 está localizado no cromossomo 3q21.3 e codifica uma proteína

transmembrana com alta expressão no cérebro durante o desenvolvimento. As plexinas

formam uma grande família de receptores que são expressos em neurônios, participando

da sinalização celular (102).

A PLXNA1 forma um complexo com a proteína NRP1 (Neuropilina 1) e o complexo

NRP1/PLXNA1 interage com a proteína SEMA3A (Semaphorina III), responsável pela orien-

tação do axônio (103).

A expressão da PLXNA1 já foi encontrada alterada em tumores e sua função foi relaci-

onada à proliferação celular (104).

Desse modo, a duplicação encontrada e a possível alteração na expressão da proteína

PLXNA1 poderiam estar relacionadas à malformação do paciente 283/01.

5.5.4. Gene TSNARE1

O gene TSNARE1 está localizado no cromossomo 8q24.3 e apesar de não haver relatos

na literatura relacionando esse gene a MDC, ele está envolvido com o transporte intrace-

lular de proteínas, função está já relacionada a distúrbios de migração neuronal.

Discussão 146

Assim como o gene TSNARE1, o gene ARFGEF2 participa do transporte de vesículas na

célula. Sheen et al. (12), identificaram uma forma autossômica recessiva de microcefalia

acompanhada de HNP causada por mutações no gene ARFGEF2. Tal estudo mostrou que o

transporte de vesículas é um importante regulador da proliferação e migração neuronal

durante o desenvolvimento do córtex cerebral.

Desse modo, a HNP encontrada no paciente (302/01) poderia estar relacionada à du-

plicação encontrada no gene TSNARE1, tornando-o um gene candidato para as malforma-

ções corticais.

5.5.5. Gene DAAM1

O gene DAAM1 foi encontrado duplicado em um paciente com HNP (Caso 524/09).

Este gene está localizado no cromossomo 14q23.1 e codifica uma proteína amplamente

expressa de 1078 aminoácidos.

O gene DAAM1 faz parte do grupo das “formin proteins”, proteínas citoplasmáticas

envolvidas na polimerização da actina, que promovem a organização do citoesqueleto.

Estudos mostraram que essa proteína participa de vias de sinalizações que promovem a

reorientação do centrossomo durante a migração celular (105) (106). Desse modo, a du-

plicação encontrada poderia ser uma das responsáveis pela falha na migração celular,

causando a HNP do paciente 524/09.

5.5.6. Gene ARX

O gene ARX foi encontrado deletado no mesmo paciente citado acima (Caso 524/09).

Este gene está localizado na região Xp22.3-p21.1 e a proteína codificada é expressa no

cérebro fetal e adulto.

O gene ARX tem importante papel na orientação do axônio, proliferação celular e mi-

gração neuronal. Mutações nesse gene já foram relacionadas a casos de lissencefalia com

genitália anormal (107), agenesia do corpo caloso com genitália anormal (108), epilepsias

e retardo mental ligado ao X (109). Homens com mutação no gene ARX são mais grave-

mente afetados, enquanto mulheres que carregam a mutação (heterozigotas) podem não

ter sintomas, ou ter fenótipos mais leves.

Discussão 147

Geralmente, mutações no gene ARX que levam a formação de uma proteína truncada

são responsáveis por fenótipos relacionados a malformações cerebrais. Já alterações que

causam expansão na região de polialanina da proteína estão relacionadas a fenótipos de

retardo mental sem malformações cerebrais associadas. As mutações missenses se divi-

dem entre os dois grupos, mas a gravidade do fenótipo aumenta quanto mais conservada

for a região que contém a variação (108).

Porém, Oegema et al. (75) identificaram uma inserção de seis pares de bases

(c.335ins6) no exon 2 do gene ARX, que aumenta o trato de polialanina, em um paciente

com HNP, polimicrogiria e agenesia do corpo caloso. Desta forma, o gene ARX parece es-

tar envolvido com uma variada gama de malformações corticais, incluindo a heterotopia

nodular periventricular, fenótipo encontrado no caso em questão.

5.6. Outros casos estudados por SNP-ARRAY

5.6.1. Paciente 271/09

O paciente 271/09, do sexo masculino, possui HSB. A alteração encontrada nesse pa-

ciente, duplicação na FLNA, é um caso inédito, nunca antes descrito na literatura. A técni-

ca de microarranjo possibilitou um melhor detalhamento dessa duplicação, identificada

primeiro pelo MLPA.

Pacientes do sexo masculino com HSB são raros, mas já foram relatados casos assim,

nos quais há evidências de mosaicismo somático para mutações nos gene DCX e LIS1 (22)

(90) explicando assim o fenótipo mais leve.

Alterações estruturais na FLNA já foram descritas em pacientes com HNP (110). Cla-

pham et al. (110), identificaram três famílias com deleções na FLNA: uma família possui

grande parte da região 3’ terminal do gene FLNA deletada; a segunda família possui uma

deleção na região 3’ terminal e uma parcial duplicação da região 5’ terminal e do gene

EMD; e a terceira família possui os genes FLNA e EMD inteiros deletados. Todos os indiví-

duos afetados do trabalho de Clapham (110) possuem HNP, nenhum deles possui HSB.

Discussão 148

Apesar da associação entre o gene FLNA e o espectro LIS-HSB nunca ter sido relatada,

há algumas evidências na literatura da associação entre a HNP e as vias moleculares de

LIS-HSB, por exemplo, heterotopias periventriculares foram descritas em alguns pacientes

com a síndrome de Miller-Dieker (111), além de um artigo recente ter mostrado uma de-

leção de YWHAE (um gene geralmente deletado na síndrome de Miller-Dieker e conside-

rado como modificador do quadro de agiria, tornando-o mais grave) em um paciente com

HNP (112).

Recentemente, novos trabalhos tem identificado o mesmo gene como responsável

por diferentes tipos de malformações, quebrando o paradigma de 1 gene=1 malformação.

Como o gene WDR62, que foi identificado alterado em pacientes com grande espectro de

malformações corticais, incluindo microlissencefalia, agiria, paquigiria, esquizencefalia e

microcefalia (52). Outro exemplo é o gene TUBA1A que foi encontrado alterado em um

paciente com agiria/paquigiria e em três pacientes de uma família, dois deles com quadro

de polimicrogiria perisilviana (53).

5.6.2. Paciente 1324/06

Foi identificada uma grande deleção na região 1p36 na paciente 1324/06, confirman-

do seu diagnóstico como portadora da síndrome da deleção do 1p36.

A síndrome da deleção do 1p36 é uma desordem descrita recentemente, considerada

a síndrome de deleção subtelomérica mais comum (1 em cada 5000 nascidos a 1 a 10000

nascidos) (76) (113). Deleções na região do 1p36.3 são responsáveis por 0.5% a 1.2% de

deficiência mental (114). No estudo de Battaglia et al. (114), 88% dos pacientes com essa

síndrome possuem anormalidades no sistema nervoso central, 44% dos pacientes apre-

sentam crises epilépticas e 2% dos pacientes apresentam paquigiria.

