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Fundo científico

Células maduras podem ser reprogramadas para se tornar pluripotentes

O Prêmio Nobel de 2012 de Fisiologia e Medicina é atribuído ao Dr. John B.

Gurdon e ao Dr.ShinyaYamanaka por suas descobertas de que células adultas

diferenciadas, podem ser reprogramados para conter um estado celular

pluripotente. Isso representa uma mudança de paradigma na nossa

compreensão da diferenciação celular e da plasticidade do estado

diferenciado. Diferenciação celular aparece como um processo

unidirecional,onde as células indiferenciadas amadurecem para vários

destinos de células especializadas, tais como os neurónios, músculos e células

da pele. A opinião prevalente durante a primeira metade doséculo 20foi a de

que as células maduras forampermanentemente bloqueadas no estado

diferenciado, e se tornaram incapazes de voltar para um estado totalmente

imaturo,estado de células pluripotentes estaminais. Em 1962, John B. Gurdon

mudou radicalmente este ponto de vista, demonstrando queo núcleo de uma

célula epitelial intestinal diferenciada de rã foi capaz de gerar um girino

totalmentefuncional após o transplante para um óvulo sem núcleo. Esta

descoberta quebrou o dogma de que a diferenciação celular só podia ser um

processo unidirecional. A descoberta de Gurdon foi oponto de partida para o

esforço da clonagem em vários organismos. No entanto, a questão, seuma

célula intacta diferenciadapode ser totalmente reprogramada para se tornar

pluripotentepermaneceu. Em 2006, por umprocedimento surpreendentemente

simples, ShinyaYamanaka mostrou que a introdução de um pequeno conjunto

defatores de transcrição numa célula diferenciada era suficiente para

reverter a célula para um estado pluripotente.As células resultantes foram

chamadascélulas -troncopluripotentes induzidas (iPS). Juntos, Gurdon e

Yamanakatransformaram nossa compreensão da diferenciação celular. Eles

demonstraram que oestado diferenciado, geralmente muito estável , pode ser

desbloqueado, porque abriga um potencial de reversãoa pluripotência. Essa

descoberta introduziu fundamentalmente novas áreas de pesquisa, e oferece

novas oportunidades emocionantes para estudar mecanismos da doença.

Introdução

Durante o desenvolvimento normal, as células procedem a partir do estado

inicial indiferenciado do ovo e de célulasno embrião inicial para um estado

mais especializado. No organismo adulto uma gama de células diferenciadas

de vários tipos são necessárias para executar as funções específicas realizadas

no corpo adulto (Figura 1A). Oovo fertilizado e as células no zigoto são

totipotentes, em outras palavras, elas podem dar origem a todos os tipos

decélulas no embrião, bem como os tecidos, tais como placenta

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extraembrionária. Como o desenvolvimentoprogride, as células na fase de

blastocisto começam a tornar-se distinguíveis: a massa celular interna dá

origem ao embrião propriamente dito, enquanto que as células circundantes

tornam-se a linhagem de trofoblasto e são a fonte dos tecidos extra-

embrionários. As células da massa celular interna são pluripotentes, isto é,

eles podem darorigem a todas as células somáticas, bem como à linhagem de

células germinativas: células destinadas a se tornarem gametas(Óvulos e

espermatozóides).

