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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE-UFRN
Excreções de peixes amazônicos usando a abordagem da
Estequiometria Ecológica e da Teoria Metabólica da Ecologia
ÁLVARO CARVALHO DE LIMA
Orientador: RONALDO ANGELINI
Co-orientador: ADRIANO CALIMAN
Natal-RN, maio de 2019
Tese de doutorado apresentada ao
programa de pós-graduação em Ecologia
da UFRN, como requisito para obtenção do
grau de doutor em ciências biológicas, área
de concentração em Ecologia.
AGRADECIMENTOS
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Amazonas, pela bolsa de
doutorado concedida através do Programa de Bolsas de Pós Graduação em
Instituições fora do estado (edital No. 010/2015).
À Universidade Federal do Amazonas pela liberação integral das minhas
funções enquanto estive realizando o doutorado, em especial aos colegas professores
do Departamento de Ciências Pesqueiras pelo incentivo e apoio material durante o
processamento e armazenagem de amostras.
Ao Programa de Pós Graduação em Ecologia da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, pela excelência do quadro docente e pelas facilidades das
instalações.
À coordenação do Laboratório de Recursos Hídricos e Saneamento, onde
armazenei amostras, ao Laboratório de Limnologia do Departamento de Oceanografia
e Limnologia (DOL), onde realizei as análises químicas das amostras. Agradeço
também ao Instituto de Medicina Tropical por fornecer água ultra-destilada que usei
nas análises.
Aos meus orientadores, Ronaldo Angelini e Adriano Caliman, pela atenção e
tempo dedicados a minha orientação, por compartilharem ideias e acima de tudo pelo
incentivo em mergulhar nas águas da Estequiometria Ecológica.
Ao técnico do DOL, Bruno Mattos Silva Wanderley, por ter me ensinado todas
as análises de laboratório, sempre explicando os porquês das coisas. Sem sua ajuda
teria sido impossível construir esta tese.
Ao Guilherme Gerhardt Mazzochini por ter ajudado com a análise estatística de
parte dos dados.
Aos amigos e voluntários que me ajudaram com os trabalhos de campo:
Kleisson Medeiros, Ian Rocha, Jairo Rodrigues, Marcus Girão, Júlio Siqueira, Flávio
Soares, Guilherme Freire, Ronis da Silveira.
Agradecimento especial a Hélio Beltrão e Jansen Zuanon por ajudarem a
identificar os peixes.
Pelo apoio emocional, agradeço a: minha mãe Maria Lúcia Chagas de
Carvalho, minha irmã Raquel Carvalho de Lima, e minha companheira Caroline
Vasconcelos.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de
Financiamento 001.
ÁLVARO CARVALHO DE LIMA
EXCREÇÕES DE PEIXES AMAZÔNICOS USANDO A ABORDAGEM DA
ESTEQUIOMETRIA ECOLÓGICA E DA TEORIA METABÓLICA DA
ECOLOGIA
Orientador: Dr. Ronaldo Angelini
Co-orientador: Dr. Adriano Caliman
NATAL-RN
2019
Tese de doutorado apresentada ao
programa de pós-graduação em Ecologia
da UFRN, como requisito para obtenção do
grau de doutor em ciências biológicas, área
de concentração em Ecologia.
Lima, Álvaro Carvalho de.
Excreções de peixes amazônicos usando a abordagem da Estequiometria
Ecológica e da Teoria Metabólica da Ecologia / Álvaro Carvalho de
Lima. - Natal, 2019.
39 f.: il.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Centro de Biociências. Programa de Pós-graduação em Ecologia.
Orientador: Prof. Dr. Ronaldo Angelini.
Coorientador: Prof. Dr. Adriano Caliman.
1. Peixes - Tese. 2. Taxa de excreção - Tese. 3. Nitrogênio - Tese.
4. Fósforo - Tese. 5. Ontogenia - Tese. I. Angelini, Ronaldo. II.
Caliman, Adriano. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
IV. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 597.2/.5
Sumário
1. INTRODUÇÃO GERAL ..................................................................................................... 1
2. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................ 7
2.1. ÁREA DE ESTUDO.................................................................................................... 7
2.2. EXPERIMENTOS PARA MEDIÇÃO DA EXCREÇÃO ......................................... 8
2.3. ANÁLISES PARA DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO E FÓSFORO
EXCRETADOS ....................................................................................................................... 9
2.3.1. DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO EXCRETADO .................................... 9
2.3.2. DETERMINAÇÃO DE FÓSFORO EXCRETADO ....................................... 11
2.3.3. DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO E FÓSFORO NA MASSA
CORPORAL DOS PEIXES ............................................................................................. 13
2.3.4. COMPILAÇÃO DE INFORMAÇÕES SECUNDÁRIAS ............................... 14
2.4. ANÁLISES ESTATÍSTICAS .................................................................................... 14
3. RESULTADOS .................................................................................................................. 16
3.1. Efeitos diretos e indiretos do tamanho do corpo na excreção de nitrogênio e
fósforo por peixes amazônicos ........................................................................................... 16
3.2. Ontogenia e estequiometria da excreção em peixes .......................................... 19
4. DISCUSSÃO ..................................................................................................................... 27
5. CONCLUSÃO GERAL ..................................................................................................... 31
ANEXOS ................................................................................................................................... 31
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 34
RESUMO
Excreções de peixes amazônicos usando a abordagem da
Estequiometria Ecológica e da Teoria Metabólica da Ecologia
Os peixes são elos importantes nos processos de sequestro, transferência e
transformação de energia e nutrientes nas cadeias tróficas. Através de suas
excreções os peixes fornecem nutrientes para os produtores primários e, em
alguns sistemas de água doce, podem fornecer a maior parte do nitrogênio e
do fósforo necessários aos organismos autotróficos. Tamanho corporal, hábito
alimentar e características do ambiente influenciam as taxas de excreção dos
peixes. A bacia amazônica possui a maior riqueza de espécies de peixes de
água doce do planeta, sendo que nada se conhece a respeito da ciclagem de
nutrientes mediada por estes organismos neste sistema. O objetivo central
desta tese foi quantificar o aporte de nitrogênio e fósforo pelos peixes ao
ecossistema amazônico, usando medidas diretas de excreção. Estas medidas
foram realizadas através de 153 experimentos de incubação in situ, utilizando-
se de 59 espécies de peixes nativos da Amazônia. Usamos modelos de
equações estruturai para quantificar efeitos diretos e indiretos do tamanho do
corpo nas taxas e razões de excreção. Os resultados mostraram que as taxas
de excreção foram inversamente relacionadas a massa corporal e a
estequiometria do corpo, enquanto a razão N:P excretada aumentou com a
massa corporal. Buscamos identificar efeitos da ontogenia e da estequiometria
do corpo sobre a excreção de N, P e N:P, usando dados secundários para criar
um proxy de crescimento, assumindo que a taxa de crescimento é maior
quanto mais distante do tamanho máximo da espécie o peixe está e assim
comparamos a estequiometria de peixes jovens e adultos. Os resultados
mostraram efeito do crescimento sobre a estequiometria do corpo e da
excreção em indivíduos no início da fase juvenil. Concluímos que o tamanho, a
estequiometria do corpo e ontogenia influenciam na excreção de N e P
realizada por peixes.
Palavras-Chave: taxa de excreção, razão N:P, nitrogênio, fósforo, ontogenia
Excretions of amazonian fishes using the approach of Ecological
Stoichiometry and Metabolic Theory of Ecology
ABSTRACT
Fish are important in processes of uptake, transfer and transformation of energy
and nutrients in aquatic food webs. Through their excretions, fish supply
nutrients for autotroph organisms, representing the main source of nitrogen and
phosphorous for primary producers in some fresh water systems. Body size,
diet, as well as environment light-nutrient conditions, affect excretion rates and
ratios of nutrient recycled by fish. The Amazon basin encompasses the most
diverse fish fauna in the world, however nutrient recycling by fish in that
ecosystem had never being surveyed so far. The main purpose of this thesis
was to assess nitrogen and phosphorus release by fish, measuring their
excretions in field conditions. One hundred fifty three incubation experiments
were performed using 59 wild caught native species. We used structured
equations models in order to measure direct and indirect effects of body size on
excretion rates and ratio. Results showed that excretion rates were negatively
related to body mass and body stoichiometry, while excreted N:P was positively
related to body mass. We could reveal the indirect effect of body mass on
excretion because body mass also affects body stoichiometry. In order to
identify effects of ontogeny and body stoichiometry on N, P and N:P excretion
we used second hand data to create a proxy to growth rate, assuming the fish
grow faster as smaller they are from their maximum size, than we compared
body stoichiometry and excretion rates and ratios of juvenile in contrast to adult
fishes. Results revealed that growth affects body stoichiometry and excretion
ratios in the beginning of the juvenile phase. Overall, our conclusions point out
that body size, body stoichiometry and growth affect N and P release by fishes.
