guião do professor versão a

8/7/2019 Guio do professor verso A

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Guio do Professor

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Guio do professorVERSO A


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NDICE Pgina

Introduo 3

Parte I Enquadramento terico da actividade 5

Parte II Planificao da actividade 12

Parte III Problematizao da actividade 13

Parte IV Procedimentos protocolares 16

Parte V Anlise e discusso dos resultados 19

Parte VI Actividade complementar 20

Parte VII Glossrio 23

Apndices

Apndice I Power-point Kit BioExperimentando - Preparando a 25

actividade laboratorial

Apndice II Power-point Kit BioExperimentando - Anlise e discusso 27

da actividade experimental

Anexos 33

Anexo I Plasmdios utilizados: pUC18 e pCR2.1. - TOPO

Referncias Bibliogrficas 34


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Introduo

O kit BioExperimentando resultado de um trabalho de investigao na rea da biotecnologia,

nomeadamente dos testes genticos, e surgiu da necessidade da criao de actividades laboratoriais

didcticas nesta rea do conhecimento em profundo desenvolvimento.

A Biotecnologia surge integrada nos programas de ensino de Cincias, quer do 3 ciclo do Ensino

Bsico, quer do Ensino Secundrio. Relativamente ao 3 ciclo do Ensino Bsico, est apenas presente num

ponto do quarto tema geral Viver melhor na Terra. Encontra-se inserida no captulo Transmisso da

vida onde se sugere que Os alunos devem ter oportunidade para reflectirsobre algumas aplicaes e

possveis consequncias da manipulao do material gentico. A discusso de notcias veiculadas na

comunicao social (relativas, por exemplo, clonagem, reproduo medicamente assistida) pode

contribuir para o reconhecimento de algumasrestries de natureza tica que se colocam investigao

cientfica .(1 )

A Biotecnologia assume de facto maior relevncia no Ensino Secundrio, nomeadamente no

programa de Biologia do 12 ano. finalidade de aprendizagem para a formao cientfica dos jovens o

reconhecimento da relevncia da Biologia e da Biotecnologia nos dias de hoje, uma vez que influenciam a

qualidade de vida das pessoas e a organizao das sociedades, ao apresentarem alternativas e originarem

questes que exigem tomadas de deciso a nvel tecno-cientfico, poltico, social e tico(www1). Segundo

o mesmo programa pretende-se enfatizar a influncia que, actualmente, a Biologia e a Biotecnologia

exercem sobre a vida das pessoas, visando-se, por isso, tanto o conhecimento de exemplos de produtos e

servios, como a reflexo sobre aspectos de natureza social, econmica e tica que contextualizaram a

sua gnese e/ou influenciaram.(2)

Assim, tendo em conta as orientaes dadas pelo Ministrio da Educao acima referidas, pretende-

se com a implementao deste kit que os alunos atinjam os seguintes objectivos:

estudar a transmisso de determinada caracterstica hereditria, atravs de tcnicas de

Engenharia Gentica;

analisar e interpretar casos de mutao, sua gnese e consequncias;

explorar procedimentos laboratoriais de manipulao do DNA;

compreender a importncia e modo de funcionamento das enzimas de restrio;

manipular o material de laboratrio de forma autnoma e responsvel;

despertar a curiosidade relativa metodologia desta investigao;

compreender a utilidade de algumas tcnicas utilizadas em Engenharia Gentica no

quotidiano dos cidados;

usar o pensamento crtico para resolver problemas;

discutir algumas questes ticas inerentes manipulao do DNA.

Este kit foi concebido para alunos do Ensino Secundrio do Curso de Cincias e Tecnologias do

12ano, no mbito da disciplina de Biologia. No entanto poder igualmente ser implementando na

disciplina de rea de Projecto, Roteiros/Feiras da Cincia, Clubes de Cincia ou oficinas da Universidade

Jnior, na rea da Gentica.


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Kit BioExperimentando

Etapas de implementao Vantagens da uti l izao Ajuda a ensinar

Introduo aos perfis de

DNA

Restrio das amostras

de DNA

Electroforese em gel de

agarose

Anlise e interpretao

de resultados

Uso de enzimas de restrio reais e

realizao de electroforese com

fragmentos de DNA real.

A actividade pode ser realizada em trs

sesses de 90 minutos (no entanto o

professor poder reajustar o tempo).

Material suficiente para 23 alunos.

Estrutura do DNA

Hereditariedade clssica

Mendeliana (autossmica ou

ligada ao sexo)

Anlise de restrio do DNA

Preparar um gel de agarose para

electroforese

Determinar o tamanho molecular.

Simulao de perfis de DNA

Anlise de mapas de restrio

Questes ticas inerentes aos

testes genticos.

Estratgia de ensino

O kit BioExperimentando uma actividade prtica, de laboratrio, que se baseia numa

simulao de uma triagem gentica numa famlia que possui uma doena hereditria fictcia. Nesta

actividade pretende-se que se integre a compreenso de processos genticos, com as tcnicas associadas,

e as respectivas questes ticas.

A escolha de uma doena fictcia para esta anlise, deve-se essencialmente ao facto de no se usar DNAhumano na actividade. Assim, embora se possa fazer paralelismo entre a doena fictcia apresentada e

doenas hereditrias reais que apresentem o mesmo padro de transmisso, evitam-se constrangimentos

de ordem tica, quer referentes manipulao de DNA humano, quer relativos a testes genticos e seus

resultados.

Os alunos tero que determinar a probabilidade de um determinado casal ter um filho doente, atravs da

anlise das amostras de DNA, aps restrio e separao electrofortica.

Medidas de seguranaNo permitido comer, beber, fumar no laboratrio ou rea de trabalho.

recomendado a utilizao de luvas e de uma bata de algodo.

Os alunos devem lavar as mos com gua e sabo antes e depois da actividade.

Se alguma soluo entrar em contacto com os olhos dos alunos devem ser imediatamente

lavados com gua.

Condies de armazenamento

Este kit deve ser guardado temperatura ambiente, com excepo das amostras de DNA. Aps a

chegada do kit, abra-o, retire o saco dos reagentes que inclui as amostras de DNA e guarde-oimediatamente no congelador a -20C.

Tabela 1 Potencialidades pedaggicas do kit BioExperimentando


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Parte I Enquadramento terico da actividade

A anlise de DNA humano tem aplicaes em duas grandes reas:

1. Cuidados de sade inclui o diagnstico de doenas hereditrias, mutaes cromossmicas e cancro.

2. Sistema judicial identificao de suspeitos em casos criminais (homicdio, rapto, roubo) e anlise

de relaes familiares em casos de disputa da paternidade e de imigrao.

Na presente actividade simula-se o diagnstico de uma doena fictcia, que afecta vrios membros de uma

famlia. So vrios os conceitos tcnicos e tcnicos inerentes implementao e compreenso da

actividade:

Enzimas de restrio

As endonucleases (endo = dentro, nuclease = enzima que corta cidos nucleicos) so enzimas que

reconhecem sequncias especficas de bases no DNA e so capazes de hidrolisar as cadeias de DNA.

Para alm da sua funo protectora na clula bacteriana, as enzimas de restrio tm tambm

extrema importncia em investigao cientfica, nomeadamente nos processos de clonagem de genes,

execuo de mapas de restrio ou na determinao do tamanho de molculas de DNA.

