expressão gênica em oócitos e embriões priscila m. m. de leon doutoranda ppgb novembro, 2010...
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Expressão Gênica em Oócitos e Embriões
Priscila M. M. de LeonDoutoranda PPGB
Novembro, 2010
Universidade Federal de PelotasGraduação em Biotecnologia
Disciplina de Manipulação de Gametas e Embriões
Análise de Expressão Gênica
Análise do mRNA e de proteínas em oócitos e embriões
Conceito:
• Ferramenta importante na evolução de biotecnologias da
reprodução assistida;
• mRNA:
Diferença de expressão in vivo e in vitro;
Envolvidos no desenvolvimento inicial embrionário;
• Apoptose:
principal fator que afeta o potencial de desenvolvimento
embrionário;
Análise da Expressão Gênica:
Análise de Expressão Gênica
Obtenção de Marcadores Moleculares;
Identificação de genes envolvidos na Maturação oocitária;
Identificação de genes envolvidos no Desenvolvimento
Embrionário;
Marcadores de sobrevivência e imalntação embrionária;
Diferenças na expressão gênica IN VIVO e IN VITRO;
Resistência ou suscetibilidade a Criopreservação;
Objetivos:
Maturação in vitro
Insucesso da FIV
Cultivo in vitro embrionário
Danos na Criopreservação de Oócitos
Implantação embrionária
Desafios da PIV de Embriões:
Metodologia empregada na Avaliação da Expressão Gênica
• Qualidade do oócito:
» Qtidade de camadas do cumulus;
» Integridade do citoplasma e zona pelúcida;
• Expansão das células do cumulus:
» % Total e % parcial;
• Maturação nuclear e integridade de membrana:
» % MII e coloração IP e DF;
• Clivagem e desenvolvimento embrionário:
» Clivagem em 24 h, avaliação a cada 48 h;
• Viabilidade embrionária
» Coloração IP e DF;
Avaliações:
• Análise da Expressão Gênica:» Extração RNA total: reagente TRIzol® (Invitrogen™, USA);
»Quantificação e padronização do RNA;
» Sintese do cDNA: kit High Capacity cDNA Reverse
Transcription® (Applied Biosystems™, USA);
» Primers específicos (H2a, Telomerase, Caspase 3, Bcl-2,
BAX, Hsp 70, STAT-1, p 53, calpaína e catepsina);
» Avaliação da expressão: qRT-PCR (PCR quantitativa em
Tempo Real);
» Gene normalizador: GAPDH e beta-actina;
Apoptose:
• H2a;
• Telomerase;
• Caspase 3;
• Bcl-2;
• BAX;
• Hsp 70;
• STAT-1;
• p 53;
• Calpaína;
• Catepsina.
Aplicações Análise de Expressão Gênica:
• Qualidade de Oócitos e Embriões:– Avaliação morfológica têm sido utilizada como critério para selecionar
Oócitos e Embriões de melhor qualidade (Grau 1 a 5);– no entanto, a morfologia é insuficiente na avaliação do
desenvolvimento embrionário– não permitindo distinguir oócitos competentes que têm a
habilidade de levar uma gestação à termo
• Necessidade de uma seleção mais precisa que reflita a Competência Oocitária e embrionária....
• Estudos de expressão gênica associados à competência elucidando os mecanismos genéticos e bioquímicos envolvidos na sobrevivência;
• melhores resultados obtidos na reprodução assistida
• A caracterização molecular é importante:– na elucidação dos mecanismos necessários para que
o oócito adquira competência– Identificação de marcadores moleculares
relacionados com a capacidade de desenvolvimento.• A abordagem utilizada na investigação desses
mecanismos é a comparação de ovócitos com diferentes graus de competência.
