estudos dos mecanismos envolvidos no efeito protetor da … · correção da lista de referências...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

ROBERTA DALCICO

ESTUDOS DOS MECANISMOS ENVOLVIDOS NO EFEITO

PROTETOR DA SINVASTATINA NA PERIODONTITE

EXPERIMENTAL EM RATOS

FORTALEZA

2013

ROBERTA DALCICO

ESTUDOS DOS MECANISMOS ENVOLVIDOS NO EFEITO

PROTETOR DA SINVASTATINA NA PERIODONTITE

EXPERIMENTAL EM RATOS

Tese submetida à Coordenação do Programa

de Pós-graduação em Farmacologia, da

Universidade Federal do Ceará, como requisito

parcial para obtenção do grau de Doutor em

Farmacologia.

Orientadora: Profa. Dra. Gerly Anne de Castro

Brito

FORTALEZA

2013

ROBERTA DALCICO

ESTUDOS DOS MECANISMOS ENVOLVIDOS NO EFEITO PROTETOR DA

SINVASTATINA NA PERIODONTITE EXPERIMENTAL EM RATOS

Tese submetida à Coordenação do Programa

de Pós-graduação em Farmacologia, da

Universidade Federal do Ceará, como requisito

parcial para obtenção do grau de Doutor em

Farmacologia.

Aprovada em 06/12/2013

BANCA EXAMINADORA

_____________________________________________________

Profa. Dra. Gerly Anne de Castro Brito

Orientadora

Universidade Federal do Ceará - UFC

Prof. Dr. Rodrigo Otávio Citó César Rêgo


Profa. Dra. Mariana Lima Vale


Prof. Dr. Luiz Eurico Nasciutti

Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ

Profa. Dra. Maria Angelina da Silva Medeiros

Universidade de Fortaleza - UNIFOR

_____________________________________________________

_____________________________________________________

_____________________________________________________

_____________________________________________________

Dedico todo o esforço e os resultados desse

trabalho aos meus pais, fontes do bom caráter e

da índole irretocável que a mim foram confiados.

AGRADECIMENTOS

AGRADECIMENTOS

À Profa. Dra. Gerly Anne de Castro Brito, pela orientação do trabalho de

pesquisa e pela atenção dedicada durante todo esse tempo.

À coordenadora do Programa de Pós-graduação em Farmacologia, da

Universidade Federal do Ceará, Profa. Dra. Geanne Matos de Andrade Cunha.

Ao Prof. Dr. Ronaldo Ribeiro, pela acolhida no Laboratório da Inflamação e do

Câncer (LAFICA).

À Profa. Dra. Mariana Lima Vale, pela ajuda valiosa nos procedimentos

laboratoriais e na correção do artigo.

Ao Prof. Dr. Reinaldo Oriá, pela correção do artigo e pela colaboração nas

análises executadas no Laboratório da biologia da cicatrização, ontogenia e nutrição de

tecidos (LABICONTE).

À Profa. Dra. Renata Leitão, pela prestimosa atenção em todas as fases do

trabalho.

Aos amigos e professores Dr. Roberto César e Dra. Antoniella pela ajuda nos

procedimentos laboratoriais e pelo apoio durante nossa vida de pós-graduandos.

À professora e amiga Helíada Chaves, pelo auxílio valioso no aprendizado das

técnicas cirúrgicas.

À amiga Adriana Menezes, pela indispensável colaboração no andamento dos

experimentos e pela amizade dentro e fora da pós-graduação.

Ao amigo Davi, pelo companheirismo e pela ajuda nas análises no laboratório da

biologia da cicatrização, ontogenia e nutrição de tecidos (LABICONTE).

AGRADECIMENTOS

A todos os professores do Programa de Pós-graduação em Farmacologia, da

Universidade Federal do Ceará.

Aos técnicos de laboratório Maria Silvandira (Vandinha), Maria Socorro

Monte, José Ivan e Ricardo pelo auxílio nos trabalhos laboratoriais, pela atenção,

colaboração e amizade em todos os momentos.

Aos funcionários do Biotério do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da

UFC, Haroldo e Armando.

Às secretárias do Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Aura Rhanes,

Célia e Márcia, pela constante ajuda e atenção.

Às bibliotecárias do Centro de Ciências da Saúde da UFC, pela colaboração e

correção da lista de referências bibliográficas.

Aos bolsistas de iniciação científica, Luara, Luiz Fernando e André, pelo apoio

na realização dos experimentos.

À CAPES, pela concessão da bolsa de doutorado.

À querida Família do LAFICA, Ana Carla, Jand Venes, André, Priscilla,

Denusa, Helíada, Ana Paula, Dayse, pela amizade e companheirismo constantes, pela ajuda

nos momentos difíceis e pela maravilhosa convivência.

Ao Otacílio, por todo o apoio prestado de maneira incansável na execução deste

trabalho e pela ampla e irrestrita dedicação e cuidado com nosso relacionamento.

A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.

Meus sinceros agradecimentos

Para que seja destruída a ignorância, a inimiga do

intelecto, eu saúdo a luz da lamparina que traz

auspiciosidade, prosperidade, saúde e abundância.

RESUMO

RESUMO

A sinvastatina é uma droga utilizada para o tratamento das dislipidemias, cujos

efeitos pleiotrópicos podem apresentar um impacto terapêutico em doenças ósseas. O

propósito deste estudo foi avaliar os efeitos da sinvastatina em ratos submetidos à doença

periodontal experimental (DPE). A periodontite foi induzida pela colocação de uma ligadura

ao redor do segundo molar superior de ratos Wistar por 11 dias. Grupos de seis animais

receberam por via oral salina ou sinvastatina (3, 10 e 30 mg/kg/dia) até o sacrifício no dia 11.

A perda óssea alveolar foi determinada pelas análises macroscópica e histológica. Os níveis

séricos de aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT) e fosfatase

alcalina total (FAT) foram avaliados no início e no final dos experimentos. Também foram

estimados a atividade da mieloperoxidase (MPO) e os níveis de interleucina-1beta (IL-1β),

fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), interleucina-10 (IL-10), glutationa reduzida (GSH),

malondialdeído (MDA) e nitrito/nitrato (NOx) nos tecidos gengivais. A expressão de óxido

nítrico sintase induzida (iNOS), metaloproteinase de matriz-1/8 (MMP-1/8), proteína

morfogenética do osso-2 (BMP-2), osteoprotegerina (OPG), receptor ativador do fator nuclear

kappa-B (RANK) e ligante do receptor ativador do fator nuclear kappa-B (RANKL) foi

determinada no periodonto através de imunohistoquímica. A ativação do fator nuclear kappa-

B (NFκ-B) foi determinada pela mensuração dos níveis da fração p50 na gengiva através de

western blot. O tratamento com sinvastatina inibiu a perda de estrutura alveolar e atuou

positivamente em todos os parâmetros analisados, tendo demonstrado atividade

antiinflamatória e antioxidante. Adicionalmente, a sinvastatina reduziu a expressão de iNOS,

MMP-1/8, RANK, RANKL e NFκ-B, e aumentou os níveis de BMP-2 e OPG nos tecidos

periodontais. Os animais tratados com sinvastatina (30 mg/kg) também tiveram a atividade de

FAT aumentada no dia 11 do experimento, em comparação com os animais não tratados

(grupo salina). Nenhuma diferença foi encontrada para os níveis de AST e ALT entre os

grupos estudados. Tomados em conjunto, nossos dados mostram que a sinvastatina previne a

reabsorção óssea na DPE e sugerem que essa ação possa ser mediada pelas suas propriedades

antiinflamatória e antioxidante.

Palavras-chave: perda óssea alveolar, estatinas, inflamação, periodontite

ABSTRACT

ABSTRACT

STUDIES OF THE MECHANISMS INVOLVED IN THE PROTECTIVE EFFECT OF

SIMVASTATIN ON EXPERIMENTAL PERIODONTITIS IN RATS

Simvastatin is a cholesterol-lowering drug whose pleiotropic effects may have

therapeutic impact in bone diseases. The purpose of this study was to evaluate the effect of

simvastatin on rats subjected to experimental periodontal disease (EPD). Periodontitis was

induced by ligature placement around the upper second left molar of Wistar rats for 11 days.

Groups of six animals received via oral (gavage) either saline or simvastatin (3, 10 and 30

mg/kg/day) until the sacrifice on the 11th day. Alveolar bone loss was determined by

macroscopic and histologic examination. Aspartate aminotransferase (AST), alanine

aminotransferase (ALT) and total alkaline phosphatase (TAP) serum levels were evaluated.

We also analyzed the myeloperoxidase (MPO) activity and the levels of interleukin-1β (IL-1

β), tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-10 (IL-10), reduced glutathione (GSH),

malonylaldehyde (MDA) and nitrate/nitrite (NOx) in the gingival tissue. Expression of

inducible nitric oxide synthase (iNOS), matrix metalloproteinase 1 and 8 (MMP-1/8), bone

morphogenetic protein-2 (BMP-2), osteoprotegerin (OPG), receptor activator of nuclear factor

kappa-B (RANK) and receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL) was

investigated in the periodontium by immunohistochemistry. Nuclear factor kappa-B (NFκ-B)

activation was measured by determination of p50 in the gingivae by western blot. Treatment

with simvastatin improved alveolar bone structure loss in all parameters studied, showing

anti-inflammatory and antioxidant activity. In addition, simvastatin reduced expression of

iNOS, MMP-1/8, RANK, RANKL and NFκ-B, as well as enhanced the levels of OPG and

BMP-2 in the periodontal tissues. Simvastatin (30 mg/kg) was also able to increase the

activity of TAP at 11th day, when compared to the group of untreated animals (saline). No

differences were found in the levels of AST and ALT for all groups studied. Altogether our

data suggest that simvastatin prevent inflammatory bone resorption in experimental

periodontitis, which may be mediated by its anti-inflammatory and antioxidant properties.

Key words: alveolar bone loss, statins, inflammation, periodontitis

SUMÁRIO

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 13

2 REVISÃO DE LITERATURA.................................................................................. 16

2.1 A doença periodontal.................................................................................................. 16

2.1.1 O periodonto normal.................................................................................................... 16

2.1.2 Classificação e epidemiologia das doenças periodontais............................................ 18

2.1.3 Papel dos microrganismos na doença periodontal...................................................... 24

2.1.4 Imunopatogênese da doença periodontal..................................................................... 25

2.1.5 A lesão inicial............................................................................................................... 25

2.1.6 A lesão precoce............................................................................................................. 27

2.1.7 A lesão estabelecida..................................................................................................... 29

2.1.8 A lesão avançada.......................................................................................................... 31

2.1.9 Osteoimunologia........................................................................................................... 33

2.2 Estatinas...................................................................................................................... 38

2.2.1 As doenças cardiovasculares........................................................................................ 38

2.2.2 Desenvolvimento histórico das estatinas...................................................................... 40

2.2.3 Estrutura e mecanismo de ação das estatinas.............................................................. 41

2.2.4 Efeitos adversos das estatinas...................................................................................... 46

2.2.5 Efeitos pleiotrópicos das estatinas............................................................................... 48

2.2.6 Efeitos ósseos das estatinas.......................................................................................... 51

2.2.7 Efeitos das estatinas na doença periodontal................................................................ 60

3 PROPOSIÇÃO............................................................................................................ 63

4 MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................... 64

4.1 Animais........................................................................................................................ 64

4.2 Indução da doença periodontal experimental.......................................................... 64

4.3 Grupos experimentais................................................................................................ 65

4.3.1 Grupo naive.................................................................................................................. 65

4.3.2 Grupo com doença periodontal experimental (controle ou salina)............................. 65

4.3.3 Grupo tratado com estatina.......................................................................................... 65

4.4 Determinações séricas das enzimas hepáticas.......................................................... 65

4.5 Análise da estrutura óssea alveolar........................................................................... 66

SUMÁRIO

4.5.1 Estudo morfométrico do tecido ósseo........................................................................... 66

4.5.2 Análise histopatológica por microscopia óptica.......................................................... 66

4.5.3 Análise histopatológica por microscopia confocal...................................................... 68

4.6 Determinação de mieloperoxidase............................................................................ 68

4.7 Dosagem de citocinas.................................................................................................. 69

4.8 Dosagem de glutationa (GSH)................................................................................... 69

4.9 Determinação dos níveis de malonildialdeído (MDA)............................................. 70

4.10 Dosagem de nitrito/nitrato........................................................................................ 70

4.11 Imunohistoquímica para iNOS, MMP -1/-8, BMP-2, RANK, RANKL e OPG... 71

4.12 Imunofluorescência para RANKL........................................................................... 72

4.13 Western blot para a fração p50 do NFκ-B.............................................................. 72

4.14 Análise estatística....................................................................................................... 73

5 RESULTADOS........................................................................................................... 74

5.1 Perda óssea alveolar................................................................................................... 74

5.2 Análise histopatológica por microscopia óptica....................................................... 75

5.3 Análise por microscopia confocal a laser................................................................. 76

5.4 Determinação de mieloperoxidase............................................................................ 79

5.5 Dosagem de citocinas.................................................................................................. 80

5.6 Determinação de GSH E MDA.................................................................................. 82

5.7 Determinação dos níveis de nitrito/nitrato............................................................... 84

5.8 Análise dos tecidos por imunohistoquímica............................................................. 86

5.8.1 Imunohistoquímica para MMP-1/-8 e iNOS................................................................ 86

5.8.2 Imunohistoquímica para BMP-2 e RANK.................................................................... 89

5.8.3 Imunohistoquímica para OPG e RANKL..................................................................... 92

5.9 Imunofluorescência para RANKL............................................................................ 92

5.10 Western blot para NFκ-B......................................................................................... 95

5.11 Dosagem sérica de fosfatase alcalina total............................................................... 96

5.12 Dosagens séricas de AST e ALT.............................................................................. 97

6 DISCUSSÃO............................................................................................................... 99

7 CONCLUSÃO ............................................................................................................ 117

REFERÊNCIAS.................................................................................................................. 118

13

1 INTRODUÇÃO

1 INTRODUÇÃO

A periodontite crônica é considerada hoje a maior causa de perdas dentárias na

população adulta em todo o mundo (BURT et al., 2005; PETERSEN; OGAWA, 2012). A

doença afeta principalmente indivíduos acima de 30 anos, e se caracteriza por um processo

inflamatório destrutivo dos tecidos de suporte do dente. Esse processo está relacionado

essencialmente com a presença de uma placa bacteriana periodontopatogênica, capaz de

desencadear os mecanismos imunológicos que culminam com a perda do periodonto

(PAPAPANOU, 2012).

Existe um consenso na literatura de que o tratamento da doença periodontal e de

suas seqüelas deveria estar focado na eliminação dos fatores etiológicos que desempenham

um papel crucial na iniciação e progressão desse grupo de doenças. Dessa maneira, grande

parte dos esforços da Periodontia tem sido dirigida para a eliminação das bactérias

patogênicas relacionadas às periodontites, seja através de procedimentos mecânicos

(raspagem e alisamento coronário), químicos (agentes antimicrobianos), físicos (tratamentos a

laser) ou de intervenções cirúrgicas (SOCRANSKY; HAFFAJEE, 1992).

Nos últimos anos, surgiram evidências crescentes de que outros fatores inerentes

ao hospedeiro podem contribuir de maneira decisiva para uma maior prevalência, incidência e

severidade das doenças periodontais. Dentre esses fatores podemos citar o fumo e algumas

doenças metabólicas, como o diabetes e a osteoporose. Sendo assim, a Periodontia vem

contemplando também tratamentos que visem a uma modulação imunológica do hospedeiro,

em adição aos procedimentos que se destinam apenas à eliminação ou redução de fatores

exógenos (DARVEAU, 2010; GENCO, 1996).

Uma vez que as seqüelas da doença estão intimamente relacionadas com a

liberação, nos tecidos periodontais, de fatores inflamatórios, como as interleucinas e as

prostaglandinas, alguns tratamentos para a doença periodontal têm buscado a possibilidade de

modificação das respostas inflamatórias do hospedeiro. Dentro dessa perspectiva, podemos

citar o uso de substâncias antiinflamatórias não esteroidais, a regulação de enzimas destrutivas

(através da inibição das metaloproteinases) e inibição da reabsorção óssea alveolar (mediada

pelos osteoclastos) (PAQUETE; WILLIAMS, 2000).

A reabsorção óssea alveolar tem merecido especial atenção no estudo das doenças

periodontais, uma vez que representa o maior problema clínico a ser enfrentado, podendo

14

1 INTRODUÇÃO

levar à perda progressiva do aparato de inserção do dente. Nos últimos anos, vários autores

têm testado, em periodontite, o efeito de drogas moduladoras do metabolismo ósseo

normalmente empregadas para tratar doenças sistêmicas. Dentre essas drogas, as mais testadas

atualmente são a calcitonina, o estrógeno, os análogos da vitamina D e os bifosfonatos

(McCAULEY; NOHUTCU, 2002; VALVERDE, 2008).

Vários estudos in vitro e in vivo têm apontado algum grau de sucesso com o uso

dos bifosfonatos no tratamento das periodontites e das peri-implantites. Alencar et al. (2002)

mostraram que o clodronato foi efetivo como anti-inflamatório e como atenuante do processo

de perda óssea na periodontite experimental em ratos, quando administrado como pré-

tratamento ou na progressão da doença. O mesmo foi verificado por Menezes et al. (2005)

com o uso do alendronato. Além disso, outros estudos mostram que os bifosfonatos poderiam

minimizar o processo de perda óssea após o rebatimento de um retalho e, ainda, aumentar as

chances de sucesso das regenerações teciduais guiadas (TENENBAUM et al., 2002).

Infelizmente, as drogas usadas atualmente como moduladores do metabolismo

ósseo inibem a reabsorção óssea (isto é, estabilizam os níveis ósseos já presentes) ao invés de

primariamente estimular nova formação de osso (GARRETT; GUTIERREZ; MUNDY,

2001). Na última década, alguns estudos começaram a indicar que as estatinas, drogas usadas

para reduzir os níveis séricos de colesterol, podem também estimular a formação óssea em

ratos (MUNDY et al., 1999; PARK, 2009; THYLIN et al., 2002), bem como diminuir a

incidência de fraturas ósseas em humanos (GARRETT; MUNDY, 2002).

As estatinas, também conhecidas como inibidores da hidroximetilglutaril-

coenzima A redutase (HMG-CoA redutase), são amplamente utilizadas com a finalidade de

reduzir os lipídios no sangue e inibir a biossíntese do colesterol, prevenindo, dessa maneira,

eventos cardiovasculares adversos. O colesterol, os hormônios esteroidais e outros

isoprenoides são produzidos a partir dos ácidos graxos, por uma via chamada via do

mevalonato. As estatinas reduzem a síntese do colesterol pela inibição dessa via, bloqueando

a síntese do mevalonato a partir da HMG-CoA (STANCU; SIMA, 2001).

Mais recentemente, tem sido verificado que essas drogas apresentam efeitos

pleiotrópicos, que podem ser responsáveis por outros benefícios à saúde, além da prevenção

de doenças cardiovasculares. Propriedades antiinflamatórias e de estimulação óssea estão

entre as ações das estatinas que poderiam afetar positivamente a periodontite crônica. Com

relação aos seus efeitos ósseos, acredita-se que podem atuar pela estimulação direta da

expressão da proteína-2 morfogenética do osso (BMP-2), bem como por aumento da

diferenciação dos osteoblastos. À semelhança dos bifosfonatos, as estatinas inibem a

15

1 INTRODUÇÃO

formação de alguns metabólitos intermediários da via do mevalonato, interferindo nos

processos de isoprenilação de proteínas e levando a uma inibição na atividade dos

osteoclastos e na apoptose dos osteoblastos (EDWARDS, SPECTOR; 2002).

Esses mecanismos de ação despertaram pesquisadores para a possibilidade de uso

das estatinas na progressão da perda óssea alveolar e na regeneração de defeitos periodontais,

uma vez que a principal seqüela clínica da periodontite é a reabsorção do osso, resultando na

mobilidade e muitas vezes na perda do dente. Através de um estudo in vitro, Yazawa et al.

(2005) investigaram o efeito da sinvastatina nas células do ligamento periodontal, tendo

focado especialmente proliferação, metabolismo e potencial de diferenciação em osteoblastos

e de mineralização celular. Verificou-se que a sinvastatina aumentou, de maneira dose-

dependente, a proliferação e o metabolismo celulares, tendo também estimulado a atividade

da fosfatase alcalina e o conteúdo de osteopontina. Além disso, foi demonstrado que essa

atividade aumentada pode ser abolida pela administração de mevalonato.

Nassar et al. (2009) verificaram que a administração oral de sinvastatina reverteu

a perda óssea induzida por ciclosporina A em um modelo de doença periodontal por ligadura.

Os autores também observaram que a diminuição da perda óssea foi acompanhada de menor

expressão de PGE2 e IL-1β nos grupos tratados com sinvastatina. Através de uma análise

radiográfica digital, Goes et al. (2010) demonstraram que a atorvastatina foi eficaz em

prevenir a perda óssea alveolar em um modelo de periodontite induzida por ligadura. Os

resultados de maior densidade radiográfica foram corroborados pelos achados macroscópicos,

que indicaram uma redução de 47% na área de perda óssea no grupo tratado pela estatina.

Através de um estudo retrospectivo com 97 pacientes, Lindy et al. (2008)

verificaram que os pacientes em uso de estatinas apresentaram um número 37% menor de

bolsas periodontais patológicas do que aqueles que não foram submetidos a nenhum

tratamento. Um estudo piloto controlado mostrou os efeitos do tratamento sistêmico com

atorvastatina (20 mg/kg) na prevenção da perda óssea em pacientes com periodontite crônica.

Melhoras significativas foram observadas nos níveis de colesterol total e LDL, na mobilidade

dental, e na distância radiográfica da crista óssea alveolar à junção cemento-esmalte, após três

meses de uso da atorvastatina (FAJARDO et al., 2010).

Embora esses estudos já tenham aventado a possibilidade de uso das estatinas na

doença periodontal, os dados na literatura ainda são escassos e pouco conclusivos com relação

ao papel dessas drogas na inflamação e na reabsorção óssea característica da doença. Sendo

assim, mais estudos são necessários, a fim se verificar os mecanismos pelos quais as estatinas

estariam atuando beneficamente na progressão da doença periodontal.

16

2 REVISÃO DE LITERATURA


2.1 A doença periodontal

2.1.1 O periodonto normal

O periodonto (peri = em torno de, odonto = dente), também chamado de “aparelho

de inserção” ou “aparelho de suporte dos dentes”, forma uma unidade de desenvolvimento,

biológica e funcional, cuja função é inserir o dente no tecido ósseo dos maxilares, bem como

manter a integridade da superfície da mucosa mastigatória da cavidade oral. Compreende,

portanto, uma estrutura dinâmica, que sofre determinadas alterações com a idade e, além

disso, está sujeita a mudanças morfológicas relacionadas a perturbações funcionais e do meio

bucal. É composto por gengiva (G), ligamento periodontal (LP), cemento radicular (C) e osso

alveolar (OA) (figura 1). A estrutura e função dos tecidos que compõem o periodonto são

mutuamente dependentes, mantendo entre si, uma harmoniosa relação sob condições normais

(LINDHE; KARRING; ARAÚJO, 2010).

A gengiva é o elemento do periodonto que se sobrepõe ao osso alveolar e envolve

toda a porção cervical do dente. Constitui o único dos tecidos periodontais que é diretamente

visível à inspeção sob condições normais. Divide-se em gengiva marginal livre e gengiva

inserida. A gengiva marginal livre possui cor rósea, consistência firme e, frequentemente, é

arredondada, de modo a formar uma pequena invaginação ou sulco entre o tecido gengival e o

dente (sulco gengival). Em continuidade a esta, há a gengiva inserida, a qual possui uma

textura firme, aspecto de casca de laranja e estende-se em direção apical até a junção

mucogengival, onde a gengiva funde-se com a mucosa oral (figura 1). O tecido conjuntivo

gengival é composto principalmente por densas redes de fibras colágenas que funcionam de

forma interdependente, fornecendo firmeza à gengiva e, também, promovendo a inserção

desta ao cemento e ao osso alveolar subjacente (NEWMAN, 2004).

O ligamento periodontal é constituído de tecido conjuntivo denso, bastante

vascularizado, e contém células, substância fundamental amorfa, nervos e ilhas epiteliais. As

fibras colágenas do ligamento periodontal ligam o cemento radicular ao osso alveolar e

situam-se no estreito espaço entre estes dois, promovendo, assim, a ancoragem do dente. O

colágeno tipo I representa aproximadamente 80% do componente das fibras do ligamento

17


periodontal, sendo o tipo III o segundo mais comum. Além destas, existem também algumas

fibras elásticas, as quais estão incorporadas nas paredes dos vasos sanguíneos arteriais

(CARRANZA; BERNARD, 2004).