Durante esta viagem de desenvolvimento, as células tornam-se

progressivamente mais restritas em seu potencial de diferenciação e como

consequência, elas não retêm pluripotência. A maioria das células maduras

são células totalmente diferenciadas, as células-tronco, embora com potência

limitada para permanecer em determinados locais no corpo servem como uma

fonte de reposição de células na medula óssea, intestino epele, por

exemplo. As células diferenciadas são notavelmente estáveis e, como regra,

não mudam o seu destino em outros tipos decélulas diferenciadas ou revertem

para o tipo de células indiferenciadas que podem ser encontradas no início do

desenvolvimento doembrião. Por esta razão, o ponto de vista predominantefoi

o de que as células da linhagem somáticaestavam permanentemente em um

estado bloqueado,de tal forma que o caminho de retorno a um estado

altamente indiferenciado foi impossível. A percepção de que vários tipos de

células diferenciadas foram dotadas de um padrão específico deproteínas

sugere que células diferenciadas podem transportar irreversíveis modificações

epigenéticas ou alterações genéticas que tornam impossível a indução de

pluripotência. Conrad Hal Waddington propôs umapaisagem epigenética de

montanhas e vales como uma metáfora para o desenvolvimento. Dentro desse

panorama,células indiferenciadas, representadas como mármores, residem no

topo de uma montanha. Durante a diferenciação elasescorrem em vales

energeticamente mais estáveis, de onde vêm para descansar como células

diferenciadas.A expectativa era de que seria difícil reverter as células

diferenciadas de voltaaoestado indiferenciado, movendo-as de volta para o

topo da montanha (Waddington, 1957) (Figura 1B).Apesar do dogma, a noção

de que células especializadas poderiamde alguma forma ser desbloqueadas a

partir de seuestado diferenciado e desdiferenciar-senão foi completamente

descartada. Várias estratégias foram consideradaspara resolver o problema

experimentalmente . Por exemplo, Hans Spemann (Prêmio Nobel deFisiologia

ou Medicina 1935) alimentaram a idéia de transferência de núcleos de células

diferenciadas paraum meio imaturo citoplasmático para testar seu potencial de

desenvolvimento. Ele se referiu a esta abordagem como uma"Experiência

fantástica".

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Figura 1 O desenvolvimento normal de um ser humano a partir de um ovo fertilizado que ilustra o processo unidirecional da maturação através do ovo e embrião para um ser humano adulto. B, Waddington ilustraa diferenciação celular como uma paisagem epigenética no qual as células são vistas como bolinhas rolando em vales para chegar ao seu destino final como células diferenciadas. A metáfora visualiza bem o desenvolvimento unidirecional do processo de desenvolvimento normal. As células normalmente não voltam para o topo da montanha para chegar ao estado indiferenciado, e também normalmente não atravessam outros vales para se desenvolver em linhagens independentes.

Reprogramação de um núcleo de células somáticas diferenciadas

A tentativa direta para testar se as células diferenciadas na linhagem de células

somáticas foram dotadas de umapotencial desdiferenciação latente foi

realizada por Robert Briggs e King Thomas, quedesenvolveram uma

tecnologia para a transferência de núcleos de células somáticas

indiferenciadase diferenciadaspara um ovo fertilizado enucleado nos

anfíbios Ranapipiens (Briggs e King, 1952).Anfíbios são particularmente

sensíveis a este tipo de experiência devido ao grande tamanho do ovoe o

desenvolvimento de embriões extra-uterinos. Briggs e King mostraram que

um núcleo embrionário,quando transferido para um óvulo sem núcleo, poderia

de fato apoiar o desenvolvimento até a fase de girino.Em contraste, quando se

repetiu o procedimento, com núcleos de células mais diferenciadas, falhou-se

na obtenção de embriões em desenvolvimento. Assim, eles concluíram que os

núcleos diferenciados sofreram irreversíveismudanças durante a diferenciação

de tal forma que a capacidade de promover o desenvolvimento foi perdida

(King eBriggs, 1955).

John B. Gurdon, que tinha treinado em embriologia com Michael Fischberg,

em Oxford, usou um diferenteanfíbio, Xenopuslaevis em vez

de Ranapipiens, para abordar o tema. Em Xenopus, Gurdon podetirar

vantagem de um sistema de rastreio de células, desenvolvido porFischberg e

colegas (Elsdaleet al., 1958)que lhe permitiu diferenciar inequivocamente as

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células derivadas de núcleos transplantados de células do embrião

hospedeiro. Num estudo chave, por irradiação ultravioleta ovos enucleados

Gurdon descobriu que quando os ovos foram transplantados com núcleos de

epitélio intestinal diferenciado do girino, umpequeno número de girinos

nadantes foram realmente gerados (Gurdon, 1962) (Figura 2). Ele pode

mostrar também que a eficiência da reprogramação nuclear pode ser

melhorada grandemente através da realização de transplantes seriados. Por

essa estratégia, ele mostrou que uma proporção considerável de todos os

núcleos celulares de epitélio intestinal puderam ser reprogramados (Gurdon,

1962). Gurdon concluiu que núcleos de células somáticas diferenciadas tem o

potencial de reverter a pluripotência. No entanto,ganhou ampla aceitação na

comunidade científica somente depois de passado um tempo considerável

depois de suadescoberta. Nas experiências subsequentes, Gurdon usou núcleos

de rãs adultas para gerar girinos e, inversamente, núcleos embrionários

diferenciados com desenvolvimento sustentado por sapos adultos (Gurdon e

Uehlinger, 1966; Laskey e Gurdon, 1970).

