Fundação Universidade Estadual de Maringá CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

SIMONE APARECIDA GALERANI MOSSINI

EFEITOS DE EXTRATOS DE Azadirachta indica A. Juss (Meliaceae) NA

PRODUÇÃO DE MICOTOXINAS E NA MORFOLOGIA DE FUNGOS

TOXIGÊNICOS

Orientador: Prof. Dr. Carlos Kemmelmeier.

Maringá

2006

Simone Aparecida Galerani Mossini

EFEITOS DE EXTRATOS DE Azadirachta indica A. Juss (Meliaceae) NA

PRODUÇÃO DE MICOTOXINAS E NA MORFOLOGIA DE FUNGOS

TOXIGÊNICOS

Tese apresentada ao Curso de Pós-graduação em

Ciências Biológicas (Área de concentração em Biologia

Celular) da Universidade Estadual de Maringá, para

obtenção do grau de Doutor em Ciências Biológicas.

Maringá – PR

2006

“Há um momento para tudo e um tempo para todo propósito debaixo do céu.

Tempo de nascer, e tempo de morrer; tempo de plantar e tempo de arrancar a

planta. Tempo de matar, e tempo de curar; tempo de destruir, e tempo de

construir. Tempo de chorar, e tempo de rir; tempo de gemer, e tempo de

dançar. Tempo de atirar pedras, e tempo de recolher pedras; tempo de

abraçar, e tempo de se separar. Tempo de buscar, e tempo de perder; tempo

de guardar, e tempo de jogar fora. Tempo de rasgar, e tempo de costurar;

tempo de calar, e tempo de falar. Tempo de amar e tempo de odiar; tempo de

guerra e tempo de paz".

Eclesiastes 3: 1-8.

Expresso, de maneira especial, o meu profundo reconhecimento e gratidão:

Aos meus pais pelo amor, pelo incentivo, pela dedicação, pela paciência e por estarem sempre presentes. Aos meus filhos, Guilherme e Fernanda, pelo amor e pelas alegrias. Ao Luís pelo amor, pela paciência, compreensão e pelo incondicional apoio.

Ao Prof. CARLOS KEMMELMEIER, pelos valiosos conselhos, ensinamentos, incentivo, dedicação e solicitude com que sempre me orientou e, sobretudo, pela amizade demonstrada durante a realização deste trabalho.

AGRADECIMENTOS

À minha amiga e colega Carla, pela companhia, colaboração, amizade e paciência.

A Christiane, pela amizade e colaboração.

Aos colegas das disciplinas cursadas durante o curso, pela amizade.

Aos professores Dr. Oswaldo Ferrarese Filho e Dra. Maria de Lourdes Lucio Ferrarese (Departamento de Bioquímica), pela colaboração nas análises por HPLC.

A Maria Aparecida Dantas Ramos e a Gisele Adriana Bubina, pela ajuda

com as análises por HPLC e pelos momentos de descontração e amizade.

À professora Dra. Jaqueline Nelisis Zanoni (Departamento de Ciências Morfofisiológicas) e a Renata Vírginia Fernandes Pereira, pela ajuda com a captura de imagens.

Aos professores, técnicos e colaboradores do Curso de Pós-graduação em Ciências Biológicas pela colaboração e pelos ensinamentos ministrados, em especial ao Armando Luiz de Sá Ravagnani pela ajuda com as revisões gramaticais.

Aos colegas do Laboratório de Toxicologia, pela compreensão e ajuda nesta etapa final.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

(CNPq), pelo suporte financeiro.

A todos que tenham contribuído de uma forma direta ou indireta, para a realização deste trabalho.

RESUMO

O Nim (Azadirachta indica A. Juss) é uma árvore milenar, nativa da Índia, que vem sendo utilizada

há séculos para o tratamento de doenças humanas e controle de pragas. A planta Nim vem

fascinando cientistas de várias áreas, à medida que seus biocompostos encontram uso na agricultura

e medicina. Um grande número de compostos biologicamente ativos tem sido isolado de toda a

planta, sendo assim comercialmente exploráveis. A pesquisa que envolve a planta vem crescendo

significativamente, uma vez que os seus princípios ativos podem desempenhar um papel importante

no manejo integrado de sistemas e na medicina alternativa. Compostos extraídos do Nim se

mostram seletivos, não-mutagênicos, rapidamente degradáveis, com baixa toxicidade para

organismos não-alvo e benéficos, com mínimos distúrbios ao ecossistema. A árvore possui mais de

135 compostos isolados e divididos em duas classes principais: isoprenóides e outros. Os

isoprenóides incluem diterpenóides e triterpenóides (nimbin, salanin e azadiractina). Os compostos

não-isoprenóides incluem proteínas, carboidratos, compostos sulfurosos, polifenólicos

(flavonóides), cumarinas e taninos, compostos alifáticos, etc. Azadiractina, o principal limonóide

isolado do Nim, tem demonstrado várias atividades biológicas, altamente eficientes no controle de

pragas. Várias preparações industriais e terapêuticas à base de Nim têm sido comercializadas para

controle de doenças fúngicas e outras pragas. O uso de extrato de folhas de Nim tem sido testado

em cultivo líquido contra fungos patógenos do solo, demonstrando inibição do crescimento de

algumas espécies dos gêneros Fusarium, Rhizoctonia, Sclerotium e Sclerotinia. O extrato aquoso de

folhas tem sido citado também por inibir patógenos foliares (Sarcocladium, Fusarium,

Phaeoisariopsis, Puccinia, e Aspergillus). O óleo de sementes reduziu o crescimento e a

esporulação dos fungos entomopatogênicos dos gêneros (Metarhizium, Beauveria and

Paecilomyces). Recentes pesquisas têm demonstrado a correlação entre o crescimento micelial, a

produção de micotoxinas em fungos toxigênicos e os compostos derivados do Nim. Estudos in vitro

e in vivo utilizando extrato aquoso de folhas de Nim contra Aspergillus flavus e A. parasiticus

demonstraram bloqueio da biossíntese de aflatoxina, mas o extrato não foi efetivo sobre o

crescimento fúngico. Estudos, in vitro e em maçãs, com Penicillium expansum relatam que o

extrato, apesar de não inibir o crescimento vegetativo do fungo, bloqueia a produção da micotoxina

patulina pelo fungo. A presença e o crescimento de fungos em alimentos podem causar deterioração

e resultar em redução na qualidade e na quantidade da produção. Fungos causam destruição

significativa de alimentos durante a estocagem, tornando-os impróprios para consumo humano por

reduzirem seu valor nutritivo e, em algumas ocasiões, produzirem micotoxinas. Conseqüentemente,

a presença de fungos toxigênicos e micotoxinas em alimentos e grãos representa um perigo

potencial à saúde humana e animal. Micotoxinas são metabólitos tóxicos fúngicos, de estrutura

química diversa e contaminantes comuns de ingredientes de alimento animal e humano. Esses

metabólitos secundários não são essenciais para o crescimento do microorganismo, mas são

sintetizados e secretados a partir de metabólitos primários, podendo exibir efeitos tóxicos em

organismos superiores, sendo produzidos por mais de 100 espécies fúngicas. Muitas delas têm sido

reconhecidas como produtos do metabolismo de espécies do gênero Aspergillus, Penicillium e

Fusarium. A via metabólica biossintética policetídica é uma rota comum para a formação de várias

micotoxinas, entre elas aflatoxina, patulina, citrinina e ocratoxina. Citrinina é uma micotoxina

produzida por vários fungos filamentosos do gênero Penicillium, Aspergillus e Monascus,

encontrados como contaminantes em grãos, frutas e derivados. Fungos produtores de citrinina

crescem em grãos e frutas estocados com alta umidade tão bem quanto em embutidos fermentados.

A micotoxina citrinina é hepatonefrotoxica e tem sido implicada em doenças agudas em animais e

humanos. Ocratoxina é um metabólito secundário perigoso produzido por espécies toxigênicas de

fungos do gênero Penicillium em alimentos e derivados. Essa toxina é carcinogênica e é capaz de

causar dano à saúde humana e animal. A prevenção e eliminação da produção de ocratoxina dos

produtos alimentícios é fonte importante para muitos pesquisadores nos últimos anos.

Aproximadamente, 25% do cultivo mundial são afetados, anualmente, pela presença de

micotoxinas. Alimentos contaminados por micotoxinas possuem sérias implicações na área da

toxicologia alimentar, na agricultura, para as criações de animais e aves, os manipuladores de grãos,

os processadores de alimentos, consumidores e, eventualmente, para a economia nacional. Vários

inibidores fúngicos químicos têm sido utilizados na preservação de grãos armazenados. Muitas

desvantagens (geração de resíduos tóxicos, desenvolvimento de resistência, de preço e de tempo

consumido na formulação) são associadas com seu uso e existe uma tendência mundial para reduzir

o seu uso em grãos, em frutas e em derivados. Assim, existe uma necessidade contínua para o

desenvolvimento de estratégias para o controle de fungos patógenos de plantas por meio do uso de

extratos naturais que preservem o meio ambiente, fornecendo um controle mais eficiente e

melhorando a qualidade e rendimento de cultivos. O uso de biopraguicidas naturais oferece uma

opção viável para o controle de pragas, eles são baratos e prontamente viáveis em muitas regiões do

terceiro mundo. Em muitos casos, não existe um método isolado que assegure a ausência completa

do contaminante. Dessa forma, o manejo integrado com a combinação de diferentes métodos pode

reduzir significativamente os riscos associados com a contaminação por micotoxinas e render

produtos seguros e aceitáveis para o consumo. Neste estudo, nós analisamos os efeitos do extrato de

folhas de Nim sobre o crescimento, morfologia e produção de citrinina em três isolados de

Penicillium citrinum, em cultura. Análises por cromatografia em camada delgada, ensaios

colorimétricos e análises por cromatografia líquida de alta eficiência demonstraram um bloqueio na

produção de citrinina. O crescimento fúngico não foi reduzido, entretanto houve diferenças entre as

características macroscópicas das colônias controle e tratadas. Investigamos também o efeito dos

extratos sobre o crescimento, a esporulação e produção de ocratoxina A por Penicillium verrucosum

e P. brevicompactum. Análises por cromatografia em camada delgada não demonstraram inibição

da produção de ocratoxina A, mas os estudos sobre o crescimento e a esporulação dos isolados

mostraram alterações significativas na presença dos extratos de Nim. Dessa forma, este trabalho

demonstra que os extratos de Nim possuem atividade fungitóxica, apesar de seu modo de ação não

ser ainda totalmente esclarecido. É possível que os diferentes compostos ou as diferentes

concentrações dos compostos extraídos da planta possuam efeitos variados em fungos. Existem

evidências, fornecidas por este e outros estudos, que fungos reagem diferentemente aos compostos

de Nim. Pesquisas adicionais são necessárias para determinarem os usos potenciais de produtos à

base de Nim em programas de controle de fungos, para avaliarem o uso em sistemas agrícolas e

estudarem a melhor forma de separarem, extraírem, formularem e aplicarem os produtos,

maximizando os seus benefícios.

ABSTRACT

Neem (Azadirachta indica A. Juss) is a tree native to India where it has traditionally been

used for the treatment of human ailments and pest control. The Neem plant has interested

scientists from various fields of research since its active principles may be employed in

agriculture and medicine. Although several biologically active compounds have been

isolated from the Neem tree, each part has some biological property and is commercially

exploitable. Studies on the tree’s parts have increased significantly due to the fact that its

active principles may potentially be used in integrated pest management and alternative

medicine. Neem compounds seem to be selective, non-mutagenic, readily degradable, with

low toxicity to non-target and beneficial organisms, with minimal disruption to the

ecosystem. The tree has more than 135 isolated compounds subdivided into two major

classes: isoprenoids and non-isoprenoids. Whereas isoprenoids include diterpenoids and

triterpenoids (nimbin, salanin and azadirachtin), non-isoprenoids comprise proteins,

carbohydrates, sulphurous compounds, polyphenolics (flavonoids), coumarin and tannins,

aliphatic compounds, and other. Azadirachtin, a major limonoid constituent isolate from

Neem, has presented several biological activities among which were some highly effective

in pest control. Several therapeutically and industrially useful Neem-preparations have also

been marketed for control of fungal plant diseases and other pests. Whereas a number of

soilborne pathogens were tested in liquid culture using Neem leaf extracts, there was also

vegetative growth inhibition of several Fusarium, Rhizoctonia, Sclerotium and Sclerotinia

species. Aqueous leaf extract has also been reported to inhibit foliar pathogens

(Sarcocladium, Fusarium, Phaeoisariopsis, Puccinia, and Aspergillus). The sporulation

and growth of entomopathogens (Metarhizium, Beauveria and Paecilomyces) have been

reduced with oil from Neem seeds. Recent studies have demonstrated a correlation between

mycelial growth, mycotoxin production by toxigenic fungi and Neem derivates. In vitro and

in vivo studies with aqueous Neem leaf extract on Aspergillus flavus and A. parasiticus

showed aflatoxin biosynthesis blockage but no effect on fungus growth. In vitro studies and

in apples with Penicillium expansum showed that Neem extract did not inhibit fungal

vegetative growth, but impaired the production of patulin mycotoxins by fungus. The

presence and growth of fungi in food may cause spoilage and result in food quality and

quantity reduction. Fungi cause significant grain liabilities during storage, rendering it unfit

for human consumption by a decrease in its nutritive value and by frequent production of

mycotoxins. Therefore, the presence of toxigenic fungi and mycotoxins in food and grains

presents a potential hazard to human and animal health. Mycotoxins are toxic fungal

metabolites with different chemical structures, besides being common contaminants in the

ingredients that make up animal feed and human food. Although these secondary fungal

metabolites are not essential for the organism’s growth, they are biosynthesized from

primary metabolites and secreted. With over one hundred fungus species they may exhibit

toxic effects in higher organisms. Most of them have been recognized as metabolic

products of Aspergillus, Penicillium and Fusarium species. The biosynthetic polyketide

pathway is a common route for the formation of various mycotoxins, such as aflatoxin,

patulin, citrinin and ochratoxin. Citrinin, a mycotoxin produced by several filamentous

fungi of the genera Penicillium, Aspergillus and Monascus, has been found to be a natural

contaminant in grains, foods, foodstuff and fruits. Citrinin-producing fungi grow on grains

and fruits stored in humid places and on mould-fermented sausages. Citrinin is

hepatonephrotoxic and accountable for disease outbreaks in animals and human beings.

