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INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM GENÉTICA, CONSERVAÇÃO E BIOLOGIA EVOLUTIVA – PPG GCBEv
Mapeamento Cromossômico e Expressão Gênica do Elemento Retrotransponível Rex1 em Colossoma macropomum (Serrasalmidae, Characiformes) submetidos ao metal
pesado Cobre (Cu++)
Hallana Cristina Menezes da Silva
Manaus, Amazonas
Julho de 2016
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Hallana Cristina Menezes da Silva
Mapeamento Cromossômico e Expressão Gênica do Elemento Retrotransponível Rex1 em Colossoma macropomum (Serrasalmidae, Characiformes) submetidos ao metal
pesado Cobre (Cu++)
Orientadora: Dra Daniele Aparecida Matoso
Coorientadora: Dra Leila Braga Ribeiro
Manaus, Amazonas
Julho de 2016
Dissertação apresentada ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.
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FICHA CATALOGRÁFICA
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A todos que contribuíram de alguma forma para a conclusão desse trabalho. À minha família, responsável por toda a minha educação. Ao meu irmão, Aluízio Filho, que eu sempre te sirva de inspiração para as coisas boas.
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“Minha energia é o desafio, minha motivação é o impossível, e é por isso que eu preciso ser, à força e a esmo, inabalável. ”
Augusto Branco
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AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus pela vida.
Minha família, eu não poderia deixar de agradecer, Cristiana (minha mãe),
Aluízio (meu pai), Iara (minha irmã) e principalmente ao meu irmão, Aluízio Filho. Meu
maior desejo sempre foi fazer com que vocês sentissem orgulho de mim. Espero ter feito
isso. Eu amo vocês, muito, e sou grata por tudo que sempre me deram e me dão. Minha
segunda família, que cuidou de mim por tantos anos e até hoje cuida, Tia Rose, Tio
Almir, Amisa, Almira e Amile e Almir Filho, obrigada por tudo. À minha família que
está em Eirunepé, obrigada por toda a força e pelos momentos de diversão nas férias,
obrigada por tudo.
Minha orientadora, Dra Daniele Aparecida Matoso, por tudo que me foi
ensinado, pela confiança que me foi dada e por sempre me tratar como uma “filha
científica”. Sempre será uma honra dizer que trabalhei com a senhora por 4 anos. Minha
coorientadora, Dra Leila Braga Ribeiro, pelas grandes lições de citogenética, muito
obrigada pela paciência e por dedicar um pouco do seu tempo a essa leiga em
citogenética. Eu não poderia ter ou pedir duas “mães científicas” melhores que vocês,
muito obrigada por tudo.
Ao professor Adolfo Mota, meus mais sinceros agradecimentos por ter entrado
nessa com a gente, por ter me ajudado sempre e por tudo que me ensinou. Ao professor
Edson Júnior do Carmo, que foi essencial na etapa de clonagem, meu muitíssimo
obrigada.
Começando a agradecer por partes agora, desde a hora de montar o experimento
que só foi possível por conta da enorme ajuda de Daniel e José, técnicos do INPA, meu
muito obrigada; na hora da coleta, que sem a ajuda da Lorena Leles, do Rafael Travassos
e da Giovanna Maklouf eu estaria completamente perdida, foram vocês que seguraram
a barra comigo sacrificando os 60 peixes, muito obrigada de coração gente.
Aos amigos do LEA, David Bronze, Ennos Oliveira, Francislaide Costa,
Leonardo Kumagai, Lorena Oliveira, Poliana Perrut, Thamiles Gonçalves, Tiara Cabral,
Victória Xabregas; aos amigos que não são do LEA, Gleisson, Ferraz, André Santos,
queria agradecer pela paciência e também por me ensinarem que um trabalho em equipe
é um trabalho onde se tem principalmente respeito um pelos outros, onde nos ajudamos
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sem pedir nada em troca (às vezes eu cobrava uns 50 reais, mas é porque a situação
estava difícil hehehe). Obrigada por 2 anos de muita companhia.
À Coordenadora do LEA, Dra Doriane Picanço Rodrigues, por abrir as portas do
LEA e me receber de uma maneira muito carinhosa e por tudo que me foi ensinado. À
Dra Eliana Feldberg, a quem eu carinhosamente apelidei de minha “avó científica” por
todo o apoio, todo o incentivo, todas as palavras de força, todos os galões de nitrogênio
enchidos (hehehe). Muito obrigada. À Dra Vera Val, por sempre disponibilizar espaço
no LEEM para que nós possamos usar e por todo o suporte.
Aos meus amigos, Thaís, Thallyson, Jennifer, Igor, Alessandra, Cláudia, Maria
Eliza, Janilson, Rafaela, Felipe Tinoco, Rejina, Vanessa, Emanuela, Wesley, Danielle
Silva, por toda a força que vocês me deram durante esses anos de amizade, não só no
mestrado, mas durante toda a vida. Muito obrigada pela paciência da ausência e pela
força. Amo vocês. Ao Max Moraes, que foi indispensável na criação do FLIMA, que
me ouviu e embarcou na ideia de fazer um programa sobre o que não entendia, baby
obrigada por tudo.
Aos meus colegas da turma de mestrado 2014 do INPA, Bruna, Dinho, Gabriel,
Pedro, Rejane, Roberta, Sabrina, Yumi. Passamos por essa forca juntos galera.
Enfim, a todos que direta ou indiretamente ajudaram na realização e conclusão
desse trabalho, meu muito obrigada!
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RESUMO
Os elementos transponíveis são conhecidos pela capacidade de se mover e se
integrar no genoma do organismo hospedeiro. Eles possuem duas classificações: a
classe I é a classe dos retrotransposons que possuem como intermediário da transposição
o RNA, a partir do qual é sintetizado o cDNA e este é inserido no genoma. Os
retrotransposons são classificados de duas maneiras, os que possuem repetições
terminais longas, chamados de retrotransposons LTRs, e os que não possuem essa
repetição, sendo chamados de retrotransposons não – LTRs. Os retrotransposons não –
LTRs ainda podem ser classificados como LINEs (elementos longos interespaçados) e
SINEs (elementos curtos interespaçados); a classe II é composta por transposons de
DNA, que possuem como intermediário o próprio DNA migrando diretamente ou sendo
copiado e inserido no genoma. O Elemento Retrotransponível Rex1 é um
retrotransposon não LTR da família Rex e é encontrado em vários tipos de organismos.
Vários estudos apontam que os retrotransposons da família Rex possuem a capacidade
de resposta ao estresse ambiental. Nesse estudo foram feitos o mapeamento
cromossômico e a quantificação absoluta de Rex1 em Colossoma macropomum
submetidos a estresse ambiental por contaminação da água com cobre. Os resultados
encontrados corroboram a hipótese de que esse retrotransposon possua uma resposta a
esse tipo de estresse no tecido muscular do Tambaqui. No mapeamento cromossômico
encontramos, através da hibridização in situ por fluorescência, maior número de
marcações em animais que foram submetidos ao estresse e as imagens foram
quantificadas no software FLIMA, confirmando esse dado através do maior coeficiente
de fluorescência. Na quantificação absoluta das amostras de músculo de Tambaqui a
partir da PCR Real – Time, também encontramos maiores números de cópias de Rex1
nas amostras que foram submetidas ao estresse ambiental por cobre.
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ABSTRACT
The transposable elements are known for their ability to move and integrate into
the genome of the host organism randomly. They have two classifications: Class I is the
retrotransposons' class that have as an intermediary transposition RNA, which from it is
synthesized cDNA and this is inserted into the genome. The retrotransposons are
classified in two ways, those with long terminal repeats, called retrotransposons LTRs
and those who do not have this repetition is called retrotransposons not - LTRs. The
retrotransposons not - LTRs can still be classified as LINEs (long interspersed elements)
and SINES (short interspersed elements); Class II is composed of DNA transposons,
which have their own DNA as an intermediary migrating or being directly copied and
inserted into the genome. The Rex1 is retrotransposon not-LTR of Rex family and is
found in several types of organisms. Several studies indicate that the Rex family
retrotransposons have the capacity to respond to environmental stress. In this study we
were made chromosome mapping and the absolute quantification Rex1 in Colossoma
macropomum that have undergone environmental stress by water contamination with
copper. The results corroborate the hypothesis that this retrotransposon has a response
to that kind of stress in the muscle tissue of the Tambaqui. Found in chromosome
mapping by fluorescence in situ hybridization, highest number of tags in animals which
were subjected to stress and images were quantified in the FLIMA software, confirming
that data through the highest fluorescence ratio. In Tambaqui absolute quantitation of
muscle samples from the PCR Real - Time also found larger numbers of copies of Rex1
the samples were subjected to environmental stress copper.
