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Glicoconjugados sulfatados presentes na matriz gelatinosa dos óvulos de ouriços-do-mar
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Leonardo Paes Cinelli
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Química Biológica,
como parte dos requisitos à obtenção do grau de Doutor em Ciências
UFRJ / Instituto de Bioquímica Médica Hospital Universitário Clementino Fraga Filho Programa de Glicobiologia Laboratório de Tecido Conjuntivo Orientador: Paulo Antônio de Souza Mourão Rio de Janeiro, março de 2009
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Glicoconjugados sulfatados presentes na matriz gelatinosa dos óvulos de ouriços-do-mar
Leonardo Paes Cinelli Tese preparada durante o curso de Pós-Graduação em Química Biológica e apresentada ao Instituto de Bioquímica Medida da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Doutor em Ciências. Membros da Banca Examinadora: .............................................................................................................................
Prof. Adriane Regina Todeschini
Professor Adjunto do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho/CCS/UFRJ
.............................................................................................................................
Prof. Eliana Barreto Bergter Professor Titular do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes/CCS/ UFRJ
.............................................................................................................................
Prof. Marcio Lourenço Rodrigues Professor Adjunto do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes/CCS/UFRJ
.............................................................................................................................
Prof. Mario Alberto Cardoso da Silva Neto Professor Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica/CCS/UFRJ
.............................................................................................................................
Prof. Leonardo Nimrichter Professor Adjunto do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes CCS/UFRJ
.............................................................................................................................
Prof. Paulo Antônio de Souza Mourão Professor Titular do Instituto de Bioquímica Médica/CCS/UFRJ
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Ficha catalográfica
Glicoconjugados sulfatados presentes na matriz gelatinosa dos óvulos de ouriços-do-mar
xv ; 128(f) Tese de Doutorado em Ciências (Química Biológica) 1- ouriço-do-mar 2- polissacarídeo sulfatado 3- fucana sulfatada 4- biossíntese 5- estrutura 6- reação acrossômica I- Universidade Federal do Rio de Janeiro II- Glicoconjugados sulfatados presentes na matriz gelatinosa dos óvulos de ouriços-do-mar
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Agradecimentos:
“Faça do lugar em que você está o melhor lugar do mundo!” Meu primeiro agradecimento será para uma pessoa na qual impressionantemente não foi homenageada na Monografia de graduação e nem da Dissertação de mestrado... Será para mim mesmo. E, por favor, não fiquem pensando que sou egocêntrico, pois não sou!!!! O fato é que eu, sem sombra de dúvidas, fui à pessoa que mais se esforçou (vocês não imaginam quanto) para que essa Tese de doutorado se materializasse. Além disso, essa será a última vez que terei a chance de fazer agradecimentos em uma Tese. Exatamente por esse motivo esta sessão será longa, por favor, tenham paciência... Ao Prof. Mourão que me orientou, não só durante a minha IC e toda pós-graduação, como também nos momentos oportunos me deu orientações pessoais e acalmou a meu senso de injustiça. A Profa. Ana Cristina, que mesmo na Itália, mantemos contato (dentro da medida do possível). Pela paciência em ler meus longos e-mails e respondê-los. E principalmente por me apoiar silenciosamente e me explicar que fazer o que achamos correto, com garra e dedicação, sem esperar nada dos outros, nos ajuda a alcançar nossos sonhos!
Você Já Sabe Me Conhece Muito Bem, Eu Sou Capaz De Ir Vou Muito Mais Além
Do Que Você Imagina Eu Não Desisto Assim Tão Fácil Meu Amor,
Das Coisas Que Eu Quero Fazer E Ainda Não Fiz
Na Vida Tudo Tem Seu Preço Seu Valor E Eu Só Quero Dessa Vida É Ser Feliz
Eu Não Abro Mão
Nem Por Você, Nem Por Ninguém, Eu Me Desfaço Dos Meus Planos
Quer Saber Bem Mais Que Os Meus Vinte E Poucos Anos Nem Por Você Nem Por Ninguém, Eu Me Desfaço Dos Meus Planos
Quer Saber Bem Mais Que Os Meus Vinte E Poucos Anos
Tem Gente Ainda Me Esperando Pra Contar, As Novidades Que Eu Já Canso De Saber
Eu Sei Também Que Tem Gente Me Enganando, Mas Que Bobagem Já É Tempo Pra Crescer
(20 e Poucos Anos / Fabio Jr.)
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Aos meus colaboradores (que foram, são e continuarão sendo muitos, principalmente se eu passar em um concurso para Docente, torçam por mim!!!) e que me fizeram ver que existe “vida” além da fertilização do Instituto de Microbiologia: Fabiane, Fernanda, Débora, Prof. Marcio Rodrigues e Prof. Leonardo Nimrichter, do Instituto de Anatomia e Histologia: Prof. Nathan, Leonardo Salgado, Mair, Adriana Pelli, Profa. Lycia, Prof. Leonardo Andrade, Prof. Farina, Prof. Gilberto Amado (Jardim Botânico), do IBCCF: Profa. Eleonora, Gabriel Limaverde, Prof. Pedro Pascutti
“O prazer no trabalho aperfeiçoa a obra” (Aristóteles)
Aos amigos conjuntivos: Adilson, Cris, João Marcelo, Samuel, Prof. Luiz Cláudio, Eliene, Cris, Angélica, Rodrigo Rocha, Amanda, Priscila, Celso, Cintia, Mario Gandra, Aline (BiDuPan), Prof. Mauro Pavão, Marianinha, Lisandra, Jardel, Ricardo Pereira, Rafael Aquino, Eduardo (Miúdo), Eduardo (Bolo), Vitor, Bruno, Lívia, Nelson, Fabio, Bianca, Robertino, Stephan, Gustavo, Laína, Profa. Ana Tovar, Profa. Mariana, Adriana (Brigite), Sônia.
“já falei, quando tiver dúvida pergunta pro Leonardinho!” Sábado, 29/07/2006 Jornal O Globo, lido na casa do Rodrigo em Búzios durante o
SIMEC.
Aos meus alunos Gabriele, Priscila e Mario, muito obrigado pela confiança que depositam em mim, me dando a oportunidade de aprender e ensinar. Em Juiz de Fora, a UFJF, ao Prof. Raúl, a Daniela e a Carla, que me mostraram que Ensino, Pesquisa e Extensão podem ser feitos de várias formas, independente das condições que lhe são oferecidas. A Banca Examinadora que aceitou meu convite com muita felicidade em participar desta grande Festa. E que nem mesmo titubeou por conta do carnaval.
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Aos Confrareiros, Dezinho, Manú, Tatu, Marianinha, Pedro, Carol, Gabriel e Camila, amigos de bom bate-papo mensal. Aos meus bons amigos do Garriga, Paulo, Aline, Anderson, Carla, Sergio, Carol, Rodrigo, Luciano, Ricardo, Letícia, Marcelo, Tatiana, Leandro e Michele. As inesquecíveis festinhas na casa do Anderson e todas as outras farras que fizemos e ainda vamos fazer...
mais uma dose, é claro que eu estou afim
a noite nunca tem fim Porque, agente é assim ...
Agora fica comigo, e não, não desgruda de mim
vê se ao menos me engole BABY ... não me mastigue assim
(Por que que a gente é assim / Barão Vermelho)
A Dona Mara, Seu Isaias, Juninho, Patrícia, Maria Julia, e Yasmin (que eu conheci esta semana), vamos pro pula-pula, vamos?!!!! Tia Lucia, Sergio,Giovanna, Tia Leda, Carol e Vovô Sebastião, muito obrigado pelo apoio e pelas palavras nas horas importantes. E é claro pelas cervejinhas! Ao Tio Lupércio que me ensinou a sempre pensar e questionar. “Quem tem preguiça de pensar tem que voltar pra árvore!” A Tia Rosangela, Bruno, Camila, Eduardo, Aline e Vovó Neusa, as inúmeras risadas motivadas pelas inúmeras estórias da nossa própria família. A gente ri da gente mesmo!!! Marcelo e Rafaela, meus primeiros grandes amigos. Muito obrigado por terem deixado eu fazer a leitura no Casamento de vocês... Vocês não sabem como isso foi importante pra mim!!!! Ao meu sobrinho Felipe, ao maior guerreiro que conheço e pessoa que mais vontade de viver... Ao meu irmão e Zoraide, é curioso como a vida passa e a “mesma paisagem“ muda e a gente fica sem saber se é porque ela realmente mudou e/ou os nossos olhos que mudaram... Ao meu pai, o meu exemplo de compromisso. Sempre que acho que estou trabalhando pouco lembro de você falando... “Ninguém morre de trabalhar muito menos de estudar e nessa idade se dormir bem uma noite tá novo de novo”. Eu lembrei muito disso para escrever essa Tese e deu certo!!!! Obrigado pelas
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broncas na infância e conversas na juventude, com certeza parte disso tem como produto essa Tese.
“Nunca satisfeito, sempre incomodado” A minha Mãe, a pessoa mais fantástica que eu conheço. Só você poderia ter sido minha mãe mesmo. Com qualquer outra teria dado errado. As coisas que acontecem na vida da gente têm de servir para o nosso bem, mesmo que num primeiro momento pareça ruim (e muitas vezes são), mas temos que tirar uma boa lição disso tudo e encarar a vida com dignidade, ajudando o próximo e acima de tudo com felicidade.
Primeiro levaram os negros
Mas não me importei com isso Eu não era negro
Em seguida levaram alguns operários
Mas não me importei com isso Eu também não era operário
Depois prenderam os miseráveis
Mas não me importei com isso Porque eu não sou miserável
Depois agarraram uns desempregados
Mas como tenho meu emprego Também não me importei
Agora estão me levando
Mas já é tarde. Como eu não me importei com ninguém
Ninguém se importa comigo. (Bertolt Brecht, (10.02.1898 - 04.08.1956). Teatrólogo e poeta alemão)
A minha esposa, Maisa, que transforma meus dias ruins em dias melhores e meus dias bons num Reveilon!!! Me faz enxergar horizontes que antes não havia admirado. E aprimorou a minha visão sobre o devido valor que se deve dar aos pequenos momentos, bons e ruins, da vida... A minha filha (que ainda não nasceu), mas vai ser tão linda quanto à mãe dela!!!! Tomará que se essa capacidade de transformação seja genética e entre um crossing over e outro, a Maria Flor tenha herdado essa característica. E por último, a tudo que eu não consigo explicar, nem ver ou tocar, mas existe, me apóia e me energiza.
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Resumo
A matriz gelatinosa que recobre o óvulo (EJC) de ouriços-do-mar contem
glicoconjugados sulfatados responsáveis por induzir a reação acrossômica (RA)
em espermatozóides. A fucana e o sialoglicoconjugado sulfatados do EJC são
capazes de induzir e potencializar a RA, respectivamente, de maneira espécie-
específica. Essas fucanas sulfatadas oriundas de ouriço-do-mar possuem
estruturas simples, bem definidas e cada espécie tem seu padrão de sulfatação
próprio e, estruturalmente, eles dividem algumas características com os
proteoglicanos de vertebrados, exceto pela descrição da cadeia protéica. Vários
estudos sobre o EJC de ouriços-do-mar vêem sendo publicados, mas não há
informações sobre a estrutura nativa dessas fucanas sulfatadas e poucos dados
sobre a composição de açúcares do sialoglicoconjugado sulfatado. Nessa Tese
nós reportamos pela primeira vez a ocorrência de uma proteofucana sulfatada no
EJC do ouriço-do-mar Lytechinus variegatus. Além disso, nós mostramos a
caracterização parcial do sialoglicoconjugado sulfatado da mesma espécie e a
elucidação da fucana sulfatada de Paracentrotus gaimardi. Todas as amostras
foram purificadas através de técnicas cromatográficas. A proteofucana sulfatada e
a fucana sulfatada apresentam alto peso molecular, enquanto o
sialoglicoconjugado sulfatado apenas ~ 8kDa. A composição de açúcar do
sialoglicoconjugado é Neu5Gc, glucose, manose, fucose e galactose e a fucana
sulfatada de P. gaimardi é composta majoritariamente por [3-α-Lfucp-
4(OSO3)1]n. Esses achados mostram novas estruturas de polissacarídeos
sulfatados e abordam novos questionamentos sobre a biossíntese e secreção das
fucanas sulfatadas de invertebrados marinhos. O possível, papel destes
glicoconjugados sulfatados encontrados na manutenção da arquitetura do EJC e
na indução da RA são discutidos nessa Tese.
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Abstract The eggs jelly coat (EJC) of sea urchins contains sulfated glycoconjugates
responsible for triggers sperm acrosome reaction (AR). Purified sulfated fucan and
sialoglycoconjugate in EJC are able to inducing and potentiate AR, respectively, in
a species-specificity fashion. These sulfated fucans from sea urchins have simple,
well defined repeating structures, and each species represents a particular pattern
of sulfate substitution and, structurally, they share some characteristics with
vertebrate proteoglycan, except for the description of a protein core. Several
studies about the EJC of sea urchins have been published, but there is no
information about the native structure of sulfated fucan and little information about
sugar composition of sulfated sialoglycoconjugated. In this thesis we report for the
first time the occurrence of proteo-sulfated fucan in EJC of sea urchin Lytechinus
variegatus. Moreover, we show a partial characterization of sialoglycoconjugate
from the same specie and elucidation structure of sulfated fucan from
Paracentrotus gaimardi. All samples were purified by chromatography techniques.
Proteo-sulfated fucan and sulfated fucan show high molecular weight, while
sialoglycoconjugate has ~8 kDa. The sugar composition of sialoglycoconjugate is
Neu5Gc, glucose, manose, fucose, galactose and the sulfated fucan from P.
gaimardi is mostly composed of [3-α-Lfucp-4(OSO3)1]n. These findings show
new structures of sulfated polysaccharides and raise questions concerning the
biosynthesis and secretion of sulfated fucans from marine invertebrates. Possible
roles of these sulfated glycoconjugate in EJC architecture and in AR are discussed
in this thesis.
x
Índice Geral: 1) Introdução.............................................................................................. 01 1.1 Importância da Glicobiologia........................................ 01 1.2 Polissacarídeos sulfatados........................................... 03 1.2.1 Homopolissacarídeos sulfatados.................................. 05 1.2.1.1 Homopolissacarídeos sulfatados em ouriços-do-mar... 06 1.2.2 Heteropolissacarídeos ................................................. 09 1.2.3 Glicoconjugados sulfatados.......................................... 14 1.2.2.1 Heteropolissacarídeos sulfatados em ouriços-do-mar. 19 1.3 Echinodermata.............................................................. 19 1.3.1 Ouriço-do-mar como modelo de estudo....................... 20 1.3.2 Processos de ativação do espermatozóide de ouriço-
do-mar.......................................................................... 22
1.3.2.1 Ativação da motilidade.................................................. 23 1.3.2.2 Quimiotaxia................................................................... 24 1.3.2.3 Reação Acrossômica.................................................... 25 1.3.2.4 Bloqueio da poliespermia............................................. 29 2) Objetivos..................................................................................................
31
3) Material e Métodos..................................................................................
32
3.1 Obtenção dos ouriços-do-mar e dos gametas............ 32 3.2 Isolamento da matriz que envolve o óvulo de ouriço-
do-mar......................................................................... 32
3.3 Obtenção do plasma seminal...................................... 32 3.4 Solubilização da matriz gelatinosa que recobre o
óvulo............................................................................ 33
3.5 Quantificação das amostras........................................ 34 3.6 Purificação dos glicoconjugados sulfatados................ 34 3.7 Eletroforese em gel de agarose.................................. 35 3.8 Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de
SDS em condições redutoras (SDS-PAGE)................ 35
3.9 Eletroforese em gel de poliacrilamida em tampão barbital.........................................................................
36
3.10 Depolimerização de polissacarídeos sulfatados utilizando enzimas e ácido nitroso...............................
36
3.11 Identificação dos açúcares constituintes dos polissacarídeos sulfatados..........................................
36
3.12 Ressonância Magnética Nuclear................................. 37 3.13 Hidrólise do sialoglicoconjugado sulfatado.................. 37 3.14 Análise de ácido siálico e HPTLC............................... 37
xi
3.15 Análise das hexoses em cromatografo a gás acoplado a espectrômetro de massa..........................
38
3.16 Espectrometria de massas com ionização por “electrospray” (ESI-MS)...............................................
38
3.17 Preparo da amostra para microscopia de luz.............. 39 3.18 Coloração por azul de Alcian....................................... 39 3.19 Coloração por ácido periódico + reativo de Schiff
(PAS)............................................................................ 39
3.20 Coloração para lectinas............................................... 40 4) Resultados...............................................................................................
41
4.1 Expressão de polissacarídeos sulfatados na matriz gelatinosa que recobre o óvulo do ouriço-do-mar L. variegatus....................................................................
41
4.2 Purificação e caracterização parcial da proteofucana sulfatada presente na matriz gelatinosa que recobre o óvulo do ouriço-do-mar L. variegatus.......................
53
4.3 Localização e composição de açúcares do sialoglicoconjugado sulfatado presente na matriz do óvulo do ouriço-do-mar L. variegatus.............................
61
4.4 Caracterização da fucana sulfatada presente na matriz gelatinosa que recobre o óvulo do ouriço-do-mar P. gaimardi..................................................................
73
4.5 Caracterização parcial de proteoheteropolissacarídeos sulfatados presentes no plasma seminal de L. variegatus.................................
82
5) Discussão.................................................................................................
89
5.1 Expressão sazonal da fucana sulfatada em L. variegatus ...................................................................
89
5.2 Proteofucana sulfatada em ouriços-do-mar................. 92 5.3 Caracterização do sialoglicoconjugado do EJC de
ouriço-do-mar.............................................................. 94
5.4 Fucana sulfatada em morfotipos de ouriços-do-mar P. gaimardi...................................................................
95
5.5 Proteoheteropolissacarídeos sulfatados no plasma seminal.........................................................................
97
6) Perspectivas............................................................................................
98
6.1 Proteofucana sulfatada................................................ 98 6.2 Sialoglicoconjugado sulfatado..................................... 99 6.3 Fucana sulfatada em P. gaimardi................................ 100
xii
7) Referências.............................................................................................. 102 8) Anexos aceitos ou publicados...............................................................
111
8.1 Dermatan sulfate is the major metachromatic glycosaminoglycan in the integument of the anuran Bufo ictericus……………………………………………..
112
8.2 Expression of two different sulfated fucans by females of Lytechinus variegatus may regulate the seasonal variation in the fertilization of the sea urchin
114
8.3 The influence of brown algae alginates on phenolic compounds capability of ultraviolet radiation absorption in vitro………………………………………..
123
8.4 Self-aggregation of Cryptococcus neoformans capsular glucuronoxylomannan is dependent on divalent cátions…………………………………………..
125
8.5
A vanadium bromoperoxidase catalyzes the formation of high molecular weight complexes between brown algal phenolic substances and alginates…………………………………………………..
127
Indice de Tabelas: Tabela 1 Principais características estruturais dos
glicosaminoglicanos.................................................................... 12
Tabela 2 Classificação de alguns proteoglicanos segundo sua localização...................................................................................
17
Tabela 3 Deslocamento químico de prótons para resíduos de -L-fucose
da -L-fucana sulfatada de L. variegatus e compostos padrões
50
Tabela 4 Deslocamento químico de carbono dos resíduos de -L-fucose
da -L-fucana sulfatada de L.variegatus e compostos padrões
51
Tabela 5 Características da solubilização da matriz gelatinosa em diversos tampões........................................................................
54
Tabela 6 Quantificação de proteínas, polissacarídeos sulfatados e hexoses em 1mg/ml presentes após cada etapa purificativa...................................................................................
60
Tabela 7 Deslocamento químico de prótons para resíduos de α-L-fucose da α-L-fucana sulfatada de P. gaimardi......................................
80
Tabela 8 Deslocamento químico de carbono para resíduos de α-L-fucose da α-L-fucana sulfatada de P. gaimardi...........................
81
Tabela 9 Possível resultado de ensaio de fertilização in vitro entre os gametas de L. variegatus e P. gaimardi......................................
97
xiii
Indicie de Figuras: Figura 1 Etapas da interação adesiva de linfócitos com o endotélio de
veias dos linfonodos.................................................................. 2
Figura 2 Distribuição de glicosaminoglicanos sulfatados no Reino Animal........................................................................................
4
Figura 3 Estrutura da fucana sulfatada encontrada na parede do corpo do pepino-do-mar L. grisea.......................................................
5
Figura 4 Estrutura da galactana sulfatada presente na matriz extracelular da grama marítima R. marítima...........................
6
Figura 5 Estruturas de α-L-fucanas sulfatadas e α-L-galactana sulfatada da matriz gelatinosa que recobre o gel do óvulo de ouriços-do-mar........................................................................
7
Figura 6 Estruturas das galactanas sulfatadas isoladas do gel que envolve o óvulo e do ovário do ouriço-do-mar E. lucunter......
9
Figura 7 Unidades dissacarídicas dos glicosaminoglicanos................. 11 Figura 8 Estrutura da glucuronoxilomanana encontrada em diferentes
sorotipos.................................................................................... 13
Figura 9 Diversidade estrutural de ácidos siálicos................................ 14 Figura 10 Esquema de um proteoglicano............................................... 15 Figura 11 Representação esquemática da estrutra do proteoglicano de
perlecan.................................................................................. 18
Figura 12 Foto do ouriço-do-mar L. variegatus....................................... 20 Figura 13 Posição filogenética dos ouriços-do-mar em comparação com
outros organismos................................................................... 21
Figura 14 Esquema evidenciando as semelhanças morfológicas entre o espermatozóide do ouriço-do-mar e camundongo..................
22
Figura 15 Esquema evidenciando algumas semelhanças morfológicas entre os gametas femininos de camundongo e ouriço-do-mar.........................................................................................
22
Figura 16 Esquema evidenciando as primeiras etapas do processo de fertilização de ouriço-do-mar...................................................
25
Figura 17 Esquema evidenciando as etapas da reação acrossômica............................................................................
26
Figura 18 Relação espécie-específica existente na indução da reação acrossômica em ouriços-do-mar de três espécies distintas.....
28
Figura 19 Diagrama esquemático do receptor da fucana sulfatada localizada na matriz gelatinosa que recobre o óvulo do ouriço-do-mar eo processo de ativação do óvulo.................................
29
Figura 20 Representação esquemática dos dois eventos hierarquicos do reconhecimento entre gametas de ouriço-do-mar................
30
Figura 21 Processo de extração dos polissacarídeos totais a partir da matriz gelatinosa (MG) que recobre o óvulo.............................
41
Figura 22 Purificação dos polissacarídeos sulfatados da matriz gelatinosa que recobre o gel do óvulo do ouriço-do-mar L. variegatus..................................................................................
42
xiv
Figura 23 Eletroforese em gel de agarose dos polissacarídeos sulfatados de L. variegatus purificados em DEAE - celulose
44
Figura 24 Purificação dos polissacarídeos sulfatados da matriz gelatinosa que recobre o gel do óvulo do ouriço-do-mar L. variegatus. ................................................................................