O cemento radicular consiste em um tecido calcificado especializado que recobre

a superfície radicular dos dentes. Sua função é prender as fibras do ligamento periodontal à

superfície radicular, bem como contribuir para o processo de reparo após danos à superfície

radicular. Cerca de 50% do cemento é constituído por material orgânico, tais como

proteoglicanas, glicoproteínas e colágeno, sendo que este último compreende a grande

maioria. Sua porção mineral é composta por cálcio e fósforo, que estão presentes na forma de

hidroxiapatita. O cemento não contém vasos (sanguíneos e linfáticos), não possui inervação,

não sofre remodelação nem reabsorção fisiológicas, contudo, sofre deposição contínua ao

longo da vida (PERIODONTAL LITERATURE REVIEWS, 1996).

O processo alveolar é um tecido mineralizado inervado e vascularizado.

Compreende a parte da maxila e da mandíbula que forma os alvéolos dentários e proporciona

suporte para as raízes dos dentes. Esses processos alveolares são dependentes da presença dos

dentes e estão sujeitos à reabsorção quando a unidade dental é perdida. O osso alveolar

propriamente dito é contínuo com o processo alveolar e forma a delgada lâmina óssea que

reveste o alvéolo dentário. O osso alveolar está continuamente sofrendo remodelação como

resultado de sua adaptação às necessidades funcionais (LINDHE; KARRING; ARAÚJO,

2010).

O cemento radicular, o ligamento periodontal e o osso alveolar constituem o

aparelho de inserção dos dentes, cuja função principal é distribuir e absorver as forças geradas

pela mastigação e outros contatos dentários.

18


Figura 1 - Desenho esquemático do dente com seu periodonto. G: gengiva, C: cemento, LP: ligamento

periodontal, OA: osso alveolar, PA: processo alveolar, GL: gengiva livre; GI: gengiva inserida; JMG: junção

mucogengival. Adaptado de Carranza e Newman (2004).

2.1.2 Classificação e epidemiologia das doenças periodontais

As doenças periodontais (DP) incluem diversas alterações dos tecidos de proteção

e sustentação dos órgãos dentais, cuja etiologia está principalmente relacionada à placa dental,

embora distintos fatores etiológicos, como vírus, fungos, traumas mecânico e químico,

drogas, doenças sistêmicas, má-nutrição, alergias, entre outros, possam também estar

relacionados com essas alterações. O mais recente e internacionalmente aceito sistema para a

classificação das condições e doenças periodontais divide as patologias do periodonto em oito

categorias principais (ARMITAGE, 1999), conforme mostrado de maneira simplificada no

quadro 1.

JMG

GI

GL

PA

LP

C

OA

G

JMG

19


I. DOENÇAS GENGIVAIS

Doenças gengivais induzidas pela placa

Lesões gengivais não induzidas por placa

II. PERIODONTITE CRÔNICA

Localizada

Generalizada

III. PERIODONTITE AGRESSIVA

Localizada

Generalizada

IV. PERIODONTITE COMO MANIFESTAÇÃO DE DOENÇAS SISTÊMICAS

V. DOENÇAS PERIODONTAIS NECROSANTES

Gengivite ulcerativa necrosante

Periodontite ulcerativa necrosante

VI. ABSCESSOS DO PERIODONTO

Abscesso gengival

Abscesso periodontal

VII. PERIODONTITES ASSOCIADAS A LESÕES ENDODÔNTICAS

Lesão endoperiodontal

Lesão perioendodôntica

Lesão combinada

VIII. DEFORMIDADES E CONDIÇÕES DE DESENVOLVIMENTO OU

ADQUIRIDAS

Fatores localizados relacionados ao dente

Deformidades e condições mucogengivais ao redor do dente

Deformidades e condições mucogengivais em rebordos desdentados

Trauma oclusal

Quadro 1 - Classificação das doenças periodontais (Armitage, 1999).

De acordo com um recente relato da Organização Mundial de Saúde a respeito das

condições de saúde bucal da população mundial, as doenças periodontais ainda contribuem

significativamente para a carga global de doenças bucais. Em termos epidemiológicos, as

doenças gengivais induzidas pela placa (anteriormente classificadas como gengivite marginal

crônica ou simplesmente gengivite) e a periodontite crônica são as entidades patológicas

20


periodontais mais frequentes e afetam as populações humanas em todo o mundo, com altas

taxas de prevalência (PETERSEN, 2003) (figura 2).

Figura 2 – Exemplos clássicos das patologias periodontais mais prevalentes. A, gengivite induzida pela placa. B,

periodontite crônica. Em ambos os casos, observa-se a presença dos depósitos microbianos em íntima associação

com a inflamação dos tecidos periodontais (setas). Retirado de PIZZO et al. (2010).

A despeito das grandes melhoras no “status” de saúde bucal das populações em

vários países, os problemas ainda persistem, principalmente entre grupos pouco privilegiados

nos países desenvolvidos e em desenvolvimento. As doenças periodontais, por exemplo, ainda

recebem uma atenção limitada por parte da população de um modo geral, dos provedores de

cuidados de saúde bucal, bem como pelos administradores da saúde coletiva, embora seja a

maior causa de perda dental entre adultos, em termos mundiais (PETERSEN; OGAWA,

2012).

Na maioria dos estudos epidemiológicos conduzidos globalmente, significativa

relação tem sido observada entre a situação sócio-econômica e a condição periodontal das

populações, uma vez que a condição social afeta drasticamente o acesso à educação e aos

bons hábitos de higiene bucal e geral (PAGE; BECK, 1997). Em adição à pobre higiene oral,

os fatores de risco importantes para a severidade das doenças periodontais relacionam-se com

o uso do tabaco, má-nutrição, excesso no consumo de álcool, estresse, diabetes mellitus e

outras condições sistêmicas, como, por exemplo, as doenças cardiovasculares. De uma

maneira geral, estilos de vida pouco saudáveis, que compreendem um fator comum a várias

doenças, possuem um significante impacto como determinantes das doenças crônicas severas

(GENCO et al., 1999; TAYLOR, 2001).

A B

21


2.1.3 Papel dos microrganismos na doença periodontal

A boca possui uma considerável microbiota vivendo em simbiose com o

hospedeiro saudável. Estima-se que mais de 700 espécies bacterianas colonizam a boca, das

quais 400 podem colonizar a área subgengival. Esta microbiota, formada tanto por espécies

aeróbicas como anaeróbicas, cresce na superfície do dente como um complexo biofilme com

colônias interdependentes entre si (PIHLSTROM; MICHALOWICZ; JOHNSON, 2005).

A deficiência da higiene oral leva a um aumento da quantidade de

microrganismos no biofilme. Com isso, há uma mudança nos fatores ecológicos locais, o que

levará a alterações nos microrganismos e permitirá o aparecimento de novas espécies. Assim,

os microrganismos que eram principalmente gram-positivos, facultativos e sacarolíticos, vão

dar lugar a uma microbiota predominantemente gram-negativa, anaeróbica e proteolítica.

Além das bactérias, outros microrganismos podem compor o biofilme, tais como fungos,

protozoários e vírus (SOCRANSKY; HAFFAJEE, 2005).

De forma particular, espécies gram-negativas anaeróbicas estão aumentadas na

placa subgengival como também na doença periodontal severa, mostrando que uma alteração

neste microambiente contribui para a destruição tecidual. Números crescentes de várias

espécies bacterianas, incluindo Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Tannerella

forsythia, Campylobacter rectus, Eubacterium nodatum, Prevotella spp., Peptostreptococcus

micros, Streptococcus intermedius e Fusobacterium nucleatum, estão elevados em pacientes

com periodontite e a presença destes microrganismos está positivamente relacionada com o

aumento da profundidade da bolsa periodontal e da perda progressiva do ligamento

periodontal (SOCRANSKY; HAFFAJEE, 2010).

Em nosso laboratório, demonstramos que a microbiota adjacente ao tecido

gengival de ratos submetidos à doença periodontal experimental (DPE) era principalmente

composta de Fusobacterium nucleatum e bacilos Gram-negativos pigmentados, sendo

diferente da microbiota de ratos normais, isto é, sem DPE (MENEZES et al., 2005).

KESAVALU et al. (2007) verificaram, em um modelo de periodontite em ratos, que P.

gingivalis, T. denticola e T. forsythia não somente existem como um consórcio que está

associado à doença periodontal, mas também exibem virulência sinergística, que resulta na

reabsorção óssea imunoinflamatória característica da periodontite.

Sendo assim, a periodontite é iniciada e mantida por fatores oriundos da

microbiota subgengival. Algumas dessas substâncias podem causar injúria direta às células e

aos tecidos do hospedeiro, enquanto outros componentes microbianos podem ativar o

22


processo inflamatório ou o sistema imune celular e humoral, o que secundariamente danifica

o periodonto. (PAGE et al., 1997).

Microrganismos presentes na placa podem prejudicar os componentes celulares e

estruturais do periodonto, através da liberação de produtos proteolíticos e nocivos. Os

microrganismos produzem uma grande variedade de enzimas solúveis que digerem as

proteínas e outras moléculas do hospedeiro, desse modo produzindo nutrientes para o

crescimento. Eles também liberam muitos produtos metabólicos, como amônia, indol, sulfeto

de hidrogênio e ácido butírico. Dentre as enzimas liberadas pelas bactérias, encontram-se as

proteases capazes de digerir colágeno, elastina, fibronectina, fibrina e diversos outros

componentes da matriz intercelular dos tecidos epitelial e conjuntivo (SOCRANSKY;

HAFFAJEE, 2010).

Apesar da capacidade dos microrganismos de produzir uma multiplicidade de

proteases, a principal atividade da protease no sulco gengival é, provavelmente, aquela que se

origina do hospedeiro sendo, portanto, valioso mencionar as proteases do hospedeiro no

contexto das proteases microbianas. Os fragmentos de colágeno predominantes no sulco são

aqueles resultantes da ação da protease do hospedeiro e não a microbiana, enfatizando a

sobreposição da contribuição do hospedeiro para a atividade da protease no sulco

(KORNMAN, 1999).

O efeito de muitos produtos estruturais, enzimáticos e residuais consiste em

estimular, provavelmente de maneira nociva, a produção de citocinas celulares pelo

hospedeiro. As citocinas assim produzidas são predominantemente pró-inflamatórias e

possuem múltiplos efeitos, servindo para intensificar a resposta inflamatória. Os

lipopolissacarídeos – LPS (endotoxinas) dos microrganismos Gram-negativos são capazes de

suscitar tanto uma resposta inflamatória quanto uma resposta imune, quando da sua interação

com as células do hospedeiro (TAUBMAN et al., 2005). Muitas das funções atribuídas aos

LPS no passado devem-se às suas ações de estímulo à produção de citocinas, assim como às

moléculas da membrana externa, proteínas e enzimas que se ligam às moléculas do LPS.

Demonstrou-se também que os LPS apresentam profundos efeitos sobre o sistema de

coagulação sangüínea e sobre o sistema do complemento, resultando na alteração da

hemostasia e na formação de vários peptídeos pró-inflamatórios (MADIANOS; BOBETSIS;

KINANE, 2005).

Numerosas são as propriedades atribuídas ao LPS e aos ácidos lipoteicos (LTA)

dos microrganismos Gram-positivos. LPS, LTA e proteínas ou polissacarídeos específicos

produzidos e liberados pelos microrganismos subgengivais, ativam os mediadores químicos

23


da inflamação, causando aumento da permeabilidade vascular e estimulando, através de ações

quimiotáticas, o deslocamento das células inflamatórias para os tecidos. Fazem ainda com que

as células de defesa liberem agentes e citocinas pró-inflamatórias. As respostas imunes aos

microrganismos são direcionadas, principalmente, contra as proteínas e os polissacarídeos da

membrana externa, e contra as enzimas e toxinas liberadas fora da célula (MADIANOS;

BOBETSIS; KINANE, 2005). Essas reações imunes liberam citocinas e mediadores pró-

inflamatórios adicionais, o que, por sua vez, causa o aumento da inflamação, com maiores

danos ao hospedeiro.

Embora as reações inflamatórias e imunológicas no periodonto possam parecer

semelhantes às observadas em outras partes do corpo, há diferenças significantes. Isto ocorre,

em parte, como uma consequência da anatomia do periodonto, ou seja, a permeabilidade

característica do epitélio juncional resulta em um processo notavelmente dinâmico

envolvendo células e fluidos, preservando todo o tempo a integridade epitelial através da

interface tecido duro e tecido mole (SOCRANSKY; HAFFAJEE, 2010).

Além disso, os processos inflamatórios e imunológicos nos tecidos periodontais

não representam respostas a uma espécie microbiana simplesmente, mas a um grande número

de microrganismos e seus produtos, agindo durante um período de tempo relativamente longo.

As bolsas periodontais podem conter mais de 400 espécies diferentes de microrganismos,

cada uma apresentando potenciais diferentes para a indução de doença, os quais vão variar de

acordo com o meio e o estágio de colonização. A doença periodontal tem sido referida

algumas vezes como uma "infecção bacteriana mista" para assinalar que mais de uma espécie

microbiana contribui para o desenvolvimento da doença (DARVEAU, 2010).

Uma dificuldade importante no planejamento e desenvolvimento de uma vacina

eficaz para a prevenção da doença periodontal é a multiplicidade de patógenos periodontais

suspeitos. Embora se obtenha o sucesso na erradicação de uma espécie ou cepa microbiana,

outros membros da extensiva microbiota podem substituí-la, desempenhando o seu papel no

processo patogênico.

As espécies microbianas interagem e, embora algumas possam não ser patógenos

suspeitos, ainda influenciam o processo da doença, participando através de fatores específicos

de crescimento ou defesa que aumentam o potencial de virulência de outros microrganismos.

A microbiota, nas bolsas periodontais, encontra-se em um estado de fluxo contínuo; espécies

que são relevantes em uma fase da doença podem não ser importantes para outra. Em outras

palavras, a destruição periodontal pode ser o resultado da combinação de fatores bacterianos

que variam com o tempo (HAAKE et al. 2004).

24


Esta situação contrasta com a maioria das demais doenças infecciosas clássicas

(por exemplo, tuberculose, sífilis, gonorreia), nas quais o hospedeiro enfrenta apenas um, em

vez de vários microrganismos, e o diagnóstico de uma fase ativa da doença está relacionado à

presença ou à ausência do patógeno, sendo, portanto, muito mais simples. Os eventos

moleculares que desencadeiam e mantêm as reações inflamatórias e imune na doença

periodontal podem estar sofrendo alterações constantemente e isso pode ser devido a

múltiplas espécies microbianas, muitas das quais são considerados organismos comensais

(KINANE; BERGLUNDH; LINDHE, 2010).

2.1.4 Imunopatogênese da doença periodontal

A era moderna da patogênese, prevenção e tratamento das doenças periodontais

iniciou-se em meados da década de 1960, com evidências experimentais em humanos e

animais demonstrando o papel crítico das bactérias na iniciação da gengivite e periodontite.

No início dos anos 80, avanços no estudo da patogênese da periodontite passaram a indicar as

bactérias microaerófilas ou anaeróbicas Gram-negativas como causa principal da doença

periodontal. Alguns anos após, iniciou-se uma extensa pesquisa pela descrição das respostas

do hospedeiro, que poderiam ter características protetoras ou destrutivas. A partir de então,

observou-se que os mecanismos imunomodulatórios do hospedeiro poderiam levar à

destruição dos tecidos de sustentação do dente, pela ativação de mecanismos teciduais, como

metaloproteinases de matriz (MMP), interleucina 1 (IL-1) e prostaglandinas (KORNMAN,

2008).

A partir de 1997, novos modelos de patogênese da doença começaram a indicar

que o fenótipo clínico da doença não se baseava simplesmente no desafio microbiano

acompanhado de uma resposta padrão do hospedeiro. Pesquisas clínicas e laboratoriais

demonstraram que vários fatores de risco poderiam influenciar a progressão da doença,

através de uma modificação nos mecanismos protetores e destrutivos do hospedeiro.

Surgiram, então, evidências da participação das variações genéticas na susceptibilidade da

doença, bem como de outros fatores ambientais, como fumo, diabetes e a dieta (PAGE;

KORNMAN, 1997). Além disso, estudos mais recentes mostram que a periodontite pode

representar um fator modificador das doenças sistêmicas dos pacientes, predispondo a ou

mesmo agravando diversas patologias, como aterosclerose, parto prematuro, infecções

respiratórias, diabetes, entre outras (SOUTHERLAND et al., 2006).

25


Sendo assim, observa-se que o processo da doença constitui-se em uma complexa

rede regulatória. Dentro dessa rede, a modulação dos fatores de risco genéticos, locais e

ambientais, bem como de outros fatores modificadores da doença, definiriam um padrão

específico de expressão das respostas teciduais, que poderia representar uma mudança do

estado de saúde para um estado de doença clinicamente manifesta.

As respostas teciduais verificadas no curso da doença serão expostas a seguir,

seguindo, com finalidade meramente didática, a série clássica de estágios descrita por Page e

Schroeder (1976). De acordo com esses autores, a progressão da inflamação gengival e

periodontal pode ser classificada em quatro estágios: inicial, precoce, estabelecido e

avançado. As lesões inicial e precoce representam a histopatologia das fases clinicamente

"agudas" ou iniciais da gengivite, enquanto a lesão estabelecida reflete a histopatologia da

forma da gengivite "crônica". A descrição histopatológica da lesão avançada reflete a

progressão da gengivite para periodontite.

Essas discussões foram baseadas nas informações predominantes obtidas

principalmente de material de biópsia de animais e algumas amostras de adolescentes

humanos. Em humanos, as situações da gengiva primitiva ou não infiltrada (histologicamente

sadia) são quase impossíveis de se obter. Por conseguinte, a descrição sobre a progressão da

lesão é predominantemente baseada em experimentos com não-humanos. As fases clássicas

da inflamação “aguda” e “crônica” não são facilmente aplicadas na doença periodontal,

provavelmente porque em muitas situações de saúde clínica ocorre uma lesão similar a uma

lesão aguda. Subseqüentemente, há superposição das alterações inflamatórias crônicas, de tal

modo que os elementos agudos e crônicos coexistem nas lesões precoces, estabelecidas e

avançadas (KINANE; BERGLUNDH; LINDHE, 2010).

2.1.5 A lesão inicial

Os estágios iniciais das lesões inflamatórias dos tecidos periodontais

caracterizam-se clinicamente pelo acúmulo de placa na margem gengival e histologicamente

pela formação de edema, aumento no fluxo do fluido gengival, acúmulo de leucócitos

polimorfonucleares (PMN) e perda do tecido conectivo. À medida que a placa se acumula,

enzimas e produtos metabólicos bacterianos aumentam a permeabilidade do epitélio

juncional, permitindo tanto o ingresso de mais produtos microbianos, como a saída de mais

fluido gengival.

26


A ativação dos componentes do sistema complemento presentes nesse fluido

através da “via alternativa” resulta na produção das anafilotoxinas C3a e C5a, que por sua

vez, levam à liberação de aminas vasoativas a partir dos mastócitos. Essas substâncias

vasoativas levam, então, a um aumento na permeabilidade vascular e na formação de edema,

um dos sinais cardinais da inflamação. Neste estágio, os mastócitos liberam o fator de necrose

tumoral-α (TNF-α), que é grandemente responsável pela expressão de moléculas de adesão

pelas células endoteliais e pela subseqüente migração de PMN para dentro dos tecidos

gengivais e para fora do sulco gengival (OHLRICH; CULLINAN; SEYMOUR, 2009).

Os leucócitos polimorfonucleares (neutrófilos) formam a primeira linha de defesa

contra as bactérias periodontopatogênicas. Constituem 90% dos leucócitos existentes na

cavidade oral, sendo os 10% restantes constituídos por células mononucleares. No sulco

gengival, os PMN tentam eliminar as bactérias através da fagocitose e, além disso, liberam

substâncias inflamatórias e antibacterianas capazes de eliminar os microrganismos, tais como

lisozima, lactoferrina, fosfatase alcalina, hidrolases ácidas, proteínas catiônicas,

mieloperoxidase (MPO), bem como espécies reativas de oxigênio. Embora os PMN possuam

eficientes mecanismos de controle microbiano, algumas bactérias periodontopatogênicas

escapam dos neutrófilos, produzindo um fluxo constante desses fagócitos no sulco gengival e

ocasionando a degranulação e o acúmulo contínuo dos PMN nesse local (BASCONES-

MARTÍNEZ et al., 2009; MIYASAKI; NEMIROVSKIY, 1997).

A mieloperoxidase é uma enzima presente nos grânulos azurofílicos dos

neutrófilos, considerada antibacteriana devido às espécies reativas geradas a partir do sistema

MPO-H2O2-haleto. Contudo, em condições patológicas, a ativação persistente do sistema

MPO-H2O2 dos fagócitos ativados pode afetar adversamente os tecidos (ÖVER et al., 1993;

YAMALIK et al., 2000).

A MPO pode ser considerada um indicador do acúmulo de neutrófilos no tecido.

Quando os tecidos periodontais encontram-se inflamados, ocorre um aumento no número de

PMN na gengiva e, conseqüentemente, há uma elevação na atividade da MPO. Além disso,

foi observado que a atividade da MPO apresenta-se significativamente reduzida após terapia

periodontal ou em pacientes sem comprometimento destes tecidos (MARCACCINI et al.,

2010; ÖVER et al., 1993). Similarmente, resultados obtidos em nosso laboratório mostram

que a atividade de MPO encontra-se aumentada na gengiva de ratos submetidos à DPE, na 6ª

hora após a indução da doença (MENEZES et al., 2005).

As substâncias quimiotáticas derivadas das bactérias, juntamente com C5a, são

responsáveis pela migração inicial dos PMN. Uma vez no sulco gengival, os PMN

27


descarregam seu conteúdo lisossomal, cujas enzimas podem voltar para dentro da gengiva e

contribuir para a destruição dos tecidos conectivos (OHLRICH; CULLINAN; SEYMOUR,

2009). Adicionalmente, os neutrófilos, após estimulação por antígenos bacterianos, produzem

e liberam grande quantidade de espécies reativas de oxigênio (ROS), as quais, na ausência de

antioxidantes satisfatórios, podem levar os tecidos periodontais ao dano oxidativo

(CANAKCI et al., 2009). Também foi demonstrado que os PMN promovem a lise das células

epiteliais em um modelo in vitro, através da interação peróxido de hidrogênio-

mieloperoxidase (VAN DYKE; SERHAN, 2003).

A infiltração dos PMNs e sua ativação nos tecidos inflamados são mediadas por

quimiocinas, moléculas de adesão e citocinas, entre estas IL-8, ICAM -1, IL-1 e TNF. Em

contrapartida, os neutrófilos ativados podem produzir mais destes mediadores, levando a uma

auto-amplificação do recrutamento e da ativação dos PMN, aumentando e perpetuando a

resposta inflamatória e a destruição tecidual (VAN DYKE; SERHAN, 2003).

2.1.6 A lesão precoce

Após 4-7 dias do acúmulo de placa, a natureza do desenvolvimento das lesões

muda de um estado inflamatório que consiste primariamente de PMN para outro com número

aumentado de linfócitos e macrógafos. Esta fase é chamada de lesão precoce, na qual as

mudanças vasculares tornam-se mais pronunciadas, com o consequente aumento de leitos

vasculares previamente adormecidos e o desenvolvimento de um infiltrado inflamatório

perivascular. Como resultado, verifica-se um maior fluxo de fluidos para dentro dos tecidos

gengivais inflamados e um subseqüente acréscimo no fluxo do fluido crevicular gengival. Um

adicional alargamento dos espaços intercelulares entre as células do epitélio juncional permite

uma difusão aumentada de produtos bacterianos nos tecidos gengivais.

As lesões iniciam-se como pequenos infiltrados perivasculares, que

progressivamente aumentam em tamanho e coalescem. Aos 21 dias do início da lesão, os

linfócitos representam 70% do infiltrado; os PMN e plasmócitos totalizam, neste estágio, 10%

do total do infiltrado do tecido. No entanto, o número de PMN aumenta quatro vezes no

epitélio juncional (SEYMOUR; POWELL; AITKEN, 1983). Acréscimos nas moléculas de

adesão, tais como ELAM-1 (molécula de adesão leucócito-endotélio-1) e ICAM-1 (molécula

de adesão intercelular), juntamente com um aumento na produção de interleucina-8 (IL-8),

ajudam a estabilizar um rápido fluxo de neutrófilos através do epitélio juncional para dentro

do sulco gengival, onde formam uma barreira contra os microrganismos da placa

28


(MOUGHAL et al., 1992). Embora a área infiltrada permaneça bem localizada neste estágio,

mais de 60-70% do colágeno dentro da zona infiltrada é degradado.

