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EXPLORACIÓN Y ANALISIS DE LA SINTESIS DE UN BIOCATALIZADOR PARA LA OBTENCION DE BIODIESEL.
Juan Camilo Naranjo Beltrán
Universidad de los Andes
Facultad de Ingeniería
Departamento de Ingeniería Química
Bogotá – Colombia
2008
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EXPLORACIÓN Y ANALISIS DE LA SINTESIS DE UN BIOCATALIZADOR PARA LA OBTENCION DE BIODIESEL.
Juan Camilo Naranjo
Autor
M.Sc. Andrés Córdoba
Asesor
Dr. Juan Carlos Moreno P.
Asesor
Universidad de los Andes
Facultad de Ingeniería
Departamento de Ingeniería Química
Bogotá – Colombia
2008
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Nota de Aceptación
_______________________
_______________________
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_______________________
_________________________________
M.Sc. Andrés Córdoba Asesor
_________________________________
Dr. Juan Carlos Moreno P Asesor
_________________________________
M.Sc. y P.H.D Pablo Ortiz Jurado
Bogotá – Colombia
2008
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“¿Estudie Que?”.
“ I guess This is Growing Up!”
“ Con las palabras sabias de Sócrates: Me tome que?! ”
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AGRADECIMIENTOS
Son tantas las personas que me ayudaron, me enseñaron, me corrigieron y me animaron durante la carrera. Mis padres, Yolanda y Armando gracias por brindarme esta oportunidad y por estar al lado mío y tenerme paciencia. Mis hermanos, Diana y Diego gracias por todo y por tenerme paciencia. Mis amigos, Forradita futbol club, Mauricio Peña, Rodrigo Heredia, Claudia Ruiz, Brisa Salamanca, Nadia Chávez, John Fontecha, gracias, ustedes son la motivación y es por ustedes que estoy en donde estoy.
Diana Carolina Heredia, son raros los momentos en donde uno encuentra personas que le cambian la vida por completo, gracias por aparecerte en mi vida y aun dejar tus huellas en mi.
A mi familia que son como un carbón activado, dentro de todo el desorden y caos, juntos y unidos hacemos parte de algo magnifico y maravilloso.
Los profesores de Ingeniería química, ya que son la motivación y el ímpetu en nuestra vida universitaria.
Jose Maria, El Mono, Luis Fernando y Veronica, Luz Dary, Sonia, Andres, Vanessa, Diana y Giovanny sin ustedes esto no existiría.
Gracias John Fontecha, es en los momentos difíciles y Abrumadores donde uno encuentra guías, amigos, compañeros que uno nunca olvida, gracias esta tesis es tuya también, lo logramos!!!
Para mis asesores, Andrés Córdoba y Juan Carlos Moreno gracias por la confianza y la paciencia y la oportunidad de hacer esto realidad muchísimas gracias.
Gracias a todos y a nadie, a muchos y a pocos, pero especialmente gracias a ustedes siempre los llevare en mi mente.
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CONTENIDO
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 1
2. JUSTIFICACIÓN 2
3. OBJETIVOS 3
3.1. OBJETIVO GENRAL 3
3.2. OBJETIVO ESPECÍFICO 3
4. MARCO TEÓRICO 4
4.1.ORIGEN E HISTORIA DEL BIODIESEL 4
4.1.1.Síntesis del Biodiesel 5
4.1.2.Vías Iniciales de Síntesis de Biodiesel 5
4.1.3. Catalizadores Recientes para la Sístensis de Biodiesel 6
4.1.3.1. Recientes Desarrollos en Catálisis para Síntesis de Biodiesel 6
4.2. CARBON ACTIVADO Y TELA DE CARBON ACTIVADO (TCA) 7
4.3. OLEOQUIMICA 8
4.3.1. Reacciones a partir de la Molécula de Biodiesel 10
4.4. CATALISIS Y CATALIZADORES 10
4.4.1 Definición 10
4.4.2. Tipos de Catálisis 11
4.4.3 Catalizadores 12
4.5. BIOCATALISIS 15
4.5.1. Biocatalizadores 16
4.5.2. Enzima 16
4.5.2.1. Definición 16
4.5.2.2. Clasificación Enzimática 18
4.5.2.3. Enzimas como Catalizadores 19
4.5.2.4. Lipasas 20
4.5.2.4.1 Características de las Lipasas 20
4.5.2.4.2. Clasificación de la Lipasa 20
4.5.2.4.3. Reacciones Catalizadas por Lipasas 20
4.5.2.4.4. Importancia de la Lipasa en la Industria 21
7
4.5.2.5. Pseudomona Cepacia y lipasa de Pseudomona Cepacia 22
4.5.2.5.1. Lipasa de Pseudomona Cepacia 22
4.5.2.6. Inmovilización de una Enzima 22
4.5.2.6.1. Tipos de Inmovilización 22
4.5.2.7. Soportes para la Inmovilización de la Lipasa 24
4.5.2.7.1. Ventajas en la Inmovilización de la Lipasa 24
5. CARACTERIZACION Y MÉTODOS DE ANÁLISIS 25
5.1 Método de Análisis de la Experimentación 25
5.2. Caracterización de la Concentración y Cantidad de Lipasa en una Solución e
Inmovilizada en un Soporte 25
5.3. Difracción de Rayos por (DRX) 26
5.4. Análisis Termo Gravimétrico (TGA) 27
5.5. Textura de Superficie, Morfología y Tamaño de Cristal 28
5.6. Adsorción de Gases 28
6. CARACTERIZACIÓN 33
6.1. CARACTERIZACIÓN DEL SOPORTE EN ESTE CASO LA TELA DE CARBONO 33
6.2. INMOVILIZACIÓN DE LA ENZIMA EN ESTE CASO LA LIPASA EN LA TELA DE
CARBONO 35
6.3. OBTENCIÓN DE BIODIESEL UTILIZANDO EL SISTEMA DE SOPORTE LIPASA 36
7. RESULTADOS Y ANALISIS 38
7.1. ISOTERMAS DE ADSORCION 38
7.2. D.R.X. 40
7.3. TITULACION BOEHM 40
7.4. PRUEBA DE CARGA DE CERO 41
7.5. INFRARROJO 41
7.6. INMOVILIZACION ENZIMATICA 42
7.7. DISEÑO EXPERIMENTAL 46
7.8. S.E.M. 47
7.9. INFRARROJO 48
7.10. ISOTERMA DE ADSORCION PARA SISTEMA SOPORTE CATALIZADOR 50
8
8. CONCLUSIONES 52
9. RECOMENDACIONES 53
BIBLIOGRAFIA 54
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1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La creciente problemática ambiental a nivel mundial, y el temor hacia la escasez del petróleo, ha
incentivado al hombre a asumir dentro de sus responsabilidades, el proponer una alternativa
energética y su aplicabilidad. Una de estas alternativas es conocida como Biodiesel, la cual
consiste en obtener diesel a partir de fuentes renovables.
Uno de los aceites destacado por tener características propicias para la obtención de biodiesel, es
el aceite de palma, Colombia es el cuarto productor a nivel mundial. En el litoral del Pacifico
Colombiano se encuentran cultivadas cientos de hectáreas de palma africana, siendo esto un
factor importante para el desarrollo de estudios e investigaciones en el área de la Oleoquímica. [1].
En el estudio que se va a llevar a cabo se busca la síntesis de biodiesel utilizando lipasas como
biocatalizador. El biocatalizador será soportado en un material carbonoso. Las lipasas son enzimas
que tienen la capacidad de catalizar reacciones de hidrólisis, esterificación y transesterificación en
presencia de una pequeña cantidad de agua. Este tipo de catalizador produce un producto más
puro que con otros catalizadores, por esta razón la necesidad de purificar el producto, o
descontaminar aguas es innecesario.
Las lipasas se encuentran en todos los organismos vivos y pueden ser de origen microbiano,
animal o vegetal. Las lipasas microbianas se obtienen a partir de una amplia variedad de
microorganismos como hongos y bacterias como por ejemplo: Aspergillus niger, Candida rugosa, Penicillium cyclopium, Pseudomona aeruginosa, Pseudomona Putida, Rhizopus boreas, entre otros.
Dado que las lipasas son un recurso de fácil obtención, el cual representa un gran potencial en el
sector industrial, es viable realizar un estudio que involucre las lipasas como biocatalizador, y
posibilite una alternativa para la producción de biodiesel.
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2. JUSTIFICACIÓN
La importancia que día a día toma la conservación del medio ambiente y la elaboración de
productos a base de materiales biodegradables que ayuden a la preservación del mismo, son la
base fundamental en esta investigación. Ésta busca diseñar un protocolo experimental que
optimice la producción de biodiesel, utilizando lipasas de origen bacteriano como biocatalizador,
pues son de fácil accesibilidad y presentan un gran potencial en el sector industrial.
El desarrollo de esta investigación trae consigo un aporte significativo, no solamente a la Facultad,
sino también a la Universidad, al abrir una alternativa hacia la producción de Biodiesel a partir de
un nuevo catalizador y al ampliar el conocimiento de dicho catalizador.
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3. OBJETIVOS
3.1.OBJETIVO GENERAL
Obtener un biocatalizador a partir de una lipasa de origen bacteriano para optimizar el proceso de
síntesis de biodiesel.
3.2.OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Caracterizar textural y químicamente un sólido que actúe como soporte catalítico de las
lipasas.
• Establecer las variables apropiadas para fijar la lipasa en el soporte.
• Caracterizar texturalmente y químicamente el sistema soportelipasa.
