hugo ludovico martins análise da detecção de c4d, linfócitos
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HUGO LUDOVICO MARTINS
Análise da detecção de C4d,
linfócitos B e plasmócitos
no processo de rejeição ao aloenxerto renal
Tese apresentada à Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo para obtenção do título
de Doutor em Ciências
Área de concentração: Nefrologia
Orientadora: Profa. Dra. Irene de Lourdes Noronha
São Paulo 2010
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Preparada pela Biblioteca da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
reprodução autorizada pelo autor
Ludovico-Martins, Hugo
Análise da detecção de C4d, linfócitos B e plasmócitos no processo de rejeição ao
aloenxerto renal / Hugo Ludovico-Martins. -- São Paulo, 2010.
Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
Departamento de Clínica Médica.
Área de concentração: Nefrologia.
Orientadora: Irene de Lourdes Noronha.
Descritores: 1.Transplante de rim 2.Rejeição de enxerto 3.Linfócitos B
4.Plasmócitos 5.Via clássica do complemento 6.Imunoistoquímica
7.Imunofluorescência
USP/FM/SBD-062/10
"A ciência humana de maneira nenhuma nega a existência de Deus. Quando
considero quantas e quão maravilhosas coisas o homem compreende,
pesquisa e consegue realizar, então reconheço claramente que o espírito
humano é obra de Deus, e a mais notável."
Galileo Galilei
A Deus, nosso Senhor, por colocar no meu caminho pessoas
fundamentais para o meu desenvolvimento profissional e pessoal,
por ter me dado força para superar os obstáculos e a graça de
concluir esta difícil tarefa, me abençoando com mais uma
conquista importante na minha vida.
“Se um dia, já feito homem realizado, sentires que a terra cede a teus pés,
que tuas obras desmoronam, que não há ninguém a tua volta para te
estender a mão, esquece a tua maturidade, passa pela tua mocidade, volta a
tua infância e balbucia entre lágrimas e esperanças, as últimas palavras que
sempre te restarão na alma: minha mãe, meu pai!"
Rui Barbosa
Aos meus queridos e amados pais, Dr. Sebastião Ludovico Martins e Wanda Brill
Ludovico, os quais me conceberam; com muita sabedoria me transmitiram os preceitos
fundamentais da ética, da justiça, da moral e, principalmente, da humildade e
religiosidade; apoiaram-me nos momentos mais difíceis (no momento em que imaginei
não haver mais trilha a seguir, quando me deparei com a desilusão de viver por ver meus
sonhos impossibilitados, iluminaram com maestria a trilha a qual havia perdido,
mostraram-me que a vida consistia na fantástica arte de driblar os obstáculos por mais
impossíveis que pareciam ser e que, principalmente, havia toda uma vida a me esperar,
com todos os sonhos que eu sonhara a serem conquistados); que por muitas vezes
abriram mão de seus sonhos para que eu pudesse conquistar os meus... Dizer um “muito
obrigado” a vocês que depositaram todas as suas confianças na minha luta e
acreditaram no meu potencial é muito pouco... Logo, gostaria de dedicar cada letra desta
tese a vocês que, apesar da distância geográfica, sempre se fizeram presente em minha
vida... Portanto, meus amados pais, esta vitória é de vocês! Muito obrigado pela vida e
por tornar possível a realização de mais um sonho! Amo vocês!
"O amor é a poesia dos sentidos. Ou é sublime, ou não existe. Quando
existe, existe para sempre e vai crescendo dia a dia."
Honoré de Balzac
À minha querida e amada esposa Aline Cavalcante Ludovico,
companheira que Deus colocou no meu caminho, pela sua paciência,
compreensão e, principalmente, pelo seu amor incondicional que
impulsiona o meu viver. Contigo aprendi que amar não é subtrair e,
tampouco, dividir... Mas sim, somar e multiplicar... A sua sogra costuma
dizer: “atrás de todo grande homem, existe uma grande mulher cansada”...
Não sei se sou um grande homem, mas com certeza você é uma grande
mulher, provavelmente cansada pela minha ausência, pela minha falta de
tempo e pelo meu stress... A sua força, o seu amor e a sua dedicação
foram instrumentos poderosos que me auxiliaram nesta jornada... Portanto,
você também é responsável por esta conquista e, por isto, não apenas
dedico esta tese, como também a minha vida, à minha amada e eterna
princesa! Te amo! Obrigado por tudo!
“É tão estranho, os bons morrem jovens. Assim parece ser, quando me
lembro de você que acabou indo embora cedo demais... Eu continuo aqui,
meu trabalho e meus amigos e me lembro de você em dias assim... Dia de
chuva, dia de sol e o que sinto não sei dizer... Vai com os anjos! Vai em
paz... E cedo demais, eu aprendi a ter tudo o que sempre quis, só não
aprendi a perder... Não é sempre, mas eu sei que você está bem agora... Só
que neste mundo, o verão acabou, cedo demais...”
Renato Russo
À minha eterna “tiaô”, Aparecida Maria Luis da Mata (“in memoriam”), que
dedicou a sua breve vida a educar e cuidar de mim e meus irmãos como se
fôssemos seus legítimos filhos. Embora tenha nos deixado há alguns anos,
muito do que hoje sou é fruto da dedicação e dos conselhos desta
guerreira. Sempre humilde em suas atitudes, mas generosa em seus
sentimentos... Sofreu as minhas derrotas, torceu e comemorou as minhas
vitórias e, fundamentalmente, me amou acima de qualquer coisa, como
uma mãe ama seu filho... “Tiaô”, cada vitória minha tem um “dedinho” seu
e, por isto, onde quer que eu vá e onde quer que você esteja sempre estará
em meu coração e nas minhas melhores recordações... Serei eternamente
grato por Deus ter colocado, mesmo que de forma breve, você em meu
caminho... Que Deus sempre esteja contigo! Obrigado! A vitória também é
sua!
AGRADECIMENTOS
“O valor das coisas não está no tempo que elas duram, mas na intensidade
com que acontecem. Por isso, existem momentos inesquecíveis, coisas
inexplicáveis e pessoas incomparáveis.”
Fernando Sabino
Inicialmente, gostaria de agradecer à minha orientadora Profa. Dra.
Irene de Lourdes Noronha, exemplo de mulher, professora e médica, pelos
seus ensinamentos que transcendeu em muito o campo da ciência. Ainda
recém-formado e imaturo na medicina, tive a oportunidade de conhecê-la
como minha professora na especialização em Nefrologia e, nesta época,
além dos conhecimentos desta área, recebi toda a base que posteriormente
viria a aplicar na minha prática médica. Após, como “colega” (que
atrevimento meu, hein!) de equipe, aprendi com o seu amor e a sua
dedicação intensa e quase que exclusiva aos pacientes que, o objetivo final
de qualquer ato médico é o bem estar do paciente e que, qualquer boa
prática médica inicia-se pelo respeito irrestrito ao paciente. Por fim, tive a
oportunidade única de conhecê-la como pesquisadora, sempre empenhada
e perseverante na busca por respostas, me ensinou tudo que sei dentro de
um laboratório. Ao longo desta trajetória, também tive a felicidade ímpar de
conhecer a amiga que existe por detrás desta profissional versátil e, com as
inúmeras e sinceras conversas que mantivemos ao decorrer desta trajetória,
recebi apoios e conselhos imprescindíveis para o meu sucesso profissional e
pessoal. Portanto, Dra. Irene, devo à senhora o meu desenvolvimento como
médico, pesquisador e, sobretudo, como homem. Respeito, ética, disciplina
e dedicação são alguns dos legados que herdei da senhora e haverei de
levá-los comigo por onde quer que eu vá... O futuro a Deus pertence, mas
espero sempre poder continuar a conviver e a aprender com esta pessoa
maravilhosa que é a senhora! O meu muito obrigado, do fundo do meu
coração, por tudo o que a senhora representou, representa e, se Deus
quiser, representará na minha vida!
À Dra. Walcy Rosolia Teodoro, mais que uma professora, uma doce
e grande amiga... Sempre atenciosa, me ensinou tudo o que sei de
imunofluorescência e abriu as portas do seu laboratório para que eu
pudesse realizar os experimentos de imunofluorescência. A senhora é parte
importante nesta minha trajetória... Portanto, Dra. Walcy, o meu mais sincero
obrigado!
Ao Prof. Dr. Roberto Zatz, uma pessoa amiga e acessível, pela
dedicação a qual coordena o curso de Nefrologia, tornando este curso um
destaque na USP. Também gostaria de agradecê-lo pela oportunidade de
fazer parte desta “família” Nefrologia da USP que, com certeza, é motivo de
muito orgulho para mim.
Ao Dr. Rui Toledo Barros, pelo o amor e a dedicação o qual o
senhor coordena o curso de Pós-Graduação da Nefrologia, sempre nos
incentivando como pesquisadores. Também gostaria de agradecê-lo pela
oportunidade de poder fazer parte deste privilegiado grupo de pós-
graduando da Nefrologia.
Ao Prof. Dr. Hugo Abensur, além de um exímio profissional, um
grande amigo, fez parte da minha formação profissional e sugeriu a inclusão
do estudo dos plasmócitos na minha pesquisa durante a qualificação,
sugestão esta que veio a enriquecer a minha tese. O meu muito obrigado
pela dedicação com a qual o senhor conduziu o meu estágio em Nefrologia
(com as aulas todas as sextas-feiras e com as visitas em grupo aos leitos
dos pacientes) e, principalmente, pelos conselhos que o senhor me deu ao
longo dos nossos encontros. Por onde eu for, levarei comigo a imagem e os
conselhos deste profissional ético e dedicado.
Ao Prof. Dr. Dino Martini Filho, um grande patologista e uma pessoa
admirável. Simples, acessível e muito inteligente, me ensinou o que sei de
histopatologia renal. Participou das minhas duas qualificações, sempre com
observações pertinentes que vieram a somar em minha tese. Os meus
sinceros agradecimentos por sempre me receber de portas abertas em seus
laboratórios (nos Hospitais Beneficência Portuguesa e Santa Casa),
disponibilizando os casos incluídos neste trabalho e, principalmente, sempre
se prontificando a me ensinar e sanar as minhas dúvidas quando solicitado.
À Dra. Vanda Jorgetti, sempre carismática e receptiva. O meu muito
obrigado pelas oportunidades em que tive de sentar ao lado da senhora e
ouvir os seus conselhos e dicas.
Ao Prof. Dr. Luiz Fernando Onuchic, exímio pesquisador que tive a
oportunidade de conhecer e conviver nos últimos anos da pós-graduação.
À Dra. Denise Maria Avancini Costa Malheiros, pelas
oportunidades que tive de sentar ao lado dessa pessoa maravilhosa e
discutir alguns casos, além das lâminas do meu trabalho que, às vezes,
pegava para analisar. Muito acessível e simpática. Obrigado!
Ao Wagner Vasques Dominguez, para os íntimos “Wagnãããooo!”.
Agradeço a Deus pela oportunidade de ter conhecido esta pessoa de
coração tão generoso! Amigo de todas as horas me ensinou tudo o que sei
de estatística e foi um grande companheiro nos inúmeros happy hours! O
que posso afirmar deste amigo tão querido é que, pela sua dedicação aos
amigos e pela sua sinceridade, faz parte de um seleto grupo de amizade
“estatisticamente significativo”...
À Cleonice Silva, uma profissional maravilhosa, uma mãe
dedicada e uma amiga admirável! Com muita paciência e sapiência, foi
driblando a minha ansiedade e o meu stress quase que cotidiano,
ensinando-me que a calma é uma das grandes virtudes dos vencedores. Por
quantas vezes você me disse: “calma! Respire fundo... Agora repita...”
Bastava isto para que, em uma fração de segundo, eu encontrasse as
respostas para as minhas dúvidas. Me ensinou muito sobre as técnicas de
laboratório, sobre cálculos e sobre as unidades de concentração (Molar,
milimolar e etc) que pareciam “monstros de sete cabeças” para mim.
Também teve uma participação importante na escrita da minha tese, pois
por inúmeras vezes leu e releu o que escrevia, sempre fazendo correções
pertinentes... Por tudo isto, posso dizer que tive a sorte de conhecer esta
amiga admirável! Ah! Já ia me esquecendo... Também gostaria de pedir
desculpas pelas inúmeras “desculpas” que pedi ao longo destes anos
(hehe)... O meu muito obrigado por tudo, Clééééooooo!!!! Ah! Desculpa por
pedir “desculpa”, hein!
À Rita de Cássia Cavaglieri, uma amiga ímpar! No meu primeiro dia
no laboratório, me recebeu com todo o seu carisma e bom humor e, desde
então, nasceu uma grande amizade... Fomos contemporâneos na pós-
graduação, passamos por obstáculos semelhantes, por decepções e
conquistas semelhantes e, tudo isto, serviu para enriquecer muito a nossa
amizade. Ritinha, por quantas vezes choramos e sorrimos juntos, hein?!
Sempre disposta a me escutar, encontrei em seus abraços, nos seus
conselhos e na sua religiosidade, as respostas para as minhas angústias...
Posso afirmar que, sem a sua amizade, com certeza este caminho seria
mais árduo! Hoje, estamos aqui sorridentes e orgulhosos, pois chegamos ao
final da nossa luta... Mas, espero que seja apenas o final desta etapa, pois
amizade assim é para, no mínimo, uma vida inteira! Por onde eu for, levarei
comigo os momentos deliciosos que compartilhamos na pós-graduação e,
para sempre, será a amiga que jamais esquecerei! Conte sempre comigo,
hein! Parabéns pelo sucesso e muito obrigado por esta maravilhosa
amizade!
À Andréia Fabiana do Vale Franco, uma amiga muito especial. Pude
experimentar na prática a lei da física que diz “os opostos se atraem”!
Hehe... Entre “tapas” e elogios, foi crescendo uma amizade muito sincera.
Companheira de todas as horas (aqui vale ressaltar que é a única amiga que
também gosta de música sertaneja, só aí já ganhou minha admiração!), me
conquistou com a sua dedicação, determinação e perseverança! Continue a
ser esta pessoa especial que, com certeza, Deus te reservará um futuro
brilhante e cheio de conquistas! Obrigado por tudo!
Ao Dr. Humberto Dellê, um grande amigo e companheiro! Obrigado
pelo apoio constante e pelas dicas que sempre vieram a engrandecer o meu
trabalho. A sua dedicação à pesquisa e aos amigos muito me admira! O seu
futuro será brilhante. Obrigado por tudo!
Ao Dimitri Bordon Espinhel Marinotto, um grande amigo e divertido
companheiro! A sua inteligência atrelada à sua humildade te faz uma pessoa
nobre, muito especial nesta minha trajetória! Muito obrigado por tudo!
Ao Dr. Antônio Carlos Cordeiro Silva Junior, um grande amigo e
companheiro de todas as horas! Surgiu na minha vida num momento muito
importante e, desde então, me acolheu como um irmão. Muito obrigado
pelos conselhos, pela atenção e pela companhia ímpar!
Ao Dr. Luis Eduardo Becker, um grande amigo, companheiro de
laboratório e de equipe, após breve período de convivência foi estudar em
Heidelberg (Alemanha) e por lá ficou. Entretanto, a nossa amizade
continuou... Um grande abraço e sucesso!
Às colegas e amigas Dra. Adriana Nazaré Castro da Silva e Dra.
Carina Nilsen Moreno, pela amizade sincera de longa data. Vocês sempre
estiveram presentes em minha trajetória.
Aos novos amigos Dr. Rodrigo José Ramalho e Dra. Pércia
Rosistelly Bezerra de Medeiros. Rodrigo, amigo sincero e divertido,
responsável por boas gargalhadas que me ajudaram a descontrair nesta
etapa final, e Pércia, amiga carismática e extrovertida. Desejo a vocês
sucesso, pois vocês merecem!
Aos alunos de iniciação científica Alexandre Chagas de Santana,
Rosana Domingues, Filipe Miranda de Oliveira Silva e William Pereira
Felix. Alunos dedicados a aprender tudo sobre pesquisa e sempre dispostos
a nos ajudar. Continuem sempre assim, pois vocês representam o futuro da
pesquisa. Obrigado por tudo!
Às inúmeras amigas que tive a oportunidade de conquistar no
laboratório da Dra. Irene, tais como: Arianni di Petta, Tatiana Tavares,
Camile Alba Pereira, Camila Fazzani, Laila dos Santos Silva Casado,
Tatiana Marques Ferreira da Rocha, Carla Cristina Gomes Pinheiro,
Virgínia Zalotti e Ivone Braga de Oliveira. Tive uma breve convivência
com vocês, mas de uma forma ou de outra, cada uma de vocês me marcou
positivamente. Muito obrigado pelas amizades as quais guardarei com todo
o carinho em meu coração.
À Rozidete Aparecida Bezerra Coelho, pelo carinho que tem por
mim, sempre dispondo-se do seu tempo para vir cortar as biópsias. Você me
ajudou muito! Obrigado!
Aos demais amigos que tive a oportunidade de conhecer ao decorrer
da pós-graduação: Ana Paula, Ane, Andressa, Fernanda, Eliene, Zenaide,
John, Michelle e Bruno (LIM 29); Luciene, Fabiana, Dra. Rosa, Rita e Dr.
Rodrigo (Laboratório da Dra. Vanda Jorgetti); Luzia e Karen (Laboratório do
Dr. Joel Heimann); Luciana (laboratório do Dr. Roberto Zatz); Dra. Verônica
e Dra. Flávia (laboratório do Dr. Luis Yu). Um muito obrigado, a cada um de
vocês, pela maravilhosa convivência.
Às meninas da secretaria, Neide e Denise, além da Janice. Muito
obrigado pela prontidão em me ajudar sempre que necessitei.
Aos meus amados avós: Dr. Hugo Brill (“in memoriam”) e Maria
Cândida de Lima (“in memoriam”) (avós maternos); Sebastião Ludovico
de Almeida (“in memoriam”) e Maria Luiza Martins Ludovico (avós
paternos). Representam o princípio de tudo! Não há presente e, tampouco
futuro, sem que antes tenha havido um passado... Portanto, conhecer o
nosso passado é o primeiro passo para o sucesso... Muito obrigado pela
família maravilhosa que vocês me deram!
Aos meus irmãos Dr. Bráulio Ludovico Martins e Dr. Bruno
Ludovico Martins. Agradeço pela amizade incondicional de cada um de
vocês, sempre presentes na minha vida nos momentos mais difíceis,
auxiliando-me e me orientando nas minhas decisões. Vocês, juntamente
com os meus pais, são o exemplo de como uma família unida prospera
mesmo perante as dificuldades. Muito obrigado, do fundo do meu coração,
pelo apoio e confiança depositados em mim ao longo da minha vida! Vocês
são pessoas fundamentais na minha vida!
