Genes candidatos para fendas orais em regiões de alta frequência identificadas pelo Estudo Colaborativo Latino- Americano de Malformações

Congênitas (ECLAMC) e a aplicação deste modelo de estudo no Brasil

Flavia Martinez de Carvalho

Laboratório de Epidemiologia das Malformações Congênitas (LEMC) /IOC

As fendas orais (FO), fendas labiais com ou sem fenda palatina (FL+FP) e fendas palatinas isoladas (FP) estão entre as anomalias craniofaciais mais comuns em humanos e onerosas ao sistema público de saúde ao longo da vida. A prevalência das FO está estimada em 1/700 nascimentos e varia conforme a origem geográfica e a condição socioeconômica da população. A prevalência também varia em diferentes etnias. A FL±FP ocorre de forma isolada ou em associação com outros defeitos congênitos. As formas isoladas ou não-sindrômicas possuem etiologia complexa com a contribuição de fatores genéticos e ambientais. Já as formas associadas ou sindrômicas surgem em decorrência de várias etiologias envolvendo mais de 500 doenças Mendelianas, anomalias cromossômicas, teratógenos e síndromes ainda não categorizadas. De todos os genes associados às FL±FP, o gene IFR6 foi o mais consistentemente associado ao defeito nas mais variadas populações. As características subclínicas ou subfenótipo (Exames envolvidos: ultrassom do músculo orbicularis do lábio, exame dentário detalhado, impressão labial, fotografias de corpo inteiro e face, fotografia tridimensional da face e dermatoglifos), assim como a divisão da amostra por etnia são importantes para aumentar a chance de identificar outras variantes etiológicas através da homogeneização da amostra. A presença frequente de subfenótipos em famílias com FO versus famílias controle pode explicar por que uma anomalia congênita deletéria persiste na população e por que as famílias com FO apresentam penetrância reduzida e, ainda, pode nos permitir identificar os fatores que impedem a plena expressão de genes de risco para FO. A maioria das doenças crônicas de grande impacto na morbimortalidade da população são doenças de etiologia complexa, onde poligenes interagem com fatores ambientais. Assim, este modelo de estudo com FO, aplica-se não só a área de anomalias craniofaciais, mas ao estudo de qualquer patologia crônica complexa relevante.

O projeto modelo, que motivou a expansão deste estudo para regiões brasileiras, utilizou a infraestrutura e organização do ECLAMC para estudar uma área de alta prevalência para FO na Patagônia (Argentina), baseado no pressuposto de que nesta subpopulação prevalecem algumas das inúmeras causas deste defeito. A busca, a partir de uma subpopulação provavelmente mais homogênea, do ponto de vista etiológico, poderia fornecer os genes candidatos de maior impacto na causalidade das FO. Uma série de trabalhos de campo coletou informação clínica e genealógica de 141 famílias afetadas por pelo menos um caso de FO (2686 pessoas). Material biológico além de análise subfenotípica foram obtidos de 538 indivíduos e estocados no biorepositório de amostras biológicas do ECLAMC. Utilizando a mesma metodologia, iniciou-se em 2010 o trabalho de campo na região amazônica do Brasil, através de uma colaboração com a Universidade Federal do Pará (UFPA) e com o setor de fonoaudiologia do Hospital Ophyr Loyola em Belém do Pará. Até o momento examinamos um conjunto de 145 famílias e 205 controles sem histórico de FO na família, nascidos na mesma região e sem grau de parentesco entre eles. Uma colaboração com o Centro Pró-sorriso na cidade de Alfenas (Minas Gerais) possibilitou a obtenção de amostras de 30 trios afetados por FO isolada. No Rio de Janeiro, existe uma colaboração com o Hospital Nossa Senhora do Loreto, centro de referência no tratamento de FO na cidade, com a casuística de amostras de DNA de 120 famílias com FO (297 indivíduos: 57 tríades e 63 díades). Nesses 2 últimos locais falta organizar a campanha para a coleta dos dados clínicos complementares, genealógicos e subfenotípicos. No estado da Paraíba, estabeleceu-se contato recente com a Maternidade Cândida Vargas, hospital participante da rede ECLAMC em João Pessoa, para início de coleta de amostras de famílias com FO e toda a gama de informações clínicas complementares propostas.

A hipótese de trabalho é que populações mais homogêneas são mais sensíveis em detectar os fatores

etiológicos causais de FO. No futuro, áreas de alta prevalência de FO no Brasil serão localizadas com auxílio

da informação do campo de malformações congênitas do DATASUS (Brasil, Ministério da Saúde) e da rede

de hospitais ECLAMC. Almeja-se contribuir para o entendimento dos principais fatores genéticos na

causalidade das FO no Brasil assim como em populações latino-americanas com grande contribuição

ameríndia. Como objetivos específicos podemos pontuar a busca de genes candidatos para as FO,

utilizando famílias afetadas pela forma isolada da doença e consideradas fenotipicamente mais

homogêneas, através de microarranjos de genotipagem de polimorfismos de um único nucleotídeo (SNPs)

e sondas de variação de número de cópias (CNV) para estudos de associação e também para mapas de

homozigosidade; a estratificação dos resultados obtidos por variáveis de risco relacionadas à prevalência

como etnicidade e, confirmar se as associações sugeridas na fase inicial deste projeto serão encontradas

em outras regiões geográficas do Brasil e no material retrospectivo do ECLAMC por genotipagem em larga

escala através da técnica de PCR em tempo real. A análise de subfenótipos também auxiliará na

identificação dos casos sindrômicos de FO, caracterizando se o excesso de prevalência decorre de casos

isolados ou associados de FO. Proponho, como estratégia adicional, que os casos pontuais de FO com

suspeita de herança monogênica associados às síndromes ainda não descritas ou de casos isolados familiais

sem diagnóstico específico sejam estudados através da tecnologia do sequenciamento massivo, utilizando

painéis de exoma customizados para os mais de 4.000 genes do Online Mendelian Inheritance in Man®

(OMIM).

A fase atual do estudo molecular está concluindo os experimentos de microarranjo das populações de Belém do Pará e de Alfenas. O propósito de escolher estas amostras para os estudos iniciais está em selecionar duas populações com misturas étnicas provavelmente diferentes. Neste simpósio serão apresentados os resultados moleculares já finalizados publicados ou ainda em fase de escrita de manuscrito. Uma das expectativas deste projeto é a avaliar as necessidades dos pacientes afetados por FO dependendo das áreas do país, criar ou aprimorar diretivas de tratamento e apoio às famílias com FO, compreendendo a multidisciplinaridade necessária na assistência a esses pacientes e as realidades regionais existentes. Espera-se também a identificação de formas sindrômicas e não sindrômicas de FO, facilitada pela homogeneização subfenotípica, para estabelecer um melhor diagnóstico etiológico e posterior aconselhamento genético.

Palavras-chave: fendas orais; subfenótipos; etnicidade; PCR de tempo real; microarranjos; polimorfismos de um único nucleotídeo; polimorfismos por variação do número de cópias; sequenciamento massivo.

Taxonomia Integrativa de Roedores Reservatorios Potenciais de Zoonoses

Marcelo Weksler Laboratório de Ecoepidemiologia de Doença de Chagas – LEDOC/IOC

A ordem Rodentia constitui o grupo mais diverso da classe Mammalia, com cerca de 2.360 espécies

reconhecidas, correspondendo a 42% de todos os mamíferos. Apesar do recente avanço no estudo

sistemático de roedores, a real diversidade dos roedores brasileiros ainda é desconhecida e vários grupos

são de difícil tratamento taxonômico. Várias espécies de roedores desempenham papel fundamental na

manutenção de ciclos parasitários e na dispersão e transmissão de várias zoonoses na América do Sul,

incluindo endemias emergentes e re-emergentes como as síndromes Pulmonar por Hantavirus, Febre

hemorrágica por Arenavirus, Leishmaniose e Doença de Chagas. A resolução de problemas taxonômicos e a

correta identificação das espécies hospedeiros, principalmente espécies crípticas, são partes fundamentais

nos estudos epidemiológicos e no monitoramento e controle de endemias, dado o fato de muitas relações

parasito-hospedeiro serem espécie-específicas. Propomos a pesquisa taxonômica integrativa de quatro

gêneros de roedores reservatórios, Oligoryzomys e Neacomys (Cricetidae), e Trinomys e Thrichomys

(Echimyidae). Estes táxons possuem classificação confusa devido a falta de revisões abrangentes recentes,

ampla distribuição dos táxons, grande similaridade morfológica entre linhagens evolutivas distintas, e

relativamente alta diversidade de espécies. A abordagem inclui uma amostragem geográfica ampla, e

análises da variação morfológica, citogenética e molecular. O projeto tem também como objetivo central a

formação de recursos humanos no estudo taxonômico integrativo de mamíferos, com ênfase em roedores.

Este trabalho servirá para estabelecer e diagnosticar unidades taxonômicas; descrever possíveis novas

espécies; fornecer a base taxonômica para bibliotecas de 'DNA barcodes; e fomentar a colaboração,

modernização e manutenção de dois importantes acervos de espécimes (vouchers) e amostras genéticas de

mamíferos brasileiros no Laboratório de Biologia e Parasitologia de Mamíferos Silvestres Reservatórios

(LABPMR, IOC/FIOCRUZ) e no Museu Nacional/UFRJ (MN/UFRJ). Este projeto é financiado pelo CNPq através

de projeto do "PROGRAMA DE CAPACITACAO EM TAXONOMIA – PROTAX" (Processo: 440663/2015-6).

Palavras-chave: Cricetidae, Echyimidae, Sistemática, variação fenotípica, DNA barcode

Comportamento reprodutivo em machos de Aedes aegypti e possíveis implicações ecológicas e epidemiológicas

Luciana Ordunha Araripe

Laboratório de Biologia Molecular de Insetos/IOC

Historicamente, o estudo de características fisiológicas e comportamentais de mosquitos hematófagos tem sido feito exclusivamente em fêmeas, enquanto machos quase não são estudados. A principal razão para isso é que os machos de mosquitos não picam, e por isso não são eles próprios os vetores de doenças que atingem as populações humanas. Porém, um estudo completo do cenário epidemiológico de determinada doença transmitida por mosquitos só pode ser confiável se contar com previsões feitas a partir do conhecimento da ecologia e da distribuição de populações de mosquitos. Para isso, uma descrição de comportamentos reprodutivos é essencial.

Aedes aegypti é o principal vetor de três doenças predominantes em regiões tropicais: Dengue, Chikungunya e Zica. Contribuindo também para a extensão de sua importância epidemiológica, está que suas populações continuam crescendo e sua distribuição expandindo-se para regiões subtropicais, fazendo com que novas estratégias de controle sejam extremamente urgentes. Por conta disso, a WHO tem encorajado a aplicação de métodos que vão além do uso de inseticidas e que têm como alvo a fertilidade de indivíduos adultos e a viabilidade de ovos e larvas. Para a criação desses métodos, o conhecimento de aspectos reprodutivos e embriológicos é essencial. Dentre estes, o comportamento reprodutivo é uma característica-chave, porque garante que machos e fêmeas se encontrem para a perpetuação de populações naturais. Logo, o comportamento reprodutivo de machos também pode ser considerado um alvo importante para estratégias de controle populacional.

Neste trabalho, estudamos o ritmo circadiano da atividade de vôo em machos de A. aegypti da linhagem de laboratório Rockefeller, usando o sistema Trikinetics LAM 25. Este sistema permite estudar a atividade de até 120 machos, em intervalos de menos de um minuto, ao longo de vários dias em condições controladas de temperatura e fotoperíodo. Aproveitando esse sistema, onde cada indivíduo é colocado dentro de um tubo de vidro com fonte de alimento (sacarose 10%) em um dos lados, nós criamos uma extensão que permite estudar a atividade pré-cópula. Para isso, adaptamos tubos de plástico translúcido a uma das extremidades dos tubos de vidro, separando dois ambientes por um micro tule. Os tubos de plástico serviram de confinamento para fêmeas, enquanto machos tiveram sua atividade medida nos tubos de vidro. O micro tule permitiu a comunicação química e acústica entre machos e fêmeas, enquanto impediu a cópula.

O tubo de confinamento funcionou perfeitamente e, depois do experimento piloto (Exp1), 4 experimentos de 15 dias foram completados. Para esses, usamos condições replicadas e tratamentos diferentes, de acordo com novas questões levantadas acerca das interações pré-cópula. Os controles foram replicados em todos os experimentos. No Exp2 medimos a atividade de vôo de 120 machos em quatro tratamentos diferentes: a) com fêmeas virgens confinadas e com solução açucarada em ambos

os tubos, b) com fêmeas inseminadas confinadas e com solução açucarada em ambos os tubos, c) sem fêmeas nos tubos de confinamento, mas com solução açucarada em ambos os tubos, e d) sem fêmeas e sem solução açucarada nos tubos de confinamento. No Exp3 as condições a), b) e c) foram repetidas e em d) medidos a atividade de fêmeas nos tubos de vidro, sendo que os tubos de confinamento permaneceram vazios. No Exp4 as condições a), c) e d) foram repetidas. Todos os experimentos foram feitos em uma incubadora Precision Scientific, modelo 818, em 25oC, durante 4 dias em regime LD 12:12 (12 h de claro seguidas de 12h de escuro), e 11 dias em escuro constante (DD).

Nossos resultados mostram que machos e fêmeas respondem imediatamente ao acendimento das luzes, produzindo um pico matinal abrupto de atividade (M). Logo após esse pico, a atividade cai e um novo pico de atividade só é observado ao anoitecer (E). Em machos o pico E é dividido em dois (E1 e E2) e o pico E2 se sobrepõe ao único pico E de fêmeas. O mais interessante é que E2 é significativamente maior quando fêmeas estão presentes nos tubos de confinamento. Isso indica que a presença de fêmeas não é apenas nitidamente percebida pelos machos, mas é também capaz de alterar o comportamento de machos, mais especificamente, seu ritmo de atividade de vôo.

Para investigar quais os sinais por trás da percepção do ritmo das fêmeas pelos machos, montamos o Exp5 usando indivíduos com certos órgãos removidos. Novamente, fizemos quatro tratamentos: a) machos que sofreram ablação de antenas, com fêmeas confinadas, b) machos que sofreram ablação de antenas, sem fêmeas confinadas, c) machos normais com fêmeas que sofreram ablação de asas, e d) machos e fêmeas normais. Os resultados indicam que machos sem antenas têm uma atividade total significativamente mais baixa, além de não alterarem o ritmo em resposta à presença de fêmeas. Por outro lado, os tratamentos c) e d) não foram diferentes significativamente, ou seja, o ritmo de atividade de machos não muda quando as fêmeas presentes sofreram ablação de asas. Isso sugere que os sinais pré-cópula são percebidos mesmo quando fêmeas não produzem o som de batimento das asas.

Para medir a alteração de amplitude dos picos de atividade E1 e E2, nós criamos o índice MDI (Mating Drive Index). Este índice caracteriza, com um único valor, a resposta de cada macho à presença de fêmeas, a partir da alteração de seu ritmo de atividade. O MDI é definido como (E2 – E1)/(E1 + E2). Em todos os experimentos, MDI foi significativamente diferente entre machos com e sem fêmeas confinadas.

Nossos resultados sugerem que o ritmo circadiano de machos de Aedes aegypti, dado por sua atividade de vôo, pode ser manipulado por sinais envolvidos com a atividade pré-cópula. Experimentos preliminares indicam que sinais químicos são mais importantes do que a percepção de som para essa comunicação. Como perspectivas, continuaremos na direção de estudar os genes envolvidos na resposta de machos à presença de fêmeas, a partir do estudo dos perfis de expressão gênica de genes do relógio circadiano e genes de percepção neuro-sensorial.

Palavras-chave: Aedes aegypti, comportamento reprodutivo, relógio circadiano, atividade de vôo.

Importância do recrutamento e diferenciação de células do sistema imune

inato na malária

Flávia Lima Ribeiro-Gomes

Laboratório de Pesquisa em Malária, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz.

A malária é uma doença infecto-parasitária causada por protozoários do gênero Plasmodium e um dos

principais problemas de saúde pública do mundo. A parasitose pode se manifestar da forma não complicada ou

evoluir para formas graves, como a malária cerebral. Evidências epidemiológicas sugerem que não apenas a

malária cerebral, mas também a malária não-cerebral está associada a alterações neurológicas de longo prazo.

