folha de julgamento - cursos uea · 2013-02-22 · de leishmania sp em 96,66% das amostras de...
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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS – UEA FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS – FMT-AM
PROGRAMA DE POS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE EM BIÓPSIAS DE PELE EMBLOCADAS
EM PARAFINA COMPATÍVEIS COM LEISHMANIOSE TEGUMENTAR
AMERICANA
ROSILENE VIANA DE ANDRADE
MANAUS
2007
ROSILENE VIANA DE ANDRADE
REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE EM BIÓPSIAS DE PELE EMBLOCADAS
EM PARAFINA COMPATÍVEIS COM LEISHMANIOSE TEGUMENTAR
AMERICANA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas, em convênio com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, para a obtenção do grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas.
Orientador (a): Prof. Dr. Luiz Carlos de Lima Ferreira
MANAUS
2007
ii
FICHA CATALOGRAFICA
Andrade, Rosilene Viana
Reação em cadeia de polimerase em biópsias de pele emblocadas em parafina
compatíveis com Leishmaniose Tegumentar Americana a histopatologia, 2007.
xiv, 56f.
Tese (Mestrado) – Programa de Pós Graduação em Medicina Tropical da Universidade
do Estado do Amazonas, em convênio com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas.
Título em ingles: Reaction Chain polymerase in paraffine-embedded skin biopsies with
histopathological features consistent with American Cutaneous Leishmaniasis.
1.Cutaneous Leishmaniasis, 2.PCR, 3. kDNA minicircles, 4.histopathology.
.
iv
A Deus, o idealizador de tudo.
Á minha família, pela compreensão, pelo amor
incondicional e pelo apoio nos momentos
difíceis - o meu porto seguro.
v
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela sua imensa bondade para com a minha vida, pois tenho
somente que agradecer pelos momentos bons, por todas as conquistas e forças nos
momentos difíceis.
À minha família, pelo carinho e amor, sempre me apoiando em todos os
momentos da minha vida e da vida das minhas filhas.
Às minhas filhas, que são motivo de alegria, amor e força para seguir
enfrentando os bons e os maus momentos da vida.
Ao Dr. Luiz Carlos de Lima Ferreira, pela paciência, incentivo, e
conhecimentos científicos - a pessoa mais importante na minha vida profissional,
pois tem estado sempre comigo.
À Meline Nogueira, bolsista do PAIC, pelo carinho, ajuda e conhecimentos
técnicos imprencidíveis na realização da técnica Reação em Cadeia de Polimerase.
Ao Programa de Mestrado e Doutorado da Universidade Estadual do
Amazonas, pelos conhecimentos técnicos e pelo apoio financeiro; à Drª. Graça,
Coordenadora do programa e aos secretários, pela atenção, apoio e simpatia
sempre manifestados.
A Fundação de Medicina Tropical do Amazonas
Ao Sr Presidente Dr. Sinésio Talhari, pelo apoio pessoal, financeiro e
disponibilização de suporte técnico e laboratorial desta Fundação.
A Gerência de Leishmaniose, pela disponibilização das Fichas de
Atendimento Ambulatorial dos pacientes com biópsias c/c LTA.
A Gerência de Virologia, que nos permitiu a utilização do espaço físico e
aparelhagem para a realização da reação em cadeia de polimerase.
vi
Ao Laboratório de Anatomia Patológica; ao Dr. Araújo, pelo apoio neste
trabalho; à Sandra Caranhas, pela ajuda na realização dos cortes
histopatológicos das biópsias do estudo.
Ao Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia (INPA) e à Gerência de
Leishmaniose, pela disponibilização de cepas de Leishmaniose, usadas nos
controles positivos da PCR.
À Superintendência da Zona Franca de Manaus (SUFRAMA), pelo apoio
financeiro na realização da pesquisa.
vii
São muitas, Senhor Deus meu, as maravilhas
que tens operado e também os teus desígnios para
conosco; ninguém há que se possa igualar contigo.
Salmos 40,5.
viii
RESUMO
Introdução. A Leishmaniose Cutânea é uma doença de alta incidência no Brasil e
no ano de 2003 foram notificados 26.185 novos casos. No estado do Amazonas a
doença é endêmica. Os métodos tradicionais de diagnóstico de LTA, como a cultura
e histopatologia, requerem a presença de um número relativamente alto de
microorganismos, porém, na fase crônica, o número de parasitas é muito baixo.
Diagnosticar Leishmaniose Tegumentar Americana através da PCR em tecidos
parafinizados com laudos histopatológicos compatíveis com leishmaniose
tegumentar americana. Material e método O presente estudo avaliou a realização
da PCR para o diagnóstico de Leishmaniose Cutânea em biópsias de pele
emblocadas em parafina de pacientes c/c LTA a histopatologia. A amplificação de
DNA de Leishmania utilizou primers de área conservada do kDNA com 120 pares
de base. As biópsias foram também reavaliadas histopatologicamente e
classificadas de acordo com Magalhães 1986. Resultados. A PCR amplificou DNA
de Leishmania sp em 96,66% das amostras de biópsias compatíveis com LTA. Na
reavaliação histopatológica, os achados mais comumente percebidos nas biópsias
compatíveis com LTA e PCR positivo foram a presença de hiperplasia
pseudoepiteliomatosa em 90% dos casos e reação granulomatosa em 90,69%. O
tipo histopatológico mais frequentemente encontrado foi o tipo IV da classificação de
Magalhães et al em 62,22% dos casos Conclusão. O PCR demonstrou alta
sensibilidade para o diagnóstico de Leishmaniose Cutânea nas fases crônicas da
doença.
Palavras-chave: Leishmaniose Cutânea, PCR, Minicírculo de kDNA, Histopatologia.
ix
ABSTRACT
Introduction.The Cutaneous Leishmaniasis is on of the infections-diseases of
highest incidence in Brazil with 26.185 new cases in 2003, it has been observed in
endemic area in North region. The diagnosis of chronic lesion using routine methods
requires the presence of high numbers of the parasites, for example culture and
histopathology but in chronic lesion, the number of parasite is low. Material and
methods.In this study we assessed the ability of PCR to diagnostic cutaneous
leishmaniasis. We used to amplify a 120 base pair fragment of Leishmania
kinetoplast DNA (kDNA) minicircles of paraffin-embedded skin biopsies of specimens
of cutaneous leishmaniasis with histopathological features consistent with cutaneous
leishmaniasis but failed to detect parasite. The biopsies were reviewed and
characteristic elements were descript and following grouped based with Magalhães
classification. Results. The PCR amplify Leishmania DNA in 96,66% of the cases
consistent with cutaneous leishmaniasis. The histopathological group more frequently
observed were the group IV of Magalhães in 62,22%.The histopathological features
more frequently observed were pseudoepitheliomatous hyperplasia and
granulomatous reaction in 90% and 90,69% respectively . Conclusion.The PCR on
paraffin-embedded tissue is highly sensitive test for diagnosis of chronic lesion of
cutaneous leishmaniasis when others method failed to detect parasite.
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Distribuição dos pacientes c/c LTA de acordo com a faixa etária..............22
Tabela 2 Distribuição dos pacientes c/c LTA de acordo com o número de lesões
ulceradas....................................................................................................................23
Tabela 3 Distribuição dos pacientes c/c LTA de acordo com o tempo de evolução
das lesões ulceradas..................................................................................................24
Tabela 4 Distribuição dos casos de c/c LTA de acordo com o tipo histológico
baseados na Classificação de Magalhães.................................................................25
Tabela 5 Distribuição dos casos de acordo com a análise das características
histopatológicas das biópsias c/c LTA reavaliadas....................................................26
Tabela 6 Distribuição do número médio de linfócitos e plasmócitos nos pacientes c/c
LTA e pacientes com LTA a histopatologia................................................................26
Tabela 7 Resultado do teste estatístico para proporções (Teste Z) das
características histopatológicas..................................................................................27
Tabela 8 Distribuição do número médio de linfócitos e plasmócitos nos pacientes c/c
LTA e PCR positivo para gênero Leishmania e nos casos positivos para LTA a
microscopia óptica......................................................................................................27
xi
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 Lista de espécies de Leishmania causadoras de Leishmaniose
Tegumentar no Brasil e seus principais vetores.......................................................02
Quadro 2 Amplificação da PCR no termociclador :números de ciclos, variação de
temperatura e o tempo de cada etapa.......................................................................18
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Distribuição dos casos de Leishmaniose Tegumentar no Velho e Novo
Mundo de acordo com a Organização Mundial de Saúde.........................................03
Figura 2 Padrão histopatológico das biópsias compatível com Leishmaniose
Cutânea......................................................................................................................15
Figuras 3 Distribuição dos pacientes c/c LTA a histopatologia de acordo com o
sexo............................................................................................................................21
Figura 4 Distribuição dos pacientes c/c LTA de acordo com o localização das lesões
ulceradas....................................................................................................................22
Figura 5 Tipo IV, tipo histopatológico mais freqüentemente encontrado de acordo
com a classificação de Magalhães.............................................................................25
Figura 6 Gel de eletroforese do resultado da amplificação do DNA de Leishmania sp
através da PCR..........................................................................................................28
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
β minutos
μ micro
> Maior
< Menor
dNTP Desoxirribonucleosídios trifosfato
DNA Ácido desoxirribonucléico
FMTAM Fundação de Medicina Tropical do Amazonas
INPA Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia
LTA Leishmaniose Tegumentar Americana
M molar
pb Pares de base
SDS Sulfato duodecil de Sódio
Taq Termus aquaticus - polimerase termo estável
TBE Tampão de Tris-base e ácido bórico
V Volts
xiv
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO..................................................................................................... 1 1.1 Considerações Gerais................................................................................... 1 1.2 Epidemiologia................................................................................................ 2 1.3 Diagnóstico Laboratorial................................................................................ 4
2 OBJETIVO........................................................................................................... 12 2.1 Geral.............................................................................................................. 12 2.2 Específico...................................................................................................... 12
3 MATERIAL E MÉTODO...................................................................................... 13 3.1 População e modelo de estudo..................................................................... 13 3.2 Delimitação da área de estudo...................................................................... 13 3.3 Critérios de inclusão...................................................................................... 14 3.4 Comitê de ética.............................................................................................. 14 3.5 Procedimentos realizados.............................................................................. 14 3.6 Análise estatística.......................................................................................... 21
4 RESULTADOS.................................................................................................... 22 4.1 Resultados do estudo clínico dos pacientes compatíveis com LTA.............. 22 4.2 Estudo laboratorial......................................................................................... 24
5 DISCUSSÃO....................................................................................................... 29
6 CONCLUSÃO...................................................................................................... 37
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................... 38
8 ANEXOS.............................................................................................................. 43