Ochratoxin is a secondary and hazardous fungus metabolite produced by toxigenic

Penicillium and Aspergillus strains in foods and foodstuffs. This toxin is a carcinogenic

compound and causes health hazards to human beings and animals. Prevention of

ochratoxin production and its elimination from food products has been recently of

paramount importance for many researchers. Approximately 25% of the world’s food crops

are affected each year by mycotoxins. Mycotoxin-contaminated food has serious safety

implications for toxicology, crop, livestock, and poultry producers; grain handlers; food and

feed processors; consumers worldwide, and eventually national economies. Various fungi-

inhibiting chemicals have been used for the preservation of stored grain. However, many

disadvantages (generation of toxic residues, development of resistance pathogens,

expensive and time-consuming to formulate) are associated with their usage, besides a

world trend towards reducing their use in grain, fruits and foodstuffs. There is therefore a

continuing need to develop strategies for controlling plant pathogen fungi with natural

extracts that preserve the environment and undertake a more efficient control of pathogenic

fungi. An improvement in crop yield and quality will result. The use of natural

biopesticides offers a viable option for pest control. Actually they are cheap and readily

available in many Third World regions, relatively safe and degradable. In most cases, there

is no single method that will ensure the complete removal of the contaminant. Thus,

integrated management with a combination of different methods may significantly reduce

risks associated with mycotoxin contamination and yield products that are safe and

acceptable for consumption. Current research deals with the effect of Neem leaf extract on

growth, morphology and citrinin production by three isolates of Penicillium citrinum in

culture. Analyses by thin layer chromatography, colorimetric assay and analyses by high

performance liquid chromatography demonstrated blockage of citrinin production.

Although fungus growth was not reduced, there were differences between colony

macroscopic characteristics on controls and treatments. The extract’s effects on growth,

sporulation and ochratoxin A production by Penicillium verrucosum and P.

brevicompactum were also investigated. Thin layer chromatography failed to show any

inhibited ochratoxin A production; however, Neem extracts affected growth rate and

sporulation of isolates. Assays show that Neem extracts have fungitoxic activity even

though their mode of action is still not fully understood. It is also quite possible that

different chemicals or different ratios of chemicals found in Neem trees have varied effects

on fungi. Evidence exists in current study and in others that fungi species react differently

to compounds from the Neem tree. Additional research is needed to determine the potential

usefulness of Neem products in fungi control programs, evaluating their use in many

agricultural systems and studying how best to separate, extract, formulate and use them to

maximize their benefit.

De acordo com as normas do Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, esta tese

é composta por três artigos: um de revisão (publicado) e dois elaborados na forma de

artigos científicos. O segundo artigo está sendo reconsiderado para resubmissão no Current

Microbiology, e o terceiro artigo, em preparação para submissão no Journal of Basic

Microbiology.

Acta Farm. Bonaerense 24 (1): 139-48 (2005) Revisiones Recibido el 9 de julio de 2004 Aceptado el 12 de diciembre de 2004

A árvore Nim (Azadirachta indica A. Juss): Múltiplos Usos

Simone Aparecida Galerani MOSSINI e Carlos KEMMELMEIER*

1 Universidade Estadual de Maringá, Departamento de Bioquímica, Avenida Colombo, 5790, BR- 87020-900. Maringá, PR Brasil

RESUMO. O Nim é uma árvore milenar, nativa da Índia, que vem sendo utilizada há séculos para os mais variados fins. Suas atividades medicinais e praguicidas têm sido fonte de grande interesse na pesquisa científica. A planta fornece grande número de metabólitos secundários com atividade biológica, sendo a azadiractina considerada de maior importância ecológica. A pesquisa envolvendo a planta vem crescendo nos últimos anos, devido à procura por métodos ambientalmente seguros no controle de pragas, sendo evidente que a árvore pode desempenhar um papel importante no manejo integrado de sistemas, e também devido aos seus comprovados efeitos medicinais.

SUMMARY. “The Neem tree (Azadirachta indica): wide-ranging uses”. Neem is a millenary tree native to India where it has traditionally been used for centuries for treatment of human ailments and pest control. The Neem tree has fascinated scientists from various fields of research as its secondary metabolites find use in agriculture and medicine. A large number of biologically active compounds have been isolated from it; the best known among them is azadirachtin, which is considered to be of the most ecological importance. Studies on the various parts of the tree have been increased significantly and its active principles have interesting potential for use in integrated pest management and alternative medicines.

PALAVRAS CHAVE: Azadirachta indica, Nim, múltiplos usos. KEY WORDS: Azadirachta indica, Neem, wide-ranging uses.

* Autor a quem dirigir correspondência. E-mail: ckemmelmeier@uem.br

INTRODUÇÃO Azadirachta indica (sin. Antelaea azadirachta, Melia azadirachta), conhecida popular-mente

como Nim, tem sido usada por séculos no Oriente como: planta medicinal (no tratamento de inflamações, infecções virais, hipertensão e febre), planta sombreadora, repelente, material para construção, combustível, lubrificante, adubo e mais recentemente como praguicida

1-3. Embora os

praguicidas sintéticos ainda sejam o principal meio de proteção às culturas, o uso de métodos alternativos tem aumentado, em função da necessidade atual de superar pro-blemas como resistência e redução dos riscos de contaminação ambiental provocados pelos pro-dutos sintéticos não-biodegradáveis. A procura por compostos naturais com potencial preventivo e

curativo, sem indesejáveis efeitos tóxicos, vem crescendo nas últimas décadas. Devido à baixa toxicidade e larga distribuição na natureza, o Nim pode ser considerado como uma valiosa fonte para uso na Medici-na tradicional e no desenvolvimento de drogas modernas. Em geral, os efeitos benéficos de produtos naturais, como o Nim, podem ser atribuídos a um ou mais compostos fitoquímicos, incluindo antioxidantes, flavonóides e outras substâncias.

A presente revisão tem por objetivo trazer as principais informações sobre as inúmeras quali-dades e potencial do uso do Nim presentes na literatura científica nacional e internacional.

A planta Nim A árvore Nim cresce bem em áreas de clima tropical e subtropical

4. É uma planta pertencente à

família Meliaceae, como o mogno, sendo hoje conhecida pelo nome botânico Azadirachta indica A. Juss. O porte da árvore pode variar de 15 a 20 m de altura, com tronco semi-reto a re-to, de 30 a 80 cm de diâmetro, relativamente curto e duro, com fissuras e escamas, de coloração marrom-avermelhada. O diâmetro da copa varia de 8 a 12m, podendo atingir 15 m em árvores isoladas

2. São

árvores atrativas, com grande quantidade de folhas sempre verdes, do tipo imparipenadas, alternadas, com folíolos de coloração ver-de-claro intenso, que caem somente em casos de seca extrema. As raízes penetram profunda-mente no solo, onde o local permite, e quando sofrem algum tipo de dano, produzem brotos. O sistema radicular da planta é composto por uma raiz pivotante, sua principal sustentação, possibilitando a retirada de água e nutrientes de grandes profundidades e de raízes laterais auxiliares. As flores são pequenas, brancas, bissexuadas, brotam em feixes axiais, arranjando-se em inflorescências de cerca de 25 cm de comprimento; possuem um perfume semelhante ao mel e atraem muitas abelhas. Os frutos são lisos, glabros, elipsóides, com 1,5 cm x 2 cm de comprimento, de cor amarelada quando maduros, com uma polpa doce envolvendo as sementes, que são compostas por uma casca e um ou mais caroços. As sementes e as folhas são usualmente empregadas no controle de pragas

2,3. A árvore normalmente começa a fornecer frutos

após 3-5 anos do plantio, com produção superando 25 kg/planta a partir do quinto ano 3. A produção

de frutos ocorre principalmente entre julho e setembro, podendo ocorrer uma segunda florada entre novembro e janeiro. O Nim é facilmente propagado, tanto sexualmente quanto vegetativamente, podendo ser plantado por meio de sementes, mudas, árvores novas, brotos de raiz ou tecido de cultura. Entretanto, o crescimento se mostra melhor em áreas com chuvas anuais de 800 - 1800 mm, solos arenosos, profundos e bem drenados, com pH entre 6,5 e 7,5 e temperaturas de 20 °C

2.

Apesar de possuir atividade inseticida, existem insetos que danificam a planta, como as formigas cortadeiras, causadoras de desfolha do Nim, percevejos e cochonilhas. No Brasil, a doença ocorre esporadicamente, não ocasionando danos significativos para caracterizá-las como pragasdoNim

2.

A química do Nim Nim é capaz de se proteger contra grande número de pragas por meio de uma grande

quantidade de compostos bioativos. Seus principais elementos químicos são uma mistura de 3 ou 4 compostos correlatos, que podem ser modificados em mais de 20 outros menores, porém não menos ativos. No geral, esses compostos pertencem à classe dos produtos naturais conhecidos por triterpenos, mais especificamente limonóides. De fato, pelo menos 9 limonóides de Nim têm demonstrado habilidade em bloquear o desenvolvimento de pragas agrícolas. Dentre esses, o limonóide ou tetranortriterpenóide azadiractina é o mais estudado e mais potente. Apesar de os compostos bioativos presentes no Nim serem encontrados em toda a planta, aqueles presentes primeiramente nas sementes e folhas são os que possuem compostos mais concentrados e acessíveis, facilmente obtidos por meio de processos de extração em água e solventes orgânicos como hidrocarbonetos, álcoois, cetonas ou éteres

2,5.

Métodos de extração com solventes fornecem vários compostos biologicamente ativos e o mais antigo e popular método utilizando água é extremamente eficaz. Por outro lado, o uso de

solventes não-polares fornece uma variedade de compostos químicos. Após a extração, métodos de separação podem ser utilizados no isolamento e identificação dos compostos, como HPLC e análises espectrofotométricas

5. Várias técnicas têm sido modificadas para tornar mais eficiente o

processo de extração dos compostos bioativos do Nim, com grande enfoque no composto aza-diractina

6-8.

Paralelamente, grande número de novos triterpenóides com atividade biológica vem sendo isolados de extratos de sementes e folhas do Nim

9-12. Também têm sido identificados produtos

derivados e produtos análogos do composto azadiractina 13,14

. Dos nove isômeros de azadiractina descritos na literatura, azadiractina A e B representam a maior concentração de metabólitos presentes nas sementes e são consideradas importantes para a comercialização da planta como biopesticida

15. A azadiractina se concentra principalmente nos frutos, aumentando ao longo do

desenvolvimento, sendo máxima no amadurecimento e durante o armazenamento, podendo sofrer variações de acordo com o modo de colheita, armazenamento, teores de umidade, presença de luz, temperatura e variações no pH

2,3.

Jain et al. 16

detectaram que, quando a árvore está situada em solos ligeiramente alcalinos, apresenta maior quantidade de nutrientes disponíveis, e que fatores ambientais, como latitude geográfica, desempenham papel significativo no aumento de produtividade da planta. Outros es-tudos também relatam variações no conteúdo de azadiractina entre plantas provenientes de di-ferentes regiões e países, entretanto, tais variações não são atribuídas apenas às condições climáticas, uma vez que ocorrem de forma individual entre as árvores de uma mesma região, mas sim devido a diferenças genéticas

15.

Efeitos praguicidas do Nim Apesar de os efeitos de produtos à base de Nim serem bastante conhecidos no controle de

insetos, podem também influenciar outros organismos como os nematóides (uma das pragas mais devastadoras na agricultura), caramujos (especialmente Biomphalaria glabrata, auxiliando no controle da esquistossomose), crustáceos (que prejudicam culturas de arroz por utilizarem as mesmas fontes de nitrogênio), viroses de plantas e fungos. Por outro lado, a planta contém compostos que podem produzir um acréscimo na produção de certas espécies benéficas à agricultura. Bons exemplos disso são aumentos em cerca de 25% na produção de minhocas (Eisenia foetida) utilizadas no melhoramento de solos e de compostos que parecem ser benignos para aranhas, borboletas, abelhas que polinizam plantações e árvores, joaninhas que consomem pulgões, e vespas que atuam como parasitas em várias pestes agrícolas

1,2.

Há relatos na literatura sobre o efeito inseticida do Nim envolvendo principalmente, lagartas e besouros, sendo várias espécies de lepidópteros, coleópteros, homópteros, dípteros e heterópteros testadas com resultados positivos

2. Espécies de insetos reagem diferentemente aos compostos do

Nim. Estudos têm indicado que limonóides presentes na planta possuem diver-sos mecanismos e sítios de ação

17, causando efeito antialimentar

2,3,17-24 , efeito repelente de postura de ovos

25-27,

efeito regulador do crescimento2,3,17,19,28, interferência nas funções bioquímicas e fisiológicas 2,19,21,22

, efeitos sobre a reprodução 2,3,29

, e, em certos casos, a morte 19,28-30

. Outros estudos demonstraram uma ação direta, inibindo a motilidade por meio de efeitos citotóxicos

17,19, e

promovendo inibição da síntese de quitina 3 . Estes resultados não são apenas dose-dependentes, há

um aumento do po-der de resposta com os primeiros estádios larvais. Entretanto, algumas espécies reagem de maneira diferente, sofrendo ação do Nim apenas ao final da fase adulta

2 .