Tendo em conta que o parasito da malária não é neurotrópico, sequelas neurológicas são uma consequência de

uma resposta neuroinflamatória desencadeada por um desequilíbrio entre uma resposta imune pró- e anti-

inflamatória. Camundongos C57BL/6 e BALB/c infectados com Plasmodium berguei-ANKA representam modelos

de infecções utilizados para estudar a resposta imune e suas complicações na malária cerebral e na sua forma

não complicada, respectivamente. Considerando que as células da imune inato representam a primeira linha de

defesa, produzindo mediadores inflamatórios que amplificam a imunidade inata e modelam o desenvolvimento

da resposta imune adquirida contra o patógeno, a proposta do projeto é investigar, no modelo murino, o

recrutamento de subpopulações de células do sistema imune inato como neutrófilos e monócitos para o baço de

camundongos C57BL/6 e BALB/c infectados com P. berguei-ANKA. Assim como, a diferenciação dos monócitos

em células dendríticas e macrófagos, e identificar o fenótipo funcional destes em macrófagos classicamente (M1)

ou alternativamente (M2) ativados por citometria de fluxo. O tecido cerebral de camundongos infectados com P.

berguei ANKA e o P. chabaudi também será analisado, onde investigaremos o perfil funcional das micróglias (M1-

e M2-like), macrófagos do sistema nervoso central, o depósito de corpos β-amiloides, e a capacidade fagocítica

das micróglias. Todos os protocolos experimentais foram submetidos e aprovados à avaliação pelo Comitê de

Ética no Uso de Animais (CEUA) da Fiocruz.

Palavras-chave: Malária, Imunidade inata, Neutrófilos, Monócitos, Células dendríticas, Macrófagos e Micróglia.

Fluorescence Lifetime Imaging of Alterations in the Cellular Metabolism During the Enterovirus Infection

Ivanildo Pedro de Sousa Júnior Laboratório de Enterovírus – LEV/IOC

Enteroviruses selectively exploit specific elements of the host to form specialized organelles where cellular specific lipids are key to regulate viral RNA replication and changes in lipids traffic have been observed. Little is known about how these changes are controlled at the molecular level, and how they are related to the metabolic states of the infected cell. In this study, we apply a label-free method that uses NADH fluorescence lifetime as an intrinsic biomarker to characterize the metabolic changes in live cells upon enterovirus infection. NAD is a key determinant of cellular energy metabolism and the reduced form of this pyridine nucleotide (NADH) is fluorescent in living cells. We use Fluorescence Lifetime Microscopy (FLIM) to show that different metabolic states are related to different stages of the infection process. In this method, the fluorescence decay is measured at each pixel of an entire image. In this way, FLIM provides a method to distinguish free and bound NADH based on the difference between their fluorescence decay time, known as fluorescence lifetime. While free NADH presents an average lifetime of 0.38 ns, protein-bound NADH fluorescence lifetime increases to about 2 ns. During the early stages of infection, the cells follow a metabolic trajectory from a glycolytic phenotype (15 min post-infection - PI) to a more oxidative phosphorylation phenotype (1 h PI). Initially, the cells were characterized free/bound NADH ratio higher than the control (non-infected) cells changing to a lower free/bound NADH ratio due to viral infection. However, after 150 min PI cells switched back to a more glycolytic phenotype when compared to uninfected cells. Overall, our results suggest an order of events in which infected cells metabolic status changes throughout infection, as measure by NADH ratio. These events may be correlated to virus replication sites assembly and virus production. Furthermore, for the first time we show that NADH FLIM provides a label-free and sensitive method to identify different metabolic states of cells during viral infection.

Key words: Enterovirus; NADH; FLIM

Estudo de doenças genéticas humanas

Verônica Marques Zembrzuski Laboratório de Genética Humana – LGH

Desde sua constituição, o Laboratório de Genética Humana (LGH) realiza pesquisas científicas básicas e aplicadas, claramente identificadas com os desafios da ciência e tecnologia, relativas a fatores hereditários envolvidos na suscetibilidade e resistência a doenças infecto-parasitárias e epidemiologia molecular de doenças de herança complexa. Também tem contribuído para o desenvolvimento de técnicas e métodos moleculares para o diagnóstico de doenças de etiologia genética. Neste contexto, desde a minha entrada no LGH (novembro de 2015), tenho me envolvido em projetos nas principais linhas de pesquisa do laboratório: a) Epidemiologia genético-molecular da Fibrose Cística (FC); b) Estudo de marcadores genéticos associados a doenças infecciosas; c) Fatores genéticos envolvidos com o desenvolvimento de doenças neuromusculares degenerativas; d) Genética de doenças crônicas e multifatoriais, e e) Genética de populações.

Em relação à FC, recentemente realizamos um sequenciamento de toda a extensão do gene CFTR (quase 200 mil pares de bases), em amostras de 95 pacientes acometidos pela doença. Os resultados obtidos estão em fase inicial de análise, mas nos permitirão identificar mutações entre as quase 2000 já descritas, além de mutações novas, que possam estar implicadas no desenvolvimento da FC.

No estudo de doenças infecciosas, através de uma parceria com pesquisadores da Escola Nacional de Saúde Pública (ENSP) que trabalham com saúde de populações indígenas, foi realizada a análise de mutações em genes que codificam enzimas metabolizadoras de drogas utilizadas no tratamento da tuberculose. Este enfoque farmacogenético desenvolveu-se tanto em uma amostra da população da cidade de Dourados, estado do Mato Grosso do Sul, com a inclusão de indígenas das etnias Guarani e Terena, como na população de uma aldeia Xavante do Mato Grosso. Os resultados obtidos nesses dois estudos resultaram em artigos científicos que estão em fase final de submissão.

Além dessas linhas, estou envolvida com o estudo das doenças crônicas e multifatoriais, como hipertensão, obesidade e Parkinson. Polimorfismos genéticos associados à hipertensão arterial estão sendo estudados por uma aluna de mestrado (PPGBMC - Programa de Pós-graduação em Biologia Molecular e Celular, da Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro - UNIRIO), a qual co-oriento. Para auxiliar na conclusão desse estudo, farei a submissão de proposta de projeto para o edital APQ1 da FAPERJ (novembro de 2015). Participo, ainda, dos estudos relacionados à Genética da Obesidade Humana. Tenho trabalhado com essa patologia desde a minha graduação (2000), na Universidade Federal do Rio Grande do Sul, até recentemente (2014), em outra IES do estado do Rio de Janeiro (UNIGRANRIO). A fim de obter verba para as pesquisas em obesidade, submeti projetos para os dois últimos editais APQ1 da FAPERJ (novembro de 2014 e junho de 2015), porém sem resposta positiva da agência de fomento. Atualmente, venho estabelecendo parcerias com pesquisadores da UERJ e da UFF para realizar um estudo sobre farmacogenética da doença de Parkinson. O Grupo da UERJ já trabalha com determinantes genéticos da doença de Parkinson, enquanto o grupo da UFF tem experiência na farmacogenética de transtornos psiquiátricos. O primeiro passo para levarmos o projeto adiante foi a submissão de adendo ao Comitê de Ética e Pesquisa da UERJ, onde as amostras de DNA encontram-se estocadas.

Por fim, outro projeto que pretendo iniciar é “Transição epidemiológica na etnia xavante: um estudo da suscetibilidade genética à obesidade, à hipertensão e ao diabetes”. Sobretudo nas populações indígenas, têm se observado mudanças no perfil de morbimortalidade, com a diminuição da ocorrência de doenças infecciosas, e o crescimento da morbidade e da mortalidade por doenças crônicas não transmissíveis, entre elas, o diabetes, as doenças cardiovasculares e a obesidade; nos indígenas na etnia Xavante, isso não é diferente. Desde a época do contato permanente (1940-1950), vem ocorrendo a redução de territórios, sedentarização e inclusão de novas técnicas de cultivo de alimentos. Dados antropométricos vêm sendo coletados desde 1960, e estudos realizados

principalmente pelo grupo de pesquisa da ENSP mostram o surgimento de diabetes mellitus tipo 2 e altas prevalências de sobrepeso e obesidade entre os adultos. Por se tratar de um estudo genético em uma população indígena, o processo para estabelecimento do projeto é dificultado e o início das pesquisas é lento, devido a todo trâmite em Comitês de Ética em Pesquisa e assinatura de termos de consentimento.

Palavras-chave: genética humana, doenças humanas, mutação, polimorfismo.

O papel de neutrófilos e da elastase neutrofílica no controle da infecção e da

disseminação de Toxoplasma gondii em macrófagos e enterócitos

Rafael Mariante Meyer

Laboratório de Biologia Estrututal – LBE/IOC

O protozoário intracelular Toxoplasma gondii encontra-se amplamente distribuído na natureza, infectando virtualmente todas as espécies animais de sangue quente. Seu sucesso reside, em parte, nos mecanismos de transmissão que apresenta, incluindo, dentre outros, a rota oral de infecção pela ingestão de cistos presentes na água ou em alimentos malcozidos. O encontro entre o parasito e o sistema imune do hospedeiro também é determinante para o sucesso da infecção. Sabe-se que leucócitos medeiam respostas imunes essenciais que levam à proteção e ao controle da toxoplasmose. Paradoxalmente, presume-se que a função migratória inerente aos leucócitos seja utilizada pelo T. gondii para mediar sua dispersão no organismo, através de um mecanismo que envolve o transporte do parasito pelos leucócitos.

De maneira geral, a eliminação de microrganismos é inicialmente controlada por neutrófilos, através de mecanismos oxidativos – produção de espécies reativas de oxigênio pela atividade do complexo enzimático da NADPH oxidase – e não-oxidativos – dependentes da liberação de peptídeos antimicrobianos e das proteases elastase neutrofílica (NE), proteinase 3 e catepsina G. Essas proteases agem dentro de fagossomos, digerindo microrganismos fagocitados em conjunto com peptídeos antimicrobianos e o sistema oxidativo. A NE é também responsável pela regulação de processos inflamatórios, através da indução da produção de mediadores pró-inflamatórios por macrófagos.

Recentemente, a NE foi observada participando do controle da carga parasitária de tripanosomatídeos. O tratamento de coculturas de macrófagos infectados com Leishmania amazonensis ou Trypanosoma cruzi e neutrófilos com um inibidor de NE reduziu significativamente a atividade tóxica contra tripanosomatídeos mediada por neutrófilos. Até o momento, porém, não há evidências de participação desta protease no controle da infecção por T. gondii. Por outro lado, sabe-se que o T. gondii produz um potente inibidor de proteases, denominado TgPI-1, que atua na inibição de tripsina, quimotripsina e elastase neutrofílica, possivelmente agindo na proteção contra os efeitos microbicidas da NE.

Um papel primordial dos neutrófilos na infecção intestinal por T. gondii foi descrito recentemente, e observou-se que essas células são capazes de disseminar o parasito pelo lúmen intestinal. Contudo, os mecanismos envolvidos neste processo permanecem desconhecidos. Tendo em vista o papel da NE no controle da carga parasitária e a importância dos neutrófilos na disseminação de T. gondii, duas hipóteses serão testadas neste projeto. A primeira é a de que a NE regula negativamente a replicação do parasito. Nesta hipótese, a administração de um inibidor farmacológico de NE in vitro e in vivo implicaria no aumento da carga parasitária em células hospedeiras e no consequente aumento da formação de cistos teciduais em camundongos. Por outro lado, a administração de NE exógena às culturas de macrófagos/enterócitos deverá inibir a infecção da célula hospedeira e a proliferação do parasito.

A segunda hipótese é a de que o trânsito dos neutrófilos encontra-se alterado na infecção por T. gondii, direcionando os neutrófilos para os enterócitos infectados. Neutrófilos seriam atraídos pelo epitélio intestinal infectado (através da modulação, pelo parasito, da secreção de mediadores quimiotáxicos e da expressão de

moléculas de adesão pela célula intestinal) e, em seguida, infectados pelo protozoário. No interior dos neutrófilos, o parasito deve se estabelecer em um vacúolo parasitóforo – evitando as vias de degradação lisossomal – até que os neutrófilos migrem para outra região do intestino, onde os microrganismos deixarão as células e infectarão novos enterócitos. Para testar essa hipótese será desenvolvido um modelo in vitro de barreira epitelial intestinal onde serão utilizados enterócitos e neutrófilos isolados de camundongos. Os mecanismos celulares e moleculares envolvidos na interação parasito-enterócito e na participação dos neutrófilos na disseminação da infecção serão avaliados por técnicas de microscopia, citofluorimetria e ensaios imunoenzimáticos.

Uma vez elucidados, esses mecanismos devem fornecer informações valiosas a respeito da interação entre o parasito e a célula hospedeira, possibilitando a exploração de aspectos que contribuam, por exemplo, para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas que visem à intervenção da infecção oral, principal rota de infecção utilizada pelo parasito.

Palavras-chave: Iteração T. gondii-célula hospedeira, Neutrófilos, Barreira intestinal, Elastase neutrofílica,

Macrófagos, Infecção.

O papel de pesquisadora no laboratório de Malacologia do Instituto Oswaldo Cruz (LABMAL): projetos, coleção científica, ensino de pós-graduação, extensão

e serviço de referência.

Suzete Rodrigues Gomes

Laboratório de Malacologia, Instituto Oswaldo Cruz/Fiocruz

Os projetos desenvolvidos junto ao laboratório de Malacologia do Instituto Oswaldo Cruz (IOC) desde o início de minhas atividades têm tratado, principalmente, dos moluscos terrestres, procedentes de áreas urbanas, agrícolas e de Mata Atlântica, além dos helmintos associados a estes. Várias espécies de gastrópodes terrestres atuam como hospedeiros intermediários naturais de nematódeos de interesse médico e veterinário, entre os quais o Angiostrongylus cantonensis e A. costaricensis, agentes etiológicos da meningite eosinofílica e da angiostrongilíase abdominal, respectivamente. Nestes casos, a infecção humana é acidental, pela ingestão desses hospedeiros crus ou mal cozidos e de hortaliças contaminadas com larvas de terceiro estágio do parasito. Tais projetos têm envolvido levantamentos de diversidade da malacofauna terrestre e a identificação de associações destes com helmintos de interesse médico e veterinário. A identificação taxonômica de ambos os grupos vem sendo feita através de análises morfológicas e moleculares. Para isto, tem sido feitas análises da concha e da anatomia interna, através de dissecações sob estereomicroscópio, assim como o sequenciamento do marcador molecular Citocromo Oxidase I (COI), utilizando técnicas de extração de DNA, Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e sequenciamento. Helmintos têm sido obtidos a partir dos moluscos pela técnica de digestão artificial. Um dos projetos sob minha responsabilidade conta com uma bolsa de Iniciação Científica aprovada pela FAPERJ, e tem focado na análise da diversidade de espécies de lesmas Veronicellidae em áreas alteradas e de Mata Atlântica no estado do Rio de Janeiro. Esta família inclui as principais espécies hospedeiras do nematódeo A. costaricensis no Brasil. Outros dois projetos estão vinculados a monografias de alunos do curso de Especialização de Malacologia de Vetores do IOC. Um deles vem avaliando a diversidade de moluscos terrestres em áreas de cultivos agrícolas no município de Pelotas, RS, sob diferentes tratamentos agrícolas, enquanto o outro vem tratando dos moluscos terrestres e límnicos ocorrentes no Parque Municipal da Taquara, em Duque de Caxias, RJ. Nestes dois projetos, atuo como orientadora e co-orientadora, respectivamente. Também foi recentemente iniciado projeto que tratará dos moluscos terrestres ocorrentes no Campus da FIOCRUZ em Manguinhos, o qual deverá ser desenvolvido por aluno vinculado ao Programa de Vocação Científica (PROVOC). Além destes projetos, também tenho atuado como colaboradora no projeto que envolve o estudo da espécie exótica invasora Achatina fulica e outros moluscos terrestres na Mesorregião do Estado do Rio de Janeiro, e em projetos desenvolvidos por equipes da Embrapa Uva e Vinho (em Bento Gonçalves, RS) e PUCRS (Porto