45
Figura 25 PAGE das -L-fucanas sulfatadas de L. variegatus.................. 46
Figura 26 Expansão dos espectros de uma dimensão (1H) das fucanas sulfatadas de L. variegatus. ......................................................
49
Figura 27 Expansão do espectro de COSY da fucana sulfatada P3 de L. variegatus. ...............................................................................
50
Figura 28 Espectro 1H / 13C HMQC da fucana sulfatada P3 de L. variegatus..................................................................................
51
Figura 29 Comparação entre as duas fucanas sulfatadas obtidas da matriz gelatinosa que recobre o óvulo de L.variegatus.............
52
Figura 30 Purificação da proteofucana sulfatada da matriz gelatinosa que recobre o óvulo do ouriço-do-mar L. variegatus.................
56
Figura 31 Eletroforese em gel de agarose do extrato bruto matriz gelatinosa que recobre o óvulo do ouriço-do-mar L. variegatus................................................................................
56
Figura 32 Eletroforeses em gel de poliacrilamida (7.5%) em condição redutora...................................................................................
58
Figura 33 Purificação da proteofucana sulfatada da matriz gelatinosa que recobre o óvulo do ouriço-do-mar L. variegatus..............
59
Figura 34 Purificação da proteofucana sulfatada da matriz gelatinosa que recobre o óvulo do ouriço-do-mar L. variegatus..............
59
Figura 35 Purificação dos polissacarídeos sulfatados da matriz gelatinosa que recobre o gel do óvulo do ouriço-do-mar L. variegatus................................................................................
62
Figura 36 Eletroforeses do sialoglicoconjugado sulfatado purificado a partir de matriz gelatinosa que recobre o óvulo de ouriço-do-mar L. variegatus....................................................................
63
Figura 37 TLC do ácido siálico purificado do sialoglicoconjugado sulfatado obtido do EJC de L. variegatus...............................
64
Figura 38 ESI do ácido siálico purificado do sialoglicoconjugado sulfatado do ouriço-do-mar L. variegatus................................
65
Figura 39 HPTLC do ácido siálico purificado do sialoglicoconjugado sulfatado obtido do EJC de L. variegatus...............................
66
Figura 40 TLC das hexoses do sialoglicoconjugado sulfatado obtido do EJC de L. variegatus..........................................................
67
Figura 41 Análise do sialoglicoconjugado obtido da matriz gelatinosa que recobre o óvulo do ouriço-do-mar da espécie L. variegatus por GC-MS............................................................
68
Figura 42 Espectro de uma dimensão (1H) do sialoglicoconjugado sulfatado obtido da matriz gelatinosa que recobre o óvulo do ouriço-do-mar da espécie de L. variegatus.............................
69
Figura 43 Microscopia de luz dos óvulos de L. variegatus. O óvulo foi corado com azul de Alcian (pH 2.5) e com PAS.....................
70
xv
Figura 44 Microscopia de luz dos óvulos de L. variegatus...................... 72 Figura 45 Purificação dos polissacarídeos sulfatados da matriz
gelatinosa que recobre o óvulo dos três morfotipos do ouriço-do-mar da espécie P. gaimardi..................................................
74
Figura 46 Eletroforese em gel de agarose dos polissacarídeos sulfatados de morfotipos de P. gaimardi purificados em DEAE-celulose........................................................................
75
Figura 47 Eletroforeses das fucanas sulfatadas presentes na matriz gelatinos que recobre o óvuklo dos três morfotipos de ouriço-do-mar da espécie P. gaimardi..................................................
75
Figura 48 Esquema representativo do resultado da cromatografia em papel da fração P2 obtida do EJC de morfotipos de P. gaimardi...................................................................................
76
Figura 49 Espectro de RMN 1H unidimensional a 600 mHz da fucana sulfatada de P. gaimardi.........................................................
77
Figura 50 Expansão do espectro de COSY da fucana sulfatada do EJC de P. gaimardi...........................................................................
78
Figura 51 Espectro 1H / 13C HMQC da fucana sulfatada do EJC de P. gaimardi...................................................................................
78
Figura 52 Estrutura da fucana sulfatada isolada do EJC dos três morfotipos de P. gaimardi analisados.....................................
79
Figura 53 Eletroforese em gel de agarose do extrato bruto do plasma seminal L. variegatus intacto e tratado com enzima proteolítica.................................................................................
82
Figura 54 Purificação dos proteoheteropolissacarídeos sulfatados do plasma seminal de L. variegatus. .............................................
83
Figura 55 Eletroforese em gel de agarose do extrato bruto do plasma seminal L. variegatus intacto.....................................................
84
Figura 56 PAGE 6% em tampão barbital sódico....................................... 85 Figura 57 Eletroforese em gel de agarose dos
proteoheteropolissacarídeos sulfatados do plasma seminal de L. variegatus..............................................................................
87
1
INTRODUÇÃO
1.1) Importância da Glicobiologia:
O termo glicobiologia foi cunhado em 1988 e definido como uma nova
fronteira da biologia molecular e bioquímica que visa estudar a estrutura, a
biossíntese, e a biologia dos carboidratos. O entendimento do papel biológico
desempenhado por carboidratos cresceu nos últimos anos, demonstrando que
estão envolvidos em processos como desenvolvimento, fertilização,
envelhecimento, (re)construção da matriz extracelular (MEC), regulação da
atividade de fatores de crescimento e de enzimas importantes nos mais variados
eventos biológicos (Varki et al., 1999 ; Bernfield et al., 1999 ; Kawashima , 2006 ;
Volpi, 2006 ; Vilela-Silva et al., 2008).
Atualmente é uma área do conhecimento com relevância crescente na
pesquisa básica, aplicada, e biotecnológica. Atrai grandes investimentos do setor
privado, principalmente porque muitas patologias são caracterizadas por
alterações na biossíntese ou degradação de carboidratos. Além disso, diversas
interações e funções biológicas importantes são mediadas por essa família de
moléculas (Lehmann et al., 2006 ; Hardingham e Fosang, 1992).
Uma das enfermidades cuja patogenia envolve carboidratos é a
aterosclerose. Essa é uma doença degenerativa de grande incidência nos dias
atuais. Altos níveis de lipoproteína de baixa densidade (LDL) e baixos níveis de
lipoproteína de alta densidade (HDL) estão associados com o aumento do risco de
lesões ateroscleróticas dos grandes vasos, favorecendo o infarto do miocárdio e
outras doenças cardiovasculares. As primeiras fases do desenvolvimento da lesão
se caracterizam pela entrada de monócitos na região subendotelial dos vasos
sangüíneos. Há evidências de que no rolamento de monócitos ocorre a expressão
de P-selectina no endotélio, que reconhece uma glicoproteína conhecida como “P-
selectin glycoprotein ligant-1”, presente no monócito circulante (Furie e Furie,
1995). Além disso, a LDL nativa, e principalmente a oxidada, liga-se a
proteoglicanos (PG) da parede das artérias. Esse complexo é posteriormente
fagocitado por macrófagos arteriais, formando as chamadas células esponjosas ou
2
“foam cells”. Essas células podem sofrer lise celular, devido ao grande conteúdo
citoplasmático adquirido, e complicar o quadro da doença devido ao
extravasamento do seu conteúdo (Kaplan e Aviram, 2001).
Outro exemplo de patologia associada aos carboidratos é a doença de
Alzheimer, muito estudada atualmente. Essa patologia decorre de placas
amilóides emaranhadas às neurofibrilas, causando a morte neuronal. O heparam
sulfato (HS), está implicado na patogenia da lesão. Investigações mostram uma
alta afinidade entre PGHS e precursores amilóides. (GrIffith e SchmItz, 1995 ;
Lindahl et al., 1995) Esse dado indica que cadeias de HS podem ter um papel
importante na patogênese da doença de Alzheimer (Verbeek et al., 1999).
Outro evento que envolve carboidratos é a chamada “recirculação
linfocitária”, em que linfócitos movem-se do sangue para órgãos linfóides
secundários e vice-versa, permitindo que o sistema imune reconheça antígenos
externos. Glicanas sulfatadas estão presentes nos dois primeiros passos desse
processo. O primeiro é o rolamento linfocitário, proveniente da interação específica
entre L-selectinas, presentes nos linfócitos, e glicoproteínas sulfatadas expressas
no endotélio de veias dos linfonodos. O segundo é a ativação linfocitária,
promovida por quimiocinas apresentadas por PGHS, também expressos no
endotélio (Figura 1) (Yeh et al., 2001). Existem evidências de que o ácido siálico
(Sia) e a fucose (Fuc) exerçam papel crítico na interação entre as células
endoteliais e a L-selectina (Homeister et al., 2001).
Figura 1 - Etapas da interação adesiva de linfócitos com o endotélio de veias dos linfonodos. Retirado de Kawashima, 2006.
3
A participação dos carboidratos em processos biológicos também é
observada durante a fertilização animal. Para que ocorra a fertilização, o
espermatozóide precisa ser capacitado durante sua passagem pelo trato
reprodutivo feminino até o local de fertilização (Visconti e Kopf, 1998; Visconti et
al., 1998). Esse processo envolve remoção e modificação de proteínas da
membrana do espermatozóide (Suarez, 1996), ativação da motilidade do gameta
(Cross, 1998), perda do colesterol da sua membrana plasmática (Visconti e Kopf,
1998) e outras modificações bioquímicas. HDL, glicosaminoglicanos (GAG) e
albumina sérica são algumas das moléculas que participam do processo de
capacitação dos espermatozóides (Cross, 1998).
A concentração de condroitim sulfato (CS) e de ácido hialurônico (HA) no
fluido folicular humano, de pacientes submetidos à estimulação hormonal para
fertilização in vitro, está aumentada. Além disso, observa-se o aumento da
motilidade dos espermatozóides tratados com esses GAG. A manipulação dessas
moléculas in vitro, durante tratamentos de infertilidade humana, poderia
aperfeiçoar esses procedimentos, elevando as possibilidades do seu sucesso
(Hamamah et al., 1996).
No fluido seminal de ouriços-do-mar também já foi relatada a presença de
polissacarídeos sulfatados complexos, compostos por galactose (Gal),
glucosamina e manose (Man), ligados covalentemente à cadeia protéica. Não se
conhece a função desses polissacarídeos no fluido seminal de ouriços-do-mar,
mas sugere-se que possam retardar a indução da reação acrossômica (RA)
espontânea e/ou aumentar a motilidade dos espermatozóides (Cinelli et al,
submetido). Por fim esses são alguns exemplos da participação de carboidratos
em processos fisiológicos e patológicos.
1.2 - Polissacarídeos sulfatados:
Os polissacarídeos sulfatados apresentam longas cadeias, formadas por
açúcares com característica ácida, devido à presença de cargas negativas, que
provem de ésteres de sulfato e/ou carboxilas. Essas moléculas são amplamente
distribuídas no Reino Animal (Figura 2) e em algumas plantas marinhas. Possuem
4
grande variedade estrutural e diversas funções em seus tecidos de origem
(Medeiros et al., 2000 ; Aquino et al., 2005). Além disso, podem ser expressos
tanto no espaço extracelular – MEC ou lâmina basal - quanto na célula - superfície
das células ou em grânulos intracitoplasmáticos (Chen et al., 2008).
Figura 2: Distribuição de glicosaminoglicanos sulfatados no Reino Animal. Fonte: Mederios et al. 2000.
Uma das formas clássicas de se classificar esse conjunto de moléculas é
de acordo com a sua composição de monossacarídeos, sendo chamadas de
homopolissacarídeos ou heteropolissacarídeos.
Nessa Tese serão abordadas três classes distintas de glicoconjugados
sulfatados, presentes na matriz gelatinosa que recobre o óvulo dos ouriços-do-mar
(EJC): 1) fucanas sulfatadas (FS), considerada como homopolissacarídeo, 2)
sialoglicoconjugado sulfatado (SGCS), considerado um heteropolissacarídeo e 3)
proteofucana sulfatada (pFS), um homopolissacarídeo ligado a uma cadeia
protéica.
Nessa introdução vamos discutir exemplos de função e localização de
moléculas pertencentes a esses três grupos de macromoléculas que
5
mencionamos anteriormente. Focaremos a maioria de nossos exemplos na fauna
marinha, habitat dos ouriços-do-mar que é o modelo utilizado nessa Tese.
1.2.1 - Homopolissacarídeos sulfatados:
Homopolissacarídeo sulfatado é um polímero composto por uma única
unidade de açúcar, contendo ésteres de sulfato. Alguns exemplos são as
galactanas sulfatadas e FS, compostas exclusivamente por galactose (Gal) e Fuc,
respectivamente.
A parede do corpo do pepino-do-mar Ludwigothurea grisea contém uma FS,
que foi estudada por metilação e ressonância magnética nuclear (RMN). Esta FS é
constituída por unidades tetrassacarídicas repetitivas, como mostrado na Figura 3
(Mulloy et al., 1994 ; Ribeiro et al., 1994).
Figura 3: Estrutura da fucana sulfatada encontrada na parede do corpo do pepino-do-mar L. grisea. Fonte: Mulloy et al., 1994.
Os polissacarídeos sulfatados são amplamente distribuídos no Reino Animal,
mas aparentemente ausentes em plantas superiores. Entretanto, recentemente foi
relatado que a grama marinha da espécie Ruppia marítima, contém uma galactana
sulfatada, com a seguinte estrutura: [3-β-D-Gal-2(OSO3)-14-α-D-Gal-14-α-D-
Gal-13-β-D-Gal-4(OSO3)-1]n (Figura 4). Esse foi o primeiro relato da presença
de polissacarídeos sulfatos em vegetais superiores (Aquino et al, 2005).
6
Figura 4: Estrutura da galactana sulfatada presente na matriz extracelular da grama marítima R. maritima. Fonte Aquino et al., 2005.
1.2.1.1 - Homopolissacarídeos sulfatados em ouriços-do-mar:
Alves e colaboradores (1997) isolaram e purificaram os polissacarídeos
sulfatados do EJC de três espécies de ouriços-do-mar. Esses compostos possuem
estruturas bastante simples, constituídas por unidades repetitivas bem definidas. A
espécie Echinometra lucunter possui um homopolímero, formado de -L-Gal,
sulfatada na posição O-2 e unidas por ligação do tipo 13 (Figura 5). As espécies
Arbacia lixula e Lytechinus variegatus possuem polissacarídeos lineares, formados
de unidades tetrassacarídicas regulares, repetitivas, de -L-Fuc, que diferem
apenas no padrão de sulfatação (Figura 5) (Mulloy et al., 1994).
7
Figura 5: Estruturas de α-L-fucanas sulfatadas e α-L-galactana sulfatada da matriz gelatinosa que recobre o gel do óvulo de ouriços-do-mar. São mostradas nove estruturas de polissacarídeos sulfatados da matriz gelatinosa que recobre o gel do óvulo de ouriços-do-mar completamente caracterizadas. O padrão de sulfatação, posição da ligação glicosídica e constituição monossacarídica são evidenciadas na figura. Fonte Vilela-Silva et al., 2008.
8
O EJC do ouriço-do-mar Strongylocentrotus franciscanus possui uma
homofucana sulfatada, constituída de resíduos de -L-Fuc, unidos por ligação
13 e sulfatados na posição O-2 (Figura 5) (Vilela-Silva et al.,1999).
Também foram descritos os polissacarídeos sulfatados no EJC dos ouriços-
do-mar das espécies Strongylocentrotus droebachiensis e S. pallidus.
Surpreendentemente, os óvulos das fêmeas de S. droebachiensis possuem duas
FS, que se diferem na sulfatação do C2. A FS I (Figura 5, idem FS de A. lixula) é
composta majoritariamente por uma seqüência regular de quatro resíduos, ao
passo que a FS II (Figura 5) é um homopolímero constituído por uma única
unidade repetitiva. Curiosamente, as fêmeas de S. pallidus contem um FS
semelhante ao isotipo I de S. droebachiensis (Figura 5)(Vilela-Silva et al., 2002).
Assim como em S. droebachiensis, as fêmeas do ouriço-do-mar S.
purpuratus também contêm dois isotipos de FS no seu EJC, compostas de
unidades de -L-Fuc unidas através de ligações do tipo 13. Uma dessas FS é
completamente sulfatada na posição O-2 e apresenta 80% de sulfatação na
posição O-4 (Figura 5). O outro isotipo é composto por uma seqüência repetitiva
de três resíduos de -L-fucopiranose, unidos por ligações do tipo 13, com o
primeiro resíduo apresentando sulfatação nas posições O-2 e O-4 e os dois
restantes apenas com sulfatação na posição O-4 (Figura 5) (Alves et al., 1998).
Cerca de 90% das fêmeas analisadas apresenta apenas um dos isotipos de FS no
seu EJC e os 10% restantes uma mistura das duas FS.
A espécie L. variegatus, durante os meses de junho, junho e agosto, além de
expressar a sua FS habitual (Mulloy et al., 1994), também sintetiza outra FS
distinta. Esse composto contém resíduos de -L-Fuc sulfatados na posição 4 e
unidos por ligação 13. Curiosamente, essa FS de variação sazonal não induz a
RA nos espermatozóides homólogos (Cinelli et al., 2007).
A gônada feminina do ouriço-do-mar E. lucunter apresenta dois isotipos de
galactana sulfatada. Uma delas é igual à encontrada no EJC (Figura 6A) e a outra
apresenta uma sulfatação extra no C6 (Figura 6B). Ocorre uma alta concentração
de polissacarídeos sulfatados dentro de grânulos localizados no interior do
ovócito. Todavia, a região perimembranar, local onde irá se localizar o EJC,
9
praticamente não possui polissacarídeo sulfatado. Após a liberação do óvulo na
água do mar, a concentração de polissacarídeo sulfatado no interior do citoplasma
cai e aumenta no EJC. O papel desse polissacarídeo com unidades de Gal
dissulfatadas ainda não está esclarecido. Também desconhecemos seu
mecanismo de exocitose/secreção para formação do EJC como um precursor da
galactana monosulfatada encontrada no EJC (Cinelli et al., dado não publicado).
-O3SO
HO
OOCH2
O3SO
-O3SO-O
3SO
HO
OOCH2
O3SOCH2
O3SOO
3SO
-O3SO
HO
OOCH2
O3SO
-O3SO-O
3SO
HO
OOCH2
O3SOCH2
O3SOO
3SO
1.2.2 - Heteropolissacarídeos:
Heteropolissacarídeo é um polímero composto por duas ou mais unidades
monossacarídixas distintas. Os melhores representantes dessa classe de
carboidratos vastamente estudada de moléculas são os GAG, embora existam
outros compostos que não constituem uma família definida.
Os GAG são formados por unidades dissacarídicas repetitivas, distribuídos
linearmente ao longo do polímero. Essas unidades dissacarídicas são constituídas
por uma hexosamina, que pode ser glucosamina ou galactosamina, unida através
de ligação glicosídica a um açúcar não-aminado, que geralmente é um ácido
hexurônico, [ácido glucurônico (GlcA) ou o ácido idurônico (IdoA)], ou então, um
açúcar neutro [Gal] (Figura 7). As hexosaminas inseridas na cadeia de GAG
podem apresentar grupos O- e/ou N-sulfato em diferentes posições que,
Figura 6: Estruturas das galactanas sulfatadas isoladas do gel que envolve o óvulo (A) e do ovário (B) do ouriço-do-mar E. lucunter. O polissacarídeo (A) apresenta sulfatação no C2 e (B) uma sulfatação adicional no C6.
3
H
A)
B)
10
juntamente com as carboxilas dos ácidos urônicos, são responsáveis pela carga
altamente negativa dessas moléculas.
De acordo com os tipos de unidades dissacarídicas, os GAG podem ser
divididos nos grupos, descritos na Tabela 1, (Jeanloz, 1960).
Na pele da enguia elétrica Electrophorus electricus ocorre um dermatan
sulfato (DS) composto por unidades não sulfatadas, monosulfatadas e
dissulfatadas. Ainda não conhecemos o papel fisiológico dessa molécula, mas
sabemos que possue alta atividade anticoagulante (Souza et al., 2007).
Na parede do corpo do pepino-do-mar, L. grisea, ocorrem três frações de
polissacarídeos sulfatados que se diferenciam pelo seu peso molecular e
composição química. A fração majoritária destes polissacarídeos possui uma
estrutura do tipo CS, com ramificações de Fuc sulfatada, que impedem a sua
degradação pelas condroitinases. A utilização de anticorpos monoclonais revelou
que, além das ramificações de Fuc sulfatada, este CS fucosilado do pepino-do-
mar contém ésteres de sulfato na posição 3 dos resíduos de GlcA (Vieira et al.,
1991). O CS fucosilado ocorre no tecido conjuntivo do pepino-do-mar como um
PG (Vieira et al., 1993). Esse foi o primeiro estudo detalhado de um PG de
invertebrado marinho.
11
R 1 R
2
Figura 7: Unidades dissacarídicas dos glicosaminoglicanos: A, B e F possuem ácido glucurônico; C possui ácido idurônico e D pode apresentar além do ácido glucurônico, o ácido idurônico como seu componente do açúcar não aminado. Quanto ao constituinte de hexosamina, A, B e C são formados por N-acetilgalactosamina e D, E e F por N-acetilglucosamina. Substituição de ácido urônico por galactose é encontrada em E.
A)
B)
E)
D)
C)
F)
açúcar não aminado
hexosamina glicosaminoglicano
Condroitim 6-sulfato
Condroitim 4- sulfato
Dermatam- sulfato
R 1
R 2
= =
o
ou
Heparam-S / heparina
Queratam- sulfato
Ácido hialurônico
-
-
-
-
-
12
Tabela 1: Principais características estruturais dos glicosaminoglicanos: (Jeanloz, 1960 ; Kim et al., 1996). a - Peso molecular médio varia neste intervalo de acordo com a origem dos glicosaminoglicanos; b - Todos os açúcares estão na configuração D, exceto o ácido idurônico que está na configuração L.
GAG P.M.a
(Da) MONOSSACARÍDEOS
b
POSIÇÃO DO
SULFATO
LIGAÇÃO
GLICOSÍDICA
5 - 50 x 105
Ácido
hialurônico
N-acetilglucosamina
Ácido glucurônico
-
-
(1-4)
(1-3)
2 - 5 x 104
Condroitim
4-sulfato
N-acetilgalactosamina
Ácido glucurônico
4
-
(1-4)
(1-3)
2 - 7 x 104
Condroitim
6-sulfato
N-acetilgalactosamina
Ácido glucurônico
6
-
(1-4)
(1-3)
Dermatam
sulfato 2 - 5 x 10
4
N-acetilgalactosamina
Ácido idurônico
4
-
(1-4)
(1-3)
Queratam
sulfato 1 - 3 x 10
4
N-acetilglucosamina
Galactose
6
-/6
(1-3)
(1-4)
Acharam
sulfato 2,9 x 10
4
Glucosamina
Ácido idurônico
2/-6
-2
(1-4)
Heparam
sulfato 1 - 6 x 10
4
Glucosamina
N-acetilglucosamina
Ácido glucurônico
Ácido idurônico
2/6
-/6
-
-/2
(1-4)
(1-4)
(1-4)
(1-4)
Heparina 0.5 -5 x 104
Glucosamina Ácido glucurônico Ácido idurônico
2/6 -
-/2
(1-4)
(1-4)
(1-4)
13
Outros polissacarídeos sulfatados foram isolados da alga vermelha
Pterocladia capilacea. Esses compostos foram fracionados em seis componentes,
utilizando coluna de troca iônica eluída com concentrações crescentes de NaCl.
