23

I. Introduo Geral

24

1. OBJECTIVO DO TRABALHO

25

1. OBJECTIVO DO TRABALHO

A floresta, em Portugal, representa aproximadamente 38 % do territrio, o que pode

traduzir-se pela produo de elevadas quantidades de resduos florestais que so

normalmente constitudos por diferentes espcies de arbustos e ramos de rvores.

No sentido de valorizar esta biomassa pretende-se, com este trabalho, determinar as

eventuais actividades, antioxidante, anti-bacteriana e anti-fngica dos extractos brutos

(etanlicos e aquosos) de urze, carqueja e giesta. O estudo ser completado com a

caracterizao dos extractos, em termos de compostos fenlicos totais e flavonides.

Posteriormente, os extractos sero fraccionados por cromatografia em coluna e a

actividade anti-microbiana das fraces ser tambm estudada.

Neste trabalho, so usados mtodos colorimtricos para flavonides (usando o

cloreto de alumnio) e fenis totais (usando o reagente de Folin-Ciocalteu); mtodos do

DPPH e do -caroteno/cido linoleico para capacidade antioxidante; e actividade anti-

microbiana pelo teste de difuso em disco e posterior determinao da concentrao

mnima inibitria.

26

2. OS ARBUSTOS

27

2. OS ARBUSTOS

A floresta parte integrante do ecossistema global, constituindo um elemento

fundamental para o seu equilbrio. A floresta formada por rvores, arbustos, ervas e

um grande nmero de outros seres (plantas e animais). Logo a seguir aos desertos, a

floresta ocupa a maior parte da superfcie da terra emersa, isto , cerca de 30 % dessa

superfcie. Encontra-se, no entanto, distribuda de forma irregular, devido diversidade

climtica e s caractersticas dos terrenos. A floresta um recurso renovvel, e por isso,

contribui no s para o equilbrio ecolgico da Terra, como tem sido, atravs dos

tempos, um meio fundamental para a sobrevivncia do Homem: renova o ar,

produzindo oxignio e consumindo dixido de carbono; regulariza o clima, atravs da

produo de vapor de gua; protege os solos, evitando a eroso; favorece a infiltrao e

conservao de gua no solo; impede o avano da areia e dos ventos martimos;

constitui uma fonte de alimentao para muitos seres vivos; para o Homem, fonte de

energia e de matrias-primas [1].

A floresta portuguesa um ecossistema muito antigo, inicialmente com rvores de

folha caduca no norte do pas e rvores de folha perene a sul. Actualmente, a rea

florestal portuguesa ascende aos 3,3 milhes de hectares. Em Portugal, a floresta,

representa cerca de 38 % do territrio, o que pode traduzir-se pela produo de elevadas

quantidades de resduos florestais. Estes so constitudos por diferentes espcies de

arbustos e ramos de rvores [2].

No existe uma definio exacta, contudo, considera-se arbusto, todo o vegetal do

grupo das angiosprmicas dicotiledneas lenhosas, que se ramifica desde o solo e que

tem menor porte do que as rvores [3].

2.1. A Urze

2.1.1. Caractersticas do arbusto

A urze (Erica spp.), o nome comum de diversas plantas da famlia Ericaceae,

espontneas em terrenos pobres em calcrio e com flores de cores diversas (branco,

rosa-prpura, vermelho, esverdeado, etc.) que cobre os solos de terrenos incultos por

toda a parte. um arbusto rasteiro, que tambm se pode apresentar sob a forma de

28

pequenas rvores nas regies montanhosas onde a gua abundante. Os

famlia Ericaceae so arbustos de folha perene

Maio [3].

Entre as vrias espcies de u

nas serras e florestas portuguesas, nomeadamente,

endmica dos Aores), Erica scoparia

ocidental e no centro de Portugal), entre outras

Figura 1: Erica scoparia azorica

2.1.2. Utilizao na Medicina

A urze tradicionalmente

principal aco combater cistites

urinrias. diurtica, o que permite aumentar o volume de urina

eliminar as toxinas e infece

[4].

Os princpios activos encontrados na urze

flavonides (de aco diurtica) e os taninos (que servem para acalmar a inflamao

dolorosa da parede da bexiga e to

contm arbutina ou arbutsido (um glucsido da hidroquinona

da hidroquinona) que as bactrias intestinais transformam em hidroquinona, anti

urinrio (Figura 2) [4,5].

pequenas rvores nas regies montanhosas onde a gua abundante. Os

so arbustos de folha perene, e a sua florao ocorre entre Fevereiro e

Entre as vrias espcies de urze, destacam-se aquelas que so mais frequentes

nas serras e florestas portuguesas, nomeadamente, Erica scoparia azorica

Erica scoparia ou Urze-das-vassouras (frequente no noroeste

ocidental e no centro de Portugal), entre outras (Figura 1) [3].

Erica scoparia azorica ( esquerda), Erica scoparia ( direita)

Utilizao na Medicina Popular

rze tradicionalmente usada como anti-inflamatrio das vias urinrias. A sua

principal aco combater cistites, inflamaes da prstata e as restantes infeces

diurtica, o que permite aumentar o volume de urina, indispensvel para

infeces existentes nas vias urinrias; tambm actua nas diarreias

Os princpios activos encontrados na urze, principalmente na flor,

flavonides (de aco diurtica) e os taninos (que servem para acalmar a inflamao

bexiga e todas as infeces urinrias). Todas as partes da planta

contm arbutina ou arbutsido (um glucsido da hidroquinona -D-

da hidroquinona) que as bactrias intestinais transformam em hidroquinona, anti

pequenas rvores nas regies montanhosas onde a gua abundante. Os membros da

a sua florao ocorre entre Fevereiro e

se aquelas que so mais frequentes

Erica scoparia azorica (espcie

vassouras (frequente no noroeste

( direita) [3].

inflamatrio das vias urinrias. A sua

inflamaes da prstata e as restantes infeces

indispensvel para

; tambm actua nas diarreias

, principalmente na flor, so os

flavonides (de aco diurtica) e os taninos (que servem para acalmar a inflamao

. Todas as partes da planta

-glucopiransido

da hidroquinona) que as bactrias intestinais transformam em hidroquinona, anti-sptico

29

Figura 2: Estruturas qumicas da Arbutina e Hidroquinona [6].

Sabe-se que as espcies pertencentes famlia Ericaceae, so fontes ricas de

fenis, nomeadamente, flavonides, antocianinas, proantocianidinas (designao

alternativa de taninos condensados pelo facto destes compostos originarem

antocianidinas aps tratamento, a quente, com um cido mineral). Compostos que esto

identificados como antioxidantes, com potencial para prevenir os danos oxidativos

causados pelas espcies reactivas de oxignio (ROS) [7]. As antocianinas diminuem a

permeabilidade capilar, particularmente dos capilares venosos, aumentando a sua

resistncia, da a sua aco antiedematosa [6].

Preparaes de ervas, utilizando as partes areas de Erica arborea e Erica

manipulifora so popularmente utilizadas como diurticos, adstringentes, e no

tratamento de infeces urinrias. Particularmente, um copo de infuso ou decoco das

folhas de Erica arborea tem sido recomendado para a reduo do edema corporal [8].

Uma receita antiga, descoberta num livro de Dioscorides (autor do primeiro

grande Tratado sobre plantas e medicina), descreve que um cataplasma preparado com

folhas de vrias espcies de Erica faria cicatrizar as mordeduras de serpentes [8].

Existem comercialmente venda, cpsulas de urze para o tratamento de

problemas urinrios [5].

Hidrlise

Bactrias Intestinais

Arbutina Hidroquinona

30

2.1.3. Evidncias Experimentais

2.1.3.1. Actividade anti-inflamatria de diferentes espcies de Erica

Um estudo desenvolvido por Akool e colaboradores [8] avaliou a actividade

anti-inflamatria de extractos de Erica arborea, Erica bacquetii, Erica manipulifora e

Erica sicula em ratos aos quais tinham sido induzidos diferentes estados de inflamao

e edema. Foi possvel concluir que estes extractos apresentam uma actividade anti-

inflamatria significativa, o que se pode dever ao facto de possurem flavonides, entre

outros, que sequestram os radicais de oxignio e que podem por isso interferir na

produo dos metabolitos do cido araquidnico atravs da inibio da enzima

lipoxigenase e pela reduo da concentrao de leucotrienos [8].

2.1.3.2. Actividade hipolipidmica do extracto aquoso de flores de

Erica multiflora

As doenas cardiovasculares so a causa de morte mais comum nos pases

industrializados. Sabe-se que a hiperlipidmia representa o maior factor de risco para o

desenvolvimento prematuro de aterosclerose e de complicaes cardiovasculares. Assim

sendo, uma estratgia lgica para prevenir e tratar a aterosclerose e reduzir a incidncia

de doenas cardiovasculares resolver o problema da hiperlipidmia pela dieta e/ou

utilizando drogas hipolipemiantes [9].

Em Marrocos, assim como em outros pases, a maioria dos doentes

hiperlipidmicos, utiliza plantas medicinais para tratar a hiperlipidmia e a

aterosclerose. Existe um grande interesse em descobrir substncias hipolipemiantes

naturais que derivam das plantas medicinais normalmente utilizadas, nomeadamente a

Erica multiflora. Esta planta, tem sido largamente utilizada no leste de Marrocos por

indivduos hiperlipidmicos como uma alternativa teraputica convencional e o estudo

fitoqumico, permitiu descobrir que os maiores constituintes das flores so os taninos, as

proantocianidinas e os flavonides [9].

O estudo desenvolvido por Arfani e colaboradores [9], permitiu concluir que a

administrao intra-gstrica de extracto aquoso de Erica multiflora em ratos aos quais

tinha sido induzida hiperlipidmia, provoca uma diminuio significativa dos nveis

plasmticos de lpidos. Aps 7 horas de tratamento, o colesterol plasmtico total, os

triglicridos e o colesterol

respectivamente, no entanto,

indicam que o extracto aquoso desta erva contm produtos que diminuem as

concentraes plasmticas de lpidos e que podem ter efeitos benficos no

hiperlipidmia [9].

2.2. A Carqueja

2.2.1. Caractersticas do arbusto

A carqueja, tambm conhecida por carqueija ou por carqueijeira, pertence

famlia Leguminosae e subfamlia

Pterospartum tridentatum. um arbusto de folha perene, com

amarela e cuja poca de florao vai de Maro a Maio. um arbusto inerme, erecto ou

prostrado, muito ramoso, em que os ramos novos se posicionam distintamente alados e

comprimidos. Uma das carac

folhas parecerem umas asas onduladas, formando trs dentes ou trs lobos em cada n.