A paciente em questão tem um quadro de HSB, portanto, apesar da baixa frequência

de fenótipos do espectro LIS/HSB encontrada por Battaglia et al. (114), ela se enquadra na

descrição desta síndrome.

Além dessa deleção, também identificamos uma duplicação na região 4p16.3 de

14137,937kbp. Esta região abrange totalmente a região crítica para a síndrome de Wolf

Hirschhorn (WHS), uma síndrome rara de microdeleção em 4p16.3 bem caracterizada. A

Discussão 149

primeira região crítica, chamada de WHSCR1, é uma região de 165kpb distando aproxima-

damente 2Mb do telômero do cromossomo 4p e inclui os genes WHSC1 e WHSC2 (77) (78)

(79). A segunda região crítica é chamada de WHSCR2, inclui os genes WHSC1 e LETM1 e é

contínua com a região WHSCR1. O CNV do caso em questão abrange ambas as regiões.

Apesar da Síndrome de Wolf Hirschhorn ser bem caracterizada como uma síndrome de

deleção, duplicações nessa mesma região já foram descritas levando a um fenótipo mais

leve nos pacientes (115).

5.6.3. Paciente 523/01

Trata-se de uma paciente do sexo feminino com HSB que apresentou uma deleção de

1652,719kb na região 3q29. Esta deleção envolve os genes FBXO45, PAK2 e DLG1, já rela-

cionados à Síndrome de deleção do 3q29, e o gene RNF168, relacionado à síndrome de

RIDDLE, uma síndrome que leva a imunodeficiência, hipersensibilidade a radiação e difi-

culdade de aprendizado (116).

A maioria dos pacientes com a síndrome de deleção do 3q29 são casos esporádicos,

nos quais os indivíduos apresentam atraso no desenvolvimento e dimorfismos faciais. Po-

rém, recentemente, uma grande variedade de fenótipos, como autismo e esquizofrenia,

vem sendo relacionados a esta síndrome (117) (118).

O caso em questão apresenta HSB, ainda não relacionada na literatura às síndromes

descritas acima, porém, os genes envolvidos estão relacionados ao desenvolvimento neu-

ronal, atuando na sinalização celular, organização do citoesqueleto, proliferação celular e

sinaptogênese. Desse modo, é grande a probabilidade da deleção de tais genes estarem

relacionadas ao fenótipo da paciente. Além disso, a deleção do 3q29 já foi relatada em um

paciente com microcefalia, uma malformação cortical devido a distúrbios na proliferação

neuronal (80).

5.7. SNP-ARRAY: Perspectivas

Apesar da grande quantidade de achados interessantes de CNVs, ainda serão neces-

sários estudos para confirmação dessas alterações utilizando uma segunda técnica, como

Discussão 150

o PCR em tempo real (Real Time PCR). Os pais dos indivíduos com alterações no número

de cópias alélicas serão analisados para identificar se as alterações encontradas foram

herdadas ou são CNVs de novo.

A comparação dos achados desse trabalho com um grupo controle brasileiro, isto é,

de mesma origem étnica/geográfica, é de grande importância para aferir quanto das alte-

rações encontradas são variantes normais da população brasileira. Tal estudo já se encon-

tra em andamento por um grupo do nosso departamento.

Conclusão 151

6. CONCLUSÃO

6.1. HNP e FLNA

• Em oposição ao relatado por Masruha et al. (71), a mutação c.1286C>T no gene

FLNA foi encontrada em indivíduos do nosso grupo controle, e portanto trata-se, mais

provavelmente, de uma variante rara não patogênica.

• Confirmamos o relatado por Parrini et al. (14) que a mutação c.4543C>T no gene

FLNA está associada a HNP bilateral em mulheres.

• Confirmamos que pacientes com padrões de neuroimagem atípicos de HNP não

possuem mutações no gene FLNA.

6.2. Espectro LIS/HSB, LIS1 e DCX

• Observamos que mutações de ponto na sequencia do DNA do gene LIS1 não estão

relacionadas a LIS/HSB nos pacientes analisados.

• Identificamos duas novas mutações no gene DCX (c.993A>T e c.1047T>C) associa-

das a LIS/HSB nos pacientes.

• Confirmamos que alterações estruturais envolvendo os genes LIS1 e DCX são a

maior causa de LIS/HSB.

• Confirmamos que pacientes com lissencefalia com a região posterior do córtex

mais afetada tem maiores chances de apresentar variações estruturais no gene LIS1.

• Confirmamos que mulheres com HSB têm maiores chances de apresentar altera-

ções no gene DCX.

Conclusão 152

6.3. Achados nos genes da família das tubulinas

• Os genes pertencentes a esta família, TUBA1A, TUBB2B e TUBA8 não estão relacio-

nados ao espectro LIS/HSB ou esquizencefalia nos pacientes analisados.

6.4. Relação esquizencefalia e gene EMX2

• Confirmamos que o gene EMX2 não está relacionado à esquizencefalia nos pacien-

tes analisados.

6.5. Análise de CNV

• Identificamos seis potenciais genes candidatos para malformações do desenvolvi-

mento cortical através da análise genômica de CNVs (NCAPG2, HAUS7, TSNARE1, PLXNA1,

DAAM1 e ARX).

• Identificamos um caso inédito na literatura de um indivíduo com HSB que possui

uma duplicação parcial do gene FLNA.

• Identificamos duas síndromes de microdeleção: síndrome da deleção do 1p36 e

síndrome da microdeleção do 3q29 em pacientes com HSB.

Referências 153

7. REFERÊNCIAS

1. Delatycki MB, Leventer RJ. Listen carefully: LIS1 and DCX MLPA in lissencephaly and subcortica

band heterotopia. Eur J Hum Genet. 2009, Vol. 17.

2. Guerrini R, Marini C. Genetic malformations of cortical development. Exp Brain Res. 173, 2006,

Vol. 2.

3. Barkovich AJ, Guerrini R, Kuzniecky RI, Jackson GD, Dobyns WB. A developmental and genetic

classification for malformations of cortical development update 2012. Brain. 2012, Vols. 135:

1348-69.

4. Sahara S, O'Leary DDM. . Fgf10 regulates transition period of cortical stem cell differentiation to

radial glia controlling generation of neurons and basal progenitors. Neuron. 63, 2009, Vols. 1:48-

62.

5. Sidman RL and Rakic P. Neuronal migration with special reference to developing human brain: a

review. Brain Res. 1973, Vols. 62: 1-35.

6. Rikens. Laboratory for Developmental Neurobiolgy. New Discovery for Mechanism of Neuronal

Migration and Morphogenesis. [Online] julho 2008. [Cited: maio 30, 2013.]

http://www.brain.riken.jp/bsi-news/en/no40/research03.html.

7. Barkovich AJ, Kuzniecky RI, Dobyns WB, Jackson GD, Becker LE, Evrard P. A classification

scheme for malformations of cortical development. Neuropediatrics. 1996, Vols. 27:59-63.

8. Aronica E, Becker AJ and Spreafico R. Malformations of Cortical Development. Brain Pathology.

2012, Vols. 22:380-401.

