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BIOQUÍMICA

FOSFORILAÇÃO OXIDATIVA


INTRODUÇÃO

A fosforilação oxidativa corresponde ao último estágio do metabolismo aeróbi-co produtor de energia, sendo o ponto de convergência da degradação de car-boidratos, lipídios e aminoácidos. O processo de oxidação desses compostos leva à produção de Acetil-CoA a qual é totalmente oxidada a CO2 no Ciclo de Krebs, sendo este o ponto máximo de oxidação dos átomos de carbono que compõem carboidratos, proteínas e lipídios.

Esse processo consiste na redução do O2 e H2O com os elétrons doados pelas coenzimas aceptoras de elétrons NADH e FADH2, as quais sofreram redução ao longo dos processos de oxidação. A obtenção de energia na forma de ATP dá-se a partir do fluxo desses elétrons por uma cadeia de transportadores liga-dos à membrana mitocondrial interna.

A OXIDAÇÃO DAS COENZIMAS

A reoxidação das coenzimas é de extrema importância pois, ao voltar à forma oxidada, estas podem participar novamente das vias de degradação dos nutri-entes. Além disso, é através desse processo que a energia nelas conservada pode ser reaproveitada pelas células a partir da síntese de ATP.

Como anteriormente mencionado, o processo de oxidação das coenzimas acep-toras de elétrons ocorre pela transferência destes elétrons ao oxigênio. Ao re-ceber o elétron, o oxigênio se liga a prótons presentes no meio, formando H2O.

A diferença de potenciais de óxido-redução entre a coenzima reduzida e o oxi-gênio faz com que neste processo seja liberada grande quantidade de energia que será designada para a produção de ATP. No entanto, caso os elétrons das coenzimas fossem passados diretamente ao oxigênio, essa energia seria dissi-pada na forma de calor, inutilizável pela célula. Sendo assim, a estratégia ado-

tada para aproveitar essa energia consiste em transformá-la em um gradiente de prótons.

CADEIRA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS

A obtenção do gradiente de prótons é conseguida pela transferência indireta dos elétrons das coenzimas para o oxigênio através da passagem por vários compostos que constituem uma cadeia transportadora de elétrons.

Os compostos constituintes da cadeia são posicionados de forma crescente de acordo com seus potenciais de óxido-redução. Desta forma, os elétrons partem da coenzima reduzida – que apresenta potencial de óxido-redução menor que os componentes da cadeira – e percorrem uma sequência de transportadores com potenciais crescentes até chegarem ao oxigênio, que apresenta o maior potencial.

Ao mesmo tempo que ocorre o fluxo de elétrons, é estabelecida uma diferença de concentração de prótons de cada um dos lados da membrana onde ocorre o transporte (gradiente de prótons). A energia contida neste gradiente é, então, utilizada na fosforilação do ADP, formando ATP, e, por utilizar a energia deri-vada da oxidação de coenzimas, é denominada fosforilação oxidativa.

Os componentes da cadeia transportadora de elétrons organizam-se na mem-brana mitocondrial interna em quatro complexos (I, II, III, IV). Além destes, dois importantes componentes estão dispostos para conectar os complexos entre si: coenzima Q (CoQ) que conecta os Complexos I e II ao Complexo III, e o Cito-cromo C que conecta o Complexo III ao Complexo IV.

Com exceção da coenzima Q, todos os outros componentes do transporte de elétrons são proteínas que estão associados a grupos prostéticos como FAD, FMN (flavina mononucleotídeo) e centros ferro-enxofre.

A transferência de elétrons pelos quatro complexos, além do CoQ e do citocro-mo c, é possível pois todos eles são capazes de ser reduzidos e oxidados. As-

sim, ao receberem um elétron do componente anterior da cadeia, reduzem-se; transferindo o elétron para o componente seguinte, oxidam-se e estão aptas a receber elétrons novamente.