A carqueja cresce espontaneamente e

oeste da Pennsula Ibrica, particularmente em Portugal

Figura 3

2.2.2. Utilizao na Medicina Popular

A carqueja, uma planta que possui

estimulante do fgado. Est indicada como auxiliar no

gstricas, intestinais e das vias urinrias.

para o tratamento da anemia, clculos biliares, diarreia, m circulao de sangue,

triglicridos e o colesterol-LDL, sofreram uma reduo de 47 %, 95

respectivamente, no entanto, o colesterol-HDL no sofreu alterao. Estas observaes

indicam que o extracto aquoso desta erva contm produtos que diminuem as

de lpidos e que podem ter efeitos benficos no

Caractersticas do arbusto

A carqueja, tambm conhecida por carqueija ou por carqueijeira, pertence

e subfamlia Papilionaceae, e tem como nome cientfico

. um arbusto de folha perene, com flor em fascculo de cor

e cuja poca de florao vai de Maro a Maio. um arbusto inerme, erecto ou

prostrado, muito ramoso, em que os ramos novos se posicionam distintamente alados e

comprimidos. Uma das caractersticas mais evidentes deste arbusto o facto de as suas

folhas parecerem umas asas onduladas, formando trs dentes ou trs lobos em cada n.

cresce espontaneamente e encontra-se facilmente em solos cidos em todo o

, particularmente em Portugal (Figura 3) [3].

igura 3: Pterospartum tridentatum [4].

Utilizao na Medicina Popular

A carqueja, uma planta que possui aco digestiva, diurtica e

estimulante do fgado. Est indicada como auxiliar no tratamento de diversas doenas

gstricas, intestinais e das vias urinrias. Emprega-se tambm em forma de

para o tratamento da anemia, clculos biliares, diarreia, m circulao de sangue,

31

47 %, 95 % e 67 %,

Estas observaes

indicam que o extracto aquoso desta erva contm produtos que diminuem as

de lpidos e que podem ter efeitos benficos no tratamento da

A carqueja, tambm conhecida por carqueija ou por carqueijeira, pertence

, e tem como nome cientfico

flor em fascculo de cor

e cuja poca de florao vai de Maro a Maio. um arbusto inerme, erecto ou

prostrado, muito ramoso, em que os ramos novos se posicionam distintamente alados e

deste arbusto o facto de as suas

folhas parecerem umas asas onduladas, formando trs dentes ou trs lobos em cada n.

se facilmente em solos cidos em todo o

aco digestiva, diurtica e aco

tratamento de diversas doenas

se tambm em forma de infuses

para o tratamento da anemia, clculos biliares, diarreia, m circulao de sangue,

32

ictercia, diabetes e parasitas intestinais. Devido ao efeito diurtico e depurativo, est

indicada na gota e no reumatismo [4,10].

utilizada toda a planta, na forma de decoco. Existem tambm cpsulas nas

ervanrias e estabelecimentos dietticos. Para o emagrecimento e anemia existem

cpsulas de carqueja e algas marinhas. Em cataplasma usa-se no tratamento de feridas.

Sob a forma de infuso, pode ainda ser utilizada no tratamento de gripes, bronquites e

pneumonias. As flores podem ser usadas no tratamento de irritaes da garganta e em

misturas de ervas para o tratamento de diabetes [4,10].

2.2.3. Evidncias Experimentais

2.2.3.1. Actividade de proteco do endotlio, dos flavonides

presentes nos extractos de Pterospartum tridentatum

O trabalho desenvolvido por Vitor e colaboradores [10] teve como objectivo

avaliar a capacidade dos extractos aquosos tradicionalmente preparados, de proteco

do endotlio contra os danos oxidativos produzidos por ROS em doentes diabticos tipo

II, uma vez que o stresse oxidativo parece ter um papel preponderante no

desenvolvimento de complicaes vasculares associadas aos diabticos tipo II. Este

estudo permitiu concluir que o extracto aquoso da carqueja protege uma cultura de

clulas endoteliais humanas dos danos oxidativos induzidos pelo perxido de

hidrognio; e que a isoquercetina um dos compostos responsveis pela actividade

antioxidante do extracto [10].

Pode ento dizer-se que o extracto aquoso desta erva pode prevenir ou reduzir o

desenvolvimento de complicaes vasculares nos diabticos [10].

2.3. A Giesta

2.3.1. Caractersticas do arbusto

A giesta, tambm designada por giesteira-das-vassouras (porque se utilizam os

caules deste arbusto no fabrico de vassouras), um arbusto de folha caduca, que

pertence famlia Leguminosae e subfamlia Papilionaceae e que tem como

designao cientfica Cytisus scoparius. um arbusto que pode atingir os dois metros

de altura e que possui ramos angulosos, erectos ou ascendentes e delgados. As folhas

so usualmente 3-folioladas. As flores so

formam cachos axilares de corola amarela

fruto uma vagem. Este arbusto encontra

rocha abundante e em locais soalheiros

devido presena de bactrias nitrificantes

comum em Portugal nas bermas de caminhos

Monchique e nos Aores [3

2.3.2. Utilizao na Medicina Popular

As flores (em boto) contm flavonides (escoparina) com propriedades

diurticas, sendo indicadas para tratar clculos renai

com insuficincia cardaca e constipaes.

alcalide que faz aumentar a fora contrctil do corao, e aminas estimulantes do

sistema nervoso vegetativo, que so a tiramina e a dopamina, de efeito vasoconstritor e

hipertensor semelhante ao da Digitalis (

As propriedades vasoconstritoras

e oxitiramina. Admite-se a fenilalanina, um

precursor destes compostos azotados. Formam

sucessivas: uma oxidase tra

descarboxilase origina a tiramina e, por fim, uma tiramina

aparecimento da oxitiramina

folioladas. As flores so abundantes e de cor amarel

de corola amarela (Figura 4). As suas folhas so diminutas e o

Este arbusto encontra-se principalmente em solos arenosos ou com

rocha abundante e em locais soalheiros e quentes, nos quais se adapta fac

devido presena de bactrias nitrificantes. muito frequente no oeste Europeu,

nas bermas de caminhos, nas zonas de Sintra, na Serra de

Monchique e nos Aores [3,4,11].

Figura 4: Cytisus scoparius [3,4].

na Medicina Popular

As flores (em boto) contm flavonides (escoparina) com propriedades

diurticas, sendo indicadas para tratar clculos renais, a gota, nefrose, nefrite, doentes

com insuficincia cardaca e constipaes. Os ramos jovens so ricos em

alcalide que faz aumentar a fora contrctil do corao, e aminas estimulantes do

sistema nervoso vegetativo, que so a tiramina e a dopamina, de efeito vasoconstritor e

hipertensor semelhante ao da Digitalis (Digitalis lanata) [4].

vasoconstritoras da giesta devem-se, principalmente, tiramina

se a fenilalanina, um aminocido fundamental, como o

destes compostos azotados. Formam-se custa de reaces enzimticas

sucessivas: uma oxidase transforma a fenilalanina em tirosina, depois uma

descarboxilase origina a tiramina e, por fim, uma tiramina-oxidase determina o

aparecimento da oxitiramina [11]. Esta planta ainda utilizada devido aos seus efeitos

33

abundantes e de cor amarelo-claro, que

As suas folhas so diminutas e o

se principalmente em solos arenosos ou com

e quentes, nos quais se adapta facilmente,

. muito frequente no oeste Europeu,

, nas zonas de Sintra, na Serra de

As flores (em boto) contm flavonides (escoparina) com propriedades

, nefrite, doentes

s em espartena, um

alcalide que faz aumentar a fora contrctil do corao, e aminas estimulantes do

sistema nervoso vegetativo, que so a tiramina e a dopamina, de efeito vasoconstritor e

mente, tiramina

fundamental, como o

se custa de reaces enzimticas

nsforma a fenilalanina em tirosina, depois uma

oxidase determina o

Esta planta ainda utilizada devido aos seus efeitos

34

hipnticos e sedativos, e no tratamento de diabetes e doenas hepticas. Estudos

farmacolgicos confirmaram o seu efeito de estimulao uterina e a sua actividade

espasmdica. Tambm referida a sua actividade hipotensiva e o seu efeito estrognico

[12].

A giesta contm flavonas, como a 6-O-acetil-escoparina, flavonides,

nomeadamente: rutina, quercetina, quercitrina, isoharmetina e campferol; e ainda

algumas isoflavonas como a genistena e o sarotamnsido. A maioria das actividades

biolgicas relacionadas com esta planta devem-se presena destes inmeros

constituintes activos de natureza antioxidante [12].

2.3.3. Evidncias Experimentais

2.3.3.1. Cytisus scoparius Um antioxidante natural

Os compostos fenlicos presentes nos extractos das partes areas da giesta

contribuem directamente para a sua aco antioxidante e so os responsveis pela sua

aco biolgica benfica. Esta actividade antioxidante pode ser importante na preveno

ou abrandamento do progresso de vrias doenas relacionadas com o stresse oxidativo

[12].

Foi provado que a administrao de extracto de giesta promove a converso da

glutationa oxidada (GSSH) em glutationa reduzida (GSH) pela reactivao da glutationa

redutase heptica (Figura 5), em ratos com danos hepticos significativos e

apresentando stresse oxidativo. Foi tambm verificada uma reduo nos nveis das

transaminases glutmicas oxaloactica e pirvica sricas e da desidrogenase do lactato,

aps a administrao de extracto de giesta, o que indica uma estabilizao das

membranas plasmticas, assim como uma reparao dos danos nos tecidos, causados

pelo tetracloreto de carbono (CCl4). Por outro lado, as actividades da superxido

dismutase e da catalase, ficaram prximo do normal, aps a administrao do extracto

de giesta aos ratos pr-tratados com CCl4, o que indica a aco antioxidante do extracto

contra os radicais livres de oxignio [13].

Conclu-se que o extracto de giesta tem um efeito significativo nos danos

hepticos, assim como no stresse oxidativo, resultando numa reduo da peroxidao

lipdica e numa melhoria dos parmetros bioqumicos do soro (transaminases

35

glutmicas oxaloactica e pirvica, desidrogenase do lactato) assim como num aumento

dos valores de superxido dismutase e de catalase, que se encontravam diminudos nos

ratos tratados com CCl4 [13].

Figura 5: Interconverso da glutationa nas suas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSH), pela

aco de vrias enzimas [14].

