extraÇÃo e caracterizaÇÃo de compostos fenÓlicos de folhas...
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UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
KATHLYN SCHAFRANSKI
EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS
DE FOLHAS DE AMOREIRA PRETA (Morus nigra L.) E
ENCAPSULAMENTO EM ESFERAS DE ALGINATO
DISSERTAÇÃO
PONTA GROSSA
2019
KATHLYN SCHAFRANSKI
EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS
DE FOLHAS DE AMOREIRA PRETA (Morus nigra L.) E
ENCAPSULAMENTO EM ESFERAS DE ALGINATO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, da Universidade Tecnológica Federal do Paraná, para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia. Orientador: Prof. Dr. Eduardo Sidinei Chaves Coorientador: Prof. Dr. Matheus Pereira Postigo
PONTA GROSSA
2019
Ficha catalográfica elaborada pelo Departamento de Biblioteca da Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Câmpus Ponta Grossa n.18/19
Elson Heraldo Ribeiro Junior. CRB-9/1413. 11/03/2019.
S296 Schafranski, Kathlyn
Extração e caracterização de compostos fenólicos de folhas de amoreira preta (Morus nigra L.) e encapsulamento em esferas de alginato. / Kathlyn Schafranski, 2019.
100 f.; il. 30 cm. Orientador: Prof. Dr. Eduardo Sidinei Chaves Coorientador: Prof. Dr. Matheus Pereira Postigo
Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia, Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Ponta Grossa, 2019.
1. Amora. 2. Cápsulas (Farmácia). 3. Fenóis. 4. Flavonóides. 4. Secagem. I. Chaves, Eduardo Sidinei. II. Postigo, Matheus Pereira. III. Universidade Tecnológica Federal do Paraná. IV. Título.
CDD 660.6
FOLHA DE APROVAÇÃO
Título de Dissertação Nº 1/2019
EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS DE FOLHAS DE AMOREIRA PRETA (Morus nigra L.) E ENCAPSULAMENTO EM ESFERAS
DE ALGINATO
por
Kathlyn Schafranski
Esta dissertação foi apresentada às 9 horas de 25 de fevereiro de 2019, na sala do
mini auditório bloco C, como requisito parcial para a obtenção do título de MESTRE
EM BIOTECNOLOGIA, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. O candidato
foi arguido pela Banca Examinadora, composta pelos professores abaixo assinados.
Após deliberação, a Banca Examinadora considerou o trabalho APROVADO.
Prof. Dr. Luiz Gustavo Lacerda (UEPG) Profa. Dra. Alessandra Cristine Novak Sydney (UTFPR)
Prof. Dr. Matheus Pereira Postigo (UTFPR)
Coorientador e presidente da banca
Visto da Coordenadora:
Profa. Dra. Juliana Vitória Messias Bittencourt
Coordenadora do PPGBIOTEC UTFPR – Câmpus Ponta Grossa
- A FOLHA DE APROVAÇÃO ASSINADA ENCONTRA-SE ARQUIVADA NA SECRETARIA DO CURSO -
AGRADECIMENTOS
A Deus pela vida, por sua infinita bondade e pela natureza. Assim como
agradeço pela oportunidade que tem me dado de evoluir um pouco a cada dia.
A minha mãezinha Soeli Oliveira dos Santos que sozinha foi e é pai e mãe ao
mesmo tempo. Reconheço sua luta e acima de tudo seu amor na minha criação.
A minha família querida, aos meus irmãos e sobrinhos pelo amor, carinho e
apoio.
Ao meu marido João Vieira Junior que sempre me apoiou, agradeço pelo
carinho, pelo amor e por me fazer feliz.
Ao professor Dr.° Eduardo Sidinei Chaves pela orientação, amizade e incentivo.
Sou muita grata pelos ensinamentos, sabedoria e conselhos, obrigada por ser uma
inspiração para todos nós e por nos mostrar que sempre podemos ir além.
Ao professor Dr.° Matheus Pereira Postigo pela coorientação e contribuição
com seus conhecimentos.
À professora Dr.ª Alessandra Cristine Novack Sydney por todo apoio prestado
e auxílio na parte dos compostos bioativos.
À minha amiga Klaiani Bez Fontana pela amizade, carinho e apoio.
A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e à
coordenadora prof.ª Dr.ª Juliana Vitoria Messias Bittencourt.
À UTFPR Campus Ponta Grossa por ser a responsável pela minha formação
desde a graduação.
À UFSC pela acolhida ao ceder seu espaço.
À CAPES pelo incentivo financeiro da bolsa de pesquisa.
A todos que de alguma forma contribuíram para a realização desta pesquisa,
meus singelos agradecimentos.
RESUMO
SCHAFRANSKI, Kathlyn. Extração e caracterização de compostos fenólicos de folhas de amoreira preta (Morus nigra L.) e encapsulamento em esferas de alginato. 2019. 100 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Ponta Grossa, 2019.
A amoreira preta (Morus nigra L.), é uma planta de origem asiática, aclimatizada no Brasil, e suas folhas são utilizadas como infusões, devido a propriedades benéficas à saúde. Sua ação antioxidante e anticancerígena tem sido demonstrada e podem ser atribuídas à presença de compostos fenólicos na planta. Entretanto, essa classe de compostos possui baixa estabilidade e uma das alternativas de conservação da bioatividade destes compostos pode ser o encapsulamento. O objetivo deste trabalho é a extração de compostos fenólicos de folhas de amoreira preta para posterior encapsulamento em esferas de alginato de cálcio. As condições de extração para obtenção dos extratos aquosos de folhas de Morus nigra foram otimizadas por meio de um delineamento experimental, no qual foram avaliadas condições de temperatura de secagem, temperatura de infusão e tempo de extração, monitorando o conteúdo fenólico total (CFT). Foram determinadas concentrações de CFT, flavonoides, flavonóis, orto-difenólicos, atividade antioxidante frente ao radical DPPH· e capacidade redutora total dos extratos. Identificação e quantificação de compostos fenólicos por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas (LC-ESI-MS/MS). Foram determinadas concentrações de minerais. A atividade antimicrobiana dos extratos também foi realizada. Os extratos foram encapsulados em esferas de alginato de cálcio e avaliados em termos do CFT, por testes de eficiência de encapsulamento, liberação do princípio ativo em água, estabilidade ao armazenamento e caracterização das esferas. Entre as condições avaliadas as extrações mais eficientes ocorreram em folhas que foram expostas a menores temperaturas de secagem e maiores temperaturas de infusão. Os extratos apresentaram concentrações apreciáveis de classes fenólicas e atividade antioxidante. A análise por LC-ESI-MS/MS permitiu identificar substância fenólica ainda não relatada na literatura até o momento. Além disso 10 elementos minerais foram determinados em concentrações significativas, entre eles o potássio, ferro e manganês. A eficiência de encapsulamento do CFT para esferas secas e úmidas foi de 95,1 ± 1,4 e 81,7 ± 0,8 % respectivamente. As imagens do MEV para esferas secas mostraram que o extrato e a secagem afetaram a morfologia das esferas. Os espectros de FTIR das esferas em branco e carregadas com extrato revelaram compatibilidade entre os compostos fenólicos e a matriz de alginato. Dos 81 dias de estocagem as esferas secas mantidas a 4 ± 1°C apresentaram estabilidade em CFT até 36 dias, entretanto leve decaimento no CFT foram observadas até o fim do período. Para as esferas úmidas mantidas a 4°C o CFT manteve-se estável nas primeiras quatro semanas. Assim, o encapsulamento de extratos de amoreira preta em esferas de alginato é uma técnica promissora para promover ação protetora sobre os compostos fenólicos. Palavras-chave: Folhas de amoreira preta. Compostos fenólicos. Encapsulamento.
Esferas de alginato.
ABSTRACT
SCHAFRANSKI, Kathlyn. Extraction and characterization of phenolic compounds of black mulberry leaves (Morus nigra L.) and encapsulation in alginate beads. 2019. 100 p. Thesis (Master Degree in Biotechnology) - Federal University of Technology - Paraná, Ponta Grossa, 2019. Black mulberry (Morus nigra L.) is a plant of Asian origin, acclimatized in Brazil, and its leaves are used as infusions, due to beneficial health properties. Its antioxidant and anticancer action has been demonstrated and can be attributed to the presence of phenolic compounds in the plant. However, this class of compounds has low stability and one of the alternatives of conservation of the bioactivity of these compounds can be the encapsulation. The objective of this work is the extraction of phenolic compounds from leaves of black mulberry for later encapsulation in spheres of calcium alginate. Initially, aqueous extracts of Morus nigra leaves were prepared through an experimental design to determine the best conditions of drying and infusion temperatures and extraction time regarding their total phenolic content (CFT). Concentrations of CFT, flavonoids, flavonols, ortho-diphenols, antioxidant activity against DPPH radical and total extractive capacity were determined. Identification and quantification of phenolic compounds by high performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-ESI-MS / MS). Concentrations of minerals were determined. The antimicrobial activity of the extracts was also performed. The extracts were encapsulated in calcium alginate beads and evaluated in terms of CFT, encapsulation efficiency tests, release of the active principle in water, storage stability and ball characterization. Among the evaluated conditions the most efficient extractions occurred in leaves that were exposed to lower drying temperatures and higher infusion temperatures. The extracts showed appreciable concentrations of phenolic classes and antioxidant activity. Analysis by LC-ESI-MS / MS allowed to identify phenolic substance not yet reported in the literature to date. In addition 10 mineral elements were determined in significant concentrations, among them potassium, iron and manganese. The encapsulation efficiency of CFT for dry and wet spheres was 95.1 ± 1.4 and 81.7 ± 0.8% respectively. SEM images for dry spheres showed that the extract and drying affected the morphology of the spheres. FTIR spectra of beads loaded with extract showed compatibility between the phenolic compounds and the alginate matrix. Along the 81 days of storage, the dried spheres kept at 4 °C showed stability in CFT up to 36 days, however small changes in CFT were observed until the end of the period. For moist spheres stored at 4 °C, CFT remained stable for the first four weeks. Thus, the encapsulation of black mulberry extracts in alginate beads is a promising technique to promote protective action of phenolic compounds. Keywords: Black mulberry leaves. Phenolic compounds. Encapsulation. Beads alginate.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Relação entre metabolismo primário e secundário em plantas. ................ 16
Figura 2 - Classificação dos compostos fenólicos. .................................................... 18
Figura 3 - Diferenças nas estruturas fenólicas. ......................................................... 19
Figura 4 - Ilustração esquemática para a microencapsulação de compostos ........... 24
Figura 5 - Estrutura do alginato. ................................................................................ 27
Figura 6 - Processo de gelificação iônica do alginato de sódio ................................. 29
Figura 7 - Esquema representativo do encapsulamento de extrato aquosos de folhas de Morus nigra L. em alginato. ....................................................................... 42
Figura 8 - Esquema representativo do teste de estabilidade das esferas úmidas e secas. ........................................................................................................................ 44
Figura 9 - Cromatograma das análises de LC-ESI-MS/MS em extratos de folhas de amoreira preta. ..................................................................................................... 58
Figura 10 - Concentração inibitória mínima (CIM) de extratos de folhas de Morus nigra L. ...................................................................................................................... 61
Figura 11 - Micrografias MEV das esferas de alginato. ............................................. 68
Figura 12 - Fotografias das esferas de alginato úmidas em branco e dopadas com extrato de folhas de amoreira preta. .......................................................................... 69
Figura 13 - Espectro de infravermelho das esferas de alginato em branco (A) e dopadas com extrato de folhas de amoreira preta (B). ............................................. 70
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 - Efeito da temperatura de secagem, temperatura de infusão e tempo no conteúdo fenólico total de folhas de amoreira preta. ............................................ 49
Gráfico 2 - Valores preditos versus valores observados pelo conteúdo fenólico total............................................................................................................................ 50
Gráfico 3 - Gráficos de superfície de resposta para conteúdo fenólico total em função de: Temperatura de secagem versus Temperatura de infusão (A); Temperatura de secagem versus Tempo (B); Temperatura de infusão versus Tempo (C). ................................................................................................................ 51
Gráfico 4 - Influência da concentração do alginato de sódio no conteúdo fenólico total de extratos de amoreira preta encapsulados. .................................................... 65
Gráfico 5 - Cinética de liberação de compostos fenólicos em água das esferas úmida e secas dopadas com extrato de folhas de amoreira preta. Os resultados são representados em termos de média ± desvio padrão. ........................................ 72
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Planejamento experimental fatorial com as variáveis e níveis de variação para extração de compostos fenólicos totais em folhas de Morus nigra. .... 33
Tabela 2- Analitos e fragmentos utilizados para identificação de compostos fenólicos em folhas de amoreira preta....................................................................... 37
Tabela 3- Valores médios e desvio padrão do conteúdo fenólico total de extratos aquosos de folhas de amoreira preta. ....................................................................... 47
Tabela 4- Estimativa dos efeitos para o conteúdo fenólico total. ............................... 48
Tabela 5- Tabela da ANOVA para o conteúdo fenólico total. .................................... 52
Tabela 6- Valores médios e desvio padrão da composição fenólica (classes) dos extratos aquosos de Morus nigra L., e capacidade redutora total e capacidade antioxidante. .............................................................................................................. 54
Tabela 7- Parâmetros de desempenho analítico para determinação de compostos fenólicos por LC-ESI-MS/MS. .................................................................................... 56
Tabela 8- Valores médios e desvio padrão dos compostos fenólicos identificados e quantificados por LC-ESI-MS/MS em extratos de folhas de amoreira preta. ......... 57
Tabela 9- Figuras de mérito para determinação de minerais por ICP MS e fotometria de chama. ................................................................................................. 62
Tabela 10- Concentração de minerais em folhas de amoreira preta expressos como média ± desvio padrão. ................................................................................... 63
Tabela 11- Estabilidade do conteúdo fenólico total das esferas secas dopadas com extrato de folhas de amoreira preta durante 81 dias de armazenamento a 4 ± 1°C e temperatura ambiente (25 ± 6°C). Os resultados são representados em termos de média ± desvio padrão. ............................................................................ 73
Tabela 12- Estabilidade do conteúdo fenólico total em esferas úmidas dopadas com extrato de folhas de amoreira preta durante 81 dias de armazenamento a 4 ± 1°C e temperatura ambiente (25 ± 6°C) no extrato e em soro. Os resultados são representados em termos de média ± desvio padrão ............................................... 74
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................... 11
2 OBJETIVOS ....................................................................................................... 13
2.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................. 13
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................... 13
3 REVISÃO DA LITERATURA .............................................................................. 14
3.1 AMOREIRA PRETA (Morus nigra L.) .................................................................. 14
3.2 EXTRATOS DE FOLHAS DE AMOREIRA PRETA ............................................. 14
3.3 COMPOSTOS BIOATIVOS ................................................................................. 16
3.4 COMPOSTOS FENÓLICOS ............................................................................... 17
3.5 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE .............................................................................. 20
3.6 MICRONUTRIENTES MINERAIS ....................................................................... 21
3.7 TÉCNICAS DE SECAGEM DE VEGETAIS ......................................................... 22
3.9 ENCAPSULAMENTO DE COMPOSTOS BIOATIVOS ....................................... 24
3.10 ENCAPSULANTES ........................................................................................... 26
3.11 ENCAPSULAMENTO COM ALGINATO DE SÓDIO ......................................... 27
3.12 GELIFICAÇÃO IÔNICA EXTERNA DAS ESFERAS DE ALGINATO ................ 28
4 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 31
4.1 REAGENTES E SOLUÇÕES .............................................................................. 31
4.2 AMOSTRAS ........................................................................................................ 31
4.3 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL E PREPARO DO EXTRATO ..................... 32
4.5 QUANTIFICAÇÃO DE CLASSES DE COMPOSTOS FENÓLICOS EM
EXTRATOs DE FOLHAS DE AMOREIRA PRETA ................................................... 34
4.5.1 Determinação do Conteúdo Fenólico Total (CFT) ............................................ 34
4.5.2 Determinação de Flavonoides Totais ............................................................... 34
4.5.3 Determinação de Flavonóis Totais ................................................................... 35
4.5.4 Quantificação de Orto - difenólicos................................................................... 35
4.6 ANÁLISE DE COMPOSTOS FENÓLICOS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
COM ESPECTRÔMETRO DE MASSA (LC-ESI-MS/MS) ......................................... 36
4.7 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS EXTRATOS ................................................. 37
4.7.1 Sequestro de Radicais Livres (DPPH•) ............................................................. 37
4.7.2 Capacidade Redutora Total .............................................................................. 38
4.8 AÇÚCAR REDUTOR........................................................................................... 39
4.9 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA .......................................................................... 39
4.10 DETERMINAÇÃO DE MINERAIS ..................................................................... 40
4.11 ENCAPSULAMENTO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS EM ESFERAS DE
ALGINATO ................................................................................................................ 41
4.11.1 Eficiência de Encapsulamento (EE) ............................................................... 42
4.11.2 Caracterização das Esferas de Alginato de Cálcio ......................................... 43
4.11.3 Estudo Cinético da Liberação de Compostos Fenólicos em Água ................. 43
4.11.4 Teste de Estabilidade ..................................................................................... 44
4.12 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................... 45
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................... 46
5.1 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL ................................................................... 46
5.3 ANÁLISE DO PERFIL FENÓLICO DOS EXTRATOS POR LC-ESI-MS/MS ....... 55
5.3.1 Parâmetros de Desempenho Analítico para Análise ........................................ 55
5.3.2 Perfil Fenólico dos Extratos de Amoreira Preta ................................................ 57
5.4 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA .......................................................................... 60
5.5 DETERMINAÇÃO DE MINERAIS ....................................................................... 62
5.5.1 Parâmetros de Desempenho Analítico para os Minerais.................................. 62
5.5.2 Perfil Mineral dos Extratos de Amoreira Preta .................................................. 63
5.6 ENCAPSULAMENTO DE COMPOSTOS FENÓLICOS EM ESFERAS DE
ALGINATO ................................................................................................................ 65
5.6.1 Eficiência de Encapsulamento ......................................................................... 66
5.6.2 Caracterização das Esferas de Alginato de Cálcio ........................................... 67
5.6.3 Teste de Liberação In Vitro .............................................................................. 71
5.6.4 Teste de Estabilidade ....................................................................................... 72
6 CONCLUSÕES ................................................................................................... 76
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 78
11
1 INTRODUÇÃO
Os compostos fenólicos são uma ampla classe de bioativos, resultantes do
metabolismo secundário das plantas em resposta a estresses bióticos e abióticos, tais
como seca, umidade, insetos e plantas hospedeiras. Eles podem ser definidos como
compostos químicos que possuem como estrutura básica um anel aromático com um
ou mais substituintes hidroxila, são classificados com base no número de unidades de
fenol na molécula, e nesta classe destacam-se os flavonoides e os ácidos fenólicos.