Existe um gradiente de ICAM-1 no epitélio juncional, com maiores concentrações

encontradas na face sulcular. Este fato, associado à liberação vascular de ELAM-1 e ICAM-1,

tanto no tecido clinicamente "sadio" quanto no tecido inflamado, sugere que a expressão

dessas moléculas é um processo fundamental, que direciona a migração do leucócito para o

sulco gengival. A importância desses mecanismos é ressaltada pela periodontite rápida e

grave que é encontrada nos pacientes portadores da síndrome da deficiência de adesão

leucocitária (MOUGHAL et al., 1992).

Como relatado anteriormente, a gengivite se desenvolve como uma lesão

perivascular de linfócitos/macrófagos. Os linfócitos são predominantemente células T, com

uma razão de CD4:CD8 em torno de 2:1. As células T CD4+ podem ser vistas como um

“mestre coordenador” das respostas imunológicas que, através da produção de citocinas,

influencia praticamente todas as células do sistema imune. As células T CD8+ agem

principalmente como células citotóxicas capazes de destruir outras células, embora também

estejam envolvidas na produção de citocinas pró-inflamatórias (ABBAS; MURPHY; SHER,

1996).

Na iniciação da resposta imune, as células de Langerhans no interior do epitélio

apreendem o material antigênico proveniente dos microrganismos, levando-o para o tecido

linfóide, onde o apresentam para os linfócitos. Para tal, o peptídeo antigênico une-se ao

complexo principal de histocompatibilidade classe II (MHC) presente nessas células

apresentadoras de antígenos. A célula Thelper (CD4+), através de um receptor de célula T

antígeno específico (TCR), reconhece o antígeno ligado ao MHC, o que resulta na

sensibilização desta célula. Essas células T sensibilizadas voltam para os tecidos do desafio

antigênico original (ou seja, os tecidos gengivais), onde, após uma nova apresentação de

antígenos pelas células dendríticas, tornam-se ativadas e iniciam a liberação de citocinas. As

citocinas, por sua vez, agem sobre outras células linfóides (macrófagos, células B e outras

células T), de modo a amplificar a resposta inflamatória (OHLRICH; CULLINAN;

SEYMOUR, 2009).

Juntamente com os macrófagos fagocíticos, as células T controlam o ingresso dos

antígenos nos tecidos gengivais. Uma vez persistindo a agressão gerada pelo biofilme da

placa, a resposta imunológica persiste, ao invés de seguir para a resolução. Dado que as

bactérias da placa raramente invadem os tecidos do hospedeiro, os vários fagócitos (PMN no

sulco gengival e macrófagos nos tecidos) não são capazes de erradicar o desafio microbiano.

29


A natureza prolongada do processo inflamatório resulta em uma gengivite crônica por

natureza, que só poderá ser controlada a partir dos procedimentos de remoção mecânica da

placa. O colágeno é degradado na lesão estabelecida, mas isso não resulta em qualquer perda

de inserção (KINANE; BERGLUNDH; LINDHE, 2010).

2.1.7 A lesão estabelecida

Em algumas pessoas, devido aos fatores ambientais, ou à sua própria

suscetibilidade inata (ou ambos), a lesão precoce muda para uma resposta de células

B/plasmócitos, com a produção de altos níveis de IL-1, IL-6 e a subsequente quebra e perda

do tecido conjuntivo. À medida que ocorre a perda desse tecido, o epitélio juncional migra em

direção apical e forma-se uma bolsa periodontal, cujo epitélio invagina-se em direção ao

tecido conjuntivo (OHLRICH; CULLINAN; SEYMOUR, 2009).

A característica principal que identifica a lesão estabelecida/progressiva é a

predominância de plasmócitos dentro do tecido conjuntivo periodontal, indicando a presença

de uma resposta imune adaptativa de células B. Nesse acaso, a produção de anticorpos pode

ser local ou sistêmica e estes agem agregando ou formando grumos de microrganismos,

evitando a aderência destes últimos ao epitélio, atuando junto com o complemento para

destruí-los, e, em associação com os PMNs, aumentando a eficácia da fagocitose

(opsonização). Tanto o número de anticorpos quanto a sua função são importantes; indivíduos

capazes de produzir resposta imune efetiva podem ser mais resistentes à periodontite do que

aqueles cujas respostas imunes apresentam deficiência na quantidade ou na qualidade.

A permeabilidade aumentada do epitélio da bolsa permite o ingresso continuado

de produtos microbianos, com a consequente produção de citocinas inflamatórias, como IL-1

e TNF-α e de prostaglandina E2 (PGE2), e a perpetuação do processo inflamatório, o que leva

a uma contínua destruição tecidual no periodonto (GEMMELL; MARSHALL; SEYMOUR,

1997).

As citocinas desempenham importante papel na patogênese da periodontite. As

principais citocinas envolvidas nesta patologia são a IL-1β e o TNF-α, as quais são

encontradas em concentrações elevadas no periodonto de pacientes acometidos pela doença

periodontal. Estas citocinas atuam direta e sinergisticamente estimulando a degradação da

matriz de tecido conjuntivo, o recrutamento e/ou ativação dos osteoclastos e a reabsorção

óssea. Além disso, já foi verificado que os níveis destas citocinas no sulco gengival

30


relacionam-se diretamente à severidade da doença periodontal (GORSKA et al., 2003) e

podem estar reduzidos após o tratamento da periodontite (LINS et al., 2007).

A IL-1β estimula a produção de mediadores catabólicos do tecido conjuntivo e de

reabsorção óssea, incluindo a própria IL-1β, IL-6, TNF-α, prostaglandina E2 (PGE2) e

metaloproteinases de matriz (MMP). Esses fatores contribuem para a perpetuação da

degradação do tecido conjuntivo, bem como para o recrutamento e ativação dos osteoclastos

(PAQUETTE; WILLIAMS, 2000). A IL-1β também promove ativação de linfócitos T,

proliferação de linfócitos B e estimulação da produção de anticorpos; influencia ainda na

modulação da função da célula endotelial, que inclui a liberação de fator estimulador de

colônias granulócito-macrófago (GM-CSF), prostaciclina (PGI2) e síntese do fator ativador de

plaquetas (PAF) (PREISS; MEYLE, 1994).

O fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) é uma proteína trimérica, secretada por

vários tipos celulares, entre eles os monócitos-macrófagos, e que desempenha um papel

fundamental na doença periodontal como mediador da destruição tecidual. Exerce importante

papel na ativação dos osteoclastos, estimulando a reabsorção óssea. Além disso, estimula a

produção local de prostaglandina, induz a secreção de metaloproteinases, as quais realizam a

dissolução da matriz orgânica secretada pelo osteoblasto, resultando em perda óssea local

(GRAVES, 2008). Adicionalmente, o TNF-α também auxilia os leucócitos em sua capacidade

de adesão às células endoteliais, aumentando sua quimiotaxia e a capacidade de fagocitose

(LINS et al., 2007).

Nosso laboratório demonstrou a importância dessa citocina na doença periodontal

experimental em ratos, através de estudos com inibidores da síntese de TNF-α

(clorpromazina, pentoxifilina e talidomida). Foi observado que estas drogas reduziram de

forma significativa o índice de perda óssea, as alterações histológicas e a leucocitose, 11 dias

após a indução da doença periodontal experimental (LIMA et al., 2000; LIMA et al., 2004).

Os metabólitos do ácido araquidônico também desempenham papel fundamental

na doença periodontal. Eles são importantes mediadores catabólicos desta patologia, uma vez

que representam potentes estimuladores da reabsorção óssea e estão em níveis elevados nos

tecidos gengivais de indivíduos com periodontite. Esses compostos são sintetizados a partir da

metabolização do ácido araquidônico, através da ação da cicloxigenase (COX) e lipoxigenase,

e liberados em resposta à lesão tecidual local. Como exemplo destes metabólitos, podemos

citar prostaglandinas (PG), tromboxanos (TX), leucotrienos (LT) e outros ácidos

hidroxieicosatetraenóicos (HETE) (PAQUETTE; WILLIAMS, 2000).

31


A prostaglandina E2 (PGE2) está especialmente envolvida na destruição tecidual

que ocorre na periodontite. São encontrados elevados níveis de PGE2 na gengiva e no fluido

crevicular gengival de pacientes com esta patologia. PGE2 promove vasodilatação, aumento

da permeabilidade capilar e é um importante mediador da reabsorção óssea pelos osteoclastos

(AZOUBEL et al., 2008). Lohinai et al. (2001) mostraram um aumento significativo nos

níveis de PGE2, bem como na expressão da isoforma COX-2, nos animais submetidos à

doença periodontal experimental, em relação ao grupo de animais sem a doença. Resultado

semelhante foi encontrado por Zhang et al. (2003), que mostraram níveis aumentados de

COX-2 no tecido gengival inflamado de pacientes com periodontite, quando comparados com

pacientes periodontalmente saudáveis.

A eficácia dos antiinflamatórios não-esteroidais (AINE) no tratamento da doença

periodontal está associada à inibição dos metabólitos do ácido araquidônico. Em nosso

laboratório, Bezerra et al. (2000) observaram que a inibição da COX-2, promovida por

fármacos antiinflamatórios não-esteroidais, foi capaz de prevenir a perda óssea alveolar na

doença periodontal experimental. Em outro estudo de nosso grupo, Azoubel et al. (2007)

observaram que o uso do etoricoxibe, um inibidor seletivo da COX-2, reduziu o infiltrado

inflamatório, a destruição das fibras colágenas e a reabsorção do osso e do cemento na

periodontite experimental. Adicionalmente, Azoubel et al. (2008) mostraram que o uso do

etoricoxibe por pacientes com periodontite agressiva promoveu, durante o período do

tratamento, uma redução nos níveis de PGE2 no fluido crevicular gengival, a qual esteve

associada a uma discreta melhora da condição óssea dos pacientes.

2.1.8 A lesão avançada

A lesão avançada possui essencialmente as mesmas características celulares da

lesão estabelecida. A principal diferença reside na marcante perda de inserção que é evidente

clínica e histologicamente. É atualmente aceito que o mecanismo da destruição tecidual se dá

pelos efeitos da resposta imune. Fibroblastos e macrófagos são estimulados pelas citocinas

inflamatórias IL-1, TNF-α e PGE2 a produzirem metaloproteinases de matriz (MMP), que são

uma família de proteinases cujo propósito primeiro é a degradação da matriz extracelular. As

moléculas de colágeno são quebradas em fragmentos menores, que são, então, desnaturados

no ambiente extracelular ou fagocitados pelos fibroblastos circundantes (COX et al., 2006).

As metaloproteinases de matriz (MMP) constituem uma família de

endopeptidases que contêm zinco e estão envolvidas em vários eventos fisiológicos, tais como

32


involução do útero após o parto, desenvolvimento embrionário, remodelação tecidual, erupção

dental, entre outros. Porém, as MMP também participam de processos patológicos, entre os

quais podemos citar doença periodontal, artrite, aterosclerose, enfisema pulmonar e

osteoporose (RYAN; GOLUB, 2000).

Baixos níveis de MMP estão presentes nos tecidos normais. Porém, em condições

inflamatórias ou de dano tecidual, a expressão de MMP é aumentada pela ação de citocinas

pró-inflamatórias, tais como TNF-α e TGF-β (fator transformador de crescimento-β), ou por

mediadores celulares, como o óxido nítrico (NO) (McCARTHY et al., 2008). Estas enzimas

promovem a degradação de macromoléculas que compõem a matriz extracelular, incluindo

colágeno, fibronectina, laminina e proteoglicanos. Elas são secretadas na forma latente e

tornam-se ativas no meio pericelular através da clivagem da ligação Zn+2-cisteína. Esta

ligação bloqueia a reatividade do sítio ativo da enzima (BIRKEDAL-HANSEN, 1993).

As MMPs são divididas em quatro grupos dependendo do seu substrato e da

homologia da seqüência, os quais são: colagenases (tipo fibroblasto ou MMP-1, tipo

neutrofílico ou MMP-8, colagenase-3 ou MMP-13 e colagenase-4 ou MMP-18); gelatinases

(A ou MMP-2 e B ou MMP-9); estromelisinas (-1 ou MMP-3, -2 ou MMP-10, -3 ou MMP-11

e matrilisina ou MMP-7); e MT-MMPs (MMP tipo membrana, tais como MMP-14, MMP-15,

MMP-16, MMP-17 e MT1-MMP). Metaloelastase (MMP-12), MMP-19 e MMP-20

(enamelisina) também fazem parte da grande família das MMPs (DAHAN et al, 2001).

As MMPs desempenham papel crítico na destruição dos tecidos de suporte da

estrutura dentária. O início da destruição do colágeno na periodontite é causado pela ação das

colagenases, um subgrupo das MMP. Em condições saudáveis, o periodonto é protegido do

ataque proteolítico mediado pelas MMP pelos TIMP (inibidores teciduais das

metaloproteinases). De modo particular, TIMP-1 inibe de forma eficiente a atividade da

colagenase. O inibidor forma complexos com a molécula da colagenase ativa, atuando como

inibidor competitivo da enzima e, talvez, limitando o início da cascata colagenolítica. Na

periodontite crônica, os níveis de TIMP estão baixos e insuficientes para inibir a grande

quantidade de MMP (RAI et al., 2008).

A MMP-8 (colagenase do tipo neutrofílico ou colagenase-2) é o tipo

predominante na periodontite. A principal origem desta colagenase é a partir de neutrófilos

degranulados e extravasados, os quais estão presentes na gengiva inflamada. A MMP-8 possui

a habilidade de quebrar o colágeno tipo I e III. Elevados níveis de MMP-8 estão altamente

correlacionados com a profundidade de sondagem, perda clínica da fixação do dente e

sangramento à sondagem (RAI et al., 2008). Kinane et al. (2003) verificaram que os níveis

33


desta colagenase são significativamente reduzidos após terapia periodontal mecânica dos

pacientes com periodontite.

A partir da ação das MMP e dos osteoclastos ativados, a lesão periodontal

aumenta, e a perda óssea alveolar se torna aparente, caracterizando a lesão avançada. A seção

abaixo discorre sobre os aspectos ósseos do processo inflamatório que leva à progressão da

periodontite.

2.1.9 Osteoimunologia

O reconhecimento de que a periodontite envolve um componente inflamatório,

bem como alterações no metabolismo ósseo, proveu novas perspectivas para o entendimento

da patogênese dessa doença, agora considerada sob a ótica da “osteoimunologia”

(COCHRAN, 2008). Osteoimunologia é uma área emergente de estudo, que foca nas

interações entre componentes celulares e moleculares do esqueleto e do sistema imune

(GRAVES, 2008). Este novo campo interdisciplinar surgiu aproximadamente há uma década

e integra diferentes áreas, como imunologia e biologia óssea. A seção que se segue serve

como uma visão geral dos mediadores e das células que governam as atividades imunes que

afetam a perda óssea associada com a doença periodontal.

Em condições fisiológicas, o osso é periodicamente reabsorvido pelos

osteoclastos, enquanto novo osso é formado pelos osteoblastos. O remodelamento ósseo é o

processo metabólico predominante que regula a estrutura e função do osso durante a vida

adulta, com a participação chave dos osteoclastos. A maioria das doenças esqueléticas no

adulto é devida a um excesso na atividade dos osteoclastos, levando a um desequilíbrio no

remodelamento ósseo que favorece a reabsorção. Tais doenças incluem osteoporose, doença

periodontal, artrite reumatóide, mieloma múltiplo e alguns tipos de câncer metastáticos

(BOYLE; SIMONET; LACEY, 2003).

Recentes avanços no entendimento da ativação e diferenciação dos osteoclastos

vieram da descoberta e análise de uma família de proteínas biologicamente relacionadas com

o TNF e seu receptor (TNFR). Essas moléculas incluem a osteoprotegerina (OPG), o receptor

ativador do fator nuclear kappa-B (RANK) e o ligante do RANK (RANKL), e juntas regulam

a função dos osteoclastos (KONG et al., 1999). Embora tenha sido demonstrado que vários

hormônios e citocinas calciotrópicos, tais como PTHrP (proteína relacionada ao hormônio da

paratireóide), vitamina D3, IL-1β e TNF-α, possam afetar a osteoclastogênese em diferentes

estágios de desenvolvimento, somente RANKL e RANK provaram ser absolutamente

34


necessários para o desenvolvimento dos osteoclastos in vivo, como evidenciado pela completa

ausência de osteoclastos em ratos knockout para RANK e RANKL (DOUGALL et al., 1999).

A osteoprotegerina (OPG) – cujo termo se refere à sua capacidade protetora sobre

o osso – foi a primeira molécula do trio a ser descoberta, tendo sido descrita quase que

simultaneamente por dois grupos, em virtude de sua habilidade em inibir o desenvolvimento

dos osteoclastos in vitro e in vivo (SIMONET et al., 1997; TSUDA et al., 1997). A

osteoprotegerina (também chamada de fator inibitório da osteoclastogênese – OCIF) é um

membro da superfamília do receptor de TNF e, ao contrário das outras moléculas da família,

não possui um domínio transmembrana, indicando que a OPG é secretada pela célula na

forma de uma proteína solúvel. A sinalização por OPG foi encontrada no cérebro, fígado,

pulmão, calvária, coração, rins, músculo esquelético, pele, intestinos, estômago e placenta

(TAN et al., 1997).

Aproximadamente na mesma época da descoberta da OPG, dois grupos

publicaram a caracterização de outro membro da família da citocina TNF, ao qual deram o

nome de TRANCE (um acrônimo para TNF-related activation-induced cytokine) (WONG et

al., 1997) e RANKL (um acrônimo para receptor activator of NF-κB ligand) (ANDERSON et

al., 1997). Esses grupos clonaram RANKL com base em sua grande capacidade de

suprarregulação de células T, após estímulo do receptor pelo antígeno, e mostraram que

RANKL aumenta a habilidade de células dendríticas em estimular a proliferação de células T

naïve.

Por outro lado, os dois grupos que inicialmente descreveram OPG clonaram um

ligante para essa molécula, que foi denominado ODF (fator de diferenciação de osteoclasto)

(YASUDA et al.,1998) e de OPG ligante (OPGL) (LACEY et al., 1998). Funcionalmente,

ODF/OPGL induz osteoclastogênese in vitro e in vivo, e seu efeito na osteoclastogênese é

contrabalanceado pela OPG inibitória (LACEY et al., 1998; YASUDA et al.,1998).

Subsequentemente foi descoberto que TRANCE, OPGL, RANKL e ODF são codificados

pelo mesmo gene, sendo, portanto, moléculas idênticas. Além dos altos níveis de expressão de

RANKL no esqueleto e nos tecidos linfóides primários e secundários, a expressão de RNAm

para RANKL também pode ser detectada nos queratinócitos, nas células epiteliais das

glândulas mamárias, no coração, músculo esquelético, pulmão, estômago, placenta, glândula

tireóide e cérebro. RANKL possui atividade biológica tanto na forma ligada à membrana de

40-45 kDa, quanto na forma solúvel de 31 kDa, que é derivada da forma ligada a partir da

clivagem pós-tradução por membros da família do domínio das desintegrinas e

metaloproteases (ADAM) e das metaloproteases de matriz (MMP) (IKEDA et al., 2001).

35


A clonagem do receptor de sinalização para RANKL, RANK, foi também relatada

por vários grupos simultaneamente (ANDERSON et al., 1997; HSU et al., 1999;

NAKAGAWA et al., 1998). Primeiramente, RANK foi clonado a partir de uma célula

dendrítica derivada da medula óssea (ANDERSON et al., 1997) e secundariamente, como um

receptor envolvido na diferenciação in vitro dos osteoclastos (HSU et al., 1999;

NAKAGAWA et al., 1998). RANK é um membro da super família dos receptores de TNF,

sendo que seu RNAm é mais abundantemente expresso em células dendríticas, osso, músculo

esquelético, timo, fígado, colon, intestino delgado e glândula adrenal. A proteína RANK pode

ser detectada na superfície de células dendríticas, células T CD4+ e CD8+ e células de

Langerhans (LEIBBRANDT e PENNINGER, 2008).

O osteoclasto é uma célula do tipo macrófago, multinucleada e tecido-específica,

criada pela diferenciação de células precursoras de monócitos/macrófagos sobre ou ao lado da

superfície óssea. O íntimo contato entre os tipos celulares do estroma da medula óssea é

essencial para a osteoclastogênese, sugerindo que fatores derivados do estroma estimulam

esse processo. Já se sabe que a produção de dois fatores hematopoiéticos é necessária e

suficiente para a osteoclastogênese, a citocina RANKL e o fator de crescimento polipeptídico

CSF-1 (fator estimulador de colônia-1), além da subseqüente ativação de RANK na superfície

das células precursoras hematopoiéticas. Juntos, CSF-1 e RANKL induzem a expressão de

genes que tipificam a linhagem dos osteoclastos, incluindo aqueles que codificam a fosfatase

ácida resistente a tartarato (TRAP), a catepsina K (CATK), o receptor para calcitonina e a β3-

integrina, levando ao desenvolvimento de osteoclastos maduros (LACEY, 1998).

O corpo celular do osteoclasto é polarizado e, em resposta à ativação de RANK

pelo seu ligante RANKL, sofre mudanças estruturais internas que o preparam para reabsorver

o osso. RANKL pode ativar osteoclastos maduros de uma maneira dose-dependente in vitro e

levar à rápida reabsorção de osso in vivo pela ativação de osteoclastos pré-existentes. A

sobrevivência dos osteoclastos maduros e a sua participação em sucessivos “rounds” de

reabsorção óssea são reguladas em parte por hormônios e citocinas, conforme mostrado na

figura 3. RANKL e IL-1, por exemplo, aumentam o tempo de sobrevivência de osteoclastos

maduros in vitro e in vivo e isto pode ser devido à habilidade desses fatores em induzir a

atividade de NF-κB (BOYLE, SIMONET e LACEY, 2003).

36


Figura 3 – Controle hormonal da reabsorção óssea. Representação esquemática do mecanismo de ação de A,

fatores calcitrópicos pró-reabsorção; e B, fatores anabólicos anti-osteoclásticos. A expressão de RANKL é

induzida em osteoblastos, células T ativadas, fibroblastos sinoviais e células do estroma da medula óssea;

RANKL se liga ao seu receptor de membrana específico, o que por sua vez leva à ativação de uma rede de

cascatas de quinases mediadas por TRAF, que promovem diferenciação, ativação e sobrevivência dos

osteoclastos. Ao contrário, a expressão de OPG é induzida por fatores que bloqueiam o catabolismo ósseo e

promovem efeito anabólico. OPG se liga e neutraliza RANKL, levando a um bloqueio na osteoclastogênese e a

um decréscimo na sobrevivência de osteoclastos. CFU-GM – unidade formadora de colônia de

granulócito/macrófago, M-CSF – fator estimulador de colônia de macrófago, PTH – paratormônio, PTHrP –

proteína relacionada ao paratormônio, PGE2 – prostaglandina E2, LIF – fator inibidor da leucemia, BMP –

proteína morfogenética do osso, TGF-β – fator de crescimento tumoral β, PDGF – fator de crescimento derivado

de plaquetas. Adaptado de BOYLE, SIMONET e LACEY (2003).

Fibroblastos sinoviais ativados

Pré-osteoclasto

Linfócitos T ativados

Células dendríticas ativadas

Osteoclasto multinucleado

Osteoclasto ativado

Osteoclasto apoptótico

Osteoblastos ou células do estroma da medula óssea

Osso

Fatores pró-reabsorção e calcitrópicos

1,25(OH)2 vitamina D3, PTH, PTHrP, PGE2, IL-1, IL-6, TNF, prolactina, corticosteróides, oncostatina M, LIF

Fatores anabólicos e anti-reabsorção

Estrógenos, calcitonina, BMP 2/4, TGF-β, trombopoietina, IL-17, PDGF, cálcio

37


Quando RANKL se liga ao seu receptor RANK, várias vias de sinalização

intracelular que regulam a osteoclastogênese são ativadas, como, por exemplo, as vias das

quinases ativadas por mitógenos (MAPK), da fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) e a via do

NF-κB. Fatores associados ao receptor de TNF (TRAF) e outros adaptadores, tais como Gab2,

estão ligados à calda citoplasmática do RANK e são mediadores-chave da sinalização

RANK/RANKL. Ambas as vias (canônica e alternativa) do NF-κB são ativadas pela

estimulação de RANK e contribuem para a regulação transcripcional de genes alvo. A via das

MAPK leva à ativação de membros da família de fatores de transcrição AP-1, que são

também fundamentais para a osteoclastogênese. A sinalização por PI3K liga a estimulação de

RANK à ativação de AKT/PKB e à sinalização pelo cálcio via PLCγ, que é crucial para a

ativação de NFATc1 mediada por calcineurina (LEIBBRANDT e PENNINGER, 2008).