2.3.3.2. Avaliao das actividades antioxidante e ansioltica de Cytisus

scoparius

Foi desenvolvido um estudo para determinar as eventuais actividades

antioxidante e ansioltica de extracto de giesta, administrando-se a ratos que tinham sido

sujeitos a condies de stresse crnico, esse mesmo extracto. Foi possvel observar, que

a administrao deste extracto durante os perodos em que os ratos se encontravam em

stresse, proporcionava alteraes metablicas, indicando alguma influncia nos sistemas

neurolgico e endcrino. Conclui-se tambm, que este extracto possui actividade

ansioltica mas no apresenta propriedades anti-depressivas [15].

Por outro lado, este estudo verificou que a administrao de extracto de giesta

diminui os valores da superxido dismutase e da catalase, que se encontravam alteradas

devido s condies de stresse a que os ratos foram sujeitos e que leva a uma

diminuio do contedo das substncias reactivas com o cido tiobarbitrico medida

36

indirecta da peroxidao lipdica em vrios tecidos, o que permite uma atenuao dos

efeitos adversos resultantes do stresse crnico e que leva formao de ROS [15].

O contedo fenlico da giesta pode contribuir para o efeito antioxidante

observado e princpios activos como a flavona 6-O-acetil-escoparina, contribuem para

as propriedades antioxidantes deste arbusto [15].

37

3. CONSTITUINTES ACTIVOS DAS PLANTAS

38

3. CONSTITUINTES ACTIVOS DAS PLANTAS

As plantas, como todos os organismos vivos, possuem numerosos constituintes de

natureza qumica bem definida, uns, normalmente presentes em todas as plantas, outros,

sobretudo os do metabolismo secundrio, muitas vezes em pequenas quantidades,

podem pela sua presena particular, caracterizar uma dada espcie ou gnero. Uma

planta adquire o estatuto de medicinal quando possui constituintes

farmacologicamente activos que conferem a essa planta a possibilidade de ser usada

directa ou indirectamente na teraputica com benefcios para o tratamento ou preveno

de uma dada patologia. Para alm do ou dos constituintes activos, existem nas plantas

medicinais outros compostos que podem influenciar a aco destes. Estes compostos

em muitos casos protegem os constituintes activos de alteraes, nomeadamente

oxidaes, hidrlises, isomerizaes, etc., ao inibirem sistemas enzimticos, ou podem

at permitir uma melhor absoro pelo organismo, ao facilitarem a passagem atravs

das membranas. Isto explica o facto de a aco da planta ou de um extracto dessa tenha

muitas vezes maior actividade do que a mesma quantidade de um dado constituinte

activo isolado [6,16].

3.1. Constituintes do metabolismo primrio

3.1.1. Glcidos

Fazem parte dos glcidos as oses (monossacridos), os di-holsidos

(dissacridos), os oligo-holsidos (molculas com 3 a 10 oses), poli-holsidos

homogneos (sacridos com mais de 10 oses, dando por hidrlise a mesma ose) e os

poli-holsidos heterogneos (por hidrlise do duas ou mais oses diferentes, podendo

estar associados a cidos urnicos, tambm denominados poliurnidos). Deste grupo de

compostos fazem parte as gomas clssicas, mais usadas em tecnologia farmacutica, as

mucilagens e as substncias ppticas, estas j com interesse na teraputica [6,16].

3.1.2. Lpidos

Na base dos lpidos est a existncia de cidos gordos (cidos carboxlicos de

cadeia linear ou ramificada com quatro ou mais tomos de carbono geralmente em

39

nmero par, podendo ser saturados ou insaturados com 1, 2, 3 ou mais ligaes duplas)

que se podem encontrar livres ou esterificando um lcool ou poliol, caso do glicerol.

Consideram-se provenientes do metabolismo primrio, embora na formao dos cidos

gordos haja condensao de molculas de acetil-coenzima A [6,16].

3.1.3. Aminocidos

Os aminocidos, so molculas que contm um grupo amina e um grupo

carboxlico. Conhecem-se mais de 300 aminocidos vegetais, embora s cerca de 20

entrem na constituio das protenas, polmeros compostos de dezenas a centenas de

aminocidos [6,16].

3.2. Constituintes do metabolismo secundrio obtidos via acetato e via

siquimato

3.2.1. Fenis, cidos fenlicos e seus derivados

Os fenis simples so bastante raros nas plantas, com excepo dos derivados da

hidroquinona que existem em vrias famlias (nomeadamente na famlia Ericaceae),

geralmente sob a forma de glucsido de um difenol (arbutina ou arbutsido) ou do seu

monometilter (metilarbutina). Estes compostos esto presentes nas folhas da urze [4,5]

e da uva-ursina [4-6,16], os quais por hidrlise originam hidroquinona, de actividade

anti-sptica, justificativa do seu emprego em infeces urinrias [4-6,16].

So relativamente abundantes no reino vegetal os cidos fenlicos derivados do

cido benzico e do cido cinmico, em especial os compostos hidroxilados, alguns

deles ligados a oses. Um cido fenlico derivado do cido saliclico, muito vulgar, o

cido glico (Figura 6), um dos constituintes dos taninos que tem propriedades

adstringentes, por isso, usado por via externa em queimaduras e dermatoses, para alm

de hemosttico. Os cidos fenlicos derivados do cido cinmico, geralmente sob a

forma de hetersidos fenilpropanicos (C6-C3), mais difundidos na natureza, so o cido

p-cumrico, o cido cafeico, o cido ferlico e o cido sinptico e outros cidos que sob

a forma de steres, vo ser encontrados em diversas plantas medicinais [6,16].

40

Figura 6: Estrutura qumica do cido Glico [6].

Tradicionalmente, as plantas contendo estes compostos, so empregues como

colerticas e hipocolesteromiantes. Mais recentemente, estes compostos tm sido

estudados em relao actividade antioxidante. Nos ltimos anos tem-se verificado que

muitos steres heterosdicos de fenilpropanicos so inibidores enzimticos,

particularmente da fosfodiesterase do AMP cclico e da aldo-redutase, originando uma

certa inibio sobre a formao de hidroperxidos e leucotrienos, o que justifica a aco

benfica de certos frmacos no caso das doenas inflamatrias [6,16].

3.2.1.1. Determinao laboratorial dos fenis totais e polifenis

A quantificao espectrofotomtrica de compostos fenlicos realizada atravs

de diversas tcnicas, todavia, a que utiliza o reagente de Folin-Ciocalteu figura entre as

mais extensivamente utilizadas. Este reagente consiste numa mistura dos cidos

fosfomolbdico e fosfotngstico (designados em conjunto por cido fosfomolbdico-

tngstico) [17,18], no qual o molibdnio e o tungstnio se encontram no estado de

oxidao +6 (com a cor amarela), porm, na presena de certos agentes redutores, como

os compostos fenlicos, e em meio alcalino, formam-se os chamados molibdnio azul e

tungstnio azul, nos quais a mdia do estado de oxidao dos metais est entre 5 e 6 e

cuja colorao permite a medio colorimtrica e a determinao da concentrao das

substncias redutoras, que no precisam necessariamente de possuir natureza fenlica

[19,20]. Estes pigmentos azuis tm uma absoro mxima que depende da qualidade

e/ou composio quantitativa das misturas de fenis e do pH das solues, usualmente

obtido adicionando carbonato de sdio [20].

Apesar do mtodo do reagente de Folin-Ciocalteu ser amplamente utilizado na

determinao dos fenis totais em diferentes tipos de amostras, apresenta algumas

41

limitaes, visto que mede a capacidade redutora total de uma amostra. Esta

determinao correlaciona-se com a capacidade redutora e antioxidante dos compostos

fenlicos. A dissociao do proto dos fenis leva formao do anio fenolato, que

capaz de reduzir o reagente de Folin-Ciocalteu. Assim sendo, este mtodo no

especfico para compostos fenlicos. Muitos compostos no-fenlicos, presentes em

frutas e plantas, principalmente o cido ascrbico e os sacridos, podem reduzir o

reagente de Folin-Ciocalteu [17,19,20].

3.2.2. Flavonides

Neste grupo de constituintes poder-se-o referir os compostos com uma origem

biogentica comum e com o mesmo elemento estrutural de base, o 2-fenilcromano, isto

, um dos pigmentos dos vegetais mais vulgares, os flavonides amarelos (chauconas,

auronas e flavonis amarelos) e as antocianinas vermelhas, azuis ou violetas. Cerca de

80 % dos flavonides incluem as flavonas, os flavonis e as flavononas encontrando-se

normalmente sob uma forma osdica. So exemplos de flavonas a apigenina e a

luteolina; dos flavonis, o campferol e a quercetina; e das flavononas, a naringerina

[6,16].

De um modo geral, os flavonides so compostos capazes de diminuir a

permeabilidade capilar e reforar a sua resistncia, com marcada aco anti-inflamatria

e actividade antioxidante relacionada com a inibio de vrios sistemas enzimticos

(hialuronidase, catecol-O-metiltransferase, fosfodiesterase do AMP cclico, aldose

reductase), facto comprovado in vitro [6,16].

Um aspecto toxicolgico a destacar diz respeito aco mutagnica que os

flavonides livres manifestam, mas no os glucsidos, sendo referido que a quercetina

provavelmente o flavonide de maiores propriedades mutagnicas, embora a existncia

de grupos metoxi originem uma marcada reduo dessas propriedades. No sentido de

se poderem conhecer os possveis efeitos carcinognicos da quercetina, os ensaios

realizados tm sido controversos: ensaios em ratos foram positivos; outros ensaios, que

incluram ratinhos e hamsters, foram negativos [6,16].

Os antociansidos, os hetersidos das antocianinas, coram habitualmente as

flores e frutos. Em meio cido, esto sob a forma catinica, possuindo sempre um

42

hidroxilo em C3 para alm de outros hidroxilos que podem estar livres, eterificados com

metanol ou ligados a uma ose, com um hidroxilo em C5, C7 ou C4, livre, o que permite a

formao de estruturas quinnicas coradas. Os antociansidos diminuem a

permeabilidade capilar, particularmente dos capilares venosos, aumentando a sua

resistncia. Da a sua aco antiedematosa e o aumento da regenerao da prpura

retiniana [6,11].

Os flavonides absorvem radiao electromagntica na faixa do ultravioleta e do

visvel e desta maneira desempenham um papel fundamental de defesa das plantas das

radiaes ultravioletas da luz solar. Estes compostos desempenham tambm um papel

importante na sade humana. Como esto presentes em todas as plantas, acabam por

fazer parte da dieta do Homem. Os flavonides tm aco antioxidante, minimizando a

peroxidao lipdica e o efeito dos radicais livres [21].

