identidade e diversidade genÉtica de espÉcies de … · identidade e diversidade genÉtica de...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA E CONSERVAÇÃO
IDENTIDADE E DIVERSIDADE GENÉTICA DE ESPÉCIES DE OSTRAS NATIVAS NO ESTADO DE SERGIPE
AUTOR: THOMAZ DE FRANÇA E SILVA ORIENTADOR: EDILSON DIVINO DE ARAÚJO
ABRIL DE 2015
SÃO CRISTÓVÃO – SERGIPE BRASIL
THOMAZ DE FRANÇA E SILVA
IDENTIDADE E DIVERSIDADE GENÉTICA DE ESPÉCIES DE OSTRAS NATIVAS NO ESTADO DE SERGIPE
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ecologia e Conservação da Universidade Federal de Sergipe, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ecologia e Conservação.
Orientador: Prof. Dr. Edilson Divino de Araújo
ABRIL DE 2015 SÃO CRISTÓVÃO – SERGIPE
BRASIL
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
S586i
Silva, Thomaz de França e Identidade e diversidade genética de espécies de ostras nativas
no estado de Sergipe / Thomaz de França e Silva ; orientador Edilson Divino de Araújo. – São Cristóvão, 2015.
40 f. : il.
Dissertação (mestrado em Ecologia e Conservação) – Universidade Federal de Sergipe, 2015.
1. Ecologia Aquática. 2. Genética animal. 3. Ostra - Criação. 4. Crassostrea rhizophorae. I. Araújo, Edilson Divino de, orient. II. Título.
CDU 574:594.121(813.7)
i
A Rinaldo de França Lima,
Meu Norte.
ii
Agradecimentos
Antes de tudo, tenho que agradecer a meus pais, Lúcia e Rinaldo, que sempre
acreditaram em mim e me apoiaram nas minhas decisões. Sem eles não teria
chegado tão longe, nem teria a coragem para seguir em frente. E também a minha tia
Marly, por ser doutora em aturar meu mau humor.
À Universidade Federal de Sergipe, por prover o necessário para a elaboração
e desenvolvimento do projeto. E, também a todos os professores que tive a sorte de
ter durante as aulas desde a graduação.
Ao laboratório de Biologia Molecular e todos os seus integrantes, em especial
aos que em algum momento estiveram comigo, auxiliando-me quando mais precisava:
Andrea, Giulia, Rosane, Genilda e Lucyana.
A meu orientador, Prof. Dr. Edilson Divino de Araújo, pela oportunidade, os
ensinamentos, a orientação e dedicação.
A Sona Jain, que durante todo o mestrado esteve comigo, com sua calma e
dedicação, me ajudou a superar a grande maioria dos obstáculos que surgiram
durante o caminho. Muito obrigado, mesmo.
Ao Prof. Dr. Sílvio Dolabella, por me confiar seus equipamentos na
quantificação das amostras. E a Yrna pela paciência de quantificá-las para mim.
Ao Prof. Dr. Marcus Batista pelo auxílio nas análises estatísticas.
A Juliana, secretária do PPEC, pelo seu empenho em manter o programa
funcionando corretamente, e auxiliar os alunos da melhor maneira possível.
A todos os meus amigos que estiveram por perto quando eu mais precisava.
Em especial a Arthur, por me ajudar a perseguir a meta móvel; a Daiany, pelos seus
conselhos precisos; a Tirzah, pela ajuda agradável no laboratório de Parasitologia; a
Poliana, por esse sorriso contagiante; e a Juninho pelo companheirismo desde os
tempos de Matemática Básica.
Às professoras Claudia Moura de Melo e Silmara de Moraes Pantaleão por
participarem da banca de avaliação e pelos comentários construtivos para o trabalho.
À Capes pela bolsa concedida; e ao Sebrae e Fapitec pela ajuda financeira.
À Universidade Federal de Pernambuco, pelo sequenciamento das amostras.
iii
SUMÁRIO
Lista de Figuras ........................................................................................................... iv Lista de Tabelas .......................................................................................................... v Resumo ....................................................................................................................... vi Abstract ....................................................................................................................... vii 1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 1
1.1 Sobre Crassostrea sp. ....................................................................................... 1 1.2 Técnicas moleculares ........................................................................................ 5 1.3 Justificativa ........................................................................................................ 6
2 OBJETIVOS .............................................................................................................. 7
2.1 Objetivo geral .................................................................................................... 7 2.2 Objetivos específicos ........................................................................................ 7
3 HIPÓTESES ............................................................................................................. 8 4 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 9
4.1 Área de estudo .................................................................................................. 9 4.2 Coleta do material biológico ............................................................................ 11 4.3 Extração e quantificação do DNA ................................................................... 12 4.4 Identificação genética e sequenciamento ...................................................... 13 4.5 Análises estatísticas ....................................................................................... 15
5 RESULTADOS ....................................................................................................... 16
5.1 16S Mitocondrial .............................................................................................. 16 5.2 Citocromo oxidade I ....................................................................................... 17
5.2.1 Crassostrea brasiliana ............................................................................. 17 5.2.2 Crassostrea rhizophorae .......................................................................... 21
6 DISCUSSÃO ........................................................................................................... 24
6.1 Distribuição e identificação ............................................................................. 24 6.2 Estrutura populacional e diversidade haplotípica ........................................... 25
6.2.1 Crassostrea brasiliana ............................................................................. 26 6.2.2 Crassostrea rhizophorae .......................................................................... 27
6.3 Conservação ................................................................................................... 28 7 CONCLUSÃO ......................................................................................................... 29 8 REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 30
iv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Conchas de ostras do gênero Crassostrea obtidas no estuário Vaza Barris, Sergipe. Crassostrea brasiliana: (a), (b) e (c). Crassostrea rhizophorae: (d), (e) e (f). Unidade de escala: 1cm.
3
Figura 2. Localização geográfica dos estuários sergipanos
estudados. 1. São Francisco; 2. Vaza Barris; 3. Piauí-Real. (Modificado de CPRM: http://www.cprm.gov.br, 2015).
9
Figura 3. Áreas de coleta em estuários de Sergipe: (a) Piauí-Real;
(b) São Francisco; (c) Vaza Barris. Fontes: (a) e (b): Acervo Pessoal; (c): LABEC.
11
Figura 4. Diagrama contendo os sítios de restrição utilizando a
enzima de restrição HaeIII em um fragmento do gene de DNA mitocondrial 16S das duas espécies de ostras analisadas (Modificado de Pie et al., 2006).
14
Figura 5. Rede de haplótipos para o gene mitocondrial citocromo
oxidase I de Crassostrea brasiliana formada com as amostras dos estuários dos rios São Francisco (representado pela cor preta), Vaza Barris (representado pela cor vermelha) e do complexo fluvial Piauí-Real (representado pela cor amarela).
20
Figura 6. Rede de haplótipos de Crassostrea rhizophorae para o
gene citocromo oxidase I formada com as amostras dos estuários dos rios São Francisco (representado pela cor preta), Vaza Barris (representado pela cor vermelha) e do complexo fluvial Piauí-Real (representado pela cor amarela).
22
v
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Primers utilizados nos protocolos de PCR. 13 Tabela 2. Abundância das espécies de ostras em três estuários de
Sergipe classificadas de acordo com o número de sítios de restrição obtidos na análise do gene mitocondrial 16S em 2014.
16
Tabela 3. Distribuição das espécies de ostras de Sergipe por taxa de
salinidade em 2014. 17
Tabela 4. Posição dos nucleotídeos polimórficos para os 12
haplótipos identificados nas amostras de Crassostrea brasiliana para o gene mitocondrial citocromo oxidase I. Os haplótipos (H) estão listados na coluna da esquerda e os números em negrito correspondem aos sítios polimórficos.
18
Tabela 5. Distribuição geográfica dos haplótipos de Crassostrea
brasiliana para cada estuário analisado em Sergipe em 2014.
19
Tabela 6. Dados obtidos através da análise AMOVA para
Crassostrea brasiliana. 19
Tabela 7. Posição dos nucleotídeos polimórficos para os 14
haplótipos identificados nas amostras de Crassostrea rhizophorae para o gene mitocondrial citocromo oxidase I. Os haplótipos (H) estão listados na coluna da esquerda e os números em negrito correspondem aos sítios polimórficos.
21
Tabela 8. Distribuição geográfica dos haplótipos de Crassostrea
rhizophorae para cada estuário analisado em Sergipe em 2014.