Os centros ferro enxofre (Fe-S), presentes nos três primeiros Complexos, são formados de íons ferro e enxofre podendo apresentar-se em diversas configu-rações. Sua ligação às cadeias polipeptídicas se dá através de ligação de resí-duos de cisteína. Os centros Fe-S atuam unicamente transportando os elétrons recebidos pelo íon Fe cuja valência é alterada de Fe3+ para Fe2+. Os prótons não são recebidos pelos centros Fe-S, sendo transferidos da membrana interna da mitocôndria para o espaço intermembranas, criando uma diferença de concen-tração de prótons entre esses espaços e o chamado gradiente de prótons.

COMPLEXO I

Também chamado de NADH-coenzima Q redutase, o Complexo I está associa-do a uma molécula de FMN e 6 ou 7 centros ferro-enxofre. A FMN se comporta como a FAD, sendo capaz de receber 2 prótons e 2 elétrons, passando a forma reduzida (FMNH2).

O doador de elétron para a redução de FMN é o NADH proveniente de reações metabólicas anteriores, como por exemplo: oxidação de glicealdeído-3-fosfato (glicólise), conversão do piruvato a Acetil-CoA, isocitrato, alfa cetoglutarato e malato (Ciclo de Krebs) etc.

NADH + H+ + FMN NAD+ + FMNH2

Assim, os elétrons do FMNH2 são transferidos para os centros Fe-S até deixa-rem o Complexo I, sendo entregues à Coenzima Q. Os prótons provenientes de NADH+ são transferidos para o espaço intermembranas.

COMPLEXO II Também chamado de succinato-coenzima Q redutase, o Complexo II conta com a participação da enzima succinato desidrogenase, a única enzima do Ci-clo de Krebs presente na membrana e não na matriz mitocondrial. Essa enzima catalisa a reação de formação do fumarato a partir do succinato com a conse-quente redução do FAD, que passa a ser FADH2.

Além desta enzima, também participam do Complexo II alguns centros Fe-S e o citocromo b560, pelos quais passam os elétrons provenientes do FADH2 até estes serem doados à coenzima Q.

Ao contrário do que ocorre no Complexo I, os prótons do FADH2 são devolvidos à matriz mitocondrial e, portanto, não contribuem para a formação do gradiente de prótons.

COENZIMA Q

Também chamada de ubiquinona, a Coenzima Q apresenta características hi-drofóbicas que permitem sua mobilidade pela membrana. Ela é capaz de rece-ber 2 prótons e 2 elétrons, passando a forma reduzida (ubiquinol), sendo os elétrons provenientes dos Complexos I e II.

Outras vias de transferências de elétrons também utilizam a Coenzima Q, como no metabolismo dos trigacilgliceróis. Neste caso, o substrato é oxidado por uma desidrogenase, que é uma flavoproteína, com consequente redução de FAD a FADH2.

Os elétrons de diferentes procedências, seja do Complexo I, Complexo II ou das flavoproteínas, percorrem um caminho comum até o oxigênio a partir da Coen-zima Q do qual fazem parte centros de Fe-S, átomos de cobre e vários citocro-mos.

CITOCROMOS

Os citocromos são proteínas transportadoras de elétrons que contêm heme como grupo prostético, podendo ser do grupo a, b ou c. O íon ferro, presente no grupo heme, é responsável pela transferência de elétrons destas proteínas ao alternarem entre os estados de oxidação Fe2+ e Fe3+.

O citocromo c é uma proteína solúvel periférica, ao contrário dos outros cito-cromos, que são proteínas transmembrana, e está situado na face externa da membrana mitocondrial interna. Seu pequeno tamanho e mobilidade permitem-lhe cumprir sua função de conectar o Complexo III ao Complexo IV.

COMPLEXO III

Também chamado citocromo C oxi-redutase, o Complexo III é constituído por dois citocromos b, por um centro Fe-S e pelo citocromo c. A transferência dos elétrons da Coenzima Q para os componentes do Complexo III e deste para o citocromo c são acompanhadas de movimento de prótons: os citocromos e os centros Fe-S recebem apenas elétrons enquanto os prótons presentes na co-enzima Q reduzida são liberados no espaço intermembrana.

