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MIRELLY CAROLINE ALVES
IDENTIFICAÇÃO DE INFECÇÕES SIMPLES E
MISTAS DE ESTIRPES DE Potato virus Y (PVY)
EM CAMPOS PRODUTORES DE BATATA
LAVRAS – MG
2016
Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema de Geração de Ficha Catalográfica da Biblioteca
Universitária da UFLA, com dados informados pelo(a) próprio(a) autor(a).
Alves, Mirelly Caroline.
Identificação de infecções simples e mistas de estirpes
de Potato virus Y (PVY) em campos produtores de batata / Mirelly
Caroline Alves. – Lavras : UFLA, 2016.
88 p. : il.
Dissertação (mestrado acadêmico)–Universidade Federal de
Lavras, 2015.
Orientador(a): Antônia Dos Reis Figueira.
Bibliografia.
1. DAS e TAS ELISA. 2. RT-PCR multiplex. 3. Potyvirus. 4.
PVY. 5. RT-qPCR. I. Universidade Federal de Lavras. II. Título.
O conteúdo desta obra é de responsabilidade do(a) autor(a) e de seu
orientador(a).
MIRELLY CAROLINE ALVES
IDENTIFICAÇÃO DE INFECÇÕES SIMPLES E MISTAS DE ESTIRPES
DE Potato virus Y (PVY) EM CAMPOS PRODUTORES DE BATATA
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Lavras, como parte das
exigências do Programa de Pós-
Graduação em Biotecnologia Vegetal,
área de concentração em Biotecnologia
Vegetal, para a obtenção do título de
Mestre.
Orientadora
Dra. Antônia dos Reis Figueira
Coorientadora
Dra. Suellen B. F. Galvino-Costa
LAVRAS – MG
2015
MIRELLY CAROLINE ALVES
IDENTIFICAÇÃO DE INFECÇÕES SIMPLES E MISTAS DE ESTIRPES
DE Potato virus Y (PVY) EM CAMPOS PRODUTORES DE BATATA
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Lavras, como parte das
exigências do Programa de Pós-
Graduação em Biotecnologia Vegetal,
área de concentração em Biotecnologia
Vegetal, para a obtenção do título de
Mestre.
APROVADA em 05 de agosto de 2015.
Dra. Suellen B. F. Galvino-Costa – UFLA
Dr. Douglas Rodríguez Martínez - Departamento de Pesquisa Aplicada
Driscoll´s Strawberry Associates, México.
Dra. Antônia dos Reis Figueira
Orientadora
LAVRAS – MG
2015
À Deus por mais esta conquista.
OFEREÇO
Aos meus pais, Antonio & Vanda,
por tornarem possível esta conquista.
Aos queridos Regis e Marli (in memorian),
saudades eternas.
DEDICO
AGRADECIMENTOS
À Deus, por me conceder o privilégio do despertar todas as manhãs,
pelas bênçãos imerecidas e por conduzir cada passo dado me guiando e
protegendo.
À Universidade Federal de Lavras e ao Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia Vegetal, pela oportunidade de realizar o Mestrado.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de estudos.
À Profa. Dra. Antônia dos Reis Figueira, pela orientação, pelo desafio
proposto neste trabalho e pela experiência obtida através desses anos de estudo.
À Dra. Suellen, pela coorientação e companhia durante as longas horas
de trabalho, pela dedicação, paciência e ensinamentos.
Aos meus pais, Antônio e Vanda, que são a razão de todos os meus
esforços em buscar ser cada dia melhor. Aos meus amados, meu reconhecimento
por tudo que fizeram até hoje por mim, cada um à sua maneira, me mostrou o
quanto eu devia ser forte. Também agradeço aos meus irmãos, Francielly e
Thiago, que são extremamente especiais e queridos, a concretização de mais
essa etapa é com certeza devido ao apoio de vocês.
Ao Jefferson, por estar presente em todos os momentos construindo o
futuro ao meu lado, que Deus continue nos abençoando para que nossos planos
se tornem realidade.
Ao vovô João e a vovó Glorinha, pelo amor dedicado nos mais simples
gestos, sempre preocupados com meu bem-estar. São o exemplo de vida mais
doce e lindo, vocês me inspiram todos os dias, obrigada por cuidar de toda a
família e mantê-la sempre unida. Todo o carinho de ambos eu guardo no
coração. Aos tios, tias, primos e primas, em especial Andresa e Ana Cláudia,
pelo carinho, amor e amizade, e por me aturarem nos momentos mais
estressantes dessa jornada.
E não poderia me esquecer de agradecer a minha segunda família,
Francisco, Suelba e Walisson, pelos inúmeros momentos de descontração e
divertimento, principalmente agradeço a minha sogra Marli (in memorian), por
ter me acolhido tão gentilmente, será sempre um exemplo de dedicação,
generosidade e altruísmo pra mim.
Aos amigos de laboratório, Priscilla, Roberto, Daniele, Kelly, Thaís e
Elisângela, pela companhia durante o trabalho. As minhas amigas de infância
Keren e Cristina, que mesmo distantes torcem por mim. Aos demais parentes e
amigos não citados, mas que direta ou indiretamente participaram desta
conquista, meus sinceros agradecimentos.
“Deus nunca disse que a jornada seria fácil,
mas Ele disse que a chegada
valeria a pena.”
(Max Lucado)
RESUMO
O Potato virus Y (PVY) é considerado o principal vírus com importância
econômica para a bataticultura no Brasil. Um dos fatores responsáveis pelo
aumento da diversidade de PVY são as infecções mistas de estirpes, que durante
o processo de replicação viral podem gerar recombinantes mais bem adaptados
às condições ambientais, com propriedades biológica, sorológicas e moleculares
diversificadas. Neste trabalho, foram analisados 126 tubérculos e 39 folhas de
plantas de batata infectadas com PVY, coletadas em campos comerciais
localizados no sul de Minas Gerais. Inicialmente foram avaliados os sintomas
apresentados pelas plantas provenientes dos tubérculos infectados e, em seguida,
foram utilizadas as técnicas DAS e TAS-ELISA, RT-PCR multiplex e RT-qPCR
para estimar a ocorrência e predominância de estirpes PVY, bem como a sua
concentração nas plantas amostradas. Nas plantas originadas dos tubérculos
infectados, os sintomas variaram de leve a severo, em todas as cultivares de
batata, indicando uma provável variabilidade na época do ciclo em que foram
infectadas. Do total de amostras submetidas ao teste sorológico TAS-ELISA,
46,1% mostrou comportamento sorológico compatível com estirpes pertencentes
ao grupo de sorotipo O e 34,5% com o grupo N, enquanto que 23,9% foram
positivas para infecções mistas e 5,5% não reagiram com nenhum dos antissoros
monoclonais testados. Dentre estas, dez amostras apresentaram padrão
sorológico não usual. No teste RT-PCR multiplex, as amostras com sorotipo O e
N ao mesmo tempo, foram identificadas como portadoras de infecção mista com
as estirpes PVYNTN
e PVYN:O/N-Wi
. As amostras com sorotipo O foram
identificadas como PVYN:O/N-Wi
e as amostras com sorotipo N foram
identificadas como PVYNTN
, exceto quando possuíam infecções mistas. Foram
identificados 43,6% de PVYN:O/N-Wi
, 37% de PVYNTN
e 19,4% de infecções
mistas. Foram selecionadas aleatoriamente para o teste de RT-qPCR 151
amostras. As concentrações da estirpe PVYNTN
nas plantas com infecção mista,
independentemente da sua origem, variaram de 2,79x107
a 2,79x1010
cópias
virais/µl, enquanto que as concentrações da estirpe PVYN:O/N-Wi
foram menores,
variando de 2,41x103
a 4,13x106
cópias virais/µl. Sessenta e um isolados, que
apresentaram perfil típico do recombinante PVYNTN
na RT-PCR multiplex e RT-
qPCR. Quando submetidos à reação de RT-PCR para amplificação do PVYE, 43
deles foram positivos apresentando perfil característico dessa estirpe
recombinante, embora 9 isolados tenham apresentado padrões atípicos para o
recombinante PVYE. A diversidade dos isolados de PVY, bem como a
ocorrência de infecções mistas encontrada neste trabalho, fornece um panorama
epidemiológico desse patógeno no país.
Palavras-chave: DAS e TAS-ELISA. RT-PCR multiplex. Potyvirus. PVY. RT-
qPCR.
ABSTRACT
The Potato virus Y (PVY) is considered the main virus with economic
importance to potato culture in Brazil. One of the factors responsible for the
increasing PVY diversity are mixed infections of strains that, during the viral
replication process, can generate recombinants better adapted to environmental
conditions with diverse biological, serological and molecular properties. In this
paper, 126 tubers and 39 potato plant leaves infected with PVY, collected in
commercial fields located in southern Minas Gerais were analyzed. Initially it
was assessed the symptoms exhibited by plants from infected tubers and then
DAS and TAS-ELISA, multiplex RT-PCR and RT-qPCR techniques were used
to assess the occurrence and prevalence of PVY strains as well as their
concentration in the sampled plants. In the plants originated from infected
tubers, the symptoms vary from mild to severe in all potato cultivars, indicating
a probable variability in the time cycle in which they were infected. In the TAS-
ELISA serological testing, 46.1% of the samples showed serological behavior
compatible with strains belonging to the 'O' serotype group and 34.5% with the
‘N’ group, while 23.9% were positive for mixed infections and 5.5% did not
react with any of the tested monoclonal antisera. Among these, ten samples
showed unusual serological pattern. In the multiplex RT-PCR test, the samples
with O and N serotypes at the same time were identified as having mixed
infection with PVYNTN
and PVYN:O/N-Wi
strains. Samples with O serotype were
identified as PVYN:O/N-Wi
and the ones with N serotype, as PVYNTN
, except when
they had mixed infections. It was identified 43,6% of PVYN:O/N-Wi
, 37% of
PVYNTN
and 19,4% of mixed infections. One hundred and fifty-one samples
were randomly selected for the RT-qPCR testing. The concentrations of PVYNTN
strain in plants with mixed infections, regardless of its origin, varied from
2,79x107
to 2,79x1010
viral copies/µl, while the concentrations of PVYN:O/N-Wi
were lower, ranging from 2,41x103 to 4,13x10
6 viral copies/µl. Sixty-one isolates
showed typical profile of PVYNTN
recombinant in RT-PCR multiplex and RT-
qPCR. When subjected to RT-PCR for amplification of PVYE, 43 of them were
positive, having a characteristic profile for this recombinant strain, although 9
isolates was also observed with atypical patterns for recombinant PVYE. The
diversity of PVY isolates present in Brazilian fields of potatoes studied in this
work, as well as the occurrence of mixed infections, provides a general
epidemiological picture of this pathogen in the country.
Keywords: DAS and TAS-ELISA. RT-PCR multiplex. Potyvirus. PVY. RT-
qPCR.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 Padrões de sintomas apresentados pelas plantas de batata
provenientes dos tubérculos plantados: A1) Controle negativo:
Planta de batata sadia; A2 e A3) MO+: 609/5 e CMF92; A4)
MO++: S4; A5, A6 e A7) Mo+++: 610/35, CMF1 e 608/84;
A8 e A9) MO+++/RF: 611/33, 608/63. ..................................... 42
Figura 2 Padrão eletroforético encontrado entre os isolados analisados.
M=marcador 100pb; 1) 619.1/3; 2) 618.1/18; 3) S8; 4)608/84;
5) 610/27; 6) S1; 7) CMF46; 8) 618.1/1; 9) 609/5; 10)
CMF18; 11) S11; 12) 619.2/2; 13) 610/98; 14) CMF1; 15)
619.1/3; 16) 618.1/18; 17) S8; 18) 608/84; 19) 610/27; 20) S1;
21) 622.2/6; 22) CMF46; 23) CMF50; 24) CP PVYNTN
=LUI-
AGA; 25) CP PVYN:O/N:Wi
=PED-AX; 26) CP (controle
positivo) PVYE= AGA-MON; 27) CN (controle negativo)
PVYE=batata sadia; 28) CN (controle negativo) PVY
NTN e
PVYN:O/N:Wi
=batata sadia. ............................................................ 60
Gráfico 1 Perfil sorológico dos isolados de PVY analisados por TAS-
ELISA. ........................................................................................ 51
Gráfico 2 Médias das absorbâncias obtidas no teste TAS-ELISA, das
amostras provenientes de campos de batata localizados no
município de Ouro Fino-MG, utilizando os anticorpos
monoclonais 1F5 e SASA-N, MAb2 e SASA-O, capazes de
detectar os sorotipos N e O, respectivamente. O valor
representado em cada barra indica a somatória das
absorbâncias obtidas com os respectivos antissoros ................... 56
Gráfico 3 Médias das absorbâncias obtidas no teste TAS-ELISA, das
amostras provenientes de campos de batata localizados no
município de São Gotardo - MG, utilizando os anticorpos
monoclonais 1F5 e SASA-N, MAb2 e SASA-O, capazes de
detectar os sorotipos N e O, respectivamente. O valor
representado em cada barra indica a somatória das
absorbâncias obtidas com os respectivos antissoros ................... 56
Gráfico 4 Médias das absorbâncias obtidas no teste TAS-ELISA, das
amostras provenientes de campos de batata localizados no
município de Maria da Fé e Cristina-MG, utilizando os
anticorpos monoclonais 1F5 e SASA-N, MAb2 e SASA-O,
capazes de detectar os sorotipos N e O, respectivamente. O
valor representado em cada barra indica a somatória das
absorbâncias obtidas com os respectivos antissoros ................... 57
Gráfico 5 Médias das absorbâncias obtidas no teste TAS-ELISA, das
amostras provenientes de estabelecimentos revendedores de
batata localizados no município de Lavras-MG, utilizando os
anticorpos monoclonais 1F5 e SASA-N, MAb2 e SASA-O,
capazes de detectar os sorotipos N e O, respectivamente. O
valor representado em cada barra indica a somatória das
absorbâncias obtidas com os respectivos antissoros ................... 57
Gráfico 6 Proporção dos grupos de PVY recombinantes analisados por
RT-PCR Multiplex...................................................................... 59
Gráfico 7 Quantificação versus Ct para os pontos da curva padrão de cada
reação estirpe-específica da RT-qPCR. As diluições seriadas
dos plasmídeos linearizados (102
a 1012
) foram testadas em
triplicatas e os slopes e coeficiente de variação da curva
padrão foram calculados e estão expostos nos gráficos. A)
Curva padrão para detecção da estirpe PVYNTN
. B) Curva
padrão para detecção da estirpe PVYNTN
. ................................... 62
LISTA DE TABELA
Tabela 1 Combinação de primers empregados para a detecção das
diferentes estirpes de PVY por meio de RT-PCR multiplex ...... 34
Tabela 2 Sequência de nucleotídeos dos primers e sondas utilizados para
a detecção de variantes genéticos do PVY por RT-qPCR .......... 36
Tabela 3 Origem e denominação dos isolados analisados, sintomas
induzidos nas plantas de batata e resultado da análise por
TAS-ELISA e por RT-PCR ........................................................ 43
Tabela 4 Resultados comparativos dos métodos de detecção utilizados,
dados de quantificação da RT-qPCR para as estirpes
analisadas, e resultados da RT-PCR específica para PVYE ........ 67
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................... 13
2 REFERENCIAL TEÓRICO .................................................................... 16
2.1 Cultura e aspectos econômicos da batata (S. tuberosum L.) .................... 16
2.2 Viroses de batata ...................................................................................... 18
2.3 Potato virus Y (PVY) e seus recombinantes ............................................ 19
2.4 Transmissão e Sintomatologia ................................................................. 24
2.5 Métodos de diagnose de vírus .................................................................. 26
3 MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................... 31
3.1 Condução do experimento e obtenção das amostras ................................ 31
3.2 Origem e manutenção dos isolados virais ................................................ 31
3.3 Coleta, processamento das amostras e avaliação dos sintomas ............... 32
3.4 Detecção das estirpes de PVY por TAS-ELISA ...................................... 32
3.5 Extração do RNA total ............................................................................. 33
3.6 Síntese do cDNA e PCR multiplex .......................................................... 34
4 RT-qPCR ................................................................................................. 36
4.1 Desenho das Sondas e Primers ................................................................ 36
4.2 Elaboração da curva padrão ..................................................................... 37
4.3 Extração de RNA, síntese de cDNA e ensaio qPCR ................................ 38
4.4 Validação do RT-qPCR para diagnose de Potato virus Y ........................ 39
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................. 40
5.1 Sintomas observados nas plantas de batata provenientes dos tubérculos
infectados ................................................................................................. 40
5.2 Resultados obtidos no TAS-ELISA ......................................................... 51
5.3 Detecção e distinção de estirpes de PVY por RT-PCR multiplex e esboço
da situação epidemiológica destas no campo .......................................... 58
5.4 Detecção de estirpes de PVY em infecções simples e mistas por RT-qPCR
................................................................................................................. 61
5 CONCLUSÕES ......................................................................................... 74
REFERÊNCIAS......................................................................................... 75
13
1 INTRODUÇÃO
A batata (Solanum tuberosum) possui ampla distribuição ao redor do
mundo e está entre os principais produtos comercializados, ocupando o
quarto lugar em volume de produção, atrás apenas do trigo, milho e arroz.