Alegre, RS), envolvendo espécies de moluscos pragas, entre as quais a lesma exótica chinesa Meghimatium pictum, que vem atacando uvas em áreas de cultivos no sul do Brasil. Das espécies de moluscos identificadas até o momento, várias foram encontradas associadas ao nematódeo A. cantonensis, causador da meningite eosinofílica, entre os quais A. fulica (Achatinidae), Bulimulus tenuissimus (Bulimulidae), Sarasinula linguaeformis (Veronicellidae) e Leptinaria unilamelata (Subulinidae). Além destas, a lesma exótica M. pictum foi encontrada naturalmente parasitada com A. costaricensis e como responsável pela transmissão da angiostrongilíase abdominal humana no sul do Brasil. Outras têm sido também encontradas parasitadas por espécies dos gêneros Strongyluris sp. e Rhabditis sp., parasitos intestinais de répteis e de mamíferos em geral, respectivamente. Como pragas agrícolas, destacam-se as espécies M. pictum, S. linguaeformis, Deroceras laeve, Bulimulus spp. e Bradybaena similaris em uva, soja, cítrus e hortaliças em geral. Outra atividade de destaque é a de curadora-substituta da Coleção de Moluscos do Instituto Oswaldo Cruz (CMIOC), tendo entre as responsabilidades assumidas o auxílio na elaboração de relatórios, preenchimento de formulários da CMIOC relacionados aos serviços prestados, reacondicionamento de exemplares da parte seca da coleção (2.021 lotes até o momento), além da supervisão do trabalho de três bolsistas em atividades que incluem o tombamento de lotes de moluscos na CMIOC (826 lotes de janeiro até o momento) e a preservação de lotes já tombados. A coleção também vem sendo ampliada no que diz respeito à inclusão de lotes de moluscos terrestres e preservação dos espécimes com vistas a futuras análises moleculares. Outras atividades envolvem a representação da CMIOC em eventos, reuniões e no recebimento de visitas internas e externas ao IOC. Desde o início das atividades no LABMAL também atuei como professora colaboradora em quatro disciplinas em nível de pós-graduação oferecidas pelo LABMAL na FIOCRUZ e em disciplina do Programa de Pós-Graduação em Ecologia e Evolução da UERJ, assim como em dois treinamentos voltados a profissionais da área da saúde do Estado do Rio de Janeiro, e como palestrante em três eventos na área da Malacologia, dois nacionais e um internacional. Também se destaca que neste período houve cinco atuações como referee, para revistas nacionais e internacionais e participação em três bancas de pós-graduação na FIOCRUZ, UERJ e UFRJ. Dentro do Serviço de Referência tenho atuado em especial, na identificação de espécies terrestres de interesse para a saúde pública, bem como no auxilio para a padronização de métodos de análises moleculares utilizados no Laboratório de Referência Nacional para Esquistossomose - Malacologia, com fins de identificação molecular dos helmintos e moluscos interesse médico e veterinário. Os projetos em desenvolvimento, bem como as demais atividades desenvolvidas, estão perfeitamente alinhados às linhas de pesquisa e missão do LABMAL, e ao papel do pesquisador frente à geração de conhecimento e divulgação deste à comunidade científica, estudantes e população.

Palavras-chaves: moluscos terrestres, taxonomia, nematódeos, parasitologia, biodiversidade

Análise Geoespacial da Infecção por Trypanosoma cruzi na População de Reservatórios e Hospedeiros Sentinelas em Áreas de Transmissão do parasita no Brasil

Autora: Samanta Cristina das Chagas Xavier

Laboratório de Biologia de Tripanosomatídeos, Instituto Oswaldo Cruz,

FIOCRUZ

Cada vez mais, hoje, as questões ambientais e a sustentabilidade dos ecossistemas são levadas em conta na tomada de decisão nos estudos ambientais. Para uma correta avaliação das variáveis ambientais, as ferramentas de análise geográfica são imprescindíveis. Atualmente, os casos de doença de Chagas Aguda (DCA) vêm ocorrendo devido a ingestão de alimento contaminado por formas infectivas do vetor e/ou devido a invasão de domicílios por triatomíneos silvestres infectados atraídos pela luz. Este novo recorte é desafiador devido às diferenças nos cenários regionais onde ocorre em paralelo com as peculiaridades do Trypanosoma cruzi. T. cruzi é um táxon extremamente heterogêneo, inclui seis genótipos que apresentam

diferentes características epidemiológicas e enzotiológicas mas que infectam centenas de espécies de mamíferos e vetores. Estas múltiplas variáveis resultam em complexos ciclos de transmissão do T. cruzi com características e particularidades locais e temporais. Os surtos recorrentes vêm demonstrando que ainda não se adotou medidas de controle efetivas dentro deste novo perfil epidemiológico. É aqui que se insere este projeto. Pretende-se realizar um estudo abrangente incluindo variáveis ambientais e paisagísticas, aspectos biológicos e ecológicos dos triatomíneos, bem como da diversidade de espécies animais que constituem a rede trófica na qual está incluído o T. cruzi em áreas onde aconteceram os casos de DCA e/ou que reportam alta prevalência de infecção em triatomíneos com relato de invasão domiciliar. O objetivo é elucidar as variáveis reguladoras da transmissão do T. cruzi na natureza como forma de validar o monitoramento de cães como sentinela e sua utilização como medida de vigilância epidemiológica. Pretende-se ainda construir mapas de áreas de risco como forma de definir áreas estratégicas de ação e assim prevenir novos surtos e/ou casos. Dentro deste objetivo, serão testados como bioindicadores do risco de transmissão os mamíferos silvestres e os animais domésticos e peridomiciliares. Em relação ao ciclo silvestre, pretende-se avaliar composição faunística e abundância de pequenos mamíferos bem como o seu papel no ciclo de transmissão do T. cruzi. Neste sentido o perfil da infecção dos animais examinados será determinado por exames parasitológicos (exame de sangue à fresco e hemocultivo), por ser este que expressa a sua competência ou não de infectar o vetor e sorológicos (RIFI, ELISA e TR-DPP/LVC) permitirá avaliar a exposição dos animais à infecção. O mesmo será realizado com os animais domésticos na região. Para realizar o diagnóstico da infecção por T. cruzi dos mamíferos no campo, pretende-se desenvolver e implementar um teste rápido imunocromatográfico de fluxo lateral utilizando os antígenos recombinantes CRA e FRA. Os isolados de T. cruzi serão caracterizados molecularmente, como forma de rastrear quais as subpopulações do parasita (DTUs) que estão circulando em quais hospedeiros nas áreas de atividade humana e em áreas silvestres. A modelagem espacial da dispersão da transmissão da infecção por T. cruzi, incluirá a análise exploratória dos dados biológicos e ambientais por meio de mapas temáticos aplicando a técnica de interpolação, além da análise por Álgebra de mapas gerados no ArcGIS 9.3. Na modelagem estatística, será utilizado o Modelo Linear Generalizado. Os resultados referentes ao tipo de DTUs, os resultados parasitológicos e sorológicos de animais domésticos e silvestres bem como variáveis de clima e de paisagem serão mapeados e tratados por lógica Fuzzy com vistas a reconhecer áreas de risco e fornecer elementos para definição de ações sustentáveis de vigilância epidemiológica.

Palavras-chave: Trypanosoma cruzi, Reservatórios, Ciclos de Transmissão, Diagnóstico, Análise Espacial, Hospedeiros Sentinelas, Doença de Chagas Aguda (DCA), Lógica Fuzzy

Inibidores de α-glicosidases como agentes anti-hiperglicemiantes orais e sua aplicação no tratamento da diabetes

Mario R. Senger, Rafael F. Dantas, João de M. Rezende-Neto, Floriano P. Silva-Jr Laboratório de Bioquímica Experimental e Computacional de Fármacos, IOC, FIOCRUZ

Introdução: Mais de 310 milhões de pessoas sofrem de diabetes mellitus tipo 2 (DM-2) no mundo. Na DM-2 a secreção de insulina pelo pâncreas pode ser normal, mas a entrada de glicose nas células está comprometida, devido ao número reduzido de receptores para insulina, elevando os níveis glicêmicos. As glicosidases (E.C. 3.2.1.x) são enzimas ubíquas que catalisam a hidrólise de ligações glicosídicas entre di, oligo, polissacarídeos e glicoconjugados. Sabe-se que estas enzimas desempenham um papel fundamental na digestão de carboidratos. A inibição da atividade das glicosidases digestivas e a consequente diminuição da glicemia pós-prandial são de suma importância para o tratamento de DM-2. Por essa razão, nos últimos anos, muitos trabalhos vêm tentado descobrir novos inibidores de glicosidases, sejam estes compostos sintéticos ou naturais. Atualmente já existem fármacos inibidores de glicosidases presentes no mercado e utilizados para o tratamento da DM-2, como a acarbose. Este fármaco inibe as enzimas alfa-glicosidases pancreáticas e intestinais, mas possui diversos efeitos colaterais. Nosso grupo vem estudando através de abordagens experimentais e computacionais novos inibidores sintéticos glicoconjugados1,2 e não-glicoconjugados3 de α-glicosidases como agentes antidiabéticos. Materiais e Métodos: A atividade enzimática das glicosidases modelo, maltase de levedura e α-amilase pancreática suína foi avaliada em um volume final de 50µL em microplacas de 384 poços. A atividade da maltase foi aferida em tampão fosfato de potássio (50mM, pH 7,0), pré-incubada à 37°C por 5 minutos e a reação foi iniciada pela adição do substrato

2-cloro-4-nitrofenil-α-D-glicopiranosídeo (1 mM). A atividade enzimática da a α-amilase foi aferida em tampão HEPES (50mM, pH 7,0), CaCl2 (5mM), NaCl (100mM), pré-incubada à 37 °C por 5 minutos e a reação foi iniciada pela adição de 2-cloro-4-nitrofenil-α-D-maltotriosídeo (1mM). A leitura de absorvância foi realizada em um leitor de microplacas automatizado, onde foi medida taxa de aparecimento de p-nitrofenol (λ= 405 nm). Os experimentos para o cálculo de IC50 (concentração de inibidor que promove 50% de inibição da atividade enzimática) foram realizados conforme descrito acima e determinado pela titulação de pelo menos oito concentrações de inibidor. Os valores de IC50 foram calculados no software Sigmaplot 12.0 pelo ajuste dos dados de atividade residual e concentração de inibidor à equação logarítmica de 4 parâmetros: Ativ. Res. = min + (max-min) / (1 + ([I]/IC50) ^ (-Coef.Hill)). A acarbose foi utilizada como controle positivo. Nos experimentos de reversibilidade, as glicosidases foram incubadas a uma concentração de 100 vezes acima do valor requerido para o ensaio de atividade com uma concentração de inibidor equivalente a 10 vezes o IC50. Após 30 min de incubação, a reação foi iniciada pela diluição 100 vezes no tampão de reação contendo o substrato. A curva de progresso foi comparada a uma amostra semelhante da enzima incubada e diluída na ausência do inibidor. Resultados e Discussão: Neste trabalho foram estudados dois extratos naturais e 60 compostos sintéticos. Primeiramente foi testado o extrato de Achyrocline satureioides (Asteraceae), este inibiu as glicosidases com valor de IC50 para maltase e para α-amilase de 185,21 e 265,72 µg/mL, respectivamente. Experimentos já foram realizados para determinar seu efeito anti-hiperglicemiante in vivo e os dados estão sendo analisados. Após, investigamos o efeito do extrato bruto de Bauhinia holophylla (Caesalpinaceae). Foi determinado o IC50 e analisado seu modo de inibição. Nossos resultados mostraram que o extrato bruto apresentou o valor IC50 de 28,04 µg/mL para α- amilase e 43,01 µg/mL para maltase, tendo uma inibição lenta e reversível. Apesar dos valores de IC50 de ambos os extratos testados serem maiores que o da acarbose para amilase, devemos levar em consideração que estamos comparando um composto purificado com extratos brutos e, mesmo assim, os extratos foram mais eficientes para a inibição da maltase quando comparado com a acarbose. Os compostos sintéticos testados pelo nosso grupo possuem o núcleo 1,2,3-triazol, que foram sintetizados pela reação de cicloadição 1,3-dipolar de Huisgen catalisada por cobre. Os 60 compostos obtidos tiveram sua síntese, composição farmacêutica e métodos de tratamento patenteados junto ao INPI (BR10201402751). Estes foram triados a 500 µM na atividade enzimática da α-amilase e na maltase, os inibidores mais potentes já tiveram seu valor de IC50 reportado3. A maior parte dos inibidores ativos nas glicosidases descritas acima são derivados de carboxialdeído, fenilhidrazona (20b), N-metilenoisonicotinamida (20h) e oxima (20i). Para os testes in vivo selecionamos os compostos mais potentes que não foram derivados de carboxialdeídos. Os compostos (20b, 20h e 20i) assim como a acarbose (controle positivo) foram administrados via sonda oral (gavagem) na concentração de 10 mg/Kg juntamente com 4 g/Kg de uma solução de maltose. Os camundongos tratados com o composto 20i e com acarbose demonstraram uma redução significativa no pico de glicemia pós-prandial quando comparados com os animais controle, que receberam somente a solução de maltose. Nossos resultados demonstram a atividade anti-hiperglicemiante de derivados de 2-fenil-2H-1,2,3-triazóis. Esses compostos são uma nova classe de moléculas não glicosídicas obtidas através de simplificação molecular com potencial para o tratamento da DM-2. Estudos estão sendo conduzidos pelo nosso grupo para determinar a cinética do mecanismo de inibição promovido por estes compostos. Conclusão: Esperamos identificar arcabouços moleculares inibidores de glicosidases que possam ser utilizados no controle da glicemia pós-prandial. Espera-se que estes compostos possam auxiliar no desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento da diabetes e síndrome metabólica. Perspectiva: A Implementação de um modelo animal pertinente para o estudo da DM-2, como o camundongo db/db, é de fundamental importância para nossa instituição. Com este modelo poderemos avaliar o efeito in vivo de candidatos a fármacos e consolidar nossa plataforma de triagem pré-clínica de fármacos.

Palavras-chave: Diabetes, Glicosidases, anti-hiperglicemiantes, produtos naturais, triazóis.

Genômica evolutiva e funcional de pseudogenes em tripanossomatídeos

Marcos Paulo Catanho de Souza

Laboratório de Genômica Funcional e Bioinformática – LAGFB/IOC

Tripanossomatídeos são protozoários parasitas pertencentes à ordem Kinetoplastida, um grupo muito ancestral da árvore

filogenética dos eucariotos. O sequenciamento dos genomas de alguns tripanossomatídeos patogênicos ao homem,

pertencentes aos gêneros Leishmania e Trypanosoma, sem dúvida contribuiu para uma melhor compreensão não só da

biologia destes organismos, como também de aspectos relevantes da evolução de seus genomas. Atualmente, a

disponibilidade de um importante número de genomas de tripanossomatídeos, com variado grau de divergência entre

eles, nos dá a possibilidade de realizar análises comparativas e evolutivas mais robustas, oferecendo novas oportunidades

de compreender melhor diversos processos biológicos importantes, ou até mesmo revelar outros desconhecidos, nestes

organismos.

Neste projeto, propomos realizar um estudo comparativo e evolutivo dos processos e mecanismos relacionados com

pseudogenes em tripanossomatídeos. Tentaremos identificar genes ou grupos de genes com maior propensão à

desfuncionalização e, portanto, à pseudogenização. Mediante este tipo de análise comparativa, poderemos conhecer,

ainda, quais grupos de genes não foram afetados por processos de pseudogenização e que, portanto, são indispensáveis

em cada um dos grupos de tripanossomatideos estudados. Este tipo de análise nos permitirá obter um panorama

qualitativo e quantitativo dos processos de aquisição e perda de genes através do tempo nestes organismos.

Outro ponto importante que abordaremos neste projeto se relaciona com a possível aquisição de novas funções por estes

pseudogenes. A visão tradicional é a de que uma vez perdida a função, o destino destas sequências é a progressiva

degradação. Entretanto, existem várias evidências de que pseudogenes podem adquirir novas funções, particularmente

com participação na regulação da expressão gênica de outros membros da mesma família multigênica. Deste modo,

usando dados de sequenciamento profundo (Illumina), determinaremos os padrões de expressão dos pseudogenes em

alguns tripanossomatídeos, com o objetivo de obter pistas sobre suas possíveis novas funções.