• Explorar las condiciones experimentales adecuadas para utilizar el biocatalizador en el
proceso de optimización para la síntesis del biodiesel.
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4. MARCO TEÓRICO
4.1. ORIGEN E HISTORIA DEL BIODIESEL.
El biodiesel es un combustible líquido proveniente de una biomasa, de aceite vegetal nuevo o
usado y/o grasa de animales; se obtiene por medio de la reacción de transesterificación y es
implementado como alternativa para usarse como combustible cotidiano, ya que presenta una alta
estabilidad, reducción en las emisiones de gases de tipo invernadero, es renovable y relativamente
más económico que el combustible proveniente del petróleo. [2]
El uso del biodiesel se hizo por primera vez hacia 1898 cuando Rudolph Diesel lo implementó, para
demostrar un motor de ignición por compresión que llevaba su propio nombre en una exhibición en
Paris. El tipo de biodiesel que utilizó fue proveniente de aceite de maní. Paralelo a Rudolph Diesel,
Henry Ford promulgó el uso de biocombustible a partir de etanol para su motor modelo T en 1908.
El uso de combustible proveniente de aceite vegetal fue utilizado en motores hasta 1920, cuando
se le realizaron alteraciones a los motores, para que trabajaran con residuos de petróleo, lo cual es
conocido como el diesel de hoy en día. [3]
En 1937 se conoce la primera patente otorgada a G. Chavanne de la universidad Bruselas,
Bélgica. Esta patente (# 422,877) describe el uso de metil ésteres provenientes del aceite de
palma, en las décadas siguientes no se hicieron investigaciones importantes con respecto a el
biodiesel. A finales de 1970 y comienzo de 1980 se retomó el interés por el biocombustible debido
al incremento de los precios del petróleo. [4]
Hoy en día la temática se ha profundizado e investigado hasta el punto de contemplar
catalizadores, enzimas, y optimización de procesos para poder obtener una mayor producción de
biodiesel que pueda contrarrestar la dependencia del petróleo como única fuente de energía.
A continuación se ilustra la configuración de la molécula biodiesel.
COOH R − ´ (1) Configuraron de la molécula de biodiesel. [4]
Donde R´ es una cadena de hidrocarbones con más de 10 carbonos.
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4.1.1. Sintesis de Biodiesel. La reacción química de biodiesel consiste en reacciones reversibles
consecutivas que producen como resultado moléculas de metil éster. La reacción inicia con la
conversión de triglicéridos a diglicéridos, que a su vez se convierten a monoglicéridos, los cuales
sufren a su vez una conversión a glicerol. Durante todo este proceso se libera moléculas de metil
éster por cada conversión que sufre la molécula. A continuación se ilustra la reacción general y la
reacción detallada de esterificación de los triglicéridos. [5]
(2) Ecuación general de la reacción de transesterificación de triglicéridos [5]
(3)
Ecuación detallada de la reacción de transesterificación de triglicéridos [5]
4.1.2. Vías Iniciales De Síntesis De Biodiesel. En las investigaciones iniciales acerca de la
producción de biodiesel se estudió la implementación de la catálisis ácida o In Situ que utilizaba ácido sulfúrico, fosfórico, clorhídrico, entre otros. Este tipo de catálisis es más apropiada para
glicéridos que contiene alto contenido de agua y de ácidos grasos libres. La catálisis In Situ hace posible la esterificación y extracción del producto en el mismo proceso, esto significaba que el
alcohol actuaba tanto como agente esterificante como solvente extractor. [5]
Posteriormente se investigó el uso de catalizadores Alcalinos como el hidróxido de sodio, hidróxido
de potasio, entre otros. El proceso de transesterificación catalizado con agentes alcalinos es
aproximadamente 4000 veces más rápido que la reacción por medio de catálisis ácida o In Situ y presentan altos niveles de conversión. Para utilizar este tipo de catalizadores se deben tener en cuenta las variables de proceso, tales como, temperatura, relación molar del alcohol con respecto
6
al aceite y tipo de catalizador. La implementación de este tipo de catalizadores fue acogida por la
industria debido a la economía que representaba el uso del catalizador y su duración en el
proceso. Este tipo de catalizadores presentan problemas tales como: la recuperación del glicerol
es tediosa, el catalizador tiene que ser removido del producto, se tiene que implementar un sistema
de tratamiento para las aguas alcalinas provenientes del proceso y tanto los ácidos grasos como el
agua interfieren en la reacción. [5]
Es por esta razón que las investigaciones de hoy en día están dirigidas utilizar diferentes sistemas
de catalizadores, como soportes metálicos, soportes a partir de sólidos porosos y biocatalizadores
que permiten atenuar dichos inconvenientes.
4.1.3. CATALIZADORES RECIENTES PARA LA SÍNTESIS DE BIODIESEL.
Nuevos tipos de catalizadores como sistemas de catalizadosoporte fueron estudiados en la
síntesis de biodiesel. Los catalizadores heterogéneos son una alternativa para la producción de
biodiesel, entre ellos se encuentran los soportes metálicos y los soportes porosos, que son
utilizados para inmovilizar los catalizadores. Estos aportan una mayor área superficial de activación
y un óptimo uso de los catalizadores. [5]
Como alternativa al uso de catalizadores orgánicos e inorgánicos, se están haciendo estudios con
biocatalizadores. Estos son enzimas que también atenúan el problema presentado por los
catalizadores iníciales. Estas enzimas, en particular las lipasas, presentan un buen desempeño
catalítico lo que resulta en una tasa elevada de conversión de biodiesel. El biocatalizador presenta
un proceso más limpio de producción de biodiesel con respecto otros catalizadores. El alto costo
de la enzima cohíbe la propagación de este método en la industria. El inmovilizar estas enzimas en
soportes hace que los sitios de activación estén mejor ubicados permitiendo así una mayor
conversión. [6]
4.1.2.3.1 Recientes Desarrollos En Catálisis Para Síntesis De Biodiesel. Recientes estudios en
el área de producción de biodiesel han permitido a científicos experimentar con la producción de
biodiesel sin la necesidad de utilizar catalizadores. Saka y Kusdiana lograron demostrar que el
precalentar el aceite a una temperatura de 350°C y tratarlo con etanol supercrítico durante 240
segundos, se podía obtener metil ésteres. Fue demostrado que la conversión de metil éster fue
mayor con el metanol supercrítico, que con cualquier otro tipo de catálisis, y a su vez, la
purificación del producto es más sencilla debido a que el proceso no es catalítico. Sin embargo, la
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esterificación vía metanol supercrítico necesita de altas temperaturas (350°C) y una presión
elevada (45MPa), lo cual se traduce a un mayor consumo de energía. [5]
4.2. CARBÓN ACTIVADO Y TELAS DE CARBÓN ACTIVADO (TCA).
El carbón activado es un material poroso que presenta una gran área superficial y un nivel elevado
de porosidad, lo cual lo hace apropiado para la adsorción y para la función de soporte en las
reacciones que utilizan catalizadores.
El material carbonoso proveniente de madera, petróleo o carbón es calentado con unos gases
inertes en la ausencia de aire y en ocasiones se le adiciona productos químicos para favorecer la
porosidad. Este proceso deja como resultado un material poroso que normalmente contiene
hidrógeno. Este hidrógeno se puede activar por medio de una oxidación controlada con vapor o
dióxido de carbono lo cual también facilita la apertura de los poros e incrementa el área total
superficial, esta área superficial puede llegar a ser de 1200 m 2 /g, resultando en lo que se conoce
como carbón activado [7,8].
El carbón activado debe sus características superficiales y su porosidad al precursor y las
condiciones del proceso de carbonización y activación al que este fue sometido. El carbón activado
también presenta un alto nivel de adsorbancia debido a su naturaleza química, ya que en la
superficie se encuentran varios grupos funcionales, haciéndolo a fin a una amplia gama de
sustancias. Es por esta razón que el carbón activado puede ser utilizado como soporte cuando este
no interfiera en la reacción. Su utilización se destaca en el soporte de metales nobles en donde la
adsorción del carbono hacia moléculas orgánicas es fuerte. El carbono activado puede traer
impurezas que llegan afectar la reacción o el mismo soporte, estas impurezas se pueden eliminar o
disminuir con lavados ácidos. [7, 8]
Las telas de carbono o como también son conocidas TCA, son materiales que se han puesto de
moda debido a su elevada porosidad que dan como resultado grandes áreas superficiales (950 –
1550 m 2 /g),lo que las hace ideales para el proceso de adsorción en fase líquida o gaseosa. Estas
también presentan bajas caídas de presión y mayor flujo de masa. Así mismo tienen mayor
capacidad adsortiva que el carbón activado granular y una taza de adsorción superior. La única
falencia que presenta este producto es su alto costo de producción frente al carbón activado
general. [9, 10]
8
Figura 1. Estructura del Carbón Activado [11]
4.3. OLEOQUÍMICA
La industria Oleoquímica se encarga de la transformación de aceites vegetales en productos
empleados para la elaboración de cosméticos, jabones y en otras industrias. Los productos
oleoquímicos básicos como: ácidos grasos, alcoholes grasos, glicerina, ésteres metílicos y aminas
grasas, son obtenidos a partir de hidrogenación, hidrólisis y transesterificación. La producción de
estos ha logrado un incremento a nivel mundial por la tendencia y necesidad de remplazar
químicos sintéticos por productos de mejores características biodegradables, por el desarrollo de
nuevos productos oleoquímicos y por la variación en la demanda de productos derivados del
petróleo y del gas. Los productos oleoquímicos se encuentran divididos en dos grandes categorías:
[1]
Los productos oleoquímicos básicos obtenidos de una transesterificación y una hidrogenación son:
biodiesel, metil ésteres, alcoholes grasos, ácidos grasos, entre otros. [1].