Key-words: Excretion rate, N:P ratio, nitrogen, phosporous, ontogeny
1
1. INTRODUÇÃO GERAL
Peixes são elos importantes nos processos de sequestro, transferência e
transformação de energia e nutrientes nas cadeias alimentares, por que
ocupam diversos níveis tróficos e se constituem muitas vezes na maior
biomassa dos ecossistemas aquáticos (Sterner & Elser, 2002; Vanni, Boros &
McIntyre, 2013; Boros, Takács & Vanni, 2015). Através de seus deslocamentos
(migrações) os peixes transportam nutrientes entre diferentes habitats e
ecossistemas (Durbin et al., 1979; Meyer & Schulz, 1985; Persson, 1997). Além
disso, peixes causam alterações nas comunidades aquáticas por meio de
herbivoria, predação seletiva e bioturbação (Attayde et. al., 2010; Menezes et.
al., 2010; Reissig et. al., 2015), assim como também fornecerem nutrientes
para os produtores primários através de suas excreções.
As excretas dos peixes contêm compostos nitrogenados e fosfatados, que
são liberados pelas vias branquiais e urinárias, podendo ser rapidamente
assimiláveis pelos organismos autotróficos (Persson, 1997; Zimmer, Herwig &
Laurich, 2006). Nitrogênio e fósforo podem ser elementos limitantes para a
produção primária, e aporte de nutrientes oriundos dos peixes pode ser
relevante para ecossistemas marinhos e de água doce (Schaus et al., 1997;
McIntyre et al., 2008; Wheeller, Miller & Crowl, 2015).
A Teoria Metabólica Ecológica (TME) e a Estequiometria Ecológica (EE)
fornecem uma base teórica integrativa para os processos de reciclagem de
nutrientes mediados por consumidores (Vanni & McIntyre, 2016). Estas teorias,
que são fundamentadas em leis da física e da química (Elser et al., 1996;
Sterner & Elser, 2002; Algeier et al., 2015). foram usadas nesta tese para
investigar a ciclagem de nutrientes mediada por peixes amazônicos.
Teoria Metabólica Ecológica (TME)
Segundo a Teoria Metabólica Ecológica, a temperatura ambiente e o
tamanho corporal influenciam o metabolismo por meio de diferentes
mecanismos (Gillooly et al., 2001; Brown et al., 2004). A temperatura afeta o
metabolismo na medida em que reações enzimáticas são aceleradas pelo
aumento da temperatura; em temperaturas próximas a 0 oC a água nas células
2
tende a congelar, cessando as reações metabólicas. No extremo oposto, em
temperaturas acima de 40 oC as reações metabólicas se tornam mais lentas
devido ao aumento da influência do catabolismo (Gillooly et. al., 2001).
O tamanho do corpo, por seu turno, também modula a taxa metabólica. De
acordo com a lei da invariância energética, a taxa metabólica do organismo (B)
é função da massa corporal (M) elevada ao expoente de 3/4 (Elser et al., 1996;
West et al., 1999, Gillooly et. al., 2001; Isaac et. al., 2010), isto implica que a
taxa metabólica específica (B/M) é função da massa elevada a -1/4. Esta
alometria é consequência da relação entre superfície e volume corporal, que
limita a superfície de trocas e as redes de transporte de substâncias em
células, órgãos e no organismo como um todo com o aumento do tamanho
(Gillooly et. al., 2001). Esta mesma relação descreve a taxa metabólica basal,
que é a taxa mínima de gasto energético para a simples manutenção das
funções vitais; e a taxa metabólica de metabólica de campo, que inclui a
alocação de energia para o crescimento e reprodução (Brown et. al., 2004).
Em síntese, quanto menor o organismo e maior a temperatura ambiente,
mais acelerado é o metabolismo, refletindo em um aumento na taxa de
excreção por unidade de massa (taxa de excreção específica) do organismo.
Estequiometria Ecológica (EE)
Na Estequiometria Ecológica (EE) a excreção é abordada de forma
qualitativa, olhando as proporções entre os elementos químicos e seus fluxos
entre o alimento e o organismo, e entre o organismo e ambiente. De acordo
com EE a estequiometria da excreção é condicionada pela lei de conservação
das massas (segunda lei de Lavoisier), que diz “nada se perde, nada se cria,
tudo se transforma”. Em termos ecológicos significa que aquilo que o
organismo excreta é o que sobrou de reações químicas mediadas pelo
metabolismo, em que os reagentes iniciais são os elementos químicos
presentes no ambiente (alimento) e o produto final é o organismo em sua
constituição e funcionamento.
Os peixes, assim como a totalidade de organismos heterotróficos
macroscópicos, obtêm os nutrientes de que precisam através dos alimentos
3
que ingerem. A matéria ingerida pode seguir dois caminhos: sair do organismo
sem ser aproveitada (egesta) ou ser digerida, formando moléculas menores
que podem ser assimiladas pelo organismo e empregada na forma de energia
e matéria de acordo com a sua demanda metabólica. O alimento é, portanto
um “pacotes” de nutrientes. Desta forma razão estequiométrica da excreção é
resultado da diferença entre balanço de nutrientes entre o alimento digerido
pelo organismo e os nutrientes necessários para sua manutenção, crescimento
e reprodução (Schindler & Eby, 1997; Elser et. al., 2006; Elser & Urabe, 1999;
Sterner & Elser, 2002; Hessen et al., 2013; Moody et al., 2015). A equação
abaixo resume o processo de excreção de um consumidor.
𝐸𝑥 = 𝐴 × [𝑥]𝐴 × 𝐸𝐴𝑥 − (𝐶 × [𝑥]𝑐)
Onde:
Ex é quantidade de um dado elemento x na excreção;
A é a quantidade de alimento ingerido;
[x]A é a concentração do elemento no alimento;
EAx é a eficiência de assimilação do elemento pelo consumidor
C é a massa do consumidor
[x]c é a concentração do elemento no corpo do consumidor
De uma perspectiva estequiométrica a razão de excreção, ou seja, a
proporção entre dois elementos x, y na excreção de um organismo
heterotrófico segue o mesmo princípio:
𝑆𝑥: 𝑦 =𝐴 × [𝑥]𝐴 × 𝐸𝐴𝑥 − (𝐶 × [𝑥]𝑐)
𝐴 × [𝑦]𝐴 × 𝐸𝐴𝑦 − (𝐶 × [𝑦]𝑐)
Portanto, o desbalanceamento nutricional entre a composição do alimento e
a composição do consumidor tende a gerar uma relação inversa entre a
4
quantidade excretada de um dado elemento e a concentração deste elemento
no corpo do consumidor.
Nitrogênio e fósforo estão entre os seis elementos mais abundantes
envolvidos na construção e funcionamento dos vertebrados, atrás apenas de H,
O, C e Ca que é ligeiramente mais abundante que P (Sterner & Elser, 2002,
p.3). Contudo as proporções destes elementos diferem entre os órgãos e
tecidos. Nitrogênio toma parte na constituição de proteínas, ácidos nucléicos e
nucleotídeos. Tecido epitelial e muscular são particularmente ricos em N (10% -
16%) e pobres em P (menos de 2%). Cerca de 40% da massa corporal de um
vertebrado corresponde a músculo. Fósforo participa de processos de
transformação energética (ATP-ADP) e síntese proteica (RNA), além de ter
função estrutural na composição da membrana celular (na forma de
fosfolipídios) e tecido ósseo. Ossos são particularmente ricos em P (cerca
12%) e relativamente pobres em N (menos de 4%). O esqueleto corresponde
por 50% a 60% da massa corporal (Sterner & Elser, 2002 p. 170).