COMPLEXO IV

Também chamado de citocromo c oxidase, o Complexo IV é composto por dois citocromos do tipo a e dois íons cobre, cada um deles associado a um citocro-mo. Os íons cobrem participam do transporte de elétrons pois, assim como os íons Fe, alteram seu estado de oxidação Cu2+ e Cu1+.

O complexo IV é responsável pela doação de quatro elétrons para a molécula de oxigênio, que, ligando-se a prótons do meio, converte-se em 2 moléculas de H2O, a chamada “água metabólica”.

A retirada de prótons da matriz mitocondrial contribui para o estabelecimento do gradiente de prótons. Além disso, o Complexo IV bombeia ativamente pró-tons para o espaço intermembrana, contribuindo ainda mais para o gradiente.

FONTE: NELSON, D.L. & COX, M. M. Princípios da Bioquímica de Lehninger, 6ª edição, Porto Alegre: Artmed, 2014.


A fosforilação oxidativa funciona com base no chamado Modelo Quimiosmótico descrito por Peter Mitchell. A energia derivada do transporte de elétrons é con-vertida em uma força próton motriz que bombeia os prótons para o exterior da matriz mitocondrial (contragradiente), conferindo um processo endergônico. A diferença de concentração de prótons entre os meios estabelece uma diferença de pH entre a matriz e o exterior, que, somada ao gradiente elétrico, geram um potencial de membrana da ordem de 0,1 a 0,2 V. A energia conservada nesse gradiente eletroquímico é chamada de força próton motriz.

O movimento dos prótons de volta ao interior da matriz mitocondrial é um pro-cesso passivo, a favor do gradiente eletroquímico, que libera energia (força pró-ton motriz) capaz de levar à síntese de ATP. A membrana interna é impermeá-vel aos prótons, de modo que não podem voltar a matriz sem a ajuda dos sítios

específicos da membrana interna constituídos pelo complexo sintetizador de ATP: a ATP sintase.

A ATP SINTASE

A ATP Sintase é uma ATPase do tipo F que catalisa a formação de ATP a partir de ADP e Pi. É constituída de duas porções, cada uma delas formada por várias cadeias polipeptídicas. A porção esférica, chamada fator de acoplamento (F1), contém os sítios de síntese de ATP. A outra porção, chamada FO (sensível à oligomicina), forma um canal embebido na membrana interna através do qual os prótons retornam à matriz mitocondrial.

A ATP Sintase é o único ponto da membrana permeável aos prótons, cuja con-centração no espaço intermembrana é maior do que na matriz mitocondrial. Logo, a volta dos prótons ao interior da mitocôndria é termodinamicamente fa-vorável. Cerca de 50kJ.mol-1 são consumidos para síntese de ATP, logo, estima-se que seja necessária a passagem de quatro prótons pela ATP sintase para cada ATP sintetizado.

Essa ATPase apresenta três sítios catalíticos idênticos que podem se apresen-tar, cada um, em três conformações distintas: aberta (open), frouxa (loose), apertada (tight). Antes do início de um novo ciclo catalítico, cada um dos três sítios apresenta-se em uma conformação, estando o primeiro deles no estado aberto, o segundo frouxo e o terceiro apertado, contendo este um ATP sinteti-zado referente do ciclo anterior.

• Etapa 1: Ligação de ADP e Pi ao sítio de conformação frouxa;

• Etapa 2: Alteração conformacional nos três sítios provocada pela passa-gem de prótons através da porção FO da ATP sintase de modo que o primeiro sítio passa para a conformação frouxa, o segundo para a con-formação apertada e o terceiro para a aberta;

• Etapa 3: O ATP é sintetizado no sítio onde havia ADP e Pi, que agora está na conformação apertada. Assim, o sítio de conformação aberta li-bera o ATP formado.