1
1.INTRODUÇÃO
1.1. Considerações gerais.
A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma doença de evolução
crônica que acomete, isoladamente ou em associação, a pele e mucosas do nariz,
da boca, da faringe e da laringe (Veronesi et al) 2004. É causada por um protozoário
do gênero Leishmania Ross 1903. Alexandre Cerqueira, em 1885, na Bahia, foi o
primeiro a identificar a moléstia e a suspeitar do papel dos flebotomíneos como
vetores. Gaspar Viana, em 1911, propôs a denominação de Leishmania brasiliensis
para o agente da LTA. Apresenta-se agrupada em dois subgêneros: Viannia e
Leishmania, de acordo com o local de adesão e multiplicação do parasita no tubo
digestivo dos flebotomíneos, (Lainson & Shaw 1987).
Atualmente sete espécies do gênero Leishmania foram identificadas no Brasil,
seis pertencentes ao subgênero Viannia: Leishmania (Viannia) brasiliensis,
Leishmania (Viannia) guyanenensis, Leishmania (Viannia) shawi, Leishmania
(Viannia) lainsoni, Leishmania (Viannia) lindembergi, Leishmania (Viannia) naiffi e
uma espécie do subgênero Leishmania: Leishmania (Leishmania) amazonensis.
(Gontijo, Carvalho, 2003).
O protozoário da Leishmania apresenta duas formas evolutivas principais:
uma forma flagelada ou promastigota, encontrada no tubo digestivo do inseto vetor e
em meios de cultura, e outra com flagelo interno, a amastigota, observada nos
hospedeiros vertebrados. (Veronesi 2004 et al).
A transmissão ao homem ocorre pela picada de vetores flebotomíneos. No
Brasil diferentes espécies são responsáveis pela transmissão da leishmaniose, como
estão relacionados abaixo. (Gontijo, Carvalho 2003). Referida no Quadro 1.
A leishmaniose é primariamente uma enzootia de animais silvestres, o
homem representa um hospedeiro acidental. Um grande número de espécies de
mamíferos como roedores, edentados, marsupiais, procionídeos, canídeos, primatas
e ungulados agem como reservatório de Leishmania sp, (Arias et al 1981).
2
Quadro1. Espécies de Leishmania que acometem o homem no Brasil e seus
principais vetores.
Espécies de Leishmania
Principais vetores
Leishmania (V) brasiliensis.
Leishmania (V) guyanensis
Leishmania (V) naiffi
Leishmania(V) shawi
Leishmania (V) lansoni
Leishmania (L) amazonensis
Lutzomyia whitmani, Lu. wellcomei e Lu.
Intermédia
Lu. squamiventris e Lu. umbralitis, Lu. anduzei e
Lu. whitmani
Lu. squamiventris , Lu. paraensis e Lu. ayrozai
Lu. whitmani
Lu. umbiquitalis
Lu. flaviscutellata e Lu. Olmeca
A Leishmaniose Tegumentar Americana pode ser classificada de acordo com
suas manifestações clínicas em forma cutânea localizada, sendo caracterizada por
lesões ulceradas, indolores, únicas ou múltiplas e, menos freqüentemente lesões
nodulares, vegetantes e em placa; a forma disseminada, que apresenta múltiplas
úlceras cutâneas distribuídas em diversas áreas do tegumento; a forma cutâneo-
mucosa, caracterizada por lesões mucosas agressivas que afetam as mucosas
nasofaríngeas de forma isolada ou concomitante a lesão cutânea e, finalmente, a
forma difusa, com lesões nodulares múltiplas. (Ramos-e-Silva , Jacques, 2002).
1.2. Epidemiologia
A Organização Mundial de Saúde estima uma incidência de 12 milhões de
casos de leishmaniose no mundo, ocorrendo nos quatro continentes. Estimando-se
dois milhões de novos casos (1,5 milhão de casos de leishmaniose cutânea e
500.000 mil de Leishmaniose Visceral), sendo endêmica em 88 países e de
notificação compulsória em 32 destes. (OMS 2006). Figura 1.
3
Na distribuição Geográfica, 90 % dos casos de Leishmaniose Cutânea
ocorrem no Afeganistão, Brasil, Irã, Peru, Arábia Saudita e Síria e 90% dos casos de
Leishmaniose Cutâneo-Mucosa ocorrem na Bolívia, Brasil e Peru. (OMS 2006).
Figura 1. Distribuição dos casos de leishmaniose cutânea no Velho e Novo
Mundo (OMS 2006).
No Brasil, a doença é endêmica e de elevada incidência, uma vez que no ano
de 2006 ocorreram 23.427 casos notificados de LTA, segundo o Ministério da Saúde
(2006). Só no Amazonas, neste mesmo ano , foram notificados 1.437 casos e em
2005, a taxa de incidência da doença foi de 60,24/100.000 hab. No quadro abaixo
se observa o número de casos notificados, distribuídos de acordo com a região e os
estados com o maior número de notificações.
Na Amazônia, em particular no Estado do Amazonas, a incidência de LTA tem
se mantido elevada, como acima citado. No ano de 2003 foram notificados 3.436
casos. A associação com atividades profissionais pode estar ausente em áreas onde
surgiram condições para a transmissão domiciliar, por exemplo, em Manaus, no
estado do Amazonas, onde a expansão urbana aproximou a população dos focos
naturais da doença (Guerra 2006 et al ).
Nas florestas vicinais, a zoonose, mantida principalmente pelo gambá, passou
a acometer indistintamente adultos e crianças de ambos os sexos (Arias 1981). A
abertura de novas estradas, a instalação de núcleos residenciais em áreas de
4
floresta e os treinamentos militares constituem fatores importantes na epidemiologia
da leishmaniose, (Guerra et al 2006).
Na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, centro de referência do
estado em doenças infecciosas e parasitárias, foram registrados 828 casos de
Leishmaniose Tegumentar no ano de 2004, 823 casos em 2005 e 462 casos em
2006, (Boletim Epidemiológico da FMTAM 2006).
1.3. Diagnóstico Laboratorial
O diagnóstico da Leishmaniose Tegumentar Americana abrange aspectos
epidemiológicos, clínicos e laboratoriais. Os exames laboratoriais empregados são:
pesquisa direta, isolamento em cultura, inoculação em animais de laboratório, exame
histopatológico, exame sorológico e, mais recentemente, reação em cadeia da
polimerase (PCR). (Safei 2002 et al ), (Gontijo et al 2003).
1.3.1. Escarificação
A pesquisa direta do parasito pode ser realizada em material obtido pela
escarificação na borda da lesão ulcerada ou da lesão não ulcerada, com estilete
descartável ou lâmina de bisturi. Realiza-se um esfregaço em lâmina, fixado em
metanol por 3 minutos e corada pela técnica de Giemsa. O resultado positivo é dado
pela presença, no microscópio óptico, de formas amastigotas de leishmania isoladas
ou intracelularmente, (Gontijo, Carvalho 2003).
1.3.2. Cultura
O isolamento do parasito pode ser feito em cultura de tecidos biopsiados ou
aspirados dos bordos da lesão ou a partir de inóculos em animais susceptíveis. A
cultura permite a definição de espécie. O parasito cresce em meios de cultura como,
por exemplo, Nicolle, Nevy e Mcneal ( NNN ), entre 24º a 26º C, após o quinto dia,
formas promastigotas podem ser observadas, (Gontijo, Carvalho 2003).
1.3.3. Inoculação em animais de laboratório
Na inoculação, os animais utilizados são o camundongo e o hamster, o
inóculo deve ser obtido a partir de uma suspensão homogeneizada do material de
biópsia em solução salina estéril e aplicado preferencialmente nas extremidades
5
(patas posteriores). As lesões desenvolvem-se tardiamente (a partir de um mês),
(Ministério da Saúde 2006).
1.3.4. Diagnóstico Imunológico
1.3.4.1.Intrademorreação de Montenegro: traduz a resposta de
hipersensibilidade celular retardada a uma injeção de antígeno preparado com
promastigotas. O resultado é positivo quando se observa pápula ou nódulo maior ou
igual a 5 mm de diâmetro ou ulceração que é lida após 48 a 72 h. Em áreas
endêmicas, deve-se considerar a possibilidade de leishmaniose anterior ou
exposição ao parasito sem a doença.( Gontijo, Carvalho 2003).