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SUMÁRIO
1. Introdução .......................................................................................................... 14 1.1 Informações gerais sobre o tambaqui: Aspectos econômicos e Moleculares ........ 14
1.2 Os elementos transponíveis e sua possível resposta a alterações ambientais ........ 16
1.3 Os elementos retrotransponíveis da família Rex .................................................. 21
1.4 O uso do sulfato de Cobre na piscicultura e seu impacto ambiental .................... 22
1.5 Hipóteses ............................................................................................................ 23
2. Objetivo Geral ................................................................................................... 23 2.1 Objetivos específicos .......................................................................................... 24
3. Material e Métodos ............................................................................................. 24 3.1 Material e desenho experimental ......................................................................... 24
3.2 Métodos ............................................................................................................. 26
3.2.1 Obtenção de cromossomos mitóticos ................................................... 26
3.2.2 Detecção da Heterocromatina Constitutiva (Técnica de Banda C) ........ 27
3.2.3 Extração de DNA ................................................................................ 27
3.2.4 Isolamento das Sequências Repetitivas por PCR (Polymerase Chain Reaction) ...................................................................................................... 28 3.2.5 Hibridização in situ por Fluorescência (Técnica de FISH) .................... 29
3.2.6 Elaboração do software para a quantificação da fluorescência da FISH 30
3.2.7 Reação de Polimerização em Cadeia das amostras de DNA Genômico para a Quantificação Absoluta das amostras via PCR Real – Time ............... 31
3.2.8 Clonagem dos fragmentos de Rex 1 e Reação de Sequenciamento das Amostras Amplificadas ............................................................................................ 31
3.2.9 Confecção de Primers Específicos para a Reação de PCR Real - Time . 32
3.2.10 Reação de PCR Real – Time (qPCR) para a Quantificação das amostras ...................................................................................................................... 33
4. Resultados e Discussão ....................................................................................... 35
4.1 Capítulo 1 – Artigo 1: Quantificação diferencial e mapeamento cromossômico do elemento retrotransponível Rex1 em Colossoma macropomum (Serrasalmidae, Characiformes) expostos a estresse ambiental por cobre (Cu++) ................................ 36
4.1.1 Introdução ............................................................................................ 36
4.1.2 Material e Métodos ............................................................................... 38 4.1.2.1 Desenho experimental ........................................................... 38
4.1.2.2 Extração de DNA e Reação em cadeia da Polimerase (PCR) . 38
4.1.2.3 Clonagem .............................................................................. 39
11
4.1.2.4 Sequenciamento das amostras clonadas para a quantificação por PCR Real - Time ............................................................................... 39
4.1.2.5 Confecção dos primers específicos para a reação de PCR Real - Time ................................................................................................. 39
4.1.2.6 Reação de PCR Real – Time para a quantificação absoluta das amostras ............................................................................................ 39
4.1.2.7 Análises estatísticas ............................................................... 40
4.1.2.8 Bandeamento C ..................................................................... 40
4.1.2.9 Hibridização in situ por fluorescência (FISH) ........................ 40
4.1.3 Resultados ........................................................................................... 40
4.1.4 Discussão ............................................................................................. 47
4.2 Capítulo 2 – Artigo 2: Fluorescence Image Analyzer – FLIMA: Software para análise quantitativa de Hibridização in situ (FISH) ................................................... 51
4.2.1 Introdução ............................................................................................ 51
4.2.2 Material e Métodos ............................................................................... 52
4.2.3 Resultados e Discussão ......................................................................... 53
5. Conclusões Gerais ............................................................................................... 57
6. Referências .......................................................................................................... 58
12
Lista de Figuras
Introdução
Figura 1: Colossoma macropomum – Tambaqui ....................................................... 14
Figura 2: Cariótipo de C. macropomum, coloração convencional Giemsa (Irchio et al.,
2003) .......................................................................................................................... 16
Figura 3: Esquema de retrotransposons ..................................................................... 18
Material e Métodos
Figura 3: a e b) Tanques de polietileno montados; c e d) Espécimes de tambaqui sendo
aclimatados nos tanques de polietileno ...................................................................... 25
Artigo 1
Figura 1: Quantificação das amostras que tiveram 48 horas de exposição ao metal .. 41
Figura 2: Quantificação das amostras que tiveram 72 horas de exposição ao metal .. 42
Figura 3: Gráfico para as amostras expostas à 48 horas ao sulfato de cobre (Cu)
apresentando sobreposição de valores das médias entre o grupo experimental e o grupo
controle ...................................................................................................................... 43
Figura 4: Gráfico apresentado as amostras sob exposição de 72 hoas ao sulfato de cobre
(Cu) ............................................................................................................................ 44
Figura 5: Distribuição da heterocromtina pelo bandeamento C e mapeamento
cromossômico pela FISH do elemento transponível Rex 1 em C. macropomum expostos
à 48 horas de sulfato de cobre 30% da CL50 ............................................................ 46
Artigo 2
Figura 1: Interface inicial do software FLIMA ......................................................... 55
Figura 2: Interface de análise dos resultados do software FLIMA ........................... 56
13
Lista de Tabelas
Material e Métodos
Tabela 1: Combinações de primers feitas na PCR Real – Time ................................ 33
Artigo 1
Tabela 1: Valores de números de cópias apresentados na quantificação absoluta via PCR
Real – Time a partir da fórmula de avogrado ............................................................. 45
14
1. INTRODUÇÃO 1.1 Informações Gerais sobre o Tambaqui: Aspectos econômicos e moleculares
O Colossoma macropomum, mais conhecido como Tambaqui, é um dos mais
populares peixes da região amazônica. Segundo dados da Embrapa, em 2011 o tambaqui
representou 67% da produção nacional de pescado e em 2014 o Ministério da Pesca e
Aquicultura estimou que a produção tenha aumentado para 87% (Ministério de Pesca e
Aquicultura, 2011; SEBRAE, 2014). Chegando a pelo menos um metro de comprimento
total e 30 kg, o Tambaqui é o segundo maior peixe da bacia Amazônica e foi descrito
por Cuvier em 1818 (Goulding & Carvalho, 1982) (Figura 1).
Figura 1: Colossoma macropmum – Tambaqui (Soares et al., 2008).
O habitat comum do tambaqui compreende lagos e rios de águas pretas, claras e
brancas (Araújo – Lima & Goulding, 1998; Soares et al., 2008). Sua dieta é dividida em
duas fases. Os peixes juvenis se alimentam de zooplâncton, sementes e frutas e, quando
adultos, sua dieta alimentar é composta principalmente por frutos (Goulding & Carvalho
1982; Saint - Paul, 1986). Este peixe também é conhecido por suportar ambientes onde
há hipóxia (suportam viver em habitats que possuem pouco oxigênio) possuindo um
sistema de respiração de emergência, onde ocorre o aumento do lábio inferior (Saint –
Paul, 1986; Soares et al., 2008).
Características como uma carne com baixo teor de gordura, rusticidade, altas
taxas de fecundidade, crescimento rápido, resistência a mudanças abruptas de pH e
baixas concentrações de oxigênio dissolvido, e a capacidade de aceitar alimentos de
várias fontes, favorecem a criação do tambaqui em sistemas de criação intensiva (Junk
15
1985; Araújo-Lima & Goulding 1998; Mendonça et al. 2009; Dairiki & Silva 2011).
Essa espécie é a segunda mais cultivada no Brasil e contribui com mais de 20% da
produção pesqueira de aquicultura continental (Ministério de Pesca e Aquicultura 2011),
sendo observada uma tendência nacional no aumento no número de produtores de
tambaqui. De acordo com dados estatísticos de produção de tambaqui no país, pode-se
observar um contínuo crescimento nos últimos anos, com um crescimento de 123% na
produção entre os anos de 2003 e 2009, com médica anual de 14% (Dairiki & Silva
2011).
Vários estudos já foram realizados com o tambaqui no que diz respeito a análises
da variabilidade populacional, propriedades fisiológicas e do seu transcriptoma. Prado
– Lima & Val (2016) realizaram o primeiro estudo do transcriptoma de tambaqui
expostos a três mudanças climáticas distintas onde os autores identificaram vários genes
que podem ser empregados como marcadores genéticos para rastrear mudanças
climáticas, identificaram processos biológicos e vias intracelulares relacionadas a
alterações na expressão gênica e identificaram elementos repetitivos que podem ser
utilizados para o desenvolvimento de futuros marcadores genéticos. Porém, atualmente
existem poucos estudos focando a análise da expressão gênica bem como o mapeamento
de elementos repetitivos móveis no genoma dessa espécie. Sobre as características
citogenéticas, Almeida – Toledo et al. (1987) fizeram a descrição cariotípica de machos
de Tambaqui e Nirchio et al. (2003) também apresentaram a sua caracterização
citogenética. Em ambos os estudos o cariótipo foi composto pelo número diploide 2n =
54, onde 14 pares são metacêntricos e 13 pares de cromossomos são submetacêntricos
(Figura 2) (Nirchio et al., 2003).
16
Figura 2 – Cariótipo de Colossoma macropomum, coloração convencional Giemsa (Nirchio et al., 2003).
1.2 Os elementos transponíveis e sua possível resposta a alterações ambientais
Os Elementos Transponíveis (TEs) possuem a capacidade de se mover e se
integrar ao genoma do organismo hospedeiro. Acredita – se que por essa habilidade,
eles possuam um mecanismo de resposta a variações ambientais, sendo um dos
responsáveis pela adaptação ambiental dos organismos por meio de mecanismos como
fenômenos de mosaicismo, grande plasticidade fenotípica e geração de variabilidade
genética intraespecífica (Whitelaw & Martin, 2001), além de efeitos sobre o controle e
regulação da expressão gênica no genoma (Mita & Boeke, 2016). Eles podem ser
classificados como retrotransposons(Classe I) (Kazazian, 2007) e transposons de DNA
(Classe II), que diferem nas suas características estruturais e moleculares, e também no
modo de transposição (Burt & Triver, 2006).
Os transposons de DNA são encontrados, principalmente, em bactérias, mas
também podem ser encontrados em insetos, vermes e humanos (Finnegan, 1985; Craig
et al., 2002). Esta classe, chamada Classe II, possui como intermediário o próprio DNA
e pode se mover no genoma de duas maneiras: sendo cortado de um sítio no genoma e
inserido em outro ou pelo mecanismo de “cópia e cola” onde através da enzima
transposase, esse fragmento de transposons é copiado e colado em outro sítio do
genoma. Essa reação ocorre por meio da hidrólise das ligações fosfodiéster entre os
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transposons e o DNA dupla fita, para liberar os resíduos de 3’OH para que o transposons
seja inserido no novo sítio (Finnegan, 1985; Craig et al., 2002).
Os retrotransposons (classe I) são transposons que possuem como intermediário
o RNA. Estes fazem uma transcrição reversa e seu cDNA é incorporado ao genoma.
Podem ser de dois tipos: os retrotransposons LTRs, que possuem uma repetição terminal
longa (LTR – Long Terminal Repeat) em ambas as extremidades; e, os retrotransposon
não – LTRs, que não possuem repetições terminais longas, ao invés disso possuem uma
sequência poliadenilada em sua terminação 3’. A forma de replicação desses
retrotransposon se assemelha à dos retrovírus, pois ambos precisam conter a maquinaria
necessária para a síntese do cDNA a partir do RNA e inserí – lo no genoma (Xiong &
Eickbush, 1988; Voytas et al., 2002). Os retrotransposons não LTRs ainda podem ser
classificados em dois tipos: elementos longos intercalados, mais conhecidos como
LINEs (Long Interspersed elements) e os elementos curtos intercalados, mais
conhecidos como SINEs (Short Interspersed Elements). Os elementos LINEs possuem
um comprimento de 4 – 6 kb e geralmente possuem duas ORFs (Open Reading Frame),
uma que codifica a proteína responsável pela ligação do retrotransposon no genoma e
outra que codifica a transcriptase reversa para a síntese de cDNA. O conhecimento
acerca do método de transposição dos elementos SINEs ainda é escasso, mas acredita-
se que eles utilizam da maquinaria dos elementos LINEs para fazer a sua transposição
(Kazazian, 2007). A figura 3 apresenta a estrutura dos tipos de retrotransposons já
estudados.
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Figura 3: Esquema de retrotransposons. Os retrotransposons (Classe I de Transposons) são subclassificados em duas categorias: Retrotransposons LTR (Long Terminal
Repeats), que são semelhantes a retrovírus exógenos e divididos em várias subfamílias; e os retrotransposons não – LTR, que incluem LINEs (ou seja, L1Hs),
SINEs (ou seja, Alus) e, em humanos, elementos SVAs (elementos SINE – VNTR – Alu, subdividos em classes A – F). Os domínios transcricionalmente ativos dos
diferentes retroelementos são indicados com cilindros quadriculados. Os triângulos indicam duplicações no local alvo (TSD). Alu – like na figura, significa a orientação
invertida destes domínios em elementos SVA. Abreviaturas: UTR, região não traduzida; ORF, de leitura aberta; PT, domínio endonuclease; RT, domínio
transcriptase reversa; Na, domínio rico em A; pA, poli – A; A B, domínios essenciais para a transcrição de SINE; VNTR, número variável de repetições alvo; Pro, protease; Gag, gene de antígeno grupo – específico (proteína de revestimento); Pol, polimerase (transcriptase reversa); Env, gene de envelope; IN, integrasse (Mita & Boeke, 2016).
Antigamente, acreditava-se que os TEs eram “DNA lixo”, ou seja, não possuíam
e nem apresentavam características que somassem ao genoma do indivíduo. Então, em
1940, Bárbara McClintock através de seu estudo com padrão de coloração do milho
observou que haviam sequências de DNA capazes de andar pelo genoma da planta e,
observou ainda que essas sequências podiam alterar o funcionamento de alguns genes.
