Evolução Molecular Evolução Molecular Metodologias de AnáliseMetodologias de Análise

Ricardo Lehtonen Rodrigues de Souza

Laboratório de Polimorfismos e Ligação

Depto de Genética – UFPR

lehtonen@ufpr.br

DadosDadosMolecularesMoleculares x x MorfológicosMorfológicos

► HereditáriosHereditários► Descrição não Descrição não

ambígua ambígua ► Mais fácil Mais fácil

estabelecer estabelecer homologiahomologia

► Permite Permite comparações de comparações de espécies distantesespécies distantes

► Abundantes Abundantes

►Fatores Fatores ambientaisambientais

►Diferenças de Diferenças de classificaçãoclassificação

Evolução MolecularEvolução Molecular

As mutações genéticas são a As mutações genéticas são a matéria prima do processo matéria prima do processo evolutivo. evolutivo.

A taxa de mudança gênica pode A taxa de mudança gênica pode ser usada para medir a ser usada para medir a evolução.evolução.

Evolução MolecularEvolução Molecular

►Seqüências de DNA mudam Seqüências de DNA mudam lentamentelentamente

►Não é possível observar diretamente a Não é possível observar diretamente a evoluçãoevolução

►Comparação de 2 ou mais seqüências Comparação de 2 ou mais seqüências homólogas (descendem de um homólogas (descendem de um ancestral comum)ancestral comum)

Modelo de um parâmetroModelo de um parâmetro (Jukes e Cantor)(Jukes e Cantor)

► A taxa de A taxa de substituição em substituição em cada direção é cada direção é

► A taxa de A taxa de substituição para substituição para qualquer nt é qualquer nt é 3 3

► A probabilidade A probabilidade que um nt não que um nt não mude é mude é 1 - 3 1 - 3

Modelo de 2 parâmetrosModelo de 2 parâmetros (Kimura)(Kimura)

► A taxa de A taxa de transiçãotransição é é

► A taxa de A taxa de transversãotransversão é é

► Considera Considera ee , , pois pois transiçõestransições são mais são mais freqüentes que freqüentes que transversõestransversões

Tipos de substituições Tipos de substituições entre 2 seqüênciasentre 2 seqüências

► Substituição únicaSubstituição única► Substituições Substituições

seqüenciaisseqüenciais► Substituições Substituições

coincidentescoincidentes► Substituições Substituições

paralelasparalelas► Substituições Substituições

convergentesconvergentes► Retro substituiçãoRetro substituição

tempo

Nu

mer

o d

e d

ifer

ença

sEsperado

Observado

Regiões CodificadorasRegiões Codificadoras

►Distinguir entre:Distinguir entre: Substituição Substituição sinônimasinônima Substituição Substituição não sinônimanão sinônima

►Para estimar as proporções de Para estimar as proporções de substituições sinônimas e não substituições sinônimas e não sinônimas é preciso saber, sinônimas é preciso saber, respectivamente, o número total respectivamente, o número total possível de:possível de: Sítios sinônimosSítios sinônimos Sítios não sinônimosSítios não sinônimos

Regiões CodificadorasRegiões Codificadoras Cálculo do número de sítios Cálculo do número de sítios sinônimos e não sinônimossinônimos e não sinônimos

►SeSe ii é o número de mudanças é o número de mudanças sinônimas em um sítio, esse sítio é sinônimas em um sítio, esse sítio é contado separadamente como: contado separadamente como: i/3 sinônimo i/3 sinônimo (Ns = (Ns = i/3) i/3) (3-i)/3 não sinônimo (3-i)/3 não sinônimo [Na = [Na = (3-i/3)] (3-i/3)]

Regiões codificadorasRegiões codificadoras

Ks = - 3/4 ln (1 - 4Ms/3Ns)Ks = - 3/4 ln (1 - 4Ms/3Ns)Ka = - 3/4 ln (1 - 4Ma/3Na)Ka = - 3/4 ln (1 - 4Ma/3Na)

Ks e Ka : proporção de diferenças Ks e Ka : proporção de diferenças sinônimas e não sinônimas por sítio sinônimas e não sinônimas por sítio sinônimo e não sinônimo, sinônimo e não sinônimo, respectivamente.respectivamente.

Ms e Ma : número respectivo de Ms e Ma : número respectivo de diferenças sinônimas e não sinônimas diferenças sinônimas e não sinônimas observadas,.observadas,.

Ns e Na : número respectivo de sítios Ns e Na : número respectivo de sítios sinônimos e não sinônimos esperados.sinônimos e não sinônimos esperados.