Estudos relatam seu uso com finalidade repelente contra mosquitos dos gêneros Aedes, Culex, Anopheles, demonstrando segurança e eficácia nas aplicações

31-33. Rahman et al.

34 demonstraram

efeito larvicida do Nim contra o mosquito Culex quinquefasciatus, enquanto Elhga et al. 35

verificaram efeito sobre a habilidade de eclosão dos ovos e desenvolvimento larval do mosquito

Culex pipiens, efeitos dependentes da dose e tempo de exposição. Produtos de Nim também mostram potencial considerável no controle de pragas em grãos estocados, sen-do o efeito repelente importante. Um bom exemplo é o tratamento com óleo de Nim em sacos de juta prevenindo a penetração de pragas por vários meses

3 .

A eficácia do Nim sobre ácaros e nematóides na agricultura 2,26,36,37

tem gerado interesse como um meio efetivo de controle dessas pragas, principalmente devido à característica da planta de ser inócua a organismos não-alvo

37 .

A atividade moluscocida do Nim também ocorre de maneira dose e tempo-dependente, com eficácia superior aos moluscocidas sintéticos

38 . Estudos envolvendo a ação do extrato de óleo da

semente de Nim sobre lesmas comestíveis não mostraram efeitos nocivos, já extratos crus da casca, raiz e folhas a 500 e 700 mg kg (-1) produziram mortalidade após 48h de exposição para Limicolaria aurora e em 72h para Archachatina marginata

39 .

O composto azadiractina se mostra eficaz na inibição da transmissão de Trypanosoma cruzi, agente causal da Doença Chagas, mediante sua ação sobre o inseto barbeiro Rhodnius prolixus

2.

Testes envolvendo o uso de extratos de folhas em cultura líquida mostraram inibição do crescimento vegetativo de Fusarium oxysporum f. sp. ciceri, Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, e Sclerotinia sclerotiorum. Há relatos da ação de extratos aquosos de folhas na inibição, em vários graus, de certos patógenos foliares do arroz: Pyricularia oryza, Rhizoctonia solani, Curvularia lunata, Aspergillus niger e Fusarium moniliforme, sendo o grau de atividade variável com o organismo em teste; Sarcocladium oryzae e Fusarium oxysporum f. sp. cepae, Phaeoisariopsis personata e Puccinia arachidis em amendoim, e Aspergillus niger e Aspergillus flavus também em amendoim

1,40. Outros relatos têm confirmado a atividade antifúngica dos extratos

2,41-44; efeitos

fungitóxicos in vitro 45

; efeito fungistático sobre fungos fitopatogênicos, 45

dentre eles Aspergillus flavus, Diaporthe phascolorum, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium verticillioides e Sclerotinia sclerotiorum

47; atividade fungistática com inibição da produção de aflatoxina B1 em

cultura submersa de Aspergillus spp aflatoxigênica 48

; inibição da formação de aflatoxina em Aspergillus parasiticus em níveis superiores a 90% com extrato de Nim 50% (v/v)

49. Análises por

cromatografia em camada delgada e cromatografia líquida de alta performance demonstram inibição da produção de patulina pelo fungo Penicillium expansum em concentrações de extrato aquoso 10%, superiores a 50 mg/ml, em meio de cultivo líquido

50.

Também de difícil controle, viroses de plantas se mostram suscetíveis à ação do Nim 51

.

Usos na pecuária e veterinária Além da ação repelente contra carrapato e mosca-do-chifre, o Nim vem sendo utilizado no

controle de pulgas e piolhos, na cicatrização e assepsia de ferimentos, na cura da sarna e como vermífugo

2.

O uso da torta de Nim como suplemento alimentar vem sendo avaliado com resultados sa-tisfatórios tanto do ponto de vista econômico, quanto da segurança, podendo até mesmo substituir a ração em alguns casos

52 . Rao et al.

53 avaliaram a ação da torta de sementes de Nim adicionada à

alimentação de cabras e por meio de análises sanguíneas verificaram redução no conteúdo lipídico e aumento de ácidos graxos insaturados, achados considerados benéficos na redução dos níveis de colesterol, não afetando a qualidade da carne.

Outros estudos indicam que o uso da torta de semente de Nim tratada com uréia em substituição à torta de amendoim na alimentação de ovelhas é uma excelente fonte protéica, com resultados positivos em relação ao ganho de peso, economia e segurança; entretanto pode ocorrer formação de microcálculos nos rins

54 .

As propriedades anti-helmínticas foram avaliadas contra Heligmosomoides polygyrus em ratos, não demonstrando efeito biológico significativo nesse modelo

55 . Estudos envolvendo atividade

anti-helmíntica em cordeiros também não mostraram eficácia quando comparado ao compostodereferência

56.

Usos na agricultura Produtos à base de Nim têm sido aplicados em culturas, por meio de polvilhamento do pó de

sementes e folhas, para controle de pragas como a lagarta e mediante pulverização de extratos aquosos ou de soluções de óleo emulsionável para controle de insetos e outras pragas foliares. A incorporação de folhas, frescas ou se-cas, no solo tem reduzido a população de nematóides, sendo que a ação do produto aumenta à medida que vai se decompondo. Cultivos de tomate, berinjela, repolho e couve-flor conduzidos em plantio intercalado com Nim têm demonstrado redução nas infestações por nematóides

2 .

Um dos principais problemas do uso de Nim é a durabilidade do composto azadiractina. Nas condições do campo, a atividade dos compostos se reduz rapidamente permanecendo por 4 a 8 dias, devido a fotodegradação provocada pela luz ultravioleta, baixa de pH e chuvas, havendo a necessidade de muitas aplicações por estação

3,4,57. Por outro lado, a derivação do produto natural

estabiliza a azadiractina aumentando sua atividade residual 4.

Três formulações básicas têm sido preconizadas para uso no manejo de pragas: extrato aquoso, óleo da semente e pó da semente, sen-do as soluções aquosas empregadas na pulverização de culturas no campo e as formulações em óleo ou pó na preservação de grãos estocados

58.

Aplicações de suspensão aquosa de extratos de Nim, por meio de pulverização foliar, sobre tomate e pimenta, em casa de vegetação e no campo, não só reduziram a incidência de doença como também aumentaram o rendimento, produzindo frutos mais saudáveis sem causar efeitos fitotóxicos 59. Estudos comparando a eficácia de produtos à base de Nim em relação ao praguicida hexacloro benzeno (BHC) demonstraram superioridade significativa na redução da oviposição, eclosão e do desenvolvimento larvar em Caryedon serratus Olivier

60. Nim tem sido aplicado em plantios

hidropônicos, demonstrando controle eficiente contra ataques por insetos, sendo que o efeito é con-centração e tempo dependente

61. Também o uso de produtos à base de Nim no manejo de pragas do

algodão tem sido visto com potencial para ser empregado em larga escala, por ser efetivo, econômico e ambientalmente seguro

62. Pesquisadores utilizando extratos de semen-tes puderam

demonstrar inibição significativa da nitrificação, promovendo a imobilização do sulfato de amônia e aumentando a eficiência do uso de N em diferentes tipos de solo

63. Segundo Majumdar et al.

64,

produtos à base de Nim são úteis no processo de inibição da nitrificação e podem ser utilizados em adição ao composto dicyandiamide (DCD) para reduzir a emissão de N2O a partir do cultivo de arroz. Experimentos empregando Nimin (extrato etanólico de Nim) em cultura de menta japonesa

(Mentha arvensis) demonstraram eficácia comparável ao DCD na redução da formação de NO3– no

solo, além de aumentar a produção da erva e o rendimento de óleos essenciais a partir do cultivo 65

.

Gajalakshmi & Abbasi 66

investigaram o uso de folhas de Nim como substrato para produção de vermifertilizante. Neste modelo, as minhocas se alimentavam do fertilizante de Nim com uma taxa de conversão em vermifertilizante superior a 7% ao dia. Segundo o estudo, a planta pode fornecer um fertilizante que funciona também como pesticida.

Xuan et al. 67

demonstraram o efeito alelopático proveniente de compostos fenólicos presentes na casca e folhas do Nim sobre a germinação e crescimento de alfafa (Medicago sativa L.), feijão (Vigna angularis), cenoura (Daucus carota L.), rabanete (Raphanus sativus L.), arroz (Oryza sativa L.), sesame (Sesamum indicum L.) e ervas-daninhas Echinochloa crus-galli, Monochoria vaginalis e Aeschynomene indica L. em laboratório e no solo.

Chaturvedi et al. 68

procurando aumentar e melhorar a produção da planta realizaram estudos, inicialmente envolvendo a produção do Nim em cultura e posteriormente

69 utilizando a propagação

clonal de árvores de Nim, escolhidas pelo conteúdo em azadiractina, e verificaram que a seleção promovia considerável melhoria na produção do composto, além de acelerar consideravelmente a produção do material para o plantio.

Usos na biorremediação Nim tem sido utilizado na descoloração de corantes têxteis sintéticos: o resíduo da casca de Nim

(rico em lignina e outros compostos fenólicos) é empregado para produção de lignina peroxidase por Phanerochaete chrysosporium sob fermentação sólida

70. Pó de folhas de Nim tem sido

utilizado com eficácia para remoção do corante Verde Brilhante presente em soluções aquosas, como uma alternativa ao uso de carvão ativado

71.

O comportamento da casca de Nim como bioabsorvente dos metais pesados tóxicos Cd2+

, Hg2+

, e Cr

3+, em submicro concentrações, na remediação ambiental a partir de lixo aquoso tem sido

investigado com resultados positivos 72

. Produtos de Nim também têm sido utilizados na remoção de amônia a partir de água salobra

73.

A casca da árvore é também utilizada no preparo de corantes, usados no tingimento de tecidos finos. Nim se mostra resistente aos gases poluentes, tolerante à seca e ao dióxido de enxofre e atua como indicador da presença de pó e fumaça, na redução da erosão do solo e purificando o ar

74.

Efeitos medicinais do Nim

Grandes variedades de atividades farmacológicas e aplicações medicinais são conhecidas a partir de várias partes da planta. Relatos na literatura têm exibido grande diversidade de funções biológicas a partir de um grupo de compostos presentes na planta. Apesar da exata composição do extrato de Nim ser ainda indeterminada, os componentes da folha solúveis em água têm provado ser eficazes no controle de várias doenças, incluindo câncer

75,76. Na literatura, têm sido descritas

atividades anti-sépti-cas, curativas, antiúlcera, antiinflamatória, antifertilidade, hipolipidêmica e hepatoprotetora

77. Dentre essas atividades, o efeito hepatoprotetor das folhas de Nim foi

demonstrado por meio de sua administração como pré-tratamento antes do uso de paracetamol. O extrato estabilizou os níveis séricos das enzimas marcadoras de dano hepático, resultados confirmados pelas análises histopatológicas realizadas

78. Extrato aquoso de folhas de A. indica tem

demonstrado capacidade em prevenir e reverter significativamente o dano hepatotóxico induzido por drogas antituberculares em ratos

79.

Estudos envolvendo o uso de extrato de folhas de Nim em formulações de gel dental mos-tram redução da placa bacteriana; folhas têm si-do utilizadas no tratamento de gengivites e periodontites 80

. Azadirachta indica mostrou atividade antiinflamatória, mediante a supressão da capacidade do patógeno Propionibacterium acnes de induzir espécies oxigênio reativas e citocinas pró-inflamatórias

81. A ação antibacteriana do óleo de Nim também foi demonstrada in vitro contra

bactérias patogênicas por meio da inibição da síntese da membrana celular bacteriana 82

. Efeitos gastroprotetores (anti-secretor e antiúlcera) têm sido observados com o uso de extrato da

casca, eqüipotentes à ranitidina e ao omeprazol 83

, assim como significante inibição da ulceração gástrica induzida por indometacina em ratos

84. Atividades hipoglicemiantes foram investigadas em

ratos normais e diabéticos, revelando redução significativa nos níveis de glicose sanguínea 85,86

; atividades sobre o sistema cardiovascular de gatos e rãs, resultando em efeitos hipotensivos e redutores da atividade cardíaca com o uso de extrato hidroalcoólico de folhas, também têm sido relatadas

87. Estudos avaliando o papel protetor de extratos de sementes em ratos com diabetes

(induzida por estreptozotocina) indicam prevenção do estresse oxidativo no coração e eritrócitos, protegendo os animais do dano cardíaco

88.

Produtos à base de óleo de Nim têm demonstrado efeitos antifertilidade 89-91

, ação espermicida direta e atividade antimicrobiana significativa contra patógenos sexualmente transmissíveis

91.

Killare & Shrivastan 92

realizaram estudos sobre o efeito do extrato de folhas em espermatozóides humanos e constataram potente ação espermicida, sendo que aproximadamente 3 mg de extrato são necessários para imobilizar e matar 100% de 1 milhão de espermatozóides em 20 segundos.

Sementes e folhas administradas oralmente possuem imunomoduladores que induzem reações imunocelulares, causando interrupção completa da gestação antes do estágio de implantação em roedores e primatas, de forma reversível, sendo a fertilidade restaurada nos ciclos subseqüentes. Os efeitos imunomoduladores têm recebido grande atenção, devido às suas propriedades diuréticas, antimicrobianas, antiinflamatórias, antipiréticas, anti-tumorais, e indutoras de interferon

93,94.

Potente atividade citotóxica contra um grupo de células humanas cancerígenas foi obtida in vitro 95

. O efeito contraceptivo pós-coital do óleo de Nim não envolve estrogênio ou progesterona, podendo ser considerado como efeito não-hormonal, portanto, não ocasionando os efeitos colaterais dos contraceptivos esteróides

96. Em adição à ação contraceptiva, têm sido descritas ações

antimicrobianas associadas (antibacteriana, antifúngica e antiviral), úteis na prevenção contra doenças

94.

