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Genética Andrea Ghelfi

Genética Bacteriana – in vivo

1. Transformação Genética

2. Transdução

3. Conjugação


Transformação Genética

� O que é transformação genética?

� Processo pelo qual o DNA na forma livre é incorporado

por uma célula receptora

� Resultado: esta célula pode vir a apresentar alterações

genéticas

� Qual foi o evento que permitiu a descoberta da capacidade de

transformação genética pelas bactérias? E qual foi sua

conseqüência?

� Fred Griffith (1928)


Fred Griffith 1928

� Fred Griffith 1928 e a “metamorfose” das células

� Streptococcus pneumoniae

� Linhagens virulentas SIII (capsuladas)

� Linhagens avirulentas R (mutantes SII – sem cápsula)

� DNA é o material genético das células

� 1941 Griffith morre num ataque aéreo na Inglaterra!


DNA é o “Princípio Transformante”

� Quando ocorreu a demonstração e comprovação de que o DNA

é o material genético das células e é responsável pela

transformação bacteriana?

� Dawson e Sai (1931)

• Descobriram um método de transformar as células R em

SIII no tubo de ensaio (sem o camundongo)

� Alloway (1932)

• Tentou isolar e purificar o “princípio transformante”

• Problema: difícil reprodução do experimento


Teste de Flutuação de Luria e Delbrück (1943)

� Quais foram as duas hipóteses vigentes sobre o “princípio

transformante”?

1. O organismo é capaz de se adaptar a um ambiente

modificado e de passar esta característica a seus

descendentes � Jean Baptiste Lamarck (1744-1829)

2. O organismo pode, com uma pequena probabilidade,

sofrer uma mutação qualquer, sendo a mutação

independente das condições ambientais.


Avery, MacLeod e McCarty (1944)

� Quando ocorreu a demonstração e comprovação de que o DNA

é o material genético das células e é responsável pela

transformação bacteriana?

� Avery, MacLeod e McCarty (1944)

• Isolaram o DNA, RNA, proteínas, lipídios e carboidratos

das células tipo SIII e inocularam em placas contendo as

células R

• Somente o DNA foi capaz de transformar as células R em

SIII (virulentas)

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Genética Bacteriana – in vivo

� Transformação Genética

� Competência

� Captação do DNA

� Integração do DNA transformante

� Competência Induzida

• Íons de Ca e baixa temperatura

• Eletroporação


Transformação Genética

� O que é competência de uma célula?

� Capacidade de captar uma molécula de DNA

� É regulada por proteínas responsáveis pela captação e

processamento do DNA


Transformação Genética - Competência Natural

� Quais são estas proteínas e como elas atuam?

� Proteínas de ligação do DNA, associadas à MP

� Nucleases

� As células produzem um peptídeo e tornam-se

competentes quando este peptídeo atinge uma determinada

concentração

� Proteína ComA �ativadora de vários genes

� Proteína ComP � quinase sensora: reguladora de resposta


Transformação Genética - Competência Natural

� Exemplos de competência natural

� Bacillus: 20% das células se tornam competentes e assim

permanecem por várias horas

� Streptococcus: 100% se torna competente, por poucos

minutos, durante o ciclo celular


Transformação Genética – Captação do DNA

� Como ocorre a Captação do DNA?

� Há diferenças entre as bactérias

� Na maioria dos casos, Gram- (na forma de fita simples) e

Gram + (fita dupla)

� Como é a captação do DNA nas bactérias Gram –

� DNA fita dupla é degradado na forma de fita simples no

espaço periplasmático

� Somente a fita simples é transportada ao citoplasma


Sub-reino Eubacteria

Retém o

corante de

Gram

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Parede Celular de Gram -



Parede Celular de Gram + e o ácido teicóico



Peptideoglicano Gram + Peptideoglicano Gram -



� Como é a captação do DNA nas bactérias Gram +

� DNA é captado na forma de fita dupla

� A fita complementar é degradada no processo

� O que ocorre durante a transformação?

� Inicialmente, as células competentes ligam-se ao DNA de

maneira reversível

� Posteriormente, a ligação torna-se irreversível



� Algumas características das célula competente?

� Aumento de 1000x na capacidade de se ligar ao DNA

exógeno

� São incorporados fragmentos de DNA

• Há competição entre os fragmentos


Transformação Genética – Integração do DNA

� O DNA transformante liga-se à superfície da célula por meio de uma

proteína de ligação ao DNA

� O fragmento de dupla fita é captado

� Ou uma nuclease passa a degradar uma das fitas enquanto a fita

restante é captada

� Após a captação, DNA associa-se a uma proteína RecA

� Protege da degradação de nucleases

� O DNA é integrado ao genoma por meio de recombinação

� São pequenos fragmentos, raramente são transferidos plasmídeos

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Transformação – Competência Induzida

� É possível induzir a competência de uma célula bacteriana?

� Choque Térmico

� Eletroporação



� Choque Térmico

� Elevada concentração de íons de Ca (CaCl2): desestabiliza

a membrana celular

� Baixa temperatura: aumenta a porosidade da parede

� Este método permite a captação de DNA plasmidial

� Baixa eficiência, porém é mais barato



� Eletroporação

� As células são submetidas a um pulso elétrico que provoca

a formação de poros na membrana

� Permite a passagem de DNA fita dupla

� Método mais eficiente que o choque térmico, porém mais

caro. Depende do eletroporador

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