São abundantes na natureza podendo ser considerados o maior grupo de
antioxidantes naturais, importantes na prevenção do estresse oxidativo e doenças
crônicas (KHODDAMI; WILKES; ROBERTS, 2013).
As folhas de Morus nigra L., comumente conhecida como amoreira preta, suas
folhagens são abundantes e possuem papel importante na produção de seda,
principalmente na China. São usadas na medicina tradicional, apresentam valor
agronômico por servirem de biomassa para alimentação de gado, assim como
alimento humano na forma de bebidas, infusões, corantes naturais e outros alimentos
(PARK et al, 2013; WU et al, 2013).
Estudos com as folhas deste gênero embora escassos, correlacionam agentes
bioativos como os compostos fenólicos com diversas ações biológicas, tais como
antimicrobianas, antialergênicas, efeitos antidepressivos e neuroprotetores
acompanhados do decréscimo do estresse oxidativo (KATSUBE et al, 2009;
ENKHMAA et al, 2005; HARAUMA et al, 2007; ZENI et al, 2017; DALMAGRO et al,
2017).
Apesar das folhas de amoreira preta apresentarem altos níveis de compostos
fenólicos, estes são instáveis e podem ser degradados quando submetidos a
processamentos de conservação e armazenamento, principalmente quando expostos
ao oxigênio e temperaturas elevadas. Tradicionalmente o processo de conservação
mais empregado na produção de chás e extratos biológicos de plantas envolve a
secagem em estufa ou liofilização. Katsube e colaboradores (2009) chamam a
atenção para que sejam estudadas as condições de processamento das folhas de
amoreira e que preservem a capacidade antioxidante e na concentração de
compostos fenólicos.
Atualmente novas técnicas como o encapsulamento vêm surgindo para
preservar a atividade biológica, alcançar a liberação controlada de compostos
12
bioativos, além de mascarar aromas indesejáveis, como o sabor amargo e a
adstringência de natureza fenólica. O encapsulamento consiste em aprisionar os
componentes ativos dentro de um material polimérico, permitindo assim maior
proteção contra agentes externos. Os polímeros mais usuais são a maltodextrina,
goma arábica, quitosana e o alginato de sódio. As matrizes utilizadas como
encapsulantes devem possuir determinados requisitos como baixo preço,
simplicidade de manuseio, biodegradabilidade, biocompatibilidade e boa capacidade
de armazenamento (PETERS et al, 2011; DELADINO et al, 2008; STOJANOVIC et al,
2012).
Neste contexto o objetivo deste trabalho é a extração e caracterização de
compostos fenólicos de folhas de amoreira preta (Morus nigra L.) para posterior
encapsulamento em esferas de alginato de cálcio, almejando-se aumentar a
valorização destas como fonte natural e promissora de compostos fenólicos, bem
como o aumento da sua estabilidade por meio do encapsulamento em alginato.
13
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Extração e caracterização de compostos fenólicos de folhas de amoreira preta
Morus nigra L., para posterior encapsulamento em esferas de alginato de sódio.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Otimizar o processo de extração dos compostos fenólicos analisando as
variáveis temperatura de secagem das folhas, temperatura de infusão e
tempo de extração.
Quantificar a concentração de compostos fenólicos totais, flavonoides
totais, flavonóis totais, orto-difenólicos, capacidade redutora total,
capacidade antioxidante e açúcar redutor dos extratos aquosos por
metodologias espectrofotométricas;
Identificar e quantificar os principais constituintes fenólicos, testar o
potencial antimicrobiano e determinar a concentração de minerais nos
extratos aquosos de folhas de amoreira preta
Estudar a eficiência de encapsulamento e a liberação dos compostos
fenólicos in vitro, caracterizar as esferas de alginato e avaliar a estabilidade
do conteúdo fenólico total dos encapsulados durante o armazenamento em
diferentes condições de estocagem.
14
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 AMOREIRA PRETA (Morus nigra L.)
A Morus nigra L., também conhecida como amoreira preta, é uma espécie
vegetal que pertence ao gênero Morus, da família Moraceae. A planta é originária da
Ásia com produção de frutos mais intensa e abundante na Ásia Menor. No Brasil essa
planta apresenta-se absolutamente adaptada ao clima (CRUZ, 1979). Este gênero é
composto por cerca de 24 espécies e uma subespécie, sendo relatadas
aproximadamente 100 variedades (TUTIN et al, 1996).
A amoreira preta pode alcançar de 4 a 5 m de altura; as folhas são de coloração
verde-clara e bastante espessas (MORGAN, 1982). Podem ser encontradas em
regiões temperadas e subtropicais, mas são capazes de variar em diversas condições
climáticas, topográficas e de solo (ERCISLI; ORHAN, 2007). Conforme Vijayan (2010),
tradicionalmente a amoreira preta tem sido cultivada por suas folhas servirem como
alimento para o bicho da seda (Bombyx mori L.) e como árvores ornamentais.
Na medicina tradicional chinesa as folhas da amoreira preta têm sido
amplamente utilizadas como antiflogístico, hepatoprotetor, hipotensor, antipirético,
analgésico, diurético, expectorante, e também contra sintomas da diabetes
(NOMURA, 1988; CHEN et al, 1995) bem como utilizadas no tratamento de anemia e
artrite (OZGEN et al, 2009).
Seus frutos são comestíveis de sabor doce a ligeiramente ácidos e quando
maduros apresentam coloração vermelho-escura chegando à tonalidade preta
(MORGAN, 1982). São consumidos frescos ou processados, como geleias, sumos,
xaropes, bebidas, frutos secos, podendo ainda ser utilizados na produção de corantes
naturais (GUNDOGDU et al, 2011).
3.2 EXTRATOS DE FOLHAS DE AMOREIRA PRETA
Devido à busca constante do uso de ingredientes naturais os extratos vegetais
têm ganhado popularidade nos últimos anos. De acordo com Oliveira e Akisue (1997),
os extratos vegetais são elaborações concentradas com aspectos variados
provenientes de matérias-primas vegetais secas passíveis de tratamentos prévios ou
15
não (ação por enzimas ou moagem). Esses meios complexos envolvem processos
com solventes que podem separar compostos específicos ou parte deles.
Os extratos vegetais mais comuns são os chás ou infusões de ervas. O
consumo dessas bebidas é mundialmente distribuído e extremamente popular em
diversos países asiáticos, sul-americanos e europeus, em virtude de vários benefícios
à saúde e às funções fisiológicas (BETTUZZI et al, 2006; BANSAL et al, 2012).
Wu e colaboradores (2013) reportaram que o extrato fenólico da folha de
amoreira possui a capacidade de diminuir o acúmulo de lipídios hepáticos por meio
da ativação da via de sinalização da proteína quinase. Além disso, outros estudos
indicaram que os extratos de folhas do mesmo gênero Morus poderiam ser utilizados
na prevenção de doenças assinaladas por inflamações crônicas através da inibição
do fator de transcrição nuclear (PARK et al, 2013) e no tratamento de diabetes tipo 2
e outras doenças cardiovasculares (JESZKA-SKOWRON et al, 2014).
As folhas de amoreira são de uso habitual em certos países da Ásia, inclusive
o pó da folha é adicionado ao trigo para elaboração da paratha (massa folhada), um
item muito comum da culinária indiana (SRIVASTAVA et al, 2003). Já na Coreia e
Japão a procura das folhas para infusões e sucos aumentou significativamente nos
últimos anos (DESMUKH et al, 1993; KATSUBE et al, 2010; THABTI et al, 2012). No
Brasil é utilizada no tratamento de diabetes, problemas cardiovasculares, para aliviar
os sintomas do climatério e cefaleia, obesidade e gota (OLIVEIRA et al, 2013).
Um fator extremamente relevante é a avaliação de segurança dos extratos de
folhas de amoreira preta. De acordo com experimentos de Figueredo e colaboradores
(2018), que realizaram estudo da toxicidade oral aguda e subaguda em ratos Wistar,
o extrato foi administrado nas doses de 500, 750 e 1000 mg / kg por 28 dias. Neste
caso as folhas de amoreira preta não apresentaram efeitos tóxicos significativos
quando administradas oralmente a ratos machos e fêmeas.
Há um crescente interesse no estudo estrutural e farmacológico dos
compostos fenólicos, cujas biomoléculas são encontradas em várias espécies da
família Moraceae (NOMURA E HANO, 1994; HUNYADI et al, 2013; SÁNCHEZ-
SALCEDO et al, 2015a). Estudos de Doi e colaboradores (2001) e Kim e
colaboradores (1999), com folhas de M. alba, demonstraram a presença de diversos
constituintes fenólicos, entre eles, os flavonoides e flavo-glicosídeos como a
quercetina.
16
3.3 COMPOSTOS BIOATIVOS
As plantas produzem metabólitos secundários (MS), decorrentes do
mecanismo de defesa contra herbívoros, microrganismos e plantas competidoras,
como artefato de atração para agentes polinizadores e animais disseminadores de
sementes ou sistemas de proteção contra radiações danosas como a radiação
ultravioleta (UV). Os MS são produzidos durante a fotossíntese e ainda que não
participem de modo direto nos processos de crescimento, desenvolvimento e
reprodução como os metabólitos primários, são primordiais para a sobrevivência da
planta e perpetuação de sua espécie (Figura 1). São elementos biologicamente ativos
com habilidades de interferir a nível molecular no organismo. Assim, a ação desses
compostos presentes em alimentos vegetais na conservação da saúde humana tem
sido alvo de diversos estudos nos últimos anos (MARTINS et al, 2016; SILVA et al,
2010; WINK, 2016).
Figura 1- Relação entre metabolismo primário e secundário em plantas.
Fonte: Adaptado de Martins et al. (2015).
O conhecimento sobre os compostos bioativos influenciou o conceito de
alimentos funcionais. Segundo a ANVISA (Agencia Nacional de Vigilância Sanitária)
compostos bioativos são os nutrientes e não nutrientes que possuem ação no
17
metabolismo ou fisiológico específico. Neste cenário a palavra saúde ganha um novo
sentido no conhecimento dos alimentos, de modo que a alimentação apropriada não
somente preocupa-se em fornecer energia e nutrientes essenciais, como ressalta a
importância dos compostos bioativos, uma vez que são capazes de exercer efeitos
fisiológicos benéficos, podendo prevenir ou reduzir o risco do desenvolvimento de
doenças cardiovasculares, câncer, infecções intestinais, hipertensão, osteoporose,
doenças neurodegenerativas e enfermidades inflamatórias (CARRATU; SANZINI,
2005; COSTA; JORGE, 2011).
Civilizações passadas já utilizavam plantas para fins terapêuticos como
tratamento de primeira escolha, levando em consideração evidências aparentes no
corpo, bem como observaram a toxicidade conforme a dose. Entretanto, os povos não
compreendiam a razão desses efeitos e tampouco a composição das plantas
(HALBERSTEIN, 2005; MURRAY; PIZZORNO, 1998; PETROVSKA, 2012). Hoje
sabe-se que as plantas possuem milhares de compostos químicos biologicamente
ativos funcionando em harmonia e contribuindo com uma gama de bioatividades. A
comunidade científica tem se concentrado identificação de moléculas bioativas em
uma diversidade de plantas, assim como suas propriedades e mecanismos de ação
(AGARWAL et al, 2010; ALVES-SILVA et al, 2013; ASGARPANAH; KAZEMIVASH,
2012; ASL; HOSSEINZADEH, 2008, BAKKALI et al, 2008, KANAFANI; PERFECT,
2008; RANA et al, 2011; SHER, 2009; SHOJAII; FARD, 2012; SILVA et al, 2011;
SINGH et al, 2010).
3.4 COMPOSTOS FENÓLICOS
Os compostos fenólicos são um importante grupo de metabólitos secundários.
Conforme Hernández e Prieto Gonzáles (1999), são substâncias que possuem grupos
benzênicos que possuem no mínimo um de seus hidrogênios substituídos por
grupamentos hidroxila. Na natureza são encontrados em abundância e abrangem
desde moléculas simples até outras com alto grau de polimerização. Mais de 8000
compostos fenólicos já foram identificados em plantas (DAI; MUMPER, 2010). A
finalidade destes compostos está associada com inibição ou ativação de uma vasta
diversidade de sistemas enzimáticos, como quelantes de metais ou podendo
sequestrar radicais livres (GARBISA et al, 2001; RUSSO et al, 2000).
18
O termo “fenólicos” engloba um grupo superabundante e diversificado de
compostos químicos, que são subdivididos de acordo com o número de subunidades
de fenol presentes na molécula, classificados entre polifenóis e fenóis simples
(GIADA, 2013). As principais classes e subclasses de compostos fenólicos podem ser
observadas na Figura 2.
Figura 2- Classificação dos compostos fenólicos.
Fonte: Adaptado de LUTHRIA (2006).
A multiplicidade de estruturas dos compostos fenólicos ocorre graças à grande
diversidade de combinações que sucedem na natureza, que podem ser categorizadas
em inúmeras classes. Entre os compostos fenólicos, existem moléculas simples, como
ácidos fenólicos ou estruturas complexas, como taninos hidrolisáveis (Figura 3)
(HARBORNE et al, 1999). São fontes de substâncias fenólicas as frutas cítricas, frutas
vermelhas, legumes, vegetais e outras plantas, constituídas principalmente de ácidos
fenólicos, flavonoides e taninos (PIMENTEL et al, 2005).
Os flavonoides correspondem à classe fenólica mais importante e variada entre
os produtos de origem vegetal. Apresentam uma rica diversidade estrutural, possuindo
um esqueleto de 15 carbonos em sua estrutura química, que consiste de dois anéis
aromáticos chamados A e B ligados através de um anel pirano chamado
C. Modificações nesta estrutura básica tais como hidroxilação, metilação, acilação e
19
glicosilação podem dar origens a diversas classes de flavonoides (MACHADO et al.,
2008). São compostos que possuem boa capacidade antioxidante natural atuando no
bloqueio de espécies reativas de oxigênio (EROs) por ação inibitória de enzimas ou
como quelantes de traços de elementos envolvidos na produção de radicais livres
(TOMINAGA et al, 2006).
Figura 3- Diferenças nas estruturas fenólicas.
Fonte: Adaptado Soto et al. (2015).
A comunidade científica tem se concentrado na extração de compostos
fenólicos principalmente de folhas de diversas fontes vegetais (SANTOS-GOMES et
al, 2003; ALARA et al, 2018; SUMERE et al, 2018; IRAKLI et al, 2018)
Entretanto, outros estudos concentram-se em estudar as propriedades
bioativas dos extratos, como atividades antioxidantes (RADOJKOVIĆ et al, 2016;
SÁNCHEZ-SALCEDO et al, 2015a), atividade antimicrobiana (HUSSAIN et al, 2010;
KOZŁOWSKA et al, 2015; ONITSUKA et al, 2019) e ação citotóxica (KOCKA et al,
2018; FIGUEREDO et al, 2018).
Esforços com o objetivo de identificar compostos fenólicos em folhas de
amoreira têm sido realizados (DUGO et al, 2009; THABTI et al, 2012). Estes fatos
corroboram para a valorização deste material vegetal uma vez que indicam
expressamente a bioatividade intrínseca reforçando o desenvolvimento de produtos
20
oriundos da folha como chás, bebidas fortificadas e fitoquímicos (NAM; JANG;
SHIBAMOTO, 2012).
Apesar de utilizada na medicina popular, são limitados os estudos no que diz
respeito à composição fenólica, farmacológica e avaliação das propriedades
biológicas das folhas de M. nigra. Em sua maioria as pesquisas são voltadas aos frutos
dessa espécie.
3.5 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
Antioxidantes são compostos capazes de retardar a velocidade da oxidação
através de um ou mais mecanismos impedindo a formação de radicais livres e
complexação de metais. A atividade antioxidante de compostos fenólicos deve-se
principalmente às suas propriedades de oxido-redução desempenhando um papel
significativo na absorção e neutralização de radicais livres, atuando como quelante de
oxigênio triplete e singlete ou ainda na decomposição de peróxidos (ANTUNES;
CANHOS, 1984; BRENNA; PAGLIARINI, 2001; ZHENG; WANG, 2001; FENNEMA,
1993).