Em peixes, a massa seca do corpo contém de 8% a 13% de nitrogênio e de
1,5% a 4,5% de fósforo. Esta maior variação na quantidade de fósforo em
comparação a nitrogênio possivelmente reflete diferenças interespecíficas na
alocação de fósforo em estruturas ósseas (Sterner & Elser, 2002, p.171). Por
consequência dessa demanda diferenciada de P em relação a N para formação
de esqueleto, a razão N:P no corpo diminui à medida em que o animal aumenta
de tamanho (Elser et al., 1996, Pilati & Vanni, 2007), resultando em tendência
inversa na excreção; ou seja, a razão N:P excretada diminui com o aumento de
tamanho.
Hábito alimentar e a estequiometria da excreção
Conforme explicitado nos argumentos e nas equações acima a excreção
resulta do desbalanceamento entre o alimento e o requerimento do
consumidor, sendo que o alimento mais “equilibrado” para um consumidor seria
aquele com a estequiometria mais semelhante àquela sua; nesse sentido um
organismo com hábito canibal possuiria a dieta mais balanceada possível,
enquanto um animal herbívoro teria a dieta mais desequilibrada possível.
Portanto, o hábito alimentar é outra variável a ser considerada em estudos
5
sobre a ciclagem de nutrientes mediada por consumidores (Elser & Urabe,
1999; Esterner & Elser, 2002, p. 181). Contudo, este aspecto não deverá ser
abordado nesta tese.
Ontogenia e estequiometria da excreção
A estequiometria dos organismos passa por mudanças vinculadas ao
seu desenvolvimento, portanto é de se esperar que a estequiometria da
excreção seja influenciada pelo crescimento dos organismos.
A partir de evidências para zooplâncton, insetos e bactérias, Sterner &
Elser (2002, p. 142) sugerem haver uma associação entre taxa alta de
crescimento com o aumento da concentração de P, causada pelo aumento na
quantidade de RNA (rico em fósforo) nas células, reduzindo a razão N:P no
corpo na fase inicial do crescimento. Esta hipótese é conhecida como Growth
Rate Hypothesis (GRH) (Elser et al., 2003), entretanto esta relação
(crescimento e estequiometria da excreção) ainda é escassamente
documentada, especialmente para peixes (Vanni & McIntyre, 2016).
Peixes Amazônicos como objetos de estudo da ciclagem de nutrientes mediada
por consumidores
Com cerca de 2.400 espécies descritas, a bacia Amazônica possui a fauna
de peixes mais rica do planeta (Reis et al., 2016). A riqueza de espécies é
refletida em uma ampla variedade de hábitos alimentares, incluindo desde
espécies generalistas, até as altamente especializadas, como por exemplo,
consumidores de sangue ou escamas. A variedade de tamanhos também é
alta, com espécies cujos adultos não ultrapassam poucos centímetros de
comprimento, enquanto outras podem alcançar mais de dois metros (Queiroz et
al., 2013).
As características tróficas dos ambientes aquáticos amazônicos são
influenciadas pela geologia e clima. Assim, os rios provenientes dos escudos
guianense e brasileiro drenam terrenos antigos e bastante lixiviados, resultando
em águas com baixa quantidade de eletrólitos e ácida, devido à alta carga de
ácidos húmicos e fúlvicos. Devido a coloração escura, estes rios são chamados
de “água preta” e suas planícies de inundação são denominadas “igapó”. Em
6
contraste, rios que drenam a região andina e terrenos sedimentares são
relativamente mais ricos em nutrientes, com grande quantidade de sólidos em
suspensão e maior concentração de eletrólitos. A cor da água é barrenta
devido à alta carga de argila e silte em suspensão, por isso são chamados de
rios de “água branca” e suas planícies de inundação são chamadas de “várzea”
(Furch, 1984; Sioli, 1984, McClain & Naiman, 2008).
As condições limnológicas nos rios na Amazônia mudam ao longo do ano,
em função do pulso de inundação, em que o nível da água pode variar mais de
dez metros, com alterações cíclicas no aporte de nutrientes, no regime de luz,
na produção primária e na decomposição de matéria orgânica (Furch & Junk,
1997;Junk, 1984; Rai & Hill, 1984; Junk & Howard-Williams, 1984). Os peixes
são integrados nesta dinâmica transferindo os nutrientes entre a planície
inundada e o canal do rio. O entendimento dos fatores que afetam os
processos de troca de nutrientes entre organismos consumidores e o meio tem
aumentado nos últimos anos, mas os dados para a melhor formulação deste
processo são ainda escassos (Algeier et al., 2015; Moody et al., 2015).
O objetivo central desta tese foi entender (quali e quantitativamente) o
aporte de nitrogênio e fósforo de algumas das espécies de peixes da bacia
amazônica. Mais especificamente, este estudo buscou: a) identificar e
quantificar efeitos diretos e indiretos do tamanho do corpo nas taxas e razão de
excreção de N e P; b) avaliar o efeito do crescimento sobre a estequiometria do
corpo e sobre as taxas e razão de excreção de N e P. Para tal, partimos das as
seguintes premissas: 1) a estequiometria da excreção é inversamente
relacionada com a estequiometria do corpo; 2) a estequiometria do corpo varia
com o crescimento devido a alocação de P no RNA para a síntese proteica nos
estágios iniciais de desenvolvimento; 3) a estequiometria do corpo muda com o
aumento de tamanho devido a alocação de P nos ossos.
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2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. ÁREA DE ESTUDO
A coleta de dados foi realizada em um raio de 50 km da cidade de Manaus,
Amazonas, Brasil. Os locais amostrados foram as planícies alagadas do rio
Negro e Solimões. Respectivamente, o maior rio de água preta e o maior rio se
água branca da Amazônia. Coletas também foram feita nos rios Tarumã e
Ariaú, afluentes do rio Negro (Figura 1).
Figura 1. Área de estudo, assinalando os locais de realização dos experimentos.
Comparada com água do rio Negro, a água do Solimões contém dez
vezes mais cátions (Na + K + Mg + Ca) e quatro vezes mais fósforo (Furch,
1984). A transparência de Secchi nos rios de água branca é de no máximo 50
cm, enquanto na água preta a transparência pode chegar até mais de um
metro. A vegetação aquática nos ambientes de várzea (água branca) é de
plantas herbáceas e floresta inundada. A vegetação aquática herbácea nos
ambientes de água preta é menos abundante, em seu lugar predomina uma
vegetação arbustiva, juntamente com floresta de igapó.
O nível da água varia cerca de dez metros ao longo do ano. A estação
de subida das águas na região vai de novembro a maio, de junho a outubro o
nível do rio baixa. O pulso de inundação condiciona mudanças no regime de
nutrientes, luz, e ciclos de produção autotrófica, entre outros processos
ecológicos nas planícies de inundação dos rios Solimões e Negro (os livros
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editados em 1984 por Harald Sioli e por Wolfgang Junk, em 1997, fornecem
muita informação a esse respeito).
2.2. EXPERIMENTOS PARA MEDIÇÃO DA EXCREÇÃO
Os experimentos de medição de excreção consistiram em incubar de um
a cinco indivíduos de mesma espécie, por cerca de uma hora, em bolsas
plásticas contendo água mineral previamente aerada. Os experimentos foram
realizados in situ, com o propósito de manter as mesmas condições de
ambientais existentes onde o peixe foi coletado.
Os peixes usados nos experimentos foram capturados com rede-de-
cerco de tamanho de malha de cinco milímetros, medindo 15 metros de
comprimento por 3 metros de altura. Tarrafa e rede-de-mão (rapixé) foram
usadas em poucas ocasiões em locais onde não foi possível operar a rede-de-
cerco. Estes apetrechos de pesca foram escolhidos por causar menos danos
aos peixes. Imediatamente após a captura, os peixes foram enxaguados com
água mineral e transferidos para as bolsas de incubação contendo de meio litro
a três litros de água dependendo do tamanho dos indivíduos. Peixes não
incubados em até cinco minutos após o momento da captura foram liberados.
Bolsas plásticas contendo apenas água mineral e nenhum peixe foram usadas
como controle do experimento.
Ao final de cada experimento uma amostra da água do tratamento e uma
amostra do controle foram extraídas com seringas de 50 mL. A seguir, a água
era passada por um filtro de seringa de porosidade inferior a 0,8 µm, para
remover quaisquer partículas e foram recolhidas em frascos de plástico de 50
mL, que depois rotulados foram conservados em gelo. Os peixes usados nos
experimentos foram eutanasiados com gelo e em seguida conservados em
gelo. Foram registrados o tempo de duração de cada experimento e a
temperatura da água no local a 20 cm de profundidade.