No ano de 2013, a produção média mundial chegou a 368 milhões de
toneladas. Porém, a susceptibilidade das variedades comercializadas, às
diversas doenças, pode levar a perdas significativas, expressas pela redução
da qualidade e produtividade das plantas (BRAVO-ALMONACID et al.,
2012; GRAY et al., 2010; HANE; HAMM, 1999).
As viroses são um dos grandes problemas enfrentados pelos
produtores de batata no país, uma vez que o seu controle é geralmente
dificultado em função das três principais formas de disseminação da doença:
mecânica, por enxertia e através de insetos vetores, causando rápida
degenerescência dos tubérculos-sementes.
No Brasil, as condições climáticas do país favorecem a presença de
afídeos o ano todo. A espécie Myzus persicae é o vetor que apresenta
reconhecidamente a maior eficiência na transmissão do Potato vírus Y. A
relação vírus/vetor é do tipo não persistente ou não circulativa, de modo que
o pulgão adquire e transmite o vírus em poucos segundos, na “picada de
prova”. A ampla distribuição geográfica do vetor é responsável por grande
parte da disseminação do vírus (LOPES et al., 2014; QUENOUILLE;
VASSILAKOS; MOURY, 2013).
Atualmente, o PVY encontra-se entre as dez principais viroses com
importância econômica, sendo que a batata (Solanum tuberosum), o fumo
(Nicotiana spp.), o tomate (S. lycopersicum) e a pimenta (Capsicum spp.)
são as principais hospedeiras cultivadas. Em culturas de batata são descritos
como sendo os mais comuns e agressivos vírus encontrados, ocasionando
perdas que podem chegar a 80% do cultivo (DE BOKX; HUTTINGA, 1981;
SCHOLTHOF et al., 2011).
14
Pertencente ao gênero Potyvirus (família Potyviridae), o PVY possui
um genoma constituído por RNA de fita simples, senso positivo e com
aproximadamente 9.7kb de tamanho, ligado covalentemente a uma proteína
VPg ao terminal 5’ e uma cauda poli(A) ao terminal 3’. O genoma é
expresso como uma poliproteína de aproximadamente 3062 aminoácidos,
que posteriormente é processado por três proteases específicas do vírus em
10 proteínas funcionais (BERGER et al., 2005; QUENOUILLE;
VASSILAKOS; MOURY, 2013) Uma outra proteína foi recentemente
encontrada, codificada separadamente da poliproteína, denomina PIPO
(CHUNG et al., 2008).
De acordo com as reações observadas em plantas indicadoras de
batata portando os genes de resistência Ny, Nc e Nz, e os sintomas
apresentados em tabaco (Nicotiana tabacum), as estirpes de PVY foram
classificadas em cinco grupos: PVYO, PVY
C, PVY
N, PVY
Z, e PVY
E. Nas
últimas décadas, houve um aumento na prevalência de isolados
recombinantes entre PVYO e PVY
N descritos no mundo todo, apresentando
grau de virulência variado e propriedades biológicas, sorológicas e
moleculares muito próximas (DJILANI-KHOUADJA et al., 2010;
GALVINO-COSTA et al., 2012b; JONES, 1990; SCHOLTHOF et al., 2011;
SINGH et al., 2008; URCUQUI-INCHIMA; HAENNI; BERNARDI, 2001).
A frequente recombinação em PVY cria muitos desafios para os
fitopatologistas, tanto na identificação precisa dessas estirpes no campo,
quanto na previsão dos seus impactos sobre a produção. Devido à variedade
de sintomas causados pelas diversas estirpes reconhecidas de PVY, é
indispensável o uso de técnicas de diagnóstico específicas que apresentem
aplicabilidade para diagnósticos rápidos e em grande escala, a fim de
constatar a sua incidência no campo. No Brasil, poucos estudos foram
realizados a fim de identificar o tipo de infecção predominante nos campos
produtores. Assim sendo, amostras constituídas por folhas e tubérculos
provenientes de campos localizados no sul de Minas Gerais foram analisadas
15
por DAS, TAS-ELISA, RT-PCR multiplex, e RT-qPCR, visando avaliar a
ocorrência e incidência das principais estirpes de PVY, para elucidar alguns
aspectos referentes à sua frequência e variabilidade nos campos produtores
de batata.
16
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Cultura e aspectos econômicos da batata (S. tuberosum L.)
A batata (Solanum tuberosum L.) é uma planta herbácea pertencente
à família Solanaceae. Nativa da América do Sul foi originalmente
encontrada nas Cordilheiras dos Andes, onde era consumida pela população
local. Introduzida na Europa, no final do século XVI, tornou-se rapidamente
base alimentar de diversos povos de outros continentes (AMARAL et al.,
2012; BIRCH et al., 2012; TAVARES; CASTRO; MELO, 2002).
Aproximadamente, mais de um bilhão de pessoas ao redor do mundo fazem
uso da batata em sua dieta, por apresentar uma rica fonte de energia,
nutrição, fácil cultivo e custo reduzido (INTERNACIONAL POTATO
CENTER - CIP, 2013). Assim sendo, a batata tem sido foco de estudos
substanciais, principalmente devido a seu uso como alimento básico na
nutrição humana, por ser uma fonte significativa de elementos essenciais à
saúde.
Mesmo possuindo um grande valor nutricional, o consumo médio de
batata no Brasil é considerado relativamente baixo, em torno de 15
kg/habitante ano, enquanto nos países europeus o consumo ultrapassa 80
kg/habitante ano (FIGUEIREDO et al., 2011; TAVARES; CASTRO;
MELO, 2002). Isso se deve, provavelmente, ao fato de que no Brasil o arroz
e o feijão são alimentos básicos da maioria da população, ao contrário do
que acontece nos países europeus.
Dentre os mais de 130 países produtores de batata no mundo, que
apresentam uma produção anual de aproximadamente 368 milhões de
toneladas, o Brasil ocupa a 20ª posição, com uma produção de 3,5 milhões
de toneladas em 128 mil hectares de área plantada em 2013 (FOOD AND
AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS -
17
FAOSTAT, 2013). No mercado interno, em termos econômicos, a batata
ocupa lugar relevante entre os produtos agrícolas mais importantes.
As regiões Sul e Sudeste do Brasil compõem o maior polo nacional
produtor de batata, com destaque para o estado de Minas Gerais que produz
33% da safra anual, cerca de 1.182 mil t/ano (INSTITUTO BRASILEIRO
DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA - IBGE, 2013). Juntamente aos estados
de São Paulo (17%), Paraná (21%) e Rio Grande do Sul (10%), totalizam
mais de 80% da produção em três safras (AGRIANUAL, 2012; CAMARGO
FILHO; ALVES, 2005; SOARES, 2012). A primeira é a safra das águas
(primeira safra), em seguida a safra da seca (segunda safra) e finalmente a
safra de inverno (terceira safra), estabelecidas de acordo com as condições
edafoclimáticas de cada região.
No Sudeste brasileiro, a safra de inverno estrategicamente antecede a
safra das águas devido às chuvas poucas e irregulares, de modo que é feito o
plantio irrigado no trimestre abril-junho, com colheita de agosto a outubro.
Já no início do ano agrícola julho-agosto, a safra das águas é iniciada, com
possibilidade de cultivo por toda a primavera e colheita de outubro a março
ou final do verão no Sudeste e Sul brasileiro. A safra da seca se inicia no
primeiro trimestre do ano e a colheita pode se estender até julho. No
Nordeste, devido ao regime pluviométrico diferenciado, é produzida apenas
a segunda safra (CAMARGO FILHO; ALVES, 2005).
Embora no país o volume de produção seja considerado alto, a
produtividade dessa hortaliça é baixa, comparada aos países mais
desenvolvidos (COSTA et al., 2010). Isso pode ser reflexo de diversos
fatores (abióticos ou bióticos), sendo o principal deles a incidência de
doenças fúngicas, bacterianas, viróticas e/ou as causadas por nematoides.
Devido ao potencial de agressividade de algumas doenças, a diagnose
precoce delas dentro da lavoura é imprescindível para o estabelecimento de
medidas efetivas de controle. Assim sendo, a busca constante por técnicas de
18
diagnose mais rápidas, precisas e confiáveis tem sido uma prioridade nos
programas de pesquisa ligados à cultura da batata em todo o mundo.
2.2 Viroses de batata
Dentre as doenças que mais se destacam na cultura da batata estão as
de etiologia viral. Os primeiros relatos de viroses em plantas de batata no
Brasil datam da década de 1930. São descritas aproximadamente 40 tipos de
viroses diferentes infectando batatas no mundo, e mais da metade delas já
foram detectadas no país (KERLAN, 2006; SOUZA DIAS; IAMAUTI,
1997).
Os vírus comumente reconhecidos por comprometer a rentabilidade
da cultura da batata são: Potato leafroll virus (PLRV) gênero Polerovirus;
Potato virus Y (PVY) e Potato virus A (PVA), gênero Potyvirus; Potato
virus X (PVX) gênero Potexvirus; Potato virus S (PVS), e Potato virus M
(PVM) gênero Carlavirus, que causam no campo e durante a pós-colheita
sintomas variados que vão de leves a severos acarretando perdas econômicas
significativas do cultivo (KERLAN; MOURY, 2008; VALKONEN, 2007;
YARDIMCI; KILIÇ; OZDEMIR, 2014).
No Brasil, o vírus do enrolamento da folha (PLRV) era considerado
o único causador de perdas para o cultivo da batata. Porém com a introdução
do Potato virus Y em tubérculos-semente provenientes de importação, o
quadro epidemiológico do país sofreu uma mudança drástica devido ao alto
potencial de disseminação deste vírus no campo. O constante monitoramento
do PLRV e do PVY é uma prática rotineira nos campos produtores de batata
no mundo todo (VALKONEN, 2007; WANG et al., 2011). Atualmente, o
vírus do enrolamento da folha (PLRV) encontra-se sob controle, assim como
os vírus PVX, PVS, PVA e PVM. Estes últimos não apresentam relevância
epidemiológica no país, uma vez que os níveis de detecção para os mesmo
são muito baixos. Isto porque os tubérculos-semente utilizados para plantio
19
têm sido constantemente monitorados, por razões que variam desde a
incidência até a necessidade de proteger o país contra a entrada de material
importado, apresentando alta incidência dos vírus (AVILA; MELO; LEITE,
2007; FIGUEIRA, 2002; SILVA et al., 2005).
Diversas medidas são necessárias para controlar a disseminação
dessas doenças nas lavouras. Entre elas, conhecer a ecologia das viroses é
imprescindível para a produção adequada de tubérculos-sementes. A
utilização de sementes certificadas, que ainda é a medida mais importante
para evitar a introdução precoce dos vírus nas lavouras, além do uso de
cultivares resistentes e o controle dos vetores que também são medidas
indispensáveis para obter sucesso nessa cultura (HALTERMAN;
CHARKOWSKI; VERCHOT, 2012; PELLETIER et al., 2012).
2.3 Potato virus Y (PVY) e seus recombinantes
O Potato virus Y (PVY) é a espécie tipo do gênero Potyvirus
(família Potyviridae) que contém a maioria dos vírus economicamente
importantes para o Brasil e o mundo. O PVY foi descrito pela primeira vez
por Smith em 1931, e desde então, tem sido um dos principais vírus de
planta estudados, especialmente por estar intimamente associado à
degeneração da batata (HARRISON et al., 1971; KERLAN, 2006;
SCHOLTHOF et al., 2011; SHUKLA; WARD; BRUNT, 1994; SMITH,
1931).
Assim como todos os membros do gênero Potyvirus, o genoma do
PVY é constituído de uma fita simples de RNA senso positivo (ssRNA+),
apresentando uma cauda poly (A) no terminal 3’ e uma proteína VPg
covalentemente ligada ao terminal 5’. Essas estruturas terminais atuam na
proteção e replicação do genoma, e também como reguladores da expressão
gênica. O genoma de ssRNA+, com aproximadamente 9.7kb, codifica uma
ORF (Open Reading Frame) flanqueada por duas regiões não traduzidas, e
20
expressa como uma poliproteína de aproximadamente 3062 aminoácidos.
Essa poliproteína viral é autoclivada em 10 proteínas funcionais (P1, HC-
Pro, P3, 6K1, CI, 6K2, VPg, Nla, Nib e CP) por três proteases específicas do
vírus (BERGER et al., 2005; KARASEV; GRAY, 2013; LARBI et al., 2012;
RIECHMANN et al., 1992).
Chung et al. (2008) descobriram uma segunda ORF conservada na
família Potyviridae denominada PIPO, incorporada à ORF maior
(poliproteína) na região do cistron P3 com tamanho variável entre os
potyvirus. Esta nova ORF é traduzida no frame +2 de leitura e,
possivelmente está envolvida na replicação, movimento, supressão do
silenciamento sistêmico ou ainda em uma combinação de outras funções.
Estudos realizados por Wei et al. (2010), confirmaram que a proteína P3N-
PIPO coordena, junto a proteína CI codificada pela poliproteína, o
movimento célula-a-célula através da formação de estruturas cônicas nos
plasmodesmos que permitem o movimento intercelular.
Em Potato virus Y (PVY) a variação de sequências de nucleotídeos
do gene PIPO extraídos de batata, quando comparadas com outras
sequências de estirpes de PVY publicadas, apresentaram 92% de
similaridade indicando que o gene PIPO em PVY é altamente conservado.
Desta forma sugere-se que o gene PIPO possa ser um novo marcador para
análise filogenética do gênero (GAO, 2013). Cuevas et al. (2012) também
observaram que a P3N-PIPO apresenta tamanhos variáveis comparando
diferentes isolados de PVY, o que permite classificá-los em grupos distintos.
Entre as proteínas codificadas pelo genoma do gênero Potyvirus
existe alta similaridade, deste modo é possível inferir sobre a função de cada
uma delas fazendo uma analogia entre os membros deste grupo. As três
proteases virais específicas responsáveis pela clivagem da poliproteína
durante o processamento do genoma viral são NIa, P1 e HC-Pro. A primeira
proteína codificada pela região 5’ do genoma do PVY (P1) exerce, além da
atividade proteolítica, forte influência sobre a sintomatologia e o movimento
21
do vírus célula-a-célula. A Helper Component-Proteinase (HC-Pro) está
diretamente ligada à transmissão por afídeos, replicação do RNA viral,
movimento sistêmico, intensidade do sintoma e atua, inclusive, como
supressora do silenciamento gênico na planta. A proteína P3 desempenha
papel importante na patogenicidade e replicação viral, enquanto a proteína
inclusão citoplasmática (CI), possui atividade de ATPase, RNA helicase, e
também está associada ao movimento célula-a-célula, replicação e formação
de inclusões citoplasmáticas. A VPg auxilia na transmissão por afídeos e no
movimento célula-a-célula. A NIa-Pro ou (inclusão nuclear a) atua na
localização celular, na replicação viral, na especificidade ao hospedeiro, e na
interação proteína-proteína. A NIb (inclusão nuclear b) é a RNA polimerase
dependente do RNA (RdRp) nos Potyvirus, e possui atividade de replicase,
sendo geralmente responsável pela formação de inclusões no núcleo de
plantas infectadas. As duas proteínas pequenas 6K1 e 6K2 estão
provavelmente relacionadas ao processo de replicação do RNA viral
(ADAMS; ANTONIW; FAUQUET, 2005; BRAULT et al., 2010;
CARRINGTON; JENSEN; SCHAAD, 1998; PRUSS et al., 1997;
RIECHMANN et al., 1992; TIAN; VALKONEN, 2015; URCUQUI-
INCHIMA; HAENNI; BERNARDI, 2001; VERCHOT; CARRINGTON,
1995).
A partícula do PVY possui uma única proteína capsidial (CP) de 267
aminoácidos (aa), codificada pelo fragmento C-terminal da poliproteína.
Esta proteína tem a função de encapsidar o RNA viral, formando uma
partícula simétrica alongada e flexível, de aproximadamente 740nm de
comprimento e 11nm de diâmetro (DE BOKX; HUTTINGA, 1981;
DELGADO-SANCHEZ; GROGAN, 1970; KARASEV; GRAY, 2013).
Além da encapsidação viral, está associada à transmissão por afídeos, no
movimento sistêmico célula-a-célula, e na regulação da amplificação do
RNA (ROJAS et al., 1997; URCUQUI-INCHIMA; HAENNI; BERNARDI,
2001).
22
Vírus, especialmente os de RNA, exibem um alto grau de
variabilidade que é resultado de três fenômenos que afetam seu genoma:
mutação, recombinação e rearranjo de segmentos do genoma (GLAIS;
TRIBODET; KERLAN, 2002). A recombinação de segmentos de RNA pode
ter diferentes funções durante o ciclo de vida viral, tais como: o reparo do
RNA defeituoso, o aumento da variabilidade de sequências, e facilitar a
adaptação e evolução dos vírus (NAGY; BUJARSKI, 1998). Essas trocas
podem ocorrer entre dois vírus ou duas estirpes virais diferentes, ou até
mesmo entre o vírus e seu hospedeiro (WOROBEY; HOLMES, 1999).