Existem duas classes de antioxidantes: os que possuem atividade enzimática
e os que não a possuem. Na primeira classe, estão as substâncias que possuem
capacidade de impedir o início da oxidação capturando moléculas instáveis. Entre os
antioxidantes que não detém atividade enzimática, encontram-se moléculas que
possuem afinidade com espécies radicalares, portanto são consumidas ao longo da
reação. Esta divisão engloba os antioxidantes naturais e os sintéticos (MOREIRA;
MANCINI, 2004).
Ainda que o organismo possua defesas antioxidantes endógenas reais no
combate ao excesso de radicais livres, pressupõe-se que possam existir falhas e
consequentemente a formação constante de radicais livres. Portanto, o consumo de
antioxidantes através da dieta é fundamental na manutenção da saúde. Muitas
doenças como o câncer, diabetes, artrite, doenças do coração, podem estar
diretamente ligadas aos danos promovidos por formas reativas de oxigênio. Os
radicais livres também estão intimamente ligados aos processos de envelhecimento
do corpo (BRENNA; PAGLIARINI, 2001). Um maior consumo de alimentos ricos em
compostos fenólicos possui forte relação entre a baixa incidência de doenças
crônicas (HERTOG et al, 1993).
21
A Organização Mundial de Saúde (OMS) relaciona que doenças pertinentes a
idade, tais como diabetes, câncer, distúrbios cardiovasculares e neurodegenerativas
são as principais causas de mortalidade e morbidade. De acordo com Herrero e
colaboradores (2008), o estresse oxidativo é visto como um evento patológico, onde
as células não são capazes de neutralizar os efeitos prejudiciais das espécies reativas
de oxigênio.
Os compostos bioativos de natureza fenólica têm sido o ponto central de
pesquisas acerca de novos compostos e bioprodutos para retardar ou impedir a
oxidação de substratos intracelulares (ESCOTÉ et al, 2012; LEÓN-GONZÁLEZ et al,
2014).
3.6 MICRONUTRIENTES MINERAIS
Além dos compostos bioativos presentes nas plantas e ervas medicinais, os
constituintes inorgânicos também auxiliam no bom funcionamento do organismo.
Portanto, é de extrema relevância que essas concentrações sejam analisados nas
folhas de amoreira. Os minerais são elementos que estão envolvidos em muitas
funções fisiológicas e bioquímicas, tais como equilíbrio ácido-base e consequente
manutenção do pH, transmissão de impulsos nervosos, pressão osmótica, auxílio na
regulação de diversas enzimas, podendo a carência de minerais afetar seriamente o
organismo (GERNAND et al, 2016).
Micronutrientes são definidos como elementos ou compostos necessários em
quantidades pequenas para o corpo, e incluem as vitaminas e os minerais. São
divididos em macrominerais, aqueles cuja necessidade diária é maior que 100 mg, e
microminerais, aqueles que possuem necessidade inferior a este valor. Os
macrominerais compreendem o cálcio (Ca), magnésio (Mg), potássio (K), sódio (Na),
cloro (Cl), fósforo (P) e enxofre (S), enquanto os microminerais são iodo (I), zinco (Zn),
selênio (Se), ferro (Fe), manganês (Mn), cobre (Cu), cobalto (Co), molibdênio (Mo),
flúor (F), cromo (Cr) e boro (B) (LUKASKI, 2004; DUTRA-DE- OLIVEIRA E MARCHINI,
1998).
A família Moraceae contém quantidades apreciáveis de minerais. Entretanto,
estudos da composição mineral da espécie Morus nigra ainda são escassos.
22
3.7 TÉCNICAS DE SECAGEM DE VEGETAIS
A secagem possivelmente é um dos métodos mais antigos de preservação de
alimentos pós-colheita empregados pelo homem. Este processo baseia-se na retirada
de água de um material, com transferência de calor e massa, ou seja, conserva o
material restringindo a umidade presente, sendo uma tecnologia de baixo custo que
geralmente leva a poucas alterações sensoriais e nutritivas (ERBAY; ICIER, 2010;
ONWUDE et al, 2016).
A principal vantagem desse método é facilitar o armazenamento e transporte,
uma vez que dispensa o uso de refrigeração, assim como facilita outras operações
unitárias como a moagem e mistura. Além disso, a planta fresca possui altas
concentrações de atividade de água, ambiente favorável à multiplicação microbiana e
às reações enzimáticas, possibilitando a deterioração ou até mesmo podendo
degradar o princípio ativo da planta. Consequentemente, a estocagem e a
comercialização in natura destes materiais não são viáveis (MUJUMDAR; LAW,
2010).
A liofilização é um exemplo de secagem artificial considerada nobre na
conservação de produtos farmacêuticos e alimentares, no qual o material previamente
congelado é desidratado a baixa temperatura e pressões negativas, ocorrendo assim
a sublimação dos micros cristais de gelo sem romper as estruturas das moléculas,
melhorando a estabilidade, indicada para amostras sensíveis ao calor (CARPENTER
et al, 1999).
A secagem artificial faz emprego de secadores ou estufas onde o calor é
produzido artificialmente. Essa tecnologia apresenta vantagens significativas, entre
elas a não dependência de condições climáticas, maior controle de temperatura,
umidade e corrente do ar e maximização da qualidade nutricional (GALLALI et al,
2000; RAMANA MURTHY, 2009).
A secagem em estufa com circulação de ar é um método simples e apresenta
baixo custo de manutenção. Nela o material é disposto uniformemente em bandejas
com temperaturas e tempo controlados através de um termostato. Todavia, como se
trata de um tratamento com ar quente podem implicar na degradação térmica de
certos compostos bioativos (MRKIC et al, 2006).
Takuya e colaboradores (2009) chamam a atenção para que sejam estudadas
as condições de processamento das folhas de amoreira e na preservação da
23
capacidade antioxidante e efetiva de compostos fenólicos, uma vez que a secagem
frequentemente é usada na fabricação de chás e outros derivados.
3.8 MÉTODOS DE QUANTIFICAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS
Os compostos bioativos de natureza fenólica podem ser categorizados em
relação de seu conteúdo total, quantificação individual ou de um grupo ou classe de
compostos fenólicos (MOURE et al, 2001). Essas análises são influenciadas pelo
conteúdo do composto, a metodologia de extração empregada, a grandeza da
amostra, a duração e tipo de estocagem, bem como o padrão empregado e a presença
de interferentes como proteínas, açúcares redutores e ácido ascórbico (SHAHIDI;
NACZK, 1995).
De acordo com Benvenuti e colaboradores (2004), Kapasakalidis e
colaboradores (2006), analisando-se uma mesma espécie de fruta, os conteúdos em
fenóis totais encontrados estão correlacionados ao tempo de crescimento, variedade,
propriedades climáticas e ambientais, local geográfico e técnicas de agronomia
realizadas. Tendo em vista o tratamento da amostra, podem haver interferências de
luz, temperatura e dos métodos de extração. Em virtude da pluralidade de sistemas
metabólicos na geração de substâncias fenólicas é difícil fazer uma estimativa da
concentração nos tecidos vegetais de maneira absoluta (EVARISTO E LEITÃO,
2001).
Alguns métodos já testados e validados para determinação de compostos
fenólicos são: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) (GRANATO;
KATAYAMA; CASTRO, 2011); HPLC acoplado com espectrometria de massas
(SLATNAR et al, 2014); cromatografia gasosa (WANG; ZUO, 2011); HPLC acoplado
com espectrometria de massa com alta resolução e biossensores (PORTACCIO et al,
2006).
Recentemente, a HPLC acoplada a um detector de arranjo de diodos com
espectrometria de massas mostrou-se a melhor ferramenta para separar e identificar
fenóis e derivados em várias amostras. Desse modo, tal técnica propicia uma
quantidade abundante de informações qualitativas e quantitativas (GONZALEZ-
MOLINA et al, 2010; SIMIRGIOTIS et al, 2009).
A espectrofotometria é uma técnica muito utilizada na quantificação de
compostos fenólicos, em razão de sua simplicidade, rapidez e baixo custo. Contudo
24
apresenta desvantagem, pois permite somente uma estimativa do conteúdo de fenóis
totais, onde não há diferenciação dos compostos individualmente. Além disso, por
tratar-se de substâncias complexas nas mais variadas matrizes e oscilações reativas
dos fenóis aos reagentes dos ensaios, um vasto espectro de metodologias é
empregado, o que pode levar a resultados errôneos e não comparáveis (IGNAT et al,
2011).
3.9 ENCAPSULAMENTO DE COMPOSTOS BIOATIVOS
O encapsulamento é uma técnica na qual partículas, tais como pigmentos,
enzimas, ou conservantes são envoltas em cápsulas. A substância encapsulada é
chamada de recheio ou núcleo, e a substância que compõe a cápsula é o
encapsulante, cobertura ou parede. As partículas são classificadas conforme seu
tamanho: macrocápsulas (>5000 μm), microcápsulas (0,2-5000 μm) e nanocápsulas
(< 0,2 μm) (SUAVE et al, 2006). Estudos trazem técnicas para processar, fabricar e
aplicar diferentes estruturas, com formatos e tamanhos controlados (PETERS et al,
2011; DICKINSON; 2012; ASSIS et al, 2012; EZHILARASI et al, 2013).
As cápsulas podem ser definidas conforme sua forma em dois grupos: no
primeiro, o núcleo é claramente localizado na região central, rodeado por um filme
definido e contínuo do material de parede. Tais partículas podem ser vistas como um
sistema do tipo reservatório, o que as configura como microcápsulas ou cápsulas. Já
o segundo grupo é considerado como um sistema matricial, no qual o núcleo
apresenta-se disperso de maneira uniforme em uma matriz, configurando as
microesferas ou esferas (Figura 4) (AZEREDO, 2005).
Figura 4- Ilustração esquemática para a microencapsulação de compostos
Fonte: Adaptado de Matté; Rosa (2013).
25
A diferença básica entre microcápsulas e microesferas é que nestas últimas
uma pequena fração do material encapsulado mantém-se exposta na superfície, o que
usualmente não ocorre na verdadeira encapsulação. Porém, o termo encapsulamento
engloba tanto a formação microcápsulas quanto a de microesferas (DEPYPERE,
2003).
De acordo com Suave e colaboradores (2006), ao definir o método mais
adequado deve-se levar em conta o tipo de material ativo, do destino e dos meios
utilizados para que exista a liberação desejada. Basicamente a diferença entre as
técnicas efetivas está na maneira como será envolvido ou aprisionado o material ativo
pelo agente encapsulante, dado que a conjunção entre o material e o agente ativo
pode ser de caráter físico, químico ou físico-químico. Spray-dryer, spray-cooling,
pulverização em banho térmico, leito fluidizado, extrusão centrífuga com múltiplos
orifícios, co-cristalização e liofilização são exemplos de técnicas que utilizam meios
físicos. Já os métodos químicos vão desde inclusão molecular à polimerização
interfacial. Finalmente, metodologias físico-químicas envolvem coacervação,
emulsificação seguida de evaporação do solvente, pulverização em agente formador
de reticulação e inclusão lipossômica (RABELLO, 2009; SUAVE et al, 2006).
As biomoléculas fenólicas apresentam vulnerabilidade a ambientes oxidantes,
como por exemplo quando expostas à luz, oxigênio e umidade, já que apresentam
insaturações em suas estruturas moleculares. Dessa forma, para aumentar a
estabilidade de estocagem elas podem ser encapsuladas o que também as torna
viáveis a utilização pelo fabricante e assegurando benefícios aos consumidores. O
processo de encapsulamento não só estabiliza esses compostos bioativos como
também colabora para mascarar aromas indesejáveis, englobando o sabor amargo e
a adstringência de fenólicos (GOUIN, 2004; NEDOVIC et al, 2011;).
O encapsulamento de bioativos fenólicos são de extrema importância para as
indústrias farmacêuticas, de alimentos funcionais e cosméticos (SANGUANSRI et al.,
2013). Muitas das técnicas de encapsulamento são fundamentadas em processos de
secagem, pois a maioria dos extratos que possuem bioatividade são líquidos. Logo, a
liofilização e a secagem por pulverização são tecnologias bastante utilizadas, a
primeira indicada para compostos sensíveis ao calor, conservando praticamente
intactas as propriedades desses componentes, e a segunda usualmente utilizada por
causa do baixo custo e flexibilidade (FANG; BHANDARI, 2010; CEBALLOS et al,
2012).
26
Posteriormente, muitas pesquisas foram realizadas a fim de otimizar o
encapsulamento de compostos fenólicos, como o caso do extrato de erva mate
(DELADINO et al, 2008), extratos de folhas de oliva (KOSARAJU et al, 2006) e
extratos fenólicos de amoras (LAINE et al, 2008).
3.10 ENCAPSULANTES
A natureza do material encapsulante é um fator determinante no sucesso da
encapsulação e na estabilidade das cápsulas e esferas. Segundo Gharsallaoui e
colaboradores (2007), a seleção da matriz depende de uma série de fatores:
propriedades químicas e físicas do núcleo e da parede, os quais devem ser
compatíveis, fatores econômicos e o agente encapsulante deve possibilitar uma
liberação controlada e conter a volatilização de compostos, apresentar boas
propriedades de formação de filme, baixa viscosidade, ser solúvel em água e
preferencialmente de baixo custo.
Vários são os materiais que podem ser utilizados para encapsulamento para
fins alimentícios e farmacológicos, mas usualmente utilizam-se os polissacarídeos,
pois apresentam uma grande diversidade e baixo custo. Entre eles estão
maltodextrina, goma arábica, amidos hidrofobicamente modificados e quitosana, do
mesmo modo que suas misturas (Quadro 1) (RAY et al, 2016).
Quadro 1- Classes de substâncias utilizadas como encapsulantes de ingredientes alimentares.
Classe Matriz Métodos de encapsulamento aplicáveis
Glicídios Amido, maltodextrinas, amidos modificados, sacarose, ciclodextrinas
Atomização, extrusão, coacervação, inclusões complexas
Celulose Carboximetilcelulose, metilcelulose, etilcelulose, nitrocelulose,
acetilcelulose
Coacervação, atomização, filmes comestíveis
Gomas Goma arábica, ágar, alginato de sódio, carragena
Atomização, método com seringa
Lipídeos Cera, parafina, cera de abelha, diacilglicerol, óleos, ácidos graxos
Emulsão, formação de filmes
Proteínas Glúten, caseína, gelatina, albumina, hemoglobina, peptídeos
Emulsão, atomização
Fonte: adaptado de Desai; Park (2005).
27
Para promover as características morfológicas que favoreçam a eficiência de
encapsulação, estabilidade durante a estocagem, grau de proteção do núcleo e
características microscópicas da superfície, é comum também a utilização de blendas
poliméricas (GBASSI; VANDAMME, 2012). Assim como a utilização de combinações
de métodos de encapsulamento.
3.11 ENCAPSULAMENTO COM ALGINATO DE SÓDIO
O alginato de sódio é um polissacarídeo que recobre extracelularmente
algumas espécies de bactérias e na matriz intercelular de algas marrons encontradas
em ambientes aquáticos. Sua descoberta em algas marrons ocorreu no final do século
XIX, tornando-se um produto de grande importância comercial, podendo atingir de 40
a 60% de peso seco (HAY et al, 2010). Os primeiros estudos voltados a extração de
alginatos destas algas foram realizados pelo químico inglês E.C.C. Stanford em 1883,
onde observou a formação de uma substância gelatinosa na digestão com carbonato
de sódio (MEDINA; LEDO, 2010).
Apresentam características estruturais de copolímeros lineares constituídos de
ácidos α-L-gulurônicos e β-D-manurônicos com ligações 1-4 de composição e
sequência abundantemente variáveis (Figura 5). Sua característica polianiônica é fruto
dos grupos carboxílicos que aparecem ao longo da cadeia. Especificamente a
composição e dimensão das sequências, assim como a massa das moléculas, são
determinantes nas propriedades dos alginatos (DRAGET; TAYLOR, 2011).
Figura 5- Estrutura do alginato.
Fonte: Oliveira et al. (2017).
28
Estudos recentes de encapsulamento evidenciaram a possibilidade de
aumentar a estabilidade de compostos fenólicos preservando sua bioatividade
(BELŠČAK-CVITANOVIĆ et al, 2011; DELADINO et al, 2013; LÓPEZ-CÓRDOBA et
al, 2014). Como um biopolímero natural o alginato de sódio é considerado
biocompatível, possuindo ação gelificante e espessante, biodegradabilidade, baixa
toxicidade, baixo custo, simplicidade de uso, demonstrando proteção efetiva quando
empregado como material de revestimento. Como consequência resulta em máxima
eficiência na preservação de compostos fenólicos extraídos de plantas (DELADINO et
al, 2008; STOJANOVIC et al, 2012).
3.12 GELIFICAÇÃO IÔNICA EXTERNA DAS ESFERAS DE ALGINATO
Muitos estudos reportaram o desenvolvimento de diferentes técnicas para
produzir partículas eficientes, à exemplo a secagem por atomização (PICOT;
LACROIX, 2004), gelificação iônica com o emprego de polissacarídeos associados a
íons cálcio (MAESTRELLI et al, 2008) e união de métodos como leito fluidizado mais
coacervação complexa (LAMBERT; WEINBRECK; KLEEREBEZEM, 2008),
coacervação complexa mais secagem por spray drying (BARACAT et al, 2004;
OLIVEIRA et al, 2007) gelificação iônica e complexação eletrostática (GBASSI et al,
2011).