22
Tabela 9. Dados obtidos através da análise AMOVA para
Crassostrea rhizophorae. 23
vi
IDENTIDADE E DIVERSIDADE GENÉTICA DE ESPÉCIES DE OSTRAS NATIVAS
NO ESTADO DE SERGIPE
Autor: Thomaz de França e Silva
Orientador: Prof. Dr. Edilson Divino de Araújo
Resumo
O cultivo de ostras “ostreicultura” é uma atividade pesqueira que vem crescendo no Brasil ao longo dos anos para suprir a demanda comercial local. Nos estuários brasileiros, duas ostras nativas apresentam a maior abundância populacional: Crassostrea rhizophorae e Crassostrea brasiliana e, por consequência, são as principais espécies exploradas. Devido à grande semelhança e por também apresentarem hábitos ecologicamente similares, as pequenas variações morfológicas entre as duas espécies prejudicam a identificação visual, tornando-se necessárias análises genéticas que possibilitem sua diferenciação. Tendo em vista o setor pesqueiro, a identificação das ostras cultivadas é essencial para o aumento da produtividade, além de possibilitar o uso sustentável e responsável dos recursos naturais. O transporte de um organismo para outro habitat, com finalidade econômica, pode desencadear diversos prejuízos para o ecossistema, portanto é preciso certificar que há fluxo gênico entre os locais para evitar tais danos ecológicos. O presente trabalho teve por objetivo diferenciar as espécies de Crassostrea por meio de amostras de DNA extraídas do músculo adutor da concha de 180 ostras coletadas em três estuários de Sergipe: São Francisco, Vaza Barris e Piauí-Real. Os níveis de variabilidade foram determinados através da amplificação de dois genes mitocondriais: DNA ribossomal 16S, para a identificação das espécies e citocromo oxidase I (COI), utilizado para identidade genética e diversidade populacional. Dos 156 indivíduos utilizados para a análise genética, 49 foram identificados como C. rizophorae e 107 como C. brasiliana, sendo que as duas espécies coocorreram nos três estuários analisados. C. brasiliana é mais frequente em locais de salinidade mais baixa e também junto aos sítios de ostreicultura. O marcador COI apresentou o mesmo nível de polimorfismo para as duas espécies e 14 haplótipos para C. rhizophorae, 12 haplótipos para C. brasiliana. O teste AMOVA detectou a inexistência de estruturação geográfica nas populações das duas espécies, devido ao baixo valor de fixação FST. De acordo com os dados obtidos, é possível afirmar que há grande fluxo gênico entre as populações das duas espécies de ostras nativas dos estuários analisados. A maior diversidade genética para C. brasiliana encontra-se no estuário do complexo fluvial Piauí-Real, podendo estar relacionada ao sentido Norte-Sul das correntes marinhas nessa região, que favorece a migração de larvas para estuários do Sul, entretanto dificulta o fluxo de haplótipos exclusivos do complexo Piauí-Real para estuários localizados ao Norte. Por outro lado, a maior diversidade para C. rhizophorae foi encontrada no rio Vaza Barris, devido a ausência de criatórios comerciais de ostras nativas neste estuário, sabendo que nos viveiros são cultivadas ostras da espécie C. brasiliana, por possuir melhor desempenho para fins comerciais. Dessa forma, pode-se concluir que, do ponto de vista genético, a translocação de ostras nativas entre os estuários analisados para cultivo, não afetaria as populações locais. Palavras chave: genética, Crassostrea, ostreicultura, 16S, COI, identificação.
vii
IDENTITY AND GENETIC DIVERSITY OF NATIVE OYSTER SPECIES IN SERGIPE,
BRAZIL
Author: Thomaz de França e Silva
Advisor: Prof. Dr. Edilson Divino de Araújo
Abstract
Oyster farming is a fishing activity that has been showing growth among the years to supply Brazil's commercial demand. In Brazilian estuaries, two native oysters represent most of this type of mollusk population: Crassostra rhizophorae and Crassostrea brasiliana. Due to their great resemblance and also for sharing the same ecological traits, the lack of morphological distinction in between the two species do complicate the visual identification. Hence, genetic analysis is mandatory to distinguish them. Owing to fishing industry, it is crucial to identify accurately cultivated oysters aiming productivity growth, also providing sustainable and responsible use of natural resources. The transference of one organism to another habitat, under economic purposes, may trigger several hazards to the ecosystem; therefore it must be ensured that there is gene flow between the two locations to avoid such ecological damages. To do this, an analysis of DNA haplotypes may be used among the samples to estimate genetic structure. This research used DNA samples extracted from the adductor muscle of the shell of 180 oysters gathered at three estuaries of Sergipe: São Francisco, Vaza Barris and Piauí-Real. Levels of genetic variability were determined through amplification of two mitochondrial genes: 16S, for the species identification, and cytochrome oxidase subunit I (COI), for genetic identity and population diversity. Of the 156 analyzed oysters, 49 were identified as C. rhizophorae and 107 as C. brasiliana. The two species co-occurred in all three examined estuaries. C. brasiliana is more frequent in lower salinity waters and next to oyster farming sites. Molecular marker COI delivered the same polymorphism levels for both species, and 14 haplotypes for C. rhizophorae, 12 haplotypes for C. brasiliana. AMOVA analysis detects the absence of geographical structuring in both species' populations due to the low FST value. According to the acquired data, it can be stated that there is gene flow in high levels between populations of the two native oyster species at the analyzed estuaries. The higher genetic diversity for C. brasiliana is situated on Piauí-Real estuary. It may be related to the North-South direction of ocean currents in this region, which favors the migration of larvae to South estuaries, on the other hand it hinders the flow of unique haplotypes of Piauí-Real estuary to others located to the North. Moreover, the higher diversity for C. rhizophorae was detected in Vaza Barris river, due to the absence of any oyster farming sites in this estuary, whereas the choice of C. brasiliana for cultivation because it has better performance for commercial purposes. Thus, it can be concluded that, from a genetically speaking, the translocation of native oysters among the researched estuaries for cultivation would not affect local populations. Key-words: genetics, Crassostrea, oyster farming, 16S, COI, identification.
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 Sobre Crassostrea sp.
A ostreicultura (ou malacocultura), como é denominado o cultivo de ostras, é
um dos mais importantes recursos pesqueiros de comunidades costeiras, além de
ser considerada uma das formas pioneiras de extrativismo marinho. Com as
necessidades da demanda de um mercado em crescimento, houve o avanço da
tecnologia e a modernização das técnicas de cultivo e, consequentemente, o
aumento na produção de ostras (LUDWIG et al., 2011; GALVÃO et al., 2013).
Economicamente, a ostreicultura é um sistema extrativista ecologicamente
simples, com grande potencial econômico (além de gerar empregos, é rentável). Por
se tratar de uma atividade de baixo impacto ambiental, também permite a
estabilidade dos recursos marinhos (LEGAT et al., 2009).
Em escala global, ostras do gênero Crassostrea (Sacco 1897) apresentam
grande relevância econômica, principalmente devido ao valor da “carne” e também
ao uso da concha como matéria prima na fabricação de produtos industriais e
medicinais (COSTA, 1985; ERSE & BERNARDES, 2008). No ano de 2008, a
produção mundial de ostras do Pacífico, Crassostrea gigas, alcançou o marco de
600.000 toneladas, com valor estimado de U$ 1 bilhão (Food and Agriculture
Organization, 2010).
No Brasil, atualmente, não há registros de atuação de uma grande companhia
neste setor. Nesse sentido, a exploração é feita principalmente por trabalhadores
autônomos, ou organizados em associações e cooperativas (Food and Agriculture
Organization, 2010). Dentre os bivalves cultivados no Brasil, 93% tem origem no
estado de Santa Catarina, principal produtor nacional. As outras áreas importantes
de cultivo são observadas ao longo da costa do Sudeste. No entanto, estuários
localizados no Norte e Nordeste possuem grande potencial para a aquicultura,
especialmente para ostras nativas (Food and Agriculture Organization, 2004).
Indivíduos do gênero Crassostrea que ocorrem nas regiões estuarinas de baixa
e média salinidade do litoral do Brasil recebem o nome popular de ostra do mangue.
Duas delas destacam-se por sua importância no extrativismo e na aquicultura
brasileira: Crassostrea rhizophorae (Guilding, 1828) e Crassostrea brasiliana
2
(Lamark, 1819) (ABSHER, 1989) (Figura 1). São ostras que eliminam os gametas,
sem indícios de incubação prévia, diretamente na água, onde ocorre a fertilização e
o desenvolvimento completo do estágio larval (SILVA & BOEHS, 2007). As larvas
permanecem na coluna d’água por até três semanas antes de atingirem o tamanho
necessário para a fixação no substrato (MANN, 2005; NARVÁEZ et al., 2012).
Além do transporte ativo, mediante à movimentação livre das larvas, a
dispersão e retenção desses organismos também é influenciada pelo transporte
passivo (BOEHS, 1995). O fluxo dos rios, a ação das marés e também as correntes
marítimas atuam diretamente no potencial destes indivíduos alcançarem novos
locais para a fixação (NYBAKKEN, 1993).
