Histórico, elaboração e conteúdo da proposta de instrução normativa para

inoculantes micorrízicos

Orivaldo José Saggin JúniorEmbrapa Agrobiologia, Seropédica, RJ orivaldo.saggin@embrapa.br

Introdução

Havia necessidade da legislação viabilizar

registro de inoculantesmicorrízicos

Pesquisadores não tinham claro como

modificar/atender a legislação

xTécnicos do MAPA desconheciam as características da

multiplicação de FMAs

HistóricoTudo começou com ótimos dados de pesquisa....

S. hetA. mor N.I.S. pelG. cla

Altura final de A. mangium inoculadas com FMAs Altura final de A. holosericea inoculadas com FMAs

S. hetA. mor N.I.S. cal

Altura final de A. auriculiformis inoculadas com FMAs

S. hetA. mor N.I.S. cal G. claE. con E. col

Altura final de A. mangium co-inoculadas com FMAs e fECTO

S. cal+ S. het+ O64A. mor+ S. cal+ S. het S. cal+ S. het N.I.A. mor

Altura final de A. auriculiformis co-inoculadas com FMAs e fECTO

N.I.S. cal+ O64 A. mor+ S. cal+ S. het+ O64 A. mor+ S. cal+ O64

Altura final de A. holosericea co-inoculadas com FMAs e fECTO

N.I.A. mor+ S. cal+ S. het+ O64 A. mor+ S. cal+ S. hetS. cal+ S. het+ O64

Será realizado de 2 a 4 de julho de 2013, oworkshop Microrganismos na agricultura:potencial, aplicação e regulamentações,promovido pela Rede Dimiagri – projetoiberoamericano que.......verificamos que háuma heterogeneidade na legislação – e oBrasil é um dos países mais rígidos emtermos de comercialização demicrorganismos", cita Kátia Regina Teixeira,pesquisadora da Embrapa Agrobiologia.

• Adriana Mayumi Yano-Melo -Universidade Federal do Vale do São Francisco; • Arnaldo Colozzi Filho - Instituto Agronômico do Paraná; • Camila Maistro Patreze - Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro; • Eliane Maria Ribeiro da Silva - Embrapa Agrobiologia; • Leonor Costa Maia - Universidade Federal de Pernambuco; • Marco Aurélio Carbone Carneiro - Universidade Federal de Lavras; • Maria Catarina Megumi Kasuya - Universidade Federal de Viçosa; • Orivaldo Jose Saggin Junior, coordenador - Embrapa Agrobiologia; • Sidney Luiz Stürmer - Universidade Regional de Blumenau e• Vera Lucia Divan Baldani - Embrapa Agrobiologia

Grupo Micorrizas

O grupo é aberto a qualquer

micorrizólogo que tenha disposição

de tempo e vontade de colaborar

INSTRUÇÃO NORMATIVA Nº 30, DE, 12 DE NOVEMBRO DE 2010

Art. 1º Estabelecer os métodos oficiais para análise de inoculantes, sua contagem, identificação e análise de pureza na forma desta Instrução Normativa.

Enfoque 2013-2014: modificar a IN 30

1ª reunião presencial do Grupo Micorrizas em 17/09/2014

• Propor uma Instrução Normativa Nova específica para método de análise de inoculantes de Glomeromycota

• Incluir nesta instrução método de identificação morfológica de FMAse os inoculantes baseados em solo-inóculo => Biofertilizantes

• Convidar para o grupo mais alguns micorrizólogos

• Modificar a Instrução Normativa 13 de 2011 para atender inoculantesde fungos micorrízicos

• Complexa

• Análise de pureza para inoculantes (fungos e bactérias)

• Análises de ervas espontâneas, fungos, nematóides e ácaros (fitopatogênicos, fitófagos ou de importância quarentenária) nos biofertilizantes

• Análise de coliformes, ovos de helmintos e Salmonella

• Além das metodologias de quantificação de propágulos, colonização e identificação taxonômica de FMAs

Enfoque 2015: IN exclusiva para FMAs

IN de métodos biológicos para Inoculantes e biofertilizantes

Proposta enviada ao MAPA em 08 de janeiro de 2016

Reunião em conjunto do Grupo Micorrizascom os Técnicos do MAPA

Reunião no MAPA em 18/05/2016

Foi possível compartilhar conhecimentos e entendimentos entre os micorrizólogos e técnicos do MAPA

Foi esclarecido que todas as IN devem ser baseadas nas definições da Lei nº 6.894, DE 16/12/1980 e do Decreto nº 4.954, de 14/01/2004