Los productos oleoquímicos intermedios que son reproducidos por la etoxilación y/o sulfonación de
alcoholes grasos son: jabones, cosméticos, pinturas, farmacéuticas, agricultura entre otros. [1]
La figura 1 ilustra una visión global de la utilidad y el provecho que se puede dar al aceite de palma [1].
9 Figura 2. Rutas de producción a partir de aceite de palma [1]
10
Alcohólisis o Transesterificación [12]:
RCOOR′ + R′′OH <=>RCOOR′′ + R′OH (utilizando catalizador) (4).
4.3.1. Reacciones apartir de La Molécula de Biodiesel. Como se puede observar en la Figura 1,
el biodiesel o el metil éster puede formar otros productos a través de diferentes reacciones. Los
metil ésteres Alfasulfonados son el resultado de la reacción de sulfonación del biodiesel. La
sulfonación es una reacción química que permite que la molécula obtenga una parte a fín a las
grasas y otra parte a fín al agua [13]. De la misma forma, la hidrogenación del Metil éster produce
alcoholes grasos que a su vez pueden participar en reacciones de etoxilación, produciendo sulfato
de éter de alcohol graso, con el cual se elaboran espumas y cosméticos, o una reacción de
sulfonación que produce epoxilatos de alcoholes grasos.
4.4. CATÁLISIS Y CATALIZADORES.
Desde el primer uso en las industrias, los catalizadores facilitan la obtención de un producto debido
a que presentan otra ruta para la reacción del proceso que consume menos energía y menos
tiempo. Esto implica que se puede optimizar la cantidad y calidad de producto que se obtiene
mediante un proceso de reacción química que implementa catalizadores.
4.4.1. Definición. Catálisis se define como una reacción de tipo cerrado en donde se utiliza un
catalizador. La reacción catalítica se caracteriza por el aumento en la tasa de reacción con
respecto a la misma reacción sin uso de un catalizador [14].
11
Figura 3. Cantidad de energía que necesita una reacción cuando no está y Cuando esta catalizada [14].
El catalizador es un componente agregado a la reacción el cual permite que exista la catálisis entre
dos sustancias químicas. Éste, no afecta la naturaleza química de los productos y a la vez no altera
la afinidad termodinámica de la reacción con respecto a la constante de equilibrio. El catalizador
abre un nuevo camino para que se lleve a cabo la reacción, aumentando la velocidad de reacción y
disminuyendo la energía de activación. [8, 15, 16]
4.4.1. Tipos de Catálisis. Existen varios tipos de catálisis, una de ellas se denomina catálisis
homogénea, la cual hace referencia al catalizador cuando se encuentra en la misma fase de los
reactantes. El otro tipo de catálisis se denomina catálisis heterogénea, que significa que el
catalizador está en una fase diferente a la de los reactantes. [15]
Este trabajo implementará la catálisis enzimática, la cual consiste en producir biodiesel utilizando
lipasa, que es una enzima que logra catalizar reacciones de transesterificación. El tipo de catálisis
usada, se puede presentar tanto en una reacción de catálisis homogénea o heterogénea. [16]
12
4.4.2. Catalizadores. La función de un catalizador es modificar el camino de una reacción,
alterando la taza de reacción o la velocidad de reacción. Dentro de la preparación de los
catalizadores se involucran otros elementos que pueden llegar a ser fundamentales en el
catalizador [8, 15, 16,17]. En la tabla 2 se muestran algunos ejemplos de los tres componentes
que modifican la composición de un catalizador.
Tabla 1. Ejemplos de los elementos que hacen parte de un catalizador [17]
La fase activa, esta compuesta de metales de transición como también sus óxidos, sulfatos,
nitratos, carbonatos. Su característica principal recae en la habilidad de catalizar reacciones debido
a las múltiples aéreas superficiales con bajos estados electrónicos. Esta superficie facilita y acepta
electrones en el proceso de crear y romper enlaces superficiales [16, 17]. En la tabla 3 se
ejemplifican las fases activas más comunes.
Componentes Tipos de Materiales Ejemplos
Fase Activa Metales Metales nobles: Pt, Pd; Metales Base: Ni, Fe
Metales óxidos Metales óxidos de transición: MoO2, CuO
Metales Sulfurosos Metales sulfurosos: MoS2, Ni3S2
Promotores
Texturales Metales Óxidos
Metales de Transición y grupo IIIA: Al2O3, SiO2, MgO, BaO,
TiO2, ZrO2
Químicos Metales Óxidos Álcali o tierra alcalina: K2O, PbO
Soporte
Óxidos Metálicos de
alta área Superficial,
Grupo IIIA, Arcillas, Óxidos de metales de Transición:
Al2O3, SiO2, MgO, Zeolitas, Carbón Activado.
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Tabla 2. Fase activa y reacciones que catalizan [17]
Fase Activa Elementos/compuestos Reacciones Catalizadas
Metales
Fe, Co, Ni, Cu, Ru, Rh, Pd, Ir,
Pt, Au. Hidrogenación, Deshydrogenacion, Oxidación
Óxidos
Óxidos de V, Mn, Fe, Cu, Mo,
W, Al, Si, Sn, Pb, Bi.
Oxidación completa y parcial de hidrocarburos, síntesis de
Metanol, Reacciones con catálisis acida.
Sulfurosos Co, Mo, W, Ni. Hydrotratamientos, Hidrogenación
Carbonosos Fe, Mo, W. Hidrogenación y Síntesis de FT
El promotor es una sustancia que se agrega en la preparación del catalizador y ayuda en la
selectividad, estabilidad y actividad del catalizador. Éste se divide en dos tipos: el promotor textural,
el cual facilita la preparación de un catalizador bien esparcido y ayuda a mantener ese mismo
catalizador fijo durante la reacción, ejemplo de estos son la alúmina y la sílica; y el promotor
químico, que es un aditivo que aumenta la selectividad de la fase catalítica, ejemplos de este tipo
son óxidos de metales, y algunos metales alcalinos entre otros. [16,17]
El soporte de un catalizador es de suma importancia ya que presenta una gran área superficial,
porosidad, y la capacidad de mantener y sujetar el catalizador durante la reacción. Las áreas
superficiales de dichos soportes oscilan entre 1.5 – 1500 m 2 /g, el volumen de los poros oscila
entre 0.4 – 1 cm 3 /g, y el diámetro de los poros oscila entre 0.4 – 200nm. Existen varios tipos de
poros como [17]:
Macroporos: poros con diámetros mayores a 50 nm
Mesoporos: poros con diámetros de 3 – 50 nm
Microporos: poros con diámetros menores a 3 nm
14
Figura 4. Tipos de poros que se encuentra en un soporte poroso [11].
En la tabla 3, se muestran las características superficiales de los soportes más usados
comercialmente.
Tabla 3. Propiedades físicas de los soportes [17]
Soporte Área Bet(m 2 /g) Volumen de Poro (cm 3 /g) Diámetro de Poro
Carbón Activado 500 1500 0, 0,8 0,6 – 2
Zeolitas (tamices moleculares 500 1000 0,5 0,8 0,4 1,8
Gel de Silica 200 – 600 0,4 3 20,
Arcillas Activadas 150 – 225 0,4 0,52 20
Activado 100 300 0,4 0,5 6 40,
Celita 296 4,2 1,14 2200
Existen varios tipos de catalizadores que tienen un uso particular dependiendo de la reacción o
manejo de costos que se esté llevando a cabo. Estos tipos de catalizadores son [15,16]:
Catalizadores Porosos: Estos son catalizadores que presentan gran área superficial debido a su
estructura porosa. (Raney niquel)
Catalizadores con Tamiz Molecular: Estos son catalizadores que debido al tamaño de sus poros
permiten el paso de algunas moléculas y otras no las deja pasar. (zeolitas)
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Catalizadores Monolíticos: Estos consisten en catalizadores con estructura de panal que presentan
una gran área geométrica superficial, tienen una alta densidad celular y trabajan a una fracción de
caída de presión.
Catalizadores soportados: Como lo hace evidente el nombre estos son catalizadores inmovilizados
en un soporte metálica o de aleación metílica.
Biocatalizadores: Son catalizadores biológicos como las enzimas o células enteras.
La tabla 5 hace referencia a la implementación catalizadores a través de la historia.
Tabla 4 Uso de Catalizadores en la industria [17]
Año de
Comercialización Proceso o Reacción Catalizador Área de industria
1875 oxidación Pt, V2O5 Química
1913 Síntesis de Amonio Fe/Al2O3/K2O Fertilizantes Químicos
1930 Síntesis de FischerTropsch Fe/CuO,Co/Kieselguhr Petroleras
19361942 Cracking Catalítico SiO2 Al2O3 Petroleras
1942 Alcalinización de Parafinas H2SO4 Petroleras
1950 Reformación de Naftaleno Pt/ Al2O3 Petroleras
1960 Proceso de Wacker PdCl2 Química
1980 1995 Reacciones Selectivas por tamaño Nuevas Zolitas, ZSM5 Petroquímicas
4.5. BIOCATÁLISIS.
Se da el nombre de biocatálisis o catálisis enzimática aquellos procesos que utilizan enzimas
aisladas, microorganismos o células enteras como catalizadores (biocatalizadores) con el fin de
convertir un sustrato en producto. Este tipo de catálisis a tomado mayor fuerza durante las últimas
dos décadas debido a la metodología limpia y eficiente, la cual la hace perteneciente al campo de
la “Química Verde “[18,19, 20].