Extrato de folhas administrado em hamsters, com carcinoma bucal induzido por 7,12-dimetil-benz[a]antraceno (DMBA) promoveu supressão do câncer. Estudos sugerem mecanismo de ação por meio de modulação da peroxidação lipídica, antioxidantes e sistemas de detoxificação

76. Re-

sultados de investigações envolvendo a ação quimiopreventiva, possivelmente mediada pela modulação da peroxidação lipídica, antioxidantes e detoxificação de enzimas, são altamente promissores na terapia do câncer, incrementando os mecanismos antioxidantes de defesa do hospedeiro

76,97-99. Flavonas isoladas de flores de Nim mostraram efeitos antimutagênicos baseados

na inibição da ativação enzimática de aminas heterocíclicas100

. Folhas de Nim podem atuar como mediador na ativação da resposta imune. Baral & Chatto-

padhyay 75

, estudando em ratos o efeito profilático e terapêutico das folhas sobre carcinoma de Ehrlich e melanoma B16, verificaram que o extrato é capaz de proteger o animal contra o crescimento do tumor e assim atuar como agente quimiopreventivo, mediante a ativação imune e/ou outros mecanismos de defesa do hospedeiro.

Existem vários relatos quanto à eficácia da atividade do extrato aquoso de folhas contra grande número de viroses como poxvírus, poliomielite, herpesvírus

94. O composto azadiractina e o extrato

aquoso de folhas também demonstram ação inibitória in vitro e in vivo sobre a replicação do vírus da Dengue tipo 2, confirmada por ensaios de inibição viral e RT-PCR

101. A planta possui efeito

antiviral contra o grupo Coxsackie B in vitro, segundo estudos realizados por Badan et al. 102

. Nim tem sido descrito como possuindo atividade antimalárica: estudos relatam efeitos do extrato

de sementes sobre o crescimento e desenvolvimento dos estágios sexual e assexual do parasita humano da malária Plasmodium falciparum. O efeito anti-plasmodial ocorre também sobre parasitas já resistentes a outras drogas antimaláricas (cloroquina e pirimetamina), sendo ativo não apenas contra as formas do parasita responsáveis pelos aspectos clínicos da doença, mas também contra as formas responsáveis pela transmissão da malária

103-105. Isah et al.

106 avaliaram as

propriedades antimaláricas e a padronização do uso de tabletes de Nim em ratos, evidenciando a existência de atividade antimalárica em tabletes preparados a partir da casca e folhas.

O componente bioativo azadiractina tem demonstrado afetar o desenvolvimento do protozoário parasita Trypanosoma cruzi em diferentes espécies do vetor triatomíneo

103,107.

Nim tem demonstrado atividade antidermatofítica in vitro contra os dermatófitos Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton violaceum, Microsporum nanum, Epidermophyton floccosum

108.

Toxicidade Testes de toxicidade em mamíferos, utilizando produtos à base de Nim, não causaram mor-

talidade nas doses máximas por via oral aguda, dermal ou por inalação. Extrato aquoso de folhas a

10%, administrado via oral por 24 horas, mostrou leve efeito diurético. Em cães, a administração intravenosa causou diurese, já a administração intramuscular não teve efeito. Atividades mutagênicas e relacionadas a possíveis danos cromossômicos, investigadas in vivo e in vitro, forneceram resultados negativos

2,3. A DL50/24h do óleo de Nim foi estabelecida como 14 ml/kg

em ratos e 24 ml/kg em coelhos 109

. Testes avaliando irritação ocular e cutânea primárias, inalação aguda, resposta imune e sensibilização não forneceram resultados preocupantes do ponto de vista toxicológico

3.

Raizada et al. 110

revelam ausência de efeitos adversos com administração de azadiractina 12% via oral, a ratos machos e fêmeas até 1500 mg/ Kg/dia por 90 dias, não produzindo sinais de to-xicidade, mortalidade, alterações de peso ou dos parâmetros sanguíneos.

Estudos toxicológicos com óleo de Nim não demonstraram presença de efeitos adversos nos parâmetros reprodutivos em ratos monitorados por três gerações, podendo ser recomendado para uso humano

111.

Efeitos do extrato aquoso foram investigados em Tilapia zilli (Gervais), em condições de la-boratório por um período de 96 horas, demonstrando toxicidade aguda ao animal

112.

Extratos podem causar fitotoxicidade quando em altas concentrações, dependendo da espécie, idade e fase de desenvolvimento da planta sobre a qual são aplicados. Todavia, quando utilizados no campo, nas doses recomendadas, não têm demonstrado tal efeito. Além disso, a azadiractina é totalmente biodegradável e sua meia vida no solo é de cerca de 20 dias

2.

Produtos à base de Nim não mostram toxicidade a abelhas produtoras de mel na faixa de 500 ppm; minhocas têm se beneficiado com a aplicação de extratos no solo, com aumento de peso e multiplicação; aranhas, borboletas e formigas não apresentam efeitos prejudiciais a partir da exposição aos extratos

2,3,113.

Em estudos sobre a função tireoidiana em ratos machos, o extrato de folhas exibiu diferentes efeitos: em altas doses se mostrou não-seguro quanto à função tireoidiana [decréscimo dos níveis séricos de triiodotironina (T3) e aumento dos níveis de tiroxina (T4)]; promoveu aumento na peroxidação lipídica hepática e decréscimo na atividade da glicose-6-fosfatase; já em doses baixas nenhum efeito foi observado

114.

Estudos investigando o efeito do produto Vepacide (praguicida à base de Nim) sobre as enzimas fostatase ácida e alcalina em diferentes tecidos de ratos albinos Wistar machos e fêmeas, indicam aumentos significativos das enzimas no soro, rins, pulmões e tecido hepático. As alterações enzimáticas se mostraram dose e tempo dependentes, reversíveis com a remoção do toxicante e passíveis de serem utilizadas como biomarcadores de exposição ao produto

115.

Raji et al. 84

verificaram que a administração intraperitonial de Azadirachta indica (1000 mg/kg de extrato) não produziu sinal de toxicidade em ratos, nem alteração significante no peso corpóreo ou de órgãos durante 3 semanas após aplicação, não sendo observados sintomas de diarréia, comportamento estereotípico ou morte durante esse período. Entretanto, a administração oral de 3200 mg/kg de extrato causou 100% de mortalidade.

Segundo estudos realizados por Khan & Awasthy 116

o composto azadiractina pode ser considerado como um carcinógeno genotóxico devido à presença da seqüência (-O-CH=) na estrutura em meio anel furano do composto, como ocorre em muitos carcinógenos, incluindo aflatoxinas. Além disso, a eletronegatividade do composto é da mesma magnitude que ocorre nas moléculas de DNA. A alta incidência de alterações sinápticas e variações numéricas em cromossomos confirmam a citotoxidade do extrato, em concordância com observações realizadas em cromossomos mitóticos. O estudo revela também um aumento na freqüência de esper-matozóides aberrantes, juntamente com diminuição da contagem. Dessa forma, os danos potenciais do extrato não podem ser ignorados, tendo em vista o longo período de risco genético ao homem. Kasturi et al.

117 verificaram alterações ultraestruturais, induzidas pelo uso de folhas de Nim, nos

testículos de ratos albinos, mediante propriedades antiespermatogênicas e antiandrogênicas,

afetando assim a espermatogênese. Pesquisas realizadas com o produto Nimbo-kil-60 EC (inseticida à base de óleo de semente de

Nim) para determinação de toxicidade em mamíferos revelaram ausência de efeitos adversos ou doença nos animais testados. A LD50 foi estabelecida em 16 ml/kg, com ausência de alterações histológicas em órgãos vitais

118.

Raizada et al. 110

realizaram estudos toxicológicos administrando azadiractina via oral a ratos machos e fêmeas nas doses de 500, 1000 e 1500 mg/kg/dia por 90 dias. Não foram observados sinais de toxicidade, mortalidade, alterações patológicas ou séricas, sendo a dose de 1500 mg/kg indicada como dose basal para determinação do nível de ausência de efeitos do composto para calcular sua margem de segurança.

CONCLUSÃO O uso da planta Nim vem se tornando importante na terapia herbal alternativa, graças aos já

comprovados efeitos curativos. A planta é uma constante fonte de novos e únicos compostos fitoquímicos utilizados no desenvolvimento de novos fármacos contra várias doenças humanas. Produtos à base da planta estão sendo estudados para o desenvolvimento de drogas seguras e agentes agroquímicos humana e ambientalmente seguros.

Muitas vezes, o foco das pesquisas tem sido o desenvolvimento de métodos de controle de pragas, em que estas não tenham que ser mortas instantaneamente, desde que suas populações possam ser incapacitadas, tornando-se inofensivas às pessoas. Os efeitos precisos de vários tipos de extratos da árvore Nim, quanto ao controle de pragas, são freqüentemente difíceis de serem apontados, uma vez que a complexidade dos compostos e seus diversos modos de ação dificultam a elucidação dos mecanismos envolvidos.

O composto azadiractina exibe boa eficácia contra importantes pragas na agricultura, possui mínimo ou nenhum impacto sobre organismos não-alvo, é compatível com outros agentes de controle biológico e mostra boa adaptação aos programas de manejo integrado de pragas. Já vida residual relativamente curta dos princípios ativos presentes nos extratos de Nim pode ser considerada uma desvantagem do ponto de vista econômico, entretanto, ecologicamente, produtos com tais características não perturbam o ecossistema nem causam o aparecimento de novas pragas.

Os extratos podem ser utilizados quando os métodos de manejo da lavoura não forem suficientes para se evitar perdas, sendo bastante promissores para implementação em programas de controle alternativo de pragas, pois a planta apresenta características importantes como ser rústica, não invasora, perene, não necessitar ser destruída para obtenção dos extratos, ter alto te-or de compostos ativos solúveis em água e de fácil extração com baixo custo.

Produtos à base de Nim possuem diferentes efeitos sobre insetos, sendo que os efeitos sobre multiplicação e crescimento são os mais intensos contra grande número de pragas e de grande interesse para o manejo de cultivares. Outros efeitos secundários têm sido observados, incluindo repelência, antioviposição, esterilidade, redução da fecundidade, perda da habilidade de vôo, perturbação da comunicação sexual e redução da motilidade intestinal.

Embora esses produtos possuam algumas falhas, funcionam bem como ferramenta no mane-jo integrado de pragas, são uma alternativa ambientalmente segura aos químicos sintéticos, têm efeitos significativos sobre pragas sem prejudicarem organismos benéficos aos plantios, e os estudos toxicológicos têm indicado segurança para os mamíferos. Entretanto, achados envolvendo toxicidade aguda em peixes sob condições laboratoriais devem ter suas implicações sobre o meioambiente, discutidas e reavaliadas.

Em relação aos usos medicinais da planta, pode-se destacar suas atividades antimicrobianas, antivirais e antifúngicas, associadas à atividade contraceptiva pós-coital de natureza nãohormonal, portanto, com efeitos colaterais menores que os provocados pelos contraceptivos esteróides, além de promover e manter a saúde dos órgãos sexuais femininos. Já a ação sobre o sistema reprodutor masculino deve ser vista com cautela e necessita de maiores estudos. Quanto às atividades antivirais, o uso de novos agentes antivirais de origem natural, não-tóxi-cos, de fácil uso e mais

baratos, podem ser um grande auxílio às populações de regiões tropicais e subtropicais, mais pobres e mais acometidas pelas doenças.

Dados sugerindo o uso da planta no controle dos níveis sanguíneos de glicose são promissores em direção à prevenção e controle do diabetes, assim como relatos sobre os efeitos quimio-preventivos e antitumorais são valiosos para o desenvolvimento de novas e modernas drogas.

Em relação aos resultados de estudos toxicológicos, os efeitos dos extratos parecem depender da quantidade consumida, enquanto baixas doses não são tóxicas, altas doses exibem disfunção tireoidiana e efeitos hepatotóxicos.

Agradecimentos. Nós gostaríamos de agradecer a Prof.ª Maria Aparecida Neri Galerani e ao Armando Luiz de Sá Ravagnani pela revisão gramatical do manuscrito e ao CNPq pelo suporte financeiro desse trabalho.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1.Locke, J.C. (1995) “Fungi” In: “The Neem Tree”. Edited By H. Schmutterer, VHC, 118-26. 2.Martinez, S.S. (Ed) (2002) O Nim -Azadirachta indica Natureza, Usos Múltiplos, Produção. Publicado pelo IAPAR - Londrina. 3.Schmutterer, H. (1990) Annu. Rev. Entomol. 35: 271-97. 4.Verkerk, R.H.J. & D.J. Wright (1993) Pest. Sci. 37: 83-91. 5.Lee, S.M., J.I. Olsen, M.P. Schweizer & J.A. Klocke (1988) Phytochemistry 27: 2773-5. 6. Deota, P.T., P.R. Upadhyay, K.B. Patel, K.J. Mehta, B.V. Kamath & M.H. Mehta (2000) J.

Liquid Chrom. Rel. Technol. 23: 2225-35. 7. Schaaf, O., A.P. Jarvis, A. Van Der Esch, G. Giagnacovo & N.J. Oldham (2000) J. Chrom. A.

886: 89-97. 8. Dai, J., V.A. Yaylayan, G.S.V. Raghavan, J.R. Parè & Z. Liu (2001) J. Agric. Food Chem. 49:

1169-74. 9. Siddiqui, B.S, F. Afshan, T. Gulzar, R. Sultana, S.N. Naqvi & R.M. Tariq (2003) Chem. Pharm.