De forma que os produtos baseados em solo-inóculo não poderiam ser designados de “biofertilizantes”

Lei 6894 => divide os produtos em seis grupos grupos

• Fertilizantes

• Corretivos

• Inoculantes

• biofertilizantes ou estimulantes

• Remineralizadores

• Substratos para plantas

(redação dada pela Lei nº 12890, de 2013)

Inoculantes: substância que contenha microrganismos com a atuação favorável ao desenvolvimento vegetal

Biofertilizante: produto que contenha princípio ativo apto a melhorar o desenvolvimento das plantas

Lei nº 6.894, DE 16/12/1980

Decreto nº 4.954, de 14/01/2004

Conteúdo da proposta de IN para inoculantes micorrízicos

Estabelece métodos oficiais para:

• análise quanto à presença de organismos não especificados;

• quantificação dos propágulos de FMAs;

• mensuração da colonização micorrízica e

• identificação taxonômica dos FMAs

Lei nº 6.894, DE 16/12/1980

Decreto nº 4.954, de 14/01/2004

Decreto 4954 => Define tipos de produtos(redação dada pelo Decreto nº 8.384, de 2014)

• 14 tipos de fertilizantes

• 04 tipos de corretivos, entre eles condicionador de solo

• Inoculantes (não define tipos) mas define que devem ter “ausência de qualquer tipo de microrganismos que não sejam os especificados”

• Define biofertilizante como possuidor de princípio ativo ou agente orgânico capaz de atuar elevando a produtividade das plantas, sem ter em conta o seu valor hormonal ou estimulante;

“agente orgânico” não interpretado como um “agente biológico” e sim como um “agente de natureza química”

• Mudar o decreto 4954 é um processo moroso e inviável no momento

• Como meio mais rápido para a viabilizar produtos com FMAs:

Enxugar a IN proposta para atender apenas os inoculantes de FMAsaxênicos (Cuja pureza atenda ao Decreto 4954);

Propor modificações na IN nº 13 de 24/03/2011 para atender inoculantes de FMAs

Propor modificações na IN nº 35 de 04/07/2006, a qual já está sendo modificada pelo MAPA, incorporando os produtos a base de solo-inóculo como condicionador de solo

Principais orientações após a Reunião no MAPA

Definição de condicionador de solo no Decreto 4954:produto que promove a melhoria das propriedades físicas, físico-químicas ou atividade biológica do solo

Reunião com os Técnicos do MAPA na Embrapa Agrobiologia

Diretor do DFIA/SDA André Felipe Carrapatoso Peralta da Silva e com o Coordenador da CFIC/DFIA/SDA Hideraldo José Coelho

Reunião na Embrapa Agrobiologia 29/09/2016

Entrega formal da IN de inoculantes de FMAs e das sugestões de modificações da IN 13

Principais orientações após a Reunião na Embrapa

• Existe possibilidade de alteração do Decreto Nº 4.954 diante da postura desburocratizante do novo Ministro da Agricultura

• O caminho para isso seria que as modificações necessárias fossem encaminhadas para o Ministro por Associações ou Sociedades (ANPII -Associação Nacional dos Produtores e Importadores de Inoculantes; RELARE; Sociedade Brasileira de Ciência do Solo; Sociedade Brasileira de Microbiologia; e outras)

• As sociedades e associações aprovariam um documento único pedindo ao Ministro da Agricultura a modificação desse Decreto.

Reunião na FertBio 2016 dia 18/10/2016

• Apesar da possilidade de modificação do Decreto Nº 4.954 devemos continuar avaliando e propor modificações da IN 35 de condicionador de solo para atender os produtos a base de solo-inóculo;

• Sugerir as modificações do Decreto Nº 4.954 DE 14/01/2004 e buscar o apoio das Sociedades para seu encaminhamento para o MAPA.

V - inoculante: produto que contém microorganismos com atuação favorável ao crescimento de plantas, sendo: entendendo-se como:

a) suporte: material excipiente e esterilizado, livre de contaminantes segundo os limites estabelecidos, que acompanha os microorganismos e tem a função de suportar ou nutrir, ou ambas as funções, o crescimento e a sobrevivência destes microorganismos, facilitando a sua aplicação; e

b) pureza do inoculante: ausência de qualquer tipo de microorganismos que não sejam os especificados;

Inoculante de Bactérias fixadoras de NitrogênioInoculante de Microrganismos promotores de crescimento vegetalInoculante de Microrganismos solubilizadores de fosfatoInoculante de Fungos Micorrízicos ArbuscularesInoculante de Outros Fungos MicorrízicosInoculantes mistos