De acordo com Revers et al. (1996) o rearranjo genético causado
pela recombinação pode levar ao aparecimento de novos isolados de vírus no
campo, alguns dos quais podem adquirir novas propriedades biológicas.
Eventos de recombinação já foram encontrados em vários grupos, inclusive
entre as diferentes estirpes de PVY encontradas atualmente (GALVINO-
COSTA; 2012b; GLAIS; TRIBODET; KERLAN, 2002; KERLAN et al.,
2011; SIMON; BUJARSKI, 1994). Hu et al. (2009), avaliando algumas
estipes de PVY de acordo com os eventos de recombinação, observaram
nove padrões diferentes, que são resultantes da presença de uma até oito
junções de recombinação (JR).
Tradicionalmente, os isolados de PVY foram inicialmente
classificados em três grupos de estirpes principais: PVYO, PVY
N e PVY
C,
sendo estas estirpes não recombinantes. À medida que a variabilidade das
estirpes passou a ser estudada mais detalhadamente, novas classificações
foram surgindo. Uma delas é a classificação em estirpes genéticas, feita de
acordo com a reação de hipersensibilidade (HR) observada em cultivares de
batatas, indicadoras e em sintomas induzidos em fumo (Nicotiana tabacum).
Com base nesses critérios, as estirpes genéticas descritas são: PVYO, PVY
C,
PVYN, PVY
Z e PVY
E (BECZNER et al., 1984; BLANCO-URGOITI et al.,
1998; DE BOKX; HUTTINGA, 1981; GALVINO-COSTA et al., 2012b;
23
JONES, 1990; KERLAN et al., 2011; KERLAN; LE ROMANCER, 1999;
SINGH et al., 2008; SOUZA DIAS; IAMAUTI; 1997).
Outra classificação é a chamada classificação de estirpes
moleculares, esta se baseia na estrutura genômica do vírus e separa as
estirpes em não recombinantes (PVYO, PVY
N, PVY
C) e recombinantes
(PVYNTN
, PVYN:O/N-Wi, PVYN:O
, PVYE, PVY
NE-11, PVY
NA, PVY
NA-N/NTN,
PVYZNTN, PVY
NTN-NW). A análise das sequências de nucleotídeos
possibilita identificar cada recombinante de PVY, comparando-os aos tipos
parentais PVYO e PVY
N. Isto porque, a maioria dos recombinantes é uma
mistura de segmentos genômicos destes dois parentais, modificando-se
apenas o número e as posições em que cada evento de recombinação ocorreu
ao longo da evolução de cada estirpe viral. O PVYNTN
, por exemplo,
apresenta uma estrutura genômica recombinante portadora de 3-4 junções de
recombinação (JR), enquanto o PVYN:O/N-Wi
apresenta de 1-2 JR (GLAIS;
TRIBODET; KERLAN, 2002; LORENZEN et al., 2006a; SINGH et al.,
2003).
Nas últimas décadas uma vasta gama de estirpes e variantes com
diferentes graus de virulência, e apresentando propriedades biológicas,
sorológicas e moleculares atípicas tem sido observada. Galvino-Costa et al.
(2012) identificaram dois isolados recombinantes entre os genomas parentais
de PVYNTN
e PVY-NE-11, os quais foram descritos como uma nova estirpe
recombinante chamada PVYE.
Até o momento, constam na literatura nove estirpes recombinantes
oficialmente publicadas (citadas no parágrafo anterior), as quais possuem
significativo potencial para causar novos índices de perdas nas lavouras, uma
vez que, devido às variações genômicas inéditas não se sabe qual será o
efeito da interação vírus-planta sobre as cultivares de batatas brasileiras mais
plantadas nos últimos anos.
24
2.4 Transmissão e Sintomatologia
O PVY é eficientemente transmitido por mais de 40 espécies de
afídeos, principalmente pela espécie Myzus persicae, de um modo não
persistente ou estiletar, tornando difícil seu controle. No modo não
persistente, o vírus é adquirido em questão de segundos e conservado por
apenas alguns minutos por seus vetores. Também podem ser transmitidos
mecanicamente através de extratos de plantas infectadas, ou vegetativamente
por enxertia em tubérculos de batata contaminados (HARRINGTON;
KATIS; GIBSON, 1986; KARASEV; GRAY, 2013; KERLAN, 2006;
SALAS; LOPES; FERERES, 2010; SCHOLTHOF et al., 2011; WATSON;
ROBERTS, 1939).
A disseminação das partículas virais dos Potyvirus por afídeos
vetores é mediada por um produto funcional denominado “helper
component” ou HC-Pro, codificado pela região N-terminal da poliproteína.
A hipótese de ponte sugere que a HC-Pro interage com o estilete dos afídeos
vetores através de regiões altamente conservadas como o domínio peptidil
“KITC” (Lys-Ile-Thr-Cys), e o “PTK” (Pro-Thr-Lys) localizado na porção
N-terminal e C-terminal da sequência da HC-Pro, respectivamente. Estes
domínios são responsáveis por ligar a proteína da capa viral a receptores
desconhecidos do aparelho bucal do inseto. Por outro lado, outro domínio
conservado denominado “DAG” (Asp-Ala-Gly), localizado próximo ao N-
terminal da proteína capsidial do vírus também pode estar envolvido na
transmissão por afídeos. Neste caso, a região N-terminal da CP pode ligar-se
diretamente ao aparelho bucal do vetor através de uma mudança
conformacional da CP do vírus pela proteína HC (AMMAR; JARLFORS;
PIRONE, 1994; BLANC et al., 1997, 1998; BRAULT et al., 2010; PIRONE;
BLANC, 1996).
Embora uma das principais fontes de preocupação sejam as perdas
relativas à batata, muitas outras culturas da família Solanaceae sofrem com
25
danos significativos na produtividade: fumo, tomate e pimenta (DE BOKX;
HUTTINGA, 1981; KERLAN, 2006; QUENOUILLE; VASSILAKOS;
MOURY, 2013). Além destas, outras hospedeiras podem servir de
reservatórios naturais como espécies das famílias Chenopodiaceae e
Leguminosae (DE BOKX; HUTTINGA, 1981).
Em batata os sintomas causados por PVY podem afetar tanto
folhas quanto tubérculos. O aparecimento dos sintomas e a intensidade
dependem da cultivar de batata infectada, a estirpe de PVY associada às
condições ambientais, bem como, o tipo de infecção: primária – que consiste
na infecção durante o primeiro ano de plantio, ou secundária – proveniente
do plantio de tubérculos infectados, que geram plantas infectadas em
plantios subsequentes. Geralmente os sintomas causados em infecções
primárias são leves e podem surgir apenas no fim da estação de crescimento.
Por outro lado, os sintomas secundários podem ser visualizados no início da
estação de crescimento apresentando sintomas mais graves (DE BOKX;
HUTTINGA, 1981).
Os sintomas observados em plantas infectadas com PVY incluem
mosaico simples ou rugoso, algumas vezes associados com distorção foliar
ou encarquilhamento. Estes sintomas em geral levam ao retardamento do
crescimento e/ou nanismo da planta, podendo também ser observadas
diferentes reações necróticas com lesões locais, amarelecimento sistêmico,
necrose de nervuras ao longo da planta, e anéis necróticos no tubérculo de
batata (PTNRD – potato tuber necrotic ringspot disease) (BECZNER et al.,
1984; DE BOKX; HUTTINGA, 1981; KARASEV; GRAY, 2013;
TRIBODET et al., 2005). Glais, Tribodet e Kerlan (2002) comparando as
características moleculares com as propriedades patogênicas dos isolados
analisados, sugeriram que os sintomas de necrose causados por estirpes de
PVY podem estar relacionados à HC-Pro, induzindo necrose em folhas de
fumo, e o NIA, NIb e/ou proteína CP na necrose em tubérculos de batata.
26
Em plantas com infecções virais mistas os sintomas geralmente
apresentam sintomas mais graves, e o aumento dos níveis de titulação de um
ou ambos os vírus (SRINIVASAN; ALVAREZ, 2007). As infecções mistas
podem ocorrer entre dois ou mais vírus distintos ou por duas ou mais estirpes
diferentes do mesmo vírus, resultando em interações complexas com tipos de
fenótipos imprevisíveis da doença. A coinfecção da planta hospedeira
geralmente ocorre de duas formas, sinergística ou antagonística. O resultado
das interações vírus-vírus em antagonismo varia de exclusão mútua, a
eventual proteção cruzada. Em contraste, o sinergismo pode manifestar-se
por um aumento na replicação viral, ou na cooperação e coexistência entre
os membros do complexo viral, afetando ambos ou pelo menos um dos vírus
envolvidos, nesse caso o efeito dos sintomas sobre o hospedeiro torna-se
maior do que a soma dos efeitos individuais (ELENA; BERNET;
CARRASCO, 2014; SYLLER, 2012).
Syller e Grupa (2014), avaliando isolados de PVY representados
pelos grupos: PVYO, PVY
N:O/N-Wi e PVY
NTN através de diferentes métodos de
diagnose, observaram reduções significativas nas concentrações de certos
isolados de PVY durante a coinfecção. Além disso, eles também observaram
que as maiores e menores taxas de transmissão do vírus pelos pulgões,
individualmente, foram observadas para os isolados de PVYNTN
e PVYO,
respectivamente. Os pulgões individuais de M. persicae foram capazes de
transmitir simultaneamente dois isolados de PVY, evidenciando que o efeito
da disseminação de vírus nas lavouras infectadas pode ser agravado na
presença de infecções mistas de estirpes de PVY.
2.5 Métodos de diagnose de vírus
O controle eficiente de PVY exige a disponibilidade de métodos
confiáveis de detecção e identificação de estirpes de PVY. Os métodos
frequentemente utilizados para esse fim têm demandado constante
27
atualização devido ao crescente número de novas estirpes variantes surgidas
a cada ano. Atualmente, o grande objetivo da maioria dos produtores é
reduzir a incidência de PVY no campo. Porém, em algumas variedades de
batata os sintomas foliares de PVY são muito leves e quase imperceptíveis,
impossibilitando a identificação de plantas infectadas no campo ou mesmo
durante a certificação de lotes de tubérculos-semente.
Inicialmente, eram utilizadas informações baseadas nas propriedades
sorológicas da proteína do capsídeo viral e na gama de hospedeiros, com o
objetivo de identificar e caracterizar os vírus de plantas. As propriedades
imunogênicas de PVY em interações antígeno-anticorpo estudadas foram
utilizadas para a formulação de anticorpos policlonais e/ou monoclonais para
ensaios sorológicos do tipo ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
utilizando sanduíche duplo (DAS) ou triplo (TAS) (GURGELI; FRIES,
1983; MAAT; DE BOKX, 1978; SHUKLA et al., 1989; SHUKLA; WARD,
1989). Esses anticorpos foram utilizados de forma satisfatória por muitos
anos na detecção dos isolados de PVY. No entanto, o surgimento das muitas
variantes de PVY evidenciou as limitações das ferramentas disponíveis com
base sorológica, uma vez que estas, apenas são capazes de distinguir entre
PVYO, PVY
N ou PVY
C, mas não diferenciam isolados do tipo N de NTN ou
O de N:O. Desta forma, estirpes que apresentem o mesmo sorotipo não
podem ser identificadas separadamente através do método DAS-ELISA, por
ele utilizar anticorpos policlonais, capazes de reagir com qualquer uma das
estirpes de PVY (KARASEV et al., 2010; SINGH et al., 2008).
O TAS-ELISA, que emprega anticorpos monoclonais para o
reconhecimento de estirpes específicas, também, nem sempre é eficiente,
porque algumas estirpes apresentam a mesma capa proteica e recombinações
em outros segmentos do genoma. Assim sendo, a técnica RT-PCR (reverse
transcription polymerase chain reaction) poderia ser uma alternativa mais
eficiente, pois permite o desenho de primers para os segmentos específicos
em que ocorreu a variabilidade (CHIKH-ALI et al., 2010; NIE; SINGH,
28
2002). Geralmente o uso combinado das técnicas diagnósticas é a melhor
abordagem para a obtenção de resultados mais confiáveis e com maior grau
de sensibilidade. A imunocaptura, por exemplo, pode ser usada para
melhorar a sensibilidade e/ou especificidade de testes de PCR, e assim
superar os problemas relacionados a inibidores nas amostras (WARD et al.,
2004).
As diversas ferramentas descritas para diagnose como, por exemplo,
a fluorescência competitiva RT-PCR (WALSH et al., 2001), o multiplex
imunoensaio de microesfera (MIA) (BERGERVOET et al., 2008), a RT-
PCR (BOONHAM et al., 2002; DU; CHEN; HIRUKI, 2006; NIE; SINGH,
2002; RIGOTTI; GUGERLI, 2007), e a imunocaptura (IC)-RT-PCR e
multiplex RT-PCR, entre outras, são ferramentas eficientes na capacidade de
detectar isolados de PVY, mas não são ferramentas quantitativas (NIE;
SINGH, 2003).
Em contrapartida, a técnica de PCR em tempo real (qPCR),
apresenta todos os requisitos para uma detecção rápida, e quantificação
precisa, inclusive de quantidades mínimas de ácidos nucléicos (HEID et al.,
1996; SAPONARI; MANJUNATH; YOKOMI, 2008). A PCR em tempo
real desenvolvida para fitovírus cujo genoma é RNA (RT-qPCR)
proporcionou resultados satisfatórios em vários estudos já descritos
(BALME-SINIBALDI et al., 2006; FAGERIA et al., 2013; SINGH et al.,
2013; TANG et al., 2014). O diferencial dessa técnica consiste no
acompanhamento da reação a cada ciclo, apresentando elevado rendimento,
sensibilidade, especificidade, reprodutibilidade quando comparado ao RT-
PCR convencional. O princípio do método consiste na quantificação dos
ácidos nucleicos durante a fase exponencial da reação. O ponto que detecta
quando o ciclo atinge o limiar da fase exponencial da reação é denominado
“Cycle Threshold” (CT). Neste ponto, é possível a quantificação exata e
reproduzível da amostra com base na fluorescência emitida. Compostos
fluorescentes, presentes na reação, têm a função de gerar sinais luminosos
29
que aumentam proporcionalmente a quantidade de produto da PCR, assim os
valores da fluorescência vão sendo gravados durante cada ciclo,
representando o produto amplificado (NOVAIS; PIRES-ALVES, 2004;
SAPONARI; MANJUNATH; YOKOMI, 2008).
Um dos tipos de RT-qPCR utiliza sondas de hidrólise, que
possibilitam tanto a detecção de vírus em infecções simples quanto em
mistas, além de permitir a diferenciação de duas ou mais estirpes muito
próximas em uma mesma planta hospedeira (AGINDOTAN; SHIEL;
BERGER, 2007; DUBIELA et al., 2013; OSMAN et al., 2013). Essa técnica
se baseia na detecção e monitoramento em tempo real da atividade
exonuclease 5’‐3’ da Taq DNA polimerase que é responsável por degradar a
sonda (HOLLAND et al., 1991). Neste sistema são utilizados dois primers
específicos (foward e reverse) para uma determinada sequência de DNA
alvo, juntamente a sonda de hidrólise complementar à região do fragmento
de DNA entre os primers. As sondas são constituídas de oligonucleotídeos
ligados a um fluorocromo com especificidade para uma determinada
sequência de DNA alvo. Na extremidade 3’ dessas sondas é ligada uma
molécula quencher responsável por captar a energia da molécula repórter e
dissipá-la na forma de luz ou calor, e na extremidade 5’ um fluorocromo
repórter. A proximidade entre estas duas moléculas quencher e reporter no
início da reação suprime a detecção da fluorescência pela transferência de
energia. Em seguida, à medida que ocorre a amplificação do DNA pelos
primers a atividade de exonuclease 5’-3’ da Taq DNA polimerase cliva a
sonda liberando o fluoróforo. Desta forma, a quantidade de fluorescência
monitorada é proporcional a quantidade de produto de PCR gerado,
possibilitando detectar exclusivamente a sequência específica nos
fragmentos de DNA amplificados durante cada ciclo (BUSTIN et al., 2009;
LUIGI; FAGGIOLI, 2011; NOVAIS; PIRES-ALVES, 2004).
Embora a tecnologia de PCR em tempo real, utilizando sondas de
hidrólise, possuam elevada especificidade e sensibilidade, ainda é
30
rotineiramente substituída por metodologias menos sensíveis e confiáveis e
ainda bastante laboriosas, resultado do elevado custo atribuído à técnica. No
entanto, considerando o nível de acurácia deste tipo de diagnose, torna-se
necessário o desenvolvimento de ensaios específicos que possibilitem uma
detecção rápida e altamente precisa para as fitoviroses de maior importância
para o país.
