glicohemoglobina

451Arq Bras Endocrinol Metab vol 48 nº 4 Agosto 2004

RESUMO

A glico-hemoglobina (GHb) é um parâmetro importante no controleglicêmico de pacientes com DM. Vários estudos clínicos mostraramclaramente que a melhora no controle glicêmico está fortemente asso-ciada com a diminuição no desenvolvimento e/ou progressão dascomplicações em diabetes melito tipos 1 e 2. A medida exata e precisada GHb é uma questão importante para os laboratórios clínicos. Váriosfatores afetam os resultados e podem levar a resultados errôneos.Nesta revisão, discutimos os problemas da padronização da determi-nação da GHb para monitorar a terapia diabética e também os prin-cipais fatores interferentes. Os métodos para GHb podem ser diferente-mente afetados pelas interferências. O efeito da interferência pode serclinicamente mais relevante com o pior controle glicêmico. O labo-ratório deve estar atento para estes fatores para evitar confusão nainterpretação clínica dos resultados, e os clínicos devem contatar olaboratório sempre que houver discrepância entre a impressão clínicae o resultado laboratorial. (Arq Bras Endocrinol Metab 2004;48/4:451-463)

Descritores: Hemoglobina glicada; Controle metabólico do DM; Medi-da de GHb; Hemoglobina anômala; Anemia; Drogas

ABSTRACT

Glycohemoglobin (GHb): Clinical and Analytical Aspects.Glycohemoglobin (GHb) has a key role in the assessment of glycemiccontrol in diabetic patients. Several studies have clearly shown thatimproved glycemic control is strongly associated with decreased devel-opment and/or progression of diabetic complications in both type 1and 2 diabetes mellitus. Therefore, accurate determination of GHb con-centration is an important issue for clinical laboratories. Several factorsmay affect and lead to erroneous results. We discuss the problems ofstandardization of GHb measurements for monitoring glycemic controland also consider the potential interfering factors on GHb measure-ments. Moreover, GHb assays may be affected by interference in differ-ent ways. The effect of interference may be more clinically relevant withpoor metabolic control. Laboratory staff must be aware of all pitfalls toavoid adding more confusion to the clinical interpretation of HbA1c val-ues and physicians should contact laboratories if discrepanciesbetween clinical impressions and laboratory data are observed. (ArqBras Endocrinol Metab 2004;48/4:451-463)

Keywords: Glycated hemoglobin; Metabolic control; Sample storage;Variant hemoglobin; Anemia; Drugs

Importância do Diabetes Melito e Uso Clínico da GHb/HbA1c

ODIABETES MELITO (DM) pode se acompanhar de complicações crôni-cas micro e macrovasculares que estão associadas a elevada morbidade

revisãoGlico-Hemoglobina (HbA1c): AspectosClínicos e Analíticos

Joíza Lins CamargoJorge Luiz Gross

Unidade de Bioquímica do Serviçode Patologia Clínica (JLC) e

Serviço de Endocrinologia (JLG),Hospital de Clínicas de Porto

Alegre, Porto Alegre, RS.

Recebido em 29/12/03Revisado em 15/06/04

Aceito em 23/06/04

Teste A1c: Aspectos Clínicos e AnalíticosCamargo & Gross

452 Arq Bras Endocrinol Metab vol 48 nº 4 Agosto 2004

e mortalidade.A nefropatia diabética acomete mais de um

terço dos pacientes e é a causa mais comum de doençarenal terminal e ingresso em programas de hemodiálise(1), e a retinopatia diabética é a principal causa decegueira entre os 20–74 anos. As doenças cardiovascu-lares (DCV) são responsáveis por mais de 50% dasmortes em pacientes com DM tipo 2 (DM2) e tam-bém por 30% das internações em centros de tratamen-to intensivo (2).

Os níveis glicêmicos são um fator determinantedo desenvolvimento e progressão das complicações doDM (3,4). A medida da glico-hemoglobina (GHb) é oparâmetro de referência para avaliar o grau do controleglicêmico em pacientes com DM (5). A AssociaçãoAmericana de Diabetes (ADA) recomenda que a GHbseja medida regularmente em todos os pacientes aintervalos de 4 a 6 meses (6). Considerando a altaprevalência do DM e o impacto das complicações dadoença na sociedade, a dosagem da GHb é um dosprocedimentos mais importantes no laboratório clíni-co atual. O número de requisições deste teste temaumentado consideravelmente nos últimos dez anos, eos laboratórios devem estar preparados para fornecerresultados exatos e precisos de GHb, para ajudar oclínico a prevenir e manejar as complicações do DM.No Hospital de Clínicas de Porto Alegre, o númeromédio de requisições mensais para GHb era 340 em1996 e aumentou para 750 em 2003, indicando umaumento de 120% no número de exames realizadosmensalmente (dados da Unidade de Bioquímica, Hos-pital de Clínicas de Porto Alegre).

As dosagens de GHb foram disponibilizadas nolaboratório clínico no início da década de 80 (7). Oteste foi logo introduzido na prática clínica para auxiliarno manejo dos pacientes com DM (8). No entanto, foiapenas na década de 90 que o verdadeiro valor clínicodesta dosagem laboratorial ficou definitivamente esta-belecido, a partir de dois grandes ensaios clínicos (3,4)que analisaram o papel do controle intensivo daglicemia no desenvolvimento das complicações crôni-cas do DM. No estudo Diabetes Control and Compli -cations Trial (DCCT) (3), o risco para o desenvolvi-mento e progressão das complicações crônicas do DMfoi intimamente relacionado com o grau do controleglicêmico, medido pela GHb, fração HbA1 c. Os resul-tados do DCCT determinaram a relação dos valores deH b A1 c com a glicemia média e estabeleceram objetivosa serem atingidos em pacientes com DM tipo 1. Houveredução no risco de desenvolver retinopatia, microal-buminúria, proteinúria e neuropatia clínica no grupoque foi tratado intensivamente comparado com o

grupo que teve tratamento convencional. Também foiobservado um aumento exponencial no desenvolvi-mento destas complicações com o aumento dos níveisde HbA1 c (figura 1).