Uma enzima de restrio liga-se a uma molcula de DNA e desliza ao longo da hlice at reconhecer

sequncias especificas de pares de bases que indicam que esta deve parar de deslizar. A enzima corta

ento quimicamente o DNA naquele local, chamado local de restrio. Se um local de restrio especfico

ocorrer em mais do que um local numa molcula de DNA, a enzima de restrio ir cortar em cada um

desses locais, resultando mltiplos fragmentos. Do mesmo modo, se uma sequncia linear de DNA

cortada com uma enzima de restrio cujo local especfico de reconhecimento encontrado em dois locais

diferentes na molcula de DNA, o resultado ir ser de 3 fragmentos de diferentes tamanhos. Se o

fragmento de DNA circular e cortado com uma enzima de restrio cujo local especfico de

reconhecimento encontrado em dois locais diferentes na molcula de DNA, o resultado vai ser 2

fragmentos de diferentes tamanhos. O tamanho de cada fragmento vai depender da localizao dos locais

de restrio na molcula de DNA.

Quando as enzimas de restrio so usadas para cortar cadeias de plasmdios circulares de DNA, tal

como acontece neste kit, fragmentos de diferentes tamanhos so produzidos. O DNA que se cortou pode

ser observado usando um processo conhecido como electroforese em gel de agarose. Os fragmentos

resultantes podem depois ser usados para criar um mapa do plasmdio.As enzimas tm uma designao que deriva do nome cientfico da espcie bacteriana de onde

extrada, como o caso da enzima EcoRI, a primeira (I) a ser isolada da estirpe R da bactria Escherichia

coli.


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O gel de agarose

O gel de agarose prepara-se dissolvendo uma suspenso de agarose numa soluo tampo e

deixando arrefecer num recipiente apropriado. A agarose um polssacardeo derivado do agar, com

estrutura tridimensional, altamente purificado e livre de cargas (no influencia deste modo a migrao das

molculas) e impurezas (no provoca impedimento da migrao das molculas).

A agarose deve ser previamente pesada para a concentrao pretendida do gel e deve ser dissolvida na

soluo tampo com a ajuda de uma fonte de calor (em banho maria ou no microondas). Assim que a

soluo levantar fervura deve ser retirada da fonte de calor, pois se deixarmos ferver a malha do gel pode

ficar laxa, o que poder trazer implicaes na electroforese e nos resultados que deveremos obter.

A soluo deve ser vertida num molde apropriado quando atinge uma temperatura de cerca de 50C (ou

seja, quando pudermos pegar no recipiente directamente com a mo sem nos queimarmos).

Antes de vertermos a soluo de agarose no molde, devemos colocar um pente junto da extremidade

orientada para o plo negativo da tina de electroforese (uma vez que o DNA ir migrar para o plo

positivo) para obtermos um gel com uma fileira de poos.

Aps solidificao do gel, vertemos tampo de electroforese sobre o gel, e cuidadosamente retiramos o

pente, tendo o cuidado de no danificar os poos (nunca retirar o pente sem o gel estar submerso em

tampo de electroforese!). Posteriormente vertemos um pouco mais de tampo de electroforese sobre os

poos para eliminar eventuais resduos de agarose que no tenha sido polimerizada.

Dependendo da tina de electroforese que se utilizar, poder ser necessrio colocar fita isoladora no

recipiente onde se vai colocar a soluo de agarose, no sentido de limitar a respectiva rea de solidificao

da soluo de agarose. Noutras tinas, no necessrio o uso de fita isoladora, uma vez que existem uns

adaptadores de borracha que se colocam nas extremidades do recipiente do gel (figura1). Em qualquer

um dos casos, chama-se a ateno para o facto de ser necessrio retirar quer a fita isoladora quer os

adaptadores de borracha das extremidades do recipiente molde antes de submeter as amostras de DNA a

electroforese. Caso contrrio, a corrente elctrica no atravessar de forma eficaz o gel de agarose.

Electroforese

A electroforese consiste em fazer migrar biomolculas por uma matriz, sob a influncia de um

campo elctrico, permitindo separ-las segundo os seus tamanhos. Podem realizar-se electroforeses de

protenas, de RNA e de DNA. A electroforese em gel de agarose um procedimento utilizado em vrias

reas da biotecnologia, em laboratrios de investigao, medicina e de biologia forense. Esta tcnica

permite analisar fragmentos de DNA e determinar o seu tamanho.

Figura 1 Gel de agarose


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O DNA antes de ser carregado nos poos tem que ser tratado com tampo de amostra que tem vrias

funes: d cor amostra (azul de bromofenol ou xilenocianol), confere densidade (tem sacarose ou

glicerol) e mantm o pH alcalino. Os fragmentos de DNA so ento descarregados em poos, no gel de

agarose, que colocado numa tina cheia de tampo de electroforese (TAE ou TBE). O tampo de

electroforese fornece condutibilidade elctrica e mantm o pH que necessrio para a manuteno da

carga e estabilidade das molculas. O carregamento dos poos um procedimento que deve ser feito com

muito cuidado para no danificar os poos do gel. Quando procedemos ao carregamento, devemos

adoptar a posio que melhor permita uma total estabilizao da mo que segura a pipeta e que vai

carregar as amostras de DNA nos poos (figura 2). Assim pode-se adoptar uma posio em que com os

cotovelos bem pousados na bancada onde est a tina, se segure bem o punho da mo que vai pipetar

com a outra mo, para evitar tremer durante a pipetagem no gel, ou ento adoptar uma posio em que

no se apoiem os cotovelos, mas se consiga estabilizar a mo que vai proceder pipetagem nos poos

com a ajuda da outra mo, pois um simples toque nos limites do poo a carregar pode danific-lo e

interferir nos resultados a obter pela electroforese (o poo pode furar e a amostra ser perdida). O

contedo deve ser expelido da pipeta devagar e continuamente, carregando no mbolo da pipeta at ao

primeiro ponto de resistncia. Quando sentida esta primeira resistncia, deve-se aguardar uns breves

segundos antes de retirar, lentamente, a ponta da pipeta do poo.

Aps o carregamento dos poos, ligam-se os elctrodos fonte de alimentao, determinando

previamente a voltagem e o tempo de electroforese (figura 3).

A corrente elctrica passada entre os elctrodos que esto nos terminais da tina de electroforese. Desde

que os fragmentos de DNA estejam carregados negativamente, eles vo avanar para o plo positivo

(ctodo) quando estiverem sujeitos a um campo elctrico. No decorrer da electroforese, verifica-se junto

extremidade que contm o elctrodo negativo a libertao de H 2. Na extremidade que contm o plo

positivo observa-se a libertao de O2. Se no estiver a ocorrer a electroforese no h formao deste

gases, pelo que a observao da libertao destes gases sob a forma de bolhinhas um bom indicador

da ocorrncia ou no deste processo.

A matriz do gel de agarose funciona como uma malha molecular atravs da qual cada fragmento

pequeno de DNA se move mais facilmente do que os fragmentos maiores. No entanto, a razo entre o que

cada fragmento de DNA migra atravs do gel inversamente proporcional ao seu tamanho em pares de

bases. Aps um determinado perodo de tempo, os fragmentos menores de DNA vo viajar at mais longe

do que os maiores. Fragmentos do mesmo tamanho ficam juntos, e migram numa nica banda de DNA.

Estas bandas iro ser vistas posteriormente no gel aps o DNA ser corado.