31
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Condução do experimento e obtenção das amostras
Os experimentos foram conduzidos em casa de vegetação, no
laboratório de Virologia Molecular, e no Centro de Indexação de Vírus de
Minas Gerais (CIV-MG) localizados no Departamento de Fitopatologia da
Universidade Federal de Lavras (DFP/UFLA).
Foram utilizados, no presente trabalho, dois tipos de material
vegetal: a) tubérculos ou folhas de batatas selecionados a partir de lotes
indexados no CIV-MG, recebidos de diferentes campos produtores, e b)
tubérculos coletados em Lavras-MG de estabelecimentos revendedores de
batata (verdurões, feiras, supermercados). Cada material coletado foi
identificado e os testes sorológicos e moleculares foram posteriormente
realizados como descrito a seguir.
3.2 Origem e manutenção dos isolados virais
Os isolados de PVYN:O/N-Wi
, denominado PED-AX e de PVYNTN
,
denominado LUI-AGA, foram provenientes da coleção de vírus mantida no
laboratório de Fitopatologia do DFP/UFLA (GALVINO-COSTA et al.,
2012a). A sua multiplicação foi feita por inoculação de material dessecado
em plantas de fumo (Nicotiana tabacum) cv. Turkish e Turkish NN. Para a
padronização das técnicas, as duas estirpes que foram detectadas nos testes
sorológicos e RT-PCR, foram inoculadas separadamente e em combinação
(NTN + Wilga) nas plantas de fumo. Plantas de fumo não inoculadas
serviram como controle.
Para a inoculação mecânica, tecidos dessecados de plantas de fumo,
infectadas com as estirpes citadas, foram triturados em presença de tampão
fosfato de sódio 0,001M pH 7,0 contendo sulfito de sódio na mesma
32
molaridade, e o extrato obtido foi friccionado nas folhas das plantas
receptoras previamente pulverizadas com carborundum (600 mesh) como
abrasivo.
As plantas infectadas foram analisadas por DAS e TAS-ELISA, RT-
PCR multiplex (conforme será descrito posteriormente) e RT-qPCR, cerca
de 3 a 4 semanas após a inoculação. Durante toda a realização dos
experimentos as plantas foram mantidas em casa de vegetação, a uma
distância segura entre os dois isolados, para que não houvesse contaminação.
3.3 Coleta, processamento das amostras e avaliação dos sintomas
O material de batata coletado (folhas e/ou tubérculos) foi
inicialmente analisado por DAS-ELISA para determinar a presença dos
seguintes vírus: PVY, PVX, PVS e PLRV. Foram empregados antissoros
policlonais da Agdia, seguindo o protocolo sugerido pelo fabricante. Os
materiais infectados apenas pelo PVY foram selecionados, sendo que as
folhas foram diretamente processadas através da obtenção do extrato de
parte delas para posterior análise por TAS-ELISA e extração do RNA total
para futuro processamento por RT-PCR e RT-qPCR. Os tubérculos foram
tratados com ácido giberélico a 10ppm e, após a brotação, plantados em casa
de vegetação para a análise das plantas deles originadas, conforme feito para
as folhas.
3.4 Detecção das estirpes de PVY por TAS-ELISA
Na técnica sorológica TAS-ELISA foram realizados dois testes
distintos empregando anticorpos de diferentes origens, para garantir a
detecção das estirpes: em um dos testes foi empregado um anticorpo
policlonal (UID8) e dois anticorpos monoclonais da empresa Agdia: MAb2,
que detecta o PVYO, PVY
N:O, PVYN:O/N-Wi e a estirpe PVY
C
33
(MCDONALD; KRISTJANSSON, 1993) e o IF5 que detecta estirpes de
PVYN, PVY
O-O5 e PVY
NTN (ELLIS; STACE-SMITH; VILLIERS, 1996;
KARASEV et al., 2010); no segundo teste foram empregados o anticorpo
policlonal G500, e os monoclonais SASA-O, específico para PVYO, PVY
N:O,
PVYN:O/N-Wi
e PVYC, e o SASA-N que detecta PVY
N e PVY
NTN, seguindo-se
o protocolo do fabricante com modificações conforme descrito por Karasev
et al. (2010). Foram utilizados como controles positivos para os testes
sorológicos os dois isolados virais já discriminados (PED-AX e LUI-AGA),
inoculados separadamente nas plantas de fumo.
Foram analisadas 165 amostras com a utilização dos anticorpos
monoclonais específicos para estirpe necrótica (1F5 e SASA-N) e estirpe
comum (MAb2 e SASA-O), constituídas por tubérculos e folhas de batata
que apresentaram resultado positivo para PVY, no teste DAS-ELISA. Dessas
amostras, 154 foram coletadas a partir de lotes de sementes indexados pelo
Centro de Indexação de Vírus – CIV-MG, e 11 foram provenientes de
estabelecimentos revendedores, tais como: mercados, feiras e verdurões
locais.
3.5 Extração do RNA total
A extração do RNA total foi realizada seguindo o método Trizol
(AFGC PROTOCOLS, 2014). As folhas jovens infectadas foram maceradas
na presença de nitrogênio líquido e o pó obtido foi homogeneizado com a
solução extratora Trizol (38% de fenol saturado, 0,8M de tiocianato de
guanidina, 0,4M de tiocianato de amônio e 0,1M de acetato de sódio, pH 5 e
5% de glicerol), na proporção de 1g de tecido / 5mL solução. Em seguida, o
extrato obtido foi transferido para microtubos e esses foram incubados em
banho-maria por 5 minutos a 60 °C e centrifugados a 12.000 rpm por 10
minutos, a 4 ºC. O pellet foi descartado e o sobrenadante transferido para
novos microtubos, adicionando-se a eles 300μL de clorofórmio. Esses tubos
34
foram agitados em vórtex e deixados à temperatura ambiente por 3 minutos
e, em seguida, centrifugados a 12.000 rpm por 10 minutos, a 4 ºC. Após a
transferência da fase aquosa para novos tubos, foi adicionado ½ volume, do
sobrenadante coletado, de solução contendo 0,8M de Citrato de Sódio +
1,2M de Cloreto de Sódio e ½ volume de isopropanol. Em seguida, os tubos
foram agitados cuidadosamente por inversão e deixados à temperatura
ambiente por 10 minutos, com posterior centrifugação a 12.000 rpm por 10
minutos, a 4 ºC. O sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado com
etanol 70% gelado (-20 oC). O RNA foi, então, seco a vácuo e ressuspendido
em 25μL de água ultrapura tratada com dietilpirocarbonato (DEPC). O RNA
total extraído foi analisado em gel de agarose a 0,7%, contrastado com Gel
Red Nucleic Acid Gel Stain (Biotium), antes de ser utilizado nos testes
subsequentes. A avaliação de integridade e pureza do RNA total extraído foi
realizada pelo equipamento NanoVue Plus™(GE Healthcare), separado em
alíquotas e armazenado a -80 oC para posterior utilização nos testes de RT-
PCR e RT-qPCR.
3.6 Síntese do cDNA e PCR multiplex
O teste RT-PCR Multiplex empregado foi o descrito por Lorenzen et
al. (2006a), empregando-se um conjunto de oito primers, que estão
discriminados na Tabela 1.
Tabela 1 Combinação de primers empregados para a detecção das diferentes
estirpes de PVY por meio de RT-PCR multiplex
Vírus Primers Amplificação (pb) PVY
NTN, PVY
N-Wi N2258 + o2439c 181bp
PVYO
O2172 + o 2439c 267bp PVY
N N2258 + n2650c 398bp
PVYN,PVY
NA-N/NTN N5707 + A6032m 328bp
PVYNTN
S5585 + A6032m 452bp PVYN:O/N-Wi, PVY
O S5585 + 06266c 689bp
Fonte: Lorenzen et al. (2006a)
35
Para a síntese do cDNA, 1,2µL do RNA total, extraído da planta
infectada foi incubado à temperatura de 70 ºC por 5 min. Em seguida foram
adicionados 0,6µL da enzima Superscript II (Invitrogen), 6µL de 5x RNA
Buffer, 12µL de dNTP (2,5mM), 0,3µL de RNAse out, 1,2µL de Oligo dT
(3µM), 8,7µL de água ultrapura tratada com DEPC. A reação foi submetida
à temperatura de 25 ºC por 2 min e em seguida essa temperatura aumentou 1
ºC a cada 30s por 17 vezes, ficando no final a 42 ºC por 45min. Após
alcançar essa temperatura, houve novamente um incremento de 1 ºC a cada 2
min durante 18 ciclos, e finalmente a reação foi mantida a 70 ºC por 10min,
sendo transferida imediatamente para o gelo para posterior utilização na
reação de amplificação (PCR).
A reação de PCR multiplex para cada isolado de PVY foi constituída
por 7,95µL de água ultrapura com DEPC, 0,75 de MgCl2 (50mM), 1,6µL de
dNTP mix (2,5mM), 2µL de 10x tampão do PCR, 6,4µL da mistura de
primers na concentração de 3µM cada, 0,3µL de TAQ DNA polimerase
(INVITROGEN) e 1µL do cDNA obtido na reação anterior. Foram
empregados 33 ciclos de amplificação, sendo eles distribuídos em duas
etapas. A primeira foi: 95 °C/2min, 11 ciclos de 95 °C/30s, 66 °C/30s e 72
°C/1min, diminuindo a temperatura de anelamento em 0,5 ºC/ciclo. A
segunda foi: 22 ciclos de 95 ºC/30s, 60 ºC/30s e 72 ºC/1min, com extensão
final a 72 °C/7min.
Uma reação de PCR adicional foi realizada utilizando os primers
AGA-8031F, descrito por Galvino-Costa et al. (2012b), e NE11-9026R,
descrito por Lorenzen et al. (2008), para identificar possíveis isolados
pertencentes à estirpe PVYE, os quais teriam sido inicialmente classificados
como estirpe NTN na RT-PCR multiplex. O ciclo da reação de PCR
utilizado iniciou-se em 94 ºC por 2min, seguido por 30 ciclos de 94 ºC/1min,
60 ºC/1min e 72 ºC/2min, com extensão final de 72 ºC por 5min.
36
Após os ciclos de amplificação, os resultados da PCR foram
verificados em gel de agarose a 0,7%, contrastado com Gel Red Nucleic Acid
Gel Stain (Biotium).
4 RT-qPCR
O sistema de detecção utilizado na reação de RT-qPCR, bem como o
método utilizado para a análise quantitativa do número de partículas virais
presentes nas amostras foi realizado conforme descrito a seguir:
4.1 Desenho das Sondas e Primers
Foram utilizados dois conjuntos de sondas e primers desenvolvidos
por Santos (2014) através do programa Primer Quest (Integrated DNA
Technologies, IDT®), e com base nas regiões do genoma portadoras das
junções de recombinação específicas das estirpes PVYNTN
e PVYN:O/N-Wi
. Foi
necessário substituir o primer reverse qNTN-R (SANTOS, 2014) pelo
A6032m-R, descrito por Lorenzen et al. (2006a), para obtenção de uma
detecção mais específica do PVYNTN
. As sequências dos primers e sondas
utilizados estão indicadas na Tabela 2.
Tabela 2 Sequência de nucleotídeos dos primers e sondas utilizados para a
detecção de variantes genéticos do PVY por RT-qPCR
Variante
detectado Conjunto de primers/sondas utilizados Amplicon
PVYNTN
Primer qNTN-F: 5’-GGGCTGGCTTTGAAATTGAC- 3’
Primer A6032m-R: 5’- CTTGCGGACATCACTAAAGCG- 3’
Sonda qNTN-P: 5’HEX-TGGATCTGCATACAGGAAGAAGGGA- 3’
265pb
PVYWi
Primer qWi-F: 5-ACGCGCATCCAGAAGAAA- 3’
Primer qWi-R: 5’-TCTCCACCAGCAATAGTGATCTTTGAC- 3’
Sonda qWi-P: 5’ Cy5-TCACTTCCAGATGGCAGCTCCTAGTA- 3’
125pb
Fonte: Modificado de Santos (2014) (Dados não publicados)
37
4.2 Elaboração da curva padrão
Os fragmentos amplificados para a elaboração da curva padrão de
cada uma das estirpes controle PVYNTN
e PVYN:O/N-Wi
utilizadas nos testes,
foram obtidos através da RT-PCR utilizando os primers descritos no Item
4.1. O ciclo utilizado para a reação de PCR iniciou-se em 94 ºC por 2min,
seguido por 30 ciclos de 94 ºC/1min, 60 ºC/1min e 72 ºC/2min, com
extensão final de 72 ºC por 5min.
Os produtos de RT-PCR obtidos com os pares de primers do PCR
em tempo real, específicos para as estirpes, foram purificados utilizando-se o
kit Wizard® SV Gel e PCR Clean-Up System (Promega). Os fragmentos
foram ligados ao vetor pGEM®-T Easy (Promega) e clonados em
Escherichia coli αDH6, seguindo as indicações dos fabricantes. Os
plasmídeos foram extraídos através do método de lise alcalina (Miniprep) e,
posteriormente, quantificados com o equipamento NanoVue Plus™ (GE
Healthcare) para o cálculo do número de cópias virais/μl de cada estirpe e
também para análise de pureza das amostras. Após a quantificação, o
número de cópias virais foi calculado utilizando-se a fórmula descrita por
Dai et al. (2013):
Em que:
X = quantificação do DNA em g/µl;
6 × 1023
= número de moléculas em 1 mol (constante de Avogadro);
Comprimento do plasmídeo (pb) = plasmídeo pGEM®-T Easy (3015pb) + inserto
(PED-AX = 125pb ou LUI-AGA = 265pb);
660 = peso molecular médio de 1 pb de DNA.
38
Os plasmídeos com índices de pureza mais altos (relações A260/280
e A260/230) foram selecionados para o processo de linearização e posterior
composição da curva padrão. O processo de linearização foi realizado
através da restrição plasmidial usando a enzima SalI (Fermentas), seguindo
as instruções do fabricante. Os plasmídeos linearizados foram purificados
com fenol/clorofórmio, conforme recomendado pelo fabricante,
adicionando-se a cada 1µl do DNA plasmidial linearizado um volume de
10µl de 3M Acetato de sódio, a mistura foi homogeneizada e, em seguida,
extraída por centrifugação com igual volume de fenol/clorofórmio 1:1. O
sobrenadante foi transferido para novos tubos e precipitado com igual
volume de clorofórmio. Novamente o sobrenadante foi transferido para um
novo tubo e a ele foi adicionado duas vezes de seu volume de etanol
absoluto, os tubos foram incubados a -20 ºC durante 30 min para
precipitação do DNA. Após esse período, procedeu-se a centrifugação do
material a 12000rpm por 20 minutos. O pellet formado foi lavado em etanol
70% gelado, e posteriormente, ressuspendido em água ultrapura tratada com
DEPC. Os plasmídeos linearizados e purificados foram utilizados para a
construção da curva padrão da qPCR, oito pontos de diluições seriadas
foram preparados englobando concentrações que variaram de 101 até 10
9
cópias virais/μl.
4.3 Extração de RNA, síntese de cDNA e ensaio qPCR
A extração do RNA total das plantas infectadas, destinado a RT-
qPCR, foi realizada conforme já descrito no Item 4.6.
A reação de RT-qPCR foi conduzida em duas etapas separadas,
sendo a síntese do cDNA a primeira delas, realizada com a enzima
Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen) e o primer Oligo DT
(Promega), seguindo a termociclagem já descrita no Item 3.6.
39
A reação de qPCR utilizando o cDNA recém-sintetizado foi montada
para um volume final de 20μl, contendo: 10μl do TaqMan Universal Master
Mix II (Apllied Biosystems), 0,9μM de cada primer, 0,25μM da sonda
específica para a estirpe (Tabela 2) a ser detectada e 2μl do cDNA. O
equipamento utilizado foi o Eco Real-Time PCR (Illumina) e a
termociclagem empregada foi 50 ºC por 2 min na etapa de UDG Incubation,
95 ºC por 10 min para ativação da Polimerase, seguidos por 40 repetições
dos ciclos de: 95 ºC por 30 segundos e 60 ºC por 1 min (para PVYN:O/N-Wi
) ou
2 min (para PVYNTN
).
As amostras processadas em triplicatas foram analisadas utilizando o
software EcoStudy v5.0 (Illumina).
4.4 Validação do RT-qPCR para diagnose de Potato virus Y
A validação do processo de detecção via RT-PCR em tempo real foi
realizada comparando-se os resultados obtidos pelos métodos de RT-PCR
multiplex (convencional) e os resultados do teste TAS-ELISA aos resultados
obtidos com o RT-PCR em tempo real tanto para as amostras controle
quanto para as desconhecidas.
40
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Sintomas observados nas plantas de batata provenientes dos
tubérculos infectados
As 39 amostras de São Gotardo, constituídas por folhas que
apresentaram resultado positivo para PVY quando foram analisadas no CIV-
MG, foram coletadas no final do ciclo, de modo que pelo estágio de quase
senescência das plantas não permitiram uma avaliação dos sintomas. Sendo
de um campo de sementes, provavelmente foram infectadas no final da
estação corrente, e continham uma baixa porcentagem de partículas virais,
não apresentando sintomas.