A morfologia externa de algumas espécies de ostras, inclusive Crassostrea
spp., varia de acordo com as condições ambientais às quais estão sujeitas, de modo
que a variação morfológica entre indivíduos de mesma espécie causa conflitos na
identificação. Dessa forma, o processo de diferenciação das espécies com base em
características externas da concha, como cor, forma, estrutura e cicatriz do músculo
não é totalmente confiável (IGNACIO et al., 2000). Nesse sentido, métodos
moleculares são imprescindíveis para estabelecer as pequenas diferenças entre as
espécies (THORPE & SOLÉ-CAVA, 1994; GUO et al., 2012).
A identificação fenotípica entre as duas espécies de ostras do mangue
brasileiras pode ser dificultada tendo em vista que ambas possuem o mesmo
habitat, fixam-se nos mesmos substratos e, acima de tudo, são morfologicamente
semelhantes (SIQUEIRA, 2008). A plasticidade fenotípica exibida pelas formas
adultas de ambas as espécies, em relação ao substrato ao qual estão fixadas,
reforça a dificuldade e controvérsia na identificação taxonômica (ABSHER, 1989).
De acordo com Rios (1973), C. rhizophorae já foi considerada sinônimo de C.
brasiliana, no entanto, através do estudo realizado por Christo & Absher (2008) da
morfologia larval, foi possível observar a diferenciação genética entre as duas
espécies e sua co-ocorrência em estuários brasileiros (PIE et al., 2006).
3
Figura 1. Conchas de ostras do gênero Crassostrea obtidas no estuário Vaza Barris, Sergipe. Crassostrea brasiliana: (a), (b) e (c). Crassostrea rhizophorae: (d), (e) e (f). Unidade de escala: 1cm.
Crassostrea rhizophorae é uma espécie hermafrodita protândrica, que se
distribui do Caribe ao Atlântico Sul-americano (até o Sul do Brasil). Estas ostras
apresentam o tamanho médio da concha de 6,5 cm em estágio adulto, sendo
grossa e de formato variável, geralmente larga, e de tonalidade que varia de clara a
4
escura (VILLARROEL et al., 2003; LAZOSKI et al., 2011). Sua distribuição se
extende ao longo de zonas tropicais, onde ocorre, principalmente, fixadas às raízes
aéreas do mangue vermelho, Rhizophora mangle, ou nas zonas intertidais de
costões rochosos (NASCIMENTO, 1983).
C. brasiliana (sinonímia de C. gasar), até meados da década de 1970, era
identificada erroneamente como C. rizhophorae, baseando-se estritamente na
observação de caracteres morfológicos. Porém, é notório o fato de C. brasiliana
apresentar melhor performance de crescimento em cultivos (PEREIRA et al., 2003).
Além disso, é uma espécie que apresenta distribuição em zonas infralitoral do
Sudeste do Brasil e em áreas mais próximas ao trópico de Capricórnio. Sua concha
em estágio adulto apresenta tamanho variável, com valores entre 5 a 19 cm
(LAZOSKI et al., 2011).
No ambiente aquático, a grande maioria dos organismos apresenta
reprodução externa. Devido a isso, é esperado que a facilidade de dispersão dos
gametas possibilite um aumento na diversidade genética destes indivíduos
(LAZOSKI et al, 2011). Porém já foi discutido em trabalhos, cujo o foco são espécies
de ostras Crassostrea, que o oposto também é observado (HEDGECOCK &
OKAZAKI, 1984; XIAO, et al., 2010), devido à presença de casos de isolamento
espacial entre as populações.
Dado o alto valor comercial destas ostras, principalmente de C. brasiliana,
devido ao seu maior tamanho, é vital certificar a identidade das espécies através de
fatores que não sejam influenciados pelo ambiente (IGNACIO et al., 2000). Além
disso, a correta identificação possibilita o melhoramento em técnicas na aquicultura
e no biomonitoramento, fornecendo também dados importantes para a preservação
das espécies (REBELO et al., 2003). A genética molecular é um dos métodos mais
confiáveis para resolver este dilema, tendo já sido utilizada para questões
semelhantes em estuários de outras regiões (BUROKER et al., 1979; GAFFNEY &
ALLEN JR, 1993; THORPE & SOLÉ-CAVA, 1994; PIE et al., 2006; LUDWIG et al.,
2011; KONG et al., 2013).
5
1.2 Técnicas moleculares
Ao considerar-se a variação fenotípica expressa no gênero Crassostrea, a
seleção genotípica é mais indicada para a identificação, pois trata-se de uma fonte
de informação mais confiável, por apresentar dados mais precisos (GRIFFITHS et
al., 2006). Neste caso específico, optou-se por empregar marcadores moleculares
de DNA, pois o genótipo de um indivíduo se mantém durante todo o seu ciclo de
vida, enquanto o fenótipo, por se tratar da expressão do genótipo, pode mudar de
acordo com condições ambientais específicas (GRIFFITHS et al., 2006; SNUSTAD &
SIMMONS, 2013).
Atualmente, a maior parte das análises genéticas baseadas em
procedimentos de Biologia Molecular se utiliza de técnicas de PCR (Polymerase
Chain Reaction). Este método consiste, fundamentalmente, na amplificação de
fragmentos de DNA pela ação da enzima Taq DNA polimerase, capaz de polimerizar
moléculas de nucleotídeos, com base em uma fita molde de DNA (ANTONINI et al.,
2004; CAVALEIRO et al., 2013).
Um dos métodos mais utilizados para identificação de espécies de ostras do
gênero Crassostrea é o de PCR-RFLP, que utiliza a amplificação de regiões
específicas do genoma do organismo seguida de cortes realizados por enzimas de
restrição (PIE et al., 2006). Um exemplo do êxito da técnica é dado por Boudry et al.
(2003), que utilizaram com sucesso o método para discriminar ostras exóticas C.
gigas, das ostras portuguesas, C. angulata. Um estudo mais recente realizado por
Pie et al. (2006), ao utilizar o mesmo processo, discriminou as três espécies de
ostras cultivadas na costa brasileira: C. brasiliana, C. rhizophorae e C. gigas,
sugerindo que a descrição de espécies de ostras utilizando o método molecular
pode garantir a certificação genética da identificação dos indivíduos comercializados.
Além da necessidade de identificar diferenças taxonômicas entre as ostras
nativas brasileiras, é importante avaliar a diversidade genética destes organismos.
Dado seu valor comercial, o conhecimento prévio das populações de ostras permite
a implementação de melhores estratégias na comercialiazação destes animais, tal
como a importação de sementes adequadas para o cultivo em determinados
estuários (LEGAT et al., 2009). Tais informações também servem como base para
6
estudos de processos evolutivos e ecológicos (manejo e conservação) (LAZOSKI et
al., 2011).
De acordo com Caetano (2009), uma opção válida para este procedimento é
a utilização de SNP (Single Nucleotide Polymorphism), cuja base são as alterações
mais elementares da molécula de DNA, ou seja, mutações em bases únicas da
cadeia de bases nitrogenadas. Não obstante à sua abundância, que facilita sua
utilização, o uso das bases moleculares permite que haja, no genoma, uma
distribuição homogênea de SNP. A grande abrangência em seu uso é útil em casos
de estudos de associação e mapeamento genético de organismos, assim como em
ensaios diagnósticos para confirmação de paternidade, identificação individual
(rastreabilidade), detecção de doenças genéticas e/ou polimorfismos associados a
características de produção.
1.3 Justificativa
Sabe-se que a introdução de espécies exóticas é a principal causa da
“poluição biológica”, com impactos imprevisíveis e irreversíveis (NAYLOR et al.,
2001). Crassostrea gigas, por exemplo, causou diversos problemas ambientais nos
estuários em que foi introduzida para cultivo, tal como alteração na estrutura das
comunidades nativas (PATIL et al., 2005), e introdução de parasitas e epibiontes
(LUDWIG et al., 2011).
Tendo em vista essa problemática, há a necessidade de avaliar quais
espécies ocorrem nos estuários sergipanos e como se encontra o estoque de
sementes no Estado. Com essa finalidade, a utilização de técnicas moleculares
permite não só a identificação adequada de espécies nativas, mas também avalia a
diversidade dentro dos estuários, fornecendo informações sobre o fluxo gênico entre
as populações.
Dessa forma, as informações a serem obtidas no presente trabalho têm por
objetivo gerar dados que subsidiem estratégias para o manejo e conservação de
ostras nos estuários de Sergipe.
7
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar identidade e diversidade genética de ostras nativas em estuários do
estado de Sergipe.
2.2 Objetivos específicos
• Definir a identidade genética das espécies de ostras por meio de diferentes
marcadores moleculares;
•
• Determinar o fluxo gênico das espécies de ostras encontradas entre os
diferentes estuários analisados.
8
3 HIPÓTESES
Hipótese 1:
• Crassostrea rhizophorae e Crassostrea brasiliana co-ocorrem nos estuários
analisados;
Hipótese 2:
• Ocorre fluxo gênico entre as ostras nativas nos estuários do estado de Sergipe e
não há diferença significativa na diversidade genética;
Hipótese 3:
• A diversidade genética em estuários mais próximos ao sul de Sergipe é maior
devido ao sentido norte-sul da corrente marítima na costa do Estado.