Figura 2 Carregamento dos poos Figura 3 A electroforese


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Visualizao do DNA

O DNA incolor, por isso os fragmentos no gel no podem ser vistos durante a electroforese. Um

tampo de amostra contendo dois corantes azuis adicionado s amostras de DNA. O tampo de amostra

no cora o DNA, mas torna o processo de carregamento dos poos com o DNA mais fcil, assim como

permite uma monitorizao do progresso do DNA durante a electroforese. As frentes do corante migram

em direco extremidade positiva do gel, como os fragmentos de DNA. Corando as bandas de DNA

possvel a sua localizao no gel.

O corante mais comum para a visualizao das bandas de DNA o brometo de etdio, cuja visualizao s

possvel recorrendo a uma transiluminador de raios UV. Contudo este corante no usado em trabalhos

com alunos uma vez que apresenta propriedades mutagnicas. Em alternativa a este corante utiliza-se

habitualmente um outro corante o Azure A - 100% incuo, e com um grau de eficcia muito elevado, j

que permite uma boa visualizao do DNA, num espao de tempo reduzido (figura 4).

Corantes de DNA

Caractersticas Vantagens Desvantagens

Brometo de Etdio

Muito usado paravisualizao do DNA.

Corante de fluorescncia.

Grandesensibilidade abaixasconcentraes.

Txico e altamente mutagnico.

No deve ser lanado directamentepara a rede de saneamento.(http://www.merck-chemicals.com/brazil/brometo-de-etidio/MDA_CHEM-

111615/p_xw.b.s1LJBYAAAEW4eAfVhTl)

Azure A

Inflamvel.Adicionado ao gel aps

separao electrofortica.O gel fica todo corado e

para vermos as bandas deDNA temos que descolorar ogel.

O DNA aparece formandobandas azuis.

No txiconemcarcinognico.

Pode sereliminado semprejuzo para oambiente.

O gel coradopode serguardadoindefinidamente.

A descolorao do gel um pouco lenta(tem que se lavar o gel vrias vezes comgua).(http://www.ncbe.rdg.ac.uk/NCBE/PROTOCOLS/DNA/PDF/DNA14.pdf)

Carolina BLU DNA Stain

Seguro.Sistema de colorao em

duas etapas.

Tempo decolorao curto

(15 minutos)

Pouca sensibilidade.

(http://www.carolina.com/product/carolinablu+dna+stain.do)

Figura 4 Corante para o visualizao doDNA - Azure A

Quando o gel imerso no corante Azure A, as molculas

do corante atacam o DNA que se encontram na malha do

gel de agarose. Quando as bandas ficam visveis, possvel

comparar os padres de restrio do DNA em diferentes

amostras de DNA.

Existe no mercado uma nova gerao de corantes de

qualidade que permitem obter uma boa visualizao das

bandas de DNA: Carolina BLU DNA Stain, Fast Blast DNA

Stain, GelRed e GelGreen DNA Stain. As caractersticas de

diferentes corantes de DNA, bem como as respectivas

vantagens e desvantagens da sua utilizao, encontram-se

definidas na tabela 2.


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Fast Blast DNA Stain

Seguro e de fcil utilizao.Cora o DNA de azul.Apresenta-se numaconcentrao de 500x.Pode ser utilizado numconcentrao de 100x ounuma concentrao de 1x.

Pode ser utilizado paracolorao do ncleo.

No txico.Econmico.Pode ser

utilizado parauma rpidacolorao(concentrao de

100x).Permite obter50L de soluo 1xconcentrada.

Quando utilizado 1x concentrado necessrio uma noite para visualizao dasbandas.

(http://www.bio-rad.co.jp/LifeScience/pdf/Bulletin_4110153A.pdf)

GelRed Nucleic Acid Gel

Stain

Corante de fluorescncia,sensvel.

Soluo estvel temperatura ambiente.

Deve evitar-se a exposiodo corante luz.

Permite substituir acolorao com brometo deetdio.

A colorao das bandaspode ser feita terminada aelectroforese, diluindo asoluo concentrada em guae incubando o gel na soluo.

A colorao pode ser feitatambm aquando dapreparao do gel.

No mutagnico nemtxico para oHomem, nempara o meioambiente.

Mais sensvelque o brometo deetdio.

No necessriodescolorar o gel.

O tempo de vida do GelRed 3x soluoem gua, de cerca de 6 meses, quandoarmazenado devidamente.

A utilizao do GelRed aquando dapreparao do gel pode comprometer aresoluo das bandas de DNA ou retardar amigrao das mesmas.

A colorao do DNA demora cerca de30 minutos.

necessrio um transiluminador UV.O custo por embalagem de 4L de

$168.

(http://www.biotium.com)

GelGreen Nucleic Acid

Gel Stain

Corante de fluorescncia,sensvel.

Soluo estvel temperatura ambiente.

Deve evitar-se a exposiodo corante luz.

Permite substituir acolorao com SYBR ouGelStar.

A colorao das bandas

pode ser feita terminada aelectroforese, diluindo asoluo concentrada em guae incubando o gel na soluo.

A colorao pode ser feitatambm aquando dapreparao do gel.

No mutagnico nemtxico para oHomem, nempara o meioambiente.

Mais sensvelque o SYBR ouGelStar.

No

necessriodescolorar o gel.

O tempo de vida da soluo GelGreen10000x em gua, de cerca de 6 meses,quando armazenado devidamente.

A utilizao do GelGreen aquando dapreparao do gel pode comprometer aresoluo das bandas de DNA ou retardar amigrao das mesmas.

A colorao do DNA demora cerca de30 minutos.

necessrio um scanner a laser com

leitor de comprimento de onda na ordemdos 488nm, ou um Dark Reader queutiliza uma luz azul visvel para excitao.

O custo por embalagem de 0,5mL de$100.

(http://www.biotium.com)

Dada a relao qualidade/preo/segurana, o corante seleccionado para esta actividade o Azure A. No

caso da escola possuir transiluminador UV sugere-se a utilizao do corante GelRed. No caso da escola

possuir uma fonte de luz azul, pode optar-se pela utilizao do GelGreen.

* O corante GelRed e Gel Green pode ser adquirido atravs do site www.biotium.com

Tabela 2 Propriedades de diferentes corantes de DNA


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Perfis de DNA

Cada indivduo apresenta diferenas e semelhanas nas sequncias de DNA. Para mostrar que

um determinado fragmento de DNA contm uma sequncia especfica de nucletidos, uma sonda

radioactiva complementar pode ser feita para reconhecer e ligar-se a essa sequncia. As sondas

radioactivas permitem aos bilogos moleculares localizar, identificar, e comparar o DNA de diferentes

indivduos. Devido especificidade, a sonda radioactiva pode ser utilizada para demonstrar semelhanas

genotpicas entre indivduos. Num perfil de DNA, a posio relativa das bandas radioactivas num gel

determinado pelo tamanho dos fragmentos de DNA em cada banda. O tamanho dos fragmentos reflecte

variaes no DNA dos indivduos.

A evidncia necessria para um perfil de DNA pode ser obtida a partir de qualquer material biolgico que

contenha DNA: tecidos, fluidos (sangue, esperma), folculos capilares, etc. A anlise de DNA pode inclusive

ser feita a partir de material desidratado, como manchas de sangue ou tecidos mumificados. Se a amostra

de DNA for demasiado pequena, pode ser amplificada utilizando a tcnica de PCR. O DNA ento tratado

com enzimas de restrio que cortam o DNA em fragmentos de diferentes tamanhos.

