FERRAMENTAS DEANÁLISE MOLECULAR

Ferramentas de Análise Molecular• Existem hoje em dia, inúmeras ferramentas de

análise de sequência de DNA, que auxiliam nos processos automáticos de sequenciamento ou ainda, são capazes de realizar testes comparativos nas fitas prontas. Estas além disso, são responsáveis também pela análise qualitativa da molécula, permitindo então a detecção de doenças.

• Dentre elas, são as mais conhecidas: o PCR, a EletroForese, a Espectrofotometria e as comparações com bases de dados, como a BLAST

BLASTBasic Local Alignment Search Tool(Ferramenta de Alinhamento de Busca Local)

• É um programa instrumental para identificação de genes e de sequências genéticas características.

• Uma das ferramentas mais conhecidas. • Disponibilizada pelo NCBI (National Center for

Biotechnology Information).• Foi desenvolvido para a pesquisa de

semelhança entre sequências de nucleotídeos.• Seu objetivo é executar pesquisa de sequências

contra a base de dados de DNA completa em menos de 15 segundos

BLASTBasic Local Alignment Search Tool(Ferramenta de Alinhamento de Busca Local)

• É um algoritmo para comparar informações de sequências biológicas primárias, tais como sequências de aminoácidos de diferentes proteínas ou nucleotídeos de sequências de DNA.

• Uma pesquisa BLAST permite que um investigador compare uma sequência fornecida em uma consulta com uma biblioteca ou base de dados de sequências e identificar as bibliotecas de sequências que se assemelham à sequência consultada e que estejam acima de um certo grau de semelhança.

• Algoritmo - é uma sequência finita de instruções bem definidas e não ambíguas, cada uma das quais pode ser executada mecanicamente num período de tempo finito e com uma quantidade de esforço finita

BLASTBasic Local Alignment Search Tool(Ferramenta de Alinhamento de Busca Local)• Após descobrir um gene anteriormente

desconhecido em um camundongo, um cientista pode tipicamente elaborar uma pesquisa no BLAST do genoma humano para verificar se existem seres humanos portadores de um gene semelhante.

• O programa BLAST foi projetado por Eugene Myers, Stephen Altschul, Warren Gish, David J. Lipman e Webb Miller no National Institutes of Health.

Instrumentação em Biologia Molecular - BLAST 6

Instrumentação em Biologia Molecular - BLAST 7

Instrumentação em Biologia Molecular - BLAST 8

Conclusão• As pesquisas voltadas a genética e genoma, vêm se

desenvolvendo com enorme velocidade nas últimas décadas, aliadas a revolução na informática, possibilitando que cada vez mais e cada vez melhor se analise.

• Percebemos uma enorme junção de áreas que até então corriam em paralelo, como a biologia e a computação, comprovado com o surgimento de uma nova ciência, denominada Bioinformática, e profissionais que hoje podem montar e analisar milhares de seqüências de DNA num curto período de tempo, deixando de lado métodos manuais extremamente limitados, devido a gigantesca quantidade de bases nitrogenadas por molécula de DNA.

BibliografiaDarnell, J., Lodish, H., Baltimore, D. Molecular Cell Biology. 2nd Edition. Scientific

American Books. Distributed by W. H. Freeman and Company, New York. p. 213. 1990

Ferreira, M. E.; Neto, C. R. B. A importância da pesquisa genômica e o seqüenciamento de DNA. Brasília, DF. 2003. 4 p.

Criado um banco de amostras brasileiro para aprimorar identificação pelo DNA. Biologias.com. Disponível em: <http://biologias.com/noticias/205/Criado-um-banco-de-amostras-brasileiro-para-aprimorar-identificacao-pelo-DNA>. Acesso em: 09 de nov. 2009.

Baptista, E. S. Uma abordagem alternativa para seqüenciamento por hibridização. 2003. 150 f. Dissertação (Mestrado em Engenharia Elétrica) Escola de Engenharia, Universidade Federal de Pernambuco, Pernambuco. 2003

Blast Information. NCBI. Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html>. Acesso em 16 de nov. 2009.

Instrumentação em Biologia Molecular - BLAST 11

Instrumentação em Biologia Molecular - BLAST 12

Instrumentação em Biologia Molecular - BLAST 13

Instrumentação em Biologia Molecular - BLAST 14

Instrumentação em Biologia Molecular - BLAST 15

Instrumentação em Biologia Molecular - BLAST 16

Sequenciamento por Hibridização Oligonucleotídica

• Supera as limitações dos métodos convencionais• Desenvolveu um eficiente algoritmo para a

reconstrução da sequência original de DNA a partir de subsequências encontradas.

• Um chip de DNA contendo um arranjo de diferentes nucleotídeos é utilizado e a hibridização a um oligonucleotídeo.

• A análise da sequência da molécula de DNA pesquisada é feita pela comparação entre todas as sequências oligonucleotídicas a qual ocorreu hibridização.

Método de Sanger• Uma fita simples de DNA que será sequenciada

é hibridizada com um Primário (tinta) de desoxinucleotídeos marcado na ponta 5´.

• Quatro misturas de reação são preparadas onde os Primários (tinta) utilizados serão elongados por uma DNA polimerase.

Métodos de Sequenciamento.• O método tradicional de sequenciamento de

DNA foi proposto por Frederick Sanger na década de 70.

• Consiste na adição de nucleotídeos modificados, chamados didesoxirribonucleotídeos que impedem o crescimento de um fragmento de DNA em replicação pela DNA polimerase após sua adição.

• Tem sido largamente utilizado por centros de pesquisa ao redor do globo.

Método de Pirosequenciamento• Consiste em uma nova abordagem molecular do

sequenciamento,• Foi desenvolvido pela Roche Applied Sciences; • Uma luciferase é adicionada, emitindo luz quando

acoplada à polimerização do DNA previamente fragmentado e aderido a microesferas.

• A máquina é capaz de captar essa emissão de luz com o uso de sequência adaptadora.

• Através deste método, pode-se sequenciar genomas de organismos diversos de maneira muito mais rápida e barata

Método de Sanger• Uma vez que um didesoxinucleotídeo não tem

ponta 3´-OH, não é possível haver elongação a partir do nucleotídeo adicionado, parando a reação.

• Então separada em um gel de sequenciamento por eletroforese se detecta cada um dos nucleotídeos presentes na sequência de DNA lida.