A essas sequências ela deu o nome de “elementos controladores”. Porém alguns
pesquisadores não acreditavam que esses elementos possuíssem a capacidade de se
mover tanto a ponto de causar mutações no organismo (Biémont, 2010). Em 1970, um
estudo sobre o cruzamento de linhagens específicas de Drosophila melanogaster
19
mostrou que essas linhagens cruzadas possuíam diversas mudanças genéticas, incluindo
esterilidade, aumento das mutações e das taxas de recombinação. Alguns anos depois,
Picard et al. (1978), Kidwell et al. (1979), Rubin et al. (1982) e Engel (1988)
confirmaram que esses eventos estavam acontecendo associados a elementos
transponíveis específicos.
O interesse nos TEs aumentou quando vários genomas foram sequenciados e
observou-se haver uma grande quantidade dessas sequências móveis no genoma de
diversos organismos. Assim, estimou-se que os TEs compõem grande parte do genoma
total de diferentes organismos. Em Drosophila chegua a aproximadamente 12%, em
seres humanos 45% e em algumas espécies de plantas eles cheguam a 90% de
composição no genoma (Flavell, 1986; Sanmiguel et al., 1996; Kindwell & Minar,
1997; Bennetzen, 2000). Em alguns estudos estimou-se que as proporções de mutações
induzidas pelos TEs sejam extremamente baixas comparadas a sua quantidade no
genoma e acredita-se que, em alguns casos, sua abundância no genoma não esteja ligada
a sua atividade (Kindwell & Lish, 2002).
A compreensão acerca dos TEs melhorou a partir do aumento de dados
genômicos e do conhecimento dos sistemas de regulação epigenéticos dos TEs. No
momento, acredita – se que esses elementos sejam ativados por estresse biótico e
abiótico (García Guerreiro, 2012). A duplicação e a mobilização dos elementos
transponíveis não são tidos como mecanismos aleatórios e em plantas, percebeu – se
que eles possuem transposição espontânea. Esses mecanismos podem ser controlados
por sinais celulares, por fatores externos como ataque de parasitas, e outros tipos de
estresse, ou ainda, baseados na auto – regulação, onde o próprio elemento restringe a
sua movimentação de acordo com a abundância no genoma (Charlesworth & Langley,
1986; Deininger et al., 2003; Almeida & Carareto, 2005; Burt & Trivers, 2006).
García Guerrero (2012), em seu trabalho de revisão, apresenta uma síntese dos
trabalhos já realizados com Drosophila associando estresse ambiental e os TEs, e qual
desses estresses foram suficientes para ativá-los. Strand e McDonald (1995), Junakovic
et al. (1986), Ratner et al. (1992), Vasilyeva et al. (1999), Bubenshchikova et al. (2002)
fizeram experimentos de choques térmicos em Drosophila e notaram a ativação de TEs
como copia, copia – like e 412. Eeken & Sobles (1986) e Zabanov (1995), realizaram
experimentos utilizando radiação e encontraram ativação de TEs como o elemento P e
412. Blount et al. (1985) e Vasilyeva et al. (2003), trabalhando com estresses químicos
20
como a utilização de EMS, MMS e etanol e encontraram ativação nos TEs elemento P
e 412. Potter et al. (1979), Junakovic et al. (1988), Di Franco et al. (1992) e Maisochaute
et al. (2007), realizaram experimentos com cultura de células e encontraram ativação
dos TEs copi – like e 1731. E Nabirochkin et al. (1998), realizou experimentos com
injeções virais e encontrou a ativação do TE mdg2. Nos trabalhos citados, vários outros
TEs foram testados, porém, cada TE respondia de maneira diversa conforme o tipo de
estresse indutor aplicado, sugerindo que cada TE possui um mecanismo intrínseco de
regulação/ ativação genômica e, por isso, pode apresentar diferentes respostas
dependendo do agente estressor e do ambiente de estresse ao qual o organismo é
submetido.
Na década de 1970, quando os estudos com TEs haviam começado e tinha-se
um interesse em conhecer esses elementos, utilizava-se a técnica de Southern Blot para
estimar o seu número de cópias no genoma. Quanto a sua localização cromossômica, a
hibridização in situ foi utilizada para mapear esses elementos nos genomas dos
organismos. A hibridização in situ foi a técnica mais utilizada para a localização dos
TEs, porque a partir dela pode-se estimar a detecção do polimorfismo de sua inserção
dentre e entre as populações e ainda a quantidade de cópias comparadas entre os
cromossomos (Biémont, 2010). Atualmente ainda se usa a hibridização in situ por
fluorescência para estimar a quantidade de TEs distribuídos nos cromossomos dos
organismos, porém a técnica de Southern Blot foi substituída pela possibilidade de se
fazer a PCR Real – Time na forma de quantificação absoluta para estimar, mais
precisamente, o número de cópias de TEs no genoma dos organismos.
Em peixes, os TEs parecem estar diretamente relacionados à evolução genômica
e todos os retrotransposons já descritos até o momento foram encontrados no genoma
desses animais (Okada et al., 1997; Poulter et al., 1999; Volff et al., 1999; Aparicio et
al., 2002). Além disso, uma abordagem aplicada para os estudos de TEs em espécies de
peixes comerciais pode ser relacionada ao uso dessas sequências móveis como
transportadores de genes, gerando assim novos produtos biotecnológicos (Phillips &
Reed, 1996; Largaespada, 2003; Tafalla et al., 2005).
21
1.3 Os elementos retrotransponíveis da família Rex
Em peixes, TEs do tipo não – LTR da família Rex são os que possuem a melhor
caracterização até o momento, mostrando – se ativos na evolução desse grupo e
amplamente distribuídos no seu genoma (Volff et al., 1999; Volff et al., 2000; Volff et
al., 2001). Os elementos retrotransponíveis da família Rex possuem esse nome porque
foram primeiros relatados em peixes do gênero Xiphophorus (Retrotransposable
Elements of Xiphophorus – Rex). O primeiro retrotransposon a ser descrito foi o Rex3
em um trabalho realizado por Volff et al. (1999), onde eles utilizaram a clonagem para
o sequenciamento do fragmento de retrotransposon que ainda não era conhecido e a
técnica de Southern Blot para a estimativa de número de cópias de Rex3 no genoma.
Não foram encontradas regiões LTR flanqueando esse retrotransposon, sendo concluído
assim que este pertence à família de retrotransposons não – LTRs. Foi descrito também
que o Rex3 codifica uma transcriptase reversa com nove domínios conservados
encontradas em retrotransposons não – LTRs (Volff et al., 1999).
O segundo retrotransposon da família Rex identificado foi o Rex1, também em
um estudo feito por Volff et al. (2000). Esse estudo também caracterizou o Rex1 como
sendo um retrotransposon não – LTR que possui uma sequência que codifica um produto
semelhante a transcriptase reversa. A metodologia usada neste trabalho foi semelhante
à usada para a descrição do Rex3, fazendo uso da clonagem para posterior
sequenciamento do retrotransposon. Neste sequenciamento foram identificadas 3
sequências variantes de Rex1. Neste trabalho também se sustentou a hipótese de que os
retrotransposons possuem a capacidade de transferência horizontal, uma vez que o autor
cita que o Rex1 também foi encontrado em espécies da família Anguilla e isso poderia
ser um exemplo raro dessa transferência em organismos vivos (Volff et al., 2000).
O último Rex descrito também por Volff et al. (2001) foi o Rex6. Utilizando a
mesma metodologia, o Rex6 também foi descrito como um retrotransposon não – LTR
que codifica uma transcriptase reversa. Porém, nesse retrotransposon foi identificado
uma sequência que corresponde a uma enzima de restrição semelhante à endonuclease,
sendo este o único retrotransposon codificando essa enzima que é utilizada para clivar
o seu local de retrotransposição no genoma (Volff et al., 2001).
Todos os três retrotransposons da família Rex descritos por Volff et al. (1999,
2000 e 2001) foram identificados como tendo papéis importantes na dinâmica evolutiva
22
dos peixes estudados e de vertebrados. Alguns trabalhos mais recentes sustentam a
hipótese de que os retrotransposons da família Rex também possuem mecanismos de
resposta a estresses ambientais, iguais aos outros retrotransposons mais conhecidos.
Ribeiro (2013), estudou a distribuição de Rex1, Rex3 e Rex6 em Colossoma
macropomum quando estes foram aclimatados em diferentes temperaturas,
evidenciando um maior número de marcações nos cromossomos dos indivíduos
mantidos a 22ºC, considerada estressante para o tambaqui. O primeiro trabalho com
análise da expressão diferencial de Rex6 foi realizado por Barbosa et al. (2014). Nesse
estudo os autores obtiveram como resultado que tecidos como brânquias, fígado e
músculo de Colossoma macropomum tem um maior nível de expressão em água clara,
quando comparados com a água preta, talvez pelo fato dos tipos de águas apresentarem
diferenças físico – químicas. Outro estudo feito por Silva et al. (2016) utilizando
Hoplosternum litoralle em dois diferentes tipos de água, mostrou que animais que
habitam em águas poluídas apresentam, através da hibridização in situ por fluorescência,
mais marcações de Rex 3 em relação aos animais que habitam o tipo de água não
poluída.
1.4 O uso do sulfato de cobre na piscicultura
Um dos principais problemas ambientais nos dias de hoje é o aumento mundial
da contaminação de sistemas de água doce por compostos químicos industriais e
resíduos domésticos (Schuwarzenbach et al., 2006) e dentre várias fontes de poluição,
ações como descarga de águas não tratadas, resíduos de efluentes industriais e resíduos
de aquicultura são as principais fontes de poluição das águas interiores (Sampaio et al.,
2013). Sabe – se que nos viveiros de produção existe uma alta densidade de matéria
orgânica devido ao grande número de espécimes que lá são cultivados e como
consequência disso, fica difícil manter a qualidade da água nesses viveiros (Kubtiza,
1998). O sulfato de cobre (CuSO4) foi uma maneira que os aquicultores encontraram
para contornar os problemas no processo produtivo causado pela matéria orgânica nos
tanques, porém essa substância causa efeitos tóxicos quando usada (Beaumont et al.,
2000; Novelli – Filho et al., 2000). O sulfato de cobre é aplicado em reservatórios, lagos,
e em viveiros em busca do controle da floração de algas e do crescimento de organismos
aquáticos indesejados nos viveiros (Thornton, 1997; Rast, 1997) e é também utilizado
23
como agente terapêutico no controle de doenças bacterianas branquiais e outros
parasitas (Reardon, 1990; Harrel, 1990).
O íon cobre é um metal pesado traço essencial para os organismos, sendo
requerido em pequenas quantidades pois servem como importantes co-fatores de
funções catalíticas. Porém, quando utilizado em altas concentrações pode ser nocivo ao
organismo, sendo capaz de causar sérios impactos nos sistemas fisiológicos, estruturais
e nos sistemas metabólicos (Nriagu, 1990) sendo assim caracterizado como uma forma
de estresse aos organismos de água doce.