O método de encapsulamento habitualmente utilizado é a extrusão via
gelificação externa. O método de extrusão envolve a dispersão do material do núcleo
em uma massa fundida de um carboidrato, a qual é lançada, através de uma seringa,
em direção a um líquido desidratante que endurece a cobertura formando assim
microgotas ou gotas, estando seu tamanho sujeito ao diâmetro do orifício e da
velocidade de saída do material. Este processo de endurecimento ocorre por
diferentes meios como a evaporação do solvente, difusão do solvente ou reação
química (CHAN et al, 2009).
A técnica de gelificação iônica pode ser realizada de duas maneiras: interna ou
externa (difusão). Na gelificação há formação reticular dos grupos carboxílicos da
cadeia polimérica do hidrocolóide, estabelecendo zonas de junção que servem de
apoio para a estrutura tridimensional dos géis. Certos fatores podem interferir na
geração das zonas de junção, como a temperatura, presença de íons e até mesmo a
própria estrutura do hidrocolóide. Os hidrocolóides aniônicos, sobretudo os alginatos,
29
podem ser empregados para a encapsulação por extrusão, devido à sua habilidade
de formar géis em contato com soluções salinas (BUREY et al, 2008).
A gelificação iônica interna é baseada na produção de partículas mediante
adição de sais de cálcio de modo direto na solução polimérica contendo material de
recheio, ou seja, dispersão de uma fase aquosa envolvendo um agente reticulador em
sua forma inativa e o biopolímero. No momento em que há a redução de pH do meio
ou a adição de um ácido orgânico, o qual penetra na fase aquosa, o agente de
reticulação ioniza, que resulta na gelificação (COOK et al, 2012; HU; AZADI;
ARDEKANI, 2015).
A produção de microgéis pelo processo de gelificação iônica externa consiste
na formação de grânulos que possuem a solução de alginato e o constituinte a ser
encapsulado, com auxílio de um dispositivo extrusor de gotejamento sobre uma
solução iônica em concentrações pré-determinadas (Figura 6).
Figura 6- Processo de gelificação iônica do alginato de sódio
Fonte: Paredes-Juarez et al. (2014).
Imediatamente as partículas solidificam-se, com início na face exterior, onde
ocorre a reação de íons divalentes com as cadeias biopoliméricas, com carga
negativa, formando estruturas tridimensionais firmes, com concentração de água
elevada, difundindo para o centro da partícula, proporcionando um meio favorável à
reticulação do exterior para o interior, que podem conter níveis satisfatórios do ativo
30
encapsulado e partículas de diferentes formas e tamanhos (HELGERUD et al, 2009;
SCHOUBBEN et al, 2010; SMRDEL et al, 2008). Após o processo de gelificação iônica
do alginato de sódio, este denomina-se alginato de cálcio.
31
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 REAGENTES E SOLUÇÕES
Os reagentes utilizados na realização das análises de cromatografia como
ácido fórmico e metanol foram de grau cromatográfico. Os padrões catequina, ácidos
gálico, cafeico, p-cumárico, ferúlico, salicílico, vanílico, siríngico, protocatecuico,
quercetina, umbeliferona foram obtidos na Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA).
Todos os reagentes apresentaram pureza maior do que 95 %. Reagentes de Folin-
Ciocalteu, 2,2-difenil-1-picrilhidrazila (DPPH•), metanol, ácido fórmico e alginato de
sódio foram obtidos na Sigma-Aldrich (São Paulo, Brasil).
Todos os reagentes utilizados foram de grau analítico. Cloreto de ferro (III)
hexahidratado (FeCl3.6H2O), ferricianeto de potássio (K3[Fe (CN)6]), sulfato de cobre
pentahidratado (CuSO4.5H2O), tartarato duplo de sódio e potássio (KNaC4H4O6·4H2O)
e glicose anidra foram adquiridos da Alfhatec (Rio de Janeiro, Brasil). Carbonato de
sódio, Cloreto de alumínio hexahidratado (AlCl3.6H2O), nitrito de sódio (NaNO2), álcool
etílico, 2,3,5-trifenil cloreto de tetrazólio, isobutanol (C4H10O) e citrato de
sódio tribásico (Na3C6H5O7. 2H2O) foram adquiridos da Vetec (Rio de Janeiro, Brasil).
Molibdato de sódio diidratado (Na2MoO4.2H2O) e hidróxido de sódio (NaOH), foram
adquiridos da Dinâmica (São Paulo, Brasil). Ácido clorídrico foi adquirido da Biotec
(São Paulo, Brasil). Acetato de sódio anidro (C2H3NaO2) foi adquirido da Proquimios
(Rio de Janeiro, Brasil). O caldo infusão cérebro e coração foi adquirido da Kasvi (São
Paulo, Brasil). A água ultrapura com resistividade 1,75 MΩ/cm, purificada em
purificador (GEHAKA Master All 2000 system, Brasil) foi utilizada no preparo das
amostras e soluções. Uma solução estoque multielementar ICP-3 (Perkin-Elmer)
contendo 1000 mg mL-1 dos analitos Si, Cu, Zn, V, Ni, Al, K, Mg e Mn, foi utilizada para
o preparo das soluções de calibrações. Peróxido de hidrogênio e ácido nítrico
bidestilado foram adquiridos da Merck (São Paulo, Brasil) usados para a digestão das
amostras para posterior determinação da concentração dos minerais.
4.2 AMOSTRAS
Folhas da amoreira preta (Morus nigra L.), jovens totalmente expandidas, com
pecíolo, livres de pragas e doenças e de uma mesma árvore, foram coletadas no
32
período da manhã, tempo nublado com temperatura de 18°C na região de Ponta
Grossa em setembro de 2017. Todo material foi inicialmente armazenado em sacos
plásticos e imediatamente transportado até o Laboratório de Métodos Instrumentais
da Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Campus Ponta Grossa. No
laboratório, o material foi higienizado por lavagem em água corrente e posteriormente
em água destilada, deixadas em repouso para escorrer o excesso de água e
posteriormente aplicados os tratamentos térmicos para desidratação das folhas.
As amostras foram desidratadas em estufa de circulação de ar forçado (Fanem,
320-SE) com temperatura regulada para 50 ± 1, 75± 1 e 100 ± 1°C (limites inferiores,
ponto central e limites superiores do planejamento experimental respectivamente) e
pesadas até a massa constante. Em seguida foram moídas em moinho analítico
(Quimis®, São Paulo, Brasil) e passadas em peneira com diâmetro < 0,71 mm para
obtenção de um pó fino, e em seguida armazenadas em refrigerador a -6 ± 1°C em
tubos do tipo falcon escuros protegidos da luz até o momento das análises.
4.3 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL E PREPARO DO EXTRATO
Utilizou-se o planejamento experimental fatorial 2³ totalizando-se 8 corridas
com ponto central em triplicata (Tabela 1) para investigação dos efeitos das variáveis
independentes: temperatura de secagem, temperatura de infusão e tempo de extração
sobre a variável dependente (conteúdo fenólico total). Essas condições foram
determinadas após resultados preliminares os quais indicaram a influência da
temperatura de secagem, da temperatura de infusão e do tempo na extração dos
compostos fenólicos.
33
Tabela 1- Planejamento experimental fatorial com as variáveis e níveis de variação para extração de compostos fenólicos totais em folhas de Morus nigra.
Ensaios Temperatura de secagem (°C) Temperatura de infusão (°C) Tempo (min)
1 1 (50 ± 1,0)
1 (70 ± 0,1) 1 (10)
2 -1 (100 ± 1,0) 1 (70 ± 0,1) 1 (10)
3 1 (50 ± 1,0) -1 (96 ± 0,1) 1 (10)
4 -1 (100 ± 1,0) -1 (96 ± 0,1) 1 (10)
5 1 (50 ± 1,0) 1 (70 ± 0,1) -1 (30)
6 -1 (100 ± 1,0) 1 (70 ± 0,1) -1 (30)
7 1 (50 ± 1,0) -1 (96 ± 0,1) -1 (30)
8 -1 (100 ± 1,0) -1 (96 ± 0,1) -1 (30)
9 0 (75 ± 1,0) 0 (83 ± 0,1) 0 (20)
10 0 (75 ± 1,0) 0 (83 ± 0,1) 0 (20)
11 0 (75 ± 1,0) 0 (83 ± 0,1) 0 (20)
Fonte: a autora.
Os extratos foram preparados utilizando-se 0,5 g de matéria seca em pó das
folhas de amoreira preta em 25 mL de água ultrapura. As extrações foram realizadas
em banho Ultratermostático (Solab SL 152) com tempo e temperatura ajustados
conforme Tabela 3. Os extratos foram centrifugados por 3 min a 2325 g (Lab 1000,
Modelo DMO4125) em temperatura ambiente e em seguida o sobrenadante
armazenado em tubos do tipo falcon escuros para posterior análise. A determinação
da concentração do conteúdo fenólico total foi realizado imediatamente após a
extração.
34
4.5 QUANTIFICAÇÃO DE CLASSES DE COMPOSTOS FENÓLICOS EM
EXTRATOS DE FOLHAS DE AMOREIRA PRETA
4.5.1 Determinação Do Conteúdo Fenólico Total (CFT)
O CFT de extratos das folhas da amoreira preta foi determinado seguindo o
procedimento de Folin-Ciocalteu com algumas modificações (SINGLETON et al,
1999). Uma alíquota de 100 μL do extrato, 500 μL de água e 500 μL de uma solução
aquosa do reagente Folin-Ciocalteau (1:3 v/v) foram misturados em tubo de ensaio.
As amostras foram agitadas e após 5 min foram adicionados 500 μL de Na2CO3 (10%
m/v), deixando-se repousar durante 1 h. Após realização de varredura prévia, que
revelou máximo em 720 nm a absorbância da amostra foi medida em
espectrofotômetro UV-vis (FEMTO 800 XI, Brasil) em cubeta de vidro com caminho
óptico de 1 cm.
Uma curva de calibração foi preparada com ácido gálico (R 2 = 0,9974) na faixa
de concentração de 25 a 600 mg L-1. O experimento foi realizado em triplicata e os
resultados expressos como média ± desvio padrão em mg de ácido gálico equivalente
por g de amostra seca (mg GAE g-1).
4.5.2 Determinação De Flavonoides Totais
A quantificação da concentração de flavonoides foi realizada em triplicata por
meio de leitura em espectrofotômetro, com base em uma curva de calibração
construída pela diluição de uma solução padrão de catequina (R² = 0,9966) e os
resultados são expressos como média ± desvio padrão em mg de catequina
equivalente por g de amostra seca (mg CAE g-1). Para tal, uma alíquota de 250 μL da
amostra de extrato previamente diluído, seguidos de 2720 μL de etanol (30%v/v) e
120 μL de uma solução de nitrito de sódio (0,5 mol L -1) foram misturados em um tubo
de ensaio e após 5 min adicionou-se 120 μL de uma solução de cloreto de alumínio
hexaidratado (0,3 mol L-1). Decorridos 5 min adicionou-se 800 μL de uma solução de
hidróxido de sódio (1mol L-1), homogeneizando-se manualmente. A absorbância foi
medida a 510 nm (LEES; FRANCIS, 1972).
35
4.5.3 Determinação De Flavonóis Totais
O conteúdo de flavonóis foi estimado usando o método colorimétrico descrito
por Yermakov et al. (1987) com adaptações, em que uma alíquota de 1140 μL do
extrato de folhas de amoreira preta diluído em água ultrapura na proporção (1:20),
seguida de 1140 μL de uma solução etanólica de cloreto de alumínio hexahidratado a
2% m/v e de 1700 μL de acetato de sódio (0,6 mol L-1). Os tubos foram agitados por
20 s em vórtex e após 2,5 h de reação à temperatura ambiente, a absorbância foi
monitorada no comprimento de onda de 420 nm em espectrofotômetro. A linha de
base do equipamento foi registrada com uma solução com todos os reagentes nas
proporções utilizadas, com exceção da amostra, substituída por água ultrapura. Para
quantificação dos flavonóis dos extratos uma curva analítica (R²=0,9865) foi
construída com quercetina na faixa de concentração de 6 a 60 mg L-1. A análise foi
realizada em triplicata e os resultados expressos como média ± desvio padrão em mg
de quercetina equivalente por g de amostra seca (mg QE g-1).
4.5.4 Quantificação De Orto - difenólicos
A concentração de orto - difenólicos foi avaliada conforme metodologia descrita
por Durán et al. (1991). Para isso, uma alíquota de 800 μL do extrato diluído em água
ultrapura (1:20 v/v) foi adicionada a 3200 μL de uma solução alcoólica a 5% m/v de
molibidato de sódio dihidratado. A mistura foi agitada e permaneceu reagindo durante
25 min. A absorbância foi registrada em espectrofotômetro, no comprimento de onda
de 370 nm. A linha de base do equipamento foi registrada utilizando uma solução com
todos os reagentes nas proporções utilizadas com exceção da amostra, substituída
por água ultrapura. A concentração de compostos orto-difenólicos presentes no
extrato foi calculada a partir de uma curva analítica (R²=0,9993) de ácido cafeico na
faixa de concentração de 10 a 140 mg L-1. O experimento foi realizado em triplicata e
os resultados expressos como média ± desvio padrão em mg de ácido cafeico
equivalentes por g de amostra seca (mg ACE g-1).
36
4.6 ANÁLISE DE COMPOSTOS FENÓLICOS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
COM ESPECTRÔMETRO DE MASSA (LC-ESI-MS/MS)
Realizou-se extrações em triplicata, onde preparou-se os extratos foliares da
amoreira preta como no item 4.3 e em seguida foram adicionadas de 5 mL de metanol
acidificado em pH 2,0 e desengorduradas com auxílio de banho de ultrassom. Em
seguida, estes foram submetidos a três ciclos de partição com éter etílico, e os
sobrenadantes combinados foram submetidos a arraste com nitrogênio para remoção
completa dos solventes. Os extratos residuais foram suspensos em metanol e seus
volumes aferidos para 1 mL, centrifugados a 14000 rpm por 4 minutos (Eppendorf
22331, Hamburgo Alemanha). Após diluição de 10 vezes em metanol: água (70:30
v/v) foram injetados em sistema de cromatografia líquida acoplado ao detector de
massas em tandem LC-ESI-MS/MS (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemanha).
A avaliação dos compostos foi executada em sistema cromatográfico acoplado
a um espectrômetro de massas com analisador triploquadrupolo e ion trap linear, que
foi utilizado em conjunto com ionização por eletrospray em modo negativo. Os
compostos fenólicos foram separados em coluna Synergi TM (4.0 μm, 2.0 x 150 mm
d.i.; Phenomenex, USA). A fase móvel consistiu de uma solução de metanol 95 % v/v
e água 5 % v/v (A) e ácido fórmico 0,1 % v/v (B). A separação foi realizada a 30 °C
utilizando eluição por gradiente, segmentado de acordo com as seguintes etapas: 0 –
5 min, 10 % A; 5 – 7 min, 90 % A; 7 – 10 min, 90 % A; 10 – 17 min, 10 % A. O fluxo
utilizado foi de 250 µl min-1 e volume de injeção de 10 μL. As leituras foram
observadas utilizando monitoramento de reações múltiplas (MRM). A identificação dos
compostos foi realizada com base no tempo de retenção, íon precursor e seus
fragmentos através da comparação com os respectivos padrões disponíveis
comercialmente. A otimização dos parâmetros do espectrômetro de massas foi
realizada por infusão direta de soluções contendo os compostos de interesse
individualmente, apresentados na Tabela 2. O software Analyst versão 1.6.2 foi
utilizado para aquisição e tratamento dos dados. A quantificação foi realizada
monitorando um íon quantitativo selecionado para cada composto e utilizando curvas
de calibração construídas em razão dos compostos previamente identificados com os
valores da área do pico do analito versus a concentração. Os limites de detecção (LD)
e limites de quantificação (LQ) foram obtidos a partir da relação sinal ruído de 3:1 e
10:1, respectivamente (RIBANI et al, 2004). As concentrações dos compostos nas
37
amostras foram expressas como média ± desvio padrão em mg g -1 de pó seco de
folhas de amoreira preta.
Tabela 2- Analitos e fragmentos utilizados para identificação de compostos fenólicos em folhas de amoreira preta.
Composto Ion precursor (m/z) Q1 Ion precursor (m/z) Q3 Tempo de retenção (min)
Ácido Protocatecuico 136,900 109,000 6,95 Ácido 4-
hidroximetilbenzóico 150,899 104,200 8,84
Ácido clorogênico 352,863 187,800 9,19
Ácido cafeico 178,834 131,300 9,45
Ácido vanílico 166,831 148,500 9,65
Ácido siríngico 196,862 119,600 10,01
Ácido p -cumárico 163,040 119,000 10,46
Ácido ferúlico 192,856 129,700 10,73
Umbeliferona 160,802 129,500 10,78
Quercetina 301,010 149,300 10,84
Ácido salicílico 136,900 91,100 10,99
Ácido elágico 300,813 142,500 11,71
Fonte: a autora.