3.2.2.1. Determinao laboratorial dos flavonides totais

A dosagem dos flavonides difcil de efectuar devido ao diferente

comportamento dos hetersidos e dos constituintes aglicnicos; alm disso no existe

um mtodo eficaz na eliminao de outras substncias de natureza qumica diferente,

que em geral acompanham os flavonides, e que podem interferir nos mtodos de

dosagem. No se conhecem tcnicas capazes de dosear em conjunto os diversos

flavonides contidos na mesma planta; muitas vezes adaptam-se a grupos mais ou

menos amplos de constituintes que revelam igual comportamento. Os mtodos fsico-

qumicos utilizados so colorimtricos, fluorimtricos, espectrofotomtricos,

cromatogrficos e polarogrficos. O problema inicial provm da dificuldade de isolar os

derivados flavnicos das matrias-primas vegetais na sua totalidade e num estado de

pureza conveniente para tal efeito [11].

Um processo usado nos mtodos quantitativos consiste em precipitar os

flavonides com cloreto de alumnio (AlCl3) em meio alcalinizado. Este precipitado,

adquire cor, sendo assim possvel, dosagem colorimtrica. Os compostos flavnicos

em presena do cloreto de alumnio possuem uma fluorescncia amarela intensa,

quando observados no ultravioleta [11,17]. A utilizao de cloreto de alumnio na

anlise da presena de alguns compostos qumicos foi pela primeira vez empregue para

as antocianinas. Actualmente um mtodo amplamente aceite e utilizado para a

43

determinao de flavonides. Neste mtodo, o catio alumnio forma complexos

estveis com os flavonides (em soluo metanlica) (Figura 7), ocorrendo na anlise

espectrofotomtrica um desvio para maiores comprimentos de onda e uma

intensificao da absoro. Assim, possvel determinar a quantidade de flavonides,

evitando-se as interferncias de outras substncias fenlicas, principalmente os cidos

fenlicos, que invariavelmente acompanham os flavonides nos tecidos vegetais. O

complexo flavonide-alumnio formado, absorve num comprimento de onda superior ao

do flavonide sem a presena do agente complexante (AlCl3). Os cidos fenlicos,

mesmo os que formam complexos com o cloreto de alumnio, absorvem em

comprimentos de onda muito inferiores, evitando-se deste modo, interferncias nas

leituras das absorvncias [21].

Figura 7: Formao do complexo flavonide-alumnio, em soluo metanlica, com cloreto de

alumnio [21].

A utilizao do cloreto de alumnio na determinao da quantidade de

flavonides totais no , no entanto, um procedimento isento de limitaes. O mtodo

preciso, isto , um mtodo reprodutvel, fornecendo desvios muito pequenos ou quase

nulos entre um ensaio e outro com a mesma amostra. No entanto, pode ser pouco

exacto, ou seja, o valor que fornece pode ser diferente (geralmente inferior) em relao

quantidade de flavonides totais realmente presentes na amostra analisada. O valor

medido e o valor real so tanto mais prximos entre si quanto maior a proporo de

flavonis na amostra, e tanto mais distantes quanto maior a proporo de flavonas. Isto

porque, o comprimento de onda seleccionado (415 nm 425 nm) corresponde banda

de absoro do complexo quercetina-alumnio. Os complexos de outros flavonis com

alumnio absorvem bem prximo da banda 415 nm 425 nm, mas os complexos

44

derivados de flavonas absorvem em comprimentos de onda inferiores, o que causa uma

sub-estimativa nas determinaes de misturas muito ricas em flavonas [21].

3.2.3. Isoflavonides

Os isoflavonides ao contrrio dos flavonides, tm na natureza uma

distribuio muito restrita, aparecendo praticamente apenas na famlia das Febceas.

Das diferentes estruturas existentes nos isoflavonides, interessam teraputica as

isoflavonas e os cumestanos, pelas propriedades estrognicas que manifestam ao se

ligarem aos receptores estrognicos [6,16].

3.2.4. Taninos

Os taninos so substncias de natureza fenlica, hidrossolveis, mas capazes de

formarem complexos insolveis com os alcalides e com as protenas. As propriedades

adstringentes e de inibio do desenvolvimento de fungos e de bactrias est na base do

seu emprego na teraputica. Distinguem-se habitualmente dois grandes grupos: o dos

taninos hidrolisveis (taninos glicos, dando por hidrlise para alm da ose, cido glico

e taninos elgicos que, por hidrlise do cido elgico) e o dos taninos condensados,

tambm designados proantocianidinas. Proantocianidinas uma designao alternativa

de taninos condensados pelo facto de estes compostos darem origem a antocianidinas

aps tratamento, a quente, com um cido mineral. Estruturalmente, as proantocianidinas

caracterizam-se como oligmeros ou polmeros de catequinas monomricas (3-

flavonis) e de leucoantocianidinas (3,4-flavonodiis) que so biossintetizadas pela via

mista do siquimato-acetato/malonato [6,16].

As procianidinas na maior parte dos casos so formadas por molculas de

catequina e de epicatequina unidas por ligao carbono-carbono [6,16].

Em medicina, os taninos so usados no tratamento de diarreias, como anti-

inflamatrios, anti-spticos e hemostticos. Visto terem a propriedade de precipitarem

alcalides (excepto a morfina) e metais pesados, podem ser empregues como antdoto

nos envenenamentos com estes compostos. Supe-se que os taninos actuem segundo

mecanismos relacionados, pelo menos em parte, com as caractersticas comuns aos

taninos hidrolisveis e condensados: actividade antioxidante e sequestradora de radicais

45

livres e capacidade de complexar macromolculas de natureza proteica (enzimas

digestivas, protenas fngicas ou virais) ou polissacrida e ies metlicos. Alguns

ensaios in vitro sugerem que estes compostos intervm na modulao de processos

envolvidos na diviso e proliferao celular, na coagulao, na inflamao e na resposta

imunolgica. Por via externa, os taninos, atravs da complexao tanino-protena e/ou

polissacrido, impermeabilizam as camadas mais externas da pele e das mucosas. Desta

forma, limitam a perda de fluidos e impedem as agresses externas, favorecendo a

regenerao dos tecidos e, consequentemente, a cura de feridas, queimaduras e

inflamaes. Por via interna, admite-se que um mecanismo idntico contribua para a

aco anti-ulcerosa sobre a mucosa gstrica [6,16]

Quanto actividade anti-microbiana dos taninos, ela tem sido fundamentada em

trs hipteses [6]:

Modificao do metabolismo microbiano por aco dos taninos sobre as

membranas celulares de bactrias e de fungos;

Inibio das enzimas microbianas e/ou complexao com os substratos dessas

enzimas;

Decrscimo de ies essenciais ao metabolismo das bactrias e fungos devido

complexao desses ies com os taninos.

Estudos recentes tm demonstrado que os taninos actuam como captadores de

radicais livres e como antioxidantes, facto que tem atrado o interesse cientfico quanto

ao desenvolvimento e verificao da eficcia de novos produtos farmacuticos base

de extractos de plantas contendo particularmente proantocianidinas [6,16].

3.2.5. Antraquinonas

O nome antraquinona deriva da presena de um grupo carbonilo no anel central

do esqueleto do antraceno (composto com trs anis benznicos). Embora nem todos os

compostos antraquinnicos sejam quinonas. Pois os sensidos so diantronas, isto ,

formados por duas unidades quinnicas reunidas, cada, com o seu grupo carbonilo. Em

linhas gerais, os derivados antraquinnicos exercem uma aco laxativa ou purgativa,

conforme a dose, que se faz sentir entre 10 a 12 horas aps a ingesto. Os hetersidos,

ao atingirem o clon, so hidrolisados pelas enzimas da flora bacteriana, indo as geninas

46

actuar sobre as terminaes nervosas da parede intestinal, com o que diminui a

reabsoro da gua e se d uma estimulao do peristaltismo intestinal [6,16].

3.3. Alcalides

Os alcalides so compostos existentes nos materiais vegetais, dotados de

actividade farmacolgica importante, mas tambm, de um modo geral, de elevada

toxicidade. Tm na sua estrutura, para alm dos elementos bsicos das substncias

orgnicas, carbono e oxignio, tambm, na maioria dos casos, oxignio e, sempre, um

ou mais tomos de azoto que conferem molcula propriedades bsicas. A basicidade

explicada pelo carcter insaturado do tomo de azoto, pois, dos cinco electres

planetrios desse tomo, trs esto ligados a tomos de hidrognio e a radicais, estando

os outros dois em condies de captar protes, pelo que formam sais com cidos. Os

alcalides raramente apresentam massas moleculares elevadas. Possuem um carcter

lipfilo muito acentuado, pelo que so solveis nos solventes orgnicos e no lcool de

elevada graduao. Quando reagem com os cidos originam sais que passam a ser

solveis na gua ou nas solues hidroalcolicas. A presena de oxignio na maioria

dos alcalides confere-lhes propriedades particulares. Os oxigenados cristalizam

facilmente, so inodoros e no volteis, sendo normalmente incolores, com excepo de

um pequeno nmero que so corados. J os que no possuem oxignio so lquidos,

odorferos e volteis (por exemplo a espartena). Aqueles que possuem massas

moleculares pequenas e percentagem de oxignio baixa so lquidos ou cristalizam

dificilmente [6,16].

Quanto sua origem biogentica, os precursores mais importantes so os

aminocidos; no entanto, conhecem-se numerosos alcalides que derivam de terpenos e

de esteris. Frequentemente, a biossntese resulta da combinao de produtos

provenientes de duas ou mais vias anablicas [6,16].

Os alcalides tm numerosas aces farmacolgicas [6]:

A nvel do sistema nervoso autnomo: como simpaticomimtica (efedrina de

Efedra spp.), simpaticoltica (ioimbina de Pausinystalia yohimbe e alguns

alcalides da cravagem do centeio), anticolinrgica (atropina e hiosciamina de

Solanceas midriticas), ganglioplgica (nicotina do tabaco) e

47

parassimpaticomimtica (eserina da fava do Calabar, o Physostigma venenosum,

pilocarpina de Pilocarpus spp.);

A nvel do sistema nervoso central: como depressor (morfina do pio, a

escopolamina das Solanceas midriticas), como estimulante (estricnina de

espcies do gnero Strychnos, a cafena do caf, do ch, do guaran e do mate);

Amebicida (emetina da ipecacuanha Cephaelis ipecacuanha);

Analgsica e ansioltica (alcalides da papoila da Califrnia Eschscholtzia

californica);

Anestsica local (cocana da coca Eritroxylon coca);

Antiarrtmica (espartena da giesta Cytisus scoparius);

Antifibrilante (quinidina da quina Cinchona sps.);

Antipaldica (quinina da quina);

Antitssica (codena do pio);

Antitumoral (vinblastina da vinca Catharanthus roseus);

Diurtica (teotrombina do cacau Theobroma cacao);

Hipotensora (reserpina da rauvlfia Rauwolfia serpentina).