A descoberta de Gurdon foi uma mudança fundamental de paradigma,

mostrando pela primeira vez que o núcleo da célulaa partir de uma célula

somática diferenciada foi dotado com a capacidade de impulsionar o

desenvolvimento completo em uma gama de tipos de células somáticas e

tecidos após serem colocados no meio citoplasmático de uma célula de ovo.

Figura 2 John Gurdonutilizou luz UV (1) para destruir o núcleo da célula num ovo de rã. Ele em seguida, substituiu o núcleo do ovopelo núcleo de célula a partir de uma célula epitelial intestinal diferenciada a partir de um girino (2) Muitos ovos manipulados não se desenvolveram, mas em vários casos os girinos de natação normal foram gerados(3). Isto mostrou que a informação genética necessária para gerar as células diferenciadas em um girino permaneceram intactas na célula doadora do núcleo. Estudos posteriores demonstraram que os mamíferos também podem ser clonados por esta técnica (4).

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Desenvolvimento de reprogramação por transferência nuclear

A descoberta de Gurdonintroduziu um novo campo de pesquisa centrado na

transferência nuclear somática(SCNT) como um método para compreender

reprogramação e como alterar as células quando se tornam especializadas.Em

1997, o primeiro mamífero clonado, a ovelha Dolly, nasceu depois de uma

SCNT de células mamárias epiteliais adultas para um ovo enucleado de

ovelhas (Wilmutet al., Nature, 1997). A estratégia experimental desenvolvida

por Ian Wilmut e Keith Campbell foi baseada no trabalho Gurdon

em Xenopus, mas com adicionaladaptação técnica. Por exemplo, uma

modificação importante foi que os núcleos usados para transplantação em

mamíferos vieram a partir de células epiteliais da glândula mamaria induzidas

a entrar quiescência, o que tornou as mesmas mais adequadas para se

sincronizar com o embrião em desenvolvimento. Desde a clonagem de

ovelhas, em 1997, até agora SCNT foi usada para clonar uma infinidade de

espécies de mamíferos, incluindo rato, vaca, porco, lobo e onças

africanas. Através da transferência nuclear de núcleos de células a partir

decélulas B - e T –do sistema imunitário, apresentou provas conclusivas de

que um núcleo de célula diferenciada com rearranjo deimunoglobulina

ougenes de receptores celulares T, poderia ser reprogramado para apoiar

odesenvolvimento de um rato (Hochedlinger e Jaenisch, 2002).

Reprogramação de uma célula somática diferenciada intacta para se

tornar pluripotente

Gurdon revelou que um núcleo de célula diferenciada tem a capacidade de se

reverter com êxito a umestado indiferenciado, com um potencial para reiniciar

o desenvolvimento. No entanto manteve-se uma questão em aberto, ou seja, se

seria possível induzir reversão de uma célula intacta diferenciada

aum estado altamente imaturo. Muitos cientistas consideraram esta questão

impossível, ou no mínimo, que a mesma requereria uma reorganização muito

complexa na célula para desbloquear o estado diferenciado. Essa foi a cena

quandoShinyaYamanaka decidiu abordar o problema da reprogramação de

pluripotência.Yamanaka, que havia treinado tanto em cirurgia ortopédica e

biologia molecular, tornou-se interessado pelo estado pluripotente, em parte,

pelo estudo das células-tronco embrionáriaspluripotentes (ES), caracterizadas

primeiramente por Martin Evans (Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina de

2007).