9
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Área de estudo
O trabalho analisou os estoques de ostras que ocorrem em estuários dos três
rios mais importantes para a ostreicultura ao longo do litoral do estado de Sergipe:
São Francisco, Vaza Barris e Piauí-Real (Figura 2).
Figura 2. Localização geográfica dos estuários sergipanos estudados. 1. São Francisco; 2. Vaza Barris; 3. Piauí-Real. (Modificado de CPRM: http://www.cprm.gov.br, 2015).
10
Carvalho e Fontes (2007) caracterizam os estuários Sergipanos da seguinte
maneira: [1] O estuário do Rio São Francisco (Figura 3.a) pode ser considerado um
sistema estuarino-lagunar. Apresenta formação geológica de planície costeira e nas
suas margens possui vegetação de manguezal formada primariamente por
Rhizophora mangle. Ao longo da extensão estuarina, há sinais de desmatamento
dos manguezais para a construção de viveiros para piscicultura e carcinocultura,
podendo acarretar em mudanças no padrão hidrodinâmico. [2] O rio Vaza Barris
(Figura 3.b) possui uma faixa estuarina de aproximadamente 20km de extensão. Ao
longo do estuário é possível observar a presença de várias ilhas de diversos
tamanhos com vegetação de manguezal, com canais estreitos e rasos. A influência
antrópica pode ser determinada pelo uso de viveiros e tanques para o cultivo de
camarões, além de desmatamento ao longo das margens com finalidade da
construção de empreendimentos imobiliários. [3] Por fim, os estuários dos rios Piauí
e Real (Figura 3.c), de acordo com a ADEMA (1984), por estarem geograficamente
próximos e apresentarem características ambientais semelhantes, podem ser
analisados em conjunto. A vegetação deste estuário apresenta maior diversidade,
contendo espécimes de R. mangle, Laguncularia racemosa e Avicennia germanis.
As mudanças no padrão hidrodinâmico podem ter como causa principal o
desmatamento do manguezal com várias finalidades (agricultura, infra-estrutura
habitacional, psicultura, carcinocultura e construção de estradas).
11
Figura 3. Áreas de coleta em estuários de Sergipe: (a) Piauí-Real; (b) São Francisco; (c) Vaza Barris.
Fontes: (a) e (b): Acervo Pessoal; (c): LABEC.
4.2 Coleta do material biológico
Para a coleta dos indivíduos foram determinados seis pontos de coleta (um de
alta salinidade e outro de baixa salinidade para cada um dos três estuários). Em
cada um desses pontos foram coletadas 30 ostras adultas, escolhidas
aleatoriamente e oriundas de agrupamentos diferentes, totalizando 180 espécimes.
O tamanho mínimo considerado para a fase adulta é de 5 cm, de acordo com
Galvão et al. (2013). Em campo, também foram estimados parâmetros abióticos da
água nos pontos de coleta: salinidade, oxigênio dissolvido, pH e temperatura.
As ostras foram obtidas entre os meses de junho e novembro de 2014. Elas
foram acondicionadas na água do próprio local de coleta até o momento em que
foram preparadas para a obtenção do material biológico. No laboratório as amostras
foram lavadas com água corrente e removidos quaisquer contaminantes da concha.
Os espécimes foram numerados e logo depois fotografados. Para facilitar a abertura,
os exemplares foram aquecidos em banho-maria (Kacil, BM-02) a 65°C por cinco
12
minutos. Com o auxílio de uma faca, elas foram abertas e, utilizando um bisturi de
lâmina descartável com o auxílio de pinças, todo o conteúdo interno da ostra foi
removido.
O material obtido do interior da ostra foi depositado em tubos plásticos de 5
mL contendo conservante PBS (tampão fosfato-salino) para a manutenção do
material em pH constante. Após o preparo as amostras foram refrigeradas a -20°C
até o momento da extração de DNA.
4.3 Extração e quantificação do DNA
Todos os métodos incluem um passo no qual o DNA é extraído de amostras
de tecido. Tal procedimento de extração consiste, basicamente, nas etapas de lise
celular e precipitação das moléculas de DNA utilizando-se reagentes e temperaturas
variadas (FORESTI et al., 2005).
Com base no protocolo fornecido pelo kit de extração e purificação de DNA
(Wizard® Genomic DNA Purification Kit, Promega), para a extração de DNA utiliza-
se um exemplar de ostra adulta conservada, de onde será retirado 20 mg do
músculo adutor interno da concha com o auxílio de bisturi descartável e pinça. Após
o término do processo de extração, de acordo com as instruções do fabricante, o
material obtido foi armazenado a -20°C.
Para verificar da integridade do DNA extraído foi utilizado 2µL da solução de
DNA, 6µL de água ultra pura, 2µL de corante BlueOrange e 2µL de SYBR® (Invitrogen) para cada amostra, submetidos a eletroforese com TBE 1X (89mM Tris-
base, 89mM ácido bórico e 2mM EDTA dissódico) em gel de Agarose (0,8%)
juntamente com o padrão de peso molecular (100 bp DNA Step Ladder, Promega).
A quantificação do DNA foi feita por nanoespectrofotometria (Epoch, Biotek).
Logo após, a solução de DNA de cada amostra foi diluída em água ultra pura
(MILIQ) e padronizada para concentração aproximada de 25 ng/µL.
13
4.4 Identificação genética e sequenciamento
Os primers foram escolhidos de acordo com Lazoski et al. (2011): [1] 16SAR
e 16SBR para a amplificação de um fragmento de 560 pb de DNA ribossomal (16S);
e [2] LCO e HCO para a amplificação de um fragmento do gene COI mitocondrial
com aproximadamente 700 pb (citocromo oxidase) (Tabela 1).
Tabela 1. Primers utilizados nos protocolos de PCR.
Primers Sequências (5’- 3’) Gene Tipo de primer
Ar CGCCTGTTTATCAAAAACAT 16S Universal
Br CCGGTCTGAACTCAGATCACGT 16S Universal
HCO TAAACTGGGTGACCAAAAAATCA 16S Universal
LCO GGTCAAATCATAAAGATATTGG 16S Universal
A partir do DNA purificado e quantificado foi realizada uma reação de
amplificação por PCR com volume final de 50 µL, utilizando 25 µL de Taq DNA
Polymerase 2x Master Mix RED com 1,5 nM MgCl2 (Ampliqon®), 1 µL de DNA
extraído com aproximadamente 25 ng/µL de concentração, 2,5 µL de cada primer
(10 µM), e 19 µL de água ultra pura (MILIQ). As amplificações foram realizadas em
um termociclador (Infinigen) com duas programações. A primeira, utilizada para os
primers HCO/LCO (Citocromo Oxidase), inicia-se com um passo de 95ºC por 3
minutos para desnaturação, seguido por 30 ciclos de 3 etapas: 94ºC por 1 minuto
(desnaturação), 52ºC por 1 minuto (anelamento dos primers) e 72ºC por 1 minuto
(extensão), finalizando em um estágio de 72ºC por 5 minutos. A segunda, utilizada
para os primers 16SAR/16SBR, inicia-se com um passo de 94ºC por 4 minutos para
desnaturação, seguido por 32 ciclos de 3 etapas: 94ºC por 30 segundos
(desnaturação), 56ºC por 40 segundos (anelamento dos primers) e 72ºC por 1
minuto (extensão), finalizando em um estágio de 72ºC por 1 minuto.
Uma parte do produto da reação (10 µL), corado com Diamond Nucleic Acid
Dye (Promega), foi submetido a eletroforese em Tampão TBE (Tris-borato 89mM,
EDTA 2mM, pH 8,0) e em gel de agarose a 1,5%, a 100V, durante 90 minutos. Em
14
seguida, o gel foi revelado em transluminador (Loccus) sob luz UV e fotografado por
sistema de captura de imagem (Loccus, L-PIX).
Foi então realizada a purificação do produtos de PCR por meio do kit de
purificação Pure Link™ (Invitrogen by Life Technologies), seguindo o protocolo
informado pelo fabricante. Após o término do processo, as amostras obtidas foram
novamente quantificadas por espectrofotometria (Epoch, Biotek) e padronizadas
para a concentração de 10 ng/µL. Por fim, para o sequenciamento foi utilizado o Big
Bye@ Terminator v.3.1 Cycle Sequency kit no sequenciador ABI 3500 (Applied
Biosystem).
Para a identificação das espécies foi usada a metodologia proposta por Pie et
al. (2006), com modificações, utilizando as mesmas informações genéticas, porém
substituindo a técnica de PCR/RFLP pela análise direta das sequências
mitocondriais amplificadas de 16S em busca de sítios de digestão específicos da
enzima HaeIII (Figura 4). Para a identificação de C. rhizophorae seria necessário a
marcação de 3 sítios GGCC, enquanto que para C. brasiliana seriam encontrados 4
sítios. Além disso, as sequências de Citocromo Oxidase foram submetidas ao
BLAST de nucleotídeos (GenBank: www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) a posteriori para
confirmar a identidade da amostras.