16
4.5.1. Biocatalizadores. La biocatálisis hace uso de enzimas aisladas como de células enteras. El
uso de cualquiera de estos catalizadores trae consigo ventajas y desventajas. El utilizar células
enteras como catalizador evita el uso de etapas de extracción y purificación, pero el paso de
sustrato y de productos a través de la membrana y la pared celular puede ser dispendioso,
extendiendo en tiempo la reacción o obligando a utilizar mayor energía para llevar a cabo la
reacción de una forma más óptima. Esto no es el caso de las enzimas ya que tienen una velocidad
de reacción mayor a la de células enteras pero en varios procesos se debe hacer uso de procesos
de extracción, purificación y además son muy costos lo cual no lo hace atractivo para el uso en el
sector industrial [20].
4.5.2. Enzima.
4.5.2.1. Definición. Las enzimas son macromoléculas del tipo proteínas. Su función principal es
catalizar las reacciones químicas que tienen lugar en el metabolismo de todas las células, es por
esto que son consideradas como una de las partes más importantes en todos los sistemas vivos
(invivio) por igual son capaces de catalizar reacciones en donde intervienen sustratos naturales
como no naturales (invitro). Su característica principal es la especificidad de su actividad catalítica,
esto se debe a que poseen un sitio activo formado por secuencias de aminoácidos que determinan
su estructura tridimensional. Pequeños cambios en algunas de las moléculas que conforman la
proteína se ven reflejados en cambios en la estructura de las proteínas [21].
La estructura de una enzima está compuesta por 3 estructuras diferentes, cada una se ve
influencia y obtiene su forma dependiendo de los enlaces que se presente. La estructura primaria
está conformado por secuencias de aminoácidos que se encuentran unidos por enlaces peptidicos.
Figura 5 Estructura primaria 1 [22].
La estructura secundaria está conformada por enlaces de hidrogeno que están presente en la
cadena polipeptídica lo cual pude dar una conformación de tipo αhelicoidal o de lamina β. La
estructura terciaria le da la forma globular a la enzima, la cual se mantiene debido a los enlaces
disulfuro entre los grupos tiol adyacente como también a los enlaces iónicos que existen entre los
grupos carboxílicos libres y grupos amino. Estas estructuras le brindan tridimensionalidad a la
proteína como también lo hace los enlaces de hidrogeno y las interacciones hidrofóbicas [4].
17
Figura 6 Estructura Secundaria [22]. Figura 7 Estructura Terciaria [22].
Figura 8 Estructura de la Lipasa [23]
La sensibilidad de las enzimas esta dado por las estructuras que las conforman, es decir cambios
en el pH, temperatura, concentraciones de sales como también estar en presencia de disolventes
pueden provocar que la enzima pierda actividad o en el peor de los casos se desnaturalice, esto
significa la pérdida de sus estructuras. Es por esto que las condiciones óptimas de la mayoría de
las enzimas se encuentran a un pH de 7 y una temperatura de 37°C [24].
Para catalizar una reacción, la enzima disminuye la energía de activación por medio de la
formación del complejo enzimasustrato, sin embargo, ésta no afecta la constante de equilibrio de
la reacción ni la energía libre. La formación de este complejo es posible ya que en el sitio activo
existen numerosas interacciones débiles como fuerzas de Van der Waals, puentes de hidrogeno,
interacciones hidrofóbicas, interacciones electrostáticas y otras. El sustrato se une a la enzima en
este sitio activo, el cual posee un alto grado de especificidad, ya que solo un tipo definido de
sustrato está en capacidad de unirse al sitio activo según la enzima, así que solo este sustrato
acelerará su reacción gracias a la acción de la enzima correspondiente [25].
18
4.5.2.2. Clasificación Enzimática. Dada la gran variedad de enzimas existentes y su nivel de
especificidad, ha sido necesario desarrollar una clasificación que permita manipular de una manera
más fácil y organizada la información obtenida a partir del estudio de estas enzimas. Con este fin,
la Enzyme Commission (EC) decidió crear una clasificación, la cual está organizada de manera tal
que describe una gran variedad de enzimas, incluso diferenciando aquellas cuya reacción
catalizada es muy similar [25].
Esta clasificación está formada por las letras E.C., que hacen referencia a la Enzyme Comission, y
continúa con cuatro dígitos que describen la enzima según la clasificación que se explica a
continuación. Las letras A y B son utilizadas para identificar las sustancias involucradas en las
reacciones y la letra X indica el grupo químico principal que es transferido:
EC 1: OxidoReductasas: Estas enzimas catalizan las reacciones de oxidoreducción, que son la
trasferencia de átomos de hidrogeno, oxigeno o electrones de un sustrato a otro. El segundo digito
indica el grupo donador del átomo de hidrogeno o del electrón involucrado y el tercer dígito
describe el aceptor.
EC 2: Transferasas: Catalizan la transferencia de grupos químicos principales, en dos sustancias.
AX + B à BX + A (4)
El segundo dígito indica el grupo transferido y el tercer dígito indica la naturaleza exacta de este
grupo.
EC 3: Hidrolasas: A este grupo pertenecen las enzimas que ayudan con la hidrólisis, adhiriendo al
sustrato los elementos H+ y OH del agua
AX + H2O à XOH + HA (5)
El segundo dígito indica el grupo sobre el cual se realiza la hidrólisis.
19
EC 4: Liasas: Catalizan la separación o adhesión no hidrolítica de enlaces CC, CO, CN, entre
otras. El segundo dígito indica el tipo de enlace que rompe y el tercer grupo indica el grupo
removido
EC 5: Isomerasas: Estas enzimas catalizan la transformación de un compuesto químico en su
isómero. El segundo dígito indica el tipo de reacción involucrada y el tercero describe el tipo de
molécula sobre la cual actúa la enzima.
EC 6: Ligasas: Está involucrada en la unión de dos moléculas, donde además se lleva a cabo la
degradación de una molécula de ATP. El segundo dígito indica el tipo de enlace formado.
En general el segundo y tercer dígito indica el tipo de reacción catalizada, mientras que el cuarto
digito diferencia enzimas con la misma función, según el tipo de sustrato [25].
4.5.2.3 Enzimas como catalizadores. Las enzimas como todo catalizador, aceleran el curso de
las reacciones al disminuir la energía de activación necesaria para que se pueda llevar a cabo. Las
enzimas tienden a catalizar mejor las reacciones que los catalizadores inorgánicos. Su mejor
desempeño como catalizadores se debe a que las enzimas forman un complejo intermedio de
enzima sustrato que después va ser la encima inicial y el producto [26].
Una de las características de la enzima que predomina en su función como catalizador es su
selectividad. Esto hace referencia a un lugar importante en la enzima denominada, sitio activo. El
sitio activo normalmente está localizado en una cavidad o hueco dentro de la estructura de la
enzima. Este sitio activo posee dimensiones, topología y alineamientos característicos que
estructura la selectividad de la enzima.
Ventajas de catálisis enzimática en medio orgánico [26]:
Incrementa la solubilidad de los reactivos apolares.
Se produce un desplazamiento del equilibrio termodinámico a favor del proceso.
La recuperación de los productos de la reacción en disolventes de bajo punto de ebullición
es más sencilla.
Mayor estabilidad para las enzimas.
20
Existe la posibilidad de recuperación de las enzimas mediante filtración simple.
4.5.2.4. Lipasas. Las lipasas son uno de los grandes catalizadores de la naturaleza, ya que no
solo pueden catalizar las reacciones de hidrólisis en medio acuoso sino también tienen la habilidad
de catalizar reacciones en medios no convencionales como disolventes orgánicos. Este tipo de
reacciones ha permitido implementar diferentes técnicas en la industria y desarrollar diferentes
productos como esteres de sabor, biodiesel, entre otros [26]. Las lipasas catalizan la
transesterificación de las grasas de animales como también el aceite de vegetales con el fin de
producir ácidos grasos y glicerol. [27] Las lipasas se encuentran presentes en bacterias, levaduras
y hongos [22].
4.5.2.4.1. Características de las Lipasas. Las lipasas de origen microbiano en su mayoría
presentan su actividad máxima a intervalos de pH de 5.6 – 8.5, pero presentan su estabilidad a pH
neutro. Las lipasas se activan en intervalos de temperatura que varía desde 20°C – 45°C, aun así
el intervalo de óptimo funcionamiento de la lipasa se encuentran entre 30°C – 45°C. La mayoría de
las lipasas tienden a perder actividad hasta el punto de desnaturalizarse a temperaturas por
encima de 40°C [26].
4.5.2.4.1.1. Clasificación de la Lipasa. La lipasa pertenece al grupo de las hidrolasas y además
actúa sobre grupos ésteres, es decir, la clasificación numérica inicial de las lipasas es E.C.3.1. Por
ejemplo, la lipasa triacilglicerohidrolasa tiene clasificación EC 3.1.1.3. El primer dígito indica que es
una hidrolasa, el segundo dígito indica que actúa en los enlaces de ester, el tercer dígito indica que
es una carboxilester hidrolasa, y el último le da la clasificación definitiva, es decir
triacilglicerohidrolasa [27].
4.5.2.4.1.2. Reacciones Catalizadas por Lipasas. En general las reacciones que son catalizadas
por las lipasas son las siguientes [12]
Hidrólisis:
RCOOR′ + H2O >=>RCOOH + R′OH (6)
El resultado de esta reacción es un ácido en específico, un alcohol o la desintegración de la misma
grasa.