Com relação ao micro-ambiente dos tecidos periodontais, vários estudos

analisaram as concentrações e a distribuição de OPG e RANKL em tecidos saudáveis e

inflamados. Foi demonstrada uma alta expressão de RANKL em tecidos periodontais

inflamados, fato este que parece estar intimamente associado com sítios de perda óssea

(CROTTI et al., 2003). Além disso, esses mesmos autores verificaram que há uma redução

nos níveis de osteoprotegerina nos tecidos granulomatosos adjacentes à perda óssea alveolar,

o que sugere que o balanço entre os níveis de OPG e RANKL pode regular a destruição óssea

observada na periodontite. Estudos recentes mostram que não somente a razão RANKL/OPG

aumenta nos sítios inflamados, como também a proporção entre essas citocinas pode ser

correlacionada com a severidade da doença. Por exemplo, a razão RANKL/OPG está mais

aumentada no fluido crevicular obtido de pacientes com periodontite crônica ou agressiva,

quando comparada com a taxa obtida de pacientes com gengivite apenas (BOSTANCI et al.,

2007).

Todos esses achados identificaram um novo alvo terapêutico promissor para o

tratamento de doenças ósseas e encorajaram o desenvolvimento de novas drogas que

modulem o eixo RANKL/RANK/OPG, no sentido de aumentar as concentrações de OPG

e/ou reduzir os níveis teciduais de RANKL, em consonância com os objetivos de reduzir a

reabsorção óssea e estimular a formação de novo osso.

38


2.2 Estatinas

2.2.1 As doenças cardiovasculares

Um dos maiores desafios da saúde pública, atualmente, é o crescente

envelhecimento populacional. Tal fato ocorreu inicialmente em países desenvolvidos, mas

recentemente tem se expandido de forma acentuada nos países em desenvolvimento,

principalmente devido às melhorias nas condições de saúde das populações. A crescente

expectativa de vida no mundo vem trazendo, dentre outras consequências, um aumento da

incidência de doenças relacionadas a esse período da vida (LIMA-COSTA; VERAS, 2003).

Com o envelhecimento populacional aliado às mudanças do perfil de saúde dos idosos, ao

invés de doenças infecciosas e parasitárias, que se resolviam rapidamente através da cura ou

do óbito, tornaram-se predominantes as doenças crônico-degenerativas e suas complicações

(CHAIMOWICZ, 1997).

Diante desse novo cenário epidemiológico, caracterizado pela alta prevalência de

doenças crônico-degenerativas, as doenças cardiovasculares aparecem como o principal

problema de saúde pública, sendo as doenças do aparelho circulatório a principal causa de

óbitos no Brasil (32%), abrangendo todas as regiões (BRASIL, 2003). De acordo com as

projeções da Organização Mundial de Saúde, esta tendência de elevação da doença

cardiovascular tende a persistir, agravando ainda mais o quadro de morbidade e mortalidade

elevada (SPOSITO et al., 2007).

As doenças cardiovasculares são responsáveis por 18 milhões de mortes por ano

no mundo, sendo as doenças coronarianas e as doenças cerebrovasculares responsáveis por

dois terços desses óbitos e, aproximadamente, 22% dos 55 milhões de óbitos por todas as

causas (BEAGLEHOLE; SARACCI; PANICO, 2001). Estimativas da mortalidade por

doença cardiovascular por região indicam que os países em desenvolvimento contribuem com

uma parcela maior da carga global de mortalidade pela doença, quando comparada aos países

desenvolvidos, com um excesso relativo da ordem de 70% (SANDHI et al., 2003).

Além de importante causa de mortalidade, as doenças cardiovasculares também

representam um grande peso em termos de morbidade e lideram a lista de causas ordenadas

pelo indicador de anos de vida vividos com incapacidade, além de representar um dos mais

altos custos em assistência médica (SANDHI et al., 2003).

Diversos estudos epidemiológicos envolvendo pacientes hiperlipêmicos têm

mostrado uma relação direta entre o risco de desenvolvimento de doença arterial coronariana,

39


a presença de lesões ateroscleróticas e os altos níveis sanguíneos de lipídeos (SIASOS et al.,

2011).

Valores elevados de colesterol no sangue, geralmente na forma de lipoproteínas,

são reconhecidamente o fator chave responsável pela formação dessas placas ateroscleróticas

e, consequentemente, pelo surgimento das doenças cardiovasculares. Essa associação é

confirmada epidemiologicamente pelo fato de as mudanças dietéticas e a redução

farmacológica da produção do colesterol diminuírem dramaticamente o risco de acidentes

vasculares, infartos e da mortalidade de um modo geral (EISENBERG, 1998).

De acordo com as diretrizes do “National Cholesterol Education Program”

(EXPERT PANEL ON DETECTION, EVALUATION, AND TREATMENT OF HIGH

BLOOD CHOLESTEROL IN ADULTS, 2001), a prescrição de medicamentos deve ser

considerada para pacientes que, apesar de se submeterem a uma dieta apropriada, prática

regular de atividade física e perda de peso, apresentam concentrações elevadas de colesterol

plasmático. Visto que uma grande proporção do colesterol corpóreo é sintetizada pelo fígado

e apenas um quarto é obtido pela dieta, inibir parcialmente a síntese do colesterol no fígado

seria uma solução lógica para esses pacientes (CHOY; SIOW; MYMIN, 2004).

Para o colesterol passar para o sangue e dele aos tecidos, precisa ser incorporado a

lipoproteínas que lhe servem de transporte. As principais classes de lipoproteínas plasmáticas

foram delineadas na década de 50 e 60 com os trabalhos de Oncley, Gofman e Fredrickson.

As quatro principais classes são VLDL (very low density lipoprotein ou lipoproteína de muito

baixa densidade), IDL (lipoproteína de densidade intermediária), LDL (lipoproteína de

densidade baixa) e HDL (lipoproteína de densidade alta) (BROWN; GOLDSTEIN, 1986).

Sabe-se que a lipoproteína carreadora de colesterol plasmático mais preocupante

com relação a problemas de saúde é a LDL-C. Acima dos limites normais, as lipoproteínas de

baixa densidade podem representar um importante fator de risco para as doenças

coronarianas, uma vez que a deposição do LDL no espaço subendotelial é um dos passos

fundamentais para o início e a progressão da aterogênese (KANNEL; WILSON, 1992).

Os valores considerados desejáveis para o LDL devem estar abaixo de 130

mg/dL; valores entre 130-159 mg/dL são tidos como limítrofes e acima de 160 mg/dL,

aumentados, embora os valores ideais possam ser modificados, como base na presença de

outros fatores de risco. Além disso, atualmente também se sabe que baixos níveis do chamado

“colesterol bom” (HDL) também estão associados à maior incidência de acidentes vasculares

(VAN WIJK; STROES; KASTELEIN, 2009).

40


Dentre as alternativas farmacológicas para a redução dos níveis de colesterol, as

estatinas emergiram nas três últimas décadas como a classe mais importante de agentes para

tratamento da hipercolesterolemia. Estudos clínicos substanciais utilizando as estatinas para

prevenção primária e secundária das doenças cardiovasculares (DC) mostram redução

significativa de eventos cardiovasculares fatais e não fatais, em pacientes com variadas

situações de risco (DOWNS et al., 1998).

Isso explica o enorme sucesso das estatinas nos campos médico e comercial. Em

2006, duas estatinas, atorvastatina e sinvastatina, lideraram a lista America’s 20 Best Selling

Drugs da revista Forbes, com vendas anuais nos valores de 8,4 e 4,4 bilhões de dólares,

respectivamente. E a tendência atual é de um aumento no uso desses fármacos. As seções a

seguir relatam o histórico do desenvolvimento das estatinas, seu mecanismo de ação, bem

como os atuais usos clínicos e experimentais desses fármacos.

2.2.2 Desenvolvimento histórico das estatinas

A primeira estatina foi isolada pelo japonês Akiro Endo e sua equipe de cientistas,

pesquisadores da indústria farmacêutica Sankyo Co. Ltd. Endo procurava, através de um

screening em culturas fúngicas, uma substância que pudesse inibir a 3-hidroxi-3-metilglutaril-

coenzima-A redutase (enzima responsável pela etapa limitante na biossíntese do colesterol),

em extratos de fígado de rato (ENDO; KURODA; TSUJITA, 1976). A equipe encontrou um

composto, produzido pelas colônias do fungo Penicillium citrinum, que foi originalmente

denominado ML236B ou mevastatina.

Neste mesmo ano, Brown e colaboradores isolaram da cultura de um fungo,

Penicillium brevicompactum, uma substância com propriedades antimicrobianas cujo

esqueleto carbônico era formado por uma unidade decalina e outra β-hidroxi-δ-lactona

interligadas entre si por uma ponte etilênica. A essa substância os autores deram o nome

genérico de compactina (BROWN et al., 1976). Verificou-se, logo em seguida, que a

mevastatina isolada por Endo e a compactina de Brown tratavam-se da mesma substância,

porém de fontes diferentes.

Tão logo o potencial deste novo composto foi entendido, pesquisadores da Merck

iniciaram seus próprios screenings, também utilizando fungos. Esses cientistas isolaram uma

cepa de Aspergillus terreus, que produzia uma estatina ainda mais efetiva: a lovastatina

(ALBERTS et al., 1980). De maneira independente, Endo (1979) isolou o mesmo composto

em caldos de Monascus ruber, embora essa espécie não seja usada para produção industrial

41


daquele metabólito. A estrutura química da lovastatina é idêntica à da compactina, exceto por

um grupo metil adicional.

Após estudos clínicos bem sucedidos nos quais a lovastatina provou reduzir

dramaticamente o LDL (low-density lipoprotein), o FDA (Food and Drug Administration)

aprovou a lovastatina sob o nome comercial de Mevacor®. A Sankyo desenvolveu a

pravastatina, um derivado da compactina mais eficiente. A companhia japonesa aliou-se à

Bristol-Myers Squibb para que efetuasse a venda e distribuição da pravastatina

(comercializada como Pravacol®) (ENDO, 2010).

Por outro lado, a Merck desenvolveu uma segunda geração de derivados semi-

sintéticos da lovastatina, que é até agora a segunda estatina líder no mercado. Este derivado

foi chamado de sinvastatina e, embora seja produzida sinteticamente a partir da lovastatina,

pode também ser fabricada agora por processo biotecnológico. A Merck conduziu o

Scandinavian Simvastatin Survival Study (1994), com 4444 pacientes diagnosticados com

hipercolesterolemia moderada (200 - 300 mg/dL), dos quais 2221 passaram a tomar

sinvastatina. Os resultados não somente mostraram um decréscimo significativo no colesterol

total (25%) e LDL (35%) nos pacientes em uso do fármaco, como também apontaram 42% de

redução na taxa de morte desse grupo.

Este e outros estudos expressivos estimularam a entrada de novas companhias no

mercado das estatinas. Parte dos esforços foi direcionada para a fabricação das estatinas

sintéticas: a fluvastatina foi a primeira estatina totalmente sintética (Sandoz AG, Lescol®),

seguida pela atorvastatina (Pfizer), melhor conhecida pelo seu nome comercial, Lípitor®. Este

último produto posteriormente tornou-se a estatina sintética mais importante e a grande

campeã de vendas nos Estados Unidos, seguida da lovastatina e da rosuvastatina (Crestor®),

com fatias menores do mercado, e da pitavastatina, que é comercializada atualmente em

alguns países orientais (CAMPO; CARVALHO, 2007).

2.2.3 Estrutura e mecanismo de ação das estatinas

Todas as estatinas diminuem a síntese do colesterol pela inibição de uma etapa na

via biossintética comum dos isoprenóides e dos esteróis. A síntese do colesterol no fígado tem

como matéria prima de partida uma molécula de acetil coenzima A (Ac-CoA) e envolve mais

de 20 reações enzimáticas. A figura 4A ilustra de maneira resumida as principais etapas dessa

via que leva à síntese do colesterol. Um desses caminhos é regulado por uma enzima do tipo

glicoproteína politópica transmembrana solúvel em água, chamada 3-hidroxi-3-metilglutaril-

42


coenzima A redutase (HMG-CoA redutase) que catalisa a desacilação redutiva da 3-hidroxi-3-

metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) em CoA e mevalonato (figura 4B). O mevalonato,

através de tantas outras reações, aporta no intermediário estratégico, esqualeno, que, após

sofrer várias reações de ciclização, chega ao colesterol (ISTVAN; DEISENHOFER, 2001).

Figura 4 – Em A estão descritas as principais etapas biossíntéticas que conduzem à formação hepática do

colesterol. Em B observa-se mais detalhadamente as reações químicas de desacilação da hidro-metil-glutaril-

coenzima A (HMG-CoA), catalisadas pela enzima HMG-CoA redutase (NADP é a forma oxidada da

nicotinamida adenina dinucleotídeo, NADPH é a forma reduzida de NADP).

As estatinas são inibidores da enzima HMGCoA-redutase. Como pode ser

esperado da estrutura química da compatina (figura 5), a inibição é competitiva com respeito à

enzima. A similaridade estrutural entre HMG-CoA e compactina e análogos sugere que o

centro ativo desses agentes na inibição da enzima HMG-CoA redutase seja o radical δ-

lactônico dessas moléculas. A hipótese é suportada pelos dados de que a atividade inibitória

da compactina é reduzida de 1/100 ou menos se o grupo hidroxila na posição C-3’ ou C-5’ for

acetilado (ENDO, 1985).

Acetil-CoA

HMG-CoA

Mevalonato

Mevalonato-pirofosfato

Isopentenil-pirofosfato

Geranil-pirofosfato

Farnesil-pirofosfato

Escaleno

Colesterol

3S-HMG-CoA 3S,5R-Mevalonil-CoA tiohemiacetal

3-R-Mevalonato

(A)

(B)

http://www.google.com.br/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&docid=AsY-l29WVe8H6M&tbnid=i4ksQaEvlZeScM:&ved=0CAUQjRw&url=http://chemwiki.ucdavis.edu/Organic_Chemistry/Organic_Chemistry_With_a_Biological_Emphasis/Chapter_16:_Oxidation_and_reduction_reactions/Section_16.4:_Hydrogenation//dehydrogenation_reactions_of_carbonyls,_imines,_and_alcohols&ei=ehWGUv3JHImMkAfwsYHYDQ&psig=AFQjCNHHwmn5lvb7lwsjBuK_AVq3vS3puQ&ust=1384603513533142

http://www.google.com.br/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&docid=AsY-l29WVe8H6M&tbnid=i4ksQaEvlZeScM:&ved=0CAUQjRw&url=http://chemwiki.ucdavis.edu/Organic_Chemistry/Organic_Chemistry_With_a_Biological_Emphasis/Chapter_16:_Oxidation_and_reduction_reactions/Section_16.4:_Hydrogenation//dehydrogenation_reactions_of_carbonyls,_imines,_and_alcohols&ei=ehWGUv3JHImMkAfwsYHYDQ&psig=AFQjCNHHwmn5lvb7lwsjBuK_AVq3vS3puQ&ust=1384603513533142

43


Figura 5 - Semelhanças entre a estrutura química de HMG-CoA (A) e a forma ácida da compactina (B).

O valor de Ki (constante de inibição) para a forma ácida da molécula da

compactina é ~ 1 x 10-9 M, enquanto que nas mesmas condições, o valor Km (constante de

Michaelis) para a HMG-CoA é ~10-5 M. Portanto a afinidade da enzima HMG-CoA redutase

para a compactina é 10000 vezes maior do que sua afinidade para com a substância HMG-

CoA, o que significa que as estatinas se ligam à HMG-CoA redutase em concentrações

nanomolares, levando ao deslocamento do substrato natural, HMG-CoA, que se liga em

concentrações micromolares. Isso mostra que a compactina e as outras estatinas naturais e

sintéticas são inibidores muito potentes da enzima (ENDO, 1985).

A inibição competitiva da síntese endógena do colesterol causa uma depleção do

“pool” intracelular dessa substância nos hepatócitos. Essa redução das reservas de colesterol

induz, ainda, uma resposta fisiológica que resulta em aumento da atividade dos receptores de

LDL tipo lipase na superfície celular e em um acréscimo da captação e eliminação do

colesterol circulante, com a conseqüente diminuição do colesterol plasmático (RODRÍGUEZ-

YÁÑEZ et al., 2008; VEILLARD; MACH, 2002).

Embora a meia-vida das estatinas no plasma seja relativamente curta, a redução

dos níveis de LDL é gradual e sustentada, sendo que o efeito máximo da droga pode ser

observado após várias semanas de terapia. Os efeitos desses fármacos em reduzir as

triglicérides e o VLDL e em aumentar as concentrações de HDL são também graduais,

refletindo as mudanças ocorridas na síntese e secreção das lipoproteínas ricas em

triglicerídeos e a provável estimulação da síntese de apolipoproteínas tipo HDL (LAROSA;

HE; VUPPUTURI, 1999).

A observação das estruturas químicas das estatinas revela a existência de um

grupamento químico semelhante à HMG, comum a todos os tipos de estatinas, naturais e

sintéticas, e que é responsável pela inibição da HMG-CoA redutase (figura 6). Além desse

44


grupamento, as estatinas compartilham grupos rígidos, hidrofóbicos, que estão

covalentemente ligados à porção semelhante à HMG (ISTVAN; DEISENHOFER, 2001).

Lovastatina e sinvastatina possuem um anel lactona em seu sítio ativo e são

enzimaticamente hidrolisadas em suas formas hidroxi-ácido nos tecidos corpóreos, enquanto

que as outras estatinas são administradas na forma ácida aberta e biologicamente ativa. Dentre

as estatinas naturais e semi-sintéticas, a sinvastatina é duas vezes mais potente que

pravastatina e lovastatina. Fluvastatina é uma estatina completamente sintética com uma

estrutura bem diferente dos produtos de origem fúngica. A estrutura química da fluvastatina

consiste de um derivado de mevalolactona, com um anel indol flúor-fenil substituído. As

estatinas que chegaram ao mercado após a fluvastatina também possuem estruturas similares,

com grandes grupos flúor-fenil ligados à porção semelhante à HMG (figura 6) (CORSINI;

MAGGI; CATAPANO, 1995).

Figura 6 - Estruturas químicas dos inibidores da HMG-CoA redutase. Dentre as estatinas, sinvastatina,

lovastatina e pravastatina são derivados de produtos fúngicos, enquanto as outras mais recentemente

desenvolvidas são completamente sintéticas. Os produtos fúngicos sinvastatina, lovastatina e pravastatina são

estruturalmente relacionados e possuem um anel decalina em comum. Sinvastatina e lovastatina são pró-drogas

administradas por via oral na forma de lactona. Outras estatinas totalmente sintéticas possuem diferentes

estruturas, embora possuam um grupamento HMG-símile entre os grupos 4-fluorfenil- e isopropil- ou

ciclopropil-. As diferenças na estrutura são responsáveis por sua solubilidade diferente em água.

45


Istvan e Deisenhofer (2001) referem-se aos produtos que possuem a mesma

estrutura de anel decalina substituído da compactina como inibidores tipo 1 (lovastatina,

pravastatina e sinvastatina) ou de 1ª geração. Fluvastatina, cerivastatina, atorvastatina e

rosuvastatina foram classificadas em grupo 2 (2ª geração), uma vez que possuem grupamentos

maiores ligados ao radical semelhante à HMG. As estatinas também diferem quanto ao seu

caráter de hidrofobicidade, o que reflete seu potencial de atravessar membranas celulares de

maneira não seletiva por difusão passiva. Sinvastatina, cerivastatina e atorvastatina são

consideradas muito hidrofóbicas, enquanto pravastatina e rosuvastatina são drogas

parcialmente hidrofóbicas (também consideradas na literatura como hidrofílicas) e necessitam

de mecanismos carreadores específicos nas células hepáticas e em outras células (CORSINI et

al., 1999).

O mecanismo direto das estatinas em prevenir a aterosclerose e as doenças

cardiovasculares pela redução da biossíntese do colesterol associada à inibição da HMG-CoA

redutase já foi extensivamente compreendido e estudado. No entanto, as estatinas também

previnem as doenças cardiovasculares por outros mecanismos. O ácido mevalônico, cuja

síntese é inibida pelas estatinas, é o precursor não somente do colesterol, mas também de

outros metabólitos, incluindo a isopentil adenosina (contida no RNA de transferência), o

dolicol para síntese de glicoproteínas e a CoQ10 (ISTVAN; DEISENHOFER, 2001).

Em adição, metabólitos do ácido mevalônico, como pirofosfato e

geranilgeranilpirofosfato medeiam a prenilação de várias proteínas específicas. As proteínas

preniladas estão envolvidas em um grande número de processos, incluindo a transdução de

sinais celulares, diferenciação, proliferação, mielinização e dinâmica do citoesqueleto (figura

7) (ZHANG; CASEY, 1996). Sendo assim, as estatinas também podem proteger o sistema

circulatório da aterosclerose pela modulação das funções celulares que envolvem a prenilação

de proteínas.

Através desse mecanismo, as estatinas afetam os miócitos arteriais, macrófagos e

metaloproteases, prevenindo assim, a aterosclerose. Além das alterações no perfil lipídico,

recentes evidências clínicas e experimentais indicam que o uso das estatinas implica em

melhoria e restabelecimento da função endotelial, aumento da estabilidade das placas de

ateroma, diminuição do estresse oxidativo e da inflamação, inibição da resposta trombogênica

na parede vascular e inibição da agregação plaquetária (KINLAY, 2005; KY et al., 2008;

ROSENSON, 2004; TOUSOULIS; ANTONIADES; STEFANADIS, 2007).

46


Figura 7 – A via do mevalonato leva não somente à formação do colesterol, como também de produtos

intermediários capazes de prenilar e ativar diversas proteínas envolvidas na proliferação e migração celulares, no

estresse oxidativo e na manutenção do citoesqueleto celular (PP – pirofosfato, eNOS – óxido-nítrico sintase

endotelial, t-PA – ativador do plasminogênio tecidual, ET-1 – endotelina-1, PAI-1 – inibidor 1 do ativador de

plasminogênio ).

2.2.4 Efeitos adversos das estatinas

O desconforto gastrintestinal (náuseas, dores abdominais, dispepsia, flatulência,

obstipação ou diarréia), as cefaléias (1-3% dos doentes), a subida das transaminases

(“transaminasite”) e as dores musculares estão entre os efeitos adversos mais frequentemente

apontados a estes fármacos (KIORTSIS et al., 2007). Dados da literatura obtidos a partir de

estudos clínicos mostram que as estatinas não são hepatotóxicas e eventuais alterações do

perfil enzimático não são, necessariamente, indicadoras de toxicidade hepática (COHEN;

ANANIA; CHALASANI, 2006; ESCOBAR; ECHARRI; BARRIOS, 2008).

Nas doses “habituais”, só muito raramente ocorrem elevações significativas das

transaminases, da bilirrubina ou das outras enzimas hepáticas. Convém lembrar que a

47


flutuação enzimática é um fenômeno corrente no doente com dislipidemia, relacionada

possivelmente com a esteatose hepática coexistente, com eventuais terapêuticas

concomitantes ou como resultado da própria redução dos lipídios (e do reajuste metabólico

consequente) (ARMITAGE, 2007).

A subida das aminotransferases é, normalmente, assintomática e depende,

largamente, da dose e da farmacodinâmica da estatina. Ocorre, geralmente, nos primeiros seis

meses de tratamento e melhora espontaneamente com a parada ou com a suspensão

temporária do fármaco, aliás, obrigatória quando os valores de transaminases ultrapassam três

vezes o limite superior da normalidade. Aparentemente, as maiores “transaminasites” podem

ocorrer quando há comorbidades também favorecedoras de “toque hepático” (cerca de 50%

dos doentes hiperlipidêmicos tem esteatohepatite não alcoólica, situação muito comum nos

doentes diabéticos, obesos e com síndrome metabólica), quando ou estão medicados com

outros fármacos com risco potencial de interações medicamentosas ou quando se recorre a

doses maiores de estatinas (BAYS, 2006; BOTTORFF, 2006).