1.3.4.2. Imunofluorescência Indireta (IFI) e Teste Imunoenzimático
(ELISA): expressam os níveis de anticorpos circulantes. Nas lesões ulceradas por
Leishmania (V) braziliensis a sensibilidade da Imunofluorescência está em torno de
70%. Geralmente considera-se positiva a reação a partir da diluição de 1:40.
(Ministério da saúde 2000).
1.3.5 Histopatologia
O exame histopatológico permite a visualização direta do parasito e/ou a
presença de características histopatológicas sugestivas de LTA. Nos casos em que
o exame histopatológico não visualiza o agente etiológico, o anatomopatologista
emite o laudo histopatológico de “compatível com Leishmaniose Tegumentar”.
Considera-se “compatível com Leishmaniose Tegumentar” as biópsias de pele com
suspeita clínico-epidemiológica de LTA cujo exame histopatológico demonstre
formações granulomatosas, constituídas por células epitelióides, células gigantes
tipo Langhans, linfócitos, hiperplasia pseudoepiteliomatosa, histiócitos vacuolizados
e moderado infiltrado de plasmócitos. ( Safaei et al 2002).
A primeira classificação de Leishmaniose Tegumentar Americana foi proposta
por Azulay, em 1960, que acreditava que um processo exsudativo agudo
caracterizava histopatologicamente a fase inicial da doença e um granuloma
tuberculóide surgisse na fase tardia.
6
Em 1980, Ridley e colaboradores classificaram histopatologicamente 60
biópsias de pacientes com leishmaniose cutânea em cinco grupos: grupo l, que foi
quase normal exceto por leves alterações degenerativas do colágeno; grupo ll, a
característica predominante foi um processo necrotizante mais severo que o grupo l.
O grupo lll corresponde a um infiltrado inflamatório acentuado sem necrose e
granuloma. O grupo lV e V foram associados a células epitelióides e células gigantes
multinucleadas.
Magalhães et al 1986, na Bahia, através de um estudo histopatológico de 162
casos de Leishmaniose cutânea e mucosa, descreveram cinco padrões
histopatológicos distintos:
-Tipo l reação exsudativo-celular com infiltrado inflamatório
histiolinfoplasmocitário dérmico ou do córion da mucosa com proporções que
tendem a equivalência;
-Tipo ll reação exsudativo-necrótica caracterizada por necrose tissular na
derme ou córion da mucosa de amplitude variável, além do infiltrado
histiolinfoplasmocitário;
-Tipo lll reação exsudativa e necrótico-granulomatosa consistente com reação
granulomatosa desorganizada ao redor ou nas proximidades da área de necrose
tissular, caracterizada pela presença de macrófagos ativados e de células gigantes.
Presença de infiltrado histiolinfoplasmocitário.
- Tipo lV reação exsudativa e granulomatosa com reação granulomatosa
desorganizada isolada no seio do infiltrado inflamatório, sem presença de necrose
tissular. Presença de infiltrado histiolinfoplasmocitário;
- tipo V reação exsudativa e tuberculóide com reação granulomatosa
constituída por macrófagos, células epitetióides e células gigantes, dispostas em
arranjos tuberculóides bem delimitados, além do infiltrado histiolinfoplasmocitário.
Bittencourt et al, em 1991, realizaram avaliação das classificações
histopatológicas anteriores de Leishmaniose Cutânea e Leishmaniose Mucocutânea
7
(Riddley et al 1980 e Magalhães et al 1986) propondo uma classificação mais
simplificada com apenas três padrões. Aspectos histopatológicos distintos foram
observados em diferentes lesões ou ainda na mesma lesão. Os autores concluem
neste trabalho que os padrões histopatológicos não representam um estágio de
leishmaniose tegumentar e então não podem ser correlacionados com prognóstico e
resposta terapêutica como sugere a literatura.
Andrade-Narvaez et al 2005 avaliaram, através da histopatologia, 73 casos
de leishmaniose cutânea localizada. Os achados histopatológicos foram baseados
na classificação de Magalhães et al 1986 é o padrão mais comumente encontrado
foi caracterizado pela presença de granulomas não organizados sem necrose
(43,8%). A identificação do parasito foi positiva em 50/73(68,5%) dos casos.
Ramirez et al em 2000, realizaram um trabalho comparando a sensibilidade
do exame de esfregaço do centro e das bordas de lesões ulceradas de 115
pacientes com leishmaniose cutânea, a sensibilidade do exame microscópico foi
respectivamente de 90,4 e 78,3%. Quando o método da PCR foi utilizado com um
grupo de 40 pacientes, observou-se alta sensibilidade nas amostras do cento das
úlceras, com 80,8% versus 57,7% nas amostras colhidas das bordas da lesão.
Outros métodos diagnósticos parasitológicos, tais como cultura e histopatológico,
foram menos sensíveis com 67,5 e 64,3 respectivamente. A coleta simultânea para
exame microscópico do centro e das bordas da úlcera aumentou a sensibilidade
para 94%,sendo está rotina indicada pelo autor.
1.3.6. REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica in vitro que permite
a amplificação de seqüências específicas de ácido desoxirribonucléico (DNA) ou de
ácido ribonucléico (RNA), sendo este último realizado a partir da síntese de ácido
desoxirribonucléico complementar. A PCR foi originalmente descrita por Mullis
(1987) e desde então tem sido utilizada em vários campos da ciência. A aplicação do
PCR permite rápida detecção e identificação do DNA dos parasitos sem a
necessidade de isolamento, permitindo a geração de cópias de seqüências
específicas de DNA.
8
No diagnóstico de leishmaniose, um dos principais alvos das técnicas
moleculares desenvolvidas é o DNA do cinetoplasto (kDNA) Rodgers et al 1990. O
kDNA é constituído por duas moléculas, os minicírculos de 1,42 Kb e os
maxicírculos de cerca de 36 Kb. A reação em cadeia de polimerase pode ser usada
para aumentar a sensibilidade da detecção de Leishmanias por métodos de
hibridização através da amplificação de seqüências do minicírculo. O Método foi
sensitivo o suficiente para detectar o kDNA de um simples organismo e essa
sensibilidade permitiu o uso de métodos de hibridização não radioativos. (Rodgers
et al 1990).
Os estudos da reação em cadeia da polimerase em tecidos, fixados em
parafina, para diagnóstico de leishmaniose foram iniciados por (Laskay et al 1995)
que avaliou a habilidade da PCR para detectar DNA de Leishmania aethiopica em
biópsias de pele emblocadas em parafina nos 17 casos de leishmaniose cutânea,
confirmados pela cultura e/ou exame histopatológico de 40 pacientes com
diagnóstico clínico de leishmaniose sem a demonstração laboratorial do parasito. O
PCR foi positivo nos 17 pacientes com o diagnóstico confirmado laboratorialmente
de leishmaniose e em sete dos 22 pacientes com achados histopatológicos
consistentes com leishmaniose e negativas em todos os 18 pacientes que
histopatologicamente não apresentavam características suspeitas de leishmaniose.
Libório et al, em 2005, avaliaram a extração do DNA genômico de amostras
de cavidade oral fixadas em parafina e arquivadas nos últimos 40 anos. Na reação
em cadeia da polimerase, foram utilizados fragmentos de β globina de 268pb que
amplificou o DNA em 55% das amostras, preferencialmente nos casos mais
recentes. Nos fragmentos com 536 pb, o gene da β globina foi amplificado somente
em 25% das amostras e também preferencialmente nos casos mais recentes. O
fragmento do gene WAF1 com 149 pb apresentou amplificação fraca, mais presente
em 75% dos casos, uma correlação positiva foi observada entre a quantidade de
DNA e a idade das amostras. A eletroforese mostrou DNA genômico
predominantemente nos fragmentos menores (com número menor de pares de
base).
9
Cao et al, em 2003 compararam métodos de extração de DNA de 34
biópsias fixadas em parafina, analisando o gene da β globina, comparando a
eficiência de 3 protocolos diferentes de extração. O resultado obtido foi 30/34
(88,2%) com o uso do “boiling method”, 29/34 (85,3%) com utilização de fenol-
clorofórmio e 18/34 (52,9%) com um Minikit de extração. Os métodos de extração do
DNA que utilizaram o fenol-clorofórmio e o “boiling method” foram os mais eficientes.
Na amplificação da PCR de células bucais, com boiling método em 2/16 casos
(12%), com fenol clorofórmio em 16/17 casos (94,1%) e com o Kit em 12/16 (75%).
Safaei et al, em 2002 mostrou que a reação em cadeia de polimerase em
tecidos parafinizados apresenta-se como um método altamente sensível (92% de
sensibilidade) e específico (100% de especificidade) no diagnóstico de leishmaniose
cutânea. O estudo dividiu os pacientes em dois grupos: o grupo um, cujos pacientes
apresentavam Leishmania a histopatologia, a PCR mostrou parasito em todos os 33
casos. No grupo dois, constituído de 29 pacientes que foram negativos à
visualização microscópica de amastigotas, 24 amostras foram positivas através da
PCR. Na avaliação histopatológica, os achados mostraram que a presença de
granulomas imaturos foi diretamente correlacionada com a detecção de parasitos na
biópsia e a presença de granulomas bem formados foi inversamente correlacionada.