Os resultados do DCCT foram confirmadospelo United Kingdon Prospective Diabetes Study(UKPDS) em 1998 (4), em pacientes com DM tipo 2.Este estudo também mostrou que a intensificação dotratamento da hiperglicemia reduz a incidência dascomplicações. Para cada 1% de decréscimo absolutoem HbA1c, houve diminuição de 35%, 25% e 7% norisco de complicações microvasculares, mortes rela-cionadas ao DM e mortes em geral, respectivamente.

Normalmente, estes ensaios clínicos demons-traram que a cada decréscimo absoluto de 1% emHbA1c, há uma redução de 30 a 35% no risco de com-plicações microvasculares do DM.

Esta mesma relação entre níveis de HbA1c e odesenvolvimento das complicações crônicas do DMtambém foi observada em outros ensaios clínicos pu-blicados nas últimas décadas (9-16).

Embora a maioria dos estudos não tenha sidoprimariamente delineada para estabelecer a relaçãoentre controle glicêmico e DCV, análises de subgruposde dados nas coortes do DCCT e UKPDS mostraramuma associação fortemente sugestiva entre controleglicêmico e doença macrovascular. Na coorte doUKPDS (4), a taxa de eventos cardiovasculares foi alta.Houve uma redução de 18% nos casos de infartoagudo do miocárdio (IAM) no grupo de pacientes queteve tratamento intensivo, mas este achado apresentousignificância estatística limítrofe (P= 0,052). Quando ogrupo foi observado como um todo, houve umarelação altamente significante entre HbA1c e o risco deDCV nestes pacientes (15). Apenas um estudo (16)relatou aumento da incidência de doença macrovascu-

Figura 1. Relação da glico-hemoglobina/HbA1c e risco decomplicações microvasculares.Adaptado de Skyler JS. Endocrinol Metab Clin 1996; 2 5 : 2 4 3 -5 4 .



lar em pacientes com DM2 tratados intensivamente.Neste estudo, o grupo selecionado tinha DM porvários anos. Estes dados sugerem que o efeito do con-trole glicêmico pode ser diferente em pacientes noestado inicial da doença, como os pacientes doUKPDS, e em pacientes com mais de 10 anos deduração do DM. No entanto, mais estudos sãonecessários para comprovar esta relação.

Na população de indivíduos não-diabéticos ecom DM, níveis mais elevados de GHb/HbA1c tam-bém são marcadores de risco cardiovascular, de even-tos e mortalidade. A coorte de Norfolk (17) apresen-tou um aumento no risco de doença macrovascularcom o aumento dos níveis de HbA1c nos indivíduossem DM.

Com base nas evidências acima, pode-se con-cluir que níveis elevados de GHb/HbA1 c estão asso-ciados, em todas as populações estudadas, comaumento das complicações do DM, ou seja, a HbA1 cé um marcador do risco de complicações no DM. Otratamento dos pacientes com DM deve, portanto,procurar atingir os níveis mais próximos do normalpossível da homeostase glicêmica e o grau do controleglicêmico deve ser avaliado pela medida da GHb/H b A1 c.

Valor ideal de HbA1c: Qual o objetivo dotratamento?O tratamento deve ter como objetivo a normalizaçãodos níveis glicêmicos. Baseado nos dados do DCCT eUKPDS (3,4), recomenda-se atingir valores deHbA1c< 7,0% (5,6). Este foi o valor alcançado pelospacientes tratados intensivamente nos ensaios clínicose abaixo do qual há uma diminuição considerável dascomplicações crônicas (figura 1). A ADA recomendaque medidas terapêuticas adicionais devem ser implan-tadas quando os valores excederem 8,0% (6). Devido aessa última recomendação, muitos clínicos não tratamo DM tão agressivamente como deveriam, e deixampara intensificar o controle glicêmico só quando comvalores de HbA1c> 8,0%. Conseqüentemente, os valo-res de HbA1c, na maioria dos pacientes, estão acima dameta de 7,0% preconizada. Devido a isso, a meta paraHbA1c recomendada pela Federação Internacional deDiabetes (IDF European Policy Group), com o respal-do do Colégio Americano de Endocrinologia (ACE)(18,19), é 6,5%. O UKPDS mostrou que o risco deocorrer complicações micro e macrovasculares é maiorpara os valores de HbA1c> 6,5% (4). Este valor se cons-titui de três desvios-padrão (3DP) acima da média deH b A1 c para populações não-diabéticas. Estudosindicam que valores mais elevados de HbA1c, ainda

que dentro dos limites normais, já estão associadoscom desenvolvimento de complicações, principal-mente cardiovasculares, em coortes sem diabetes (17).

A Academia Nacional de Bioquímica ClínicaAmericana (NACB), respaldada pela ADA, recomendaque a determinação de HbA1c seja feita pelo menosduas vezes ao ano em todos os pacientes portadores deDM tipos 1 e 2 (5). Este intervalo deve ser menor, acada 3 ou 4 meses, para aqueles pacientes que nãoatingem o controle glicêmico desejável.