Ao fim de cada dia de coleta as amostras de água foram congeladas em
freezer e os peixes usados nos experimentos foram trazidos para laboratório,
onde foram identificados ao mais baixo nível taxonômico possível e postos a
secar em estufa até atingirem peso constante. Após secagem, os peixes foram
9
macerados manualmente usando graal e pistilo, até resultar em um pó
homogêneo, e em seguida foram armazenados em frascos de vidro e
congelados. Peixes maiores foram triturados usando multiprocessador de
alimentos antes de serem macerados manualmente. Foram registrados o peso
fresco e peso seco dos indivíduos usados nos experimentos. Em casos em que
não foi possível homogeneizar totalmente o peixe durante a trituração, devido a
presença fragmentos de pele e/ou escamas grossas, as frações foram
guardadas em frascos separados. O armazenamento, secagem e pulverização
das amostras foram feitos no Laboratório de Tecnologia do Pescado da
Universidade Federal do Amazonas.
2.3. ANÁLISES PARA DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO E FÓSFORO
EXCRETADOS
2.3.1. DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO EXCRETADO
As amostras congeladas de água foram trazidas para o Laboratório de
Limnologia, no Departamento de Oceanografia e Limnologia (DOL) da UFRN.
Depois de descongeladas e atingirem a temperatura ambiente, alíquotas de 15
mL de cada amostra foram depositadas em frascos de vidro, previamente
lavados em ácido clorídrico a 10%, que depois terem sido enxaguados três
vezes com água miliQ, foram muflados a 450 ̊C por duas horas. Os frascos
contendo as amostras eram imediatamente fechados com parafilme e levados
a um analisador de elementos (modelo TOC-V CPH/CPN, SHIMADZU
CORPORATION, Kyoto, Japão Versão 2.10. O qual daqui pra frente será
chamado de TOC).
A medição de nitrogênio total do TOC é feita por quimiluminescência após
combustão. A amostra é queimada a 720 ̊C, nestas condições o nitrogênio na
amostra se converte em óxido nitroso (N2O), que é transportado em uma
coluna de gás (Ar Sintético 5.0 FID) até o sensor de quimiluminescência. O
sinal de detecção gera um pico cuja área é convertida em concentração de
nitrogênio, por meio de um software próprio do equipamento.
Em cada bateria de análise foram incluídos dois frascos contendo água
miliQ, que serviram como “brancos”, sendo que a média da concentração dos
brancos foi subtraída das leituras dos tratamentos e controles analisados.
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A quantidade de nitrogênio excretado foi calculada como sendo a diferença
da concentração do elemento entre o tratamento (bolsa contendo peixe) e o
controle (bolsa contendo apenas água), multiplicado pelo volume de água
usado na incubação, conforme a equação a seguir:
Nexc = ([Nt] − [Nc]) ∗ Vinc equação 1
onde:
Nexc: quantidade de N excretado pelo peixe em mg;
[Nt]: concentração de N no tratamento em mg.L-1;
[Nc]: concentração de N no controle em mg.L-1;
Vinc: volume de água usado na incubação em Litros
A taxa de excreção individual (TEI) foi calculada dividindo Nexc pelo
tempo de incubação em horas:
TEI =Nexc
t∗n equação 2
onde:
TEI: taxa de excreção em mg.h-1
Nexc: quantidade de N excretado em mg;
t: tempo de incubação em horas;
n: número de indivíduos incubados
A taxa de excreção específica (TEE) de nitrogênio foi calculada como segue:
TEE = (Nexc
m∗t) /n equação 3
onde:
TEE: taxa de excreção em mg.g-1.h-1;
Nexc: quantidade de N excretado em mg;
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m: soma da massa seca dos indivíduos incubados em g;
t: tempo de incubação em horas;
n: número de indivíduos incubados
2.3.1.1. CALIBRAÇÃO DO TOC
O TOC, foi calibrado usando solução padrão de Nitrato de Sódio (NaNO3)
com concentração de 1g.L-1, que produziu uma curva de calibração com
valores entre 0,02 a 1 mg.L-1, por meio de uma rotina automática de diluições
da solução padrão, programada no aparelho. O processo de calibração do TOC
foi repetido cada vez que se fez troca de gases, de reagentes, ou quando
alguma manutenção foi realizada.
2.3.2. DETERMINAÇÃO DE FÓSFORO EXCRETADO
Foram utilizados frascos plásticos, tipo Falcon, previamente lavados em
ácido clorídrico a 10%, que depois terem sido enxaguados três vezes com
água miliQ, foram enxaguados com cerca de 5 mL da própria amostra. Dez mL
de amostra foram transferidos para cada frasco, usando um pipetador
automático. Em cada bateria de análise, foram incluídos dois frascos contendo
10 mL de água miliQ para servir como branco. Em seguida, em cada frasco,
foram adicionados 2 mL de reagente corante combinado, que é elaborado pela
mistura de 50 mL de Ácido Sulfúrico (H2SO4) 5N, 5 mL de Antimônio Tartarato
de Potássio (K2(C4H2O6Sb)2.3H2O), 15 mL de Molibdato de Amônio
((NH4)6Mo7O24.4H2O) e Ácido Ascórbico (C6H8O6) 0,1M.
O princípio de medição de fósforo consiste em que, no meio ácido, os íons
ortofosfato (PO4-3) combinam com o Molibdato de Amônio, resultando em Ácido
Fosfomonobílico (H3PMo12O40). A reação desenvolve coloração azul, cuja
intensidade e diretamente proporcional à quantidade de fósforo incorporado.
Após cerca de 10 minutos dessa mistura, a reação de cor se completa e as
amostras foram levadas ao espectrofotômetro (Bioespectro, modelo SP 220)
para medir a absorbância na faixa de 885 ɳm. Para cada amostra foram
12
efetuadas três medidas de absorbância. Entre uma leitura e outra, a cubeta era
lavada três vezes com água miliQ. A média das absorbâncias lidas, subtraída
da média das absorbâncias dos brancos, foi atribuída para cada amostra.
Os valores de absorbância foram convertidos em valores de concentração
(mg.L-1) de fósforo:
𝑋 =𝑌−𝑎
𝑏 equação 4
Onde:
X: concentração de fósforo em (mg.L-1);
Y: absorbância da amostra
a: coeficiente linear (intercepto) da regressão linear entre X e Y
b: coeficiente angular (inclinação) da regressão linear entre X e Y
Os valores dos parâmetros a e b foram obtidos seguindo os passos
descritos na seção 2.4.2.1 abaixo.
A quantidade de fósforo excretado, bem como as taxas de excreção (TEI e
TEE) foram determinadas da mesma maneira descrita para o nitrogênio,
usando as equações 1, 2 e 3, respectivamente.
2.3.2.1. CALIBRAÇÃO DO ESPECTROFOTÔMETRO
Uma solução padrão de Fosfato de Potássio (KH2PO4) contendo 2,5 mg de
P.L-1 foi diluída a fim de obter soluções com concentrações de fósforo de: 0,05;
0,25; 0,50; 0,75; 0,10 (mg.L-1). Depois, foi medida a absorbância na faixa de
885 ɳm de cada uma das soluções e em seguida foram calculados os
parâmetros da equação 4, bem como o coeficiente de determinação da reta de
regressão (R2), sendo considerados satisfatórios valores de R2 maiores que
0,98.
Este processo de calibração foi repetido cada vez que houve troca de
reagentes ou alguma manutenção foi realizada no equipamento.
13
2.3.3. DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO E FÓSFORO NA MASSA
CORPORAL DOS PEIXES
As análises de nitrogênio e fósforo na massa corporal dos peixes seguiram
os mesmos princípios e métodos de medição usados nas análises de água
(seção 2.3.1 e seção 2.3.2), sendo que foram precedidas por uma reação de
digestão, na qual o N e P existentes na massa do peixe são convertidos em
nitritos, nitratos e fosfatos.
2.3.3.1. DIGESTÃO DAS AMOSTRAS
Uma alíquota de cerca de 20 mg de amostra foi dissolvida em 30 mL de
MiliQ em frascos autoclaváveis de vidro borosilicato com tampa rosqueada. Em
seguida foram adicionados 8 mL de solução digestora de Persulfato de
Potássio (K2S2O8) 5%. Os frascos foram fechados, porém as tampas
rosqueadas não foram apertadas até o máximo, para que os frascos não
criassem vácuo, o que impediria a reabertura depois. As amostras foram
autoclavadas por duas horas em pressão de 1,2 a 1,4 Kgf.cm-2. Em cada
bateria de autoclavagem foram incluídos dois frascos contendo apenas as
mesmas quantidades de água MiliQ e de Persulfato de Potássio usadas na
digestão das amostras, para servirem como “branco”.
