identificação e caracterização de genes e fatores relacionados à floculação e desenvolvimento...

Identificação e caracterização de Identificação e caracterização de genes e fatores relacionados à genes e fatores relacionados à

floculação e desenvolvimento de floculação e desenvolvimento de uma levedura industrial não uma levedura industrial não

floculantefloculanteAline Rodrigues

Orientação: Dr. Gonçalo A. G. Pereira

Projeto de Doutorado

Sumário

PARTE I

Leveduras industriais Floculação Objetivos Metodologia

PARTE II

Genes relacionados ao estresse oxidativo Objetivos Metodologia / Resultados Parciais

PARTE IPARTE I

FLOCULAÇÃOFLOCULAÇÃO

LEVEDURAS INDUSTRIAISLEVEDURAS INDUSTRIAIS

Principais fatores que influenciam no

processo de fermentação para

produção de etanol

Capacidade fermentativa das

leveduras

Resistência das leveduras às condições de

estresses submetidas

Leveduras iniciais

Leveduras selvagens

IsoladIsoladasas

BG-1 (Usina Barra Grande)CR-1 (Usina Cresciumal)SA-1 (Usina Santa Adélia)CAT-1 (Usina Catanduva)PE-2 (Usina da Pedra)

LEVEDURAS INDUSTRIAISLEVEDURAS INDUSTRIAIS

.Linhagens selvagens selecionadas pela capacidade de predominar sob as condições físico, química e microbiológicas presentes na dorna

.Condições de estresse adverso:

alta contaminação

bacteriana alta acidez

altas temperatura

s

?

AGREGADOS MULTICELULARESAGREGADOS MULTICELULARES - FLOCULAÇÃO!! -- FLOCULAÇÃO!! -

PROBLEMAS CAUSADOS PELA FLOCULAÇÃOPROBLEMAS CAUSADOS PELA FLOCULAÇÃO

Floculação Decréscimo de rendimento Prejuízos !!!

• . Redução da área de contato das leveduras com o meio

• . Problemas na circulação do líquido nas tubulações

. Reversível dependente de cálcio

Controlado geneticamente!!

GENES RELACIONADOS À FLOCULAÇÃOGENES RELACIONADOS À FLOCULAÇÃO

FAMÍLIA FLO

FLO1FLO5FLO9FLO10

OUTROS GENES ?FLO8

MSS11GTS-1

Floculação controlada por 3 genes

FLO8

outros 2 genes desconhecidos

OBJETIVOSOBJETIVOS

Desenvolver uma levedura industrial que não apresente o fenótipo floculante, independente das condições encontradas nas dornas.

Objetivos específicos:

. Identificar e caracterizar os genes reguladores envolvidos no processo de floculação;

. Desenvolver mutantes para os genes selecionados em uma linhagem de levedura de laboratório

. Desenvolver mutantes para os genes selecionados em uma linhagem de levedura industrial

Demais objetivos: Identificar características gênicas de linhagens industriais relacionadas com resistências a estresses presentes nas dornas.

outros 2 genes desconhecidos

MAPEAMENTOComparação do genoma entre isolados haplóides

originários da mesma linhagem, mas com

características distintas quanto ao fenótipo

floculante.

SEQUENCIAMENTO

Identificadas composições de genes diferentes

para cada isolado e polimorfismos nos

variados alelos

Seleção dos GENES ALVOS

METODOLOGIAMETODOLOGIAFLOCULAÇÃO - IDENTIFICAÇÃO DOS GENES DE INTERESSE

Seleção dos GENES ALVOS

Estudos de transformação para desenvolvimento de

mutantes FLOCULAÇÃO - DELEÇÃO DE GENES ESPECÍFICOS

Delitto Perfetto - nenhuma marca de seleção será deixada no final do processo de deleção de cada locus

ENSAIOS DE FLOCULAÇÃO

Leveduras serão desfloculadas, ressuspendidas em tampão de floculação;

A floculação será induzida por Ca2+;

Capacidade de floculação: F=(1-B/A)x100%,

onde A=A600 antes das células serem agitadas em tampão de floculação e B=A600 após 6 min sem agitação

ENSAIOS DE FLOCULAÇÃO – ENSAIOS DE FLOCULAÇÃO – PE-2PE-2

não flocula

em laboratór

io!!

- Ensaios de laboratório -

tentativas para induzir a floculação

da PE-2 diferentes

temperaturas

diferentes concentraçõ

es de bactérias

contaminantes

variação de pH

PARTE IIPARTE II

ESTUDOS DE GENES ESTUDOS DE GENES RELACIONADOS AO RELACIONADOS AO

ESTRESSE OXIDATIVOESTRESSE OXIDATIVO

PARTE IIPARTE II

ESTUDOS DE GENES RELACIONADOS AO ESTRESSE ESTUDOS DE GENES RELACIONADOS AO ESTRESSE OXIDATIVOOXIDATIVO

ESTRESSE OXIDATIVOOUTRAS CONDIÇÕES ADVERSAS

desafios que as leveduras

encontram nas dornas para sobreviver e fermentar

SNO/SNZMPR

resistência a alguns

fenômenos de estresse

Estudo pode ser importante

para a manipulação genética de

leveduras industriais

PARTE IIPARTE II


GENES SNO/SNZ EM LEVEDURAS

SNZSNZ

SNZ2SNZ2SNZ1SNZ1 SNZ3SNZ3

SNSNOO

Coregulados durante a fase de crescimento até a

fase estacionária e durante a limitação de

nutrientes

SNO e SNZ em leveduras – envolvidos na síntese de vitamina B6 e vitamina B1

PARTE IIPARTE II


GENES SNO/SNZ EM LEVEDURAS

S288c

SNO1/SNZ1 - região mediana do braço direito do cromoss. XIIISNO2/SNZ2 - braço esquerdo do cromoss. XIVSNO3/SNZ3 -braço esquerdo do cromoss. VI

Teloméricos!!