As duas principais frações foram caracterizadas estruturalmente, utilizando
metilação e espectroscopia de RMN. Uma delas possui uma região central,
formada por unidades alternadas de -D-Gal, ligados através de posição 3 e
unidades de 3,6-anidro- -L-Gal, ligados pela posição 4. A outra fração é um
polissacarídeo complexo, sulfatado principalmente em C6 das unidades de -D-
Gal e no C3 de -L-Gal (Errea e Matulewicz, 1994).
O fungo Cryptococcus neoformans é envolvido por uma cápsula rica em
polissacarídeos. Um desses polissacarídeos, conhecido como
glucuronoxilomanana, tem uma estrutura complexa, esquematizada na Figura 8.
Esse glicano é responsável pela imunosupressão em pacientes, podendo levar à
morte dos mesmos (McFadden et al., 2006).
Figura 8: Estrutura da glucuronoxilomanana encontrada em diferentes sorotipos. Qualquer cepa de Cryptococcus neoformans pode conter uma ou mais unidades destas. Cada possível repetição é composta por três manoses (círculos), um ácido glucurônico (losango) e xiloses (triângulos). Fonte McFadden et al., 2006.
Os Sia são uma família açúcares, com 9 átomos de carbonos, comumente
encontrados no terminal não redutor de cadeia oligossacarídica ligada as
glicoproteínas e aos glicolipídeos (Figura 9). Os Sia também podem ocorrer livres
na natureza, mas geralmente são ligados glicosidicamente a outros resíduos de
14
açúcar. O mais comum são ligações através nas posições 3 ou 6 da Gal ou na
posição 6 da GalNAc ou GlcNAc. Também podem formar homopolímeros,
conhecidos como ácidos polisiálicos.
Os Sia possuem uma extraordinária diversidade estrutural, com uma família
de pelo menos 50 membros, que ocorrem na natureza. A expressão de Sia é
amplamente distribuída na natureza, sendo encontrados tanto em
deuterostemados, como em bactérias (Schauer e Kamerling,1997 ; Angata e
Varki, 2002).A maior variação estrutural ocorre no C5, o qual pode ser substituído
por um acetoamido, hidroxilacetoamido ou hidroxil e, assim, formar, ácido 5-N-
acetil neuramínico (Neu5Ac), ácido 5-N-glicolil neuramínico (Neu5Gc) ou ácido
deaminado neuramínico (KDN), respectivamente. Essas modificações também
podem ocorrer nas hidoxilas dos C4, C7, C8 e C9 (Fig. 9).
Figura 9: Diversidade estrutural de ácidos siálicos. Fonte Lehmann et al., 2006.
1.2.3) Glicoconjugados sulfatados:
Os glicoconjugados sulfatados são moléculas contendo homopolissacarídeo
ou heteropolissacarídeo sulfatado, ligados covalentemente a lipídeo ou proteína.
Os exemplos mais conhecidos são os PG, já possuem um heteropolissacarídeo
sulfatado, o GAG, ligado a um “core” proteíco.
Os PG formam um grupo heterogêneo de glicoconjugados, amplamente
distribuído nos tecidos animais, desde os filos mais primitivos até os mais recentes
(Nader et al., 1999).
Todos os PG identificados são compostos por GAG, covalentemente ligados
a um “core” protéico (Rodén, 1980). Essas macromoléculas apresentam uma
15
grande diversidade estrutural, que resulta das muitas possibilidades de inserção
da cadeia polissacarídica no “core” protéico, do grande e crescente número de
proteínas passíveis dessa substituição e, finalmente, da própria diversidade
estrutural dos GAG, os quais contribuem para o envolvimento dos PG numa
grande variedade de funções biológicas.
Com exceção do HA, todos os outros GAG são sintetizados como PG. Esse
processo inicia-se no retículo endoplasmático rugoso, com a adição de um resíduo
de Xyl aos aminoácidos serina ou treonina do “core” protéico (Kjellen e Lindahl,
1991 ; Salmivirta et al., 1996). Em seguida, duas unidades de Gal e uma de GlcA
são adicionadas por glicosiltransferases específicas da porção cis e mediana do
complexo de Golgi, formando o tetrassacarídeo de ligação, comum à maioria dos
GAG. No caso do queratam sulfato, a cadeia de GAG pode estar ligada à proteína
através da ligação O ou N-glicosídica da GlcNAc aos resíduos de serina ou
asparagina, respectivamente. O tetrassacarídeo de ligação funciona como uma
sequência iniciadora, fundamental para a polimerização da cadeia de GAG (Figura
10).
Figura 10: Esquema de um proteoglicano. Na esquerda é mostrada a formação do monossacarídeo e na direita formação do tetrassacarídeo de ligação responsável pela ligação da cadeia de glicosaminoglicano. Retirado de do site de Sasisekharan Laboratory.
16
O alongamento da cadeia ocorre através da adição alternada de uma
hexosamina e um açúcar não aminado, a partir de seus respectivos nucleotídeos
difosfatos, em reações em catalizadas por glicosiltransferases específicas da
membrana da porção mediana do complexo de Golgi. Após a polimerização, a
cadeia de GAG é modificada pela ação de epimerases – que alteram a
conformação ao redor do átomo de carbono de algumas unidades de GlcA do HS,
DS e heparina, originando o IdoA. A formação dos GAG se completa pela ação de
sulfotransferases, que adicionam ésteres de sulfato à cadeia glicídica a partir de
fosfoadenosilfosfosulfato. As sulfotransferases estão situadas na porção trans do
Golgi. Quando a estrutura final do PG é obtida, a molécula é, transportada para a
superfície celular (Jackson et al., 1991 ; Almond, 2007 ; Gotting et al., 2007).
A superfamília dos PG contém mais de trinta moléculas descritas, que atuam
como organizadores de tecidos, influenciam o crescimento e a maturação das
células de tecidos especializados, funcionam como filtros biológicos, modulam a
atividade de fatores de crescimento, regulam a fibrilogênese do colágeno e afetam
a invasão e o crescimento das células tumorais. A maioria das funções dos PG
estão relacionadas com a estrutura dos GAG.
Muitas de suas funções permanecem desconhecidas. (Iozzo, 1998). Na
Tabela 2 são citados alguns PG com as suas respectivas localizações, famílias e
funções.
17
Tabela 2: Classificação de alguns proteoglicanos segundo sua localização (KJELLÉN e LINDAHL, 1991).
LOCALIZAÇÃO FAMÍLIA NOME ALGUMAS FUNÇÕES
Extracelulares
Matriz Extracelular
Hialectanos Agrecam Funcionam como pontes entre os componentes da matriz a superfície celular
Versicam Neurocam Brevicam
Ricos em Leucina Decorina
Controle da fibrilogênese do colágeno
Regulação da hematopoiese
Biglicam Fibromodulina Epificam (proteoglicano-Lb) Lumicam
Facultativos Colágeno 2 (Tipo IX)
Integridade estrutural da matriz extracelular
Fosfocam Testicam Apicam
Membrana Basal Membrana Basal Perlecam Bamacam Agrim
Diferenciação celular e morfogênese tecidual
Celulares
Grânulos Citoplasmáticos
Serglicim Serglicim Participam de eventos imunológicos
Facultativo Cromogranina A
Membrana Plasmática
Sindecans Sindecam 1 Reconhecimento de
moléculas extracelulares Regulação da proliferação
celular
Sindecam 2 (Fibroglicam) Sindecam 3 (N-sindecam) Sindecam 4 (Anfiglicam)
Glipicam Glipicam 1 Participam de processos de comunicação de célula
a célula ou com componentes da matiz extracelular
Glipicam 2 (Cerebroglicam) Glipicam 3 (OCI-5) Glipicam 4 (K-glipicam) Glipicam 5
Facultativos Betaglicam
Receptores de superfície celular
Trombomodulina Cadeia Invariante CD44 Receptor de Transferrina Integrina 5 1
18
Embora a cadeia de GAG seja o protagonista da maioria das funções
relacionadas aos PG, existem algumas situações em que o “core” proteíco possui
papel bem definido. O perlecan é um exemplo. È considerado um dos PG mais
complexos devido ao seu peso molecular elevado, ao número de modificações
pós-traducionais que sofre até estar maduro e por possuir 5 domínios bem
definidos (Figura 11).
O domínio II contém 4 repetições da porção ligante do receptor de LDL,
mostrado na Figura 11 como LA, sendo capaz de ligar fisiologicamente a LDL. O
domínio III é homólogo aos subdomínios da laminina-1 e consegue promover
adesão celular mediada por integrina. O domínio IV é o mais longo e apresenta 21
repetições de “Ig-like” humana, que estão associadas com a sua dimerização e
associação intermolecular (Iozzo, 1998).
Figura 11: Representação esquemática da estrutra do proteoglicano de perlecan. Retiado de Iozzo, 1998.
Ainda não foi descrito um homopolisscarídeo sulfato ligado ao um “core”
proteíco. No entanto, veremos nos resultados desta Tese, a primeira descrição
parcial de uma molécula com esta característica.
19
1.2.2.1 - Heteropolissacarídeos sulfatados em ouriços-do-mar:
Os embriões do ouriço-do-mar S. purpuratus sintetizam grandes
quantidades de DS na passagem do estágio de blástula para gástrula. Esse GAG
possui a seguinte unidade repetitiva: [4- -L-IdoA-13- -D-GalNAc-1]n
dissulfatada no C4 e C6 das unidades de galactosamina. O papel deste DS não é
totalmente claro, mas sugere-se sua participação na estabilidade da MEC (Vilela-
Silva et al., 2001). O ouriço-do-mar Clypeaster japonicus também é capaz de
sintetizar DS, mas somente na fase de gástrula (Yamaguchi et al., 1989).
Um novo dissacarídeo foi isolado do EJC de ouriço-do-mar da espécie
Pseudocentrotus depressus. As análises químicas mostram que ele é formado por
um resíduo de Fuc (14) ligado a um NeuGc (Hotta e Kurokawa, 1972).
Outro SGCS, nomeado de flagelasialina, foi obtido do flagelo do ouriço-do-
mar S. purpuratus. Sua massa molecular pode variar de 40 – 80 kDa, contendo 96
aminoácidos, altamente O-glicosilado. Sua estrutura é composta por ligação 2,9
de NeuGc. Esse SGCS é altamente expresso em gônadas masculinas, mas não
foi detectada no ovário. O tratamento dos espermatozóides com um anticorpo anti-
flagelasialina resulta na elevação do Ca++ intracelular e inibição da motilidade
(Miyata et al., 2006).
1.3) Echinodermata:
O filo Echinodermata é constituído por invertebrados marinhos; dentre eles
há cerca de 7.000 espécies distribuídas em seis classes distintas: Crinoidea,
Asteroidea, Ophiuroidea, Echinoidea, Holothuroidea e Concentricycloidea. O nome
do filo é derivado de duas palavras gregas: echinos, que significa espinho, e
derma, que significa pele, e se refere às projeções em forma de espinhos ou
tubérculos, presentes na superfície do corpo desses invertebrados. Trata-se de
um grupo muito antigo, filogeneticamente relacionado ao Chordata (Ettensohn et
al., 2004).
A classe Echinoidea reúne dois tipos bem característicos. Um deles tem
forma hemiesférica globosa, representado pelo ouriço-do-mar ou ouriço regular.
Vivem especialmente sobre fundos consolidados, cavando-o através de um
20
desgaste provocado pelo contínuo movimento rotatório dos espinhos, mas
também podem ocorrer em fundos não consolidados. O outro tipo tem forma
discóide achatada, representada pela bolacha-do-mar ou ouriço irregular, o qual é
típico de fundos não consolidados, existindo, inclusive, algumas espécies que
vivem enterradas na areia. Todos, independentemente da sua forma, podem se
alimentar de algas e/ou gramas marinhas (Klinger e Lawrence, 1985; Ogden et al.,
1973).
Os ouriços-do-mar regulares são dióicos, possuem reprodução sexuada e
fecundação externa. Distribuem-se desde a região entre marés até
aproximadamente 4.800 m de profundidade, com cerca de 950 espécies descritas.
São animais de movimentos livres, apresentam simetria radial e cobertura de
espinhos móveis, algumas vezes longos. As espécies diferenciam-se pela
coloração, forma e tamanho do endoesqueleto calcário e dos espinhos Esses
invertebrados apresentam cinco gônadas e de cada uma delas estende-se um
gonoducto, que conduz os gametas para fora do seu corpo quando expelidos
através do gonoporo. Uma fêmea típica expulsa cerca de três a seis milhões de
óvulos enquanto um macho libera aproximadamente um trilhão de
espermatozóides (Barnes e Ruppert, 1996).
1.3.1) Ouriço-do-mar como modelo de estudo:
Os ouriços-do-mar são um bom modelo para estudos experimentais, já que
são animais pequenos, um único espécime é capaz de liberar grandes
Figura 12: Foto do ouriço-do-mar L. variegatus
21
quantidades de gametas, são de fácil manuseio e captura (Figura 12). São
estudados há algumas décadas por vários grupos em todo mundo (Rothschild,
1949). Sua biologia molecular ainda é pouco explorada embora o genoma da
espécie Strongylocentrotus purpuratus tenha sido totalmente seqüenciado
recentemente (Sea Urchin Genome Sequencing Consortium, 2006).
Esses organismos são os mais utilizados para estudos de embriologia
experimental, porque o desenvolvimento pode ser facilmente acompanhado desde
o ovo até a fase de larva (Horstadius, 1973). É um modelo animal barato, por não
necessitar de biotério. Todavia, se necessário, pode-se usar tanques e aquários.
Também são utilizados em estudos de movimento flagelar (Gibbons, 1996 ; Imai e
Shingyoji, 2003), RA (Darszon et al., 2001 ; Neill e Vacquier, 2004), quimiotaxia
por moléculas liberadas pelo óvulo (Ward et al., 1985 ; Garbers, 1989 ; Kaupp et
al., 2003), e observa-se uma ligação do espermatozóide com o óvulo espécie-
específica (Glabe e Lennarz, 1979 ; Metz et al., 1994 ; Kamei e Glabe, 2003).
Na escala evolutiva é um animal que merece destaque por estar próximo dos
vertebrados (Figura 13), além de apresentar semelhanças morfológicas entre os
gametas masculinos (Figura 14) e femininos (Figura 15). Os eventos que
precedem sua fertilização são semelhantes aos dos mamíferos (Darszon et
al.,1999).
Figura 13: Posição filogenética dos ouriços-do-mar em comparação com outros organismos. Retirado de Special Section Nature, 2006.
22
Figura 14: Esquema evidenciando as semelhanças morfológicas entre o espermatozóide do ouriço-do-mar (esquerda) e camundongo (direita). Retirado de Darszon, 1999.
Também pode-se estabelecer uma similaridade entre o EJC dos ouriços-do-
mar com a zona pelúcida dos óvulos de mamíferos (Mengerink e Vacquier, 2001),
pois ambas as estruturas possuem alta concentração de glicoconjugados
sulfatados, que induzem a RA nos respectivos espermatozóides (Liu et al., 1997).
1.3.2) Processos de ativação do espermatozóide de ouriço-do-mar:
O processo de fertilização de todas as espécies necessita da interação entre
os gametas masculino e feminino completamente maduros e capazes de fertilizar.
A atuação de moléculas no meio extracelular desencadeia mudanças morfológicas
e bioquímicas nos espermatozóides. Os tipos de interações e de moléculas
Figura 15: Esquema evidenciando algumas semelhanças morfológicas entre os gametas femininos de camundongo (esquerda) e ouriço-do-mar (direita). Os números indicam eventos relacionados à fertilização que serão abordados adiante. Retirado do site www.luc.edu/depts/biology/dev/seamouse.htm
23
envolvidas no processo de fertilização são fundamentais para sua espécie-
específidade.
A proposta desse capítulo é descrever brevemente os eventos essenciais
que ocorrem no espermatozóide e garantem o sucesso da fertilização.
1.3.2.1) Ativação da motilidade:
Os espermatozóides dos ouriço-do-mar são imóveis enquanto residem nas
gônadas, mas assim que são ejaculados para a água do mar começam a nadar
vigorosamente devido ao batimento flagelar. Modificações iônicas que ocorrem
somente quando o espermatozóide entra em contato com água do mar são
responsáveis por induzir mudanças fisiológicas requeridas para ativação da sua
motilidade. Dentro da gônada masculina, a alta tensão de CO2 mantém o pH
interno em torno de 7,2 (Jonhson et al., 1983). A ATPase – dineína, que conduz a
motilidade flagelar, é inativa e com pH interno próximo de 7,2, tanto a respiração
quanto a motilidade estão abaixo do pH 7,3 inibidas (Christen et al., 1982 , Lee et
al., 1983). Quando o espermatozóide é ejaculado na água do mar, a tensão de
CO2 diminui, prótons são liberados e o pH interno eleva-se para aproximadamente
7,6. O aumento do pH interno resulta na ativação da ATPase – dineína, iniciando-
se os processos de motilidade e o aumento da concentração interna de ADP. Em
resposta ao aumento da concentração de ADP, ocorre o estimulo da respiração
mitocondrial (Christen et al., 1982). Além disso, a queda da tensão de CO2 e a
ejaculação causam hiperpolarização da membrana plasmática do espermatozóide.
A hiperpolarização provavelmente contribui para o aumento do pH interno e
para a atividade da adenilil ciclase, a qual é ativada por potencial de membrana
(Bookbinder et al., 1990; Beltran et al., 1996). Conseqüentemente, há aumento de
AMPc, que pode ativar proteínas quinases dependente de AMPc. Essas quinases
fosforilam proteínas no axonema flagelar e estimulam a sua motilidade (Garbers,
1989; Morisawa, 1994).
24
1.3.2.2) Quimiotaxia:
Quimiotaxia é definida como movimento celular em resposta a um gradiente
de concentração (Ward e Kopf, 1993). É um mecanismo utilizado para direcionar
diversos tipos celulares, como bactérias, neutrófilos e fungos para um alvo
específico (Devreotes e Zigond, 1988). A quimiotaxia do espermatozóide em
resposta a moléculas quimioatratoras liberadas pelos óvulos, já foi observada em
diversas espécies animais (Eisenbach, 1999).
As moléculas ativadoras do espermatozóide dos ouriços-do-mar (SAP) são
pequenos peptídeos, de 10 a 15 aminoácidos, encontrados no EJC. Esses
peptídeos difundem facilmente na água do mar e conseguem interagir com o
espermatozóide a uma distância do óvulo ainda não conhecida. O SAP causa
ativação celular quando se liga ao espermatozóide, resultando em quimiotaxia de
maneira espécie-específica (Figura 16).
O primeiro SAP purificado e caracterizado foi isolado da espécie
Hemicentrotus pulcherrimus (Suzuki, 1995). Trata-se de um decapeptídeo
(GFDLNGGGVG), denominado inicialmente como speract e atualmente conhecido
como SAP-1. Em concentrações picomolares e com o pH externo de 6,6, o SAP-1
induz o aumento do metabolismo de fosfolipídeos, da respiração e da motilidade
do espermatozóide (Kopf et al., 1979; Garbers e Kopf, 1980; Hansbrough et al.,
1980). Na água do mar, com o pH habitual de 8,0, o SAP-1 induz diversas outras
mudanças no espermatozóide, como o aumento do influxo de Na+ e Ca++, e do
efluxo de K+ e H+ e o aumento na concentração de AMPc e GMPc (Darzon et al.,
1999 e 2001).
25
Existem relatos sobre a capacidade de indução da RA por SAP (Hirohashi e
Vacquier, 2002b). Entretanto, o mesmo grupo de pesquisa já publicou outros
trabalhos afirmando que seu papel restringe-se a potencializar a indução da RA
por outras moléculas (Hirohashi e Vacquier, 2002a).
O receptor para speract foi identificado utilizando marcação com 125I. Sua
massa molecular é de 77 kDa, estimada por SDS-PAGE em condições redutoras
(Dangott e Garbers, 1984).
1.3.2.3) Reação Acrossômica:
A RA em espermatozóides de ouriços-do-mar foi descrita pela primeira vez
no início dos anos 50. Trata-se de um passo crucial na fertilização e ocorre
quando o espermatozóide entra em contato com o EJC (Dan 1952, 1954a, 1967).
Alguns anos depois foram caracterizados os dois principais eventos fisiológicos
que ocorrem durante a RA: a exocitose de vesículas acrossomais e a extensão do
processo acrossomal.
O primeiro desses processos leva à liberação de enzimas hidrolíticas pelas
vesículas acrossomais, que degradam o EJC do ouriço-do-mar. O segundo é a
formação de um feixe contendo filamentos de actina polimerizada. A formação do
processo acrossomal é dependente do pH intracelular. Possui aproximadamente 1
m de comprimento e se forma na cabeça do espermatozóide. O acrossoma é
recoberto pela proteína bindina, que interage com receptores específicos na linha
Figura 16: Esquema evidenciando as primeiras etapas do processo de fertilização de ouriço-do-mar. Quando os espermatozóides são ejaculados na água do mar eles iniciam a motilidade e começam a nadar (1). Pequenos peptídeos da matriz que recobre o óvulo servem como ativadores da motilidade e atratores (2). E quando o espermatozóide se aproxima e entra em contato com o polissacarídeo sulfatado encontrado na matriz é induzida a reação acrossômica (3). Retirado Neill e Vacquier, 2004.
26
vitelínica do óvulo e, dessa forma, leva à fusão das membranas dos gametas
(Figura 17).
O indutor da RA nos ouriços-do-mar é o polissacarídeo sulfatado encontrado
no EJC. O polissacarídeo sulfatado presente no EJC das espécies de ouriços-do-
mar E. lucunter, A. lixula e L. variegatus são indutores espécie-específicos da RA.
A ligação glicosídica do polímero e o padrão de sulfatação dos açúcares são os
requisitos que determinam a espécie-especificidade da RA (Hirohashi et al., 2002,
Vilela-Silva et al. 2002). Incubações dos polissacarídeos sulfatados com os
espermatozóides de cada espécie mostram que a RA é induzida somente pelo
polissacarídeo sulfatado com o espermatozóide da espécie homóloga (Figura 18).
A RA é induzida pelo polissacarídeo puro, sem qualquer associação com
proteínas (Alves et al., 1997).
Em questão de segundos, o polissacarídeo sulfatado induz o influxo de Na+ e
Ca2+, e o efluxo de K+ e H+ (Darszon et al., 1999 e 2001). O movimento desses
íons resulta em mudanças no potencial de membrana do espermatozóide
(Schackmann et al., 1984; Gonzalez-Martinez e Darszon, 1987) e num segundo
aumento de Ca2+ (Guerreiro e Darszon, 1989b).