Digesto do DNA pelas enzimas de restrio

As enzimas de restrio so as tesouras qumicas dos bilogos moleculares. A restrio

enzimtica uma das formas de se detectar um SNP (single nucleotide polymorphism polimorfismo

nucleotdico simples). Para se proceder restrio enzimtica so utilizadas enzimas de restrio prprias

para a sequncia de nucleotdeos que nos interessa.

As enzimas de restrio tm um melhor desempenho sob determinadas condies tamponantes e de

temperatura. O tampo de enzima, juntamente com as amostras de DNA tambm foi includo neste kit, de

forma a que quando se misturarem as enzimas com as amostras de DNA, estejam criadas as condies

ideais para uma ptima funcionalidade. As enzimas e os tampes so normalmente adquiridos em firmas

que os comercializam, e so fornecidos em conjunto. Neste caso em concreto o tampo j se encontra

includo no tubo que contem a enzima liofilizada, a enzima BamHI.

Reaco de Polimerizao em Cadeia PCR

Esta reaco foi descrita por Kary Mullis, em 1985. uma reaco que permite a amplificao de

pores especficas de DNA que estejam presentes numa mistura complexa de DNA, desde que sejam

conhecidas as suas extremidades. Em aproximadamente 2 horas podem-se obter milhes de cpias de

DNA, a partir de uma pequena quantidade de DNA. Numa reaco simples, o DNA molde desnaturadopelo calor (94C) para originar duas cadeias simples. So fornecidos em excesso dois oligonucletidos

sintticos, complementares s extremidades 3das cadeias simples originadas. A temperatura reduzida

para 50-60C, durante 1 minuto, para que os oligonucletidos em excesso emparelhem por

complementaridade com as extremidades 3do DNA molde. Os oligonucletidos funcionam como

iniciadores (primers) de uma nova cadeia de DNA por parte de uma DNA polimerase (Taq DNA

polimerase), que incorpora desoxirribonucletidos a 3dos iniciadores por complementaridade com a

cadeia de DNA molde temperatura de 72C. Quando a sntese da segunda cadeia termina, toda a

mistura aquecida outra vez (94C) para desnaturar as novas molculas de DNA, e deste modo reinicia-

se o ciclo anteriormente descrito. Cada ciclo completo de amplificao consiste pois na desnaturao dadupla cadeia de DNA a uma temperatura prxima da ebulio de modo a obter cadeias simples de DNA,


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ligao dos primers e replicao da cadeia modelo por extenso dos primers mediada pela polimerase

(figura 5). A PCR ocorre num termociclador que permite fazer variar de uma forma rigorosa o tempo e a

temperatura ao longo das trs etapas em que se desenvolve um ciclo de amplificao.

A especificidade da PCR dada pelos primers. Por isso, no necessrio isolar o DNA que se pretende

amplificar.

A visualizao dos produtos amplificados feita normalmente aps electroforese, atravs de um corante

de DNA.

Testes genticos

Um teste gentico o mais recente e sofisticado procedimento utilizado para identificar

alteraes genticas, e envolve a anlise directa do DNA. Alguns testes genticos incluem testes

bioqumicos para produtos de genes como enzimas e outras protenas e exame microscpico de

cromossomas.

As finalidades dos testes genticos podem ser o diagnstico, o rastreio ou a monitorizao. Os testes

genticos podem ser utilizados para diagnosticar uma doena gentica, para determinar se um indivduo

portador de uma doena associada a uma mutao, para prever o desenvolvimento de uma doena

gentica, para determinar a susceptibilidade de um indivduo para uma determinada doena, ou ainda

para aplicaes na cincia forense.

Os testes genticos devem ter reproducibilidade, elevada especificidade e sensibilidade e valor preditivo.

Um teste gentico preditivo o uso dos testes genticos para prever se um determinado indivduo ir

desenvolver uma doena gentica. Pode apenas ser utilizado se for conhecida a relao mutao doena

e esta for altamente penetrante. Um exemplo clssico da utilizao deste tipo de teste gentico para

prever a doena de Huntington. O gene associado a esta doena foi descoberto em 1993. A doena

associada com alteraes numa parte especfica da sequncia, que facilmente so detectadas pela anlise

do DNA. Como a doena de Huntington s se manifesta tardiamente, um indivduo que tenha um dos pais

afectado pela doena, no ir saber se a doena foi ou no transmitida, at atingir a meia-idade. Contudo,

o teste de DNA em qualquer idade, at mesmo pr-natal, ir revelar se a mutao est ou no presente,

alterando o risco do indivduo de 50% para 100% ou 0%.

Idealmente, a utilizao de um teste gentico de previso deve ser utilizado conjuntamente com um

tratamento profilctico, para os indivduos cujo resultado tenha sido positivo. A doena de Huntington

incurvel e fatal, pelo que o aconselhamento cuidadoso essencial para qualquer pessoa proveniente de

uma famlia afectada e que pense realizar um teste gentico.

Actualmente so realizados centenas de testes genticos e muitos outros esto em desenvolvimento.

Figura 5 PCR (Reaco de Polimerizao em Cadeia)Fonte: Hughes (1995) National academy of science


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Parte II - Planificao da actividade

A planificao que se segue foi elaborada para enquadramento no programa de Biologia de

12ano do Curso de Cincias e Tecnologias, e apenas uma sugesto, podendo ser reajustados os

tempos de execuo das diferentes actividades, com mais ou menos preparao prvia das actividades

laboratoriais feita pelo professor, ou pelo maior ou menor aprofundamento das questes levantadas. Cabe

ao professor, adaptar a planificao ao tempo disponvel que possuir e realidade de cada turma.

Aula Tema Estratgia Durao

1 Introduo Perfis de DNA

Explorao do power-point n1

sobre:

- Estrutura do DNA;

- Restrio das amostras de DNA;

- Electroforese.

45 minutos

2 Restrio das amostras de DNA

Actividade laboratorial n1:

Restrio das amostras de DNA.

Actividade laboratorial n2:

Preparao do gel de agarose.

90 minutos

3

Electroforese em gel de agarose das

amostras de DNA

Actividade laboratorial n2 (cont.):

Electroforese em gel de agarose

das amostras de DNA.

Registo dos resultados

90 minutos

4 Anlise e discusso dos resultados obtidos

Explorao do power-point n2

sobre:

- Anlise dos resultados obtidos;

- Discusso da questo problema;

- Questes ticas inerentes ao

trabalho desenvolvido

45 minutos

Nota: Existe disponvel no site : www.bioexperimentando.blogspot.com uma planificao mais detalhada,

que inclui estratgias, materiais, competncias e tempo de execuo.

Tabela 3 Planificao da actividade


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Parte III Problematizao da actividade

Inicialmente, e antes da apresentao da questo-problema que vai servir de ponto de partida

para o desenvolver de toda a actividade, sugere-se que o professor explore um power-point de reviso de

alguns contedos leccionados em anos anteriores e de apresentao de alguns procedimentos que vo ser

executados aquando da actividade laboratorial, fundamentais para uma profunda e slida compreenso de

todos os processos envolvidos nesta actividade. O power-point (ver apndice I) pode ser obtido acedendo

ao site http://bioexperimentando.blogspot.com .