9. Eksioglu YZ, Scheffer IE, Cardenas P, Knoll J, Di Mario F, Ramsby G. Periventricular heterotopia:

an X-linked dominant epilepsy locus causing aberrant cerebral cortical development. Neuron. 16,

1996, Vols. 1:77-87.

10. Fox JW, Lamperti ED, Eksioglu YZ, Hong SE, Feng Y, Graham DA. Mutations in filamin 1

prevent migration of cerebral cortical neurons in human periventricular heterotopia. Neuron.

1998, Vols. 21:1315-25.

Referências 154

11. Liu G, Thomas L, Warren RA, Enns CA, Cunningham CC, Hartwig JH. Cytoskeletal protein ABP-

280 directs the intracellular trafficking of furin and modulates proprotein processing in the

endocytic pathway. J. Cell Biol. 1997, Vols. 139: 1719–33.

12. Sheen VL, Ganesh VS, Topcu M, Sebire G, Bodell A, Hill RS et al. Mutations in ARFGEF2

implicate vesicle trafficking in neural progenitor proliferation and migration in the human cerebral

cortex. Nat. Genet. 2004, Vols. 36: 69–76.

13. Ferland RJ, Batiz LF, Neal J, Lian G, Bundock E, Lu J et al. Disruption of neural progenitors

along the ventricular and subventricular zones in periventricular heterotopia. Hum Mol Genet. 18,

2009, Vols. 3: 497–516.

14. Parrini E, Ramazzotti A, Dobyns WB, Mei D, Moro F, Veggiotti P et al. Periventricular

heterotopia: phenotypic heterogeneity and correlation with Filamin A mutations. Brain. 2006,

Vols. 129: 1892–906.

15. Barkovich AJ, Raybaud CA. Malformations of cortical development. Neuroimag Clin N Am.

2004, Vols. 14: 401– 423.

16. Guerrini R, Parrini E. Neuronal migration disorders. Neurobiology of Disease. 2010, Vols. 38:

154–166.

17. Dobyns WB, Reiner O, Carrozzo R, Ledbetter DH. Lissencephaly. A human brain malformation

associated with deletion of the LIS1 gene located at chromosome 17p13. JAMA. 1993, Vols.

270:2838–42.

18. Gressens P, Passemard S, Sebag G, Chalard F, Laquerriere A. Double Cortex. Elsevier Ltd. 2009,

pp. 621-626.

19. Reiner O, Carrozzo R, Shen Y, Wehnert M, Faustinella F, Dobyns WB, Caskey CT, Ledbetter

DH. Isolation of a Miller-Dieker lissencephaly gene containing G protein beta-subunit-like repeats.

Nature. 19, 1993, Vols. (6439):717-21, 364.

20. Gleeson JG, Allen KM, Fox JW, Lamperti ED, Berkovic S, Scheffer I et al. doublecortin, a Brain-

Specific Gene Mutated in Human X-Linked Lissencephaly and Double Cortex Syndrome, Encodes a

Putative Signaling Protein. Cell. 1998, Vols. 92: 63–72.

21. Pilz DT, Macha ME, Precht KS, Smith ACM, Dobyns WB,. Ledbetter DH. Fluorescence in situ

hybridization analysis with US1 specific probes reveals a high deletion mutation rate in isolated

lissencephaly sequence. Goleh'cs in Medicine. 1, 1998.

Referências 155

22. D'agostino MD, Bernasconi A, Das S, Bastos A, Valerio RM , Palmini A et al. Subcortical Band

Heterotopia (SBH) in males: clinical, imaging and genetics findings in comparison with females.

BRAIN. V. 2002, Vols. PT11: 2507-22.

23. Quelin C, Saillour Y, Souville I, Poirier K, N’Guyen-Morel MA, Vercueil L et al. Mosaic DCX

deletion causes subcortical band heterotopia in males. Neurogenetics. 2012, Vols. 13: 367–373.

24. Sasaki S, Shionoya A, Ishida M, Gambello MJ, Yingling J, Wynshaw-Boris A et al. A

LIS1/NUDEL/Cytoplasmic Dynein Heavy Chain Complex in the Developing and Adult Nervous

System. Neuron. 2000, Vols. 28: 681–696.

25. Mei D, Lewis R, Parrini E, Lazarou LP, Marini C, Pilz DT et al. High frequency of genomic

deletions—and a duplication—in the LIS1 gene in lissencephaly: implications for molecular

diagnosis. J Med Genet. 2008, Vols. 45: 355–361.

26. Haverfield EV, Whited AJ, Petras KS, Dobyns WB, Das S. Intragenic deletions and duplications

of the LIS1 and DCX genes: a major disease-causing mechanism in lissencephaly and subcortical

band heterotopia. Eur J Hum Genet. 2009, Vols. 17: 911 – 18.

27. Hirotsune S, Fleck MW, Gambello MJ, Bix GJ, Chen A, Clark GD et al. Graded reduction of

Pafah1b1 (Lis1) activity results in neuronal migration defects and early embryonic lethality. Nature

Genet. 1998, Vols. 19: 333-339.

28. Cahana A, Escamez T, Nowakowski RS, Hayes NL, Giacobini M, von Holst A. Targeted

mutagenesis of Lis1 disrupts cortical development and LIS1 homodimerization. Proc. Nat. Acad.

Sci. 2001, Vols. 98:6429-34.

29. Gleeson JG, Lin PT, Flanagan LA, Walsh CA. Doublecortin Is a Microtubule-Associated Protein

and Is Expressed Widely by Migrating Neurons. Neuron. 1999, Vols. 23: 257–271.

30. Matsumoto N, Leventer RJ, Kuc JA, Mewborn SK, Dudlicek LL, Ramocki MB et al. Mutation

analysis of the DCX gene and genotype/phenotype correlation in subcortical band heterotopia. Eur

J Hum Genet. 2001, Vols. 9: 5– 12.

31. Bai J, Ramos RL, Ackman JB, Thomas AM, Lee RV, Lo Turco JJ. RNAi reveals doublecortin is

required for radial migration in rat neurocortex. Nature Neuroscience. 6, 2003, Vols. 12: 1277-83.

32. Caspi M, Atlas R, Kantor A, Sapir T, Reiner O. Interaction between LIS1 e doubleocortin, two

lissencephaly gene products. . Hum Mol Genet. 9, 2000, Vols. 15: 2205-13.

33. Poirier K, Keays DA, Francis F, Saillour Y, Bahi N, Manouvrier S et al. Large spectrum of

lissencephaly and pachygyria phenotypes resulting from de novo missense mutations in tubulin

alpha 1A (TUBA1A). Human Mutation. 28, 2007, Vols. 11: 1055-64.

Referências 156

34. Keays DA, Tian G, Poirier K, Huang GJ, Siebold C, Cleak J et al. Mutations in alpha-tubulin

cause abnormal neuronal migration in mice and lissencephaly in humans. Cell . 2007, Vols. 128:

45–57.

35. Bahi-Buisson N, Poirier K, Boddaert N, Saillour Y, Castelnau L, Philip N et al. Refinement of

cortical dysgeneses spectrum associated with TUBA1A mutations. J Med Genet. 2008, Vols. 45:

647–653.