Portanto, com este projeto, pretendemos contribuir para uma melhor compreensão da dinâmica nos genomas dos

tripanossomatídeos, (i) obtendo um panorama qualitativo e quantitativo dos processos de aquisição e perda de genes

através do tempo nestes organismos e traçando a história particular de cada família gênica entre as linhagens estudadas,

bem como (ii) analisando a dinâmica evolutiva dos pseudogenes, ou seja, os processos de pseudogenização e

neofuncionalização, nestes organismos.

Palavras-chave: genoma, pseudogene, tripanossomatídeo, bioinformática, evolução

Genômica e evolução de bactérias com impacto na saúde pública: determinantes de resistência, virulência e adaptabilidade

Érica Lourenço da Fonseca

Laboratório de Genética Molecular de Microrganismos – Instituto Oswaldo Cruz

O principal objetivo do projeto de pesquisa no qual estou envolvida é estudar e gerar informação acerca dos

eventos de micro e macroevolução dos genomas bacterianos envolvidos direta ou indiretamente com a emergência da

resistência aos antimicrobianos, virulência e fitness adaptativo considerando tanto bactérias clínicas quanto

ambientais. Desta forma, o sequenciamento completo de genomas permite acessar na íntegra toda informação

genética destes organismos, que compreende o genoma estável assim como o genoma acessório.

Um de nossos modelos é a bactéria Pseudomonas aeruginosa, que é ubíqua em ambientes naturais mas é um

dos principais patógenos responsável por infecções nosocomiais em todo mundo. Algumas linhagens de P. aeruginosa

são resistentes à ação dos antimicrobianos, devido à presença de mecanismos multifatoriais de resistência intrínsecos

e adquiridos. Temos trabalhado a quase uma década com uma linhagem de P. aeruginosa (clone SP) que vem

persistindo em hospitais de todo Brasil. Esta linhagem carreia o gene blaSPM-1 que codifica uma metalo-β-lactamase,

que hidrolisa β-lactâmicos, incluindo os carbapenemas, antibióticos eficazes no tratamento de diversas infecções.

Além de seu espalhamento em um país com dimensões continentais como o Brasil, o nosso grupo identificou, através

de análises de epidemiologia global, que este clone também foi encontrado em diferentes continentes, evidenciando

seu potencial pandêmico. Recentemente, em 2014, nosso constatamos que esta linhagem continua causando

infecções nosocomiais na cidade de São Luís do Maranhão, demonstrando que o mesmo continua persistindo em

ambientes hospitalares. A persistência e espalhamento de uma linhagem multirresistente não é comum, uma vez que,

normalmente, a resistência a antibióticos compromete o fitness da bactéria. Portanto, passamos a investigar quais

seriam os determinantes genéticos responsáveis pelo fitness desta linhagem. Assim, o genoma completo de isolados

do clone SP distintos espaço-temporalmente foi sequenciado utilizando a Plataforma de Auto-desempenho do

Instituto Oswaldo Cruz (Campus Manguinhos). Os dados genômicos vem sendo analisados, focando no estudo dos

genes únicos, resistoma e mobiloma destes isolados. A análise da informação genômica nos permitiu determinar o

contexto do gene blaSPM-1, e estes resultados foram publicados no periódico Journal of Antimicrobial Chemotherapy

(Fator de Impacto: 5.3) (Fonseca et al., 2015). Neste trabalho, foi mostrado pela primeira vez a presença de um

elemento integrativo conjugativo (ICE) carreando genes de resistência, tanto o blaSPM-1 quanto o bcr-1, que ainda não

havia sido descrito nesta espécie. Estes resultados são relevantes não só sob o ponto de vista da microevolução desta

linhagem mas principalmente pelo potencial deste gene, cujo produto tem impacto direto na emergência da

resistência a drogas de importância clínica, ser espalhado por transferência horizontal. Além deste ICE (ilha genômica),

outras ilhas foram identificadas que poderiam estar influenciando o fenótipo de persistência e espalhamento. Tais

ilhas carreavam genes de sistemas toxina-antitoxina, envolvidos com persistência e tolerância a drogas, e distintos

sistemas de secreção que podem estar diretamente envolvidos com secreção de toxinas, de DNA extracelular e

formação de biofilme. Ensaios in vitro estão em andamento para verificar algumas características envolvidas com o

fitness, como formação de biofilme, motilidade e produção de pigmento.

Além deste projeto principal, também estou inserida em outros projetos do LGMM relacionados a estudos

genômicos de bactérias como Bordetella pertussis e Neisseria meningitidis, cujas doenças associadas são

imunopreveníveis. No momento, estamos realizando a análise de um elemento genético do tipo ICE identificado pela

primeira vez em N. meningitidis. Tal elemento carreia genes que, de acordo com nossas análises, podem estar

impactando a patogenicidade e sucesso na transmissão e estabelecimento da doença meningocócica.

Palavras-chave: Genômica funcional; Resistoma; Mobiloma; Viruloma; Fitness adaptativo.

Estudo da apoptose eritrocitária na malária experimental: papel na patogênese da anemia grave

Paulo Renato Rivas Totino Laboratório de Pesquisa em Malária/IOC

A anemia grave é sem dúvida uma das complicações mais comuns da infecção malárica e é uma das principais responsáveis pela elevada taxa de mortalidade de crianças e mulheres grávidas em regiões endêmicas africanas. Apesar do impacto na saúde pública mundial, relativamente poucos estudos têm sido conduzidos para elucidar os mecanismos fisiopatológicos implicados na anemia da malária. Este fato contribui para o entendimento deficiente sobre essa manifestação clínica e, por conseguinte, reflete no desenvolvimento de estratégias preventivas que possam minimizar a sua morbiletalidade. Sabe-se, porém, que além da destruição dos eritrócitos parasitados e da diminuição da produção de novos eritrócitos devido à alterações na eritropoiese, a eliminação precoce de eritrócitos não parasitados tem importante contribuição para a patogênese da anemia da malária. Frente a esse fato e tendo em vista a já descrita susceptibilidade dos eritrócitos ao processo de apoptose que, inclusive, parece estar relacionado com a anemia de diversas patologias e pode ser induzido por componentes parasitários e da resposta imune do hospedeiro, nosso grupo se voltou para o estudo da apoptose eritrocitária na anemia grave associada à malária. Em nossos estudos iniciais na infecção experimental por P. yoelii 17XL foi possível evidenciar que há um aumento nos níveis basais de eritrócitos não parasitados em apoptose durante a fase da infecção marcada por uma redução acentuada no número de eritrócitos periféricos e que essa apoptose estava associada com a parasitemia (Totino et al., 2010). Entretanto, as elevadas cargas parasitadas alcançadas nessa infecção limitaram nossas análises concernentes à relação da apoptose com o desenvolvimento da anemia (Totino et al., 2013). De fato, na malária humana, cuja infecção cursa com parasitemias mais baixas, observamos recentemente que o plasma de pacientes com malária não complicada causada pelo mais patogênico dos plasmódios que acometem o homem, o P. falciparum, foi capaz de induzir apoptose in vitro em eritrócitos de indivíduos clinicamente sadios, indicando a possibilidade desse fenômeno ocorrer em quadros de anemia grave não relacionados às hiperparasitemias (Totino et al., 2014). Assim, no presente trabalho estudaremos a apoptose de eritrócitos maduros, bem como das células precursoras eritróides da

medula óssea, e sua relação com a anemia da infecção experimental por P. berghei ANKA em ratos Wistar – um modelo experimental de malária que, diferentemente da maioria das infecções murinas e similarmente à malária humana, cursa com baixos percentuais de parasitemia e, ainda assim, é marcado por uma anemia aguda com redução de até 60% dos níveis de hemoglobina. Para esse fim, serão conduzidas as seguintes estratégias: avaliar o percentual de apoptose de eritrócitos no sangue periférico, bem como de precursoras eritróides em seus diferentes estágios de desenvolvimento na medula óssea; verificar a atividade eritropoiética através da quantificação de reticulócitos periféricos; quantificar os níveis séricos de moduladores da apoptose eritrocitária, tais como anticorpos antieritrocitários, óxido nítrico, prostaglandina E2 e eritropoetina; investigar o perfil da resposta imune celular através do estudo de citocinas proinflamatórias e anti-inflamatórias presentes no plasma e na medula óssea e; relacionar os níveis de apoptose com a carga parasitária, o grau de anemia, o perfil da resposta imune e os níveis de moduladores da apoptose eritrocitária. Os resultados obtidos irão contribuir para um melhor entendimento da fisiopatogenia da anemia malárica e, consequentemente, para o embasamento de estudos direcionados ao desenvolvimento de estratégias com potencial atuação nas vias celulares envolvidas na anemia grave da malária, minimizando assim a morbiletalidade das populações residentes em áreas endêmicas.

Palavras-chave: malária; anemia; apoptose

Caracterização morfológica e molecular e avaliação da viabilidade e estabilidade de cepas de Fonsecaea pedrosoi preservadas por longos períodos na Coleção de Culturas de Fungos Filamentosos do Instituto Oswaldo Cruz - FIOCRUZ

Simone Quinelato - Coleção de Culturas de Fungos Filamentosos, LTBBF / IOC / FIOCRUZ.

As coleções biológicas constituem ferramentas vitais para o manejo e conservação da biodiversidade, agregando importantes informações sobre os organismos. Neste contexto, as coleções microbiológicas assumem considerável importância, pois são encarregadas da manutenção e disponibilização de organismos relevantes para a pesquisa científica, aplicações tecnológicas e atividades de ensino. O material preservado, por métodos adequados, nas coleções de cultura tem um amplo espectro de aplicações nas áreas de saúde, agropecuária, indústria e meio ambiente. Levando-se em consideração a demanda internacional para modernização das coleções biológicas, a incessante evolução da ciência e a necessidade por dados sobre as espécies depositadas, as coleções não podem se comportar apenas como depósitos de organismos. Devem ser centros de pesquisa, educação e conservação, garantindo a distribuição de material biológico com conformidade assegurada e gerando informações relevantes para a sociedade. Recentemente, o governo federal, no contexto da política de fortalecimento dos setores prioritários, criou o fundo que disponibilizará recursos para as atividades ligadas a biotecnologia. Nesta conjuntura, é cada vez maior a implantação de pólos biotecnológicos na cidade do Rio de Janeiro, também incentivados pela relevante atividade científica da cidade, devido suas importantes universidades e institutos de pesquisa. A estruturação de Centros de Recursos Biológicos (CRB) é essencial para o desenvolvimento biotecnológico do país. O objetivo da Rede CRB no Brasil é interligar instituições com competência reconhecida de forma a permitir ao país oferecer materiais biológicos, bem como informações sobre esses materiais, confiáveis e de qualidade. As atividades de acreditação e avaliação da conformidade promoverão a confiança e reconhecimento, no âmbito nacional e internacional. A política de desenvolvimento da biotecnologia, prevê a estruturação de Centros de Recursos Biológicos que operem como coleções prestadoras de serviço para fins de pesquisa e desenvolvimento. A política tem como objetivo, entre outros, o estabelecimento de ambiente adequado para o desenvolvimento de produtos e processos biotecnológicos inovadores e o estímulo a maior eficiência da estrutura produtiva nacional. Mas para tal, exige a reorganização da infraestrutura de conservação e distribuição de material biológico, a adequação de marcos legais, a capacitação dos quadros técnicos de serviços especializados e a gestão dos centros de produção e distribuição de material biológico. A Coleção de Culturas de Fungos Filamentosos (CCFF) do Instituto Oswaldo Cruz (IOC-FIOCRUZ) no Rio de Janeiro, foi criada em 1922 e representa uma das mais antigas coleções biológicas do país, destacando-se não apenas pelo tamanho de seu acervo, mas também por possuir cepas de importância histórica. Entre as importantes espécies que integram o acervo, encontram-se 58 cepas

de Fonsecaea pedrosoi, preservadas sob óleo mineral. Isoladas principalmente entre os anos 20 e 50, possuem grande importância para saúde pública, pois esta espécie é o principal agente etiológico da cromoblastomicose no mundo, sendo frequente no Brasil e acometendo os pacientes durante sua fase mais produtiva, tornando-os limitados para o trabalho e o convívio social. A CCFF, além de ser uma coleção de serviço, é também responsável por disponibilizar informações importantes para a comunidade científica e acadêmica. Há a necessidade de rastreamento das informações das cepas do acervo, além de assegurar a qualidade das cepas depositadas e cedidas. Devido a isso, torna-se de grande relevância a autenticação taxonômica do acervo e a introdução de métodos de conservação mais adequados para longos períodos de preservação. Desta forma, o presente projeto dará início ao processo de atualização do acervo da CCFF com as cepas de Fonsecaea pedrosoi integrantes do acervo. Para isso os objetivos deste projeto são: a) Reativação e avaliação da viabilidade, estabilidade e pureza das 58 cepas de Fonsecaea pedrosoi, preservadas sob óleo mineral, que integram o acervo da CCFF; b) Caracterização morfológica e molecular das cepas de F. pedrosoi; c) Comparação da viabilidade e estabilidade das cepas de F. pedrosoi em relação aos períodos de armazenamento; d) Preservação das cepas de F. pedrosoi por métodos de longo prazo, como a liofilização e a criopreservação, selecionando técnicas mais eficientes para este grupo de fungos. Os resultados obtidos servirão para atualizar e complementar o banco de dados SICol/FIOCRUZ, em relação a viabilidade, autenticação e métodos de preservação destas cepas, tornando estas informações disponíveis para a sociedade e contribuindo para a modernização e ampliação das atividades desenvolvidas nesta histórica coleção.

Palavras-chave: coleções biológicas; autenticação, métodos de preservação, Fonsecaea pedrosoi.

Análise da dinâmica de ativação de vias de sinalização envolvidas na modulação do citoesqueleto e entrada do Trypanosoma cruzi na célula

alvo.

Tatiana Galvão de Melo de Oliveira Laboratório de Ultraestrutura Celular/IOC

O reconhecimento receptor-ligante entre componentes da superfície do Trypanosoma cruzi

e da célula alvo é capaz de disparar vias de sinalização distintas favorecendo a entrada do parasito.

Proteínas tirosina quinases (PTKs) estão envolvidas em diferentes mecanismos de invasão,

independente ou dependente do citoesqueleto da célula hospedeira. Recentemente,

demonstramos que quinase de adesão focal (FAK), uma PTK envolvida no remodelamento de actina,

desempenha importante papel na invasão do T. cruzi em cardiomiócitos (Melo et al., 2014). A

ativação de FAK foi deflagrada pela elevação dos níveis de FAK fosforilada (p-FAKTyr397) associada ao

aumento da expressão de Src total e fosforilada (p-Src), demonstrando a participação do complexo

FAK/Src na entrada do T. cruzi. A aplicação da ferramenta de modulação negativa de FAK por siRNA

ou por transfecção de células utilizando sistema de repressão por tetraciclina resultou na inibição

da invasão do T. cruzi. A descrição desta nova via de sinalização envolvida no processo de invasão

abre novos questionamentos sobre os atores protagonistas deste evento (receptor-ligante) e a

dinâmica de atuação de FAK associado a outras vias de sinalização que modulam o citoesqueleto de

actina. Assim, este estudo visa avaliar o papel da interação proteoglicanos de heparam sulfato

(PGHS) - proteínas de ligação à heparina (PLHs) no disparo da via de sinalização de FAK e ainda,

determinar se tripomastigotas de T. cruzi de diferentes genótipos e estágios de infecção ativam FAK

durante processo de invasão. Outra abordagem refere-se ao entendimento da dinâmica entre a

ativação de FAK e sua interface com vias de sinalização envolvidas na modulação do citoesqueleto,

incluindo Rho GTPases, IP3K e ainda uma proteína estrutural, cortactina, presente na ativação

destas vias.

Dados preliminares revelam que tripomastigotas metacíclicos não são capazes de levar a

ativação de FAK durante o seu processo de invasão contrastando com os níveis elevados de FAK

fosforilada (p-FAKTyr397) revelados na entrada de tripomastigotas de diferentes genótipos

provenientes de cultura de células. Esse mecanismo de entrada pode ser modulado pelo

reconhecimento PGHS-PLHs uma vez que a remoção de GAGs através do tratamento com p-

nitrofenil-beta-D-xilosideo (pnx) ou remoção de Heparam sulfato da superfície celular por

heparinase, acarreta em uma redução de 30% e 35% na ativação de FAK, respectivamente, quando

comparado ao controle na presença ou ausência dos tratamentos. Ainda, o uso de células de ovário

de hamster deficientes em glicosaminoglicanos (CHO-745) corrobora a importância da participação

de PGHS como modulador da entrada do parasita e ativação da via de FAK, uma vez que a não

ativação de FAK nesse tipo celular contrasta com o aumento em torno de 30% nos níveis de

fosforilação dessa PTK durante processo de invasão do T. cruzi nas células competentes (CHO-K1).