O problema apresentado turma o seguinte:

Parte III Procedimentos protocolaresParte IV Anlise e discusso dos resultados

D. Maria Sr Joaquim

Ana Andr

Paulo

Vera

Jos Rosa ManuelAgostinhoElisabete Helena Joana Antnio

MartaDianaSerafimJosefinaRuiTiagoRita

Carlos Pedro

Filho A Filho B

Transmisso da doena Raritose

A famlia Antunes afectada h quatro geraes sucessivas pela doena Raritose. A Ana, bisneta da D. Maria e do Sr Joaquim,casou com o Andr, e pretendem ter um filho. Tendo o Andr conhecimento de que a famlia de Ana tem problemas com essadoena, este sugere a Ana que faam um teste gentico para averiguar a probabilidade dos seus eventuais filhos serem doentesou portadores da doena. A rvore genealgica desta famlia encontra-se disponvel na figura 6.

Questo- problema: Ser possvel pela anlise do DNA descobrirmos se os filhos de Ana e Andr sero doentes?

Figura 6 rvore genealgica da famlia Antunes

Legenda

Mulher

Homem

SexoIndefinido


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Para simplificao de identificao, a cada membro da famlia ser atribudo um nmero, como mostra a

figura 7.

Parte III Procedimentos protocolares

Trabalho laboratorial:

- Material/Mtodos

- Notas para o professor

- Informao adicional

Pipetagem

Electroforese

Membros da famlia Antunes:

No sentido de dar resposta questo formulada anteriormente, foram recolhidas amostras de

cada um dos membros da famlia Antunes. De referir que cada amostra de DNA recolhida contm parte do

gene responsvel pela doena, amplificado previamente por PCR (Reaco de Polimerizao em Cadeia).

Existem apenas dois alelos diferentes para o locus que est ser investigado. Um indivduo que seja

homozigtico para o alelo dominante (gentipo RR) ter apenas DNA do tipo R. Um indivduo que seja

homozigtico para o alelo responsvel pela doena (gentipo rr) ter apenas DNA do tipo r. Por sua vez,

1 2

20 21

5

23

3 4 876 9 10 11

18171615141312

19 22

Filho A Filho B

Figura 7 rvore genealgica da famlia Antunes numerada

1 D. Maria2 Sr. Joaquim3 Jos4 Rosa

5 Paulo6 Elisabete7 Agostinho8 Manuel

9 Helena10 Joana11 Antnio12 Rita

13 Tiago14 Rui15 Josefina16 - Serafim

17 Diana18 Marta19 Carlos20 Ana

21 Andr22 Pedro23 Vera

Mulher

Homem

SexoIndefinido

Legenda


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um indivduo que seja heterozigtico (gentipo Rr), ter DNA dos dois tipos. A amplificao da regio de

interesse do DNA origina fragmentos de mesmo tamanho para ambos os alelos, neste caso, 6500 pb.

O objectivo detectar que formas de DNA esto presentes em cada amostra, e para isso sujeitam-se as

amostras a restrio com a enzima BamHI e analisar os fragmentos de DNA resultantes, no gel de

electroforese.

A diferena na sequncia de DNA dos alelos R e r tal que, no alelo r existe uma sequncia de bases que

pode ser reconhecida e cortada pela enzima de restrio BamHI. O alelo R no possui local de restrio

para a enzima BamHI e assim no vai ser cortada pela enzima.

Os resultados que podem ser observados no gel de agarose, aps o tratamento das amostras com a

enzima de restrio e da electroforese so os seguintes:

Um marcador de DNA, que consiste num conjunto de fragmentos de tamanhos conhecidos, sujeito a

electroforese juntamente com as amostras, para se poder confirmar que os fragmentos mais pequenos

obtidos, quando combinados, formam o fragmento maior (4000 + 2500 = 6500 bp).

Gentipo Nmero de bandas

RR 1

rr 2Rr 3

Nota para o professor 1

As amostras de DNA

Nesta actividade no foi utilizado DNA humano. Usaram-se trs plasmdios de diferentes tamanhos para preparar asamostras (A, B e C) que correspondero respectivamente a uma, duas ou trs bandas no gel.Os plasmdios so fragmentos circulares de DNA, mas uma preparao de plasmdio pode conter o plasmdio emdiferentes estados: circular (uma cadeia est quebrada), linear (duas cadeias quebradas) e super-enrolado. Asdiferentes formas iro correr no gel de agarose a diferentes velocidades, originando diferentes bandas para um nicoplasmdio.Durante esta simulao cada plasmdio tratado com uma enzima de restrio. Os plasmdios seleccionados temapenas um local de restrio para a enzima, por isso a enzima ir apenas cortar o DNA circular para formar umfragmento linear que originar uma nica banda aps electroforese (ver anexo I).


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Parte IV Procedimentos protocolares

Segue-se o trabalho de laboratrio que implica o cumprimento de todas as regras de segurana

j mencionadas na introduo deste guio. De referir que quando se manuseia DNA, deve ter-se sempre

em ateno que todo o material que entre em contacto com o DNA deve ser esterilizado, com particular

ateno s pontas das micropipetas. Estas nunca devem ser tocadas com as mos ou entrar em contacto

com material no esterilizado, para que no haja contaminao do DNA.

1. Distribuio das amostras de DNA

a) No topo de cada um dos tubos que contm enzima liofilizada, proceder identificao dos mesmos

com os nmeros de 1 a 23 (utilizar caneta de tinta permanente).

b) Colocar 20 L de cada amostra de DNA (amostra A, B e C) no respectivo tubo (figura 8) que

continha j enzima de restrio liofilizada (9 tubos recebem a amostra de DNA A, 11 tubos recebem a

amostra de DNA B, e 3 tubos recebem a amostra de DNA C).

c) Proceder mistura da soluo de DNA com a enzima, fazendo leves batimentos com os dedos no

fundo do tubo.

2. Restrio enzimtica

a) Com os tubos dispostos num suporte adequado, incubar as amostras de DNA numa estufa a 37C,

durante cerca de 40 minutos.

3. Preparao do gel de agarose

a) Pesar 0,4 g de agarose num matraz, adicionar 50 mL de tampo TAE (1x) (ver nota para o

professor 2).

b) Tapar o matraz com pelcula aderente, e furar a pelcula antes de o levar ao microondas (no

utilizar parafilme).

c) Proceder sua dissoluo no microondas durante 2 minutos (ter ateno para a soluo no

levantar fervura, uma vez que se ferver a malha do gel vai ficar laxa, havendo implicaes na

electroforese).

d) Retirar o matraz do microondas com o auxlio de uma pega, e agitar suavemente, certificando de

que toda a agarose se encontrava totalmente dissolvida.e) Deixar arrefecer at temperatura aproximada de 60C.

Tubos que recebem a amostra de DNA A: tubos 3, 9, 10, 12, 14, 17, 18, 19, 22

Tubos que recebem a amostra de DNA B: tubos 1, 2, 4, 5, 6, 8, 13, 16, 20, 21, 23

Tubos que recebem a amostr a de DNA C: tubos 7, 11, 15

Figura 8 Distribuio das diferentes amostras de DNA


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f) Colocar o pente junto ao elctrodo negativo da tina de electroforese.

g) Verter continuamente o volume de agarose derretida na tina de electroforese, (evitando assim a

criao de bolhas de ar) de modo a encher a cavidade central, e a circundar os dentes do pente.

h) Aguardar a polimerizao da agarose durante cerca de 20 minutos.