A ligação do polissacarídeo sulfatado à superfície do espermatozóide
acarreta muitas outras modificações fisiológicas, tais como o aumento substancial
do inositol 1,4,5-trifosfato (Domino e Garbers, 1988), a ativação de adenil ciclase
Figura 17: Esquema evidenciando as etapas da reação acrossômica. Durante a reação acrossômica ocorre no espermatozóide fluxo intenso de íons (3a) que causa a exocitose de vesículas acrossomais (3b) e polimerização de actina, formando o processo acrossomal que liga o espermatozóide à membrana vitelínica do óvulo (3c). Posteriormente, a bindina interage com seu receptor na membrana plasmática do óvulo auxiliando na fusão das duas membranas plasmáticas (3d). N, núcleo; M, mitocôndria. Retirado de Neill e Vacquier, 2004
27
dependete de Ca2+ (Watkins et al., 1978), o conseqüente aumento de AMPc
(Garbers e Kopf, 1980) e o aumento de óxido nítrico (Kuo et al., 2000).
O SGCS, outro componente do EJC de ouriço-do-mar, tem o papel de
potencializar a RA e aumentar o pH interno dos espermatozóides (Hirohashi e
Vacquier, 2002b).
A proteína localizada na membrana plasmática do espermatozóide, que
interage e reconhece o polissacarídeo sulfatado, é conhecida como suREJ. Já
foram descritas mais de dez suREJ em diversos ouriços-do-mar, embora seu
estudo concentre-se na espécie S. purpuratus (Gunaratne et al., 2007). Estudos
cristalográficos mostraram que todas as regiões da suREJ que reconhecem
carboidratos apresentam a mesma conformação (Taylor e Drickamer, 2003).
Surpreendentemente, proteínas homólogas dessa família são encontradas em
mitocôndrias e na face interna da membrana plasmática (Mengerink et al., 2000 ;
Neill et al., 2004 ; Galindo et al., 2004).
O uso de anticorpos monoclonais (Mabs) que reagem com a suREJ da
espécie S. purpuratus permitiu demonstrar que essa glicoproteína está presente
no flagelo e cobrindo a vesícula acrossomal do espermatozóide. Esses Mabs
foram capazes de induzir a RA e competir com o efeito do polissacarídeo sulfatado
(Moy et al., 1996). O gene que codifica a suREJ1 já foi clonado. A região N-
terminal da proteína tem dois domínios de ligação de carboidratos e um domínio
cálcio-dependente, lectina tipo C (Taylor et al., 1990 ; Drickamer e Fadden, 2002).
Após a indução da RA, o próximo passo para a fertilização é a ligação entre
duas proteínas, a bindina e seu receptor específico, localizados no processo
acrossomal e na linha vitelínica do óvulo, respectivamente.
A bindina é uma proteína de 24 kDa isolada pela primeira vez do ouriço-do-
mar S. purpuratus (Vacquier e Moy, 1977; Glabe e Vacquier, 1978; Glabe e
Lennarz, 1979). Partículas isoladas de bindina aglutinam preferencialmente ovos
homólogos de ouriços-do-mar (Glabe e Vacquier, 1977; Glabe e Lennarz, 1979).
Existe uma alta-afinidade (Kd = 10-8M) entre a bindina e os polímeros de FS
encontrados no EJC de ouriço-do-mar, embora esses carboidratos não sejam os
ligantes específicos da proteína (Glabe e Vacquier, 1978; Glabe et al., 1982;
28
Rossignol et al., 1984). Ainda não se conhece a via exata de transdução de sinal
que leva à ativação do óvulo no momento da fertilização. Todavia, o papel central
do cálcio é evidenciado no esquema da Figura 19 (Ohlendieck e Lennarz, 1995 ;
Neill e Vacquier, 2004 ; Hirohashi et al., 2008).
Figura 18: Relação espécie-específica existente na indução da reação acrossômica em ouriços-do-mar de três espécies distintas. Retirado de Vilela-Silva et al., 2008.
Em algumas espécies de ouriços-do-mar, os espermatozóides podem
promover fecundação não específica, quando pré-estimulados com o EJC da
espécie homóloga e, em seguida, colocados em contato com os óvulos da espécie
heteróloga, Essas espécies não diferem na estrutura da bindina e pode ocorrer
fertilização não específica, se a etapa de indução da RA for ultrapassada (Vilela-
Silva et al., 2002). Entretanto, esse evento dificilmente ocorrerá naturalmente.
O esquema da Figura 20 mostra, resumidamente, os dois eventos
hierarquicos que os gametas de ouriço-do-mar devem vencer para que o processo
de fertilização ocorra.
29
Figura 19: Diagrama esquemático do receptor da fucana sulfatada localizada na matriz gelatinosa que recobre o óvulo do ouriço-do-mar eo processo de ativação do óvulo. Retirado de Ohlendieck e Lennarz, 1995.
1.3.2.4) Bloqueio da poliespermia:
Dois mecanismos evoluíram para reduzir a ocorrência de poliespermia. O
primeiro é a ligação do espermatozóide ao óvulo, causando a entrada de íons de
Na+, provocando a despolarização da membrana e, dessa forma, bloqueando de
forma transiente a ligação de um espermatozóide adicional. Esse evento é
conhecido como “bloqueio rápido”. Essa despolarização pode ser bloqueada pela
adição de nicotina (Jaffe, 1980). Além disso, a ligação do espermatozóide ao óvulo
também estimula a liberação de íons Ca++ do retículo endoplasmático, em paralelo
30
com a fusão de umas séries de vesículas exocíticas - os grânulos corticais - com a
membrana plasmática. O conteúdo desses grânulos, inclusive proteases “tripsina-
like”, é liberado consequentemente destroem ou separam os sítios de ligação para
os espermatozóides da membrana vitelínica (Vacquier et al., 1972 e 1973).
No segundo mecanismo para evitar a poliespermia é a formação do envelope
de fertilização, produzindo um bloqueio mais longo da poliespermia, o “bloqueio
lento”. Esse mecanismo decorre da clivagem proteolítica da proteína de
membrana p160 e a ação da água do mar, levando ao destacamento entre a
membrana plasmática e a linha vitelínica. (Haley e Wessel, 2004 a e b).
Figura 20: Representação esquemática dos dois eventos hierarquicos do reconhecimento entre gametas de ouriço-do-mar. Em (A) o reconhecimento baseado nos polissacarídeos sulfatados; a reação acrossômica ocorre assim que receptor específico interage com o polissacarideo sulfatado correto e esta reação expõe a bindina. Em (B) o reconhecimento baseado na bindina; a bindina localizada no processo acrossomal reage e liga-se ao seu receptor específico na linha vitelínica e ocorre a ligação e fusão dos gametas. Retirado de Biermann et al., 2004.
31
2. OBJETIVOS:
Os objetivos dessa Tese envolvem os seguintes aspectos:
1.) Monitorar ao longo do ano a expressão de polissacarídeos sulfatados na
matriz gelatinosa que recobre o óvulo do ouriço-do-mar da espécie L. variegatus.
2.) Demonstrar que a FS encontrada no EJC do ouriço-do-mar L. variegatus
está ligada à proteína, constituindo moléculas semelhantes aos PG de
vertebrados.
3.) Obter dados estruturais do SGCS encontrado no EJC do ouriço-do-mar L.
variegatus.
4.) Determinar a estrutura da FS encontrada no EJC do ouriço-do-mar
Paracentrotus gaimardi.
5.) Isolar e caracterizar parcialmente os proteoheteropolissacarídeos
sulfatados presentes no plasma seminal do ouriço-do-mar da espécie L.
variegatus.
32
3. MATERIAL E MÉTODO:
3.1 Obtenção dos ouriços-do-mar e dos seus gametas:
Os ouriços-do-mar das espécies Lytechinus variegatus e Paracentrotus
gaimardi foram coletados por mergulho em apnéia a 5 metros de profundidade na
enseada da Urca, Rio de Janeiro, (RJ) e Praia de Itaipu, Niterói (RJ),
respectivamente. Os invertebrados foram transportados vivos até o laboratório em
galões com água do mar. A identificação do sexo foi feita a partir da liberação dos
gametas dos indivíduos coletados. Foram injetados 2 mL de KCl 0,5 M na
cavidade intracelômica de cada ouriço-do-mar. As fêmeas e machos foram
identificados, respectivamente, pela coloração alaranjada e esbranquiçada dos
seus gametas.
3.2 Isolamento da matriz que envolve o óvulo do ouriço-do-mar:
Os gametas femininos foram lavados com água do mar artificial sem cálcio,
(NaCl 480 mM, KCl 10 mM, MgCl2 27 mM, MgSO4 29 mM, NaHCO3 2 mM e EDTA
10 mM) em pH 8,0 e à temperatura de 4 C. Modificou-se o pH de 8,0 para 5,0 e
mantendo-se nessa condição por cinco minutos. Logo após, elevou-se o pH
novamente para 8,0. Centrifugou-se o material por 30 min a 10.000 x g à
temperatura de 4 C. O sobrenadante, rico em polissacarídeo sulfatado, foi
dializado contra água destilada, por 24 h, à temperatura de 4 C (SeGall e Lennarz,
1978).
3.3 Obtenção do plasma seminal:
Os gametas masculinos foram centrifugados por 15 minutos a 1000 x g em
temperatura ambiente. O sobrenadante foi recolhido e colocado em sacos de
diálise, com exclusão de 12 kDa, contra água destilada a 4 C durante 48 horas e
liofilizados ou estocados a - 20 C. A diálise é necessária para desalinizar o
material para sua posterior aplicação na coluna de troca-iônica e, além disso, não
é possível fazer a liofilização do material altamente salino. Adaptado de Yamada e
Aketa, 1982.
33
3.4 Solubilização da matriz gelatinosa que recobre o óvulo:
a) Para a preparação da proteofucana sulfatada
O peso seco da matriz gelatinosa que recobre o óvulo foi anotado.
Posteriormente, o material foi rehidratado em diversos tampões, para a escolha do
solvente mais adequado para sua solubilização. Os tampões utilizados foram: 1.)
água do mar artificial, 2.) tampão acetato de sódio 100 mM (pH 5.0), 3.) tampão
HEPES 10 mM (pH 8.0), 4.) tampão HEPES 10 mM (pH 8.0) com EDTA 20 mM,
5.) tampão HEPES 10 mM (pH 8.0) com Uréia 6 M, 6.) tampão HEPES 10 mM (pH
8.0) com NaCl 3 M, 7.) tampão HEPES 10 mM (pH 8.0) com Triton X-100 2%, 8.)
tampão HEPES 10 mM (pH 8.0) com Nonidet P-40 2%, 9.) tampão HEPES 10 mM
(pH 8.0) com guanidina 4 M. Após a mistura do EJC com esses solventes em
concentração final de 1 mg/mL a mistura foi mantida em agitação durante 24 h à
4°C. Em seguida, dializou-se esse material exaustivamente contra água destilada,
seguido de liofilização. O extrato bruto, contendo a proteofucana sulfatada, foi
purificado por cromatografia de troca iônica.
b) Para a obtenção dos polissacarídeos sulfatados (fucana sulfatada e
sialoglicoconjugado sulfatado)
O peso seco da matriz gelatinosa que recobre o óvulo foi anotado após
liofilização. Posteriormente, foi rehidratado em tampão de digestão (0,1 M de
acetato de sódio, 5 mM de cisteína, 5 mM de EDTA, pH 6,0). Após 1 h foi
adicionado papaína, o correspondente a 10% do peso seco, a mistura foi incubada
por 24 h a 60 C. O material insolúvel foi removido por centrifugação e os
polissacarídeos sulfatados, presentes no sobrenadante, foram precipitados com
três volumes de etanol absoluto por 24 h a 4 C, seguido por centrifugação durante
15 min a 2000 x g. O precipitado contendo os polissacarídeos totais, foram
purificados por cromatografia de troca iônica.
34
3.5 Quantificação das amostras:
A solubilização do EJC em diferentes solventes foi avaliada pela
transparência e presença de precipitado nas soluções de 1 mg/mL, após agitação
por 24 h, a 4°C. As amostras também foram monitoradas pela sua propriedade
metacromática, misturando-se 1 mL de uma solução de 1,9-dimetil azul de
metileno, 50 μL da amostra solubilizada e medindo a A525nm (Farnadale et al.,
1986). Proteína foi determinada pelo método de Bradford, utilizando-se 200 μL de
reagente de Bradford concentrado, 800 μL da amostra solubilizada e medindo a
A595nm. As hexoses foram determinadas pela reação de Dubois (Dubois et al.,
1956). O peso seco foi determinado pela pesagem do material liofilizado.
3.6 Purificação dos glicoconjugados sulfatados:
a) para obtenção da proteofucana sulfatada
Para a purificação da proteofucana sulfatada, o EJC solubilizado em tampão
HEPES 10 mM + uréia 6 M foi inicialmente submetido a cromatografia de iônica
DEAE-celulose (Sigma). A coluna foi equilibrada em tampão HEPES 10 mM, Uréia
6 M (pH 8,0) e eluída em concentrações crescentes de sal NaCl 0 4 M na
mesma solução. O fluxo utilizado foi de 60 mL/h e o volume das frações de 1 mL.
A segunda etapa purificativa foi em cromatografia de troca iônica Mono Q
(Pharmacia). A coluna foi equilibrada em TRIS-HCl 20 mM, (pH 8,0) e eluída com
concentrações crescentes de NaCl 0 3 M na mesma solução. O fluxo utilizado
foi de 30 mL/h e o volume das frações de 0,5 mL. A terceira etapa foi uma
cromatografia de filtração em Superose 12, equilibrada e eluída em gradiente
isocrático TRIS-HCl 20 mM contendo NaCl 250 mM (pH 8,0). O fluxo utilizado foi
de 15 mL/h e o volume das frações recolhidas foi de 0,25 mL. Todas as
cromatografias foram acopladas a um sistema de HPLC. As frações foram
monitoradas pela sua metacromasia, absorção a 280 ou 220 nm e condutividade,
quando necessário.
35
b) para obtenção da fucana sulfatada e do sialoglicoconjugado sulfatado
Após o tratamento do EJC com papaína, os polissacarídeos sulfatados foram
purificados em coluna de troca iônica em DEAE-celulose (Sigma) e Mono Q
(Pharmacia), esta acoplada a um sistema de FPLC. Ambas as colunas foram
equilibradas em tampão acetato de sódio 0,1 M, contendo EDTA 10 mM (pH 5,0) e
eluídas em concentrações crescentes de NaCl 0 2M para a resina de DEAE –
celulose e 0 4M para a Mono Q - FPLC. O fluxo utilizado foi de 10 mL/h para a
colunas DEAE – celulose e 30 mL/h para a coluna Mono-Q. As frações foram
monitoradas pela sua propriedade metacromática, utilizando-se 1 mL de uma
solução de 1,9-dimetil azul de metileno e 50 uL de cada fração (Farnadale et al.,
1986) e pelo seu conteúdo de ácido siálico pelo ensaio de Ehrlich (Werner e Odin ,
1952). As frações foram agrupadas, dializadas exaustivamente contra água
destilada e liofilizadas.
3.7 Eletroforese em gel de agarose:
As frações de polissacarídeos sulfatados ou de proteofucana sulfatada foram
analisadas por eletroforese em gel de agarose, como descrito (Dietrich e Dietrich,
1976). O volume ideal a ser utilizado em cada poço do gel de agarose foi estimado
misturando-se volumes crescentes da solução da amostra a 1 mL de DMB até que
a solução adquirisse tom róseo. As amostras foram aplicadas num gel de agarose
0,5 %, preparado em tampão 1,3 diaminopropano acetato 0,05 M (pH 9,0). O gel
foi submetido a 100 V por 1 h. Os polissacarídeos sulfatados no gel foram fixados
por 12 h com Cetavlon 0,1 % em água destilada. Em seguida, o gel foi desidratado
e corado com azul de toluidina 0,1 % e descorado por ácido acético / etanol / água
(0,1 : 5 : 5, v/v).
3.8 Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS em condições
redutoras (SDS-PAGE):
Aproximadamente 15 g da amostra diluída no volume máximo de 15 L,
foram misturadas com 5 L de tampão de amostra desnaturante contendo β-
mercaptoetanol e mantidos a 100 C por 5 min. Após essa etapa, as amostras
36
foram aplicados em gel de poliacrilamida 7,5%, com “stacking” gel de 4,0%. O gel
foi submetido à voltagem de 100 V por 2 h em sistema de eletroforese Mini – gel
da Bio – Rad e corado posteriormente com azul de comassie 0,1% e/ou por azul
de toluidina 0,1%.
3.9 Eletroforese em gel de poliacrilamida em tampão barbital:
Aproximadamente 20 g de polissacarídeos sulfatados, no volume máximo
de 10 L, foram aplicados em gel de poliacrilamida 6%, em tampão barbital sódico
0,02 M (pH 8,6). O gel foi submetido a voltagem de 100 V por 40 min, em sistema
de eletroforese Mini – gel da Bio – Rad. Em seguida, o gel foi corado com azul de
toluidina 0,1% preparado em ácido acético 1%.
3.10 Depolimerização de polissacarídeos sulfatados utilizando enzimas e
ácido nitroso:
As digestões com condroitinases AC e ABC foram realizadas conforme
descrito por Saito et al., 1968. Aproximadamente, 100 μg de polissacarídeos
sulfatados foram incubados com 0,3 unidades de condroitim AC ou ABC liases por
12 horas a 37 °C em 100 μL de tampão 50 mM Tris - HCl (pH 8.0) contendo 5 mM
EDTA e 15 mM acetato de sódio. A enzima condroitim AC liase cliva
especificamente condroitim sulfato enquanto a condroitim ABC liase dermatam
sulfato e condroitim sulfato. A clivagem deaminativa com ácido nitroso em pH 1,5
ocorreu conforme descrito por Shively e Conrad, 1976. Brevemente,
aproximadamente 100 μg de polissacarídeos sulfatados foram incubados com 200
μL de ácido nitroso a temperatura ambiente por 90 minutos. A reação foi
neutralizada adicionando 1,0 M Na2CO3. Este ácido tem a capacidade de clivar
resíduos de glucosamina N-sulfatados e \ ou N-livres.
3.11 Identificação dos açúcares constituintes dos polissacarídeos
sulfatados:
Os polissacarídeos sulfatados foram hidrolisados em ácido trifluoroacético 6,0
M (concentração final) por 6 h a 100 C. Os açúcares liberados foram identificados
37
por cromatografia descendente em papel Whatmann 1 MM. O solvente utilizado foi
ácido isobutírico / hidróxido de amônia 1 N, na proporção (5 : 3, v/v) por 24 h e
reveladas com nitrato de prata. Esse solvente separa hexosaminas (glucosamina
e galactosamina) da galactose e ainda todos os açúcares neutros, exceto
galactose de glucose. O solvente butanol : piridina : água na proporção (3 : 2 : 1,
v/v) por 48 horas foi utilizado para diferenciar glucose de galactose.
3.12 Ressonância Magnética Nuclear:
Os espectros foram obtidos em um espectrômetro Bruker DRX 600 MHz
utilizando uma sonda de tripla ressonância de 5 mm. Utilizou-se de 1,5 a 10 mg de
amostra dissolvidas em 0,5 a 0,7 mL de D2O 99,9%. Os experimentos foram
realizados a 60 C com supressão de HDO por presaturação. Foram realizados
espectros unidimensional (detecção direta de 1H) e bidimensional de HMQC
(“Heteronuclear Multiple Quantum Coherence”) e COSY (“Correlation
Spectroscopy”).
3.13 Hidrólise do sialoglicoconjugado sulfatado:
O sialoglicoconjugado sulfatado purificado de L. variegatus foi hidrolisado sob
condições distintas. Para a obtenção do ácido siálico livre e posterior
caracterização estrutural, o sialoglicoconjugado foi solubilizado em água, e o pH
ajustado para 2,0 com ácido fórmico 1 M. A amostra foi então mantida a 80oC e
fracionada como descrito no item abaixo. Para análises cromatográficas com o
objetivo de detectar os monômeros ou oligômeros de ácido siálico, o
sialoglicoconjugado foi hidrolisado em ácido triofluoroacético 0,1 N a 80°C por 1 h
(obtenção de monômeros) ou em tampão AcNa 50 mM a 80°C, 60°C, 37°C por 2 a
6 h (obtenção de oligômeros). Tanto o ácido siálico livre quanto a sua forma
oligomérica foram analisados por TLC (placas de silica) (Kitazume et al., 1996).
3.14 Análise de ácido siálico e HPTLC:
Depois da incubação em água acidulada com ácido fórmico a 80°C durante 1
h, a suspensão foi resfriada e centrifugada durante 10 min a 900 x g. O
38
sobrenadante foi centrifugado a 50.000 x g por 30 min (4°C). O sobrenadante foi
coletado e liofilizado, e o resíduo seco foi ressuspenso em 1 mL de água e
separado das macromoléculas com o auxílio de Centricon 3 Micropartition
(Amicon). A camada inferior foi passada em 2 mL de coluna catiônica Dowex 50 W
X 8 (100 to 200 mesh, forma protonada). A resina foi lavada com 6 mL de água e
tanto o eluato e quanto a lavagem foram unidos e liofilizados. Finalmente a
amostra foi purificada por cromatografia de gel filtração (BioGel P2) (100 x 0.5 cm,
400 mesh). A eluição foi feita com ácido acético 0.01 M, com fluxo de 1 mL/h.
Frações de 0.4 mL foram coletadas e as que continham ácido siálico foram
identificadas e quantificadas pelo método colorimétrico do ácido tiobarbitúrico
(Warren, 1959). As amostras positivas para o ácido siálico foram analisadas em
HPTLC (placas de silica), através de separação em mistura solvente contendo n-
propanol-1; amônia 1 M; água (6:2:1; v/v/v). As bandas foram visualizadas pela
reação com Resorcinol-HCl. Foram utilizados como padrão Neu5Gc e Neu5Ac, na
concentração de 1 mg/mL (Rodrigues et al., 1997).
3.15 Análise das hexoses em cromatografo a gás acoplado a espectrômetro
de massa:
O sialoglicoconjugado (~ 5 mg) foi hidrolisado com ácido triofluoroacético 6 M
durante 5 h a 100°C, reduzido com borohidreto de sódio e os alditols obtidos foram
acetilados com anidrido acético:piridina (1:1, v/v) (Kircher, 1960). Os alditols
acetatos foram dissolvidos em clorofórmio e analisados em um aparelho de
cromatografia gasosa, acoplado a um espectrômetro de massa. A coluna utilizada
foi a ZB-5ms, com o injetor a 270°C e a interface a 230°C. A temperatura inicial da
corrida foi de 110°C e a final de 250°C, com aumento de 2°C /min (Alves et al.,
1997).