À Eunice Alves de Carvalho, uma pessoa humilde em seus gestos,
porém extravagante no seu amor e dedicação por mim... Por quantas vezes
te peguei chorando perante as minhas quedas e festejando os meus
sucessos ao longo da minha vida! Conforto-me ao saber que, na minha
ausência, a minha mãe está em excelente companhia. Muito obrigado, do
fundo do meu coração, por tudo aquilo que você representa em minha vida!
Por fim, gostaria de agradecer a Deus pela oportunidade de conhecer
tantas pessoas e, com isto, construir amizades maravilhosas que haverei de
levar comigo por onde o destino me guiar... Também gostaria de agradecer
aos meus amados e queridos pais que compartilharam dos meus ideais e os
alimentaram, incentivando-me a prosseguir nesta jornada, fossem quais
fossem os obstáculos. Meu pai, um exemplo de profissional a ser seguido,
com certeza você é a minha fonte de inspiração inesgotável para cada passo
que dou. Minha mãe, um brilho de entusiasmo e religiosidade que ilumina a
minha estrada... Lembro como se fosse hoje que, desde pequeno, escutava
a senhora a me dizer: “Hugo, você é menininho da USP, acredite!”... Pois é,
minha amada mãe aqui estou e, como sempre, a senhora estava certa!
Vocês são os melhores pais do mundo e, com certeza, fazem parte desse
caminho que hoje sigo em paz... À minha esposa e sua família, que também
fazem parte da minha vida, pela paciência e por sempre acreditarem em
mim... A todos os meus familiares que, de uma forma ou de outra, fazem
parte da minha história e contribuíram para eu chegar aqui e, finalmente, aos
meus amigos (todos aqui listados e os que, porventura eu tenha esquecido
de listar... Neste caso, as minhas sinceras desculpas pela falha da minha
fraca memória) que são pérolas que conquistei ao longo da minha jornada e
que farei questão de cuidar bem delas como quem cuida de suas jóias, pois
os vejo justamente assim, verdadeiras jóias em minha vida!
SUMÁRIO
Lista de abreviaturas
Lista de figuras
Lista de tabelas
Resumo
Summary
I. INTRODUÇÃO ........................................................................ 1
I.1. Rejeição mediada por anticorpos – Definição diagnóstica ... 3
I.1.1) Rejeição mediada por anticorpos aguda (RMA aguda) ...... 4
I.1.2) Rejeição mediada por anticorpos crônica (RMA crônica) ... 6
I.2. Fragmento C4d ..................................................................... .8
I.2.1) Origem da fração C4d no sistema complemento ................ 8
I.2.2) C4d em transplante renal ................................................. 11
I.3. Linfócitos B - Plasmócitos ................................................... 14
I.3.1) Maturação, ativação e diferenciação dos linfócitos B ....... 14
I.3.2) Funções imunológicas dos linfócitos B .......................... ...17
I.4. Rejeição mediada por anticorpos e linfócitos B .................. 18
II. OBJETIVOS ......................................................................... 20
III. CASUÍSTICA E MÉTODOS ................................................ 21
III.1. Casuística .......................................................................... 21
III.1.1) Casuística geral .............................................................. 21
III.1.2) Casuística para análise do fragmento C4d ..................... 23
III.1.3) Casuística para análise dos linfócitos B ......................... 24
III.1.4) Casuística para análise dos plasmócitos ........................ 25
III.2. Biópsias de enxerto renal .................................................. 25
III.3. Processamento das biópsias ............................................ 27
III.3.1) Fixação e parafinização .................................................. 28
III.3.2) Tecido congelado ........................................................... 28
III.4. Preparo das lâminas para os experimentos ...................... 29
III.4.1) Desparafinização e recuperação antigênica ................... 29
III.4.2) Fragmentos congelados ................................................. 30
III.5. Detecção do fragmento C4d ............................................. 30
III.5.1) Técnica de imunofluorescência ...................................... 30
III.5.2) Técnica de imuno-histoquímica ...................................... 31
III.6. Detecção de linfócitos B (CD20+) ...................................... 32
III.7. Detecção de plasmócitos (CD138+) .................................. 34
III.8. Análise dos resultados ...................................................... 35
III.8.1) Fragmento C4d ............................................................... 35
III.8.2) Linfócitos B e plasmócitos .............................................. 36
III.9. Dados clínicos avaliados ................................................... 36
III.10. Análise estatística............................................................ 37
IV. RESULTADOS ................................................................... 38
IV.1. Detecção de C4d: análise das técnicas e do tipo de tecido................................................................ 38
IV.2. Análise da positividade de C4d peritubular de acordo com o diagnóstico histológico ........................................... 41
IV.3. Correlação entre a positividade para C4d e a evolução clínica do transplante ............................................................... 42
IV.4. Análise da expressão dos linfócitos B .............................. 44
IV.4.1) Infiltrado de linfócitos B .................................................. 44
IV.4.2) Expressão dos linfócitos B de acordo com o diagnóstico histológico ................................................... 45
IV.5. Correlação entre a expressão de linfócitos B e a evolução clínica do transplante ........................................ 49
IV.6. Análise do infiltrado plasmocitário de acordo com o diagnóstico histológico ............................................ 54
IV.7. Correlação entre a expressão de plasmócitos e a evolução clínica do transplante ........................................ 56
IV.8. Correlação entre plasmócitos e o infiltrado de células CD20+ ................................................................... 58
IV.9. Correlação entre a positividade de C4d peritubular e a expressão de linfócitos B (CD20+) e plasmócitos (CD138+) ....................................................... 60
IV.9.1) Correlação: C4d peritubular e infiltrado de linfócitos B (CD20+) ........................................................ 60
IV.9.2) Correlação: C4d peritubular e infiltrado de plasmócitos (CD138+) .................................................... 62
V. DISCUSSÃO ........................................................................ 64
VI. CONCLUSÕES ................................................................... 76
VII. ANEXOS ............................................................................ 77
VII.1. Anexo A: classificação de BANFF-2007 .......................... 77
VII.2. Anexo B: carta de aprovaçãodo estudo pelo comitê de ética em pesquisa do Hospital das Clínicas/FMUSP .. 78
VII.3.Anexo C: tabela com dados clínicos, scores da Marcação do C4d utilizando as 4 diferentes técnicas de marcação do fragmento C4d e follow-up dos 41 casos inclusos no estudo ............................................ 79
VIII. REFERÊNCIAS ................................................................ 81
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
% Porcentagem
°C Graus centígrados
µl Microlitro
µm Micrômetro
APC Antigen presenting cells (Células apresentadoras de antígenos)
ATG Globulina anti-timócito
Bx Biópsia
CAPPesq Comissão de Ética para Análise de Projeto de Pesquisa
CD Cluster determinant
cél/mm2 Células por milímetro quadrado
DAB Diaminobenzidina
DF Doador falecido
DRP Doença renal policística
DVNR Doador vivo não-relacionado
DVR Doador vivo relacionado
EP Erro padrão
FAPESP Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
FITC Isotiocianato de fluoresceína
g Grama
GNC Glomerulonefrite crônica
HCl Cloreto de hidrogênio
HLA Human leukocyte antigen (Antígeno leucocitário humano)
H2O2 Peróxido de hidrogênio
IF Imunofluorescência
IgIV Imunoglobulina intravenosa
IH Imuno-histoquímica
IL-2 Interleucina-2
IL-4 Interleucina-4
IL-5 Interleucina-5
IL-6 Interleucina-6
IL-10 Interleucina-10
IL-13 Interleucina-13
INF- Interferon-
LPS Lipopolissacarídeos
M Molar
MAC Membrane attack complex (Complexo de ataque à membrana)
MCP Membrane co-factor protein (Proteína co-fator de membrana)
mg Miligrama
mg/dL Miligrama por decilitro
ml Mililitro
mM Milimolar
mm2 Milímetro quadrado
NaCl Cloreto de sódio
NCE Nefropatia crônica do enxerto
Nefrotox iCN Nefrotoxicidade por inibidores da calcineurina
PBS Solução salina fosfato-tamponada
pH Potencial hidrogênico
RA Rejeição aguda
RCB Receptor de antígeno em célula B
RMA Rejeição mediada por anticorpos
TM Trademark (Marca registrada)
TBS Solução salina tris-tamponada
TNF- Tumor necrosis factor- alfa (Fator de necrose tumoral – alfa)
vs Versus
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Cascata do sistema complemento (via clássica) e a formação do fragmento C4d. ..................................................................................... 10
Figura 2. Linfopoiese da célula B (seqüência da diferenciação dos linfócitos B) ........................................................................................... 15
Figura 3. REJEIÇÃO AGUDA. Detecção do fragmento C4d em criostato ........... 39
Figura 4. REJEIÇÃO AGUDA. Detecção do fragmento C4d em parafina ............ 39
Figura 5. Nível da creatinina nos grupos C4d negativo e C4d positivo no momento da biópsia do enxerto renal ................................................... 42
Figura 6. Creatinina sérica nos grupos C4d negativo e C4d positivo. ................. 43
Figura 7. Sobrevida do enxerto renal nos grupos C4d negativo e C4d positivo. ........................................................................................ 44
Figura 8. REJEIÇÃO AGUDA. Infiltrado de linfócitos B ...................................... 45
Figura 9. Expressão de linfócitos B nas rejeições agudas Banff I e II ................. 47
Figura 10. Expressão de linfócitos B nos diferentes grupos de nefropatia crônica do enxerto. ............................................................. 48
Figura 11. Nível da creatinina de acordo com a presença e o padrão do infiltrado de linfócitos B no momento da biópsia ................................. 50
Figura 12. Creatinina sérica nos grupos CD20 negativo e CD20 positivo ............ 50
Figura 13. Creatinina sérica nos grupos CD20 negativo e padrão nodular .......... 51
Figura 14. Creatinina sérica nos grupos padrão de células isoladas e padrão nodular .................................................................................... 51
Figura 15. Sobrevida do enxerto renal nos grupos CD20 negativo e CD20 positivo ...................................................................................... 52
Figura 16. Sobrevida do enxerto renal nos grupos CD20 negativo e padrão nodular .................................................................................... 53
Figura 17. Sobrevida do enxerto renal nos grupos padrão isolado e padrão nodular .................................................................................... 53
Figura 18. REJEIÇÃO AGUDA. Plasmócitos presentes no infiltrado intersticial ............................................................................................ 54
Figura 19. Expressão de plasmócitos nas rejeições agudas Banff I e II .............. 55
Figura 20. Nível da creatinina de acordo com a presença do infiltrado de plasmócitos no momento da biópsia ................................................... 56
Figura 21. Creatinina sérica nos grupos CD138 negativo e CD138 positivo ........ 57
Figura 22. Sobrevida do enxerto renal nos grupos CD138 negativo e CD138 positivo .................................................................................... 58
Figura 23. Expressão de plasmócitos nos grupos CD20 negativo e CD20 positivo ...................................................................................... 59
Figura 24. Expressão de plasmócitos nos grupos CD20+ padrão de células isoladas e CD20+ padrão nodular ....................................................... 59
Figura 25. Porcentagem dos casos CD20 positivos nos grupos C4d negativo e C4d positivo ............................................................... 60
Figura 26. Número de células CD20+ nos grupos C4d negativo e C4d positivo ........................................................................................ 61
Figura 27. Porcentagem dos casos CD138 positivos nos grupos C4d negativo e C4d positivo ............................................................... 62
Figura 28. Número de células CD138+ nos grupos C4d negativo e C4d positivo ........................................................................................ 63
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Resumo dos principais estudos sobre a detecção do fragmento C4d em biópsias de enxerto renal .................................. 12
Tabela 2. Análise das biópsias incluídas no estudo, de acordo com o diagnóstico histológico ..................................................................... 22
Tabela 3. Análise das biópsias incluídas no estudo do fragmento C4d, de acordo com o diagnóstico histológico ......................................... 24
Tabela 4. Análise das biópsias incluídas no estudo dos linfócitos B, de acordo com o diagnóstico histológico ......................................... 25
Tabela 5. Concordância entre a técnica de imunofluorescência em criostato e as demais técnicas para a detecção do C4d .................. 40
Tabela 6. Correlação entre a técnica de imunofluorescência em criostato e as demais técnicas para a detecção do C4d ................................ 40
Tabela 7. Positividade para o fragmento C4d em biópsias de enxerto renal (imunofluorescência em criostato) .......................................... 41
Tabela 8. Expressão dos linfócitos B em biópsias de aloenxerto renal ........... 46
Tabela 9. Expressão dos plasmócitos em biópsias de aloenxerto renal e a relação entre plasmócitos e linfócitos B (CD20+) .......................... 55
Tabela 10. Análise da expressão do fragmento C4d em relação ao padrão de infiltrado de linfócitos B ............................................... 62
Tabela 11. Correlação entre linfócitos B (CD20+ e CD138+) e fragmento C4d (teste de Spearman) ....................................................................... 63
RESUMO
Ludovico-Martins, H. Análise da detecção de C4d, linfócitos B e
plasmócitos no processo de rejeição ao aloenxerto renal [tese]. São
Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2010.
A rejeição ao aloenxerto mediada por mecanismos celulares ou humorais
representa uma importante complicação no pós-transplante renal. Estudos
anteriores demonstraram que o depósito de C4d peritubular é um marcador
de rejeição mediada por anticorpos. A técnica padrão ouro para a pesquisa
de C4d é a imunofluorescência em criostato. No entanto, o manuseio do
material congelado implica em algumas limitações custo-operacionais,
particularmente em nosso meio. Nos casos de rejeição mediada por
anticorpos é de relevância patogenética a análise da participação de
linfócitos B e plasmócitos, pois são as células responsáveis pela produção
de anticorpos. Considerando que até o momento o envolvimento de linfócitos
B e plasmócitos no processo de rejeição foi pouco investigado, no presente
estudo também será analisada a expressão de CD20 e CD138 em biópsias
renais, para caracterização destes componentes celulares. Portanto, o
objetivo do presente estudo foi analisar a detecção do fragmento C4d por
meio de 4 diferentes técnicas, além de analisar o infiltrado de linfócitos B e
plasmócitos em biópsias de enxerto renal, correlacionando estes achados
com o C4d peritubular. Foram analisadas 107 biópsias de 82 pacientes
submetidos a transplante renal. A pesquisa do C4d foi realizada utilizando-se
as técnicas de imunofluorescência [IF] (em cortes de criostato e de parafina)
e imuno-histoquímica [IH] (em cortes de criostato e de parafina), enquanto
que as pesquisas dos linfócitos B e plasmócitos foram realizadas pela
técnica de IH em cortes de parafina utilizando-se os anticorpos anti-CD20 e
anti-CD138, específicos para linfócitos B e plasmócitos, respectivamente.
Com relação à detecção de C4d, as técnicas com maior índice de
concordância com a IF-criostato, considerada padrão-ouro, foram IH-
criostato (75,6% dos casos apresentaram resultados coincidentes, r=0,72;
p<0,0001) e IF-parafina (73%, r=0,59; p=0,0001), enquanto a taxa de
concordância na técnica de IH-parafina foi de apenas 51,4% (r=0,35;
p=0,03). Analisando a evolução clínica, a sobrevida do enxerto renal em 3
anos pós-biópsia foi menor no grupo C4d positivo comparado ao grupo C4d
negativo (67% vs 96%, respectivamente, p=0,01). A prevalência de linfócitos
B (CD20+) foi de 54% das biópsias de enxerto renal. A análise histológica do
infiltrado de linfócitos B revelou 2 padrões distintos de infiltrado: padrão de
células isoladas (74%) e padrão nodular (26%). O padrão nodular esteve
associado a uma menor sobrevida do enxerto renal em 3 anos pós-biópsia
(61% vs 89% no grupo CD20 negativo; p=0,03; e 61% vs 87% no grupo
padrão de células isoladas; p=0,03). A prevalência de plasmócitos (CD138+)
em biópsias de enxerto renal foi de 59%. O infiltrado plasmocitário não
esteve associado a uma pior evolução clínica do transplante. A análise da
correlação entre C4d peritubular, linfócitos B e plasmócitos demonstrou que
o número de células CD20+ e CD138+ foi significativamente maior nos casos
C4d positivos comparados aos casos C4d negativos (CD20+: 155±53 vs
26±7 cels/mm2, respectivamente; p=0,001; CD138+: 46±22 vs 4±1 cels/mm2,
respectivamente; p=0,002). O presente estudo concluiu que o depósito
peritubular de C4d e o infiltrado de linfócitos B, em especial o padrão
nodular, estão associados a uma evolução clínica desfavorável do
transplante renal. Outra conclusão importante é que há uma associação
positiva entre os infiltrados de linfócitos B e de plasmócitos com o C4d
peritubular, sugerindo um possível papel destas células responsáveis pela
produção de anticorpos na ativação do sistema complemento in situ.
Finalmente, as técnicas de IH-criostato e IF-parafina podem ser
consideradas técnicas alternativas à técnica de IF-criostato para a detecção
do C4d.
Descritores
1. Transplante de rim; 2. Rejeição de enxerto; 3. Linfócitos B; 4. Plasmócitos;
5. Via clássica do complemento; 6. Imuno-histoquímica; 7. Imunofluorescência.
SUMMARY
Ludovico-Martins, H. Analysis of C4d, B lymphocytes and plasma cells
detection in the renal allograft rejection [thesis]. São Paulo: Faculdade
de Medicina, Universidade de São Paulo; 2010.