4. Carregamento do gel

a) Aps a solidificao do gel de agarose, cobrir toda a

sua superfcie com TAE (0,25x).

b) Remover cuidadosamente o pente do gel bem como

as placas laterais.

c) Adicionar 2 L de tampo de amostra que contm azul de

bromofenol a cada um dos tubos que contem as amostras de DNA.

d) Agitar suavemente no sentido de misturar o tampo de

amostra com a soluo de DNA.

e) Pipetar 5 L do marcador molecular Lambda DNA/HindIII e adicionar

2L de tampo de amostra.

f) Carregar 5 L da soluo anterior no primeiro poo do gel.

g) Pipetar 20 L de cada amostra de DNA, pela ordem numrica dos tubos, e carregar nos poos do

gel (figura 9) (ver nota para o professor 3).

Figura 9 Carregamento do gel deagarose


Carregamento dos poos

o Por conveno, no 1 poo carregamos o nosso marcador. O marcador de DNA serve para podermos comparar o tamanho dos diferentesfragmentos de restrio, pois o marcador provm de um DNA j cortado, em que o tamanho dos seus fragmentos so conhecidos (em kb).Nesta actividade utilizamos o marcador Lambda cortado com a enzima HindIII, comercializado pela Fermentas Life Science.

o Os poos carregam-se da esquerda para a direita.o No carregamento dos poos do gel com as amostras de DNA, devemos ter o cuidado de estabilizar a pipeta antes de expelir o contedo.

Para isso podemos apoiar os cotovelos na bancada e segurar a pipeta com as duas mos, ou segurar a pipeta com uma das mos enquantoa outra estabiliza a mo que segura a pipeta.

o No se pode introduzir toda a ponta da pipeta no poo, uma vez que se poder furar o poo e assim perder a amostra de DNA.o Durante o carregamento das amostras de DNA nos poos, o mbolo da pipeta deve ser pressionado continuamente, sem interrupes, at

ao primeiro ponto de resistncia.o Retirar a pipeta do poo com o mbolo ainda pressionado (se se largar o mbolo antes de retirar a pipeta, a amostra de DNA vai ser

aspirada do poo.


Clculos a realizar para a preparao do Gel:

o Agarose em tampo TAE (1x) (0,8% p/v) : 0,8 g de agarose para cada 100 mL de TAE (1x)

GEL: Vfinal= 50 mL (o volume final depende do tamanho da tina de electroforese)

0,8 g agarose ---------------------------- 100 mL TAE

X ----------------------------- 50 mL Vfinal

X= (0,8 X 50) / 100

X= 0,4 g agarose

Tampo TAE:

o Tampo de electroforese (tris-cido actico EDTA) Tris um tampo de pH e o EDTA um agente quelante, isto , capta catiesbivalentes (neste caso Mg2+) necessrios actividade das DNAses evitando assim a destruio do nosso DNA alvo.


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5. A electroforese

a) Verificar se os elctrodos esto bem colocados

(ver nota para o professor 4).

b) Regular a voltagem para os 120 volts.

c) Submeter o DNA a electroforese durante 20 a 30 minutos (figura 10).

d) Interromper a electroforese quando o azul do tampo alcanar o

fim do gel.

6. Colorao do DNA

a) Remover a soluo tampo TAE da tina, reservando-a para posteriores utilizaes (tem que se ter

o cuidado de segurar o gel, e assim evitar que este se parta).

b) Verter cerca de 10mL de corante do DNA, Azure A, na superfcie do gel (ver nota para o professor

5).

c) Deixar actuar cerca de 4 minutos.

d) Retirar o corante da superfcie do gel e guarda-lo para posterior reutilizao, anotando no frasco o

n de vezes que este j tinha sido utilizado.

e) Retirar o corante da superfcie do gel, lavando-o com 5ml de etanol a 70%, durante uns segundos.

f) Eliminar o lcool e lavar o gel com gua corrente, durante 3 ou 4 minutos, no deixando gua no

gel, para que no seja removido do gel a totalidade do corante.

g) Aguardar at que as bandas se tornem visveis.

h) Observar os resultados.

i) Registar o nmero de bandas na respectiva rvore genealgica.

Figura 10 - Electroforese


A electroforese

o Na tina de electroforese, os poos de gel de agarose devem ocupar a posio junto ao plo negativo (elctrodo preto), pois o DNA migrado plo negativo para o plo posi tivo (elctrodo vermelho).

o Quando a tina de electroforese ligada corrente podemos certificarmo-nos da passagem da corrente elctrica se houver libertao debolhas no interior da tina, resultantes da hidrlise da gua (h libertao de bolhas de oxignio e de hidrognio).


Se a colorao for feita com GelRed, ou com GelGreen, a quantidade de DNA a pipetar de 5 L (passo1 do

procedimento experimental). Deve adicionar-se 5 L de GelRed/GelGreen ao gel de 50mL antes de este polimerizar. Quando

tiver terminado a electroforese, dever observar-se as bandas obtidas utilizando um transiluminador UV, ou um leitor com luz

azul, respectivamente.


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Parte V Anlise e discusso dos resultados

Aps a realizao dos procedimentos laboratoriais os alunos so convidados a debaterem um

conjunto de questes. Posteriormente ser explorado um power-point Kit BioExperimentando Anlise e

discusso da actividade experimental (apndice II), de consolidao e reflexo de toda a actividade

desenvolvida. O power-point pode ser obtido acedendo ao site http://bioexperimentando.blogspot.com .

Questes e explorar:

1. Elabore um desenho do gel resultante do trabalho laboratorial, com os poos devidamenteassinalados.

2. Na rvore genealgica fornecida, registe o nmero de bandas obtido em cada indivduo (paracada amostra de DNA poder visualizar uma, duas ou trs bandas).

3. Indique, justificando, qual o modo de transmisso da doena.

4. Identifique os indivduos que so portadores da doena.

5. Refira os indivduos que podem ter falecido devido doena BX.

6. Indique o gentipo e o fentipo dos indivduos 1, 15 e 22.

7. Comente a seguinte afirmao: A probabilidade de o Andr e a Ana terem um filho doente igual probabilidade de terem um filho portador. (Sugesto: Faa um xadrez mendeliano).

8. A Ana e o Andr optaram na realidade pela realizao de um teste gentico, antes de terem filhos,para saberem se h a possibilidade de terem um filho doente. Alguns membros da famlia apoiam a

deciso tomada pelo casal, mas h outros membros que se opem. Enumera dois argumentos quepossam ter sido referidos a favor da realizao do teste gentico e dois argumentos que possam tersido referidos contra.

9. Complete o V de Gowin relativo actividade experimental desenvolvida.

10. Elabore uma resposta para a questo-problema formulada inicialmente Ser possvel pelaanlise do DNA descobrirmos se os filhos de Ana e Andr sero doentes?


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Parte VI Actividade complementar

Actividade complementarMapeamento de plasmdios

Plasmdios e enzimas de restrio

O mapeamento de plasmdios revolucionou a biologia molecular e abriu o caminho para a indstria da

biotecnologia. Esta tcnica permite aos bilogos moleculares avaliar rapidamente o sucesso de

experincias de clonagem assim como identificar facilmente plasmdios e tratamentos associados em

diferentes organismos. Embora os verdadeiros perfis de DNA sejam conseguidos a partir do DNA

genmico, a actividade que se segue utiliza DNA plasmdico para simular como os verdadeiros perfis de

DNA so analisados.

Aps o corte dos plasmdios pelas enzimas de restrio, estes podem ser ligados a um fragmento de DNA

proveniente de um outro organismo que tenha sido cortado com a mesma enzima de restrio. O

plasmdio resultante que possui DNA hbrido pode ser incorporado em clulas bacterianas (transformao).