Com base no que foi citado, a utilização de TEs em análises de expressão gênica
e em estudos envolvendo o mapeamento cromossômico pode proporcionar uma melhor
compreensão sobre a organização genômica do tambaqui. Além disso, o entendimento
de como os TEs se comportam frente a estresses ambientais é importante para subsidiar
estudos de genética aplicada.
1.6 Hipóteses
H0: Ao expor espécimes de Colossoma macropomum ao agente estressor cobre,
o retrotransposon Rex1 não apresentará replicação e transcrição alteradas no genoma
dessa espécie, sem significativa expressão. Além disso apresentar – se – à pouco
disperso em ambas as condições (controle e experimental).
H1: Ao expor espécimes de Colossoma macropomum ao agente estressor cobre,
o retrotransposon Rex1 apresentará maior replicação e transcrição no genoma dessa
espécie, com expressão diferencial nas condições experimental e controle. Além disso
apresentar – se – à amplamente disperso em diferentes regiões cromossômicas.
2. OBJETIVO GERAL
Estudar a estratégia de resposta adaptativa do genoma da espécie Colossoma
macropomum quando exposto ao agente estressor cobre, através de análises
citogenéticas e de quantificação absoluta do elemento repetitivo Rex1.
2.1 Objetivos Específicos
24
Analisar os níveis de quantificação absoluta do elemento retrotransponível Rex1
no genoma de C. macropomum submetidos a estresse por exposição aguda ao
metal pesado cobre e em espécimes do grupo controle;
Mapear em cromossomos metafásicos de C. macropomum o elemento
retrotransponível Rex1 em espécimes expostos ao metal pesado cobre e grupo
controle por meio de hibridização in situ por fluorescência;
Comparar a localização cromossômica do Rex 1 com os tipos de cromatina em
espécimes expostos ao sulfato de cobre e em indivíduos do grupo controle;
Correlacionar os resultados encontrados no mapeamento cromossômico e
quantificação absoluta, a fim de detectar variações entre as duas condições
experimentais.
25
3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Material e desenho experimental
Sessenta juvenis de tambaqui (Colossoma macropomum), oriundos de
piscicultura, foram aclimatados durante quinze dias em tanques de polietileno na
estrutura montada no Bloco M – Universidade Federal do Amazonas (Figura 3). Seis
tanques de polietileno foram montados, e em cada tanque foram dispostos 10 animais
experimentais. O sistema de aclimatação foi mantido com circulação de água aberta,
circulação de oxigênio aberta e a temperatura da água nos tanques foi mantida entre
27ºC (+/- 2ºC). Os animais foram alimentados todos os dias com ração comercial
(aproximadamente 36% de proteínas) durante o período de aclimatação uma vez ao dia,
sendo retirado o que não foi ingerido para evitar formação de matéria orgânica nos
tanques.
Figura 4: a e b) Montagem do experimento; c e d) Aclimatação dos espécimes juvenis de tambaqui.
Após as duas semanas de aclimatação, a água foi retirada e o volume foi
completado para 240 litros. Os três primeiros tanques, escolhidos como tanques
experimentais receberam 30% da CL50 calculada de cobre descrita para o tambaqui
26
(CL50-96h = 0,380 mg/L; 30% CL50-96h = 0,114 mg/L) (Figueiredo et al., 2014), e seu
sistema de água foi fechado. Os três tanques restantes foram os dos animais utilizados
como animais controle, com 10 espécimes em cada tanque e seu sistema de água foi
fechado.
Na primeira parte do experimento, os animais foram mantidos em água
contaminada com cobre por um período de 48 horas. Destes animais, quinze espécimes
de cada tratamento (experimental e controle) foram anestesiados com água gelada e
sacrificados. Na segunda parte do experimento, os demais espécimes foram mantidos
em água contaminada com cobre mais um dia, totalizando 72 horas de exposição.
Quinze espécimes foram anestesiados com água gelada e sacrificados, bem como os
quinze restantes do grupo controle. Os tecidos retirados foram: rins, para as análises
citogenéticas e músculo, para as análises de quantificação absoluta.
3.2 Métodos
3.2.1 Obtenção de cromossomos mitóticos
A metodologia utilizada consistiu na utilização do protocolo de GOLD et al.,
1990, com algumas adaptações. Nessa metodologia, o rim foi retirado, colocado em uma
cuba de vidro contendo 10mL de meio de cultura RPMI 1640 a temperatura ambiente e
o material foi dissociado com o auxílio de seringas descartáveis sem agulha. Foi
adicionado ao material dissociado cerca de quatro gotas de colchicina 0,0125% e
deixado em temperatura ambiente por cerca de 25 minutos. Com o auxílio de uma pipeta
Pasteur, o material foi ressuspendido, passado para um tubo Falcon de 10mL e
centrifugado durante 10 minutos a 900 RPM. O sobrenadante foi removido com uma
pipeta Pasteur e foi acrescentado ao tubo solução hipotônica de KCl a 0,075M de modo
a completar o volume no tubo Falcon (10 – 12mL). O material foi ressuspendido e
incubado durante 25 minutos em estufa a 36 – 37ºC. Passado esse tempo, o material foi
ressuspendido novamente com bastante cuidado, a suspensão obtida foi transferida para
um novo tubo, de modo que os pedaços de tecido ainda não desfeitos foram descartados,
acrescentou-se algumas gotas de fixador (álcool metílico 3: ácido acético 1) recém
preparado, o material foi ressuspendido novamente e centrifugado a 900 RPM durante
10 minutos, depois o sobrenadante foi descartado com uma pipeta Pasteur. Foi
27
adicionado, vagarosamente, de 6 a 8mL de fixador recém preparado, deixando escorrer
através das paredes do tubo Falcon, o material foi ressuspendido cuidadosamente com
o auxílio da pipeta Pasteur e centrifugado novamente a 900 RPM durante 10 minutos.
Esse passo foi repetido mais uma vez para a melhor limpeza da suspensão. Após a última
centrifugação e eliminação do sobrenadante foi adicionado cerca de 1,5mL de fixador e
o material foi ressuspendido novamente. A suspensão foi passada para um microtubo de
1,5mL e guardado em freezer.
Para a preparação das lâminas, as mesmas foram lavadas, secas ao ar e
posteriormente imersas em água destilada a 50ºC. Após 5 minutos, as lâminas foram
retiradas da água de forma a manter uma película de água sobre a sua superfície, na qual
foi gotejada a suspensão celular em diferentes regiões. As lâminas secaram ao ar e foram
posteriormente coradas em Giemsa 5% por 10 minutos para observação em microscópio
óptico.
3.2.2 Detecção da Heterocromatina Constitutiva (Técnica de Banda C)
Após a análise prévia das preparações celulares, as lâminas foram submetidas à
técnica de bandeamento C, utilizada para a caracterização da heterocromatina
constitutiva segundo o protocolo de Sumner em 1972, com algumas modificações. As
lâminas contendo as preparações cromossômicas foram tratadas durante 2 minutos com
HCl 0,2N em temperatura ambiente, lavadas em água destilada e secas ao ar. Logo após,
as lâminas foram incubadas em hidróxido de Bário (BaOH) 5%, recém preparada e
filtrada, durante 2 minutos e 20 segundos em uma temperatura de 42ºC. A ação do BaOH
foi interrompida imergindo a lâmina em solução de HCl 0,2N a 42ºC durante 20
segundos e lavou-se logo depois em água destilada, deixando-as secar ao ar. Depois de
secas, as lâminas foram incubadas durante 20 minutos em solução 2xSSC (Cloreto de
Sódio 0,3M e Citrato Trisódico 0,03M, pH 6,8) em banho Maria a 60ºC, lavadas e secas
ao ar. Logo após, elas foram coradas com Iodeto de Propídeo (20µL de antifade + 1µL
de iodeto de propídeo), cobertas com lamínula e analisadas em microscópio de
fluorescência Olumpus BX51.
28
3.2.3 Extração de DNA
A extração de DNA foi realizada das amostras de músculo coletadas seguindo o
protocolo básico de Sambrook (1979) que consiste na utilização de fenol, com umas
poucas modificações. Anterior ao processo de extração foi feito um tampão de lise que
consiste em 8mL de Tris-HCl 1M pH 8,0, 1mL de NaCl 1M, 10mL de SDS 10%, 2mL
de EDTA 0,5M e o volume foi completado para 100mL com água ultrapura.
Aproximadamente 20 mg de tecido muscular foi cortado, picado e colocado em
um tubo de 1,5mL, adicionando ao tecido 500µL de tampão de lise, 30µL de proteinase
K (10mg/mL) e o tubo foi incubado em banho seco durante 1 hora a 60ºC, até que todo
o tecido fosse digerido. Logo após o tecido ter sido digerido, foi adicionado ao tubo
20µL de RNAse (10mg/mL) e voltou ao banho seco durante 1 hora a 37ºC. Passada 1
hora, foi adicionado ao tubo 600µL da solução de fenol – clorofórmio (1:1), o tubo foi
agitado gentilmente por inversão, centrifugado a 14000 RPM durante 20 minutos e o
sobrenadante foi transferido cuidadosamente para um novo tubo. Ao novo tubo foi
adicionado 600µL de clorofórmio, misturou-se gentilmente por inversão, e foi
centrifugado durante 15 minutos a 14000 RPM. O sobrenadante foi transferido
cuidadosamente para um novo tubo, a ele foi adicionado 600µL de isopropanol gelado
100%, misturou-se gentilmente por inversão e o tubo foi deixado em um freezer – 20ºC
para precipitar overnight. Após, o tubo foi centrifugado por 20 minutos a 14000 RPM.
O sobrenadante foi descartado cuidadosamente para que o pellet não caísse, e este foi
lavado com 1mL de etanol 70%, centrifugado por 10 minutos a 14000 RPM e o
sobrenadante descartado novamente. O tubo contendo o pellet de DNA foi levado a
estufa com temperatura de 55ºC para secar. Depois foi ressuspendido em 50µL de água
ultrapura e armazenado em freezer – 20ºC.
3.2.4 Isolamento das Sequencias Repetitivas por PCR (Polymerase Chain
Reaction)
As sequencias repetitivas de Rex 1 de Colossoma macropomum foram
amplificadas com os primers descritos na tabela abaixo:
Rex 1 (Volff et al., 2000)
29
RTX1 F1: 5’ TTC TCC AGT GCC TTC AAC ACC 3’
RTX1 R3: 5’ TCC CTC AGC AGA AAG AGT CTG CT 3’
Utilizando o DNA total previamente extraído, a amplificação destes elementos
foi realizada a partir da técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction – Saiki et al.,
1988). Foi utilizada na reação 100ng de DNA total em uma solução contendo 2µL de
tampão 1x contendo 1,5mM de Cloreto de Magnésio (MgCl), 0,2µL de dNTP em uma
concentração de 10mM, 0,08µL de Taq DNA Polimerase em uma concentração de
5U/µL, 1µL de ambos os primers (forward e reverse) em uma concentração de 5pmol.
Em um termocilador Veriti 96 Well Thermal Cycler (Applied Biosystems), as amostras
foram submetidas às temperaturas de 94ºC durante 2 minutos, 35 ciclos de 94ºC durante
1 minuto, 54ºC durante 1 minuto e 72ºC durante 2 minutos, e extensão final de 72ºC
durante 5 minutos.