3.16 Espectrometria de massas com ionização por “electrospray” (ESI-MS):
As amostras de ácido siálico e padrões relacionados foram analisados por
ESI-MS usando o equipamento ion trap Finnigan LCQ-Duo (Thermo Electron, San
Jose, CA). As amostras foram introduzidas no espectrômetro de massas sob um
39
fluxo de 5 – 10 uL/min, com o auxílio de uma microbomba infusora (Harvard
Apparatus, Cambridge, MA, USA). As análises ocorreram no modo positivo (ESI+).
A fonte e a voltagem do capilar foram de 4.5 kV and 3 V (ESI+). A temperatura do
capilar foi mantida em 200°C e os espectros foram coletados na faixa de 200 a
1000 m/z. A dissociação induzida pela fonte (SID) foi de 25 V. O experimento de
dissociação por colisão induzida do íon capturado (ESI-MS/MS ou ESI-MSn) foi
feita de 20 – 60 % (1 – 3 eV) e normalizado por colisão de energia relativa. O
espectro foi processado utilizando o programa Xcalibur (Thermo Electron).
3.17 Preparo da amostra para microscopia de luz:
Óvulos frescos foram fixados com uma solução aquosa de formol neutro
tamponado a 10%, por aproximadamente uma semana, e/ou no líquido de Bouin
(Kiernan, 1990). As células foram desidratadas utilizando-se concentrações
crescentes de álcool etílico (álcool 70%, 80%, 90% e 100% - dois banhos de 20
min cada). Após a desidratação foram clarificados em dois banhos sucessivos de
xilol (15 min cada), impregnado em dois banhos de parafina (15 min cada) e,
finalmente, emblocados em parafina.
3.18 Coloração por azul de Alcian:
Os cortes foram desparafinados em três banhos de xilol, hidratados e lavados
em água destilada. Procedeu-se a coloração pelo azul de Alcian (1% de azul de
Alcian solubilizado numa solução aquosa de ácido acético 3%) em pH 2,5, por 30
min e diferenciados em HCl 1N. Posteriormente, os cortes foram contra-corados
pelo nuclear fast red e lavados em água destilada. Os cortes foram desidratados,
clarificados em três banhos de xilol e montados com lamínulas, usando-se entelan
(Entellan® new, Merck). O método identifica de polímeros ácidos carboxilados e
sulfatados, com características de glicosaminoglicanos (Kiernan, 1990).
3.19 Coloração com ácido periódico + reativo de Schiff (PAS)
Os cortes foram desparafinados em três banhos de xilol, hidratados e lavados
em água destilada. A seguir procedeu-se a oxidação com a solução do ácido
40
periódico à 1% por 10 min. Os cortes foram lavados em água destilada, imersos
no reativo de Schiff durante 10 min e lavados em água corrente por 5 min. A
seguir, os cortes foram mergulhados em solução sulfurosa de 2 a 3 min e depois
lavados em água corrente por mais 5 min. Finalmente, os cortes foram
desidratados, clarificados em três banhos de xilol e montados com lamínulas,
usando-se entelan (Entellan® new, Merck). As glicoproteínas neutras contendo
hexoses e/ou ácido siálico são visualizadas em magenta (Kiernan, 1990).
3.20 Coloração para lectinas:
As lectinas biotiniladas (fonte da lectina e especificidade), AAA (Aleuria
aurantia; α-L-fucose), LCA (Lens culinaris; α-mannose) e PNA (Arachis hypogaea;
β-D-galactose) (Burlingame CA, USA). Uma vez desparafinizados e hidratados, os
cortes foram lavados em H2O2 3% por 10 min para bloquear a atividade da
peroxidase endógena e então, lavados em tampão PBS 0.05 M, pH 7.4, e
incubados em solução de lectinas em diluições apropriadas (1:4,000) por 1 h em
temperatura ambiente. Após três lavagens em PBS, os cortes foram incubados em
solução contendo 3,3’-diaminobenzidine (DAB) a 0.05% e H2O2 a 0.005% em PBS
0.05 M (pH 7.4) por 1 min a temperatura ambiente antes da desidratação e
montagem da lâmina. Como controle foi utilizado meio de incubação com o
tampão sem lectina, como controle negativo.
41
Resultados:
1.) Monitorar ao longo do ano a expressão de polissacarídeos sulfatados na matriz
gelatinosa que recobre o óvulo do ouriço-do-mar da espécie L. variegatus
Após a coleta e mudança de pH a que os óvulos do ouriço-do-mar foram
submetidos, pode-se obter a matriz gelatinosa que os recobre. Esta matriz foi
tratada com enzima proteolítica e posteriormente precipitada com etanol. Desta
forma, foram obtidos os polissacarídeos totais desta matriz (Figura 21).
Sobrenadante
EJC
digestão
proteolítica
Papaína
60º C
Polissacarídeos totais
precipitaçãoEtanol P. A.
4º C
Sobrenadante
EJCEJC
digestão
proteolítica
Papaína
60º C
Polissacarídeos totais
precipitaçãoEtanol P. A.
4º C
Ao longo do ano, mês a mês, essas matrizes foram sendo estocadas para
que se acompanhasse a expressão dos polissacarídeos sulfatados.
Com esse objetivo, os polissacarídeos totais obtidos ao longo dos meses
foram submetidos à cromatografia de troca iônica, DEAE – celulose, em tampão
acetato de sódio 100 mM, 5 mM EDTA (pH 6) e eluida em gradiente linear de NaCl
(0 2 M) apresentado nos resultados da Figura 22. As frações obtidas foram
monitoradas quanto a sua propriedade metacromática.
MG
Figura 21: Processo de extração dos polissacarídeos totais a partir da matriz gelatinosa (MG) que recobre o óvulo.
42
0 20 40 60 80 100
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
propriedade metacromática
condutividade
0 20 40 60 80 100
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
AB
S 5
25
nm
[NaC
l] (M)
[NaC
l] (M)
AB
S 5
25
nm
frações
P1
P1
P2
P2
P3
agosto
- maio
junho -
julho
0 20 40 60 80 100
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
0 20 40 60 80 100
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
propriedade metacromática
condutividade
propriedade metacromática
condutividade
0 20 40 60 80 100
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
0 20 40 60 80 100
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
AB
S 5
25
nm
[NaC
l] (M)
[NaC
l] (M)
AB
S 5
25
nm
frações
P1
P1
P2
P2
P3
agosto
- maio
junho -
julho
Pode-se verificar que as amostras obtidas no período entre agosto até maio
do ano seguinte mostraram os perfis de eluição similares, apresentando sempre
dois componentes. A primeira fração, denominada como P1, foi eluida com 0,7 M
A
)
B)
(Verão)
(Inverno)
Figura 22: Purificação dos polissacarídeos sulfatados da matriz gelatinosa que recobre o gel do óvulo do ouriço-do-mar L. variegatus. Os polissacarídeos totais foram aplicados e purificados em DEAE – celulose, como descrito em Material e Método. Os quadrados brancos e a linhas pontilhadas indicam, respectivamente, a propriedade metacromática e o gradiente linear de NaCl. Os meses estão indicados no lado direito de cada gráfico.
43
de NaCl enquanto a segunda fração, denominada como P2, foi removida da
coluna com 1,3 M (Figura 22A).
Ainda observamos que a primeira fração reagiu positivamente na reação de
Ehrlich, o que evidência a presença de ácido siálico (dado não mostrado). A
segunda fração, foi positiva na reação de Dubois, evidenciando a presença de
hexoses como constituinte do polímero (dado não mostrado). Estes resultados
corroboram com aqueles obtidos em 1997 por Alves et al., mostrando a presença
de sialoglicoconjugado e fucana sulfatada no gel do óvulo do ouriço-do-mar L.
variegatus.
Entretanto, nos meses de junho e julho (correspondente ao inverno),
verificamos a presença de três frações (Figura 22B). As duas primeiras eluiram da
coluna com as mesmas molaridades de NaCl usadas para remover P1 e P2 no
experimento anterior. A terceira fração eluiu em concentração mais elevada de
NaCl, aproximadamente 1,8 M, mostrou-se negativa para a dosagem de ácido
siálico e positivo para reação de Dubois.
A cromatografia da Figura 22A é representativa do que foi obtido em todos os
meses de agosto a maio, já que para cada mês foi feita uma cromatografia
obedecendo todos os parâmetros descritos em metodologia de pesquisa.
Não se deve fazer especulação sobre a quantidade desses polissacarídeos
na matriz que recobre o óvulo ao longo do ano, pois a massa de polissacarídeos
total aplicada em cada cromatografia variou. Por isso, a única conclusão que se
pode obter é quanto ao aparecimento de um componente adicional nos meses de
junho e julho e o fato de que P2 e P3 estão em concentrações proporcionais
nestes meses, já que as áreas dos dois picos cromatográficas são semelhantes.
Além disso, a área de P3 maior do que P2 da Figura 22B não reflete seu
rendimento quando é liofilizado. A massa obtida do P3 é bem inferior a de P2.
Obviamente, não podemos excluir a possibilidade da fração P3 estar
presente nos meses de verão, mas em quantidades não detectáveis pela
metodologia utilizada, obscurecidas por concentrações muito elevadas de P1 e
P2.
44
As frações obtidas nas cromatografias de troca iônica foram agrupadas,
dializadas contra água destilada, liofilizadas e submetidas à eletroforese em gel de
agarose em tampão propilenodiamino conforme mostrado na Figura 23. P1 e P2
obtidas no período do verão co-migram com as mesmas frações coletadas do
ouriço-do-mar durante o inverno, indicando que correspondem ao
sialoglicoconjugado e a fucana sulfatada (Figura 23).
Estes resultados indicam fortemente que as frações obtidas são
polissacarídeos puros, que devem se diferenciar nas suas densidades de carga.
Na eletroforese em gel de agarose a migração dos polissacarídeos sulfatados
depende da sua interação com o tampão propilenodiamino (Dietrich e Dietrich,
1976). Porém a eluição destes compostos da coluna de troca iônica é dependente
da sua densidade de carga.
Figura 23: Eletroforese em gel de agarose dos polissacarídeos sulfatados de L.
variegatus purificados em DEAE - celulose. As frações (~ 10 g de cada) foram aplicadas em gel de agarose 0,5%, submetidas a eletroforese como descrito em Material e Método e coradas com azul de toluidina.
Origem
+
P2 P3 P1 P2 P1
Origem
+ +
P2 P3 P1 P2 P1
junho / julho junho / julho junho / julho ago / maio ago / maio ago / maio
45
Todavia, a fração P3, obtida no período do inverno poderia ser um artefato
resultante de uma remoção parcial das cadeias polipeptídicas ligadas ao
polissacarídeo ou mesmo um artefato na coluna de DEAE - celulose. Com o
objetivo de esclarecer esta questão, a fração P3 foi tratada exaustivamente com
enzima proteolítica e recromatografado utilizando uma metodologia mais refinada
para sua análise.
0 20 40 60 80
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0
1
2
3
4
propriedade metacromática
condutividade
0 20 40 60 80
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0
1
2
3
4
AB
S 5
25 n
m
[NaC
l] (M)
[NaC
l] (M)
AB
S 5
25 n
m
frações
P2
P3
0 20 40 60 80
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0
1
2
3
4
0 20 40 60 80
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0
1
2
3
4
propriedade metacromática
condutividade
propriedade metacromática
condutividade
0 20 40 60 80
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0
1
2
3
4
0 20 40 60 80
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0
1
2
3
4
AB
S 5
25 n
m
[NaC
l] (M)
[NaC
l] (M)
AB
S 5
25 n
m
frações
P2
P3
Com este propósito, utilizamos uma troca – iônica forte, a Mono-Q, acoplada
a um sistema de FPLC. O tampão e o monitoramento foram os mesmos utilizados
da cromatografia em DEAE - celulose, com diferença apenas na progressão do
Figura 24: Purificação dos polissacarídeos sulfatados da matriz gelatinosa que recobre o gel do óvulo do ouriço-do-mar L. variegatus. P2 obtido de diferentes meses e P3 obtido de junho – julho foram aplicadas em cromatografia Mono Q – FPLC como descrito em material e método. Os quadrados brancos e a linhas pontilhadas indicam respectivamente a propriedade metacromática e o gradiente linear de NaCl.
Jan - dez
Jun - jul
46
gradiente utilizado, que foi de 0 4 M de NaCl. Nestas novas condições de
cromatografia os dois polissacarídeos sulfatados continuaram a mostrar uma
eluição muito distinta, com diferenças muito significativas na concentração de
NaCl necessária para remoção dos dois polissacarídeos sulfatados da coluna
(Figura 24).
Estes resultados confirmam que P2 e P3 são polissacarídeos distintos.
Provavelmente o P3 apresenta densidade de carga negativa mais elevada do que
P2, já que eluiu em concentração de NaCl mais elevada. As frações P2 e P3 não
apresentam diferenças significativas de peso molecular quando analizadas por
eletroforese em gel de poliacrilamida (Figura 25). Os dois polissacarídeos
apresentam um peso molecular de aproximadamente 290 kDa.
Origem
+
padrões Ago/maio Jun/jul
C 6-SDex-S 500 KD
a
C 4-S
Dex-S 8 KDa
Fuc-S L. v
P2P2
P3
Origem
+
Origem
+
padrões Ago/maio Jun/jul
C 6-SDex-S 500 KD
a
C 4-S
Dex-S 8 KDa
Fuc-S L. v
P2P2
P3C 6-S
Dex-S 500 KDa
C 4-S
Dex-S 8 KDa
Fuc-S L. v
C 6-SDex-S 500 KD
a
C 4-S
Dex-S 8 KDa
Fuc-S L. v
P2P2
P3P2P2
P3
Figura 25: PAGE das -L-fucanas sulfatadas de L. variegatus: Frações purificadas de -L-fucanas sulfatadas foram aplicadas em gel de poliacrilamida 6% em tampão barbital sódico 0,02 M (pH 8,6) e coradas com azul de toluidina. Os marcadores de peso molecular foram dextran sulfato de 500 kDa e 8 kDa, fucana sulfatada de L. variegatus (290 kDa), condrotim 6 sulfato (60 kDa) e condroitim sulfato 4 (40 kDa).
47
Embora as frações P2 e P3 tivessem mostrado reatividade positiva quando
analisadas pelo método de Dubois, ainda não conhecíamos a composição de
monossacarídeos destes polímeros. Com a finalidade de determinar quais as
unidades sacarídicas que compõem as frações P2 e P3, estas amostras foram
submetidas à hidrólise ácida e os açúcares liberados foram identificados por
cromatografia em papel, com posterior coloração por prata, conforme descrito em
Material e Método. Este experimento revelou que o único açúcar componente das
frações P2 e P3 é fucose.
A estrutura química da fucana sulfatada (fração P3) foi determinada por
espectrometria de ressonância magnética nuclear. Nestes experimentos
analizamos, em paralelo a fração P2, embora a estrutura deste polissacarídeo já
seja conhecida (Alves et al., 1997). A fração P2 apresentou quatro sinais de próton
anomérico em proporções aproximadamente equivalentes (Figura 26A), como
esperado. Este polissacarídeo é constituído por uma unidade tetrassacarídica
repetitiva (ver Figura 5). Surpreendentemente, a fração P3 mostrou um espectro
de RMN muito simples, com um único sinal de próton anomérico (Figura 26B).
A fração P3 foi analisada através de espectros bidimensionais como 1H / 1H
COSY (Figura 27) e 13C / 1H HMQC (Figura 28). A análise destes espectros nos
permitiu determinar o valor de deslocamento químico de 13C e 1H das unidades de
fucose encontradas na fração P3, como relatadas nas tabelas 3 e 4.
Os resultados da Tabela 3 indicam claramente um deslocamento do sinal de
H4 da fração P3 de ~0,7 ppm para campo baixo quando comparado com sinal de
H4 de resíduos não sulfatados. Em contraste, todos os deslocamentos químicos
dos outros prótons apresentam valores compatíveis com resíduos não sulfatados.
Estes dados indicam claramente que a fucana sulfatada P3 é constituída por um
único tipo de unidade, com sulfato na posição O-4. A posição de ligação
glicosídica foi esclarecida pela analise do deslocamento químico de 13C.
Claramente, o C3 apresentou um deslocamento químico (76,6 ppm) compatível
com a ligação glicosídica 13. Isto é evidenciado por comparação com os valores
obtidos por fucanas sulfatadas unidas por ligação glicosídica 14 (~71 ppm) e
13 (76 – 79 ppm) ver Tabela 4.
48
Em síntese, nossos resultados indicam que durante o período do inverno os
ouriços-do-mar L. variegatus apresentam no gel que recobre o óvulo um outro tipo
de fucana sulfatada, constituída por unidades unidas por ligação 13 e sulfatadas
na posição 4 (Figura 29A). Esta fucana co-existe com aquela constituída por
unidades tetrassacarídicas repetitivas, conforme descrita em nosso laboratório
(Figura 29B).
49
Fuc-CH3
H1 H4
Fuc-CH3
H1 H4
Figura 26: Expansão dos espectros de uma dimensão (
1H) das fucanas
sulfatadas de L. variegatus. Em (A) a fucana sulfatada nomeada de P2, em (B) a fucana sulfatada nomeada de P3 e em (C) todo espectro de P3. H1 e H4 indicam respectivamente os deslocamentos químicos de prótons ligados ao carbono 1 e carbono 4. E Fuc-CH3 é assinalado para confirmar a presença de fucose no carboidrato.
A)
C)
B)
H1
H4
H1
H4
50
Tabela 3: Deslocamento químico de prótons para resíduos de -L-fucose da -L-fucana sulfatada de L. variegatus e compostos padrões.
Espécie de
ouriço-do-mar Tipo de resíduo Polissacarídeo Deslocamento químico (ppm)
a
H1 H2 H3 H4 H5 H6
L. variegatus Trabalho atual P3 5,10 3,86 4,02 4,72 4,45 1,25
L. variegatus -3- -L-Fucp-(2SO3-)-1-b P2 5,40 4,51 4,25 4,05 4,31 1,23
L. variegatus -3- -L-Fucp-(2,4SO3-)-1-b P2 5,38 4,54 4,22 4,77 4,51 1,25
L. variegatus -3- -L-Fucp-(2SO3-)-1-b P2 5,31 4,54 4,12 4,06 4,44 1,24
L. variegatus -3- -L-Fucp-(4SO3-)-1-b P2 5,08 3,87 3,98 4,78 4,45 1,27
A. lixula -4- -L-Fucp-(2SO3-)-1-c 5,31 4,56 4,23 4,01 4,52 1,35
A. lixula -4- -L-Fucp-(2SO3-)-1-c 5,25 4,51 4,16 4,01 4,56 1,38
S. purpuratus -3- -L-Fucp-(4SO3-)-1-d 5,14 3,90 4,07 4,76 4,55 1,32
a
Os espectros unidimensionais foram feitos a 500 MHz, 60 C em 99,8% de D2O. Os deslocamentos químicos têm como referência o ácido trimetilsilpropiônico. Valores em negrito indicam a posição de ligação do sulfato. b Alves et al., 1997
c Mulloy et al., 1994
d Alves et al., 1998
Figura 27: Expansão do espectro de COSY da fucana sulfatada P3 de L. variegatus. Os valores de deslocamento químico de prótons estão reportados na Tabela 3.
1H deslocamento químico
1H
de
slo
ca
men
to q
uím
ico
H
1
H2 H1
H3 H4
H5
H6
51
H1
H2
H3
H4
H5
H1
H2
H3
H4
H5
Tabela 4: Deslocamento químico de carbono dos resíduos de -L-fucose da -L-fucana sulfatada de L.variegatus e compostos padrões:
Espécie de
ouriço-do-mar Tipo de resíduo Deslocamento químico (ppm)
a
C1 C2 C3 C4 C5 C6
L. variegatus Trabalho atual (P3) 98,5 68,8 76,6 79,9 67,0 15,8
S. franciscanus -3- -L-Fucp-(2SO3-)-1-b 96,77 75,52 75,94 74,16 69,00 18,00
S pallidus -3- -L-Fucp-(4SO3-)-1-c 97,20 70,05 78,55 81,80 69,13 15,00
S pallidus -3- -L-Fucp-(4SO3-)-1- c 95,70 70,05 78,55 81,80 69,13 15,00
S.droebachiensis -4- -L-Fucp-(2SO3-)-1- c 101,97 77,90 70,97 83,40 69,96 13,00
S.droebachiensis -4- -L-Fucp-(2SO3-)-1- c 101,60 77,90 71,40 83,40 69,96 13,00
a
Os valores de deslocamento químico de 13
C foram obtidos por espectros bidimensionais tendo como referencia o ácido trimetilsilpropiônico. Valores em negrito indicam a posição envolvida na ligação glicosídica. b Vilela-Silva et al., 1999
c Vilela-Silva et al., 2002
1H deslocamento químico
Figura 28: Espectro 1H /
13C HMQC da fucana sulfatada P3 de L. variegatus. O assinalamento
foi baseado no COSY. Os valores de deslocamento químico de carbono estão reportados na Tabela 4.
13C
de
slo
ca
men
to q
uím
ico
52
O
-O3SO
-O3SO
O-O
3SO
CH3
HO
O -O3SO
HO
CH3
OO
CH3
O
-O3SO
O
HO
CH3 O
-O3SO
HO
CH3O
O
-O3SO
HO
CH3O
O
-O3SO
HO
CH3O
O Fucana do trabalho presente
Fucana descrita por Alves et al., 1997
O
-O3SO
-O3SO
O-O
3SO
CH3
HO
O -O3SO
HO
CH3
OO
CH3
O
-O3SO
O
HO
CH3 O
O
-O3SO
-O3SO
O-O
3SO
CH3
HO
O -O3SO
HO
CH3
OO
CH3
O
-O3SO
O
HO
CH3 O
-O3SO
HO
CH3O
O
-O3SO
HO
CH3O
O
-O3SO
HO
CH3O
O Fucana do trabalho presente
Fucana descrita por Alves et al., 1997
Figura 29: Comparação entre as duas fucanas sulfatadas obtidas da matriz gelatinosa que recobre o óvulo de L.variegatus.
A)
B)
53
2.) purificação e caracterização parcial da proteofucana sulfatada pesente na matriz gelatinosa que recobre o óvulo do ouriço-do-mar L. variegatus.
A injeção de uma solução de KCl 0,5 M na cavidade intracelômica dos
ouriços-do-mar da espécie L. variegatus leva à liberação dos seus gametas. Os
gametas femininos são identificados pela coloração amarelada, e foram usados
para a preparação do EJC. O processo consiste inicialmente na mistura dos
óvulos em uma solução de água do mar artificial, sem cálcio e contendo 10 mM de
EDTA (pH 8,0). Posteriormente, o pH da solução é diminuído para 5, durante 5
minutos e, em seguida, elevado novamente para 8 (conforme descrito em Material
e Método).