O plasmdio hbrido replica-se na bactria da mesma forma que o plasmdio original, incluindo o fragmento

de DNA estranho que foi introduzido. Assim, cada plasmdio hbrido contm uma cpia do DNA estranho

incorporado. Diz-se que o fragmento de DNA foi clonado e o plasmdio de DNA que o transporta

designado vector.

Os plasmdios podem ser descritos em termos de localizao dos locais de restrio usando simples

procedimentos e lgica. O procedimento geral digerir um plasmdio com duas enzimas de restrio

separadamente e com as duas em simultneo (digesto dupla). Os tamanhos dos fragmentos de DNA

resultantes so determinados usando a lgica para determinar a localizao relativa dos locais de

restrio.

Uma vez que os plasmdios so circulares, o nmero de fragmentos representam o nmero de cortes ou

locais de restrio.

Ler um mapa de um plasmdio

Um mapa de um plasmdio contm informaes relativas ao tamanho do plasmdio, aos genes presentes,

origem do local de replicao, e aos locais de restrio para as enzimas de restrio. Os plasmdios

utilizados nesta actividade laboratorial foram o plasmdio pUC 18, o plasmdio pCR2.1.TOPO, e o plasmdio

pCard (resulta da adio de um insert de 1500bp no plasmdio pCR 2.1 TOPO). Foi utilizada a enzima de

restrio BamHI, embora outras enzimas pudessem ter sido utilizadas para cortar estes plasmdios

(exemplo da enzima HindIII). Os locais de restrio so marcados no mapa com um nmero que indica o

local de restrio. Uma vez que o plasmdio circular, existe um local zero arbitrrio. Todos os locais de

restrio so indicados com um nmero entre zero e o nmero total de pares de base do plasmdio. O

tamanho dos fragmentos pode ser calculado pela simples subtraco (e nalguns casos adio) entre

pontos do plasmdio.

Plasmdios utilizados neste kit

O mapa de um plasmdio mostra as posies (numeradas pelos pares de bases do DNA) dos locais onde o

plasmdio pode ser cortado por determinadas enzimas de restrio. O nome do plasmdio e o seu tamanho


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em pares de base de DNA mostrado dentro do crculo, assim como a Origem de Replicao (Ori). Dois

dos plasmdios utilizados neste kit so plasmdios comerciais: o pUC18 e o pCR2.1 (figura 11 e 12).

Figura 11 Plasmdio pUC 18Fonte da imagem: http://www.taq-dna.com/puc18-dna-_149.html

Figura 12: Plasmdio pCR2.1Fonte da imagem: http://www.imagenes-bio.de/info/vectors/pCR2.1_pic.shtml


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Questes:

1. A partir do mapa do plasmdio pCR2.1 enumere as enzimas de restrio que podem cortar o plasmdio.

2. Qual dos plasmdios, pUC 18 ou pCR2.1, o maior e qual o seu tamanho?

3. Utilizando o plasmdio pUC18 como exemplo, procure os locais de restrio para a enzima AvaII.

Quantos locais de restrio existem? Se a enzima AvaII for usada para restrio deste plasmdio, quantos

fragmentos iremos obter?

4. Determine o tamanho dos fragmentos obtidos da restrio do plasmdio pUC18 com a enzima AvaII.

Confirme que a soma dos fragmentos obtidos igual ao tamanho total do plasmdio.

Proposta de soluo

1. As enzimas que podem cortar o plasmdio so:Hind III; Kpn I; Sac I; BamH I; Spe I; EcoR V; Not I;Xho I; Nsi I; Xba I; Apa I; Dra III; AspEI; Rsr II; Neo I; MscI; Bgl II; BssH II.

2. O plasmdio maior o pCRr2.1 que apresenta 3929bp.

3. Existem dois locais de restrio para a enzima AvaII. Iremos obter dois fragmentos.

4.

Tamanho do 1fragmento: 2059-1837=222bp

Tamanho do 2fragmento: 3900-222=3678bp

3678+222=3900bp


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Parte VII -Glossrio

Glossrio

cido desoxirribonucleico vulgarmente conhecido por DNA, um polmero orgnico complexo formado por duascadeias de nucletidos emparelhadas entre si, com uma disposio antiparalela. Cada nucletido que constitui o DNA

composto por um acar, a desoxirribose, um grupo fosfato e uma das quatro bases azotadas (timina, adenina,guanina e citosina).

cido ribonucleico vulgarmente conhecido por RNA, um polmero orgnico formado por uma cadeia simples denucletidos. Cada nucletido que constitui o RNA composto por um acar, a ribose, um grupo fosfato e uma dasquatro bases azotadas (adenina, guanina, citosina e uracilo).

Adenina base azotada prica presente nos nucletidos que constituem o DNA e o RNA.

Agarose polmero constitudo por unidades de galactose. Aps dissoluo em gua a ferver, seguido dearrefecimento, toma uma consistncia gelatinosa.

Alelos formas diferentes de um determinado gene.

Base Azotada molculas que entram na constituio dos cidos nucleicos. No DNA podemos encontrar quatro bases

azotadas: a adenina, timina, citosina e guanina. A adenina e a timina so bases complementares, emparelhando entresi. De igual modo a citosina e a guanina emparelham por complementaridade.No RNA encontram-se tambm quatro bases azotadas: guanina, citosina, adenina e uracilo em vez da timina. As basesemparelham do mesmo modo que no DNA excepo da adenina que vai emparelhar com o uracilo.

Caritipo conjunto dos cromossomas presentes nas clulas de cada ser vivo.

Centrmero parte central dos cromossomas. O centrmero importante no processo de mitose e de meiose para aseparao dos cromossomas.

Citosina base azotada pirimdica presente nos nucletidos que constituem o DNA e o RNA.

Co-dominncia situao em que h expresso individual dos dois alelos de um locus, num heterozigtico.

Cromatdio componente de um cromossoma contendo uma molcula de DNA.

Cromatina denso material do ncleo constitudo principalmente por DNA e protenas.

Cromossoma estrutura filamentosa constituda por DNA associado a protenas estruturais (histnicas e nohistnicas). Os cromossomas encontram-se no ncleo das clulas eucariticas.

Cromossoma homlogo cada um dos cromossomas de um par de cromossomas idnticos, que apresenta osmesmos loci genticos. Cada cromossoma de um desses pares homlogo do outro e emparelha com ele durante ameiose.

DN A ver cido desoxirribonucleico.

DN A fingerprinting tcnica de separao de segmentos de DNA que permite a identificao gentica dosindivduos.

DNA polimerase enzima presente nas clulas procariticas e eucariticas, responsvel pela polimerizao das novas

cadeias de DNA.

Dominante refere-se a um carcter que se exprime quando h heterozigotia para o gene que o determina. Aexpresso ocorre na presena de uma cpia normal do alelo.

Enzimas de restrio - enzimas responsveis por cortar o DNA. Estas enzimas so produzidas por bactrias erecebem o nome da espcie da bactria de onde foram extradas. Enzimas de restrio diferentes reconhecem e cortamDNA em diferentes sequncias de bases.

Electroforese uma tcnica que permite a separao de molculas (DNA, protenas) de acordo com o tamanho,carga e forma que apresentam, quando sujeitas a uma corrente elctrica. As molculas vo movimentar-se no meio desuporte (gel de agarose ou de poliacrilamida, por exemplo) a velocidades diferentes consoante as caractersticas queapresentam (tamanho, carga e forma).