36. Kumar RA, Pilz DT, Babatz TD, Cushion TD, Harvey K, Topf M. TUBA1A mutations cause wide

spectrum lissencephaly (smooth brain) and suggest that multiple neuronal migration pathways

converge on alpha tubulins. Hum Mol Genet. 19, 2010, Vols. 14 :2817-27.

37. Fallet-Bianco C, Loeuillet L, Poirier K, Loget P, Chapon F, Pasquier L et al. Neuropathological

phenotype of a distinct form of lissencephaly associated with mutations inTUBA1A. Brain. 2008,

Vols. 131: 2304-20 .

38. Lecourtois M, Poirier K, Friocourt G, Jaglin X, Goldenberg A, Saugier-Veber P et al. Human

lissencephaly with cerebellar hypoplasia due to mutations in TUBA1A: expansion of the foetal

neuropathological phenotype. Acta Neuropathol. 2010, Vols. 119:779–89 .

39. Morris-Rosendahl DJ, Najm J, Lachmeijer AMA, Sztriha L, Martins M, Kuechler A et al.

Refining the phenotype of a-1a Tubulin (TUBA1A) mutation in patients with classical lissencephaly.

Clin Genet. 2008, Vols. 74: 425–33.

40. Brunelli S, Faiella A, Capra V, Nigro V, Simeone A, Cama A et al. Germline mutation in the

homeobox gene EMX2 in patients with severe schizencephaly. Nature Genet. 1996, Vols. 12: 94-6.

41. Barkovich AJ, Kuzniecky RI, Jackson GD, Guerrini R, Dobyns WB. Classification system for

malformations of cortical development – update 2001. Neurology. 2001, Vols. 57: 2168-78.

42. Merello E, Swanson E, De Marco P, Akhter M, Striano P, Rossi A, et al. No major role for the

EMX2 gene in schizencephaly. Am J Med Genet. 2008, Vols. 146A: 1142–50.

43. Tietjen I, Bodell A, Apse K, Mendonza AM, Chang BS, Shaw GM, Barkovich AJ, Lammer EJ,

Walsh CA. Comprehensive EMX2 genotyping of a large schizencephaly case series. Am J Med

Genet. Part A, 2007, Vols. 143A:1313–16.

44. Hosley MA, Abroms IF, Ragland RL. Schizencephaly: case report of familial incidence. Pediatr

Neurol. 1992, Vols. 8:148–150.

45. Faiella A, Brunelli S, Granata T, D’Incerti L, Cardini R, Lenti C et al. A number of schizencephaly

patients including 2 brothers are heterozigous for germline mutations in the homeobox gene

EMX2. Eur J Hum Gent. 1997, Vols. 5:186-190.

Referências 157

46. Granata T, Fariana L, Faiella A, Cardini R, D’Incerti L, Boncinelli E et al. Familial schizencephaly

associated with EMX2 mutation. Neurology. 1997, Vols. 48: 1403-06.

47. Simeone A, Gulisano M, Acampora D, Stornaiuolo A, Rambaldi M, Boncinelli E. Two

vertebrate homeobox genes related to the Drosophila empty spiracles gene are expressed in the

embryonic cerebral cortex. EMBO J. 1992, Vols. 11:2541–50.

48. Bayatti N, Sarma S, Shaw C, Eyre JA, Vouyiouklis DA, Lindsay S et al. Progressive loss of PAX6,

TBR2, NEUROD and TBR1 mRNA gradients correlates with translocation of EMX2 to the cortical

plate during human cortical development. European Journal of Neuroscience. 2008, Vols. 28:1449-

56.

49. Hamasaki T, Leingartner A, Ringstedt T, O’Leary DD. EMX2 regulates sizes and positioning of

the primary sensory and motor areas in neocortex by direct specification of cortical progenitors.

Neuron. 2004, Vols. 43: 359–72.

50. Hehr U, Pineda-Alvarez DE, Uyanik G , Hu P, Zhou N, Hehr A et al. Heterozygous mutations in

SIX3 and SHH are associated with schizencephaly and further expand the clinical spectrum of

holoprosencephaly. Hum Genet. 2010, Vols. 127:555–561.

51. Chiara MM, Walsh CA. What disorders of cortical development tell us about the cortex: one

plus one does not always make two. Current Opinion in Genetics & Development . 2011, Vols.

21:333–339.

52. Bilguvar K, Ozturk AK, Louvi A, Kwan KY, Choi M, Tatli B, et al. Whole exome sequencing

identifies recessive WDR62 mutations in severe brain malformations. Nature. 467, 2010 , Vols.

7312: 207–10.

53. Jansen AC, Oostra A, Desprechins B, De Vlaeminck Y, Verhelst,H, Regal L et al. TUBA1A

mutations: From isolated lissencephaly to familial polymicrogyria. Neurology . 2011, Vols. 76: 988-

92.

54. Romaniello R, Tonelli A, Arrigoni F, Baschirotto C, Triulzi F, Bresolin N et al. A novel mutation

in the b-tubulin gene TUBB2B associated with complex malformation of cortical development and

deficits in axonal guidance. Developmental Medicine & Child Neurology. 2012, Vol. Case Report.

55. Jaglin XH, Poirier K, Saillour Y, Buhler E, Tian G, Bahi-Buisson N. Mutations in the beta-tubulin

gene TUBB2B result in asymmetrical polymicrogyria. Nat Genet. 41, 2009, Vols. 6 :746-52.

56. Abdollahi MR, Morrison E, Sirey T, Molnar Z, Hayward BE, Carr IM et al. Mutation of the

variant alpha-tubulin TUBA8 results in polymicrogyria with optic nerve hypoplasia. Am J Hum

Genet. 85, 2009, Vols. 5:737-44.

Referências 158

57. Feuk L, Carson AR, Scherer SW. Structural variation in the human genome. Nat Rev Genet. 7,

2006 , Vols. 2:85-97, Review.

58. Venter JC, Adams MD, Myers EW, Li PW, Mural RJ, Sutton GG et al. The sequence of the

human genome. . Science. 2001, Vols. 291: 1304–51.

59. Consortium., International HapMap. A haplotype map of the human genome. Nature. 2005,

Vols. 437: 1299–320.

60. Hinds DA, Stuve LL, Nilsen GB, Halperin E, Eskin E, Ballinger DG et al. Whole-genome patterns

of common DNA variation in three human populations. Science. 2005, Vols. 307: 1072–79.

61. Pinto D, Marshall C, Feuk L, Scherer SW. Copy-number variation in control population cohort.

Human Molecular Genetics. 2007, Vols. 16:168–73, Review.

62. Hochstenbach R, Buizer-Voskamp JE, Vorstman JAS, Ophoff RA. Genome Arrays for the

Detection of Copy Number Variations in Idiopathic Mental Retardation, Idiopathic Generalized

Epilepsy and Neuropsychiatric Disorders: Lessons for Diagnostic Workflow and Research.

Cytogenet Genome Res. 2011, Vols. 135: 174-202.