A relevante participação de FAK na dinâmica de actina ativando diferentes vias de

sinalização tem apontado FAK como molécula chave em diversos processos biológicos, incluindo a

invasão por diferentes patógenos. Acreditamos que o mapeamento das moléculas envolvidas no

disparo da ativação de FAK possa contribuir para o melhor entendimento deste mecanismo de

invasão pelo T. cruzi e auxiliar na detecção de alvos potenciais para terapia na doença de Chagas.

Palavras-chave: Trypanosoma cruzi, cardiomiócitos, sinalização celular, quinase de adesão focal.

Antioxidantes e drogas tripanocidas para o controle do parasitismo e da

cardiomiopatia chagásica

Kelly Salomão Salem

Laboratório de Biologia Celular – LBC/IOC

A doença de Chagas, causada pelo Trypanosoma cruzi, é uma das 17 doenças tropicais negligenciadas, sendo endêmica na América Latina com cerca de 6 milhões de pessoas infectadas com o T. cruzi. Nos últimos 30 anos a doença de Chagas vem emergindo em países não endêmicos, fenômeno conhecido como a “globalização da doença” devido a migração de indivíduos infectados das áreas endêmicas para a América do Norte, Europa, Ásia e Austrália, onde a transmissão se dá pela via congênita, transfusional e por transplante de órgãos. A terapia para a doença de Chagas se mantém a mesma desde a introdução do benznidazol e nifurtimox nas décadas de 60 e 70. Apesar destes nitroderivados serem efetivos no tratamento de infecções agudas, nos casos congênitos e nas infecções crônicas recentes, a eficácia do tratamento varia de acordo com a área geográfica, sendo a maior limitação a menor eficácia na fase crônica. A gravidade desta doença está principalmente associada a danos cardíacos, manifestação mais séria na doença crônica. Evidências mostram que o estresse oxidativo, resultante do aumento da produção de radicais livres, tem um importante papel na patogênese de doenças cardíacas, podendo levar a processos inflamatórios e, em consequência, a danos teciduais. Dados da literatura revelaram que a infecção pelo T. cruzi é capaz de reduzir o potencial mitocondrial da célula, assim como induzir a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS), produzindo assim um estresse oxidativo persistente; e além disso, a infecção reduz a expressão e altera a distribuição de proteínas importantes na manutenção da adesão focal, sítios de associação célula-matriz extracelular. Há relatos in vitro e in vivo demonstrando desarranjo da distribuição costamérica de vinculina em células musculares cardíacas levando a um desalinhamento de discos intercalares entre as fibras, podendo levar à instabilidade mecânica do músculo cardíaco , impossibilitando a propagação normal de impulso cardíaco e a eficiência do órgão. Estudos relatam o comprometimento de junções intracelulares, durante a infecção pelo T. cruzi, com alteração no padrão de distribuição destas e “down regulation” de proteínas de junções aderentes, como N-caderina e β-catenina, bem como de conexinas , importantes na transmissão do impulso elétrico durante mecanismo de contração celular. Neste contexto, este projeto tem como objetivo a avaliação de novos compostos ativos sobre T. cruzi e da combinação potencial de benznidazol e outros compostos com substâncias antioxidantes, neste

caso visando a inibição de processos de injúria oxidativa. Esta combinação pode representar um protocolo terapêutico alternativo na busca de minimizar os efeitos colaterais e/ou modular a resposta antioxidante envolvida nos distúrbios cardíacos causados na infecção pelo T. cruzi. Esses novos compostos estão sendo sintetizados por colaborações já estabelecidas com grupos do Departamento de Síntese de Fármacos (Farmanguinhos/Fiocruz), do Instituto de Química da UFF e da UFRJ dentro de um programa interdisciplinar de pesquisa visando o desenvolvimento de novos medicamentos para a doença de Chagas. Primeiramente, será realizada a triagem in vitro dos novos compostos sobre tripomastigotas e amastigotas intracelulares assim como a toxicidade para células de mamíferos. Os compostos mais ativos serão avaliados quanto ao mecanismo de ação estudado por microscopia eletrônica, citometria de fluxo, ensaios de respirometria; visando identificar organelas-alvo e metabólitos gerados pelo tratamento. Além da avaliação sobre o parasito, iremos avaliar as possíveis reversões de danos estruturais causados pelo parasito em culturas de células de mamíferos com o tratamento destas com antioxidantes e/ou com os agentes tripanocidas. Estes compostos também serão administrados a camundongos Swiss Webster infectados para avaliação da parasitemia, peso corporal, taxa de mortalidade e taxas bioquímicas desses animais. Alguns dos compostos que já estão sendo investigados são inibidores da biossíntese de ergosterol, especificamente de uma das enzimas associadas a biossíntese de esteróis, a C14α-esterol demetilase (CYP51), que que catalisa a remoção do grupo metila no C14 do lanosterol. Uma vez que T. cruzi necessita de ergosterol para o desenvolvimento do seu ciclo celular, a biosíntese de esteróis é uma das vias alvo para o desenvolvimento de novas drogas. Dois inibidores da CYP51, o posaconazol e ravuconazol, foram capazes de curar animais experimentais nas fases aguda e crônica. Porém, quando submetidos a ensaios clínicos de fase II para o tratamento de pacientes crônicos, tiveram resultados desapontadores quando empregados em esquemas de monoterapia, provavelmente devido a baixa biodisponibilidade oral em humanos. Com isso, novos derivados triazólicos foram sintetizados a partir do posaconazol e fluconazol, mantendo o grupamento farmacofórico e otimizando parâmetros farmacocinéticos. Estes derivados foram obtidos com baixo custo de síntese e , apresentaram uma atividade anti-T. cruzi, superior à de fluconazol e de benznidazol, sobre formas amastigotas e tripomastigotas da cepa Tulahuen. Nos testes com a cepa Y, alguns compostos apresentaram atividade sobre tripomastigotas, sendo porém menor do que para a cepa Tulahuen, podendo esta diferença estar relacionada à suscetibilidade da cepa ou ainda do estágio evolutivo do parasito, uma vez que a maioria dos parasitos presentes no teste com a cepa Tulahuen é a forma amastigota intracelular. Resultados preliminares mostram que os compostos testados apresentam seletividade pelo parasito, incentivando a continuidade de estudos in vitro e in vivo. Pretendemos com o desenvolvimento deste estudo contribuir para o avanço do conhecimento sobre a doença de Chagas e o desenvolvimento de novas drogas para o seu tratamento.

Palavras-chave: Trypanosoma cruzi, doença de Chagas, quimioterapia, CYP51, inibidores da biossíntese de ergosterol.

Desenvolvimento de métodos computacionais inovadores para o estudo do

impacto da diversidade produzida por eventos de splicing alternativo e de

INDELs na sequência de proteínas.

Fabio Passetti

Laboratório de Genômica Funcional e Bioinformática, Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz

(Fiocruz).

A bioinformática pode auxiliar na caracterização experimental de genes, transcritos e proteínas que

ainda não estejam descritos em bancos de dados. Sabe-se que mais que 90% do genoma humano produz

transcritos decorrentes do processamento alternativo de seus mRNAs em alguma etapa do ciclo de vida de

uma célula. Diferentes iniciativas de bioinformática produziram repositórios de proteínas hipotéticas oriundas

de eventos de splicing alternativo que são eventualmente utilizados também para a anotação de

experimentos de larga escala de proteômica. Entretanto, há sempre uma fração dos peptídeos obtidos

experimentalmente que ainda não são identificados nos repositórios de referência de proteômica, sendo eles

potencialmente produzidos por transcritos processados alternativamente ou oriundos de alterações na

sequência do genoma. Com o advento de sequenciadores de alta vazão, transcriptomas completos podem ser

analisados com maior grau de resolução e os métodos para detecção de novas variantes de splicing

aumentou consideravelmente nos últimos 10 anos. Desta forma, este projeto tem como primeiro objetivo

desenvolver uma abordagem computacional que auxilie na identificação de variantes por splicing alternativo

em dados de proteoma. Não obstante, há um tipo de variação de sequência que pode ser confundido como

um evento de splicing alternativo, apesar de ser uma inserção ou deleção na sequência do genoma (INDEL).

Assim, um polimorfismo no DNA pode produzir um transcrito que pode ser confundido com o processamento

alternativo de um mRNA. Sabe-se que os íntrons são geralmente sequências longas removidas durante o

evento de splicing. Os menores íntrons humanos conhecidos possuem 87 pares de bases e foram

identificados nos dados de sequenciamento das populações do projeto 1000 Genomes. O impacto funcional

de uma INDEL menor que 100 nucleotídeos pode estar associado à produção de transcritos alternativos a

partir de modificações em sítios de splice, bem como modificar nucleotídeos da região codificadora de

proteínas com potencial para alterar os aminoácidos codificados e mudar a fase de leitura da tradução.

Frequentemente, a identificação de INDELs ocorre a partir de dados de sequenciamento de DNA. Entretanto,

na última década, dados de transcriptoma foram extensamente produzidos e são mais abundantes do que

dados de sequenciamento de genomas. Assim, como segundo objetivo deste projeto, usaremos dados de

transcriptoma para identificar novas INDELs genômicas com tamanho menor do que 100 nucleotídeos e o seu

impacto na sequência das proteínas. Desta forma, este projeto de pesquisa pretende usar dados públicos ou

de acesso controlado de transcriptomas (RNA-Seq) de amostras normais e de doenças humanas para

investigar o impacto de eventos de splicing alternativo no transcriptoma e de INDELs na sequência de

proteínas. Assim, este projeto poderá contribuir para o descobrimento de novos biomarcadores, auxiliando

no acompanhamento de patologias e também para o desenvolvimento de novas ferramentas de diagnóstico.

Palavras-chave: bioinformática, splicing alternativo, INDEL, proteoma

Taxonomia integrativa dos vetores da doença de Chagas (Hemiptera; Reduviidae; Triatominae)

Carolina Branco Dale Coutinho Laboratório de Biodiversidade Entomológica – LABE/IOC

Descoberta em 1909, a doença de Chagas (DC) é uma infecção que tem como agente etiológico o Trypanosoma cruzi. A principal forma de transmissão ao homem e outros mamíferos é através das fezes infectadas de insetos vetores da Subfamília Triatominae (Hemiptera; Reduviidae), popularmente conhecidos como barbeiros.

A subfamília Triatominae está composta 148 espécies descritas dividida em cinco tribos (Alberproseniini, Bolboderini, Cavernicolini, Rhodniini e Triatomini), 18 gêneros, sendo Rhodnius, Triatoma e Panstrongylus os mais epidemiologicamente revelevantes.

No Brasil, após o controle da principal espécie vetora, o Triatoma infestans (Klug, 1834), espécies que antes eram consideradas primariamente silvestres e de pouca importância epidemiológica, vem sendo frequentemente encontradas, tanto em domicílios quanto em peridomicílios, aparecendo como potencias transmissores da DC no país. Apesar do sucesso dos programas de controle, esta doença ainda é considerada de caráter socioecoômico, sendo a quarta principal endemia das Américas, estimando-se que afete entre 6 e 7 milhões de pessoas e que mais de 25 milhões estejam em áreas de risco.

Devido à ausência de vacinas e de drogas mais efetivas, os programas de controle permanecem fundamentados no combate da transmissão vetorial através de ações químicas e de ações físicas. Porém, estas medidas não obterão êxito se empregadas isoladamente. É preciso investir na elaboração de novos planos de vigilância e controle baseados na correta identificação dos vetores, que podem ser encontrados tanto no ambiente silvestre, como em processo de domiciliação e também ocasionalmente invadindo esses ambientes.

Apesar de existirem estudos descritivos de diversas espécies de triatomíneos, algumas espécies não apresentam caracteres suficientes para fácil diagnose. Procurando esclarecer a identidade taxonômica de algumas dessas espécies recentemente, alguns autores passaram a utilizar uma combinação de diferentes técnicas, como a morfometria tradicional, morfometria geométrica, microscopia eletrônica de varredura, sequenciamento de genes mitocondriais e nucleares e a cromatografia acoplada à espectrometria de massas na análise de hidrocarbonetos cuticulares conhecida como taxonomia integrativa. Esta abordagem auxilia na identificação de espécies (sobretudo crípticas), permite o mapeamento da biodiversidade, funcionando como uma ferramenta auxiliar na taxonomia clássica.

O presente trabalho tem como objetivo analisar e comparar, através da taxonomia integrativa diferentes espécies da subfamília Triatominae, a fim de contribuir na identificação e caracterização desses vetores, visando a utilização destes dados para avaliação do risco da reinstalação da DC em diferentes localidades do Brasil, e no aprimoramento dos planos de vigilância entomológica.

Palavras-chave: Taxonomia, morfometria, hidrocarbonetos cuticulares, triatominae, doença de Chagas.

Diversidade e plasticidade dos parasitos do gênero Leishmania e a epidemiologia das leishmanioses

Mariana Côrtes Boité Laboratório de Pesquisa em Leishmaniose - LPL

A ideia de diversidade está ligada aos conceitos de pluralidade, multiplicidade, diferentes ângulos de visão ou

de abordagem, heterogeneidade e variedade. Já a plasticidade é a propriedade de sofrer modificações diante

de distintas forças. Esses conceitos são aplicados em diferentes áreas de estudo, da antropologia à química, e

também na parasitologia. Os parasitas do gênero Leishmania representam estes conceitos muito

efetivamente. A sua diversidade inter e intraespecífica é apontada como um dos responsáveis pelo cenário

pleomórfico das leishmanioses, uma vez que existe, por exemplo, associação parcial entre a espécie infectante

e forma clinica. A diversidade pode ser caracterizada tanto pelas variações biológicas observadas entre as cepas

do parasito – tropismo tissular, crescimento em cultura, infectividade em modelos animais ou em cultura de

células – como pelas variações genéticas - polimorfismos detectados nas sequencias nucleotídicas de distintas

regiões do genoma entre as diferentes cepas. Essas observações são parte da justificativa para o elevado

número de espécies descritas para o gênero.

A capacidade de infectar diferentes ordens de mamíferos, de espécies de flebotomíneos em biomas variados,

mostram também o quão plástico este parasito é. A plasticidade fenotípica consiste na capacidade dos parasito

de alterar a sua fisiologia ou morfologia de acordo com as condições do ambiente. Também pode ser definida

como a habilidade de um genótipo produzir mais de um fenótipo quando exposto a diferentes ambientes.

Recentemente Sterkers et al., (2011) caracterizaram um padrão incomum na estrutura do genoma das

leishmânias que pode oferecer uma explicação para esta plasticidade: o mosaico aneuploide. As diferentes

células parasitárias de uma cepa (geradas principalmente por bipartição clonal) apresentam seus cromossomos

homólogos organizados em números variados, e este padrão pode mudar tanto entre cepas e quanto para uma

mesma cepa, sob condições diferentes (whole chromossome copy number variation – CNV). Este mosaico

cromossômico pode ter importante papel na plasticidade fenotípica sem que seja detectado por estudos

utilizando o sequenciamento de DNA baseado em tecnologia Sanger. Ou seja, genomas sem diferenças

significativas na sequencia nucleotídica podem diferir estruturalmente, no conteúdo cromossômico e gênico.

Apesar de uma divergência estimada em 20 a 100 milhões de anos, o conteúdo gênico entre as espécies de

Leishmania é muito conservado, com espécies do Velho e Novo Mundos contendo número similar de

cromossomos haplóides (36 e 35 ou 34 respectivamente) e sequenciamento do genoma mostrando poucos

genes espécie específicos. Assim, é relevante compreender a diversidade e a origem da plasticidade do parasito

e como - na complexa relação com o hospedeiro humano - estas características contribuem para as distintas

formas clínicas e respostas ao tratamento observadas.