Figura 4. Diagrama contendo os sítios de restrição utilizando a enzima de restrição HaeIII em um fragmento do gene de DNA mitocondrial 16S das duas espécies de ostras analisadas (Modificado de Pie et al., 2006).
15
4.5 Análises estatísticas
Para verificar se houve diferença significativa entre o número de amostras
para as duas espécies nos três estuários e entre locais de alta e baixa salinidade, foi
utilizado o teste t-student, considerando margem de erro de 5%, através do software
R 3.1.3 for Mac (R CORE TEAM, 2015).
Para a análise da qualidade das sequências obtidas foi utilizado o software
Staden Package 2.0 (BONFIELD et al., 1995). Dessa forma, apenas as sequências
com valor Phred acima de 30 foram utilizadas para os testes subsequentes. As
sequências foram alinhadas por meio do programa MEGA (Molecular Evolutionary
Genetics Analysis, versão 6.0.5) (TAMURA et al., 2013) com a utilização do
algoritmo CustalW.
A diversidade nucleotídica, a haplotípica e o número de haplótipos foram
calculados usando o programa DnaSP 5.10.1 (LIBRADO & ROZAS, 2009). A análise
da estrutura genética das populações foi feita através de AMOVA (Analysis of
Molecular Variance) e FST, ambos realizados com auxílio do programa ARLEQUIN
3.5 (EXCOFFIER & LISCHER, 2010).
A significância da estatística FST foi determinada pelas permutações não-
paramétricas, com 1000 permutações. Esta estimativa leva em consideração a
frequência de distribuição dos haplótipos e o número de diferenças de mutações
entre eles, onde os valores de divergências são incorporados a uma análise de
variância para estimar o grau de subdivisão genética intraespecífica. A rede de
haplótipos foi construída a partir do programa Network 4.613 (BANDELT et al.,
1999).
16
5 RESULTADOS
5.1 16S Mitocondrial
Foi possível determinar a identidade de 124 indivíduos, tendo como base os
sítios para a enzima HaeIII utilizados por Pie et al. (2006). Destes, 81 indivíduos
(65,32%) apresentaram quatro sítios de restrição e foram classificados como C.
brasiliana, enquanto 43 indivíduos (34,68%) apresentaram apenas três sítios de
restrição, sendo classificados como C. rhizophorae (t = 3,26; p = 0,19) (Tabela 2).
Devido a problemas durante o processo de sequenciamento, das 180
amostras, 154 (85%) foram processadas, sendo que 30 foram descartadas em
função do truncamento das sequências e não apresentaram os sítios de restrição
necessários para a análise. Apesar disso, o número de amostras obtidos foi
suficiente para as análises estatísticas.
Sob o aspecto salinidade, foi possível observar que C. rhizophorae foi
encontrada com mais frequência nas regiões de alta salinidade, enquanto que C.
brasiliana foi observada nas regiões com valores mais baixos de salinidade (Tabela
3). Os outros dados abióticos coletados (temperatura, oxigênio dissolvido e pH) não
apresentaram diferenças significativas entre os estuários.
Tabela 2. Abundância das espécies de ostras em três estuários de Sergipe classificadas de acordo
com o número de sítios de restrição obtidos na análise do gene mitocondrial 16S em 2014.
São Francisco Piauí-Real Vaza Barris Total
C. brasiliana 26 28 27 81
C. rhizophorae 17 0 26 43
Total 43 28* 53 124 *As 30 amostras que não apresentaram os sítios de restrição necessários para análise estavam todas presentes no complexo
fluvial Piauí-Real.
17
Tabela 3. Distribuição das espécies de ostras de Sergipe por taxa de salinidade em 2014. Entre
parêntesis está o valor médio do grau de salinidade para os pontos amostrados.
Alta Salinidade (30,5%) Baixa Salinidade (19%) t p
C. brasiliana 4 77 1,1096 0,4670
C. rhizophorae 40 3 1,1622 0,4523
Total 44 80 - - Entre parêntesis está o valor médio do grau de salinidade para os pontos amostrados.
5.2 Citocromo Oxidadase I
Das 180 amostras sequenciadas, 125 (70%) apresentaram rendimento
satisfatório, apresentando 550 pb analisáveis. As amostras foram submetidas ao
BLAST para a identificação das espécies e 37 (29%) espécimes possuíam genótipo
de C. rhizophorae e 88 (71%) de C. brasiliana. Em comparação com a identificação
obtida por meio do método de Pie et al. (2006), apenas 2,4% das amostras (3
espécimes) apresentaram divergência na identificação.
5.2.1 Crassostrea brasiliana A região amplificada apresentou 14 sítios polimórficos (Tabela 4). A
composição nucleotídica foi de 22,43% de timina; 20,19% de citosina; 38,64% de
adenina; e 18,74% de guanina, tendo sido detectados 12 haplótipos.
18
Tabela 4. Posição dos nucleotídeos polimórficos para os 12 haplótipos identificados nas amostras de
Crassostrea brasiliana para o gene mitocondrial citocromo oxidase I. Os haplótipos (H) estão listados
na coluna da esquerda e os números em negrito correspondem aos sítios polimórficos.
H 22 36 154 352 361 364 367 373 391 433 502 504 526 544 1 G T A G C C G T C T C A T G
2 . . . . . . . . . . . G . .
3 . . . A . . . . . . . . . .
4 . . . . T T A . . . . . C .
5 . . . . T T A . . . . . . .
6 . A . . . . . . . . . . . .
7 . . . . . . . . . . . . . A
8 . . G . . . . . . . . . . .
9 A . . . . . . . . . . . . .
10 . . . . . . . C . . . . . .
11 . . . . T T A . . C T . . .
12 . . . . . . . . T . . . . .
O haplótipo mais comum, H1, representa 84% das amostras analisadas,
estando presente em todos os estuários e em cada estuário separadamente (Tabela
5). H1 representa 100% das amostras analisadas no estuário do Rio São Francisco.
No teste AMOVA, foi obtido o valor de FST = 0,01638 (α = 0,05; P-value =
0.17204) (Tabela 6).
Tabela 5. Distribuição geográfica dos haplótipos de Crassostrea brasiliana para cada estuário
analisado em Sergipe em 2014.
Haplótipos
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
São Francisco 17 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Vaza Barris 14 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 Piauí Real 43 1 1 2 1 1 1 1 1 0 0 0 Total 74 1 1 3 2 1 1 1 1 1 1 1
19
A rede de haplótipos (Figura 5) ilustra a distribuição geográfica dos mesmos,
demonstrando o fluxo gênico entres os estuários analisados. O tamanho dos círculos
é proporcional à frequência correspondente de cada haplótipo.
Tabela 6. Dados obtidos através da análise AMOVA para Crassostrea brasiliana.
Fonte de variação GL SQ QM f Entre as populações 2 0,953 0,00560 1,64
Dentro das populações 85 28,604 0,33652 98,36
20
21
5.2.2 Crassostrea rhizophorae A região amplificada do gene mitocondrial citocromo oxidase I apresentou 14
sítios polimórficos (Tabela 7). A composição nucleotídica foi de 22,45% de timina;
22,23% de citosina; 38,61% de adenina; e 18,71% de guanina, tendo sido
detectados 14 haplótipos.
Os haplótipos mais comuns, H1 e H4, que juntos representam 61% das
amostras analisadas, estão presentes em todos os estuários (Tabela 8).
A rede de haplótipos (Figura 6) ilustra a distribuição geográfica dos mesmos,
demonstrando o fluxo gênico entres os estuários analisados. O tamanho dos círculos
é proporcional à frequência correspondente de cada haplótipo.
No teste AMOVA, o foi obtido o valor de FST = -0.04370 (α = 0,05; P-value =
0.81232) (Tabela 9).
Tabela 7. Posição dos nucleotídeos polimórficos para os 14 haplótipos identificados nas amostras de
Crassostrea rhizophorae para o gene mitocondrial citocromo oxidase I. Os haplótipos (H) estão
listados na coluna da esquerda e os números em negrito correspondem aos sítios polimórficos.
H 34 46 64 100 169 175 298 301 343 406 415 424 517 544
1 C G T T G G T A A T A A G A
2 . . C . . . . G . . G . . .
3 T . . . . A . G . . . . . .
4 . . . . . . . G . . . . . .
5 . . . . . . . G . . . G . .
6 . . . . . . C G . . . . . .
7 . . . . . A . G . . . . . .
8 . . . . . A . G . . . . . G
9 . . . . A . . G . . . . A .
10 . A . . . . . . . . . . . .
11 . A . . . A . G . . . . . .
12 . . . C . . . G . . . . . .
13 . . . . . . . G G . . . . .
14 . . . . . . . . . C . . . .