O risco de aumento das transaminases hepáticas está direta e intimamente

relacionada com a dose (por cada 10% de redução do LDL-C, a taxa de elevação das enzimas

hepáticas é cerca de 2,5 vezes maior quando se usam doses mais elevadas de estatina) e,

possivelmente, com o tipo de estatina usada (as estatinas hidrofílicas podem determinar um

ligeiro acréscimo do risco absoluto de elevação das aminotransferases) (DALE et al., 2007).

Outro efeito adverso relacionado à terapêutica com estatinas diz respeito às ações

dessas no sistema muscular esquelético. Nos EUA foi descrito um número muito baixo de

complicações graves, como a rabdomiólise, uma síndrome caracterizada por necrose

muscular, elevação de creatinofosfoquinase (CPK) acima de 10 vezes o limite superior da

normalidade, acompanhada de dores musculares, mioglobinúria e determinando, em geral,

risco de vida devido à insuficiência renal. A incidência de rabdomiólise fatal nos EUA foi

descrita como sendo de 0,15 casos por milhão de prescrições de estatinas (STAFFA;

CHANG; GREEN, 2002). Quando os sintomas musculares não se acompanham de elevação

significativa das enzimas musculares, caracterizamos a mialgia, que parece incidir em 6 a

14% dos eventos adversos associados com a prescrição das estatinas (UCAR; MJORNDAL;

DAHLQVIST, 2000).

A causa da miotoxicidade (e da rabdomiólise) relacionada com as estatinas não

esta ainda devidamente esclarecida. Frequentemente, os efeitos adversos musculares têm sido

atribuídos a deficiências, absolutas ou relativas, dos diversos compostos da via do

mevalonato, com implicações moleculares, mais ou menos firmadas, de tipo fisiopatológico:

48


redução do colesterol e perturbação da razão colesterol/fosfolipídios; déficit de ubiquinona

(coenzima Q10) e perturbação da fosforilação oxidativa mitocondrial; alteração da prenilação

de proteínas, nomeadamente das proteínas ras e ras-dependente (ras, rho A e rho B), e da

transdução de sinal intracelular; e indução da apoptose com inibição da proliferação da célula

muscular esquelética (menos provável) (THOMPSON; CLARKSON; ROSENSON, 2006;

VAKLAVAS, 2009).

Um dos aspectos mais descritos com as estatinas é o seu potencial de interações

farmacológicas com drogas que compartilham o mesmo sítio de metabolização microssomal

hepático. Sendo assim, as miopatias associadas com as estatinas são dose-dependentes e sua

incidência aumenta até cinco vezes (~0,3 a ~1,5%) quando certas estatinas (lovastatina,

sinvastatina, atorvastatina) são coadministradas com certos medicamentos como fibratos

(especialmente gemfibrozil), bloqueadores de canais de cálcio, imunossupressores

(ciclosporina), agentes antifúngicos (itraconazol, cetoconazol, fluconazol), drogas

antiretrovirais como os inibidores de protease e combinações destas e outras drogas, incluindo

suco de grapefruit (FONSECA, 2011).

Apesar dos múltiplos efeitos adversos que têm sido atribuídos às estatinas, a

terapêutica intensiva redutora do colesterol não está associada a consequências deletérias,

dependentes da maior eficácia obtida, ou a efeitos colaterais graves. Pelo contrário,

globalmente, parece possível sublinhar que, nos doentes coronários com um risco elevado,

reduções maiores do LDL-C são seguras e determinam uma diminuição superior de eventos

cardiovasculares subsequentes, com uma propensão para a ocorrência de menos eventos

primários e colaterais (SILVA, 2010).

2.2.5 Efeitos pleitrópicos das estatinas

Como relatado anteriormente, os resultados de vários estudos demonstraram o

impacto terapêutico dos efeitos das estatinas não relacionados à redução do colesterol,

levantando a possibilidade de que outros mecanismos de ação, além da atividade

hipolipemiante, possam ser responsáveis pelos resultados benéficos desses fármacos em

pacientes com aterosclerose. Os efeitos das estatinas independentes da redução do colesterol

plasmático são chamados de efeitos pleiotrópicos e podem ser verificados em outros sistemas

além daqueles já relatados anteriormente (sistema circulatório) Embora os efeitos

pleiotrópicos sejam mais frequentemente atribuídos às ações das estatinas em sítios extra-

hepáticos, suas ações no fígado também podem gerar efeitos sistêmicos com consequências

49


extra-hepáticas, uma vez que esses fármacos sofrem um extenso metabolismo nesse órgão

(BONETTI et al., 2003; MÄRZ; KÖENIG, 2003).

Através de sua ação na etapa inicial da via do mevalonato, as estatinas diminuem

a disponibilidade de importantes compostos intermediários, dentre os quais se destacam os

derivados isoprenóides. Os isoprenóides constituem-se em uma gama de compostos formados

a partir do isopentenil pirofosfato, os quais possuem o mesmo bloco básico de construção de 5

carbonos, chamado de unidade isoprênica. Através de um processo chamado prenilação, os

isoprenóides lipídicos de 15 ou 20 átomos de carbono (farnesil e geranilgeranil,

respectivamente) ligam-se de maneira covalente a resíduos de cisteína próximos à região C

terminal de diversas proteínas. A prenilação permite, então, a interação dessas proteínas com

a membrana plasmática, dada a hidrofobicidade dos lipídeos envolvidos (ZHANG; CASEY,

1996).

Esse mecanismo de modificação pós-tradução dos polipeptídeos envolve diversos

tipos de proteínas, como, por exemplo, compostos fúngicos de mimetização, lamininas

nucleares, as subunidades das proteínas G triméricas, proteínas quinases e pelo menos uma

proteína viral. De especial importância é a prenilação da família das pequenas proteínas G,

incluindo Ras e Ras-símile (Rho, Rap, Rab e Ral). As proteínas farnesiladas Ras são proteínas

de ligação ao GTP, que possuem papel crucial nas vias de sinalização que controlam o

crescimento e a diferenciação celulares (CASEY; SEABRA, 1996).

Os efeitos pleiotrópicos das estatinas incluem ações vasodilatadora,

antitrombótica, antioxidante, antiinflamatória, imunossupressora e angiogênica. Foi verificado

também um decréscimo na produção do peptídeo β-amilóide (DEKOSKY, 2005) e uma maior

regulação da ativação microglial (MIIDA et al., 2005), fatores esses relacionados à prevenção

da doença de Alzheimer e da demência. Além disso, como será discutido mais adiante, as

estatinas possuem efeitos anabólicos no metabolismo ósseo, o que sugere que as diversas

ações pleiotrópicas desses fármacos podem significar um benefício na prevenção e tratamento

de várias doenças relacionadas ao envelhecimento e ao estilo de vida (WALDMAN;

KRITHARIDES, 2003).

Os efeitos imunomodulatórios das estatinas tem sugerido o uso dessa classe de

fármacos em transplantes (KOBASHIGAWA et al. 1995), e em várias doenças auto-imunes,

como esclerose múltipla (PENG et al., 2006), artrite reumatóide (PRICE, 2011) e lupus

(AMURO et al., 2010). As ações antiproliferativas observadas em vários tecidos podem ser

responsáveis pela inibição da diferenciação e crescimento tumoral (DENOYELLE et al.,

50


2001), significando um menor risco de desenvolvimento de diferentes tipos de câncer

(BOUDREAU et al., 2004; GRAAF et al., 2004; POYNTER et al., 2005).

Com relação ao efeito antiinflamatório das estatinas, o tratamento com os

inibidores de HMG-CoA redutase causa uma redução dos valores de proteína C-reativa (PCR)

(de 30 a 89%), correlacionada com uma menor taxa de eventos cardiovasculares. Essa

redução nos valores de PCR foi observada independentemente da idade, sexo, perfil lipídico e

terapia de reposição hormonal feminina. Indivíduos com índice de massa corporal maior que

29 kg/m2 obtiveram uma maior redução dos valores de PCR, enquanto os tabagistas

obtiveram esse efeito atenuado. A diminuição dos valores de PCR foi observada em 2

semanas após o tratamento (BLAKE; RIDKER, 2002; NISSEN et al., 2005).

Nareika et al. (2007) demonstraram que a pré-exposição de histiócitos U937 a

altas concentrações de glicose aumentou de maneira marcante a secreção de citocinas pró-

inflamatórias e quimiocinas induzida por LPS; também verificou-se que o efeito da glicose foi

revertido pela adição de sinvastatina ao meio. Os autores concluíram que as altas doses de

açúcar e o LPS atuam de maneira sinérgica na secreção de mediadores inflamatórios pelos

macrófagos e que as estatinas poderiam ser úteis no tratamento da doença periodontal em

pacientes diabéticos.

Os inibidores da HMG-CoA redutase podem bloquear as β-2 integrinas e o

antígeno de função leucocitária-1 (LFA-1) (que são sinais co-estimuladores para ativação das

células T) por ligação a um sítio alostérico dentro do LFA-1, independente do efeito na HMG-

CoA redutase e, conseqüentemente, das proteínas isopreniladas (NISHIBORI; TAKAHASHI;

MORI, 2003). Outros efeitos antiinflamatórios são a diminuição da resposta imune Th1, o

aumento da resposta Th2 e a menor expressão de CD 40 em células vasculares (CORDLE et

al., 2005; ELROD; LEFER, 2005).

Evidências iniciais com relação ao efeito imunomodulatório das estatinas

demonstraram a ação dessas drogas em prevenir e reverter as paralisias recorrentes na

encefalomielite auto-imune experimental, um modelo animal de esclerose múltipla

(YOUSSEF et al., 2002). Em humanos, observações mais recentes mostram que atorvastatina

e sinvastatina foram capazes de reduzir a severidade do lúpus eritematoso sistêmico

(FERREIRA et al., 2007; KOTYLA, 2008). Além disso, a sinvastatina promoveu

proeminente supressão das concentrações de TNF-α no plasma, após 4 semanas de tratamento

(KOTYLA, 2008). Provavelmente as estatinas agem bloqueando a transcrição de vários genes

induzidos pelo fator nuclear-κB e inibindo, nas células endoteliais, a expressão do antígeno

humano leucocitário classe II induzido por interferon-γ. A supressão desses fatores contribui

51


para prevenir a ativação local de células T, minimizando a auto-imunidade dirigida por Th1

(MERONI; LUZZANA; VENTURA, 2002).

Estudos clínicos verificando o efeito imunomodulatório e antiinflamatório de

baixas doses de sinvastatina na artrite reumatóide demonstraram que as razões Th1/Th2 e

CD4/CD8 no sangue foram significativamente reduzidas pelo fármaco (KANDA; YOKOTA;

KOHNO, 2007). Pacientes tratados com atorvastatina mostraram uma melhora clínica no

quadro de artrite e redução nos valores de CRP (McCAREY et al., 2004). O mecanismo de

ação das estatinas na atrite reumatóide pode estar relacionado com uma inibição na produção

de citocinas e na ativação de NFκ-B. A sinvastatina reduziu significativamente a produção de

IL-6 e IL-8 em sinoviócitos estimulados por IL-1, através de um bloqueio da HMG-CoA

redutase e conseqüente interferência no processo de prenilação (LAZZERINI et al., 2007).

Os estudos descritos acima mostram que as moléculas produzidas a partir da via

do mevalonato funcionam como reguladores essenciais da relação entre linfócitos T helper

tipo 1 e linfócitos Th2 e que a inibição da HMG-CoA redutase é um mecanismo potencial

para modular respostas patogênicas das células T. Um aumento na produção de citocinas tipo

Th2 pode representar um mecanismo protetor nos estados patológicos caracterizados por

condições inflamatórias predominantemente Th1, como lúpus, artrite reumatóide, doença de

Crohn, esclerose e múltipla, entre outras (ZEISER et al., 2009).

2.2.6 Efeitos ósseos das estatinas

As doenças relacionadas ao metabolismo ósseo, tais como osteoporose, artrite

reumatóide, doença periodontal, cânceres metastáticos líticos e leucemia, afetam milhões de

pessoas em todo mundo e representam um profundo impacto nos sistemas de saúde. A

osteoporose, por exemplo, é hoje o maior problema de saúde pública nas mulheres mais

idosas (LEIBBRANDT; PENNINGER, 2008).

A maioria das drogas disponíveis atualmente para tratar doenças caracterizadas

por perda de massa óssea, especialmente a osteoporose, são agentes que inibem a reabsorção

óssea, incluindo os bifosfonatos, o estrógeno, os moduladores seletivos do receptor de

estrógeno, a calcitonina e os análogos da vitamina D. Esses agentes possuem efeitos benéficos

para os pacientes apenas na prevenção de uma perda óssea adicional, uma vez que agem

principalmente na estabilização da massa óssea, com mínimos efeitos anabólicos (RIGGS;

HARTMANN, 2003). Portanto, agentes anabólicos, capazes de aumentar a massa óssea e

52


majorar a arquitetura do osso trabecular são cruciais no tratamento de problemas como a

osteoporose e a doença periodontal (MARGOLIS; CANALIS; PARTRIDGE, 1996).

Os agentes anabólicos sob investigação correntemente são o hormônio da

paratireóide, o flúor, o estrôncio e o hormônio do crescimento. Até agora, apenas o

paratormônio humano (hPTH) injetável foi aprovado para uso no tratamento da osteoporose

nos Estados Unidos, porém, até agora, nenhuma droga anabólica para administração oral está

disponível para compor a terapia dessa doença (HORIUCHI e MAEDA, 2006).

Osteoporose, doença periodontal e aterosclerose compartilham a tendência de

acelerar após a menopausa; as três doenças são promovidas por um processo inflamatório, e

muitos aspectos da calcificação arterial e da formação óssea são similares. A relação entre

aterosclerose (doença coronariana) e doença periodontal vem sendo investigada já há vários

anos e hoje se sabe que, além de ambas compartilharem fatores de risco semelhantes, a

doença periodontal pode representar mais um elemento na cadeia causal dos acidentes

vasculares, como por exemplo, o infarto do miocárdio (BLAIZOT, 2009).

Com relação à osteoporose, alguns trabalhos mostram que a perda óssea sistêmica

pode estar associada com perda da inserção periodontal, perda da massa óssea alveolar e, em

conseqüência, da própria dentição (TEZAL, 2000). Além disso, o tratamento sistêmico da

osteoporose também possui efeitos nos tecidos orais e influencia a progressão da doença

periodontal (RONDEROS et al., 2000). Um grande estudo coorte de mulheres acima dos 60

anos mostrou que as voluntárias em terapia de reposição de estrógeno possuíam taxas

significativamente mais baixas de perda óssea, edentulismo e uso de próteses totais, quando

comparadas com mulheres sem reposição hormonal (PAGANINI-HILL, 1995).

Adicionalmente, parece ainda haver uma relação entre osteoporose e

aterosclerose, relação essa suportada pela observação de que a progressão da calcificação

aórtica é mais severa em mulheres com maiores perdas ósseas metacarpais (HAK et al.,

2000). Os fatores que podem relacionar os três processos (doença periodontal, aterosclerose e

osteoporose) incluem a deficiência de estrógeno e concentrações aumentadas de citocinas pró-

inflamatórias, como IL-1, IL-6 e TNF-α (BALDINI et al., 2005).

Sedo assim, as drogas atualmente em investigação para osteoporose e

aterosclerose são também de interesse no tratamento das doenças periodontais. Dentro desse

objetivo, uma das classes de drogas mais pesquisadas, dados seus pronunciados efeitos em

várias outras doenças crônicas de difícil tratamento, é o grupo das estatinas.

Os efeitos biológicos das estatinas no metabolismo ósseo foram primeiramente

relatados em 1999, quando Mundy e colaboradores observaram que as estatinas eram potentes

53


estimuladores da formação óssea in vitro. Mais de 30000 compostos foram investigados com

relação à sua habilidade em estimular a ativação do promotor da BMP-2 em células

osteoblastos-símile de osteosarcoma humano (MG63) e em osteoblastos murinos (2T3). Os

autores imaginavam que a diferenciação dos osteoblastos deveria ser aumentada por membros

da família BMP, incluindo BMP-2, enquanto que outros fatores de crescimento ósseo, tais

como TGF-β e fator de crescimento de fibroblastos estimulariam a proliferação dos

osteoblastos, mas inibiriam a diferenciação dessas células (SAKOU, 1998). Nesse grande

estudo de referência, Mundy et al. (1999) mostraram que as estatinas aumentaram a expressão

do RNAm para BMP-2 em culturas de células ósseas humanas e de camundongos e

promoveram formação óssea em calvárias murinas mantidas em cultura de órgão, sugerindo

fortemente que essas drogas poderiam ter um efeito benéfico na saúde óssea.

Adicionalmente, esses autores demonstraram que sinvastatina e lovastatina

aumentam a formação óssea, quando injetadas subcutaneamente sobre a calvária dos

camundongos, e que as estatinas causam um acréscimo no volume ósseo trabecular quando

administradas oralmente nas doses de 5 e 10 mg/kg a ratas oforectomizadas osteopênicas.

Subsequentemente, Sugiyama et al. (2000) demonstraram que estatinas lipofílicas,

tais como sinvastatina e mevastatina, aumentavam a expressão do RNAm e da proteína BMP-

2 em células humanas de osteosarcoma, e que a sinvastatina também ativava o promotor da

BMP-2 ligado a um gene repórter da luciferase. Os autores também verificaram que a

ativação do promotor da BMP-2 podia ser abolida pela adição de mevalonato, o metabólito

final da HMG-CoA redutase, o que sugere fortemente que a ativação do promotor é um

resultado da inibição da HMG-CoA redutase. Também foi mostrado neste estudo que

estatinas hidrofílicas, tais como a pravastatina, não apresentaram a habilidade de induzir a

expressão de BMP-2 em osteoblastos. Essas observações suportam a noção de que a

lipofilicidade das estatinas é importante na geração de efeitos pleiotrópicos, tais como a

formação óssea.

Em 2001, Maeda et al. investigaram se a sinvastatina regula a diferenciação e

função dos osteoblastos usando osteoblastos não transformados (MC3T3-E1) e células da

medula óssea de ratos. Os resultados indicaram que a sinvastatina aumenta a atividade de

fosfatase alcalina e a mineralização, de uma maneira dose e tempo dependente. Esse mesmo

grupo também demonstrou que as estatinas, tais como sinvastatina e cerivastatina, regulam a

função dos osteoblastos, aumentando a expressão de sialoproteína do osso (BSP),

osteocalcina (OCN) e colágeno tipo I, e suprimindo a expressão gênica de colagenases, como

MMP-1 e MMP-13 (MAEDA et al., 2004).

54


Adicionalmente, foi investigado se outros fatores anabólicos, além de BMP-2, são

induzidos pelo tratamento com estatinas. Maeda et al. (2003) verificaram que estatinas

lipofílicas, como sinvastatina, atorvastatina e cerivastatina – mas não pravastatina, uma

estatina hidrofílica – aumentaram de maneira marcante a expressão de VEGF (fator de

crescimento derivado do endotélio), um fator anabólico, nos osteoblastos. Este efeito

estimulatório foi abolido com o tratamento por mevalonato e GGPP, enquanto que a adição de

manumicina A, um inibidor da prenilação de proteínas, mimetizou os efeitos das estatinas na

expressão de VEGF. Inibidores de PIK3 inibiram a expressão induzida pelas estatinas. Sendo

assim, os autores concluíram que as estatinas estimulam a expressão de VEGF nos

osteoblastos através de uma redução na prenilação de proteínas e da ativação da via PIK3.

Outro estudo in vitro, utilizando células humanas de ligamento periodontal,

demonstrou que, em baixas concentrações, a sinvastatina exibe efeitos positivos na

proliferação e na diferenciação osteoblástica das células do ligamento periodontal,

estimulando a atividade de fosfatase alcalina e de osteopontina no meio de cultura. Esses

efeitos foram revertidos pela adição de mevalonato ao meio (YAZAWA et al., 2005).

Como já relatado anteriormente, as estatinas inibem a enzima HMG-CoA redutase

e, consequentemente, suprimem a produção dos metabólitos intermediários da via do

mevalonato. À semelhança dos bifosfonatos, as estatinas compartilham a capacidade de inibir

a formação do geranilgeranilpirofosfato (GGPP), interferindo na prenilação de algumas

proteínas, tais como a rho p21, fundamentais para a manutenção do citoesqueleto e da

consequente sobrevivência dos osteoclastos (HORIUCHI; MAEDA, 2006; VAN BEEK et al.,

1999).

Dentro dessa perspectiva, Woo et al. (2000) observaram, em cultura de células,

que a compactina inibiu a diferenciação dos osteoclastos, interferindo no processo de fusão

pelo qual osteoclastos pré-fundidos se desenvolvem em células multinucleadas semelhantes a

osteoclastos maduros. Além disso, a compactina promoveu a quebra do anel de actina dos

osteoclastos maduros; ambos os efeitos da compactina foram prevenidos pela adição de FPP e

GGPP ao meio de cultura. Staal et al. (2003) mostraram in vitro que a cerivastatina foi capaz

de inibir a reabsorção óssea estimulada pelo hormônio da paratireóide (PTH); além disso, a

estatina suprimiu a prenilação de proteínas nos osteoclastos isolados da medula óssea de

coelhos, após tratamento dos animais com a cerivastatina.

A despeito dos bons resultados verificados nos estudos iniciais in vitro e no

estudo in vivo de Mundy et al. (1999), resultados conflitantes relativos aos efeitos indutores

das estatinas no metabolismo ósseo foram obtidos em trabalhos in vivo subseqüentes. Maritz

55


et al. (2001) demonstraram que a sinvastatina administrada por via oral (20 mg/kg/dia) não foi

capaz de prevenir a perda óssea causada pela oforectomia em ratas e não mostrou efeito

anabólico in vivo sobre o osso dos animais. Em contraste, Oxlund et al. (2001) encontraram

que a sinvastatina, na dose oral de 10 mg/kg aumentou o osso trabecular em 23% e a força

compressiva desse osso em 24% nas vértebras de ratas envelhecidas não-oforectomizadas.

Um estudo in vivo de Skoglund et al. (2002) demonstrou pela primeira vez que a

sinvastatina administrada por via oral através da dieta dos ratos foi capaz de promover uma

melhora nos parâmetros de cicatrização de fraturas ósseas em camundongos.

Pytlik et al. (2003) verificaram os efeitos da administração oral de sinvastatina (3

e 6 mg/kg/dia) no desenvolvimento de osteopenia induzida por oforectomia em ratas com 3

meses de idade. Foi observado que a sinvastatina intensificou o processo de formação óssea e

reduziu o de reabsorção induzidos por oforectomia bilateral, sendo que a dose de 6 mg/kg

mostrou maior atividade. O mesmo resultado foi verificado por Mukherjee et al. (2006), com

doses diárias de lovastatina de 0,9 mg/kg. Ho et al. (2009) observaram que a melhora nos

parâmetros ósseos em ratas oforectomizadas submetidas ao tratamento com sinvastatina na

dose de 20 mg/kg coincidiu com um aumento na expressão osteoblástica de BMP-2, colágeno

tipo I e osteocalcina nos ossos vertebrais.

A fim de reexaminar os efeitos da sinvastatina no metabolismo ósseo, von

Stechow et al. (2003) compararam as ações da estatina e do hormônio humano da paratireóide

(PTH) na formação óssea em camundongos fêmeas oforectomizadas e osteopênicas.

Verificou-se que, enquanto o PTH demonstrou os efeitos anabólicos esperados no osso, a

sinvastatina falhou em estimular a neo-formação óssea, a despeito da presença do metabólito

ativo no sangue dos camundongos.

Hanayama et al. (2009) verificaram os efeitos de uma dieta rica em frutose no

desenvolvimento de osteoporose em ratas oforectomizadas, submetidas ou não ao tratamento

com estatinas. Os autores observaram que a administração de frutose às ratas induziu

resistência à insulina e acelerou a osteoporose, enquanto que a fluvastatina – mas não a

pravastatina – atenuou de maneira significativa a ativação e diferenciação dos osteoclastos,

através de um bloqueio da via do mevalonato e de uma ação antioxidante, prevenindo, assim,

o desenvolvimento de osteoporose.

Desde a descoberta de que as estatinas poderiam interferir positivamente no

metabolismo ósseo, vários estudos clínicos dedicaram-se a avaliar os efeitos dessa classe de

drogas nos parâmetros relacionados à osteoporose, como a incidência de fraturas, a densidade

de massa óssea e os marcadores de formação e perda óssea. Diversos estudos transversais e do

56


tipo caso-controle foram efetuados e demonstraram que o uso das estatinas está associado a

uma menor incidência de fraturas (CHAN et al., 2000; MEIER et al., 2000; WANG et al.,

2000) e a uma maior densidade de massa óssea (EDWARDS; HART; SPECTOR, 2000;

PASCO et al., 2002).