21
Esterificación:
RCOOH + R′OH <=>RCOOR′ + H2O (7)
Interesterificación:
RCOOR′ + R′′COOR*<=>RCOOR*+ R′′COOR′ (8)
Alcohólisis:
RCOOR′ + R′′OH <=>RCOOR′′ + R′OH (9)
Acidólisis:
RCOOR′ + R′′COOH =>R′′COOR′ + RCOOH (10)
4.5.2.4.1.3. Importancia de la Lipasa en la Industria. El uso de las lipasas a nivel industrial es
amplio gracias al vasto número de reacciones que catalizan. Entre ellas se encuentra la reacción
de hidrólisis en los aceites vegetales para producir ácidos grasos utilizados en la industria de:
cosméticos, jabones, detergentes y alimentos [10]. El interés que despiertan las lipasas se debe a
la capacidad de catalizar reacciones que involucran sustratos lípidos insolubles en agua, además
son excelente catalizadores para reacciones de hidrólisis como también para reacciones
reversibles como la esterificación, transesterificación y aminólisis en solventes orgánicos [12]. Las
lipasas presentan varias ventajas sobre catalizadores clásicos debido a su especificidad
(rigioselectividad y enantioselectividad) y trabajan a bajas temperaturas y presiones, lo cual le
permite catalizar reacciones reduciendo la producción de subproductos, lo cual se traduce a una
reducción de costos en tratamientos [22].
Tabla 5 Lipasas en procesos industriales [26,28]
Proceso Industria
Interesterificación de aceites y grasas Alimentaria
Esterificaciones e hidrólisis de esteres Alimentaria farmacéutica y química
Hidrólisis de aceites y grasas Detergentes, textiles alimentación, cosméticos
22
4.5.2.5. Pseudomona Cepacia y Lipasa de Pseudomona Cepacia. La pseudomona cepacia
ahora conocida como Burkholderia Cepacia fue descubierta en 1949 por Walter Burkholder. B.
Cepacia es una bacteria pateogena Gramnegativa que se encuentra comúnmente en la tierra y en
el agua. Este tipo de bacterias son resistentes a los antibióticos comunes [29, 30].
4.5.2.5.1. Lipasa de Pseudomona Cepacia. Este tipo de lipasa proviene de la bacteria
conocida como Pseudomona o Burkholderia cepacia. Esta lipasa tiene un alta resistencia a la
inhibición del metanol y además puede presentar altos niveles catalíticos en poca presencia de
agua. Es por estas razones que la B. cepacia está siendo estudiada profundamente en la catálisis
de la reacción de transesterificación [31].
4.5.2.6. Inmovilización de una Enzima. El inmovilizar una enzima presenta grandes beneficios
para la estructura de dicha enzima, para aumentar la actividad catalítica entre otros, pero es
importante entender el proceso de inmovilización con el que se logra inmovilizar la enzima [26].
La inmovilización de una enzima se entiende como él en confinamiento de dicha enzima a un
espacio específico con el cual se va dar lugar a formas insolubles que retendrán su actividad
catalítica y la brindara la facilidad de poder ser utilizadas más de una vez. La inmovilización de una
enzima se puede presentar bajo dos modalidades, retención física y unión química [26].
4.5.2.6.1. Tipos de Inmovilización [26].
Retención Física:
Atrapamiento: Este método de inmovilización consiste en retener la enzima dentro de las
cavidades o poros que se presentan en una matriz solida porosa en soportes de tipo
poliacrilamida, colágeno o resinas de poliuretano. Esta inmovilización se hace en una
suspensión de la enzima en una solución del soporte que se vaya a utilizar.
Inclusión en membranas:
• Microencapsulacion: Este método consiste en encapsular la enzima con una
membrana semipermeable que permita el paso de los sustratos y productos más
no el de la enzima. Este tipo de inmovilización se utiliza en la industria alimenticia.
23
• Reactores de Membrana: Reactores que emplean membrana permeables al
producto final, sustrato inicial e impermeables a la enzima. Se produce una
adsorción de la enzima sobre la membrana. Esta adsorción se puede llevar a cabo
por medio de contacto continuo de la enzima con la membrana o mediante el paso
de una solución buffer con la enzima por la membrana.
Union Química:
Reticulado: Este método también es denominado entrecruzamiento o “crosslinking”. El
método hace uso de reactivos bifuncionales que crean uniones intermoleculares entre la
estructura de la enzima, ejemplos de estos reactivos son: diiminoésteres, diisocianatos,
sales de bisdiazonio.
Adsorción: Este método es el mas empleado para la inmovilización de las enzimas. La
enzima es inmovilizada al soporte debido a las interacciones iónicas presentes tanto en el
soporte como en la enzima. Estas interacciones iónicas pueden ser, fuerzas de Vander
Waals y puentes de hidrogeno.
Union covalente: Este método se basa en la activación de los grupos químicos situados en
el soporte para que reaccionen con los nucleófilos de las enzimas, los grupos químicos de
la enzima que reaccionan se encuentran en la superficie de la enzima.
Todos estos métodos son utilizados y no se puede afirmar que alguno sea mejor que otro, ya
que cada uno tiene su función y su fin particular, con el propósito de visualizar las ventajas y
desventajas que presentan estos métodos frente a sí mismos a continuación se presenta una
tabla con sus debilidades y fortalezas.
24
Tabla 6. Tabla Comparativa entre los Métodos de Inmovilización de Lipasa [26].
Método Inclusión en membranas Atrapamiento Reticulado Adsorción Química Union Covalente
Preparación Intermedia Difícil Intermedia Sencilla Difícil
Fuerza de Ion Débil Media Débil‐Media Media Fuerte
Actividad Enzimática Media‐Alta Baja Baja Media Alta
Regeneración soporte Posible Imposible Imposible Posible Difícil
Coste de proceso Media‐Alta Medio Medio Bajo Alto
Estabilidad Media Alta Alta Baja Alta
Validez General General Limitada General Limitada
Resistencia
Microbiana Si Si Si Si Si
4.5.2.7. Soportes para la Inmovilización de la Lipasa [26]. Los soportes utilizados en la
inmovilización de la lipasa se pueden clasificar bajo dos grupos.
EL primero grupo se conoce como los soportes inorgánicos donde se encuentra una gran variedad
de soportes como: sílice, bolas de vidrio, alumina, ortofosfatos entre otros.
El segundo grupo de soportes se denomina soportes orgánicos, estos a su vez se subdividien en
varios grupos como:
Protenia fibrosa (colágeno, queratina, etc)
Polimeros sinteticos (acrilatos, acrilamidas,etc)
Polisacáridos (sefadez, celulosa, agarosa, quitina, etc)
Hidrogeles, resinas, etc
4.5.2.7.1. Ventajas en la Inmovilización de la Lipasa:
Reutilización de la lipasa, disminuyendo costos de materia prima.
25
Aumento en la estabilidad de la enzima frente a pH y temperatura.
5. CARACTERIZACIÓN Y MÉTODOS DE ANÁLISIS
5.1. MÉTODO DE ANÁLISIS DE LA EXPERIMENTACIÓN.
Para analizar y estudiar los factores que influyen en la experimentación se implementarán los
diseños factoriales. Estos diseños se utilizan para aquellos experimentos en los que hay más de
una variable que pueda afectar la respuesta(s) del sistema, en este caso dichas variables se les
conoce como factores. Hay varios tipos de modelos que permiten el estudio de casos especiales
dentro del diseño de experimentos, dentro de los casos especiales que se pueden considerar es
importante mencionar el modelo 2 k , puesto que es uno de los más usados, ya que permite hacer
un tamizado de los factores que pueden afectar la respuesta(s) del sistema; es decir permite
determinar qué factores son los que realmente ejercen un efecto significativo sobre el valor de ésta;
la ventaja es justamente que se puede utilizar en las etapas iniciales del proceso de
experimentación. El nombre de 2 k se debe a que se pueden tener k variables como factores y cada
factor tiene solo dos niveles, los cuales pueden ser representados en forma cualitativa o
cuantitativa; por lo general los niveles de cada factor son conocidos como nivel alto(+) y nivel bajo(
). El modelo consiste en generar todas las posibles combinaciones de los niveles entre factores.
El hecho de que se consideren solo dos niveles por cada factor, permite suponer que la respuesta
esta linealmente influenciada por cada factor en el intervalo delimitado por los niveles de cada uno.
Así mismo al aumentar la cantidad de factores y el número de replicas a analizar, aumentan
igualmente el número de posibles combinaciones entre factores generando también un aumento en
los costos y tiempo de experimentación [32].
5.2. CARACTERIZACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN Y CANTIDAD DE LIPASA EN UNA
SOLUCIÓN E INMOVILIZADA EN UN SOPORTE.
Para la determinación de la cantidad de lipasa a utilizar y presente en las soluciones, se utilizará el
método de biuret en medio alcalino, el cual consiste en la formación de un complejo de color violeta
entre el Cu +2 y los grupos NH. La intensidad de dicho color esta dictaminado por la cantidad de
proteína presente en la solución. Este tipo de método es muy específico ya que pocas sustancias
interfieren con el resultado. La sensibilidad del método es muy baja por lo cual siempre es
recomendado hacerlo cuando la concentración de la proteína es alta. El Cu +2 se une al enlace
peptídico de las proteínas produciendo el color violeta. Estas muestras se deben leer a una
26
longitud de onda de 540 – 560 nm. La sensibilidad de la prueba está en un rango de – 6 mg/ml de
proteína [33, 34].