Engenharia gentica manipulao do material gentico.

Feniltiocarbamida a feniltiocarbamida (PTC) uma protena, descoberta na dcada 30,


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Fentipo caractersticas observveis num organismo. O fentipo resulta da combinao de factores genticos eambientais.

Gene a unidade bsica da hereditariedade. Corresponde a uma sequncia nucleotdica de DNA que codifica umadeterminada sequncia polipeptdica, responsvel por determinada caracterstica ou funo no organismo. Cada geneencontra-se num local especfico de um cromossoma (locus) e pode apresentar vrias variantes (alelos) quedeterminam uma forma particular dessa caracterstica (exemplo: a caracterstica cor dos olhos pode ter vrios alelos:alelo que determina a cor azul, alelo que determina a cor castanha, etc).

Gentica cincia que estuda os genes e a hereditariedade.

Genoma - conjunto de todos os genes de um organismo.

Gentipo constituio gnica de um indivduo no que diz respeito aos alelos de um locus.

Guanina - base azotada prica presente nos nucletidos que constituem o DNA e o RNA

Hereditariedade mecanismo atravs do qual as caractersticas genticas passam dos progenitores para osdescendentes.

Heterozigtico um indivduo diz-se heterozigtico quando possui dois alelos diferentes para o mesmo gene.

Histona protenas bsicas, associadas ao DNA nos cromossomas. Tm baixo peso molecular, e so ricas nos

aminocidos lisina ou arginina.

Homozigtico um indivduo diz-se homozigtico quando possui alelos iguais para o mesmo gene.

Locus localizao de um gene num cromossoma.

Primer pequena sequncia especfica de oligonucletidos que se liga ao DNA alvo, para permitir o incio da sntese dacadeia complementar pela DNA polimerase.

Reaco de polimerizao em cadeia (PCR) - reaco que permite a amplificao de pores especficas de DNAque estejam presentes numa mistura complexa de DNA, desde que sejam conhecidas as suas extremidades.

Recessivo gene ou carcter que s se manifesta em homozigotia ou em hemizigotia (presena de um nico alelo nogenoma).

RNA ver cido ribonucleico.SNP (Single nucleotide polymorphism) variao numa sequncia de DNA que envolve uma alterao num niconucletido.

Southern blot mtodo descrito por E.Southern em que fragmentos de restrio so separados num gel deelectroforese e transferidos para uma membrana de nitrocelulose ou de nylon. Esta membrana posteriormentetratada com uma sonda (fragmento de DNA ou RNA com uma sequncia de bases conhecida, e complementar ao DNAcontido na membrana) que vai hibridar com o fragmento de DNA que se pretende identificar. A sonda de DNA marcada radioactivamente para permitir a sua deteco.

Taq polimerase uma DNA polimerase termoestvel, utilizada na amplificao de fragmentos de DNA atravs datcnica de PCR. O seu nome devido a ter sido identificada pela primeira vez na bactria Thermus aquaticus. A Taqpolimerase suporta as elevadas temperaturas usadas em PCR, tendo uma semi-vida enzimtica de 40 minutos (a 94C).

Teste gentico teste que permite detectar a presena, ausncia ou alterao, num gene particular, cromossoma ounum produto gentico.

Timina base azotada pirimdica presente nos nucletidos que constituem o DNA (ausente no RNA).

Uracilo base azotada pirimdica encontrada nos nucletidos do RNA.


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Apndices

Apndice I

Power-Point n 1 Kit BioExperimentando - Preparando a actividade experimental

Este documento uma sugesto de explorao do power-point Preparando a actividade experimental, a

utilizar antes da realizao da actividade laboratorial.

O objectivo deste power-point servir como introduo terica actividade, recordando termos e

conceitos j abordados nas aulas de Cincias Naturais do 9ano, de Biologia-Geologia do 10 e 11 ano e

nas aulas de Biologia do 12ano. Para alm disso, o power-point permitir fazer uma breve abordagem ao

trabalho laboratorial, fazendo referncia s tcnicas a utilizar. Por ltimo ser levantada a questo-

problema, para a qual os alunos devero encontrar resposta com a execuo da actividade laboratorial.


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Apndice II

Power-Point n 2 kit BioExperimentando Anlise e discusso da actividade experimental


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Neste momento, o professor poder levantar outras questes ticas relacionadas com a realizao de testesgenticos:

Dilemas relacionados com o sigilo mdico.

Permanecer na ignorncia vs atitude responsvel.Dilemas relacionados com as seguradoras.Confidencialidade por medo de discriminao.


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Anexo I

Plamdios utilizados

1) pUC 18

2) pCR 2.1 TOPO

Plasmdio pUC 18Fonte da imagem: http://www.taq-dna.com/puc18-dna-_149.html

Plasmdio pCR2.1Fonte da imagem: http://www.imagenes-bio.de/info/vectors/pCR2.1_pic.shtml


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Referncias Bibliogrficas

(1 )Ministrio da Educao, Direco-Geral de Inovao e de Desenvolvimento Curricular, Departamentoda Educao Bsica, Orientaes Curriculareshttp://www.dgidc.min-edu.pt/fichdown/programas/ciencias_fisicas_naturais.pdf

(2 ) Ministrio da Educao, Direco-Geral de Inovao e de Desenvolvimento Curricularhttp://eec.dgidc.min-edu.pt/programas/biologia_12.pdf

Para mais informaes consultar:

Bailey J (1995) A Gentica A Nova Enciclopdia das Cincias, Crculo de Leitores.

Regateiro F (2003) Manual de Gentica Mdica - Imprensa da Universidade de Coimbra.

Sambrook J., Fritsch E. F., e Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold SpringHarbor: Cold Spring Harbor Laboratory.

Videira A (2001) Engenharia Gentica Princpios e Aplicaes, Lidel.

Corantes

Biotiumwww.biotium.com

Carolinahttp://www.carolina.com

BioRadhttp://www.bio-rad.co.jp/LifeScience/pdf/

Biotecnologia conceitos e tcnicas

The European Initiative for Biotechnology Educationhttp://www.eibe.info/

Learn.Genetics - Science Learning Centerhttp://learn.genetics.utah.edu/

Roy J. Carver Biotechnology Centerhttp://www.biotech.uiuc.edu/

Orientaes curriculares do Ministrio da Educao

Ministrio da Educao, Direco-Geral de Inovao e de Desenvolvimento Curricularhttp://eec.dgidc.min-edu.pt/programas/biologia_12.pdf

Ministrio da Educao, Direco-Geral de Inovao e de Desenvolvimento Curricular, Departamento da EducaoBsica, Orientaes Curriculareshttp://www.dgidc.min-edu.pt/fichdown/programas/ciencias_fisicas_naturais.pdf

Kits comerciaisNature`s dice Teacher`s guidehttp://www.ncbe.reading.ac.uk/NCBE/MATERIALS/DNA/PDF/DiceTG.pdf

Bio-Rad Laboratorieshttp://www3.bio-rad.com

Testes genticosUnderstanding Gene Testinghttp://www.accessexcellence.org/AE/AEPC/NIH/gene19.php

Plasmdios

Invitrogenwww.invitrogen.com

Source BioScience ImaGeneshttp://www.imagenesbio.de/info/vectors/pCR2.1_pic.shtml

guião do professor versão a

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