O Laboratório de Yamanaka foca-se em fatores importantes para a

manutenção de pluripotência em células-tronco embrionárias, comoERas

(Takahashi et al., 2003) e identificação, em paralelo com o laboratório de

Austin Smith, a pluripotênciado gene Nanog (Mitsui et al, 2003;.. Chambers

et al, 2003). Yamanaka então embarcou na busca de induzir pluripotência em

células somáticas. Em seu trabalho e outros, que ele conheceu um grande

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número de fatores de transcrição que foram expressos nas células ES com

confirmação ou suspeita de funções na manutenção do estado

pluripotente. Além disso, as células ES foram conhecidas por

induzirpluripotência em núcleos de células somáticas depois de fusões de

células induzidas por entre ES e células somáticas (Tada etal.,

2001). Equipado com esta informação, Yamanaka selecionou um conjunto de

24 fatores de transcrição celularde ES que ele considerou como candidatos

para restabelecer pluripotência em células somáticas.

Em uma experiência surpreendente, todos os 24 genes que codificam estes

fatores de transcrição foram introduzidos emum passo em fibroblastos da pele

e alguns deles realmente geraram colônias que mostraram umanotável

semelhança com células-tronco embrionárias. O número de genes capazes de

induzir tais colônias foram reduzidas, uma - a - uma, para identificar uma

combinação de apenas quatro fatores de transcrição (Myc, Oct3 / 4, Sox2e

Klf4) que foi suficiente para converter os fibroblastos embrionários de ratinho

para as células estaminais pluripotentes(Takahashi e Yamanaka, 2006) (Figura

3). As células-tronco pluripotentes, que Yamanaka chamou de células-tronco

pluripotentes induzidas (células iPS), apareceram com uma freqüência muito

baixa, mas poderiam ser selecionadas pela expressão de uma neomicina / lacZ

gene de fusão (βgeo) inseridos no locus no genoma Fbx15do rato a partir do

qual os fibroblastos foram obtidos. O promotor Fbx15 é ativo em células-

troncopluripotentes e a ativação da expressão de βgeo nas células estaminais

pluripotentes resulta em resistência a G418. As células iPS geraram vários

tipos celulares em ensaios de teratoma e contribuiram para a formação dos

tecidosquiméricos de ratos após a injeção em blastocistosde ratos. No entanto,

a linha de células iPS de transmissão de germes não foi alcançada no primeiro

estudo (Takahashi e Yamanaka, 2006). Porém, um ano depois, o grupo de

Yamanaka, emparalelo com Rudolph Jaenisch e grupos Konrad Hochedlinger,

desenvolveram um refinado sistema de seleção(Agora selecionando para

ativação, quer do Oct4 ou loci Nanog de genes), e os resultantes células iPS

mostraramna linha a transmissão de germes (Okita et al, 2007;. Wernig et al,

2007;.. Maherali et al, 2007). Em 2007, os laboratórios de Yamanaka e James

Thomson foram os primeiros a produzir células iPS humanas (Takahashiet al,

2007;. Yu et al, 2007). Nas experiências com células humanas iPS, Yamanaka

usou o fator quatro de combinação do papel 2006 (Myc, Oct4, Sox2 e Klf4),

enquanto Thomson usou um pouco da combinação de fatores de transcrição

diferentes (Lin28, Nanog, 04 de outubro e Sox2).

A descoberta de Yamanaka de células iPS representa uma descoberta

verdadeiramente fundamental, pois foi a primeira vez que uma célula

somática diferenciada intacta pode ser reprogramado para se tornar

pluripotente. A descoberta de Yamanakaabriu um campo de pesquisa

totalmente novo, e as iPS surpreendentemente simples são agora tecnologia

utilizada em um grande número de laboratórios de todo o mundo.

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Figura 3 A partir de uma coleção de 24 diferentes fatores de transcrição (simbolizados por tubos de ensaio), (1),Takahashi e Yamanaka (2006) demonstraram que um conjunto de apenas quatro fatores de transcrição (Myc, Oct3 / 4, Sox2e Klf4) foi suficiente para converter as culturas emembriões de rato ou fibroblastos adultos (2) para se tornarem células pluripotentes capazes de produzir in vivo teratomas e contribuirpara formar os ratos quiméricos (3). As células pluripotentes foramchamadas células-tronco pluripotentes induzidas (células iPS).