Mudanças EvolutivasMudanças Evolutivas

►Substituição de Substituição de aminoácidosaminoácidos

Substituição de Substituição de AminoácidosAminoácidos

►A proporção (A proporção (pp) de diferentes ) de diferentes aminoácidos entre duas aminoácidos entre duas seqüências:seqüências:

p = n/Lp = n/L nn: número de aminoácidos diferentes: número de aminoácidos diferentes LL: comprimento da seqüência: comprimento da seqüência

►O número de substituições de O número de substituições de aminoácidos por sítio (aminoácidos por sítio (dd):):

d = - ln (1-p)d = - ln (1-p)

Algumas substituições de Algumas substituições de aminoácidos requerem mais aminoácidos requerem mais substituições de nt substituições de nt

► Ile Ile Thr Thr : uma mudança : uma mudança►AUU AUU A ACCUU►AUC AUC A ACCCC►AUA AUA A ACCAA

► Ile Ile Cys Cys: duas mudanças: duas mudanças►AUU (Ile) AUU (Ile) A AGGU (Ser) U (Ser) UUGU (Cys)GU (Cys)►AUU (Ile) AUU (Ile) UUUU (Phe) UU (Phe) U UGGU (Cys)U (Cys)

Substituição de Substituição de NucleotídeosNucleotídeos

Taxas e PadrõesTaxas e Padrões

Taxa de substituição de Taxa de substituição de nucleotídeosnucleotídeos

► Divergência de 2 Divergência de 2 seqüências seqüências homólogas a partir do homólogas a partir do ancestral comumancestral comum

► r = K/2Tr = K/2T► rr = n = noo de de

substituições por substituições por sítio/anosítio/ano

► KK = n = noo médio de médio de substituiçõessubstituições

► TT = tempo desde a = tempo desde a divergênciadivergência

►Normalmente consideramos o tempo Normalmente consideramos o tempo de de divergência das seqüênciasdivergência das seqüências como como igual ao tempo de igual ao tempo de divergência das 2 divergência das 2 espéciesespécies

►Mas, em espécies próximas, podemos Mas, em espécies próximas, podemos estar vendo estar vendo diferenças que já estavam diferenças que já estavam presentes no ancestral comumpresentes no ancestral comum

►A A duplicação das seqüênciasduplicação das seqüências pode pode ocorrer ocorrer independente da especiaçãoindependente da especiação

Espécie Ancestral

Homem Gorila

especiação

Seqüência comum ancestralT

emp

o

►As seqüências As seqüências divergiram há divergiram há mais tempomais tempo que as espécies que as espécies

►Se for usado o tempo de Se for usado o tempo de divergência das espécies, divergência das espécies, a a taxa de substituição será taxa de substituição será superestimadasuperestimada

Taxas de substituições sinônimas (S) e não sinônimas (NS) em genes de proteínas em mamíferos.

Médias:

NS: 0,74

S: 3,51

Regiões Codificadoras

Regiões codificadoras e não Regiões codificadoras e não codificadoras: comparando codificadoras: comparando seqüências e descobrindo seqüências e descobrindo

genesgenes

Padrões de substituiçãoPadrões de substituiçãoDiferenças nas pressões seletivasDiferenças nas pressões seletivas

► Alguns poucos aminoácidos em um Alguns poucos aminoácidos em um

ponto críticoponto crítico Região do grupo Heme na Região do grupo Heme na

HemoglobinaHemoglobina O restante só precisa ser hidrofílicoO restante só precisa ser hidrofílico

► Toda a proteínaToda a proteína Histona 4Histona 4 A proteína toda está em contato com A proteína toda está em contato com

o DNA ou proteínaso DNA ou proteínas Quanto mais importante a função, mais Quanto mais importante a função, mais

lenta a taxa de evoluçãolenta a taxa de evolução

Padrões de substituiçãoPadrões de substituição

►Padrões de substituição podem dar Padrões de substituição podem dar informações sobre a função da proteínainformações sobre a função da proteína

►Genes diferentes evoluem a taxas Genes diferentes evoluem a taxas diferentesdiferentes

►Aminoácidos conservados são críticos Aminoácidos conservados são críticos para a função da proteínapara a função da proteína

Distâncias físico-químicas Distâncias físico-químicas entre os aminoácidosentre os aminoácidos

Distâncias físico-químicas Distâncias físico-químicas entre pares de aminoácidosentre pares de aminoácidos

Cerca de 60-90% das trocas Cerca de 60-90% das trocas de aa envolvem o 1de aa envolvem o 1oo ou 2 ou 2oo

vizinhos do anelvizinhos do anel

Relógio MolecularRelógio Molecular

►Número de mudanças é proporcional Número de mudanças é proporcional ao tempoao tempo

►Então, usando o número de mudanças Então, usando o número de mudanças é possível é possível estimar o tempo de estimar o tempo de divergênciadivergência entre espécies ou entre entre espécies ou entre genesgenes

►Pré-requisito: Pré-requisito: taxa de evolução taxa de evolução constanteconstante

Obtenção das seqüênciasObtenção das seqüências

► SeqüenciamentoSeqüenciamento

► Bancos de dadosBancos de dados

Bancos de dadosBancos de dados

►EntrezEntrez►http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/

►GenBank: 85.759.586.764 bases (fev GenBank: 85.759.586.764 bases (fev 08)08)

EntrezEntrez

Busca de seqüênciasBusca de seqüências

Busca de seqüênciasBusca de seqüências

Alinhamento de seqüênciasAlinhamento de seqüências

►ClustalWClustalW http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.htmlhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html

►BioEditBioEdit http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.htmlhttp://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html

►MegaMega http://www.megasoftware.net/http://www.megasoftware.net/

BioEditBioEdit

Métodos de construção de Métodos de construção de árvores filogenéticasárvores filogenéticas

Métodos baseados em distânciaMétodos baseados em distância► UPGMAUPGMA – considera a árvore como aditiva e – considera a árvore como aditiva e

que todos os táxons estão igualmente que todos os táxons estão igualmente distantes da raiz.distantes da raiz.

