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Coleta, Classificação e Maturação in

Universidade Federal de Pelotas

Graduação em Biotecnologias

Disciplina de Manipulação de Gametas e Embriões

2ª Aula:

vitro de Oócitos

Priscila M. M. de Leon

Doutoranda PPGB

Agosto, 2010

OócitoOócito

Conceito:

o oócitos são células germinativas femininas

resultantes do processo determinado Oogênese

• Oogênese: processo de maturação das oogônias em

oócitos. Este processo inicia-se na vida fetal e termina

após a puberdade.

1º bloqueio meiótico → oócitos em

Diplóteno da Prófase I

Oogênese:

Fases da Ovogênese

Embrionária Nascimento A partir da Puberdade

Ovogonias Ovócito I FecundaçãoOvócito II

Diplóteno da Prófase I

Metáfase II

Óvulo

Oócito

• Diplóteno da Prófase I Estágio de Vesícula Germinativa

• VG: núcleo desenvolvido e imaturo;

• Foliculogênese formação → Complexo cumulus

oophuros

Foliculogênese

• Folículo Primário: oócito envolto por camada simples de céls. pavimentosas;

Bovinos → Folículo = 35µm; Oócito = 30µm

• Folículo Secundário: duas ou + céls. Foliculares

– Oócito começa a crescer– Oócito começa a crescer

– Formação de junções comunicantes (gap junctions)

– Meiose permanece bloqueada

• Folículo Antral (Terciário ou De Graaf): – Crescimento folicular

– Crescimento e maturação do oócito

Bovinos → Folículo = 1mm; Oócito = 80µm

→ Folículo = 15mm; Oócito = 120µm

Oócito

• Quebra da Vesícula Germinativa → marca a retomada da

meiose e início do processo de Maturação Oocitária;

– In vivo ocorre pela estimulação por LH (Hormônio

Luteinizante)

– In vitro ocorre na coleta do oócito

• 2º bloqueio meiótico: oócitos em Metáfase II

– Estágio em que o oócito é ovulado

– A meiose só prosseguirá se ocorrer a fertilização

Folículo Primário

Folículo Secundário

Folículo Antral (Terciário)

Oócito I

Oócito I

Oócito I

VG

QVG

Foliculogênese: Oogênese: Meiose:

Folículo Pré-Ovulatório Oócito II

Fecundação Óvulo

MIIOvulação Oócito II

MI

Foliculogênese Humana

Complexo Cumulus Oophorus

Coroa Radiada

Antro Folicular

Zona Pelúcida

Oócito

Maturação Oocitária

1. Crescimento Oocitário

2. Capacitação Oocitária

3. Maturação Oocitária

a. Maturação Citoplasmática

b. Maturação Nuclear

4. Ativação do Oócito

1. Crescimento Oocitário

• Crescimento Oocitário se inicia com o Crescimento

Folicular;

• Finalizado na formação do Folículo Antral;

• Aumento de tamanho (3x);

• Aumento e oraganização de Organelas;

• Síntese de RNA e proteínas :

Maturação, Fecundação e Desenvolvimento Embrionário

• Entre final do Crescimento e início da Maturação

• Modificações Estruturais

2. Capacitação Oocitária

• Acaba a síntese de RNA

• Ocorre no Folículo Antral

• Ainda se mantém no 1º bloqueio meiótico

• Quando o oócito retoma a Meiose

• Após o pico de LH

3. Maturação Oocitária

• Abrange 2 estágios:

�Maturação Citoplasmática

�Maturação Nuclear

• Reversão do 1º bloqueio meiótico

• Vai até o segundo bloqueio meiótico → Metáfase II

• Condensação dos cromossomos e Quebra da Vesícula

3.1. Maturação Nuclear

• Condensação dos cromossomos e Quebra da Vesícula

Germinativa (QVG)

• Extrusão do 1º Corpúsculo Polar

Diacinese → Metáfase I → Anáfase I → Telófase I → Metáfase II

• Ocorrem Modificações Citoplasmáticas:

– Mitocondrias e complexos de Golgi migram para a periferia

nuclear;

3.2. Maturação Citoplasmática

nuclear;

– Grânulos Citoplasmáticos migram para a periferia do oócito,

próximo a membrana celular;

– Microtubulos e microfilamentos são reorganizados;

– Expansão das células do cumulus (modificação das junções gap)

Junções Gap: Cumulus Expandido:

Oócito em MII:

Tremoleda et al., 2006.