Desenvolvimentos de reprogramação celular e seu uso na pesquisa

médica

Desde a descoberta inicial, a tecnologia tem sido melhorada de várias

formas. Por exemplo, os fatores de pluripotência podem agora ser entregues à

célula, sem a utilização de vectores retrovirais, os quais se integram

aleatoriamente no genoma e causam desregulação dos genes endógenos nas

proximidades que podem contribuir para a formação de tumores. A não

integração de vírus estabilizados,RNAs ou proteínas, bem como plasmídeos

epissomais, agora é usada para a integração - entrega gratuita dos genes

pluripotência. Em certostipos celulares menos de quatro fatores são

necessários para induzir pluripotência, no rato adulto, por exemplo, células-

tronco neurais requerem apenas Oct4 para indução de células iPS (Kim et al.,

2009). Do mesmo modo, em moléculas pequenas foi demonstrado certos

contextos celulares para substituir alguns dos fatores de pluripotência (Li et

ai., 2009). É importante notar que as células iPS satisfazem os critérios mais

rigorosos para pluripotência, pois elas são capazes de gerar todas as células

iPS de ratos em ensaios de complementação tetraplóides, isto é, quando as

células são introduzidastetraplóidemente com 8 células na fase de mórula

(Zhao et al, 2009.). Todas estas melhorias, com base na origemda descoberta

deYamanaka, foram passos importantes para tornar a tecnologia mais eficiente

e iPS ‘úteis.

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A descoberta de Yamanaka, demonstrou que mudanças dramáticas no estado

diferenciado, que é geralmente muito estável, podem ser conseguidas, também

tem inspirado os esforços de investigação para alterar o destino das células

semtramitava a um estado pluripotente. Experimentos de transdiferenciação

têm uma longa história quevolta para experiências de discos imaginais

de Drosophila, em 1960, seguindo-se a utilização de alguns únicos genes,

como Antennapedia, MyoD, GATA1 ou PAX5 para induzir interruptores de

destino celular. Em particular, oMyoD descoberta que pode transdiferenciar

10T1 / 2 fibroblastos de mioblastos (Davis et al., 1987) mostrou que os genes

que realizaram transdiferenciação poderia ser sistematicamente identificados.

Yamanaka tomou uma abordagem sistemática para definir um pequeno

conjunto de fatores de transcrição, em vez de um único fator, inspirou uma

recente onda de experimentos usando combinações de transdiferenciação e

fatores de transcrição. Por exemplo, as células exócrinas para converter

células endócrinas no pâncreas através da introdução de três fatores de

transcrição (Zhouet al., 2008). Do mesmo modo, pode ser cardiomiócitos

gerados a partir de fibroblastos in vitro através da introdução de três fatores de

transcrição diferentes (Ieda et al.,2010), e um comutador de destino

correspondente na célula foi recentemente realizado in vivo usando os mesmos

fatores (Song et al, 2012;.. Qian et al, 2012). Estes exemplos fornecem

evidência paratransdiferenciação dentro de uma camada germinativa, mas

eficientementetransdiferenciação entre camadas germinativas pode também

ser alcançada. A transdiferenciação de fibroblastos (mesoderma) para os

neurônios (ectoderme) (assimchamado em células) foi realizada por expressão

de fatores de transcrição em três (Panget al., 2011).

As células-tronco, incluindo as células iPS, pode, potencialmente, ser usadas

para substituir células doentes ou perdidas em desordem degenerativa ,

incluindo por exemplo, doença de Parkinson e na diabetes de tipo 1. Na

terapia celular com substituição poriPS as células podem permitir que o

enxerto autólogo de células que seria menos propenso a rejeição imunitária. O

melhor método para a geração de células iPS será importante para esses

esforços. No entanto, existe a possibilidadede que os procedimentos utilizados

atualmente para a reprogramação possam introduzir mutações genômicas ou

outras anomalias, que podem torná-los impróprios para a terapia celular. A

possibilidade de utilizar as células-troncopluripotentes, incluindo as células

ES, no transplante de células permanece um desafio para um número de

razões adicionais. Assim, embora esta seja uma área de pesquisa muito

interessante e promissora, o trabalho adicional é necessário para assegurar que

a utilização de células com origem em células estaminais pluripotentesseja

uma terapia segura para os pacientes.