48

4. ACTIVIDADE ANTIOXIDANTE

49

4. ACTIVIDADE ANTIOXIDANTE

Enquanto as reaces cido-base podem ser caracterizadas como processos de

transferncia de protes, as reaces designadas por oxidao-reduo (ou redox) so

consideradas reaces de transferncia de electres. Uma reaco que envolva a perda

de electres denominada reaco de oxidao. O termo oxidao foi originalmente

utilizado pelos qumicos para representar combinaes de elementos com o oxignio.

No entanto, tem agora um significado mais amplo que inclui reaces que no

envolvem o oxignio. Uma reaco que envolva ganho de electres denominada por

reaco de reduo. Quando um elemento oxidado, diz-se que actua como agente

redutor, visto que doa electres a uma outra substncia, causando a sua reduo.

Quando, pelo contrrio, um elemento reduzido, actua como agente oxidante porque

aceita electres, causando a sua oxidao [22].

4.1. Radicais Livres

O termo ROS inclui radicais de oxignio e um nmero de espcies relacionadas

com a produo de radicais livres. Os radicais livres podem ser produzidos

enzimaticamente (em reaces redox de cadeia de transporte de electres mitocndria,

retculo endoplasmtico e membrana celular e plasmtica e como intermedirio

durante a desintoxicao de drogas, na sntese de prostaglandinas e durante a activao

de leuccitos e plaquetas), por causas ambientais (como a luz ou radiao ultravioleta

ou ionizante) e por processos no enzimticos (atravs da auto-oxidao de muitas

substncias cidos gordos polinsaturados (PUFAs), hemoglobina, mioglobina,

catecolaminas que pode ser estimulada por ies metlicos com capacidade redox

ferro e cobre radiao ionizante ou ultravioleta e por corantes fotoactivados ou

pigmentos) [23-25].

A iniciao do processo oxidativo por radicais livres no est ainda clarificada,

sendo o radical hidroxilo (HO) e o radical peroxinitrilo (NO2) os radicais iniciadores.

tambm atribudo um papel importante ao radical anio superxido (O2-) devido

50

possibilidade de gerar o radical hidroxilo, muito reactivo atravs da reaco de Haber-

Weiss:

H2O2 + O2- OH- + HO + O2

Esta reaco ocorre apenas na presena de um metal de transio (normalmente

o ferro) que reduzido pelo O2- e reage com o perxido de hidrognio (H2O2) numa

reaco tipo Fenton:

O2- + Fe3+ O2 + Fe2+

H2O2 + Fe2+ OH- + HO + Fe3+

Uma vez formadas, as ROS passam para a microcirculao, e devido sua alta

reactividade, vo actuar a nvel das diferentes estruturas celulares (protenas e DNA) e

tambm a nvel da membrana celular (lpidos polinsaturados) [23-25].

Quando se verifica um desequilbrio entre a formao de espcies reactivas de

oxignio/radicais livres e as defesas antioxidantes/mecanismos de reparao do

organismo existe stresse oxidativo, que pode estar associado a doena [23].

4.1.1. Peroxidao Lipdica

A peroxidao lipdica tem uma importncia relevante por constituir um

processo em cadeia, isto , em que a formao de um radical lipdico desencadeia a

propagao do processo peroxidativo. Na peroxidao lipdica formam-se diversos

produtos reactivos nomeadamente radicais lipdicos e aldedo malnico. Estes produtos

finais, para alm de actuarem directamente sobre outros componentes da membrana

celular, podem infiltrar-se na corrente sangunea aumentando os nveis no sangue e no

plasma. Este aumento indicador da ocorrncia de danos nas membranas celulares de

rgos ou tecidos, que podem ser responsveis pelo desencadear de diversos processos

patolgicos [23-25].

4.1.2. Oxidao de Protenas

A alterao das propriedades das protenas, e a formao de perxidos de

aminocidos podem levar degradao das protenas, por fragmentao e formao de

51

ligaes cruzadas (cross-linking), o que pode resultar na sua polimerizao e

inactivao, especificamente em protenas que contm grupos sulfdricos (-SH) e grupos

aromticos. A oxidao de protenas provoca ainda alterao da sua estrutura terciria

que leva a agregao proteica e formao de amilide. A oxidao de aminocidos por

radicais livres induz alterao na actividade enzimtica, havendo tambm um

comprometimento do potencial antioxidante de clulas e tecidos [23-25].

4.1.3. Oxidao de DNA

Os danos no DNA so dos processos mais importantes resultantes da ocorrncia

do processo peroxidativo in vivo. A alterao do DNA por danos oxidativos uma das

principais causas responsveis pelo desencadear da carcinognese, quer por activao

de proto-oncogenes, quer por inactivao de genes supressores de tumores [23-25].

A inibio da programao da morte celular, a apoptose, poder tambm estar

associada com a oncognese e com alteraes ao nvel do DNA e poder surgir em

consequncia da aco de radicais livres que levam ao aumento da concentrao de

clcio citoplasmtico [23-25].

4.2. Antioxidantes

Definem-se antioxidantes como quaisquer substncias que, presentes em

concentraes relativamente baixas (comparadas com as dos substratos), impedem ou

retardam significativamente a oxidao de substratos oxidveis [23-25].

4.2.1. Sistemas Antioxidantes

O organismo possui mecanismos de controlo de produo de ROS e mecanismos

para limitar e reparar os danos tecidulares. O sistema antioxidante integrado

compreende vrios componentes [23-25]:

Antioxidantes que previnem a formao de ROS (ceruloplasmina - Cu,

metalotionina - Cu, albumina - Cu, tranferrina - Fe, ferritina - Fe e mioglobina -

Fe);

52

Antioxidantes que removem ROS, prevenindo assim reaces em cadeia:

enzimas (superxido dismutase, glutationa peroxidase, glutationa redutase,

catalase, metaloenzimas), molculas pequenas (glutationa, ascorbato ou vitamina

C, tocoferol ou vitamina E, bilirrubina, cido rico, carotenides e flavonides);

Enzimas de reparao (reparam e removem biomolculas). Estas incluem

enzimas reparadoras de DNA, metionina sulfxido redutase.

Contudo, a maior defesa antioxidante primria intracelular atribuda a

superxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase [23-25].

4.3. Relao entre stresse oxidativo e patologias

Sabe-se que o stresse oxidativo est directamente relacionado com um grande

nmero de patologias, nomeadamente o cancro (uma vez que os radicais livres tm

actividade de iniciao e promoo as duas fases fundamentais de desenvolvimento do

cancro), as doenas cardiovasculares (o excesso de radicais livres pode iniciar a

aterosclerose por danos nas paredes dos vasos sanguneos), a diabetes mellitus (os

radicais livres contribuem para a destruio das clulas dos ilhus pancreticos na

diabetes mellitus dependente de insulina), as doenas inflamatrias (os radicais livres

podem actuar indirectamente como mensageiros celulares e desencadear uma resposta

inflamatria), a infertilidade (os radicais livres iniciam a peroxidao lipdica e a

acumulao de perxidos nas membranas dos espermatozides, causando uma reduo

na mobilidade e viabilidade dos mesmos), as cataratas (os radicais superxido e

hidroxilo lesam as protenas e os lpidos das membranas celulares, que se depositam na

superfcie do cristalino causando opacidade), o envelhecimento (que se deve produo

de reaces de radicais livres na mitocndria que se acumulam com a idade), as doenas

neurolgicas (o crebro, rico em cidos gordos polinsaturados e ferro e pobre em

antioxidantes, rodeado pelo fluido cerebrospinal, tem pouca ou nenhuma capacidade de

quelar o ferro), doenas hepticas (nveis elevados de cidos gordos de cadeia curta

aumentam a captao de ferro pelos hepatcitos, aumentando a produo de perxido de

hidrognio e radicais livre), as doenas pulmonares (os radicais livres de oxignio e

outros produtos txicos formados pelas prprias clulas pulmonares e pela actividade

neutroflica, que se acumulam nos pulmes quando o oxignio puro respirado, podem

53

contribuir possivelmente para o dano oxidativo), entre muitas outras condies

patolgicas [23-25].

4.4. Mtodos de determinao laboratorial da actividade antioxidante

Os mtodos para avaliar o comportamento antioxidante podem ser agrupados em

duas categorias, que reflectem a importncia da actividade antioxidante nos alimentos

ou a bioactividade em humanos. No caso dos sistemas alimentares, a necessidade

consiste em avaliar a eficcia dos antioxidantes em fornecer uma proteco para os

alimentos contra a deteriorao oxidativa. Uma subcategoria envolve a medio da

actividade antioxidante em alimentos, particularmente frutas, vegetais e bebidas, mas

com o objectivo de determinar a carga de antioxidantes na dieta e a sua actividade

antioxidante in vivo [26].

Os antioxidantes podem actuar por vrios mecanismos, como sequestrando os

radicais livres, decompondo os perxidos e quelando os ies metlicos. Assim sendo, a

actividade antioxidante deve ser medida e avaliada por vrios mtodos que contemplem

diferentes mecanismos qumicos de actividade antioxidante [27].

De acordo com as reaces qumicas usadas, os mtodos de determinao da

actividade antioxidante podem ser agrupados em duas classes: transferncia de tomos

de hidrognio (HAT) e transferncia de electres (ET). Os mtodos HAT medem a

capacidade de um antioxidante em inactivar os radicais livres por doao de tomos de

hidrognio. Os mtodos ET medem a capacidade de um potencial antioxidante em

transferir um electro para os radicais reduzidos, metais ou carbonilos [27].

Um dos problemas na determinao da actividade antioxidante que esta varivel

em funo do mtodo utilizado. Mas sabe-se que um mecanismo antioxidante nas

diversas matrizes biolgicas muito complexo e muitos outros factores podem intervir

nesse mecanismo. Perante esta complexidade, apenas um mtodo de determinao da

actividade antioxidante no suficiente para se chegar a uma concluso, logo, so

aplicados diferentes mtodos e so determinadas diferentes propriedades e

caractersticas [27].

54

4.4.1. Determinao da actividade antioxidante pelo mtodo do DPPH

O mtodo do DPPH baseia-se no estudo da actividade sequestradora do radical

livre estvel 2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH) (Figura 8), de colorao prpura que

absorve a um determinado comprimento de onda (515 nm 517 nm). Por aco de um

antioxidante (AH) ou uma espcie radicalar (R), o DPPH reduzido formando difenil-

picril-hidrazina (Figura 9), de colorao amarela, com consequente desaparecimento da

absoro, podendo a mesma ser monitorizada pelo decrscimo da absorvncia. A partir

dos resultados obtidos determina-se a percentagem de actividade antioxidante ou

sequestradora de radicais livres e/ou a percentagem de DPPH remanescente no meio

reaccional [19,26].