Um aspecto importante a ser observado é quemuitos pacientes desconhecem a existência do teste A1 ce, conseqüentemente, não sabem que existem metas aserem atingidas. Dados norte-americanos (20) revelamque cerca de 40% dos pacientes com DM não tem oteste A1 c realizado na freqüência recomendada. Aquelesque têm o teste realizado apresentam níveis > 8% emmais de 50% dos casos. Estes dados não surpreendem,pois os pacientes que foram recrutados para participarda maioria dos ensaios clínicos apresentavam valores deH b A1 c ao redor de 9% na época da seleção (3,4).

O conhecimento dos médicos e pacientes sobreo teste tem um papel importante no manejo clínico.Recentemente, campanhas nacionais americanas, pro-movidas por órgãos públicos e privados, foramlançadas com o objetivo de divulgar o teste e orientarsobre a interpretação dos resultados. A campanha “TheDiabetes A1c Initiative™”, promovida pela AssociaçãoAmericana de Educadores em Diabetes (AADE), foilançada nacionalmente no Dia Mundial do Diabetes(14 de novembro) do ano passado. Com o lema “Aim.Believe. Achieve.”, o objetivo da campanha foi alertar eeducar os pacientes com DM para alcançar valores deHbA1c< 7% e, com isso, baixar os riscos de compli-cações do DM.

No Brasil, não existem dados sobre a disponi-bilidade do teste nos laboratórios. Também não háinformação sobre o conhecimento, por parte dospacientes, da importância e necessidade de se realizar oteste A1c. A Sociedade Brasileira de Diabetes recomen-da que o teste A1c seja feito regularmente, no mínimoduas vezes ao ano, e os valores devem ser mantidos nolimite superior do intervalo de referência do métodoutilizado para dosagem (21).

Clínicos e pacientes devem entender bem o sig-nificado da GHb/HbA1c, e saber sobre as limitaçõesque envolvem a dosagem, para garantir o valor clínicodo teste A1c.

Devido ao impacto das complicações crônicasdo DM, para pacientes e sociedade, o teste A1c temsido utilizado como indicador importante na avaliaçãoe monitoramento da qualidade da assistência aos



pacientes com DM pelas diferentes instituições (5).Informações sobre a freqüência com que é solicitado eos níveis alcançados pelos pacientes têm sido requisi-tadas como forma de garantir que o teste A1c seja uti-lizado e que as metas recomendadas para o controleglicêmico sejam atingidas.

Reação de Glicação Não-Enzimática e GHbEm 1955, Kunkel e Wallenius (22) descreveram, pelaprimeira vez, a heterogeneidade da hemoglobina nor-mal (Hb) em adultos. A seqüência de aminoácidos doscomponentes menores, que foram separados por cro-matografia, era idêntica ao componente principal(hemoglobina A0). Estudos posteriores (23) identi-ficaram subfrações que eluíam mais rápido que HbA0,e foram coletivamente chamadas de Hb “rápidas” enomeadas, individualmente, como HbA1a, HbA1b eHbA1c, conforme a ordem de eluição da coluna. Rah-bar e cols. (24) mostraram que estas frações estavamelevadas nos eritrócitos de pacientes com DM. Em1971, pela primeira vez, foi descrita a relação entre ashemoglobinas rápidas, a glicemia média e as compli-cações crônicas de pacientes com DM (7).

A formação da GHb ocorre via uma reação deglicação não-enzimática entre o grupo aldeído livre daglicose, ou outros açúcares, e um grupo amino livre namolécula da hemoglobina. Esta reação é conhecidacomo reação de Maillard. A reação envolve a formaçãode um composto intermediário instável (base de Schiff,aldimina ou fração lábil), que se forma rapidamente eé proporcional à concentração de glicose momentânea(25). Este composto sofre, lentamente, o rearranjo deAmadori e forma uma cetoamina estável e irreversível(proteína glicada/GHb).

Existem vários sítios de glicação na molécula dehemoglobina. O resíduo terminal de valina na cadeia corresponde a aproximadamente 60-80% da glicoseligada. Outros sítios de ligação também ocorrem nacadeia . Outros açúcares podem se ligar à molécula econtribuem para a fração total glicada (HbA1). Ocomponente especificamente ligado à glicose é co-nhecido como HbA1c (26).

A natureza heterogênea da GHb tem geradoconfusão na nomenclatura e no componente que estásendo medido por um determinado método. A Inter -national Federation of Clinical Chemistry – IFCC (27)define GHb como o termo genérico para denominaros componentes menores da hemoglobina. O termoinclui todas as hemoglobinas modificadas com a gli-cose ou outros açúcares, incluindo HbA1 e suas fraçõesHbA1a, HbA1b, HbA1c e HbA1d, bem como as outrashemoglobinas anômalas glicadas (HbS, HbF, HbC)

que, eventualmente, possam estar presentes. As espé-cies mais conhecidas de GHb são HbA1, HbA1c eGHb total (todas as frações ligadas a um açúcar, emqualquer sítio da cadeia de Hb, inclusive as Hb anô-malas). Recentemente, baseados nos dados do DCCTe UKPDS (3,4), que usaram métodos que mediamespecificamente HbA1c, o termo “teste A1c” tem sidorecomendado (5,6,28).

Relação da Glicose e GHbA glicação não-enzimática da hemoglobina é determi-nada principalmente por três fatores: concentraçãomédia da glicose plasmática, tempo de meia-vida dahemácia e permeabilidade da membrana do eritrócitoà glicose. A membrana de eritrócitos humanos é livre-mente permeável à glicose (29). Sendo assim, a con-centração plasmática de glicose e o tempo de meia-vida da hemácia são os principais determinantes dareação de glicação da proteína em seres humanos.Como a meia-vida dos eritrócitos é, em média, até 120dias, podemos dizer que a GHb é um índice da médiada glicemia nos 120 dias que precedem à coleta domaterial para o teste laboratorial. A GHb reflete, maisespecificamente, o controle glicêmico dos meses queprecederam a dosagem.