Allograft rejection mediated by cellular or humoral mechanisms represents an
important complication after kidney transplantation. Capillary C4d deposition
was recognized as a specific and independent prognostic marker of antibody
mediated rejection. The gold standard technique for C4d detection is the
immunofluorescence in cryostat sections. However, this technique involves
some operating and costs limitations, particularly in Brazil. In antibody
mediated rejection, the analysis of B lymphocytes and plasma cells is of
pathogenetic relevance since these cells are responsible for antibody
production. Considering that the involvement of B lymphocytes and plasma
cells in the rejection process is not clear, in this study the CD20 and CD138
expression in kidney biopsies will be also analyzed. Therefore, the aim of the
present study was to analyze the C4d detection by 4 different techniques and
the infiltration of B lymphocytes and plasma cells in renal allograft biopsies,
correlating these findings with the capillary C4d deposition. One hundred and
seven biopsies of 82 renal transplant patients were analyzed. C4d was
evaluated by immunofluorescence (IF) and immunohistochemistry (IHC)
techniques in frozen and paraffin sections (obtained from the same patients),
whereas B-lymphocytes and plasma cells were evaluated by
immunohistochemistry in paraffin sections using specific antibodies anti-B
Lymphocytes (CD20) and anti-plasma cells (CD138). Regarding the C4d
detection, the techniques with higher concordance rate with frozen-IF,
considered the gold standard, were the frozen-IHC technique (85.4% of
cases showed coincident results, r=0.72; p<0.0001) and the paraffin-IF
technique (73%, r=0.59; p=0.0001), whereas the concordance rate in the
paraffin-IHC technique was only 51.4% (r=0.35; p=0.03). The clinical follow
up analysis demonstrate that C4d positive group was associated with a poor
graft survival at 3 years post-diagnosis (67% vs 96% in C4d negative group;
p=0.01). The histological analysis of mature B cells (CD20+) infiltrate showed
2 distinct patterns: scattered cells and clusters. The cluster pattern was
associated with poor graft survival at 3 years (61% vs 89% in the CD20
negative group; p=0.03; and 61% vs 87% in the CD20+ scattered pattern
group; p=0.03). The plasma cells infiltrate was not associated with a worse
clinical transplant outcome. The analysis of the capillary C4d and B
lymphocytes correlation demonstrate that the number of CD20+ and CD138+
cells was significantly higher in C4d positive cases (CD20+: 155±53 vs 26±7
cells/mm2, respectively; p=0.001; CD138+: 46±22 vs 4±1 cells/mm2,
respectively; p=0.002). This study concluded that C4d capillary and mature B
cells (clusters pattern) are associated with worse graft survival. Another
important conclusion is a positive association between B lymphocytes
(mature B cells and plasma cells) and capillary C4d, suggesting a possible
role of these cells, responsible for antibodies production, in the in situ
complement system activation. Finally, the frozen-IHC and paraffin-IF
techniques may be considered alternative to frozen-IF technique for C4d
detection.
Descriptors
1. Kidney transplantation; 2. Graft rejection; 3. B-lymphocytes; 4. Plasma
cells; 5. Complement pathway, classical; 6. Immunohistochemistry; 7.
Fluorescent antibody technique
Introdução
1
I. INTRODUÇÃO
O transplante renal é considerado a melhor opção terapêutica para
pacientes com doença renal crônica, possibilitando recuperar a homeostase
volêmica e metabólica, refletindo em melhor qualidade de vida (KAPLAN et
al., 2004; SAYEGH et al., 2004).
Apesar dos avanços técnico/cirúrgico do transplante e do advento de
novas e potentes drogas imunossupressoras a perda do enxerto por rejeição
ainda representa uma importante barreira a ser vencida para se alcançar o
sucesso total desta modalidade terapêutica. A ocorrência de algumas formas
graves de rejeição, a despeito dos potentes agentes imunossupressores
disponíveis, despertaram interesse no estudo de novos mediadores
imunológicos envolvidos na rejeição ao aloenxerto renal.
Em 1990, observando a evolução desfavorável de alguns casos de
rejeição aguda, Halloran e colaboradores constataram a existência de um
tipo grave de rejeição aguda, que evoluia com rápida deterioração da função
do enxerto renal e era acompanhada do desenvolvimento de anticorpos
contra antígenos HLA classe I do doador (HALLORAN et al., 1990). Em 1991
Feucht e colaboradores estudaram de forma pioneira a expressão da fração
C4d em biópsias de enxerto renal (FEUCHT et al., 1991). Estes autores, em
1993, demonstraram que a presença do fragmento C4d em capilares
peritubulares refletia um fenômeno de aloreatividade humoral com forma
grave de rejeição (FEUCHT et al.,1993). Desde então, diversos estudos
foram realizados para caracterizar esta nova modalidade de rejeição
humoral.
Introdução
2
Em 1995, Lobo e colaboradores demonstraram haver uma menor
sobrevida do enxerto renal em casos de rejeição aguda mediada por
anticorpos anti-doador desenvolvidos no pós-transplante (LOBO et al.,
1995). Porém, foi o grupo de Feucht que, buscando correlacionar esta forma
grave de rejeição com pior prognóstico do enxerto e o depósito de C4d em
capilares peritubulares, concluiu que a presença do fragmento C4d em
capilares peritubulares é o preditor mais importante para a perda do enxerto
renal (LEDERER et al., 2001).
Um passo importante nos estudos do depósito do fragmento C4d em
biópsias renais foi a publicação, em 2002, de dois trabalhos que
compararam a presença do C4d em capilares peritubulares e a presença de
anticorpo anti-doador no soro do receptor (colhido no momento da biópsia)
(BÖHMIG et al., 2002; MAUIYYEDI et al., 2002b). Estes estudos foram
fundamentais para confirmar a especificidade do fragmento C4d em
capilares peritubulares como marcador de rejeição mediada por anticorpos
(RMA). Com isto, foi possível definir esta forma grave de rejeição,
inicialmente denominada de rejeição humoral aguda e que posteriormente
convencionou-se denominá-la de rejeição mediada por anticorpos aguda
(RMA aguda), caracterizada por depósito de C4d em capilares peritubulares,
presença de anticorpos circulantes específicos anti-doador e prova cruzada
positiva pós-transplante.
Os conhecimentos gerados a partir destes estudos foram de grande
importância e tiveram como impacto a alteração da classificação de BANFF,
proposta na reunião de junho/2003 (RACUSEN et al., 2003).
Introdução
3
Os critérios de BANFF-97 tradicionalmente classificavam as biópsias
renais como: I) Normal; II) Rejeição humoral (hiperaguda/aguda acelerada);
III) Alterações borderline; IV) Rejeição aguda (celular e vascular); V)
Nefropatia crônica do enxerto; VI) Outros (RACUSEN, et al., 1999). Com o
advento da detecção do fragmento C4d em capilar peritubular como
marcador de rejeição mediada por anticorpos, foi criada uma nova
classificação: I) Normal; II) Rejeição mediada por anticorpos (aguda e
crônica); III) Alterações Borderline; IV) Rejeição mediada por linfócitos T
(aguda e crônica); V) Fibrose intersticial e atrofia tubular (sem etiologia
específica); VI) Outros (SOLEZ et al., 2008) (Anexo A).
I.1. Rejeição mediada por anticorpos – Definição diagnóstica
Embora a rejeição mediada por linfócitos T seja a forma mais comum
de rejeição, RMA acomete uma fração substancial de pacientes com enxerto
renal, 21 a 51% (FEUCHT, 2003; MENGEL et al. 2005), e constitui uma das
principais causas de perda aguda do enxerto (TRUONG et al,
2007;VATHSALA, 2005).
A detecção do fragmento C4d em biópsia de enxerto renal é
considerada um marcador específico da RMA, apresentando uma
especificidade de 96% e uma sensibilidade de 95% (MAUIYYEDI et al.,
2002b). Com a utilização deste marcador, foi possível demonstrar que a
RMA não é exclusiva do período pós-transplante imediato (rejeição
hiperaguda), mas ocorre também, nos primeiros meses pós-transplante
(RMA aguda) e no seguimento tardio dos pacientes (RMA crônica).
Introdução
4
I.1.1) Rejeição mediada por anticorpos aguda (RMA aguda)
Ao contrário da rejeição hiperaguda, que ocorre devido à existência
de anticorpos pré-formados (resultado de um estado imunológico de
sensibilização prévia), a rejeição RMA aguda pode ocorrer em pacientes não
sensibilizados previamente, pois é mediada tanto por anticorpos pré-
formados (mais frequente) quanto por anticorpos anti-doador “de novo”
(BÖHMIG et al., 2002; FEUCHT, 2003; MENGEL et al. 2005; COLVIN,
2007). Estes anticorpos são possivelmente anti-HLA e/ou anti-endotélio, que
ativam a via clássica do sistema complemento. Nestes casos, anticorpos
circulantes anti-doador são freqüentemente detectados e a prova cruzada
pós-transplante é positiva (prova cruzada positiva “de novo”) (COLLINS et
al., 1999; BÖHMIG et al., 2002).
A prevalência de RMA aguda varia de 2,5 a 10% dos transplantes
renais (WATSCHINGER et al., 2002; MENGEL et al., 2005; TRUONG et al.,
2007; MATL et al., 2008; SLATINSKA et al., 2009), sendo que em 20 a 30%
das rejeições agudas existe um componente humoral isolado ou em
associação ao componente celular (linfócito T) (WATSCHINGER et al., 2002;
FEUCHT, 2003; TRUONG et al., 2007; MATL et al., 2008).
Clinicamente, a RMA aguda pode apresentar-se com deterioração
brusca da função renal, retardo da função do enxerto ou na forma de
síndrome hemolítica-urêmica e, em geral, apresenta baixa taxa de resposta
ao tratamento convencional anti-rejeição (CRESPO et al., 2001; MAUIYYEDI
et al., 2002a; MOLL et al., 2005; LUDOVICO-MARTINS et al., 2006).
Introdução
5
Os achados histológicos da RMA aguda incluem algumas
características de rejeição celular aguda, como a presença de infiltrado
intersticial composto por linfócitos e macrófagos e tubulite, presentes em
mais de 50% dos casos. A presença de lesão vascular caracterizada por
endarterite é menos freqüente (ocorre em torno de 25% dos casos)
(MAUIYYEDI et al., 2002b; MAUIYYEDI et al., 2002a). Os achados
histológicos característicos de RMA aguda, conforme atualização da
classificação de Banff 97, incluem: neutrófilos em capilares peritubulares,
necrose fibrinóide de arteríolas e lesão tubular aguda (RACUSEN et al.,
2003). Muitas vezes, o aspecto histológico é o de necrose tubular aguda e,
nestes casos, o diagnóstico se baseia na demonstração da atividade
humoral contra os antígenos do doador. Isto pode ser evidenciado pela
positividade da prova cruzada pós-transplante conseqüente ao aparecimento
de anticorpos anti-HLA do doador e pela detecção do fragmento C4d no
capilar peritubular consequente à ativação do sistema complemento pelo
imunocomplexo antígeno-anticorpo.
Em resumo, os critérios para o diagnóstico de RMA aguda incluem:
a) Evidência imunopatológica da reação humoral
através da detecção de depósitos de C4d em capilares peritubulares
b) Evidência morfológica de lesão tecidual
Presença de pelo menos 1 das seguintes alterações:
- neutrófilos em capilares peritubulares
- necrose fibrinóide em artérias
- lesão tubular aguda
c) Evidência sorológica de anticorpos circulantes específicos anti-doador
anticorpos anti-HLA ou contra outros antígenos do endotélio.
Introdução
6
Dentre os objetivos dos esquemas terapêuticos propostos para a
rejeição mediada por anticorpos aguda destacam-se a supressão da
resposta dos linfócitos T (com a utilização da globulina antitimócito [ATG]), a
eliminação dos anticorpos circulantes (com o emprego de sessões de
plasmaferese), a inibição dos anticorpos residuais (com a administração de
imunoglobulina intravenosa IgIV) e, mais recentemente, a supressão ou
depleção de linfócitos B (com a administração de rituximab) (ROCHA et al.,
2003; FEUCHT, 2003; LEHRICH et al., 2005; TRUONG et al., 2007; SINGH
et al., 2009).
I.1.2) Rejeição mediada por anticorpos crônica (RMA crônica)
Os estudos recentes, analisando a expressão de C4d em biópsias de
enxerto renal e sua relação com a RMA, têm observado que algumas
rejeições crônicas, em especial aquelas que evoluem mais rapidamente para
a perda do enxerto renal, estão associadas com um componente humoral
ativo.
Assim como na RMA aguda, a RMA crônica pode ser mediada tanto
por anticorpos pré-formados, quanto por anticorpos anti-doador “de novo”.
Porém, a RMA crônica é mais frequentemente mediada por anticorpos anti-
doador “de novo” (FEUCHT, 2003; COLVIN, 2007; SOLEZ et al., 2007). Isto
se deve provavelmente pelo fato de, ao longo de vários anos pós-
transplante, ocorrer uma sensibilização lenta e progressiva do receptor ao
enxerto (FEUCHT, 2003).
Introdução
7
Na nefropatia crônica do enxerto, a prevalência de RMA crônica está
em torno de 34%, mas pode chegar até 62% (REGELE et al., 2002; DAVID-
NETO et al., 2007). Analisando apenas casos de rejeição crônica, esta
prevalência sobe para 60% (FEUCHT, 2003; MAUIYYEDI et al., 2001).
Os achados histológicos mais freqüentes de RMA crônica incluem a
glomerulopatia crônica do transplante com a duplicação da membrana basal
dos capilares peritubulares, presentes em mais de 50% dos casos
(MAUIYYEDI et al., 2001; REGELE et al., 2002), além de atrofia tubular e
neutrófilos em capilares peritubulares (REGELE et al., 2002; FEUCHT, 2003;
COLVIN, 2007; SOLEZ et al., 2007). Outros achados histológicos que
podem acompanhar a RMA crônica são: depósitos de células inflamatórias
mononucleares em capilares peritubulares, glomerulite e infiltrado intersticial
de plasmócitos (SOLEZ et al., 2007).
Em resumo, os critérios para o diagnóstico de RMA crônica incluem:
a) Evidência imunopatológica da reação humoral
através da detecção de C4d em capilares peritubulares
b) Evidência morfológica de lesão tecidual
Presença de pelo menos 1 das seguintes alterações:
- glomerulopatia do transplante
- duplicação da membrana basal dos capilares peritubulares
- fibrose intersticial / atrofia tubular
- fibrose intimal das artérias sem duplicação da camada elástica
c) Evidência sorológica de anticorpos circulantes específicos anti-doador
anticorpos anti-HLA ou contra outros antígenos do endotélio.
Introdução
8
Apesar de estudos recentes sugerirem um componente humoral ativo
em alguns casos de rejeição crônica, ainda não há uma conduta terapêutica
proposta para estes casos. Recentemente, Ferreira e colaboradores
demonstraram que enxertos renais com disfunção crônica e depósito de
fragmento C4d se beneficiaram da substituição do inibidor de calcineurina
(tacrolimo ou ciclosporina) pelo sirolimo, com aumento da sobrevida do
enxerto renal em 2 anos de seguimento (FERREIRA et al., 2009).
I.2. Fragmento C4d
I.2.1) Origem da fração C4d no sistema complemento
O sistema complemento é um componente termolábil constituído por
proteínas inativas presentes em grandes quantidades no plasma e em
superfícies celulares, que auxilia na reposta imune. Existem duas formas
principais de ativação do complemento: a via clássica, ativada por
complexos imunes e a via alternativa, ativada diretamente quando o sistema
complemento (via fração C3) entra em contato com uma superfície não-
própria (como por exemplo, membrana celular bacteriana) (WALPORT,
2002).
O resultado da ativação da cascata do complemento é a formação de
um complexo de ataque à membrana (MAC – membrane attack complex). A
unidade funcional do MAC é um poro que se insere na camada lipídica da
membrana que altera sua permeabilidade seletiva, permitindo a entrada de
água, íons e pequenas moléculas para o citosol da célula-alvo, levando à
sua ruptura (lise) (WALPORT, 2002).
Introdução
9
O fragmento C4d é originado a partir da via clássica do sistema
complemento. Como apresentado de forma esquemática na figura 1A, a
ativação da via clássica inicia-se pela interação do imunocomplexo com a
fração C1q, promovendo uma modificação conformacional no complexo
C1qrs, que resulta na ativação do C1s. O C1s ativado cliva o componente
C4, gerando dois fragmentos, o C4a e o C4b. O fragmento C4b liga-se à
superfície celular e associa-se ao C2, originando C4b2a, também chamado
C3-convertase, que posteriormente cliva o C3, gerando C3a e C3b. O C3b
liga-se ao C4b2a formando a C5-convertase que culmina, após
subseqüentes etapas de ativação, no C5b-9 também chamado de MAC
(WALPORT, 2002).
Um dos mecanismos de regulação deste processo de ativação do
complemento ocorre através da ação do fator I presente no plasma que,
juntamente com a proteína co-fator da membrana (MCP – Membrane Co-
factor Protein), cliva C4b formando C4c e C4d (Figura 1B). Estes dois
fragmentos são inativos e não apresentam efeitos patológicos (PLATT,
2002). No entanto, o fragmento C4d, capaz de se ligar de forma covalente às
estruturas da membrana celular, permanece fixado no tecido por vários dias
ou mesmo semanas após a ativação do sistema complemento, tornando sua
detecção possível em fases mais tardias, quando outros componentes do
complemento já não são mais detectados (MOLL et al., 2005).
Introdução
10
Adaptado de Mark Walport - Imunologia, 4a Ed, 2002 Figura 1. A: Cascata de eventos do sistema complemento (via clássica). B: Formação do fragmento C4d, a partir da clivagem do C4b pelo fator I e pela proteína co-fator da membrana (MCP)
Assim, a detecção do fragmento C4d em biópsias de enxerto renal
possibilita a caracterização do envolvimento da via clássica do sistema
complemento no processo de rejeição aguda ao aloenxerto.
MEMBRANA
Complexo imune
Ag-AC
C4
C3
C1q
C1r C1r
C1s C1s
C4b2a3b
C5 convertaseC3 convertase
C4a
C4b
C4b C4b2
C2b
C4b2a C3b
C3a
C3b
A
C2
MEMBRANA
Complexo imune
Ag-AC
C4
C3
C1q
C1r C1r
C1s C1s
C4b2a3b
C5 convertaseC3 convertase
C4a
C4b
C4b C4b2
C2bC2b
C4b2aC4b2a C3b
C3a
C3b
A
C2
C4
C3
C1r C1r
C1s C1s
C4b2a3b
C5 convertaseC3 convertase
C4a
C4b
C4b
C2b
C4b2a C3b
C3a
C3b
B
C2
C4dMCP
Fator IC4b2
MEMBRANA
C1q
Complexo imune
Ag-AC
C4
C3
C1r C1r
C1s C1s
C4b2a3b
C5 convertaseC3 convertase
C4a
C4b
C4b
C2bC2b
C4b2aC4b2a C3b
C3a
C3b
B
C2
C4dMCP
Fator IC4d
MCP
Fator IC4b2
MEMBRANA
C1q
Complexo imune
Ag-AC
Introdução
11
I.2.2) C4d em transplante renal
Um resumo dos principais trabalhos sobre a detecção do fragmento
C4d em transplante renal é apresentado na tabela 1.
Com os conhecimentos acumulados acerca do fragmento C4d, sabe-
se que, em rim normal, não há depósito de C4d em capilares peritubulares.