Para la determinación de la concentración de la lipasa se llevara a cabo una curva de calibración a
partir de Albumina Bovina, ya que este es el método estándar para cuantificar la concentración de
proteínas que son demasiado costosas como para hacer la curva de calibración con la proteína en
cuestión.
Utilizando la curva de calibración que resulta siendo una línea recta, y su ecuación de forma
Y= Mx + B (11)
Se puede determinar la concentración que se encuentra en una muestra y además la cantidad en
masa que se encuentra presente.
Técnicas de Caracterización del Soporte:
5.3. DIFRACCIÓN DE RAYOSX (DRX).
El DRX se utiliza para análisis químico cualitativo y cuantitativo en una sola fase. La
fundamentación teórica de esta técnica recae en la composición cristalina de cada sustancia. Esta
composición cristalina es formada por el ordenamiento de átomos que forman planos consecutivos
capaces de difractar rayos x. EL ángulo de difracción difiere en todos los planos de un cristal, por
ende cada compuesto o elemento es identificado por un patrón propio de difracción. La diferencia
de cada patrón permite reconocer diferentes estructuras dentro del material bajo estudio [16].
Para que ocurra la difracción se debe satisfacer la “ley de Bragg”, la cual hace alusión a la
existencia de partículas a escala atómica y la manera como reflejan los rayosx, así como se
ilustra en la figura 7. [35]
Figura 9. Difracción de rayos x [36]
θ λ sin * * 2 * d n = (12) Ecuación de la ley de Bragg [36]
27
n= un entre determinado por el orden dado
λ= Longitud de onda del rayox y electrones protones y neutrones en movimiento.
D= es el espaciamiento entre los planos atómicos
Θ= ángulo entre el rayo incidente y las partículas.
5.4. ANALISIS TERMO GRAVIMETRICO (TGA).
Un método para conocer el estado oxidado de un sólido, es por medio de la reducción u oxidación
de una muestra en un sistema controlado y cuantificar el cambio de peso por medio de técnicas de
microbalanza, como el (TGA) [16].
Para llevar a cabo este análisis, una muestra de 5 a 100 mg se lleva al equilibrio mediante una
temperatura particular, en una corriente de gas inerte. Luego un gas reactivo es incorporado en la
corriente del gas inerte. El H2 es utilizado cuando se va llevar a cabo una reducción y O2 cuando se
va a llevar a cabo una oxidación. Estos cambios de estado se asocian con cambios de peso. Lo
cual puede brindar información acerca del estado de valencia de la muestra [16]. La figura 8
ejemplifica un comportamiento general de peso versus tiempo y temperatura, para demostrar el
efecto de la reducción u oxidación en el peso de una muestra.
Figura 10. TGA [16].
5.5. TEXTURA DE SUPERFICIE, MORFOLOGÍA Y TAMAÑO DE CRISTAL.
El microscopio electrónico, es una herramienta útil para observar e investigar la estructura química,
textura superficial, morfología y tamaño de cristal de una muestra [16].
Ganancia de Peso
Pérdida de Peso
Minutos
% en Peso
Temperatura °C
28
S.E.M., con sus siglas en ingles significa microscopía electrónica de barrido, la cual proporciona un
análisis de superficie con resoluciones hasta de 1 a 20 nm. Este tipo de microscopio registra y
detecta los electrones que son reflejados por una muestra, la topología de la misma, produce
variación en la intensidad de los electrones. [16]
5.6. ADSORCIÓN DE GASES.
La adsorción y desorción son fenómenos importantes en una reacción catalítica. El catalizador
puede tener en su superficie lugares óptimos para la adsorción de las moléculas.
La adsorción es un fenómeno superficial en el cual hay enriquecimiento de una sustancia en la
superficie de un sólido y puede ser de dos tipos, fisisorción ó quimisorción [16].
La fisisorción es la condensación no selectiva de moléculas gaseosas sobre un sólido. Ésta se da
por la interacción física entre adsorbato y adsorbente. A temperaturas bajas las fuerzas atractivas
que trabajan en este proceso son principalmente del tipo Vander Walls [8,16].
La quimisorción es la adsorción química de gases reactivos en sitos activos de un sólido a
temperaturas altas [8,16].
La cuantificación de la cantidad adsorbida de una molécula se realiza por medio de isotermas,
donde se observa la cantidad de superficie cubierta por la molécula adsorbida, en un rango de
presiones manteniendo una temperatura constante. [10]
La figura 9 ilustra cómo se genera la adsorción de moléculas de nitrógeno en los poros de una
superficie sólida.
29
Figura 11. Adsorción de moléculas de N2 en los poros de un sólido.
Existen varios tipos de Isotermas, de acuerdo al fenómeno superficial que ocurra en el sólido bajo
estudio. Las isotermas más frecuentes son:
La isoterma de Langmuir, que se utiliza para adsorción en monocapas y en esta se asume que la
molécula es adsorbida por un solo sitio. Esto permite concluir que no hay interacción entre sitios.
[8]
Figura 12. Isoterma tipo 1 [11].
Este tipo de isoterma se encuentra con frecuencia en la caracterización de carbón activado, pero
sus fundamentos no se cumplen estrictamente, pero aun asÍ constituyen la parte inicial de toda
isoterma sobre superficies homogéneas [16].
30
La ecuación que caracteriza dicha isoterma es:
a
a
kP kP +
= 1
θ (13)
Ecuación la isoterma tipo 1 [8]
Θ= área superficial cubierta por la molécula.
K= constante de equilibrio de adsorción.
Pa= Presión del gas
La isoterma de Freundlich representa datos en un intervalo más amplio de Θ, que el modelo de
langmuir, además tiene en cuenta la disminución exponencial del calor de adsorción sobre la
superficie, su ecuación es:
n a cP 1
= θ (14)
Ecuación de Frundlich [8]
C=constante
Pa=presión del gas
n= constante que relaciona la interacción de moléculas adsorbidas.
Donde n es mayor que 1, y n y C decrecen a medida que la temperatura aumenta [8].
Figura 13. Isoterma de Freundlich [11].
Este tipo de isotermas son las más comunes en superficies heterogéneas.
31
La isoterma BET (Brunauer, Emmett y Teller) se utiliza para determinar el área interna de
materiales mesoporosos con áreas de superficie mayores a 1 o 2 m 2 /g hasta 1200 m 2 /g,
basándose en la adsorción y condensación de N2 liquido a 77 K, acoplado a un sistema de vacío
[16].
0
) 1 ( 1 ) 1 (
P P X
cVm X C
cVm X V X
=
− + =
− (15)
Ecuación de BET [16]
P0= presión de saturación
V= volumen adsorbido
Vm= Volumen adsorbido en la monocapa
C= Es una constante
Figura 14. Isoterma de adsorción en más de una capa de BET [16].
Este modelo de isoterma multicapa o BET se presenta cuando hay se presente adsorción en más
de una capa [16].
Otros tipos de isotermas que se presentan en carbones activados son ilustradas a continuación: [11]
32
. Figura 15. Isoterma lineal [11].
Las isotermas lineales no son comunes en la adsorción de sustancias en carbón activado ya que
este presenta un comportamiento de baja absorbancia.
.
Figura 16. Isoterma de Alta afinidad [11].
Las isotermas de alta afinidad muestran un incremento de adsorción marcado a bajas
concentraciones el cual es seguido por un pseudoplato.
Figura 17. Isoterma de Sigmoidal [11].
Las isotermas sigmoidales no son muy comunes ya que se necesita una superficie de alto grado de
homogeneidad como el caso de los carbones grafitizados,V3G y Graphon.
33
6. CARACTERIZACIÓN
6.1. CARACTERIZACIÓN DEL SOPORTE, EN ESTE CASO LA TELA DE
CARBONO.
*Infrarrojo *Titulación de Boehm:
Obtener información acerca de la superficie de
la muestra
*Prueba de Punto de
Carga 0
Tomar muestras de TCA
Preparar 50ml de
soluciones de NaOH, HCL,
y NaCHO3 todos a una
concentración de 0.1molar
y hacer estandarización
respectiva.
Vertir muestras de TCA en
soluciones en enlerrmeyer,
se deja 3 muestras sin tela
que servirán como blancos.
Vertir muestras de TCA en
soluciones en enlerrmeyer,
se deja 3 muestras sin tela
que servirán como blancos.
Dejar agitando las
muestras por cinco (5)
días.
Al finalizar los cinco (5)
días, tomar una alícuota de
5ml de cada muestra y
titular respectivamente.
Comprar con los resultados
de los blancos y
obtener información acerca
de los grupos funcionales
en la muestra
Tomar una muestra de
TCA de aproximadamente
1gr
Sumergir la muestra en una
solución de 50ml de KCL
en un enlermeyer.
Dejar reposar por 5 días.
Al finalizar los 5 (cinco)
días tomar pH con pH
metro con electrodo de
vidrio
referencia TA20 PLUS
Obtener dato de pH de la
muestra
Utilizar FTIR Thermo
Nicolet Serie Nexus.
Tomar una muestra de
TCA de 0.5% del valor
del peso de KBr. y
Mezclar la muestra de
TCA y KBr..
Prensar la mezcla hasta
obtener una pastilla
semitranslucida e
Introducir muestra al
equipo y tomar 40
lecturas por refractancia
difusa
34
ü Caracterización del soporte, en este caso la Tela de Carbono.
*Isotermas de Adsorción
Obtener información
acerca del área
superficial, porosidad,
volumen de poros.