PARTE IIPARTE II

IMPORTÂNCIA DAS VITAMINAS B1 E B6 EM LEVEDURAS IMPORTÂNCIA DAS VITAMINAS B1 E B6 EM LEVEDURAS INDUSTRIAISINDUSTRIAIS

Vitamina B6

Metabolismo de

aminoácidos

Forma biologicame

nte ativa PLP

Em S. cerevisiae

Precursor da tiamina (Vitam.

B1)

Vitamina B1

Cofator tiamina

pirofosfato

Essencial para a

utilização do açúcar

Fermentação

ALTA ALTA DEMANDA DE DEMANDA DE TIAMINA NOS TIAMINA NOS AMBIENTES AMBIENTES

INDUSTRIAIS !!INDUSTRIAIS !!!!

AUMENTO DA REGULAÇÃO DOS

GENES DE METABOLISMO DA

TIAMINA EM LEVEDURAS DE

FERMENTAÇÃO E DE DIVERSOS AMBIENTES

INDUSTRIAIS

TIAMINA NO TIAMINA NO MEIOMEIO

Efeito negati

vo Fase inicial de crescimento

das células de levedura

Consequência do efeito

repressor de tiamina na

biossíntese de PLP

Diminuição resultante no

conteúdo celular da

vitamina B6

Muitas vias metabólicas

são reprimidas

PARTE IIPARTE II

IMPORTÂNCIA DAS VITAMINAS B1 E B6 EM LEVEDURAS IMPORTÂNCIA DAS VITAMINAS B1 E B6 EM LEVEDURAS INDUSTRIAISINDUSTRIAIS

. CNVs (variação no número de cópias)- genoma de 5 linhagens industriais

. 72 CNVs exclusivas de linhagens industriais –importantes amplificações dos genes teloméricos SNO e SNZ - SNO2/SNZ2 e SNO3/SNZ3

. Linhagens industriais – perderam genes SNO/SNZ do cromoss. VI, mas apresentaram hibridizações em vários outros cromossomos

Inibição do crescimento induzida por

tiamina/açúcar

linhagem de

laboratório

S288cNenhuma das cinco leveduras industriaisapresentaram o fenótipo de crescimento

tiamina-repressível

PARTE IIPARTE II


GENES MPR EM LEVEDURAS

MPR – pode conferir uma vantagem adaptativa às condições adversas das dornas de fermentação : estresse oxidativo, resistência à temperatura elevada e alta concentração de etanolDiminuição de níveis intracelulares de ROS quando as células de levedura são expostas à condições de estresse oxidativo como choque térmico, peróxido de hidrogênio, congelamento ou tratamento com etanol

SNO/SNZ e MPR - número de cópias elevado

linhagem industrial X linhagem de laboratório (S288c)

Vantagem adaptativa Bom desempenho fermentativo

Objetivos específicos:Objetivos específicos:

Analisar esporos de uma linhagem industrial (PE-2), relacionando o número de cópias desses genes (SNO/SNZ e MPR) com a eficiência nos ensaios fermentativos e resistência a estresses

PARTE IIPARTE II


OBJETIVOSOBJETIVOS

Identificar características gênicas de linhagens industriais relacionadas com resistências a estresses presentes nas dornas

OBTENÇÃO DOS ESPOROS HAPLÓIDES

Asco

Esporulação

Dissecção de

tétrades

PARTE IIPARTE II


RESULTADOS PARCIAISRESULTADOS PARCIAIS

30 tétrades linhagem PE-

2 (isolado JAY270)

120 esporos haplóides4

esporos viáveis

120 esporos haplóides

PARTE IIPARTE II


RESULTADOS PARCIAISRESULTADOS PARCIAIS

PFGETransferência dos géis de PFGE para membranas de hibridização

Southern-blot

Segregação dos genes SNO/SNZ e MPR

Avaliar o número de cópias desses genes em cada esporo haplóide isolado, e localização cromossômica

Ensaios fermentativos e de resistência a estresses

CARIOTIPAGEM POR ELETROFORESE EM CAMPO PULSADO

(PFGE - Pulsed Field Gel Electrophoresis)

Construção das Sondas

Genes Primers

SNO/SNZSNO/SNZ F: 5’TACGGATTTGTAAGAGTTCCT3’

SNO/SNZ R: 5’CCCAAATGTATTGCATATGAC3’

MPRMPR1 F: 5’TTCAACCGTTAGCCGACTCT3’

MPR1 R: 5’ATGAGGCACCAGTCCAATTC3’

SOUTHERN-BLOT – GENES SNO/SNZ

PRÓXIMAS ETAPAS DO PROJETOPRÓXIMAS ETAPAS DO PROJETO

FLOCULAÇÃO

Deleção do gene FLO8

Ensaios floculação – PE-2

GENES RELACIONADOS AO ESTRESSE OXIDATIVO

Análises de Southern-blot

Ensaios fermentativos e resistência a estresses

Obrigada!Obrigada!!!!!

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