Desse modo, o ciclo termina com o mesmo quadro existente no início, diferen-ciando apenas pois cada um dos sítios apresenta agora a conformação inicial-mente exibida pelo sítio anterior.

O mecanismo de ação da ATP sintase também pode ser explicado pela chama-da catálise rotacional: a porção F1 é composta por três subunidades beta e três subunidades alfa.

• Etapa 1: Uma subunidade beta começa o processo estando na confor-mação β-ADP, que liga ADP e Pi do meio;

• Etapa 2: A subunidade então muda de conformação, assumindo a forma β-ATP a qual se liga fortemente ao ATP, estabilizando-o;

• Etapa 3: Por fim, a subunidade beta muda para a conformação β-vazia, com baixa afinidade pelo ATP. Uma nova rotação se inicia quando a su-bunidade assume a forma β-ADP.

A força para a rotação da porção FO é conseguida pela passagem de prótons do espaço intermembrana à matriz mitocondrial.


BALANÇO ENERGÉTICO

Para cada NADH que se oxida, ou seja, para cada par de elétrons transporta-dos pelos Complexos I, III e IV, há a síntese de 3 ou 2,5 moléculas de ATP. Ao passo que, para cada FADH2 oxidado, 2 ou 1,5 molécula de ATP são formadas.

OBSERVAÇÃO: as literaturas divergem acerca da quantidade de ATP forma-das para cada coenzima oxidada ao final do processo, mas convergem no fato de que a oxidação do NADH resulta em mais ATPs do que a do FADH2.

Essa conta pode ser explicada pela quantidade de prótons bombeadas para o espaço intermembrana a cada NADH ou FADH2 que entra no processo, ou seja, a cada par de elétrons transferidas ao oxigênio. A transferência de dois elétrons do NADH para o O2 é acompanhada do bombeamento de 10 prótons, ao passo que o mesmo processo no caso do succinato, demanda o bombeamento de 6 prótons. Se 4 prótons devem passar pela ATPase, e adentrar a matriz mitocon-drial, para que uma molécula de ATP seja formada, podemos dizer que, em média, 2,5 ATP são formados para cada NADH e 1,5 ATP é formado para cada

FADH. Vale lembrar que os elétrons provenientes do NADH passam por mais bombas de prótons do que o FADH.

O balanço energético para uma molécula de glicose pode ser resumido em:

• Glicólise: 2 ATP + 2 NADH 8 ATP ou 7 ATP

• Ciclo de Krebs: 2 GTP (ATP) + 8 NADH + 2 FADH2 30 ATP ou 25 ATP

Sendo assim, cerca de 38 (em algumas literaturas) ou 32 ATPs (em outras lite-raturas) são obtidos na oxidação completa de uma molécula de glicose.

A saída do ATP formado da matriz mitocondrial para o espaço intermembrana ocorre por um transportador chamado adenina nucleotídeo translocase que realiza o antiporte de um ATP com um ADP. O fosfato que será acoplado ao ADP entra na matriz mitocondrial pelo transportador fosfato translocase que realiza o simporte do fosfato com um próton.

MODULAÇÃO DA FOSFORILAÇÃO OXIDATIVA

Para promover o ajuste da produção de ATP de acordo com a demanda celular naquele momento, o transporte de elétrons e a síntese de ATP são intimamente acopladas, ou seja, só há oxidação de coenzimas se houver síntese de ATP, e vice-versa. Dentre os substratos utilizados no processo, o ADP é o único que atinge concentrações limitantes na célula, sendo, assim, o regulador do proces-so.