Figura 8: Estrutura qumica do radical livre DPPH [28].

A percentagem de actividade antioxidante corresponde quantidade de DPPH

consumido pelo antioxidante, sendo que a quantidade de antioxidante necessria para

reduzir a concentrao inicial de DPPH em 50 % denomina-se por concentrao

eficiente (EC50), tambm chamada por concentrao inibitria (IC50). O tempo

necessrio para atingir o estado estacionrio concentrao eficiente (EC50), isto , o

tempo necessrio para que a concentrao inicial de DPPH decresa 50 % designado

por tempo eficiente (TEC50). Quanto maior o consumo de DPPH por uma amostra,

menor ser a sua EC50 e maior a sua actividade antioxidante [19,26].

Figura 9: Reaco entre o DPPH e a substncia antioxidante dadora de um tomo de hidrognio

[29].

55

Este mtodo baseia-se, no fundo, na capacidade do DPPH reagir com

substncias dadoras de hidrognio, incluindo compostos fenlicos [30].

A estequiometria da reaco do DPPH com um composto antioxidante pode ser

descrita pelas seguintes equaes [18,31]:

DPPH + antioxidante + H DPPH (H) + R (1)

DPPH(H) + R DPPH + antioxidante + H (2)

DPPH + R produto

R + R produto

R + R produto + antioxidante

(1) Envolve a abstraco de hidrognio do antioxidante presente na sua forma

protonada, ou transferncia electrnica entre o DPPH e o antioxidante, ligada

captura de um proto, sendo esta hiptese a mais provvel;

(2) Tem em conta a reversibilidade do passo inicial (1).

4.4.2. Determinao da actividade antioxidante pelo sistema -

caroteno/cido linoleico

O sistema -caroteno/cido linoleico, que consiste na descolorao (oxidao)

do -caroteno induzida pelos produtos da degradao oxidativa do cido linoleico,

estima a habilidade relativa de compostos antioxidantes presentes em extractos de

plantas de sequestrar o radical perxido do cido linoleico (LOO), que oxida o -

caroteno presente na emulso. Este mtodo tem sido amplamente utilizado, com

diferentes meios de extraco dos antioxidantes, para avaliao da actividade

antioxidante de matrizes alimentares. Como no ocorre a altas temperaturas, permite a

determinao do poder antioxidante de compostos termolbeis e a avaliao qualitativa

da eficcia antioxidante de extractos vegetais [32].

O mecanismo do branqueamento do -caroteno um fenmeno mediado por

radicais hidroperxido resultantes da oxidao, pelo ar, do cido linoleico. A actividade

antioxidante dos carotenides baseada na formao de aductos radicalares de

carotenides com os radicais livres formados pelo cido linoleico. O radical livre do

56

cido linoleico, formado aps a abstraco de um tomo de hidrognio de um dos seus

grupos metileno-diallicos, ataca as molculas do -caroteno altamente insaturadas.

Assim que as molculas do -caroteno perdem as suas ligaes duplas pela oxidao,

neste sistema modelo, na ausncia de antioxidantes, o composto perde o seu cromforo

e a sua cor-de-laranja caracterstica, que pode ser monitorizada

espectrofotometricamente [33].

A comparao da actividade antioxidante tem que ter em considerao o

solvente utilizado para a extraco dos compostos, a concentrao do extracto e as

condies do mtodo analtico escolhido. A eficcia dos vrios compostos na proteco

dos sistemas lipdicos deve ser comparada na mesma concentrao molar a padres

puros, como o butil-hidroxi-tolueno (BHT) e o tocoferol, entre outros. Alm do aspecto

comparativo, a medida do padro para cada ensaio realizado importante para assegurar

a repetibilidade do teste [32].

4.5. Relao entre compostos fenlicos, flavonides e actividade antioxidante

Recentemente, h um aumento no interesse em antioxidantes naturalmente

encontrados em frutos e plantas para uso em fitoterapia, a fim de substituir os

antioxidantes sintticos, os quais tm uso restrito devido aos seus efeitos colaterais, tais

como a carcinogenecidade. Alm disso, os antioxidantes naturais possuem a capacidade

de melhorar a qualidade e a estabilidade dos alimentos, e proporcionar, ainda,

benefcios adicionais sade dos consumidores. Embora as evidncias sejam claras

sobre a aco in vitro dos fenis e polifenis contra as ROS, eles podem, em algumas

circunstncias, tal como o ascorbato e os carotenides, mostrarem caractersticas pr-

oxidantes [34-36].

Na indstria alimentar, a oxidao lipdica inibida por sequestradores de radicais

livres. Os compostos mais utilizados com esta finalidade so o butil-hidroxi-anisol

(BHA), BHT, terc-butil-hidroxi-quinona (TBHQ), tri-hidroxi-butil-fenona (THBF) e

galato de propilo (GP). Estudos tm demonstrado a possibilidade destes antioxidantes

apresentarem alguns efeitos txicos. O galato de propilo, por exemplo, quando em

presena de perxido de hidrognio reage com ies ferrosos formando ROS, as quais

podem posteriormente atacar alvos biolgicos. Em funo dos possveis problemas

provocados pelo consumo de antioxidantes sintticos, as pesquisas tm-se voltado no

57

sentido de encontrar produtos naturais com actividade antioxidante, os quais permitiro

substituir os sintticos ou fazer associao entre eles [36-38].

Os compostos activos mais comummente encontrados nas frutas, hortalias e plantas

so as substncias fenlicas, as quais so conhecidas como potentes antioxidantes e

antagonistas naturais de agentes patognicos. Estas substncias encontram-se nos

vegetais na forma livre ou ligadas a acares e protenas. Como antioxidantes naturais,

alm de serem compostos alternativos com finalidade de evitar a deteriorao oxidativa

dos alimentos, tambm podem exercer um importante papel fisiolgico, minimizando os

danos oxidativos no organismo animal. H evidncias de que os compostos fenlicos

encontrados em uvas e vinhos tintos podem inibir a oxidao in vitro das lipoprotenas

de baixa densidade (LDL) humanas, assim como possvel a sua utilizao na

preveno de aterosclerose [19]. A actividade antioxidante dos compostos fenlicos

deve-se principalmente s suas propriedades redutoras e sua estrutura qumica. Estas

caractersticas desempenham um papel importante na neutralizao ou sequestro de

radicais livres e quelao de metais de transio, agindo tanto na etapa de iniciao

como na propagao do processo oxidativo. Os intermedirios formados pela aco de

antioxidantes fenlicos so relativamente estveis, devido ressonncia do anel

aromtico presente na estrutura destas substncias. Os compostos fenlicos podem

actuar como agentes redutores, dadores de tomos de hidrognio, neutralizadores de

oxignio singleto e quelantes de metais demonstrando diferentes actividades biolgicas,

tais como: actividade anti-bacteriana, anti-carcinognica, anti-inflamatria, anti-viral,

anti-alrgica, estrognica e estimuladora do sistema imunitrio [38-41].

Estudos tm demonstrado que polifenis naturais possuem efeitos significativos na

reduo do cancro, e evidncias epidemiolgicas demonstram correlao inversa entre

doenas cardiovasculares e consumo de alimentos, fonte de substncias fenlicas,

possivelmente pelas suas propriedades antioxidantes [41-43].

Os flavonides so um grupo de compostos polifenlicos conhecidos pelas suas

propriedades que incluem, sequestrao ou quelao de radicais livres, inibio de

enzimas hidrolticas e oxidativas e actividade anti-inflamatria. Evidncias

experimentais, sugerem que estas propriedades se relacionam com actividade

antioxidante dos flavonides [43-45].

58

Estudos demonstram uma grande correlao linear entre o contedo de compostos

fenlicos numa determinada amostra e a sua actividade antioxidante relacionada com a

capacidade sequestradora de radicais livres, assim como boas correlaes positivas entre

o contedo de flavonides de uma amostra e a respectiva actividade antioxidante [43-

45].

59

5. ACTIVIDADE ANTI-MICROBIANA

60

5. ACTIVIDADE ANTI-MICROBIANA

As molculas produzidas por microrganismos (Penicillium spp., Streptomyces spp.,

entre outros) com propriedades anti-microbianas contra outros microrganismos, so

designadas por antibiticos, e as molculas de sntese qumica com idnticas

propriedades so os quimioterpicos. Actualmente d-se a designao genrica de

antibiticos a todos os frmacos com aco anti-microbiana [46].

A quimioterapia comeou em 1935 com a utilizao do corante Prontosil no

tratamento das infeces estreptoccicas. A cedncia no organismo de sulfanilamida a

partir do Prontosil constituiu a premunio da era das sulfonamidas em Medicina. Com

a descoberta da penicilina por A. Fleming, em 1945, d-se incio era da antibioterapia.

A penicilina sendo um antibitico inibidor da biossntese do peptidoglicano, molcula

tipicamente procariota, praticamente no apresenta efeitos prejudiciais para o Homem.

Mais tarde descoberta a estreptomicina, dando-se incio era dos antibiticos

inibidores da sntese proteica [46].

A primeira descrio de resistncia bacteriana a antibiticos deve-se a Abraham e

Chain, em 1940, com o aparecimento de estirpes de S. aureus produtoras de

penicilinases, enzimas que inactivam por hidrlise as penicilinas. Em 1950 surgem no

Japo estirpes de Shigella resistentes s sulfonamidas e, em 1952, estirpes co-resistentes

s sulfonamidas, estreptomicina e tetraciclina. A resistncia microbiana aos diversos

grupos de anti-microbianos tem vindo a aumentar ao longo dos anos, sobretudo nos

ambientes hospitalares com o acrscimo de morbilidade e mortalidade nas infeces.

Por este motivo, surge o interesse na pesquisa de novos compostos de origem

natural/vegetal que tenham propriedades anti-microbianas e que possam ser usados em

humanos como alternativa aos antibiticos tradicionais [46].

Por outro lado, como uma grande variedade de microrganismos pode levar a uma

deteriorao dos alimentos, sendo a intoxicao alimentar um problema para os

consumidores e para a indstria alimentar, alguns produtos qumicos sintticos so

utilizados para controlar o crescimento microbiano e reduzir a incidncia de

deteriorao dos alimentos e consequentes intoxicaes alimentares. Embora estes

conservantes sintticos sejam eficazes, podem ser prejudiciais para a sade humana

61

causando preocupao nos consumidores, logo tem sido crescente o interesse na procura

de novas substncias anti-microbianas a partir de fontes naturais, como plantas, para

reduzir a aplicao de agentes anti-microbianos sintticos na conservao dos

alimentos. Extractos brutos de especiarias, ervas e plantas medicinais, ricos em

compostos fenlicos so cada vez mais importantes na preservao dos alimentos

devido sua actividade anti-microbiana [47].