22
Tabela 8. Distribuição geográfica dos haplótipos de Crassostrea rhizophorae para cada estuário
analisado em Sergipe em 2014.
Haplótipos
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
São Francisco 2 0 0 2 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 Vaza Barris 8 0 0 7 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Piauí Real 2 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Total 12 1 1 10 1 2 2 1 1 1 1 1 1 1
Figura 6. Rede de haplótipos de Crassostrea rhizophorae para o gene citocromo oxidase I formada com as amostras dos estuários dos rios São Francisco (representado pela cor preta), Vaza Barris (representado pela cor vermelha) e do complexo fluvial Piauí-Real (representado pela cor amarela).
23
Tabela 9. Dados obtidos através da análise AMOVA dos haplótipos para Crassostrea rhizophorae.
Fonte de variação GL SQ QM f Entre as populações 2 0,961 -0,03223 -4,37
Dentro das populações 33 25,400 0,76970 104,37
24
6 DISCUSSÃO 6.1 Distribuição e identificação genética Foram identificadas apenas duas espécies de ostra do mangue entre os
estuários sergipanos analisados. Outros trabalhos com metodologia semelhante
indicam a existência de uma terceira espécie nativa, ainda não identificada,
Crassostrea sp. em estuários da região Sudeste (VARELA et al., 2007; MELO et al.,
2010). A ostra-do-Pacífico C. gigas, introduzida no Brasil com finalidade comercial,
conforme era esperado, também não foi registrada em função da distribuição dessa
espécie estar restrita a áreas com temperaturas mais baixas (AKABOSHI, 1979).
O número de indivíduos classificados como C. brasiliana foi significativamente
maior (p > 0,05) em relação ao número de C. rhizophorae. Esse resultado também
foi observado por Melo et al. (2010) ao mapearem a distribuição geográfica de ostras
do mangue no Brasil. O maior número de espécimes de C. brasiliana pode ter
relação com os melhores rendimentos no cultivo dessa espécie em viveiros,
aumentando o número de indivíduos e, consequentemente o número de larvas que
se deslocam pelos estuários.
A salinidade se apresentou como fator preponderante para a distribuição de
Crassostrea spp. nos estuários de acordo com os dados analisados. A maior
abundância de C. brasiliana em locais de baixa salinidade pode estar relacionada
com os locais de cultivo, que se localizam em regiões mais afastadas do mar, onde
as taxas de salinidade são mais baixas, e por consequência seu desenvolvimento é
mais acentuado (VARELA et al., 2007). Já a preferência por C. rhizophorae por
regiões de alta salinidade pode estar relacionada com o local de fixação desta
espécie às raízes de mangue vermelho Rhizophora mangle. Lazoski et al. (2011), ao
analisarem as ostras que ocorrem nos manguezais brasileiros chegaram a
resultados que corroboram os obtidos neste trabalho, indicando também a co-
ocorrência das duas espécies nos estuários, inclusive, em alguns casos no mesmo
local de fixação. Galvão et al. (2013) obtiveram resultados semelhantes, ao informar
que C. rhizophora não foi amostrada em áreas com baixa salinidade, além de ambas
espécies co-existirem nas raízes de mangue em proporções iguais.
25
Sobre o método de identificação, dos 125 espécimes identificados através do
gene 16S por meio do sítio de restrição proposto por Pie et al. (2006), três obtiveram
uma identificação diferente ao serem analisadas as sequências obtidas por
citocromo oxidase I. Apesar da margem de erro baixa (2,4% das amostras), o
resultado obtido indica que o método de identificação utilizando sítios de restrição da
enzima HaeIII do gene ribossomal 16S não é totalmente confiável. Sugere-se então
a realização de outros estudos utilizando mais de um método de identificação
(citocromo oxidase ou análise de DNA nuclear) para assegurar a identidade das
espécies analisadas.
6.2 Estrutura populacional e diversidade haplotípica Para analisar os dados de estruturação populacional, é necessário interpretar
o valor de FST obtido no teste de AMOVA. Os valores de FST variam de 0 – quando
as duas populações estão cruzando livremente – e 1 – quando as duas populações
definitivamente não compartilham material genético (WEIR & COCKERHAM, 1984).
Segundo Wright (1965), os valores de FST entre zero e 0,05 representam baixa
estruturação genética; entre 0,05 e 0,15, moderada estruturação; entre 0,15 e 0,25,
alta estruturação; e acima de 0,25, uma forte estruturação.
Os resultados de estruturação genética podem se tornar mais robustos e
informativos quando mais de um tipo de marcador molecular é utilizado (HOARAU et
al., 2004). Teoricamente, pode-se assumir que a variação genética em locos
nucleares deva ser maior do que as encontradas em DNA mitocondrial, por este
apresentar herança uniparental. No entanto, ao apresentar a análise populacional
das espécies de ostras do Atlântico utilizando marcadores moleculares, Lazoski et
al. (2011) obtiveram valores maiores de variação haplotípica utilizando uma região
do gene mitocondrial 16S.
Em um estudo realizado utilizando os mesmos marcadores moleculares com
três gêneros de ostras (Crassostrea, Saccostrea e Striostrea), Klimbunga et al.
(2005) relataram que entre elas, Crassostrea possuia a menor diversidade
haplotípica e nucleotídica.
26
6.2.1 Crassostrea brasiliana No presente estudo, o teste AMOVA apresentou valores de FST condizentes
com uma estruturação baixa para C. brasiliana nos seis locais de coleta dos três
estuários analisados Como a espécie possui grande capacidade de dispersão
(GALVÃO et al., 2013), a distância e as barreiras geográficas existentes entre os
estuários não são suficientes para impedir o fluxo gênico entre eles. Por outro lado,
os estuários amostrados apresentam não só haplótipos compartilhados entre si, mas
também haplótipos únicos para cada região, exceto para o estuário do rio São
Francisco. Os valores encontrados de FST entre os pares de estuários indicam que
há mais similaridade e, consequentemente, a possibilidade de mais fluxo gênico
entre os indivíduos do São Francisco e o Piauí-Real (FST = 0,011), do que entre os
indivíduos do Vaza Barris e o Piauí-Real (FST = 0,016) e do que São Francisco e
Vaza Barris (FST = 0,062). Apesar da distância geográfica ser maior entre o rio São
Francisco e o Piauí-Real, eles apresentaram maior similaridade. Tal fato pode ser
explicado pela existência de cultivo de ostras nos dois estuários, havendo ainda a
possibilidade das ostras cultivadas em ambos locais terem a mesma origem, sendo
a dispersão desta espécie mediada por atividade antrópica.
A rede de haplótipos organizada permite inferir que há grande fluxo gênico
entre as três regiões amostradas, visto que a maioria dos indivíduos apresentam um
haplótipo comum entre eles. O estuário do Piauí-Real apresentou o maior número de
haplótipos exclusivos, indicando a maior diversidade haplotípica nesta localidade.
Logo após vem o grupo amostral do rio Vaza Barris, e por fim o do rio São
Francisco, com a menor diversidade haplotípica. O padrão de diversidade,
aumentando seu valor na direção Norte-Sul, pode ser explicado devido a influência
da corrente marinha equatorial. Por agir no transporte de larvas de ostras neste
sentido, cria-se uma tendência para o fluxo gênico do Norte para o Sul, o que geraria
uma restrição na dispersão de haplótipos específicos do complexo Piauí-Real para o
estuário do rio São Francisco (já que se situa mais distante e ao Norte do complexo
Piauí-Real). Os haplótipos exclusivos e a maior diversidade encontrada entre as
amostras do complexo estuarino Piauí-Real, principalmente devido a maior
diversidade vegetal observada neste estuário, indicam que essa área pode ser
considerada o principal estoque de sementes de ostra C. brasiliana entre os
27
estuários analisados, portanto, de grande importância para fins de conservação e
obtenção de novas linhagens para fins de cultivo.
Entre os haplótipos obtidos, outro fator que evidencia a baixa estruturação
populacional é o pequeno número de mutações entre os dois haplótipos mais
distantes. Com apenas seis mutações, os haplótipos se mostram muito próximos
entre si, confirmando a fraca estruturação populacional.
6.2.2 Crassostrea rhizophorae Os valores de FST obtidos também indicam ausência de estruturação
populacional nas três regiões amostradas e entre os pares de regiões. Assim como
C. brasiliana, C. rhizophorae também possui alta capacidade de dispersão (MELO et
al., 2010). Os estuários amostrados apresentam haplótipos compartilhados entre si e
haplótipos únicos para cada região. Os valores encontrados de FST entre os pares
de estuários indicam que há mais similaridade e, consequentemente, a possibilidade
de maior fluxo gênico entre populações do estuário do rio Vaza Barris e do complexo
Piauí-Real (FST = 0,030), do que entre os indivíduos do São Francisco e do Vaza
Barris (FST = 0.049) e do que São Francisco e Piauí-Real (FST = 0,070). Neste caso,
por se tratar de uma espécie de baixo valor comercial, a dispersão de C. rhizophorae
raramente se dá por métodos antrópicos (ERSE & BERNARDES, 2008), portanto
pode ser observado o padrão natural de que, quanto menor a distância geográfica,
menor será a diversidade entre as localidades.