Por outro lado, a maioria dos estudos longitudinais que buscaram correlacionar o

uso das estatinas com melhoras nos parâmetros da osteoporose falharam em verificar um

aumento na densidade óssea ou menor incidência de fraturas nos pacientes com uso crônico

dessas drogas (LACROIX et al., 2003; PEDERSEN; KJEKSHUS, 2000; REID et al., 2001;

REJNMARK et al., 2004). Uma recente revisão sistemática de estudos longitudinais

controlados sobre o efeito das estatinas na saúde óssea em 3022 mulheres pós-menopausa

mostrou que o uso das estatinas não esteve associado a uma menor incidência de fraturas ou a

um aumento na densidade óssea, e também não se correlacionou a nenhuma mudança nos

marcadores de formação e reabsorção óssea (YUE et al., 2010).

Contrariando esses resultados, o mais atual estudo clínico longitudinal controlado

envolvendo 212 pacientes portadores de hiperlipidemia e osteopenia mostrou que a

sinvastatina, usada em doses moderadas e altas, foi efetiva em aumentar a densidade óssea

mineral dos pacientes, bem como a concentração sérica de marcadores da formação óssea;

além disso, os pacientes em uso da estatina apresentaram menores concentrações sanguíneas

de marcadores de reabsorção óssea, quando comparados com os pacientes que utilizaram

outras drogas hipolipêmicas (genfibrozil ou fibrato) (CHUENGSAMARN et al., 2010).

A explicação para esses resultados divergentes com relação aos efeitos das

estatinas em humanos parece estar associada às características farmacocinéticas e

farmacodinâmicas da droga nos tecidos corpóreos. As estatinas administradas por via oral são

recicladas na circulação entero-hepática e, em sua na maior parte, metabolizadas no fígado

pelos mecanismos de primeira passagem. Sendo assim, apenas pequena parte da droga

administrada oralmente estará disponível para atuar em outros tecidos, como por exemplo, o

osso. Um estudo sobre a deposição e metabolismo da atorvastatina em ratos mostrou que 73%

da dose oral da estatina foi excretada na bile, e que a administração de múltiplas doses não

altera os perfis metabólicos biliares (BLACK et al., 1999).

No caso da sinvastatina, menos de 5% da dose oral alcança a circulação sistêmica.

As concentrações das estatinas na medula óssea ainda não estão bem estabelecidas, mas

acredita-se que os osteoblastos e osteoclastos possam estar expostos a concentrações muito

baixas de estatina com os regimes orais existentes (PARK, 2009). Em virtude disso, diversos

autores têm sugerido outras vias de administração para as estatinas, a fim de a droga possa

57


“escapar” da acumulação no fígado e chegar aos tecidos periféricos, o que potencializaria seus

efeitos no metabolismo ósseo (HORIUCHI; MAEDA, 2006).

Dentro dessa nova perspectiva, observou-se que a administração intraperitoneal de

sinvastatina na dose de 10 mg/kg por 30 dias aumentou o contato ósseo de implantes de

titânio colocados em ratas envelhecidas, bem como a densidade óssea ao redor do implante,

sugerindo um potencial das estatinas em promover a osseointegração (AYUKAWA et al.,

2004).

Um estudo in vivo de Gutierrez et al. (2006) mostrou que a aplicação transdérmica

de estatinas a ratas oforectomizadas induz um maior efeito no metabolismo ósseo, quando

comparada com a administração oral. Após 4 semanas de estudo, houve um aumento de 150%

nas taxas de formação óssea no grupo da estatina, efeitos esses conseguidos com doses em

torno de 1% da dose oral. Além disso, os níveis sanguíneos de lovastatina, mensurados pela

atividade da HMG-CoA redutase, mantiveram-se mais elevados e mais estáveis no grupo de

animais que receberam a aplicação transdérmica.

Utilizando o mesmo modelo de perda óssea induzida por oforectomia, Hughes et

al. (2007) observaram que injeções subcutâneas diárias de rosuvastatina e cerivastatina na

dose de 20 mg/kg foram efetivas em preservar o conteúdo ósseo mineral e a densidade óssea

das tíbias analisadas após 21 dias de tratamento. Adicionalmente, os autores observaram in

vitro que rosuvastatina, pravastatina, cerivastatina e sinvastatina causaram um acúmulo da

Rap-1A não prenilada nas células semelhantes a osteoclastos de coelho e em macrófagos J774

e inibiram significativamente a atividade dos osteoclastos.

Um recente estudo mostrou que a aplicação intraperitoneal diária de sinvastatina

nas doses de 5 e 10 mg/kg por 30 dias foi efetiva em aumentar a formação de osso medular e

a taxa de contato ósseo ao redor de implantes de titânio. Adicionalmente, verificou-se um

aumento nos marcadores de formação óssea e uma diminuição nos de reabsorção

(AYUKAWA et al., 2010).

Han et al. (2010) investigaram os efeitos da sinvastatina na recidiva e no

remodelamento tecidual periodontal após a movimentação dental experimental em ratos e

explorou os possíveis mecanismos envolvidos. Foi observado que as porcentagens de recidiva

e as distâncias dessa recidiva foram menores no grupo tratado com sinvastatina intraperitoneal

na dose de 2,5 mg/kg/dia, em relação aos controles; além disso, verificou-se um aumento na

expressão tecidual de osteoprotegerina e uma diminuição de RANKL no periodonto do grupo

tratado com a estatina.

58


Além dos estudos mostrados acima, envolvendo diferentes vias de administração

sistêmica das estatinas, vários trabalhos conduzidos recentemente têm verificado a ação das

estatinas aplicadas localmente na regeneração óssea, utilizando diferentes sistemas de entrega

em distintos modelos animais.

Thylin et al. (2002) verificaram que uma única dose de sinvastatina (2,2 mg) em

gel de metilcelulose aplicada subcutaneamente sobre a calvária de camundongos Swiss

estimulou a aposição de osso craniano; quando o gel de sinvastatina foi associado a uma

membrana de poli(ácido lático), os resultados de ganho de espessura óssea foram

significativamente mais pronunciados.

Utilizando o mesmo modelo, Jeon et al. (2008) verificaram a bioatividade óssea

de dois sistemas de entrega do hidroxiácido de sinvastatina: um sistema de entrega contínuo e

outro intermitente, ambos formados a partir de uma mistura de ftalato de acetato de celulose

com óxido de polietileno ou polipropileno. Os autores verificaram que ambos os sistemas

aumentaram a espessura e a área ósseas, sendo que o sistema com liberação intermitente

estimulou uma resposta 32,3% maior na espessura óssea e 74,1% maior na área óssea, em

relação ao sistema de liberação contínua.

A fim de avaliar os efeitos das estatinas na regeneração de defeitos ósseos tibiais,

ANBINDER et al. (2006) administraram aos ratos sinvastatina por via oral na dose de 20

mg/kg ou por via subcutânea sobre a área do defeito na dose de 7 mg/kg durante todo o

período do estudo (15 ou 30 dias). As análises histomorfométricas e histológicas não

revelaram diferenças significativas no potencial de regeneração óssea da sinvastatina em

relação ao controle negativo, em nenhuma das vias de administração testadas.

Por outro lado, Wang et al. (2007) observaram que a administração de

sinvastatina (10 mg/kg) subcutaneamente sobre o sítio de fraturas na tíbia de ratas

oforectomizadas esteve associada com um significativo aumento na espessura de

mineralização, no volume de mineralização e na taxa de aposição mineral. Os autores

sugeriram que a aplicação local de sinvastatina poderia promover a cicatrização de fraturas

em ratas oforectomizadas.

Morris et al. (2008) realizaram um estudo piloto, a fim de avaliar o potencial de

regeneração óssea da sinvastatina injetada localmente em defeitos periodontais criados

cirurgicamente em cães, de tamanho semelhante aos defeitos ósseos humanos. Os autores

verificaram que a crista edêntula foi o único meio no qual as injeções de sinvastatina

mostraram potencial para aumentar a espessura óssea. Nenhum efeito foi verificado com

relação aos defeitos intra-ósseos e às lesões de furca.

59


Com o objetivo de verificar o efeito da sinvastatina na reabsorção óssea alveolar

após extração dental, Wu, Liu e Sun (2008) implantaram sistemas de liberação a base do

polímero poli(ácido lático-co-ácido glicólico), com e sem sinvastatina, no alvéolos dentais

pós-exodontia dos incisivos inferiores. Observou-se que a altura relativa do rebordo residual

apresentou-se significativamente maior no grupo experimental, após 2, 4, 8 e 12 semanas. A

densidade mineral também foi maior para o grupo tratado com sinvastatina, o que sugere que

a estatina em estudo pode efetivamente preservar a osso alveolar residual. Esse mesmo grupo

verificou ainda uma supra-regulação do RNAm para TGF-β1, BMP-2 e VEGF nos alvéolos

que receberam sinvastatina, após 1, 2 e 4 semanas da exodontia (LIU; WU; SUN, 2009).

Nyan et al. (2009) conduziram um estudo in vivo a fim de avaliar se a combinação

de uma dose ótima de sinvastatina e do substituto ósseo alfa-tricálcio-fosfato poderia induzir o

máximo de regeneração óssea com menos reação inflamatória, uma vez que vários estudos

mostravam que a aplicação local de estatinas para regeneração óssea induzia em graus

variados um processo inflamatório nos tecidos moles. Para tal foram criados defeitos de 5 mm

de diâmetro na calvária de ratos Wistar, os quais foram preenchidos com preparações de

diferentes doses de sinvastatina combinadas com partículas de alfa-tricálcio-fosfato. Os

autores verificaram que a combinação de 0,1 mg de sinvastatina com o alfa-tricálcio-fosfato

foi a dose mais eficiente para a estimulação da máxima regeneração óssea nos defeitos nas

calvárias, sem a indução de inflamação, podendo ser aplicada como um efetivo material de

enxerto ósseo.

Ayukawa et al. (2009) investigaram o efeitos da administração local de

sinvastatina nos eventos celulares e na formação óssea em defeitos ósseos criados

cirurgicamente na tíbia de ratos. Os autores observaram que a estatina promoveu maior

formação óssea, com um aumento significativo na expressão gênica de fosfatase alcalina e

BMP-2 e uma diminuição na expressão de catepsina K e RANKL.

Contrariando os resultados anteriores, Calixto et al. (2010) não verificaram

qualquer efeito de uma esponja de colágeno embebida em sinvastatina na regeneração óssea

de calvárias de ratos. Não foi observada diferença significativa na densidade radiográfica e na

análise histomorfométrica nos defeitos ósseos entre os grupos que receberam a estatina e o

grupo que recebeu apenas a esponja de colágeno.

Um trabalho de Masuzaki et al. (2010) verificou que uma única injeção

transdérmica de microesferas de poli(ácido lático) contendo fluvastatina no dorso de ratos foi

efetiva em aumentar a formação óssea ao redor de implantes de titânio, 2 e 4 semanas após a

60


colocação dos implantes, sem nenhuma influência nos níveis séricos de ALT, AST ,

creatinina e colesterol.

Um estudo recente de Shan et al. (2011) investigou o efeito de um gel de

sinvastatina/metilcelulose contendo diferentes concentrações da droga na regeneração de

defeitos ósseos de furca criados em porcos miniatura. Os autores verificaram que todos os

grupos de animais tratados com sinvastatina exibiram completo preenchimento dos defeitos

com novo osso e tecido fibroso, o mesmo não tendo ocorrido nos grupos que receberam

somente metilcelulose.

2.2.7 Efeitos das estatinas na doença periodontal

Além dos trabalhos descritos acima, a respeito da ação das estatinas em vários

modelos de regeneração óssea, alguns estudos utilizando modelos animais de doença

periodontal dedicaram-se a estudar os efeitos dessa classe de drogas na perda óssea alveolar.

Vaziri et al. (2007) avaliou o efeito da sinvastatina aplicada subperiostealmente na reabsorção

óssea induzida por ligadura na mandíbula de ratas oforectomizadas. As análises histológicas

mostraram que o grupo tratado com a sinvastatina desenvolveu um menor desarranjo

periodontal, com menores índices de perda óssea alveolar, em comparação ao grupo controle.

Utilizando o mesmo modelo, Seto et al. (2008) avaliaram o efeito da sinvastatina

na recuperação óssea após 20 dias de periodontite experimental. Posteriormente à remoção da

ligadura, os autores injetaram a sinvastatina topicamente na gengiva vestibular dos ratos

durante 70 dias e, subsequentemente, analisaram os tecidos histologicamente e por tomografia

computadorizada. As imagens da tomografia revelaram que o tratamento com sinvastatina

recuperou a reabsorção óssea induzida pela ligadura, tendo mostrado 46% de reversão da

altura óssea. O exame histológico evidenciou que osso alveolar pouco mineralizado foi

formado nos ratos que receberam a sinvastatina.

Nassar et al. (2009) verificaram que a administração oral de sinvastatina na dose

de 20 mg/kg reverteu a perda óssea induzida por ciclosporina A em um modelo de doença

periodontal por ligadura. Os autores também observaram que a diminuição da perda óssea foi

acompanhada de menor expressão de PGE2 e IL-1β nos grupos tratados com sinvastatina.

Através de uma análise radiográfica digital, Goes et al. (2010) demonstraram que

a atorvastatina aplicada por via oral na dose de 9 mg/kg foi eficaz em prevenir a perda óssea

alveolar em um modelo de periodontite induzida por ligadura. Os resultados de maior

61


densidade radiográfica foram corroborados pelos achados macroscópicos, que indicaram uma

redução de 47% na área de perda óssea no grupo tratado pela estatina.

Utilizando um modelo de periodontite induzida por LPS, Price et al. (2013)

verificaram, através de tomografias microcomputadorizadas, que a administração profilática

de um conjugado de sinvastatina e alendronato na gengiva de ratos promoveu uma menor

perda de volume ósseo interproximal, quando esse grupo de animais foi comparado com o

grupo que recebeu apenas a injeção de LPS.

Com relação aos efeitos das estatinas na doença periodontal em humanos, Cunha-

Cruz et al. (2006) observaram, em um estudo coorte retrospectivo de 7 anos, resultados

variados a respeito do uso de estatinas no risco de perdas dentárias. Os autores verificaram

que o uso regular de estatinas durante 3 anos esteve associado com uma redução não

significativa de 37% na taxa de perdas dentárias, ocorridas no ano subsequente ao período de

três anos de uso da droga. Qualquer uso de estatinas durante os primeiros três anos após o

exame periodontal inicial foi associado a uma significativa redução de 48% na taxa de perdas

dentárias observadas nos anos subsequentes de avaliação.

Através de um estudo retrospectivo com 97 pacientes em tratamento no Centro de

Saúde de Helsink, Lindy et al. (2008) verificaram que os pacientes em uso de estatinas

apresentaram um número 37% menor de bolsas periodontais patológicas do que aqueles que

não foram submetidos a nenhum tratamento. Os autores observaram ainda que os menores

sinais de injúria inflamatória periodontal foram verificados de maneira semelhante nos

pacientes que usaram sinvastatina ou atorvastatina.

Um estudo piloto controlado mostrou os efeitos do tratamento sistêmico com





Pradeep e Thorat (2010) investigaram a efetividade de um gel de liberação

controlada biodegradável contendo 1,2 mg de sinvastatina, como adjunto ao tratamento de

raspagem e alisamento radiculares no tratamento de pacientes com periodontite crônica. Os

pacientes que usaram a droga toleraram bem o gel e apresentaram maiores reduções no índice

gengival, na profundidade de bolsa à sondagem e no número de sítios com sangramento à

sondagem. Além disso, os locais tratados com sinvastatina também mostraram maior ganho

de inserção após 6 meses, em comparação aos sítios não tratados com a droga.

62


Os mesmos resultados do estudo citado anteriormente foram verificados por

Pradeep et al. (2013), ao tratarem pacientes com diabetes tipo II utilizando a mesma

metodologia descrita em 2010. Os autores verificaram que no grupo que recebeu o gel de

sinvastatina houve maior preenchimento dos defeitos intra-ósseos após 9 meses de tratamento,

em comparação com o grupo que recebeu apenas raspagem e alisamento radiculares.

Um recente estudo de Subramanian et al. (2013), envolvendo 83 indivíduos com

fatores de risco para aterosclerose ou com aterosclerose estabelecida, investigou o efeito de

baixas (10 mg) e altas (80 mg) de atorvastatina nos níveis de inflamação arterial e de perda

óssea periodontal. Os graus de inflamação foram avaliados através de tomografia por emissão

de pósitrons e por tomografia computadorizada no início do estudo e após 4 e 12 meses da

terapia com a estatina. Verificou-se que a atorvastatina em altas doses reduziu o processo

inflamatório periodontal, e que esse efeito se correlacionou com as mudanças observadas na

inflamação da carótica. Os autores aventaram a possibilidade de que uma parte do impacto

benéfico das estatinas na aterosclerose poderia ser devido a reduções nos quadros de

inflamação extra-arteriais.

Embora as pesquisas citadas nessa revisão mostrem o potencial antiinflamatório e

antirreabsorção óssea das estatinas, indicando um possível benefício do uso dessas drogas na

doença periodontal, mais estudos são necessários a fim de se verificar os efeitos das estatinas

nas complexas características das periodontites. De especial interesse é a elucidação dos

mecanismos de ação pelo qual essas substâncias estariam agindo na inflamação periodontal e

nos processos de reabsorção óssea próprios da doença, e a busca pelas vias e mediadores

envolvidos na prevenção da destruição do periodonto.

Dentre os modelos animais utilizados para verificar a ação de determinados

tratamentos na doença periodontal, o modelo de periodontite induzida em ratos pela ligadura

com fio de náilon tem se mostrado extremamente útil em esclarecer os efeitos de drogas e os

mecanismos envolvidos na inibição da progressão dessa doença, tendo sido, por esse motivo,

o modelo de escolha do presente estudo.

63

3 OBJETIVOS

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

O presente estudo tem como objetivo verificar o efeito da sinvastatina nos

parâmetros clínicos, histológicos e bioquímicos da doença periodontal induzida em ratos, bem

como elucidar os possíveis mecanismos pelos quais a estatina acima mencionada estaria

atuando na doença.

3.2 Objetivos específicos

• Verificar a ação dessas drogas sobre a perda óssea induzida pela doença

periodontal através da análise macroscópica e microscópica do periodonto.

• Sugerir possíveis mecanismos de ação para a sinvastatina, através do estudo

do seu efeito na infiltração neutrofílica, na expressão de citocinas, nas dosagens de

marcadores hepáticos e ósseos, bem como seu efeito sobre as vias do óxido nítrico, sobre a

formação de radicais livres e em alguns parâmetros relacionados ao metabolismo ósseo.

64

4 MATERIAL E MÉTODOS


4.1 Animais

Foram utilizadas aproximadamente 200 ratas Wistar (Rattus novergicus) fêmeas,

com massa corpórea entre 180 e 220 gramas, provenientes do Biotério Central do Campus do

Pici - UFC e transferidas para o Biotério Setorial do Departamento de Fisiologia e

Farmacologia da Faculdade de Medicina - UFC. Os animais foram mantidos em gaiolas

apropriadas, em número de 6 animais por gaiola, num ambiente com temperatura de 22 ± 2oC

e ciclo de 12h luz/12h escuro. Todos receberam água e alimentação ad libitum e

permaneceram nas mesmas condições ambientais durante os experimentos.

Os protocolos experimentais estão de acordo com os Princípios Éticos na

Experimentação Animal adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal

(COBEA). O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA) da

Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará (UFC) através do protocolo nº

23/09.

4.2 Indução da doença periodontal experimental

Os animais foram anestesiados com cetamina (50 mg/Kg) + xilazina (5 mg/Kg),

ambas da Virbac, por via intraperitoneal (i.p.). A Doença Periodontal Experimental (DPE) foi

induzida através da inserção cirúrgica de um fio de sutura de náilon (3.0) (Plast Suture) ao

redor do segundo molar superior esquerdo. Previamente à passagem do fio, utilizou-se uma

guia (Ethibond Excel®, Ethicon) nos espaços interproximais mesial e distal do dente

supracitado, a fim de facilitar a colocação do fio. Este foi adaptado de modo que o nó

cirúrgico ficasse voltado para a face vestibular da boca do animal. Após 11 dias, sacrificou-se

o animal através de deslocamento cervical, sendo tal procedimento precedido por anestesia

em câmara de éter etílico.

O dia escolhido para o sacrifício foi o 11º dia de experimento, o qual foi baseado

em estudos prévios realizados no LAFICA, que constataram destruição total do processo

alveolar e destruição importante do cemento após 11 dias da colocação da ligadura (LIMA et

al., 2000; MENEZES et al., 2005).

65


4.3 Grupos experimentais

4.3.1 Grupo naïve

Esse grupo foi constituído por 6 animais (para cada parâmetro avaliado), que não

foram submetidos à Doença Periodontal Experimental (DPE) e que também não receberam a

administração de qualquer droga, a fim de verificar a existência de alguma alteração nos

parâmetros analisados entre os grupos.

4.3.2 Grupo com doença periodontal experimental (controle ou salina)

Esse grupo foi constituído por 6 animais (para cada parâmetro avaliado),

submetidos à doença periodontal experimental. Os animais receberam solução salina a 0,9%

(via oral, 5 mL/kg) por gavagem, 30 minutos antes e diariamente após a cirurgia até o 11 dia,

quando foram, então, sacrificados.

4.3.3 Grupos tratados com estatina

Esse grupo foi constituído por 6 animais (para cada dose e cada parâmetro

avaliado) que receberam sinvastatina (Clinfar®, Merck Sharp & Dohme) nas doses de 3, 10 e

30 mg/kg, administradas por via oral (gavagem), 30 minutos antes e diariamente após a

cirurgia até o 11° dia, quando ocorreu o sacrifício.

4.4 Determinações séricas das enzimas hepáticas

A função hepática dos animais foi acompanhada através da determinação da

atividade das enzimas hepáticas aspartato transaminase (AST), também chamada de

aminotransferase glutâmica oxalacética sérica (SGOT ou TGO) ou aspartato aminotransferase

(ASAT) e alanina transaminase (ALT), também chamada transaminase glutâmica pirúvica

sérica (SGPT ou TGP) ou alanina aminotransferase (ALAT), no plasma dos animais. Foi

realizada também a determinação sérica de fosfatase alcalina total (FAL ou FAT), como

marcador de neoformação óssea.

Para tal, amostras de sangue foram coletadas do plexo orbital de ratas

anestesiadas, antes da indução da periodontite e no 11º dia (dia do sacrifício). O sangue foi

66


centrifugado (Centrifuge 5804R, Eppendorf™) a 1800 X g, por 10 min, e o sobrenadante

armazenado a -70ºC até a análise bioquímica. As amostras foram utilizadas para a dosagem de

AST, ALT e FAT no soro dos animais, utilizando-se um “kit” específico, cuja metodologia

foi seguida conforme orientação do laboratório fabricante (LABTEST®).

4.5 Análise da estrutura óssea alveolar

Para o estudo da estrutura óssea alveolar das maxilas submetidas à doença

periodontal experimental, foram realizadas as análises morfométrica e histopatológica

(microscopia de luz e microscopia confocal). As hemiarcadas contralaterais, ou seja, sem

doença periodontal, foram utilizadas como controle.

4.5.1 Estudo morfométrico do tecido ósseo

Os animais foram sacrificados no 11º dia após o procedimento cirúrgico. Suas

maxilas foram removidas e fixadas no formol tamponado a 10%, durante 24 horas. Após esse

período, as maxilas foram separadas em duas hemiarcadas (direita e esquerda), dissecadas e

coradas com azul de metileno a 1%, a fim de distinguir o tecido ósseo dos dentes, os quais se

coram com menos intensidade. Para a quantificação da reabsorção óssea, as duas hemiarcadas

foram acomodadas com cera utilidade em lâminas de vidro e fotografadas com distância focal

padronizada para todos os espécimes (câmera Nikon©, lente Nikor 105 mm).

As imagens digitais obtidas foram submetidas à análise pelo software ImageJ®.

Para tal, calculou-se inicialmente uma área correspondente aos dentes e à perda óssea alveolar

das hemiarcadas com DPE, que foi subtraída da área correspondente aos dentes na

hemiarcada contralateral, para obtenção da área real da perda óssea alveolar de cada rato. Essa

área foi calculada inicialmente em pixels, que foram posteriormente convertidos em mm2 pelo

uso de um padrão de milímetros fixado ao lado das maxilas.