As 126 amostras restantes foram provenientes dos tubérculos que
apresentaram resultado positivo para PVY por DAS-ELISA. Os sintomas
apresentados por elas foram classificados em mosaico forte e redução da
área foliar (Mo+++/RF), mosaico forte (Mo+++), mosaico médio (Mo++) e
mosaico leve (Mo+) (Figura 1). Entre as 53 plantas oriundas dos tubérculos
de batata produzidos em Ouro Fino, quatro não apresentaram sintomas
aparentes, quatro apresentaram mosaico forte mais redução foliar, cinco
apresentaram apenas mosaico forte, treze apresentaram mosaico médio e a
maioria, vinte e sete plantas, apresentou apenas mosaico leve (Tabela 3).
Experimentos realizados por Ramalho (2012) mostraram que isolados de
PVYN:O/N-Wi
e de PVYNTN
não induziram sintomas em plantas da cv. Ágata
em infecções primárias, ou seja, quando a planta é infectada na estação
corrente. Sintomas com diferentes intensidades somente apareceram em
infecções secundárias, na segunda e terceira geração quando a planta estava
infectada com PVYNTN
, mas em alguns casos os isolados de PVYN:O/N-Wi
não
induziram sintomas aparentes até a terceira geração.
Das cinquenta e duas plantas originadas dos tubérculos produzidos
em Maria da Fé, dez apresentaram mosaico forte, treze apresentaram
41
mosaico médio e novamente a maioria, ou seja, vinte e nove, apresentou
mosaico leve. Em Cristina, entre as dez plantas avaliadas, uma apresentava
mosaico forte, duas apresentaram mosaico médio e sete apresentaram
mosaico leve. Finalmente, das onze plantas obtidas a partir dos tubérculos
provenientes dos supermercados e verdurões locais, três apresentaram
mosaico médio e oito apresentaram mosaico leve. A maioria das amostras
com sintomas mais acentuados (mosaico médio e forte) apresentou sorologia
positiva para PVYN quer seja em infecções simples ou mistas.
A intensidade e o aspecto dos sintomas observados em plantas de
batata variam consideravelmente entre cultivares, e geralmente estão
associados ao estágio no qual estas plantas foram infectadas e a estirpe de
PVY envolvida na infecção, bem como as condições ambientais em que
essas plantas se encontravam no campo. Podem surgir além de mosaico,
outros sintomas, tais como: lesões necróticas, amarelecimento sistêmico e
necrose internerval (KARASEV; GRAY, 2013; KERLAN; LE
ROMANCER, 1999). Além disso, a estirpe PVYNTN
é reconhecida por
induzir anéis necróticos (PTNRD) nos tubérculos de cultivares de batata
suscetível, afetando diretamente a qualidade da produção (BALDAUF;
GRAY; PERRY, 2006; LE-ROMANCER; NEDELLEC, 1997;
MCDONALD; SINGH, 1996). Entretanto, a cultivar Ágata tem se mostrado
aparentemente uma exceção as demais cultivares por não apresentar
sintomas foliares, ou anéis nos tubérculos, quando infectada por esta estirpe.
As infecções tardias na planta também não induzem perdas significativas na
produção, embora os vírus possam se translocar para os tubérculos,
geralmente ocasionando a degenerescência da semente em plantios
sucessivos (BOONHAM et al., 2002; COSTA et al., 2010; KARASEV;
GRAY, 2013).
42
Figura 1 Padrões de sintomas apresentados pelas plantas de batata provenientes dos
tubérculos plantados: A1) Controle negativo: Planta de batata sadia; A2 e A3) MO+:
609/5 e CMF92; A4) MO++: S4; A5, A6 e A7) Mo+++: 610/35, CMF1 e 608/84;
A8 e A9) MO+++/RF: 611/33, 608/63.
43
Tabela 3 Origem e denominação dos isolados analisados, sintomas induzidos nas plantas de batata e resultado da análise por TAS-ELISA e por
RT-PCR
Isolado Origem
Cultivar
Sintomas
Resultados obtidos quando
as amostras foram analisadas por
TAS-ELISA, usando os anticorpos
indicados Possível (is)
Estirpe(s)
Resultados obtidos
por RT-PCR
Multiplex Anticorpos
AGDIA SASA
1F5 MAb2 SN SO
618.1/1 São Gotardo Ágata S/SA - + - - YO/N-Wi
N:O/N-Wi 618.1/3 São Gotardo Ágata S/SA + + + + Y
N/NTN+Y
O/N:Wi N:O/N-Wi +NTN
618.1/4 São Gotardo Ágata S/SA + - + - YN/NTN
NTN
618.1/11 São Gotardo Ágata S/SA + + + + YN/NTN
+YO/N:Wi
N:O/N-Wi +NTN 618.1/18 São Gotardo Ágata S/SA - - - - - NTN
618.1/24 São Gotardo Ágata S/SA + + + + YN/NTN
+YO/N:Wi
N:O/N-Wi +NTN
618.1/25 São Gotardo Ágata S/SA - + - - YO/N-WI
N:O/N-Wi 619.1/2 São Gotardo Ágata S/SA - + - - Y
O/N-WI N:O/N-Wi
619.1/3 São Gotardo Ágata S/SA + - + - YN/NTN
NTN 619.1/4 São Gotardo Ágata S/SA + - + - Y
N/NTN NTN
619.1/5 São Gotardo Ágata S/SA + - + - YN/NTN
NTN
619.1/6 São Gotardo Ágata S/SA + - + - YN/NTN
NTN 619.1/7 São Gotardo Ágata S/SA + + + + Y
N/NTN+Y
O/N:Wi N:O/N-Wi +NTN
619.1/9 São Gotardo Ágata S/SA + - + - YN/NTN
NTN 619.1/10 São Gotardo Ágata S/SA - + - - Y
O/N-WI N:O/N-Wi
619.1/11 São Gotardo Ágata S/SA + + + + YN/NTN
+YO/N:Wi
N:O/N-Wi +NTN 619.1/13 São Gotardo Ágata S/SA - + - - Y
O/N-WI N:O/N-Wi
619.2/1 São Gotardo Ágata S/SA + + + + YN/NTN
+YO/N:Wi
N:O/N-Wi +NTN
619.2/2 São Gotardo Ágata S/SA + - + + YN/NTN
+YO/N:Wi
N:O/N-Wi +NTN
44
“Tabela 3, continua”
Isolado Origem
Cultivar
Sintomas
Resultados obtidos quando
as amostras foram analisadas por
TAS-ELISA, usando os anticorpos
indicados Possível (is)
Estirpe(s)
Resultados obtidos
por RT-PCR
Multiplex Anticorpos
AGDIA SASA
1F5 MAb2 SN SO 619.2/4 São Gotardo Ágata S/SA + - + - Y
N/NTN NTN
619.2/5 São Gotardo Ágata S/SA + - + - YN/NTN
NTN 619.2/8 São Gotardo Ágata S/SA - + - + Y
O/N-WI N:O/N-Wi +NTN
619.2/9 São Gotardo Ágata S/SA - + - - YO/N-WI
N:O/N-Wi+NTN 622.2/6 São Gotardo Ágata S/SA - - - - - NTN
622.2/8 São Gotardo Ágata S/SA + - + + YN/NTN
+YO/N:Wi
N:O/N-Wi +NTN
622.2/9 São Gotardo Ágata S/SA - - - - - N:O/N-Wi +NTN 622.2/12 São Gotardo Ágata S/SA - - - - - NTN
622.2/13 São Gotardo Ágata S/SA - - - - - NTN 622.2/15 São Gotardo Ágata S/SA - - - - - NTN
622.2/16 São Gotardo Ágata S/SA + + + + YN/NTN
+YO/N:Wi
N:O/N-Wi +NTN
622.2/17 São Gotardo Ágata S/SA + + + + YN/NTN
+YO/N:Wi
N:O/N-Wi +NTN 623.3/4 São Gotardo Ágata S/SA - + - - Y
O/N-WI N:O/N-Wi
623.3/12 São Gotardo Ágata S/SA - - - - - NTN 623.3/16 São Gotardo Ágata S/SA - + - - Y
O/N-WI N:O/N-Wi
624.3/6 São Gotardo Ágata S/SA + + + + YN/NTN
+YO/N:Wi
N:O/N-Wi +NTN 624.3/8 São Gotardo Ágata S/SA - + - - Y
O/N-WI N:O/N-Wi
624.3/15 São Gotardo Ágata S/SA + + + + YN/NTN
+YO/N:Wi
N:O/N-Wi +NTN
624.3/18 São Gotardo Ágata S/SA + + + + YN/NTN
+YO/N:Wi
N:O/N-Wi +NTN 624.3/24 São Gotardo Ágata S/SA + - + + Y
N/NTN+Y
O/N:Wi N:O/N-Wi +NTN
608/57 Ouro Fino Ágata MO+ - + - + YO/N-Wi
N:O/N-Wi
45
“Tabela 3, continua”
Isolado Origem
Cultivar
Sintomas
Resultados obtidos quando
as amostras foram analisadas por
TAS-ELISA, usando os anticorpos
indicados Possível (is)
Estirpe(s)
Resultados obtidos
por RT-PCR
Multiplex Anticorpos
AGDIA SASA
1F5 MAb2 SN SO 608/63 Ouro Fino Ágata MO+++/RF + - + - Y
N/NTN NTN
608/84 Ouro Fino Ágata MO+++ + - + - YN/NTN
NTN 608/100 Ouro Fino Ágata MO+++ + - + - Y
N/NTN NTN
609/1 Ouro Fino Ágata MO+++ + - + - YN/NTN
NTN
609/2 Ouro Fino Ágata MO++ + - + - YN/NTN
NTN 609/5 Ouro Fino Ágata MO+ - + - + Y
O/N-WI N:O/N-Wi
609/8 Ouro Fino Ágata MO++ + - + - YN/NTN
NTN 609/11 Ouro Fino Ágata MO+ - + - + Y
O/N-WI N:O/N-Wi
609/12 Ouro Fino Ágata MO+ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi
609/32 Ouro Fino Ágata MO++ + - + - YN/NTN
NTN 609/41 Ouro Fino Ágata MO+ + - + - Y
N/NTN NTN
609/49 Ouro Fino Ágata MO+ + - + - YN/NTN
NTN 609/61 Ouro Fino Ágata MO+ - + - + Y
O/N-WI N:O/N-Wi
609/65 Ouro Fino Ágata MO+++/RF + - + - YN/NTN
NTN 609/68 Ouro Fino Ágata MO+ - + - + Y
O/N-WI N:O/N-Wi
609/77 Ouro Fino Ágata MO+ + - + - YN/NTN
NTN
609/93 Ouro Fino Ágata MO++ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi 610/1 Ouro Fino Ágata MO++ + - + - Y
N/NTN NTN
610/5 Ouro Fino Ágata MO++ + - + - YN/NTN
NTN 610/14 Ouro Fino Ágata MO++ + - + - Y
N/NTN NTN
610/22 Ouro Fino Ágata MO - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi
46
“Tabela 3, continua”
Isolado Origem
Cultivar
Sintomas
Resultados obtidos quando
as amostras foram analisadas por
TAS-ELISA, usando os anticorpos
indicados Possível (is)
Estirpe(s)
Resultados obtidos
por RT-PCR
Multiplex Anticorpos AGDIA SASA
1F5 MAb2 SN SO 610/27 Ouro Fino Ágata S/SA + - - - Y
N/NTN NTN
610/33 Ouro Fino Ágata MO+ + - + - YN/NTN
NTN 610/34 Ouro Fino Ágata MO+ - + - + Y
O/N-WI N:O/N-Wi+NTN
610/35 Ouro Fino Ágata MO+++ + - + - YN/NTN
NTN
610/41 Ouro Fino Ágata MO++ + - + - YN/NTN
NTN 610/42 Ouro Fino Ágata MO+ + - + - Y
N/NTN NTN
610/44 Ouro Fino Ágata MO+ + - + - YN/NTN
NTN 610/51 Ouro Fino Ágata MO++ + - + - Y
N/NTN NTN
610/56 Ouro Fino Ágata MO+ + - + - YN/NTN
NTN
610/57 Ouro Fino Ágata MO+ + - + - YN/NTN
NTN 610/69 Ouro Fino Ágata MO+++/RF + + + + Y
N/NTN+Y
O/N:Wi N:O/N-Wi +NTN
610/77 Ouro Fino Ágata MO+++ + - + - YN/NTN
NTN 610/82 Ouro Fino Ágata MO+ - + - + Y
O/N-WI N:O/N-Wi +NTN
610/89 Ouro Fino Ágata MO+ + - + - YN/NTN
N:O/N-Wi +NTN 610/93 Ouro Fino Ágata MO+ - + - + Y
O/N-WI N:O/N-Wi
610/94 Ouro Fino Ágata MO++ + + + + YN/NTN
+YO/N:Wi
N:O/N-Wi +NTN
610/95 Ouro Fino Ágata MO+ + - + - YN/NTN
NTN 610/98 Ouro Fino Ágata S/SA - - - - - N:O/N-Wi +NTN
610/100 Ouro Fino Ágata MO+ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi 611/33 Ouro Fino Ágata MO+++/RF + + + + Y
N/NTN+Y
O/N:Wi N:O/N-Wi +NTN
612/4 Ouro Fino Ágata MO+ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi
47
“Tabela 3, continua”
Isolado Origem
Cultivar
Sintomas
Resultados obtidos quando
as amostras foram analisadas por
TAS-ELISA, usando os anticorpos
indicados Possível (is)
Estirpe(s)
Resultados obtidos
por RT-PCR
Multiplex Anticorpos AGDIA SASA
1F5 MAb2 SN SO 612/6 Ouro Fino Ágata MO+ + - + - Y
N/NTN N:O/N-Wi +NTN
612/27 Ouro Fino Ágata MO+ + - + - YN/NTN
NTN 612/34 Ouro Fino Ágata MO+ + - + - Y
N/NTN NTN
612/46 Ouro Fino Ágata MO+ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi
612/56 Ouro Fino Ágata MO++ + - + - YN/NTN
NTN 612/57 Ouro Fino Ágata MO+ - + - + Y
O/N-WI N:O/N-Wi
612/59 Ouro Fino Ágata S/SA + - + - YN/NTN
NTN 612/73 Ouro Fino Ágata S/SA - - - - - N:O/N-Wi +NTN
612/76 Ouro Fino Ágata MO++ + - + - YN/NTN
NTN
612/86 Ouro Fino Ágata MO++ + - + - YN/NTN
NTN CMF1 Maria da Fé Caesar MO+++ + + + + Y
N/NTN+Y
O/N:Wi N:O/N-Wi +NTN
CMF2 Maria da Fé Caesar MO+++ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi CMF9 Maria da Fé Caesar MO++ - + - + Y
O/N-WI N:O/N-Wi
CMF10 Maria da Fé Caesar MO++ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi CMF18 Maria da Fé Caesar MO++ - + - + Y
O/N-WI N:O/N-Wi
CMF19 Maria da Fé Caesar MO++ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi
CMF20 Maria da Fé Caesar MO++ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi CMF21 Maria da Fé Caesar MO+ - + - + Y
O/N-WI N:O/N-Wi
CMF22 Maria da Fé Caesar MO+ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi CMF24 Maria da Fé Caesar MO+ - + - + Y
O/N-WI N:O/N-Wi
CMF33 Maria da Fé Caesar MO++ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi
48
“Tabela 3, continua”
Isolado Origem
Cultivar
Sintomas
Resultados obtidos quando
as amostras foram analisadas por
TAS-ELISA, usando os anticorpos
indicados Possível (is)
Estirpe(s)
Resultados obtidos
por RT-PCR
Multiplex Anticorpos
AGDIA SASA
1F5 MAb2 SN SO CMF45 Maria da Fé Caesar MO++ + - + - Y
N/NTN NTN
CMF46 Maria da Fé Caesar MO++ + - + - YN/NTN
NTN CMF47 Maria da Fé Caesar MO+ - + - + Y
O/N-WI N:O/N-Wi
CMF48 Maria da Fé Caesar MO+++ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi
CMF49 Maria da Fé Caesar MO++ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi CMF50 Maria da Fé Caesar MO+++ + - + - Y
N/NTN NTN
CMF51 Maria da Fé Caesar MO+ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi CMF52 Maria da Fé Caesar MO+ - + - + Y
O/N-WI N:O/N-Wi
CMF53 Maria da Fé Caesar MO+++ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi
CMF54 Maria da Fé Caesar MO+ + - + - YN/NTN
NTN CMF55 Maria da Fé Caesar MO+ - + - + Y
O/N-WI N:O/N-Wi
CMF56 Maria da Fé Caesar MO+ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi CMF57 Maria da Fé Caesar MO+ - + - + Y
O/N-WI N:O/N-Wi
CMF59 Maria da Fé Caesar MO+++ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi CMF60 Maria da Fé Caesar MO+ - + - + Y
O/N-WI N:O/N-Wi
CMF61 Maria da Fé Caesar MO+ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi
CMF62 Maria da Fé Caesar MO+ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi CMF63 Maria da Fé Caesar MO++ + + + + Y
N/NTN+Y
O/N:Wi N:O/N-Wi +NTN
CMF64 Maria da Fé Caesar MO+ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi CMF65 Maria da Fé Caesar MO+ - + - + Y
O/N-WI N:O/N-Wi
CMF66 Maria da Fé Caesar MO+ + - + - YN/NTN
NTN
49
“Tabela 3, continua”
Isolado Origem
Cultivar
Sintomas
Resultados obtidos quando
as amostras foram analisadas por
TAS-ELISA, usando os anticorpos
indicados Possível (is)
Estirpe(s)
Resultados obtidos
por RT-PCR
Multiplex Anticorpos
AGDIA SASA
1F5 MAb2 SN SO CMF67 Maria da Fé Caesar MO+++ - + - + Y
O/N-WI N:O/N-Wi
CMF68 Maria da Fé Caesar MO+ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi CMF69 Maria da Fé Caesar MO+ - + - + Y
O/N-WI N:O/N-Wi
CMF70 Maria da Fé Caesar MO+ + - + - YN/NTN
NTN
CMF71 Maria da Fé Caesar MO+ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi CMF72 Maria da Fé Caesar MO+ + - + - Y
N/NTN NTN
CMF73 Maria da Fé Caesar MO+ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi CMF74 Maria da Fé Caesar MO+ - + - + Y
O/N-WI N:O/N-Wi
CMF75 Maria da Fé Caesar MO+ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi
CMF76 Maria da Fé Caesar MO+++ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi CMF77 Maria da Fé Caesar MO+ + + + + Y
N/NTN+Y
O/N:Wi N:O/N-Wi +NTN
CMF78 Maria da Fé Caesar MO+ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi CMF79 Maria da Fé Caesar MO+++ - + - + Y
O/N-WI N:O/N-Wi
CMF80 Maria da Fé Caesar MO++ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi CMF81 Maria da Fé Caesar MO++ - + - + Y
O/N-WI N:O/N-Wi
CMF82 Maria da Fé Caesar MO+++ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi
CMF83 Maria da Fé Caesar MO+ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi CMF84 Maria da Fé Caesar MO++ - + - + Y
O/N-WI N:O/N-Wi
CMF87 Maria da Fé Caesar MO+ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi CMF99 Maria da Fé Caesar MO+ - + - + Y
O/N-WI N:O/N-Wi
CMF36 Cristina Caesar MO+ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi
50
“Tabela 3, conclusão”
Isolado Origem
Cultivar
Sintomas
Resultados obtidos quando
as amostras foram analisadas por
TAS-ELISA, usando os anticorpos
indicados Possível (is)
Estirpe(s)
Resultados obtidos
por RT-PCR
Multiplex Anticorpos
AGDIA SASA
1F5 MAb2 SN SO CMF39 Cristina Caesar MO++ - + - + Y
O/N-WI N:O/N-Wi
CMF41 Cristina Caesar MO+ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi CMF42 Cristina Caesar MO+++ - + - + Y
O/N-WI N:O/N-Wi
CMF44 Cristina Caesar MO++ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi
CMF89 Cristina Caesar MO+ + - + - YN/NTN
NTN CMF91 Cristina Caesar MO+ - + - + Y
O/N-WI N:O/N-Wi
CMF92 Cristina Caesar MO+ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi CMF94 Cristina Caesar MO+ + - + - Y
N/NTN NTN
CMF98 Cristina Caesar MO+ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi
S1 Mercados e Feiras Ágata MO+ - - - - - NTN S3 Mercados e Feiras Ágata MO+ - - - - - NTN
S4 Mercados e Feiras Ágata MO++ + - + - YN/NTN
NTN S5 Mercados e Feiras Ágata MO++ + - + - Y
N/NTN NTN
S6 Mercados e Feiras Ágata MO+ - - - - - NTN S7 Mercados e Feiras Ágata MO+ + - + - Y
N/NTN NTN
S8 Mercados e Feiras Ágata MO++ + - + - YN/NTN
NTN
S11 Mercados e Feiras Ágata MO+ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi S15 Mercados e Feiras Ágata MO+ - - - - - N:O/N-Wi +NTN
S16 Mercados e Feiras Ágata MO+ - + - + YO/N-WI
N:O/N-Wi S17 Mercados e Feiras Ágata MO+ - - - - - N:O/N-Wi +NTN
*S/SA: sem sintomas aparentes; MO=Mosaico; Intensidade: Fraco (+), Médio (++), Forte (+++); RF=Redução foliar.