► Evolução mínimaEvolução mínima – estima-se para cada – estima-se para cada árvore alternativa o comprimento de cada árvore alternativa o comprimento de cada braço a partir das distâncias entre os braço a partir das distâncias entre os táxons. A árvore escolhida é a que tem táxons. A árvore escolhida é a que tem menor somatória do comprimento de menor somatória do comprimento de braços.braços.

Métodos de construção de Métodos de construção de árvores filogenéticasárvores filogenéticas

►Agrupamento de vizinhos (Neighbor Agrupamento de vizinhos (Neighbor Joining):Joining): Baseado no método de Baseado no método de evolução mínima – não examina todas evolução mínima – não examina todas as topologias possíveis, mas procura as topologias possíveis, mas procura encontrar vizinhos que minimizem o encontrar vizinhos que minimizem o comprimento total da árvore.comprimento total da árvore.

Métodos de construção de Métodos de construção de árvores filogenéticasárvores filogenéticas

Métodos baseados em caráterMétodos baseados em caráter►Máxima Parcimônia:Máxima Parcimônia: o método assume o método assume

o critério da parcimônia, minimizando o critério da parcimônia, minimizando o número de passos evolutivos aceitos o número de passos evolutivos aceitos na árvorena árvore

►Máxima verossimilhança:Máxima verossimilhança: considera considera todos os sítios indistintamentetodos os sítios indistintamente

►Análise Bayesiana:Análise Bayesiana: probabilidades a probabilidades a posterioriposteriori

Métodos de construção de Métodos de construção de árvores filogenéticasárvores filogenéticas

►Vários desses métodos estão Vários desses métodos estão implementados no programa implementados no programa MegaMega

►Também no pacote de programas Também no pacote de programas PhylipPhylip: : http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.htmhttp://evolution.genetics.washington.edu/phylip.htmll

ExemplosExemplos► Neighbor-Joining Neighbor-Joining

PON2 Homosapiens

PON2 Pan troglodytes

PON2 Macaca mulata

PON2 Mus musculus

PON3 Mus musculus

PON3 Macaca mulata

PON3 Homo sapiens

PON3 Pan troglodytes

PON2 Galus gallus

PON1 Mus musculus

PON1 Macaca mulata

PON1 Homo Sapiens

PON1 Pan Troglodytes

PON2 Xenopus tropicalis

PON1 Xenopus laevis

MRNA Danio rerio

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95

100

100

95

100

100

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64

64

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100

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0.05

ExemplosExemplos► Minimum Evolution Minimum Evolution

PON2 Homosapiens

PON2 Pan troglodytes

PON2 Macaca mulata

PON2 Mus musculus

PON3 Mus musculus

PON3 Macaca mulata

PON3 Homo sapiens

PON3 Pan troglodytes

PON1 Mus musculus

PON1 Macaca mulata

PON1 Homo Sapiens

PON1 Pan Troglodytes

PON2 Galus gallus

PON2 Xenopus tropicalis

PON1 Xenopus laevis

MRNA Danio rerio

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96

100

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51

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100

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0.05

ExemplosExemplos► Maximum Parsimony Maximum Parsimony

PON2 Homosapiens

PON2 Pan troglodytes

PON2 Macaca mulata

PON2 Mus musculus

PON3 Mus musculus

PON3 Macaca mulata

PON3 Homo sapiens

PON3 Pan troglodytes

PON2 Galus gallus

PON1 Mus musculus

PON1 Macaca mulata

PON1 Homo Sapiens

PON1 Pan Troglodytes

MRNA Danio rerio

PON2 Xenopus tropicalis

PON1 Xenopus laevis

100

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100

99

100

100

99

100

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33

52

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100

ExemplosExemplos► UPGMAUPGMA

PON2 Homosapiens

PON2 Pan troglodytes

PON2 Macaca mulata

PON2 Mus musculus

PON2 Galus gallus

PON3 Mus musculus

PON3 Macaca mulata

PON3 Homo sapiens

PON3 Pan troglodytes

PON1 Mus musculus

PON1 Macaca mulata

PON1 Homo Sapiens

PON1 Pan Troglodytes

PON2 Xenopus tropicalis

PON1 Xenopus laevis

MRNA Danio rerio

99

100

99

100

100

100

100

100

100

100

90

67

97

0.000.050.100.15

Leitura recomendadaLeitura recomendada

►Schneider, Horacio. Métodos de Schneider, Horacio. Métodos de análise filogenética: um guia prático. análise filogenética: um guia prático. 33aa edição. Ed. Holos e SBG, 2007. edição. Ed. Holos e SBG, 2007.

►www.sbg.org.brwww.sbg.org.br