A confirmação da eficiência da reação foi realizada através do gel de agarose
1,5%, em tampão TBE 1x, corado com brometo de etídio e visualizado em
transiluminador de luz UltraVioleta. Uma vez confirmada a eficiência da reação, os
produtos de PCR foram quantificados em Nanovue e utilizados tanto para obtenção de
sondas utilizadas na Hibridização in situ por Fluorescência.
3.2.5 Hibridização in situ por Fluorescência (Técnica de FISH)
Para a hibridização in situ por fluorescência seguiu – se o protocolo descrito por
Pinkel et al. (1986), com modificações. A marcação da sonda seguiu o método de Nick
translation, onde as sondas foram marcadas com digoxigenina (Kit DIG – Nick™
Translation Mix – Roche) seguindo as orientações do fabricante.
As lâminas foram lavadas duas vezes em solução 2xSSC durante 5 minutos cada
lavagem e depois desidratadas em série alcoólica 70%, 85% e 100% (soluções mantidas
no freezer) durante 5 minutos cada. Após a desidratação, as lâminas foram mergulhadas
em formamida 70% em 2xSSC durante 5 minutos a 70ºC, desidratadas novamente em
série alcoólica de 70%, 85% e 100% (soluções mantidas no freezer) durante 5 minutos
cada e secas ao ar.
30
Em um microtubo de 1,5mL foi adicionado 20µL de formamida 100% (50% do
volume final), 8µL de sulfato de dextrano 50%, 4µL da sonda marcada, 4µL de 20xSSC
(concentração final de 2xSSC), obtendo um volume final de 40µL (para cada lâmina).
Esta solução foi utilizada para hibridização, e foi desnaturada a 99ºC durante 10 minutos
e estocada imediatamente em gelo.
A etapa de hibridização foi feita colocando-se 40µL da solução de hibridização
sobre uma lamínula e invertendo a lâmina sobre ela. As lâminas foram mantidas com o
material voltado para baixo em uma câmara úmida a 37ºC durante 16 horas,
aproximadamente. Ao saírem da câmara úmida, as lâminas foram lavadas duas vezes
em formamida 15%, 0,2xSSC pH 7,0 a 42ºC durante 10 minutos cada lavagem, três
vezes em 0,1xSSC a 60ºC durante 5 minutos cada lavagem e três vezes em solução
Tween 0,5% em temperatura ambiente durante 5 minutos.
Seguindo essa etapa, foi feita a detecção do sinal que constituiu em incubar as
lâminas em tampão NFDM (Nonfat dry milk) (5%NFDM / 4xSSC) durante 15 minutos
e lavá-las duas vezes com Tween 5% em temperatura ambiente durante 5 minutos cada
lavagem. Em cada lâmina foi adicionado 20µL de anti digoxigenina-rodamina (1:200).
A lâmina foi invertida sobre a lamínula e incubada durante 60 minutos em câmara úmida
a 37ºC. Após esse tempo, a lâmina foi lavada três vezes com Tween 5% em temperatura
ambiente durante 5 minutos cada lavagem. Após isso, as lâminas foram desidratadas em
série alcoólica 70, 85 e 100% durante 5 minutos cada e secas ao ar.
Ao final do processo, cada lâmina foi montada com 20µL de antifade + 1µL de
DAPI e coberta com lamínula. Os cromossomos metafásicos foram analisados e
fotografados em um microscópio de fluorescência Olympicus BX51 e as imagens foram
capturadas através do software Image – PRO MC 6.0.
3.2.6 Elaboração do software para a quantificação da fluorescência da FISH
As imagens capturadas foram compostas e editadas no programa Adobe
Photoshop CS6, para posterior quantificação de sinais de Rex 1. Tendo em vista a
necessidade de se quantificar, numericamente, a fluorescência observada nas imagens
de FISH e para uma análise comparativa mais precisa, e a falta de um software que
31
realize esse tipo de análise, elaborou-se um algoritmo capaz de quantificar a intensidade
de sinal da imagem.
O algoritmo fez a análise de pixels na imagem gerada pelo microscópio de
fluorescência, separando as cores e apresentando um coeficiente equivalente a cor da
sonda que foi hibridizada, tons de vermelho para a sonda de digoxigenina, tons de verde
para a sonda de biotina, e tons de branco para as duas sondas que são utilizadas juntas
na Double FISH. Este coeficiente gerado foi chamado de coeficiente de fluorescência e
foi medido através do programa FLIMA (Fluorescence Image Analyzer), software para
a análise quantitativa da hibridização in situ (FISH) desenvolvido como parte desse
trabalho e melhor detalhado na seção resultados e discussão.
3.2.7 Reação de Polimerização em Cadeia das amostras de DNA Genômico para
a Quantificação Absoluta das Amostras via PCR Real – Time
As regiões de Rex 1 foram amplificadas utilizando-se os primers descritos na
tabela abaixo:
Rex 1 (Volff et al., 2000)
RTX1 F1: 5’ TTC TCC AGT GCC TTC AAC ACC 3’
RTX1 R3: 5’ TCC CTC AGC AGA AAG AGT CTG CT 3’
Foram utilizados os DNA’s genômicos previamente extraídos e a amplificação
destes elementos foi realizada a partir da técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction
– Saiki et al., 1988). Foi utilizada na reação aproximadamente 20ng de DNA genômico
em uma solução contendo 2µL de tampão 1x contendo 1,5mM de Cloreto de Magnésio
(MgCl), 0,2µL de dNTP em uma concentração de 10mM, 0,08µL de Taq DNA
Polimerase em uma concentração de 5U/µL, 1µL de ambos os primers (forward e
reverse) em uma concentração de 5pmol. Em termocilador Veriti 96 Well Thermal
Cycler (Applied Biosystems), as amostras foram submetidas às temperaturas de 94ºC
durante 2 minutos, 35 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 54ºC durante 1 minuto e 72ºC
durante 2 minutos, e extensão final de 72ºC durante 5 minutos.
32
A confirmação da eficiência da reação foi realizada através do gel de agarose
1,5%, em tampão TBE 1x, corado com brometo de etídio e visualizado em
transiluminador de luz UltraVioleta. Os produtos foram quantificados em QUBit
(Invitrogen).
3.2.8 Clonagem dos fragmentos de Rex 1 e Reação de Sequenciamento das
Amostras Amplificadas
Para a clonagem foi utilizado o plasmídeo pGEM – T Easy (Promega), onde os
produtos de PCR de Rex1 foram inseridos. As células competentes para a inserção do
plasmídeo clonado fora de linhagem DH5α de Escherichia coli e foram transformadas
por quimiocompetência. Esses plasmídeos foram alinhados com a enzima de restrição
NCOI.
A reação de sequenciamento foi realizada seguindo o protocolo do kit ABI
PRISM® Big Dye Terminator Cycle Sequecing Ready Reaction, fornecido pela Applied
Biosystems. Para tal reação, em uma placa de sequenciamento com 96 poços foi
adicionado 2µL de tampão de sequenciamento 5x, 1µL de primer 5 pmol, 0,5µL de Big
Dye V3.1, 2µL de produto de PCR e o volume foi ajustado com água ultrapura para
10µL de volume final. A reação de sequenciamento ocorreu nas seguintes condições:
80ºC durante 5 minutos, 30 ciclos de 96ºC durante 10 segundos, 48ºC durante 5
segundos e 60ºC durante 4 minutos.
Ao final da reação de sequenciamento, foi feita a precipitação da placa a fim de
prepará-la para ir para o sequenciador. Na placa foram adicionados 2,5µL de EDTA 125
mM, 27,5µL de Etanol 100%, a placa foi deixada em temperatura ambiente por 15
minutos e em seguida foi centrifugada a 4458 RPM, 4ºC por 30 minutos. A placa foi
centrifugada novamente, porém invertida, durante 1 minuto, 4ºC a 1180 RPM. Foi
adicionado a placa 30µL de Etanol 70%, esta foi centrifugada a 4049 RPM, 4ºC, durante
15 minutos, depois foi centrifugada novamente invertida durante 1 minuto, 4ºC a 1180
RPM e foi levada a estufa durante 15 minutos numa temperatura de 40ºC. Adicionou-
se 10µL de formamida HiDi e foi levada ao sequenciador automático de 4 capilares ABI
Sequece Analizer 3130, da Applied Biosystems.
33
As sequências obtidas foram analisadas quanto aos parâmetros de qualidade dos
eletroferogramas e os dados brutos nos programas Finchtv versão 1.4 (Geospiza, Inc.) e
SeqScanner 2 (Applied Biosystems). Foram editados e alinhados nos programas MEGA
6 e BioEdit Versão 7.2.5. Para a detecção de homologia nucleotídica e confirmação da
sequência amplificada foi feito um BLASTn, na plataforma BLAST do NCBI.
3.2.9 Confecção de Primers Específicos para a Reação de PCR – Real Time
Após confirmadas que as sequências geradas eram de Rex 1, utilizou-se a
plataforma Primer Quest Tool, da empresa IDT DNA, para a confecção dos primers
específicos onde usou-se a opção “qPCR Intercalating Dyes (Primers only)”. Os
parâmetros utilizados para o desenho dos primers foram: tamanho do primer de 17 a 22
pares de bases, quantidade de GC aceitável de 48%, temperatura de melting dos primers
entre 59ºC a 62ºC, concentração de Na+ de 50mM, concentração de Mg++ de 1,5mM e
concentração de dNTP de 0,2mM.
A fim de avaliar a qualidade dos primers quanto às estruturas de Hairpin, Self-
Dimer e Hetero-Dimer, utilizou-se a plataforma Oligo Analizer Tool, também da
empresa IDT DNA, onde avaliou-se a TM de Hairpin e Delta G aceitáveis para Self-
Dimer e Hetero-Dimer sendo maior que -5.
Depois de escolhidos os melhores primers seguindo os parâmetros descritos,
estes ainda passaram na plataforma Primer Blast, do NCBI, para a confirmação da
eficiência dos primers nas sequências amplificadas.
3.2.10 Reação de PCR Real – Time (qPCR) para as quantificações das amostras
As reações de Real – Time PCR (qPCR) foram realizadas no aparelho StepOne™
System (Applied Biosystems) e utilizando o reagente SYBR® Green PCR Master Mix.
Inicialmente, foi feito um teste para a otimização das concentrações dos primers a serem
utilizados. As concentrações testadas são descritas na tabela abaixo:
34
Tabela 1: Combinações de primers feitas na PCR Real – Time.
Foram calculados os volumes das concentrações dos primers e à reação foi
adicionado 5µL de SYBR Green e 5ng de DNA. As reações foram realizadas em
triplicata para a detecção de possíveis erros, controles negativos foram adicionados às
análises para a detecção de possíveis contaminações e controles positivos (genes de
referência) foram adicionados para o controle da eficiência dos reagentes. Para a
detecção da diferença nos níveis de Rex 1 para a quantificação absoluta das amostras foi
feita uma curva padrão das amostras com quantidade de DNA conhecidas e adicionadas
às análises de cada placa gerada.
35
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados obtidos com a análise quantitativa de Rex 1 e o mapeamento
cromossômico, são apresentados no Artigo 1 dessa dissertação. No artigo 2 será
apresentado o software FLIMA (Fluorescence Image Analisys), desenvolvido
especificamente para a quantificação dos sinais fluorescentes obtidos pela FISH.