Ao saírem da autoclave, as amostras e “brancos” foram deixadas para
atingirem a temperatura ambiente. Usando um micropipetador transferia-se dali
15 mL de solução da amostra digerida para frascos de vidro previamente
limpos, que depois de tampados com parafilme, foram levados para análise de
nitrogênio total no TOC.
Para análise de fósforo, foram usados frascos tipo Falcon previamente
limpos e enxaguados com a própria amostra, onde foram colocados cinco mL
da solução de amostra digerida mais um mL de reagente corante combinado.
Por causa da massa corporal dos peixes conter tipmuito fósforo, após a reação
de cor se completar, as amostras foram diluídas com adição de 30 mL de água
miliQ, com a finalidade de reduzir a intensidade de azul, fazendo que as
medidas caíssem dentro dos limites de detecção do espectrofotômetro. As
concentrações obtidas foram corrigidas para compensar o efeito da diluição.
14
2.3.3.2. CÁLCULO DAS CONCENTRAÇÕES DE NITROGÊNIO E
FÓSFORO NA MASSA CORPORAL DOS PEIXES
O cálculo da quantidade de nutriente na massa corporal do peixe (X) é feito
pela razão entre a concentração da massa de amostra diluída [M] e a
concentração de nutriente [x] lida na amostra multiplicada por (m):
𝑋 = {[𝑥]
[𝑀]} ∗ 𝑚 equação 6
2.3.4. COMPILAÇÃO DE INFORMAÇÕES SECUNDÁRIAS
A base de dados Fishbase (www.fishbase.org) foi usada como fonte de
informações para: 1- classificar as espécies amostradas quanto ao hábito
alimentar em três categorias tróficas (onívoro, carnívoro, detritívoro); 2- calcular
um proxy da taxa de crescimento dos indivíduos amostrados, que foi feito da
seguinte forma: a partir dos valores de comprimento máximo e os parâmetros
da relação peso comprimento das espécies amostradas, foi calculada a massa
fresca correspondente ao tamanho máximo da espécie. Em seguida os valores
de massa fresca dos indivíduos amostrados foram transformados em valores
percentuais relativos ao tamanho máximo da espécie e então transformados
em logarítmos decimais para resultar em uma curva assintótica.
2.4. ANÁLISES ESTATÍSTICAS
Basicamente foram usados modelos gerais lineares e modelos de equações
estruturais. As variáveis resposta foram as taxas e razões de excreção, como
variáveis preditoras foram usadas a massa corporal (peso seco), as
concentrações de N e P no corpo em porcentagem da massa seca e a razão
N:P molar do corpo. Antes das análises foram excluídos dados de
experimentos de excreção que deram resultados negativos (casos em que os
peixes aparentemente absorveram nutrientes da água). Quando aconteceu de
mais de um experimento ter sido realizado com uma mesma espécie em um
mesmo dia e local de coleta foi calculada uma média da excreção por espécie.
Os dados usados nas análises foram transformados em logarítmos decimais
15
para homogeneizar as variâncias e em seguida padronizamos os dados para
unidades de desvio padrão.
Para quantificar os efeitos do tamanho do corpo na excreção usamos
modelos de equações estruturadas (SEM). Estes permitem explorar hipóteses
sobre a estrutura causal entre variáveis de um sistema. A estrutura causal do
sistema (hipótese) é representada num diagrama de setas ou caminhos
(paths). O diagrama é traduzido em um conjunto de equações lineares
(modelos componentes), que são avaliadas individualmente. Uma vantagem
destes modelos é permitir que uma mesma variável apareça como preditora de
uma relação e como variável resposta em outra relação do mesmo modelo,
permitindo o teste e a quantificação de efeitos indiretos (Lefcheck, 2016).
O ajuste dos parâmetros das equações lineares é feito encontrando os
valores que melhor reproduzem a covariância observada. A adequação do
modelo global (global goodness-of-fit) aos dados observados é avaliada por
meio de um teste Qui-quadrado para comparar a matriz de covariância
estimada com a observada (Grace, 2006). As relações de causa e efeito
(hipóteses) são consideradas consistentes quando é alta a probabilidade da
somatória das significâncias dos modelos individuais, representada pela
estatística C de Fisher, acontecer por acaso (Lefcheck, 2016), ou seja, o
modelo causal é rejeitado se o valor de C é menor que o nível de significância
escolhido (Shipley, 2009). Para estas análises foi usado o pacote
PIECEWISESEM do R (https:// github.com/jslefche/piecewiseSEM).
Para investigar o efeito do crescimento sobre a estequiometria do corpo
e da excreção foram usados modelos de regressão múltipla considerando
como variáveis preditoras das taxas de excreção de N, P e razão N:P
excretada: 1) a massa corporal; 2) a razão N:P do corpo; 3) o proxy de taxa de
crescimento. Usamos o Fator de Inflação da Variância (VIF) para inspecionar o
grau de autocorrelação entre as variáveis preditoras (Dormann et al., 2013).
Avaliação das premissas dos modelos de regressão: linearidade,
normalidade e efeito de pontos extremos foi feita por inspeção visual (ANEXO
2). Para verificar efeito isolado do crescimento na excreção descontando os
efeitos do tamanho e estequiometria do corpo, usamos um exame das parciais
16
do modelo de regressão. Os gráficos das parciais mantêm constantes (no valor
da mediana) as demais variáveis preditoras para tentar revelar o efeito de uma
variável preditora isoladamente. Para estas análises foram utilizados os
pacotes ppcor e car do programa R.
Três modelos foram ajustados: 1) com o conjunto de dados completos,
2) com os dados de peixes abaixo de 10% do tamanho máximo, aqui
considerados juvenis; 3) com os dados de peixes acima de 10% do tamanho
máximo, denominados aqui não-juvenis. A ideia foi examinar separadamente a
fase inicial do crescimento, que é onde esperamos ter efeito mais forte da taxa
de crescimento na estequiometria da excreção. O limite de 10% do tamanho
total para separar os dados foi estabelecido por duas razões, uma é biológica,
a outra é estatística: 1) por não termos conhecimento prévio sobre em que
tamanho as espécies saem da fase juvenil, consideramos seguro estabelecer
este limiar de 10% como garantia que todas as espécies abaixo deste tamanho
não são adultos; 2) esta partição dos dados fornece dois subconjuntos com o
mesmo número de réplicas.
3. RESULTADOS
3.1. Efeitos diretos e indiretos do tamanho do corpo na excreção de
nitrogênio e fósforo por peixes amazônicos
. Foram usados dados de 101 experimentos de incubação realizados com
indivíduos de 46 espécies, com tamanhos entre 2,4 miligramas e 108 gramas
de massa seca (Tabela 1). A massa corporal explicou mais de 70% da
variância observada nas taxas de excreção de N e P (p< 0,003; Figs. 1A, 1B) e
cerca de 30% da variação na razão N:P excretada (Fig. 1C), que foi
positivamente relacionada com o tamanho do corpo. Os efeitos diretos do
tamanho do corpo nas taxas de excreção de N e P foram negativos, padrão
que é esperado pela TEM. A variação do tamanho, por outro lado, também
afetou significativamente (p<0,001) a estequiometria do corpo, explicando entre
12% e 17% da variação das concentrações de nitrogênio e fósforo.
17
Tabela 1 – Espécies amostradas, número de experimentos e amplitudes de tamanho de corpo por espécie.
Espécie n. experimentos
massa seca (g)
Mín. Máx.