A relação da glicose e GHb é complexa e nãopode ser explicada por um simples cálculo matemático.Modelos matemáticos e dados clínicos (3,30-32)mostram que a média glicêmica dos 20-30 dias anteri-ores à coleta da amostra contribui com aproximada-mente 50% do resultado final, e que os 90-120 diasprecedentes contribuem com apenas 10%. Isso signifi-ca que o valor de HbA1c, em qualquer momento, tema contribuição de todos os eritrócitos: velhos (120 diasde idade) e novos. No entanto, os níveis recentes deglicose (1-2 meses anteriores) contribuem mais para oresultado final. Devido a isso, a GHb pode detectargrandes variações da glicemia em pequenos períodosde tempo, como 3 a 4 semanas. É possível detectarmudanças clinicamente relevantes nos valores deHbA1c sem precisar esperar 120 dias após os supostosepisódios hiperglicêmicos.

Estudos cinéticos na formação da GHb (30)sugerem que a reação de glicação da Hb é uma reaçãode primeira ordem e ocorre em condições de equi-líbrio. O tempo requerido para se alcançar um pontomédio entre o valor inicial e um novo valor é relativa-mente constante em 30-35 dias.

Os dados do DCCT (3) proporcionaram infor-mações importantes sobre a complexa relação entreglicemia média e GHb. Existe uma forte correlaçãoentre glicemia e GHb (r= 0,81, P< 0,0001) e, para



cada 1% de variação da GHb (%HbA1c), há uma varia-ção de 35mg/dL da glicemia média (32). Esta relaçãooriginou-se da análise de mais de 26.000 resultados deHbA1c de 1439 pacientes da coorte do DCCT. Emmédia, foram analisados 18 valores de HbA1c para cadapaciente e seus perfis glicêmicos correspondentes (7pontos de glicemia – antes das refeições, 90 minutosapós as refeições e antes de dormir). Estes dadosmostraram que a relação GHb e Glicemia é previsívele pode ser resumida pela equação: Glicose (mg/dL)=(1,98%HbA1c – 4,29) / 0,056. Esta relação pode serutilizada para se ter uma idéia aproximada dos valoresde glicose apropriados para cada paciente, para que osvalores de GHb recomendados possam ser alcançadose mantidos na prática (tabela 1). A correlação entre osvalores de HbA1c e glicemia de jejum foi menor (r=0,69) do que a encontrada para HbA1c e glicemiamédia estimada pelo perfil glicêmico de sete pontos.Os valores elevados de glicose de jejum subestimam osvalores de HbA1c. Os níveis glicêmicos pós-refeiçõesapresentam uma melhor correlação com os valores deHbA1c. Níveis pós-desjejum tendem a superestimarHbA1c, enquanto que as glicemias pós-almoço apre-sentam uma relação similar àquela da glicemia médiadeterminada pelo perfil glicêmico (32).

Em pacientes tipo 2, a relação entre glicemia eHbA1c parece ser mais complexa (33). Em geral, osníveis glicêmicos, durante diferentes períodos do dia,apresentam uma correlação menor do que a encontra-da para pacientes tipo 1, sendo que os níveis pré-refeição foram os mais relacionados com os níveis deHbA1c. Em DM tipo 2, HbA1c parece fornecer poucainformação sobre os níveis pós-prandiais e, conseqüen-temente, pode não ser um bom índice para as variaçõesdos níveis glicêmicos após as refeições. Devido a isso,há sugestões de que o monitoramento de pacientescom DM2 seja feito através de medidas de glicemias de

jejum, HbA1c e também de medidas glicêmicas pós-prandiais (33). Esta relação em pacientes tipo 2 precisaser melhor estudada.

Na prática, os pacientes que mantiverem seusníveis glicêmicos médios ao redor de 170mg/dL(9,5mmol/L) alcançarão o valor-alvo de 7% recomen-dado para HbA1c. Aqueles pacientes com glicemias >200mg/dL (11,1mmol/L) necessitarão ação adi-cional no tratamento. A determinação da glicemia nãosubstitui o teste A1c, mas pode dar uma idéia do valorda A1c no acompanhamento ambulatorial dos pa-cientes. Precauções devem ser tomadas na interpre-tação destas relações. Os dados são válidos apenasquando métodos similares ao usado pelo DCCT, oumétodos DCCT alinhados/convertidos, são utilizadospara a dosagem de HbA1c (5).

Métodos para Dosagem da GHbExistem mais de 30 métodos diferentes para a dosagemde GHb disponíveis para uso no laboratório clínico(5,34). Eles medem a GHb baseados nas diferenças físi-cas, químicas ou imunológicas entre a fração glicada( H b A1 ou HbA1 c) e a não-glicada HbA0 (figura 2).

De uma maneira geral, os métodos podem serclassificados em dois grandes grupos (tabela 2):

Métodos Baseados na Diferença de CargaElétrica Entre GHb e HbA0A cromatografia de troca catiônica (HPLC e minico-lunas) e a eletroforese usam este princípio. O princípiobaseia-se no fato de que a ligação da glicose, ou deoutro açúcar, ao amino grupo terminal da cadeiaaltera a carga total da hemoglobina, fazendo com quea fração glicada migre mais rápido em um campoelétrico ou em resinas de troca iônica, permitindo aseparação das frações.