Pirmez et al, em 1999 avaliaram 216 pacientes com diagnóstico clínico de
leishmaniose, sendo o PCR positivo em 94% (203/216) dos casos, enquanto os
métodos convencionais (esfregaço, cultura e reação de Montengro) em 62% destes
pacientes. Na doença mucosa o impacto foi maior, pois enquanto o diagnóstico foi
realizado em apenas 17% (4/24) dos pacientes por técnicas convencionais, o PCR
foi positivo em 71%(17/24) dos pacientes.
Em estudos (Medeiros et al 2002), utilizaram a PCR em 54 biópsias de pele e
mucosa de pacientes com diagnóstico clínico e/ou laboratorial de leishmaniose
cutâneo americana usando primers gênero-específico (13A e 13B), com resultados
positivos obtidos em 82% das amostras. Quando o PCR foi comparado com aqueles
do histopatológico, o PCR mostrou resultados superiores com 81.5% de
sensibilidade.
10
Rodrigues et al, 2002 avaliaram 119 biópsias de pele através de PCR do DNA
do cinetoplasto de pacientes com Leishmaniose Cutânea Americana de áreas
endêmicas do Norte do Brasil. Foram usados “primers” gênero-específico e
subgênero Viannia. O PCR específico para o subgênero Viannia teve sensibilidade
de 95.4%, enquanto o PCR gênero-específico detectou DNA em 88.2% das
amostras testadas.
Faber et al, em 2003 na Holanda realizaram estudo de biópsias de pele de 46
pacientes com suspeita clínica de Leishmaniose Cutânea através de métodos
convencionais e encontraram sensibilidade de 65% no esfregaço, 84% na cultura,
82% no histopatológico, 87% na reação de Montenegro, compararam-nos a PCR
que identificou 100% , demonstrando ser o mais sensível teste diagnóstico para
leishmaniose cutânea.
Mimori et al 1998 realizaram estudo para identificação das cinco principais
espécies de Leishmania que causam Leishmaniose Cutânea do Novo Mundo em
biópsias fixadas em parafina através da reação em cadeia de polimerase,
enfatizando sua importância no arsenal de ferramentas utilizadas no diagnóstico de
leishmaniose cutânea.
Na Amazônia, em particular no Estado do Amazonas, a incidência de LTA tem
se mantido elevada. A Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, que atende em
média 47,5% dos casos de leishmaniose do Estado, vem registrando em torno de
1.000 casos novos a cada ano, quase todos oriundos do Município de Manaus,
principalmente de áreas periféricas da cidade e das rodovias AM-010 e BR-174.
A doença é endêmica e de elevada incidência no estado do Amazonas; 3.436
casos notificados em 2003. Assim, trabalhos visando seu estudo são importantes,
principalmente quando dão ênfase a fase crônica da doença, quando outros
métodos falham em demonstrar o parasita na lesão, como exemplo, exame direto,
cultura in vitro e histopatológico, pois requerem a presença de número relativamente
alto de microorganismos intactos morfologicamente, sendo mais sensíveis apenas
nos primeiros meses de doença .
A busca de técnicas mais especificas e reprodutíveis como a PCR ajudam na
decisão de condutas clínicas e ações de caráter epidemiológico. Na reação em
11
cadeia da polimerase, o diagnóstico pode ser dado mesmo na presença de
quantidades reduzidas de DNA do parasita, permitindo inclusive o conhecimento das
espécies de Leishmania causadoras da doença e minimizando os falsos
diagnósticos, como também os efeitos adversos da terapia para leishmaniose.
O presente estudo dá ênfase ao uso da PCR como ferramenta importante no
diagnóstico de Leishmaniose Cutânea, principalmente na fase crônica da doença,
quando os métodos tradicionais apresentam sua sensibilidade diminuída em
decorrência do número reduzido de parasitos encontrados.
12
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
- Diagnosticar Leishmaniose Tegumentar Americana através da PCR em tecidos
parafinizados com laudos histopatológicos compatíveis com leishmaniose
tegumentar americana.
2.2 Específicos
- Estudar a utilização do PCR no diagnóstico de LTA em tecidos parafinizados, tendo
como padrão diagnóstico o laudo histopatológico de compatível com LTA;
- Estabelecer o padrão histopatológico através da microscopia óptica das biópsias de
pele compatível com LTA e PCR positivo;
- Realizar estudo comparativo com biópsias de pele PCR positivo com ausência de
amastigotas e PCR positivo e presença de amastigotas a histopatologia.
13
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1) População e Modelo de Estudo
Foi realizado estudo transversal, retrospectivo com delineamento do tipo
detecção de casos através da técnica de reação em cadeia de polimerase e revisão
de 90 biópsias de pele com diagnóstico histopatológico compatível com
Leishmaniose Tegumentar Americana (c/c LTA) da Gerência de Anatomia Patológica
e análise das Fichas Ambulatoriais do arquivo da Gerência de
Leishmaniose/Dermatologia da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas
(FMTAM) no período de 2003 e 2004.
Foram usados como controles positivos biópsias com diagnóstico
histopatológico de Leishmaniose tegumentar realizadas na FMTAM e amostras de
cultura de leishmaniose cedidas pelo Laboratório de Leishmaniose do Instituto de
Nacional de Pesquisa da Amazônia e como controles negativos biópsias de pele
com outras patologias, a saber: eritema nodoso, hanseníase, doença de Jorge Lobo,
cromomicose tuberculose cutânea e micobacteriose atípica realizadas na FMTAM no
período de 2003 a 2004.
3.2) Delimitação da área de estudo
As amostras foram obtidas dos blocos em parafina de biópsias de pele
arquivados no Laboratório de Patologia da FMTAM, Centro de Referência Terciária
no atendimento de doenças infecciosas na cidade de Manaus.
A cidade de Manaus é a capital do estado do Amazonas e possui população
estimada pelos dados do IBGE para 2006 de 1.688,524 habitantes, com área
territorial de 11.401,06 km2, situada na margem esquerda do Rio Negro, a 92m
acima do nível do mar e apresenta clima quente e úmido. A economia está baseada
no turismo e montagem de artigos eletroeletrônicos e setor de duas rodas.
3.3) Critérios de Inclusão:
- Biópsia colhida devido a suspeita clínica de Leishmaniose Tegumentar Americana;
- Biópsia com laudo histopatológico compatível com Leishmaniose Tegumentar
Americana;
14
- Quantidade de tecido representativo para a realização da PCR.
3.4) Comitê de Ética:
O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa de Seres Humanos
da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas em janeiro de 2006 (n.1757/05).
3.5) Procedimentos realizados:
3.5.1) Estudo clínico dos pacientes c/c LTA a histopatologia
Foram analisadas 90 Fichas Ambulatoriais colhidas na gerência de
Leishmaniose da FMTAM dos pacientes c/c LTA cujas biópsias foram examinadas
na gerência de Anatomia Patológica.
3.5.2) Procedimentos histopatológicos:
Os procedimentos histopatológicos foram realizados no serviço de patologia
do FMTAM e seguiram padronização técnica, (Prophet 1994).
Foram revisadas as 90 lâminas dos histopatológicos, com laudo de
compatíveis com leishmaniose tegumentar americana, do arquivo da Gerência de
Anatomia Patológica dos anos de 2003 e 2004,
O exame histopatológico permite a visualização direta do parasito e/ou a
presença de características histopatológicas sugestivas de LTA. Nos casos em que
o exame histopatológico não visualiza o agente etiológico, o anatomo-patologista
emite o laudo histopatológico de “compatível com Leishmaniose Tegumentar”.
Considera-se “compatível com Leishmaniose Tegumentar” as biópsias de
pele com suspeita clínico-epidemiológica de LTA cujo exame histopatológico
demonstrou formações granulomatosas, constituídas por células epitelióides, células
gigantes tipo Langhans, linfócitos, hiperplasia pseudoepiteliomatosa, histiócitos
vacuolizados e moderado infiltrado de plasmócitos. O desejável é o diagnóstico de
certeza, visto que, outros agentes etiológicos podem exibir o mesmo padrão
histopatológico, ou seja, inflamação granulomatosa crônica. Figura 2
15
IV
Figura 2. Padrão histopatológico das biópsias compatível com Leishmaniose
cutânea: caracterizado por infiltrado inflamatório crônico granulomatoso constituído
por linfócitos, histiócitos, plasmócitos células epitelióides e células gigantes
multinucleadas.
As biópsias foram agrupadas de acordo com a classificação histopatológica de
Magalhães et al 1986. Numa etapa posterior, 43 biópsias dos 90 pacientes c/c LTA e
40 biópsias dos pacientes com diagnóstico de LTA comprovado na microscopia pela
visualização das amastigotas foram avaliadas histopatologicamente, sendo
verificadas as seguintes características: hiperplasia, ulceração, necrose e presença
de granulomas. O exame microscópico foi realizado avaliando-se seis campos com
aumento de 200x em cada lâmina corada pela hematoxilina-eosina, provenientes do
arquivo da Gerência de Anatomia Patológica da FMTAM.
Foram analisados também nos seis campos, em aumento de 200x, o número
médio de linfócitos e plasmócitos em 36 pacientes c/c LTA à microscopia óptica e
PCR positivo para gênero leishmania e 32 pacientes com diagnóstico de LTA à
microscopia óptica (com presença de amastigotas).