4.5.2 Análise histopatológica por microscopia óptica

As análises histopatológicas foram realizadas em cortes seriados da hemiarcada.

Decorridos 11 dias após o procedimento cirúrgico (colocação do fio de náilon), os animais

foram sacrificados e suas hemiarcadas, removidas. Estas foram fixadas em formol tamponado

a 10% durante 24 horas, sendo, posteriormente, submetidas a tratamento com ácido

67


etilenodiamino tetra-acético (EDTA) a 10% por aproximadamente 30 dias, para a adequada

desmineralização dos espécimes. A seguir, as hemiarcadas foram suspensas em sulfato de

sódio a 5% por 24 horas, e, então, incluídas em parafina. Após este procedimento, foram

feitos cortes seriados de 5 m em micrótomo apropriado (Olympus) e as lâminas obtidas

foram coradas pelos métodos hematoxilina-eosina (HE) e Tricrômico de Mallory.

Para a análise microscópica da hemiarcada com a coloração HE, foi considerada a

região entre os 1º e 2º molares, sendo avaliados os aspectos inflamatórios como

presença/intensidade de infiltrado celular, além do estado de preservação do processo alveolar

e cemento. Tais achados foram classificados de acordo com os escores padronizados no

Laboratório da Farmacologia da Inflamação e do Câncer – LAFICA (LEITÃO et al., 2005),

citados no quadro a seguir:

Escore 0: Ausência ou somente discreta infiltração celular (infiltração de células

inflamatórias esparsas e restrita à região da margem gengival);

Processo alveolar e cemento preservados.

Escore 1: Infiltrado celular moderado (infiltração celular inflamatória sobre toda a

gengiva inserida);

Pequena reabsorção do processo alveolar;

Cemento preservado.

Escore 2: Infiltrado celular acentuado (infiltração celular inflamatória na gengiva e no

ligamento periodontal);

Degradação acentuada do processo alveolar;

Destruição parcial do cemento.

Escore 3: Infiltrado inflmatório acentuado;

Completa reabsorção do processo alveolar;

Destruição severa do cemento.

Quadro 2 – Escores utilizados para avaliação histopatológica de maxilas murinas submetidas à doença

periodontal experimental.

Para análise microscópica da hemiarcada pela coloração Tricrômico de Mallory,

também foi considerada a região entre os 1º e 2º molares, sendo avaliados os feixes de fibras

colágenas de forma qualitativa, isto é, sua direção, continuidade e densidade.

68


4.5.3 Análise histopatológica por microscopia confocal

Os espécimes, preparados de acordo com a descrição prévia, foram colocados em

lâminas de vidro e cobertos com meio próprio para análise em um microscópio confocal

equipado com laser de argônio/criptônio (Olympus FV1000, Olympus). A área analisada

correspondeu à região entre os 1º e 2º molares, onde a ligadura foi colocada. As secções

foram avaliadas com relação ao seu conteúdo de colágeno, graças à autofluorescência dessa

substância. A análise foi efetuada a partir da obtenção dos histogramas das imagens referentes

aos grupos salina e sinvastatina 30 mg/kg.

4.6 Determinação de mieloperoxidase

A mieloperoxidase (MPO) é uma enzima presente nos grânulos azurófilos dos

neutrófilos e tem sido utilizada, portanto, como marcador quantitativo da infiltração de

neutrófilos nos processos inflamatórios em vários tecidos. Na doença periodontal

experimental, a análise de mieloperoxidade é obtida durante a fase aguda do processo

inflamatório, seis horas após a colocação da ligadura.

A medida da atividade da MPO foi realizada na gengiva vestibular correspondente

à região de molares superiores dos animais, usando uma versão modificada do método

colorimétrico descrito por Bradley e colaboradores (BRADLEY et al., 1982). Na 6ª hora, os

animais foram sacrificados e suas gengivas foram removidas, pesadas e congeladas em freezer

-70ºC até a realização do ensaio. Durante a determinação, as amostras foram incubadas em

solução de HTAB 0,5% (brometo de hexadecilmetilamônio) na proporção de 15 mg de tecido

por 400 L de tampão. Em seguida, os espécimes foram homogeneizados e centrifugados

(1500 X g por 15min), sob condições adequadas de refrigeração (4ºC). Os sobrenadantes

foram transferidos para eppendorfs e novamente centrifugados (10 min) para a melhor

remoção dos contaminantes. Após plaqueamento de 7 µL do sobrenadante em placas de 96

poços, em duplicata, 200µL da solução de leitura (5 mg de O-dianisidine, 15 µL H2O2 1%, 3

mL de tampão fosfato de potássio, 27 mL de água destilada) foram adicionados aos poços e

foi realizada a leitura a 460 nM (t0=0 min e t1=1min). A mudança na absorbância foi obtida e

plotada em curva padrão de neutrófilos, e os valores obtidos foram expressos como Unidades

de MPO/mg de tecido.

69


4.7 Dosagem de citocinas

No 11º dia, os animais foram sacrificados e suas gengivas, após serem removidas,

foram congeladas em freezer a 70ºC negativos até a realização do ensaio. O tecido coletado

foi homogeneizado em tampão para citocinas como descrito por Safieh-Garabedian et al.

(1995). A detecção das citocinas IL-1, TNF-α e IL-10 foi determinada por ELISA, usando o

Kit DuoSet (R&D Systems).

Resumidamente, placas para ELISA de 96 poços foram incubadas por 18h a 4oC

com 100 µL por poço de anticorpo de captura para IL-1, TNF-α e IL-10. Posteriormente, as

placas foram lavadas três vezes com 300 µL de tampão de lavagem e bloqueadas com 100 µL

por poço de BSA 1%. Após bloqueio das placas com BSA 1% por 1 hora, 100 µL das

amostras e da curva padrão foram adicionadas em duplicata a cada poço em várias diluições e

incubadas por 2 horas a 4o C. As placas foram então lavadas três vezes com 300 µl de tampão

de lavagem e depois incubadas com anticorpo de detecção para IL-1, TNF-α e IL-10. Após o

período de incubação a 4o C por 2 horas, as placas foram lavadas novamente por três vezes

com 300 µL de tampão de lavagem e incubadas à temperatura ambiente por 20 minutos com

100 µL de estreptavidina diluída 1:200. As placas foram lavadas novamente por três vezes

com 300 µL de tampão de lavagem, e 100 µL da solução substrato para revelação (Kit

DuoSet, R&D Systems Catalog – DY999) foram adicionados. As placas foram incubadas

durante 20 minutos, no escuro e à temperatura ambiente. A reação enzimática foi parada com

a solução de parada (H2SO4) e a absorbância medida a 450 nm em espectrofotômetro

(Spectronic20, Genesys). O resultado foi expresso em pg/mL.

4.8 Dosagem de glutationa (GSH)

Para a determinação de GSH na gengiva dos ratos submetidos à doença

periodontal experimental por 11 dias foi utilizado o método de Sedlak e Lindsay (1968).

Aproximadamente 30 mg da gengiva da região de molares superiores do lado

esquerdo foram homogeneizados em 300 µL de EDTA 0,02 M gelado. A uma alíquota de 400

μL do homogenato foi adicionado 320 μL de água destilada, mais 80 μL de ácido

tricloroacético a 50%, seguido de agitação e filtração. Foram retirados 200 μL do filtrado e

adicionados 400 μL de tampão Tris 0,4 M (pH 8,9) e 10 μL de DTNB (5,5-ditiobis-2-2 ácido

nitrobenzóico). A absorbância foi determinada dentro de 5 min a 412 nm. A concentração de

GSH foi expressa em μg de GSH/mg de tecido.

70


4.9 Determinação dos níveis de malonildialdeído (MDA)

A concentração de malonildialdeído nos tecidos é utilizada como indicador da

peroxidação lipídica (ANTUNES et al., 2008). Neste estudo, os níveis de malonildialdeído na

gengiva dos animais submetidos à DPE de 11 dias foram determinados pelo método de

Mihara e Uchiyama (1978).

Fragmentos da gengiva com aproximadamente 30 mg da região vestibular de

molares superiores do lado esquerdo foram homogeneizados com KCl gelado 1,15% para

preparar 10% de homogenato. Meio mililitro (0,5 ml) desse homogenato foi pipetado dentro

de um tubo de centrífuga de 10 ml; três ml de H3PO4 (1%) e 1 ml de uma solução aquosa de

ácido tiobarbitúrico aquoso (0,6%) foram acrescentados. Os tubos foram aquecidos por 45

minutos em um banho de água fervendo e a mistura reacional foi então resfriada em um

banho de água gelada, seguida da adição de 4 ml de n-butanol. Os conteúdos foram

misturados por 40 segundos com um misturador vortex, centrifugados a 1200 X g por 10

minutos e a absorbância da camada orgânica foi mensurada a 520 e 535 nm em

espectofotômetro. Os resultados foram expressos em nmol/mg de fragmentos umedecidos.

4.10 Dosagem de nitrito/nitrato

No 11º dia, os animais foram sacrificados e suas mucosas, removidas e

congeladas em freezer a 70ºC negativos até a realização do ensaio. A dosagem de nitrito foi

obtida como um indicador da produção de óxido nítrico, através da determinação do conteúdo

total de nitrito/nitrato (NO2- / NO3

-) na gengiva através da concentração total nas amostras,

determinada espectrofotometricamente pela reação de Griess (CHEN et al., 2000).

Inicialmente, as amostras foram homogeneizadas em 100 L de uma solução

gelada de cloreto de potássio (KCL) a 1,15% (homogenato a 10%). O homogenato foi

centrifugado por 15 minutos a 14.000 rpm. O nível total de NO2- / NO3

- foi determinado como

NO3- das amostras (0,04 mL) convertido em NO2

- pela incubação em uma solução de 0,04 mL

de nitrato redutase, NADPH, KH2PO4 e água destilada “overnight”. Foram utilizadas placas

de 96 poços, adicionando 80 L da amostra experimental em cada poço, em duplicata. Uma

série de diluições da curva-padrão de referência de NO2- (640 M, 320 M, 160 M, 80 M,

40 M, 20 M, 10 M, 5 M, 2.5 M, 1.25 M e 0.625 M) foi preparada. A seguir, foram

adicionados 80 L da solução de Griess (2% de sufanilamida, ácido fosfórico 5%, NED e

71


água destilada) em cada poço. A coloração púrpura/magenta foi medida em leitor de placas

com filtro de 540 nm. Os valores obtidos para as amostras experimentais foram comparados

com os obtidos para curva padrão e expressos em NOx (μM).

4.11 Imunohistoquímica para iNOS, MMP-1/-8, BMP-2, RANK, RANKL e

OPG

A imunohistoquímica para iNOS, MMP-1/-8, BMP-2, RANK, RANKL e OPG foi

realizada utilizando o método de estreptavidina-biotina-peroxidase (HSU; RAINE, 1981). No

11º dia, os animais foram sacrificados e tiveram suas maxilas removidas, fixadas em formol a

10% durante 24 horas, as quais foram, posteriormente, submetidas a tratamento com EDTA a

10% para a desmineralização.

A seguir, as hemiarcadas foram suspensas em sulfato de sódio a 5%, sendo, então,

incluídas em parafina. Após este procedimento, foram feitos cortes seriados de 4m em

micrótomo apropriado e colocados em lâminas de L-polilisina, apropriadas para a realização

de imunohistoquímica. Os cortes foram desparafinizados, hidratados em xilol e álcool e

imersos em tampão citrato 0,1 M (pH 6,0), sob aquecimento em forno de microondas, por 15

minutos para a recuperação antigênica. Após o resfriamento, obtido em temperatura ambiente

durante 20 minutos, foram feitas lavagens com solução tamponada de fosfato (PBS),

intercaladas com o bloqueio da peroxidase endógena com solução de H2O2 a 3% (15

minutos). Os cortes foram incubados “overnight” (4ºC) com os anticorpos policlonais

primários de coelho anti-iNOS, anti-MMP-1/-8, anti-BMP-2, anti-RANK, anti-RANKL ou

anti-OPG (Santa Cruz Biotechnology®), todos diluídos na proporção de 1:200, em albumina

sérica bovina a 5% (PBS-BSA).

Após a lavagem do dia seguinte, foi feita a incubação com o anticorpo secundário

(de detecção) biotinilado anti-IgG de coelho, diluído 1:200 em PBS-BSA, por 30 minutos.

Depois de lavados, os cortes foram incubados com o complexo estrepto-avidina peroxidase

conjugada (ABC staining system, Santa Cruz Biotechnology®) por 30 minutos. Após nova

lavagem com PBS, seguiu-se coloração com o cromógeno 3,3’diaminobenzidine-peróxido

(DAB), seguida por contra-coloração com hematoxilina de Mayer. Por fim, realizou-se a

desidratação das amostras e montagem das lâminas. Controles negativos foram processados

simultaneamente como descrito acima, sendo que o anticorpo primário foi substituído por

PBS-BSA 5%.

72


4.12 Imunofluorescência para RANKL

De maneira semelhante ao que foi feito na técnica de imunohistoquímica, a

imunofluorescência indireta para RANKL foi realizada em cortes de maxila montados em

lâminas de L-polilisina, usando para tal um anticorpo secundário marcado com isotiocianato

de fluoresceína (FITC, Santa Cruz Biotechnology®). A técnica seguiu o mesmo protocolo

descrito anteriormente, sendo que, após a desidratação das amostras, os espécimes foram

cobertos com meio próprio para análise em microscópio confocal (Olympus FV1000,

Olympus).

4.13 Western blot para a fração p50 do NFκ-B

Western blots foram realizados a partir do tecido gengival da região vestibular dos

molares superiores, para análise da expressão da fração dissociada p50 (NLS) do NFκ-B. Para

tal, após 11 dias de experimento, os animais foram sacrificados e as gengivas, retiradas,

imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas em freezer (-80ºC).

Os espécimes descongelados foram colocados em criotubos contendo tampão de

lise e triturados com um homogeneizador (Turrax®). Após a trituração, os homogenatos foram

transferidos para tubos de ensaio com inibidores de protease e centrifugados a 14.000 rpm. O

sobrenadante foi quantificado para proteína (usando o método de Pierce - BCA), a fim de se

padronizar a quantidade de proteína a ser colocada nos poços (50 μg). As amostras foram

colocadas para correr num gel de desnaturação de poliacrilamida (Sistema mini-gel, da

Biorad, Hercules), e, após isso, o gel foi transferido durante a noite para membranas de

nitrocelulose. As membranas de nitrocelulose foram, então, incubadas com anticorpo primário

de coelho anti-p50 (NLS) (Santa Cruz Biotechnology) por 90 min (em temperatura ambiente)

e depois lavadas por três vezes num tampão de lavagem para, em seguida, serem incubadas

com um anticorpo secundário biotinilado e lavadas como descrito acima. Cada membrana foi

lavada e exposta em câmara escura a um filme Kodak X-Omat AR. Os filmes de raio-X

foram, então, escaneados, para a realização da análise densitométrica das bandas utilizando o

programa ImageJ. Os resultados foram expressos em porcentagem de proteína em relação ao

controle salina.

73


4.14 Análise estatística

Os resultados foram expressos como média erro padrão. Para verificar a

existência de diferenças entre os grupos foram utilizados os testes de Análise de Variância

(ANOVA) one way e two way e o teste de Bonferroni.

Nas análises histopatológicas, os dados obtidos foram expressos como mediana e

o teste estatístico aplicado foi o de Kruskal-Wallis seguido do teste de Dunns para dados não-

paramétricos. Em todas as situações, foi adotado o nível de significância p<0,05.

74

5 RESULTADOS

5 RESULTADOS

5.1 Perda óssea alveolar

O estudo morfológico das maxilas das ratas mostrou que a indução da DPE nos

animais que receberam apenas salina resultou em reabsorção óssea significativa em relação

aos animais sem DPE. Observou-se que o tratamento com sinvastatina nas doses de 10 e 30

mg/kg inibiu significativamente a perda óssea alveolar, quando comparado ao grupo controle

(p < 0,05). Não houve diferença significativa entre os grupos controle e a dose de 3 mg/kg,

bem como entre os grupos que receberam as doses de 10 e 30 mg/kg (gráfico 1).

A redução na reabsorção óssea na face vestibular das maxilas em foi de 48,72%

para o grupo da sinvastatina 30 mg/kg e de 27,36% para o grupo 10 mg/kg, quando

comparados ao grupo salina.

Gráfico 1 - Efeito da sinvastatina na perda óssea alveolar resultante da doença periodontal experimental em ratos

(n=15). Observou-se que a sinvastatina, nas doses de 10 e 30 mg/kg reduziu significantemente a área de perda

óssea. Os resultados estão expressos como média da área de perda óssea alveolar ± erro padrão. *P < 0,05, em

relação ao controle salina (ANOVA one way seguida de Bonferroni).

*

*

Salina 3 mg/kg 10 mg/kg 30 mg/kg0

1

2

3

4

5

Sinvastatina

Perd

a ó

ssea a

lveo

lar

(mm

2)

75

5 RESULTADOS

A figura 8 (A, B e C) mostra espécimes (hemimaxilas) representativos do grupo

naïve (A), controle (B) e do grupo tratado com sinvastatina 30 mg/kg (B). Observou-se, a

partir da comparação macroscópica das hemiarcadas dos animais submetidos à doença

periodontal experimental (8B) com as hemiarcadas contra-laterais (8A), que a permanência do

fio de náilon foi capaz de induzir a doença periodontal experimentalmente, de forma a

reproduzir os principais sinais clínicos da periodontite em humanos, tais como: reabsorção

óssea alveolar e exposição de raízes.

A figura 8C evidencia a redução da perda óssea no grupo de animais submetidos à

DPE e tratados com sinvastatina 30 mg/kg, em relação ao grupo de animais com DPE que

receberam apenas salina.

5.2 Análise histopatológica por microscopia óptica

A análise histológica da região entre o primeiro e o segundo molar superior do

grupo com doença periodontal (hemi-maxila esquerda) mostrou intenso infiltrado inflamatório

com destruição do cemento e do osso alveolar, evidenciado pela mediana dos escores

atribuída a esse grupo (mediana 3). Em relação ao grupo salina, a mediana dos escores do

grupo ao qual foi administrada sinvastatina na dose de 30 mg/kg foi significativamente menor

(mediana 1); nesse grupo verificou-se uma redução do infiltrado inflamatório e a preservação

do osso alveolar e do cemento. Estes resultados estão expressos na tabela 1.

Tabela 1 - Análise histológica das maxilas de ratos submetidos à periodontite experimental (n=8). As regiões

entre o 1º e o 2º molares foram consideradas para análise da presença de infiltrado celular inflamatório e da

preservação do processo alveolar e cemento. Os resultados estão expressos como valores de mediana e variação.

*P < 0,05, em relação ao controle salina (Kruskal-Wallis seguido de Dunns).

Grupos Escores (valores de mediana e variação)

Salina 3,0 (2-3)

Sinvastatina 3 mg/kg 2,5 (0-3)

Sinvastatina 10 mg/kg 1,5 (0-3)

Sinvastatina 30 mg/kg 1,0 (0-2)*

76

5 RESULTADOS

As características descritas anteriormente estão evidenciadas na figura 8 (D, E e

F), na qual estão representados três cortes histológicos corados em Tricrômico de Mallory,

representativos do grupo naïve (D), salina (E) e do grupo sinvastatina 30 mg/kg (F). A análise

da região entre o 1º e 2º molares dos animais submetidos à DPE e que receberam salina

mostrou presença de infiltrado celular inflamatório acentuado, reabsorção do processo

alveolar e destruição parcial do cemento (figura 8E). Os espécimes referentes ao grupo que

recebeu sinvastatina na dose de 30 mg/kg apresentaram discreto infiltrado celular inflamatório

e preservação do processo alveolar e do cemento radicular (Figura 8F).

Além disso, a coloração pelo Tricrômico de Mallory permitiu ainda observar a

desorganização das fibras colágenas no periodonto dos animais submetidos à DPE e tratados

com salina (figura 8E) quando comparados aos animais pertencentes ao grupo naïve (figura

8D). Sinvastatina na dose de 30 mg/kg (figura 8F) preveniu a desorganização das fibras

colágenas e manteve as características do ligamento periodontal.

5.3 Análise por microscopia confocal a laser

A análise histológica das hemimaxilas por microscopia confocal está representada

na figura 8 (G, H e I). Conforme foi observado na análise histológica por microscopia óptica,

a microscopia confocal, valendo-se das características de auto-fluorescência das estruturas

ricas em colágeno, também mostrou perda do cemento e do osso alveolar e completa

desorganização das fibras do ligamento periodontal no grupo salina (figura 8H), quando

comparado com o grupo naïve (figura 8G). A figura 8I evidencia a preservação dos tecidos

periodontais encontrada nos animais tratados com sinvastatina 30 mg/kg, bem como uma

maior organização das fibras colágenas.

A menor fluorescência das imagens relativas ao grupo salina foi demonstrada

através da confecção do histograma (figura 9) correspondente à área marcada em vermelho na

figura 9B. O histograma mostra a freqüência e a intensidade da fluorescência na área

selecionada do espécime (grade vermelha). No caso do grupo salina, o histograma mostra uma

alta freqüência de intensidades baixas de fluorescência, sugerindo uma menor quantidade do

colágeno na região selecionada (figura 9E). No grupo de animais tratados com sinvastatina na

dose de 30 mg/kg, o histograma mostrou intensidades maiores de fluorescência (figura 9F),

corroborando os dados encontrados na coloração por Mallory, em que se observou maior

organização das fibras colágenas nos espécimes do grupo sinvastatina 30 mg/kg.

77

5 RESULTADOS

Figura 8 – Aspectos macro e microscópico do periodonto dos ratos submetidos à doença periodontal

experimental e tratados com salina ou sinvastatina. A. Hemi-maxila direita - naïve; B. Hemi-maxila esquerda,

correspondente ao grupo salina; observa-se severa reabsorção óssea com exposição das superfícies radiculares;

C. Hemi-maxila esquerda correspondente ao grupo tratado com sinvastatina 30mg/kg; há considerável redução

da perda óssea alveolar. D. Fotomicrografia correspondente ao grupo naïve, mostrando a região entre o primeiro

e o segundo molares e a normalidade da gengiva (g), cemento (c), ligamento periodontal (lp) e processo alveolar

(pa); E. Fotomicrografia correspondente ao grupo salina, onde se evidenciam um intenso infiltrado celular

inflamatório (ici), reabsorção do cemento (setas) e total destruição do processo alveolar; F. Fotomicrografia

correspondente ao grupo tratado com sinvastatina 30 mg/kg, mostrando preservação das fibras do ligamento

periodontal, manutenção do cemento, da dentina e do processo alveolar (setas). Aumento original: 100X. G.

Fotomicrografia correspondente ao grupo naïve; H. Fotomicrografia correspondente ao grupo salina, onde se

evidenciam a perda e desorganização das fibras de colágeno (lp), com a formação de crateras na região de

cemento (setas) e destruição do osso alveolar; I. Fotomicrografia correspondente ao grupo tratado com

sinvastatina a 30 mg/kg, mostrando preservação das fibras do ligamento periodontal, manutenção do cemento

(c), da dentina (d) e do processo alveolar (pa). Aumento original: 400X.

A B C D

78

5 RESULTADOS

Figura 9 - Microscopia confocal do periodonto de ratos submetidos à doença periodontal experimental e tratados

com salina ou sinvastatina. A, B e C. Fotomicrografias relativas aos grupos naïve (A), salina (B) e sinvastatina

30 mg/kg (C); D. Histograma representativo da área (grade vermelha) mostrada na fotomicrografia A,

evidenciando alta intensidade de auto-fluorescência das fibras colágenas; E. Histograma representativo da área

mostrada na fotomicrografia B, evidenciando baixa intensidade de auto-fluorescência das fibras colágenas; F.

Histograma representativo da área mostrada na fotomicrografia C, no qual se observa um aumento na freqüência

de intensidades maiores de auto-fluorescência. Aumento original: 400X.

79

5 RESULTADOS

5.4 Determinação de mieloperoxidase

A MPO é uma enzima que está presente nos grânulos azurófilos dos neutrófilos e

pode ser considerada um indicador do acúmulo de neutrófilos no tecido (BRADLEY et al.,

1982). Houve um aumento significativo (p < 0,05) da atividade da MPO na 6ª hora após a

indução da DPE no grupo salina, quando comparado ao grupo naïve. O tratamento com

sinvastatina reduziu, de forma dose-dependente, a atividade da enzima mieloperoxidase na

gengiva vestibular dos ratos, quando comparado ao grupo controle, que recebeu somente

salina. A redução foi significativa para as duas doses mais altas do fármaco. Não houve

diferença entre as doses de 10 e 30 mg/kg.