Acarichthys heckelli 10 0,540 13,610
Acaronia nassa 3 0,036 2,766
Aequidens palidus 2 0,080 0,250
Apistograma gephyra 1 0,190
Apistograma sp 1 0,120
Brycon cf. pesu 6 0,091 4,590
Bryconops caudomaculatus 3 0,642 2,463
Chalceus erythrurus 2 8,800 9,600
Cichla ocelaris 1 1,200
Cichlassoma amazonarum 1 0,290
Copela nattereri 1 0,068
Copela sp 1 0,119
Ctenobrycon hauxwellianus 1 0,670
Ctenobrycon spilurus 3 0,062 0,185
Curimatopsis cripticus 1 0,946
Fluviphylax sp 2 0,002 0,007
Geophagus altifrons 5 2,060 18,119
Hemigrammus analis 3 0,159 0,220
Hemigrammus diagonicus 1 0,108
Hemigrammus levis 4 0,032 0,093
Hemiodus atranalis 2 1,490 2,550
Hemiodus goeldii 1 5,220
Hemiodus immaculatus 1 1,910
Hemiodus microlepis 1 4,770
Heros severus 1 6,520
Hoplias malabaricus 5 0,290 108,500
Leporinus fasciatus 1 0,888
Leporinus friderici 1 82,880
Loricariichthys acutus 2 4,030 5,990
Mesonauta festiva 1 2,045
Mesonauta insignis 1 0,221
Moenkhausia intermedia 1 1,390
Moenkhausia lepidura 1 0,330
Mylossoma aureum 1 13,310
Mylossoma sp 1 0,103
Nemadoras elongatus 2 1,480 2,270
Odontostilbe fugitiva 1 0,015
Pseudoplatystoma punctifer 1 16,020
Pterophylum scalarium 4 3,880 6,550
Raphiodon vulpinus 1 12,670
Rivulus sp 1 0,218
Satanoperca acutisseps 1 9,180
Satanoperca jurupari 1 5,720
Semaprochilodus insignis 1 11,470
Sturisoma lyra 1 4,590
Sturisoma sp 1 2,200
18
Figura 1- Modelos de equações estruturais explorando as relações entre o tamanho e estequiometria do corpo com a excreção de: (A) nitrogênio N, (B) de fósforo P, (C) razão N:P na excreção. Setas representam relações unidirecionais entre as variáveis. A largura das setas foi baseada na magnitude do efeito das variáveis preditoras sobre as variáveis respostas (coeficientes das regressões são apresentados nas caixas de texto sobre as setas). Os R
2 de
cada modelo componente são mostrados ao lado da ponta de cada seta. Todos os coeficientes foram significativos (p<0,001) exceto quando assinalados com “ns”.
Estes resultados evidenciam que o tamanho do corpo afetou diretamente
a excreção e a estequiometria do corpo. A magnitude do efeito do tamanho foi
maior sobre a excreção de N e P do que para a razão N:P. A razão N:P, em
contraste, foi mais influenciada pela estequiometria do corpo, particularmente
em função da variação na concentração de fósforo, como será visto a seguir.
Analisando os efeitos diretos da estequiometria do corpo nas taxas e
razão de excreção, encontramos que a concentração de fósforo no corpo
explicou 38% da variação na taxa de excreção deste nutriente (Fig. 1B). Por
outro lado, a excreção de N não foi afetada pela concentração de N no corpo
19
(Fig. 1A). Os coeficientes dos modelos componentes (valores associados às
setas) mostraram que a variação de fósforo no corpo foi mais determinante da
razão N:P excretada do que a massa corporal (Fig. 1C).
Em síntese, os resultados dos modelos componentes apontam que a
excreção de N é regulada pelo tamanho corporal em si, ao passo que a
excreção de P e a razão N:P excretada são reguladas ao mesmo tempo pelo
tamanho e pela estequiometria do corpo. Os coeficientes dos modelos
componentes podem ser multiplicados para fornecer uma medida do efeito
indireto do tamanho na excreção via estequiometria do corpo. Por exemplo, o
coeficiente linear do efeito indireto do tamanho do corpo na taxa de excreção
de P (Fig. 1B) é –0,25 (-0,62 * 0,41). De igual forma, o efeito indireto do
tamanho na excreção de N:P é 0,23 (-0,38 * -0,62). Este resultado mostra que
a magnitude de efeito total do tamanho do corpo (integrando efeitos diretos e
indiretos) é aumentada em 25% na excreção de P e 74% na razão N:P do que
se apenas o efeito direto do tamanho do corpo é levado em consideração.
Apesar de os modelos componentes terem explicado razoavelmente a
variação observada entre as variáveis, os modelos propostos na hipótese
foram rejeitados (os valores da estatística C de Fisher foram 124, 100 e 18,6
para os modelos de excreção de N, P e razão N:P, respectivamente, em todos
os modelos os valores de p foram menores que 0,005).
3.2. Ontogenia e estequiometria da excreção em peixes
Foram usados dados de 47 experimentos de incubação realizados com
indivíduos de 26 espécies de peixes nativos da bacia amazônica, com
tamanhos entre 0,10 a 408 gramas de massa fresca (Tab. 2). Os modelos
ajustados explicaram entre 56% e 64% da variância na taxa de excreção de N
(Tab. 3), cerca de 70% da variância na taxa de excreção de P (Tab. 4), e entre
34% e 49% da razão N:P excretada (Tab. 5).
20
Tabela 2- Espécies usadas na análise. Dados de peso máximo das espécies foram compilados de www.fishbase.org. * tamanho máximo foi emprestado de C. epakros
Espécie peso do peixe amostrado
(g massa fresca)
peso máximo da espécie
(g massa fresca)
Aequidens palidus 1,29 457,6
Aequidens palidus 0,37 457,6
Bryconops caudomaculatus 7,57 35,6
Bryconops caudomaculatus 10,14 35,6
Bryconops caudomaculatus 7,48 35,6
Bryconops caudomaculatus 3,19 35,6
Bryconops caudomaculatus 2,63 35,6
Bryconops giacopinni 19,35 47,3
Chalceus erythrurus * 30,39 243,0
Chalceus erythrurus * 33,15 243,0
Cichla ocelaris 6,00 4.935,7
Ctenobrycon hauxwellianus 2,47 17,7
Geophagus altifrons 86,03 316,0
Geophagus altifrons 27,08 316,0
Geophagus altifrons 47,26 316,0
Geophagus altifrons 55,06 316,0
Geophagus altifrons 10,17 316,0
Hemiodus immaculatus 70,68 245,9
Hemiodus immaculatus 9,12 245,9
Hemiodus microlepis 21,10 277,0
Heros severus 27,61 385,4
Hoplias malabaricus 13,15 3104,5
Hoplias malabaricus 110,60 3104,5
Hoplias malabaricus 408,87 3.104,5
Hoplias malabaricus 1,50 3.104,5
Hoplias malabaricus 2,31 3.104,5
Hoplias malabaricus 84,84 3.104,5
Leporinus friderici 276,71 1.709,5
21
O proxy de crescimento foi significativo apenas para a razão N:P
excretada no modelo ajustado com os dados de peixes juvenis (menores que
10% do tamanho máximo), mas não para peixes maiores que 10% do tamanho
máximo (Tab. 5). O efeito do proxy de crescimento teve a mesma magnitude de
efeito da estequiometria do corpo.
Tab. 2 cont.
Espécie
peso do peixe amostrado
(g massa fresca)
peso máximo da espécie
(g massa fresca)
Mesonauta festiva 8,29 101,3
Moenkhausia lepidura 1,33 11,3
Moenkhausia lepidura 1,26 11,3
Mylossoma aureum 61,89 212,6
Mylossoma duriventre 3,18 667,1
Mylossoma sp 0,60 667,1
Odontostilbe fugitiva 0,10 0,8
Pterophylum scalarium 26,17 21,4
Pterophylum scalarium 16,25 21,4
Pterophylum scalarium 22,56 21,4
Raphiodon vulpinus 55,97 3.756,9
Rhytiodus argenteofucus 70,54 466,2
Satanoperca jurupari 24,30 225,0
Schizodon fasciatus 30,39 724,9
Schizodon fasciatus 16,70 724,9
Schizodon fasciatus 10,75 724,9
Semaprochilodus insignis 47,39 631,0
Triportheus albus 15,32 225,1
Triportheus angulatus 11,23 253,2
22
Tabela 3. Parâmetros e estatísticas dos modelos de regressão para N excretado. Dados de
entrada nos modelos foram transformados em logaritmos decimais e expressos em unidades
de desvio padrão (*** p<<0,001; ** p < 0,001; * p ≤ 0,05, n.s = p > 0,05)
Tabela 4. Parâmetros e estatísticas dos modelos de regressão para P excretado. Dados de
entrada nos modelos foram transformados em logaritmos decimais e expressos em unidades
de desvio padrão (*** p<<0,001; ** p < 0,001; * p ≤ 0,05, n.s = p > 0,05)
N excretado Todos os tamanhos
Juvenis
massa fresca <10% do
peso máximo
Não juvenis
massa fresca > 10% do
peso máximo
coef.pad. IC 95% coef.pad IC 95% coef.pad IC 95%
Intercepto -8,53e-12
-0,18 0,18 -7,98e-11
-0,29 0,29 -4,17 e-11
-0,28 0,28
crescimento -0,15 -0,37 0,07 -0,24 -0,66 0,18 0,08 -0,24 0,41
massa seca -0,72*** -0,94 -0,50 -0,58** -1,00 -0,16 -0,84*** -1,14 -0,53
N corpo 0,07 -0,12 0,26 0,06 -0,25 0,38 0,14 -0,18 0,46
R2 ajustado 0,64 0,56 0,61
F 26,38 10,02 11,36
g.l. 39 19 17
P 1,7e-9
0,0004 0,0002
P excretado Todos os tamanhos
Juvenis
massa fresca <10% do
peso máximo
Não juvenis
massa fresca > 10% do
peso máximo
coef.pad IC 95% coef.pad IC 95% coef.pad IC 95%
Intercepto -1,84e-11
-0,16 0,16 -1,38e-10
-0,25 0,25 -8,52e-11
-0,25 0,25
crescimento 0,04 -0,15 0,23 0,18 -0,19 0,55 0,09 -0,18 0,35
massa seca -0,76*** -0,95 -0,56 -0,81*** -1,10 -040 -0,76*** -1,04 -0,47
P corpo -0,25** -0,43 -0,08 -0,33 -0,62 -0,04 -0,21 -0,50 0,07
R2 ajustado 0,71 0,69 0,69
F 36,42 16,52 15,81
g.l. 39 18 17
P 2,2e-11
2,08e-5
3,62e-5
23
Tabela 5. Parâmetros e estatísticas dos modelos de regressão para razão N:P excretada.
