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Análise da Indução de Lipoxigenase de Maracujá (Passiflora edulis SIMS) após o uso de Metil Jasmonato, Ferimento Mecânico e Herbivoria BRUNO DE CASTRO JARDIM UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO - UENF CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ NOVEMBRO - 2009

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  • Anlise da Induo de Lipoxigenase de Maracuj (Passiflora

    edulis SIMS) aps o uso de Metil Jasmonato,

    Ferimento Mecnico e Herbivoria

    BRUNO DE CASTRO JARDIM

    UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO - UENF

    CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ

    NOVEMBRO - 2009

  • Anlise da induo de Lipoxigenase de maracuj (Passiflora edulis

    SIMS) aps o uso de Metil Jasmonato, Ferimento Mecnico e Herbivoria

    BRUNO DE CASTRO JARDIM

    Orientadora: Prof. Dr. Tnia Jacinto Freitas da Silva

    UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO - UENF

    CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ

    NOVEMBRO - 2009

    Tese apresentada ao Centro de Biocincias e

    Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte

    Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das

    exigncias para a obteno do ttulo de Doutor

    em Biocincias e Biotecnologia.

  • Anlise da induo de Lipoxigenase de maracuj (Passiflora edulis

    SIMS) aps o uso de Metil Jasmonato, Ferimento Mecnico e Herbivoria

    BRUNO DE CASTRO JARDIM

    Aprovada em 30 de novembro de 2009.

    Comisso examinadora:

    Prof.Dr. Jos Roberto da Silva UFRJ

    Prof. Dr.Beatriz Ferreira UENF

    Prof. Dr. Francisco Jos Alves Lemos - UENF

    Prof. Dr. Tnia Jacinto Freitas da Silva UENF Orientadora

    Tese apresentada ao Centro de Biocincias e

    Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte

    Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das

    exigncias para a obteno do ttulo de Doutor

    em Biocincias e Biotecnologia.

    http://www.uenf.br/Uenf/Pages/CBB/LBT/?modelo=1&cod_pag=650&id=1149&np=&tpl=1&grupo=LBT

  • Dedico este trabalho quela que mais

    contribuiu para concluso desta tese: minha

    filha Alice.

  • AGRADECIMENTOS

    A Deus, por ter me conduzido at aqui.

    Aos meus pais, Luiz Carlos e Ana Francisca, e irmos, Vitor e Patrcia, pelo

    apoio incondicional.

    A Tnia Jacinto por ter acreditado no meu trabalho mesmo nos momentos mais

    difceis.

    A Vivian Vasques pelo companheirismo e dedicao.

    A Dr Beatriz Ferreira, pela reviso deste trabalho.

    Aos professores Francisco Jos, Jos Roberto e Marlia por aceitarem o

    convite de participao da banca examinadora.

    Ao meu grande amigo Sylvio por esses anos de contribuio na bancada e nas

    confraternizaes peridicas.

    Aos meus amigos Csar, Sylvio, Viviane, Cristiane, Stafani, Keite, Dalvania,

    Amod Frutuoso por toda a ajuda nestes cinco anos.

    Ao pessoal do Instituto de Biofsica da UFRJ. Professores Turn. Ao Dr. Deivid

    Carvalho pela ajuda nos experimentos de northern blot.

    A Professora Ana Carolina, pela seqncia de DNA do fragmento da

    lipoxigenase.

    Aos meus amigos do LBT.

    A todos aqueles que direta e indiretamente contriburam para a concluso

    desse trabalho.

  • Lista de Figuras e Tabelas

    Figura 1: Lagartas e Adulto de Agraulis vanillae vanillae ..................................... 6

    Figura 2: Lagarta e adulto de Dione juno juno ...................................................... 6

    Figura 3: A rota do octadecanide ..................................................................... .11

    Figura 4: A rota do Octadecanide e suas principais oxilipinas .......................... 15

    Figura 5: Sntese de cido jasmnico ................................................................. 16

    Figura 6: Esquema do plasmdeo ....................................................................... 27

    Figura 7: Avaliao da integridade do RNA total extrado do tecido foliar de

    plantas de maracuj ........................................................................................... 40

    Figura 8: Anlise do perfil de amplificao da LOX de maracuj ...................... 41

    Figura 9: Padro de digesto enzimtica ........................................................... 42

    Figura 10: Seqncia de nucleotdeos. ......................................................... .... 44

    Figura 11 : Comparao das seqncias de aminocidos deduzida .................. 45

    Figura 12: Anlise do acmulo dos transcritos de LOX ...................................... 47

    Figura 13: Perfil de expresso do gene em resposta a herbivoria ...................... 48

    Figura 14: Atividade de LOX em resposta a herbivoria ...................................... 51

    Figura 15: Anlise eletrofortica por SDS-PAGE ............................................... 52

    Figura 16: Anlise do soro imune e pr-imune ................................................... 53

    Figura 17: Espectro de massas .......................................................................... 54

    Figura 18: Anlise do cido jasmnico endgeno .............................................. 55

    Tabela 1: Dados referentes produo brasileira de suco de maracuj .............. 4

    Tabela 2: Reagentes para clonagem do inserto ................................................. 26

  • RESUMO

    O maracuj uma importante cultura do Norte/Noroeste Fluminense.