Bull. 51: 415-7. 10. Siddiqui, B.S., F. Afshan, S. Faizi, S.N. Naqvi & R.M. Tariq (2002) J. Nat. Prod. 65: 1216-8. 11.Hallur, G., A. Sivramakrishnan & S.V. Bhat (2002) J. Nat. Prod. 65: 1177-9. 12. Luo, X., Y. Ma, S. Wu & D. Wu (1999) J. Nat. Prod. 62: 1022-4. 13. Siddiqui, B.S., F. Afshan & S. Faizi (2001) Tetrahedron 57: 10281-6. 14. Ramji, N., K. Venkatakrisshnan & K.M. Madyastha (1998) Phytochemistry 49: 265-7. 15. Sidhu, O.P., V.Kumar & H.M. Behl (2003) J. Agric. Food Chem. 51: 910-5. 16. Jain, A., A.K. Singh, H Lal & S.K. Banerjee (2002) Indian Forester 128: 786-94. 17. Koul, O. & M.B. Isman (1991) J. Insect Physiol. 37: 591-8. 18. Abudulai, M., B.M. Shepard & P.L. Mitchell (2003) J. Entomol. Sci. 38: 398-408. 19. Martinez, S. & H.F. Van Emden (2001) Neotropical Entomol. 30: 113-25. 20. Gajmer, T., R. Singh, R.K. Saini & S.B. Kalidhar (2003) J. Med. Arom. Plant Sci. 25: 108-12. 21. Carpinella, M.C., M.T. Defago, G. Valladares & S.M. Palacios (2003) J. Agric. Food Chem. 51:

369-74. 22. Govindachari, T.R., G. Suresh, Geetha-Gopalakrish-nan & S.D. Wesley (2000) J.

Appl.Entomol. 124: 287-91. 23.Al-Rajhy, D.H., A.M.Alahmed, H.I. Hussein & S.M. Kheir (2003)Pest Manag. Sci. 59: 1250-4. 24. Gupta, G.P. & A. Birah (2001) Indian J. Agric. Sci.71: 325-8. 25. Patil, R.S. & K.B. Goud (2003) J. Entomol. Res. New Delhi 27: 13-8. 26. Lale, N.E.S. & A. Mustapha (2000) J. Stored Prod. Res. 36: 215-22. 27. Gajmer, T., R. Singh, R.K. Saini & S.B. Kalidhar (2002) J. Appl. Entomol. 126: 238-43. 28. Mancebo, F., L. Hilje, G.A. Mora & R. Salazar (2002) Crop Prot. 21: 107-12. 29. Webb, E.C. & M. David (2002) South African J. Anim. Sci. 32: 1-6. 30. Azam. K.M., A.A. Raeesi, A. Srikandakumar & W.S. Bowers (2003) Crop Res. Hisar. 25: 567-

71.

31. Dua, V.K., B.N. Nagpal & V.P. Sharma (1995) The Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health. 26: 180-2.

32. Sharma, S.K., V.K. Dua & V.P. Sharma (1999) Acta Tropica. 72: 39-52. 33. Palsson, K. & T.G.T. Jaenson (1987) Vet. Human Toxicol. 29: 16-9. 34.Rahman, M.M., M.I. Hossain & M.U. Ameen (2001) Bangladesh J. Zool. 29: 29-36. 35. Elhag, E.A., E.R. Abd, N.H. El & A.A. Zaitoon (2001) Indian Vet. J. 78: 199-201. 36. Abdel, S.S. & A.A. Zayed (2002) Vet. Parasitol. 106: 89-96. 37. Akhtar, M. (2000) Intern. Pest Cont. 42: 16-7. 38. Singh, K., A. Singh & D.K. Singh (1996) J. Ethnopharmacol. 52: 35-40. 39. Ebenso, I.E. (2004) Pest Manag. Sci. 60: 178-82. 40. Bhonde, S.B., S.G. Deshpande & R.N. Sharma (1999) Hindustan Antibiot. Bull. 41: 22-4. 41. Govindachari, T.R., G. Suresh & S. Masilamani (1999) Fitoterapia 70: 417-20. 42. Verma, D.K., V.J. Tripathi, V. Taneja & B.K. Rana (1998) Indian J. Pharm. Sci. 60: 305-6. 43. Owolade, O.F., A.N. Amusa & Y.O.K. Osikanlu (2000) Cer.Res. Commun. 28: 323-7. 44. Amandioha, A.C. (2000) Crop Prot. 19: 287-90. 45. Hirose, E., P.M.O.J. Neves, Zequi, J.A.C, L.H. Martins, C.H. Peralta & J.A. Moino (2001)

Brazilian Arch. Biol. Technol. 44: 419-23. 46. Coventry, E. & E.J. Allan (2001) Phytoparasitica 29: 441-50. 47. Carpinella, M.C., L.M. Giorda, C.G. Ferrayoli & S.M. Palacios (2003) J. Agric. Food Chem. 51:

2506-11. 48. Zeringue, H.J.J., B.Y. Shih & D. Bhatnagar (2001) Phytoparasitica 29: 361-6. 49. Allameh, A., A.M. Razzaghi, M. Shams, M.B. Rezaee & K. Jaimand (2002) Mycopathol. 154:

79-84. 50. Mossini, S.A.G.; K.P De Oliveira, & C. Kemmelmeier. (2004) J. Basic Microbiol. 44: 106-13. 51. Tewari, K.K. (2001) J. Phytol. Res. 14: 207-8. 52. Anandan, S., V.R.B. Sastry, L.M. Musalia & D.K. Agrawal (1996) Small Rum. Res. 22: 205-12. 53. Rao, V.K. , B.N Kowale & A.K. Verma (2003) Small Rum. Res. 47: 213-9. 54. Musalia, L.M., S. Anandan, V.R.B. Sastry & D.K. Agrawal (2000) Small Rum. Res. 35: 107-16. 55. Githiori, J.B., J. Hoglund, P.J. Waller & B.R. Leyden (2003) Vet. Parasitol. 118: 215-26. 56. Hordegen, P., H. Hertzberg, J. Heilmann, W. Lang-hans & V. Maurer (2003) Vet. Parasitol.

117: 51-60. 57. Caboni, P., M. Cabras, A. Angioni, M. Russo & P. Cabras (2002) J. Agric. Food Chem. 50:

3491-4. 58. Lale, N.E.S. & H.T. Abdulrahman (1999) J. Stored Prod. Res. 35: 135-43. 59. Abbasi, P.A., D.A. Cupples & G. Lazarovits (2003) Can. J. Plant Pathol. 25: 41-8. 60. El-Atta, H.A. & A. Ahmed (2002) J. Appl. Entomol. 126: 577-82. 61. Hummel, E. & H. Kleeberg (2002) Meded. Rijksuniv. Gent. Fak. Landbouwkd Toegep Biol. Wet

67: 631-9. 62. Gahukar, R.T. (2000) Int. J. Pest Manag. 46: 149460. 63. Zhang, X., Q. Shen, J. Tan & Z. Mao (2002) Ying Yong Sheng Tai Xue Bao. 13: 1417-20. 64. Majumdar, D., S. Kumar, H. Pathak, M.C. Jain & U. Kumar (2000) Agric. Eco. Environ. 81:

163-9. 65. Kiran, U. & D.D. Patra (2003) Int. J. Food Microbiol.15: 223-30. 66. Gajalakshmi, S. & S.A. Abbasi (2004) Biores. Technol. 92: 291-6. 67. Xuan, T.D., T. Eiji, T. Hiroyuki, M. Mitsuhiro, T.D. Khanh & I.M. Chung (2004) Crop Prot.

23: 335-45. 68. Chaturvedi, R., M.K. Razdan & S.S. Bhojwani (2003) J. Plant Physiol. 160: 557-64. 69. Chaturvedi, R., M.K. Razdan & S.S. Bhojwani (2004) Plant Sci. 166: 501-6. 70. Verma, P. & D. Madamwar (2002) Folia Microbiol. 47: 283-6. 71. Bhattacharyya, K.G. & A. Sarma (2003) Dyes Pigm. 57: 211-22. 72. Tiwari, D., S.P. Mishra, M. Mishra & R.S. Dubey (1999) Appl. Rad. Isot. 50: 631-42.

73. Krishnani, K.K., B.P. Gupta, K.O. Joseph, M. Muralidhar & A. Nagavel (2002) J. Environ. Sci. Health Part. A. Tox. Hazard Subst. Environ. Eng. 37: 893904.

74. Amirthalingam, M. (2001) Indian Forester 127: 1336-41. 75. Baral, R. & U. Chattopadhyay (2004) Int. Immunopharmacol. 4: 355-66. 76. Balasenthil, S., S. Arivazhagan, C.R. Ramachandran, V. Ramachandran & S. Nagini (1999) J.

Ethnopharmacol. 67: 189-95. 77. Chattopadhyay, R.R. (1999) J. Ethnopharmacol. 67: 373-6. 78. Yanpallewar, S.U., S. Sen, S. Tapas, M. Kumar, S.S. Raju & S.B. Acharya (2003)

Phytomedicine 10: 3916. 79. Kale, B.P., M.A. Kothekar, H.P. Tayade, J.B. Jaju & M. Mateenuddin (2003) Indian J.

Pharmacol. 35: 177-80. 80. Pai, M.R., L.D. Acharya & N. Udupa (2004) J. Ethnopharmacol. 90: 99-103. 81. Jain, A. & E. Basal (2003) Phytomedicine 10: 34-8. 82. Baswa, M., C.C. Rath, S.K. Dash & R.K. Mishra (2001) Microbios. 105: 183-9. 83. Bandyopadhyay, U., K. Biswas, R. Chatterjee, D. Bandyopadhyay, I. Chattopadhyay, C. K.

Ganguly, T. Chakraborty, K. Bhattacharya & R.K. Banerjee(1997) Physiol. Mol. Plant Pathol. 51: 181-94.

84. Raji, Y., I.A. Ogunwande, C.A. Osadebe & G. John (2004) J. Ethnopharmacol. 90: 167-70. 85. Kar, A., B.K. Choudhary & N.G. Bandyopadhyay (2003) J. Ethnopharmacol. 84: 105-8. 86. Chattopadhyay, R.R. (1999) J. Ethnopharmacol. 67: 367-72. 87. Chattopadhyay, R.R. (1997) Gen. Pharmacol. 28: 449-51. 88. Gupta, S., M. Kataria, P.K. Gupta, R.C. Murganandan & R.C. Yashroy (2004) J. Ethnopharmacol. 90: 185-9. 89. Kaushic, C. & S.N. Upadhyay (1995) Contraception. 51: 203-7. 90. Riar, S.S., C. Devkumar, R.C. Sawhney, G. Ilavazhagan, J. Bardhan, A.K. Kain, P. Thomas, R. Singh, B. Singh & R. Parshad (1991) Contraception. 44: 319-23. 91. Garg, S., G.P. Talwar & S.N. Upadhyay (1998) J. Ethnopharmacol. 60: 235-46. 92. Khillare, B. & T.G. Shrivastav (2003) Contraception 68: 225-9. 93. Mukherjee, S., S. Garg & G.P. Talwar (1999) J. Ethnopharmacol. 67: 287-96. 94. Sairam, M., G. Ilavazhagan, S.K. Sharma, S.A. Dhanraj, B. Suresh, M.M. Parida, A.M. Jana, K.

Devendra & W. Selvamurthy (2000) J. Ethnopharmacol. 71: 377-82. 95. Nanduri, S., S.S.R. Thunuguntla, V.K. Nyavanandi, S. Kasu, P.M. Kumar, P. Sairam, S.

Rajagopal, R.A. Kumar, D.S. Deevi, R. Rajagopalan & A. Venkateswarlu (2004) Ind. Crops Prod. 19: 69-75.

96. Prakash, A.O., R.K. Tewari & R. Mathur (1988) J. Ethnopharmacol. 23: 53-9. 97. Arivazhagan, S., S. Balasenthil & S. Nagini (2000) Phytother Res. 14: 291-3. 98. Arivazhagan, S., S. Nagini, S.T. Santhiya & A. Ra-mesh (2003) Pharmazie 58: 750-2. 99. Subapriya, R., R. Kumaraguruparan, S.K. Abraham & S. Nagini (2004) Drug. Chem. Toxicol.

27: 15-26. 100. Nakahara, K., M.K. Roy, H. Ono, I. Maeda, M.O. Kameyama, M. Yoshida & G.

Trakoontivakorn (2003) J. Agric. Food Chem. 51: 6456-60. 101. Parida, M.M., C. Upadhyay, G. Pandya & A.M. Jana (2002) J. Ethnopharmacol. 79: 273-8. 102. Badam, L., S.P. Joshi & S.S. Bedekar (1999) J. Commun. Dis. 31: 79-90. 103. Dhar, R., K. Zhang, G.P. Talwar, S. Grag & N. Kumar (1998) J. Ethnopharmacol. 61: 31-9. 104. Jones, I. W., A.A. Denholm, S.V. Ley, H. Lovell, A. Wood & R.E. Sinden (1994) FEMS

Microbiol. Lett. 120: 267-74. 105. Khalid, S.A., H. Duddeck & M. Gonzales-Sierra (1989) J. Nat. Prod. 52: 922-27. 106. Isah, A.B., Y.K Ibrahim & E.O. Iwalewa (2003) Phytother. Res. 17: 807-10. 107. Gonzalez, M.S. & E. S. Garcia (1992) J. Invert. Pathol. 60: 201-5. 108. Natarajan, V., S. Pushkala, V.P. Karuppiah & P.V. Prasad (2002) Indian J. Pathol. Microbiol.

45: 311-3.