4.7 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS EXTRATOS
4.7.1 Sequestro De Radicais Livres (DPPH•)
A determinação da atividade antioxidante pelo método DPPH baseia-se na
redução deste radical livre, relativamente estável, DPPH (2,2 difenil-1-picrilhidrazila),
em solução metanólica, o qual, na presença de antioxidantes doadores de hidrogênio,
captura elétrons destes, mudando a coloração de violeta para amarela, passando para
sua forma estável, DPPH-H. A capacidade antioxidante foi determinada segundo
método proposto por Brand-Williams e colaboradores (1995) e Boroski e
colaboradores (2011), com algumas modificações. Os extratos da folha da amoreira
38
preta foram pipetados em volumes crescentes (50, 100, 150 e 200 μL) avolumados
para 200 μL, em seguida adicionados 3 mL da solução metanólica de DPPH (0,1192
mmol L-1). Após 30 min de reação em temperatura ambiente e ao abrigo da luz,
efetuou-se a leitura da absorbância em espectrofotômetro a 517 nm.
A capacidade de captura do radical foi determinada a partir do cálculo IC50
(Equação 1), o qual estima a concentração de antioxidante necessária para inibir 50%
do radical DPPH.
% 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑖𝑏𝑖çã𝑜 = (1 − (𝐴𝑏𝑠517 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎
𝐴𝑏𝑠517 𝑏𝑟𝑎𝑛𝑐𝑜)) ∗ 100 = (1)
Com os resultados obtidos na equação 1, foi possível realizar a curva da
atividade antioxidante em função da concentração do extrato, e assim calculado por
regressão linear a concentração necessária para a obtenção do IC50, ou seja, 50% da
atividade antioxidante. Todos os ensaios foram realizados em triplicatas e foram
expressos como média ± desvio padrão.
4.7.2 Capacidade Redutora Total
A capacidade redutora total (CRT) foi analisada pelo método de Folin Ciocalteu
modificado por Berker e colaboradores (2013). Este método considera o potencial de
redução de antioxidantes solúveis em água e também os de origem lipofílica dos
extratos. Inicialmente, isobutanol foi utilizado para diluir o reagente de Folin Ciocalteu
na proporção de 1:2 (v/v), sendo utilizados 75 μL desta solução com 50 μL dos
extratos das folhas de amoreira preta previamente diluídos em acetona, seguidos de
875 μL de uma solução de NaOH (0,10 mol L-1) e 1500 μL de água ultrapura. A mistura
resultante foi agitada em vortex por 10 segundos. Depois de 20 min de reação, a
absorbância foi registrada 665 nm contra um branco (água ultrapura), em
espectrômetro. Quercetina foi utilizada como padrão para a curva analítica (R²=
0,9983). A análise foi realizada em triplicata e os resultados expressos como média ±
desvio padrão em mg de quercetina equivalente por g de amostra seca (mg QE g-1).
39
4.8 AÇÚCAR REDUTOR
O procedimento de Lane-Eynon é baseado na capacidade dos açúcares
redutores como a glicose e frutose reduzirem o cobre na solução cuproalcalina. Os
açúcares redutores possuem grupos carbonílico e cetônico livres, que detêm a
capacidade de oxidar-se na presença de agentes oxidantes. Consequentemente por
ser um potencial interferente nas análises de fenólicos totais, faz-se necessária essa
determinação. As análises foram feitas segundo Lane e Eynon (1934). A solução de
Fehling foi primeiramente padronizada utilizando-se uma solução de glicose a 1% m/v.
A partir disso, calculou-se o fator de conversão para ser usado como parâmetro nas
análises das amostras em questão.
4.9 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
A determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi realizada por
microdiluição, de acordo com os procedimentos recomendados pelo Clinical and
Laboratory Standards Institute (CLSI, 2012). A atividade antimicrobiana será testada
frente as bactérias Escherichia coli (051), Pseudomonas aeruginosa (079) e Bacillus
cereus (047) depositadas no banco de cepas da Universidade Tecnológica Federal do
Paraná- Campus Ponta Grossa. Os inóculos foram padronizados em tubos contendo
5 mL de solução salina a 0,9% m/v esterilizada. A suspensão microbiana foi ajustada
em espectrofotômetro com comprimento de onda a 625 nm, o qual equivale a 105
UFC/mL (Unidade Formadora de Colônia).
Foram preparadas soluções estoque dos extratos de folhas de amoreira preta
na concentração de 20.000 µg mL-1 diluídos em água purificada estéril. Em uma placa
de 96 poços o extrato foi diluído em série (2.500; 1.250; 625; 312,5; 156,2; 78; 39;
19,5; 9,8; 4,9 e 2,45 µg mL-1) em caldo BHI (do inglês: Brain Heart Infusion)
esterilizado, 10 μL do inóculo de cada microrganismo foram adicionados em todos os
poços em suas respectivas placas. Como controle negativo da atividade
antimicrobiana foi utilizado clorhexidina a 0,12% m/v e positivo somente o caldo BHI.
As placas foram incubadas em estufa a 35 ± 1ºC e o crescimento bacteriano foi
indicado pela adição de 50 μL do corante microbiológico 2,3,5-trifenil cloreto de
tetrazólio (0,05% m/v) em cada poço. Bactérias viáveis reduzem o corante mudando
sua coloração para rosa e a CIM foi definida como a menor concentração da
40
substância que inibiu a mudança de coloração do corante microbiológico. Cada cepa
foi testada em microplaca distinta, e todos os testes foram realizados em triplicata.
4.10 DETERMINAÇÃO DE MINERAIS
Todas as análises foram conduzidas em um espectrômetro de massa com
plasma indutivamente acoplado (ICP-MS) da Universidade Federal de Santa Catarina
(UFSC), modelo Elan 6000, equipado com vaporizador eletrotérmico, modelo HGA
600 MS, com amostrador automático para líquidos, modelo AS-60 (Perkin ElmerSciex,
Thornhill, Canada). Gás argônio fornecidos pela White Martins (Santa Catarina, Brasil)
com pureza de 99,996% foi utilizado como gás carreador e gerador do plasma. No
Quadro 2 são descritas as condições operacionais ICP-MS. As condições
operacionais do ICP-MS encontram-se na Quadro 2.
Quadro 2- Condições operacionais do ICP-MS.
Potência de radiofrequência 1100 W
Cone Sampler/ skimmer Pt
Medida do Sinal Peak Hopping
Unidade de medida Área do pico
Resolução 0,7 u (10 % altura do pico)
Varreduras por leitura 1
Dwell time 25 ms
Leituras por replicata 55
Replicatas 3
Vazão do gás nebulizador 1,2 L min-1
Fonte: a autora.
Para o preparo das amostras utilizou-se de 0,3 g pesadas diretamente em
frascos de politetrafluoretileno (PTFE), adicionados de 4 mL de ácido nítrico e 2 mL
de peróxido de hidrogênio, e levadas a digestão em forno digestor assistida por micro-
ondas modelo DGT 100 Plus (Provecto Analítica) a 600 W. Posteriormente foram
avolumados para 30 mL e diluídas adequadamente para análise por ICP-MS.
41
A determinação de potássio foi realizada em fotômetro de chama modelo 610
MS (Analyser).
4.11 ENCAPSULAMENTO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS EM ESFERAS DE
ALGINATO
A influência do alginato de sódio no encapsulamento de compostos fenólicos
foi avaliada a partir de diferentes proporções do alginato de sódio (1;1,5 e 2% m/v).
As esferas de alginato foram obtidas dissolvendo o alginato de sódio na concentração
otimizada em 100 mL de extrato de folhas de amoreira preta obtido nas condições
ótimas de extração. Uma vez homogeneizada, foi realizada a extrusão da solução
através de uma ponteira universal de 200 µL (Kasvi) com auxílio de uma bomba
peristáltica (Watson Marlon 12OS) com fluxo de 50 μL min-1, à temperatura de 25 ±
2°C, sendo gotejada em uma solução de CaCl2 (2 mols L-1). As esferas foram mantidas
em banho gelificante para endurecer por 3 horas e depois filtradas e lavadas com
água destilada (Figura 7). Finalmente, foram pesadas e armazenadas em frascos
âmbar. As esferas também foram obtidas em branco, ou seja, apenas com água
ultrapura.
42
Figura 7- Esquema representativo do encapsulamento de extrato aquosos de folhas de Morus nigra L. em alginato.
Fonte: a autora.
Após obtenção dos encapsulados, as esferas foram divididas em esferas
úmidas e secas, as primeiras sendo mantidas em líquido (tanto no próprio extrato de
amoreira preta quanto em soro fisiológico) e as segunda parte sendo desidratadas em
estufa a 40 ± 0,1°C posteriormente armazenadas em frascos âmbar e mantidas em
dessecador com sílica a 4 ± 2°C até o momento das análises.
Para análises de compostos fenólicos totais do extrato encapsulado,
aproximadamente 1 g de esferas foi dissolvido em uma solução aquosa de citrato de
sódio (5 g/100 ml) sob agitação em vórtex a 37 ± 2°C. Posteriormente a concentração
de CFT foi determinada conforme item 4.5.1.
4.11.1 Eficiência De Encapsulamento (EE)
A porcentagem de eficiência de encapsulamento (EE) foi calculada usando a
Equação 2 (ARRIOLA et al, 2016).
43
𝐸𝑓𝑖𝑐𝑖ê𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝐸𝑛𝑐𝑎𝑝𝑠𝑢𝑙𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 (𝐸𝐸, %) = (𝐿𝐿0
⁄ ) 𝑥 100 (2)
Onde L é a composição fenólica total (CFT) na solução de citrato de sódio de
esferas de alginato dissolvidas e o L0 a CFT no extrato otimizado inicial.
O CFT carregado nas esferas foi determinado em triplicata como descrito
anteriormente no item 4.5.1. A EE das esferas de alginato úmidas e nas esferas
desidratadas foram determinadas imediatamente após o encapsulamento.
4.11.2 Caracterização Das Esferas De Alginato De Cálcio
Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
As características morfológicas das esferas foram obtidas através de um
microscópio eletrônico de varredura (Tescan, Vega 3 LMU), operando numa tensão
de aceleração de 15 kV, acoplado a um espectroscópio de energia dispersiva (EDS)
(AZTec Energy X-Act, Oxford). As amostras foram recobertas com ouro por sputtering,
devido a esse preparo da amostra, apenas as esferas desidratadas puderam ser
analisadas.
Espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR)
Foram utilizadas técnicas com pastilha de KBr. O experimento de FTIR foi
realizado em um espectrofotômetro da marca Shimadzu, modelo IR Prestige-21 com
transformada de Fourier da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC).
4.11.3 Estudo Cinético Da Liberação De Compostos Fenólicos Em Água
O estudo da cinética de liberação de fenóis em água permite observar o tempo
e a porcentagem de liberação do princípio ativo. Massa de esferas úmidas (25 g) e
esferas secas (0,6 g) foram colocadas em um béquer com 125 mL de água ultrapura.
O sistema foi mantido na temperatura ambiente, sob agitação. Após certos intervalos
de tempo (0, 5, 10, 20, 30, 60, 90, 120, 180 e 240 min) retirou-se uma alíquota e estas
foram analisadas frente a concentração de fenóis totais utilizando o ensaio Folin-
44
Ciocalteau descrito anteriormente. Os experimentos foram realizados em triplicata. A
porcentagem de compostos fenólicos liberados em água foi calculada conforme
Equação 3.
𝐶𝑜𝑚𝑝𝑜𝑠𝑡𝑜𝑠 𝐹𝑒𝑛ó𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠 𝑙𝑖𝑏𝑒𝑟𝑎𝑑𝑜𝑠 (%) = (𝑀𝑡
𝑀∞⁄ ) 𝑥 100 (3)
Onde (Mt / M∞) representa a fração de massa liberada no tempo t (Mt) em
relação à massa máxima de fenólicos que seria liberada no tempo t =∞ (ARRIOLA et
al, 2016).
4.11.4 Teste De Estabilidade
A estabilidade das esferas úmidas foi verificada em 4 condições experimentais
diferentes, as quais foram armazenadas em frascos âmbar com soro fisiológico 0,9%
m/v e também no próprio extrato de folhas de amoreira preta, mantidos em geladeira
a 4 ± 0,1°C e em temperatura ambiente. As esferas secas foram armazenadas em
frasco âmbar em geladeira a 4 ± 0,1°C e em temperatura ambiente (Figura 8).
Figura 8- Esquema representativo do teste de estabilidade das esferas úmidas e secas.
Fonte: a autora.
45
Esferas em branco foram mantidas nas mesmas condições para minimizar
interferências na análise de fenóis. As medidas de compostos fenólicos totais foram
realizadas em triplicata em intervalos de tempo de 7 dias inicialmente e depois a cada
15 dias perfazendo um total de 81 dias.
4.12 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Todas as metodologias foram realizadas individualmente e em triplicata. Os
resultados foram expressos pela média ± desvio padrão. A análise estatística foi
realizada utilizando os softwares Sasm-Agri, Origin® 8 e Statistica versão 10 (Statsoft,
Tulsa, OK, EUA). Os resultados obtidos foram submetidos a análise de variância
(ANOVA), assumindo p<0,05 (5%) seguida de comparação de médias pelo teste
Tukey.
46
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL
Visando simular a preparação natural de chá de folhas de amoreira preta a
agua foi escolhida como solvente de extrator. Outro motivo da escolha de extração
aquosa é que um dos maiores desafios na extração de compostos bioativos naturais
é a toxicidade alta dos solventes orgânicos e na quantidade de resíduos gerados.
Dessa forma seria o protocolo mais adequado uma vez que posteriormente esses
extratos seriam encapsulados (CHEMAT; VIAN; CRAVOTTO, 2012).
O conteúdo fenólico total, em relação às variáveis independentes temperatura
de secagem, temperatura de infusão e tempo de extração está apresentado na Tabela
3. Houve diferença estatística (p<0,001) entre as amostras, variando de 16,96 ± 0,15
a 5,73 ± 0,33 mg GAE g-1. A literatura traz alguns estudos sobre a M. nigra, entretanto
não foram encontrados trabalhos de avaliação dos compostos fenólicos totais através
da extração com água nestes moldes de análise. Resultados semelhantes foram
reportados por outros autores que encontraram em folhas de M. nigra coletadas na
Espanha, estudo em que utilizou-se extração assistida por ultrassom e metanol
aquoso acidificado com éter, resultando em valores de CFT entre 13,48 ± 0,46 e 16,13
± 0,55 mg GAE g-1 (SÁNCHEZ-SALCEDO et al, 2015b).
Um estudo revelou que solventes com alta polaridade, como a água podem
resultar em extratos com impurezas, como ácidos orgânicos e açúcares redutores
podendo interferir na quantificação dos compostos fenólicos (VIZZOTTO; PEREIRA,
2011). A fim de não superestimar o conteúdo de fenólicos totais, foi realizada análise
de açúcar redutor (AR) nos extratos aquosos de folhas de amoreira preta, as quais
demonstraram valor muito baixo de AR de 0,03 ± 0,01 mg g-1. Dessa forma, considera-
se que as leituras de valores de compostos fenólicos não foram afetadas pela
concentração de açúcares redutores, já que essa concentração encontra-se dentro
dos limites de desvio padrão das análises.
Kim e colaboradores (2014), encontraram 23,2 mg GAE g-1 em extratos
metanólicos de folhas de amoreira branca coletadas nas províncias da Coreia
(Daejeon) no período de setembro. Valores superiores de CFT (21,05 e 23,34 mg GAE
g-1) foram relatados por Koyu e colaboradores (2017) em seus experimentos com
extração assistida por ultrassom, utilizando água subcrítica em frutos de Morus nigra.
47
Entretanto características ambientais, parte da planta utilizada, tipo de solo, espécie,
região de cultivo e condições de extração exercem grande influência na composição
fenólica (DALMAGRO et al, 2018; KATSUBE et al, 2009; MEMON et al, 2010;
ERCISLI; ORHAM, 2008).
Tabela 3- Valores médios e desvio padrão do conteúdo fenólico total de extratos aquosos de folhas de amoreira preta.
Ensaios Temperatura de
secagem (°C) Temperatura de
infusão (°C) Tempo (min)
Conteúdo Fenólico Total (mg GAE g-1)
1 1 (50 ± 1,0) 1 (70 ± 0,1) 1 (10) 12,59 ± 0,54c
2 -1 (100 ± 1,0) 1 (70 ± 0,1) 1 (10) 5,73 ± 0,33g
3 1 (50 ± 1,0) -1 (96 ± 0,1) 1 (10) 16,61 ± 0,53a
4 -1 (100 ± 1,0) -1 (96 ± 0,1) 1 (10) 8,09 ± 0,26ef
5 1 (50 ± 1,0) 1 (70 ± 0,1) -1 (30) 14,28 ± 0,34b
6 -1 (100 ± 1,0) 1 (70 ± 0,1) -1 (30) 7,09 ± 0,29f
7 1 (50 ± 1,0) -1 (96 ± 0,1) -1 (30) 16,96 ± 0,15a
8 -1 (100 ± 1,0) -1 (96 ± 0,1) -1 (30) 8,98 ± 0,24e
9 0 (75 ± 1,0) 0 (83 ± 0,1) 0 (20) 11,30 ± 0,45d
p-valor (ANOVA) <0,001
Letras distintas na mesma coluna indicam diferença estatística significativa ao nível de 5% pelo teste de Tukey. Fonte: a autora.