16
3.5.3) Procedimentos Moleculares: No protocolo para a realização da PCR as
seguintes etapas foram realizadas:
3.5.3.1) Cortes histológicos:
Os blocos de tecido parafinizados foram submetidos a cortes de 20 μm com
navalhas descartáveis, uma navalha para cada bloco, em micrótomo usual. Os
cortes foram acondicionados em microtubos estéreis e mantidos em geladeira até o
momento dos procedimentos para PCR.
3.5.3.2) Desparafinização.
- Adicionou-se aos cortes de 20μm armazenados previamente 1,0 ml de xilol
aquecidos em banho-maria a 65º C por 10 min e a seguir centrifugou-se a 13.000
rpm por 5 min a 4º C. Desprezou-se o sobrenadante. O procedimento de lavagem
com xilol foi repetido por duas vezes. O sedimento foi mantido à temperatura
ambiente em etanol a 100% até completa evaporação do etanol e obtenção de
resíduo seco (em torno de 2h).
3.5.3.3) Extração do DNA:
1) Protocolo de fenol/clorofórmio. Isola et al (1994)
- Adicionou-se 500µL de solução tampão ao resíduo seco (0,1M de Nacl 0,01 de Tris
Hcl pH 8,0 e 0,001M de EDTA com pH 8,0), 15μL de proteinase k a 1% e 75μL de
sulfato de duodecil a 10%, misturando-se cuidadosamente os tubos por inversão.
- As amostras permaneceram em banho-maria a 56º C em pernoite e foram
misturadas para dissolver qualquer resíduo sólido. Adicionou-se 600μL de fenol
agitando-se por inversão por 2 minutos, centrifugando-se as amostras a 14000 rpm
por 10 minutos. Em novos tubos retirou-se a fase aquosa, preservando o que não
pode ser coletado.
- Adicionou-se 600μL de fenol-clorofórmio/álcool isoamilico (24:24:1) e agitou-se por
inversão durante 2 minutos. As amostras foram centrifugadas a 14000 rpm por 10
minutos e em novos tubos, desprezou-se o sobrenadante.
17
- Adicionou-se 600μL de clorofórmio e misturou-se por 2 minutos, realizou-se
centrifugação das amostras a 14000 rpm por 10 minutos e troca para novos tubos,
desprezando o sobrenadante.
- Adicionou-se 55μl de 5M NaCl em cada tubo (10% do volume total) e 1000μl de
álcool absoluto (a 95%), misturou-se cuidadosamente os tubos por inversão.
- As amostras permaneceram à temperatura de - 20ºC em pernoite e então foram
centrifugadas a 14000 rpm por 10 minutos. Desprezou-se o álcool, deixando o
resíduo que foi lavado em 500μL de álcool a 70% . Removeu-se o álcool, deixando
o resíduo de DNA secar a temperatura ambiente e depois se dissolveu o resíduo em
50μl de água. Armazenou-se o DNA à temperatura de -20º C em freezer.
2) Protocolo de extração com sal. (Disch et al 2004)
- Após a retirada da parafina, colocou-se em banho-maria e adicionou-se 500μl de
solução tampão “STF buffer” e 15μl de proteinase k a 1% e 75μl de sulfato de
duodecil a 10% em cada tubo, misturou-se cuidadosamente os tubos com
movimentos de inversão. As amostras permaneceram em pernoite no banho-maria
(56°C) e foram misturadas para dissolver qualquer fragmento sólido.
- Adicionou-se 60μl de 5M NaCl em cada tubo (volume total de 10%) e misturou-se
o conteúdo dos tubos por inversão, permanecendo em refrigeração de 1h ao
pernoite. Centrifugaram-se as amostras a 14000 rpm por 10 minutos.
- Retirou-se a parte aquosa e colocou-se o sobrenadante em novos tubos,
permanecendo no gelo. Centrifugou-se o sobrenadante a 14000 rpm por 5 minutos.
O sobrenadante foi colocado em novos tubos e adicionou-se 1000μl de álcool
absoluto (a 95%) que foram misturados cuidadosamente. As amostras
permaneceram em pernoite no freezer a -20° C. Centrifugaram-se as amostras a
14000rpm por 10 minutos. Desprezou-se o álcool deixando o resíduo de DNA,
adicionou-se 500μl de álcool a 70%. Repetiram-se as etapas de centrifugação e
retirada do álcool, deixando o resíduo secar a temperatura ambiente. Quando os
tubos secaram, o resíduo foi ressuspenso em 50μL de água. Armazenou-se o DNA
a - 20°C em freezer.
Obs: Solução tampão (STE): 0,1M de NaCl, 0,01M deTris HCL (pH 8,0), 0,001M
EDTA (pH 8,0).
18
3.5.3.4) Amplificação da PCR:
Para a realização da PCR utilizou-se uma enzima termoestável (DNA polimerase)
que, na presença de oligonucleotídios iniciadores (primers) e dos nucleotídeos, que
compõem a molécula de DNA, amplificou a região de interesse. Molina et al 2004.
Foram usados primers para amplificar regiões do minicírculo do DNA do cinetoplasto
da Leishmania (kDNA). A seqüência de nucleotídeos dos primers utilizada foi
Leishmania sp 13 A (5-GTGGGGGAGGGGCGTTCT-3), 13 B (5-
ATTTTACACCAACCCCCAGTT-3) e seguiu protocolo de (Rodgers et al 1990).
Esta amplificação ocorreu durante repetidos ciclos de temperatura, a saber:
94ºC para a desnaturação (separação das fitas de DNA), de 45ºC a 70ºC para o
anelamento (ligação) dos nucleotídeos iniciadores (primers da marca Invitrogen) às
seqüências complementares e 72ºC para a síntese do DNA com a ligação dos
nucleotídeos complementares da marca Invitrogen, realizada pela enzima taq
polimerase da marca Invitrogen em equipamentos chamados de termocicladores,
utilizou-se termociclador da marca Eppendorf Mastercycler gradient.
As amostras de DNA foram adicionadas à mistura contendo os seguintes
reagentes: Tampão 1x, dNTP 1mM, MgCl 1,5mM, Primer 1mM, Taq polimerase 2,5
u/μL . A reação de amplificação ocorreu no termociclador com sucessivas mudanças
de temperatura abaixo assinaladas. Quadro 3.
Quadro 3. Número de ciclos, tempo e temperatura da reação de amplificação no
termociclador.
Ciclos/Repetições Temperatura/Tempo
Pré-ciclo – 1 94ºC - 2 min
Ciclo – 40 94ºC - 45 seg.
50ºC - 45 seg.
72ºC - 45 seg.
Pós-ciclo – 1 72ºC – 7 min
19
3.5.3.5) Detecção dos produtos da PCR
Após a reação PCR, as amostras foram submetidas a uma separação
eletroforética (cuba de eletroforese Maxfill) em gel de agarose submerso em tampão
TBE 1x e corado por brometo de etídio, o material amplificado foi visualizado como
uma banda e analisado de acordo com o seu peso molecular, (Davis et al 1994).
3.5.3.6) Preparação do Gel
Adicionou-se 3g de agarose em 150mL de tampão TBE1x que foi
completamente dissolvido sobre aquecimento em microondas durante 4 minutos.
Adicionou-se 2,5μL de brometo de etídio para cada 50mL de solução contendo
agarose e o tampão TBE.
3.5.3.7) Preparação das amostras
Aplicação do gel na cuba de eletroforese, aplicaram-se os “pentes” para a
formação dos poços, adicionou-se solução tampão TBE1x, as amostras
homogeneizadas 1mM e 2μl do Ladder de marca Invitrogen com intervalo para
identificação de fragmentos de DNA entre 100 e 1500 pares de base foram
transferidos com o auxilio de uma micropipeta para cada um dos poços do gel. A
cuba foi conectada à fonte de eletroforese durante 60 min.
3.5.3.8) Visualização dos produtos da PCR
Após o termino da eletroforese, o gel de agarose foi retirado da cuba e levado
para a visualização sobre luz ultravioleta no transiluminador UVP (Upland CA91786
USA Model, 115 v 60Hg, 60 Amps). As fotos foram obtidas com maquina fotográfica
digital Canon Power Shot G6 e repassadas ao computador através de cabo de USB,
as imagens obtidas foram gravadas em formato de arquivo “JPEG” para
documentação e os produtos amplificados foram analisados.
A análise do gel consistiu na visualização das "bandas" dos produtos
amplificados, comparativamente com os produtos amplificados relativos aos
controles positivos negativos e os Ladder estipulados em cada PCR realizado.
20
3.5.3.9) Controles positivos e negativos
Em cada grupo de amplificações foram utilizados como controles positivos
biópsias de pele com diagnóstico histopatológico de Leishmaniose Tegumentar
Americana com moderada ou acentuada quantidade de parasitos visualizados à
microscopia óptica e culturas de leishmaniose de cepas cedidas pelo INPA e como
controles negativos biópsias de pele com diagnóstico histopatológico de outras
doenças granulomatosas, a saber: eritema nodoso, hanseníase, doença de Jorge
Lobo, cromomicose, tuberculose cutânea e micobacteriose atípica. Além desses,
também foi incluída uma alíquota da mistura de reagentes, sem DNA, para descartar
contaminações da mesma.
3.6) Análise estatística
Realizou-se um estudo através do Teste-t entre as médias do total do número
de linfócitos e plasmócitos das biópsias c/c LTA e PCR positiva, comparando com os
pacientes com Leishmanias evidenciadas a histopatologia.