Outra, mais iminente área, para uso médico é derivar células iPS de pacientes

com genética eoutras doenças e, em seguida, usar as células

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iPSpara diferenciação in vitro para obter uma nova percepção noprocesso da

doença ou para a produção de células - para plataformas baseadas em testes de

toxicologia ou no desenvolvimento de drogas(Onder e Daley, 2012) (Figura

4). As células iPS foram produzidas a partir de um amplo espectro de doenças,

incluindo esclerose lateral amiotrófica (ELA), síndrome de Rett, atrofia

muscular espinhal (AME), α1 -antitripsina, hipercolesterolemia familiar e

armazenamento de glicogênio 1A. Paradoença cardiovascular, existem

atualmente modelos celulares para iPS Síndrome de Timothy, síndrome de

LEOPARD e a síndrome do QT longo, sendo do tipo 1 ou 2 (Onder e Daley,

2012). Em várias dessas células iPS - com base em modelos de doenças,

doenças com fenótipos relevantes são observadas. Por exemplo, a perda

progressiva de um neurônio automóvelé observado no modelo iPS para

SMA. Além disso, na síndrome de Rettcélulas específicas iPS mostraram

reduzida densidade da coluna após a diferenciação neuronal (Marchetto et al.,

2010). A hepatocíticadiferenciação de células iPS de α1 - antitripsinaem

pacientes com deficiência leva a acumulação elevada de lipídios e glicogênio

(Rashid et al., 2010). In vitro os modelos de células diferenciadas iPS também

pode imitar aspectos de doenças com manifestação tardia, tais como a doença

de Alzheimer (Israel et al., 2012), ataxia espinocerebelar (Kochet al., 2011) e

doença de Huntington (O HD iPSC Consortium, 2012). O progresso também

tem sido feito quando se trata de doenças de modelagem com a genética

complexa, tais como esquizofrenia (Brennand et al.,2011). No entanto,

existem também as doenças, para as quais pode ser difícil imitar com sucesso

a patologia nas células iPS advindas de células derivadas. Além disso, para

algumas doenças, na linhagem hematopoiética, estudos em protocolos de

diferenciação in vitro de células iPS são escassos, limitando o progresso nesta

área.

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Figura 4 As células diferenciadas podem ser obtidas a partir de um paciente com uma doença específica e reprogramadas paratornar-se células iPS. As células resultantes iPS podem então ser diferenciadas in vitro para vários destinos de células especializadas, taiscomo neurônios, cardiomiócitos ou hepatócitos, e usadas para ganhar novas percepções sobre o processo da doença ou como plataforma de uma célula para tentar desenvolver terapias para novas doenças.

Células iPSutilizadas como base em células in vitro diferenciadas também são

cada vez mais utilizadas como plataformas de triagem para desenvolvimento e

validação de compostos terapêuticos. Em uma célula iPS - modelo baseado

em disautonomia familiar, um novo composto, cinetina, foi identificado, o que

poderia reverter parcialmente o aberrante splicing do gene IKBKAP que causa

a doença (Lee et al., 2009). Da mesma forma, a iPS pode ser usada em uma

Síndrome QT longa como modelo celular, beta-bloqueadores e bloqueadores

dos canais de íons mostraram-se eficazes na modulação do fenótipo (Itzhaki et

al., 2011). As células iPS são valiosas tornando-se assim novas ferramentas

para obter visões sobre os processos de doenças e são agora usadas para testar

e validar novas terapêuticas. Além disso, mesmo doenças com genética

complexa e de início tardio podem ser modeladascom sucesso por esta doença

" doença do prato ".

Em resumo, o conceito de que maduras, as células diferenciadas podem ser

reprogramadas a umestado de células-troncopluripotentes é um paradigma que

as descobertas estão mudando. Essa percepção tem influenciado

essencialmente todas as áreas de medicina ou fisiologia. As descobertas feitas

por John Gurdone YamanakaShinya claramente foramfundamentais e

introduziram um campo de pesquisa totalmente novo.

Jonas Frisen, UrbanLendahl e Thomas Perlmann

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