Dados de entrada nos modelos foram transformados em logaritmos decimais e expressos em
unidades de desvio padrão (*** p<<0,001; ** p < 0,001; * p ≤ 0,05, n.s = p > 0,05)
A dispersão dos resíduos dos modelos (Figs. 2, 3 e 4) mostra que a
variância dos dados não é sempre homogênea. Esta heterogeneidade foi
causada por outliers no conjunto total dos indivíduos (Fig.2), com maior
variância nos tamanhos menores no caso do modelo com indivíduos menores
que 10% (Fig.3) e maior variância nos tamanhos maiores no caso do modelo
com indivíduos maiores que 10% (Fig.4). A exclusão dos outliers não modificou
as tendências observadas, e melhorou pouco o ajuste dos modelos (resultados
não mostrados aqui), por isto optamos por manter os outliers nas análises e
mostrar a variabilidade dos dados. Autocorrelação entre as variáveis preditoras
foi baixa (VIF < 1,5 para todos os pares de variáveis), indicando que a falta de
independência não violou fatalmente as premissas de abordagem por modelos
lineares.
O coeficiente para o proxy de crescimento nos peixes juvenis (menores
que 10% do tamanho máximo) teve magnitude semelhante ao efeito da massa
corporal, mostrando que a razão N:P excretada é influenciada pelo estágio de
N:P
excretado
Todos os tamanhos
Tab 5
Juvenis
massa fresca <10% do
peso máximo
Não juvenis
massa fresca > 10% do
peso máximo
coef.pad. IC 95% coef.pad IC 95% coef.pad IC 95%
Intercepto 1,18e-10
-0,24 0,24 -6,99e-12
-0,36 0,36 1,00 e-10
-0,33 0,33
crescimento -0,35* -0,63 -0,05 -0,63* -1,20 -0,05 -0,21 -0,54 0,13
massa seca 0,38* 0,08 0,66 0,47 -0,05 0,99 0,38* 0,02 0,73
N:P corpo -0,53*** -0,80 -0,26 -0,65* -1,14 -0,16 -0,55** -0,90 -0,20
R2 ajustado 0,39 0,34 0,49
F 10,01 4,56 7,39
g.l. 39 18 17
P 5,05e-5
0,015 0,002
24
crescimento em igual medida da influência da mudança de massa. O sinal
negativo do proxy de crescimento (Tab. 5) indica que a razão N:P excretada
aumenta quanto mais distante do limiar de 10% do tamanho máximo.
Assumindo que a taxa de crescimento é inversamente relacionada ao tamanho,
quanto maior a taxa esperada de crescimento maior foi a razão N:P excretada.
A razão N:P na excreção foi influenciada negativamente pela razão N:P
no corpo dos peixes (Tab 5). Mudanças na estequiometria do corpo em função
da taxa de crescimento são previstas de acordo com a teoria estequiométrica.
Para investigar isso, nós modelamos a razão N:P do corpo em função da
massa corporal e do proxy de crescimento. O resultado mostrou que razão N:P
no corpo foi afetada negativamente pelo proxy de crescimento nos peixes
juvenis (menores que 10% do tamanho máximo) corroborando um efeito
indireto do crescimento na excreção através da estequiometria do corpo. Em
peixes maiores (acima de 10% do tamanho máximo da espécie) a razão N:P no
corpo não sofreu influência significativa do proxy de crescimento (Tab. 6, Fig.
5). Interessante mencionar que os interceptos dos modelos ajustados com os
dados log-transformados forneceram valores de (1,2 e 1,9) substituindo estes
valores no expoente da base decimal encontramos valores próximos da razão
N:P de Redfield (Tab. 6).
25
Figura 2. Resíduos e parciais do modelo linear da razão N:P excretada (logNPE) em função da
massa seca do corpo (logMS), proxy de crescimento (logW) e N:P corpo (logNPB) ajustado
com todo o conjunto de dados (todos os tamanhos).
Figura 3. Resíduos e parciais do modelo linear da razão N:P excretada (logNPE) em função da
massa seca do corpo (logMS), proxy de crescimento (logW) e N:P corpo (logNPB) ajustado
para peixes menores que 10% do tamanho máximo da espécie.
26
Figura 4. Resíduos e parciais do modelo linear da razão N:P excretada (logNPE) em função da
massa seca do corpo (logMS), proxy de crescimento (logW) e N:P corpo (logNPB) ajustado
para peixes maiores que 10% do tamanho máximo da espécie.
Tabela 6. Parâmetros e estatísticas dos modelos de regressão de N:P no corpo (*** p<<0,001;
** p < 0,001; * p ≤ 0,05, n.s = p > 0,05).
N:P corpo
Juvenis
(abaixo que 10% do
peso máximo)
Não juvenis
(acima de 10% do
peso máximo)
coef. IC 95% coef. IC 95%
Intercepto 1,21 *** 1,14 1,28 1,19 *** 0,84 1,55
Crescimento -0,12 * -0,24 -0,005 -0,005 ns
- 0,26 0,25
massa seca -0,04 ns
-0,18 0,09 -0,05 ns
-0,14 0,04
R2 ajustado 0,36 0,03
F 7,00 0,657
g.l. 19 18
P 0,005 0,530
27
Figura 5. Resíduos e parciais dos modelos de regressão da razão N:P no corpo (logNPB) em
função do proxy de crescimento (logW) e da massa corporal (logMS). (A, B, C) para peixes
juvenis (abaixo de 10% do tamanho máximo da espécie) e (D, E, F) para peixes não juvenis
(acima de 10% do tamanho máximo da espécie).
4. DISCUSSÃO
Para as 46 espécies de peixes amazônicos aqui analisadas, o tamanho
do corpo foi o fator que mais influenciou as taxas de excreção do corpo, além
disso, afetou a excreção de P e N:P indiretamente via estequiometria do corpo.
Isto está de acordo com as teorias do metabolismo e da estequiometria.
Considerando as relações de causa e efeito estabelecidas na hipótese, o
tamanho afeta mais a excreção de N e P do que as concentrações destes
elementos no corpo. Em contraste, a razão N:P na excreção foi afetada
diretamente pelo tamanho, mas principalmente pelo conteúdo de P no corpo. É
importante ressaltar que os modelos de equações estruturais permitiram
28
identificar a magnificação do efeito do tamanho do corpo na excreção em
função de seus efeitos indiretos na estequiometria do corpo.