51
5.2 Resultados obtidos no TAS-ELISA
Do total das amostras analisadas, 46,1% delas mostraram
comportamento sorológico compatível com estirpes pertencentes ao grupo
de sorotipo O, enquanto 34,5% foram compatíveis com estirpes pertencentes
ao sorotipo N. Associadas ao sorotipo O existem, até o momento, duas
principais estirpes de PVY: a estirpe comum PVYO (parental) e a estirpe
recombinante PVYN:O/N-Wi
, conhecida como estirpe Wilga. Por outro lado,
para as estirpes de PVY com sorotipo N são descritas a estirpe parental
PVYN e as estirpes recombinantes PVY
NTN, PVY
E, PVY-NE-11, PVY
NA-N,
entre outras. Do restante das amostras 13,9% foram detectadas para ambos
os sorotipos O e N, caracterizando infecções mistas.
Entretanto, algumas amostras DAS-ELISA positivas mostraram
resultado negativo no TAS-ELISA, perfazendo 5,5% do total analisado,
sendo elas: S1, S3, S6, S15 e S17 de estabelecimentos revendedores, 610/98
e 612/73 de Ouro Fino, e 618.1/18, 622.2/6, 622.2/9, 622.2/12, 622.2/13,
622.2/15, 623.3/12 de São Gotardo. Isso pode ter ocorrido devido ao fato de
as concentrações das estirpes virais estarem abaixo do limite de sensibilidade
dessa técnica, uma vez que, ao serem posteriormente analisadas por RT-
PCR, essas mesmas amostras se mostraram positivas para uma ou mais das
estirpes investigadas (Gráfico 1).
Gráfico 1 Perfil sorológico dos isolados de PVY analisados por TAS-ELISA.
52
De um modo geral, as amostras com sorotipo O foram positivas
apenas para os anticorpos MAb2 e SASA-O, que detectam as estirpes
comum e Wilga, e posteriormente estas foram identificadas por RT-PCR
multiplex como pertencendo à estirpe Wilga, com raras exceções. Das 39
amostras de São Gotardo, 10 reagiram com um ou com ambos desses
anticorpos, destas 8 amplificaram as bandas de PVYN:O/N-Wi
, enquanto que as
outras duas apresentaram infecção mista amplificando o padrão de bandas
das estirpes Wilga e NTN. Das 53 amostras provenientes de Ouro fino, 15
apresentaram sorotipo O, sendo que 13 foram identificadas como Wilga e 2
apresentaram infecções mistas com as mesmas duas estirpes na RT-PCR
multiplex. Das 52 amostras provenientes de Maria de Fé, 42 apresentaram
sorotipo O e todas as 42 foram posteriormente identificadas como sendo a
estirpe Wilga. Já entre as 10 amostras do município de Cristina, oito delas
apresentaram o sorotipo O, sendo subsequentemente confirmadas como
estirpe Wilga. Enquanto nas 11 amostras coletadas nos mercados, as 2
amostras que apresentaram sorotipo O, foram identificadas como Wilga.
De modo semelhante, a maioria das amostras com sorotipo N, foi
posteriormente identificada como pertencendo à estirpe NTN por RT-PCR
multiplex. Dentre as amostras de São Gotardo, 8 apresentaram sorotipo N e
foram identificadas como NTN. Já entre as 33 amostras de Ouro Fino que
apresentaram sorotipo N, 31 delas foram identificadas como NTN e 2 com
infecção mista NTN + Wilga. As sete amostras de Maria da Fé e duas de
Cristina, que apresentaram sorotipo N foram posteriormente identificadas
como NTN. O mesmo aconteceu com 4 das amostras coletadas nas gôndolas
dos mercados.
Todas as amostras que reagiram tanto com os antissoros do grupo O
como com os do grupo N foram confirmadas como infecção mista na RT-
PCR multiplex com as duas estirpes já citadas: 14 de São Gotardo, 3 de Ouro
Fino e 3 de Maria da Fé. Entre as amostras que foram soronegativas, 6 de
São Gotardo foram identificadas como NTN e uma com infecção mista; nas
amostras de Ouro Fino 2 apresentaram infecção mista e nas 5 negativas entre
53
as coletadas nos mercados, 3 estavam infectadas com NTN e duas
apresentaram infecção mista. Não houve amostra soronegativa entre as
provenientes de Maria da Fé. Estas amostras junto àquelas que haviam sido
inicialmente caracterizadas como infecções simples e que posteriormente
foram identificadas como infecção mista no RT-PCR multiplex, totalizaram
32 amostras. As absorbâncias obtidas em cada um dos testes TAS-ELISA
realizados estão representadas nos gráficos 2 a 5.
É interessante observar que existe uma tendência de haver
predominância de determinada estirpe em campos diferentes de produção.
Em São Gotardo 35,9% dos isolados pertenciam à estirpe NTN, contra
20,51% da estirpe Wilga. Foi o local onde apresentou a maior incidência de
infecção mista (43,59%). Em Ouro fino, 58,49% das amostras foram
identificadas como NTN, contra 24,53% da estirpe Wilga e 16,98%
infecções mistas entre estas duas estirpes. Já entre as amostras coletadas nos
mercados e feiras, a maior parte, ou seja, 63,64% foram identificadas como
sendo a estirpe necrótica, contra apenas 18,18% para a estirpe Wilga e
infecções mistas. Nos campos de Maria da Fé e Cristina pelo menos 80%
dos isolados pertenciam à estirpe Wilga contra apenas 13,5% e 20% de
NTN, respectivamente. Isso pode estar ligado ao potencial de inóculo da
região, uma vez que foi em Maria da Fé o primeiro relato da introdução
dessa estirpe no país (FIGUEIRA, 1999). Outra causa poderia ser também a
qualidade da semente com a qual se iniciou o plantio, pois apesar de todos
serem lotes de sementes (com exceção do material coletado em Lavras) já
pertenciam à terceira ou quarta geração de multiplicação no campo.
Nota-se ainda, que algumas amostras possuíam perfil sorológico
incomum. No município de São Gotardo foram identificados seis isolados
(618.1/1, 618.1/25, 619.1/2, 619.1/10, 619.1/13 e 619.2/9) apresentando
resultados positivos para MAb2, embora negativo para SASA-O. Além
destes, os isolados 619.2/2, 622.2/8 e 624.3/24, apresentaram resultados
positivos para os anticorpos monoclonais que detectam sorotipo N (1F5 e
SASA-N) e o anticorpo SASA-O, enquanto o anticorpo MAb2 foi negativo
54
no teste. Esse tipo de padrão detectado nos isolados que foram positivos para
o anticorpo monoclonal SASA-O e negativo para o MAb2 não foram
encontrados na literatura. Nos vírus o perfil sorológico é determinado através
de regiões específicas que compõem a proteína capsidial, denominadas
epitopo, e em estirpes recombinantes são comuns mutações nessas regiões,
impossibilitando o reconhecimento do anticorpo, e assim diminuindo a
eficiência de detecção dos testes sorológicos (SHUKLA et al., 1989;
SHUKLA; WARD; 1989). Já nas amostras de Ouro Fino o anticorpo
monoclonal SASA-N falhou para a detecção do isolado 610/27, enquanto
anticorpo monoclonal 1F5 apresentou resultado positivo para o sorotipo N.
Nikolaeva et al. (2012) identificaram alguns epitopos distintos na
proteína capsidial dos isolados de PVY, que permitem que estes sejam
reconhecidos por anticorpos monoclonais específicos para o sorotipo N, e
observaram que a simples substituição de um dos aminoácidos da capa
proteica viral na região destes epitopos pode levar a completa perda de
reatividade com os anticorpos monoclonais disponíveis no mercado para o
teste TAS-ELISA, essa conclusão foi tomada com base nos estudos
realizados com o isolado brasileiro PVY-AST (NTN/AST) que reage
positivamente para o anticorpo monoclonal 1F5 e negativamente para o
anticorpo SASA-N.
Além dessas situações de mudanças genômicas, a ocorrência de
escapes em testes sorológicos também é considerada comum em alguns
casos, o que resulta em graves problemas, uma vez que, estes tubérculos
podem posteriormente servir como fonte de inóculo de vírus para afídeos
vetores nas gerações subsequentes, e ainda serem exportados para outras
áreas, introduzindo novos recombinantes nelas (SINGH et al., 2003). Além
disso, outro fator que influencia diretamente no aumento de estirpes
recombinantes no campo é a ocorrência de infecções mistas nos cultivos.
Desta forma, amostras apresentando características de infecção mista
representaram 12% do total analisado. Para cada um dos campos onde foram
detectadas coinfecções o padrão de absorbância para os sorotipos O e N
55
foram muito próximos, indicando que pode não haver vantagem seletiva
durante a competição por replicação entre as estirpes envolvidas, embora
alguns autores mencionem ser este um dos motivos para o constante
surgimento de novos recombinantes de PVY (KERLAN, 2004; LORENZEN
et al., 2006b).
Apesar de os resultados sorológicos não serem suficientes para a
identificação das estirpes e dos seus variantes genéticos, eles mostram
claramente a grande variabilidade que se nota nos campos de produção de
batata, semente de Minas Gerais e, provavelmente, do Brasil.
56
Gráfico 2 Médias das absorbâncias obtidas no teste TAS-ELISA, das amostras provenientes de campos de batata localizados no município de
Ouro Fino-MG, utilizando os anticorpos monoclonais 1F5 e SASA-N, MAb2 e SASA-O, capazes de detectar os sorotipos N e O,
respectivamente. O valor representado em cada barra indica a somatória das absorbâncias obtidas com os respectivos antissoros
Gráfico 3 Médias das absorbâncias obtidas no teste TAS-ELISA, das amostras provenientes de campos de batata localizados no município de São
Gotardo - MG, utilizando os anticorpos monoclonais 1F5 e SASA-N, MAb2 e SASA-O, capazes de detectar os sorotipos N e O, respectivamente.
O valor representado em cada barra indica a somatória das absorbâncias obtidas com os respectivos antissoros
57
Gráfico 4 Médias das absorbâncias obtidas no teste TAS-ELISA, das amostras provenientes de campos de batata localizados no município de
Maria da Fé e Cristina-MG, utilizando os anticorpos monoclonais 1F5 e SASA-N, MAb2 e SASA-O, capazes de detectar os sorotipos N e O,
respectivamente. O valor representado em cada barra indica a somatória das absorbâncias obtidas com os respectivos antissoros
Gráfico 5 Médias das absorbâncias obtidas no teste TAS-ELISA, das amostras provenientes de estabelecimentos revendedores de batata
localizados no município de Lavras-MG, utilizando os anticorpos monoclonais 1F5 e SASA-N, MAb2 e SASA-O, capazes de detectar os
sorotipos N e O, respectivamente. O valor representado em cada barra indica a somatória das absorbâncias obtidas com os respectivos antissoros
58
5.3 Detecção e distinção de estirpes de PVY por RT-PCR multiplex e
esboço da situação epidemiológica destas no campo
O teste da RT-PCR multiplex, utilizando o conjunto de primers
desenvolvidos por Lorenzen et al. (2006a) mostrou-se eficiente na
amplificação do padrão molecular específico das estirpes de PVY que
infectavam as plantas analisadas neste estudo.
As plantas de fumo infectadas com estirpes únicas e com misturas
serviram como controles no teste de RT-PCR multiplex utilizado,
comprovando assim, a eficácia de amplificação do padrão molecular das
estirpes de PVY mesmo quando em infecções mistas de duas estirpes
recombinantes. As plantas inoculadas com LUI-AGA tiveram as bandas
típicas de NTN (452pb e 181pb) amplificadas, ao passo que, as plantas de
fumo inoculadas com PED-AX tiveram bandas de 689 e 181pb amplificadas,
evidenciando o padrão da estirpe Wilga (LORENZEN et al., 2006a). As
plantas inoculadas com ambos os isolados tiveram 3 bandas de diferentes
tamanhos amplificadas, sendo elas: 181, 452 e 689 pb, esse mix de bandas é
a combinação das bandas típicas de PVYNTN
e PVYN:O/Wi
. Todas as 165
amostras de batata foram satisfatoriamente discriminadas por esse teste. Os
resultados mostram que do total de amostras analisadas, 73 apresentaram
padrão molecular da estirpe Wilga, o que corresponde a 44,2% das amostras
analisadas. Sessenta e uma amostras apresentaram padrão molecular da
estirpe necrótica, correspondendo a 37%. Finalmente, 31 amostras
apresentaram padrão de bandas correspondente a infecção mista das estirpes
PVYNTN
e PVYN:O/N-Wi
, perfazendo 18,8% do total estudado (Gráfico 6 e
Tabela 3). Os padrões moleculares amplificados para cada amostra de batata
podem ser observados na figura 2.