Eventualmente, C4d pode ser detectado nos glomérulos, em região
mesangial (como resultado da ativação fisiológica do sistema complemento)
ou em alça capilar (em casos de toxicidade por inibidores da calcineurina,
síndrome hemolítica-urêmica ou recorrência da glomerulonefrite) (COLLINS
et al., 1999; FEUCHT et al., 2005; SEEMAYER et al., 2007). Porém, nos
casos considerados C4d positivos, o depósito deste fragmento é detectado
em capilares peritubulares, indicando a ativação da via clássica do
complemento, sendo considerado marcador de rejeição mediada por
anticorpos. Estudos com dupla marcação evidenciaram que os depósitos de
C4d localizam-se na membrana basal (no colágeno tipo IV) e no endotélio
(FEUCHT et al., 2005; SEEMAYER et al., 2007).
Introdução
12
Tabela 1. Resumo dos principais estudos sobre a detecção do fragmento C4d em
biópsias de enxerto renal
Estudo Comentários
Zwirner, Feucht et al., 1989
Primeiro estudo detectando C4d em tecido renal
Feucht et al., 1991
Primeiro trabalho a analisar a expressão de C4d em transplante renal
Presença de C4d em capilares peritubulares em casos de alto risco imunológico (painel de reatividade alto, retransplante)
Feucht et al., 1993
A presença de depósitos de C4d em capilares peritubulares correlaciona-se com rejeições agudas graves e perda precoce do enxerto
Collins, Colvin, et al., 1999
Crespo, Colvin et al., 2001 Mauiyyedi, Colvin et al., 2002b Bohmig, Regele et al 2002
Confirma que C4d é crucial para o diagnóstico de RMA aguda, associado com a presença de anticorpos circulantes específicos anti-doador
Lederer, Feucht et al., 2001
A deposição de C4d em capilares peritubulares é um fator independente de pior sobrevida do enxerto renal
Takeuchi et al., 2000
Primeiro trabalho a identificar C4d em rejeições crônicas
Mauyyedi et al., 2001
Introdução do conceito de “RMA crônica”
Regele et al., 2002
O fragmento C4d na RMA crônica está associado principalmente ao achado morfológico de glomerulopatia crônica do transplante
Racusen et al., 2003 Foi proposta a alteração da classificação de BANFF-97, incluindo a RMA (aguda e crônica)
Seemayer et al., 2007 A técnica de IF-criostato é mais sensível do que a técnica de IH-parafina
Colvin, 2007 Foi introduzido o conceito de “acomodação” (presença do anticorpo anti-doador no soro e do fragmento C4d em capilares peritubulares, porém sem alterações histológicas de RMA e sem disfunção do enxerto renal)
Singh et al., 2009 Foi proposta uma abordagem terapêutica racional para as rejeições mediadas por anticorpos.
Introdução
13
Mais recentemente, foi proposta uma teoria para tentar explicar os
mecanismos envolvidos na RMA. De acordo com esta teoria, o primeiro
evento (estágio I) é a produção de anticorpos circulantes anti-doador. No
estágio II, os anticorpos circulantes interagem com os aloantígenos,
resultando na deposição do fragmento C4d em capilares peritubulares. Em
consequência à interação antígeno-anticorpo, surgem as alterações
histológicas da rejeição humoral (estágio III) e, por fim, ocorre a
manifestação clínica da RMA, ou seja, a disfunção do enxerto (estágio IV).
No estágio IV, em alguns casos, os anticorpos circulantes e, eventualmente,
o fragmento C4d já não estão presentes (COLVIN, 2007). Esta teoria
também introduz o conceito “acomodação”, o qual é definido pela presença
do anticorpo anti-doador no soro e do fragmento C4d em capilares
peritubulares, porém sem alterações histológicas características de RMA e
sem disfunção do enxerto (estágios I e II) (COLVIN, 2007).
Segundo Colvin, a “acomodação” talvez ocorra por uma “resistência”
desenvolvida pelo enxerto. Estudos in vitro demonstraram alterações na
natureza dos anticorpos anti-doador e uma redução no número de antígenos
alvos, redução esta mediada por múltiplos mecanismos (internalização,
downregulation, inativação e inibição). Porém, estes achados não foram
confirmados em casos de transplantes ABO-incompatíveis que
apresentaram o evento de acomodação (COLVIN, 2007).
Introdução
14
I.3. Linfócitos B - Plasmócitos
Até recentemente, pouca atenção foi dada à participação dos
linfócitos B e plasmócitos no mecanismo de rejeição em transplantes de
órgãos sólidos (TSAI et al., 2006). Embora esteja bem estabelecido o papel
dos linfócitos B e plasmócitos como células responsáveis pela produção de
anticorpos, a associação destas células com o C4d não está clara. Portanto,
torna-se necessário uma melhor avaliação no que diz respeito à relação
entre linfócitos B e plasmócitos e a rejeição mediada por anticorpos no
aloenxerto renal.
I.3.1) Maturação, ativação e diferenciação dos linfócitos B
Os linfócitos B passam por três processos básicos durante seu
desenvolvimento: maturação, ativação e diferenciação. O processo de
maturação ocorre na medula óssea e é independente da presença de
antígenos. Os demais ocorrem nos órgãos linfóides secundários (periféricos)
e são dependentes da presença de antígenos (ABBAS et al., 2000;
LYDYARD et al., 2000; CARTER, 2006).
A maturação dos linfócitos B segue etapas sequenciais (Figura 2).
Resumidamente, na medula óssea, a célula tronco hematopoiética
diferencia-se em célula pró-B (célula precursora de linfócitos B), que por sua
vez se diferencia em célula pré-B, que se diferencia em célula B imatura e
que, finalmente se diferencia em célula B madura. As células B maduras são
lançadas na corrente sanguínea e migram para os órgãos linfóides
secundários (periféricos), onde permanecem nos centros germinativos e,
Introdução
15
quando estimuladas, dão origem aos dois processos subseqüentes, a
ativação e a diferenciação (LYDYARD et al., 2000; CARTER, 2006).
A maioria dos linfócitos B maduros expressa dois isotipos de
imunoglobulina em sua superfície, IgM e IgD. Estas imunoglobulinas estão
ligadas de forma não-covalente (por pontes dissulfeto) à Igα e Igβ, formando
o “complexo receptor de antígeno em célula B” (RCB) (ABBAS et al., 2000;
LYDYARD et al., 2000).
Adaptado de Ludovico-Martins H e Noronha IL – Atualidades em Nefrologia 10, 2008.
Figura 2. Linfopoiese da célula B (seqüência da diferenciação dos linfócitos B)
Vaso sanguíneo
Medula Óssea (fase antígeno-independente)
Célula tronco Célula pró-B Célula pré-B Célula B imatura Célula B madura
Plasmócito
Linfonodo – Centro Germinativo (fase antígeno-dependente)
Zona escura
Zona basal clara
Zona apical clara
Centroblasto
Centrócito
Célula B de
memória
Blastos de Células B
Vaso sanguíneo
Medula Óssea (fase antígeno-independente)
Célula tronco Célula pró-B Célula pré-B Célula B imatura Célula B madura
Plasmócito
Linfonodo – Centro Germinativo (fase antígeno-dependente)
Zona escura
Zona basal clara
Zona apical clara
Centroblasto
Centrócito
Célula B de
memória
Blastos de Células B
Introdução
16
A ativação dos linfócitos B inicia-se com a interação do antígeno ao
RCB. Esta interação gera uma cascata de eventos na membrana celular
que, por meio da ativação dos segundos mensageiros, inositol trifosfato
(Ca++ dependente) e diacilglicerol (via proteína quinase-C), resultará na
proliferação e diferenciação dos linfócitos B (ABBAS et al., 2000; LYDYARD
et al., 2000).
Uma vez ativados, os linfócitos B sofrem o processo de diferenciação
que dará origem às células produtoras de anticorpos e às células de
memória.
Os linfócitos B ativos expressam um maior número de moléculas de
classe II do complexo principal de histocompatibilidade, de moléculas co-
estimulatórias (B7) e de receptores de membrana para citocinas derivadas
de linfócitos T auxiliares. Tais alterações permitem que linfócitos B ativados
interajam e respondam aos mediadores secretados pelos linfócitos T
auxiliares. É esta a interação fundamental para que ocorra a formação de
linfócitos B de memória (ABBAS et al., 2000).
Vale ressaltar que, dependendo do antígeno, o linfócito B responde de
maneira mais ou menos elaborada. Quando se trata de um antígeno não-
protéico (lipopolissacarídeos-LPS, glicolípides e ácidos nucléicos), há uma
ativação direta do linfócito B, levando à proliferação policlonal das células B
produtoras de anticorpos (plasmócitos) sem que haja, no entanto, a
formação de memória. Em contrapartida, se o antígeno é protéico, a
resposta é mais elaborada, levando à interação entre linfócitos B e linfócitos
T. Esta interação resulta na produção de anticorpo e na formação de
Introdução
17
linfócitos B de memória. Portanto, a diferenciação dos linfócitos B em células
de memória é um processo T-dependente (ABBAS et al., 2000).
I.3.2) Funções imunológicas dos linfócitos B
Os linfócitos B têm um papel chave na resposta imune. Além da
produção de anticorpos, eles também atuam como células apresentadoras
de antígenos e possuem a capacidade de memória.
Produção de anticorpos. Os linfócitos B produzem anticorpos de 5
classes principais: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD. Cada plasmócito em estágio final
de diferenciação produz anticorpos de uma única classe ou subclasse.
O processo de produção de anticorpos inicia-se com o reconhecimento
do antígeno pelo linfócito B, através da interação dos epítopos antigênicos
ao RCB. Esta interação, conforme descrito acima, promove uma cascata de
eventos que, além de resultar na ativação dos linfócitos B, leva à seleção de
imunoglobulinas com afinidade para o antígeno em questão. Os epítopos
ligados ao RCB formam um complexo que é fagocitado pelo linfócito B e,
uma vez no interior da célula, este complexo ativa genes de endonucleases
específicas que inibem a produção das imunoglobulinas inespecíficas,
deixando ativados apenas aqueles responsáveis pela síntese de um isotipo
específico de imunoglobulina (por exemplo, IgG). Este isotipo de
imunoglobulina é, portanto, específico contra o antígeno em questão, e é
então liberada na circulação (MOTTA Jr, 2002).
Linfócitos B como células apresentadoras de antígenos (APC). A
interação entre um antígeno protéico com o RCB resulta na sua
Introdução
18
internalização por um processo de endocitose, seguido por sua digestão nos
lisosomos e pela formação de vários peptídeos. Estes peptídeos interagem
com as moléculas de classe II do complexo principal de
histocompatibilidade, e o complexo peptídeo/MHC II é transportado para a
superfície da célula para ser apresentado às células T auxiliares (ABBAS et
al., 2000; BATISTA et al., 2001; RODRIGUEZ-PINTO et al., 2005; CARTER,
2006).
Com a apresentação do antígeno, ocorre o contato intercelular entre o
linfócito B e linfócito T mediado pelas moléculas CD40 e gp39. A interação
intercelular estimula a secreção de citocinas por parte do linfócito T (IL-2, IL-
4, IL-5, IL-10, IL-13 e IFN-γ). Tanto o contato intercelular, como as citocinas
são estímulos que levam à intensa proliferação dos linfócitos B.
As células B também produzem citocinas, principalmente IL-4, IL-6, IL-
10 e TNF-α, que têm efeitos regulatórios sobre as células dendríticas
apresentadoras de antígeno, e mantêm a sobrevida de outras células
mononucleares (CARTER, 2006).
I.4. Rejeição mediada por anticorpos e linfócitos B
O significado clínico do infiltrado de linfócitos B na rejeição ao
aloenxerto renal continua ainda pouco elucidado, o que justifica o seu
estudo. Além disso, levantamos a hipótese do possível papel dos linfócitos B
e plasmócitos no processo in situ da rejeição mediada por anticorpos.
Entendemos que o estudo dos linfócitos B, plasmócitos e da deposição de
Introdução
19
C4d em casos de rejeição celular e rejeição mediada por anticorpos poderá
trazer novas informações sobre este tema.
Objetivos
20
II. OBJETIVOS
O objetivo do presente estudo foi analisar o depósito do fragmento
C4d e a expressão de linfócitos B e plasmócitos em biópsias de enxerto
renal.
Mais especificamente, os objetivos foram:
1) Comparar as técnicas de detecção do C4d em biópsias de enxerto
renal (imunofluorescência e imuno-histoquímica) em criostato e
parafina, para verificar a possibilidade da aplicação destas técnicas
para a detecção do fragmento C4d e, assim, facilitar a implantação
da pesquisa do fragmento C4d na rotina do transplante;
2) Analisar o depósito do fragmento C4d em biópsias de enxerto renal
para identificar um possível componente humoral nestes casos;
3) Correlacionar a presença do fragmento C4d com a evolução clínica
do transplante renal;
4) Analisar a expressão celular de CD20+ e CD138+, como marcador
de linfócitos B e plasmócitos, em biópsias de enxerto renal,
correlacionando a sua expressão com a evolução clínica do
transplante;
5) Correlacionar a presença de depósitos do fragmento de C4d com a
presença de células CD20+ e CD138+, em biópsias de enxerto
renal, para investigar uma possível participação dos linfócitos B e
plasmócitos na rejeição C4d +.
Casuística e Métodos
21
III. CASUÍSTICA E MÉTODOS
III.1. Casuística
III.1.1) Casuística geral
Trata-se de um estudo retrospectivo realizado a partir da análise de
biópsias de pacientes submetidos a transplante renal na Clínica de
Nefrologia do Hospital Beneficência Portuguesa de São Paulo.
Foram incluídas 107 biópsias de 82 pacientes submetidos a
transplante renal no período de maio de 1996 a maio de 2007. As biópsias
foram selecionadas de acordo com critérios clínicos (sem rejeição, suspeita
de rejeição aguda e, suspeita de rejeição crônica) e de acordo com critérios
histológicos (baseado na classificação de BANFF-97: “rim histologicamente
normal”, “rejeição aguda” e “nefropatia crônica do enxerto”) e foram divididas
em quatro grupos: biópsias de rim normal adiquiridas no momento da
nefrectomia do doador (grupo Normal; n=10), biópsias que não
apresentaram alterações histológicas compatíveis com rejeição (grupo Sem
Rejeição; n=6), grupo rejeição aguda (RA; n=43) e grupo nefropatia crônica
do enxerto (NCE; n=48). Os dois primeiros grupos foram utilizados como
controle (Tabela 2).
Casuística e Métodos
22
Tabela 2. Análise das biópsias incluídas no estudo, de acordo com o diagnóstico histológico
RA: rejeição aguda; NCE: nefropatia crônica do enxerto; DVR: doador vivo relacionado; DVNR: doador vivo não-relacionado; DF: doador falecido.
Dos 82 pacientes transplantados, 63 eram homens e 19 mulheres. A
idade média dos pacientes foi de 39 ± 14 anos, variando de 13 anos a 70
anos. As causas que levaram ao quadro de doença renal crônica classe V,
em ordem de prevalência, foram: glomerulonefrite crônica (GNC) (n=30;
36,6%), causa indeterminada (n=19; 23,2%), nefropatia diabética (n=13;
15,9%), pielonefrite crônica (n=7; 8,5%), nefroesclerose (n=6; 7,3%), doença
renal policística (DRP) (n=6; 7,3%) e acidente por peçonha (n=1; 1,2%).
Quanto ao tipo de doador utilizado, 32 (39,0%) transplantes foram de doador
vivo relacionado, 16 (19,5%) de doador vivo não-relacionado (cônjuges) e 34
(41,5%) de doador falecido. Das 107 biópsias analisadas, apenas 22 foram
biópsias de segundo transplante (retransplante) enquanto que as demais
(79,5%) constituiram biópsias de primeiro transplante.
Todos os pacientes receberam terapia com três drogas
imunossupressoras, incluindo um inibidor de calcineurina (ciclosporina
Rim Normal
Sem Rejeição
RA NCE
Número de biópsias 10 6 43 48
Tipo de doador 0 DVR
0 DVNR
10 DF
4 DVR
1 DVNR
1 DF
16 DVR
11 DVNR
16 DF
25 DVR
8 DVNR
15 DF
Retransplantes ---- 0 11 (25,6 %) 5 (10,4 %)
Tempo da biópsia (dias do pós-transplante)
---- 379 ± 262 139 ± 71 1068 ± 133
Casuística e Métodos
23
microemulsão, Sandimmun Neoral®, Novartis, Brasil ou tacrolimo, Prograf®,
Janssen Cilag, Brasil), micofenolato mofetil (Cellcept®, Roche, Basiléia,
Suíça) e corticóide. A terapia de indução, com anticorpo policlonal anti-CD3
(Thymoglobuline®, Genzyme, Cambridge, EUA) ou anticorpo monoclonal
anti-CD3 (Orthoclone OKT3®, Ortho Biotech, Bridgewater, EUA), foi usada
em transplantes realizados com doador falecido que evoluíram com oligúria
no pós-transplante imediato e nos casos de retransplante.
Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa –
CAPPesq-HC, nº 577/06 em agosto/2006, do Hospital das Clínicas da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (Anexo B).
III.1.2) Casuística para análise do fragmento C4d
Devido às dificuldades que limitam o manuseio de fragmentos
congelados, dificuldades estas que vão desde a obtenção do material
(necessidade de um segundo fragmento de biópsia) ao armazenamento
(necessidade de nitrogênio líquido e de freezer -70°C) e à realização do
trabalho propriamente dito (dificuldade em procurar as biópsias no freezer -
70°C), das 107 biópsias conservadas em parafinas e incluídas neste estudo,
apenas 41 biópsias de três grupos (Sem Rejeição, n = 4; RA, n = 12; e
NCE, n = 25) também tiveram seu material congelado disponibilizado e,
portanto, foram incluídos na pesquisa do fragmento C4d (Tabela 3).
Casuística e Métodos
24
Tabela 3. Análise das biópsias incluídas no estudo do fragmento C4d, de acordo com o diagnóstico histológico
RA: rejeição aguda; NCE: nefropatia crônica do enxerto; DVR: doador vivo relacionado; DVNR: doador vivo não-relacionado; DF: doador falecido
III.1.3) Casuística para análise dos linfócitos B
Todas as 107 biópsias incluídas no estudo foram submetidas à
pesquisa para linfócitos B. Para tal, as biópsias foram divididas em 4 grupos,
conforme descrito anteriormente: Normal (n=10), Sem Rejeição (n=6), RA
(n=43) e NCE (n=48). Este último foi subdividido em: NCE com evidências
de nefrotoxicidade pelos inibidores de calcineurina (Nefrotox iCN; n=20) e
outras causas de NCE (NCE outros; n=28) (Tabela 4).