O controle da fosforilação oxidativa depende, então, do balanço energético, ou seja, da relação ATP/ADP. Se esta é maior que 1, refletindo um balanço ener-gético positivo, a cadeira respiratória é freada. Por outro lado, caso a relação NADH/NAD esteja maior que 1, refletindo um balanço energético negativo, o sistema transportador de elétrons é ativado, de modo que o fluxo de prótons pela ATP sintase é acelerado bem como a oxidação das coenzimas. Assim, a

velocidade das vias que dependem da reciclagem de coenzimas oxidadas pela cadeia respiratória também é regulada pela razão ATP/ADP.


AS LANÇADEIRAS DE NADH

A membrana interna da mitocôndria é impermeável a NAD+ e NADH, o que impede que o NADH citosólico seja diretamente oxidado pela cadeia transpor-tadora de elétrons. Sendo assim, o sistema de lançadeiras consegue driblar a impermeabilidade da membrana ao transferir os elétrons do NADH para um composto citosólico que, reduzido, é capaz de atravessar a membrana mito-condrial interna ou que é capaz de transferir esses elétrons para um compo-nente da membrana.

LANÇADEIRA DO MALATO ASPARTATO

Ocorre nas células hepáticas, renais e cardíacas. Nesse processo, o NADH cito-sólico reduz oxaloacetato na reação catalisada pela malato desidrogenase cito-

sólica. O malato formado adentra a mitocôndria onde é oxidado pela malato desidrogenase mitocondrial, que também utiliza o NAD como coenzima.

Desse modo, tem-se a produção de um NADH mitocondrial a partir de NADH citosólico. O oxaloacetato, por sua vez, não pode atravessar a membrana, mas, ao receber um grupamento amino do glutamato, vai à aspartato, o qual atra-vessa a membrana e, no citosol, regenera o oxaloacetato.

FONTE: NELSON, D.L. & COX, M. M. Princípios da Bioquímica de Lehninger, 6ª edição, Porto

Alegre: Artmed, 2014.

LANÇADEIRA DO GLICEROL-3-FOSFATO

Ocorre no músculo esquelético e no cérebro. Nesse processo, o NADH citosóli-co reduz diidroxiacetona fosfato na reação catalisada pela glicerol 3-fosfato desidrogenase, formando glicerol 3-fosfato. Este se difunde até a face externa da membrana mitocondrial interna onde está localizada outra glicerol 3-fosfato

desidrogenase acoplada à FAD. A diidroxiacetona é então regenerada, produ-zindo FADH2 que entrega seus elétrons à coenzima Q.

INIBIDORES E DESACOPLADORES

A inibição da cadeia respiratória consiste no impedimento da transferência de elétrons, ao bloquear um dos complexos da cadeia, com consequente queda da força próton motriz e da produção de ATP. Um transportador reduzido, incapaz de passar adiante seus elétrons, é também incapaz de receber elétrons do transportador antecedente. Assim, todos os transportadores da cadeia anterio-res ao ponto de atuação da droga estarão reduzidos. Além disso, diminui-se o consumo de oxigênio já que o transporte de elétrons é freado.

• Rotenona (inseticida): inibidora do Complexo I

• Malonato: inibidor competitivo da succinato desidrogenase (Complexo II)

• Antimicina A: inibidor do Complexo III

• Cianeto e Monóxido de Carbono: inibidores do Complexo IV

• Oligomicina: bloqueia a porção F0 da ATP sintase

Os desacopladores podem ser naturais, como as UCP 1 ou termogenina, ou artificiais, como o dinitrofenol (DNP). Independentemente do tipo, todos os de-sacopladores desfazem o gradiente de prótons uma vez que fornecem uma alternativa para sua saída até a matriz mitocondrial, de modo que a energia é dissipada na forma de calor. A produção de ATP também é reduzida, como no caso dos inibidores da cadeia respiratória, mas, ao contrário destes, os desaco-pladores aumentam o consumo de oxigênio já que a queda na produção de ATP (ATP/ADP < 1) estimula a via glicolítica e o Ciclo de Krebs, bem como o transporte de elétrons na cadeia respiratória. Dessa forma, a demanda por oxi-gênio para receber esse fluxo de elétrons é maior.

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