*Difracción de RayosX
Aplicar un baños de
nitrógeno liquido a 77°K,
N2 como adsorbato y
tomar las lecturas en un
rango de tiempo de 8
horas.
Utilizar equipo Rigaku
Mini Flex.
Tomar una muestra 0.1gr
de TCA y colocarla en
una ampolleta y
desgasificar la muestra
por medio de vacío y a
una temperatura de
250°k.
Tomar una muestra de
TCA y pulverizar
totalmente la muestra.
Colocar la muestra
pulverizada de forma
homogénea en un
soporte.
Utilizar equipo AutoSorb
3B Quantachrome.
Programar instrumento
para hacer una lectura en
un rango de 2° a 80° y en
forma escalonada con
intervalos de 0.02,
tomando 8 lecturas por
intervalo.
Programar instrumento
para hacer una lectura en
un rango de 2° a 80° y en
forma de corrido
tomando lecturas cada
0.01°.
Obtener información
acerca de la superficie de
la muestra.
35
6.2. INMOVILIZACIÓN DE LA ENZIMA EN ESTE CASO LA LIPASA EN LA TELA DE
CARBONO.
Disolver 50 mg de lipasa en la solución buffer de fosfato.
Colocar la tela de carbón en una caja de petri.
Verter la solución enzimática en la caja
de petri, y colocarlo encima de un
shaker, agitar por 6 (seis) horas
Tomar 1 ml de muestra de la
solución en T=0 y al finalizar las 6
(seis) horas.
Mezclar las muestras con agente biuret
y colocar la mezcla en el
espectrofotómetro. Medir la
absorbancia y con manejo matemático
deducir las concentraciones.
Preparar solución buffer de fosfato a pH 7.
36
S.E.M. y Metodo de Biuret
Tomar una 0.05g de la
muestra de la tela de
carbón después de la
inmovilización
Método de Biuret
[26,33,34]
Se prepara una solución
de 100 ml de Albumina
utilizando 10 mg
Albumina.
Se toman 10 muestras de aumentando en 100 μl de solución de albumina comenzando desde 0 ml
hasta llegar a 1 ml.
Se completa 1 ml agregando el reactivo Biuret en la cantidad
necesaria de pendiendo de la muestra.
Se toma una alícuota de cada muestra y se lee al
adsorbancia en un espectrofotómetro.
Después de tomar todos
los datos se genera una
curva de calibración, con
el cual se va a leer la
concentración de la
lipasa.
Se metalizan las muestras
Se colocan las muestras
metalizadas en el
Microscopio S.E.M.
Se toman las imágenes
deseadas
37
6.3. OBTENCIÓN DE BIODIESEL UTILIZANDO EL SISTEMA SOPORTELIPASA.
Obtención de biodiesel utilizando
soportecatalizador.
10 g de Aceite de Palma
0.3 gramos de sistema soporte catalizador
Utilizar una relación molar de 7.5 moles de metanol para 1 mol de aceite
de palma.
Colocar el aceite de palma, metanol y sistema soportecatalizador en una caja de petri. Colocar caja de petri sobre un
shaker.
Colocar el shaker dentro de una estufa con el fin de mantener la temperatura
constante en 35ºC
Dejar llevar a la reacción por 24 horas.
Obtener biodiesel
38
7. RESULTADOS Y ANÁLISIS
7.1. ISOTERMAS DE ADSORCIÓN.
La gráfica obtenida con los datos de la isoterma de adsorción forma una isoterma de tipo uno
según la IUPAC, con lo cual se puede concluir que la TCA presenta altos niveles de micro
porosidad. El hecho de que no se presente histéresis dentro de la grafica confirma la poca
mesoporosidad presente en el material, como lo muestra la siguiente grafica.
Figura 18 Isoterma de adsorción de N2 a 77 K para TCA
A partir de los datos puntuales de la isoterma se obtuvo volumen el de la monocapa, 283 cm 3 /g
utilizando la ecuación de B.E.T.
cVm X c
cVm X V X ) 1 ( 1
) 1 ( −
+ = −
(17)
Ec.1 ecuación de B.E.T. [20]
Se utilizo la manipulación algebraica correcta paro poder determinar el área superficial, 1230. m 2 /g.
Cabe anotar que para poder hacer uso de la ecuación de B.E.T se utilizo un rango de P/P0 de
0.010865 hasta P/P0 0.101780.
Utilizando estos datos, se obtuvo la distribución de poroso que ratifica la porosidad de la TCA,
como se puede evidenciar en la siguiente grafica.
39
Figura 19. Distribución de poros en TCA
De esta grafica se aprecia la cantidad de microporos que están comprendidos en el rango de 0.3 a
2 nm, además se puede apreciar que existe una cantidad mínima de mesoporos.
Figura 20 Grafica de Dubinin R. para la tela de carbón activado
De esta grafica se puede apreciar que los datos de la izquierda de la grafica indican en el sector
de poros anchos, los poros anchos son más grandes que lo predicho. Además el volumen de poro
obtenido utilizando este modelo es de 0.454 cc/g lo se asemeja al resultado obtenido utilizando el
modelo de D.F.T que es de 0.486 cc/g.
40
Tanto de la grafica de la distribución de poros y la de Dubinin dan evidencia de mesoporos la cual
se encuentran en una proporción de 1 a 2% lo cual favorece la inmovilización tipo física de la
lipasa.
7.2. DRX.
Del XRD se obtuvo una grafica que permitió evidenciar la presencia del grupo cristalino grafeno un
pico en 2θ=25°, ya que dentro de la conformación aleatoria que los caracteriza se presenta un
arreglo de capas que se evidencia en la prueba de X.R.D. La ausencia de picos en el resto de
difractograma corrobora la estructura amorfa de un carbón activado como lo es la TCA.[18]
Figura 21. XRD de TCA
7.3. TITULACIÓN BOEHM.
Los resultados de la titulación de Boehm comprobó la presencia de grupos carboxilos en la
superficie. Esta presencia de grupos carboxilos está en menor proporción que los grupos lactonicos
y fenolicos.
Los resultados obtenidos de esta prueba demostraron que la TCA tiene una leve tendencia básica.
41
Tabla 7 Resultados cuantitativos de Boehm y punto de carga cero
Muestra
Grupos
funcionales
superficiales
PCC Fenoles y lactonas.
Carbón
Activado 8,43 0,0460335 0,1381005
7.4. PRUEBA DE CARGA CERO.
La prueba de carga cero corrobora los resultados del método de Boehm ya que resulta con un pH
de 8.43, lo que quiere decir que es levemente básico.
7.5. INFRARROJO.
Como complemento para la caracterización química y corroborar los resultados obtenidos por el
método de Boehm y punto de carga cero, se hizo una prueba de infrarrojo. Las bandas señaladas
en la grafica siguiente representan la presencia de grupos OH de 3100 a 3650 cm 1 .
Figura 22 Infrarrojo de Tela de Carbón Activado Virgen.
42
7.6. INMOVILIZACIÓN ENZIMÁTICA.
La grafica a continuación ilustra la concentración de lipasa en miligramo sobre gramo de soporte,
que se inmoviliza. Al hacer la comparación de la adsorción de la lipasa tanto en la tela de carbón
activado como también en carbón granulado, se puede observar que hubo mayor inmovilización de
lipasa en el carbón granulado 172.97 mg/g, mientras que en la tela fue de 84.24 mg/g. El tiempo
en que la adsorción llega a su equilibrio es a los 90 minutos en los dos soportes. Se atribuye la
baja inmovilización en la tela a que el carácter uniforme microporoso de la tela dificulta la
inmovilización. En el caso del carbón granulado el carácter superficial no es uniformemente
microporoso lo que permite la mayor existencia de meso poroso, que facilitan la inmovilización de
la lipasa.
Figura 23 Adsorción de la Lipasa sobre la Tela de Carbón Activado.
43
Figura 24 Adsorción de la lipasa sobre Carbón Granulado Activo.
Las concentraciones se obtuvieron modificando la ecuación utilizada por Salis A. et al. Como se
puede ver enseguida [13].
Ecuación 1 Ecuación de concentración de lipasa inmovilizada en soporte [13]
) ) ( ( m Co Ci V Q
− = (18)
Donde v es igual al volumen de la solución preparada, Ci es la concentración inicial de la solución,
Co es la concentración tomada en el intervalo del tiempo, y m es el peso del soporte.
Para un mejor entendimiento del fenómeno de inmovilización de la lipasa sobre el soporte se
decidió estudiar la velocidad de adsorción de la lipasa sobre los soportes carbonosos. El modelo
de lagergreen fue implementado para hacer el análisis correspondiente
Ecuación proveniente del modelo de Lagergren[29]
) 19 ( * ) 303 . 2
( ) ( t K LogQ Q Q Log ads e e − = −
44
Donde Qe es la concentración de la solución inmovilizada en el equilibrio, Q es la concentración
de la solución inmovilizada en un tiempo, Kads es la velocidad de adsorción y t es igual al tiempo en
donde se toma el dato.
El uso de este modelo parte de la Linealización de los datos obtenidos en las curvas de adsorción
para que se pueda utilizar la ecuación de la línea recta y hacer el manejo matemático adecuado. A
continuación se muestra la Linealización de las curvas de adsorción para cada soporte.
Figura 25 Linealización de la curva de Adsorción de Lipasa sobre Tela de Carbón Activado.
45
Figura 26 Linealización de la curva de Adsorción de Lipasa sobre Carbón Granulado Activado.
A partir de estas graficas se obtiene el valor de la velocidad de adsorción con respecto al soporte
en donde se llevo a cabo la inmovilización.