Sem Rejeição
RA NCE
Número de biópsias 4 12 25
Tipo de doador 3 DVR
0 DVNR
1 DF
3 DVR
6 DVNR
3 DF
13 DVR
4 DVNR
8 DF
Retransplantes 0 3 (25 %) 3 (12 %)
Tempo da biópsia (dias do pós-transplante)
89 ± 40 26 ± 5 1024 ± 160
Casuística e Métodos
25
Tabela 4. Análise das biópsias incluídas no estudo dos linfócitos B, de acordo com o diagnóstico histológico
RA: rejeição aguda; NCE: nefropatia crônica do enxerto; Nefrotox iCN: nefrotoxicidade por inibidores de calcineurina; NCE outros: outras causas de NCE; DVR: doador vivo relacionado; DVNR: doador vivo não-relacionado; DF: doador falecido
III.1.4) Casuística para análise dos plasmócitos
Como o principal objetivo do estudo dos plasmócitos foi investigar
uma possível associação entre o infiltrado plasmocitário e o depósito do
fragmento C4d em capilares peritubulares, a pesquisa de plasmócitos foi
realizada nos mesmos 41 casos analisados no estudo do fragmento C4d
(tabela 3).
III.2. Biópsias de enxerto renal
As biópsias foram realizadas na presença de disfunção do enxerto
(biópsias diagnósticas) e, em alguns casos, no momento da nefrectomia do
doador, para a obtenção de fragmentos de rim normal (biópsias de controle).
Normal Sem Rejeição
RA NCE
Total Nefrotox iCN
NCE outros
Número de biópsias 10 6 43 48 20 28
Tipo de doador 0 DVR 0 DVNR 10 DF
4 DVR 1 DVNR
1 DF
16 DVR 11 DVNR
16 DF
25 DVR 8 DVNR 15 DF
10 DVR 3 DVNR
7 DF
15 DVR 5 DVNR
8 DF
Retransplantes ---- 0 11 (25,6 %) 5 (10,4 %) 0 5 (17,9%)
Tempo da biópsia (dias do pós-transplante)
---- 379 ± 262 139 ± 71 1068 ± 133 1200 ± 232 974 ± 159
Casuística e Métodos
26
Os fragmentos de rim foram obtidos por biópsia renal percutânea, sob
orientação de ultra-som.
Os resultados das biópsias foram descritos de acordo com a
classificação de Banff para Patologia Renal (Banff-97) (RACUSEN et al.,
1999). Resumidamente, Banff tipo I (rejeição túbulo-interstitial sem arterite)
foi classificado como IA (tubulite moderada) ou IB (tubulite grave); Banff tipo
II (rejeição vascular, caracterizada por arterite intimal) foi classificado como
IIA (leve a moderada) ou IIB (grave); Banff tipo III (rejeição grave, com
arterite transmural). A nefropatia crônica do enxerto foi classificada em grau I
(leve), grau II (moderada) e grau III (grave), adicionalmente, foram
classificadas quanto a presença ou não de evidências de nefrotoxicidade
crônica pelos inibidores da calcineurina (fibrose em faixa, atrofia tubular,
dilatação tubular, esclerose focal e segmentar e arteriolopatia).
De acordo com o diagnóstico clínico e histológico, as biópsias foram
divididas em cinco grupos: grupo rejeição aguda (RA; n=43) e grupo
nefropatia crônica do enxerto (NCE; n=48), onde foram incluídas biópsias
com evidências de nefrotoxicidade pelos inibidores de calcineurina (n=20) e
biópsias com outras causas de NCE (n=28). Como controle, foram incluídas
biópsias de enxerto renal que não apresentaram alterações histológicas
compatíveis com rejeição (grupo Sem Rejeição; n=6), mas que foram
realizadas por indicação clínica (disfunção do enxerto), além de biópsias de
rim normal (grupo Rim Normal; n=10), obtidas no momento da nefrectomia
do doador.
Casuística e Métodos
27
O diagnóstico de RA foi feito baseando-se em parâmetros clínicos
(aumento de creatinina sérica, diminuição de diurese, ganho de peso) e
confirmado por biópsia. Todos os eventos de rejeição celular aguda foram
tratados com pulsos de metilprednisolona (1 g/dia EV, durante 3 dias).
Rejeições Banff tipos II e III e/ou córtico-resistentes foram tratadas com
anticorpo monoclonal anti-CD3 (OKT3) durante 10 dias.
O diagnóstico de NCE foi feito baseando-se em parâmetros
histológicos (fibrose intersticial, atrofia tubular, esclerose focal e segmentar e
hialinização vascular) utilizando biópsias de enxerto renal com disfunção
crônica e progressiva, com ou sem proteinúria.
III.3. Processamento das biópsias
Durante a realização das biópsias, um fragmento foi retirado de cada
paciente para avaliação histológica, sendo posteriormente aproveitado para
procedimento de imuno-histoquímica e imunofluorescência. Em alguns
pacientes foi retirado um segundo fragmento, o qual foi congelado para
futuras análises.
Os fragmentos foram fixados com Dubosq-Brazil, processados e
incluídos em parafina ou embebidos em Tissue Tek (Reichert-Jung Leica
Products, Alemanha) e congelados em nitrogênio líquido para,
posteriormente, serem estocadas em freezer -70°C até a data de sua
utilização.
Casuística e Métodos
28
III.3.1) Fixação e Parafinização
Os fragmentos de rim incluídos em parafina foram processados pelo
serviço de patologia do Hospital Beneficência Portuguesa e, portanto, foram
disponibilizados já emblocados em parafina.
Os blocos de parafina foram cortados em micrótomo (Reichert Yung
Supercut 2065 Leica, Nussloch, Alemanha) com navalhas descartáveis. Os
fragmentos, com espessura de 3 a 4 µm, foram aderidos em lâminas
previamente revestidas por silano 2% (Sigma Chemical Co., St. Louis, EUA).
As lâminas com os cortes permaneceram em estufa (Fabbe-Primar, São
Paulo, Brasil) a 60ºC por 2 horas e em seguida foram armazenadas a 4ºC.
III.3.2) Tecido congelado
Os fragmentos que foram previamente embebidos em TissueTek
(Reichert-Jung Leica Products), congelados em nitrogênio líquido e
armazenados à -70ºC, foram levados para cortes em criostato (Reichert-
Jung CM3000, Leica Products, Alemanha), com a realização de cortes de 5
m de espessura. Após os cortes, as lâminas secaram à temperatura
ambiente por 2 horas e foram então fixadas em acetona (Merck, Darmstadt,
Alemanha), à 4OC por 7 minutos. Em seguida, as lâminas secaram à
temperatura ambiente por, no mínimo, 10 minutos e foram armazenadas em
freezer -70ºC até o momento do uso.
Casuística e Métodos
29
III.4. Preparo das lâminas para os experimentos
III.4.1) Desparafinização e recuperação antigênica
Para a desparafinização, os fragmentos submetidos à imuno-
histoquímica foram aquecidos em estufa à 60°C, seguido de banhos de xilol
por 9 minutos (3 vezes), álcool absoluto por 5 minutos (2 vezes) e álcool
96% por 3 minutos (2 vezes).
Para a realização dos experimentos de imunofluorescência, os tecidos
conservados em parafina precisaram passar por um processo de
desparafinização mais rigoroso. Este processo diferenciou daquele utilizado
para imno-histoquímica apenas pelo método de aquecimento dos
fragmentos, onde os tecidos foram mergulhados em xilol quente (60°C), por
60 minutos.
Durante o processo de parafinização pode ocorrer o “mascaramento”
de antígenos no tecido, dificultando assim sua detecção e, portanto, foi
realizado a recuperação antigênica utilizando a técnica do microondas. Para
tanto, após o processo de desparafinização, os tecidos foram imersos em
tampão citrato 10 mM (pH 6,0) e levados ao forno microondas (Sanyo, São
Paulo, Brasil) com potência de 2400 watts durante 15 minutos. As lâminas
permaneceram no tampão até atingir a temperatura ambiente. Os
fragmentos foram então hidratados em solução TBS (salina- tris tamponada,
contendo NaCl 0,015 M e Tris 0,05 M, pH 7,6). A partir deste momento, os
tecidos estavam preparados para serem submetidos aos experimentos.
Casuística e Métodos
30
III.4.2) Fragmentos congelados
Os fragmentos congelados à -70oC foram retirados do freezer e
mantidos em temperatura ambiente por 5 minutos para descongelar. Em
seguida foram hidratados em solução TBS. A partir deste momento, os
tecidos estavam prontos para os experimentos.
III.5. Detecção do fragmento C4d
Para a identificação do fragmento C4d, foram empregadas as técnicas
de imunofluorescência e imuno-histoquímica, tanto em tecidos conservados
em parafina, quanto em tecidos congelados.
III.5.1) Técnica de imunofluorescência
Os tecidos foram, inicialmente, submetidos ao bloqueio dos antígenos
inespecíficos por 5 minutos, utilizando para isto o reagente “protein block” do
kit NovoLink. Os tecidos conservados em parafina foram incubados com
anticorpo primário policlonal anti-C4d (BIOMEDICA, Oxford, Reino Unido),
diluído 1:50, em Tris 0,5 M, pH 7,6, contendo albumina sérica bovina a 1%
(p/v) durante a noite, à 4 C, em câmara úmida. Já os tecidos congelados
foram incubados com anticorpo primário monoclonal anti-C4d (QUIDEL, San
Diego, EUA), diluído 1:1.000 em Tris 0,5 M, pH 7,6, contendo BSA a 1%
(p/v), durante 40 minutos, na estufa à 37°C, em câmara úmida. Até então,
todas as etapas foram intercaladas por duas lavagens (5 minutos, cada)
utilizando solução Tris HCl a 0,5M pH=7,6. Controles negativos, omitindo-se
a incubação com o anticorpo primário, foram realizados.
Casuística e Métodos
31
Os tecidos conservados em parafina foram incubados com anticorpo
secundário policlonal anti-imunoglobulina de coelho conjugado com FITC
(SIGMA, St. Louis, EUA), diluído 1:150 em PBS (salina fosfato-tamponada
NaH2PO4 0,025 M, Na2HPO4 0,007 M e NaCl pH 7,4) contendo Azul de
Evans 6% (p/v) por 90 minutos, à 37°C, em câmara úmida. Os tecidos
congelados foram incubados com anticorpo secundário policlonal anti-
imunoglobulina de camundongo conjugado com FITC (JACKSON
IMMUNORESEARCH Inc., West Grove, EUA), diluído 1:250 em PBS
contendo Azul de Evans 6% (p/v) por 40 minutos à 37°C, em câmara úmida.
Após, os fragmentos foram submetidos à três lavagens de 5 minutos
utilizando solução de Tris HCl a 0,5M pH 7,6. As lamínulas foram colocadas
com solução de glicerina 50% e as lâminas montadas foram armazenadas
protegidas da luz a -20oC até a leitura.
III.5.2) Técnica de imuno-histoquímica
Os tecidos foram, inicialmente, submetidos ao bloqueio da peroxidase
endógena, incubando-os por 5 minutos com a Peroxidase blocking solution
do kit NovoLink. Em seguida os possíveis antígenos inespecíficos presentes
no tecido foram bloqueados através da incubação durante 5 minutos com a
Protein Blocking Solution fornecida no kit. Os tecidos conservados em
parafina foram incubados com anticorpo primário policlonal anti-C4d
(BIOMEDICA, Oxford, Reino Unido), diluídos 1:100 em TBS contendo 1%
BSA (p/v) durante a noite, à 4 C, em câmara úmida. Já os tecidos
congelados foram incubados com anticorpo primário monoclonal anti-C4d
Casuística e Métodos
32
(QUIDEL, San Diego, EUA), diluídos 1:32.000, em TBS contendo 1% BSA
(p/v) por 30 minutos, em temperatura ambiente, em câmara úmida. Após a
incubação com o anticorpo primário, o tecido foi incubado por 30 minutos
com a solução “Post Primary Block”, seguido do complexo “NovoLink
Polymer” por 30 minutos. Todas as etapas foram intercaladas por duas
lavagens (5 minutos, cada) em TBS. Controles negativos, nos quais omitiu-
se a incubação com o anticorpo primário, foram realizados em todos os
casos.
Para a revelação os fragmentos foram incubados com o cromógeno
3,3’-diaminobenzidina (DAB), diluído em tampão substrato apropriado à
peroxidase. A revelação foi realizada sob aumento microscópico de 100
vezes e durou aproximadamente 10 minutos para o tecido conservado em
parafina e 5 minutos para os tecidos congelados. Em seguida as lâminas
foram contra-coradas com hemalumbre de Mayer (MERCK, Darmstadt,
Alemanha) por dois minutos e lavados por cinco vezes em água destilada.
As lamínulas foram colocadas com Glicergel (DAKO, Copenhagen,
Dinamarca) previamente aquecido.
III.6. Detecção de linfócitos B (CD20+)
Para a pesquisa de linfócitos B, foram utilizados apenas tecidos
conservados em parafina.
A identificação de linfócitos B foi realizada através de anticorpos
monoclonais de camundongo anti-CD20 (DAKO, Glostrup, Dinamarca), um
Casuística e Métodos
33
anticorpo específico anti-linfócito B, pelo método estreptavidina-fosfatase
alcalina.
Após a desparafinização e recuperação de antígenos, conforme
descrito anteriormente, a biotina endógena do tecido foi bloqueada através
da incubação com solução de avidina D (Vector, Burlingame, EUA), seguida
pela incubação com uma solução de biotina (Vector, Burlingame, EUA). As
lâminas foram incubadas durante 15 minutos com cada uma das soluções, e
lavadas com TBS durante 5 minutos após cada uma. As lâminas foram
então incubadas com soro não imune de cavalo (Vector, Burlingame, EUA),
diluído 70 vezes em TBS, durante 30 minutos e, após a retirada do excesso
do soro, foram incubadas com imunoglobulina anti-CD20 diluída 1:50 em
TBS, durante a noite a 4ºC. No dia seguinte, as lâminas foram lavadas em
TBS por 5 minutos e incubadas durante 45 minutos com anticorpo de cavalo
anti-camundongo biotinilado (Vector, Burlingame, EUA), diluído 200 vezes
em TBS. Após lavagem de 5 minutos com TBS, as lâminas foram incubadas
com o complexo estreptavidina-fosfatase alcalina (Dako, Carpinteria, EUA)
por 30 minutos, lavadas novamente com TBS e submetidas à revelação.
Controles negativos, omitindo-se a incubação com o anticorpo primário,
foram realizados em todos os casos.
Para a revelação, as lâminas foram incubadas com uma solução
contendo substrato para a enzima fosfatase alcalina e o corante fast-red
(Sigma Chemical Co, St. Louis, EUA), preparada da seguinte maneira: 1 mg
de fosfato de naftol AS-MX (Sigma Chemical Co, St Louis, EUA) foi diluído
em 100 l de dimetilformamida (Merck, Darmstadt, Alemanha), e em
Casuística e Métodos
34
seguida, esta solução foi diluída em 4,9 mL de tampão Tris 0,1 M (pH = 8,2)
e 10 L de levamisol 1 M (Sigma Chemical CO, St Louis, EUA) foram
acrescentados. Após, à esta solução foi acrescido por 0,005 g do corante
fast-red.
A revelação foi realizada sob microscopia em aumento de 100X e as
células positivas apresentaram coloração avermelhada. O tempo de
revelação foi de aproximadamente 10 minutos. As lâminas foram contra-
coradas com hemalunbre de Mayer (Merck, Darmstadt, Alemanha) durante 2
minutos e lavadas por cinco vezes em água destilada, e então montadas
com glicergel (Merck, Darmstadt, Alemanha).
III.7. Detecção de plasmócitos (CD138+)
Para a pesquisa de plasmócitos, foram utilizados apenas tecidos
conservados em parafina.
A identificação de plasmócitos foi realizada por imunohistoquímica
utilizando anticorpos monoclonais de camundongo anti-CD138 (DAKO,
Glostrup, Dinamarca), um marcador de superfície de plasmócitos (anticorpo
específico anti-plasmócito), utilizando-se o sistema de detecção “NovoLink
Compact PolymerTM” (NovocastraTM Reagents, Newcastle, Reino Unido).
Após a desparafinização e recuperação de antígenos, conforme
descrito anteriormente, os tecidos foram submetidos ao bloqueio da
peroxidase endógena, incubando-os por 5 minutos com a Peroxidase
blocking solution do kit. Em seguida os possíveis antígenos inespecíficos
presentes no tecido foram bloqueados através da incubação durante 5
Casuística e Métodos
35
minutos com a Protein Blocking Solution fornecida no kit. Os tecidos foram
então incubados com imunoglobulina anti-CD138 diluída 1:100 em TBS
contendo 1% BSA (p/v), durante a noite a 4ºC. No dia seguinte, os tecidos
foram incubados por 30 minutos com a solução “Post Primary Block”,
seguido do complexo “NovoLink Polymer” por 30 minutos. Todas as etapas
foram intercaladas por duas lavagens (5 minutos, cada) em TBS. Controles
negativos, nos quais omitiu-se a incubação com o anticorpo primário, foram
realizados em todos os casos.
Para a revelação, as lâminas foram incubadas com solução de 3-
amino-9-etil-carbazol a 0,01% diluído em tampão acetato 200mM contendo
H2O2 a 0,015%.
A revelação foi realizada sob microscopia em aumento de 100 X e as
células positivas apresentaram coloração acastanhada. O tempo de
revelação foi de aproximadamente 20 minutos. As lâminas foram contra-
coradas com hemalunbre de Mayer (Merck, Darmstadt, Alemanha) durante 2
minutos e lavadas por cinco vezes em água destilada, e então montadas
com glicergel (Merck, Darmstadt, Alemanha).
III.8. Análise dos resultados
III.8.1) Fragmento C4d
Os experimentos de imunofluorescência foram analisados utilizando
microscopia óptica com campo escuro (Olympus-BX51, Tóquio, Japão) sob
aumento de 400x. Para a análise dos experimentos de imuno-histoquímica,
Casuística e Métodos
36
foi utilizada microscopia óptica simples (Alphaphote-YS2 Nikon, Tóquio,
Japão) sob aumento de 400x. .