5.1. Microrganismos procariotas

Os microrganismos procariticos tm uma organizao celular bastante simples. As

bactrias, prottipo dos procariotas, apresentam uma grande diversidade morfolgica,

tendo a sua maioria uma de duas formas: esfrica (coco) ou em bastonete (bacilo). A

maioria das bactrias, aps a replicao do seu material gentico dividem-se por ciso

binria e, de acordo com os planos da diviso celular, podem apresentar diversos

agrupamentos. Os cocos podem agrupar-se aos pares (diplococos), em cadeia

(estreptococos), em cacho (estafilococos) ou em ttradas. Os bacilos aparecem

geralmente isolados, aos pares ou em cadeias curtas. Existem ainda outras formas

bacterianas demonstrando o pleomorfismo do mundo bacteriano, nomeadamente bacilos

encurvados (vibries), fusiformes e ondulados ou espirilados [46].

O tamanho da clula bacteriana tambm muito heterogneo exibindo alguns

membros do Gnero Mycoplasma 100 200 nm de dimetro e as clulas de E. coli 1,1

1,5 m de comprimento. As bactrias (excepto Mycoplasma formas L e halfilos)

possuem parede celular. De um modo geral, as bactrias desenvolvem-se em ambientes

hipotnicos e dada a fragilidade da membrana citoplasmtica ocorreria lise celular se

no fosse a presena de uma parede celular rgida. Esta estrutura constitui, portanto,

uma proteco mecnica eficaz contra a ruptura osmtica da clula bacteriana em

ambientes hipotnicos. O componente responsvel por essa rigidez o peptidoglicano

(mucopeptdeo ou murena), macromolcula presente em todas as bactrias com parede

celular, excepto nas Archaeobacterias [46].

A parede celular, estruturada sob controlo gentico, tambm responsvel pela

morfologia bacteriana e pelo duplo comportamento das bactrias em relao colorao

de Gram. A colorao de Gram tem um grande significado taxonmico pois permite

dividir as bactrias em dois grupos: positivas ao Gram / Gram positivas ou negativas ao

62

Gram / Gram negativas. As bactrias Gram positivas tomam a cor arroxeada, conferida

pelo corante primrio (cristal violeta) e as Gram negativas coram de vermelho (fucsina

bsica). O diferente comportamento das bactrias em relao colorao de Gram deve-

se ao facto dos dois grupos bacterianos apresentarem parede celular qumica e

estruturalmente distinta. As diferenas mais relevantes residem no facto de: a parede

celular das bactrias Gram positivas no apresentar lpidos (excepto Mycobacterium,

algumas estirpes de Corinebacterium, Nocardia), enquanto a parede celular das

bactrias Gram negativas apresenta um elevado teor de lpidos; o peptidoglicano ser

muito abundante nas bactrias Gram positivas, cerca de 50 90 % do peso total da

parede celular seca; nas bactrias Gram negativas o peptidoglicano constituir somente

cerca de 10 % do peso total da parede celular seca. As diferenas qumicas entre as

bactrias Gram positivas e Gram negativas vo ter repercusses na arquitectura da

parede celular, sendo as diferenas ultraestruturais entre os dois grupos bacterianos

evidenciados por microscopia electrnica de transmisso e atravs da observao de

cortes celulares ultrafinos [46].

5.1.1. Bactrias Gram positivas

5.1.1.1. Staphylococcus aureus

O gnero Staphylococcus pertence famlia dos Micrococcaceae. O nome tem

origem grega e significa cocos em cacho, morfologia caracterstica destes

microrganismos, sobretudo quando cultivados superfcie de meios de cultura slidos.

Os estafilococos so bactrias que vivem em contacto ntimo com o Homem, numa

relao habitual de comensalismo ou mutualismo. Muitas espcies constituem parte

importante da populao microbiana indgena da pele e mucosas, mas o gnero inclui

tambm alguns dos principais microrganismos patognicos, nomeadamente a espcie

Staphylococcus aureus. As infeces causadas por estafilococos so muito variadas,

tanto nas manifestaes clnicas como na potencial gravidade. O contexto

epidemiolgico em que surgem apresenta condicionalismos particulares de profilaxia e

controlo das infeces. A origem da infeco por Staphylococcus aureus , muitas vezes

endgena. A partir do nariz, da pele ou de uma leso superficial, o microrganismo pode

entrar em circulao e originar infeco distncia. Para alm da infeco endgena

ocorre tambm transmisso homem a homem, o que se verifica frequentemente na

infeco hospitalar. Neste caso a transmisso pode dar-se por contacto directo (o mais

63

importante), por contacto indirecto atravs de objectos contaminados, ou por via area

[48].

5.1.1.2. Bacillus cereus

O Bacillus cereus tem uma distribuio ubiquitria na natureza, nomeadamente

no solo e em plantas em crescimento. Por isso aparece, frequentemente, nos alimentos

(carne, leite em p, arroz e em vegetais), podendo ocasionar toxi-infeces alimentares,

devido produo de exotoxinas, que so importantes na patognse da intoxicao

alimentar [48].

5.1.1.3. Enterococcus faecalis

A grande resistncia dos enterococos aos agentes fsicos, que lhes permite

crescer e sobreviver em ambientes hostis faz com que a presena seja habitual em quase

todos os produtos biolgicos, no solo, alimentos, gua, animais, aves e insectos. No

homem e outros animais a sua presena constante nos aparelhos digestivo e urinrio.

A espcie E. faecalis existe, quase constantemente e em grande nmero, no tracto

gastrointestinal. Apesar da sua abundncia no organismo humano, o seu poder invasivo

e patognico escasso e s em circunstncias especiais que ganha relevo como agente

de infeco. Aparece, muitas vezes, associado a outros germes e, ocasionalmente,

isolado em determinadas infeces, como por exemplo, endocardite. No entanto,

quando agente de infeco a sua resistncia natural aos agentes infecciosos, torna

muito difcil o tratamento. Esta mesma resistncia natural aos antibiticos confere-lhe

vantagem em ambientes onde o uso destes frequente e, da, a sua relevncia como

agente de infeces adquiridas nos hospitais em doentes sujeitos a tratamento

prolongado com antibiticos de largo espectro que eliminam outras bactrias comensais

susceptveis [48].

5.1.2. Bactrias Gram negativas

5.1.2.1. Escherichia coli

E. coli, vulgarmente designada por coli-bacilo, a espcie de maior importncia

clnica, ocasionando frequentemente infeces urinrias, gastroenterites, pneumonias,

septicemias, abcessos, etc.. tambm um habitante indgena do tracto intestinal dos

64

mamferos e, por essa razo, a sua presena em guas de consumo indica poluio fecal.

Embora E. coli seja um habitante indgena do tracto intestinal, algumas estirpes podem

ocasionar perturbaes entricas. As estirpes E. coli enterotoxgenas (ETEC) so

produtoras de dois tipos de toxinas: termo-lbil (LT) ou termo-estvel (ST), as quais so

responsveis pela patognese da infeco entrica. A toxina LT ocasiona no entercito

um aumento de intracelular de cAMP, provocando um distrbio na permeabilidade da

membrana citoplasmtica, com perda de gua e electrlitos para o lmen intestinal. O

mecanismo descrito semelhante ao da toxina de V. cholerae [48].

5.1.2.2. Klebsiella pneumoniae

K. pneumoniae a espcie mais frequente nas infeces humanas (tracto

urinrio, tracto respiratrio, etc.). Tem a caracterstica de produzir colnias mucides

em gelose de MacKoney, ser produtora de urease, e de ser imvel [48].

5.1.2.3. Salmonella typhimurium

Na maioria dos casos, a salmonelose adquirida pela ingesto de alimentos e de

gua, contaminados ou por contacto fecal-oral. As aves e os animais contaminados

constituem o reservatrio de Salmonella no typhi e transmitem a doena ao Homem. O

reservatrio de S. typhi o Homem, que tambm o principal disseminador da febre

tifide, na fase aguda da doena ou no estado de portador assintomtico [48].

5.1.2.4. Pseudomonas aeruginosa

A espcie P. aeruginosa praticamente ubiquitria, podendo ser isolada de

guas, do solo, de plantas, de esgoto e de amostras clnicas. Um meio selectivo para P.

aeruginosa inclui cetrimida, que inibe o crescimento de muitos microrganismos, mas

no o seu, devido sua resistncia aco de compostos de amnio quanternrios.

Apesar de ser um agente patognico oportunista, na maior parte dos casos P. aeruginosa

completamente incua. As infeces por P. aeruginosa (infeces urinrias, difceis

de erradicar e frequentes aps cateterizao; infeces em feridas e zonas queimadas;

otites crnicas, mdia e externa; infeces do tracto respiratrio em doentes com fibrose

qustica e em doentes que tm que recorrer a ventiladores; infeces dos olhos aps

leso traumtica ou cirurgia) surgem, fundamentalmente, em doentes que j

65

anteriormente sofriam de outra doena ou leso, podendo causar trs tipos principais de

infeces graves: i) infeco aguda e localizada dos olhos, aps leso da crnea ou

cirurgia; ii) infeco crnica dos pulmes de doentes com fibrose qustica; iii) infeco

grave e disseminada em doentes com o sistema imunolgico deficiente (doentes com

SIDA, neoplasias, ou sob terapia com imunossupressores aps transplante de rgo) ou

que apresentem queimaduras graves [48].

5.2. Microrganismos eucariotas

As clulas so a unidade estrutural e funcional de todos os seres vivos. Por outras

palavras, cada clula possui uma organizao molecular que lhe permite desempenhar

as funes que caracterizam a vida: crescer, reproduzir-se e adaptar-se ao meio exterior.

As clulas eucariticas existem quer como organismos unicelulares quer como

constituintes de organismos multicelulares. A organizao celular eucaritica comum

aos fungos, algas e protozorios. Os seres unicelulares eucariticos mais simples so as

leveduras, enquanto os protozorios so organismos unicelulares extremamente

complexos que desenvolveram inmeras especializaes funcionais, tais como clios

sensoriais, fotoreceptores, clios e flagelos e feixes contrcteis semelhantes a msculos.

Em geral os organismos unicelulares so pequenos, consomem relativamente poucos

nutrientes, dividem-se rapidamente e possuem capacidade de adaptao aos mais

diversos meios ambientes. Apesar de terem alcanado um claro sucesso evolutivo (os

seres vivos unicelulares constituem mais de metade do total da biomassa da Terra), o

aparecimento de organismos multicelulares tornou possvel o desenvolvimento de

formas de vida com caractersticas mais complexas [46].