O EJC não se solubiliza facilmente em água do mar. Portanto, o primeiro
desafio para purificarmos moléculas encontradas nessa preparação é procurar
métodos adequados para a sua solubilização. Foram testados nove soluções
distintas, sempre utilizando 1 mg de EJC por mL: 1) água do mar artificial, 2)
acetato de sódio 100 mM (pH 5.0), 3) HEPES 10 mM (pH 8.0), 4) HEPES 10 mM
(pH 8.0) + 20 mM de EDTA, 5) HEPES 10 mM (pH 8.0) + 6 M de uréia, 6) HEPES
10 mM (pH 8.0) + 3 M de NaCl, 7) HEPES 10 mM (pH 8.0) + 2% de TX-100, 8)
HEPES 10 mM (pH 8.0) + 2% de NP-40 e 9) HEPES 10 mM (pH 8.0) + 4M de
guanidina. Essas soluções foram avaliadas considerando a presença de
precipitado e sua transparência. Também foram avaliados pela recuperação do
material solubilizado em peso seco e pelas dosagens de proteína pelo método de
Bradford e de polissacarídeo sulfatado pelo método de Farndale.
54
Tabela 5: características da solubilização da matriz gelatinosa em diversos tampões. A amostra foi solubilizada nos tampões descritos acima com concentração final de 1 mg/mL com posterior avaliação dos parâmetros citados na tabela. Legenda: (*) Interferência do detergente na leitura ; A, ausente ; P, presente ; 0, ausência ; +, valor subjetivo e crescente da presença de precipitado ; ASW, água do mar artificial ; Ac Na, acetato de sódio.
Tampões Transparência
da solução
Presença de precipitado
Peso seco (recuperação %)
Dosagem de metacromasia
(mg/mL)
Dosagem de proteína (mg/ml)
ASW (pH 8.0) A ++ 39 0,0042 0,1876
Ac Na 100 mM (pH 5.0) A +++ 10 0,0005 0,0292
HEPES 10 mM (pH 8.0) A ++ 30 0,0408 0,2668
HEPES 10 mM (pH 8.0) + EDTA 20 mM A ++ 42 0,0810 0,1942
HEPES 10 mM (pH 8.0) + Uréia 6 M P 0 59 0,1067 0,4384
HEPES 10 mM (pH 8.0) + NaCl 3 M A ++ 42 0,0701 0,2272
HEPES 10 mM (pH 8.0) + TX-100 2% A +++ ND * 0,0591 * 1,6134 *
HEPES 10 mM (pH 8.0) + NP-40 2% A ++ ND * 0,2165 * 6,7355 *
HEPES 10 mM (pH 8.0) + Guanidina 4 M A ++ 35 0,0920 0,4451
55
Os resultados obtidos indicam que a solução HEPES 10 mM (pH 8.0),
contendo 6 M de uréia, é a mais apropriada para a solubilização do EJC, em
quatro dos cinco parâmetros testados (Tabela 5). Curiosamente, quando
dobramos a concentração de EJC no tampão escolhido, esse resultado não se
mantém (dado não mostrado).
Em seguida, uma solução de EJC do ouriço-do-mar, na concentração de 1
mg/mL em HEPES 10 mM (pH 8.0), contendo 6 M de uréia, foi aplicada em uma
coluna de troca iônica (DEAE – celulose), acoplada a um sistema de HPLC. As
frações obtidas foram monitoradas pela sua metacromasia, A280nm e
condutividade, conforme mostrado na Figura 30. Observamos a presença de
quatro frações. A primeira, denominada como P1, foi eluida com 0,4 M de NaCl,
apresentou A280nm mas sem metacromasia. Outras frações, denominadas como P2
e P3, apresentaram metacromasia e A280nm intensas e foram eluidas com 0,8 e 1
M de NaCl, respectivamente. Por fim, a fração P4, eluida com 1,3 M de NaCl
mostrou, metacromasia e ausência de A280nm.
As quatro frações foram dializadas exaustivamente contra água destilada e
posteriormente liofilizadas. Após esse processo, foram submetidas à eletroforese
em gel de agarose (Figura 31) e SDS-PAGE em condições desnaturantes (Figura
32).
A eletroforese em gel de agarose foi corada com azul de toluidina, para
visualizar os polissacarídeos sulfatados (Figura 31). A fração P1 não mostrou
nenhuma banda metacromática, ao passo que as demais frações mostraram a
presença de polissacarídeos sulfatados metacromáticos. A fração P2 apresentou
mobilidade eletroforética semelhante ao SGCS. As frações P3 e P4 apresentaram
migração similar à FS. Esse dado sugere que, mesmo quando esses
polissacarídeos sulfatados estão ligados a uma cadeia protéica, suas mobilidades
eletroforéticas não se alteram.
56
Figura 30: Purificação da proteofucana sulfatada da matriz gelatinosa que recobre o óvulo do ouriço-do-mar L. variegatus. O extrato bruto foi aplicado em cromatografia DEAE – HPLC como descrito em Material e Método. Os quadrados brancos, a linha continua e linha pontilhada indicam respectivamente a propriedade metacromática, a absorção a 280 nm e o gradiente linear de NaCl. As posições em que o sialoglicoconjugado e fucana sulfatada eluem estão indicadas por setas no topo do cromatograma.
Figura 31: Eletroforese em gel de agarose do extrato bruto matriz gelatinosa que recobre o óvulo do ouriço-do-mar L. variegatus. e das frações obtidas na DEAE- HPLC: As frações obtidas foram aplicadas em gel de agarose 0.5% e coradas com azul de toluidina, assim como descrito em material e métodos. Legenda EB; extrato bruto.
A 280 nm
SGCS
FS
57
No SDS-PAGE, corado com azul de toluidina, não foi visualizada nenhuma
banda relativa à fração P1. Por outro lado, as demais frações, P2 – P4
apresentaram uma única banda de alto peso molecular (Figura 32A), coerente
com dados prévios que mostram o alto peso molecular da FS, aproximadamente
290 kDa (Alves et al., 1997). Adicionalmente, coramos a mesma eletroforese com
azul de Comassie, para a visualização de proteínas. Com a utilização desse
corante, conseguimos visualizar uma série de bandas de baixo peso molecular
presente na fração P1, mas, curiosamente, as frações P2 – P4 não apresentaram
nenhuma coloração (Figura 32B).
Os dados obtidos para as frações P1 e P4 são coerentes. Na cromatografia
de troca-iônica, P1 não mostrou metacromasia, mas A280nm. O inverso foi
observado para P4, alta metacromasia e ausência de A280nm. As frações P2 e P3
foram positivas para as duas dosagens e também não foram coradas com azul de
Comassie nas eletroforeses.
Nossa interpretação é de que a presença de grande quantidade de cadeias
de polissacarídeos sulfatados nas frações P2 e P3 impedem o acesso do corante
azul de Comassie à cadeia peptídica, não permitindo sua visualização no SDS-
PAGE.
Com o intuito de obter a pFS purificada, submetemos a fração P3 a outra
cromatografia de troca-iônica, mas utilizando uma coluna de Mono Q, acoplada a
um sistema de HPLC. Novamente, monitoramos as frações obtidas pela
metacromasia, A220nm e condutividade. O resultado obtido mostra uma fração
eluida com ~ 1,5 M de NaCl, apresentando metacromasia e A220nm (Figura 33).
Finalmente, essa fração foi cromatografada por exclusão (Superose 12),
acoplada a um sistema de HPLC. Novamente, as frações foram monitoradas pela
metacromasia e A220nm. Observamos a presença de quatro frações, mas apenas
aquela eluida no volume de exclusão, continha metacromasia e A220nm, como o
esperado para a pFS, Figura 34.
58
Figura 32: Eletroforeses em gel de poliacrilamida (7.5%) em condição redutora. A lavagem, a fração de 11 – 25 e os picos P1, P2, P3 e P4 foram analisadas. Em (A) o gel foi corado com azul de Comassie e em (B) com azul de toluidina, como descrito em Material e Método.
L AV
F 11 - 25
P1 P2 P3 P4L AV
F 11 - 25
P1 P2 P3 P4P4L A
VP1 P2 P3
F 11 - 25
A) B)
59
Figura 33: Purificação da proteofucana sulfatada da matriz gelatinosa que recobre o óvulo do ouriço-do-mar L. variegatus. O pico P3 obtido na cromatografia de DEAE-HPLC foi aplicado na Mono Q-HPLC como descrito em Material e Método. Os quadrados brancos, a linha continua e linha pontilhada indicam respectivamente a propriedade metacromática, a absorção a 280 nm e o gradiente linear de NaCl. A posição em que a fucana sulfatada elui é mostrada com uma seta no topo do croromatograma.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
F R AÇ ÃO
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
AB
S 5
25
nm
P rop. metacromática
0
100
200
300
400
500
600
AB
S 2
20
nm
P roteína
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
F R AÇ ÃO
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
AB
S 5
25
nm
P rop. metacromáticaP rop. metacromática
0
100
200
300
400
500
600
AB
S 2
20
nm
0
100
200
300
400
500
600
AB
S 2
20
nm
P roteínaP roteína
Figura 34: Purificação da proteofucana sulfatada da matriz gelatinosa que recobre o óvulo do ouriço-do-mar L. variegatus. O pico obtido na cromatografia de Mono Q-HPLC foi aplicado em Superose 12-HPLC como descrito em Material e Método. Os quadrados brancos, a linha continua e linha pontilhada indicam respectivamente a propriedade metacromática, a absorção a 280 nm e o gradiente linear de NaCl. A posição em que a fucana sulfatada elui é mostrada com uma seta no topo do cromatograma.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
NaC
l (M)
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
AB
S(5
25n
m)
0
1000
2000
3000
4000
AB
S(2
20n
m).
10
3
Prop. metacromática
Proteína
Fração
0 10 40 60 8020 30 50 70 90
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
NaC
l (M)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
NaC
l (M)
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
AB
S(5
25n
m)
0
1000
2000
3000
4000
AB
S(2
20n
m).
10
3
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
AB
S(5
25n
m)
0
1000
2000
3000
4000
AB
S(2
20n
m).
10
3
0
1000
2000
3000
4000
0
1000
2000
3000
4000
AB
S(2
20n
m).
10
3
Prop. metacromática
Proteína
Prop. metacromática
Proteína
Fração
0 10 40 60 8020 30 50 70 90
Fração
0 10 40 60 8020 30 50 70 900 10 40 60 8020 30 50 70 90
60
Tabela 6: Quantificação de proteínas, polissacarídeos sulfatados e hexoses em 1mg/ml presentes após cada etapa purificativa. Dosagem de proteína, polissacarídeos sulfatados e hexose realizadas pelos Bradford, Farnadale e Dubois respectivamente. ND – Não detectado.
Etapa
Característica
Proteína Polissacarídeos
sulfatados
Hexose
Extrato bruto 15,1 26,1 113,9
DEAE-celulose 12,6 13,9 14,3
MONO-Q 0,5 3,5 2,4
Superose-12 ND 0,2 0,1
Os valores de proteína, polissacarídeos sulfatados e hexose, obtidos ao
longo dos passos de purificação podem ser visualizados na Tabela 6.
A FS extraída do EJC, com o tratamento proteolítico é eluida nas colunas de
troca-iônica e gel filtração próximo à pFS. Essa coincidência indica que o “core”
protéico não altera drasticamente o tempo de retenção nestes dois tipos de
cromatografia, nem o caráter aniônico da molécula, como o observado para PG de
vertebrados.
O desafio atual no estudo dessa molécula é identificar o tipo de ligação
carboidratos-aminoácido e descobrir métodos adequados para o rompimento
dessas ligações, mantendo intacta a cadeia polipeptídica. Outro desafio é obter
métodos cromatográficos que permitam distinguir a FS da pFS, ou seja, separar o
polissacarídeo livre do ligado à proteína.
61
3.) Localização e elucidação da composição de açúcares do sialoglicoconjugado sulfatado presente na matriz gelatinosa que recobre o óvulo do ouriço-do-mar L. variegatus
O EJC, do ouriço-do-mar da espécie L. variegatus, foi submetido à digestão
proteolítica e os polissacarídeos totais obtidos foram separados numa
cromatografia de troca iônica (DEAE – celulose). As frações obtidas por
monitoradas por metacromasia, conteúdo de Sia e condutividade (Figura 35).
Observamos a presença de duas frações. A fração denominada como P1 eluiu
com ~0,6 M de NaCl e apresenta metacromasia e Sia. A fração P2 eluiu com
maior concentração de NaCl (1,4 M), apresenta metacromasia, mas sem Sia
(Figura 35). As duas frações foram dializadas exaustivamente contra água
destilada e posteriormente liofilizadas. Após esse processo as frações foram
submetidas à eletroforese em gel de agarose e PAGE, ambas coradas com azul
de toluidina.
Na eletroforese em gel de agarose foram visualizadas bandas
metacromáticas, referente a cada uma das frações obtidas na cromatografia em
DEAE-celulose. As frações P1 e P2 apresentaram mobilidades eletroforéticas
similares aos padrões de SGCS e FS, respectivamente (Figura 36A). Na PAGE,
utilizada para estimar o peso molecular da macromolécula, surpreendentemente, o
SGCS mostrou peso molecular baixo, aproximadamente 8 kDa, em contraste com
a FS desta espécie, que possui aproximadamente 290 kDa (Alves et al., 1997)
(Figura 36B).
O SGCS foi submetido à hidrólise ácida com ácido triofluoroacético 0,1 N, à
80°C, durante 1 h. O produto obtido foi submetido a cromatografia de exclusão em
Bio Gel P2 e, posteriormente, em uma cromatografia de troca-iônica em Dowex
(50 W X 8). Esse procedimento permitiu a purificação do Sia liberado pela hidrólise
ácida.
62
Figura 35: Purificação dos polissacarídeos sulfatados da matriz gelatinosa que recobre o gel do óvulo do ouriço-do-mar L. variegatus. Os polissacarídeos totais foram aplicados e purificados em DEAE – celulose, como descrito em Material e Método. A linha azul, amarela e preta, respectivamente, a propriedade metacromática e o ensaio de Erlich e o gradiente linear de NaCl.
63
Dex-S 500 KDa
C 6-SC 4-S
Heparina
Dex-S 8 KDa
A. lixula
E . lucunter
L . variegatus
P . depressus
P adrões Amostras
Dex-S 500 KDa
C 6-SC 4-S
Heparina
Dex-S 8 KDa
A. lixula
E . lucunter
L . variegatus
P . depressus
P adrões Amostras
Dex-S 500 KDa
C 6-SC 4-S
Heparina
Dex-S 8 KDa
A. lixula
E . lucunter
L . variegatus
P . depressus
P adrões Amostras
Figura 36: Eletroforeses do sialoglicoconjugado sulfatado purificado a partir de matriz gelatinosa que recobre o óvulo de ouriço-do-mar L. variegatus: Em (A) os picos obtidos da DEAE-celulose foram aplicados em eletroforese em gel de agarose, enquanto em (B) a fração rica em sialoglicoconjugado sulfatado foi aplicadas em gel de poliacrilamida 6% em tampão barbital sódico 0,02 M (pH 8,6. Os marcadores de peso molecular foram dextran sulfato de 500 kDa e 8 kDa, condrotim 6 sulfato (60 kDa) e condroitim sulfato 4 (40 kDa) e heparina (35 kDa). Ambas as eletroforese foram coradas com com azul de toluidina. Em (B) foram submetidos outros sialoglicoconjugados obtidos de outras espécies de ouriços-do-mar.
A) B)
64
Os Sia purificados a partir do SGCS do ouriço-do-mar foi identificado através
de HPTLC As bandas visualizadas através do corante Resorcinol-HCl revelaram a
presença de NeuGc. Além disso, outra evidência da presença desse Sia foi o tom
mais arroxeado que esta banda apresentou, como o padrão (Figura 37).Esse
material foi também analisado por espectroscopia de massa. O resultado mostrou
que o íon molecular obtido possui a mesma massa e mesma fragmentação que o
Neu5Gc, provando de forma inequívoca a presença desse Sia na composição do
SGC sulfatado (Figura 38).
Figura 37: TLC do ácido siálico purificado do sialoglicoconjugado sulfatado obtido do EJC de L. variegatus. Nos poços foram aplicados; 1 padrão de Neu5Ac , 2 padrão de Neu5GC , 3 ácido siálico constituinte do sialoglicoconjugado.
65
Figura 38: ESI do ácido siálico purificado do sialoglicoconjugado sulfatado do ouriço-do-mar L. variegatus.
66
O Sia pode ocorrer na forma mono- ou poli-sialilada. Essas formas já foram
observadas em EJC de ouriços-do-mar (Kitazume et al., 1994). Para determinar
esse aspecto estrutural, submetemos o SGCS à hidrólise ácida branda, utilizando
dois períodos de tempo e temperaturas distintas. Os produtos de cada
experimento foram analisados por TLC. Independente do tempo ou da
temperatura de hidrólise utilizados uma única banda com mobilidade igual a do
padrão de Neu5Gc é visualizada. Esse resultado prova que o SGCS é um
composto mono-sialilado (Figura 39).
Figura 39: HPTLC do ácido siálico purificado do sialoglicoconjugado sulfatado obtido do EJC de L. variegatus. O sialoglicoconjugado foi extraído com ácido triofluoroacético 0.1 N durante 15 ou 30 min e a temperatura de 37
0C ou 60
0C ou 80
0C.
Tempo (min): 15 30 15 30 15 30
Neu5Gc
37 60 80 Temperatura (0C)
67
Numa segunda etapa identificamos os outros monossacarídeos presentes no
SGCS. Para esse experimento o composto foi submetido a hidrólise ácida forte
(ácido triofluoroacético 6 M durante 5 h a 100°C) e os açúcares liberados foram
identificados por TLC (Figura 40).
Observamos cinco bandas, sendo que três delas co-migram com os padrões
de Gal, Glu e Man. A outras duas não co-migram com nenhum dos padrões de
açúcar e provavelmente são produtos de degradação, formados durante a
hidrólise ácida. Esse resultado indica que o SGCS contém Gal, Glu e Fuc em
proporções semelhantes, além do Neu5Gc.
Figura 40: TLC das hexoses do sialoglicoconjugado sulfatado obtido do EJC de L. variegatus. O sialoglicoconjugado sulfatado foi hidrolisado com ácido triofluoroacético 6 M durante 5 h a 100C. O material hidrolisado foi aplicado e corado com Resorcinol-HCl.
Fuc
Glu
Gal
contaminantes
__Origem
68
Alguns monossacarídeos co-migram em TLC. Por exemplo, Man dificilmente
se distingue de Glu. Por essa razão, os monossacarídeos liberados pela hidrólise
ácida foram derivatizados em alditol acetato e analisados por cromatografia a gás,
acoplada a um espectrômetro de massa (GC-MS). No cromatograma foram
visualizados 4 sinais, com tempo de retenção semelhantes aos padrões de fucose,
manose, glucose e galactose, na proporção de 0,3 : 0,55 : 0,5 : 0,3 (Figura 41). Os
espectros de fragmentação confirmam a presença desses açúcares.
Figura 41: Análise do sialoglicoconjugado obtido da matriz gelatinosa que recobre o óvulo do ouriço-do-mar da espécie L. variegatus por GC-MS. Análise revela a presença de fucose, manose, glucose e galactose.
Fuc
Man
Glu
Gal
69
Uma vez determinada a composição de açúcares do SGCS, o próximo
desafio é estabelecer a sua estrutura, ou seja, a seqüência desses
monossacarídeos, posição da ligação glicosídica, sítios de sulfatação, possíveis
ramificações, etc. Com esse objetivo analisamos o SGCS por 1H RMN. Os
espectros obtidos são muito complexos e indicam estruturas heterogêneas, sem
padrão repetitivo evidente (Figura 42). Os espectros bidimensionais de COSY,
TOCSY e HMQC são muito complexos, heterogêneos e de interpretação muito
difícil.
1.52.02.53.03.54.04.55.05.5 ppm1.52.02.53.03.54.04.55.05.5 ppm1.52.02.53.03.54.04.55.05.5 ppm
Figura 42: Espectro de uma dimensão (1H) do sialoglicoconjugado sulfatado obtido da matriz
gelatinosa que recobre o óvulo do ouriço-do-mar da espécie de L. variegatus.
70
Após estabelecer algumas características estruturais do SGCS, tentamos
localizá-lo no EJC do ouriço-do-mar. Os óvulos da espécie L. variegatus foram
fixados e corados com azul de alcian (pH 2,5) e PAS. Esses corantes permitem
visualizar carboidratos carboxilados e/ou sulfatados e carboidratos neutros,
respectivamente. Com o uso do azul de alcian podemos visualizar uma coloração
azul intensa na superfície dos óvulos. Com o PAS observamos uma intensa
marcação vermelha por todo o óvulo, exceto no núcleo (Figura 43). Esses
resultados mostram que óvulo possui grande concentração de carboidratos
neutros no seu citoplasma, provavelmente glicogênio. O EJC possui
preponderantemente carboidratos carregados negativamente.
Figura 43: Microscopia de luz dos óvulos de L. variegatus. O óvulo foi corado em (A) com azul de Alcian (pH 2.5) e em (B) com PAS.
Alcian Blue pH 2.5 PAS
71
A informação sobre a localização dos carboidratos sulfatados no EJC a partir
da coloração com azul de alcian, não nos fornece informações definidas sobre a
localização do SGCS. Tanto a FS quanto o SGC podem ser corados pelo azul de
alcian. Com o objetivo de definir a localização exata do SGCS, utilizamos lectinas
específicas. A lectina AAA reconhece Fuc e permite localizar a FS e o SGCS. As
lectinas LCA e PNA, que reconhecem Man e Gal, respectivamente, devem se ligar
apenas ao SGCS.
As micrografias mostram que todas as lectinas utilizadas interagiram com os
carboidratos do EJC do ouriço-do-mar L. variegatus de maneira homogênea
(Figura 44). Com essas observações microscópicas podemos concluir que o
SGCS está presente homogeneamente no EJC desta espécie de ouriço-do-mar.
72
AA
AL
CA
PN
AA
AA
LC
AP
NA
Figura 44: Microscopia de luz dos óvulos de L. variegatus. Os óvulos foram corados com lectinas biotiniladas em (A) AAA, em (B) LCA e em (C) PNA.
73
4.) Caracterização parcial da fucana sulfatada presente nos óvulos do ouriço-do-mar P. gaimardi.
Os ouriços-do-mar P. gaimardi ocorrem como cinco morfotipos, que são
distinguidos pela sua coloração. Nesta Tese os polissacarídeos do EJC de três
morfotipos dessa espécie de ouriço-do-mar foram extraídos e analisados por
cromatografia de troca-iônica (DEAE-celulose), em tampão Ac Na 50 mM, (pH
5,0), eluída com gradiente linear de NaCl (0 2 M). As frações foram coletadas e
monitoradas pela sua metacromasia, presença de Sia e condutividade. A fração
eluída com 0,65 M de NaCl foi denominada como P1, enquanto a fração removida
da coluna com aproximadamente 1,5 M de NaCl foi denominada como P2.
Podemos observar que as duas frações têm propriedade metacromática, mas
apenas P1 é positiva para a reação de Erlich. Portanto, P1 é o SGCS dessa
espécie. Esses resultados foram similares para os três morfotipos analisados
nessa Tese (Figura 45).