A expressão do fragmento C4d foi avaliada pelo método
semiquantitativo, analisando o número de túbulos que tiveram os capilares
peritubulares acometidos (que aparecem corados em marrom na imuno-
histoquímica e verde-fluorescente na imunofluorescência). Portanto, a
positividade do C4d é classificada como + (<10% dos túbulos
comprometidos), ++ (10-50%) ou +++ (>50%).
III.8.2) Linfócitos B e plasmócitos
A análise foi realizada com microscopia óptica sob aumento de 400x
em toda a extensão da biópsia. A avaliação da marcação dos linfócitos B e
plasmócitos foi realizada pelo método quantitativo, ou seja, foi realizada a
contagem do número de células positivas (que aparecem coradas em
vermelho). O total de células positivas foi expresso em relação à área total
da biópsia. Para o cálculo do número de células positivas/mm2 foi utilizado o
fator de correção de 5,096, previamente estabelecido.
III.9. Dados clínicos avaliados
Os resultados das análises histológicas para o fragmento C4d, linfócitos
B e plasmócitos foram correlacionados com a gravidade da rejeição e a
evolução clínica do enxerto renal.
Para a análise da gravidade da rejeição, foi avaliado o nível sérico de
creatinina no momento da biópsia. Para a análise da evolução clínica do
Casuística e Métodos
37
transplante, foram avaliados dois parâmetros clínicos: a evolução da
creatinina nos três anos pós-biópsia e a sobrevida do enxerto renal em três
anos pós-biópsia.
III.10. Análise estatística
Os dados estão expostos em média erro padrão (Média ± EP).
Os resultados obtidos neste estudo foram submetidos à análise de
normalidade (Kolmogorov-Smirnov) para a aplicação dos testes adequados.
Para as variáveis que apresentaram distribuição normal, foi aplicado o teste t
de Student não-pareado (com correção de Welch, se necessário) para
comparação dos grupos 2 a 2. Utilizou-se o teste de Mann-Whitney para as
variáveis que não apresentaram distribuição normal.
Para a comparação das técnicas de detecção do fragmento C4d foi
aplicado o teste de correlação de Spearman.
Foi aplicado o método de Kaplan-Meier para o cálculo da sobrevida
do enxerto em relação à presença do fragmento C4d, de linfócitos B e de
plasmócitos.
Para as análises adotou-se como estatisticamente significante um
nível descritivo inferior a 0,05.
Foi utilizado o programa estatístico GraphPad Prism V.4.03 para
realização dos testes.
Rec 60
Resultados
38
IV. RESULTADOS
IV.1. Detecção de C4d: análise das técnicas e do tipo de tecido
A técnica considerada padrão ouro para a detecção do fragmento C4d
é a imunofluorescência em criostato. Com o objetivo de verificar a
possibilidade de se aplicar outras técnicas para a detecção do fragmento
C4d, foram realizadas e comparadas com a imunofluorescência em criostato
(n=41), as técnicas de imuno-histoquímica em criostato (n=41),
imunofluorescência em parafina (n=37) e imuno-histoquímica em parafina
(n=37) (Anexo C).
Numa primeira análise, foi observado que, em criostato,
independentemente da técnica aplicada (imunofluorescência ou imuno-
histoquímica), o fragmento C4d é detectado em capilares glomerulares
(Figuras 3A e 3B). No entanto, quando utilizado cortes de parafina, em
nenhum caso houve marcação de C4d em glomérulos (Figuras 4A e 4B).
Apesar desta diferença de detecção observada em tecido de criostato versus
parafina, deve ser ressaltado que apenas a marcação em capilares
peritubulares foi considerada como positiva para o estudo. Neste ponto,
tanto em cortes de parafina como criostato, utilizando imunofluorescência ou
imuno-histoquímica, foi detectado fragmento C4d em capilares pericapilares.
Em criostato, a marcação foi mais intensa e mais nítida do que em parafina,
facilitando a interpretação do resultado.
Resultados
39
CRIOSTATO
Figura 3. REJEIÇÃO AGUDA. Detecção do fragmento C4d em criostato A. Imunofluorescência (padrão difuso, +++) (200x) B. Imuno-histoquímica (padrão difuso, +++) (200x)
PARAFINA
Figura 4. REJEIÇÃO AGUDA. Detecção do fragmento C4d em parafina A. Imunofluorescência (padrão difuso, +++) (200x) B. Imuno-histoquímica (padrão difuso, +++) (200x)
A técnica com maior índice de concordância com a
imunofluorescência em criostato (considerada padrão ouro) foi a imuno-
histoquímica em criostato, onde 31/41 (75,6%) casos apresentaram
3A 3B
4A 4B
Resultados
40
resultados coincidentes (Tabela 5). A técnica de imunofluorescência em
parafina também apresentou uma boa taxa de concordância (27/37 casos,
73%). Em contraste, na técnica de imuno-histoquímica em parafina, apenas
19/37 (51,4%) casos apresentaram concordância com a técnica de
imunofluorescência em criostato. O teste de correlação de Spearman
confirmou estes resultados (Tabela 6).
Tabela 5. Concordância entre a técnica de imunofluorescência em criostato e as demais técnicas (IF: imunofluorescência; IH: imuno-histoquímica)
IF - Criostato %
IH - Criostato 31/41 75,6%
IF - Parafina 27/37 73,0%
IH - Parafina 19/37 51,4% Tabela 6. Correlação entre a técnica de imunofluorescência em criostato e as
demais técnicas (teste de Spearman)
Correlação com IF-criostato p
IH-criostato r = 0,72 < 0,0001
IF-parafina r = 0,59 0,0001
IH-parafina r = 0,35 0,03
r: -1 (relação inversa) à +1 (prefeita relação/relação direta) IF: imunofluorescência; IH: imuno-histoquímica
Resultados
41
IV.2. Análise da positividade de C4d peritubular de acordo
com o diagnóstico histológico
Para as análises sobre a detecção do fragmento C4d, apenas os
resultados da técnica de imunofluorescência em criostato (padrão ouro)
foram considerados.
Numa primeira análise, as biópsias foram classificadas quanto à
expressão ou não do fragmento C4d e quanto ao score de positividade,
estabelecendo assim uma análise qualitativa (Tabela 7).
Das 41 biópsias submetidas à análise do fragmento C4d, 14 (34%)
foram positivas. O fragmento C4d foi detectado em 67% dos casos de
rejeição aguda e em 24% dos casos de nefropatia crônica do enxerto. Não
foi detectado fragmento C4d em biópsias do grupo Sem Rejeição.
No grupo RA, 2/8 (25%) casos positivos apresentaram score +++
(>50% dos capilares peritubulares), 5/8 (62,5%) casos apresentaram score
++ (10-50% dos capilares peritubulares) e 1/8 (12,5%) caso apresentou
score + (<10% dos capilares peritubulares). No grupo NCE, 1/6 (17%) caso
positivo foi classificado como +++, 1/6 (17%) como ++ e 4/6 (66%) como +.
Tabela 7. Positividade para o fragmento C4d em biópsias de enxerto renal (imunofluorescência em criostato)
Sem Rejeição RA NCE
n 4 12 25
C4d negativo 4 (100%) 4 (33%) 19 (76%)
C4d positivo
---
8 (67%)
+ = 1 (12,5%)
6 (24%)
+ = 4 (66%)
--- ++ =5 (62,5%) ++ = 1 (17%)
--- +++ = 2 (25%) +++ = 1 (17%)
Resultados
42
IV.3. Correlação entre a positividade para C4d e a evolução
clínica do transplante
Com o objetivo de investigar a correlação entre a expressão do
fragmento C4d e a evolução clínica do transplante, os casos estudados
foram divididos em C4d negativos (n = 27) e C4d positivos (n = 14) e foram
comparados quanto à intensidade da disfunção do enxerto no momento da
biópsia, as respostas ao tratamento, a evolução da função do enxerto renal e
a sobrevida do enxerto renal.
No momento da biópsia, a disfunção do enxerto renal, medida pelo
nível da creatinina, foi significantemente mais pronunciada no grupo C4d
positivo (5,5 ± 1,9 mg/dL vs 2,7 ± 0,5 mg/dL no grupo C4d negativo, p =
0,008) (Figura 5).
Figura 5. Nível da creatinina nos grupos C4d negativo e C4d positivo no momento
da biópsia do enxerto renal
C4d Negativo C4d Positivo
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
* p= 0,008
*
Cre
ati
nin
a s
éri
ca
(mg
/dL
)
Resultados
43
Na análise da resposta ao tratamento anti-rejeição empregado, cinco
casos de rejeição aguda com depósito de fragmento C4d (1 caso score + e 4
casos score ++) foram resistentes à corticoterapia e só responderam ao
tratamento com droga anti-linfocitária (OKT3). Os outros três casos C4d
positivos (1 caso score ++ e 2 casos score +++) apresentaram resistência ao
tratamento com droga anti-linfocitária (OKT3), evoluindo para a perda do
enxerto.
A evolução da função do enxerto renal foi avaliada pelos níveis
séricos de creatinina, ao longo de 3 anos pós-biópsia. Os níveis de
creatinina mantiveram-se constantemente mais elevados no grupo C4d
positivo em relação ao grupo C4d negativo e, após 3 anos, esta diferença foi
estatisticamente significante (p = 0,04) (Figura 6).
Figura 6. Creatinina sérica nos grupos C4d negativo e C4d positivo
-6 0 6 12 18 24 30 360
1
2
3
4
5
6
7
Negativo
Positivo
p=0,04
Tempo pós-biópsia(meses)
Cre
ati
nin
a s
éri
ca
(mg
/dL
)
Bx
Resultados
44
Para a análise da sobrevida do enxerto renal, foi avaliada a
porcentagem de enxertos funcionantes, em cada grupo, no período de 3
anos pós-biópsia, excluindo-se os óbitos com o enxerto funcionante. A
sobrevida do enxerto no grupo C4d positivo foi significantemente menor
quando comparado ao grupo C4d negativo (67% vs 96%, respectivamente;
p=0,01) (Figura 7).
Figura 7. Sobrevida do enxerto renal nos grupos C4d negativo e C4d positivo
IV.4. Análise da expressão dos linfócitos B
IV.4.1) Infiltrado de linfócitos B
A expressão de CD20+ foi detectada no citoplasma das células
positivas. A distribuição das células CD20+ ocorreu em dois padrões
distintos: padrão de células isoladas, caracterizado por células infiltrando o
interstício e os túbulos ou, padrão nodular caracterizado por infiltrado
0 6 12 18 24 30 360
20
40
60
80
100C4d negativo
C4d positivo
p=0,01
Tempo pós-biópsia(meses)
% E
nx
ert
o f
un
cio
na
nte
Bx
Resultados
45
celular focal e intenso no interstício renal, mais frequentemente na região
periglomerular, formando nódulos densos (Figura 8).
Figura 8. REJEIÇÃO AGUDA. Infiltrado de linfócitos B
A. Padrão de células isoladas (400x) B. Padrão nodular (400x)
IV.4.2) Expressão dos linfócitos B de acordo com o diagnóstico histológico
Das 107 biópsias analisadas, 58 (54%) apresentaram infiltrado de
linfócitos B. Dos casos CD20 positivos, 43/58 (74%) apresentaram células
CD20+ isoladas infiltrando o interstício renal, enquanto 15/58 (26%)
apresentaram padrão nodular. Nos grupos Normal e Sem Rejeição
nenhuma célula CD20+ foi detectada. Nos demais grupos foram detectadas
células CD20+ em número variável (Tabela 8).
A B
Resultados
46
Tabela 8. Expressão dos linfócitos B em biópsias de aloenxerto renal
Normal Sem Rejeição RA NCE
Casos CD20+ 0/10 (0%) 0/6 (0%) 30/43 (70%) 28/48 (58%)
CD20+ (cels/mm2) 0 0 70,2±19,8* 36,4±13,1#
Padrão nodular 0 0 9/30 (30%) 6/28 (21%)
*p< 0,01 vs Normal e Sem Rejeição #p< 0,05 vs Normal e Sem Rejeição
O número de células CD20+ nos casos de rejeição aguda (70,2 19,8
cels/mm2) e nos casos de nefropatia crônica do enxerto (36,4 ± 13,1
cels/mm2) foi significantemente maior comparado aos casos sem rejeição e
rim normal (p< 0,01 [RA] e p< 0,05 [NCE]). Nos casos de rejeição aguda, o
número de células CD20+ foi maior quando comparado aos casos de
nefropatia crônica do enxerto (70,2 19,8 vs 36,4 ± 13,1 cels/mm2,
respectivamente; ns).
No grupo RA, tanto o número de casos CD20 positivos, quanto o
número de células CD20+ foi maior nos casos de rejeição vascular
comparados aos casos de rejeição celular aguda (12/15 [80%] casos e 95,8
± 44,3 cels/mm2 vs 18/28 [62%] casos e 56,6 ± 19,2 cels/mm2,
respectivamente; ns) (Figura 9).
Resultados
47
Figura 9. Expressão de linfócitos B nas rejeições agudas Banff I e II
No grupo NCE, os casos com outras causas de NCE apresentaram
maior número de células CD20+ quando comparados aos casos com
evidências de nefrotoxicidade aos inibidores de calcineurina (43,8 ± 21,4 vs
26,1 ± 9,7 cels/mm2, respectivamente; ns). Excluindo-se os casos de
nefrotoxicidade por inibidores de calcineurina, o número de células CD20+
variou proporcionalmente à gravidade da NCE, sendo numericamente maior
nos casos com nefropatia crônica do enxerto grave (NCE discreta: 19,7 ±
12,1 cels/mm2, NCE moderada: 35,6 ± 17,0 cels/mm2, NCE grave: 66,5 ±
48,6 cels/mm2; ns) (Figura 10).
Banff I Banff II0
25
50
75
100
125
150
Lin
fóc
ito
s B
( ce
ls/m
m2)
Resultados
48
Figura 10. Expressão de linfócitos B nos diferentes grupos de nefropatia crônica
do enxerto
Analisando-se o período pós-transplante em que foi detectado o
padrão nodular nos casos de rejeição aguda, não houve diferença quando
comparado ao padrão de células isoladas (40 ± 11 vs 32 ± 9 dias,
respectivamente; ns). Na NCE, apesar do padrão nodular ocorrer mais
tardiamente do que o padrão de células isoladas, esta diferença não foi
estatisticamente significativa (1225 ± 392 vs 904 ± 211 dias,
respectivamente; ns)
Nef
roto
x iC
N
NCE d
iscr
eta
NCE m
oderad
a
NCE g
rave
0
25
50
75
100
125
150
Lin
fóc
ito
s B
(ce
ls/m
m2)
Resultados
49
IV.5. Correlação entre a expressão de linfócitos B e a
evolução clínica do transplante
Com o objetivo de investigar a correlação entre a expressão dos
linfócitos B e a evolução clínica do transplante, os casos estudados foram
divididos em CD20 negativos (n = 49) e CD20 positivos (n = 58), e estes em
padrão de células isoladas (n = 43) e padrão nodular (n = 15). Estes grupos
foram comparados quanto à intensidade da disfunção do enxerto no
momento da biópsia, a evolução da função do enxerto renal e a sobrevida do
enxerto renal.
No momento da biópsia, a disfunção do enxerto renal, medida pelo
nível da creatinina, foi semelhante entre os grupos CD20 positivo e CD20
negativo (3,98 ± 0,61 mg/dL vs 3,70 ± 0,67 mg/dL, respectivamente; ns) e,
entre os grupos padrão de células isoladas e CD20 negativo (3,43 ± 0,47
mg/dL vs 3,70 ± 0,67 mg/dL, respectivamente; ns). Apesar da disfunção do
enxerto ter sido numericamente mais pronunciada no grupo padrão nodular
comparado ao grupo CD20 negativo, esta diferença não foi estatisticamente
significativa (5,34 ± 1,75 mg/dL vs 3,70 ± 0,67 mg/dL, respectivamente; ns)
(Figura 11).
Resultados
50
Figura 11. Nível da creatinina de acordo com a presença e o padrão do infiltrado de
linfócitos B no momento da biópsia
A evolução da função do enxerto renal foi avaliada pelos níveis
séricos de creatinina, ao longo de 3 anos pós-biópsia. Os níveis de
creatinina mantiveram-se semelhantes nos grupos CD20 negativo e CD20
positivo, ao longo dos 3 anos (Figura 12).
Figura 12. Creatinina sérica nos grupos CD20 negativo e CD20 positivo
-6 0 6 12 18 24 30 360
1
2
3
4
5
6
7
CD20 Negativo
CD20 Positivo
Tempo pós-biópsia(meses)
Cre
ati
nin
a s
éri
ca
(mg
/dL
)
Bx
Negativo Positivo Isolado Nodular0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Cre
ati
nin
a s
éri
ca
(mg
/dL
)
Resultados
51
Apesar dos níveis de creatinina manterem-se constantemente mais
elevados no grupo padrão nodular em relação ao grupo CD20 negativo, esta
diferença não foi estatisticamente significante (p = 0,10) (Figura 13).
Figura 13. Creatinina sérica nos grupos CD20 negativo e padrão nodular
A evolução dos níveis de creatinina no grupo padrão nodular foi
significativamente maior comparado ao grupo padrão de células isoladas (p=
0,01) (Figura 14).
Figura 14. Creatinina sérica nos grupos padrão de células isoladas e padrão nodular
-6 0 6 12 18 24 30 360
1
2
3
4
5
6
7
CD20 Negativo
Padrão Nodular
p= 0,10
Tempo pós-biópsia(meses)
Cre
ati
nin
a s
éri
ca
(mg
/dL
)
Bx
-6 0 6 12 18 24 30 360
1
2
3
4
5
6
7Padrão Isolado
Padrão Nodular
p= 0,01
Tempo pós-biópsia(meses)
Cre
ati
nin
a s
éri
ca
(mg
/dL
)
Bx
Resultados
52
Para a análise da sobrevida do enxerto renal, foi avaliada a
porcentagem de enxertos funcionantes, em cada grupo, no período de 3
anos pós-biópsia, excluindo-se os óbitos com o enxerto funcionante. Não
houve diferença na sobrevida do enxerto renal entre os grupos CD20
positivo e CD20 negativo (76% vs 89%, respectivamente; ns) (Figura 15).
Porém, a sobrevida do enxerto renal foi significantemente menor no grupo
padrão nodular, quando comparado aos grupos CD20 negativo (61% vs
89%, respectivamente; p= 0,03) e padrão de células isoladas (61% vs 87%,
respectivamente; p= 0,03) (Figuras 16 e 17).