As minicolunas cromatográficas invadiram os la-boratórios clínicos na década de 80 por serem baratas ede fácil acesso. Estes métodos são pH e temperatura de-pendentes, apresentam problemas de calibração e baixareprodutibilidade (35). Por não possuírem resoluçãosuficiente para separar as frações glicadas, eles medem afração glicada total (HbA1). Nos últimos anos, eles têmsido substituídos por sistemas de HPLC mais robustos eautomatizados (35-38). O método de HPLC por trocaiônica foi utilizado pelo DCCT (3) e é recomendadocomo método de referência interino para a dosagem deGHb até que os órgãos internacionais decidam sobre ométodo de referência definitivo (27,39).

Métodos Baseados em Ligações EspecíficasEsses métodos usam a diferença estrutural ou química

Tabela 1. Valores aproximados de glicemia média e osvalores correspondentes de HbA1c para uso clínico.HbA1c Glicemia Média

( % ) (estimada pelo perfil (estimada pela glicemiade 7 pontos) de jejum)

m g / d L m g / d L4 65 855 100 1126 135 1397* 170 1668 205 1939 240 22010 275 24811 310 27512 345 302

* valor máximo recomendado pela ADA. Adaptado deRohlfing CL, et al (ref. 32).



entre GHb e HbA0 para separar as frações.Cromatografia de afinidade: baseia-se na reação

específica dos grupos 1,2 cis-diol, resultantes da li-gação da hemoglobina com a molécula de glicose, como ácido fenilborônico ou derivados. Nestes métodos, aGHb liga-se à coluna ou ao suporte contendo oboronato e a fração HbA0 elui primeiro. As variaçõesde temperatura e pH, presença de Hb anômalas, ure-mia e fração lábil não afetam estes métodos. (40).

Métodos imunológicos: usam anticorpos dire-

cionados ao N-terminal glicado da hemoglobina(seqüências que variam de 3 a 8 aminoácidos) e sãoespecíficos para a fração HbA1c, sendo que os resulta-dos são expressos com porcentagem de HbA1c. Agrande vantagem destes ensaios é a facilidade deautomatização em autoanalisadores bioquímicoscomuns. Ensaios utilizando imunoturbidimetria (41) eimunoaglutinação estão disponíveis no mercado (42).

Com a popularização do teste A1c, esta moda-lidade de ensaio tem sido recentemente utilizada para

Figura 2. Princípio dos métodos utilizados para dosar GHb: a) troca iônica; b) afinidade; c) imunoensaio.

Princípio Geral

Separação pordiferença decarga dasfrações

Separação porligação acompostosespecíficos

Método

Minicoluna –Troca Iônica

HPLC – TrocaIônica

Eletroforese

Cromatografiapor Afinidade

Afinidade/Cap-tura iônica

Imunoensaios

Princípio específi-co

HbA1, menos positi-va em pH neutro,liga-se mais fraca-mente à coluna eelui primeiro

Frações glicadassão eluídas porgradiente de pH

Migração emcampo elétrico:HbA1c é mais lentadevido à glicose

Afinidade comácido amino fenil-borônico (HPLC eminicolunas)

Afinidade + cap-tura iônica + fluo-rescência

Imunoturbidimetria(IT)Imunoaglutinação(IA)

Tipo de GHbdosada

HbA1

HbA1A1a A1b A1c

Lábil (?)

HbA1A1c

GHb Total

GHb Total

HbA1c(S1c, C1c, D1c)

PrincipaisInterferentes

HbF e outras HbLipemia/Icterí-

ciaTemperaturaFração lábil

UremiapH

HbF e outras HbUremia/AspirinaVitamina C (?)Vitamina E (?)

UremiaHbF

?

?

?

CV (%)Interen-

saio

> 10

< 5

5 – 10

< 5

5 – 6

6 – 8

Certifi-caçãoNSGP

Não

Sim

Sim

Sim

Sim

Sim

Marcas Comerci-ais Disponíveis

Labtest **Biodiagnóstica **DolesBiosystem

Biorad Variant I e IITOSOHHitachiMenarini

BeckmanSebiaHelena

Primus HPLCPierce e IsolabMinicolunas

IMX Abbot

TinaQuant RocheDade Bering Di-mensionDCA BayerMetrika

* Métodos referência IFCC não são aplicados para uso na rotina e não constam na tabela.** Teste disponível apenas no Brasil.

Tabela 2. Métodos para dosagem de glico-hemoglobina no laboratório clínico. *

a. b. c.



desenvolver testes rápidos para monitoramento dopaciente em casa ou no consultório médico na hora daconsulta (point of care testing – POCT). Estes métodosutilizam sangue capilar e cassetes descartáveis que con-têm o conjunto reativo (42,43). Os resultados sãodisponibilizados em menos de 10 minutos e apresen-tam uma boa correlação e concordância com os resul-tados dos métodos tradicionalmente usados no labo-ratório clínico. Uma desvantagem é o custo elevadode, aproximadamente, 15 a 25 dólares por teste.

Método Enzimático: recentemente foi descritoum método que utiliza proteases para digerir a hemo-globina produzindo “frutosil-aminoácido” (44). Pelaação de uma oxidase, este composto produz peróxidode hidrogênio, que reage com cromogênios na pre-sença de peroxidase. A hemoglobina total é medidaespectrofotometricamente e o resultado é dado comoa relação GHb/Hb total.