21
4 RESULTADOS
4.1. Resultados do estudo clínico dos pacientes compatíveis com LTA
4.1. 1 . sexo.
O resultado da análise das 90 fichas ambulatoriais colhidas na gerência de
Leishmaniose da FMTAM dos pacientes c/c LTA cujas biópsias foram examinadas
na gerência de Anatomia Patológica, mostrou um predomínio do sexo masculino
com 75 casos (85,2 %) sobre o feminino com 13 casos (14,8%). Figura 3.
Masculino85,2%
Feminino14,8%
Figura 3. Distribuição dos pacientes c/c LTA a histopatologia quanto ao sexo. Mas =
masculino, Fem = feminino. N (88).
4.1.2. Faixa etária.
A faixa etária mais acometida variou entre 20 e 39 anos de idade com 38
pacientes (42,69% dos casos), a idade média dos pacientes foi 32,36 anos (de dois
até 72 anos). Tabela 1.
22
Tabela 1. Distribuição dos pacientes c/c LTA de acordo com a faixa etária.
Faixa etária Freqüência %
0-12
13-19
20-39
40-59
≥ 60
Total
4
20
38
20
7
89
4,49
22,47
42,69
22,47
7,86
100
4.1.3. Localização das lesões.
As lesões dos pacientes c/c LTA localizaram-se mais freqüentemente no
membro inferior esquerdo com 19 amostras (26,02%) e membro superior esquerdo
com 15 pacientes (20,54%). Figura 4.
MSE MSD MIE MID OU
LOCALIZAÇÃO
0
5
10
15
20
25
30
N °
DE
CA
SO
S
Figura 4. Principais localizações das lesões ulceradas nos segmentos do corpo.
MSD = membro superior direito, MID = membro inferior direito, MSE = membro
superior esquerdo MIE = membro inferior esquerdo, OU = outras localizações.
4.1.4. Número de lesões ulceradas
Na maioria dos casos, 48 pacientes (75%) apresentavam uma ou duas
lesões, o número de lesões variou entre um e 20 lesões ulceradas. A média do
23
número de lesões foi de 2,5 e em 33(51,56%) dos casos, o paciente apresentava
apenas uma lesão. Tabela 2.
Tabela 2. Distribuição do número de lesões ulceradas dos pacientes c/c LTA ( N =
64).
Número de lesões Freqüência %
1
2
3
4
5
6
≥ 7
Total
33
15
7
2
2
3
2
64
51,56
23,47
10,93
3,12
3,12
4,68
3,12
100
4.1.5. Tempo de evolução das lesões ulceradas.
O tempo de evolução das lesões ulceradas, correspondente ao período do
início dos sintomas e a consulta no ambulatório de Leishmaniose, ocorreu
predominantemente nos primeiros três meses de evolução em 59,32%, em 86,44%
dos casos o tempo de evolução foi maior que de um mês. Tabela 3.
Tabela 3. Freqüência de casos de c/c LTA de acordo com o tempo de evolução em
intervalo de meses. N=59.
Tempo de lesão
(meses)
Freqüência %
< 3 m
3-5 m
6-11 m
≥ 12 m
Total
35
18
5
1
59
59,32
30,50
8,47
1,69
100
24
4.2. Estudo laboratorial.
4.2.1. Resultados da reavaliação histopatológica
As 90 biópsias dos pacientes c/c LTA a histopatologia foram revisadas e
agrupadas de acordo com a classificação histopatológica de Magalhães et al 1986,
19 amostras (21,11%) foram classificados como do tipo I (reação exsudativa e
celular), 11 (12,22%) do tipo III (reação exsudativa e necrótica-granulomatosa), 56
pacientes (62,22%), correspondendo à maioria dos casos, foram classificados como
do tipo IV (reação exsudativa e granulomatosa), Figura 5. Um paciente (1,11%) foi
classificado como do tipo V (reação exsudativa e tuberculóide), nenhum paciente foi
agrupado como do tipo II (reação exsudativa e necrótica). Entre estes pacientes
classificados de acordo com Magalhães et al, três demonstraram PCR negativa (dois
casos classificados como do tipo III e um paciente do tipo IV), Tabela 7.
Figura 5. Tipo histopatológico mais freqüentemente encontrado no presente estudo.
Tipo IV de Magalhães et al 1986.
25
Tabela 4. Distribuição do número de casos de acordo com o tipo histopatológico
usando a classificação de (Magalhães et al 1986).
PCR + % PCR - % TOTAL %
Tipo I Tipo II Tipo III Tipo IV Tipo V Não clas. Total
19 0 9
55 1 3
87
21,11 0 10 60
1,11 3,33
96,66
0 0 2 1 0 0 3
0 0
2,22 1,11
0 0
3,33
19 0 11 56 1 3 90
21,11 0
12,22 62,22 1,11 4,44 100
Outros três pacientes apresentaram PCR positiva mesmo com infiltrado
inflamatório incipiente, constituído por escassos linfócitos, histiócitos e proliferação
fibrovascular, não evidenciando características suficientes para serem agrupados na
classificação acima utilizada.
Numa etapa posterior, 43 dos 90 pacientes c/c LTA, a partir do caso com
numeração histopatológica mais baixa, foram escolhidos um caso sim e outro não,
sendo verificadas as seguintes alterações histopatológicas: hiperplasia, ulceração,
necrose e presença de granulomas. A ulceração foi presente em 11 casos (25,58%)
e ausente na maioria dos casos 32 (74,41%). A hiperplasia do epitélio de
revestimento ocorreu em 36 (90 %) dos casos e ausente em quatro (10 %). A
necrose foi presente em apenas 11 casos (25,58%) e ausente em 32 (74,41%)
correspondendo a maioria dos casos. Os granulomas foram presentes em 39 dos 43
casos correspondendo a 90.69% . Tabela 5.
Tabela 5. Resultado da análise das características histopatológicas das biópsias c/c
LTA .
Ausente % Presente Total %
Ulceração Hiperplasia Necrose Granuloma
32 4 1. 32 4
74,41 10
74,41 9,3
11 36 11 39
43 40 43 43
25,58 90
25,58 90,69
26
Foram avaliadas as mesmas características em 40 biópsias de pacientes com
LTA comprovada pela visualização das amastigotas a histopatologia, retiradas do
arquivo da Gerência de Anatomia Patológica dos anos de Janeiro de 2004 a
Fevereiro de 2007. A ulceração foi positiva em 25(62,5%) casos e negativa em
15(37,5%). A hiperplasia foi presente em 38 casos (95%) e negativa em dois casos
(5%). A necrose surgiu em três casos (7,5%) e foi ausente em 37 (92,5%). A
presença de granuloma foi encontrada em 15 casos (37,5%) e ausente em 25 (62,5
%). Tabela 6.
Tabela 6. Distribuição dos casos de LTA a microscopia óptica de acordo com
características histopatológica.
AUSENTE % PRESENTE Total %
Ulceração Hiperplasia Necrose Granuloma
15 2 37 25
37,5 5
92,5 62,5
25 38 3 15
40 40 40 40
62,5 95 7,5
37,5
Realizou-se o Teste estatístico de Z para comparar as proporções das
características histopatológicas descritas, a saber: ulceração, hiperplasia, necrose e
presença de granuloma dos pacientes compatíveis com LTA e dos pacientes com
LTA. O resultado demonstrou diferença estatística significativa quando
correlacionada ulceração, necrose e presença de granuloma e diferença estatística
não significativa quando analisada a presença de hiperplasia. Os resultados foram
descritos na tabela 7.
27
Tabela 7. Resultado do teste estatístico para proporções (Teste Z) das
características histopatológicas
c/c LTA
LTA
Valor do P
Ulceração Hiperplasia
Necrose Granuloma
0,25 0,90 0,25 0,90
0,62 0,95 0,07 0,40
p= 0,00 p= 0,67 p= 0,02 p= 0,00
Foram analisados também o número de linfócitos e plasmócitos em 36 pacientes
c/c LTA à microscopia óptica e PCR positivo para gênero leishmania e 32 pacientes
LTA positivos à microscopia óptica. O número médio nos casos c/c LTA foi, linfócitos
13,35 e plasmócitos 11,72. Nos casos positivos para LTA, a microscopia apresentou
um número médio de linfócitos de 7,34 e de plasmócitos foi de 7,37. Tabela 7.
Tabela 8. Distribuição do número médio de linfócitos e plasmócitos nos pacientes c/c
LTA e PCR positivo e negativo para gênero Leishmania e nos casos positivos para
LTA a microscopia óptica.
Nº. médio C/C LTA (PCR+) LTA
Linfócitos
plasmócitos
13,35
11,72
7,34
7,37
Realizou-se um estudo através do Teste-t entre as médias do total do número
de linfócitos e plasmócitos das amostras c/c LTA e PCR positiva, escolhidas de
forma alternada dos 90 casos estudados e 32 amostras com diagnóstico de LTA a
histopatologia. Evidenciando um p=0,0009 para a diferença do número de linfócitos
entre os dois grupos e um p=0,017 para a diferença do número de plasmócitos,
demonstrando assim diferença estatística significativa (p< 0,05).
28
4.2. 2. Resultados obtidos pelo estudo utilizando a PCR
Os resultados obtidos com a PCR para gênero demonstraram a presença de
DNA de leishmania em 87 (96,66%) dos casos estudados. Na figura 6 Observa-se a
amplificação de bandas de aproximadamente 120 pb, correspondentes a região
conservada do minicírculo de kDNA, nas amostras 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12 ,
sendo a amplificação negativa nas amostras 13 e 14. A amostra 17 corresponde ao
controle negativo (biópsia de pele com outras patologias granulomatosas) e a
amostra um apresentou banda fraca sendo posteriormente confirmada como
positiva.