Figura 15. Sobrevida do enxerto renal nos grupos CD20 negativo e CD20 positivo
0 6 12 18 24 30 360
20
40
60
80
100
CD20 negativo
CD20 positivo
Tempo pós-biópsia(meses)
% E
nx
ert
o f
un
cio
na
nte
Bx
Resultados
53
Figura 16. Sobrevida do enxerto renal nos grupos CD20 negativo e padrão nodular
Figura 17. Sobrevida do enxerto renal nos grupos padrão isolado e padrão nodular
0 6 12 18 24 30 360
20
40
60
80
100
CD20 negativo
Padrão nodular
p= 0,03
Tempo pós-biópsia(meses)
% E
nx
ert
o f
un
cio
na
nte
Bx
0 6 12 18 24 30 360
20
40
60
80
100
Padrão nodular
Padrão isolado
p= 0,03
Tempo pós-biópsia(meses)
% E
nx
ert
o f
un
cio
na
nte
Bx
Resultados
54
IV.6. Análise do infiltrado plasmocitário de acordo com o
diagnóstico histológico
Na pesquisa de plasmócitos, foi observada com certa frequência uma
marcação no epitélio tubular, porém esta marcação foi considerada
inespecífica. A positividade para os plasmócitos foi detectada na membrana
citoplasmática (Figura 18).
Figura 18 (A e B): REJEIÇÃO AGUDA. Plasmócitos presentes no infiltrado intersticial (400x)
Das 41 biópsias analisadas, 24 (59%) apresentaram infiltrado de
plasmócitos. No grupo Sem Rejeição em apenas um caso células CD138+
foram detectadas. Nos demais grupos foram detectadas células CD138+ em
número variável (Tabela 9).
B A
Resultados
55
Tabela 9. Expressão dos plasmócitos em biópsias de aloenxerto renal e a relação entre plasmócitos e linfócitos B (CD20+)
Sem Rejeição RA NCE
Casos CD138+ 1/4 (25%) 10/12 (83%) 13/25 (52%)
CD138+ (cels/mm2) 12±7 22±12 18±12
CD138+/CD20+ (%) --- 17% 27%
O número de células CD138+ foi maior nos casos de rejeição aguda
quando comparado aos casos de nefropatia crônica do enxerto (22 12 vs
18 ± 12 cels/mm2, respectivamente; ns).
No grupo RA, o número de células CD138+ foi maior nos casos de
rejeição vascular comparados aos casos de rejeição celular aguda (49,1 ±
17,4 vs 3,5 ± 1,3 cels/mm2, respectivamente; ns) (Figura 19).
Figura 19. Expressão de plasmócitos nas rejeições agudas Banff I e II
Banff I Banff II0
10
20
30
40
50
Pla
sm
óc
ito
s(c
els
/mm
2)
Resultados
56
IV.7. Correlação entre a expressão de plasmócitos e a
evolução clínica do transplante
Com o objetivo de investigar a correlação entre a expressão dos
plasmócitos e a evolução clínica do transplante, os casos estudados foram
divididos em CD138 negativos (n = 17) e CD138 positivos (n = 24). Estes
grupos foram comparados quanto à intensidade da disfunção do enxerto no
momento da biópsia, a evolução da função do enxerto renal e a sobrevida do
enxerto renal.
No momento da biópsia, a disfunção do enxerto renal, medida pelo
nível da creatinina, foi semelhante nos grupos CD138 positivo e CD138
negativo (3,93 ± 1,07 mg/dL vs 3,19 ± 0,95 mg/dL, respectivamente; ns)
(Figura 20).
Figura 20. Nível da creatinina de acordo com a presença do infiltrado de plasmócitos
no momento da biópsia
Negativo Positivo
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Cre
ati
nin
a s
éri
ca
(mg
/dL
)
Resultados
57
A evolução da função do enxerto renal foi avaliada pelos níveis
séricos de creatinina, ao longo de 3 anos pós-biópsia. Apesar dos níveis de
creatinina manterem-se constantemente mais elevados no grupo CD138
positivo em relação ao grupo CD138 negativo, esta diferença foi significativa
do ponto de vista estatístico apenas um ano pós-biópsia (3,28 ± 0,64 mg/dL
vs 2,23 ± 0,85 mg/dL no grupo CD138 negativo; p=0,01) (Figura 21).
Figura 21. Creatinina sérica nos grupos CD138 negativo e CD138 positivo
Para a análise da sobrevida do enxerto renal, foi avaliada a
porcentagem de enxertos funcionantes no período de 3 anos pós-biópsia,
excluindo-se os óbitos com o enxerto funcionante. Não houve diferença na
sobrevida do enxerto renal entre os grupos CD138 positivo e CD138
negativo (85% vs 93%, respectivamente; ns) (Figura 22).
-6 0 6 12 18 24 30 360
1
2
3
4
5
6
7
Negativo
Positivo
Tempo pós-biópsia(meses)
Cre
ati
nin
a s
éric
a(m
g/d
L)
* p= 0,01 (1 ano pós-biópsia)
Bx
Resultados
58
Figura 22. Sobrevida do enxerto renal nos grupos CD138 negativo e CD138 positivo
IV.8. Correlação entre plasmócitos e o infiltrado de
células CD20+
Com o objetivo de analisar o infiltrado de linfócitos B (de acordo com o
seu estágio final de diferenciação) foi estudada a correlação entre o infiltrado
plasmocitário (CD138+) e a expressão de linfócitos B (CD20+). Para isto, os
casos estudados foram divididos em CD20 negativos (n = 11) e CD20
positivos (n = 30), e estes, em padrão de células isoladas (n = 22) e padrão
nodular (n = 8).
O número de plasmócitos (CD138+) infiltrando o interstício renal foi
significantivamente maior no grupo CD20 positivo comparado ao grupo
CD20 negativo (23,2 ± 11,0 cels/mm2 vs 3,9 ± 3,2 cels/mm2,
respectivamente; p= 0,01) e no grupo CD20+ padrão nodular comparado ao
0 6 12 18 24 30 360
20
40
60
80
100CD138 negativo
CD138 positivo
Tempo pós-biópsia(meses)
% E
nx
ert
o f
un
cio
na
nte
Bx
Resultados
59
grupo CD20+ padrão de células isoladas (70,6 ± 37,6 cels/mm2 vs 5,9 ± 2,2
cels/mm2, respectivamente; p= 0,03) (Figuras 23 e 24).
Figura 23. Expressão de plasmócitos nos grupos CD20+ negativo e CD20+ positivo
Figura 24. Expressão de plasmócitos nos grupos CD20+ padrão de células isoladas e
CD20+ padrão nodular
CD20 Negativo CD20 Positivo0
25
50
75
100
125
150
* p= 0,01
*Pla
sm
óc
ito
s(c
els
/mm
2)
CD20+ Isolado CD20
+ Nodular
0
25
50
75
100
125
150 * p= 0,03
*
Pla
sm
óc
ito
s(c
éls
/mm
2)
Resultados
60
IV.9. Correlação entre a positividade de C4d peritubular e a
expressão de linfócitos B (CD20+) e plasmócitos (CD138+)
Com o objetivo de analisar uma possível participação dos linfócitos B
e plasmócitos na rejeição humoral, foi estudada a correlação entre a
presença do fragmento C4d em capilares peritubulares e a expressão de
linfócitos B (CD20+) e plasmócitos (CD138+). Para isto, foram analisados os
41 casos submetidos à técnica de imunofluorescência em criostato para a
detecção do fragmento C4d, dos quais 14 (34%) foram C4d positivos e 27
(66%) foram C4d negativos.
IV.9.1) Correlação: C4d peritubular e infiltrado de linfócitos B (CD20+)
Dos 41 casos analisados, 30 (73%) foram CD20 positivos e 11 (27%)
CD20 negativos. Analisando a expressão de células CD20+ nos grupos C4d
positivo e C4d negativo, linfócitos B foram detectados em 14/14 (100%)
casos C4d positivos e em 16/27 (59%) casos C4d negativos (Figura 25).
Figura 25. Porcentagem dos casos CD20 positivos nos grupos C4d negativo e C4d positivo
0%
20%
40%
60%
80%
100%
CD20+
CD20+
CD20-
CD20-
100%
C4d Positivo C4d Negativo
Resultados
61
O número de células CD20+ foi significantemente maior no grupo C4d
positivo comparado ao grupo C4d negativo (155,0 ± 52,9 cels/mm2 vs 26,4 ±
6,8 cels/mm2, respectivamente; p= 0,001) (Figura 26).
Figura 26. Número de células CD20+ nos grupos C4d negativo e C4d positivo
Comparando o padrão de infiltrado de linfócitos B com o depósito
pericapilar de fragmento C4d, em 22/30 (73%) casos CD20 positivos
apresentaram o padrão de células isoladas e 8/30 (27%) casos CD20
positivos apresentaram o padrão nodular. Em 7/22 (32%) casos com
infiltrado de linfócitos B em padrão de células isoladas foram C4d positivos,
enquanto 7/8 (87%) casos com infiltrado nodular de linfócitos B foram C4d
positivos (Tabela 10).
C4d Negativo C4d Positivo0
50
100
150
200
250
300*p= 0,001
Cé
lula
s C
D2
0+
(ce
ls/m
m2)
Resultados
62
Tabela 10. Análise da expressão do fragmento C4d em relação ao padrão do infiltrado de linfócitos B
C4d
Negativo Positivo
CD20+ isolado (n=22) 15/22 (68%) 7/22 (32%)
CD20+ nodular (n=8) 1/8 (13%) 7/8 (87%)
IV.9.2) Correlação: C4d peritubular e infiltrado de plasmócitos (CD138+)
Dos 41 casos analisados, 24 (59%) foram CD138 positivos e 17 (41%)
CD138 negativos. Analisando a expressão de células CD138+ nos grupos
C4d positivo e C4d negativo, plasmócitos foram detectados em 12/14 (86%)
casos C4d positivos e em 12/27 (44%) casos C4d negativos (Figura 27).
O número de células CD138+ foi significativamente maior no grupo
C4d positivo comparado ao grupo C4d negativo (45,7 ± 22,5 cels/mm2 vs 3,6
± 1,4 cels/mm2, respectivamente; p= 0,002) (Figura 28).
Figura 27. Porcentagem dos casos CD138 positivos nos grupos C4d negativo e C4d positivo
0%
20%
40%
60%
80%
100% CD138
+
CD138-
CD138+
CD138-
86%
C4d Positivo C4d Negativo
Resultados
63
Figura 28. Número de células CD138+ nos grupos C4d negativo e C4d positivo
Finalmente, o teste estatístico de correlação (teste de Spearman)
confirmou uma correlação positiva entre a presença do fragmento C4d em
capilares peritubulares e a expressão de linfócitos B (CD20+) e plasmócitos
(CD138+) (Tabela 11).
Tabela 11. Correlação entre linfócitos B (CD20+ e CD138+) e fragmento C4d (teste de Spearman)
Correlação com C4d (Teste de Spearman)
p
CD20+ r = 0,57 <0,0001
CD138+ r = 0,51 0,0006
C4d Negativo C4d Positivo0
20
40
60
80
100
*p= 0,002
Cé
lula
s C
D1
38
+
(cle
s/m
m2)
Discussão
64
V. DISCUSSÃO
No transplante de órgãos, a perda do enxerto por rejeição ainda
representa uma importante barreira para se alcançar o sucesso total desta
modalidade terapêutica. O manejo imunológico pós-transplante, desde o seu
primórdio, foi tradicionalmente centrado nos mecanismos de rejeição ao
enxerto mediados por linfócitos T (PESCOVITZ et al., 2005).
Apesar da sobrevida do enxerto renal em 1 ano ter melhorado de modo
significativo com a introdução de novas drogas imunossupressoras, estes
agentes não foram capazes de bloquear algumas formas graves de rejeição
aguda, sugerindo que outros mecanismos efetores possam estar envolvidos
na rejeição ao aloenxerto renal (PESCOVITZ et al., 2005). Por esta razão,
nos últimos anos, uma maior atenção tem sido dada a novos marcadores,
em especial o fragmento C4d e os linfócitos B.
Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo principal analisar
a detecção do fragmento C4d e de linfócitos B no processo de rejeição ao
aloenxerto renal. Mais especificamente, analisar a detecção do fragmento
C4d por meio de quatro diferentes técnicas e o infiltrado de linfócitos B e
plasmócitos em biópsias de enxerto renal, correlacionando estes achados
com o depósito peritubular de C4d.
Vários experimentos foram realizados com o objetivo de padronizar o
uso de apenas um tipo de anticorpo para a pesquisa de C4d por meio das
técnicas de imunofluorescência e imuno-histoquímica, tanto em material
conservado em parafina como em material congelado. Entretanto, o
Discussão
65
anticorpo monoclonal anti-C4d (Quidel) reconhece o antígeno apenas em
fragmentos congelados (podendo ser usado por imunofluorescência ou
imuno-histoquímica), enquanto o anticorpo policlonal anti-C4d (Biomédica)
reage apenas com epítopos de fragmentos conservados em parafina
(também podendo ser usado tanto em imunofluorescência como em imuno-
histoquímica). Desta forma, a utilização destes dois anticorpos foi inevitável
na comparação das quatro técnicas, mesmo sabendo-se que a utilização de
dois diferentes anticorpos pode implicar na dificuldade de determinar se uma
maior sensibilidade de um grupo comparado ao outro deve-se à técnica
propriamente dita ou ao anticorpo utilizado. Esta mesma dificuldade em
empregar um único tipo de anticorpo também foi observada nos trabalhos de
Troxell e Seemayer, os quais utilizaram os mesmos dois anticorpos aqui
empregados para comparar as técnicas de imunofluorescência em criostato
e imuno-histoquímica em parafina (TROXELL et al., 2006; SEEMAYER et
al., 2007).
Os resultados obtidos com as diferentes técnicas de detecção do
fragmento C4d foram comparados quanto ao tipo de conservação do tecido
e quanto à concordância com a técnica de imunofluorescência em criostato,
considerada padrão-ouro para a detecção do fragmento C4d.
Analisando a marcação do C4d segundo o critério de conservação do
tecido, os fragmentos congelados mostraram uma marcação mais intensa e
nítida comparado aos fragmentos conservados em parafina, independente
da técnica e do anticorpo empregados. Tais resultados podem ser
decorrentes do processo de “mascaramento” dos epítopos durante a fixação
Discussão
66
do tecido em formol, enquanto que nos tecidos congelados os antígenos
mantém as características estruturais mais próximas do tecido “in vivo”
(BOENISCH et al., 2006; BOENISCH et al., 1999). Apesar do processo de
fixação em formol ajudar a conservar a histologia do tecido, este processo
altera a estrutura tridimensional das proteínas (BOENISCH et al., 1999).
Estas alterações podem resultar na modificação dos epítopos dos antígenos
e/ou em suas cargas eletrostáticas. A perda dos epítopos bem como a
redução das cargas elétricas pode impedir ou reduzir a afinidade da reação
imunológica, prejudicando assim o estudo (marcação) dos antígenos em
questão (BOENISCH et al., 1999). Isto também pode explicar o motivo pelo
qual apenas em tecido congelado, com certa freqüência, houve a marcação
do C4d em glomérulos. A presença desta marcação glomerular já foi descrita
anteriormente na literatura, sempre em tecidos congelados (FEUCHT et al.,
2005; SEEMAYER et al., 2007). Quando presente na região mesangial está
relacionada à ativação fisiológica do sistema complemento e nas alças
capilares está relacionada à toxicidade por inibidores de calcineurina,
síndrome hemolítica-urêmica ou à recorrência da glomerulonefrite (COLLINS
et al., 1999; FEUCHT et al., 2005; SEEMAYER et al., 2007).
Analisando a marcação do C4d segundo as técnicas empregadas, a
imuno-histoquímica em criostato e a imunofluorescência em parafina
mostraram uma boa taxa de concordância com a técnica de
imunofluorescência em criostato, enquanto a concordância da técnica de
imuno-histoquímica em parafina foi muito baixa (LUDOVICO-MARTINS et
al., 2009). A comparação destas quatro técnicas de detecção do fragmento
Discussão
67
C4d é inédita, e os poucos trabalhos que analisaram técnicas de detecção
do C4d compararam apenas as técnicas de imunofluorescência em criostato
e imuno-histoquímica em parafina (TROXELL et al., 2006; SEEMAYER et
al., 2007). Nestes casos, demonstraram que a técnica de imuno-
histoquímica em parafina é menos sensível do que a imunofluorescência em
criostato (TROXELL et al., 2006; SEEMAYER et al., 2007; SOLEZ et al.,
2008).
Os resultados demonstraram que as técnicas de imuno-histoquímica
em criostato e a imunofluorescência em parafina são boas alternativas à
técnica “gold standard” imunofluorescência em criostato para a pesquisa do
fragmento C4d. Neste contexto, deve ser considerado que a grande maioria
dos centros de transplante do Brasil tem disponíveis biópsias em parafina e
muito raramente biópsias de criostato. Além das limitações custo-
operacionais para o manuseio e conservação da biópsia de criostato (gel
para congelamento, nitrogênio líquido e freezer -70°C), o transporte deste
material para eventual realização da pesquisa de C4d em outro serviço é
extremamente complicado, pois depende de nitrogênio líquido ou gelo seco,
com grande risco de descongelamento e perda do material. Assim, investir
na imunofluorescência em parafina parece ser a alternativa mais apropriada
para a pesquisa do fragmento C4d, na ausência da disponibilidade da
análise “gold standard”.
Na segunda etapa do estudo foi feita a análise do fragmento C4d nas
biópsias de enxerto renal, de acordo com o seu diagnóstico histológico, e
sua correlação com a evolução clínica do transplante. Nesta etapa, foi
Discussão
68
utilizada apenas a técnica de imunofluorescência em criostato por ser
considerada padrão-ouro.
Analisando a detecção do fragmento C4d nas biópsias de enxerto
renal, não foi detectado C4d em capilar peritubular em nenhum dos casos-
controles (grupo Sem Rejeição). A prevalência do C4d nos casos de
rejeição aguda foi de 67%, semelhante à prevalência previamente descrita,
que varia de 21 a 75% (MAUIYYEDI et al., 2002b; FEUCHT et al., 2003;
MENGEL et al. 2005). Por outro lado, a prevalência de C4d na nefropatia
crônica do enxerto foi de apenas 24%, abaixo do encontrado na literatura
que varia de 34 a 62% (REGELE et al., 2002; DAVID-NETO et al., 2007). A
menor prevalência de C4d na nefropatia crônica do enxerto encontrada
neste trabalho, comparada à literatura, pode ser explicada pelo fato de que
50% dos casos de nefropatia crônica do enxerto incluídos neste estudo
estão relacionados à nefrotoxicidade crônica por inibidores da calcineurina e,
portanto, apenas um pequeno número destes casos possivelmente está
relacionado à rejeição crônica.