O Brasil ainda não possui um programa externoda qualidade específico para GHb. A participação emprogramas internos e externos, para garantir a quali-dade de todos os resultados, é uma exigência dosórgãos fiscalizadores para a obtenção de Certificado deAcreditação para o laboratório clínico. Apesar disto, osdois maiores Programas Externos para Garantia daQualidade, gerenciados pela Sociedade Brasileira dePatologia Clínica (SBPC – PELM) e SociedadeBrasileira de Análises Clínicas (SBAC – Control-Lab)ainda não contemplam o parâmetro GHb (45,46). ASBPC – PELM está programando, para 2004, aprimeira remessa de controles para análise de GHb.

Padronização e Harmonização dos Resulta-dosEm geral, métodos utilizando diferentes princípios deensaio apresentam excelente correlação, e não existemdados suficientes para mostrar se um ou outro méto-do, ou fração, tem valor clínico superior. No entanto,os valores de GHb/HbA1c fornecidos por um labo-ratório podem não corresponder com os valoresfornecidos por outro laboratório, mesmo usando omesmo método e medindo a mesma fração. Não existeconcordância entre os valores de referência e a com-paração dos resultados é muito difícil (5,35,47-49). Amesma amostra pode apresentar um valor de 7% emum laboratório e 9% em outro. A carência depadronização limita o uso destes métodos. Apesar douso de fórmulas de conversão, oriundas de estudoscomparativos, ser uma prática largamente adotada, avalidade desta ferramenta para padronização dos resul-tados de GHb depende do método originalmente uti-lizado. Em um estudo prévio (35), relatamos que as

fórmulas de conversão, baseadas em métodos que nãomedem a fração HbA1c (como as minicolunas de trocaiônica, métodos baseados em afinidade e eletroforese),têm uma variabilidade que pode resultar em diferençasabsolutas maior que 1% do valor verdadeiro. Esta vari-ação pode mascarar uma verdadeira, e clinicamente re-levante, diferença em níveis de HbA1c. Os métodoscom baixa reprodutibilidade inferem um grande erronos resultados convertidos. No entanto, quando mé-todos precisos são utilizados, o erro na conversão dosresultados é muito menor e aceitável para uso clínico.

A preocupação com a padronização dos méto-dos para GHb foi intensificada no início da década de90, com a previsão dos resultados finais do DCCT(49).Desde 1984, o National Diabetes Data Group(NDDG) reconhecia a necessidade de padronização, egrupos de estudo discutiam o problema (50). Em1991, mudanças foram feitas no programa externo dequalidade para GHb do College of American Patholo -g i s t s (CAP) para permitir uma melhor avaliação da vari-ação interlaboratorial e exatidão dos resultados. Osmétodos foram divididos por categorias, e a GHbmedida por cada laboratório foi especificada (HbA1,A1 c ou GHb total). Foi o primeiro mapeamento dasituação, e um programa piloto de padronização foiproposto (51). Outros estudos foram realizados emostraram que a padronização era viável (52-55).

Após a publicação dos resultados do DCCT (3),preocupados com o impacto clínico dos resultados deGHb no manejo do paciente diabético, vários comitêsinternacionais trabalharam na padronização e unifi-cação dos resultados de GHb (47,56,57). O NationalGlycohemoglobin Standardization Program ( N G S P )(39), patrocinado pelas Associações Americanas deDiabetes (ADA) e de Química Clínica (AACC),começou, em 1996, a comparar e certificar os dife-rentes métodos utilizados para dosar GHb, com ointuito de relacionar os diferentes valores de GHbobtidos com os valores de HbA1c do DCCT. O centrode referência é o laboratório que participou comolaboratório central do DCCT na Universidade de Mis-souri. O objetivo principal do NGSP é certificar osmétodos a nível de fabricantes, mas laboratóriospodem também obter certificação a nível de labo-ratório de referência (nível 1) ou clínico (nível 2). Oprograma inclui a análise e monitoramento da precisãoe desvio, considerando o método do DCCT comoreferência. Os critérios para certificação são: CV< 5%(< 3% para Laboratórios de Nível 1) e um erro de ± 5%para os valores estabelecidos pelo laboratório central(valores DCCT). Desta maneira, cada método oulaboratório pode informar os resultados de GHb em %



HbA1c diretamente comparáveis com os do DCCT. Osucesso desta iniciativa está implícito no grandenúmero de métodos certificados e na pequena variaçãointerlaboratorial obtida pelos métodos certificados nosprogramas externos de garantia da qualidade (58).

A descrição de novas técnicas para dosagem daGHb, como a espectrometria de massa e técnicas mole-culares recombinantes, levaram alguns grupos a estudarpropostas de métodos de referência (59-61). A Fede-ração Internacional de Bioquímica Clínica (IFCC)aprovou recentemente um método de referência paraGHb (27). O método é baseado em clivagem da GHbem peptídeos específicos, separação por HPLC de trocaiônica e identificação por espectrometria de massa oupor eletroforese capilar. A correlação entre resultados doIFFC e NGSP é excelente, porém os valores absolutossão diferentes. Em média, os valores IFFC são1 , 6 % H b A1 c mais baixos que os valores do NGSP e, con-seqüentemente, do que os do DCCT (58). Os resulta-dos do IFCC são baseados na exatidão analítica, e osresultados dos métodos certificados pelo NGSP sãobaseados em evidências clínicas. Estudos da relação dosresultados do IFCC e DCCT estão em andamento parasaber quais valores devem ser utilizados. O impacto damudança de valores no manejo clínico será grande.Enquanto os órgãos internacionais não chegam a umacordo, o NGSP continuará certificando os métodos deGHb e incluirá o método do IFCC como um dos méto-dos âncora da rede de laboratórios do programa. Osprogramas externos de garantia da qualidade da Europajá estão informando os resultados de GHb IFFC, junta-mente com os valores DCCT/NGSP.