Conteúdo da proposta de IN

Capítulo III – QUANTIFICAÇÃO DOS PROPÁGULOS DE FMAs:

I – contagem de esporos no biofertilizante ou inoculante eII – bioensaio de número mais provável (NMP) de propágulos infectivos

Capítulo III – MENSURAÇÃO DA COLONIZAÇÃO MICORRÍZICA

I – bioensaio de infectividade micorrízica (Avalia a colonização micorrízica primáriapromovida exclusivamente pelos propágulos iniciais do inoculante)

Capítulo IV – IDENTIFICAÇÃO TAXONÔMICA DOS FMAs

I – Técnicas de biologia molecularII – Pela morfologia dos esporos

Capítulo I – ORGANISMOS NÃO ESPECIFICADOS NO RÓTULO DO INOCULANTE(PUREZA DO INOCULANTE):

método de espalhamento em placas de uma diluição seriadaMeio para Bactéria =>ANMeio para fungos => BDA

Pureza do inoculante por espalhamento em placas de diluição seriada decimal de duas subamostras

10-2 10-3 10-4 10-5

10-2 10-3 10-4 10-5

subamostra “A”

subamostra “B”

Placas testemunhas(0,1mL de solução de NaCl a 0,85%)

subamostra “A”

10-2 10-3 10-4 10-5

10-2 10-3 10-4 10-5subamostra “B”

Placas testemunhas(0,1mL de solução de NaCl a 0,85%)

Meio ágar-nutriente (AN)pH=6,5

0,1mL de cada diluição

Meio batata dextrose-ágar (BDA) pH=5,6

0,1mL de cada diluição

Incubação das placas

28°C a 30°C

48h (2° dia) 3° dia 4° dia 5° dia 10° dia... até

Contar o número de colônias na diluição que apresentar 30 a 300 colônias por placa

UFC/mL ou g de inoculante = Número médio de colônias nas placas x 10diluição escolhida para contagem (no formato 10-2 a 10-5)

Resultado: média das subamostras “A” e “B” para cada meio (AN e BDA)

Limite de contaminação: o inoculante não deverá apresentar desenvolvimento de microrganismos não especificados na diluição 10-5,

conforme IN 13

Três alíquotas de 5% da capacidade da embalagem. Não extrapolando a faixa de 1-100 mL ou gramas

Agita com 500 mL de água em liquidificador

Passa-se a mistura em jogo de peneiras

0,710 mm

0,053mm

Contagem de esporos

0,020mm

Repete por 3 vezes

Transfere para tubo de centrífuga seguidas de duas centrifugaçõesUma em água outra em sacarose 45%

Verificar ausência de esporos ou esporocarpos

A

B

C

Bioensaio de número mais provável (NMP)de propágulos infectivos

Diluição seriada decimal (base 10 ou dez vezes) da amostra

5 repetições de 1 mL

Diluição 100

180 mL

180 mL

....

10-1

10-2

10-9180 mL

Inoculante líquido usar como diluente água destilada

5 repetições de 1 mL

Rep.1 Rep.2 Rep.3 Rep.4 Rep.5

Planta teste: Brachiaria decumbens

Nº de esporos e NMP tem de ser igual ou superior aos garantidos ou declarados no registro do produto

Bioensaio de infectividade micorrízica

Tubetes de 250 mL

Diluição da amostra na dosagem recomendada do produto

Controle positivoRhizophagus clarusDiluido 1:10

Controle negativo

Condução por 28-35

dias

Planta: Brachiaria decumbens 5 repetições

Sobre o resultado da análise:

§ único. O inoculante será classificado pelo resultado nas categorias:

a) mais que 30% de colonização micorrízica – inoculante comercializável como “Promotor de Micorrizas Arbusculares – Classe A”;

b) entre 15 e 30 % de colonização micorrízica – inoculantecomercializável como “Promotor de Micorrizas Arbusculares – Classe B”;

c) menor ou igual a 14% colonização micorrízica – inoculante não comercializável como “Promotor de Micorrizas Arbusculares”

O bioensaio de infectividademicorrízica

Uso do fragmento de DNA identificador (“DNA Barcode”) de 1500 pb amplificado pelos “primers” SSUmCf e LSUmBr

Herbert Stockinger, Manuela Krüger & Arthur Schüßler, DNA barcodingof arbuscular mycorrhizal fungi, New Phytologist, v.187, n.2, p,461-474, 2010

Identificação por biologia molecular

Identificação dos FMAs por morfologia dos esporos

Obrigado

orivaldo.saggin@embrapa.br