gene discovery em eucalipto doutoranda: marcela mendes salazar orientador: prof. dr. gonçalo a. g....

Gene Discovery

em Eucalipto

Doutoranda: Marcela Mendes Salazar

Orientador: Prof. Dr. Gonçalo A. G. Pereira

Análise do genoma de espécies de eucalipto visando a identificação de genes/metabolismo chave para o incremento da sua produtividade para orientar o seu melhoramento tanto pela via convencional como pela transgenia

Doutoranda: Marcela Mendes Salazar

Orientador: Prof. Dr. Gonçalo A. G. Pereira

Resumo

• Eucalipto

• Por que o eucalipto?

• Dados do projeto Genolyptus

• Objetivos

• Resultados preliminares

• Próximas etapas

O Eucalipto

• Angiosperma - família Myrtaceae

• Gênero Eucalyptus: mais de 670 espécies, subespécies, variedades botânicas e híbridos

1774

Descrito por Brutelle -1788

1868

O Eucalipto• 1868: decoração, quebra-vento

• 1910: fins industriais – Cia. Paulista de Estradas de Ferro

• 1950: matéria prima para produção de celulose

• 1980: Brasil é 1º produtor e exportador de celulose

O Eucalipto• Florestas plantadas:

Fontes de celulose, madeira, carbono capturado Conservação da natureza Eucalipto: gênero florestal mais plantado no mundo

2005

NorteNE

CentralSE

Sul

• O Brasil: Destaque como produtor e exportador de derivados de eucalipto 2005 – 1,7 milhões de ha para indústria de papel e celulose

28,5%

O Eucalipto

• No cenário internacional: 2005: 4,6% das exportações de produtos florestais madeireiros 1º produtor e exportador de celulose branqueada de eucalipto Um dos países mais procurados no mercado de carbono

• Espécies mais plantadas: Eucalyptus grandris: crescimento rápido; Eucalyptus urophylla: rusticidade; Eucalyptus globulus: alto teor de celulose.

O Eucalipto• Manter a competitividade do eucalipto:

Investimentos em pesquisa e desenvolvimento; Melhoramento genético; Rede de pesquisas genômicas:

Forest: Eucalyptus Genome Project Consortium

Genolyptus: Rede Brasileira de Pesquisa do genoma do Eucalipto

• Geração de 168105 reads;

• Reads válidos:125034 (74,4 % );

Distribuição de reads por tamanho

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

Tamanhos dos reads (pb)

Total submetidosTotal válidos

• Bibliotecas:

Código Descrição Total 250 pb com phred > 20BC BAC (Bacterial Artificial Chromosome) 24278 18064 (74.4%)FL Flor 782 660 (84.4%)FX Floema - mistura 15634 12883 (82.4%)GE Genômico 10289 6421 (62.4%)ML Folha totalmente expandida ( Mature Leaf ) 8292 6221 (75%)PU Folha jovem naturalmente infectada por 9865 8207 (83.2%)RX Raiz – mistura 3264 1181 (36.2%)SE Plântula ( Seedling ) 15814 11322 (71.6%)TS Plântula tratada (Treated Seedling) 18250 14016 (76.8%)XX Xilema – mistura 288 229 (79.5%)XY Xilema ( Xylem ) 60364 45030 (74.6%)YL Folha jovem ( Young Leaf ) 985 800 (81.2%)

• Clusterização:– 40899 clusters:

• 17005 contigs• 23894 singlets

Distribuição de contigs por tamanho

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

< 200

200 - 300

300 - 400

400 - 500

500 - 600

600 - 700

700 - 800

800 - 900

900 - 1000

1000 - 1100

1100 - 1200

1200 - 1300

1300 - 1400

1400 - 1500

> 1500

Tamanho dos contigs (pb)

Tota

l de

cont

igs

• Blastx realizado com contigs

Cobertura dos contigs (blastx NR)

No hits27%

Hits73%

Objetivos

• Mineração de banco de dados

• Identificação de genes e fatores de transcrição

• Análise da expressão de genes específicos:• RT-PCR• Northern blot

• Proposição de genes para melhoramento

• Construção de vias metabólicas - BioCyc

Bancos de dados

• Projeto Genolyptus Saturação do banco de dados:

Eletronic Northern Gene ProjectsOutros banco de dados

• Microarranjo Dados Jorge Lepikson Dados NimbleGen

Dados - Projeto Genolyptus

Dados – Projeto Genolyptus

•Via Eletronic northern

• Fatores de trancrição

Descricao Blastx/NR FamíliaContig249 gi|15227958|ref|NP_179397.1| ANAC037 transcription factor [Arabidopsis thaliana] NACContig2000 gi|15237699|ref|NP_196061.1| NAC2 transcription factor [Arabidopsis thaliana] NACContig13753 gi|25140464|gb|AAN71732.1| WRKY transcription factor IId-3 [Lycopersicon esculentum] WRKYContig15444 gi|18417696|ref|NP_567861.1| WRKY32 WRKYContig6535 gi|32493108|gb|AAP85545.1| putative WRKY-type DNA binding protein [Glycine max] WRKY

EUGL-XY-001-006-C10-AF.R gi|15234113|ref|NP_192034.1| WRKY22 WRKYContig13792 gi|14530687|dbj|BAB61056.1| WRKY DNA-binding protein [Nicotiana tabacum] WRKYContig11732 gi|10798760|dbj|BAB16432.1| WRKY transcription factor NtEIG-D48 [Nicotiana tabacum] WRKYContig207 gi|48686707|gb|AAT46067.1| DNA binding protein WRKY2 [Vitis vinifera] WRKY

Contig14208 gi|83630931|gb|ABC26914.1| WRKY40 [Glycine max] WRKYEUGR-XY-022-013-A11-BA.T gi|83630939|gb|ABC26918.1| WRKY82 [Glycine max] WRKY

Contig2693 gi|83630939|gb|ABC26918.1| WRKY82 [Glycine max] WRKYEUGR-XY-006-012-F02-RS.R gi|48686707|gb|AAT46067.1| DNA binding protein WRKY2 [Vitis vinifera] WRKY

Contig9413 gi|1430846|emb|CAA67600.1| myb-related transcription factor [Lycopersicon esculentum] MYBContig2906 gi|1430846|emb|CAA67600.1| myb-related transcription factor [Lycopersicon esculentum] MYB

EUPE-XY-000-029-B03-MG.R gi|12321839|gb|AAG50958.1| Myb-family transcription factor, putative [Arabidopsis thaliana] MYBContig761 gi|18415984|ref|NP_567664.1| MYB85 DNA binding / transcription factor [Arabidopsis thaliana] MYB

Contig13440 gi|18874263|gb|AAL78741.1| MYB-like transcription factor DIVARICATA [Antirrhinum majus] MYBEUPE-XY-000-070-D10-MG.R gi|23476313|gb|AAN28287.1| myb-like transcription factor 6 [Gossypium raimondii] MYB

Contig224 gi|23476313|gb|AAN28287.1| myb-like transcription factor 6 [Gossypium raimondii] MYBEUUR-XY-000-007-A01-BA.F gi|24850307|gb|AAN63154.1| transcription factor MYBS3 [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] MYB

Contig13026 gi|28629811|gb|AAO45179.1| transcription factor Myb1 [Malus xiaojinensis] MYBEUUR-XY-000-023-H09-BA.R gi|28629811|gb|AAO45179.1| transcription factor Myb1 [Malus xiaojinensis] MYB

Contig11339 gi|28629811|gb|AAO45179.1| transcription factor Myb1 [Malus xiaojinensis] MYBContig13228 gi|31980091|emb|CAD98760.1| MYB transcription factor R3 type [Populus tremula x Populus MYBContig926 gi|34451908|gb|AAQ72433.1| MYB family transcription factor [Gossypium hirsutum] MYBContig418 gi|39725413|emb|CAE09057.1| MYB transcription factor [Eucalyptus gunnii] MYBContig2294 gi|39725415|emb|CAE09058.1| MYB transcription factor [Eucalyptus gunnii] MYB