No Brasil, alguns grupos trabalham na consci-entização da importância dos resultados de HbA1c,mas pouco tem sido feito para padronizar os resultados(62). Em um estudo piloto recente (63) realizado noestado do Rio Grande do Sul, os métodos utilizadospelos laboratórios foram mapeados e classificados por

grupos (tabela 3). A realidade dos laboratórios clínicosdo sul do país é muito diferente da realidade interna-cional. Apenas 23,6% dos laboratórios avaliados usammétodos certificados pelo NGSP, e 76,4% utilizammétodos não certificados e não podem ter seus resul-tados comparados aos resultados do DCCT. O méto-do de microcromatografia de troca iônica é o mais uti-lizado entre os laboratórios do Rio Grande do Sul(71,9%), apresentando, nas diferentes marcas comer-ciais, uma grande variação entre resultados.

Fatores que Afetam os ResultadosDependendo dos métodos utilizados, muitos fatorespodem afetar ou interferir nos resultados. Os fatores maisconhecidos são a fração lábil e a conservação da amostra(64-66). Estes estudos são antigos e há carência de dadosrecentes que possam ser aplicados aos novos métodos eequipamentos disponíveis no mercado.

Recentemente, relatamos o efeito destas va-riáveis nas dosagens de GHb (67). A fração lábil é umaimportante contribuição, quando não é adequada-mente eliminada ou quantificada pelo método que estásendo usado, nos valores de HbA1c. Em nosso estudo,utilizando um método de HPLC, as amostras que nãoapresentaram pico definido para a fração lábil no cro-matograma foram superestimadas em até 1,64% deHbA1c. Como uma maneira prática de evitar esta inter-ferência, propomos um pré-tratamento da amostra,que consiste de incubação do sangue total por 6h a37°C, para eliminação desta fração lábil. Em relação aoarmazenamento das amostras, verificamos que asamostras que são mantidas sob refrigeração (4°C)apresentam estabilidade por 10 dias, e o armazena-mento sob -20°C subestima significativamente a con-centração de HbA1 c, independente do tempo dearmazenamento. As amostras mantidas sob -80°C sãoestáveis até 3 meses. Sugerimos que as amostras quenão podem ser imediatamente analisadas sejam manti-

Grupo

1234567

89

Método

Mini ColunaMini ColunaMini ColunaMini ColunaMini ColunaMini ColunaImuno-turbi-

dimetriaHPLC/LPC

Eletroforese

Laboratórios(N = 89)

32111064114

74

Marca

LabtestKatal

BiodiagnósticaBiosystems

DolesBiobrásRoche

BioradCelm

Princípio

Troca iônicaTroca iônicaTroca iônicaTroca iônicaTroca iônicaTroca iônicaImunológico

Troca iônicaTroca iônica

Valor deReferência (%)

5,3 – 8,05,0 – 7,06,0 – 8,06,0 – 8,04,5 – 8,04,5 – 7,04,8 – 6,0

4,0 – 6,46,0 – 9,2

CertificaçãoNGSP

NãoNãoNãoNãoNãoNãoSim

SimNão

Tabela 3. Métodos para determinação de HbA1c/glico-hemoglobina utilizados por laboratóriosclínicos do Rio Grande do Sul.

* N=89



das sob refrigeração por até 10 dias, e que o armazena-mento a longo prazo deve ser feito a -80°C. Mais estu-dos são necessários para explicar o fato surpreendentede que amostras estocadas a -20°C perdem a estabili-dade já no primeiro dia de armazenamento.

Além destas variáveis pré-analíticas, algumasdoenças e estados patológicos, como anemias, dislipi-demias, e alguns medicamentos podem alterar signi-ficativamente os resultados de GHb (5,6).

A presença de hemoglobinas (Hb) anômalas éconsiderada um importante fator de interferência posi-tiva ou negativa nas dosagens de GHb, independentedo método utilizado (68). Relatos de diferentes inter-ferências, em diferentes métodos, têm sido publicadosnos últimos anos (69-74), enfatizando que cada labo-ratório deve ter conhecimento da influência das hemo-globinopatias no método que está sendo empregado.A interferência das hemoglobinas anômalas é maiornos métodos com base na separação de cargas, comoHPLC de troca catiônica. Alguns métodos de HPLCidentificam e quantificam as Hb variantes, outrospodem apenas expressar resultados muito baixos oualtos (68). Os métodos imunológicos parecem não serafetados por esta interferência. Em geral, os anticorposanti-HbA1c utilizados nos ensaios reconhecem os 3-5primeiros aminoácidos do N-terminal da cadeia queestá ligado à glicose. Esta seqüência inicial é igual paraa HbA e as Hb variantes comuns.

Como a concentração de GHb depende dameia-vida normal dos eritrócitos (5,6), doenças hemo-líticas ou outras condições que encurtam a sobrevidadas células reduzem significativamente os níveis deGHb. O papel da anemia nos níveis de GHb tem sidopouco estudado. Provavelmente, pacientes com dife-rentes tipos de anemia apresentem níveis reduzidos deGHb e, uma vez corrigida a anemia, tenham os valoresde GHb aumentados. Este fato pode estar relacionadocom aqueles pacientes que apresentam um controleglicêmico, medido pela GHb, em desacordo com ahistória clínica ou glicemia. Alguns estudos mostramque as anemias deficientes de ferro e de vitamina B12alteram os níveis de GHb (75-77). É provável que ane-mias por outras causas, como as de doenças crônicas,afetem os resultados de GHb da mesma forma.