A utilização de diferentes solventes orgânicos na extração de compostos
fenólicos de folhas de amoreira dificulta a comparação dos resultados dos diferentes
trabalhos publicados. A concentração de compostos fenólicos em folhas de amoreira
preta foi superior quando comparada a outras infusões de plantas medicinais:
valeriana 9,8 ± 0,3 mg GAE g-1 (Valeriana officinalis L.), anil verde 15,9 ± 0,4 mg GAE
g-1 (Pimpinella anisum L.), flor da paixão 14,9 ± 1,2 mg GAE g-1 (Passiflora
incarnata L.) e camomila 6,0 ± 0,4 mg GAE g-1 (Matricaria chamomilla L.) (HERRERA
et al, 2018).
48
Menor temperatura de secagem (50°C), maior temperatura de infusão (96°C) e
tempos de infusão de 10 e 30 minutos respectivamente, apresentaram maiores
conteúdos de compostos fenólicos totais, conforme os dados da Tabela 3.
Para entender melhor o comportamento do sistema, a Tabela 4 fornece
resultados sobre os efeitos das variáveis e os coeficientes de regressão e assim é
possível verificar se os fatores (variáveis independentes) foram significativos.
Tabela 4- Estimativa dos efeitos para o conteúdo fenólico total.
Fonte: a autora.
O p-valor pode variar de 0 a 1 e simboliza a probabilidade ou chance de o efeito
observado pelas variáveis ser devido ao acaso, e não aos fatores que estão sendo
analisados. Para que os efeitos observados sejam significativos estatisticamente o p-
valor deve ser menor ou igual a 0,05 assumindo como margem de segurança 5% de
chances de erro (FERREIRA; PATINO, 2015). Portanto estatisticamente para o
método do conteúdo fenólico total, o modelo experimental, a curvatura e todas as
variáveis independentes (temperatura de secagem, temperatura de infusão e tempo)
foram significativas.
A quantidade de compostos fenólicos presentes teve uma queda média de 8%
na secagem das folhas em temperatura de 100ºC em relação à temperatura de 50ºC.
Ao utilizar temperatura de infusão a 96°C o CFT aumentou é em média 3% do que em
temperatura de 70°C. Os efeitos da temperatura de secagem sobre a estabilidade de
compostos fenólicos também foram investigados por Larrauri e colaboradores
(1997), que ao analisarem o CFT em cascas de bagaço de uva vermelha, observaram
Fatores Efeito Erro padrão
tcalc p-valor Limite de confiança (-95%)
Limite de confiança (+95%)
Temperatura de secagem (°C) -7,6400 0,1511 -50,5657 0,0000 -7,9574 -7,3226
Temperatura de infusão (°C) 2,7383 0,1511 18,1238 0,0000 2,4209 3,0558
Tempo (min) 1,0733 0,1511 7,1039 0,0000 0,7559 1,3908
Interação temperaturas de secagem e infusão (°C)
0,6150 0,1510 4,0704 0,0007 0,9324 0,2975
49
que a secagem em estufa a 60°C não afetou a estabilidade, mas houve uma redução
considerável do CFT quando secas a 100°C.
Com o Gráfico de Pareto (Gráfico 1) é possível uma melhor compreensão visual
do comportamento do CFT em relação as variáveis independentes e suas interações.
A linha em vermelho indica a região onde as variáveis devem alcançar para
demonstrar significância estatística. Deste modo pode-se visualizar que as variáveis
temperatura de secagem, temperatura de infusão e tempo foram significativas para o
conteúdo fenólico total, assim como as interações entre a temperatura de secagem
das folhas e a temperatura de infusão, como também entre temperatura de infusão e
o tempo de extração.
Gráfico 1- Efeito da temperatura de secagem, temperatura de infusão e tempo no conteúdo fenólico total de folhas de amoreira preta.
Fonte: a autora.
A Reta de Equalidade (Gráfico 2) é outra maneira de representar a
confiabilidade do modelo estatístico proposto. Segundo Oldoni e colaboradores
(2015), esta reta estabelece relações entre os valores observados com os valores
preditos pelo modelo. Assim quanto menor for a dispersão dos valores observados
em relação à reta que representa os valores preditos, melhor e mais ajustado é
50
considerado o modelo estatístico. É possível afirmar que houve pouca dispersão dos
valores observados em relação a reta de valores preditos, confirmando assim o bom
ajuste do modelo.
Gráfico 2- Valores preditos versus valores observados pelo conteúdo fenólico total.
Fonte: a autora.
Esta análise pode ser confirmada pelo gráfico de superfície de resposta
(Gráfico 3) o qual avalia a influência de duas variáveis independentes em relação a
resposta desejada.
51
Gráfico 3- Gráficos de superfície de resposta para conteúdo fenólico total em função de: Temperatura de secagem versus Temperatura de infusão (A); Temperatura de secagem versus Tempo (B); Temperatura de infusão versus Tempo (C).
Fonte: a autora.
Analisando os gráficos de superfície de resposta é possível observar que todos
os gráficos apresentaram inclinação ascendente, as regiões ótimas de extração estão
localizadas onde se obtém as maiores concentrações de CFT. Como não foi
observado uma curvatura significativa, procura-se a condição em direção da região
ótima de extração. A realização de novos experimentos, deslocando os experimentos
em direção a condição ótima não é possível, já que a temperatura máxima de extração
52
é limitada pelo banho ultratermostático e além disso o objetivo deste estudo é simular
o preparo natural e caseiro de uma infusão das folhas de amoreira preta.
Conforme pode ser observado no Gráfico 3, a temperatura de secagem foi a
variável independente (fator) que obteve maior significância dentre os três fatores
analisados, sendo que a sua significância é atribuída à condição +1, que se refere à
utilização da temperatura de secagem das folhas a 50°C. A temperatura de infusão foi
a segunda variável independente (fator) que obteve maior efeito e a sua significância
é atribuída à condição -1, demonstrando que é mais significativo utilizar uma
temperatura de infusão a 96°C do que 70°C, que no caso deste estudo, foi a matriz
que apresentou maior percentual de conteúdo fenólico total. Embora o tempo tenha
se mostrado significativo estatisticamente, seu efeito é muito menos pronunciado do
que o efeito dos dois outros fatores principais, sendo que um menor tempo implicaria
em menor gasto de energia.
A Tabela 5 apresenta de forma reduzida a tabela da ANOVA para o conteúdo
fenólico total onde todos os parâmetros foram significativos para um nível de 99% de
intervalo de confiança. O coeficiente de correlação foi de R²=0,9932 indicando que o
modelo foi predito e foi adequado.
Tabela 5- Tabela da ANOVA para o conteúdo fenólico total.
Fatores Soma dos quadrados
Graus de liberdade
Quadrado médio
F-calculado p-valor
Temperatura de secagem (°C) 350,2176 1 350,2176 2410,6708 0,0000
Temperatura de infusão (°C) 44,9908 1 44,9908 309,6876 0,0000
Tempo (min) 6,9123 1 6,9123 47,5796 0,0000
Interação temperaturas de secagem e infusão (°C)
2,2694 1 2,2694 15,6207 0,0009
Erro 2,7603 19 0,1453
Total SS 408,3895 26
Fonte: a autora.
53
Temperaturas de secagem elevadas podem provocar alterações físicas e
químicas que influenciam a estabilidade dos fitoquímicos encontrados na amostra. Os
resultados deste estudo são coerentes com os de Sagrin e Chong (2013), embora em
outros moldes de secagem, relataram uma queda de 11,949 ± 0.847% na
concentração de compostos fenólicos em folhas de bananeira, quando em
temperatura de secagem foi aumentada de 50 para 60°C.
De forma oposta à que acontece na temperatura de secagem, na infusão
temperaturas elevadas podem auxiliar na extração de fenólicos. O aquecimento
possibilita uma permeabilidade maior das paredes celulares, consequentemente a
solubilidade e a difusão dos compostos a serem extraídos são aumentados além da
diminuição da viscosidade dos solventes o que facilitaria a extração (OLIVEIRA,
2014).
Recentemente Casagrande e seus colaboradores (2018) ao investigarem a
influência da temperatura de extração no conteúdo fenólico total em alecrim do campo,
observaram que ao aumentar a temperatura de 40 para 80°C resultou em um aumento
de 50% no CFT. Rajha e colaboradores (2014), por meio de um planejamento fatorial
para otimizar a extração etanólica em amostras de uvas alcançaram maior
quantificação de CFT a temperatura de extração de 94°C.
5.2 COMPOSIÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS EXTRATOS DE
AMOREIRA PRETA
As melhores condições de extração obtidas pelas quantificações de CFT,
temperatura de secagem a 50°C, temperatura de infusão a 96°C e tempo de extração
de 10 minutos, foram fixadas para análise das diferentes metodologias. Nesta
condição foram realizadas análises de flavonoides totais, orto-difenólicos, flavonóis
totais, capacidade redutora total, açúcares redutores e capacidade antioxidante. Os
resultados são apresentados na Tabela 6.
54
Tabela 6- Valores médios e desvio padrão da composição fenólica (classes) dos extratos aquosos de Morus nigra L., e capacidade redutora total e capacidade antioxidante.
Equivalente de Catequina (CAE); Equivalente de Ácido Cafeico (ACE); Equivalente de Quercetina (QE). Fonte: a autora.
Thabti e colaboradores (2012) constataram concentração de flavonoides totais
de 1,93 a 3,98 mg RE g-1 (Equivalente de Rutina) em folhas de diferentes espécies de
amoreira com extração água/metanol (1: 1, v / v) em banho maria a 80°C por 15
minutos. Os resultados obtidos indicam que as concentrações de flavonoides totais
foram de 4,01 ± 0,16 mg CAE g-1, sendo estes semelhantes aos relatados na literatura.
A literatura descreve os flavonoides como um grupo de compostos conhecidos
por sua ação antioxidativa. Essa capacidade antioxidante tem grande ligação com a
parte estrutural do flavonoide, ou seja, o número de substituintes hidroxil é um dos
fatores que definem o quão forte será tal atividade. Assim, os flavonoides reagem com
muitos radicais livres estabelecendo agrupamentos estáveis através da junção das
ligações duplas de suas cadeias carbônicas (PINHEIRO; JUSTINO 2012).
A concentração de flavonóis totais nos extratos de folha de amoreira preta
foram de 2,67 ± 0,13 mg QE g-1. Não foram reportados na literatura resultados para
concentração de flavonóis totais por espectrofotometria em folhas de nenhuma
espécie de amoreira. Entretanto resultados superiores de flavonóis totais entre
5,60 ± 0,20 a 6,64 ± 0,43 mg QE g- 1 foram observados em extratos aquosos de
rooibos vermelhos (Aspalathus linearis) (SANTOS et al, 2016). Os flavonóis são uma
classe de flavonoides bastante disseminado no reino vegetal, moléculas importantes
na eliminação de radicais livres, ou seja, são significativos na promoção da saúde
(PIETTA, 2000).
A concentração de orto-difenólicos foi de 2,83 ± 0,25 mg ACE g-1 em folhas de
M. nigra. Concentrações reduzidas deste composto são esperados uma vez que, é
responsável pelo escurecimento de infusões. Ao estudarem chás de Camellia
sinensis, Granato e colaboradores (2014), encontraram valores de 336 a 586 mg L-1
para orto-difenólicos e observaram ainda que a exposição a grandes tempos de
Flavonoides totais (mg CAE g-1)
Flavonóis totais (mg QE g-1)
Orto-difenólicos (mg ACE g-1)
Capacidade Redutora total (mg QE g-1)
DPPH (IC50
mg ml-1)
4,01 ± 0,16 2,67 ± 0,13 2,83 ± 0,25 27,69 ± 0,46 0,94 ± 0,12
55
oxidação pode gerar menores concentrações deste composto. Segundo Ramsden e
Riley (2014), os orto-difenóis podem ser formados a partir da ação das enzimas
catecolases que possuem cobre no centro ativo atuando no interior de células
vegetais, animais e de fungos.
Os valores encontrados para a capacidade redutora total e IC50 foram de 27,69
± 0,46 mg QE g-1 e 0,94 ± 0,12 mg mL-1 respectivamente. Mazimba e colaboradores
(2011), demonstraram uma atividade antioxidante superior em extratos metanólicos
da casca de M. nigra com IC50 de 71,2 a 73,1 μg. mL-1. Resultados semelhantes foram
registrados por Dalmagro e colaboradores (2018), que observaram valores de
atividade antioxidante em extratos aquosos de folhas de amoreira preta de IC50 de
1,25 mg mL-1. Um estudo realizado anteriormente para o ensaio com DPPH revelou
que extratos metanólicos de M. alba exibiram atividade antioxidante de 6,65 mg mL-1
e para extrato aquoso apresentou atividade de 5,59 mg mL-1 (THABTI et al, 2014).
Essa capacidade antioxidante em extratos aquosos de folhas de Morus nigra
tem sido demonstrada em estudos in vivo. Volpato e colaboradores (2011), verificaram
que uma dose de 400 mg/kg/dia ofertada a ratas Wistar grávidas diabéticas e não
diabéticas. Além de apresentarem redução nas taxas de colesterol total, colesterol
LDL (low density lipoproteins) e triglicerídeos, foi observado também que a oferta do
extrato aquoso elevou os níveis sanguíneos da enzima superóxido dismutase,
demonstrando que os extratos aquosos das folhas de amoreira preta apresentam
ação antioxidante.
5.3 ANÁLISE DO PERFIL FENÓLICO DOS EXTRATOS POR LC-ESI-MS/MS
5.3.1 Parâmetros De Desempenho Analítico Para Análise
A faixa linear, o coeficiente de determinação, os limites de detecção (LOD) e
quantificação (LOQ) e desvio padrão relativo (RSD) obtidos a partir dos dados de
calibração dos padrões utilizados nas análises por LC-ESI-MS/MS são apresentados
na Tabela 7.
56
Tabela 7- Parâmetros de desempenho analítico para determinação de compostos fenólicos por LC-ESI-MS/MS.
Composto Faixa linear (mg L-1)
R² LOD (mg L-1) LOQ (mg L-1) RSD (%)
Ácido Protocatecuico 0,08 - 1,00 0,9957 0,021 0,068 0,969 Ácido 4-
hidroximetilbenzóico 0,05 - 6,18 0,9978 0,001 0,003 2,676
Ácido clorogênico 0,03 - 2,36 0,9952 0,003 0,009 7,619
Ácido cafeico 0,05 - 4,00 0,9917 0,015 0,050 4,553
Ácido vanílico 0,40 - 3,00 0,9852 0,007 0,022 5,279
Ácido siríngico 0,08 - 6,00 0,9958 0,001 0,002 1,138
Ácido p-cumárico 0,31- 4,08 0,9937 0,001 0,005 1,819
Ácido ferúlico 0,06 - 0,61 0,9946 0,007 0,025 9,698
Umbeliferona 0,08 - 6,06 0,9903 0,010 0,035 9,183
Quercetina 0,08 - 3,21 0,9973 0,011 0,036 0,819
Ácido salicílico 0,10 - 4,00 0,9955 0,004 0,013 1,559
Ácido elágico 0,05 - 6,00 0,9995 0,010 0,020 1,610
Fonte: a autora
Coeficientes de correlação maiores do que 0,99 foram obtidos, exceto para o
padrão ácido vanílico, indicando boas correlações entre as concentrações dos
compostos investigados e as áreas das bandas, no intervalo estudado das curvas de
calibração.
Conforme Ribani e colaboradores (2004), o limite de detecção é definido como
a menor concentração do composto que está sendo analisado e que pode ser
detectado, mas não necessariamente quantificado pelo método experimental, já o
limite de quantificação é caracterizado como a menor concentração do composto sob
as condições experimentais estabelecidas que pode ser quantificado.
A precisão do método proposto foi avaliada por meio do desvio padrão relativo
(RSD), o qual apresentou resultados entre 0,819% e 9,698%, demonstrando uma boa
precisão.
57
5.3.2 Perfil Fenólico Dos Extratos De Amoreira Preta
Os extratos de folhas amoreira preta também foram identificados e
quantificados por LC-ESI-MS/MS. As concentrações dos compostos, os íons
precursores juntamente com o tempo de retenção estão descritos na Tabela 8 e
cromatogramas Figura 9.
Tabela 8- Valores médios e desvio padrão dos compostos fenólicos identificados e quantificados por LC-ESI-MS/MS em extratos de folhas de amoreira preta.
Pico Composto Concentração (mg g-1)
Ion precursor (m/z) Q1
Ion precursor (m/z) Q3
Tempo de retenção (min)
1 Ácido protocatecuico 1,247 ± 0,068 136,900 109,000 6,95
2 Ácido 4-
hidroximetilbenzóico 0,062 ± 0,003 150,899 104,200 8,84
3 Ácido clorogênico 0,029 ± 0,003 352,863 187,800 9,19
4 Ácido cafeico 0,142 ± 0,015 178,834 131,300 9,45
5 Ácido vanílico 0,030 ± 0,002 166,831 148,500 9,65
6 Ácido siríngico 0,007 ± 0,001 196,862 119,600 10,01
7 Ácido p-cumárico 0,004 ± 0,001 163,040 119,000 10,46
8 Ácido ferúlico 0,096 ± 0,004 192,856 129,700 10,73
9 Umbeliferona 0,261 ± 0,009 160,802 129,500 10,78
10 Quercetina 2,429 ± 0,538 301,010 149,300 10,84
11 Ácido salicílico 0,028 ± 0,002 136,900 91,100 10,99
12 Ácido elágico 0,045 ± 0,001 300,813 142,500 11,71
Fonte: a autora.