Figura 6. Eletroforese em gel de agarose a 2, 0% corado pelo brometo de etídio
representando os produtos de amplificação de DNA de Leishmania através de PCR.
Amostras de pacientes c/c LTA negativas para a amplificação do DNA de
Leishmania sp. L = Ladder, CN = controle negativo.
29
5 DISCUSSÃO
A reação em cadeia de polimerase tem sido grandemente aplicada para a
detecção de agentes infecciosos, tal como vírus, bactérias e protozoários, (Weigle et
al 2002). O diagnóstico de Leishmaniose Cutânea através dos métodos diagnósticos
tradicionais tal como cultura in vitro e o exame histopatológico requerem a presença
de número relativamente alto de microorganismos morfologicamente intactos,
porém, na fase crônica da Leishmaniose Cutânea o número de parasitos nas
biópsias de pele é muito baixo, tornando difícil o diagnóstico nas fases tardias.(
Laskay et al 1995); (Salman et al 1999). (Gontijo et al 2003).
Neste estudo, na avaliação dos dados clínicos e epidemiológicos, verificou-se
um predomínio do sexo masculino, em idade produtiva, com uma variação ampla na
faixa etária, de crianças a idosos, com maior freqüência nos membros inferiores,
resultados semelhantes são amplamente referidos na literatura. O sexo masculino e
a idade dentro da faixa produtiva seriam decorrentes de hábitos e profissões que
manteriam o homem em contato maior com o vetor. Veronesi et al 2004.
Na literatura, vários trabalhos correlacionam a maior incidência de LTA em
homens a profissões exercidas predominantemente pelo sexo masculino que
adentrariam as matas, aproximando, assim, o homem do vetor transmissor da
doença. Os treinamentos militares na selva amazônica constituem importantes
fatores na incidência de leishmaniose tegumentar americana, (Guerra et al 2003).
Basano et al, em 2004 em Rondônia fizeram um estudo abordando histórico,
epidemiologia e perspectivas de controle da Leishmaniose Tegumentar Americana,
correlacionaram os perfis básicos de transmissão da LTA no Brasil: referem um perfil
puramente silvestre, associado à abertura de estradas, mineração e agricultura, um
perfil peridomiciliar menos freqüente e um perfil na interface da área peridomiciliar
com nas áreas das matas relacionado com a agricultura.
Achados similares ao presente trabalho foram encontrados por Romero et al
em 2001 que fizeram um estudo comparativo clínico e de achados laboratoriais de
pacientes do estado da Bahia, Brasil com Leishmania brasiliensis (grupo A) e
30
pacientes do estado do Amazonas, Brasil com Leishmania guyanensis (grupo B)
encontraram uma predomínio no sexo masculino com respectivamente 74% e 81%
dos casos, a média de idade foi de 23 anos no grupo A (de 11-57 anos) e 25 anos
no grupo B (de 8-60 anos). Correlacionando a localização das lesões ulceradas, o
segmento corporal mais freqüentemente comprometido foram os membros
inferiores, com 60% no grupo A e 47% no grupo B.
De forma similar ao presente estudo, outro trabalho demonstra o predomínio
do sexo masculino, com faixa etária, e Ramirez et al em 2000 na Colômbia fizeram
um estudo clinico e laboratorial da Leishmaniose Cutânea em 115 pacientes,
encontrando também um predomínio do sexo masculino (81,7%), com lesão única
(64,5%), mais freqüentemente na faixa etária de 18 a 35 anos (59,1%).
Nossos resultados aproximam-se também de Passos et al em 2001 que
fizeram estudo descritivo retrospectivo com 358 pacientes com suspeita clínica de
LTA, avaliando fatores clínicos, laboratoriais e terapêuticos, encontrando um
predomínio em homens (65,3%), com idade média entre seis meses e 80 anos
(mediana = 32 anos).
Passos et al em 2001 fizeram também referência às localizações das lesões
ulceradas nos segmentos corporais, encontrando em ordem decrescente de
freqüência: membro inferior, membro superior, cabeça, tronco, abdome e genitália. O
predomínio de áreas expostas do corpo e do aspecto ulcerado corresponde à
descrição mais freqüente das lesões cutâneas da LTA.
A distribuição por gênero e idade sugere a coexistência de dois modelos de
transmissão da LTA compreendendo o maior grupo de homens, adultos, que sugere
transmissão extradomiciliar em população economicamente ativa, enquanto que o
atendimento de mulheres e crianças sugere uma transmissão intra e/ou
peridomiciliar. Ampuero et al em 2006 na Bahia levantaram está possibilidade da
transmissão peridomiciliar, fazendo um estudo retrospectivo, analisando 4.640 fichas
de atendimento ambulatorial de LTA, encontrando 491 crianças de 0 a 5 anos de
idade.
31
Na análise dos nossos dados, de acordo com a classificação histopatológica
de Magalhães et al 1986, ocorreu um predominou do grupo IV(reação exsudativa e
granulomatosa) correspondendo à maioria dos casos. Resultado semelhante foi
encontrado por Andrade-Narvaez et al 2005 que fizeram um estudo histopatológico
da leishmaniose cutânea na Penísula de Yucatan, no México, os achados foram
agrupados de acordo com a classificação proposta por Magalhães et al 1986,
encontrando com maior freqüência o tipo IV (reação exsudativa e granulomatosa)
em 43,83% dos casos. As 73 biópsias de Leishmaniose Cutânea apresentaram um
predomínio do sexo masculino 93,15%, a idade variou entre sete e 69 anos e mais
comumente com uma única lesão em 82,19% e localizada na orelha em 35% dos
casos.
Duarte et al, em 2002 fizeram um estudo em Alagoas de 21 pacientes com
diagnóstico clínico e epidemiológico de Leishmaniose Cutânea, confirmados pelo
uso de anticorpo policlonal anti-leishmania. Na análise histopatológica baseada na
classificação de Magalhães et al 1986, encontraram um predomínio dos grupos I e II.
No presente estudo os tipos histopatológicos mais encontrados fora o tipo I e IV.
O estudo analisou e quantificou através da imunohistoquímica os dendrócitos
dérmicos, FXIIIa+, as células de Langerhans CD1a+, os macrófagos CD68+,
linfócitos B CD20 e linfócitos T CD3+, comparando os resultados com a pele
normal.
Safei et al em 2002 no Iran também analisaram a presença de inflamação
granulomatosa que foi encontrada em 52 dos 54 pacientes com PCR positivo nas
biópsias de pele com suspeita clínica de LTA . No presente trabalho também
encontramos a presença de granuloma na maioria dos casos, 83,72% dos pacientes
compatíveis com leishmaniose cutânea e PCR positivo.
Medeiros et al em 2005 no estado de São Paulo, Brasil, fizeram um estudo
com 54 biópsias de pele e mucosa e compararam o resultado da PCR com a
presença de granulomas detectados a histopatologia. Das 44 amostras com PCR
positiva, 25 apresentaram granulomas (56,8%) e sete dos 10 casos com PCR
negativo não apresentavam formação de granulomas. No presente trabalho, os
granulomas foram encontrados em 90.69% dos casos c/c LTA a histopatologia e
PCR positiva.
32
O achado de reação granulomatosa como característica histopatológica
importante no presente estudo pode denotar o tempo de evolução da doença, pois a
maioria dos pacientes (86,44%) apresentava tempo de evolução maior que um mês.
Alguns autores relatam uma estreita correlação com o tempo de doença e a
presença de granuloma.
Azulay 1960 realizou estudo histopatológico descrevendo a inflamação
exsudativa aguda como modalidade reacional de início na evolução da LTA e a
formação de granulomas como um processo tardio. Laurenti et al 1990 realizaram
um estudo dos eventos histopatológicos que ocorrem na formação do granuloma,
concluindo que na pele a formação do granuloma é usualmente completada dentro
de 45 dias após a inoculação do parasito.
No presente estudo, três pacientes apresentaram PCR positiva mesmo com
granulomas incipientes, linfócitos, histiócitos e proliferação fibrovascular, não
evidenciando características suficientes para serem agrupadas na classificação
acima utilizada. Alguns estudos científicos demonstraram que, mesmo após a cura
clínica, testes moleculares evidenciaram DNA de Leishmania e em alguns casos
parasitos viáveis através da cultura de amostras de cicatrizes de Leishmaniose
Cutânea. (Mendonça et al 2004); (Botelho et al 2003).
A PCR pode ser de especial importância para o diagnóstico de Leishmaniose
Cutânea nas fases crônicas da doença quando outros métodos falham em
demonstrar o parasito nas lesões granulomatosas, sendo alta a sua sensibilidade.
Furtado 1980, em seu estudo refere que a chance de encontrar o parasito nas
lesões ulceradas é inversamente proporcional ao tempo de evolução da doença que
no caso de LTA causada por Leishmania (V) brasiliensis seria de 100% nos
primeiros 2 meses, 75% até os 6 meses e 20% acima de 12 meses de evolução.
Os resultados obtidos com a PCR para gênero Leishmania no presente
estudo demonstraram a presença de DNA de leishmania em 87 (96,66%) dos casos
com suspeita clínica e histopatológica de LTA, porém, sem evidências do parasita à
microscopia, vários estudos na literatura, de forma similar apontam a alta
33
sensibilidade do PCR como ferramenta no diagnóstico de Leishmaniose cutânea,
mesmo em tecidos fixados em formol e emblocados em parafina.