As frações obtidas através das cromatografias de troca-iônica foram
dializadas contra água destilada, liofilizadas e submetidas à eletroforese em gel de
agarose, tampão diaminopropano;acetato. Após a coloração com azul de toluidina,
notamos que os polissacarídeos obtidos do EJC dos três morfotipos analisados
contêm dois componentes distintos. O SGCS apresenta uma banda eletroforética
mais delgada enquanto o polissacarídeo sulfatado mostra uma migração
eletroforética mais polidispersa. As mobilidades eletroforéticas das frações P1 e
P2 dos três morfotipos foram semelhantes, sugerindo, preliminarmente, a
existência de polissacarídeos sulfatados semelhantes no EJC dos três morfotipos
de P. gaimardi (Figura 46).
As frações P2 dos três morfotipos foram submetidas à PAGE e coradas com
azul de toluidina. Notamos que os polissacarídeos sulfatados dos três morfotipos
possuem pesos moleculares similares ao da FS presente no EJC do ouriço-do-
mar da espécie L .variegatus, isto é, aproximadamente 290 kDa (Figura 47).
74
Figura 45: Purificação dos polissacarídeos sulfatados da matriz gelatinosa que recobre o óvulo dos três morfotipos do ouriço-do-mar da espécie P. gaimardi. Os polissacarídeos totais foram aplicados e purificados em DEAE-celulose, como descrito em material e métodos. Propriedade metacromática (■); presença de ácido siálico (○); condutividade (------). Gráfico representativo de três experimentos realizados independentemente.
75
Figura 46: Eletroforese em gel de agarose dos polissacarídeos sulfatados de morfotipos de P. gaimardi purificados em DEAE-celulose. As frações (~ 10µg de cada) foram aplicadas em gel de agarose 0.5%, submetidas à eletroforese, como descrito em material e métodos, e coradas com azul de toluidina. Gel representativo de três experimentos realizados independentemente.
Figura 47: Eletroforeses das fucanas sulfatadas presentes na matriz gelatinos que recobre o óvuklo dos três morfotipos de ouriço-do-mar da espécie P. gaimardi.Os picos P1 obtidos da DEAE-celulose referentes a cada morfotipo foram aplicados em gel de poliacrilamida 6% em tampão barbital sódico 0,02 M (pH 8,6) e corado com azul de toluidina. Os marcadores de peso molecular foram dextran sulfato de 500 kDa, condrotim 6 sulfato (60 kDa) e condroitim sulfato 4 (40 kDa) e heparina (35 kDa).
As frações P2 obtidas dos três morfotipos de P. gaimardi foram submetidas à
hidrólise ácida e os açúcares liberados identificados por cromatografia em papel,
76
através da sua coloração com nitrato de prata. Esse experimento revelou Fuc
como o único açúcar presente na fração P2 dos três morfotipos analisados (Figura
48).
Figura 48: Esquema representativo do resultado da cromatografia em papel da fração P2 obtida do EJC de morfotipos de P. gaimardi, correspondente a três experimentos realizados independentemente. Utilizou-se solvente butanol / piridina e corante nitrato de prata.
Com o intuito de determinar a estrutura química das FS, foi utilizado
espectrometria de RMN. Os espectros de 1H-RMN das FS obtidos dos três
morfotipos foram idênticos. Todos apresentaram um único sinal correspondente ao
próton anomérico e ao grupamento metil, ressonando em 5,04 e 1,23 ppm,
respectivamente (Figura 49).
A presença do grupo metil neste polissacarídeo sulfatado corrobora a análise
da composição química, indicando a presença de Fuc. A presença de um único
próton anomérico indica que o polissacarídeo é formado por um único tipo de
unidade de fucopiranose. A Figura 40 mostra a região do espectro do próton
correspondente ao H1 e H4 das FS obtidas dos três morfotipos de P. gaimardi.
Claramente, notamos que esses sinais apresentam deslocamentos químicos
semelhantes nos polissacarídeos obtidos dos três morfotipos, indicando a
similaridade dos compostos.
77
Figura 49: Espectro de RMN 1H unidimensional a 600 mHz da fucana sulfatada de P. gaimardi (A) e expansão das regiões 5.2 – 4.4 ppm dos espectros H1 unidimensionais das fucanas sulfatadas dos morfotipos amarronzado, esverdeado e rosado (B - D). H1 indica o deslocamento químico do próton ligado ao carbono 1; Fuc-CH3 = fucose
Adicionalmente, foram realizados espectros bidimensionais 1H/1H COSY e
1H/13C HMQC para elucidar a posição da ligação glicosídica e o sítio de sulfatação
dessas FS. A ocorrência de 4-sulfatação foi determinada pelo intenso
deslocamento de H4 para campo baixo (~ 0.7 - 0.8 ppm) quando comparado com
sinais de prótons não sulfatados (Figura 50). Esses dados foram comparados com
deslocamentos químicos de prótons para resíduos de α-L-fucose de FS de outras
espécies de ouriços-do-mar e indicam claramente a presença de éster sulfato na
posição O-4 (Tabela 7).
A posição da ligação glicosídica foi esclarecida pela análise dos
deslocamentos químicos dos 13C. O espectro 1H/13C HMQC apresentou seis sinais
principais e foi interpretado utilizando-se informações obtidas no espectro COSY e
por comparação com os valores de deslocamento químico de outras FS de
ouriços-do-mar, analisados anteriormente (Tabela 8). O intenso deslocamento
químico de C3 para campo baixo é indicativo da ocorrência de ligações 1→3
78
(Figura 51). O único aspecto ainda não esclarecido sobre a FS de P. gaimardi é a
presença de dois sinais no C1, como revela o espectro de 1H/13C HMQC (Figura
51).
Figura 50: Expansão do espectro de COSY da fucana sulfatada do EJC de P. gaimardi.
Figura 51: Espectro 1H/
13C HMQC da fucana sulfatada do EJC de P. gaimardi. O
assinalamento foi baseado no COSY.
79
Nossos resultados indicam que as FSs obtidas dos três morfotipos de
ouriços-do-mar P. gaimardi contém o mesmo polissacarídeo sulfatado, com a
seguinte unidade repetitiva: [1→3-α-L-fucp-4(SO3)]n (Figura 52).
Figura 52 – Proposta da estrutura majoritária encontrada na fucana sulfatada isolada do EJC dos três morfotipos de P. gaimardi analisados. A fucana sulfatada é um polímero linear 1→3 ligado, sulfatado na posição 4.
80
Tabela 7 - Deslocamento químico de prótons para resíduos de α-L-fucose da α-L-fucana sulfatada do EJC de P. gaimardi e compostos padrões. Os espectros unidimensionais foram feitos a 600 MHz, 50°C em 99.9% de D2O. Os deslocamentos químicos têm como o ácido trimetilsilpropiônico. Valores em negrito indicam a posição do sulfato.
Espécie de ouriço-do-mar Tipo de resíduo Deslocamento químico (ppm)
H1 H2 H3 H4 H5 H6
P. gamardi (este trabalho) -3-α-L-Fucp-(4SO3
-
)-1- 5.04 3.82 4.02 4.74 (4.66)
4.40 1.23
S. purpuratus -3-α-L-Fucp-(4SO
3
-
)-1- 5.14 3.90 4.07 4.76 4.55 1.32
L. variegatus (sazonal) -3-α-L-Fucp-(4SO3
-
)-1- 5.10 3.86 4.02 4.72 4.45 1.25
L. variegatus (constitutivo)
-3-α-L-Fucp-(4SO3
-
)-1- 5.08 3.87 3.98 4.78 4.45 1.27
-3-α-L-Fucp-(2SO3
-
)-1- 5.40 4.51 4.25 4.05 4.31 1.23
-3-α-L-Fucp-(di2,4SO3
-
)-1- 5.38 4.54 4.22 4.77 4.51 1.25
A. lixula -4-α-L-Fucp-(2SO
3
-
)-1- 5.25 4.51 4.16 4.01 4.56 1.38
81
Tabela 8 - Deslocamento químico de carbono dos resíduos de α-L-fucose da α-L-fucana sulfatada do EJC de P.gaimardi e compostos padrões. Os valores de deslocamento químico de
13C foram obtidos por espectros
bidimensionais tendo como referência o ácido trimetilsilpropiônico. Valores em negrito indicam a posição envolvida na ligação glicosídica.
Espécie de ouriço-do-mar Tipo de resíduo Deslocamento químico (ppm)
C1 C2 C3 C4 C5 C6
P. gamardi (este trabalho) -3-α-L-Fucp-(4SO3
-
)-1- 98.4 95.6
67.2 76.6 79.4 66.7 15.7
L. variegatus
(sazonal) -3-α-L-Fucp-(4SO3
-
)-1- 98.5 68.8 76.6 79.9 67.0 15.8
S. franciscanus -3-α-L-Fucp-(2SO
3
-
)-1- 96.77 75.52 75.94 74.16 69.00 18.00
S. pallidus -3-α-L-Fucp-(4SO
3
-
)-1- 97.20 70.05 78.55 81.80 69.13 15.00
S. droebachiensis -4-α-L-Fucp-(2SO
3
-
)-1- 101.97 77.90 70.97 83.40 69.96 13.00
82
5.) Evidência da presença de proteoheteropolissacarídeos no plasma
seminal de ouriço-do-mar da espécie L. variegatus:
Após a obtenção dos gametas masculinos, a partir da injeção de KCl
na cavidade intracelômica, estes foram mantidos a 4 C. Os gametas foram
centrifugados e o sobrenadante foi dializado e liofilizado. Uma pequena
quantidade do extrato bruto foi tratada com enzima proteolítica e outra parte
foi estocada intacta a - 20 C. Essas frações foram submetidas à eletroforese
em gel de agarose em tampão propilenodiamino / acetato para avaliar a
presença de polissacarídeos sulfatados no liquido seminal. Após a coloração
do gel com azul de toluidina, pode-se visualizar diferença na migração entre
o material antes e depois do tratamento com papaína.
O retardo da migração eletroforética dos polissacarídeos sulfatados
antes do tratamento com protease, indica a possível ligação covalente
destes compostos com proteínas (Figura 53).
Origem
++
Ext. bruto
Pd. GAG
Ext. bruto
tratamento com papaína
- +-
O resultado anterior (Figura 53) sugere a presença de estruturas
compostas por polissacarídeos sulfatados ligados covalentemente a uma
cadeia protéica. Com o objetivo de elucidar essa questão a amostra intacta foi
aplicada em coluna de troca – iônica, Mono-Q, acoplada a sistema de FPLC. O
Figura 53: Eletroforese em gel de agarose do extrato bruto do plasma seminal L. variegatus intacto e tratado com enzima proteolítica: As frações obtidas foram aplicadas em gel de agarose 0.5% e coradas com azul de toluidina, assim como descrito em Material e Método. Legenda CS (condroitim sulfato), DS (dermatam sulfato) e HS (heparam sulfato).
CS
─ DS
─ HS
─
83
tampão utilizado foi acetato de sódio 100 mM, 5 mM EDTA (pH 6,0) e a coluna
eluida com gradiente linear de NaCl (0 2 M) representado no gráfico em
linha pontilhada. As frações obtidas foram monitoradas quanto a sua
metacromasia, representada por quadrados abertos e a absorção a 280 nm por
quadrados negros.
Dentre todas as frações obtidas durante o monitoramento da coluna em
apenas duas houve coincidência entre a propriedade metacromática e
absorção a 280 nm. A terceira fração, a qual apresentou apenas metacromasia
também foi recolhida. Estas três frações eluiram, respectivamente, nas
seguintes molaridades de NaCl: 1,0 , 1,6 e 2,0 (Figura 54).
As três frações obtidas na cromatografia de troca iônica foram dializadas a
4 C, liofilizadas e submetidas à eletroforese em gel de agarose em tampão
propilenodiamino / acetato.
Os resultados obtidos a partir do gel sugerem que as três frações contêm
polissacarídeos purificados (Figura 54 e 55).
Para avaliarmos o peso molecular das frações intactas e tratadas com
papaína, utilizamos a eletroforese em gel de poliacrilamida em tampão barbital
sódico. Como padrão utilizamos dextram sulfato 500 e 8 kDa, fucana sulfatada
encontrada na matriz que recobre o óvulo da espécie Lytechinus variegatus
(290 kDa), condroitim 6 sulfato (60 kDa) e condroitim 4 sulfato (40 kDa).
propriedade metacromática
ABS 280 nm
condutividade0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
frações
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
[Na
Cl] (M
)AB
S (
nm
)
P1
P2
P3
propriedade metacromática
ABS 280 nm
condutividade
propriedade metacromáticapropriedade metacromática
ABS 280 nmABS 280 nm
condutividadecondutividade0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
frações
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
[Na
Cl] (M
)AB
S (
nm
)
P1
P2
P3
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
frações
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
[Na
Cl] (M
)AB
S (
nm
)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
frações
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
[Na
Cl] (M
)AB
S (
nm
)
P1
P2
P3
84
Fuc-S de L.v.
P1 P2 P3Pd. GAG
Origem
+
Fuc-S de L.v.
P1 P2 P3Pd. GAG
Origem
+
Origem
+
Figura 55: Eletroforese em gel de agarose do extrato bruto do plasma seminal L. variegatus intacto: As frações obtidas foram aplicadas em gel de agarose 0.5% e coradas com azul de toluidina, assim como descrito em material e métodos.
Figura 54: Purificação dos proteoheteropolissacarídeos sulfatados do plasma seminal de L. variegatus. O extrato bruto intacto foi aplicado em cromatografia Mono Q – FPLC como descrito em Material e Método. Os quadrados brancos, a linha pontilhada e os círculo fechados indicam respectivamente a propriedade metacromática, o gradiente linear de NaCl e a absorção a 280 nm.
85
Fuc-S de L.v.
C 6-S
Dex-S 500 KDa
C 4-S
P1 P2 P3
Origem
+
Fuc-S de L.v.
C 6-S
Dex-S 500 KDa
C 4-S
P1 P2 P3
Origem
+
Origem
+
Dex-S 500 KDa
C 6-S
C 4-S
P1 P2 P3Dex-S 8 KDa
Origem
+
Dex-S 500 KDa
C 6-S
C 4-S
P1 P2 P3Dex-S 8 KDa
Origem
+
C 6-S
C 4-S
P1 P2 P3Dex-S 8 KDa
Origem
+
Origem
+
Fuc-S de L.v.
C 6-S
Dex-S 500 KDa
C 4-S
P1 P2 P3
Origem
+
Fuc-S de L.v.
C 6-S
Dex-S 500 KDa
C 4-S
P1 P2 P3
Origem
+
Origem
+
Dex-S 500 KDa
C 6-S
C 4-S
P1 P2 P3Dex-S 8 KDa
Origem
+
Dex-S 500 KDa
C 6-S
C 4-S
P1 P2 P3Dex-S 8 KDa
Origem
+
C 6-S
C 4-S
P1 P2 P3Dex-S 8 KDa
Origem
+
Origem
+
Figura xx: Eletroforese em gel de
poliacrilamida 6% em tampão
barbital:
As amostras P1, P2 e P3 intactas
(em cima) e tratadas com
papaína (embaixo) foram
submetidas a PAGE e coraddas
com azul de toluidina.
Figura 56: PAGE 6% em tampão barbital sódico. As amostras P1, P2 e P3 antes (A) e após o tratamento com enzima proteolítica (B) foram submetidas a PAGE e coradas com azul de toluidina, como descrito em Material e Método. Em (A) os padrões de peso moleulares utilizados foram dextram sulfato 500 kDa, fucana sulfatada de L. variegatus, condroitim 6 e 4 sulfatos e em (B) foram dextram sulfato 500 e 8 kDa, condroitim 6 e 4 sulfatos
A)
B)
86
O resultado sugere que as três amostras intactas apresentam pesos
moleculares muito próximos da fucana sulfatada encontrada na matriz que
recobre o óvulo da espécie Lytechinus variegatus, isto é 290 kDa (Figura 56A)
enquanto as três amostras tratadas com enzima proteolítica apresentam pesos
moleculares similares ao dextran 8 kDa (figura 56B).
Este resultado nos fez supor duas hipóteses: ou a cadeia protéica desta
molécula é muito grande e contém poucas cadeias glicídicas ou a cadeia
protéica é pequena, mas contém muitas cadeias de polissacarídeos.
A fim de avaliarmos quais cadeias glicídicas estavam ligadas
covalentemente ao core protéico, tratamos as amostras com papaína e após o
termino de sua ação proteolítica utilizamos duas enzimas, a condroitinase AC
que cliva especificamente condroitim sulfato e condroitinase ABC que cliva
tanto condroitim sulfato quanto dermatam sulfato. Ainda utilizamos ácido
nitroso que cliva polissacarídeos contendo unidades de glicosamina com o
aminogrupo livre ou N-sulfatado, como ocorre nos heparinóides (heparam
sulfato e heparina).
Curiosamente, P1 não foi sensível a nenhum dos tratamentos citados
acima, enquanto, P2 e P3 foram exclusivamente sensíveis à quebra
deaminativa com o ácido nitroso (Figura 57).
Este resultado sugere que P1 não é um proteoglicano, mas P2 e P3
apresentam na sua estrutura cadeias glicídicas contendo N-sulfatação ou
grupamento N-livre, a semelhante do heparam sulfato.
87
Origem
+
P1 + papaína
Origem
+
Origem
+
P1 + papaína
Origem
+
Origem
+
P2 + papaína
Origem
+
Origem
+
P3 + papaína
Pd. GAG
CTR (-)
CHASE AC
CHASE ABC
HONO
Figura 57: Eletroforese em gel de agarose dos proteoheteropolissacarídeos sulfatados do plasma seminal de L. variegatus, tratados previamente com papaína P1 (A), P2 (B) e P3 (C) e posteriormente com condroitinase AC (CHASE AC), condroitinase ABC (CHASE ABC) e ácido nitroso (HONO). O padrão de glicosaminoglicanos é composto por condroitim 4-sulfato, dermatam sulfato e heparam sulfato.
A)
B)
C)
88
Para avaliarmos as unidades monosacarídicas que compõem estes
glicoconjugados, submetemos as três frações a hidrólise ácida e análise por a
cromatografia em papel em solvente ácido isobutírico:amônia dos açúcares
liberados. Os três picos apresentaram três monossacarídeos: galactose,
manose e glicosamina (dado não mostrado).
O solvente utilizado não é capaz de resolver glicose e galactose. Com a
finalidade de esclarecer a presença destes dois açúcares, os hidrolisados das
três frações foram submetidos à cromatografia em papel em solvente butanol :
piridina : água, capaz de resolver estes dois monossacarídeos. Neste
experimento, todas as três frações apresentaram três açúcares constituintes, a
galactose, manose e glicosamina em concentrações aproximadamente
equimolares, não revelando a presença de glicose.
89
5. DISCUSSÃO :
1.) Expressão sazonal da fucana sulfatada em L. variegatus:
A caracterização de um polissacarídeo sulfatado presente na matriz
gelatinosa que recobre o óvulo de ouriço-do-mar da espécie L. variegatus
apenas durante inverno pode ser um importante passo para a melhor
compreensão da reprodução desses animais, já que carboidratos sulfatados
estão diretamente relacionados com o processo de fertilização destes
invertebrados, induzindo a reação acrossômica.
Até o momento não há relatos sobre o período reprodutivo de espécies de
ouriço-do-mar do litoral brasileiro nem mesmo de clima tropical. Estes dados
são mais conhecidos para espécies que ocorrem no litoral europeu e
australiano. A espécie Paracentrotus lividus (Echinodermata: Echinoidea) que
habitam o litoral noroeste da Espanha, Galícia, apresenta período de
reprodução de maio a agosto (verão no hemisfério norte). Interessantemente,
durante esses meses ocorre aumento da concentração de proteína – de 36%
para 60% do peso seco da gônada - e este elevado nível protéico coincide com
níveis mínimos de glicogênio (Montero-Torreiro & Garcia-Martinez, 2003). Em
outra espécie de ouriço-do-mar, Holopneustes purpurascens (Temnopleuridae :
Echinodermata), coletado em Sidnei, Austrália, também o período de
reprodução foi descrito ocorrer do final da primavera até o verão (Williamson &
Steinberg, 2002). Em outros estudos que monitoravam o ciclo reprodutivo do
ouriço-do-mar da espécie Strongylocentrotus droebachiensis, foi verificado que
a desova ocorria majoritariamente durante a primavera e uma pequena
população liberava seus óvulos durante o inverno (Meidel e Scheibling, 1998).
Todos esses dados sugerem fortemente que o período de reprodução desses
animais ocorre na primavera e principalmente no verão.
Além disso, procurando informações sobre temperatura, salinidade,
disponibilidade de comida e luminosidade nas quatro estações do ano no Rio
de Janeiro, descobriu-se que nos meses de junho e julho há uma queda brusca
da temperatura da água do mar e das chuvas no litoral norte do estado do Rio
de Janeiro, entretanto sem uma alteração que acompanhe modificações na
salinidade das águas. Em maio e agosto a média de temperatura da água do
90
mar é de 25 C, enquanto que em junho e julho cai para 20 C e as chuvas
chegam próximo de zero nestes dois meses (Godoy et al., 2002).
A partir dessas observações e dos nossos achados, sugerimos que este
novo polissacarídeo encontrado no gel do óvulo do ouriço-do-mar, sintetizado
no final de maio até meados do inverno, possa inibir o processo de reação
acrossômica de uma pequena população de ouriços-do-mar que por ventura
tenha liberado os gametas nesse período e desta forma ter um papel
modulador na sua reprodução, servindo como mais uma barreira a favor de
processos de fertilização fora da estação propícia. A sulfatação na posição 2 é
requisito importante para que ocorra reação acrossômica nesta espécie (Vilela-
Silva et al., 1999). Para testar tal hipótese pretendemos avaliar a potência de
indução da reação acrossômica com as duas fucanas sulfatadas juntas e
separadas em espermatozóides coletados no verão e no inverno.
Não foram feitas coletas sempre no mesmo dia de cada mês, já que
impossibilidades como chuva, falta de transporte, entre outros contra tempos
impossibilitou uma coleta sempre no mesmo dia de cada mês.
Outro objetivo futuro do nosso trabalho é coletarmos fêmeas de ouriços-
do-mar, mantê-los em aquários, modificar artificialmente a temperatura da água
e avaliar o tipo de polissacarídeos sulfatados encontrados na sua matriz que
recobre o óvulo. Desta maneira, poderemos determinar se a temperatura da
água influência na expressão das fucanas sulfatadas encontradas no gel do
óvulo desta espécie. Além disso, pretendemos verificar o sinergismo entre
temperatura da água e luminosidade, pois dias longos (período de iluminação)
reduzem a taxa de gametogêneses ao passo que dias curtos induzem o
aumento do desenvolvimento gonadal (Shpigel et al., 2004). Em algas
marinhas já foi relatado que em diferentes meses a mesma espécie sintetiza
tipos distintos de carboidratos sulfatados (Percival e McDowell, 1967) e ainda
que a salinidade possa influenciar no processo de sulfatação de vários
glicídeos (Aquino et al., dado não publicado).