58
Figura 9- Cromatograma das análises de LC-ESI-MS/MS em extratos de folhas de amoreira preta.
Numeração dos picos: 1, ácido protocatecuico; 2, ácido 4-hidroximetilbenzóico; 3, Ácido clorogênico; 4, ácido cafeico; 5, ácido vanílico; 6, ácido siríngico; 7, ácido p-cumárico; 8, ácido ferúlico; 9, umbeliferona; 10, quercetina; 11, ácido salicílico; 12, ácido elágico. Fonte: a autora.
A quercetina (10) foi o composto majoritário encontrado no extrato de folhas de
amoreira preta em uma concentração aproximada de 2,429 mg g-1 por peso seco da
amostra. Segundo estudos a quercetina é um flavonoide que possui grande ação
anticancerígena principalmente reduzindo os sistemas associados a tumores,
englobando estresse oxidativo, morte celular e metástase. Tais funções biológicas
relacionadas a quercetina tem chamado a atenção como um potente coadjuvante na
quimioterapia (BAGHEL et al, 2016). Certos autores identificaram a quercetina como
um dos componentes mais abundantes em folhas de amoreira (ENKHMAA et al,
2005; KATSUBE et al, 2006). Pesquisas com camundongos evidenciaram que o
consumo dietético de folhas de amoreira atenuou o desenvolvimento de lesões
ateroscleróticas, sendo esses efeitos atribuídos à quercetina (ENKHMAA et al, 2005).
O segundo composto em maior quantidade foi o ácido protocatecuico com
concentração de 1,247 ± 0,068 mg g-1 por peso seco da amostra. Valores inferiores
foram reportados por Radojković e colaboradores (2016) em seus estudos com
extratos de folhas de Morus nigra e alba obtidos por maceração e fluido supercrítico,
tendo quantificado concentrações de ácido protocatecuico de 0,4365 a 0,7369 mg g-
1. Recentemente Nastić e colaboradores (2018) também identificaram este composto
em folhas de Morus nigra comercializadas na Sérvia. Este ácido fenólico, derivado do
59
ácido benzóico, tem sido estudado por suas propriedades antioxidantes, a qual foi
determinada in vitro por meio da quelação de íons metálicos e eliminação de espécies
reativas de oxigênio (LI et al, 2011).
O ácido cafeico é um composto fenólico que também possui ação antioxidante,
atua principalmente na neutralização de radicais livres que possam causar danos
oxidativos nas membranas celulares. É um dos ácidos hidroxicinâmicos bastante
difundidos e podem ser encontrados em diversas formas como ésteres e amidas
(GÜLÇIN, 2006). Conforme a Tabela 10 o ácido cafeico (4) apresentou-se em
quantidades significativas no extrato de folhas de amoreira preta com 0,142 ± 0,015
mg g-1. De acordo com Thabti e colaboradores (2012), os quais em suas pesquisas
com extratos metanólicos de folhas de amoreira branca constataram que o ácido
cafeico era majoritário (15,8401 mg g-1). Há vários relatos deste composto como
constituintes em folhas de Morus alba e Morus nigra (RADOJKOVIC et al, 2016;
THABTI et al, 2012), enquanto que em extratos de dimetilsulfóxido de frutos de Morus
nigra este ácido não foi encontrado (TURAN et al, 2017).
Ácido ferúlico (8) apresentou concentração de 0,096 ± 0,004 mg g-1. Memon e
colaboradores (2010), não detectaram em extratos metanólicos utilizando LC-MS-MS
de folhas de Morus alba e nigra cultivadas no Paquistão. Apesar disso em folhas de
Morus leavigata utilizando metanol e banho ultrassônico na extração de compostos
fenólicos obtiveram valores para ácido ferúlico de 0,134 mg g-1, resultados similares
aos descritos neste trabalho. Mas a vantagem da utilização da água como solvente
extrator viabiliza para aplicações futuras pois não é tóxico e não gera resíduos.
Outros derivados do ácido benzóico foram encontrados nos extratos foliares da
amoreira preta, como os ácidos vanílico, siríngico, 4-hidroximetilbenzoico, salicílico e
elágico em menores concentrações. Foram encontrados também os ácidos p-
cumárico e clorogênico que são derivados do ácido cinâmico. Os ácidos clorogênico,
vanílico, siríngico e p-cumárico já haviam sido relatados na literatura como
constituintes em folhas de Morus nigra (MEMON et al, 2010; RADOJKOVIC et al,
2012; RADOJKOVIC et al, 2016; SANCHEZ-SALCEDO et al, 2015b; DALMAGRO et
al, 2018). Em contrapartida os ácidos 4-hidroximetilbenzoico, salicílico e elágico não
foram mencionados nesta espécie em nenhum trabalho cientifico.
O composto umbeliferona (9) com concentração de 0,261 ± 0,009 mg g-1,
destacou-se por ser a terceira substância em maior quantidade, sendo a primeira vez
que a umbeliferona é relatada em folhas da espécie de Morus nigra L. Dugo e
60
colaboradores (2009), em seus estudos com extratos etanólicos de folhas de Morus
alba obtidos por maceração utilizando sistema de HPLC acoplado a um espectrômetro
de massas, também identificaram essa molécula. A umbeliferona é uma cumarina, e
esta, por sua vez, é um metabólito fenólico, sintetizada principalmente por plantas
podendo fornecer defesa contra patógenos e atuando na regulação do estresse
oxidativo e hormonal (BOURGAUD et al, 2006). Diversas ações biológicas são
atribuídas a esses compostos, tais como atividade antifúngica, atenuação de danos
renais e propriedades antioxidantes (PAN et al, 2017; GARUD; KULKARNI, 2017;
HOULT; PAYA, 1996).
5.4 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
A confirmação da concentração inibitória mínima dos extratos foi verificada
após a adição do corante microbiológico nos poços e havendo formação de coloração
vermelha evidencia-se o crescimento microbiano. Neste caso, a conclusão seria de
que o extrato não é capaz de inibir o crescimento do microrganismo avaliado. Por
outro lado, quando apresentaram alteração de cor possuem ação bactericida
(GABRIELSON et al, 2002). Os valores de CIM dos extratos contra as bactérias E.
coli, P. aeruginosa e B. cereus estão apresentados na Figura 10. O extrato de folhas
de amoreira preta apresentou ação bactericida frente as bactérias analisadas com
valores de CIM de 625 e 1250 µg mL-1, sendo mais suscetível para a bactéria P.
aeruginosa.
61
Figura 10. Concentração inibitória mínima (CIM) de extratos de folhas de Morus nigra L.
Fonte: a autora.
A busca por agentes antibacterianos naturais tem sido extensivamente
explorada principalmente para preservação biológica de alimentos assim como no
combate a várias patologias humanas e síndromes de imunodeficiência, em razão do
uso indiscriminado de antibióticos tornando as bactérias resistentes a agentes
quimioterápicos (MO et al, 2008; YAP et al, 2014).
Valores de CIM de 400 µg mL-1 foram descritos por Omidiran e colaboradores
(2012) ao testarem extratos aquosos de folhas de M. alba contra P. aeruginosa. Este
mesmo autor relata valores de CIM de 600 µg mL-1 contra E. coli. Sucos frescos de
amora (M. nigra) também demonstraram efeito bactericida contra bactérias Gram
positivas e negativas (KHALID; FAWAD; AHMED, 2011).
Os extratos de amoreira preta podem ser promissores como agentes
antimicrobianos naturais pois foram capazes de inibir a bactéria gram-negativa como
as bactérias gram-positivas avaliadas.
62
5.5 DETERMINAÇÃO DE MINERAIS
5.5.1 Parâmetros De Desempenho Analítico Para Os Minerais
Os limites de detecção (LOD) e quantificação (LOQ) obtidos para a
determinação de minerais em folhas de amoreira preta, são apresentados na Tabela
9. O LOD na ordem de mg Kg-1 foi calculado considerando 3 vezes o desvio padrão
de dez leituras do branco da amostra dividido pelo valor da inclinação da curva. Os
valores obtidos de LD variaram entre 0,03 e 1,80 mg Kg-1 demonstrando que a
sensibilidade do método proposto é adequada. Para os limites de quantificação (LOQ)
os cálculos são definidos como 3,3 vezes o LOD.
Os valores para o desvio padrão relativo (RSD) em todos os elementos
apresentaram-se menores que que 10%, indicando boa precisão do método. A faixa
linear foi de 1 a 200 ug/L para todos os elementos exceto para potássio, pois o
equipamento faz a calibração com um único padrão de 100 mg L-1.
Tabela 9- Figuras de mérito para determinação de minerais por ICP MS e fotometria de chama.
Elementos LOD (mg Kg-1) LOQ (mg Kg-1)
Co 0,03 0,10
Ni 0,03 0,10
Al 0,30 1,00
Mn 1,80 6,00
Zn 0,15 0,50
Cu 0,06 0,18
Mg 0,04 0,12
V 0,40 1,30
Fe 0,40 1,30
K 0,30 1,00
Fonte: a autora.
63
5.5.2 Perfil Mineral Dos Extratos De Amoreira Preta
Os resultados dos perfis minerais do extrato de folhas de Morus nigra estão
apresentadas na Tabela 10. As análises foram realizadas em triplicata e os resultados
são expressos como média ± desvio padrão.
Entre os elementos microminerais determinados, cobre (Cu), ferro (Fe), zinco
(Zn), vanádio (V), cobalto (Co), níquel (Ni), alumínio (Al) e manganês (Mn), as
concentrações mais altas foram determinadas para ferro na concentração de 579,85
± 0,68 mg Kg-1. Já em relação aos nutrientes necessários à saúde em maior
quantidade, os macrominerais, potássio (K) e magnésio (Mg) e apresentaram
concentrações de 913,33 ± 11,55 e 691,80 ± 21,91 mg Kg-1, respectivamente, sendo
potássio o elemento predominante entre todos os minerais analisados.
Tabela 10- Concentração de minerais em folhas de amoreira preta expressos como média ± desvio padrão.
Elementos mg Kg-1 de amostra seca
Co 0,08 ± 0,01
Ni 0,44 ± 0,04
Al 77,55 ± 7,12
Mn 119,84 ± 9,01
Zn 22,94 ± 0,13
Cu 4,74 ± 0,18
Mg 691,80 ± 21,91
V 0,79 ± 0,05
Fe 579,85 ± 0,68
K 28333,5 ± 577,15
Fonte: a autora.
Yigit colaboradores (2010), ao estudarem o conteúdo mineral de folhas de
Morus nigra coletadas em uma região da Turquia, usando um método de fluorescência
por raios-X constaram valores de potássio 15902,1 ± 213,0 ppm, inferiores aos
64
encontrados neste trabalho. Entretanto essas concentrações podem variar de acordo
com diferentes de espécies, práticas agrícolas, região, condições de solo e clima. A
predominância do potássio é observada em diversos trabalhos na literatura
relacionadas a investigação de minerais em plantas, uma vez que essa espécie
metálica é vital para muitos processos nos vegetais, tais como ativação de sistemas
enzimáticos, participação na fotossíntese e respiração, atividade estomática e
regulação osmótica (HOLDAWAY-CLARKE; HEPLE 2003; KIM et al, 2010). O
potássio é indispensável ao organismo humano pois participa do equilíbrio ácido-base,
balanço hídrico, age na conversão da glicose em glicogênio e na condução de
impulsos nervosos (HE; MACGREGOR, 2001).
Os resultados para o conteúdo de magnésio 691,80 ± 21,91 mg Kg-1 são
superiores aos reportados para folhas de Morus alba em um estudo de variação
sazonal, em que foram relatadas concentrações de magnésio de 4,4 a 4,8 mg Kg-1 de
matéria seca (VENTO et al, 2017). Para os frutos de Morus alba e Morus nigra foram
descritos valores desse mineral de 1,06 mg g-1 de matéria seca (ERCISLI; ORHAN,
2007). A concentração observada neste estudo demonstra que os extratos de
amoreira preta são uma fonte abundante desta espécie metálica. A recomendação de
ingestão diária de magnésio é de 310 a 320 mg para homens e 400 a 420 mg para
mulheres (INSTITUTE OF MEDICINE, 1997). O consumo de aproximadamente 58 g
ao dia de folhas de amoreira preta poderia suprir 10% da ingestão diária recomendada
de magnésio.
Uma ocorrência bastante oportuna investigada nos extratos foliares de
amoreira preta é a concentração de ferro ser bem maior que a de manganês, pois,
estudos indicam que o ferro e o manganês competem pelos mesmos transportadores
sistêmicos. Além disso, quando a concentração de manganês é superior pode levar a
um desequilíbrio homeostático de ferro no organismo (FITSANAKIS et al, 2010).
Investigações sobre a composição mineral de frutos de Morus nigra por
espectroscopia de absorção atômica revelaram concentrações de zinco e cobre de 32
e 4 mg Kg-1 respectivamente, concentrações que são semelhantes aos avaliados
neste estudo (ERCISLI; ORHAN, 2007).
Recentemente Sánchez-Salcedo e colaboradores (2015), ao avaliarem a
concentração de minerais em quatro clones de frutos de Morus nigra por
espectrometria de emissão atômica com plasma acoplado indutivamente, observaram
65
valores para níquel de 1,22 ± 0,13 a 2,68 ± 0,24 mg Kg-1 e para alumínio 17,95 ± 1,67
a 38,66 ± 2,82 mg Kg-1, esses resultados diferem dos encontrados no presente estudo.
5.6 ENCAPSULAMENTO DE COMPOSTOS FENÓLICOS EM ESFERAS DE
ALGINATO
A fim de verificar a melhor concentração de alginato de sódio no
encapsulamento de compostos fenólicos em folhas de amoreira preta, avaliando-se
CFT mais altos foram testadas três formulações do mesmo, os resultados são
apresentados no Gráfico 4. As análises de fenólicos totais foram realizadas com as
esferas úmidas após 30 minutos de gelificação iônica e as médias comparadas pelo
teste de Tukey. Resultados expressos por mg equivalente de ácido gálico (GAE) por
grama de esfera úmida.
Gráfico 4- Influência da concentração do alginato de sódio no conteúdo fenólico total de extratos de amoreira preta encapsulados.
Médias seguidas de letras distintas diferem significativamente entre si pelo Teste de Tukey a nível de 5% de probabilidade. Fonte: a autora.
Esses resultados podem ser explicados por causa do poder gelificante do
alginato pelo modelo “egg box” ou caixa de ovos proposto por Grant e colaboradores
66
(1973). Vale ressaltar que o alginato é composto por unidades de ácido β-D-
manurônico (M) e do seu epímero alfa-L-gulurônico (G) ligados por ligações
glicosídicas do tipo 1 →4, conferindo-lhes composição e estrutura sequencial variável.
No modelo “egg box” a forma linear do alginato modifica-se ao reagir com íons de
cálcio divalentes, formando uma rede tridimensional, por sua vez pode ser composta
por blocos MG, GG ou MM. A razão entre o conteúdo de blocos dita a flexibilidade da
cadeia, assim, a configuração MG é a mais flexível e a GG confere maior rigidez ao
alginato (HELGERUD et al, 2009).
Deste modo a baixa concentração do CFT do alginato a 1%, pode ser explicado
pela migração significativa de compostos fenólicos para a solução de cloreto de cálcio,
por causa da fragilidade dos géis formados o composto ativo não se manteve se na
rede polimérica. Enquanto que em concentração de alginato a 1,5% conferiu maior
rigidez as esferas, contribuindo para um melhor encapsulamento dos compostos
fenólicos. Desta forma a concentração de 1,5% foi fixada para o encapsulamento de
compostos fenólicos.
5.6.1 Eficiência De Encapsulamento
A eficiência de encapsulamento de compostos fenólicos de folhas de amoreira
preta em esferas de alginato apresentaram valores de 81,7 ± 0,8 % para esferas
úmidas e 95,1 ± 1,4 % para esferas secas.
Estes resultados estão de acordo com os de Deladino e colaboradores (2013)
quando relataram o processo de encapsulamento de fenólicos de extratos da erva
mate (Ilex paraguariensis), em que obtiveram resultados de eficiência de
encapsulamento entre 81,69 ± 4,26 % e 90,39 ± 4,57%. Encapsulamento de
compostos fenólicos de extratos de diferentes plantas medicinais utilizando como
material de parede alginato e quitosana também apresentaram eficiência acima de 80
% (BELŠČAK-CVITANOVIĆ et al, 2011).
Essa pequena perda de compostos fenólicos observada no presente estudo
possivelmente ocorre no gotejamento do alginato na solução de cloreto de cálcio, fato
este também relatado por outros autores, os quais atribuem esse mecanismo de ação
à formação porosa das esferas de alginato decorrente de compostos de baixo peso
molecular do polímero (BAJPAI; TANKHIWALE, 2006; DELADINO et al, 2008).
67
5.6.2 Caracterização Das Esferas De Alginato De Cálcio
Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
A morfologia da superfície das esferas de alginato desidratadas em estufa
preparadas com extrato de folhas de amoreira preta e em branco (sem a presença de
extrato) foi analisada por microscopia eletrônica de varredura (MEV). As micrografias
do MEV são apresentadas na Figura 11. As esferas secas apresentaram diâmetro
médio de aproximadamente 0,9 ± 0,1 mm, com morfologia esferoide. Os resultados
mostraram que as esferas carregadas com extrato possuem morfologia de superfície
diferente das esferas em branco, as quais apresentaram uma superfície levemente
mais lisa.