63. Kariminejad R, Lind-Thomsen A, Tumer Z, Erdogan F, Ropers HH, Tommerup N, et al. High

Frequency of Rare Copy Number Variants Affecting Functionally Related Genes in Patients with

Structural Brain Malformations. Human Mutation. 12, 2011, Vols. 32: 1427-35.

64. Valduga M, Philippe C, Bach Segura P, Thiebaugeorges O, Miton A, Beri , et al. A retrospective

study by oligonucleotide array-CGH analysis in 50 fetuses with multiple malformations. Prenat

Diagn . 2010, Vols. 30: 333–341.

65. Griswold AJ, Ma D, Cukier HN, Nations LD, Schmidt MA, Chung HR et al. Evaluation of copy

number variations reveals novel candidate genes in autism spectrum disorder-associated

pathways. Hum. Mol. Genet. 21, 2012 , Vols. 15: 3513-23. .

66. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with terminating inhibitors. Proc Natl Acad

Sci USA. 1977, Vols. 74: 5463-67.

67. Thusberg J, Olatubosu AI, Vihinen M. Performance of Mutation Pathogenicity Prediction

Methods on Missense Variants. Human Mutation. 4, 2011, Vols. 32: 358 – 68.

68. Grantham R. Amino Acid Difference Formula to Help Explain Protein Evolution. Science. 1974,

Vols. 185: 862-864.

69. Iafrate AJ, Feuk L, Rivera MN, Listewnik ML, Donahoe PK, Qi Y et al. Detection of large-scale

variation in the human genome. Nat Genet. 2004 , Vols. 9:949-51.

Referências 159

70. Zhang J, Feuk L, Duggan GE, Khaja R, Scherer SW. Development of bioinformatics resources

for display and analysis of copy number and other structural variants in the human genome. .

Cytogenet Genome Res. 2006, Vols. 3-4:205-14.

71. Masruha MR, Caboclo LO, Carrete H Jr, Cendes IL, Rodrigues MG, Garzon E et al. Mutation in

Filamin A Causes Periventricular Heterotopia, Developmental Regression, and West Syndrome in

Males. Epilepsia. 47, 2006, Vols. 1: 211–14.

72. Girirajan S, Campbell CD, Eichler EE. Human Copy Number Variation and Complex Genetic

Disease. Annu. Rev. Genet. 2011, Vols. 45:203–26.

73. Wood JL, Liang Y, Li Kaiyi, Chen J. Microcephalin/MCPH1 associates with the condensin II

complex to function in homologous recombination repair. J Biol Chem. 2008, Vols. 43:29586-92.

74. Goshima G, Mayer M, Zhang N, Stuurman N, Vale RD. Augumin: a protein complex required

for centrosome-independent microtubule generation within the spindle. J. Cell Biol. 2008, Vols.

181: 421-29.

75. Oegema R, Maat-Kievit A, Lequin MH, Schot R, Neste VMHN, Doornbos ME, Wit MCY, Halley

DJ, Mancini GMS. Asymmetric polymicrogyria and periventricular nodular heterotopia due to

mutation in ARX. Am J Med Genet . 158A, 2012, Vols. 6:1472-6.

76. Shapira SK, McCaskill C, Northrup H, et al. Chromosome 1p36 deletions: the clinical

phenotype and molecular characterization of a common newly delineated syndrome. Am J Hum

Genet. 61, 1997, Vols. 3: 642–50.

77. Wright TJ, Ricke DO, Denison K, Abmayr S, Cotter PD, Hirschhorn K et al. A transcript map of

the newly defined 165kb Wolf–Hirschhorn syndrome critical region. . Hum Mol Genet. 1997, Vols.

6:317-24.

78. Wright TJ, Costa JL, Naranjo C, Francis-West P, Altherr MR. Comparative analysis of a novel

gene from the Wolf–Hirschhorn/Pitt-Rogers-Danks syndrome critical region. Genomics. 1999, Vols.

59:203–12.

79. Stec I, Wright TJ, vanOmmenGJ, de Boer PA, van Haeringen A, Moorman AF et al. WHSC1, a

90kb SET domaincontaining gene, expressed in early development and homologous to a

Drosophila dysmorphy gene maps in the Wolf–Hirschhorn syndrome critical region and is fused to

IgH i t(4;14) multiple myeloma. Hum Mol Genet. 1998, Vols. 7:1071-82.

80. Willatt L, Cox J, Barber J, Cabanas ED, Collins A, Donnai D et al. 3q29 microdeletion syndrome:

clinical and molecular characterization of a new syndrome. Am. J. Hum. Genet. 2005, Vols. 77: 154-

60.

Referências 160

81. Li F, Lisi EC, Wohler ES, Hamosh A, Batista DAS. 3q29 interstitial microdeletion syndrome: an

inherited case associated with cardiac defect and normal cognition. Europ. J. Med. Genet. 2009,

Vols. 52: 349-53.

82. Robertson SP, Twigg SRF, Sutherland-Smith AJ, Biancalana V, Gorlin RJ, Horn D et al. OPD-

spectrum Disorders Clinical Collaborative Group, Wilkie, A. O. M. Localized mutations in the gene

encoding the cytoskeletal protein filamin A cause diverse malformations in humans . Nature

Genet. 2003, Vols. 33: 487-91.

83. Sheen VL, Dixon PH, Fox JW, Hong SE, Linton L, Sisodiya SM, et al. Mutations in the X-linked

filamin 1 gene cause periventricular nodular heterotopia in males as well as in females. . Hum Mol

Genet. 2001, Vols. 10: 1775-83.

84. Moro F, Carrozzo R, Veggiotti P, Tortorella G, Toniolo D, Volzone A, Guerrini R. Familial

periventricular heterotopia. Missense and distal truncating mutations of the FLN1 gene.

Neurology. 2002, Vols. 58: 916–21.

85. Tsuneda SS, Torres FR, Montenegro MA, Guerreiro MM, Cendes F, Lopes-Cendes I. A New

Missense Mutation Found in the FLNA Gene in a Family with Bilateral Periventricular Nodular

Heterotopia (BPNH) Alters the Splicing Process. Journal of Molecular Neuroscience. 2008, Vols. 34:

1-7.

86. Dobyns WB, Truwit CL, Ross ME, Matsumoto N, Pilz DT, Ledbetter DH, et al. Differences in

the gyral pattern distinguish chromosome 17-linked and X-linked lissencephaly. Neurology. 1999,

Vols. 53:270-77.

87. Cardoso C, Leventer RJ, Matsumoto N, Kuc JA, Ramocki MB, Mewborn SK, et al. The location

and type of mutation predict malformation severity in isolated lissencephaly caused by

abnormalities within the LIS1 gene. Hum Mol Genet. 9, 2000 , Vols. 20:3019-28.

88. Uyanik G, Morris-Rosendahl DJ, Stiegler J, Klapecki J, Gross C, Berman Y et al. Location and

type of mutation in the LIS1 gene do not predict phenotypic severity. Neurology. 69, 2007 , Vols.

5:442-7.