Reguladores da Maturação do Oócito

• MPF: Fator Promotor da Maturação

– Principal regulador das modificações morfológicas durante a maturação

do oócito.

• Funções:

• MPF: Fator Promotor da Maturação

– Principal regulador das modificações morfológicas durante a maturação

do oócito.

• Funções:• Funções:

– Regulam a condensação dos cromossomos;

– Estimulação do rompimento do envelope nuclear na QVG;

– Reorganização dos microtúbulos;

– Em baixa atividade em oócitos em VG;

– Atividade máxima em MI e MII;

– Ativado pela queda na concentração de AMPc;

– Inativado pela fertilização, permitindo a finalização da meiose pelo seu

desbloqueio.

• Funções:

– Regulam a condensação dos cromossomos;

– Estimulação do rompimento do envelope nuclear na QVG;

– Reorganização dos microtúbulos;

– Em baixa atividade em oócitos em VG;

– Atividade máxima em MI e MII;

– Ativado pela queda na concentração de AMPc;

– Inativado pela fertilização, permitindo a finalização da meiose pelo seu

desbloqueio.

Reguladores da Maturação do Oócito

• MAPK: Proteína Cinase Ativada por Mitógeno

• Funções:

• MAPK: Proteína Cinase Ativada por Mitógeno

• Funções:• Funções:

– Atua na fosforilação de fatores de transcrição e

proteínas do citoesqueleto;

– Sua ativação ocorre na QVG e se mantém até o fim

da maturação (essencial nos eventos após QVG);

• Funções:

– Atua na fosforilação de fatores de transcrição e

proteínas do citoesqueleto;

– Sua ativação ocorre na QVG e se mantém até o fim

da maturação (essencial nos eventos após QVG);

VGVG PróPró--MM MIMI

Microscopia

Confocal:

• Microtúbulos

• Microfilamentos

• Cromatina

MIMI AIAI TITI

MIIMII MIIMII DegDeg


Vídeo – Estágios de Maturação do Oócito

• http://www.youtube.com/watch?v=3-uocDm4SNg

4. Ativação do Oócito

• Oócitos são ovulados em Metáfase II;

• A ativação é induzida pela fecundação de um

espermatozóide;espermatozóide;

Metáfase II → Telófase II → extrusão do2º corpúsculo

polar → divisão embrionária

• Caso não ocorra fertilização o oócito se degenera;

Finalização da maturação do oócito:


Fertilização in vitro :


Oócito Fertilizado:

Coleta de oócitos

• In vivo:– Aspiração Guiada Por Ultra Som (OPU)

– Aspiração Folicular Cirúrgica

– Aspiração Transcutânea pelo flanco– Aspiração Transcutânea pelo flanco

• In vitro:– Aspiração Folicular

– Slicing (Técnica de Fatiamento)

– Scraping

Aspiração Guiada por Ultra Som (OPU)

• OPU – Ovum Pick-Up

• Ultra som – sonda convexa de 5MHz a 6,5MHz;

• Bomba de vácuo;

• Tranqüilização;

• Aspiração do Fluído Folicular;

• Lavagem Folicular com PBS e Heparina;

• Procura do CCO em lupa estereo microscópica;

Coleta de Oócitos in vivo - OPU - Bovino

• Média de Oócitos /OPU:

– 8 CCO viáveis;

– 20 - 25 CCOs viáveis com estimulação hormonal (Protocolo de Superovulação);

– 10% dos CCO são degenerados;

• Manejo OPU doadora:

– OPU entre os dias 14 e 16 do ciclo estral ↑ n CCOs;

– OPU no dia 5 ↑ n de COC viáveis e competentes;

– OPU de 20 vacas / dia;

– OPU 2x em uma semana (↓ nº de CCOs);

