GENÉTICA FORENSEDeterminação do

limiar analítico para PowerPlex16 e

IdentifilerPaula Cristina Margotto

Polícia Federalwww.paulomargotto.com.br

Brasília, 19 de agosto

de 2011

Garantia de qualidade

• Excelência do laboratório• Confiabilidade dos resultados• Procedimentos rastreáveis • Maior peso à prova criminal

Validação interna• Confirmação, por meio exame, de que os requisitos

para um determinado uso são atendidos documentados

• Cada kit de amplificação STR gera variações que dependem das condições específicas do laboratório.

• Empresas aconselham métodos de validação baseados ou recomendado pela SWGDAM (Scientific Working Group on DNA Analysis)

Determinação do limiar analítico

• Ruído produzido pelo instrumento de eletroforese em capilar que não reflete moléculas de DNA

• O valor pode variar com a metodologia aplicada em cada laboratório. Exemplo: capilar ,idade do laser, equipamento ,formamida, etc.

Objetivo

• Determinar o valor do limiar analítico para os kits PowerPlex16 e Identifiler

• A SWGDAM recomenda análise de dados empíricos coletados no laboratório que se pretende avaliar. Podem ser usados diversos métodos científicos derivados de amostras negativas ou de diluição em série.

1- Método de diluições seriadas1997 IUPAC ElectroAnalytical Committee Recommendations

=Escolha de amostras com perfis distintos. BS129,BS132,BS1003,PCM

=Quantificação=Diluições seriadas em 1ng ,0,5 ng, 0,25ng 0,125

ng ,0,0625ng=Amplificação com os kits(volume total)=Eletroforese de Capilar=Análise no GeneMapper

Verificação da Linearidade• Cálculos de Média e desvio padrão ,por cor, de RFU

no Excel• Verificar a linearidade por regressão linear no gráfico

de quantidade de DNA versus média de altura dos picos para cada fuorófuro.

Análise de Fluoresceína PP16

Cálculos estatísticos com weighted regression (regressão ponderada) análise exploratória Ferramenta do Excel disponível pelo Boston University School of Medicine.

at= y intercept+3*standard error

Weighted regression analysis 5Com todos os dados

xi yi si 1/si2 wi wixi wiyi wixiyi wixi

2 wiyi2

0,0625 53,2 24,9799 0,001603 2,340462 0,146279 124,5126 7,782035 0,00914243 6624,068425

0,125 70,75 29,28943 0,001166 1,702398 0,2128 120,4447 15,05558 0,02659997 8521,45951

0,25 99,7674 44,12312 0,000514 0,750154 0,187539 74,84093 18,71023 0,04688463 7466,684767

0,5 241,9792 110,8967 8,13E-05 0,118753 0,059377 28,73583 14,36791 0,02968833 6953,472858

1 406,8958 128,6549 6,04E-05 0,088233 0,088233 35,90157 35,90157 0,08823284 14608,19937

sums 0,003424 5 0,694227 384,4356 91,81734 0,2005482 44173,88493

means 0,138845 76,88711

Output

slope 369,0569091

y intercept 25,64528315

standard error 11,95970687

2- Método de controles negativos• 20 dados de controles negativos • Recomendado para pouca quantidade de

DNA.• Analisa-se as amostras com

GeneMapperID3.2 com 1 RFU , retirando-se +/- 2 bases da posição do size standard.

2-Análise de controles negativos

• 1) AT= Média de RFU de amostras brancas+3*Desvio Padrão ( valores dos resultados) Kaiser (IUPAC 1976)

• 2) AT= 2*( Maior Sinal de Pico da linha de base-Menor sinal de pico de linha de base) ( valores dos resultados) Example in SWGDAM Guidelines

Resultados• Controles negativos

Exemplo C_NEG Identifiler

Resultados Identifiler• Método de controles negativos:• 1) AT= Média +3*Desvio Padrão• FAM=8,51 RFU• VIC= 13,81 RFU• NED= 15 RFU• PET= 15,41 RFU

• 2) AT= 2*(Max-Min)• FAM=38 RFU• VIC=64 RFU• NED= 48 RFU• PET= 44RFU

Resultados PP16• Método de amostras negativas:• 1) AT= Média +3*Desvio Padrão• fluorescein= 11,64• JOE= 22,28• TMR= 10,19

• 2) AT= 2*(Max-Min)• fluorescein= 32• JOE= 56• TMR= 32

C_neg PP16

Resultados•Diluições seriadas

Resultados Identifiler• Método de diluições seriadas : Retirou-se o ponto

0,0625 por falta de dados• FAM -62,9 RFU• VIC- 48 RFU• NED-52,11 RFU• PET- 61,49 RFU

Resultados PP16

• Diluições seriadas:• Azul = 203 RFU• Verde= 252 RFU• Amarelo = 54 RFU

BS132 1ng PP16

BS132 0,0625ng PP16

Resultados Power Plex 16

xi yi si 1/si2 wi wixi wiyi wixiyi wixi

2 wiyi2

0,0625 220,3968 196,8773 2,58E-05 2,643344 0,165209 582,5845 36,41153 0,010326 128399,8

0,125 330,6702 250,105 1,6E-05 1,637948 0,204744 541,6207 67,70259 0,025593 179097,8

0,25 665,6889 454,674 4,84E-06 0,495615 0,123904 329,9256 82,4814 0,030976 219627,8

0,5 1262,56 746,8113 1,79E-06 0,183706 0,091853 231,9398 115,9699 0,045926 292837,9

1 3044,4 1612,864 3,84E-07 0,039387 0,039387 119,9088 119,9088 0,039387 365050,4

sums 4,88E-05 5 0,625096 1805,979 422,4742 0,152208 1185014

means 0,125019 361,1959

Resultados PP16

• Diluições seriadas:• Retirando-se o ponto 1 ng:• Azul =136,49 RFU• Verde =126 RFU• Amarelo=44,42 RFU

Obrigada!