Vale ressaltar que, por se tratar de um estudo retrospectivo, os
fragmentos incluídos neste estudo foram obtidos num período em que não
fazia parte da rotina do transplante a pesquisa de anticorpos anti-doador no
soro do paciente no segmento pós-transplante e, portanto, o soro destes
pacientes e a referida pesquisa de anticorpos não estavam disponíveis para
a conclusão do diagnóstico de RMA. Sendo assim, as rejeições com
depósito peritubular de C4d foram aqui denominadas de rejeição C4d
positiva.
Discussão
69
Na análise clínica pós-transplante, a presença do fragmento C4d
peritubular se associou a formas mais graves de rejeição, com níveis de
creatinina mais elevados, assim como a uma menor sobrevida do enxerto
renal em 3 anos.
Em parte, esta evolução tão desfavorável dos casos C4d positivos
pode ser explicada pelo fato de se tratar de um estudo retrospectivo e, na
época em que as biópsias foram realizadas, a pesquisa de C4d não fazia
parte da rotina do serviço e consequentemente não se empregava o
tratamento específico para a rejeição C4d positivo. Esta evolução
desfavorável dos casos C4d positivos também foi demonstrada pelo trabalho
de Lederer e colaboradores, quando verificou-se que o fragmento C4d em
capilares peritubulares é um fator independente de pior sobrevida do enxerto
renal (LEDERER et al., 2001).
Estes resultados são importantes, pois reafirmam a necessidade da
pesquisa de C4d em biópsias de enxerto renal, contribuindo para o
diagnóstico de rejeição mediada por anticorpos. A falta da pesquisa do C4d
em casos de rejeição ao enxerto pode retardar ou até mesmo impedir o
diagnóstico deste tipo grave de rejeição, impedindo o emprego de um
tratamento mais agressivo e específico, implicando em última análise numa
pior evolução clínica do transplante com uma menor sobrevida do enxerto.
Sabendo que o fragmento C4d é marcador de rejeição mediada por
anticorpos e que os linfócitos B e plasmócitos são células envolvidas na
produção de anticorpos, o próximo passo do estudo foi analisar o infiltrado
de linfócitos B e plasmócitos em biópsias de enxerto renal.
Discussão
70
Para a pesquisa dos linfócitos B foi empregado o anticorpo anti-CD20,
um anticorpo específico para linfócitos B nos estágios de diferenciação
células pré-B, células B imaturas, células B maduras e células B de
memória. Levando-se em consideração que os dois primeiros estágios
(células pré-B e células B imaturas) ocorrem ao nível da medula óssea,
podemos dizer que em biópsias de enxerto renal, assim como em qualquer
outra região fora da medula óssea, este anticorpo é específico para linfócitos
B maduros e linfócitos B de memória.
A distribuição de linfócitos B nas biópsias renais ocorreu em dois
padrões distintos: padrão de células isoladas, caracterizado por células
esparsas infiltrando o interstício e padrão nodular caracterizado por
infiltrado celular focal e intenso no interstício renal, mais frequentemente na
região periglomerular, formando nódulos densos (LUDOVICO-MARTINS et
al., 2007).
A prevalência total de linfócitos B em biópsias de enxerto renal foi de
54% e, destes, 74% apresentaram infiltrado com padrão de células isoladas
e 26% padrão nodular. Em nenhum caso-controle (grupos Normal e Sem
Rejeição) foi detectado linfócitos B infiltrando o interstício renal. A
prevalência de linfócitos B na rejeição aguda foi de 70% e na nefropatia
crônica foi de 58%. Apesar de numericamente maior, não houve diferença
estatística no número de linfócitos B infiltrando o interstício renal no grupo
Rejeção Aguda comparado ao grupo Nefropatia Crônica do Enxerto.
Houve uma tendência na rejeição aguda, do número de linfócitos B ser maior
nos casos de rejeição Banff II comparado aos casos de rejeição Banff I,
Discussão
71
porém esta diferença não foi estatisticamente significativa. O mesmo ocorreu
na nefropatia crônica do enxerto, com um maior número de linfócitos B nos
casos graves, comparado aos casos moderados e, estes, comparados aos
casos discretos. Não há trabalhos na literatura que analisaram a prevalência
do infiltrado de linfócitos B em biópsias de enxerto renal, bem como a sua
presença de acordo com o diagnóstico histológico, entretanto é de se
esperar que, à exemplo dos linfócitos T, os linfócitos B estejam presentes
tanto na rejeição aguda, quanto na rejeição crônica e que o número de
células infiltrando o interstício esteja diretamente relacionado com a
gravidade do evento.
Do ponto de vista da evolução clínica do transplante, a presença dos
linfócitos B por si só não representou uma pior evolução do transplante
renal. Entretanto, analisando apenas os casos com o infiltrado nodular de
linfócitos B, a sobrevida do enxerto renal em três anos foi significantemente
menor comparado aos casos CD20 negativo e aos casos com o infiltrado de
células CD20+ em padrão de células isoladas.
A associação entre o infiltrado de linfócitos B e a evolução clínica
desfavorável do enxerto renal é controversa na literatura. Hippen e
colaboradores, analisando casos de rejeição celular aguda C4d negativo,
constataram que os casos com infiltrado de linfócitos B apresentaram pior
prognóstico, demonstrado por uma maior incidência de resistência à
corticoterapia e uma maior taxa de perda imunológica do enxerto (HIPPEN
et al., 2005). Estes achados foram confirmados posteriormente por Tsai e
colaboradores que, adicionalmente, observaram uma incidência maior de
Discussão
72
resistência não só aos corticóides, mas também ao tratamento com
timoglobulina, imunoglobulina hiperimune e plasmaferese (TSAI et al., 2006).
No entanto, outros grupos não encontraram uma associação entre a
presença de linfócitos B e pior prognóstico do enxerto renal, apesar destes
mesmos autores demonstrarem a presença dos linfócitos B na rejeição, não
descartando a possibilidade de uma possível contribuição dos linfócitos B no
mecanismo de rejeição (DORIA et al., 2006; BAGNASCO et al., 2007;
SCHEEPSTRA et al., 2008).
Levando-se em consideração os resultados deste trabalho, há uma
concordância com os resultados dos trabalhos de Hippen e Tsai, uma vez
que estes demonstraram que apenas o infiltrado de linfócitos B em padrão
nodular está associado à uma pior evolução clínica do transplante renal.
Mediante os resultados interessantes relacionados às células CD20+ no
transplante renal, partimos para a análise dos plasmócitos nas biópsias de
enxerto renal sem evidências de doença linfoproliferativa pós-transplante.
Os anticorpos anti-CD38, anti-CD138 e PCA-1 são marcadores de
plasmócitos. Entretanto, o PCA-1 não é específico de plasmócitos,
marcando também monócitos e granulócitos. A opção da utilização do
anticorpo anti-CD138 frente ao anticorpo anti-CD38 foi orientada pelo fato de
que, apesar de ambos serem específicos para plasmócitos, o CD38 possuir
menor expressão na superfície plasmocitária quando comparado ao CD138.
A prevalência total de plasmócitos em biópsias de enxerto renal foi de
59%. Em apenas um caso “sem rejeição” foi detectado plasmócitos. Em
contrapartida, 83% dos casos de rejeição aguda e 52% dos casos de
Discussão
73
nefropatia crônica do enxerto apresentaram infiltrado de plasmócitos. Assim
como nos linfócitos B, houve uma tendência na rejeição aguda do número de
plasmócitos ser maior nos casos de rejeição Banff II comparado aos casos
de rejeição Banff I, porém esta diferença não foi estatisticamente
significativa.
Na análise clínica pós-transplante, diferente do observado com relação
aos linfócitos B, não houve diferença estatisticamente significativa no nível
de creatinina no momento da biópsia. Em relação a evolução dos níveis de
creatinina ao longo de três anos, apesar dos níveis de creatinina
constantemente mais elevados nos casos com infiltrado plasmocitário
comparado aos casos negativos, esta diferença foi significativa do ponto de
vista estatístico apenas um ano pós-biópsia. Do ponto de vista da sobrevida
do enxerto renal, apesar de menor nos casos com infiltrado plasmocitário
comparado aos casos negativos, esta diferença também não foi significante
do ponto de vista estatístico. Estes resultados estão em concordância com o
trabalho de Gärtner, o qual demonstrou que, apesar dos plasmócitos
possivelmente participarem de alguma forma nos mecanismos de rejeição
ao enxerto renal demonstrado pela presença do infiltrado plasmocitário
nestes casos, a presença de plasmócitos no infiltrado não é marcador de
pior prognóstico (GÄRTNER et al., 2006).
Na linfopoiese, sob estímulos específicos, os linfócitos B se diferenciam
em plasmócitos. De fato, a análise destes componentes celulares no
infiltrado das biópsias renais demonstrou que o número de linfócitos B foi
significantemente mais elevado do que o número de plasmócitos, atingindo
Discussão
74
índices de CD138+/CD20+ de 17% (na rejeição aguda) à 27% (na nefropatia
crônica do enxerto).
A quarta etapa do estudo foi analisar uma possível participação dos
linfócitos B e plasmócitos na rejeição C4d positivo, uma vez que o fragmento
C4d é marcador de rejeição mediada por anticorpos e os linfócitos B e
plasmócitos são células relacionadas à produção de anticorpos. Para isto,
estudou-se a correlação dos infiltrados de linfócitos B e plasmócitos com o
depósito do fragmento C4d em capilares peritubulares.
Na análise dos linfócitos B, contatou-se que em todos os casos com
depósito peritubular de C4d houve infiltrado de linfócitos B, enquanto que
apenas na metade dos casos C4d negativo houve infiltrado de linfócitos B e
que o número de linfócitos B infiltrando o interstício renal foi
significantemente maior no grupo C4d positivo comparado ao grupo C4d
negativo. Outro achado interessante foi que 7 dos 8 casos (87%) com
infiltrado nodular de linfócitos B foram C4d positivo. Estes resultados são
inéditos na literatura e demonstram uma estreita relação entre o infiltrado de
linfócitos B com o depósito peritubular de C4d.
Resultados semelhantes foram encontrados na análise da associação
entre o infiltrado plasmocitário e o depósito em capilares peritubulares do
fragmento C4d. Em 86% dos casos C4d positivos houve infiltrado
plasmocitário, enquanto que em apenas 44% dos casos C4d negativos
foram detectados plasmócitos. O número de plasmócitos infiltrando o
interstício renal foi significantemente maior no grupo C4d positivo comparado
ao grupo C4d negativo. Estes resultados corroboram o estudo de Xu e
Discussão
75
colaboradores que demonstraram uma correlação entre o infiltrado
plasmocitário e o depósito peritubular de C4d (XU et al., 2008) e, mais
recentemente, o estudo de Martin e colaboradores que demonstraram uma
associação entre o infiltrado plasmocitário, o depósito peritubular de C4d e a
presença de anticorpos anti-doador circulantes em 10 pacientes com
disfunção crônica do enxerto renal (MARTIN et al., 2009).
Por fim, o teste estatístico de correlação (teste de Spearman)
confirmou uma correlação positiva entre a presença do fragmento C4d em
capilares peritubulares e a expressão de linfócitos B e plasmócitos em
biópsias de enxerto renal.
A partir destes resultados podemos especular que a rejeição C4d
positiva envolva além do mecanismo já conhecido de produção sistêmica de
anticorpos anti-doador, a possibilidade de produção de anticorpos in situ. A
maior produção local de anticorpos provavelmente estaria relacionada com a
presença de linfócitos B e plasmócitos no infiltrado renal. Esta possível
oferta adicional de anticorpos levaria à ativação local da via clássica do
sistema complemento com a consequente deposição do fragmento C4d no
capilar peritubular. Esta seria uma possível explicação para algumas formas
de rejeição C4d positiva nas quais não se detecta a presença de anticorpos
circulantes anti-doador, formas estas que evoluem desfavoravelmente e
provavelmente estão associadas à presença de linfócitos B e plasmócitos.
Conclusões
76
VI. CONCLUSÕES
1. A pesquisa do fragmento C4d em biópsias de enxerto renal pode ser
realizada em material de criostato ou parafina, tanto pela técnica de
imunofluorescência quanto pela técnica de imuno-histoquímica. As
técnicas de imuno-histoquímica em criostato e a imunofluorescência
em parafina são as melhores alternativas à técnica “gold standard”
imunofluorescência em criostato.
2. A prevalência total de C4d foi de 34% dos casos. Em 67% dos casos
de rejeição aguda e em 24% dos casos de nefropatia crônica do
enxerto houve depósito peritubular de C4d. A presença do C4d
peritubular associou-se a uma pior evolução clínica do transplante.
3. A prevalência total dos linfócitos B foi de 54% dos casos. Em 70% dos
casos de rejeição aguda e em 58% dos casos de nefropatia crônica
do enxerto houve infiltrado de linfócitos B. A presença de linfócitos B
esteve associada a uma pior evolução clínica do transplante.
4. A presença do fragmento C4d peritubular correlacionou-se com a
presença de linfócitos B e plasmócitos em biópsias renais, sugerindo
que estas células responsáveis pela produção de anticorpos possam
desempenhar um papel na ativação in situ do sistema complemento.
Anexos 77
VII. ANEXOS
VII.1. Anexo A
Última atualização da classificação de Banff para Patologia Renal (classificação de Banff’07).
(Solez et al., 2008)
Anexos 78
VII.2. Anexo B
Carta de aprovação do estudo pela Comissão de Ética em Pesquisa – CAPPesq-HC, do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
Anexos 79
VII.3. Anexo C
Dados clínicos, scores da marcação do C4d utilizando as 4 diferentes técnicas de marcação do fragmento C4d e follow-up dos 41 casos inclusos no estudo.
RA: rejeição aguda; NCE: nefropatia crônica do enxerto; M: masculino; F: feminino; B: branco; P: pardo; N: negro; Tx: transplante; DVR: doador vivo relacionado; DVNR: doador vivo não-relacionado; Bx: biópsia; POD: pós-operatório (dia); CrS: creatinina sérica; neg: negativo.
Criostato Parafina
Caso (No)
Diagnóstico Idade (anos)
Gênero Raça Re-Tx Doador Tempo Bx (POD)
CrS (na Bx)
IF IHC IF IHC Evolução do Enxerto
1 Sem Rejeição 57 F B não DVR 168 1,9 neg neg neg +
2 Sem Rejeição 33 M B não DVR 58 2,0 neg neg neg neg
3 Sem Rejeição 47 M B não Falecido 141 1,6 neg neg neg neg
4 Sem Rejeição 28 M N não DVR 40 8,4 neg neg neg +
5 RA 42 M P não DVNR 5 12,8 neg +++ neg neg
6 RA 48 M B não Falecido 22 3,1 ++ ++ ++ ++
7 RA 39 M N não DVR 14 2,2 neg neg neg ++ óbito
8 RA 25 M B não DVR 60 2,1 + + neg neg
9 RA 55 M B sim Falecido 37 4,6 +++ +++ +++ ++ perdeu enxerto
10 RA 30 M B não DVR 2868 22,9 +++ +++ +++ +++ perdeu enxerto
11 RA 44 M P não DVNR 28 2,7 neg neg neg neg
12 RA 51 M B não DVNR 7 2,9 neg neg ++ +
13 RA 45 M P não DVNR 30 2,4 ++ + ++ neg
14 RA 55 M B sim falecido 50 3,6 ++ ++ neg neg perdeu enxerto
15 RA 70 M B sim DVNR 23 3,3 ++ ++ ++ ++ óbito
16 RA 45 M P não DVNR 30 1,9 ++ + ++ ++
17 NCE 57 F B não falecido 217 1,5 neg neg neg +
18 NCE 51 M B não DVR 1188 1,5 neg neg neg neg
19 NCE 50 M B não falecido 734 1,9 neg neg neg neg
20 NCE 23 M N não DVR 146 2,0 neg neg neg neg
21 NCE 28 M P não DVR 260 2,1 ++ neg ++ neg
22 NCE 52 M P não DVR 695 2,0 neg neg neg neg
23 NCE 19 F B não DVR 630 1,6 + neg neg +
24 NCE 43 F B não DVNR 1703 1,4 neg neg neg ++
Anexos 80
VII.3. Anexo C
Dados clínicos, scores da marcação do C4d utilizando as 4 diferentes técnicas de marcação do fragmento C4d e follow-up dos 41 casos inclusos no estudo (continuação).
RA: rejeição aguda; NCE: nefropatia crônica do enxerto; M: masculino; F: feminino; B: branco; P: pardo; N: negro; Tx: transplante; DVR: doador vivo relacionado; DVNR: doador vivo não-relacionado; Bx: biópsia; POD: pós-operatório (dia); CrS: creatinina sérica; neg: negativo.
Criostato Parafina
Caso (No)
Diagnóstico Idade (anos)
Gênero Raça Re-Tx Doador Tempo Bx (POD)
CrS (na Bx)
IF IHC IF IHC Evolução do Enxerto
25 NCE 48 M B não DVR 1395 3,0 + ++ neg +
26 NCE 28 F B não falecido 1233 4,1 + ++ neg neg
27 NCE 17 M B não DVR 2285 14,5 +++ +++ +++ ++ perdeu enxerto
28 NCE 45 M B não DVNR 2088 2,3 neg neg neg neg
29 NCE 55 M B não DVR 133 1,7 neg + + +
30 NCE 51 M B não DVNR 840 2,1 neg neg neg neg
31 NCE 49 F B não DVR 1184 1,4 neg neg neg neg
32 NCE 31 F B não DVR 2112 1,4 neg neg - -
33 NCE 44 M B não falecido 678 1,3 neg neg - -
34 NCE 51 M B não DVNR 534 2,1 neg neg neg neg
35 NCE 21 M B sim falecido 264 2,1 neg neg neg + perdeu enxerto 36 NCE 53 M P não falecido 2394 2,7 + neg - - perdeu enxerto 37 NCE 19 M B sim DVR 1153 2,3 neg + + neg
38 NCE 48 M B sim falecido 2800 2,1 neg neg ++ ++ perdeu enxerto
39 NCE 33 M B não DVR 224 2,6 neg neg neg +
40 NCE 36 M B não DVR 441 2,0 neg neg - -
41 NCE 50 F B não falecido 272 2,0 neg neg ++ +
Referências 81
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