109. Gandhi, M., R. Lal, A. Sankaranarayanan, C.K. Banerjee & P.L. Sharma (1995) Biores. Technol. 51: 233-9.

110. Raizada, R.B., M.K. Srivastava, R. A. Kaushal & R.P. Singh (2001) Food Chem. Toxicol. 39: 477-83.

111. Chinnasamy, N., N. Harishankar, P. Uday Kumar & C. Rukmini (1992) Intern. J. Immunopharmacol. 14: 1187-93.

112. Omoregie, E. & M.A. Okpanachi (1997) Acta Hydro biol. 39: 47-51. 113. Akhtar, M. (1997) Crop Prot. 16: 251-6. 114. Panda, S. & A. Kar (2000) Pharmacol. Res. 41: 419-22. 115. Rahman, M.F. & M.K.J. Siddiqui (2003) Vet. Parasitol. 117: 51-60. 116. Khan, P.K. & K.S. Awasthy (2003) Food Chem Toxicol. 41: 1325-8. 117. Kasturi, M., R.N. Ahamed, K.M. Pathan, B. Manivannan & R.H. Aladakatti (2002) J. Basic

Clin. Physiol. Pharmacol. 13: 311-28. 118. Kazmi, S.A.R. N.M. Qadri & Y. Badar (2001) Pakistan J. Sci. Ind. Res. 44: 234-8.

INHIBITION OF CITRININ SYNTHESIS IN Penicillium citrinum BY Azadirachta

indica A. Juss (Meliaceae) IN CULTURE.

Simone Aparecida Galerani Mossini and Carlos Kemmelmeier1

Departamento de Bioquímica, Universidade Estadual de Maringá, Maringá – PR, Brasil.

Abstract. The efficacy of different concentrations of the aqueous extract of neem leaf (3.12,

6.25, 12.5, 25 and 50 mg/ml) on growth and citrinin production in three isolates of

Penicillium citrinum was investigated in laboratory conditions. Mycotoxin production by the

isolates was suppressed depending on the concentration of the plant extract added to culture

media at the time of spore inoculation. Citrinin production in fungal mycelia grown for 21

days in culture media containing 3.12 mg/ml was inhibited by approximately 80% in three

isolates of P. citrinum. High-performance liquid chromatography was applied to the analyses.

Vegetative growth was assessed, but neem extract failed to inhibit it. Neem leaf extract

showed fungitoxic activity against pathogenic fungi tested, without it did not cause retardation

in fungal growth.

Key words: Penicillium citrinum, citrinin inhibition, Azadirachta indica, neem.

Title Running Head: Inhibition of citrinin production by neem extracts

Introduction

Due to the widespread nature of fungus in the environment, mycotoxins are considered

unavoidable contaminants in foods and feeds. Citrinin contamination by P. citrinum has been

reported in agricultural commodities, food and feedstuffs [1].

Recently there has been considerable interest on the preservation of grains by using natural

products to retard growth and mycotoxin production effectively. Owing to health and

economic concerns, several searches were undertaken to discover compounds that would

safely be used as substitutes for fungicides to inhibit fungus growth or mycotoxin production.

A tree, Azadirachta indica A. Juss (Meliaceae), called neem, has had excellent results, and is

one of the main sources of potentially active metabolites on a wide spectrum of pests and low

toxicity to non-target organisms [2, 3, 4]. One of the main feature of neem extracts,

particularly those from leaves, is that they do not cause retardation in fungal growth, but

inhibit aflatoxin production [5]. In vitro investigations confirmed the inhibitory effects of

neem on aflatoxin [6, 7] and patulin production [8]. Current research investigates

effectiveness of water extracts of neem leaves on citrinin production and growth of isolates of

P. citrinum.

Material and Methods

Microorganisms. Three citrinin-producing isolates of Penicillium citrinum (K1, K4 and K8),

from the culture collection of the Laboratory of Chemistry and Physiology of

Microorganisms (Department of Biochemistry, State University of Maringá – Pr) and stored

in silica, were used.

Preparation of neem leaf extract (NLE): Leaves of Azadirachta indica A. Juss (Meliaceae)

were obtained from the Agricultural Institute of the State of Paraná (IAPAR) in Londrina PR

Brazil. A 10% water NLE was prepared as described by Mossini [8].

Cultures conditions for citrinin production and extraction. Citrinin was produced in

liquid potato-dextrose medium (PD) as described by Wu et al [9]. PD was used in controls

and in an extract of neem leaves. Inocula containing 105 spores of each strain of P. citrinum

were added to 3 ml of PD medium in 25 ml flasks (20X100mm) Pyrex® and incubated at

26±0.5°C for 21 days. Treatments in four replicates consisted of 10% freeze-dried aqueous

NLE at concentrations 3.12, 6.25, 12.5, 25 and 50 mg/ml. On parallel, dry weights were

obtained by freeze-drying of cultures (controls and treatments): the flasks were weighed prior

to the addition of medium, inocula and neem extract, and posterior to the incubation period, in

four replicates. Remaining number of spores after incubation period in controls and in

treatments was obtained by a haematocytometer. Cultures were extracted three times with 10

ml of chloroform and treated with anhydrous sodium sulfate [10], filtered through filter paper

and evaporated to dryness. Residues were dissolved in 0.1 ml of chloroform.

Mycelium inhibition test . Effects of NLE on radial growth and colony characteristics of P.

citrinum isolates were determined by growth on PDA medium containing 12.5 mg/ml of NLE

and on an extract-free medium, according to the poisoned plate technique [11]. Media PDA

and PDA-extract were inoculated at the center of the plate by holding it in an inverted

position [12]. Plates were incubated for 7 days at 25oC. Four replicates were performed for

each medium in two separate experiments. The radial growth of fungi was measured on each

plate and compared, as described by Amandioha [13]. The macroscopic and microscopic

morphological features of the colonies were determined by visual comparison and by 0.1%

Lactofuchsin staining [12].

Citrinin determination . Analyses were performed according to Betina [10]. Citrinin

(Sigma®) standard was prepared in ethanol (1 mg/ml) and stored at 4oC. Extracts (dissolved

in chloroform) and standard, underwent TLC on 20 x 20 cm Aluminium plates (Silica gel 60

– G. Merck®), with toluene : ethyl acetate : formic acid (6 : 4: 0.5, v/v). After development

the plates were exposed to 365nm ultraviolet light (UV). Citrinin appears as a fluorescent

yellow spot. Phenolic group in citrinin has been estimated by Folin-Phenol reagent [14], with

linear function of the concentration for a range of 5-100 µg/ml.

HPLC analysis was performed to confirm espectrofotometer results. Residues were dissolved

in an appropriate volume of mobile phase (1ml for all samples, except for K8 control (5ml),

filtered through a 0.45 µm disposable syringe filter (Micro Filtration Systems®) prior to

injection into the chromatograph. Aliquots of 20 µl were injected on HPLC column and

analysis were accomplished using a Shimadzu® Liquid Chromatograph, equipped with an LC-

10AD pump, a Rheodine® injector, an SPD-10A UV detector, a CBM-101 Communications

Bus Module, and a Class-CR10 Workstation system. A reverse-phase Shimpack® GLC-ODS

(M) column (150 x 4.6 mm, 5 µm) was used, at room temperature, together with the same

type of pre-column (10 x 4.6 mm). The mobile phase was acetonitrile-isopropanol-8.10–2 M

phosphoric acid (35:10:55) with a flow rate of 0.8 ml/min for an isocratic run of 30 min.

Absorbance of samples and standard was detected at 360 nm. Retention times and peak areas

were calculated by Class-CR10 software. Comparison of sample retention times with that of

the standard identified the presence of citrinin in the samples. The relationships between peak

height and area and the amount injected were linear over the ranges 2.5-50 ng. The detection

limit was 10 ng/g for citrinin. All solvents used were of analytical and chromatograph grade.

Recovery Experiments. Extraction procedure for espectrofotometer experiments was

validated by the addition of citrinin standard (1mg/ml of ethanol: 10, 25 and 50 µl) to liquid

PD (3 ml), extracted, spotted on plates and analyzed, as has been described for samples.

Known aliquots of citrinin (5-50µg) were also spotted, developed, detected, eluted, and

estimated as samples to check on their recovery from plates. The percentage of added citrinin

recovery in PD medium varied between 38% (to 10 µg) and 52% (to 50 µg), while recovery of

known amounts of citrinin from plates averaged 98.4%.

Statistical Analysis. Statistical significance between control and experimental rates was

calculated according to Turkey’s Test using the Graph Pad Prisma program V.3 (Graph Pad

Software).

Results and Discussion

Figure 1 shows the effects of different concentrations of NLE extract on P. citrinum isolates,

grown on PD. Although fungus growth was maintained low at the initial concentration of

NLE, fungal growth increased in neem concentrations up to 12.5 mg/ml. At low

concentrations an initial antifungal activity occurred. However, when the fungus began to

grow, it reached and superseded the controls’ growth rate. No complete growth inhibition

exists and mycelium weight increases with an increase of NLE. Similar growth inhibition

results, were obtained by other authors, working with P. citrinum [15, 16]. The growth

inhibition patterns were similar to growth of P. expansum [8] and consistent with the findings

of other authors studying neem extracts in Aspergillus, in which the formation of toxins was

prevented but not fungal growth [5, 6, 7]. The ability of the NLE to affect mycelium

production varied among isolates. Although Fig. 1 shows no complete inhibition of spores

amount after the incubation time, different patterns among isolates may be observed: there is a

significant decrease (p<0.05) on number of K4 spores when 3.12 mg/ml of neem extract was

added to medium and maintained for the next concentrations. There was no significant

difference (p>0.05) at 3.12 mg/ml of neem extract in isolate K1; however, a significant

decrease (p<0.05) at 6.25 mg/ml, an increase at 12.5 mg/ml and another decrease at 50mg/ml

occurred. Isolate K8 decreased significantly (p<0.05) at 12.5 mg/ml without alteration for the

next concentrations of neem extract (Values have been calculated by Turkey’s Test).

Direct contact of fungus with NLE on PDA surface resulted in differences between

macroscopic colonies features but not at microscopic ones. Colonies grown on PDA-neem

(Fig. 2) were not only bigger in size than control colonies but their appearance differed too:

colonies were radially sulcate, moderately deep and produced exudates. The anterior part of

colonies on PDA-neem was more intensely green with irregular margins. Microscopic

observations revealed same sized conidia and conidiophore diameter; no alteration in asexual

reproduction development, typical branching of conidiophores and normal conidiophore

appearance; typical size and morphology of spores (results not shown). Comparisons were

also made with the morphologic features of P. citrinum described in the literature [17].

Figure 3 shows the effects of NLE on citrinin production by P. citrinum isolates in PD broth,

determinated by espectrofotometer experiments. After 21 days, quantitative determination

[14] of the extracts from liquid culture media demonstrated inhibition of citrinin production

by three isolates of P. citrinum on media with NLE. Inhibition of citrinin production does not

appear to be simply a function of mycelia weight reduction. Citrinin concentration was

reduced in cultures in which growth was not inhibited. Actually, concentrations of NLE

higher than 3.12 mg/ml inhibit citrinin production as showed by HPLC analysis. The

quantification of citrinin was done by comparing the retention times of the culture extracts

with that of an authentic sample of citrinin. Standard and citrinin from samples were eluted

between 5 to 6 min., as seen in Fig. 4. Neem extracts reached 87.16% inhibition on K4

citrinin production at NLE 3.12 mg/ml, 85.86% inhibition on K1 citrinin production at NLE

6.25 mg/ml, and 94.86% inhibition on K8 citrinin production at NLE 6.25 mg/ml (Table 1).

HPLC results confirmed espectrofotometer and TLC experiments, showing the higher

sensitivity hoped.

Generally, toxin production decreases as mycelium formation decreases. However, citrinin’s

neem extract inhibition was more significant than mycelial alteration. It has also been found

that the standard deviations of mean values for toxin production were much higher than the

deviations of mean values for mycelium with the three isolates.

Other authors [4, 5, 6, 18, 19] reported a blocking on aflatoxin production with an apparently

normal fungus growth and demonstrated that antifungal potentiality against growth may not

coincide with the inhibitory potential of toxin production. Current analysis also revealed that

although the NLE delayed the citrinin production, later the three isolates regained their

toxicogenic capacity when re-cultivated without NLE (results not shown).

Current research offers the possibility of developing methods for controlling mycotoxin

production by fungi coupled to novel environmentally safe agrochemicals of plant origin.

Acknowledgments. We would like to thank Dr. Maria de Lourdes Lucio Ferrarese and Dr.

Oswaldo Ferrarese Filho (Department of Biochemistry, State University of Maringá, Maringá

PR Brazil) for HPLC analysis; Dr.Thomas Bonnici for grammatical revision of the

manuscript; CNPq for financial support.

References

1. Xu BJ, Jia XQ, Gu L, et al. (2005) Review on the qualitative and quantitative analysis of

the mycotoxin citrinin. Food Control 17(4):271-285.

2. Isman MB, Koul O, Luczynski A, et al. (1990) Insecticidal and Antifeedant Bioactivities

of Neem Oils and their Relationship to Azadirachtin Content. J Agric Food Chem 38: 406-

1411.

3. Locke JC (1995) Fungi. In: Schmutterer H (ed) The Neem Tree, pp.118-126

4. Bhatnagar D, Mccormick SP (1988) The inhibitory effect of neem (Azadirachta indica)

leaf extracts on aflatoxin synthesis in A. parasiticus. J Am Oil Chem Soc 65:1166-1168.

5. Razzaghi-Abyaneh M, Allameh A, Tiraihi T et al. (2005) Morphological alterations in

toxigenic Aspergillus parasiticus exposed to neem (Azadirachta indica) leaf and seed

aqueous extracts. Mycopathol 159:565-570.

6. Zeringue HJJr, Bhatnagar D (1994) Effects of neem leaf volatiles on submerged cultures of

aflatoxigenic Aspergillus parasiticus. App Environ Microbiol 60:3543-3547.