Capítulo 1: Artigo 1 – Quantificação diferencial e mapeamento cromossômico
do elemento retrotransponível Rex1 em Colossoma macropomum (Serrasalmidae:
Characiformes) expostos a estresse ambiental por cobre (Cu++).
Capítulo 2: Artigo 2 – Fluorescence Image Analyzer – FLIMA: Software para
análise quantitativa da hibridização in situ (FISH).
36
4.1 Capítulo 1 - Artigo 1: Quantificação diferencial e mapeamento cromossômico
do elemento retrotransponível Rex1 em Colossoma macropomum (Serrasalmidae,
Characiformes) expostos a estresse ambiental por cobre (Cu++) (revista a ser
definida)
Hallana Cristina Menezes da Silva1, Leila Braga Ribeiro2, Adolfo José da Mota3, Eliana
Feldberg2, Daniele Aparecida Matoso1.
1 Universidade Federal do Amazonas, Laboratório de Evolução Aplicada;
2 Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Laboratório de Genética Animal;
3Universidade Federal do Amazonas – Laboratório de Biodegradação.
4.1.1 Introdução
Os elementos transponíveis (TEs) possuem a capacidade de se mover e se
integrar ao genoma do organismo hospedeiro e acredita – se que, por possuírem essa
habilidade, dependendo dos diferentes tipos de estressores e dos cenários ambientais aos
quais os organismos hospedeiros são submetidos esses TEs desencadeiem diferentes
respostas adaptativas nos genomas. Por essa razão, acredita-se que os TEs sejam os
moduladores da regulação do genoma, sendo responsáveis por sua capacidade
adaptativa através da variabilidade genética que eles podem gerar (Kazazian, 2007). Os
retrotransposons representam a classe I de TEs que possuem como intermediário o
RNA, que através da transcriptase reversa se insere no genoma via cDNA (Volff, et al,
2003; Kazazian, 2007). Os retrotransposons podem ter duas classificações: os
retrotransposons LTRs (Long Terminal Repeat), que possuem repetições terminais
longas flanqueando o retrotransposon; e os retrotransposons não – LTRs, que podem ser
classificados como elementos LINEs (Long Interspersed Elements) e SINEs (Short
Interspersed Elements) (Xiong & Eickbush, 1998; Voytas et al., 2002).
O Rex 1 é um retrotransposon da família Rex e foi descrito por Volff et al. (2000),
isolado primeiramente em Xiphophurus maculatus. Os retrotransposons da família Rex
são classificados como retrotransposons não – LTR e acredita – se que eles possuam a
capacidade de transferência horizontal entre e dentro das espécies (Volff et al., 2000).
37
O Rex 1, assim como os demais elementos da família Rex, já foi caracterizado em
diversas espécies de peixes, mostrando uma distribuição ampla no genoma desses
animais e apresentando um papel importante na dinâmica evolutiva desse grupo (Volff
et al, 1999; Volff et al, 2000; Volff et al, 2001). Acredita – se que, assim como outros
retroelementos, o mecanismo de transposição desses elementos dentro do genoma do
hospedeiro não seja aleatório, podendo ser mediado por sinais celulares ou situações de
estresse como fatores externos e ataque de parasitas (Charlesworth & Langley, 1986;
Deininger et al, 2003; Almeida & Carareto, 2005; Burt & Trivers, 2006).
Os retrotransposons vem sendo cada vez mais estudados como fonte de
variabilidade genética frente a estresse ambiental. Atualmente, estudos realizados em
peixes amazônicos sustentam a hipótese de que os retrotransposons da família Rex
possuem um mecanismo de resposta a condições de estresse, seja por características
fisico – químicas dos diferentes tipos de água, ou por poluição dos ambientes aquáticos
(Barbosa et al, 2014; Silva et al, 2016).
Um dos fatores que pode ser considerado estressante para peixes mantidos em
cativeiro é a utilização de sulfato de cobre (CuSO4) por piscicultores. Essa substância é
utilizada no controle da proliferação de matérias orgânicas nos tanques e de parasitas
(Beaumont et al, 2000; Novelli – Filho et al, 2000), mas pode ser nociva ao organismo,
sendo capaz de causar alterações fisiológicas nos indivíduos (Nriagu, 1990).
Considerando que o sulfato de cobre é um agente estressor comumente utilizado
na criação intensiva do tambaqui (Colossoma macropomum) e a possibilidade de
elementos transponíveis da família Rex serem ativados mediante estresse ambiental, o
nosso estudo buscou, através da análise de mapeamento cromossômico por hibridização
in situ por fluorescência e da quantificação absoluta através da PCR Real – Time,
analisar o comportamento do retrotransposon Rex 1 em exemplares de tambaqui
submetidos ao contato com sulfato de cobre.
38
4.1.2 Material e Métodos
4.1.2.1 Desenho experimental
Sessenta juvenis de tambaqui (Colossoma macropomum), oriundos de
piscicultura, foram distribuídos em 6 tanques de polietileno de 240 litros, com 10
animais em cada tanque. Durante duas semanas os animais foram aclimatados e
alimentados uma vez ao dia com ração comercial (36% de proteína). Após esse período
os três primeiros tanques, escolhidos como tanques experimentais receberam 30% da
CL50 calculada de cobre descrita para o tambaqui (CL50-96h = 0,380 mg/L; 30% CL50-
96h = 0,114 mg/L) (Figueiredo et al., 2014) e seu sistema de água foi fechado. Os três
tanques restantes foram os dos animais utilizados como animais controle e também
tiveram o sistema de água foi fechado.
Após 48h, 5 animais de cada tanque foram anestesiados com água gelada e
sacrificados. Esse processo se repetiu após o período de 72h. De todos os animais
retirou-se rins, para as análises citogenéticas e músculo, para as análises de
quantificação absoluta.
4.1.2.2 Extração de DNA e Reação em cadeia da Polimerase (PCR)
Estas etapas foram utilizadas tanto para a quantificação absoluta por PCR Real
– Time, quanto para as análises de Hibridização in situ por Fluorescência.
A extração de DNA das amostras de músculos coletadas dos espécimes de
Colossoma macropomum foram feitas seguindo o protocolo de Sambrook et al., 1989
utilizando fenol – clorofórmio. Seguinte a extração de DNA, foi realizada uma
amplificação por PCR onde os primers utilizados foram descritos por Volff et al., 2000,
RTX1 F1 (5’ TTC TCC AGT GCC TTC AAC ACC 3’) e RTX1 R3 (5’ TCC CTC AGC
AGA AAG AGT CTG CT 3’). Ajustada para um volume final de 20µL, a reação foi
feita utilizando tampão de reação 1X, Dntp 2,5Mm, primers a 5pmol, 1U de Taq DNA
Polimerase, 1,5mM de MgCl2 e uma concentração de DNA de 20ng. A ciclagem da
reação foi de: 94ºC durante 2 minutos, 94ºC durante 1 minuto, 54ºC durante 1 minuto,
72ºC durante 2 minutos (35 ciclos) e 72ºC durante 5 minutos. A eficiência da reação foi
confirmada em gel de agarose 1,5%. O produto utilizado para a obtenção das sondas foi
39
quantificado em Nanovue e o produto utilizado para a síntese de primers específicos,
para a PCR Real – Time, foi clonado e sequenciado.
4.1.2.3 Clonagem
Para a clonagem foi utilizado o plasmídeo pGEM – T Easy (Promega), onde os
produtos de PCR de Rex 1 foram inseridos. As células competentes para a inserção do
plasmídeo clonado fora de linhagem DH5α de Escherichia coli e foram transformadas
por quimiocompetência. Esses plasmídeos foram alinhados com a enzima de restrição
NCOI.
4.1.2.4 Sequenciamento das amostras clonadas para a quantificação por PCR Real –
Time (qPCR)
A reação de sequenciamento foi realizada seguindo o protocolo do kit ABI
PRISM® Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction seguindo as
orientações do fabricante e a placa foi precipitada utilizando o protocolo de precipitação
com NG. Ao final da precipitação foram adicionados 10µL de formamida Hi – Di. A
análise das sequencias foram feitas nos programas FinchTV versão 1.4 (Geospiza, Inc.),
SeqScanner 2 (Applied Biosystems) e MEGA 6. Para a verificação da homologia
nucleotídica e confirmação das sequencias como sendo de Rex1, foi feito um BLASTn,
na plataforma BLAST do NCBI.
4.1.2.5 Confecção de primers específicos para a reação de PCR Real – Time (qPCR)
A confecção dos primers foi realizada no site da empresa IDT DNA, na
plataforma Primer Quest Tool, onde os parâmetros utilizados foram: tamanho do primer
de 17 a 22 bases, quantidade de GC aceitável de 48%, temperatura de melting entre 59ºC
e 62ºC, concentração de Na+ de 50mM, concentração de Mg++ de 3 mM e concentração
de dNTP de 0,2mM. Os primers desenhados foram avaliados quanto às estruturas de
Hairpin, Self – Dimer e Hetero – Dimer.
4.1.2.6 Reação de PCR Real – Time (qPCR) para a quantificação absoluta das amostras
As reações de qPCR foram realizadas no aparelho StepOne™ (Applied
Biosystems). As reações foram feitas utilizando SYBR Green Master Mix 0,5µL,
0,2pmol de primers e aproximadamente 5ng de DNA genômico. As amostras foram
40
feitas em triplicata, o controle negativo foi adicionado à análise e o gene normalizador
28S descrito para Astronottus ocellatus foi utilizado como controle positivo. Os
resultados foram analisados foram através do cálculo de moléculas.
4.1.2.7 Análises estatísticas
Para as análises estatísticas da quantificação absoluta por PCR Real – Time,
foram utilizados os testes de Kolmogorov – Smirnov para a verificação de distribuição
normal das amostras, e o teste T de Student, para verificar o nível de significância dos
dois tratamentos utilizados no experimento. Ambos os testes foram feitos através do
Software R (The R Project for Statistical Computing – The R Foundation).
4.1.2.8 Bandeamento C
A técnica de banda C foi realizada utilizando o protocolo de Sumner, 1972, com
algumas modificações. As lâminas foram tratadas em HCl 0,2N durante 2 minutos,
lavadas em água destilada e secas ao ar. Seguindo o protocolo, foram tratadas com
Hidróxido de Bário (BaOH) a 42ºC durante 2 minutos e 20 segundos, depois lavadas
em HCl 0,2N a 42ºC durante 20 segundos, depois lavadas com 2X SSC a 60ºC durante
20 minutos e coradas posteriormente com Iodeto de Propídeo.
4.1.2.9 Hibridização in situ por fluorescência (FISH)
A localização cromossômica das sequências Rex 1 foi feita segundo protocolo
de Pinkel et al (1986), como modificações. Foram utilizadas sondas homólogas
marcadas via Nick translation com digoxigenina (Kit DIG-Nick Translation Mix –
ROCHE), segundo orientações do fabricante. Para a quantificação da intensidade de
sinais da FISH aplicou –se software FLIMA com taxa de distinção de cores de 220 para
três cores analisadas: vermelho, azul e preto.