    Mesmo com a expanso das reas de plantio e produo, a cultura tem srios

    problemas fitotcnicos e fitossanitrios. Dentre estes, destacam-se os insetos

    como os principais causadores de perdas em produes agrcolas por alterem

    a capacidade fotossinttica das plantas. Duas espcies so comumente

    encontradas: Agraulis vanillae vanillae e Dionae juno juno.

    Entretanto as plantas respondem aos ataques de insetos herbvoros

    exibindo uma variedade de estratgias morfolgicas e fisiolgicas. As defesas

    diretas induzidas esto envolvidas na resposta sob o ataque de predadores.

    Assim os estmulos provocados pela leso na planta levam a produo de

    molculas sinalizadoras que ativam uma cascata de eventos culminando na

    ativao de genes de defesa e em seguida a sntese de protenas defesa.

    Utilizando o tomate como planta modelo, uma via da transduo de sinalizao

    da resposta de defesa vegetal foi proposta por Farmer e Ryan (1992).

    Para o estudo do mecanismo de defesa em plantas de maracuj foi

    realizada, inicialmente, a sntese de um fragmento de cDNA de

    aproximadamente 700 pb, cuja seqncia deduzida de aminocidos foi

    homloga a diversas LOX vegetais. O fragmento foi utilizado como sonda

    marcada em experimentos de Northern blot evidenciando o acmulo de RNAm

    de LOX em folhas de maracuj na resposta ao tratamento com metil

    jasmonato, ferimento mecnico e na resposta a herbvoros generalistas e

    especialistas (Spodoptera.frugiperda e Agraulis vanillae vanillae).

    Analisamos a atividade de LOX seguindo modelo de herbivoria causado

    pelas larvas dos insetos generalistas e especialistas aps 24 e 48 horas.

    Observamos que a atividade de LOX aumenta consideravelmente quando

    submetidas as herbivorias, mesmo em folhas sistmicas (folhas intactas de

    plantas submetidas herbivoria) quando comparadas com o grupo controle. Os

    dados demonstram uma atividade anloga de LOX em resposta a ambos os

    insetos.

    Alm disso, tambm avaliamos a quantificao do cido jasmnico

    produzido em plantas feridas, relacionando a quantidade de cido jasmnico

    endgeno com o acmulo de RNAm LOX em folhas de maracuj. Aliados aos

  • outros experimentos descritos, conclumos que a LOX de maracuj participa do

    processo de defesa vegetal culminando na sntese de cido jasmnico atravs

    da via Octadecanide.

  • ABSTRACT

    The passion fruit is an important crop in North and Northwest Fluminense. Even with the

    expansion of planted areas and production, the culture has serious problems phytotechnical and

    plant. Chief among these are the insects as the main cause of losses in agricultural production

    by changing the photosynthetic capacity of plants. Two species are commonly found: Agraulis

    vanillae vanillae Dionaea and juno.

    However plants respond to attack by herbivorous insects exhibiting a variety of

    morphological and physiological strategies. Induced direct defenses are involved in the

    response under attack from predators. Thus the stimuli caused by damage to the plant led to

    production of signaling molecules that activate a cascade of events culminating in the activation

    of defense genes and then protein synthesis defense. Using tomato as a model, a way of

    signaling transduction of plant defense response was proposed by Farmer and Ryan (1992).

    To study the defense mechanism in passion fruit plants fristly we performed the

    synthesis of a cDNA fragment of approximately 700 bp, whose deduced amino acid sequence

    was homologous to several plant LOX. The fragment was used as labeled probe in Northern blot

    experiments showing the accumulation of LOX mRNA in leaves of passion in response to

    treatment with methyl jasmonate, mechanical wounding and in response to generalist and

    specialist herbivores (Spodoptera.frugiperda and Agraulis vanillae vanillae) .

    We analyzed the activity of LOX following model of herbivory caused by larvae of the

    generalist and specialist insects after 24 and 48 hours. We observed that LOX activity increases

    considerably when subjected to herbivory, even in systemic leaves (leaves intact plants

    subjected to herbivory) when compared with the control group. The data show a similar activity

    of LOX in response to both insects.

    In addition, we also evaluated the quantification of jasmonic acid produced in the

    wounded, relating the amount of endogenous jasmonic acid with