Recentemente (78), estudamos as condiçõesassociadas com os valores muito baixos de GHb. Emum grupo de 130 pacientes que apresentaram valoresde GHb abaixo do limite inferior do intervalo de refe-rência do método de HPLC utilizado, a presença dehemoglobinas anômalas foi observada em 56% (73pacientes). Estes pacientes não apresentavam sinais ousintomas de hemoglobinopatias, a maioria era branca,

e a eletroforese de Hb revelou que todos eram he-terozigotos para Hb S, C ou D. Considerando a he-terogeneidade étnica da população brasileira, estesdados mostram-se relevantes na interpretação do con-trole glicêmico de pacientes com DM. Neste mesmoestudo, os valores muito baixos de GHb tambémforam relacionados com a presença de anemia. Naausência de Hb variantes, a anemia foi observada em35% dos pacientes que apresentaram valores muitobaixos de GHb. Estes dados sugerem que diferentesgraus de anemia podem estar associados a valores maisbaixos de GHb. Isto pode ser devido a pequenas alte-rações no tempo de meia-vida das hemácias ou navelocidade de formação da GHb, ocasionando umadiminuição aparente dos níveis de GHb.

A Hb carbamilada, resultado da reação da Hb coma uréia em pacientes urêmicos (uremia> 160mg/dL),pode ser uma fonte significativa de erro nas dosagens deGHb. Estudos divergem quanto à significância clínica e àmagnitude desta interferência, que é dependente dométodo que está sendo utilizado (79-81).

A ação de drogas, como a aspirina, na formaçãoe determinação da GHb tem sido estudada(79,82,83). A aspirina pode levar à formação de umderivado de Hb “acetilado”, o qual, devido à sua cargaelétrica, migra junto com a GHb naqueles métodosque baseiam-se na diferença de carga para a dosagemde GHb, resultando em valores falsamente elevados.Em um destes estudos (82), foi demonstrado que aingestão de aspirina acarreta um aumento aparente deGHb. Outros dois estudos (79,83) não encontraramdiferenças nos valores de GHb após ingestão de aspiri-na. Da mesma forma que a interferência pelas Hb anô-malas e pela uremia, a interferência da aspirina é méto-do-dependente. O consumo abusivo de álcool, seme-lhante à aspirina, pode levar à formação do mesmoderivado “acetilado”, interferindo também nasdosagens de GHb (83).

Em paralelo, o uso prolongado de vitamina C eE também tem sido estudado como possível fonte deinterferência negativa nas dosagens de GHb (84-86).O estresse oxidativo é apontado como uma provávelcausa do aparecimento das complicações do DM. Oxi-dantes e anti-oxidantes têm um papel importante naterapia destas complicações. Vitaminas C, E e -carotenos têm sido usados como anti-oxidantes empacientes com DM (87). A suplementação de vitaminaE e C melhora o controle glicêmico de pacientes comDM (88-90). Recentemente (91), foi relatado que osníveis de GHb podem ser modificados pela dieta oupelo estilo de vida em indivíduos normais. O consumode álcool, vitamina C e E foi relacionado com o risco



de indivíduos não-diabéticos apresentarem níveis maisbaixos de GHb. Todavia, os resultados destes estudossão contraditórios e não está claro, até o momento, seo uso das vitaminas C ou E altera verdadeiramente osvalores de GHb devido a uma inibição na glicação pro-téica ou se este efeito é devido a outros fatores, nãorelacionados à glicação, mas à formação de produtosderivados, que podem causar erros metodológicos.

Em um ensaio clínico randomizado e controla-do (67), estudamos o efeito de doses usuais de aspiri-na, vitamina C e vitamina E nos níveis de HbA1c,medidos por três métodos diferentes, dois sistemas deHPLC e um imunoensaio, em um grupo de volun-tários não-diabéticos. O tratamento com vitaminas Cou E, em doses farmacológicas, não tem nenhumimpacto nos níveis de GHb de indivíduos não-diabéti-cos, quando determinados pelos métodos empregadosno estudo. A aspirina induz um modesto aumento nosníveis de GHb. Mais estudos são necessários para con-firmar este efeito em pacientes com DM.

Comentários FinaisOs estudos que avaliaram o papel do controle glicêmi-co no desenvolvimento das complicações diabéticas(3,4,92) mostraram que redução absoluta de 1% emH b A1 c determinou uma redução significativa nodesenvolvimento ou progressão das complicaçõescrônicas, como retinopatia, nefropatia e doenças car-diovasculares. Estima-se que mais de 5 milhões debrasileiros tenham diabetes (1). O tratamento dascomplicações crônicas consome parte significativa doorçamento destinado à assistência médica.

Devido ao grande número de fatores quepodem afetar os diferentes métodos, cada labo-ratório deve estar atento às fontes de erros quepodem alterar seus resultados de GHb. Embora amaioria destas interferências esteja relatada na liter-atura internacional, os resultados dos estudos sãocontraditórios. Outro aspecto importante a ser men-cionado é que as interferências são dependentes dosmétodos empregados para realizar as dosagens. Umainterferência pode ocorrer em uma magnitude clini-camente significativa em um método e ser negligívelem outro.

Os laboratórios clínicos devem estar preparadospara fornecer resultados exatos e precisos deGHb/HbA1c, para ajudar o clínico a prevenir e mane-jar as complicações do DM.

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Endereço para correspondência:

Jorge Luiz GrossServiço de EndocrinologiaHospital de Clínicas de Porto AlegreRua Ramiro Barcellos 2350, Prédio 12, 4º andar90035-003 Porto Alegre, RSFax: (51) 3332-5188e-mail: [email protected]

glicohemoglobina

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