4.1.3 Resultados
Foram coletadas e extraídas amostras de DNA de 60 espécimes de tambaqui, das
quais 20 apresentaram melhor amplificação da sequência de Rex 1 por PCR. Das 20
amostras utilizadas, 8 eram amostras experimentais expostas por 48 horas ao cobre
41
(T01, T02, T04, T07, T08, T10, T12 e T14), 3 eram amostras controles de 48 horas
(T19, T20 e T21), 4 eram amostras experimentais de 72 horas expostas ao cobre (T32,
T37, T38, T40, T49, T50) e 5 eram amostras controles de 72 horas (T53, T55 e T56). O
valor de R2 (Coeficiente de Determinação de Regressão) da curva padrão para o
experimento foi de 0,98 e sua eficiência foi de 87% de acordo com a reação de PCR
Real – Time.
Numa análise panorâmica geral do número de cópias de elementos Rex 1 nos
grupos controle e experimental observou – se que no tempo de 72 horas houve maior
número de cópias do elemento quando comparados ao tempo de 48 horas (Figuras 1 e
2). O aumento do número de cópias foi sutil no grupo de 48h (número máximo de cópias
Rex1 no experimental de 70,000,000) e visivelmente superior no grupo de 72h (número
máximo de cópias Rex1 no experimental 400,000,000)
Figura 1: Quantificação das amostras que tiveram 48h de exposição ao metal (T01, T02, T04, T07, T08, T10, T12 e T14, amostras experimentais; T19, T20 e T21,
amostras controle). O eixo y do gráfico corresponde a escala do número de cópias de Rex 1.
0
10000000
20000000
30000000
40000000
50000000
60000000
70000000
80000000
T01 T02 T04 T07 T08 T10 T12 T14 T19 T20 T21
48 horas de Exposição
42
Figura 2: Quantificação das amostras que tiveram 72 horas de exposição ao metal (T32, T37, T38, T40, T49 e T50, amostras experimentais; T53, T55 e T56, amostra controle). O eixo y do gráfico corresponde a escala do número de cópias de Rex 1.
Para testar o nível de significância das quantificações diferenciais, uma análise
estatística comparativa das médias foi desenvolvida para averiguar se as diferenças
observadas entre os grupos controle e experimental 48h e 72h eram significativas ou
não.
Assim, no gráfico da figura 3, que compreende as amostras dos grupos controle
e experimental expostas à 48 horas ao sulfato de cobre, pode – se visualizar que houve
sobreposição de valores das médias de ambos os tratamentos, indicando que 50% das
amostras do grupo controle possuem número de cópias de Rex 1 semelhantes ao grupo
experimental e o teste T de Student mostrou que não houve diferença significativa entre
as amostras.
0
50000000
100000000
150000000
200000000
250000000
300000000
350000000
400000000
450000000
T32 T37 T38 T40 T49 T50 T53 T55 T56
72 horas de Exposição
43
Figura 3: Gráfico para as amostras expostas à 48h ao sulfato de cobre (Cu) apresentando sobreposição de valores das médias entre o grupo experimental e o grupo
controle. Os números de cópias são apresentados em escala logarítmica.
Por outro lado, ao observamos o gráfico da figura 4 que apresenta as amostras
analisadas para 72 horas de exposição dos animais ao sulfato de cobre, visualizamos que
os dados se comportam dentro de uma abordagem de distribuição normal de acordo com
o teste Kolmogorov – Smirnov que foi aplicado para esta verificação, apresentando
valor de 0,6347 ou 63,47%. O teste T de Student mostrou que houve diferença
significativa entre os dois tratamentos, no nível de significância de 10% (o valor de
probabilidade calculado foi de 6,5%).
44
Figura 4: Gráfico das amostras sob exposição de 72h ao sulfato de cobre (Cu). As diferenças observadas entre as médias dos grupos controle e experimental são
estatisticamente significativas. O grupo experimental de 72 horas apresenta um número expressivamente maior de cópias do elemento Rex 1 nas amostras. Os
números de cópias são apresentados em escala logarítmica. Tabela 1: Valores de número de cópias apresentados a partir da fórmula de avogrado
para as amostras de DNA de tambaqui analisadas.
45
Em relação a abordagem citogenética, tendo em vista que os animais foram
utilizados tanto para as análises citogenéticas quanto para as análises de quantificação
absoluta, não foi possível realizar a indução de mitoses para a obtenção das preparações
cromossômicas. Sendo assim, o índice mitótico observado nos indivíduos foi baixo. As
análises citogenéticas foram realizadas apenas nos indivíduos da condição controle e
experimental de 48 horas. Os animais da condição experimental 72 horas não
apresentaram resultados satisfatórios.
Os indivíduos analisados apresentaram número diploide igual a 54
cromossomos, entretanto, sutis diferenças foram observadas na distribuição da
heterocromatina. Para ambas as condições analisadas (controle e experimental de 48
horas) foram observados blocos heterocromáticos predominantemente nas porções
centroméricas (Figura 2a e 2b), porém, nos exemplares expostos ao sulfato de cobre
observou – se um pequeno aumento na quantidade de heterocromatina. Nesses animais,
além dos blocos heterocromáticos centroméricos, foram detectados também blocos de
heterocromatina dos braços curtos e em quase a totalidade de alguns cromossomos.
46
Figura 5: Distribuição da heterocromtina pelo bandeamento C e mapeamento
cromossômico pela FISH do elemento transponível Rex 1 em C. macropomum expostos à 48 horas de sulfato de cobre 30% da CL50. a) pouca heterocromatina
visualizada na metáfase de um espécime do grupo controle; b) muitos blocos heterocromáticos visualizados na metáfase do espécime do grupo experimental,
incluindo cromossomos quase totalmente heterocromatinizados (cabeça da seta); c) FISH da amostra controle evidenciando poucas marcações visíveis do elemento retrotransponível Rex 1; d) FISH da amostra experimental evidenciando grande
número de marcações de Rex 1.
Com relação à localização cromossômica dos retrotransposons Rex 1 pode – se
afirmar que os mesmos apresentam um padrão de distribuição predominantemente
disperso nas duas condições (controle e experimental de 48 horas). No entando, na
condição experimental as marcações foram mais visíveis e em maior número, marcando
quase toda a extensão de alguns cromossomos (Figura 2d). Essas sequências Rex 1
parecem estar presentes tanto em porções eucromáticas quanto em porções
47
heterocromáticas dos cromossomos (Figura 2c e 2d). Embora o elemento Rex 1 tenha se
mostrado disperso em todos os animais analisados, foi visto em pouca quantidade nos
animais da condição controle, enquanto nos animais submetidos a 48 horas de sulfato
de cobre obervou-se um aumento no número de sítios de Rex 1 e na intensidade das
marcações, que distribuíram – se
Em relação ao coeficiente de fluorescência gerado pelo FLIMA observou-se na
figura 2c, um coeficiente de 0, 01190476 (1,19%), e para a figura 2d um coeficiente de
0,0178571 (1,78). Esses valores sugerem um aumento no número de sítios marcados de
Rex 1 entre as condições analisadas.
4.1.4 Discussão
Há algum tempo atrás, o estresse era definido como um processo que reduz
drasticamente o fitness de uma população através de uma mutação. Atualmente,
sabemos que ele pode diminuir o fitness da população, mas pode também apenas gerar
repostas moleculares que interfiram no genótipo e/ou fenótipo dos indivíduos de uma
população (Koehn & Bayne, 1989; Hoffmann & Passons, 1991; Bijlsma & Loeschcke,
1997; Bazin, 2000).
Os elementos transponíveis (TEs) são os maiores componentes do genoma dos
organismos, chegando a corresponder até 50% deste e em alguns organismos, tais como
o milho, as regiões codificantes são apenas pequenas ilhas flutuando em um mar de
retrotransposons (Mita & Boeke, 2016). Vários estudos foram realizados em busca do
entendimento da interação entre os TEs e o genoma do hospedeiro, e nesses estudos
ficou conhecido que os TEs dependem da maquinaria do organismo para a sua
funcionalidade. Esses TEs também foram caracterizados como possuindo a capacidade
de transferência horizontal e sendo capazes também de, durante a sua transposição, levar
alguns genes ou parte deles consigo tendo impacto sobre a sua expressão. Então, propôs-
se que existe uma co-evolução entre TEs e genomas hospedeiros (Capy et al., 2000).
Além disso, os TEs são componentes comuns em diversos mecanismos epigenéticos e,
de acordo com Slotkin & Martienssen (2007), os TEs estão relacionados com esse tipo
de mecanismo de regulação.
48
Devido a essa natureza aleatória de funcionamento (ativação/inativação), sem
uma relação causal direta, muitos elementos apresentam flutuações quanto às respostas
aos ambientes estressantes e aos efeitos em nível individual e genômico. Essa variação
pode se referir ao tipo de resposta do organismo, ao tipo de estresse, ou ao tipo de
regulação ao qual o TE está submetido. Nesse contexto, os TEs do tipo retrotransposons
são os que apresentam a maior faixa de variações possíveis (Capy et al., 2000). De fato,
no curso de milhões de anos, os TEs alcançaram um equilíbrio dinâmico entre os efeitos
negativos em nível individual e os efeitos positivos em nível genômico (Kazazian – Jr,
2007).
Na presente abordagem observou – se que o elemento retrotransponível Rex 1
de C. macropomum apresentou – se ativo no decorrer do experimento. Isso pôde ser
constatado pela observação de um aumento no número de cópias de Rex 1 nos animais
que sofreram exposição ao sulfato de cobre em 48 e 72 horas em relação à condição
controle. Apesar do o teste T de Studet não apresentar, para as amostras expostas a 48
horas de sulfato de cobre, uma diferença significativa, foi possível observar pela FISH
e pelo coeficiente de fluorescência um aumento sutil no número de cópias nos
indivíduos expostos ao sulfato de cobre. Complementar a isso, temos o aumento na
quantidade de blocos heterocromáticos nos indivíduos mantidos por 48h em contato
com sulfato de cobre em relação aos animais da condição controle. Essa dispersão de
heterocromatina pode ser considerada uma resposta epigenética ao contato com sulfato
de cobre, uma vez que mecanismos epigenéticos como modificação de histona,
metilação do DNA e heterocromatinização podem surgir como respostas rápidas a
mudanças ambientais. Vale ressaltar que o surgimento de blocos heterocromáticos
também pode estar relacionado com o aumento na quantidade de sítios de Rex 1. Embora
sejam abundantes no genoma, elementos transponíveis permanecem silenciados a maior
parte do tempo, e mecanismos como heterocromatinização são conhecidos por reprimir
a atividade dessas sequências móveis (Okamoto & Hirohiko, 2001; Mansour 2007).
Vários estudos relacionam a atividade de TEs com a adaptação ambiental,
deixando clara a sua relação com a mudança fenotípica adaptativa. Alguns trabalhos
foram fundamentais para estabelecer qual relação havia entre os TEs e essa adaptação.
Em seu trabalho de revisão sobre TEs, Casacuberta & González (2013) citam alguns
exemplos de trabalhos responsáveis pelo entendimento dessa relação. Stoebel et al.,
(2009), estudou a relação entre os TEs e a adaptação a alta osmolaridade utilizando
49
Escherichia coli, Sun et al., (2009), estudou a relação entre os TEs e a tolerância a
solventes orgânicos utilizando Candida tropicalis, Candida albicans, Sacharomyces
cerevisiae e Schizosaccharomyces pombe, Chou et al., (2009) estudou a relação entre
os TEs e às condições limitadas de metal em Methylobacterium extorquens, e Gaffé et
al., (2011) estudou a relação entre TEs e as condições limitadas de nutrientes em
Escherichia coli. Todos esses estudos concluíram haver uma relação direta entre as
condições de estresse e a ativação dos TEs.