Competência Oocitária:
• Definida como a habilidade ou potencial de um oócito passar pela maturação, ser fecundado, desenvolver até o estágio de blastocisto e ter a capacidade de induzir uma gestação
• é progressivamente adquirida durante os estágios finais da foliculogênese, por várias alterações celulares e moleculares que proporcionam ao oócito capacidade para o desenvolvimento embrionário após a fecundação
Aplicações Análise de Expressão Gênica:
• Maturação de Oócitos:• Genes que estão envolvidos na capacidade de maturação do
oócito;• Identificar os fatores que regulam a aquisição da competência
durante o processo de maturação;
• Esse conhecimento é fundamental para indicar as alterações necessárias para que o sistema in vitro possa ser o mais semelhante possível do in vivo, e com isso aumentar a disponibilidade de oócitos de melhor qualidade para serem utilizados
Maturação Oocitária:• A maturação se refere ao estágio final de preparação do oócito para
ser fecundado, e envolve modificações nucleares e citoplasmáticas. • A maioria dos oócitos recuperados a partir de folículos antrais é
capaz de completar a maturação nuclear, mas apenas os competentes são capazes de ter desenvolvimento embrionário normal.
• Nem todos que completam a maturação nuclear têm a capacidade de se desenvolver até o estágio de blastocisto.
• Essa diferença pode ser atribuída ao “status” de maturação citoplasmática e molecular que difere entre os competentes e incompetentes
Maturação Oocitária: 8000 genes estão sendo expressos em oócitos bovinos; Destes 821 são relacionados a maturação; Genes de origem materna tem sido foco devido seu papel no
desenvolvimento embrionário; Um aspecto importante durante o crescimento do oócito é
seu alto grau de atividade transcricional; portanto, mudanças moleculares podem ser responsáveis
pelo aumento na competência dos ovócitos; Os eventos moleculares se referem a essas modificações, que
envolvem síntese, degradação e alterações de RNAm e proteínas, favorecendo o oócito com o estoque molecular necessário para a fecundação e os eventos posteriores (clivagem, desenvolvimento e implantação)
• Oócitos possuem RNAm e proteínas necessárias ao primeiro estágio do desenvolvimento embrionário:– sendo que qualidade e quantidade de transcritos podem estar
associadas ao potencial do oócito em desenvolver um embrião– os ovócitos de mamíferos possuem a necessidade de acumular
todos os fatores maternos necessários para os eventos pós-fecundação
• Os resultados mostraram que a classificação morfológica de COCs pode separar oócitos com alto e baixo potencial de desenvolvimento antes da MIV:– Oócitos com alto potencial de desenvolvimento possuem, em geral,
maior quantidade de mRNA que foram estocados durante o crescimento do ovócito e fase final da foliculogênese
– Oócitos com baixo potencial de desenvolvimento possuem menor quantidade de mRNA
Atividade Transcricional:• Período de crescimento do oócito: oócito possui alto grau de atividade
transcricional;
• Período de Maturação oócito: a transcrição diminui marcadamente
antes da maturação do oócito.
• Em bovinos é quando o folículo possui 3 mm;
• A partir deste ponto a transcrição continua em nível bem menor,
sugerindo que as proteínas e transcritos que foram estocados não são
substituídos, pelo contrário, são gradualmente traduzidos ou
degradados até o momento da ativação do genoma embrionário, de
forma a suprir as necessidades da fecundação e desenvolvimento
embrionário inicial.
• Transcrição na maturação: comparado com o oócito não maturado, após a MIV a quantidade de RNAm foi reduzida em 69% (em oócitos bovinos)
• Clivagem: diminuindo para 10% o nível de transcrição em embriões de 2 células.
• Desenvolvimento embrionário: um aumento de 4 vezes no nível de transcrição foi observado em embriões de 4 células.
• Uma nova redução na quantidade de mRNA é evidenciada em embriões de 8 células e blastocistos
• Novo aumento no nível de transcrição em estágios de blastocistos eclodidos, é observado 9 vezes mais atividade.
Tremoleda et al., 2006.
Crescimento .: ↑ TranscriçãoMaturação .: ↓ Transcrição
(redução em 69%)
2 céls.: ↓ 10%
Blastocisto: ↓ transcrição4 céls.: ↑ 4x
8 céls.: ↓ transcrição
Blastocisto Eclodido: ↑ 9x
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