– OPU 1 x a cada 2 semanas;

– OPU no 1º Trimestre da Gestação;

Estimativa: pode ser obtidas 18 gestações/3 meses com OPU + PIV

Coleta de Oócitos in vivo - OPU - Bovino

Coleta in vivo de Oócitos - Equinos

• Equinos: maior aderência das células do cumulus à parede folicular

→ dificuldade na coleta

• Aspiração Folicular Cirúrgica (McKinnon, 1986);

• Aspiração Transcutânea pelo flanco (Palmer, 1987);

Aspiração Transvaginal guiada por ultra som (Cook, 1992);• Aspiração Transvaginal guiada por ultra som (Cook, 1992);

• Carnevale & Ginther, 1993: 78% de oócitos recuperados;

• Gaetano et al. 2005: 46,4% Recuperação Oocitária;

• Manejo OPU éguas doadoras:

– OPU 12 - 24h após hCG;

– 5 CCOs/égua;

– 11 CCOs/ éguas com protocolo de Superovulação;

Coleta in vivo de Oócitos – Caprinos e Ovinos

• Aspiração Folicular por Laparoscopia (LAF);

• Uso frequente promove aderências no trato reprodutivo;

• Coleta cirúrgica por Laparotomia muito traumática

• OPU é dificultada pelo tamanho dos animais;• OPU é dificultada pelo tamanho dos animais;

• Manejo LAF doadoras:

– Até 1 x /semana;

– 11º dia do ciclo ou do protocolo de Superovulação;

– Em média 6 CCO/coleta em cabras;

– 4 CCO/coleta em ovelhas;

Aspiração Folicular

por Laparoscopia:

LAF - Cabras

Coleta de Oócitos - Mulheres

• Dellenbach (1985): inicio da aspiração folicular por via

transvaginal guiada por ultra-som.

• Procedimento é feito sob sedação;•

• 6 CCOs ou mais coletados por OPU;

• Mulheres co infertilidade:

– 15% de taxa de gravidez com CCO próprios;

– 49% de taxa de gravidez com CCO doados;

Vídeo - Aspiração Folicular Guiada por

Ultra Som

Vídeo - Aspiração Folicular Guiada por

Ultra Som

• http://www.youtube.com/watch?v=Wm4Khn6MVbc&feature=related

Coleta de Oócitos in vitro

� Aspiração Folicular

� Slicing (Técnica de Fatiamento)

� Scraping

• Objetivos:

– Avanços científicos;

– Controle em clínicas de reprodução assistida;

Coleta de Oócitos in vitro - Scraping

• Individualização de cada folículo e abertura em placa de petri;

• Auxílio de bisturi ou cureta;

– Maior taxa de coleta (90%);

– CCO de boa qualidade;

– Muito demorado;

– Utilizado em Equinos;

Coleta de Oócitos in vitro - Slicing

• Fatiamento de toda a superfície ovariana;

– alta taxa de coleta;

– Muitos CCO inviáveis e desnudos;

– Líquido de procura bem “sujo”, maior probabilidade de

contaminação;contaminação;

– Utilizado em bovinos;

Coleta de Oócitos in vitro – Aspiração Folicular

• Aspiração do conteúdo folicular com seringa e agulha;

– Taxa de coleta em torno de 60%;

– Método mais prático e rápido;

– Líquido de procura é deixado para sedimentar;

– Utilizado em Bovinos, Equinos, Ovinos e Suínos;– Utilizado em Bovinos, Equinos, Ovinos e Suínos;

Classificação dos Complexos Cumulus Oócito

• De acordo com aspectos Morfológicos:

– Quantidade de camadas de céls. do cumulus;

– Grau de compactação das células do cumulus;

– Homogeneidade citoplasmática;– Homogeneidade citoplasmática;

– Presença de grânulos citoplasmáticos;

Influencia diretamente a qualidade embrionária e a

viabilidade após o descongelamento de oócitos


• Grau I:

– Mais de 3 camadas de céls. do cumulus;

– Cumulus compacto;

– Ooplasma com granulações finas e homogêneas;