No presente estudo, a extração de DNA de biópsias fixadas em formol e
emblocadas em parafina permitiu a amplificação do DNA através da reação em
cadeia de polimerase em 96,66% das biópsias de pacientes c/c LTA, demonstrando
assim, alta sensibilidade. Alguns autores como Momeni et al 1996, no entanto,
alegam uma baixa sensibilidade do método em decorrência da degradação do DNA
pela fixação em formol e o tempo de emblocamento. Vários outros autores, Laskay
et al 1995, Rodgers et al 1990.
Weigle em 2002 na Colômbia estudou casos agudos e crônicos de LTA
através da PCR com primers para fragmentos do minicírculo do kDNA comparando
com métodos utilizados habitualmente no diagnóstico de Leishmaniose Cutânea. Os
métodos convencionais apresentaram sensibilidade variável, 4,5% no esfregaço,
22,7% na cultura de biópsia, 18,2%na cultura do aspirado e 45,5% no PCR. O
estudo conclui que a PCR nos casos crônicos de LTA foi mais sensível que os
métodos convencionais e deve ser considerada e incorporada nas estratégias
diagnósticas de Leishmaniose Cutânea Crônica.
No estudo de Weigle os resultados demonstraram baixos índices de detecção
da parasita da LTA nos exames convencionais e também na PCR, não sendo feito
referência neste trabalho se os casos foram realizados em ambulatório geral de
úlcera, o que traduziria estes resultados baixos dos exames realizados. No presente
estudo os pacientes apresentaram história epidemiológica, achados clínicos e
histopatológicos altamente sugestivos de leishmaniose cutânea, sendo
provavelmente o motivo do alto número de pacientes que apresentaram PCR
positivo.
A fixação de tecidos com formol a 10% é um método prático e eficiente para a
preservação arquitetural do tecido, sendo assim um método largamente utilizado na
anatomia patológica. Porém, esse tipo de fixação resulta no enovelamento de
proteínas nucleares na forma de ligações entre proteínas e o DNA e vários estudos
34
se propuseram a avaliar a realização de PCR em biópsias fixadas em formol e
emblocadas em parafina.
Isola et al 1993 fez um estudo avaliando a extração de DNA de amostras
emblocadas em parafina, concluindo que o tempo de amplificação das amostras é
proporcional ao tempo de fixação do tecido em formol, um tempo de fixação igual ou
inferior às 4h, teria uma amplificação semelhante aos tecidos a fresco e um tempo
de fixação superior às 72h amplificariam apenas 25% do DNA de amostras a fresco.
Cao et al em 2003 fizeram um estudo em Los Angeles, Estados Unidos, com
3 métodos de extração de DNA em biópsias de pulmão e bexiga fixadas em
parafina, comparando com extração de DNA de células bucais e amplificou através
da PCR com primers de β globina. A amplificação ocorreu no tecido fixado em
parafina em 30/34 casos (88,2%) com extração pelo método boiling , em 29/34
(85,3%) com extração utilizando fenol-clorofórmio e em 18/34 (52,9%) usando um kit
de extração. Na amplificação de amostras de esfregaços de células bucais pelo
método boiling em 2/16 casos (12%), com fenol clorofórmio em 16/17 casos (94,1%)
e com o Kit em 12/16 (75%). A sensibilidade foi alta tanto nas amostras a fresco de
esfregaços bucais quanto nas amostras fixadas em formol.
Libório et al em 2005 no estado de São Paulo, Brasil, verificando eficácia da
PCR com amostras de biópsias fixadas em formol e emblocadas em parafina, fez um
estudo em 30 biópsias de hiperplasia fibrosa inflamatória, usando primers da β
globina, verificando a utilização de tecido humano parafinizado e arquivado. O
estudo mostrou amplificação de DNA genômico extraído de tecido parafinizado,
mesmo nas amostras arquivadas por um longo período.
. Pirmez et al em 1999 fez um estudo no Rio de Janeiro, Brasi, avaliando a PCR
como ferramenta de rotina para o diagnóstico de leishmaniose. Foram estudados
230 pacientes, sendo 216 com características clínicas sugestivas de Leishmaniose
Cutânea e 14 com outras lesões cutâneas não leishmanióticas. Cada espécime foi
processado para exame histopatológico, cultura, exame direto e identificação de
DNA (com primers de uma região conservada do minicírculo do kDNA). O uso
35
combinado das técnicas convencionais demonstrou ser positivo para leishmania em
62% dos casos enquanto a PCR foi positiva em 94% dos pacientes. Na
Leishmaniose de mucosa a sensibilidade foi ainda maior com os testes
convencionais, demonstrando leishmania em apenas 17% dos casos e a PCR em
71%.
Safei et al, em 2002 no Iran realizaram estudo comparativo através da PCR
em biópsias de pele fixadas em formol e emblocadas em parafina, usando primers
para Leishmania sp com fragmentos de DNA do minicírculo do cinetoplasto com 120
pares de base divididas em dois grupos: o grupo 1, constituído por 33 biópsias de
pele com diagnóstico de LTA com parasitos a histopatologia e o grupo 2, com 29
biópsias de pacientes com suspeita clínica de LTA, sem evidências do parasito à
microscopia óptica. O resultado da PCR foi positivo nos 33 casos do grupo 1, e em
24 dos 29 pacientes do grupo 2 (92% dos casos). O resultado da PCR foi negativo
nos controles constituídos de 20 biópsias de pacientes com outras patologias
diferentes de leishmaniose, demonstrando assim alta sensibilidade nas amostras
fixadas em formol e emblocadas em parafina.
De forma similar ao presente estudo, Medeiros et al em 2005 no estado
de São Paulo, Brasil, realizaram estudo através da PCR em 54 biópsias de pele e
mucosa usando Primers 13A e 13B da região conservada do kDNA do minicírculo .
A PCR foi positiva em 44 de 54 amostras (81,5%).
No presente estudo dos pacientes compatíveis com LTA a histopatologia,
a amplificação de DNA para gênero Leishmania foi realizada com primers obtidos a
partir de fragmentos de área conservada do minicírculo do kDNA, técnica
amplamente referida na literatura. Os trabalhos demonstram sua alta sensibilidade
em estudos comparativos com métodos convencionais de diagnóstico da LTA, (Safei
et al 2002), (Medeiros et al 2005).
A utilização do kDNA tem como vantagens o número grande de cópias do
kDNA , 10.000 cópias, (Rodgers 1990) o tamanho pequeno do fragmento utilizado,
120 pb - alguns autores como Libório et al 2005 referem que o tamanho do
fragmento mostra-se inversamente proporcional à capacidade de amplificação -, e
36
outra vantagem indicada seria a capacidade de detectar quantidade diminuta de
DNA 1/10 organismos de Leishmania. (Rodgers et al 1990).
Chargui et al em 2005 também demonstrando a sensibilidade da PCR para
Leishmaniose Cutânea realizaram um estudo em 430 pacientes da Tunísia
comparando métodos convencionais de diagnóstico para Leishmaniose Cutânea
com a PCR. Nos resultados, a microscopia óptica revelou amastigotas em 245
amostras (57%), na cultura in vitro 88 casos (20,5%) foram positivos, enquanto a
PCR para gênero detectou Leishmania em 301 amostras (70 %). Este trabalho dá
ênfase à incorporação do PCR na estratégia diagnóstica para Leishmaniose
Cutânea.
Faber et al em 2003 na Holanda fizeram um estudo da sensibilidade da PCR
para o diagnóstico de Leishmaniose Cutânea comparando-a com testes diagnósticos
convencionais, apresentando sensibilidade de 100%, enquanto que o esfregaço
demonstrou sensibilidade de 65%, a cultura 84%, a histopatologia 82% e reação de
Montenegro 87%. Indicando que a PCR parece ser o melhor teste diagnóstico para
Leishmaniose Cutânea.
37
6. CONCLUSÃO
1) Os resultados obtidos com a PCR para gênero Leishmania, no presente estudo,
demonstraram a presença do DNA de leishmania em 87 (96,66%) dos casos.
2) A PCR pode ser de especial importância para o diagnóstico de Leishmaniose
Cutânea nas fases crônicas da doença quando outros métodos falham em
demonstrar o parasito nas lesões granulomatosas, sendo alta a sua sensibilidade.
3) O PCR tem um valor significativo no diagnóstico diferencial de lesões
granulomatosas de pele, em material de biópsias emblocadas em parafina nos casos
de leishmaniose cutânea.
4) O padrão histopatológico mais comumente encontrado nas biópsias compatíveis
com LTA e PCR positiva foi caracterizado pela presença de hiperplasia
pseudoepiteliomatosa, reação exsudativa e granulomatosa desorganizada no seio
do infiltrado inflamatório de plasmócitos e linfócitos.
5) Nas biópsias c/c LTA e PCR positiva o granuloma foi encontrado em 90,69% dos
casos e a hiperplasia pseudoepiteliomatosa em 90% dos pacientes.
6) O grupo histopatológico de acordo com a classificação proposta por Magalhães et
al que predominou neste estudo foi o grupo IV.
38
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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8 ANEXOS 8.1. Anexo 1. Ficha de aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa de Seres Humanos da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas em janeiro de 2006 (n.1757/05).