Estudos de filogenia molecular e estudos de genética de população de distintas cepas - junto aos seus dados

epidemiológicos – são elaborados para compreender a relação evolutiva e buscar possíveis correlações entre

genótipos e origens geográficas e/ou manifestações clinicas/respostas ao tratamento. Tal abordagem

contribuiu e continua contribuindo para a epidemiologia molecular das leishmanioses, mas não encontrou

ainda genótipos que sejam marcadores associados à formas clínicas especificas ou eventos de resistência

terapêutica. A razão disto pode estar i) nas peculiaridades do genoma do parasita. Uma vez que as análises

citadas são baseadas principalmente em sequencias nucleotídicas, as peculiaridades genéticas, como o mosaico

aneuploide, afetam os dados obtidos e a capacidade de associação entre genótipos e dados epidemiológicos

sem que sejam detectadas. ii) Os estudos moleculares citados são feitos com as formas promastigotas de cepas

isoladas e mantidas em cultura, que não sabemos se representam os parasitas que circulam na natureza ou se

apresentam mudanças inerentes do processamento in vitro. É diante desse cenário que os objetivos gerais

desta proposta podem ser resumidos na seguinte tríade: i) confirmar se cepas isoladas e mantidas em cultura

em várias passagens (como formas promastigotas) mantêm em seu genoma as mesmas características -

estruturais e nucleotídicas - das respectivas amastigotas que infectaram o hospedeiro mamífero; ii)

caracterização in vivo e in vitro do fenótipo clínico associado às cepas; iii) Interpretação dos resultados no que

se refere ao impacto destas peculiaridades nos estudos filogenéticos e de genética de populações e nas

possíveis associações das alterações estruturais do genoma do parasita com a eco-epidemiologia das

leishmanioses.

Palavras-chave: Leishmania; diversidade genética; plasticidade fenotípica.

Isolamento, caracterização biológica e genética de Toxoplasma gondii em infecções humanas, animais silvestres e surto epidêmico em diferentes regiões

do Brasil

Edwards Frazão Teixeira Laboratório de Biologia Estrutural – LBE/IOC

Resumo: A toxoplasmose é uma doença parasitária de animais de sangue quente e de seres humanos, tendo

como agente etiológico o protozoário Toxoplasma gondii, que já foi detectado em todos os continentes. Com

tropismo pelo tecido muscular e sistema nervoso central, o parasito pode causar graves sequelas,

especialmente em indivíduos imunocomprometidos ou fetos de gestantes primo-infectadas. Neste último

caso, não são raras as ocorrências de abortamentos ou má formações congênitas, variando de severidade de

acordo com o período de gestação em que a mulher se infectou. No entanto, ao comparar manifestações

clínicas da toxoplasmose humana em países da Europa e do Brasil, percebe-se maior severidade nos casos

clínicos em nosso país , o que permite levantar a hipótese de maior patogenicidade das cepas brasileiras. De

fato, T. gondii foi inicialmente classificado em três linhagens genéticas clonais com diferentes graus de

patogenicidade a camundongos. Pesquisas recentes comprovaram essa predominância clonal na Europa, Ásia,

África e América do Norte, mas verificaram que a estrutura populacional genética do parasito é altamente

diversa na América do Sul, especialmente no Brasil. Ainda, casos fatais de toxoplasmose em indivíduos

imunocompetentes foram associados a infecção por cepas silvestres na Guiana Francesa, o que reforça a

necessidade de se investigar o intercâmbio de cepas entre o meio urbano e o silvestre. Neste contexto, nosso

grupo de pesquisa no Laboratório de Biologia Estrutural consolidou parcerias estratégicas com o intuito de

atender às duas principais lacunas existentes no estudo deste parasito no Brasil por meio do isolamento de

cepas viáveis em: 1) seres humanos e, 2) animais silvestres – visando estudos de caracterização biológica e

genética. Para o isolamento de cepas envolvidas em infecções humanas foram estabelecidas duas

importantes parcerias: com o Instituto Fernandes Figueira/Fiocruz e outra com o Hospital Naval Marcílio Dias,

que atendem casos de gestação de risco. O objetivo é identificar manifestações clínico-laboratoriais sugestivas

de toxoplasmose congênita e submeter amostras do líquido amniótico ou placentas destas pacientes à prova

biológica em camundongos para isolamento de cepas viáveis e então caracterizá-las biológica e

geneticamente. Paralelamente, os registros das principais manifestações clínicas do feto/bebê permitirão

realizar estudos correlacionais para identificação da influência genotípica na toxoplasmose humana no Brasil.

A parceria com o IFF/Fiocruz já está em andamento e, em seis meses de pesquisa, amostras de líquido

amniótico de cinco pacientes suspeitas foram analisadas. Apesar do insucesso do isolamento de cepas viáveis,

o DNA de T. gondii foi identificado em uma das amostras através da técnica de PCR. Aplicando-se PCR em

tempo real, pôde-se verificar que havia uma carga parasitária baixa no referido líquido amniótico. Para o

isolamento de cepas silvestres, estabelecemos parceria com o Laboratório de Biologia e Parasitologia de

Mamíferos Silvestres Reservatórios/IOC/Fiocruz. A pesquisa consiste, inicialmente, no levantamento das

principais espécies de pequenos mamíferos silvestres soropositivos para anticorpos anti-T. gondii em

unidades de conservação de diferentes regiões do Brasil e então submeter os tecidos dos animais positivos à

prova biológica em camundongos para isolamento. Até o momento foram analisados soros de 122 animais de

reservas de três estados brasileiros: Rio de Janeiro, Paraíba e Acre. Vinte e oito espécimes dentre os 72

analisados da Amazônia acreana estavam soropositivos (38,9%), indicando a circulação do T. gondii no meio

ambiente acreano e a participação de mamíferos de hábitos terrestres e arborícolas no ciclo deste parasito.

Uma nova expedição ao Acre está programada para o final de 2015 e ampliará a amostragem sorológica e a

coleta de tecidos dos animais soropositivos que serão submetidos à prova biológica em camundongos na

tentativa de isolamento e posterior caracterização dos perfis biológico e genético dos parasitos circulantes.

Nosso grupo de pesquisa ainda colabora com pesquisadores da Unicamp na investigação das fontes de

infecção no surto de toxoplasmose humana ocorrido no município de São Marcos, RS, nos meses de janeiro e

fevereiro de 2015. O parasito foi detectado em tecidos cárneos bovinos suspeitos e, no momento, as

amostras estão sendo submetidas à técnica MLST (Multi-locus Sequencing Typing) para classificação

genotípica das cepas envolvidas. Um desdobramento natural das linhas de pesquisa iniciadas em 2015 será a

inclusão da abordagem da inter-relação genotípica das cepas isoladas de seres humanos e de animais

silvestres e as principais linhagens envolvidas em casos clínicos severos de toxoplasmose humana. Por fim, a

longo prazo pretende-se colaborar substancialmente para a identificação da estrutura populacional genética

do parasito no Brasil e, futuramente, a partir da construção no laboratório de uma coleção biológica de cepas

de diversas fontes, oferecer subsídios para pesquisas sobre melhores estratégias de controle e tratamento da

toxoplasmose no país.

Palavras-chave: Toxoplasma gondii, genotipagem, sequenciamento, mamíferos silvestres, líquido amniótico.

Pesquisa de Rickettsia, Ehrlichia, Anaplasma, Borrelia e Babesia em carrapatos (Acari: Ixodidae) coletados de mamíferos silvestres nos estados de Mato Grosso Sul, Paraná, Santa Catarina e.

Autores: Maria Ogrzewalska#, Renata Carvalho Oliveira#, Bernardo Rodrigues Teixeira*, Alexandro Guterres#, Liana Strecht#, Carolina Moreira Blanco#, Gisélia Burigo Guimarães Rubio©, Suzana Zeccer◊, Rivaldo Venâncio®, Cibele Bonvicino*, Paulo Sérgio D’Andrea*, Elba Regina Lemos# #Laboratório de Hantaviroses e Rickettsioses, Instituto Oswaldo Cruz/IOC *Lab. de Biologia e Parasitologia de Mamíferos Silvestres Reservatórios, Instituto Oswaldo Cruz/IOC ©Secretaria Estadual de Saúde do Paraná ◊ Secretaria Estadual de Saúde de Santa Catarina ® Universidade Federal de Mato Grosso do Sul

Devido às mudanças causadas pela humanidade sobre os ambientes naturais, nas quatro últimas décadas tem se observado a emergência de várias doenças patogênicas infecciosas que representam consideráveis ameaças globais para a saúde humana e à vida selvagem tornando necessário o melhor entendimento da biologia,

ecologia e das relações entre os patógenos e seus hospedeiros invertebrados e vertebrados. Entre as doenças infecciosas emergentes, a maioria é zoonoses causadas por patógenos transmitidos por vetores artrópodes como carrapatos (Acari: Ixodidae). Até 2001, a bactéria Rickettsia rickettsii, agente etiológico da febre maculosa brasileira, era o único agente transmitido por carrapatos no Brasil, no entanto, nos últimos 14 anos, várias outras espécies de Rickettsia foram descritas. Apesar do crescente número de estudos sobre epidemiologia de febre maculosa e dos carrapatos no Brasil, ainda existe também a necessidade de se investigar a presença de outros patógenos transmitidos por carrapatos que, conhecidos por causar doenças em seres humanos no mundo, já foram identificados em animais silvestres e domésticos e nos carrapatos em nosso território. No período de 2005 a 2010 foram coletadas amostras de ectoparasitos de pequenos mamíferos silvestres nos vários locais nos estados de Paraná, Santa Catarina e Mato Grosso do Sul. O objetivo do projeto é estudar a epidemiologia dos vetores e dos agentes envolvidos com enfase na identificação morfológica dos carrapatos coletados e na detecção de infecção dos patógenos do gênero Rickettsia, Ehrlichia, Anaplasma, Borrelia e Babesia através de métodos moleculares (PCR). No total foram analisados 62 carrapatos de roedores (Oligoryzomys nigripes, Akodon montensis, Euryoryzomys russatus, Nectomys squamipes, Thaptomys nigrita) e de marsupiais (Monodelphis dimidiate, Didelphis albiventris). Pelo menos cinco espécies de carrapatos foram identificados: Amblyomma fuscum, Amblyomma dubitatum, Amblyomma ovale, Ixodes fuscipes, Ixodes schulzei e Ixodes spp. Na pesquisa de patógenos pela PCR, não foi detectado DNA genômico dos patógenos procurados, exceto de cinco amostras de Ixodes encontrados parasitando M. dimidiate do estado Paraná. Esses carrapatos foram infectados com uma nova cepa de Rickettsia do grupo de febre maculosa, filogenicamente próxima com Rickettsia monacensis, conhecida como patógeno humano na Europa e anteriormente reportada infectando os carrapatos do gênero Ixodes na Europa. Esses fatos indicam que a nova Rickettsia spp. descoberta apresenta um potencial patogênico para os seres humanos no Brasil.

Palavras-chave: carrapatos, zoonoses, Ixodes, rickettsioses, vida silvestre

Eomesodermin Regulates the Early Activation of Alloreactive CD4 T cells and Is Critical for Both GVH and GVL Responses

Bárbara Du Rocher*,1,2

, Odette Smith*,1

, Andrew M. Intlekofer1, Jarrod A. Dudakov

1, Emily Levy

1, Fabiana

Kreiners1, Steven Reiner

3, Eliana Abdelhay

2, Marcel van den Brink

**,1, Alan M. Hanash

**,1

1. Department of Medicine, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, NY; 2. Centro de Transplante de Medula Óssea, Instituto Nacional de Câncer, Rio de Janeiro, Brazil; 3. Columbia University, New York, NY * Contributed equally to this work ** Contributed equally to this work Corresponding authors: barbaradurocher@inca.gov.br and hanasha@mskcc.org

Despite increasing insights into its immunobiology, graft vs host disease (GVHD) remains a major obstacle for successful allogeneic hematopoietic stem/progenitor cell transplantation (allo-HCT). Separation of GVHD from graft vs. leukemia/lymphoma (GVL) responses also remains an elusive goal for allo-HSCT. Efforts to delineate the transcriptional networks regulating T cell differentiation post-HCT have suggested that multiple transcription factors may be involved in the regulation of alloreactive helper T (Th) cells and GVHD. However, conflicting data have emerged regarding the role of Th1 and Th17 pathways, and it remains unclear which transcription factors mediate the early activation of alloreactive T cells necessary for subsequent GVHD development.The T-box transcription factor eomesodermin (Eomes) cooperates with T-bet to regulate CD8 T cell cytotoxic function, IFNy production, and memory cell formation. Recently, a role for Eomes in CD4 Th cell polarization has been described as well.

In order to evaluate the role of Eomes in T cell function in the context of allo-HCT, we used a MHC-disparate mouse model(C57BL/6 into BALB/c) with T cell depleted donor bone marrow (TCD-BM) and wild-type (WT) or Eomes knock out (KO) donor T cells. Recipients were conditioned with lethal total body irradiation.Eomes deficiency in donor T cells led to a significant reduction in GVHD mortality (Fig 1, p<.001),morbidity (p<.001), and intestinal pathology (p<.05, colon). Notably, Eomes KO T cells exerted significantly less GVHD mortality than T-bet KO T cells (Fig 1, p<.001). Given the reduced gastrointestinal (GI) GVHD observed with Eomes KO T cells, we next analyzed the expression of homing molecules

important for T cell migration to the GI tract. Consistent with reducedGI GVHD, we detected reduced expression of α4β7 integrinon Eomes KO donor CD8 T cellsone week post-HCT.We also observed an increase in the proportion and absolute numbers of Foxp3+ regulatory T cells, as well as a decrease in expression of T-bet in mesenteric lymph nodes (MLNs).Moreover, we found decreased production of IFNy byEomes KO donorCD4 T cellstwo weeks (spleen and MLN, p<.001) and three weeks (spleen, p<.01)post-HCT without a comcomitant increase in IL-17. We also found increased IL-4 production by Eomes KO CD4 T cells two weeks post-HCT (MLN, p<.05), indicating a shift from Th1 to Th2 polarization in the absence of Eomes. Strikingly, one of the greatest differences we observed between WT and EomesKO donor T cells was impaired early activation of CD4 T cells; Eomes deficiency was associated with reduced proliferation (p<.001), reduced expression of CD25(p<.001, spleen; p<.001, MLN), and increased expression of CD62L (p<.01, spleen; p<.001, MLN) in CD4 T cells within the first 72 hours post-HCT (Fig 2).

In order to determine if Eomes was important for T cell-mediated GVL responses, we performed allo-HCT in the presence of A20 lymphoma cells. Despite the reduction in GVHD mortality as described above, A20 tumor challenge led to increased mortality in recipients of Eomes KO T cells, indicating that Eomes was also critical for effective GVL function. Given the importance of Eomes in early alloactivation of CD4 T cells, we evaluated if the impaired GVL function was due to an intrinsic CD8 defect or lack of CD4 help. B6 TCD-BM was transplanted into BALB/c recipients along with either WT or Eomes KO CD4 or CD8 T cells. Eomes deficiency in both CD4 and CD8 T cells again led to significant mortality, but HCT with Eomes KO CD4 T cells and WT CD8 T cells led to the greatest survival due to less GVHD and intact GVL (Fig 3), suggesting that Eomes is essential for intrinsic CD8 function during GVL, but not for CD4 help.

In summary, we identified distinct requirements for Eomes in CD4 versus CD8 T cells in the context of allo-HCT. Eomes regulatedmultiple aspects of CD4 T cell function following allo-HCT, including early activation, cytokine production, and gut trafficking.The multifacted functions of Eomes in CD4 T cells likely explain its requirement forGVHD. In contrast,Eomes deficiency in CD8 T cells led to impaired GVL, consistent with its established importance for cytotoxic CD8 T cell differentiation. To our knowledge, this is one of the first descriptions of a transcription factor necessary for effective GVL capacity.Our results suggest that selective manipulationof Eomes functionin T cell subsets may be useful for both limiting GVHD and enhancing GVL.

Key-Words: EOMES, GvHD, GvL.