– Ooplasma preenchendo todo o interior da zona pelúcida;– Ooplasma preenchendo todo o interior da zona pelúcida;

• Grau II:

– 3, 2 ou 1 camada de células do cumulus;

– Cumulus compacto;

– Granulações heterogeneamente distribuídas

(concentradas em uma lado ou na periferia);

– Ooplasma preenche todo o interior da zona pelúcida;


• Grau III:

– Cumulus parcialmente expandido;

– Ooplasma contraído (espaço entre a zona pelúcida e o

ooplasma);

– Manchas escuras no ooplasma;

• Grau IV:

– Cumulus expandido;

– Oócitos Desnudos;

– Ooplasma muito escuro;

– Sinais de degenação (vacúolos, inclusões citoplasmáticas);

Classificação quanto ao Estágio de Maturação

Classificação de oócitos

Grau I Grau II Grau IV

Grau II Grau III Grau IV

Classificação de oócitos

Cumulus

CompactoCumulus

Expandido

Oócito humano em Metáfase II apresentando:

Granulações Citoplasmáticas


Fragmentação do Corpúsculo Polar


Vacúolo no Ooplasma


Inclusões Citoplasmáticas

Maturação In vitro

• Condições de cultivo para maturação do oócito:

VG →MII

• 1º Bloqueio Meiótico é quebrado na coleta do oócito;

– Rompimento da comunicação entre as células foliculares e retira os fatores inibidores do fluído folicular.


• Bovinos:

– Taxa de maturação entre 80 e 90%

– 20 a 24h de incubação a 38,5°C

• Caprinos e Ovinos:• Caprinos e Ovinos:

– Taxa de maturação caprinos é 50%

– Taxa de maturação ovinos 35 – 40%

– 27 h de incubação a 38,5°C a 39°C

• Equinos:

– Taxa de maturação entre 40 e 60%;

– 36 a 40h de incubação a 38,7°C


• Maioria dos Protocolos:

– Meio de cultivo de tecidos 199 (TCM-199);

– Suplementação com Soro Fetal Bovino (SFB);

– Antibióticos (Gentamicina e Penicilina ou Sulfato de Amicacina);Amicacina);

– Adição de Hormônios :

• Estradiol

• FSH e LH

– Fatores de Crescimento e Estimulantes (GH, IGF-I, IL-1β);

– Fluído Folicular ou Soro de Vaca em Estro;

– Adição de Albumina Sérica Bovina (BSA);


• Gotas de 60 a 120 µl;

• Submersas em óleo mineral;

• Placas de Petri tratadas

• Em Estufa de CO2;

• 5% de CO2, temperatura e umidade

controladas;

Maturação in vitro :

• Dell’Aquilla et al, 1996: adição de soro de égua e vaca em estro ao TCM

199 para maturação;

• Bruck et al., 2000: MIV em fluído de folículos pré-ovulatórios;

• Carneiro et al., 2002: IGF-I adicionado a meio de maturação;

• Pereira et al. 2006: 41,47% de MIV com eGH por 30h;

• Tremoleda et al., 2006: manutenção do Bloqueio da Meiose com o

objetivo de desenvolvimento da Competência Oocitária e

Reprogramação Celular;

Leon et al., 2008:

� Adição de Cisteamina ao meio de MIV;

� Síntese de Glutationa (GSH);

� Estresse Oxidativo;

� Aumento da taxa de maturação in vitro;� Aumento da taxa de maturação in vitro;

Tratamento Imaturo Maturo Total

controle 88 (56.8%)a 67 (43.2%)a 155 (31.4%)

50µM Cisteamina 84 (57.5%)a 62 (42.5%)a 146 (29.6%)

100µM Cisteamina 89 (46.4%)b 103 (53.6%)b 192 (38.9%)

Total 261 232 493

Atividade Proposta!

• Em duplas:

• Escolha uma espécie para pesquisa.....;

• Encontre um artigo sobre maturação in vitro de • Encontre um artigo sobre maturação in vitro de

oócitos;

• Estude o diferencial da espécie e o protocolo aplicado;

• Será discutido na próxima aula prática!

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