89. Saillour Y, Carion N, Quelin C, Leger PL, Boddaert N, Elie C et al. LIS1-related isolated

lissencephaly: spectrum of mutations and relationships with malformation severity. Arch Neurol.

66, 2009 , Vols. 8:1007-15.

90. Pilz DT, Kuc J, Matsumoto N, Bodurtha J, Bernadi B, Tassinari CA et al. Subcortical band

heterotopia in rare affected males can be caused by missense mutations in DCX (XLIS) or LIS1. Hum

Mol Genet. 8, 1999 , Vols. 9:1757-60.

Referências 161

91. Bahi-Buisson N, Souville I, Fourniol FJ, Toussaint A, Moores CA, Houdusse A et al. New

insights into genotype–phenotype correlations for the doublecortin-related. Brain. 2013, Vols.

136:223-44.

92. Lo Nigro C, Chong CS, Smith AC, Dobyns WB, Carrozzo R, Ledbetter DH. Point mutations and

an intragenic deletion in LIS1, the lissencephaly causative gene in isolated lissencephaly sequence

and Miller-Dieker syndrome. Hum Mol Genet. 6, 1997 , Vols. 2:157-6.

93. Pilz DT, Matsumoto N, Minnerath S, Mills P, Gleeson JG, Allen KM, Walsh CA, Barkovich AJ et

al. LIS1 and XLIS (DCX) mutations cause most classical lissencephaly, but different patterns of

malformation. . Hum Mol Genet. 7, 1998, Vols. 13:2029-37.

94. des Portes V, Pinard JM, Billuart P, Vinet MC, KoulakoV A, Carrie A et al. A novel CNS gene

required for neuronal migration and involved in X-linked sub-cortical laminar heterotopia and

lissencephaly syndrome. . Cell. 1998, Vols. 92:51–61.

95. Guerrini R, Mei D, Cordelli DM, Pucatti D, Franzoni E, Parrini E. Symmetric polymicrogyria and

pachygyria associated with TUBB2B gene mutations. Eur J Hum Genet. 20, 2012 , Vols. 9:995-8. .

96. Sohal APS, Montgomery T, Mitra D, Ramesh V. TUBA1A Mutation-Associated Lissencephaly:

Case Report and Review of the Literature. Pediatric Neurology . 2012, Vols. 46: 127-131.

97. Liewluck T, Sacharow SJ, Fan Y, Lopez-Alberola R. A Novel Sporadic 614-Kb Duplication of the

22q11.2 Chromosome in a Child With Amyoplasia. Journal of Child Neurology. 26, 2011, Vols.

8:1005-1008.

98. Cushion TD, Dobyns WB, Mullins JGL, Stoodley N, Chung SK, Fry AE et al. Overlapping cortical

malformations and mutations in TUBB2B and TUBA1A. Brain . 2013, Vols. 136: 536–548.

99. Cederquist GY, Luchniak A, Tischfield MA, Peeva M, Song Y, Menezes MP et al. An inherited

TUBB2B mutation alters a kinesin-binding site and causes polymicrogyria, CFEOM and axon

dysinnervation. . Human Molecular Genetics. 26, 2012, Vols. 21: 5484–5499.

100. Jackson AP, Eastwood H, Bell SM, Adu J, Toomes C, Carr IM et al. Identification of

microcephalin, a protein implicated in determining the size of the human brain. . Am. J. Hum.

Genet. 2002, Vols. 71: 136-142.

101. Lawo S, Bashkurov M, Mullin M, Gomez Ferreria M, Kittler R, Habermann B et al. HAUS, the

8-subunit human augmin complex, regulates centrosome and spindle integrity. Curr. Biol. 2009,

Vols. 19:816-26.

Referências 162

102. Tamagnone L, Artigiani S, Chen H, He Z, Ming GI, Song H et al. Plexins are a large family of

receptors for transmembrane, secreted, and GPI-anchored semaphorins in vertebrates. . Cell. 99,

1999 , Vols. 1:71-80.

103. Takahashi T, Fournier A, Nakamura F, Wang LH, Murakami Y, Kalb RG, Fujisawa H,

Strittmatter S M. Plexin-neuropilin-1 complexes form functional semaphorin-3A receptors. . Cell.

1999, Vols. 99: 59-69.

104. Zhao XY, Chen L, Li YH, Xu Q. PlexinA1 expression in gastric carcinoma and its relationship

with tumor angiogenesis and proliferation. . World J Gastroentero. 13, 2007 , Vols. 48:6558-61.

105. Ang SF, Zhao ZS, Lim L, Manser E. DAAM1 is a formin required for centrosome re-orientation

during cell migration. . PLoS One. 5, 2010, Vol. 9.

106. Liu W, Sato A, Khadka D, Bharti R, Diaz H, Runnels LW et al. Mechanism of activation of the

formin protein Daam1. . PNAS. 2008, Vols. 105: 210-15.

107. Kitamura K, Yanazawa M, Sugiyama N, Miura H, Iizuka-Kogo A, Kusaka M, et al. Mutation of

ARX causes abnormal development of forebrain and testes in mice and X-linked lissencephaly with

abnormal genitalia in humans. Nat Genet. 32, 2002 , Vols. 3:359-69.

108. Kato M, Das S, Petras K, Kitamura K, Morohashi K, Abuelo DN et al. Mutations of ARX are

associated with striking pleiotropy and consistent genotype-phenotype correlation. Hum Mutat.

23, 2004 , Vols. 2:147-59.

109. Bienvenu T, Poirier K, Friocourt G, Bahi N, Beaumont D, Fauchereau F et al. ARX, a novel

Prd-class-homeobox gene highly expressed in the telencephalon, is mutated in X-linked mental

retardation. . Hum Mol Genet. 11, 2002 , Vols. 8:981-91.

110. Clapham KR, Yu TW, Ganesh VS, Barry B, Chan Y, Mei D et al. FLNA genomic rearrangements

cause periventricular nodular heterotopia. Neurology. 78, 2012, Vol. 269.

111. Dobyns WB, Curry CJ, Hoyme HE, Turlington L, Ledbetter DH. Clinical and molecular

diagnosis of Miller-Dieker syndrome. Am J Hum Genet. 1991, Vols. 48: 584- 594.

112. Mignon-Ravix C, Cacciagli P, El-Waly B, Moncla A, Milh M, Girard N, et al. Deletion of

YWHAE in a patient with periventricular heterotopias and pronounced corpus callosum hipoplasia.

J Med Genet. 47, 2010, Vols. 2:132-6.

113. Heilstedt HA, Ballif BC, Howard LA, Kashorf CD, Shaffer LG. Population data suggest that

deletions of 1p36 are a relatively common chromosome abnormality. Clin Genet. 64, 2003, Vols. 4:

310–316.

Referências 163

114. Battaglia A, Hoyme HE, Dallapiccola B, Zackai E, Hudgins L, McDonald-McGinn D et al.

Further Delineation of Deletion 1p36 Syndrome in 60 Patients: A Recognizable Phenotype and

Common Cause of Developmental Delay and Mental Retardation. Pediatrics . 2008, Vol. 121.