Tabla 8 Velocidad de Adsorción de la lipasa en los diferentes soportes.
Soporte K ads (minutos 1 )
Carbón Granulado
Activado 1.18*10 2 ±0.01
Tela De Carbón Activado 1.14*10 2 ±0.01
Como se puede observar la velocidad de adsorción de la lipasa en el carbón granulado es mayor
que el de la tela de carbón activado.
Con el objetivo de explorar a que factores influyen en la inmovilización de la lipasa sobre los
soportes si hizo un diseño experimental 2 2 , lo que significa que se variaron dos factores dentro del
proceso de inmovilización de la lipasa. Estos factores fueron el tipo de soporte y la concentración
de la solución enzimática, a continuación se muestra una tabla con los factores analizar.
46
7.7.DISEÑO EXPERMENTAL
Tabla 9 Diseño Experimental 2 2
Soporte Co
(mg/mL) Qe
(mg/g) Porcentaje de
inmovilización (%)
TCA 4 120,27 74,5 CGA 4 155,06 94,39 TCA 2 47,95 63,1 CGA 2 56,14 73,3
En la tabla se observa como a mayor concentración se presenta mayor inmovilización de la
enzima, y a su vez como el tipo de soporte favorece la inmovilización de la enzima. Esto era de
esperar ya que al aumentar la concentración de la solución enzimática se está aumentando la
posibilidad que haya una mayor inmovilización y si se tiene encuentra que las características
superficiales del carbón granulado son más propensas para que se presente una mayor
inmovilización, se está asegurando que la se lleve a cabo una mejor inmovilización en el carbón
granulado.
Se puede observar que para una baja de concentración de solución enzimática el porcentaje de
inmovilización no difiere mucho entere el tipo de soporte, pero en el caso de la solución enzimática
con alta concentración el porcentaje de inmovilización del carbón granular aumenta en un 20% con
respecto al de la tela de carbón.
47
7.8. S.E.M.
Figura 27 Lipasa inmovilizada sobre la tela de carbón.
Como se puede observar en la Figura 10 se pueden comparar los resultados obtenidos por la
prueba S.E.M de las muestras y las obtenidas en la literatura. Se observa que no existe una
conglomeración de la lipasa lo cual ratifica que hubo una baja inmovilización de la lipasa en la tela
de carbón, aun así se puede observar que la inmovilización de la lipasa se da en la superficie, lo
que significa que existe interacciones fuertes entre los grupos funcionales tanto de la lipasa como
la de la tela de carbón.
La grafica 11 C y D. fueron tomadas de una muestra de tela de carbón que había sido utilizada
previamente para llevar a cabo la reacción de transesterificación. Esto demuestra que la
interacción molecular de los dos componentes son resistentes al uso y al lavado de la tela con el
fin de remover el aceite de la tela. Esto abre la posibilidad de reutilizar la tela en futuras reacciones.
Se puede asumir que existe un anclamiento de la lipasa en los porosos de la tela, pero para
ratificar esto se necesita hacer una prueba de T.E.M.
Se tomaron imágenes S.E.M de lipasa inmovilizada de otras investigaciones con el objetivo de
comprar y ratificar la veracidad de los resultados obtenidos, como se muestra en la figura 11 A y B.
Se puede observar como las estructuras de las lipasas de las otras investigaciones son iguales a la
lipasa inmovilizada sobre la tela de carbón.
48
Figura 28 Comparativo de muestras de lipasa inmovilizada con resultados obtenidos.
A.) y B.) Houssein Noureddini et al.[31] C.) y D.) Resultados obtenidos de la inmovilización de la
lipasa en la tela de carbono.
7.9. INFRARROJO.
Con el objetivo de hacer una prueba cualitativa del resultado de la reacción de transesterificación
utilizando el sistema soportecatalizador, se hizo un análisis de infrarrojo tanto al producto de la
reacción como al aceite de palma puro. Esto con el fin de observar cambios en los espectros de
infrarrojo de cada muestra.
Como se puede observar en la figura 12 aparecen las bandas 2659.26 cm 1 , 903.29 cm 1 , 861.54
cm 1 y 501 cm 1 . Estas bandas aparecen en el infrarrojo del producto de la reacción, mientras que
en el infrarrojo del aceite de palma no están presentes. Esto comprueba de forma cualitativa que el
sistema soportecatalizador modifico la estructura de la aceite de palma. La banda 2770 [31] es
importante en el infrarrojo del producto ya que está caracterizando la presencia de grupos metilos.
La banda de 1164 [31] la cual caracteriza metil esteres, se puede observar tanto en el infrarrojo de
aceite de palma como en el infrarrojo del producto, pero la presencia de la banda de metilo ratifica
la presencia del metil ester, asi cumpliendo la función como catalizador en la reacción de
transesterificación.
49
Grafica 29 Infrarrojo del producto de la reacción de transesterificación de biodiesel utilizando el sistema soportecatalizador.
Grafica 30 Infrarrojo del Aceite de Palma R.B.D.
50
7.10. ISOTERMA DE ADSORCIÓN PARA SISTEMA SOPORTECATALIZADOR.
Se hizo un análisis por medio de las isotermas de adsorción de N2 a la tela de carbón activado con
lipasa inmovilizada. Como se puede observar en la grafica a continuación, el volumen de llenado
para la tela de carbón activado virgen es mayor que la de la tela con la lipasa inmovilizada. Esto se
deba a la presencia de la lipasa sobre la superficie del soporte.
Grafica 1 Isotermas de adsorción de tela de carbón activado virgen y con lipasa inmovilizada
Grafica 2 (+) tela de carbón activado virgen, () tela de carbón activado con lipasa inmovilizada.
51
Utilizando la ecuación de B.E.T con el fin de conocer el área superficial de la tela de carbón
activado con lipasa inmovilizada se observa que:
Área superficial
(m 2 /g)
Volumen de mono
capa c 3 /g
T.C.A. Virgen 1090,5 250,75
T.C.A.
Inmovilizació
n
957,7 220,1
La T.C.A inmovilizada muestra un área superficial menor que la tela de carbón activado virgen, lo
mismo ocurre para el volumen de mono capa. Esto se atribuye una vez más a la presencia de la
lipasa sobre la superficie del soporte.
52
8. CONCLUSIONES
La presencia de mesoporos en el carbón granulado favorecieron la inmovilización tipo física. La
presencia de grupos OH en la superficie y la leve basicidad presente en la tela favorecen la
inmovilización de tipo química. Aunque la inmovilización se presento en bajas proporciones las
características físicas de la tela hace que sea un soporte eficaz ya que la tela Zorflex® brinda una
alta resistencia física lo que significa que se puede utilizar más de una vez, esto es importante ya
que se puede reutilizar la materia prima sin procesos complicados de recuperación, esto no se
puede decir del carbón granulado ya que para poder reutilizarlo se necesitan varios procesos de
filtración y secado.
La concentración de la lipasa y tipo de soporte fueron las variables estudiadas en primera instancia
para la inmovilización. Los datos obtenidos demuestran que a concentraciones altas la
inmovilización se ve favorecida, además para los soporte analizados, los dos presentan el mismo
tiempo de saturación aunque se observa que el carbón granulado tuvo la capacidad de inmovilizar
mayor cantidad de lipasa que la tela.
Las imágenes obtenidas del S.E.M mas los resultados obtenidos de las demás pruebas de la
caracterización del sistema soporte catalizador ratifican la inmovilización de la lipasa sobre la tela
de carbón activado. También se puede evidenciar el funcionamiento del sistema soporte
catalizador en los resultados del infrarrojo. Con los resultados del S.E.M se evidencia que la
inmovilización de la lipasa es básicamente de tipo química (adsorción), esto significa que existe
fuerzas de tipo Vander Waals y puentes de hidrogeno lo suficientemente fuertes para mantener a
la lipasa sujetada en la superficie. La fuerza de este tipo de fuerzas intermoleculares se hace más
evidente en la figura 11 ya que estas imágenes son del sistema soportecatalizador utilizado en la
reacción de transesterificación, como se puede observar aun hay presencia de lipasa después del
la utilización y el lavado para extraer el aceite de la tela.
Se exploró como primera instancia la efectividad del sistema soportecatalizador, teniendo en
cuenta que la prueba se llevo a cabo con menor cantidad de materia prima que la reportada en la
literatura. El resultado de la exploración concluyo que las condiciones estándar utilizadas en la
literatura [30] con otro tipo de lipasa soportado en otro tipo de soporte arrojan resultados
satisfactorios ya que se evidencia de forma cualitativa el cambio de aceite de palma a biodiesel.
53
9. RECOMENDACIONES
Explorar mas variables que puedan tener una incidencia en la inmovilización de la enzima, dichas
variables pueden ser, la solución buffer, la cantidad de soporte y la temperatura a la cual se está
llevando a cabo la inmovilización.
Verificar la efectividad del sistema soportecatalizador de forma cuantitativa, es decir utilizar
cromatografía de gas con el fin de establecer el rendimiento y la actividad del biocatalizador.
Comprobar cuantas veces se puede reutilizar el sistema soportecatalizador, midiendo la actividad
enzimática después de cada uso y estableciendo una mínima cantidad de actividad enzimática con
la cual se pueda tener resultados tanto cuantitativos como cualitativos.
Una vez obtenido el biodiesel utilizando el biocatalizador, comprobar su pureza y sus propiedades
tanto químicas como físicas para poder compararlas con el biodiesel comercial y así verificar la
calidad del biodiesel obtenido.
Establecer La cinética de reacción del sistema soporte catalizador.
54
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