7. Allameh A, Razzaghi-Abyaneh M, Shams-Ghahfarokhi M, et al. (2002) Effects of neem

leaf extract on production of aflatoxins and activities of fatty acid synthetase, isocitrate

dehydrogenase and glutathione S-transferase in A. parasiticus. Mycopathol 154:79-84.

8. Mossini SAG, De Oliveira KP, Kemmelmeier C (2004) Inhibition of patulin production by

P. expansum cultured with neem (Azadirachta indica) leaf extracts. J Basic Microbiol 44:

106-113.

9. Wu MT, Ayres JC, Koehler PE (1974) Production of citrinin by Penicillium viridicatum

on country-cured ham. Appl Microbiol 27 (2):427-428.

10. Betina V (1984) Mycotoxins – Production, Isolation, Separation and Purification. (Betina

V, Editor), pp. 217-235. Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, Netherlands.

11. Abou-Jawdah Y, Sobh H, Salameh A (2002) Antimycotic activities of selected plant flora,

growing wild in Lebanon, against phytopathogenic fungi. J Agric Food Chem 50:3208-

3213.

12. Pitt JI, Hocking AD (1997) Fungi and Food Spoilage, 2nd edn. London, Blackie

Academic & professional.

13. Amandioha AC (2000) Controlling rice blast in vitro and in vivo with extracts of

Azadirachta indica. Crop Protection 19:287-290.

14. Damodaran C, Ramadoss, CS and Shanmugasundaram ERB (1973) A rapid procedure for

the isolation, identification and estimation of citrinin. Anal Biochem 52:482-488.

15. Wendorff WL, Wee CH (1997) Effect of smoke and spice oils on growth of molds on oil-

coated cheeses. J Food Prot 60 (2):153-156.

16. Vasquez BI, Fente C, Franco CM et al. (2001) Inhibitory effects of eugenol and thymol

on Penicillium citrinum strains in culture media and cheese. Int J Food Microbiol 67:157-

163.

17. Onions AHS, Allsopp D, Eggins, HOW (1981) Introduction to Industrial Mycology, 7th

edn. Great Britain, Edward Arnold Publishers Ltd.

18. Hitokoto H, Morozumi S, Wauke T, et al. (1980) Inhibitory effects of spices on growth

and toxin production of toxigenic fungi. Appl Environ Microbiol 39:818-822.

19. Buchanan RL, Shepherd AJ (1981) Inhibition of Aspergillus parasiticus by thymol. J

Food Sci 46:976-977.

Figure 1. Effect of neem extracts added on PD medium on dry weight (A) and on spore

numbers (B) of P citrinum (isolates K1, K4 and K8). Bars indicate standard deviation for

experiments carried out in quadruplicate.

ISOLATE K4 ISOLATE K1 ISOLATE K8

Figure 2. P. citrinum isolates (isolates K1, K4 and K8) grown on PDA and on PDA-neem

extract as described in ‘Materials and Methods’.

FRONT REVERSE

ISOLATE K1

ISOLATE K4

ISOLATE K8

PDA-Neem PDA PDA PDA-Neem

Figure 3. Citrinin production from P. citrinum isolates determined by colorimetric assay

described in materials and methods. Bars indicate standard deviation for experiments carried

out in quadruplicate.

Table 1. Effect of neem extracts (mg/ml) treatment on citrinin production (ng/ml) by

Penicillium citrinum a (isolates K1, K4 and K8).

Treatment b (neem extracts) mg/ml Citrinin (ng) c Reduction (%)

Control (K1) 1.23 x 104 -

3.12 (K1) 0.175 x 104 85.86%

Control (K4) 3.28 x 104 -

3.12 (K4) 0.42 x 104 87.16%

Control (K8) 10.7 x 104 -

6.25 (K8) 0.55 x 104 94.86%

Experimental details are as described in ´Materials and methods`. a The results are the means of 2 experiments with 4 replicates each, determined 21 days after incubation.

b Neem extracts were prepared as described in ‘Material and Methods’.

c Values obtained by HPLC analyses are means of 4 replicates.

Citr

inin

µg

0.00 3.12 6.25 12.50 25.00 50.000.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.5

Isolate K4Isolate K1Isolate K8

Neem concentrations (mg/ml)

Figure 4. HPLC elution profiles from P. citrinum isolates, as described in ‘Materials and

Methods’.(P) citrinin standard; (K1C), (K4C), (K8C-dil.1/5) controls of citrinin production

by P. citrinum isolates grown on PD without addition of neem extract; (K1 (3.12), K4 (3.12)

citrinin from P. citrinum isolates grown on PD with neem extracts (3.12 mg/ml) and (K8

(6.25) citrinin from P. citrinum isolates grown on PD with neem extracts (6.25 mg/ml);

(NLE) neem leaf extract at 12.5 mg/ml.

EFFECT OF NEEM LEAF EXTRACT AND NEEM OIL ON Penicillium GROWTH,

SPORULATION, MORPHOLOGY AND OCHRATOXIN PRODUCTION.

Simone Aparecida Galerani Mossini and Carlos Kemmelmeier1

Departamento de Bioquímica, Universidade Estadual de Maringá, Maringá PR Brazil.

ABSTRACT

In vitro trials were conducted to evaluate the effect of Azadirachta indica (Neem) on

mycelial growth, sporulation and ochratoxin A production by P. verrucosum and P.

brevicompactum. The effect of Neem leaf extract was verified at 6.25 and 12.5 mg/ml of YES

medium. Neem oil extract from seeds was evaluated at 0.125; 0.25 and 0.5% on the same

medium. Ochratoxin A production was evaluated by thin-layer chromatography technique.

Oil extracts exhibited significant (p≤ 0.05) reduction of growth and sporulation of the fungi.

There were major alterations on macroscopic morphology and sporulation when Neem leaf

extract rather than Neem oil was used. No inhibition was observed in ochratoxin A

production. With the accessibility of compounds and low cost, Neem oil could be

implemented as part of a sustainable integrated pest management strategy for plant disease, at

once Neem oil has been shown to be fungitoxic to growth and sporulation.

Key words: sporulation, ochratoxin, Azadirachta indica, antifungal activity.

*Corresponding author. Mailing address: Universidade Estadual de Maringá, Departamento de Bioquímica, Avenida Colombo, 5790; 87020-900. Maringá PR Brazil. Fax: (+5544) 3263-3655. E-mail: ckemmelmeier@uem.br

INTRODUCTION

The presence and growth of fungi in food and feeds may cause spoilage and result in a

reduction in quality and quantity. Fungi produce a variety of secondary metabolites as a

product of their metabolism; mycotoxins are metabolites that have deleterious effects on other

organisms. Ochratoxin A, a potent mycotoxin produced by certain species of Aspergillus and

Penicillium, originally associated with mouldy legumes, fruits, meat and cereal products, is at

present receiving increasing attention for its nephrotoxic effects and its potential carcinogenic

activity (1; 2; 3). Cereal products are the major group of food commodities in which the above

toxin is of high impact. Search is required for control techniques that are cheap, ecologically

sound and environmentally safe to eliminate or reduce the incidence of economically

important pathogens.

In recent years much attention has been given to the preservation of grains by natural

products so that the growth and mycotoxin production may be effectively retarded. Non-

chemical systems with plant extracts for the treatment of cultures have played important role

in the inhibition of pathogen growth s and quality improvement (4).

Neem extract is one of the most important plant compounds which inhibit mycotoxin

production. Azadirachta indica A. Juss (Meliaceae) Neem plant comprises several parts, such

as fruit, seed, leaf and oil, with several active compounds (5; 6). The ability to cause

retardation of fungus growth is the basic mode of action of a number of classical antifungal

agents. However, Neem leaf constituents are known to potentially inhibit aflatoxin production

in Aspergillus parasiticus without affecting fungal growth (7). According to Razzaghi-

Abyaneh et al. (8), the main feature of Neem extracts, particularly those derived from leaves,

is that they do not retard fungal growth, but interfere with aflatoxin production.

Current study evaluates the effects of Neem leaf extract and oil from Neem seeds on

the growth, sporulation and ability to produce ochratoxin A by Penicillium verrucosum and P.

brevicompactum.

MATERIALS AND METHODS

Mycotoxigenic fungi

Three ochratoxin-producing isolates of Penicillium verrucosum (K11 and K13) and

Penicillium brevicompactum (K20), maintained in silica storage, at the culture collection of

the Laboratory of Chemistry and Physiology of Microorganisms (Department of

Biochemistry. State University of Maringá – Pr), were used as test organisms.

Preparation of Neem extracts

Leaves of Azadirachta indica A. Juss (Meliaceae) were hand-collected from healthy mature

trees at the Agricultural Institute of the State of Paraná (IAPAR) in Londrina PR Brazil. A

10% water extract from dried Neem leaves (NL) was prepared by maceration. Oil from Neem

seeds (NO) was obtained from DalNeem Co., Brazil.

Cultures conditions for production of ochratoxin

Yeast Extract Sucrose (YES), recommended for extracellular mycotoxins (9), was the liquid

medium used for ochratoxin production. Inocula containing 105 spores of each strain of P.

verrucosum and P.brevicompactum were added to 3 ml of YES medium in 25 ml flasks (20 X

100mm) Pyrex® and incubated at 26 ± 0.5°C, for 7 days, without shaking. Treatments in four

replicates consisted of 10% freeze-dried aqueous Neem leaf extract (NL) at 6.25, 12.5 mg/ml

and 0.125, 0.25, 0.5% (v/v) of Neem oil (NO) added to YES medium. Mould growth was

reported visually throughout incubation and mycelial growth was measured daily until the end

of the incubation period. Dry weights were obtained after extraction; mycelia were separated

from the broth culture and transferred to preweighed filter paper, dried at 60°C until constant

weight, to determine the amount of growth. Ochratoxin A was extracted from the broth by

procedures according to Scott et al (10). Chloroform extracts were combined and dried by

filtering through anhydrous sodium sulfate to remove water. Chloroform was evaporated to

dryness and residue dissolved in chloroform.

Mycelial and sporulation inhibition test

The effects of NL and NO on radial growth, colony characteristics and sporulation of P.

verrucosum and P. brevicompactum were determined by growing on YES agar in absence

(control) and presence (treatments) of the Neem compounds. These media were needle-(single

spore) inoculated at the center by a sterile loop. Fungi were previously cultured in YES agar

in petri dishes, for producing isolated colonies. Cultures were subsequently incubated at 25°C,

for 7 days. Treatments consisting of NL (6.25 and 12.5 mg/ml) and NO (0.125, 0.25 and

0.5%) were added to the solid media. Radial growth was measured daily until incubation time,

compared and mean values taken, as described by Amandioha, A. C. (12). Macroscopic and

microscopic morphological features [0.1% Lactofuchsin staining (11)] were taken and

analyzed. Sporulation was measured according to Gusman-de-Pena & Herrera (13). Briefly,

mycelium grown in solid media was removed, transferred to a flask containing a sterile 0.1%

Tween 80 solution (10ml) and stirred with a vortex mixer for two minutes to free the spores.

After mycelium sedimentation, the supernatant containing the spores was recovered and

counted using a Neubauer counting chamber. Sporulation data were recorded by spores/cm2

of colony. Percentage inhibition of mycelial growth and sporulation by leaf extracts and oil

were calculated as by Amandioha, A. C. (12). Spores diameter was analyzed for

morphometric analysis by biological optic microscope, 40x lens, equipped with an IPPWIN-

DCAM image-taking kit. An area (µm2) of 200 spores of each isolate (control and treatments)

was measured by Image-Pro-Plus 3.0.1 software of image analysis. Values were analyzed by

Turkey’s test (PRISMA software) and significance level was set at p< 0.05. Data were

reported as mean (M) ± standard error (SE) for the indicated number of observations (n). Two

experiments were performed with six replicates per treatment and with one control per

experiment.

Ochratoxin detection

Ochratoxin A (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) standard solution was prepared in ethanol

(1 mg/ml) and stored at 4oC. Residues dissolved in chloroform and standard were spotted on

TLC plates (20 x 20 cm Aluminum sheets Silica gel 60 – G. Merck) by using toluene: ethyl

acetate: formic acid (5:4:1; v/v), as reported by Scott and Hand (14), followed by exposure of

plate to ammonia fumes (15). Ochratoxin-ammonia derivative appeared as light-blue

fluorescing spot under ultraviolet light. All solvents used were analytically graded.

Statistical Analysis

All statistical analyses were performed by Turkey’s honest significant difference multiple

comparison test to segregate treatments which were significantly different (PRISMA

software). Analysis of variance (ANOVA) tests were performed for significant (p≤ 0.05)

differences between experiments.

RESULTS AND DISCUSSION

Neem seed oil (NO) and Neem leaf extracts (NL) did not show the same effects on

fungi. Direct contact of fungus with NL and NO on YES medium resulted in differences

between macroscopic colonies features but not in microscopic ones. Colonies of fungi grown

on YES-NO had practically the same size and appearance as those of controls (YES): white

color, radially sulcate, moderately deep and produced exudates (Fig. 1). Fungi colonies grown

on YES-NL were not only bigger in size than control (YES), but their appearance differed

too: green color, radially sulcate, lightly deep and produced more exsudates (Fig. 2).

Microscopic observations revealed same size of conidia and conidiophores; there was no

alteration in asexual reproduction development, typical branching and appearance of

conidiophores (results not shown). Comparisons were also made with morphologic features of

P. verrucosum and P. brevicompactum described in literature (16).

There was no difference in spore area between K11 control and K11 treatments (p ≥

0.05). For isolate K13 and K20, all groups, when compared, were significantly different

(p<0.001). However, there was no similar alteration of the spore area in the isolates. Whereas

in K13 the NO extracts increased their spore area, NL extracts decreased theirs; in K20 the

NO and NL extracts decreased their spore area (Table 1).