Além disso, pretendemos saber se essa fucana recém descoberta é
sintetizada por todas as fêmeas ou somente por algumas durante o inverno e
outono. Nossos dados não permitem essa conclusão, porque utilizamos um
“pool” de matrizes que recobriam os óvulos. Nos próximos experimentos
pretendemos extrair os polissacarídeos sulfatados de cada fêmea
91
separadamente durante todos os meses do ano. A expressão diferenciada de
polissacarídeos sulfatados ocorre em ouriços-do-mar do gênero
Strongylocentrotus que habitam o oceano Pacífico (Vilela-Silva et al., 2002).
Também pretendemos fazer um “screening” coletando ouriços-do-mar de
outras espécies mês a mês encontrados no Rio de Janeiro, a fim de
verificarmos se existe expressão diferenciada de polissacarídeos sulfatados de
acordo com a estação do ano.
Até o momento não foi descrito nenhum homopolissacarídeo sulfatado
com estrutura semelhante à fração P3 em ouriço-do-mar, embora haja
polímeros, como da própria fração P2 de L. variegatus que contem esse tipo de
resíduo (Alves et al., 1997). Polissacarídeos sulfatos são reconhecidamente
uma classe de macromoléculas que pode apresentar promissora atividades
anticoagulante e antitrombótica (Mourão e Pereira, 1999). Por está razão,
pretendemos avaliar se estas duas atividades estão preexistentes neste
composto comparando-se com a heparina e com outras fucanas e galactanas
sulfatadas já conhecida (Pereira et al., 2002).
Existem alguns requisitos já conhecidos que favorecem a atividade
anticoagulante como: grau de sulfatação, posição de sulfatação, tamanho do
polímero entre outros (Pavão et al.,1998; Vicente et al., 2001). Utilizando um
novo polissacarídeo sulfatado pode-se obter mais informações sobre esse
importante evento fisiológico.
92
2.) Proteofucana sulfatada em ouriços-do-mar:
A presença de PG e GAG na MEC é amplamente estudada (Tatari, 2007 ;
Whitelock et la., 2008 ; Kwok et al., 2008 ; Seider e Dreier, 2008 ; Khan et al.,
2008). Entretanto, os estudos no EJC de ouriços-do-mar se limitam a descrever
a estrutura da cadeia polissacarídica de FS e galactanas sulfatadas, mas sem
informações sobre uma possível ligação a cadeia protéica (Vilela-Silva et al.,
2008).
A similaridade estrutural e funcional entre os GAG e as FS indica que os
polissacarídeos do EJC de ouriços-do-mar também devem estar ligados
covalentemente a cadeia protéica, à semelhança dos PG. Nessa Tese a FS
ligada a cadeia polipeptídica foi denominada como pFS.
A extração da FS do EJC dos ouriços-do-mar requer a digestão com
protease, indicando que esse polissacarídeo ocorra no tecido covalentemente
ligada à proteína. Entretanto, ainda não tínhamos evidências diretas da
ocorrência deste polissacarídeo na forma de pFS.
Dentre os métodos testados para a solubilização do EJC, optamos pelo
uso do tampão HEPES (pH 8.0), contendo uréia 6 M, que mostrou os melhores
resultados. Classicamente os PG de vertebrados são extraídos dos tecidos
com guanidina 4 M e/ou uréia 6 M, mas esse protocolo não foi apropriado para
solubilizar o EJC. Tentativas de utilizar detergentes (TX-100 ou NP-40) e alta
concentração de NaCl não se revelaram adequada. O tampão HEPES
contendo 20 mM de EDTA, que usamos para dissociar o EJC do óvulo,
também não mostrou bons resultados.
Nossos resultados sugerem que o EJC de L. variegatus contém uma pFS
de alto peso molecular (Figura 18). O estudo dessa pFS apresenta uma
complexidade adicional para sua investigação em comparação com os PG de
vertebrados. As cadeias de GAG possuem massa molecular de ~10 – 60 kDa,
enquanto os PG possuem massa molecular elevada (> 100 kDa). Desta forma,
é fácil distinguir experimentalmente a molécula de PG intacta da cadeia de
GAG liberada após tratamento proteolítico ou pelo rompimento da ligação
açúcar-aminoácido. Em contraste, a cadeia de FS é muito longa (> 100 kDa)
tornando experimentalmente difícil a separação entre o polissacarídeo livre e
aquele covalentemente ligado ao peptídeo. Os géis para cromatografia de
93
filtração não são apropriados para distinguir carboidratos com peso molecular
tão elevado, como a FS e pFS.
Curiosamente, a pFS não foi corada no SDS-PAGE com o azul de
comassie, mas é detectável com o azul de toluidina. Esse dado pode ser
explicado pelo fato da pFS conter uma quantidade muito elevada de
carboidratos em comparação a porção protéica, impedindo o acesso do azul de
comassie. Os PG de vertebrados que possuem relação GAG/proteína elevada,
como o agrecam, apresentam o mesmo problema.
Especulamos que somente uma parcela da FS exista sob a forma de pFS
no EJC. Possivelmente, a FS ocorre no EJC de ouriços-do-mar como uma
mistura de moléculas, contendo diferentes proporções de carboidrato e
proteína. Essa proposta explica os resultados do experimento da Figura 16,
mostrando que duas frações de pFS são obtidas quando o EJC é solubilizado
com HEPES + uréia 6 M e aplicado na coluna de troca-iônica. Quando a FS é
extraída do EJC com tratamento proteolítico e aplicada na mesma coluna,
observamos uma única fração de FS.
Ainda não conhecemos o significado biológico da ocorrência de duas
frações de pFS quando o EJC é solubilizado com o tampão HEPES + uréia 6
M. Uma possível explicação seria que a FS enquanto está retida em grânulos
intracitoplasmáticos do óvulo possui seu “core” protéico intacto. À medida que é
secretada para a face externa do óvulo formar o EJC, sua porção protéica é
removida. Um mecanismo similar ocorre durante a degranulação de mastócitos
em resposta à inflamação. Dentro dos grânulos secretórios há uma série de
proteases (exopeptidases, carboxipeptidases, triptase, catepiscina G, granzima
B) ligadas ionicamente a heparina, que se apresenta sob a forma PG de
serglicina, em pH ácido. Todavia, a ligação dessas proteínas à heparina as
mantém inativas (Matsumoto et al., 1995 ; Henningsson et al., 2005 ; Stevens e
Adachi, 2007). Quando os mastócitos entram em contato com o sistema
complemento (frações C3a e C5a), citocinas, histamina, entre outros fatores –
ou in vitro com compostos como 48/80, ionóforos do cálcio (Criado et al., 2005),
ocorre a degranulação dos componentes presentes nos grânulos secretórios. O
conteúdo granular em pH neutro ou básico dissocia-se do complexo protease-
PG e conseqüentemente há a clivagem do “core” protéico da serglicina. Em
94
conseqüência, a heparina é liberada para o meio extracelular (Kolset e Tveit,
2008 ; Stevens e Adachi, 2007).
Vieira e colaboradores (1993) estudaram detalhadamente o “core”
proteíco do CS fucosilado. Esse composto é classificado como um
proteoheteropolissacarídeo sulfatado. Esta Tese mostrou pela primeira vez a
caracterização parcial de um proteohomopolissacarídeo sulfatado.
3.) Caracterização do sialoglicoconjugado do EJC de ouriço-do-mar:
O foco do trabalho do nosso laboratório é o estudo da estrutura de FS e
galactanas sulfatadas de ouriços-do-mar e seus efeitos na fertilização desse
invertebrado. O SGCS ainda não foi estudado em detalhe pelo nosso grupo.
Esse composto contém Sia, mas sua identidade ainda era desconhecida.
Também possui baixo PM, quando comparado com os demais polissacarídeos
sulfatados encontrados no EJC dos ouriços-do-mar (Figura 22). Existem alguns
trabalhos sobre a caracterização e função de SGCS presente no EJC de outras
espécies de ouriços-do-mar (Kitazume et al., 1994 e 1997 ; Hirohashi e
Vacquier, 2002 ; Maehashi et al., 2003).
Nessa Tese mostramos que o SGCS da espécie L. variegatus contém
Neu5Gc, fucose, manose, glucose e galactose, sendo os quatro últimos em
proporção aproximada de equivalente a 0,3 : 0,55 : 0,5 : 0,3. No SGCS da
espécie S. purpuratus também é relatada a presença de Neu5Gc > Fuc >
Man/Xyl > GlcNAc > GalNAc > Gal. Aparentemente o SGCS presente no EJC
de L. variegatus possui uma mistura de monossacarídeos menos complexa do
que aquela encontrada na espécie S. purpuratus (Hirohashi e Vacquier, 2002).
Existem muitos relatos sobre glicoconjugados contendo Neu5Gc com
modificações, tais como acetilação ou metilação em determinadas posições. O
SGCS presente no EJC de L. variegatus apresenta estrutura mais simples, sem
qualquer substituição e polimerização. A metodologia utilizada para sua
identificação é bem conhecida e os demais trabalhos utilizaram metodologias
semelhantes.
Os SGCS e a FS distribuem-se de forma homogênea no EJC como
indicado por análises morfológicas. É relatado que durante o processo de
fertilização em ouriços-do-mar cerca de 1 trilhão de espermatozóides e 3 - 6
bilhões de óvulos sejam liberados por cada indivíduo (Barnes e Rupperts,
95
1996). Isso dá uma relação de 1 óvulo para ~25.000 espermatozóides. Devido
à grande espessura do EJC é improvável que os primeiros espermatozóides
que alcancem o EJC, e conseqüentemente tenha a RA induzida, consigam
ligar-se e fusionar-se com o óvulo, porque suas enzimas acrossomais
provavelmente não são capazes de clivar toda a extensão do EJC até a
membrana plasmática do óvulo. Sendo assim, a clivagem inicial deve ser feita
pelos primeiros espermatozóides e a clivagem final do EJC, concluída pelo
espermatozóide “fecundador”.
A indução da RA e potencialização nos espermatozóides que se
aproximam precocemente ou tardiamente do óvulo devem ser semelhante
porque o SGCS e a FS estão homogeneamente dispersos no EJC (Hirohashi e
Vacquier, 2002). Portanto, os espermatozóides com aproximação precoce ou
tardia têm chances iguais de clivar o EJC e fecundar o óvulo. Caso a
distribuição não fosse homogênea, dificilmente a RA seria induzida nos
espermatozóides lentos, reduzindo a possibilidade de fecundação.
4.) Fucana sulfatada em morfotipos do ouriços-do-mar P. gaimardi
As estruturas das FS e galactanas sulfatadas de invertebrados marinhos
são tão fascinantes quanto suas atividades biológicas, principalmente pela
indução espécie-específica da RA durante o processo de fertilização em
ouriços-do-mar. Por essas razões, tentamos estender as informações sobre a
estrutura desses compostos.
A fertilização é o resultado de uma série de interações entre moléculas
localizadas nas superfícies do óvulo e do espermatozóide (Lennarz et al.,
1993). Em organismos que liberam seus gametas para o ambiente externo,
como os ouriços-do-mar, o sucesso da fertilização depende da perfeita
sincronização de etapas que visam evitar a hibridização. O primeiro nível de
reconhecimento é um evento chamado de RA, que depende da interação entre
polissacarídeo sulfatado e suREJ específicos, seguido da ligação e fusão dos
gametas, que depende da interação da proteína bindina e seu receptor
específicos (Vilela-Silva et al., 2008).
Utilizando técnicas de RMN, pode-se concluir que a FS presente no EJC
de três morfotipos da espécie P. gaimardi é composta exclusivamente de
resíduos de α-L-Fuc, unidos por ligação 13 e sulfatados na posição 4.
96
Entretanto, não conseguimos explicar o sinal adicional de carbono anomérico
visualizado no HMQC (Figura 36). Pode-se observar que a FS caracterizada
nesse trabalho possui exatamente a mesma estrutura da FS presente na EJC
da espécie L. variegatus, coletados entre junho e agosto. Nos demais meses
do ano, esse ouriço-do-mar possui um polissacarídeo constitutivo com a
seguinte unidade repetitiva: [3-α-L-Fucp-2(OSO3)-13-α-L-Fucp-4(OSO3)-
13-α-L-Fucp-2,4(OSO3)-13-α-L-Fucp-2(OSO3)-1]n.
A expressão de uma estrutura diferenciada no EJC de L. variegatus, em
meses específicos, pode estar relacionada a períodos do ciclo reprodutivo
dessa espécie, podendo ser influenciada por fatores ambientais.
Em contraste com isotipos de FS encontradas em outras espécies de
ouriço-do-mar, o polissacarídeo que ocorre exclusivamente nos meses de julho
a agosto não é capaz de induzir RA em espermatozóides de L. variegatus
(Cinelli et al., 2007). Mas possivelmente deve ser capaz de induzir a RA em
espermatozóides de P. gaimardi, se ocorresse encontro dos gametas
heterólogos. (Tabela 9). O encontro entre os gametas destas duas espécies
pode ocorre, pois eles co-habitam o mesmo nicho biológico, embora tenham
sido coletados em locais distintos.
Mesmo que ocorra o processo de indução da RA, o mecanismo de
reconhecimento dependente da bindina pode bloquear o processo de
fertilização, se suas bindinas e os respectivos receptores não forem capazes
de se ligar de maneira heteroespecíficas.
O período de reprodução desta classe de animais é normalmente o verão
(Montealegre e Gaspar, 2005). Os dados de época de reprodução da espécie
P. gaimardi não é conhecida. Apenas a espécie P. liviuds é amplamente
estudada no Mediterrâneo e no norte dos EUA (Barbaglio et al., 2007).
97
Tabela 9 - Possível resultado de ensaio de fertilização in vitro entre os gametas de L. variegatus e P. gaimardi para avaliação da ocorrência de reação acrossômica entre essas duas espécies de ouriço-do-mar.
Indução da reação acrossômicaSptz
FS
Espécie de
ouriço-do-mar
L. varie
gatus
P. gaim
ardi
L. variegatus P. gaimardi
SIM NÃO
SIMNÃO
NÃO SIM
Indução da reação acrossômicaSptz
FS
Espécie de
ouriço-do-mar
L. varie
gatus
P. gaim
ardi
L. variegatus P. gaimardi
SIM NÃO
SIMNÃO
NÃO SIM
5.) Proteoheteropolissacarídeos sulfatados no plasma seminal:
Nós relatamos pela primeira vez a ocorrência de polissacarídeos
sulfatados complexos presents no plasma seminal de ouriço-do-mar. Esses
polissacarídeos sulfatados apresentam uma estrutura única. Primeiro, ele
contém uma cadeia curta de carboidrato (~ 8 kDa) quando comparado com
cadeias de glicosaminoglicanos de vertebrados e outros polissacarídeos
sulfatados de invetebrados marinhos (Mulloy, 2005; Pomin and Mourão, 2008),
mas um alto peso molecular é conferido devido a ligação da sua cadeia
glicídica a proteína. Segundo, eles apresentam composição de
monossacarídeos complexa, contend galactose, glucosamine e manose, o que
também difere dos glicosaminoglicanos e outros polissacarídeos sulfatdos
previamente reportados (Vilela-Silva et al., 2008). Finalmente, eles ocorrem
como três frações, as quais separam em cromatografia de troca iônica e
diferem na relação do conteúdo polissacarídeo sulfatado/proteína.
A ocorrência de polissacarídeos sulfatdos no plasma seminal de ouriços-
do-mar levanta questões interessantes sobre o papel fisiológico desses
carboidratos. A ligação entre gametas é um passo critic durante o processo de
98
fertilização (Vjugina and Evans, 2008). No caso de ouriços-do-mar, o
espermatozóide e o óvulo estão envolvidos por polissacarídeos sulfatados – a
fucana sulfatada da matriz gelatinosa que recobre o óvulo e polissacarídeos
sulfatdos complexos do plasma seminal. A concentração de polissacarídeos
sulfatados é ~ 25 vezes maior na matriz que recobre o óvulo do que no plasma
seminal. O papel fisiológico da fucana sulfatada está bem estabelecido como
indutor espécie-especifico da reação acrossômica (Alves et al., 1997; Vilela-
Silva et al., 2008).
Nós especulamos sobre o possível papel fisiológico desses
polissacarídeos sulfatdos complexos presentes no plasma seminal desse
invertebrado, mas não possumos nenhuma evidência nesse estudo. Nós
traçamos algumas analogias com glicoproteínas encontradas no plasma
seminal humano. Uma glicoproteína com composição monossacarídica similar
vêem sendo sugerida em aumentar a viabilidade e/ou motilidade do
espermatozóide ou mesmo retardar a fertilização devido a inibição da reação
acrossômica (Drisdel et al., 1995; Chiu et al., 2005; Seppälä et al., 2007). Outra
glicoproteína do plasma seminal altamente glicosilada possivelmente contribui
para a diminuição da imunogenicidade do espermatozóide (Morris et al., 1996).
Entretanto, estas glicoproteínas não possuem grupamentos sulfato na sua
estrutura.
Perspectivas:
1.) Proteofucana sulfatada:
Os dados dessa Tese mostram uma caracterização ainda parcial da pFS.
Naturalmente ainda restam muitos aspectos importantes a serem esclarecidos,
como a caracterização do tipo de ligação glicosídica entre carboidrato-proteína,
a identificação do “core” protéico, incluindo a análise por homologia estrutural
com outras cadeias polipeptídicas de PG de vertebrados, etc.
A ligação da FS à cadeia protéica não é essencial para seu efeito
biológico como indutor da RA em espermatozóides de ouriços-do-mar. Esses
resultados baseiam-se nos testes biológicos utilizando FS exaustivamente
tratadas com proteases. Entretanto, sabemos que o mesmo o tratamento
proteolítico exaustivo não assegura a retirada completa dos peptídeos ligados
99
ao carboidrato. Ao contrário, a porção de carboidratos tem um efeito
bloqueador da digestão da cadeia protéica.
Um experimento que poderia ser feito é induzir a RA em espermatozóides
de ouriço-do-mar utilizando a FS obtida por extração proteolítica e as duas
frações de pFS extraídas com tampão HEPES + uréia 6 M. Existem relatos
mais antigos que mostram que a porção protéica poderia ter um papel
importante na indução da RA na espécie H. pulcherrimus (Mikami-Takei et al.,
1991).
Mais significativo é o aspecto funcional que poder ser explicado pela
ocorrência da pFS. Por exemplo, a secreção de moléculas para o meio externo
pode envolver a remoção preliminar do seu “core” protéico. Esse tipo de
abordagem permitiria conhecer o mecanismo de secreção de polissacarídeos
sulfatados que formam o EJC dos ouriço-do-mar.
Estudos sobre secreção de carboidratos para a formação de cápsula de
fungos já possuem alguns mecanismos conhecidos e testados (Rodrigues et
al., 2007 e 2008). Porém, especialmente no caso dos ouriços-do-mar, a
secreção de polissacarídeos sulfatados ainda não foi estudada. A FS poderia
ser armazenada na forma de PG e secretada somente durante a clivagem no
seu “core” protéico, a semelhança ao processo de degranulação de mastócitos.
2.) Sialoglicoconjugado
A única função biológica atribuída ao SGCS no EJC de ouriços-do-mar é a
potencialização da indução da RA pela FS (Hirohashi e Vacquier, 2002).
O principal desafio na estrutura desse SGCS é a elucidação da sua
estrutura química. Os espectros de RMN mostraram grande complexidade,
difícil interpretação. Informações adicionais podem ser obtidas fazendo
derivatizações no composto e análise em GC-MS.
Existe uma variedade de eventos biológicos envolvendo Sia (Munster-
Kuhnel et al., 2004 ; Lehmann et al., 2006). Conhecendo a estrutura completa
do SGCS é possível, a partir da utilização de enzimas específicas e hidrólise
ácida branda, determinar quais açúcares e o tamanho mínimo do
oligossacarídeo que são necessários para a potencialização da indução da RA.
100
3.) Fucanas sulfatadas dos morfotipos de P. gaimardi
A ocorrência de FS com a mesma estrutura no EJC de três morfotipos
de P. gaimardi e o fato de existir espécie-especificidade dependente de
polissacarídeo sulfatado no processo de RA nos motiva a realização de
ensaios de indução da RA.
Experimentos de compatibilidade gamética entre os morfotipos de P.
gaimardi mostram uma alta taxa de fertilização, o que sugere um
reconhecimento entre suas bindinas e receptores específicos entre morfotipos
distintos (Ventura et al., dados não publicados). Portanto, o mecanismo de
reconhecimento a espécie-especificidade dependente do mecanismo da
bindina não deve ocorrer entre estes morfotipos. Nosso dado mostra a
presença da FS com estruturas idênticas nos 3 morfotipos estudados. Persiste
um desafio a ser esclarecido: que mecanismo assegura a diferença desses
morfotipos de ouriço-do-mar?
O isolamento e caracterização parcial dos proteoheteropolissacarídeos
presentes no plasma seminal de L. variegatus precisa de maior refinamento tal
como sequenciar o core protéico e elucidar completamente a estrutura da sua
parte glicídica, para se concluir algo definitivo sobre estas macromoléculas.
Relatos sobre proteoheteropolissacarídeos sulfatados são pouco
freqüentes (Leushner, 1987; Katzman & Kang, 1972; Katzman & Oronsky,
1971). Todavia, os dados obtidos com utilização das enzimas condoitinase AC
e condoitinase ABC e clivagem deaminativa por ácido nitroso merecem
atenção. Podemos afirmar que P2 e P3 apresentam na sua estrutura ou N-
sulfatação ou grupamentos N-livre, em razão da sua susceptibilidade a quebra
deaminativa com ácido nitroso.
Outros proteoheteropolissacarídeos sulfatados relatados na literatura
apresentam colágeno como o componente da sua cadeia protéica. Porém
nossos dados indicam que o colágeno não é um componente significativo dos
proteoheteropolissacarídeos de ouriços-do-mar, pois a papaína consegue clivar
sua cadeia protéica diminuindo seu peso molecular (Figura 24).
Os três proteoheteropolissacarídeos foram submetidos à ressonância
magnética nuclear. Contudo, os espectros obtidos foram extremamente
101
complexos (dados não mostrados), necessitando assim, da realização de
espectros em 2D, e da análise da cadeia glicídica purificada e separação da
cadeia protéica mais detalhada.
Em síntese, acreditamos que os glicoconjugados sulfatados encontrados
no EJC de ouriços-do-mar são importantes para o conhecimento do processo
de fertilização em invertebrados. Naturalmente, esse evento está diretamente
relacionado com o processo de diferenciação das espécies. Também constitui
um modelo adicional de organização de MEC, constituída por moléculas
distintas daquelas presentes na matriz de vertebrados. Por fim, esses
glicoconjugados sulfatados são moléculas que podem ser testadas em
sistemas de vertebrados, com a possibilidade de levar a descoberta de novos
compostos com efeito terapêutico.
102
Referências:
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111
ANEXO 01
112
113
Anexo 02
114
115
116
117
118
119
120
121
122
123
ANEXO 03
124
125
ANEXO 04
126
127
ANEXO 05
128
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