59
Gráfico 6 Proporção dos grupos de PVY recombinantes analisados por RT-PCR
Multiplex
Inicialmente a caraterização de PVY era realizada pela combinação
do teste ELISA e a inoculação de plantas indicadoras de fumo e batata. Em
seguida, técnicas mais elaboradas, como RT-PCR uniplex e duplex que
permitia a distinção de apenas uma ou duas estirpes foram surgindo
(BLANCO-URGOITI et al., 1998). Porém a limitação destas técnicas
tornou-se evidente com a necessidade de uma diferenciação rápida e prática,
conforme os inúmeros variantes genéticos de um mesmo vírus foram sendo
descobertos. Desde então, técnicas que permitem caracterizar com precisão
todos estes novos variantes têm sido desenvolvidas. Outras metodologias,
tais como, RT-PCR multiplex e a RT-qPCR têm oferecido subsídios para tal
distinção e, além disso, apresentam maior sensibilidade de detecção
(BALME-SINIBALDI et al., 2006; BOONHAM et al., 2002; CHIKH-ALI et
al., 2010; FAGERIA et al., 2013; LORENZEN et al., 2006a; NIE, SINGH,
2002).
60
Figura 2 Padrão eletroforético encontrado entre os isolados analisados. M=marcador
100pb; 1) 619.1/3; 2) 618.1/18; 3) S8; 4)608/84; 5) 610/27; 6) S1; 7) CMF46; 8)
618.1/1; 9) 609/5; 10) CMF18; 11) S11; 12) 619.2/2; 13) 610/98; 14) CMF1; 15)
619.1/3; 16) 618.1/18; 17) S8; 18) 608/84; 19) 610/27; 20) S1; 21) 622.2/6; 22)
CMF46; 23) CMF50; 24) CP PVYNTN
=LUI-AGA; 25) CP PVYN:O/N:Wi
=PED-AX;
26) CP (controle positivo) PVYE= AGA-MON; 27) CN (controle negativo)
PVYE=batata sadia; 28) CN (controle negativo) PVY
NTN e PVY
N:O/N:Wi=batata sadia.
De modo geral, os resultados observados no teste RT-PCR multiplex
mostraram-se compatíveis com o teste ELISA. As amostras analisadas
apresentaram uma predominância da estirpe PVYN:O/N-Wi
, seguida da estirpe
necrótica PVYNTN
, com poucas infecções mistas. Estes resultados confirmam
a vantagem seletiva das estirpes recombinantes no campo, em detrimento das
estirpes parentais (PVYO, PVY
N) não recombinantes que, atualmente, quase
não são encontradas nos campos produtores de batata do Brasil
(RAMALHO, 2012; SANTOS, 2014).
Devido a maior sensibilidade inerente dos testes moleculares, 15
amostras ELISA negativas foram claramente detectadas pelos primers
utilizados para diferenciar as estirpes na RT-PCR. Esses dados confirmam
que escapes podem ocorrer em testes sorológicos e acarretar uma maior
incidência viral nos campos de produção futuramente oriundos de sementes
falsamente detectadas como livre de vírus, quando na realidade, possuem
uma ou mais estirpes de PVY as infectando (WALSH et al., 2001). Diversos
autores têm relatado que infecções mistas, com duas ou mais estirpes, podem
61
ocasionalmente gerar recombinantes com características genômicas novas,
e/ou resultar em efeitos sinérgicos, podendo levar a danos mais severos à
planta de batata, com consequente perda de produção (GALVINO-COSTA
et al., 2012a; RAMALHO, 2012; SANTOS, 2014). Desta forma, para o
controle da disseminação do PVY nos campos produtores de batata, torna-se
necessário o uso de testes cada vez mais sensíveis e confiáveis de detecção.
5.4 Detecção de estirpes de PVY em infecções simples e mistas por RT-
qPCR
O conjunto de primers e sondas utilizados nas reações de tempo real
foram eficientes para detecção das estirpes virais PVYNTN
e PVYN:O/N-Wi
isoladamente, ou seja, em reações no formato uniplex. As análises de
regressão das curvas padrão, demonstraram que os testes tiveram alta
linearidade (y = -4.48 e -3.06 para PVYNTN
e PVYN:O/N-Wi
, respectivamente) e
coeficiente de variação (r2
= 0,997 para PVYNTN
e r2
= 0,993 para PVYN:O/N-
Wi) com eficiência próxima de 1, indicando que estas podem ser utilizadas
para quantificar/estimar as concentrações destas estirpes em amostras
desconhecidas de forma confiável (Gráfico 7).
Cento e cinquenta e uma amostras foram selecionadas para reação de
RT-qPCR, o critério para essa seleção foi analisar todas as amostras
classificadas como infecções simples por PVYNTN
ou PVYN:O/N-Wi
, e além
dessas, analisar também parte das amostras classificadas como coinfecção
por essas duas mesmas estirpes nos testes de RT-PCR multiplex feitos neste
trabalho. Sendo assim, 17 amostras com coinfecção foram selecionadas
aleatoriamente dentre o total de 31 classificadas como tal neste estudo, 61
infecções simples por PVYNTN
e 73 por PVYN:O/N-Wi
(Tabela 4) foram
testadas nas reações de RT-qPCR com intuito de confirmar as infecções
simples e mistas e também avaliar a concentração de cada estirpe nas
plantas, inferindo possíveis interações competitivas vantajosas para uma das
duas estirpes em questão.
62
Gráfico 7 Quantificação versus Ct para os pontos da curva padrão de cada reação
estirpe-específica da RT-qPCR. As diluições seriadas dos plasmídeos linearizados
(102
a 1012
) foram testadas em triplicatas e os slopes e coeficiente de variação da
curva padrão foram calculados e estão expostos nos gráficos. A) Curva padrão para
detecção da estirpe PVYNTN
. B) Curva padrão para detecção da estirpe PVYNTN
.
Foram utilizados dois testes RT-qPCR uniplex específicos, um para
a detecção da estirpe necrótica e o outro para a estirpe Wilga. Os resultados
mostraram que dentre as 73 amostras caracterizadas como PVYN:O/N-Wi
na
RT-PCR multiplex, 38 delas foram confirmadas como sendo infecção
simples pela estirpe Wilga, enquanto para as outras 35 detectou-se também
infecção pelo PVYNTN
, indicando assim que as amostras na realidade eram
portadoras de infecção mista. Por outro lado, entre as amostras identificadas
B
Y = - 3.06x + 45.16
R2
= 0.993
A
Y = - 4.48x + 65.61
R2
= 0.997
63
previamente como PVYNTN
, 11 mantiveram o mesmo diagnóstico enquanto
as outras 50 foram também positivas, na RT-qPCR, para infecção com a
estirpe Wilga, sendo assim caracterizadas como infecções mistas. Já entre as
17 amostras com infecção mista, todas foram confirmadas como tal na RT-
qPCR. O índice de amostras portadoras de infecção mista na RT-qPCR foi
quatro vezes maior quando comparado aos resultados obtidos no TAS-
ELISA e três vezes maior que na RT-PCR multiplex. Estes resultados
mostraram claramente que a RT-qPCR possui uma maior sensibilidade e
especificidade de detecção das estirpes PVYNTN
e PVYN:O/N-Wi
que os outros
testes realizados, principalmente quando as concentrações virais na planta
encontram-se em quantidades muito baixas, o que torna a técnica viável e
com resultados muito superiores aos das outras técnicas utilizadas (BALME-
SINIBALDI et al., 2006; FAGERIA et al., 2013).
Após os resultados da RT-qPCR o esboço do cenário epidemiológico
das regiões analisadas feito com base na sorologia e RT-PCR mudou,
principalmente em relação à incidência de infecções mistas. Com base
apenas nos dados de TAS-ELISA e RT-PCR multiplex, o campo de São
Gotardo havia apresentado a maior incidência de coinfecções (17 amostras),
seguido por Ouro Fino (9), Maria da Fé (3) e Mercados e feiras (2). Já
considerando os dados de RT-qPCR, o campo de Ouro Fino aumentou sua
incidência geral de coinfecção para 45 amostras dentre as 52 amostras
analisadas, sendo que 41 delas foram confirmadas por RT-qPCR
evidenciando que a taxa de coinfecção prevaleceu em aproximadamente
86% das amostras oriundas desse campo. O campo de São Gotardo
apresentou a segunda maior taxa de coinfecção, aproximadamente 82% das
amostras analisadas, sendo 32 amostras com coinfecção das 39 analisadas
(24 confirmadas por RT-qPCR). No campo de Maria da Fé, 26 amostras
foram detectadas como coinfecção (todas confirmadas por RT-qPCR) dentre
as 52 amostras analisadas, perfazendo uma taxa de coinfecção de
aproximadamente 50%. No campo de Cristina, das dez amostras coletadas e
analisadas seis estavam coinfectadas (confirmadas por RT-qPCR), gerando
64
uma taxa de 60%. E por fim, dentre as amostra coletadas em Mercados e
feiras (11 no total) sete delas apresentaram coinfecção, perfazendo uma taxa
de aproximadamente 64% do total analisado para esse local de coleta.
É importante salientar que essas taxas de coinfecção mudaram tanto
devido à alta sensibilidade de detecção do teste de RT-qPCR, característica
essa já inerente da técnica para detecção de patógenos, porém não antes
avaliada para detecção das estirpes do vírus Y no Brasil. Os dados finais
mostram que grande parte das amostras antes classificadas como portadoras
de infecção simples, por uma das estirpes, através de RT-PCR multiplex, na
realidade, estava infectada tanto com PVYNTN
quanto com PVYN:O/N-Wi
.
Várias hipóteses podem explicar o escape de detecção ocorrido no teste de
RT-PCR multiplex, como por exemplo, a infecção das plantas no campo em
períodos tardios do ciclo da cultura e, por essa razão, a replicação viral de
uma das estirpes teria sido prejudicada, resultando em uma menor
concentração de partículas virais na planta. Outra hipótese seria a teoria da
vantagem competitiva natural entre as estirpes, dado que elas tenham sido
introduzidas na planta ao mesmo tempo ou com intervalos de tempo
pequenos, seria possível que uma das duas estirpes apresentasse uma maior
habilidade e eficiência na busca por sítios de replicação dentro das células
infectadas ao passo a que outra não. Isso resultaria em uma diferença nos
níveis de concentração finais de cada estirpe em plantas com coinfecção
sistêmica.
Analisando os dados de quantificação de cada estirpe, gerados pelo
tempo real (RT-qPCR), evidencia-se, de forma generalista, que nas amostras
cujas infecções mistas foram detectadas desde os testes iniciais (sorológicos
e RT-PCR) a concentração de partículas da estirpe PVYNTN
sempre
predominou sobre a da estirpe PVYN:O/N-Wi
, independente do campo de
origem de coleta das amostras. As concentrações da estirpe PVYNTN
nas
plantas com coinfecção variaram de 2,79x107
a 2,79x1010
cópias virais/µl.
Por outro lado, as concentrações da estirpe PVYN:O/N-Wi
variaram de 2,41x103
a 4,13x106
cópias virais/µl, mostrando significativa diminuição no número
65
de cópias virais em relação a estirpe PVYNTN
. Por outro lado, considerando
os resultados iniciais de detecção (ELISA e RT-PCR) para as infecções
simples, as amostras contendo apenas a estirpe PVYNTN
, submetidas a RT-
qPCR apresentaram quantidades significativas da estirpe Wilga, com a
concentração variando ente 8,64x103 e 6,67x10
12 cópias virais/µl. Enquanto
as amostras com infecções simples que continham a estirpe PVYN:O/N-Wi
,
apresentaram valores de quantificação para a estirpe necrótica variando entre
2,38x107 e 1,38x10
10 cópias virais/µl. As amostras analisadas foram
consideradas negativas quando apresentaram concentrações superiores ao
limite de detecção (controle negativo – água) fixado em Cq mean=37,50 e
Cq mean=36,63 para PVYNTN
e PVY
N:O/N-Wi, respectivamente (Tabela 4).
Balme-Sinibaldi et al. (2006) desenvolveram um teste de RT-PCR para a
detecção de dois grupos específicos de PVY (PVYO e PVY
N), a elevada
especificidade destes dois ensaios permitiu a detecção e quantificação
confiável e simultânea com limite de detecção de 103
cópias virais por
reação. Neste caso, frações de RNA contendo quantidades iguais de
transcritos PVYO
e PVY
N, foram eficientemente detectadas e quantificadas
com concentrações de 0.5x103 para PVY
O e 2.2x10
3 para
PVY
N. Por outro
lado, quando foram testadas amostras em que as concentrações eram
diferentes PVYN=10
3/PVY
O=10
8 e PVY
N 10
8/PVY
O=10
3, observou-se que as
sequências presentes em excesso foram eficientemente quantificadas
(PVYO=0.9×10
8 e PVY
N=1.4×10
8, respectivamente) os resultados apontam
pra alta confiabilidade do teste utilizado.
Outro aspecto a ser considerado é referente à sintomatologia
observada entre as plantas de batatas analisadas. Embora os sintomas na
cultivar Ágata não sejam muito evidentes, observou-se que do total de
amostras que manifestaram os sintomas mais agressivos, tais como, mosaico
forte e médio nas plantas de batata analisadas, 62% delas foram identificadas
na RT-qPCR como coinfecção pelas estirpes Wilga e NTN, o que pode ser
um resultado do efeito sinergético desse tipo de infecção sobre o hospedeiro
(Tabela 3). Análises mais detalhadas de dados de quantificação já obtidos e
66
estudos de mais amostras oriundas de campos diferentes se fazem
necessários para que as hipóteses de interação/competição citadas acima
sejam confirmadas ou descartadas, e assim, se alcancem inferências
plausíveis sobre as interações entre a estirpe NTN versus estirpe Wilga
versus hospedeira, quando em coinfecção.
Dentre os 61 isolados que apresentaram perfil típico do
recombinante PVYNTN
na RT-PCR multiplex e RT-qPCR, quando
submetidos a uma reação de RT-PCR adicional com primers específicos
para amplificação do PVYE, 43 deles apresentaram amplificação de um
fragmento 995pb característico dessa estirpe recombinante (Tabela 4). Essa é
a primeira vez que se relata esse recombinante em território brasileiro
(campo) após a sua descrição em 2012 (GALVINO-COSTA et al., 2012b) e
mostra que há um grande indício de que sua disseminação já tenha ocorrido
também em outras regiões produtoras de Minas Gerais e até mesmo de
outros Estados do país. Essa disseminação é ainda um fato desconhecido,
principalmente porque a sua detecção é mais trabalhosa que a das outras
estirpes, uma vez que, o PVYE é facilmente erroneamente identificado como
PVYNTN
através do método de RT-PCR multiplex (LORENZEN et al.,
2006a) mais utilizado pela comunidade científica. É preciso divulgar que um
PCR adicional é necessário para identificação do PVYE nos campos,
conforme já enfatizado no trabalho de descrição desse novo recombinante
(GALVINO-COSTA et al., 2012b). Além destes, foram observados 9
isolados com padrões atípicos pertencentes ao campo de Maria da Fé e
Cristina, com a amplificação de um fragmento de aproximadamente 1500pb,
quando utilizados os mesmos primers. A divergência observada nos
tamanhos destes fragmentos pode ser atribuída a um possível evento de
recombinação ou mutação ocorrido no genoma dos isolados destes campos
especificamente, porém tornam-se necessários estudos mais detalhados,
como o sequenciamento para a identificação correta destes isolados.