115. Carmany EP, Bawle EV. Microduplication of 4p16.3 due to na unbalanced translocation

resulting in a mild phenotype. Am J Med Genet A. 155A, 2011 , Vols. 4:819-24.

116. Stewart GS, Stankovic T, Byrd PJ, Wechsler T, Miller ES, Huissoon A et al. RIDDLE

immunodeficiency syndrome is linked to defects in 53BP1-mediated DNA damage signaling. . Proc.

Nat. Acad. Sci. . 2007, Vols. 104: 16910-5.

117. Carroll LS, Williams HJ, Walters J, Kirov G, O'Donovan MC, Owen MJ. Mutation screening of

the 3q29 microdeletion syndrome candidate genes DLG1 and PAK2 in schizophrenia. . Am J Med

Genet B Neuropsychiatr Genet. 156B, 2011 , Vols. 7:844-9.

118. Sagar A, Bishop JR, Tessman DC, Guter S, Martin CL, Cook EH. Co-occurrence of autism,

childhood psychosis, and intellectual disability associated with a de novo 3q29microdeletion. . Am

J Med Genet A. . 161, 2013 , Vols. 4:845-9.

Referências 164

Anexos 165

8. ANEXOS

8.1. Anexo 1: Cromatogramas dos sequenciamentos mostrando varian-

tes neutras

Figura 35: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a alteração c.374-19G>A (círculo vermelho) no intron 2 do gene FLNA.

Figura 36: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando as alterações c.869-41C>T e c.869-28C>G (círculos vermelhos) no intron 5 do gene FLNA.

Anexos 166

Figura 37: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de uma citosina por uma timina, c.7732+11C>T, (círculo vermelho) no intron 47 do gene FLNA.

Figura 38: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de uma citosina por uma timina, c.1998C>T, (círculo vermelho) no exon 13 do gene FLNA.

Figura 39: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de uma guanina por uma adenina, c.4920G>A, (círculo vermelho) no exon 29 do gene FLNA.

Anexos 167

Figura 40: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de uma timina por uma citosina, c.6075T>C (círculo vermelho) no exon 36 do gene FLNA.

Figura 41: Cromatograma do sequenciamento automático mostando a substituição de uma citosi-na por uma timina (círculo vermelho) no intron 6 do gene LIS1, c.568+27C>T.

Anexos 168

Figura 42:Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a substituição de uma citosi-na por uma timina, c.1805C>T, (círculo vermelho) no exon 11 do gene LIS1.

Figura 43: Cromatograma mostrando a substituição de uma guanina por uma adenina, c.948+29G>A, (círculo vermelho) no intron 2 do gene DCX.

Figura 44: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de guanina para citosina, c.453G>C, (círculo vermelho) no exon 4 do gene TUBA1A.

Anexos 169

Figura 45: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de adenina por uma guanina, c.288A>G (círculo vermelho) no exon 3 do gene TUBA1A.

Figura 46: A - Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de uma timina por uma citosina, c.510T>C, (círculo vermelho) e a troca de uma guanina por uma adenina,

c.522G>A, (círculo azul) no exon 4 do gene TUBA1A. B- Cromatograma de um indivíduo que possui a sequencia considerada normal.

Figura 47: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de uma citosina por uma timina, c.73C>T, (círculo vermelho) no exon 1 do gene TUBB2B.

Anexos 170

Figura 48: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de uma timina por uma citosina, c.93T>C, (círculo vermelho) no exon 1 do gene TUBB2B.

Figura 49: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de uma timina por uma citosina, c.141T>C, (círculo vermelho) no exon 1 do gene TUBB2B.

Figura 50: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de uma timina por uma citosina, c.20T>C, (círculo vermelho) na região que precede o gene TUBB2B.

Anexos 171

Figura 51: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de uma citosina por uma guanina, g.1338C>G, (círculo vermelho) no intron 1do gene TUBB2B.

Figura 52: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a troca de uma guanina por uma citosina, g.1373G>C, (círculo vermelho) no intron 1do gene TUBB2B.

Figura 53: A- Cromatograma do sequenciamento automático mostrando um indivíduo com a dele-ção g.3784_3785delTG e B- Sequencia normal, sem a deleção dos nucleotídeos TG.

A B

Anexos 172

Figura 54: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando troca de uma guanina por uma adenina, c.58-70G>A, no intron 3 do gene TUBB2B.

Figura 55: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando troca de uma citosina por uma timina, c.166+22C>T, no intron 4 do gene TUBB2B.

Figura 56: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando troca de uma guanina por uma timina, c.564G>T, no exon 6 do gene TUBB2B.

Anexos 173

Figura 57: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a deleção de uma timina, g.8144delT, (círculo mostra a presença de 8 timinas ao invés de 9) no exon 6 do gene TUBB2B.

Figura 58: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a inserção de um CG, g.8341_8342insCG, e a mudança no quadro de leitura da sequencia no exon 6 do gene TUBB2B.

Anexos 174

Figura 59: inserção de CC no gene TUBB2B, g.833_834insCC.

Figura 60: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando deleção de três nucleotídeos (GGA), g.18639_18641delGGA, no intron 3 do gene TUBA8 e a mudança no quadro de leitura da

sequencia.

Anexos 175

Figura 61: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando troca uma citosina por uma timina, c.2071C>T, no exon 5 do gene TUBA8 (círculo vermelho).

Figura 62: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando troca uma citosina por uma timina, c.1969C>T, no exon 5 do gene TUBA8 (círculo vermelho).

Figura 63: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a alteração c.1613C>T no exon 5 do gene TUBA8 (círculo vermelho).

Anexos 176

Figura 64: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a substituição de uma gua-nina por uma adenina (círculo vermelho) no exon 1 do gene EMX2, c.865G>A.

Figura 65: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a substituição c.1290C>A no exon 2 do gene EMX2

Figura 66: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a substituição c.1370C>A no exon 2 do gene EMX2

Anexos 177

Figura 67: Cromatograma do sequenciamento automático mostrando a alteração c.592-10T>A (círculo vermelho) no intron 2 do gene EMX2.