The ability of Neem extracts to inhibit growth and sporulation varied widely. Results

(Table 1 and Figure 3) shows that NO extract was effective for reducing fungal growth at all

levels (p ≤ 0.05), however, NL extract was not only ineffective but showed a stimulatory

effect on isolate K11. At 0.125% NO inhibited diameter growth of K11, K13 and K20 by

48.30%, 33.50% and 30.43%, respectively. At 0.25%, NO extract inhibited diameter growth

of K11, K13 and K20 by 49.71%, 39% and 36.14%, respectively. Finally, at 0.5%, NO extract

inhibited growth of K11, K13 and K20 by 51.55%, 38.4% and 38.85%, respectively.

Inhibition of mycelial growth was generally associated with the inhibition of

sporulation. However, Neem extracts enhanced or increased sporulation depends on extract´s

concentration, without showed the same associated effect on mycelial growth. NO extract

significantly (p≤ 0.05) inhibited the sporulation of all fungi at 0.125%, by 47.24%, 82.6% and

80.1% (K11, K13 and K20, respectively). NO (0.25%) inhibited (p≤ 0.05) the isolates K13

(75.6%) and K20 (82.58%) and had a stimulatory effect on sporulation of isolate K11. NO

(0.5%) significantly (p ≤ 0.05) inhibited the fungus K13 (51.2%) and stimulated K11. NL

extract did not inhibit the sporulation of the fungus but showed a stimulatory effect on all

isolates. The effect of extracts on dry weight was also variable: NO decreased in all isolates;

NL increased weight in K11 weight and decreased in K13 and K20 (Table 1).

The extracts’ different effects on radial growth, sporulation and mycotoxin production

may be either due to the solubility of the active compounds or inherent to fungus metabolism.

NO extracts showed higher inhibitory effects than NL, probably owing to the presence of

azadirachtin at its highest concentration in the mature seeds (17; 18).

Toxin production generally decreases as mycelium formation decreases, but research

has shown that antifungal potentiality against growth may not coincide with the inhibitory

potential of toxin production. (6; 7; 19; 20; 21; 22). Current analyses revealed inhibitory

potential of NO extracts on sporulation and mycelium growth of fungi, but not on ochratoxin

A production. Inhibition of this toxin production does not appear to be simply a function of

mycelium weight or sporulation reduction. Although sporulation is typically accompanied by

mycotoxin production, this is not always true, because mycotoxins may be produced at high

levels in growth conditions where sporulation is inhibited (23). Our investigations showed

that the efficacy of Neem extracts against fungi was not similar in all species, since extracts

affected growth and sporulation at different rates and failed to inhibit mycotoxin production in

the fungi.

Current research has therefore shown that Neem oil could be implemented as part of a

sustainable integrated pest management strategy for plant disease, at once Neem oil has been

shown to be fungitoxic to growth and sporulation of the fungi tested.

ACKNOWLEDGMENTS

We would like to thank Dr. THOMAS BONNICI for the grammatical review of the

manuscript and to CNPq for its support of this research.

REFERENCES

1. Betina, V., (1984). Mycotoxins – Prodution, Isolation, Separation and Purification.

(Betina, V., Editor), Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, Netherlands, pp.

183-215.

2. Bragulat, M. R.; Abarca, M. L.; Cabañes, F. J., (2001). An easy screening method for

fungi producing ochratoxin A in pure culture. Int. J. Food Microbiol. 71: 139-144.

3. Pohland, A. E., (1993). Mycotoxins in review. Food Addit. Contam. 10: 17-28.

4. Nwchukwu, E. O.; Umechuruba, C.I., (2001). Antifungal activities of some leaf

extracts on seed-borne fungi of African Yam Bean Seeds, seed germination and

seedling emergence. J. Appl. Sci. Environ. Mgt. 5 (1): 29-32.

5. Martinez, S. S., (2002). O Nim – Azadirachta indica Natureza, Usos Múltiplos,

Produção. (S. S. Martinez, Editor). IAPAR: Londrina, PR, Brazil.

6. Locke, J. C., (1995). Fungi In: The Neem Tree. (H. Schmutterer, Editor), pp.118-126.

7. Bhatnagar, D. and McCormick, S. P., (1988). The inhibitory effect of Neem

(Azadirachta indica) leaf extracts on aflatoxin synthesis in Aspergillus parasiticus. J.

Am. Oil Chem. Soc., 65: 1166-1168.

8. Razzaghi-Abyaneh, M.; Allameh, A.; Tiraihi, T.; Shams-Ghahfarokhi, M.;

Ghorbanian, M., (2005). Morphological alterations in toxigenic Aspergillus

parasiticus exposed to Neem (Azadirachta indica) leaf and seed aqueous extracts.

Mycopathologia 159: 565-570.

9. Frisvad, J. C.; Filtenborg, O., (1983). Classification of terverticillate Penicilia based

on profiles of mycotoxins and other secondary metabolites. Appl. Environ. Microbiol.

46: 1301-1310.

10. Scott, P. M.; Kennedy, B.; Van Walbeek, W., (1971). Simplified procedure for the

purification of ochratoxin A from extracts of P. viridicatum. J. Assoc. Off Anal. Chem.

54: 1445-1447.

11. Pitt, J. I. and Hocking, A. D., (1997). Fungi and Food Spoilage, 2nd Edition. Blackie

Academic & Professional: London, UK.

12. Amandioha, A. C., (2000). Controlling rice blast in vitro and in vivo with extracts of

Azadirachta indica. Crop Protection 19: 287-290.

13. Guzmán-de-Pena, D. and Ruiz-Herrera, J., (1997). Relationship between aflatoxin

biosynthesis and sporulation in Aspergillus parasiticus. Fungal Genetics Biology 21:

198-205.

14. Scott, P. M. and Hand, T. B., (1967). Method for the detection and estimation of

ochratoxin A in some cereal products. J. Ass. Off. Anal. Chem. 50: 366-370.

15. Paterson, R. R. M., (1986). Standardized one- and two-dimensional thin-layer

chromatographic methods for the identification of secondary metabolites in

Penicillium and other fungi. Journal of Chromatography, 368: 249-264.

16. Onions, A. H. S.; Allsopp, D.; Eggins, H. O. W., (1981). Introduction to Industrial

Mycology, 7th edition. Edward Arnold Publishers Ltd. Great Britain, UK.

17. Fandohan, P.; Gbenou, J.D.; Gnonlonfin, B.; Hell, K.; Marasas, W. F. O.; Wingfield,

M. J., (2004). Effect of essential oils on the growth of Fusarium verticillioides and

fumonisin contamination in corn. J. Agric. Food. Chem., 52 (22), 6824-6829.

18. Schhaf, O.; Jarvis, A. P.; Van Der Esch, S. A.; Giagnacovo, G.; Oladham, N. J.,

(2000). Rapid and sensitive analysis of azadirachtin and related triterpenoids from

Neem (Azadirachtina indica) by high performance liquid chromatography-atmospheric

pressure chemical ionization mass spectrometry. J. Chromatogr . A., 886: 89-97.

19. Hitokoto, H.; Morozumi, S.; Wauke, T.; Sakai, S.; Kurata, H., (1980). Inhibitory

effects of spices on growth and toxin production of toxigenic fungi. Appl. Environ.

Microbiol. 39: 818-822.

20. Buchanan, R. L., Shepherd, A. J., (1981). Inhibition of Aspergillus parasiticus by

thymol. J. Food Sci. 46: 976-977.

21. Zeringue, H. J. JR.; Bhatnagar, D., (1994). Effects of Neem leaf volatiles on

submerged cultures of aflatoxigenic Aspergillus parasiticus. Applied and

Environmental Microbiology. 60:3543-3547.

22. Mossini, S. A. G.; De Oliveira, K. P.; Kemmelmeier, C., (2004). Inhibition of patulin

production by Penicillium expansum cultured with Neem (Azadirachta indica) leaf

extracts. J. Basic Microbiol. 44: 106-113.

23. Adam, T. H.; Yu, J., (1998). Coordinate control of secondary metabolite production

and asexual sporulation in Aspergillus nidulans. Curr. Opnion Microbiol. 1: 674-677.

Fig. 1 – P. verrucosum (isolates K11, K13) and P. brevicompactum (isolate K20) on YES

and on YES-Neem Oil (YES-NO) as described in ‘Materials and Methods’.

Isolate K11

Isolate K13

Isolate K20

YES YES-NO 0.125% YES-NO 0.25% YES-NO 0.5%

Fig. 2 - P. verrucosum (isolates K11, K13) and P. brevicompactum (isolate K20) on YES

and on YES-Neem Leaf Extracts (YES-NL) as described in ‘Materials and Methods’.

Isolate K11

Isolate K13

Isolate K20

YES YES-NL 6.25mg/ml YES-NL 12.5mg/ml

Fig.3. Effect of Neem extracts on sporulation (A) and on colony diameter (B) of

Penicillium (isolates K11, K13 and K20) on YES medium, determinated as described in

‘Materials and Methods’. Bars standard deviation for experiments carried out in 6

replicates.

0.000 0.125 0.250 0.500 6.250 12.5000.0

1.0×1008

2.0×1008

3.0×1008

4.0×1008

5.0×1008

Isolate K11Isolate K13Isolate k20

Neem extracts

NO (% v/v) NL (mg/ml) NO (% v/v) NL (mg/ml)

Spo

res/

cm2

Dia

met

er(c

m)

A B

0.000 0.125 0.250 0.500 6.250 12.5000123456789

Isolate K11Isolate K13Isolate k20

Neem extracts

0.000 0.125 0.250 0.500 6.250 12.5000.0

1.0×1008

2.0×1008

3.0×1008

4.0×1008

5.0×1008

Isolate K11Isolate K13Isolate k20

Neem extracts

NO (% v/v) NL (mg/ml) NO (% v/v) NL (mg/ml)

Spo

res/

cm2

Dia

met

er(c

m)

A B

0.000 0.125 0.250 0.500 6.250 12.5000.0

1.0×1008

2.0×1008

3.0×1008

4.0×1008

5.0×1008

Isolate K11Isolate K13Isolate k20

Neem extracts

NO (% v/v) NL (mg/ml) NO (% v/v) NL (mg/ml)

Spo

res/

cm2

Dia

met

er(c

m)

A B

NO (% v/v) NL (mg/ml) NO (% v/v) NL (mg/ml)

Spo

res/

cm2

Dia

met

er(c

m)

A B

0.000 0.125 0.250 0.500 6.250 12.5000123456789

Isolate K11Isolate K13Isolate k20

Neem extracts

Table 1. Effects of Neem extracts on Penicillium species (isolates K11, K13 and K20).

Experimental details are as described in ´Materials and methods`. Dw: dry weight; Dw-R (%): dry weight reduction %; D: diameter; D-R (%): diameter reduction %; S: spores number; S-R (%): spores number reduction %; Sa: spores area; Sa-R (%): spores area reduction %; OTA: Ochratoxin; NA: not analysed. R (%) were determined by: (mean control – mean treatment)/(mean control) x 100%. a Values, average ± standard error (n=6). b Values , average ± standard error (n=200). * Significant at p < 0.05. ** Significant at p < 0.001.

NEEM EXTRACTS Neem Oil (NO) Neem Leaf Extract (NL)

FUNGUS

Controla NO 0.125%a NO 0.25%a NO 0.5%a NL 6.25 mg/mla

NL 12.5 mg/mla

Dw (g)a 0.094±0.001 0.079±0.001 0.082±0.002 0.073±0.002 0.143±0.001 0.119±0.001 Dw –R (%) - 15.95%* 12.76%* 22.34%* 0% 0% D (mm)a 7.08±0.52 3.66±0.08 3.56±0.20 3.43±0.16 8.75±0.24 8.16±0.54 D – R (%) - 48.30%** 49.71%** 51.55%** 0% 0% S (cm2)a (x107) 1.3±0.15 0.7±0.04 2.1±0.11 2.9±0.2 7,3±1.05 19.7±1.5 S – R (%) - 47.24%** 0% 0% 0% 0% Sa (µm2)b 10.48±0.20 NA 10.32±0.21 NA NA 10.58±0.18 Sa-R (%) - - 4.79% - - 2.39%

K11

OTAa + + + + + + Dw (g)a 0.098±0.001 0.077±0.002 0.069±0.002 0.083±0.001 0.101±0.002 0.086±0.002 Dw –R (%) - 21.42%* 29.59%* 15.30%* 0% 12.24% D (mm)a 4.06±0.08 2.7±0.16 2.48±0.04 2.5±0.08 3.71±0.14 3.62±0.09 D – R (%) - 33.5%** 39%** 38.4%** 8.62% 10.8%*

S (cm2)a (x107) 2.8±0.14 0.5±0.04 0.7±0.04 1.4±0.08 11±0.17 13±0.28 S – R (%) - 82.6%** 75.6%** 51.2%** 0% 0% Sa (µm2)b 4.73±0.23 NA 7.23±0.19 NA NA 3.11±0.11 Sa-R (%) - - 0% - - 34.29%**

K13

OTAa + + + + + + Dw (g)a 0.13±0.001 0.09±0.001 0.089±0.001 0.068±0.001 0.111±0.00 0.109±0.00 Dw –R (%) - 30.76%* 31.53%* 47.69%* 15.38%* 16,15%*

D (mm)a 3.68±0.07 2.56±0.02 2.35±0.02 2.25±0.05 3.4±0.18 3.41±0.07 D – R (%) - 30.43%** 36.14%** 38.85%** 7.60% 7.33% S (cm2)a (x107) 4.0±0.31 0.8±0.12 0.7±0.09 4.0±0.20 33±1.58 43±2.87 S – R (%) - 80.09%** 82.58%** 0.24% 0% 0% Sa (µm2)b 11.5±0.18 NA 6.66±0.20 NA NA 9.14±0.13 Sa-R (%) - - 42.03%** - - 20.45%**

K20

OTAa + + + + + +