67
Tabela 4 Resultados comparativos dos métodos de detecção utilizados, dados de quantificação da RT-qPCR para as estirpes analisadas, e
resultados da RT-PCR específica para PVYE
Isolado
Resultados
obtidos no TAS-
ELISA: Possível
(is) Estirpe(s)
Resultados
obtidos
por RT-PCR
Multiplex
Concentração estimada do número de cópias virais de cada
estirpe na RT-qPCR Resultados
da RT-PCR
em tempo
real
Resultados
da RT-
PCR para
PVYE
Quantificação PVYNTN
Quantificação PVYN:O/N-Wi
(cópias/ul) Cq mean -
PVYNTN
(cópias/ul)
Cq mean –
PVYN:O/N-Wi
618.1/1 YO/N-Wi
N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi - 618.1/3 Y
N/NTN+Y
O/N:Wi N:O/N-Wi
+NTN
1,35x109 29,70374002 1,94 x10
5 32,43447561 N:O/N-Wi
+NTN
-
618.1/4 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 0,00 - NTN PVYE
618.1/11 YN/NTN
+YO/N:Wi
N:O/N-Wi
+NTN
3,70x109 27,71906299 2,40 x10
4 35,20328509 N:O/N-Wi
+NTN
- 618.1/18 - NTN Não testado Não testado 1,47 x10
4 35,86350451 N:O/N-Wi
+NTN
NTN
618.1/24 YN/NTN
+YO/N:Wi
N:O/N-Wi
+NTN
1,86x109 29,05072856 6,46 x10
5 30,83359217 N:O/N-Wi
+NTN
- 618.1/25 Y
O/N-WI N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi -
619.1/2 YO/N-WI
N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi -
619.1/3 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 9,73 x103 36,54801904 N:O/N-Wi
+NTN
NTN 619.1/4 Y
N/NTN NTN Não testado Não testado 1,46 x10
4 35,86763255 N:O/N-Wi
+NTN
NTN
619.1/5 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 1,72 x104 35,64622004 N:O/N-Wi
+NTN
NTN 619.1/6 Y
N/NTN NTN Não testado Não testado 2,47x10
9 19,87667001 N:O/N-Wi
+NTN
NTN
619.1/7 YN/NTN
+YO/N:Wi
N:O/N-Wi
+NTN
3,87x109 27,63747734 1,35 x10
4 35,96400833 N:O/N-Wi
+NTN
- 619.1/9 Y
N/NTN NTN Não testado Não testado 9,04 x10
8 21,22553763 N:O/N-Wi
+NTN
NTN
619.1/10 YO/N-WI
N:O/N-Wi 3,63 x107 37,05797291 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
-
619.1/13 YO/N-WI
N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi - 619.2/2 Y
N/NTN+Y
O/N:Wi N:O/N-Wi
+NTN
1,30 x108 34,26297106 1,39 x10
4 36,03833205 N:O/N-Wi
+NTN
-
619.2/4 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 4,51x109 19,07838672 N:O/N-Wi
+NTN
NTN 619.2/5 Y
N/NTN NTN Não testado Não testado 6,03 x10
8 21,75439179 N:O/N-Wi
+NTN
NTN
619.2/9 YO/N-WI
N:O/N-
Wi+NTN
1,45 x108 34,01059536 1,11E+06 30,14693679 N:O/N-Wi
+NTN
-
622.2/6 - NTN Não testado Não testado 1,26 x104 36,06127571 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
68
“Tabela 4, continua”
Isolado
Resultados
obtidos no TAS-
ELISA: Possível
(is) Estirpe(s)
Resultados
obtidos
por RT-PCR
Multiplex
Concentração estimada do número de cópias virais de
cada estirpe na RT-qPCR Resultados da
RT-PCR em
tempo real
Resultados
da RT-PCR
para PVYE
Quantificação PVYNTN
Quantificação PVYN:O/N-Wi
(cópias/ul) Cq mean -
PVYNTN
(cópias/ul)
Cq mean –
PVYN:O/N-Wi
622.2/12 - NTN Não testado Não testado 1,58 x104 35,77274251 N:O/N-Wi
+NTN
NTN 622.2/13 - NTN Não testado Não testado 1,53 x10
4 35,79586705 N:O/N-Wi
+NTN
NTN
622.2/15 - NTN Não testado Não testado 8,75 x103 36,55006709 N:O/N-Wi
+NTN
NTN 622.2/16 Y
N/NTN+Y
O/N:Wi N:O/N-Wi
+NTN
1,46 x1010
27,87303431 2,49 x105 32,14077101 N:O/N-Wi
+NTN
-
622.2/17 YN/NTN
+YO/N:Wi
N:O/N-Wi
+NTN
6,07 x108 31,2303922 2,82 x10
4 35,82000984 N:O/N-Wi
+NTN
-
623.3/4 YO/N-WI
N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi - 623.3/12 - NTN Não testado Não testado 1,71 x10
4 35,65093539 N:O/N-Wi
+NTN
NTN
623.3/16 YO/N-WI
N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi - 624.3/8 Y
O/N-WI N:O/N-Wi 3,05 x10
7 37,07665756 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
-
624.3/24 YN/NTN
+YO/N:Wi
N:O/N-Wi
+NTN
3,24 x107 36,92630176 1,06 x10
4 36,28518088 N:O/N-Wi
+NTN
-
608/57 YO/N-Wi
N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi - 608/63 Y
N/NTN NTN Não testado Não testado 8,92 x10
3 36,51948134 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
608/84 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 8,64 x103 36,5605016 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
608/100 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 0,00 - NTN PVYE
609/1 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 8,44 x103 36,59912594 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
609/2 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 1,98x109 20,17632536 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
609/5 YO/N-WI
N:O/N-Wi 4,24 x107 36,47170833 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
-
609/8 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 1,49 x104 35,83322255 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
609/11 YO/N-WI
N:O/N-Wi 1,37 x108 34,31504967 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
-
609/12 YO/N-WI
N:O/N-Wi 2,45 x107 37,46692033 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
- 609/32 Y
N/NTN NTN Não testado Não testado 3,44 x10
8 22,49951924 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
609/41 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 8,30 x108 21,3231306 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
609/49 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 8,12 x108 21,35228952 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
69
“Tabela 4, continua”
Isolado
Resultados
obtidos no TAS-
ELISA: Possível
(is) Estirpe(s)
Resultados
obtidos
por RT-PCR
Multiplex
Concentração estimada do número de cópias virais de
cada estirpe na RT-qPCR Resultados da
RT-PCR em
tempo real
Resultados
da RT-PCR
para PVYE
Quantificação PVYNTN
Quantificação PVYN:O/N-Wi
(cópias/ul) Cq mean -
PVYNTN
(cópias/ul)
Cq mean –
PVYN:O/N-Wi
609/61 Y
O/N-WI N:O/N-Wi 2,90 x10
7 37,14625373 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
- 609/65 Y
N/NTN NTN Não testado Não testado 6,67 x10
12 9,400928136 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
609/68 YO/N-WI
N:O/N-Wi 4,06 x107 36,51426818 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
-
609/77 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 1,87 x108 23,31606989 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
609/93 YO/N-WI
N:O/N-Wi 5,40 x107 35,98751816 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
- 610/1 Y
N/NTN NTN Não testado Não testado 1,84 x10
4 35,55412362 N:O/N-Wi
+NTN
NTN
610/5 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 2,00 x104 35,45216269 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
610/14 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 3,58 x108 22,45342285 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
610/22 YO/N-WI
N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi - 610/27 Y
N/NTN NTN Não testado Não testado 2,77 x10
5 32,00341781 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
610/33 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 2,97 x102 22,31860649 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
610/35 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 3,59 x108 22,4463702 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
610/41 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 2,19 x105 32,69367569 N:O/N-Wi
+NTN
NTN
610/42 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 3,80 x106 29,61133997 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
610/44 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 1,93 x107 26,32725208 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
610/51 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 0,00 - NTN PVYE
610/56 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 1,91 x108 23,31562814 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
610/57 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 0,00 - NTN NTN
610/69 YN/NTN
+YO/N:Wi
N:O/N-Wi
+NTN
4,46 x107 36,35943206 2,06 x10
4 35,42200619 N:O/N-Wi
+NTN
- 610/77 Y
N/NTN NTN Não testado Não testado 0,00 - NTN PVY
E
610/82 YO/N-WI
N:O/N-Wi
+NTN
2,79 x107 37,22729336 3,21 x10
4 34,81928357 N:O/N-Wi
+NTN
-
610/93 YO/N-WI
N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi - 610/94 Y
N/NTN+Y
O/N:Wi N:O/N-Wi
+NTN
3,87x109 27,66220338 2,24 x10
6 29,18211226 N:O/N-Wi
+NTN
-
70
“Tabela 4, continua”
Isolado
Resultados
obtidos no TAS-
ELISA: Possível
(is) Estirpe(s)
Resultados
obtidos
por RT-PCR
Multiplex
Concentração estimada do número de cópias virais de
cada estirpe na RT-qPCR Resultados da
RT-PCR em
tempo real
Resultados
da RT-PCR
para PVYE
Quantificação PVYNTN
Quantificação PVYN:O/N-Wi
(cópias/ul) Cq mean -
PVYNTN
(cópias/ul)
Cq mean –
PVYN:O/N-Wi
610/95 Y
N/NTN NTN Não testado Não testado 1,53 x10
7 26,63769392 N:O/N-Wi
+NTN
NTN 610/100 Y
O/N-WI N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi -
611/33 YN/NTN
+YO/N:Wi
N:O/N-Wi
+NTN
3,70 x1010
23,29430614 7,99 x105 30,6067401 N:O/N-Wi
+NTN
-
612/4 YO/N-WI
N:O/N-Wi 5,50 x107 35,91750303 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
-
612/27 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 1,11 x104 36,23167288 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
612/34 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 2,15 x109 20,06055606 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
612/46 YO/N-WI
N:O/N-Wi 2,41 x107 37,50534109 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
- 612/56 Y
N/NTN NTN Não testado Não testado 9,88 x10
7 24,17179004 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
612/57 YO/N-WI
N:O/N-Wi 5,85 x107 35,78217015 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
- 612/59 Y
N/NTN NTN Não testado Não testado 9,71 x10
7 24,20286247 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
612/73 - N:O/N-Wi
+NTN
4,09 x107 36,50356751 2,48 x10
4 35,16534415 N:O/N-Wi
+NTN
-
612/76 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 1,70 x108 23,48101011 N:O/N-Wi
+NTN
NTN 612/86 Y
N/NTN NTN Não testado Não testado 1,04 x10
8 24,10525276 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
CMF1 YN/NTN
+YO/N:Wi
N:O/N-Wi
+NTN
2,79 x1010
23,79259596 1,30 x107 26,85369 N:O/N-Wi
+NTN
- CMF2 Y
O/N-WI N:O/N-Wi 6,56 x10
7 35,56887921 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
-
CMF9 YO/N-WI
N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
-
CMF10 YO/N-WI
N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
- CMF18 Y
O/N-WI N:O/N-Wi 3,20 x10
7 36,95029825 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
-
CMF19 YO/N-WI
N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
- CMF20 Y
O/N-WI N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi -
CMF21 YO/N-WI
N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi -
CMF22 YO/N-WI
N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi - CMF24 Y
O/N-WI N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi -
71
“Tabela 4, continua”
Isolado
Resultados
obtidos no TAS-
ELISA: Possível
(is) Estirpe(s)
Resultados
obtidos
por RT-PCR
Multiplex
Concentração estimada do número de cópias virais de
cada estirpe na RT-qPCR Resultados da
RT-PCR em
tempo real
Resultados
da RT-PCR
para PVYE
Quantificação PVYNTN
Quantificação PVYN:O/N-Wi
(cópias/ul) Cq mean -
PVYNTN
(cópias/ul)
Cq mean –
PVYN:O/N-Wi
CMF33 Y
O/N-WI N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi -
CMF45 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 0,00 - NTN PVYE
CMF46 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 0,00 - NTN PVYE
CMF47 YO/N-WI
N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi -
CMF48 YO/N-WI
N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi - CMF49 Y
O/N-WI N:O/N-Wi 6,46 x10
7 35,59546173 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
-
CMF50 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 1,31 x104 36,01686349 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
CMF51 YO/N-WI
N:O/N-Wi 3,25 x107 36,93863643 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
-
CMF52 YO/N-WI
N:O/N-Wi 3,06 x107 37,12386113 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
- CMF53 Y
O/N-WI N:O/N-Wi 2,46 x10
7 37,45816764 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
-
CMF54 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 7,21 x108 21,51982125 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
CMF55 YO/N-WI
N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi - CMF56 Y
O/N-WI N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi -
CMF57 YO/N-WI
N:O/N-Wi 3,95 x107 36,54699917 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
- CMF59 Y
O/N-WI N:O/N-Wi 3,63 x10
7 36,94857672 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
-
CMF60 YO/N-WI
N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi -
CMF61 YO/N-WI
N:O/N-Wi 2,38 x107 37,69638978 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
- CMF62 Y
O/N-WI N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi -
CMF63 YN/NTN
+YO/N:Wi
N:O/N-Wi
+NTN
1,00x109 30,2752862 1,49 x10
6 29,72464175 N:O/N-Wi
+NTN
- CMF64 Y
O/N-WI N:O/N-Wi 4,95 x10
7 36,10063786 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
-
CMF65 YO/N-WI
N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi -
CMF66 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 2,23 x1012
10,84354953 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
CMF67 YO/N-WI
N:O/N-Wi 4,47 x107 36,30531371 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
-
72
“Tabela 4, continua”
Isolado
Resultados
obtidos no TAS-
ELISA: Possível
(is) Estirpe(s)
Resultados
obtidos
por RT-PCR
Multiplex
Concentração estimada do número de cópias virais de
cada estirpe na RT-qPCR Resultados da
RT-PCR em
tempo real
Resultados
da RT-PCR
para PVYE
Quantificação PVYNTN
Quantificação PVYN:O/N-Wi
(cópias/ul) Cq mean -
PVYNTN
(cópias/ul)
Cq mean –
PVYN:O/N-Wi
CMF68 Y
O/N-WI N:O/N-Wi 1,13 x10
8 34,50226521 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
- CMF69 Y
O/N-WI N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi -
CMF70 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 0,00 - NTN PVYE
CMF71 YO/N-WI
N:O/N-Wi 2,68 x107 37,35829061 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
-
CMF72 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 2,66 x108 22,8391645 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
CMF73 YO/N-WI
N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi -
CMF74 YO/N-WI
N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi - CMF75 Y
O/N-WI N:O/N-Wi 1,99 x10
9 29,45833281 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
-
CMF76 YO/N-WI
N:O/N-Wi 2,84 x107 37,1815407 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
- CMF77 Y
N/NTN+Y
O/N:Wi N:O/N-Wi
+NTN
4,11x109 27,53881993 4,13 x10
6 28,36681148 N:O/N-Wi
+NTN
-
CMF78 YO/N-WI
N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi -
CMF79 YO/N-WI
N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi - CMF80 Y
O/N-WI N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi -
CMF81 YO/N-WI
N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi - CMF82 Y
O/N-WI N:O/N-Wi 4,45 x10
7 36,34161246 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
-
CMF83 YO/N-WI
N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi -
CMF84 YO/N-WI
N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi - CMF87 Y
O/N-WI N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi -
CMF99 YO/N-WI
N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi - CMF36 Y
O/N-WI N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi -
CMF39 YO/N-WI
N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi -
CMF41 YO/N-WI
N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi - CMF42 Y
O/N-WI N:O/N-Wi 0,00 - Não testado Não testado N:O/N-Wi -
73
“Tabela 4, conclusão”
Isolado
Resultados
obtidos no TAS-
ELISA: Possível
(is) Estirpe(s)
Resultados
obtidos
por RT-PCR
Multiplex
Concentração estimada do número de cópias virais de
cada estirpe na RT-qPCR Resultados da
RT-PCR em
tempo real
Resultados
da RT-PCR
para PVYE
Quantificação PVYNTN
Quantificação PVYN:O/N-Wi
(cópias/ul) Cq mean -
PVYNTN
(cópias/ul)
Cq mean –
PVYN:O/N-Wi
CMF44 Y
O/N-WI N:O/N-Wi 2,47 x10
7 37,47468622 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
- CMF89 Y
N/NTN NTN Não testado Não testado 3,28 x10
8 22,69861167 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
CMF91 YO/N-WI
N:O/N-Wi 4,711x107 36,19691904 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
-
CMF92 YO/N-WI
N:O/N-Wi 2,62 x107 37,38360012 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
-
CMF94 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 1,07 x108 24,04227766 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
CMF98 YO/N-WI
N:O/N-Wi 1,38 x1010
25,16378439 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
-
S1 - NTN Não testado Não testado 0,00 - NTN PVYE
S3 - NTN Não testado Não testado 0,00 - NTN PVYE
S4 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 0,00 - NTN PVYE
S5 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 1,17 x104 36,20015247 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
S6 - NTN Não testado Não testado 1,47 x104 35,87514649 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
S7 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 2,18 x108 23,10690016 N:O/N-Wi
+NTN
PVYE
S8 YN/NTN
NTN Não testado Não testado 1,37 x107 28,44642881 N:O/N-Wi
+NTN
NTN
S11 YO/N-WI
N:O/N-Wi 3,64 x107 36,84576582 Não testado Não testado N:O/N-Wi
+NTN
- S16 Y
O/N-WI N:O/N-Wi 0,00 - 3,13 x10
6 28,73365302 N:O/N-Wi -
74
5 CONCLUSÕES
1. Padrões sorológicos e moleculares atípicos foram observados em amostras
de Ouro fino, São Gotardo, Maria da Fé e Cristina.
2. As estirpes de PVY prevalentes no campo foram a Wilga e a NTN,
presentes em infecções simples ou mistas.
3. A incidência de cada estirpe mudou em diferentes campos amostrados: o
índice de infecções simples pela estirpe Wilga foi maior nas amostras do
campo de Maria da Fé, porém as infecções mistas foram mais expressivas,
com destaque para as amostras do campo de Ouro Fino.
4. O teste de RT-qPCR identificou quatro vezes mais infecções mistas nas
amostras analisadas quando comparado ao teste sorológico TAS-ELISA e
três vezes mais que no RT-PCR convencional.
5. Os dados finais de RT-qPCR evidenciaram que esse teste é o mais
confiável para detecção de amostras com coinfecção devido a possíveis
baixas concentrações de uma das estirpes, concentrações essas não
detectáveis pelos limiares de detecção dos testes sorológicos e de RT-PCR.
6. Diversas amostras inicialmente detectadas como pertencentes à estirpe
PVYNTN
, foram classificadas como pertencentes à estirpe recombinante
PVYE, após serem submetidos a um RT-PCR adicional.
75
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