Quando se fala de estudos sobre elementos transponíveis, principalmente
retrotransposons, e estresse ambiental em peixes, possuímos uma certa carência quanto
a dados desse tipo. Dois trabalhos na Amazônia foram os pioneiros sobre esse estudo
em peixes amazônicos. Ribeiro, (2013) realizou o mapeamento cromossômico de Rex
1, Rex 3 e Rex 6 em espécimes de Colossoma macropomum, o tambaqui da Amazônia,
aclimatados em três diferentes temperaturas (28ºC, 30ºC e 32ºC) e como resultado
obteve que, na menor temperatura os animais possuíam mais marcações em comparação
com as outras amostras estudadas. Esse resultado corroborou a hipótese de que esses
retrotransposons teriam uma resposta ao estresse ambiental por mudança de
temperatura. Silva et al., (2016) realizaram um estudo com espécimes de Hoplosternum
litoralle, o tamoatá da Amazônia, onde, através do mapeamento cromossômico
analisaram as marcações de Rex 3 em espécimes coletados em ambientes com água
poluída e ambientes com água não poluída e observaram que os níveis de marcação de
Rex 3 nos ambientes de água poluída eram maiores que nos de água não poluída. Esses
dois estudos em peixes amazônicos corroboram a ideia de estudos anteriores de que os
TEs possuem resposta a alterações ambientais.
Os resultados encontrados neste trabalho pela utilização de duas metodologias
distintas (PCR Real – Time através da quantificação absoluta e FISH), nos permite
afirmar que o retrotransposon Rex 1 também pode ter um aumento em sua transposição
mediante o estresse ambiental pela contaminação com sulfato de cobre em ambientes
aquáticos. As reais consequências desse transporte e inserção de genes nos genomas
desses espécimes ainda é uma questão aberta que deverá ser tratada em futuras
abordagens que visem a compreensão do funcionamento dos mecanismos genéticos e
epigenéticos adaptativos requeridos pelo organismo para enfrentar diferentes desafios
ambientais. É, entretanto, inegável o papel dos TEs em importantes eventos de controle
da expressão gênica e do genoma como um todo, favorecendo processos como a
50
especiação, a variabilidade genética, a plasticidade fenotípica e a maleabilidade
genômica nas espécies. Além disso, o presente estudo também proporcionou maior
conhecimento sobre a organização genômica do tambaqui, e mostra – se importante para
subsidiar estudos de genética aplicada.
51
4.2 Capítulo 2 - Artigo 2: Fluorescence Image Analyzer – FLIMA: Software para
análise quantitativa da Hibridização in situ (FISH)
Hallana Cristina Menezes da Silva1, Daniele Aparecida Matoso1, Leila Braga Ribeiro2,
Maximiliano Moraes de Cervinho Martins Júnior3.
1 Universidade Federal do Amazonas, Laboratório de Evolução Aplicada;
2 Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Laboratório de Genética Animal;
3 Empresa Fermen.to, Programador.
4.2.1 Introdução
O termo citogenética nasceu da junção dos estudos de citologia e genética,
quando foi proposta a teoria da herança cromossômica baseada nas leis mendelianas e
em trabalhos citológicos. Logo, quando se faz um estudo com base em um cromossomo
isolado ou em conjunto, condensado ou distendido, com relação à morfologia,
organização, função e replicação, esse estudo é denominado estudo citogenético
(Guerra, 1988). A citogenética pode ser dividida em dois ramos: citogenética clássica,
que envolve técnicas de coloração convencional, impregnação por nitrato de prata e
bandeamento C; e, citogenética molecular, também denominada citogenômica, que
abrange a técnica de Hibridização in situ por fluorescência e suas derivações.
A principal técnica utilizada na citogenômica foi descrita em 1986 e chama-se
Hibridização in situ por Fluorescência (FISH) (Pinkel et al., 1986). Esta técnica é
baseada na marcação de sondas com fluorocromos, a partir da ligação
antígeno/anticorpo, essas sondas são hibridizadas no DNA cromossomal marcando a
região que se procura no cromossomo e depois visualizada em microscópio de
fluorescência. Atualmente, as análises das imagens de FISH geradas no microscópio de
fluorescência são feitas apenas de forma empírica e subjetiva, não tendo, até o momento,
um método quantitativo como forma de análise. Com o desenvolvimento da técnica de
FISH, o número de sequências de DNA estudadas vem sendo cada vez maior, e envolve
sequências de DNA repetitivo, de cópia única, de sequências com organização em
clusters ou localização dispersa ao longo dos cromossomos.
52
Pela falta de um método que permita uma análise quantitativa dos sinais
fluorescentes gerados pela técnica de FISH, sequências que se apresentam dispersas no
genoma dos organismos (como por exemplo, microssatélites e elementos transponíveis)
podem ter sua localização subestimada. Esse tipo de análise é ainda dificultada em
trabalhos onde se faz necessária uma análise comparativa dos dados obtidos, portanto,
o desenvolvimento de uma forma quantitativa e objetiva de análise da distribuição
cromossômica dessas sequências é importante, e que permita ainda a comparação entre
as imagens de FISH. Para tanto, criamos um software capaz de quantificar as
fluorescências geradas pelo microscópio de fluorescência em imagens. Esse software é
capaz de quantificar sondas de digoxigenina, que apresentam uma cor vermelha, sondas
de biotina, que apresentam a cor verde, e sondas de DOUBLE FISH que são as duas
sondas (digoxigenina e biotina) utilizadas juntas, onde é apresentada a cor branca. O
FLIMA (Fluorescence Image Analysis), quantifica a intensidade das sondas,
apresentando o valor encontrado em forma de coeficiente chamado Coeficiente de
Fluorescência.
4.2.2 Material e Métodos
Linguagem utilizada: PHP.
Biblioteca utilizada: GD Graphics Library.
Informações analisadas pelo programa:
a) Imagem: a imagem gerada pelo microscópio de fluorescência quando as lâminas são
analisadas. Estas imagens precisam estar devidamente editadas e sem background
(apresentando apenas os cromossomos que serão quantificados).
b) Quantidade de cores desejadas para quantificação: se refere à quantidade de sondas
utilizadas para a hibridização e as cores que elas apresentam na imagem.
c) Taxa de tolerância: se refere ao nível de semelhança aceito entre as cores.
Forma de análise: O sistema fragmenta a imagem e esta é analisada pixel por
pixel, reconhecendo a cor do pixel e armazenando o valor encontrado. Ao final da
análise, todas as informações são agrupadas de acordo com a semelhança entre as cores,
53
a quantidade de pixels relacionadas a cada cor é convertida proporcionalmente para o
coeficiente de fluorescência.
4.2.3 Resultados e Discussão
O FLIMA – Fluorescence Image Analyzer é um software desenvolvido para
quantificação das imagens de Hibridização in situ por Fluorescência geradas pelo
microscópio de fluorescência. Em estudos onde se faz necessário uma análise
comparativa das imagens, por exemplo, trabalhos onde se comparam números de
marcações cromossômicas de um determinado elemento repetitivo no DNA de um
organismo encontrado em diferentes ambientes, este software pode fornecer uma
quantificação numérica de qual organismo possui mais marcações. O FLIMA foi criado
com o propósito de termos um coeficiente de fluorescência, onde este coeficiente possa
ser aplicado na comparação das imagens. Imagens que apresentam maior coeficiente
são aquelas que possuem mais marcações. Este software pode ser usado para qualquer
tipo de imagem gerada por um microscópio de fluorescência.
A figura 1 apresenta a interface criada para o FLIMA, apresentando também suas
respectivas funções. A figura 2 trata da forma como o FLIMA analisa as imagens
depositadas e como podemos interpretar o coeficiente fornecido.
Para a análise das imagens, estas precisam estar editadas e sem background, ou
seja, as imagens precisam estar sem escalas ou qualquer outro tipo de figura que não
sejam parte dos cromossomos para análise (1). Uma vez selecionada a imagem, precisa-
se informar ao software quantas cores são esperadas na imagem a ser analisada,
geralmente para as imagens de FISH selecionamos apenas 3 cores (mas, podem ser
selecionadas quantas cores a imagem possuir): o plano de fundo da imagem que é preto,
os cromossomos corados com DAPI que apresentam a coloração azul e as marcações
feitas nos cromossomos que são as cores apresentadas dependendo da sonda que for
utilizada (2). Depois de serem selecionadas as cores, a taxa de tolerância deve ser
escolhida de acordo com o nível de semelhança aceito entre as cores. A taxa de
tolerância é utilizada para medir o grau de semelhança entre as cores na imagem, se esta
estiver muito baixa o software considera cores aproximadas como distintas, se estiver
muito alta, este considera as cores primárias como iguais. Como na imagem apresentada
54
pelo microscópio de fluorescência os tons de vermelho podem variar entre rosa claro,
escuro e vermelho, a taxa recomendada para a análise é de 220 (3). Escolhidos os
primeiros comandos para a imagem, pode-se escolher a opção “analisar” (4). Uma vez
que o software analisa a imagem, este apresenta o coeficiente de fluorescência para cada
cor (5).
O software será disponibilizado para comercialização uma vez feitos todos os
processos de proteção de propriedade intelectual, mas, sua negociação poderá ser
realizada mediante contato com os desenvolvedores.
55
Figura 1: Interface inicial do software FLIMA.
4
3
2
1
56
Figura 2: Interface de resultado das análises do software FLIMA. O valor 99,95 apresenta o valor de CF (Coeficiente de Fluorescência) para a cor preta. O valor 0,029 apresenta o valor de CF para a cor azul. O valor 0,017 apresenta o valor de CF para a cor vermelha. Para a
interpretação dos resultados pode – se dizer que há 1,7% de tons de vermelho na imagem. Os valores a serem comparados entre as imagens podem dar – se pelo valor de CF ou em escala de porcentagem.
5
57
5. CONCLUSÕES GERAIS
Os resultados obtidos nesse trabalho mostram que:
Os espécimes expostos às concentrações equivalentes à 30% da CL50 de sulfato
de cobre para tambaqui no período de 72 horas apresentaram aumento
significativo no número de cópias do elemento retrotransponível Rex 1 quando
comparados aos espécimes do grupo controle;
Em relação ao mapeamento cromossômico, a análise visual da FISH, bem como
o coeficiente de fluorescência, mostrou maior intensidade de sinal em metáfases
de indivíduos que foram expostos ao agente estressor sulfato de cobre no
período de 48h de exposição;
O software desenvolvido para a analisar quantitativamente sinais da FISH foi
eficiente em detectar diferenças entre as metáfases do grupo controle e do grupo
experimental;
Os resultados gerados por esse trabalho servirão de subsídios para
desenvolvimento de estratégias que visem a compreensão do funcionamento do
genoma, bem como servirão de base para estudos de genética aplicada.
58
6. REFERÊNCIAS
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