Algumas fissuras podem ser observadas provavelmente em decorrência do
processo de secagem das esferas. Além disso, apresentaram pontos esbranquiçados
possivelmente pela presença de íons cálcio que não foram totalmente eliminados no
processo de lavagem após a formação dos grânulos. Em algumas esferas pode-se
verificar a existência de pontos achatados, provavelmente em decorrência das esferas
no processo de secagem ficarem muito próximas umas das outras chegando a
deformar a esfera.
68
Figura 11- Micrografias MEV das esferas de alginato.
Esferas em branco: A (1) aumento de 50x; A (2) aumento de 150x; A (3) aumento de 250x. Esferas com extrato de folhas de M. nigra: B (1) aumento de 50x; B (2) aumento de 150x; B (3) aumento de 250x. Fonte: a autora.
As fotografias das esferas úmidas com extrato e sem o extrato de folhas de
amoreira preta são apresentadas na Figura 12. As esferas apresentaram diâmetro
médio aproximadamente de 2,8 ± 0,2 mm. Os grânulos exibiram estrutura esférica,
lisa e de tamanho homogêneo, de coloração esbranquiçada e semitransparente.
69
Figura 12- Fotografias das esferas de alginato úmidas em branco e dopadas com extrato de folhas de amoreira preta.
Esferas úmidas em branco: (A); esferas carregadas: (B). Fonte: a autora.
Não foi possível realizar a microscopia eletrônica de varredura nas esferas
úmidas pois no processo de metalização com recobrimento de ouro, o mesmo não
adere à superfície da esfera devido a umidade, que também pode danificar o
equipamento.
Espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR)
As esferas de alginato em branco e as esferas com extrato de folhas de
amoreira preta foram caracterizadas através da análise de seus principais
grupamentos funcionais, por espectroscopia de infravermelho (FTIR), conforme
ilustrado na Figura 13. A análise espectrofotométrica das esferas em branco e dopada
revelaram que em geral estas permaneceram inalteradas, ou seja, a ausência de
interações químicas entre os compostos fenólicos e o alginato poderia indicar que este
é um material compatível para encapsular compostos bioativos de natureza fenólica
(CHAN et al, 2010; STOJANOVIC et al, 2012; CHO et al, 2014).
Os espectros de FTIR exibem bandas características do alginato de cálcio. A
banda próxima a 3500 cm-1 corresponde ao estiramento do grupamento hidroxila
possivelmente envolvido em ligações de hidrogênio, além da existência de sinais
principais aproximadamente em 1650 cm-1, o qual é atribuído ao estiramento de
grupos carbonila e a banda próxima a 1000 cm-1 devido ao estiramento -C-O-C-.
70
Figura 13- Espectro de infravermelho das esferas de alginato em branco (A) e dopadas com extrato de folhas de amoreira preta (B).
Fonte: a autora.
A alta similaridade entre os dois espectros apresentados deve-se
provavelmente à baixa concentração dos compostos fenólicos em relação ao alginato.
Contudo, pode ser observada uma pequena protuberância no sinal de hidroxilas das
esferas carregadas (indicada pela seta). Esta pode ser interpretada como uma
71
pequena contribuição dos grupos hidroxila fenólicos do extrato de folhas de amoreira
preta, cuja frequência é levemente diferente.
5.6.3 Teste De Liberação In Vitro
O perfil de liberação do conteúdo fenólico total em água a partir das esferas de
alginato úmidas e secas com extrato de folhas de amoreira preta estão apresentadas
no Gráfico 5. O estudo da cinética de liberação do CFT permite observar que nos
primeiros 120 min há uma taxa de liberação crescente para ambas as esferas e que
após esse período, a taxa de liberação permanece constante para as esferas úmidas
até completar 240 min. Comportamento semelhante de liberação foi relatado por
Arriola e colaboradores (2016), que avaliaram o encapsulamento do extrato aquoso
de folhas de Stevia rebaudiana Bertoni com alginato, onde a liberação de CFT tanto
para esferas úmidas quanto liofilizadas permaneceram constantes entre 210 a 240
min.
No entanto pode-se observar que as esferas úmidas levam menos tempo (120
min) para atingir seu máximo de liberação (70%), enquanto que as esferas secas
continuam a liberar compostos fenólicos em 180 min atingindo um platô com liberação
de 80% de CFT. Essa característica de liberação dos grânulos de alginato tem sido
atribuída à sua estrutura porosa (LUPO et al, 2015).
72
Gráfico 5- Cinética de liberação de compostos fenólicos em água das esferas úmida e secas dopadas com extrato de folhas de amoreira preta. Os resultados são representados em termos de média ± desvio padrão.
Fonte: a autora.
Nos primeiros 30 min a liberação de CFT das esferas secas foi baixa (cerca de
25%), porém em 90 min pode-se observar uma liberação de 50%. Esse fato pode ser
justificado pela integridade da malha de alginato, a qual permanece durante os
primeiros instantes e que posteriormente sofre um rearranjo o que permite a liberação
da substância encapsulada. Kikuchi e colaboradores (1997), obtiveram resultados
semelhantes com teste de liberação com matriz de alginato. Segundo Wu e Brazel
(2008) a liberação do composto bioativo em grânulos secos é amplamente controlada
pelo inchaço das esferas, sendo menos significativo nas esferas úmidas. As esferas
demonstraram potencial para serem utilizadas como sistema para liberação
controlada de compostos fenólicos totais.
5.6.4 Teste De Estabilidade
A avaliação do CFT das esferas de alginato de cálcio secas durante 81 dias de
armazenamento a 4 ± 1°C e em temperatura ambiente (25 ± 6 °C) é mostrada na
Tabela 11. A concentração de compostos fenólicos das esferas de alginato secas
73
mantidas a 4°C variou de 74,3 ± 0,5 a 66,3 ± 0,3 mg GAE g-1 de esfera seca,
proporcional a um decréscimo de 10,8 % ao final do período de armazenamento, e os
encapsulados acondicionados em temperatura ambiente a variação do CFT foi de
74,3 ± 0,5 a 62,6 ± 0,4 mg GAE g-1 de esfera seca, correspondendo a uma redução
na concentração de compostos fenólicos de 15, 7% ao final do tempo de
armazenamento.
Não foram observadas nos primeiros 36 dias diferenças significativas (p <0,05)
no CFT nas esferas mantidas a 4 ± 1°C, entretanto o decréscimo do CFT a partir do
66 aos 81 dias foi mínimo, indicando que o alginato de sódio aliado à temperatura
reduzida pode ter possibilitado uma ação protetora sobre os compostos fenólicos
encapsulados. De forma distinta, as esferas mantidas em temperatura ambiente
mantiveram-se estáveis durante as primeiras quatro semanas, porém após esse
período a queda na concentração de compostos fenólicos foi mais significativa. Maier
e colaboradores (2009), também observaram perdas de compostos fenólicos em
microcápsulas de extrato de bagaço de uva, sendo tais perdas maiores em
armazenamento a 25°C do que em 4°C.
Tabela 11- Estabilidade do conteúdo fenólico total das esferas secas dopadas com extrato de folhas de amoreira preta durante 81 dias de armazenamento a 4 ± 1°C e temperatura ambiente (25 ± 6°C). Os resultados são representados em termos de média ± desvio padrão.
Conteúdo Fenólico Total (mg GAE g-1 esfera seca)
Tempo (dias) Armazenamento a 4°C Temperatura ambiente
0 74,3 ± 0,5 a 74,3 ± 0,5 a
7 73,8 ± 0,2 a 73,5 ± 0,2 a
14 73,5 ± 0,1 a 73,3 ± 0,3 a
21 72,7 ± 0,7 a 72,9 ± 0,5 a
36 72,3 ± 0,4 a 65,0 ± 0,8 b
66 69,9 ± 3,5 ab 64,4 ± 0,4 b
81 66,3 ± 0,3 b 62,6 ± 0,4 c
Letras distintas na mesma coluna indicam diferença estatística significativa ao nível de 5% pelo teste de Tukey. Fonte: a autora.
Perdas maiores que mostradas neste trabalho foram reportadas por Jimenez-
Aguilar e colaboradores (2011), em seus estudos de estabilidade de compostos
74
fenólicos de açaí e mirtilo secos por pulverização, os quais relataram perdas de 33%
de CFT após 4 semanas de armazenamento a 25°C. De maneira análoga, em
secagem por pulverização de bayberry as perdas de compostos fenólicos (após 6
meses de armazenamento a 4 e 25°C) foram de 6% e 37%, respectivamente (FANG;
BHANDARI, 2011).
A avaliação do CFT das esferas de alginato de cálcio úmidas durante 81 dias
de armazenamento a 4 ± 1°C e em temperatura ambiente 25 ± 6°C, mantidas no
próprio extrato de folhas de amoreira e em soro são mostradas na Tabela 12. As
esferas úmidas foram mantidas em meio líquido justamente para não perder a
umidade. No presente trabalho é notável a diferença na concentração de compostos
fenólicos entre esferas secas e úmidas, esta última apresentando concentração de
umidade significativamente alta (96%), e a perda de massa após secagem das esferas
acaba concentrando os fenólicos aprisionados nos grânulos (STOJANOVIC et al,
2012).
É nítida a degradação do conteúdo fenólico total nas esferas úmidas mantidas
em soro fisiológico armazenadas a 4 ± 1°C (5,35 ± 0,04 a 1,03 ± 0,06 mg GAE g-1
esfera úmida) e temperatura ambiente 25 ± 6°C (5,35 ± 0,04 a 0,86 ± 0,01 mg GAE g-
1 esfera úmida) o que corresponde a perdas de 80,7 e 83,9 % respectivamente até o
ultimo dia de análise. Esse fato pode ser atribuído a alta concentração de água contida
nas esferas, assim como a liberação dos fenólicos para o meio externo.
Tabela 12- Estabilidade do conteúdo fenólico total em esferas úmidas dopadas com extrato de folhas de amoreira preta durante 81 dias de armazenamento a 4 ± 1°C e temperatura ambiente (25 ± 6°C) no extrato e em soro. Os resultados são representados em termos de média ± desvio padrão
Conteúdo Fenólico Total (mg GAE g-1 esfera úmida)
Tempo (dias) 4°C/ Soro T. ambiente/ Soro 4°C/ Extrato T. ambiente/ Extrato
0 5,35 ± 0,04 a 5,35 ± 0,04 a 5,35 ± 0,04 b 5,35 ± 0,04 b
7 2,65 ± 0,04 b 2,56 ± 0,02 b 6,32 ± 0,09 a 5,74 ± 0,05 a
14 2,60 ± 0,02 b 2,55 ± 0,03 b 6,12 ± 0,25 a 5,68 ± 0,00 a
21 2,01 ± 0,02 c 2,23 ± 0,06 c 6,33 ± 0,05 a 5,75 ± 0,04 a
36 1,60 ± 0,08 d 1,45 ± 0,06 d 5,30 ± 0,07 b 5,10 ± 0,14 bc
66 1,43 ± 0,01 d 1,32 ± 0,11 d 5,15 ± 0,11 b 4,97 ± 0,17 c
81 1,03 ± 0,06 e 0,86 ± 0,01 e 5,07 ± 0,03 b 4,31 ± 0,02 d
Letras distintas na mesma coluna indicam diferença estatística significativa ao nível de 5% pelo teste de Tukey. Fonte: a autora.
75
A concentração de compostos fenólicos para as esferas mantidas no próprio
extrato de folhas de amoreira preta variou de 5,35 ± 0,04 a 5,07 ± 0,03 para os
grânulos armazenados a 4°C e 5,35 ± 0,04 a 4,31 ± 0,02 mg GAE g-1 esfera úmida
para as armazenadas em temperatura ambiente, ao longo de 81 dias. A estabilidade
do CFT para ambas temperaturas se manteve durante 21 dias de armazenamento.
Mas uma perda maior ao fim dos 81 dias foi registrada para os encapsulados que
permaneceram a temperatura ambiente (19,4%) do que a 4°C (5,2%).
O aumento na concentração de compostos fenólicos observado após uma
semana de armazenamento pode ser resultado da morfologia porosa da esfera e a
concentração do meio circundante estimulando a difusão dos compostos fenólicos. De
acordo com Chan e colaboradores (2009) e Gombotz e Wee (2012), esse evento
ocorre em consequência dos compostos ativos solúveis em água, como os compostos
fenólicos, possuírem a facilidade de difundir-se para o interior e exterior da solução de
armazenamento de forma mútua.
Recentemente Arriola e colaboradores (2016) investigaram a estabilidade dos
compostos fenólicos encapsulados a partir de extrato de Stevia rebaudiana utilizando
alginato de sódio como material de parede, e durante 30 dias de armazenamento a
4°C não observaram decréscimo no CFT e atribuíram esta ação protetora ao polímero
alginato de sódio.
76
6 CONCLUSÕES
De acordo com os resultados apresentados ao longo deste estudo, pode-se
concluir que foi possível realizar a extração de compostos fenólicos de folhas de
amoreira preta Morus nigra L. para posterior encapsulamento em esferas de alginato
de sódio.
Foi possível otimizar o processo de extração dos compostos fenólicos
analisando algumas variáveis: a variável temperatura de secagem das folhas de
amoreira preta apresentou forte impacto no conteúdo fenólico total, indicando que em
temperaturas mais baixas (50ºC) de secagem em estufa podem preservar esse
composto bioativo. A temperatura de infusão também exibiu grande influência na
extração de compostos fenólicos e neste caso, temperaturas mais elevadas
proporcionaram melhores extrações.
Ao contrário, para a variável tempo não foram constatados efeitos significativos
na extração de compostos fenólicos, desta forma um menor tempo implicaria em
menor gasto energético.
Muitas classes de compostos fenólicos são indicativas de bioatividades. Além
de encontradas concentrações significativas de compostos fenólicos totais nos
extratos foliares de M. nigra, assim como flavonóis, flavonoides e orto-difenólicos. Os
extratos exibiram boa capacidade antioxidante.
A análise por LC-ESI-MS/MS permitiu a identificação de 12 compostos de
natureza fenólica que podem ser associados à atividade antioxidante das folhas de
amoreira preta, entre eles, o ácido protocatecuico, quercetina, ácido cafeico, ácido 4-
hidroximetilbenzóico e em especial ao composto umbeliferona identificado e
quantificado de forma inédita, até onde se sabe, nas folhas de Morus nigra L., havendo
relatos desta substância na literatura apenas para as folhas de Morus alba L.
O extrato de folhas de amoreira preta apresentou ação bactericida frente as
bactérias E. coli, P. aeruginosa e B. cereus, sendo a P. aeruginosa a bactéria mais
suscetível ao extrato.
Foram constatadas que as folhas de M. nigra são ricas em micronutrientes
minerais, entre os 10 elementos determinados o potássio, ferro, manganês e
magnésio exibiram as maiores concentrações.
77
Em relação ao encapsulamento dos compostos fenólicos, entre as três
concentrações de alginato de sódio testadas, a intermediária contribuiu para melhor
encapsulamento do CFT e melhores esferas foram obtidas.
Valores elevados de eficiência de encapsulamento do CFT foram observados
tanto para esferas secas como para as esferas úmidas. A gelificação iônica mostrou-
se um método simples, de fácil reprodução, barato e eficiente para a produção do
encapsulados de alginato.
As micrografias de MEV revelaram que os compostos fenólicos afetaram a
morfologia da superfície das esferas dopadas com os mesmos, em comparação com
as esferas em branco. As esferas dopadas com o extrato apresentaram superfície
rugosa, com algumas fissuras provavelmente em decorrência da secagem em estufa,
assim como o tamanho da esfera diminuiu significativamente após a desidratação.
Foi possível verificar pelas análises de FTIR ausência de interações químicas
entre os compostos fenólicos e o alginato, indício de que este é um material
compatível para encapsular compostos bioativos de natureza fenólica.
Nos estudos de liberação dos compostos fenólicos encapsulados verificou-se
uma liberação do CFT mais rápida e menos significativa para esferas úmidas do que
para as secas, resultante possivelmente da diferença de integridade da malha de
alginato de cálcio. Esses resultados permitem inferir que a porcentagem liberada é
adequada para diferentes aplicações finais.
Nos testes de estabilidade para esferas secas o CFT manteve-se estável até
36 dias armazenadas a 4 ± 1°C. Entretanto, até o final dos 81 dias as alterações
fenólicas foram imperceptíveis. Para as esferas úmidas mantidas em soro fisiológico
o CFT exibiu decréscimos significativos nos primeiros 7 dias. Contudo, as esferas
úmidas mantidas no próprio extrato de folhas de amoreira preta armazenadas a 4 ±
1°C e temperatura ambiente (25 ± 6°C) mantiveram-se estáveis durante 21 dias de
armazenamento.
Por fim este estudo demonstrou que os extratos de folhas de amoreira preta
são fontes ricas de compostos bioativos, principalmente de natureza fenólica e que o
alginato de sódio pode ser um bom agente encapsulante fornecendo boa proteção e
liberação controlada do princípio ativo, permitindo sua incorporação em alimentos,
nutraceuticos e em cosméticos. A técnica de encapsulamento em esferas de alginato
é um método que deve ser explorado mais intensamente, para que os compostos
bioativos permaneçam durante o processamento.
78
REFERÊNCIAS
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