Influência do regime alimentar, idade e ambiente na diversidade da microbiota

intestinal de Ae. aegypti

Mariana Rocha David, Ana Carolina Paulo Vicente, Rafael Maciel de Freitas Laboratório de Mosquitos Transmissores de Hematozoários – LATHEMA/IOC

A microbiota intestinal influencia aspectos da biologia do Aedes aegypti, incluindo a susceptibilidade a arbovírus, como o dengue. Entretanto, para compreender o papel da comunidade bacteriana intestinal na capacidade vetorial dos mosquitos é fundamental investigar os fatores os quais determinam a sua composição, bem como a sua dinâmica ao longo da vida destes insetos. Assim, um experimento de marcação-soltura-recapura (MSR) foi realizado em uma área endêmica para dengue no Rio de Janeiro com a finalidade de investigar os efeitos do regime alimentar, da idade e do ambiente na diversidade da microbiota de Ae. aegypti.

Fêmeas da geração F1 da população local de mosquitos foram soltas e recapturadas após dispersarem-se no ambiente, onde alimentaram-se em fontes naturais de sangue e carboidratos. A microbiota de fêmeas recapturadas 2,4,6,7 e 8 dias após a soltura foi comparada àquela de (a) fêmeas jovens (3 dias pós-emersão)

mantidas no laboratório com alimentação açucarada, (b) fêmeas jovens mantidas no laboratório com alimentação açucarada e sanguínea, (c) fêmeas de 38 dias pós-emersão (senis) mantidas no laboratório com alimentação açucarada e (d) fêmeas selvagens, oriundas de criadouros naturais. A maioria das fêmeas (~80%) foi recapturada com traços de sangue no intestino, por isso apenas indivíduos nesta condição foram utilizados nas análises. A diversidade da microbiota foi identificada ao nível de família ou gênero através do sequenciamento de alto desempenho da região V3-V5 do 16S rDNA (~270pb). Adicionalmente, bactérias foram isoladas do intestino médio e identificadas com base na morfologia e sequência do 16S rDNA (~400 pb).

Através do sequenciamento de alto desempenho, 32, 23, 24, 25, e 30 taxa bacterianos foram identificados na microbiota das fêmeas recapturadas no MSR, jovens alimentadas com açúcar, jovens alimentadas com sangue, senis e selvagens, respectivamente. No total, ~46% dos taxa bacterianos identificados foram detectados em todos os grupos de Ae. aegypti. Pseudomonas foi o gênero mais abundante na maioria das amostras, abrangendo até ~70% da microbiota. Considerando os taxa com abundância relativa superior a 2%, a composição da microbiota das fêmeas recapturadas nos diferentes momentos do MSR não foi diferente daquela de fêmeas jovens do laboratório, alimentadas com açúcar ou sangue, e de fêmeas selvagens. Isto sugere que a composição da microbiota é independente do ambiente e do regime alimentar, sendo determinada após a emersão do adulto e estável nas primeiras semanas de vida do Ae. aegypti. A aplicação de bactérias da microbiota intestinal em futuras estratégias de controle de doenças depende de uma associação duradoura destes microrganismos com os vetor-alvo ao longo do tempo.

Ainda assim, as fêmeas recapturadas compartilharam alguns taxa bacterianos exclusivamente com fêmeas selvagens, o que indica que estas bactérias podem ter sido adquiridas no campo após a soltura. Porém, nenhum destes taxa expandiu sua abundância na microbiota, permanecendo abaixo de 2%, o que sugere a competição como um possível modulador da composição da microbiota. Fêmeas senis mantidas no laboratório apresentaram mudanças significativas na composição da microbiota intestinal, com a aumento relativo dos gêneros Elizabethkingia e Asaia. Tais mudanças podem estar relacionadas à capacidade imunológica dos mosquitos em controlar a proliferação de certas bactérias e/ou podem resultar de interações diretas entre os microorganismos os quais colonizam o lúmen intestinal. Já foi visto que isolados dos gêneros Elizabethkingia e Asaia apresentam vantagens competitivas sobre outras bactérias da microbiota de mosquitos do gênero Anopheles. Os isolados obtidos durante este estudo permitirão avaliar se as linhagens presentes no intestino de Ae. aegypti possuem características similares, bem como a sua influência na biologia e capacidade vetorial desta espécie.

As informações de diversidade foram utilizadas para predizer in silico as vias metabólicas presentes na microbiota de Ae. aegypti. Esta análise mostrou que as variações na composição da microbiota, relacionadas à idade dos indivíduos, implicariam em diferenças funcionas na comunidade bacteriana. Desta maneira, do ponto de vista do papel da microbiota na biologia dos insetos, os moduladores na diversidade também parecem impactar as vias metabólicas expressas pela comunidade intestinal. O entendimento dos fatores que modulam a diversidade da microbiota de Ae. aegypti abre novas perspectivas para a compreensão dos impactos desta na biologia e evolução deste mosquito, os quais podem ser explorados para o desenvolvimento de novas ferramentas de controle de doenças, como a dengue.

Terapia celular em encefalopatias associadas a infecções: impactos sobre a

neuroinflamação e dano cognitivo

Tatiana Maron-Gutierrez

Laboratório de Imunofarmacologia – LIMUNOFAR

Doenças infecciosas, tais como a sepse e malária, têm consequências neurológicas de longo prazo

importantes, porém negligenciadas quando comparadas com a ênfase dada à mortalidade. No entanto, o comprometimento do sistema nervoso central pode levar a déficits cognitivos devastadores, tendo implicações socioeconômicas substanciais. A sepse pode levar muitas vezes a disfunção orgânica

múltipla, incluindo a disfunção neurológica que está associada com pior prognóstico. Muitos pacientes apresentam ainda dano cognitivo significativo 2 meses, 9 meses, 1 ano, 2 anos, e até 6 anos após a alta hospitalar. As consequências do dano neurocognitivo são profundas e normalmente contribuem para uma diminuição da capacidade de realizar atividades diárias, piora da qualidade de vida, aumento dos custos médico e a incapacidade de retornar ao trabalho. Atualmente não há tratamentos disponíveis para a prevenção do dano cognitivo decorrente da encefalopatia associada à sepse. Deficiências neurológica e cognitiva em casos graves de malária também têm sido relatadas e podem ter um impacto devastador sobre o desenvolvimento da criança causando comprometimento cerebral duradouro e levando a profundas consequências sociais em países e áreas endêmicas. O comprometimento neurológico é frequente em crianças com malária cerebral e geralmente se resolve 6 meses após a alta. Não obstante, o comprometimento cognitivo é frequente e persistente. Déficits de memória e de atenção são comuns em crianças após a malária cerebral. Epilepsia e distúrbios neuropsiquiátricos são também observados. Embora existam grandes preocupações pelas comunidades de médicos e pacientes sobre as sequelas decorrentes de infecções graves, estratégias terapêuticas a fim de evitar o comprometimento cognitivo, induzir o reparo ou promover uma recuperação eficaz ainda se fazem necessários.

As células-tronco vêm sendo consideradas como possível terapia para doenças neurodegenerativas e lesões traumáticas do sistema nervoso central para as quais, no momento, existem poucos recursos terapêuticos. Atualmente não há tratamentos disponíveis para a prevenção do dano cognitivo, logo se faz necessário o estudo de novas terapias, como por exemplo o uso de células-tronco. Diversos estudos demonstraram em modelos experimentais de sepse, que o tratamento com células derivadas de medula óssea é capaz de diminuir a mortalidade, a inflamação e levar a melhoras funcionais em outros órgãos, tal como o pulmão. Até o momento, nenhum estudo investigou os efeitos da terapia celular na neuroinflamação e dano cognitivo associados a doenças infecciosas. A nossa hipótese é de que a terapia com células derivadas de medula óssea é capaz de mitigar a neuroinflamação e o dano cognitivo relacionados a encefalopatias associadas à sepse e à malária cerebral. Este projeto tem como objetivo principal elucidar os mecanismos envolvidos na terapia com células derivadas da medula em encefalopatias associadas a doenças infecciosas, tais como sepse e malária.

Em resumo, o presente estudo pretende caracterizar a resposta inflamatória e o dano cognitivo decorrentes do processo inflamatório/infeccioso, estudar as vias de sinalização celular envolvidas neste processo, e testar a terapia com células derivadas de medula óssea como nova abordagem terapêutica em modelos experimentais de sepse e malária. O projeto apresenta uma grande relevância experimental e clínica, visto que ainda é necessária uma maior compreensão dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos na neuroinflamação e dano cognitivo associados a doenças infecciosas. As consequências do dano cognitivo são profundas e normalmente contribuem para uma diminuição da capacidade de realizar atividades diárias, piora da qualidade de vida, aumento dos custos médico e a incapacidade de retornar ao trabalho. O estudo de uma possível terapia para essas sequelas e a elucidação dos complexos mecanismos fisiopatológicos envolvidos são necessários para a implementação de estratégias preventivas e corretivas, bem como para nortear políticas de saúde pública.

Palavras-chave: Células-tronco, Terapia celular, Doenças infecciosas, Dano cognitivo, Neuroinflamação

Estratégias terapêuticas para doenças neurodegenerativas

Rudimar Luiz Frozza

Laboratório de Pesquisas Sobre o Timo (IOC/FIOCRUZ)

O aumento da expectativa de vida e o consequente aumento significativo na proporção de idosos da população

brasileira que vem sendo anunciados pelo IBGE alertam para a necessidade de uma constante revisão das políticas

públicas voltadas para este segmento populacional, dado que as doenças neurodegenerativas tornam-se mais

frequentes nesta idade. Apesar de positivo, o aumento da expectativa de vida significa que a maior parcela de

morbidade e de mortalidade deverá estar, cada vez mais ao longo das próximas décadas, relacionado às doenças

crônico-degenerativas. Dentre estas, a incidência da doença de Alzheimer (DA) deve aumentar consideravelmente em

nossa população nas próximas décadas, tornando-se um dos novos desafios de saúde pública. Sabidamente, o maior

fator de risco para as doenças neurodegenerativas é a idade; portanto, a transição demográfica explica parte do

aumento da incidência desta doença, uma vez que a incidência da DA dobra a cada cinco anos após os 65 anos de idade.

Embora a DA seja de origem multifatorial, trabalhos recentes têm demonstrado que a inflamação crônica e alterações

metabólicas periféricas, tais como a obesidade e o diabetes Mellitus tipo 2, e centrais parecem acelerar o

desenvolvimento e a progressão da DA. Além disso, foi demonstrado que a obesidade em adultos, sem a concomitância

de diabetes, aumenta em três vezes o risco de desenvolver a DA no envelhecimento. Dessa forma, considerando que no

Brasil 48,5% dos indivíduos adultos apresentam excesso de peso e dado o envelhecimento da população brasileira a

incidência da DA pode aumentar significativamente nos próximos anos, justificando a necessidade de estudos que

abordem disfunções neurais e metabólicas. Neste contexto, em colaboração com o Laboratório de Doenças

Neurodegenerativas da Universidade Federal do Rio de Janeiro, temos obtido avanços na investigação da correlação

entre a patogênese da DA e a inflamação cerebral. Além disso, buscamos investigar se mecanismos que causam a

resistência periférica à insulina também podem levar à disfunção da sinalização cerebral por insulina na DA,

caracterizando vias moleculares que desempenham papel central na gênese da DA e em outras doenças metabólicas,

como a obesidade e o diabetes tipo 2.

Apesar dos grandes avanços oriundos da pesquisa básica voltada para a elucidação de mecanismos de patogênese na

DA, um esquema terapêutico capaz de reverter, interromper ou sequer frear de forma eficaz a progressão desta doença

devastadora ainda não se encontra disponível. Além disso, o tratamento de doenças que atigem o sistema nervoso

central (SNC) é bastante limitado, principalmente pela presença da barreira hemato-encefálica (BHE), a qual limita a

passagem de fármacos. Dessa maneira, o desenvolvimento de modalidades terapêuticas para o tratamento de doenças

neurodegenerativas constitui um dos maiores desafios na pesquisa. Neste contexto, a nanotecnologia torna-se uma

alternativa promissora na entrega de fármacos e de fatores de crescimento através da BHE. O emprego da

nanotecnologia para veiculação de fármacos promove uma liberação controlada a partir das nanopartículas e visa a

vetorização a alvos específicos no organismo, proteção da degradação, aumento da estabilidade e biodisponibilidade de

fármacos, além da possibilidade de redução de dose e de diminuição dos efeitos adversos, redução na toxicidade e uma

maior adesão do paciente à terapêutica. Neste sentido, os projetos em desenvolvimento no Laboratório de Pesquisas

Sobre o Timo visam o desenvolvimento e a caracterização físico-química de formulações de nanopartículas contendo

diferentes compostos com potencial atividade farmacológica nas alterações degenerativas relacionadas ao

desenvolvimento da DA em alterações hipotalâmicas induzidas pela obesidade, as quais estão relacionadas à

patogênese da DA. Os resultados obtidos no desenvolvimento destes projetos podem repercutir no melhor

conhecimento dos mecanismos fisiopatológicos comuns às doenças metabólicas e ao desenvolvimento de doenças

neurodegenerativas. Adicionalmente, acreditamos que o emprego da nanotecnologia pode representar uma vantagem

estratégica extremamente significativa no que diz respeito ao desenvolvimento de novas terapias para a DA e outras

doenças metabólicas, aumentando a probabilidade de êxito na tradução dos resultados das pesquisas para a clínica no

caso de doenças tão devastadoras para o indivíduo e para a sociedade. É importante ressaltar que ainda que novos

medicamentos não consigam interromper completamente o processo neurodegenerativo e/ou reverter suas

manifestações clínicas, quaisquer ganhos em termos de redução da progressão de doenças crônico-degenerativas a ela

associadas já representariam um grande avanço médico-social e um enorme benefício direto para os pacientes.

Palavras-chave: Sistema nervoso central, doenças neurodegenerativas, doença de Alzheimer, alterações metabólicas,

inflamação, nanotecnologia.

Endostatina Humana Recombinante Oligomerizável para Inibição e Regressão de Angiogênese Patológica

Gabriel Limaverde-Sousa1*, Bruno Kaufmann Robbs2, Ana Carolina Giordani-Duarte3, Leonardo Paes Cinelli4, Pedro Geraldo Pascutti5, João Paulo de Biaso Viola2, Tatiana Coelho-Sampaio3 1Instituto Oswaldo Cruz (IOC/FIOCRUZ) 2Instituto Nacional de Câncer (INCA) 3Instituto de Ciências Biomédicas (ICB/UFRJ) 4Instituto de Bioquímica Médica (IBqM/UFRJ) 5Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho (IBCCF/UFRJ)

*gabriel.sousa@ioc.fiocruz.br

O crescimento de um tumor depende de sua capacidade de formar novos vasos sangüíneos em um processo chamado “angiogênese”. De forma semelhante, diversas doenças crônico-degenerativas tem como fator causador ou agravante a formação anormal de vasos sangüíneos. Hoje, a anti-angiogênese é considerada uma nova modalidade terapêutica e vem sendo aplicada em diferentes tipos câncer, além de doenças oculares, como degeneração macular e retinopatia diabética, e com aplicação potencial em inúmeras outras patologias dependentes de angiogênese.

A endostatina é uma molécula endógena, derivada da porção C-terminal do colágeno XVIII, amplamente estudada pelo seu potencial terapêutico no controle da angiogênese. Os primeiros estudos, ainda com uma preparação insolúvel a expressa de forma recombinante em E. coli, mostraram que esta proteína é capaz de inibir e regredir completamente o crescimento tumoral em modelos animais, na ausência de toxicidade e sem induzir resistência ao tratamento. Dado o entusiasmo com os resultados iniciais, a endostatina entrou em testes clínicos apenas três anos após sua identificação, desta vez com uma preparação solúvel baseada em expressão em leveduras P. pastoris. Apesar de comprovada a segurança da molécula pela ausência de efeitos adversos em estudos clínicos, a regressão de tumores não foi observada de forma significativa em pacientes, registrando-se apenas casos de “doença estável”.

Estudos cristalográficos mostraram a coordenação de íons zinco por histidinas na região N-terminal da molécula, estruturando uma interface para potenciais dímeros de endostatina. Contudo, o papel destes íons para a função da molécula é controverso na literatura, e dímeros naturais de endostatina não haviam sido observados em solução. É interessante notar que, ao contrário do observado para monômeros, dímeros de endostatina ligados por uma ponte dissulfeto induzida artificialmente por uma mutação são capazes de promover regressão de tubos endoteliais pré-formados in vitro, o que aponta para um mecanismo de ação da endostatina regulado por oligomerização.

O objetivo inicial do projeto foi investigar modificações estruturais na endostatina induzidas por zinco que poderiam estar relacionadas a sua atividade biológica.