5.2.1. Leveduras

Os fungos so clulas eucariotas, desprovidas de clorofila e que se reproduzem

por esporos. Neles esto includos organismos de forma e dimenses muito variadas,

conhecidos correntemente como leveduras, bolores, mofo, morro e cogumelos. Os

fungos leveduriformes, designados por leveduras, so fungos unicelulares. Os outros,

que constituem a grande maioria, so fungos filamentosos ou pluricelulares [46,48].

66

A etimologia da palavra levedura tem origem no termo latino levare com o

sentido de crescer ou fazer crescer, pois as primeiras leveduras descobertas estavam

associadas a processos fermentativos como o de pes e de mostos que provocam um

aumento da massa do po ou do volume do mosto pela liberao de gs e formao de

espuma nos mostos. Como clulas simples, as leveduras crescem e reproduzem-se mais

rapidamente do que os bolores. So mais eficientes na realizao de alteraes

qumicas, por causa da sua maior relao rea/volume. As leveduras tambm diferem

das algas, pois no efectuam a fotossntese, e igualmente no so protozorios porque

possuem uma parede celular rgida. So facilmente diferenciadas das bactrias em

virtude das suas dimenses superiores e das suas propriedades morfolgicas [46,48].

5.2.1.1. Candida albicans

Candida albicans uma espcie de fungo diplide que causa, oportunistamente,

alguns tipos de infeco oral e vaginal nos seres humanos. As infeces causadas por

fungos emergiram como uma das principais causas de morte em pacientes com algum

tipo de imunodeficincia (como o que caso dos portadores da SIDA e das pessoas que

esto sujeitas a algum tipo de quimioterapia). Alm disso, este fungo pode ser perigoso

para pacientes cuja sade esteja enfraquecida, como por exemplo os pacientes de uma

unidade hospitalar. Devido a estes factores, a Candida albicans tem despertado grande

interesse nas pesquisas nas reas da sade e da medicina. A Candida albicans est entre

os muitos organismos que vivem na boca e no sistema digestivo humano. Sob

circunstncias normais, a Candida albicans pode ser encontrada em 80 % da populao

humana sem que isso implique quaisquer efeitos prejudiciais na sua sade, embora o

excesso resulte em candidase. A virulncia e patogenicidade da Candida albicans esto

ligadas a diversos factores, sendo a formao de hifas, a estrutura da sua superfcie

celular (que, durante o contacto com clulas do hospedeiro, se adapta, sendo

determinante para uma eficaz adeso e penetrao), alteraes fenotpicas (transio

espontnea entre a forma tpica de levedura, branca e circular, e uma forma opaca, em

forma de pequenos bastes) e produo de enzimas extracelulares hidrolticas [48].

http://pt.wikipedia.org/wiki/Mostohttp://pt.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lulahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Qu%C3%ADmicahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Algahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Fotoss%C3%ADntesehttp://pt.wikipedia.org/wiki/Bact%C3%A9riahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Fungohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Dipl%C3%B3idehttp://pt.wikipedia.org/wiki/Bocahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Vaginahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Ser_humanohttp://pt.wikipedia.org/wiki/AIDShttp://pt.wikipedia.org/wiki/Quimioterapiahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Medicinahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Bocahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Sistema_digestivohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Candidiase

67

5.2.1.2. Candida tropicalis

Candida tropicalis uma espcie de fungo pertencente ao gnero Candida e a

ordem Saccharomycetales. Como outras estirpes de Candida , oportunistamente,

causadora da candidase. A Candida tropicalis por vezes usada como modelo em

pesquisas genticas e medicinais [48].

5.3. Mtodos de determinao laboratorial da actividade anti-microbiana

5.3.1. Teste da difuso em disco

Os primeiros mtodos para avaliar os efeitos dos antibiticos sobre as bactrias

envolviam a utilizao de pequenos orifcios feitos em placas de agar. A soluo de

antibitico era depois colocada no orifcio para, deste modo, inibir o crescimento

bacteriano de forma perpendicular ao orifcio. Em 1943, Foster e Woodruff utilizaram

tiras de papel impregnadas com antibiticos como uma fonte alternativa de difuso. Os

reservatrios de antibiticos que inicialmente consistiam em solues dos mesmos,

depositadas em poos de agar, foram rapidamente substitudos por discos de papel

impregnados com antibiticos (Figura 10) [49].

Os resultados dos primeiros testes de difuso foram interpretados

arbitrariamente: a presena de uma zona de inibio sugeria susceptibilidade e nenhuma

zona, resistncia. Os resultados qualitativos foram considerados uma desvantagem, e

foram introduzidos vrios discos com elevado ou baixo teor de antibitico [49].

O teste de difuso em disco relativamente barato, fcil de usar e flexvel, um

mtodo baseado na difuso em agar e que fornece resultados qualitativos para o rpido

crescimento de bactrias aerbias. No entanto, o teste de difuso em disco baseado na

utilizao de um gradiente de concentrao de um antibitico relativamente instvel,

gerado a partir de uma fonte de difuso pontual central, ou seja, o disco. Muitas

variveis in vitro, tais como, a densidade do inculo, a fase de crescimento, e as

variaes na placa de agar (por exemplo, a profundidade) podem influenciar

directamente os tamanhos da zona de inibio e portanto, dar resultados pouco fiveis.

Sero obtidas zonas de inibio maiores com o crescimento lento dos organismos

fastidiosos em comparao com rpido crescimento de bactrias aerbias. Compostos

de alto peso molecular tais como a vancomicina e polimixinas no difundem bem em

agar e so, portanto, inadequados para testar por difuso em disco [49].

http://pt.wikipedia.org/wiki/Esp%C3%A9ciehttp://pt.wikipedia.org/wiki/Fungohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Candidahttp://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Saccharomycetales&action=edit&redlink=1http://pt.wikipedia.org/wiki/Candid%C3%ADase

68

Figura 10: Resultado de um teste de difuso em disco para uma estirpe muito susceptvel de

Staphylococcus [49].

5.3.2. Mtodos de determinao da Concentrao Mnima Inibitria

A Concentrao Mnima Inibitria (MIC) definida como a menor concentrao

dos compostos em estudo que inibe o crescimento visvel dos microrganismos testados

[49,50].

A Concentrao Mnima Letal (MLC), que no caso das bactrias se designa por

Concentrao Mnima Bactericida (MBC) a menor concentrao de um composto que

mata a maioria (99,9 %) do inculo [49].

Como a MIC se refere capacidade de inibio, possvel que, caso o

antibitico seja removido, o microrganismo comece a crescer novamente. Para

determinar a capacidade do antibitico para matar o microrganismo, pode ser realizado

um ensaio de crescimento. O valor de MIC pode ajudar um mdico a decidir a

concentrao de antibitico necessria para inibir o agente patognico. A determinao

do valor de MIC pode ser realizada em agar ou em meio lquido [49].

5.3.2.1. Microdiluio

O mtodo tradicional de determinao da MIC utilizando a tcnica de diluio

em meio lquido, onde vrias diluies do antibitico so incorporadas no meio lquido,

utilizando para isso os poos de microplacas ou tubos de ensaio. Cada tubo ou poo da

microplaca contm uma concentrao diferente do agente anti-microbiano e inoculada

com um valor fixo do organismo a ser testado. Aps incubao adequada, a menor

69

concentrao que no revele crescimento visvel considerada como o valor de MIC.

Um guia completo para este protocolo encontra-se na norma M7 - A7 do Clinical

Laboratory Standards Institute (CLSI). Este um teste quantitativo cujo resultado

expresso em microgramas por mililitro (g/mL) ou miligramas por mililitro (mg/mL)

[49].

Em testes de susceptibilidade anti-microbiana, o laboratrio deve manter um

elevado nvel de preciso e reprodutibilidade nos procedimentos de ensaio. Devido s

diferentes condies, tais como, inculo, composio do meio de cultura, tempo de

incubao, temperatura, pH, etc., um teste de diluio pode no proporcionar sempre o

mesmo resultado [49].

5.3.2.2. Diluio em agar

O teste de diluio em agar utilizado para a determinao do valor de MIC de

um agente anti-microbiano necessria para inibir o crescimento de um microrganismo.

Tal como acontece com tcnica de diluio em meio lquido, o mtodo de diluio em

agar fornece um resultado quantitativo, sob a forma do valor de MIC, em contraste com

os testes de susceptibilidade baseados na difuso em disco que resultam numa medida

indirecta de susceptibilidade e proporcionam um resultado qualitativo interpretativo. O

mtodo de diluio em agar o mtodo que se encontra melhor estabelecido para

determinar a susceptibilidade anti-microbiana e comummente utilizado como padro

ou mtodo de referncia para a avaliao de novos agentes anti-microbianos [49].

70

II. Material e Mtodos

71

Figura 12: Balana com infra-

vermelhos para determinao do

teor de matria seca.

MATERIAL E MTODOS

1. Moagem

As partes areas (que incluem os ramos, caules, folhas e flores) dos trs arbustos em

estudo (urze, carqueja e giesta) foram modas em moinho de lminas (RETSCH )

(Figura 11) com crivo de 2 mm, de modo a obter um p grosseiro. De referir, que nesta

fase, pode acontecer a destruio de substncias volteis e termolbeis, com o calor que

libertado neste processo.

Figuras 11: Moinho utilizado na moagem.

2. Determinao do teor de matria seca

Aps arrefecimento/estabilizao e homogeneizao do p

grosseiro obtido, determinou-se o teor de matria seca (TMS) de

cada um dos arbustos. Para tal, colocou-se uma pequena

quantidade de amostra dos arbustos reduzidos a p numa balana

com infravermelhos (Figura 12) que monitoriza a perda de peso

pelo material e indica o TMS.

72

Tabela 1: Valores do teor de matria seca (TMS) e das massas secas dos arbustos.

Extraco Espcie

Massa de

arbusto para

extraco (g)

TMS (%)

Massa seca de

arbusto para

extraco (g) *

Etanlica

Urze 110,197 92,79 102,252

Carqueja 107,506 91,68 98,562

Giesta 112,900 94,10 106,239

Aquosa

Urze 110,511 92,79 102,543

Carqueja 115,146 91,68 105,566

Giesta 111,160 94,10 104,602

3. Extraco

Fizeram-se duas extraces slido-lquido, utilizando dois solventes diferentes, a

gua (para comprovar a eficcia da utilizao das plantas na medicina tradicional) e o

etanol. Para as extraces utilizou-se uma proporo de 1:10, isto , 100 gramas de

arbusto para 1000 mL de sol