• Gene Projects


•Clusterização dos reads

•Blast

• Via outros bancos de dados


• Blast

Gene Contigs/Singlets FL FX GE ML PU RX SE TS XX XY YLAt1g52890 3853 x xAt2g46770 249/431/EUUR-XY-000-054-F09-BA.R x xAt3g61910 249/247/EUUR-XY-000-054-F09-BA.R xAt5g13180 13506/838 x x xAt1g32770 249/431/EUGL-XY-001-108-C09-AF.R x xAt1g12260 249/247 x xAt5g62380 249/EUUR-XY-000-054-F09-BA.R xAt1g71930 249/EUUR-XY-000-054-F09-BA.R x xAt1g01720 8519/10689/12961 x x x x xAt5g08790 8519/12961/8465/10689/13298/11490 x x x xAt3g15500 3853/8519/ EUGR-TS-002-050-E06-CN.R xAt3g15170 16969 xAt5g53950 16969/EUGR-TS-001-047-C02-GO.R x xAt1g76420 16969 xAt1g56010 16969 xAt5g04410 10957/ EUGR-GE-002-027-A06-DF.F x xAt1g52880 10689/ 8519/ 16969 x x x xAt1g69490 EUGR-TS-002-050-E06-CN.R x

Familia Nac 96 membros NENST1

NST2

NST3


• Família de Fatores Saturada

•Fatores específicos de plantas: regulam formação da parede secundária


• Comparação com dados do Xylem Eletronic Northern


• Programa MEME

Dados Microarranjo – Jorge

• Objetivo Comparar a expressão gênica do xilema de

diferentes espécies identificar genes relacionados com características importantes para o desenvolvimento da planta e da formação de celulose e lignina.

• Projeto de Mestrado

Análise da Expressão Gênica em eucalipto


• Biblioteca Genolyptus– 500 genes

• RNA xilema Eucalyptus grandis folhas Eucalyptus grandis xilema Eucalyptus globulus xilema Eucalyptus urophylla xilema Eucalyptus pellita

Dados Microarranjo – NimbleGen

• 21,442 Unigenes de Eucalyptus

• 10 lâminas: 2 lâminas hibridizadas com RNA de folha (E. grandis): 2 lâminas

com réplicas biológicas (“ramets”).

8 lâminas hibridizadas com RNA de xilema (sendo 4 de E. grandis e 4 de E. globulus): dois grupos de lâminas formados por indivíduos de pais diferentes com duas réplicas biológicas (“ramets”) em cada grupo.

Dados Microarranjo – NimbleGen

• Análise 1

21,442 Unigenes

Xilema/E. grandis Xilema/E.globulusX

Genes diferencialmente expressos entre

espécies

256 genes up-regulated em Grandis

286 genes up-regulated em Globulus

Dados Microarranjo – NimbleGen• Análise 2

21,442 Unigenes

Xilema/Grandis Folha/GrandisX

Genes específicos de xilema

Xilema/GlobulusX

Genes específicos de xilema diferencialmente expressos

entre as espécies

256 genes up-regulated em Grandis

286 genes up-regulated em Globulus

1674 genes

Montagem de vias metabólicas - BioCyc

•Integração da informação genômica – construção de vias metabólicas

Alguns Genes Selecionados

• Contig 13753 (3 reads) Família de fatores WRKY• Função: regulação em resposta à infecção e outros stresses• Eletronic Northern

• Xylem Eletronic Northern

• NimbleGen: globulus up

Inte

nsid

ade

Alguns Genes Selecionados• Contig 2906 (5 reads) Família de fatores MYB

• Função: regulação do metabolismo secundário

• Eletronic Northern

• Xylem Eletronic Northern – não tem correspondente

• NimbleGen: globulus up

Inte

nsid

ade


• Contig 7474 (8 reads) Gene CesA• Função: produção de celulose na parede celular


• NimbleGen: xylem upCelulose na parede

secundária??

Inte

nsid

ade

Genes CesA• Codificação da subunidade catalítica do complexo celulose sintase• Em Arabidopsis: família de 10 isoformas

3 isoformas – celulose da parede primária 3 isoformas – celulose da parede secundária

Elementos de xilema colapsados;

1/3 da quantidade de celulose

Homólogo em Eucalipto

AtCesA7


• Contig 13017 (2 reads) Gene CesA• Função: produção de celulose na parede celular


• NimbleGen: xylem upCelulose na parede

primária??

Inte

nsid

ade

Próximas etapas• Seqüenciar genes candidatos

• Confirmar expressão de genes específicos

• Proposição de genes para programas de melhoramento

• Integração dos dados de expressão nas vias metabólicas

FIMFIM

gene discovery em eucalipto doutoranda: marcela mendes salazar orientador: prof. dr. gonçalo a. g....

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