A rede de haplótipos organizada permite inferir que há grande fluxo gênico
entre as três regiões amostradas, visto que há a ocorrência de dois haplótipos
comuns – divergentes por uma mutação apenas – para a grande maioria dos
indivíduos amostrados. Além disso, a diferença entre os dois haplótipos mais
distantes foi de quatro mutações, comprovando a ausência de estruturação
populacional. O estuário do rio Vaza Barris apresentou o maior número de
haplótipos particulares, indicando a maior diversidade haplotípica nesta localidade, o
que determina a grande importância do estuário para a conservação dessa espécie
de ostra nativa. Logo após vem o grupo amostral do rio São Francisco, e por fim o
do complexo fluvial Piauí-Real, com a menor diversidade haplotípica. Diferentemente
de C. brasiliana, não foi possível inferir um padrão distribuição.
28
6.3 Conservação e manejo Considerando os baixos valores de diversidade haplotípica e a ausência de
estruturação populacional, do ponto de vista genético, a translocação de indivíduos
entre os estuários analisados não acarretaria em danos ecológicos para as
populações (NAYLOR et al., 2001). Do ponto de vista biológico, deve-se atentar para
a presença de parasitas ou indivíduos com outras doenças, visto que, devido a baixa
variabilidade genética para as duas espécies, qualquer tipo de perturbação pode
afetar grande parte dos indivíduos (SILVA et al., 2012).
Desta forma, os níveis de estruturação genética, associados aos dados
referentes à exploração por meio da ostreicultura nas regiões, apontam para a
necessidade de programas de conservação das espécies. Afinal, a extinção dos
haplótipos raros poderia levar a diminuição da – já considerada baixa – variabilidade
genética, podendo resultar em perdas estocásticas locais. Como o interesse
comercial vem aumentando na região, as informações levantadas poderão auxiliar
diretamente programas de conservação e exploração comercial dessas espécies
nos estuários sergipanos.
29
7 CONCLUSÃO Este foi o primeiro trabalho realizado utilizando sequenciamento de DNA para
avaliar a variabilidade genética e a estruturação populacional de ostras nativas em
estuários do Estado de Sergipe. Esse estudo não envolve todos os estuários
sergipanos portanto, tornam-se necessários mais estudos para avaliar a
variabilidade genética como um todo, visto que a curta extensão do litoral sergipano
facilita a dispersão das larvas entre os estuários locais.
Os resultados encontrados acerca da identificação das espécies, demonstram
um número significativo maior de indivíduos C. brasiliana, o que não era esperado.
Porém, a co-ocorrência das duas espécies nos três estuários analisados foi
comprovada.
A salinidade foi um fator preponderante para a fixação das espécies no
substrato. Em regiões de baixa salinidade, há maiores chances de serem
encontradas ostras C. brasiliana, enquanto que em regiões de alta salinidade
prevalece C. rhizophorae.
Através dos valores baixos de FST, foi possível provar a existência de grande
fluxo gênico para as populações de ambas as espécies de ostras. Dessa forma,
conclui-se a ausência de estruturação populacional de C. brasiliana e C. rhizophorae
nos estuários analisados. Portanto, do ponto de vista genético, a translocação
artificial de indivíduos entre estes locais não acarretaria em danos ecológicos
irreversíveis, visto que este fenômeno já ocorre naturalmente através da dispersão
das larvas.
Analisando a rede de haplótipos de C. brasiliana foi possível perceber um
padrão de diversidade. Devido à atuação das correntes oceânicas na costa do
Estado, na direção Norte-Sul, o transporte de larvas de ostras ocorre do rio São
Francisco (localizado ao Norte do Estado) para os estuários ao Sul dele, levando ao
aumento da diversidade genética nos estuários Vaza Barris e Piauí-Real – ambos
localizados ao Sul do rio São Francisco.
Apesar da crescente importância econômica do cultivo de ostras em Sergipe,
o conhecimento sobre a ecologia desses organismos ainda é escasso. Torna-se
então necessária a continuação de pesquisas, a fim de elaborar programas de
conservação e de exploração comercial nos estuários sergipanos.
30
8 REFERÊNCIAS ABSHER, T.M. 1989. Populações naturais de ostras do gênero Crassostrea do litoral do Paraná – desenvolvimento larval, recrutamento e crescimento. Tese de PhD. Oceanography Institute, São Paulo. ADEMA. 1984. Levantamento da flora e caracterização dos bosques de mangue do estado de Sergipe. Governo do Estado de Sergipe. 134p. AKABOSHI, S. 1979. Notas sobre o comportamento da ostra japonesa, Crassostrea gigas (Thunberg, 1793) no litoral do Estado de São Paulo, Brasil. Boletim do Instituto de Pesca, 6: 93-104. ANTONINI, S.R.C.; MENEGHIN, S.P.; URASHIMA, A.S. 2004. Técnicas básicas de biologia molecular. Universidade Federal de São Carlos. Apostila do curso de extensão universitária. BANDELT, H.J.; FORSTER P.; RÖHL, A. 1999 Median-joining networks for inferring intraspecific phylogenies. Molecular Biology Evolution, 16: 37-48. BOEHS, G. 1995. Variação temporal e espacial de larvas de Crassostrea Sacco, 1897 (Pterioida: Ostreidae) na Baía de Paranaguá, Paraná. Dissertação (Mestrado), Centro de Estudos do Mar. Universidade Federal do Paraná, Curitiba. 81p. BONFIELD, J.K.; SMITH, K.F.; STADEN, R. 1995. A new DNA sequence assembly program. Nucleic Acids Research, 23: 4992-4999. BOUDRY, P.; HEURTEBISE, S.; LAPÉGUE, S. 2003. Mitochondrial and nuclear DNA sequence variation of presumed Crassostrea gigas and Crassostrea angulata specimens: a new oyster species in Hong Kong. Aquaculture, 228(2): 15-25. BUROKER, N.E.; HERSHBERGER, W.K.; CHEW, K.K. 1979. Population genetics if the family Ostreidae. I. Intraespecific Studies of Crassostrea gigas and Saccostrea commercialis. Marine Biology, 54: 157-169. CAETANO, A.R. 2009. Marcadores SNP: conceitos básicos, aplicações no manejo e no melhoramento animal e perspectivas para o futuro. Revista Brasileira de Zootecnia, 38: 64-71. CARVALHO, M.E.S.; FONTES, A.L. 2007. A Carcinocultura no Espaço Litorâneo Sergipano. Revista da Fapese, 3: 87-112. CAVALEIRO, N.P.; SOLÉ-CAVA, A.M.; LAZOSKI, C.; CUNHA, H.A. 2013. Polymorphic microsatellite loci for two Atlantic oyster species: Crassostrea rhizophorae and C. gasar. Molecular Biology Reports, 40: 7039-7043.
31
CHRISTO, S.W.; ABSHER, T.M. 2008. Crescimento da prodissoconcha de ostras do gênero Crassostrea Sacco, 1897 (Bivalvia, Ostreidae). Boletim do Instituto de Pesca, 34(1): 71-77. COSTA, P.F. 1985. Biologia e tecnologia para o cultivo. In: Brasil – Ministério da Marinha (org.). Instituto Nacional de Estudos do Mar. Manual de Maricultura. Cap.VIII, parte B. Ministério da Marinha, Rio de Janeiro, Brasil,165-192. ERSE, E.B.; BERNARDES, M.A. 2008. Levantamento de estoques da ostra Crassostrea sp. em bancos naturais no litoral paranaense. Biotemas, 21: 57-63. EXCOFFIER, L.; LISCHER, H.E.L. 2010. Arlequin suite ver 3.5: A new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows. Molecular Ecology Resources, 10: 564-567. FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION - FAO. 2004. The state of world fisheries and aquaculture in 2003. Rome. 153p. FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION - Fisheries and Aquaculture Organization. 2010. FAO Fisheries and Aquaculture Department has published the Global Aquaculture Production Statistics for the year 2011. Disponível em: http://capeeaprac.co.za/projects/NMM101%20Marine%20Aquaculture/DEIR/Appendix%20F%20GlobalAquacultureProductionStatistics2011.pdf FORESTI, F.; OLIVEIRA, C.; REVALDAVES, E.; FORESTI, F.P.; SANTOS, S.A. 2005. Análise genética de estoques de reprodutores de curimbatá (Prochilodus lineatus) e pacu (Piaractus mesopotamicus) da estação de piscicultura de promissão, utilizando marcadores de RAPD. Instituto de Biociências. UNESP, Botucatu, Brasil, 1-2.3e GAFFNEY, P.M.; ALLEN JR, S.K. 1993. Hybridization among Crassostrea species: a review. Aquaculture, 166: 1-13. GALVÃO, M.S.N.; PEREIRA, O.M.; HILSDORF, A.W.S. 2013. Molecular identification and distribution of mangrove oysters (Crassostrea) in an estuarine ecosystem in Southeast Brazil: implications for aquaculture and fisheries management. Aquaculture Research, 44: 1589-1601. GRIFFITHS, A.J.F; WESSLER, S.R.; LEWONTIN, R.C.; GELBART, W.M.; SUZUKI, D.T.; MILLER, J.H. 2006. Introdução à Genética. 8ª ed. Ed. Guanabara Koogan. 743p. GUO, X.; LI, Q. WANG, Q.Z.; KONG, L.F. 2012. Genetic Mapping and QTL Analysis of Growth-Related Traits in the Pacific Oyster. Marine Biotechnology, 14: 218-226. HEDGECOCK, D.; OKAZAKI, N.B. 1984. Genetic diversity within and between populations of American oysters (Crassostrea). Malacologia, 25: 535–549.