Anexos 178

8.2. Anexo 2: Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de

Ciências Médicas da UNICAMP

Anexos 179

Anexos 180

8.3. Anexo 3: Formulário de consentimento

FORMULÁRIO DE CONSENTIMENTO PARA PESQUISA MÉDICA, Página 1 de 3 Título do projeto: Estudos de mutações em genes responsáveis por diferentes formas de desor-dens do desenvolvimento cortical Investigador principal: Dra. Iscia Lopes Cendes OBJETIVO DA PESQUISA: Eu entendo que fui convidado(a) a participar de um projeto de pesquisa envolvendo pacientes e famílias com suspeita clínica de malformações cerebrais. O objetivo geral do estudo é comprovar a presença de defeitos no DNA que podem ser os responsáveis por estas malformações em nossa amostra de pacientes. Esses estudos poderão levantar dados que possibilitarão um conhecimento mais aprofundado sobre as estas malformações de um modo geral. Tanto as amostras de DNA, de linhas celulares e a informação médica que forem obtidas para este estudo, poderão ser comparti-lhadas com outros pesquisadores, podendo assim ser utilizadas eventualmente para outros fins de pesquisa destas desordens. O sigilo será mantido em todos os estudos colaborativos através da utilização de um código para a identificação dos indíviduos participantes. PROCEDIMENTO: Entendo que se eu concordar em participar desse estudo, os pesquisadores participantes farão perguntas a respeito dos meus antecedentes médicos e familiais. Eu serei submetido a um exame físico e neurológico para confirmar meu estado clínico. Além disso, poderei ser submetido a exa-mes subsidiários laboratoriais, e/ou de imagem (como tomografia computadorizada ou a uma ressonância magnética de crânio). Uma amostra de sangue será colhida (20 a 30 ml, o equivalente a duas colheres de sopa). Hospitalização não será necessária. Os precedimentos mencionados acima, serão realizados dentro do primeiro ano após o consentimento em participar no estudo e, com exceção da coleta de amostra de sangue, fazem parte dos cuidados médicos de rotina para um paciente com digenesia cortical. Porém, a pesquisa laboratorial utilizando as amostras de san-gue poderá ser feita durante um período máximo de 30 anos após a coleta. As células que por ventura forem isoladas do sangue do propósito serão preservadas para utilização durante todo o estudo e depois que ele se completar serão destruídas. RISCO E DESCONFORTO Uma coleta de 20 a 30 ml de sangue será efetuada. Os riscos associados a esse procedimento são mínimos, podendo ocorrer dor e manchas roxas (equimoses) no local da coleta de sangue. O des-conforto será mínimo pois se trata de uma coleta de sangue geralmente da veia do braço que será realizado por profissional treinado e devidamente habilitado para realizar esse procedimento.

Anexos 181

FORMULÁRIO DE CONSENTIMENTO PARA PESQUISA MÉDICA, Página 2 de 3 Título do projeto: Estudos de mutações em genes responsáveis por diferentes formas de desor-dens do desenvolvimento cortical Investigador principal: Dra. Iscia Lopes Cendes VANTAGENS: Entendo que não obterei nenhuma vantagem direta com a participação neste estudo e que o di-agnóstico e o tratamento provavelmente não serão modificados. Os resultados dos testes molecu-lares que por ventura forem obtidos, estarão disponíveis através do acompanhamento no ambula-tório de origem. SIGILO Entendo que toda a informação médica, assim como o resultados dos testes genéticos decorrentes desse projeto de pesquisa, farão parte do prontuário médico do propósito e serão submetidos aos regulamentos do HC-UNICAMP referentes ao sigilo da informação médica. Se os resultados ou informações fornecidas forem utilizados para fins de publicação cientí-fica, nenhum nome será utilizado. FORNECIMENTO DE INFORMAÇÃO ADICIONAL Entendo que posso requisitar informações adicionais relativas ao estudo a qualquer momento. A DRa Iscia Lopes Cendes, tel (019) 3521-8907 estará disponível para responder minhas questões e preocupações. Em caso de recurso, dúvidas ou reclamações contactar a secretaria da comissão de ética da Faculdade de Ciências Médicas-UNICAMP, tel. (019) 3521-7232. RECUSA OU DESCONTINUAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO Entendo que a participação é voluntária e que eu posso me recusar a participar ou retirar meu consentimento e interromper a minha participação no estudo a qualquer momento (incluindo a retirada da amostra de sangue) sem comprometer os cuidados médicos que recebo atualmente ou receberei no futuro no HC- UNICAMP. Eu reconheço também que a Dra. Iscia Lopes Cendes pode interromper a minha participação nesse estudo a qualquer momento que julgar apropriado.

Anexos 182

FORMULÁRIO DE CONSENTIMENTO PARA PESQUISA MÉDICA, Página 3 de 3 Título do projeto: Estudos de mutações em genes responsáveis por diferentes formas de desor-dens do desenvolvimento cortical Investigador principal: Dra. Iscia Lopes Cendes Eu confirmo que o (a) Dr. (a)____________________________________________ me explicou o objetivo do estudo, os procedimentos que serão realizados, os riscos, desconforto e possíveis vantagens advindas desse projeto de pesquisa. Eu li e/ou me foi explicado, assim como compreendi esse formulário de consentimento e estou de pleno acordo em participar desse estu-do. Nome do participante ou responsável ______________________________________________ ___________________ Assinatura do participante ou responsável data _________________________________________________________________________ Nome da testemunha ______________________________________________ ___________________ Assinatura da testemunha data RESPONSABILIDADE DO PESQUISADOR: Eu expliquei a _______________________________________________________ o objetivo do estudo, os procedimentos requeridos e os possíveis riscos e vantagens que poderão advir do estudo, usando o melhor do meu conhecimento. Eu me comprometo a fornecer uma cópia desse formulário de consentimento ao participante ou responsável. _________________________________________________________________________ Nome do pesquisador ou associado __________________________________________________ ___________________ Assinatura do pesquisador ou associado data

Anexos 183

8.4. Anexo 4: Sondas utilizadas na técnica de MLPA

Tabela 28: Sondas presentes no kit "Salsa MLPA P061 Lissencephaly probemix"

Tamanho (nt)

SALSA MLPA probe Posição

17p13.3 DCX FLNA outros

64-70-76-82 Q-fragmentos (Controle)

88-92-96 D-fragmentos (Controle)

100 X-fragmentos (Controle)

105 Y-fragmentos (Controle)

118 Y-fragmentos (Controle)

130 FLNA probe 10768-L11372 Exon 25

136 DCX probe 10765-L11369 Exon 6

142 PAFAH1B1 probe 04120-L03532 Exon 3

148 TRPV1 probe 01472-L00946 Miller-Dieker region

155 POMT1 probe 04128-L03485 Exon 2

160 YWHAE probe 04119-L03531 17p13.3

166 DCX probe 04122-L03479 Exon 3

172 KIAA0664 probe 04610-L00948 Miller-Dieker region


184 HIC1 probe 10769-L11373 Miller-Dieker

region



202 POMGnT1 probe 04142-L03499 Exon 7

210 DCX probe 04123-L03480 Exon 4

220 HIC1 probe 03804-L00949 Miller-Dieker region





Anexos 184


275 DCX probe 04124-L03481 Exon 5


292 POMGnT1 probes 04606-L03500 Exon 18



319 DCX probe 10763-L11367 Exon 2

326 POMT1 probe 04132-L03489 Exon 17


346 RAP1GAP2 (GARNL4) probe 00689-L08392

Miller-Dieker region

355 YWHAE probe 04118-L03530 17p13.3

364 DCX probe 10766-L12011 Exon 7

373 POMT1 probe 04133-L03490 Exon 19




409 DCX probe 04127-L08388 Exon 8


427 METTL16 (METT10D (MGC3329)) probe 01924-L08393

Miller-Dieker region

436 POMT1 probe 04129-L03486 Exon 5





483 DCX probe 10764-L11368 Exon 4

nt= nucleotídeo

unicamp · iii universidade estadual de campinas faculdade de ciÊncias mÉdicas daniela aguiar de...

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