Até o quanto sabemos, existem pouquíssimos estudos sobre ciclagem
de nutrientes mediada por peixes de água doce nos neotrópicos, exceções
seriam Vanni et al. (2002) e McIntyre et al. (2008) que estudaram peixes de um
riacho de quarta-ordem. Em comparação, nossos dados provêm de um sistema
de planícies de inundação de dois rios de grande escala. Destaca-se que a
base de dados usada incluiu indivíduos de pequenos tamanhos (2,4 mg a
108,5 g de massa seca), de diferentes espécies, com adultos de espécies
pequenas e juvenis de espécies grandes, e mesmo assim o padrão se manteve
e nossos resultados parecem confirmar a Teoria Metabólica da Ecologia (TME)
em relação à alometria do metabolismo.
Estudos sobre ciclagem de nutrientes mediada por consumidores
aquáticos atestam o tamanho corporal como fator preponderante na excreção
(Algeier et al., 2015; Vanni & McIntyre, 2016). Nossos resultados avançam
além disso, mostrando que a excreção sofre efeitos indiretos do tamanho via
estequiometria do corpo. A teoria em Estequiometria Ecológica (EE) prevê que
o aumento do tamanho provocaria uma diminuição de N:P no corpo de
vertebrados, por causa do aprisionamento de fósforo em estruturas ósseas e
escamas. Em consequência, seria esperado um aumento da razão N:P
excretada (Elser et al., 1996; Sterner & Elser, 2002). Nossos resultados
aparentemente corroboram estas previsões.
Comparando nossas análises com outros trabalhos abordando efeitos da
estequiometria do corpo na excreção notamos algumas conclusões diferentes.
Vanni e McIntyre (2016) e Algeier et al. (2015), por exemplo, encontraram um
fraco efeito da razão N:P do corpo sobre a razão N:P excretada, bem como que
a concentração de N no corpo pouco explica a excreção do próprio N. Em
contraste, nossos resultados não revelaram efeito semelhante para a excreção
de N, mas por outro lado mostraram que o conteúdo de P no corpo explicou a
excreção de P e N:P (Vanni et al,. 2002).
Uma limitação de nossos resultados é a falta de informação sobre a
composição estequiométrica do alimento consumido pelos peixes usados em
29
nossos experimentos. Porém, é importante observar que a análise de conteúdo
do trato digestório de peixes muito pequenos como os aqui usados, é
trabalhosa e pode ser inútil na medida que o alimento ingerido não é
necessariamente digerido, podendo não se refletir na excreção (Vanni &
McIntyre, 2016). Outro efeito de confusão é que os peixes podem passar por
mudanças na dieta, causadas por ontogenia (Pilati & Vanni, 2007; Boros, Sály
& Vanni, 2015) mas, especialmente em nosso caso, por variações sazonais na
disponibilidade de alimento (Mortillaro et al., 2015). Considerando estas
limitações, o modelo mínimo proposto por Sterner & Elser (2002), parece ser
uma alternativa útil para analisar a excreção mediada por peixes. No entanto,
há evidência de que a incorporação de informação da dieta e qualidade do
alimento incremente o poder de explicação dos modelos de excreção baseados
em EE (Algeier et al., 2015; Vanni & McIntyre, 2016). Assim, ressaltamos este
ponto como um novo passo que pode ser dado nos estudos futuros para
espécies de peixes amazônicas.
De fato, como vimos nos resultados, modelo global foi rejeitado
indicando que é bastante provável que outras variáveis preditoras não incluídas
no modelo devem ser consideradas (temperatura, dieta, guilda trófica,
ontogenia, eficiência de assimilação, etc.). Neste trabalho mostramos a
utilidade de modelos de equações estruturais permitindo desmembrar efeitos
diretos e indiretos da TEM e EE nos processos de ciclagem de nutrientes por
consumidores, assim permitindo ampliar o conhecimento deste processo.
Nossos resultados mostraram que a razão N:P excretada foi influenciada
mais fortemente e negativamente pela estequiometria do corpo mas também
influenciada (positivamente) pela massa corporal. De acordo com a teoria
estequiométrica, a excreção de N:P aumenta com a massa corporal por que os
peixes maiores retêm proporcionalmente mais P, provocando diminuição da
razão N:P no corpo. Por outro lado, peixes que crescem numa velocidade
maior (juvenis) têm menor razão N:P de excreção.
A GRH (Growth Rate Hypothesis) prevê que os organismos em fase de
crescimento acelerado, contêm mais fósforo no corpo em função da maior
quantidade de RNA empregado na síntese protéica e por isto, a razão N:P no
30
corpo tenderia a diminuir nas fases iniciais de crescimento. No entanto, os
resultados que encontramos (Fig. 5B) não mostram isto, ao contrário, nossos
resultados mostram que a razão N:P no corpo dos peixes juvenis tende a
aumentar no início do crescimento, que é a mesma tendência observada nos
peixes estudados por Tanner et al. (2000); Pilati & Vanni (2007) e Boros, Sály e
Vanni (2015).
Tanner et al. (2000) sugeriram que isto seria causado por que espécies
de rápido crescimento aumentam proporcionalmente mais em músculos (tecido
rico em N e pobre em P) do que em ossos e escamas. Por outro lado,
diminuição na razão N:P associada ao crescimento também pode ser explicada
pelo aumento da concentração de P no corpo, decorrente da formação de
ossos e escamas (Pilati & Vanni, 2007; Boros, Sály & Vanni 2015). Nossos
resultados indicam que a variação na razão N:P no corpo são decorrentes mais
da alocação de P em estruturas ósseas do que de processos fisiológicos
previstos pela GRH. Isto por que a proporção de P associada ao RNA é muito
pequena em relação ao conteúdo total de P no corpo dos peixes, o que torna o
efeito da GRH na estequiometria do corpo imperceptível (Tanner et al., 2000).
Contudo, como nossos experimentos não incluíram a fase larval, é impossível
descartar a hipótese de que a GRH não se aplique ao desenvolvimento
ontogenético em peixes.
Estudos em estequiometria ecológica de peixes mostram que mudanças
na composição do corpo durante o crescimento acontecem abruptamente,
tanto por efeitos ontogenéticos, como por mudanças de dieta, fazendo
necessário dividir o espectro de tamanhos para tentar estabelecer relações
monotônicas entre as variáveis. Os trabalhos de Vrede et al. (2011) com Perca
fluviatilis, e Pilati e Vanni (2007) com Dorosoma cepedianum e Danio rerio,
estabeleceram limiares em torno de 20% do tamanho adulto. Em nosso
trabalho dividimos o conjunto dos dados em peixes menores e maiores que
10% do tamanho máximo, obtendo dois subconjuntos com número de amostras
similares, permitindo um delineamento estatístico equilibrado e mais rigoroso
na diferenciação dos grupos que os trabalhos supracitados.
31
Desta forma, estes experimentos nos permitem concluir que: 1) a
estequiometria da excreção foi influenciada pelo tamanho e pela estequiometria
do corpo e que, nos menores tamanhos, também atua um fator adicional,
vinculado ao crescimento; 2) nessa fase a estequiometria do corpo também é
afetada pelo crescimento, entretanto este efeito aparentemente não
corresponde ao mecanismo proposto pela GRH.
5. CONCLUSÃO GERAL
A excreção de nitrogênio (N) e fósforo (P) realizada por 46 espécies de
peixes, de tamanhos entre 2,4 mg e 108,5 g de massa seca, nativas da
Amazônia Central, foi investigada a partir das estruturas conceituais da Teoria
Metabólica Ecológica e da Estequiometria Ecológica. Este é o primeiro estudo
usando estas abordagens em sistemas aquáticos de planícies de inundação
amazônicos. Nossos resultados apontam para as seguintes conclusões:
O tamanho do corpo dos peixes afetou direta e negativamente as taxas de
excreção específicas de N e P.
O tamanho do corpo afetou diretamente e positivamente a estequiometria
da excreção
A razão N:P excretada e a taxa de excreção de fósforo foram afetadas pela
estequiometria do corpo, que por sua vez foi influenciada pelo tamanho
corporal. Portanto a variação do tamanho corporal afetou direta e indiretamente
a excreção realizada pelos peixes.
Em adição aos mecanismos listados acima, a razão N:P excretada foi
afetada por mudanças ontogenéticas na estequiometria do corpo.
32
ANEXO 1 Gráficos de dispersão dos dados usados nas análises. Os eixos das ordenadas nos
gráficos D e E são porcentagem de N e P no corpo, respectivamente.
33
ANEXO 2 Gráficos de normalidade e leverage dos modelos ajustados (Tab.3). No topo: todos os tamanhos; no meio: peixes menores que 10%; a baixo: peixes maiores que 10% do tamanho máximo.
34
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