32
HOARAU, G; PIQUET, A.M.T.; VAN DER VEER, H.W.; RIJNSDORP, A.D.; STAM, W.T.; OLSEN, J.L. 2004. Population structure of plaice (Pleuronectes platessa L.) in northern Europe: a comparison resolving power between microsatellites and mitochondrial DNA data. Journal of Sea Research, 51: 183-190. IGNACIO, B.L.; ABSHER, T.M.; LAZOSKI, C.; SOLÉ-CAVA, A.M. 2000. Genetic evidence of the presence of two species of Crassostrea (Bivalvia: Ostreidae) on the coast of Brazil. Marine Biology, 136: 987-991. KLIMBUNGA, S.; KHAMNAMTONG, B.; PUANGLARP, N.; JARAYABHAND, P.; YOOSUKH, W.; MENASVETA, P. 2005. Molecular Taxonomy of Cupped Oysters (Crassostrea, Saccostrea, and Striostrea) in Thailand Based on COI, 16S, and 18S rDNA Polymorphism. Marine Biotechnology, 7: 306-317. KONG, L.; BAI, J., LI, L. 2013. Comparative assessment of genomic SSR, EST–SSR and EST–SNP markers for evaluation of the genetic diversity of wild and cultured Pacific oyster, Crassostrea gigas Thunberg. Aquaculture, http://dx.doi.org/10.1016/j.aquaculture.2013.05.037. LAZOSKI, C.; GUSMÃO, J.; BOUDRY, P.; SOLÉ-CAVA, A.M. 2011. Phylogeny and phylogeography of Atlantic oyster species: evolutionary history, limited genetic connectivity and isolation by distance. Marine Ecology Progress Series. 426: 197-212. LEGAT, A.P.; DE OLIVEIRA, J.A.; LAZOSKI, C.V.S.; SOLE-CAVA, A.M.; DE MELO, C.M.R.; GALVÉZ, A.O. 2009. Caracterização genética de ostras nativas do gênero Crassostrea no Brasil: base para o estabelecimento de um programa nacional de melhoramento. Embrapa Meio-Norte. LIBRADO, P.; ROZAS, J. 2009. DnaSP v5: A software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data. Bioinformatics, 25: 1451-1452. LUDWIG, S.; PATELLA, R.; STOIEV, S.; CASTILHO-WESTPHAL, G.; GIROTTO, M.V.F.; OSTRENSKY, A. 2011. A molecular method to detect and identify the native species of southwestern Atlantic Crassostrea (Mollusca: Ostreidae). Zoologia, 28(4): 420-426. MANN, R. 2005. So how far do oyster larvae disperse? Theoretical and time frame considerations. J. Shellfish Res., 24(2): 665. MELO, A.G.C.; VARELA, E.S.; BEASLEY, C.R.; SCHNEIDER, H.; SAMPAIO, I.; GAFFNEY, P.M.; REECE, K.S.; TAGLIARO, C.H. 2010. Molecular identification, phylogeny and geographic distribution of Brazilian mangrove oysters (Crassostrea). Genetics and Molecular Biology, 33(3): 564-572. NARVÁEZ, D.A.; KLINCK, J.M.; POWELL, E.N.; HOFMANN, E.E.; WILKIN, J.; HAIDVOGEL, D.B. 2012. Modeling the dispersal of eastern oyster (Crassostrea virginica) larvae in Delaware Bay. Journal of Marine Research, 70: 381-409.
33
NASCIMENTO, I.A. 1983. Cultivo de ostras no Brasil: problemas e perspectivas. Ciência e Cultura, 35: 871-876. NAYLOR, R.L.; WILLIAMS, S.L.; STRONG D.R. 2001. Aquaculture – A gateway for exotic species. Science, 294: 1655-1656. NYBAKKEN, J.W. 1993. Marine Biology. 3ª ed. Ed. Harper Collins College Publishers. 462p. PATIL, J.G.; GUNASEKERA, R.M.; DEAGLE, B.E.; BAX, N.J. 2005. Specific Detection of Pacific Oyster (Crassostrea gigas) Larvae in Plankton Samples Using Nested Polymerase Chain Reaction. Marine Biotechnology, 7: 11-20. PEREIRA, O.M.; HENRIQUES, M.B.; MACHADO, I.C. 2003. Estimativa da curva de crescimento da ostra Crassostrea brasiliana em bosques de mangue e proposta para sua extração ordenada no estuário de Cananéia, SP, Brasil. Boletim do Instituto de Pesca, 29(1): 19-28. PIE, M.R.; RIBEIRO, R.O.; BOEGER, W.A.; OSTRENSKY, A.; FALLEIROS, R.M.; ANGELO, L. 2006. A simple PCR-RFLP method for the discrimination of native and introduced oyster species (Crassostrea brasiliana, C. rhizophorae and C. gigas; Bivalvia: Ostreidae) cultured in Southern Brazil. Aquaculture Research, 37: 1598-1600. R CORE TEAM. 2015. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Disponível em: http://www.R-project.org/. REBELO, M.F.; PFEIFFER, W.C.; DA SILVA, H.; MORAES, M.O. 2003. Cloning and detection of metallothionein mRNA by RT- PCR in mangrove oysters (C. rhizophorae). Aquatic Toxicology, 64: 359-362. RIOS, E. 1973. Seashells of Brazil. 2 ed. Ed. da Furg, Rio Grande. 432p. SILVA, C.C.; CASTRO, G.A.; COSTA, F.M.V.; SILVA, L.R.L. 2012. Epibiontes no bivalvo invasor Perna Perna (Bivalvia, Mytilidae) dos costões rochosos das praias costa azul e namorados, Balneário de Iriri, Anchieta – ES. Anais do XV SImpósio de Biologia Marinha, Santos – SP. 1-3. SILVA, J.R.; BOEHS, G. 2007. Ocorrência e distribuição de larvas de ostras Crassostrea rhizophorae (Guilding, 1828) na Baía de Camamu, Bahia. Anais do VIII Congresso de Ecologia do Brasil, Caxambu – MG. 1-2. SIQUEIRA, K.L.F. 2008. Avaliação do sistema de cultivo de ostra do gênero Crassostrea (Sacco, 1897) no estuário do rio Vaza-Barris (Sergipe). Dissertação de mestrado. Universidade Tiradentes, Sergipe.
34
SNUSTAD D.P.; SIMMONS M.J. 2013. Fundamentos da Genética. 6ª ed. Ed. Guanabara Koogan. 739p. TAMURA, K.; STECHER, G.; PETERSON, D.; FILIPSKI, A.; KUMAR, S. 2013 MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0. Molecular Biology and Evolution, 30: 2725-2729. THORPE, J.P.; SOLÉ-CAVA, A.M. 1994. The use of allozyme electrophoresis in invertebrate systematics. Zoologica Scripta, 23: 3-18. VARELA, E.S.; BEASLEY, C.R.; SCHNEIDER, H.; SAMPAIO, I.; MARQUES-SILVA, N.D.; TAGLIARO, C.H. 2007. Molecular phylogeny of mangrove oysters (Crassostrea) from Brazil. Journal of Molluscan Studies, 73: 229-234. VILLARROEL, E.; BUITRAGO, E.; LODEIROS, C. 2003. Identification of Environmental Factors Affecting Growth and Survival of the Tropical Oyster Crassostrea rhizophorae in Suspended Culture in the Golfo de Cariaco, Venezuela. Revista Cientifica, 14(1): 28-35. WEIR, B.S.; COCKERHAM, C.C. 1984. Estimating F-Statistics for the Analysis of Population Structure. Evolution, 38(6): 1358-1370. WRIGHT, S. 1965. The interpretation of population structure by F-statistics with special regard to system of mating. Evolution, 19: 395-420. XIAO, J.; CORDES, J.F.; WANG, H; GUO, X.; REECE, K.S. 2010. Population genetics of Crassostrea ariakensis in Asia inferred from microsatellite markers. Marine Biology, 157: 1767-1781.