Para isso foram realizadas simulações computacionais com a estrutura cristalográfica da endostatina humana (PDB 1BNL) usando o pacote GROMACS e o campo de forças GROMOS96. O raio de corte utilizado para interações entre átomos não ligados foi estipulado em 1,8 nm e 1,2 nm para os potenciais de Couloumb e Lennard-Jonnes, respectivamente. Endostatina humana recombinante foi expressa em P. pastoris em duas diferentes condições

de pH controlado (pH 6,0 e 7,5). Realizamos cromatografia de exclusão por tamanho (SEC-HPLC) usando colunas GPC100 e a atividade biológica foi analisada em ensaios de regressão de tubos endoteliais in vitro em Matrigel.

Os resultados de dinâmica molecular mostraram perda de estrutura do loop N-terminal da endostatina em simulações realizadas na ausência de zinco, acarretando em dissociação do dímero. Por outro lado, cálculos realizados na presença do íon zinco mostraram estabilidade do dímero de endostatina durante todo o tempo da simulação. Quando realizada a expressão de endostatina em pH controlado, dímeros de endostatina foram observados em solução somente na expressão feita em pH 7,5. Endostatina produzida em pH 7,5 tem atividade biológica em ensaios de regressão de tubos endoteliais em Matrigel em concentrações na faixa de nanomolar, enquanto a preparação em pH 6,0 e a formulação utilizada nos testes clínicos (endostatina em tampão citrato, pH 6.2) se mostraram inativas.

O presente projeto partiu de estudos teóricos de simulação computacional que serviram como base para a elaboração de um protocolo de expressão e purificação que favorecessem a formação de formas oligoméricas da molécula, o que foi comprovado experimentalmente. Através de estudos preliminares in vitro, verificamos uma maior atividade anti-angiogênica de nossa preparação em pH 7,5 na regressão de tubos endoteliais pré-formados em Matrigel. Os resultados aqui descritos constam do pedido de patente PI0605212-6, relacionado à preparação de endostatina oligomerizável, caracterizada pela associação não-covalente entre monômeros de endostatina, apresentada em forma solúvel e compatível com administração clínica.

Para a obtenção da redução de um tumor através de terapia antiangiogênica, além da inibição da formação de novos vasos sanguíneos é necessária também a regressão da vasculatura tumoral já existente. É amplamente descrita na literatura a capacidade da endostatina monomérica de inibir a angiogênese, bloqueando a formação de novos vasos sanguíneos. Por outro lado, a desestabilização e regressão de tubos endoteliais pré-formados foi reportada somente para endostatina oligomerizada. Baseado nestes dados, propomos que a modesta atividade nos primeiros testes clínicos possa estar relacionada ao fato de a endostatina utilizada em pacientes ter sido exclusivamente monomérica, produzida e administrada em pH ácido. Nosso trabalho sugere que a produção de endostatina humana recombinante em P. pastoris, em pH compatível com manutenção da coordenação de íons zinco por histidinas, preserva a estrutura dimérica da endostatina e sua atividade biológica, levando potencialmente a um melhor resultado terapêutico.

A continuidade do desenvolvimento deste produto biotecnológico será dada com a revalidação sistemática da caracterização do estado oligomérico em função da concentração por cromatografia por exclusão de tamanho (SEC), espalhamento dinâmico e estático de luz (DLS/MALS), e determinação de constantes de associação por calorimetria de titulação isotérmica (ITC). Pretendemos ainda realizar uma avaliação fenotípica detalhada da atividade biológica desta formulação oligomerizável através de análises de alto conteúdo (HCA) em modelos de formação e regressão de tubos endoteliais in vitro, dando suporte à posterior verificação destes efeitos in vivo utilizando modelos de Matrigel plug, inibição e regressão tumoral, e modelos de formação de granuloma para observação de efeitos de remodelamento de matriz extracelular. Se confirmados, estes resultados terão implicação direta para a realização de novos ensaios clínicos com endostatina, utilizando esta nova preparação oligomerizável.

Evolução molecular dos vírus Influenza A e identificação de marcadores genéticos virais e humanos associados a gravidade da infecção

Paola Cristina Resende Silva

Laboratório de Vírus Respiratório e Sarampo - LVR

Os vírus Influenza A são um dos principais agentes responsáveis por causar infecções respiratórias

em humanos com altas taxas anuais de morbidade e mortalidade. A infecção por Influenza é prevenível

pela vacinação administrada anualmente e também pode ser controlada por duas classes de antivirais, os

bloqueadores dos canais de prótons M2 e os inibidores de neuraminidase (iNA). Estes vírus pertencem a

família Orthomyxoviridae e apresentam um genoma octa-segmentado composto por RNA fita simples de

polaridade negativa, que codifica para cerca de 16 proteínas virais, entre elas a hemaglutinina (HA) e

neuraminidase (NA), os dois principais antígenos virais. A variabilidade genética e a manutenção destes

vírus na população deve-se principalmente a dois importantes mecanismos evolutivos que ocorrem

durante a replicação viral, são eles: as mutações pontuais (drift antigênico), que ocorrem devido à baixa

fidelidade da RNA polimerase viral, podendo ocasionar a emergência de variantes capazes de escapar do

sistema imune do hospedeiro ou de variantes resistentes aos antivirais disponíveis para uso; e o rearranjo

gênico (shift antigênico), o qual ocorre na infecção simultânea de dois subtipos virais numa única célula,

podendo levar a emergência de vírus potencialmente pandêmico. No início de 2009, ocorreu a

emergência de uma nova variante de influenza A subtipo H1N1 (H1N1pdm09) triplamente rearranjada

com segmentos oriundos de aves, suínos e humanos, que se espalhou rapidamente por toda população

mundial sendo declarada a primeira pandemia de influenza deste século. Esta também foi a primeira a

ocorrer na era genômica, sendo possível a obtenção de uma grande quantidade de dados para entender

importantes questões relacionadas a este vírus. Neste projeto propomos o estudo de algumas destas

questões, como o entendimento da dinâmica evolutiva viral desde sua emergência até seu

estabelecimento na população humana através de escalas temporais e espaciais, com um olhar voltado

para o Brasil, um país com dimensões continentais e distintos padrões de sazonalidade para os vírus

Influenza. E ainda, afim de sugerir um melhor manejo clínico, tratamento e prevenção buscamos também

com este estudo detectar potenciais marcadores genéticos virais ou humanos associados ao aumento da

gravidade da infecção.

Desde a introdução em maio de 2009 do vírus H1N1pdm09 no Brasil, nosso grupo vem

acompanhando sua contínua evolução e temos observado o acúmulo de novas mutações, especialmente

nos genes HA e NA. Com base na análise do gene HA, entre os anos de 2009 a 2014, observamos uma

evolução temporal da variante pandêmica com a circulação de pelo menos oito grupos genéticos. Sendo

observado a co-circulação de alguns grupos de 2011 a 2013, e persistência do subgrupo 6B de 2012 a

2014. Detectamos ainda, algumas mutações especialmente em sítios antigênicos o que pode contribuir

para uma diminuição na eficácia da vacina A/California/7/2009-like, que permanece a mesma na

composição da vacina anti-influenza dos hemisférios norte e sul desde 2010. Neste projeto, pretendemos

continuar este estudo ampliando as regiões geográficas analisadas, como norte e nordeste do país onde

os dados genéticos para este agente viral são escassos. Para isso, contaremos com colaborações

importantes, como a do centro nacional de influenza do Instituto de Pesquisa Evandro Chagas, que cederá

amostras de sua área de atuação, e ainda do Wellcome Trust Sanger Institute na Inglaterra, que nos

auxiliará na realização e análise dos dados do sequenciamento de alto desempenho do genoma completo

dos vírus Influenza através da plataforma Illumina. Isso nos permitirá entender melhor o padrão de

circulação viral dentro do país e possibilitará a obtenção de conhecimento de novas ferramentas para

análise viral.

Em relação ao outro objetivo deste estudo, durante os anos de circulação do vírus pandêmico

monitoramos possíveis mutações virais associadas ao aumento da gravidade da infecção, como

polimorfismo no resíduo 222 e o conjunto de mutações K-15E, P83S e Q293H na HA viral. E a única

mutação que apresentou uma forte associação com a gravidade e fatalidade pela infecção por Influenza

foi o polimorfismo D222G ou a presença de populações mistas, DG222, DN222, GN222 e DGN222.

Entretanto, nem todos os casos de gravidade puderam ser explicados por fatores virais, algumas vezes,

vírus geneticamente semelhantes ao infectarem indivíduos hígidos distintos, produzem diferentes

desfechos clínicos, desde uma infecção branda a casos fatais. As causas de patogenicidade viral têm sido

discutidas, pois estas podem ser atribuídas a fatores específicos do vírus, a fatores adquiridos do

hospedeiro (comorbidades ou imunodepressão), e ainda, a fatores genéticos do hospedeiro. Diante disso,

estudar os aspectos virais e do hospedeiro podem contribuir para um melhor entendimento da dinâmica

evolutiva viral e da gravidade da infecção por influenza. Assim, neste projeto além de compararmos o

perfil do genoma completo viral em coortes de pacientes com desfechos clínicos brandos, graves e fatais,

pretendemos também realizar a triagem de alguns marcadores genéticos humanos. Entre eles

polimorfismos nos genes CCR5, KIR, IFITM3, FcγRIIa/IGHG2, especulados por terem alguma possível

associação com a gravidade da infecção.

Desse modo, com esse projeto esperamos contribuir para um melhor entendimento dos

processos de introdução e migração dos vírus influenza A no Brasil, seus mecanismos evolutivos e

mecanismos de gravidade da infecção, buscando melhores estratégias para o controle do vírus Influenza

no país.

Palavras-chave: Influenza, hemaglutinina, biomarcadores, patogenicidade, virulência, evolução molecular,

sequenciamento de alto desempenho.

A ontogenia murina como modelo de estudo do microambiente hematopoético normal e patológico, com ênfase no fígado fetal

Jackline de Paula Ayres-Silva Laboratório de Patologia/IOC

Em mamíferos, as primeiras células hematopoéticas são geradas extraembrionariamente nas ilhotas vitelínicas de Wolff-Pander por volta de E7,5. Do E9,5 ao E12,5, as células hematopoéticas definitivas originam-se intraembrionariamente na aorta dorsal e em outros endotélios hemogênicos, dos quais começam a migrar para o fígado e baço fetais, onde proliferam e diferenciam. Do E16 ao E21, muitas células diferenciadas e indiferenciadas migram para a medula óssea em formação, principal sítio de hematopoese no adulto (1–3).

Durante o período de expansão hepática, nosso grupo e outros observaram dois microambientes favoráveis à diferenciação hematopoética: um mais imaturo, atuando como estroma da linhagem eritróide (endodérmico) e outro mais maduro, com aumento do tecido conjuntivo mesenquimal paravascular e paracapsular (endodérmico-mesenquimal) (4,5).

Do ponto de vista proteico, a partir da chegada das células hematopoéticas no fígado fetal, este começa o seu processo de amadurecimento, com o início da expressão de genes estágio-específicos, produzindo proteínas como alfafetoproteína (AFP), albumina e oncostatina M (OSM). A OSM é produzida por células hematopoéticas CD45+ e parece reduzir a habilidade dos hepatócitos em propiciar um ambiente favorável à hematopoese, por promoverem o seu amadurecimento . Estes hepatócitos passam então a adquirir funções metabólicas, tais como: desintoxicação, clearance de amônia e síntese de lipídeos e glicogênio. Ocorrem também mudanças morfológicas, aumento da adesão celular homofílica e indução da expressão de genes tecido-específicos, que também resultam num ambiente não propício à hematopoese (6,7). Duas principais vias de sinalização são ativadas após a ligação de OSM ao seu receptor: JAK-STAT e Ras. Interessantemente, a superexpressão de OSM e de STAT5ab mutante em células de medula óssea de camundongos induz uma doença mieloproliferativa severa(8). Linhagens celulares que mimetizam neoplasias mieloproliferativas crônicas (Hel, Set2, Mo7e, TF-1) ou que possuem crescimento dependente de IL-3 (Ba/F3) também mostraram a superexpressão de OSM assim como observado no soro e nas células de medula óssea de pacientes com neoplasias mieloproliferativas crônicas. Isto sugere que a OSM possa desempenhar um papel no aumento da produção de citocinas, e levar a um aumento da fibrose observada em parte dos pacientes, o que é uma característica de severidade da doença (9,10).

As moléculas de matriz extracelular (MEC) são muito importantes na modulação dos nichos celulares, proporcionando um microambiente favorável à proliferação das diversas linhagens hematopoéticas em etapas diversas de diferenciação. Entender a modulação desses nichos em estados normais e patológicos é de fundamental importância e o conhecimento gerado até o momento sobre os nichos hematopoéticos hepáticos fetais ainda é escasso, sem detalhamento temporal ao longo do desenvolvimento e pouco voltado para o modelo murino, apesar da sua complexidade de interação entre as células hematopoéticas, os hepatócitos e a matriz extracelular presente no interstício (11).

Outro alvo de estudo com carência de intelecção durante a ontogenia refere-se à entrada e saída das células hematopoéticas no fígado fetal. O principal modelo comparativo de estudo é o transplante de medula óssea (TMO), no qual a caracterização e detecção de açúcares importantes na interação entre as células hematopoéticas e endoteliais possui alguns dados descritos na literatura.

Assim, o objetivo deste trabalho é estudar as moléculas envolvidas no trânsito e na permanência das células hematopoéticas no microambiente hepático fetal, sejam de superfície ou de matriz extracelular.

Para isso, fígados fetais de camundongos entre E12,5 e E18,5 estão sendo processados histologicamente e analisados por colorações especiais, histoquímica e imunofluorescência para caracterização de moléculas de matriz extracelular, com ênfase em proteoglicanos, e localização dos nichos de diferenciação e de migração hematopoética através de marcadores celulares e lectinas tanto in situ como por citometria de fluxo. Pretendemos executar caracterização semelhante em biópsias de medula óssea (BMO) humanas provenientes de pacientes com neoplasias mieloproliferativas crônicas (NMP) com fins de aprofundamento e entendimento da patogenia e progressão desse conjunto de doenças.

No fígado fetal, evidenciamos a presença de proteoglicanos de alta sulfatação e de fibras reticulínicas e, através da utilização de lectinas, investigamos a presença de alguns resíduos de açúcares. Os resultados iniciais mostraram que a lectina Lens culinaris, que possui afinidade pelos resíduos de alfa-D-manose, apresentou marcação citoplasmática diferencial em neutrófilos, eosinófilos (E16 e E17) e megacariócitos (E18) nas diferentes idades gestacionais analisadas. A lectina Abrus precatorius (AP), que possui afinidade por resíduos de galactose, marcou os neutrófilos e as células endoteliais dos vasos e dos sinusóides hepáticos, enquanto que a lectina Arachis hypogaea (PNA), que possui afinidade por resíduos de beta-galactose (1-3) N-acetilgalactosamina, portanto reconhece resíduos mais específicos que AP, foi observada nas células endoteliais, com uma marcação muito mais delicada do que a ressaltada com a PNA, além de uma marcação seletiva nos neutrófilos (E16,5) .

No momento estamos aprofundando a caracterização dos proteoglicanos presentes no fígado fetal através de ensaios de coloração, histoquímica e bioquímica e analisando o efeito da radiação ionizante sobre a medula óssea de camundongos de forma a aprofundar e comparar os resultados da ontogenia, das neoplasias mieloproliferativas/mielodisplasias humanas e da fase de condicionamento do TMO.

Almejamos avançar no conhecimento sobre os mecanismos responsáveis pelo trânsito e permanência de células hematopoéticas no fígado fetal e na medula óssea de pacientes com NMP e mielodisplasias, nas quais a forma mais severa da doença pode cursar com uma hematopoese extramedular, tanto no baço como no fígado, o que relembraria o mecanismo ocorrido durante a ontogenia. A caracterização dos nichos hematopoéticos, com ênfase nas moléculas de matriz extracelular, tais como proteoglicanos e resíduos de açúcar presentes também ajudará na intelecção desses mecanismos, visto que são profundamente interligados.

Palavras-Chave: Hematopoese; fígado fetal; Transplante de medula óssea; neoplasias mieloproliferativas; mielodisplasias; microambiente; migração

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