Os dados referentes à avaliação da atividade da enzima mieloperoxidade estão

expressos no gráfico abaixo (gráfico 2).

Gráfico 2. Atividade da enzima mieloperoxidase na gengiva vestibular de ratos submetidos à periodontite

experimental, tratados com salina ou sinvastatina (n=12). Sinvastatina (3, 10 e 30 mg/kg) foi administrada por

via oral 30 minutos antes da indução da DPE. Os animais foram sacrificados seis horas após o procedimento

cirúrgico. Observou-se que a sinvastatina, nas doses de 10 e 30 mg/kg reduziu significantemente a atividade da

enzima. Os resultados estão expressos como média ± erro-padrão. *P < 0,05, em relação ao controle salina

(ANOVA one way seguida de Bonferroni).

*

*

Naive Salina 3 mg/kg 10 mg/kg30 mg/kg0

10

20

30

40

50

Sinvastatina

MP

O (

U/m

g)

80

5 RESULTADOS

5.5 Dosagem de citocinas

Nos gráficos que se seguem estão representados os dados das dosagens de IL-1,

TNF-α e IL-10, nas gengivas dos ratos naïve e daqueles submetidos à doença periodontal

experimental.

Os animais que foram submetidos à DPE e que receberam apenas salina

apresentaram aumento da quantidade de IL-1β (p < 0,05) no tecido gengival quando

comparados aos animais normais, sem a doença. O tratamento com sinvastatina nas doses de

10 e 30 mg/kg inibiu significativamente a formação de interleucina-1 nas gengivas de ratos

submetidos à doença periodontal experimental, quando comparado com o controle (salina).

Não houve diferença entre as duas concentrações da droga (10 e 30 mg/kg), nem entre esses

grupos e o grupo que não recebeu a cirurgia (naïve) (gráfico 3).

Gráfico 3 - Concentração de interleucina-1 na gengiva de ratos submetidos à doença periodontal experimental,

tratados com salina ou sinvastatina (n=10). Observou-se que a sinvastatina, nas doses de 10 e 30 mg/kg reduziu

significantemente os níveis de IL-1β na gengiva dos animais. Os resultados estão expressos como média ± erro-

padrão. *P < 0,05, em relação ao controle salina (ANOVA one way seguida de Bonferroni).

*

*

Naive Salina 3 mg/kg 10 mg/kg 30 mg/kg0

500

1000

1500

2000

2500

Simvastatin

IL-1

(p

g/m

L)

Sinvastatina

81

5 RESULTADOS

No grupo de animais submetidos à DPE e que receberam apenas salina, observou-

se um aumento significativo (p < 0,05) na quantidade de TNF-α nos tecidos gengivais quando

comparados ao grupo naïve. O tratamento com sinvastatina nas doses de 10 e 30 mg/kg inibiu

significativamente a formação de TNF-α nas gengivas de ratos submetidos à doença

periodontal experimental, quando comparado com o controle (salina). Não houve diferença

entre as duas maiores concentrações da droga, nem entre os grupos de 10 e 30 mg/kg e o

grupo que não recebeu a cirurgia (naïve) (gráfico 4).

Gráfico 4 - Concentração do fator de necrose tumoral-α na gengiva de ratos submetidos à doença periodontal

experimental, tratados com salina ou sinvastatina (n=10). Observou-se que a sinvastatina, nas doses de 10 e 30

mg/kg reduziu significantemente os níveis de TNF-α na gengiva dos animais. Os resultados estão expressos

como média ± erro-padrão. *P < 0,05, em relação ao controle salina (ANOVA one way seguida de Bonferroni).

Com relação à citocina IL-10, os resultados demonstraram aumento da expressão

dessa substância na gengiva dos ratos submetidos à doença periodontal experimental em

relação aos ratos não doentes (naïve). Esse aumento foi significativamente mais pronunciado

no grupo que recebeu sinvastatina na dose de 30 mg/kg (gráfico 5).

**

Naive Salina 3 mg/kg 10 mg/kg30 mg/kg0

1000

2000

3000

Sinvastatina

TN

F-

(p

g/m

L)

82

5 RESULTADOS

Gráfico 5 - Concentração de interleucina-10 na gengiva de ratos submetidos à doença periodontal experimental,

tratados com salina ou sinvastatina (n=10). Observou-se que a sinvastatina, na dose de 30 mg/kg, aumentou

significantemente os níveis de IL-10 na gengiva dos animais. Os resultados estão expressos como média ± erro-


5.6 Determinação de GSH E MDA

A fim de se verificar o potencial antioxidante da sinvastatina, foram feitas as

dosagens de GSH e MDA na gengiva dos ratos submetidos à DPE.

O gráfico a seguir (gráfico 6) mostra que as doses de 10 e 30 mg/kg de

sinvastatina foram capazes de reduzir significativamente o consumo de glutationa provocado

pelo processo inflamatório, como pôde ser observado no grupo submetido à DPE que recebeu

apenas a solução salina. Quando os níveis de glutationa dos grupos de 10 e 30 mg/kg foram

comparados com os valores de GSH no tecido normal (sem doença), não foi verificada

nenhuma diferença estatística.

*


500

1000

1500

Sinvastatina

IL-1

0 (

pg

/mL

)

83

5 RESULTADOS

Gráfico 6 - Concentração de glutationa na gengiva de ratos submetidos à doença periodontal experimental,

tratados com salina ou sinvastatina (n=6). Observou-se que a sinvastatina, nas doses de 10 e 30 mg/kg, aumentou

significantemente os níveis de GSH na gengiva dos animais. Os resultados estão expressos como média ± erro-


Com relação aos resultados observados para a dosagem de MDA, demonstramos

que, nos grupos de animais com DPE e tratados com salina, houve um aumento significativo

dos níveis dessa substância (p < 0,05) em relação ao grupo naïve. O gráfico 7 demonstra que a

dose de 30 mg/kg de sinvastatina reduziu significativamente os níveis de MDA no tecido

gengival, que estavam aumentados pelo processo inflamatório, como pôde ser observado pela

comparação com o grupo salina. Os níveis de MDA relativos à maior dose não diferiram

significativamente do grupo não operado (naïve).

*


50

100

150

200

250*

Sinvastatina

GS

H (

mm

ol/

g)

84

5 RESULTADOS

Gráfico 7 - Concentração de malonildialdeído na gengiva de ratos submetidos à doença periodontal

experimental, tratados com salina ou sinvastatina (n=6). Observou-se que a sinvastatina, na dose de 30 mg/kg,

reduziu significantemente os níveis de MDA na gengiva dos animais. Os resultados estão expressos como média

± erro-padrão. *P < 0,05, em relação ao controle salina (ANOVA one way seguida de Bonferroni).

5.7 Determinação dos níveis de nitrito/nitrato

No gráfico que se segue (gráfico 8), estão apresentados os resultados referentes à

dosagem de nitrito/nitrato na gengiva dos ratos submetidos à doença periodontal

experimental.

Nosso dados demonstram que a dose de 30 mg/kg de sinvastatina reduziu

significativamente os níveis de nitrito/nitrato no tecido gengival, que estavam aumentados

pelo processo inflamatório, como pôde ser observado pela comparação com o grupo salina.

Os níveis de NOx relativos à maior dose não diferiram significativamente do grupo não

operado (naïve).

*


10

20

30

40

50

60

70

80

Sinvastatina

MD

A (

mm

ol/

g)

85

5 RESULTADOS

Gráfico 8 - Concentração de nitrito/nitrato na gengiva de ratos submetidos à doença periodontal experimental,

tratados com sinvastatina (n=6). A sinvastatina (3, 10 e 30 mg/kg) foi administrada por via oral 30 minutos antes

e diariamente após a indução da DPE. A DPE foi induzida através da inserção cirúrgica de um fio de náilon em

torno dos segundos molares superiores esquerdos das ratas. Os animais foram sacrificados 11 dias após o

procedimento cirúrgico. Observou-se que a sinvastatina, na dose de 30 mg/kg, reduziu significantemente os

níveis de NOx na gengiva dos animais. Os resultados estão expressos como média ± erro-padrão. *P < 0,05, em

relação ao controle salina (ANOVA one way seguida de Bonferroni).

*


50

100

150

Sinvastatina

NO

X (

M)

86

5 RESULTADOS

5.8 Análise dos tecidos por imunohistoquímica

As figuras que se seguem mostram a expressão das enzimas iNOS e MMP-1/8

(figura 10), bem como das proteínas BMP-2 (figura 11), RANK (figura 11), RANKL (figura

12) e OPG (figura 12) nos tecidos periodontais de ratos submetidos à doença periodontal

experimental por 11 dias.

5.8.1. Imunohistoquímica para MMP-1/-8 e iNOS

A figura 10 mostra um aumento da expressão de iNOS e MMP-1/-8 na gengiva de

ratos submetidos à doença periodontal experimental (figura 10C e 10G, respectivamente), em

comparação ao observado no grupo naïve (figura 10B e 10F, respectivamente). A observação

dos tipos celulares imunomarcados mostra o envolvimento principalmente dos fibroblastos,

dos macrófagos e das células endoteliais. A imunohistoquímica também evidenciou que a

sinvastatina, administrada na dose de 30 mg/kg, foi capaz de reduzir a expressão das enzimas

iNOS e MMP-1/8 na gengiva dos ratos submetidos à DPE (figura 10D e 10H).

87

5 RESULTADOS

Figura 10 – Fotomicrografias mostrando a marcação de iNOS (coluna esquerda) e MMP-1/-8 (coluna direita) nos

tecidos gengivais de ratos submetidos à doença periodontal experimental. A e E representam controles

negativos. A marcação para iNOS foi realizada na gengiva obtida dos grupos naïve (B), salina (C) e sinvastatina

30 mg/kg (D). Células marcadas positivamente são claramente observadas nos tecidos gengivais retirados do

grupo salina, enquanto que poucas células marcadas foram observadas nos espécimes provenientes dos ratos

tratados com sinvastatina 30 mg/kg. As fotomicrografias menores representam uma área com aumento original

de 1000X. O espécime F é representativo da marcação para MMP-1/-8 no grupo naïve, G no grupo salina e H no

grupo tratado com sinvastatina 30mg/kg. De maneira similar ao observado para iNOS, células marcadas

positivamente foram observadas nos tecidos obtidos dos animais do grupo salina (G), enquanto uma menor

marcação foi verificada no grupo sinvastatina 30 mg/kg (H). As fotomicrografias menores representam uma área

com aumento original de 1000X. Aumento original: 400X.

88

5 RESULTADOS

89

5 RESULTADOS

5.8.2. Imunohistoquímica para BMP-2 e RANK

A figura 11 mostra ausência de expressão de BMP-2 na gengiva de ratos

submetidos à doença periodontal experimental (figura 11C), o mesmo tendo sido observado

no grupo naïve (figura 11B). A imunohistoquímica também evidenciou que a sinvastatina,

administrada na dose de 30 mg/kg, foi capaz de aumentar a expressão dessa proteína na

gengiva dos ratos submetidos à DPE (figura 11D).

Por outro lado, a imunohistoquímica para RANK mostrou uma aumento da

expressão do receptor na gengiva de ratos submetidos à doença periodontal experimental

(figura 11G), em comparação ao observado no grupo naïve (figura 11F). Também se observou

que a sinvastatina, administrada na dose de 30 mg/kg, foi capaz de reduzir a expressão de

RANK na gengiva dos ratos submetidos à DPE (figura 11H).

90

5 RESULTADOS

Figura 11 – Fotomicrografias mostrando a marcação de BMP-2 (coluna esquerda) e RANK (coluna direita) nos

tecidos gengivais de ratos submetidos à doença periodontal experimental. A e E representam controles

negativos. A marcação para BMP-2 foi realizada na gengiva obtida dos grupos naïve (B), salina (C) e

sinvastatina 30 mg/kg (D). Células marcadas positivamente são claramente observadas nas hemimaxilas retiradas

do grupo sinvastatina 30 mg/kg, enquanto que nenhuma marcação foi observada nos espécimes provenientes dos

ratos tratados com salina. As fotomicrografias menores representam uma área com aumento original de 1000X.

O espécime F é representativo da marcação para RANK no grupo naïve, G no grupo salina e H no grupo tratado

com sinvastatina 30mg/kg. Células marcadas positivamente foram observadas nos tecidos obtidos dos animais

do grupo salina (G), enquanto uma menor marcação foi verificada no grupo sinvastatina 30 mg/kg (H). As

fotomicrografias menores representam uma área com aumento original de 1000X. Aumento original: 400X.

91

5 RESULTADOS

92

5 RESULTADOS

5.8.3. Imunohistoquímica para OPG e RANKL

A figura 12 mostra ausência de expressão de OPG na gengiva de ratos submetidos

à doença periodontal experimental (figura 12C), e apenas uma discreta marcação nos tecidos

correspondentes ao grupo naïve (figura 12B). A imunohistoquímica também evidenciou que a

sinvastatina, administrada na dose de 30 mg/kg, foi capaz de aumentar a expressão dessa

proteína na gengiva dos ratos submetidos à DPE (figura 12D).

Por outro lado, a imunohistoquímica para RANKL mostrou uma aumento da

expressão do ligante na gengiva de ratos submetidos à doença periodontal experimental

(figura 12G), em comparação ao observado no grupo naïve (figura 12F). Também se observou

que a sinvastatina, administrada na dose de 30 mg/kg, foi capaz de reduzir a expressão de

RANKL na gengiva dos ratos submetidos à DPE (figura 12H).

5.9 Imunofluorescência para RANKL

De maneira semelhante aos resultados observados na análise por

imunohistoquímica, a imunofluorescência dos tecidos periodontais de ratos submetidos à

periodontite experimental (figura 12K) também mostrou a presença de marcação para

RANKL. Adicionalmente, uma menor expressão do ligante foi obervada nos tecidos naïve

(figura 12 J) e no periodonto dos ratos tratados com sinvastatina na dose de 30 mg/kg (figura

12L).

93

5 RESULTADOS

Figura 12 – Fotomicrografias mostrando a marcação de OPG (coluna esquerda) e RANKL (coluna do centro e

coluna direita) nos tecidos gengivais de ratos submetidos à doença periodontal experimental. A, E e I

representam controles negativos. A marcação para OPG foi realizada na gengiva obtida dos grupos naïve (B),

salina (C) e sinvastatina 30 mg/kg (D). Células marcadas positivamente são claramente observadas nas

hemimaxilas retiradas do grupo sinvastatina 30 mg/kg, enquanto que nenhuma marcação foi observada nos

espécimes provenientes dos ratos tratados com salina. As fotomicrografias menores representam uma área com

aumento original de 1000X. O espécime F é representativo da marcação para RANKL no grupo naïve, G no

grupo salina e H no grupo tratado com sinvastatina 30mg/kg. Células marcadas positivamente foram observadas

nos tecidos obtidos dos animais do grupo salina (G), enquanto uma menor marcação foi verificada no grupo

sinvastatina 30 mg/kg (H). As fotomicrografias menores representam uma área com aumento original de 1000X.

Observaram-se resultados semelhantes na marcação por imunofluorescência. Nos espécimes submetidos à DPE

verificou-se claramente marcação para RANKL (K), enquanto que nenhuma marcação foi observada nos tecidos

naïve (J) ou tratados com sinvastatina 30 mg/kg (L). Aumento original: 400X.

94

5 RESULTADOS

95

5 RESULTADOS

5.10 Western blot para NFκ-B

A figura 13 mostra uma representação da análise por Western Blot dos níveis de

NFκ-B no tecido gengival de ratos submetidos à doença periodontal experimental.

Figura 13 – A, Gel representativo da análise por Western Blot dos níveis da fração p50 (NLS) do fator nuclear κ-

B na gengiva de ratos submetidos à doença periodontal experimental por 11 dias (n=9). As bandas dizem

respeito aos grupos naïve (N), controle (C) e sinvastatina 30 mg/kg (S). B, Análise densitométrica das bandas

p50 (NLS), mostrando menor expressão da proteína no grupo tratado com sinvastatina 30 mg/kg. Os resultados

são mostrados como média ± erro-padrão de 3 géis (9 bandas). *P < 0,05 em relação ao controle salina (ANOVA

one way seguida pelo teste de Bonferroni).

A análise densitométrica das bandas mostrou que a indução da doença periodontal

promoveu um aumento na expressão de NFκ-B no tecido gengival. A administração de

sinvastatina na dose de 30 mg/kg, por sua vez, resultou em decréscimo da expressão da

proteína na gengiva dos ratos submetidos à DPE, quando comparada ao controle salina.

N C S N C S

N a ïv e S a lin a 3 0 m g /k g

0 .0

0 .2

0 .4

0 .6

0 .8

1 .0

1 .2

S in v a s ta t in a

% P

ro

teín

a/S

ali

na

*

(A)

(B)

96

5 RESULTADOS

5.11 Dosagem sérica de fosfatase alcalina total

Os dados referentes à determinação da atividade da enzima fosfatase alcalina

(FAT) estão expressos no gráfico 9.

Para o grupo salina, os níveis séricos de fosfatase alcalina ao final do experimento

mantiveram-se em patamares semelhantes aos do início, o que indica que a atividade da

enzima não foi afetada pela doença. Por outro lado, a administração de sinvastatina a 30

mg/kg promoveu uma elevação na concentração de FAT, quando comparamos os valores

referentes ao dia 0 com os níveis ao final do estudo. Ao compararmos os grupos entre si,

verificamos que não houve diferença nos valores iniciais de FAT para nenhum dos grupos

estudados.

Gráfico 9 – Atividade da enzima fosfatase alcalina no plasma de ratos submetidos à doença periodontal

experimental, tratados com salina ou sinvastatina (SNV) (n=10). Os níveis séricos de FAT foram determinados

no dia 0 e no dia 11 do experimento. Observou-se que a sinvastatina, na dose de 30 mg/kg, aumentou

significantemente os níveis séricos de FAT no 11º da indução da DPE. Os resultados estão expressos como

média ± erro-padrão. *P < 0,05, em relação ao grupo sinvastatina 30 mg/kg, dia 0 (ANOVA two way seguida de

Bonferroni).

*

Dia

0

Dia

11

Dia

0

Dia

11

Dia

0

Dia

11

Dia

0

Dia

11

0

20

40

60

80

100

120Salina

Sinv 3 mg/kg

Sinv 10 mg/kg

Sinv 30 mg/kg

FA

T (

U/L

)

Dia

0

Dia

11

Dia

0

Dia

11

Dia

0

Dia

11

Dia

0

Dia

11

0

20

40

60

80

100Salina

SNV 3 mg/kg

SNV 10 mg/kg

SNV 30 mg/kg

AS

T (

U/L

)

97

5 RESULTADOS

5.12 Dosagens séricas de AST e ALT

Os níveis séricos de ALT e AST nos animais submetidos à doença periodontal

experimental estão representados nos gráficos abaixo (gráficos 10 e 11).

Para nenhum dos grupos analisados houve alterações significativas nas dosagens

das enzimas hepáticas, quando se comparam os níveis correspondentes aos dias 0 e 11 do

experimento. Também não foi possível demonstrar qualquer diferença entre os grupos, de

modo que os fatores tempo e tratamento não influenciaram a atividade de AST e ALT.

Gráfico 10 – Atividade da enzima aspartato aminotransferase no plasma de ratos submetidos à doença

periodontal experimental, tratados com salina ou sinvastatina (SNV) (n=10). Os níveis séricos de AST foram

determinados no dia 0 e no dia 11 do experimento. Os resultados estão expressos como média ± erro-padrão.

Não houve diferença significativa entre os grupos, nem entre os diferentes tempos analisados (ANOVA two way

seguida de Bonferroni).

Dia

0

Dia

11

Dia

0

Dia

11

Dia

0

Dia

11

Dia

0

Dia

11

0

20

40

60

80

100Salina

SNV 3 mg/kg

SNV 10 mg/kg

SNV 30 mg/kg

AS

T (

U/L

)

98

5 RESULTADOS

Gráfico 11 – Atividade da enzima alanina aminotransferase no plasma de ratos submetidos à doença periodontal

experimental, tratados com salina ou sinvastatina (SNV) (n=10). Os níveis séricos de ALT foram determinados

no dia 0 e no dia 11 do experimento. Os resultados estão expressos como média ± erro-padrão. Não houve

diferença significativa entre os grupos, nem entre os diferentes tempos analisados (ANOVA two way seguida de

Bonferroni).

Dia

0

Dia

11

Dia

0

Dia

11

Dia

0

Dia

11

Dia

0

Dia

11

0

10

20

30

40

50Salina

SNV 3 mg/kg

SNV 10 mg/kg

SNV 30 mg/kg

AL

T (

U/L

)

99

6 DISCUSSÃO

6 DISCUSSÃO

Os modelos animais têm sido utilizados extensivamente na pesquisa médica, uma

vez que são úteis e muitas vezes necessários para provar relações de causa e efeito, bem como

para testar o potencial de novas terapêuticas. Na doença periodontal, os estudos com humanos

são limitados pela dificuldade em se estabelecer relações causais entre o colapso periodontal e

os vários fatores modificadores da doença. O periodonto é um complexo conjunto de tecidos

que está cronicamente exposto a um grande número de bactérias (PASTER et al., 2006).

Além disso, já é bem estabelecido que a resposta do hospedeiro desempenha um importante

papel na destruição periodontal e envolve provavelmente ambas as respostas imunes, inata e

adquirida (DELIMA et al., 2002).

Embora os modelos com animais não sejam perfeitos, as limitações na

investigação de questões mecanicistas não são usualmente tão severas como aquelas dos

estudos in vitro ou clínicos. Além disso, apesar de os estudos animais não representarem

todos os aspectos da doença periodontal humana, algumas questões não podem ser

tipicamente investigadas nos estudos humanos devido a importantes considerações éticas. Os

estudos com ratos, por exemplo, possuem características úteis para investigar os mecanismos

moleculares envolvidos na patogênese de doenças inflamatórias guiadas por um componente

infeccioso (GRAVES et al., 2008).

Levando em consideração a complexidade da doença periodontal, mais importante

do que escolher o modelo mais próximo da periodontite humana, é definir que modelo é mais

adequado para estudar uma hipótese específica. A seleção de um modelo de estudo de doença

periodontal deve, portanto, ser vinculada estreitamente aos objetivos do estudo e não

necessariamente precisa refletir todos os aspectos da doença periodontal. Ou seja, o modelo

mais apropriado é aquele que provavelmente provê mais informações do que estudos in vitro,

onde as complexas interações moleculares são ignoradas, ou estudos em humanos, nos quais

os mecanismos da doença são muito dificilmente investigados e provados (GRAVES et al.,

2008).

No presente estudo, buscou-se verificar o efeito do tratamento com a sinvastatina

na doença periodontal, bem como elucidar os mecanismos pelos quais essa substância atua na

periodontite, utilizando um modelo animal. Para tal, a doença periodontal foi induzida através

do método clássico da ligadura em ratos (KOIDE et al., 1995; ROVIN et al., 1966; SALLAY

100

6 DISCUSSÃO

et al., 1982; SAMEJIMA et al., 1990; WEINER et al., 1979), modificado no Laboratório de

Farmacologia da Inflamação e do Câncer – LAFICA (LEITÃO et al., 2005; LIMA et al.,

2000). O modelo consiste na inserção de um fio de náilon 3.0 ao redor dos segundos molares

superiores esquerdos de ratos Wistar, com apenas um nó disposto na face vestibular do molar

em questão, deixado em posição por 11 dias.

A colocação de ligaduras ao redor dos dentes com a finalidade de iniciar a perda

tecidual periodontal tem sido utilizada em vários tipos de animais. A ligadura leva a um

grande acúmulo de placa na região subgengival e à ulceração do epitélio sulcular, facilitando

a invasão dos tecidos conectivos. Embora o método tenha sido inicialmente usado de maneira

comum em primatas não-humanos, atualmente a dificuldade e o custo de trabalhar com esses

animais impulsionaram o emprego do modelo em animais menores. Uma vez que muitos

eventos ocorrem nos ratos da mesma maneira que nos primatas não humanos, há um renovado

interesse de vários laboratórios no método da ligadura em ratos, por ser simples e de baixo

custo (LEITÃO et al., 2005; LIMA et al., 2000).

A estrutura e a organização do tecido periodontal da região de molares em ratos,

incluindo epitélio gengival oral, epitélio sulcular oral, epitélio juncional, fibras colágenas

periodontais, cemento celular e acelular e osso alveolar, são muito semelhantes às do ser

humano. A maior diferença consiste no fato de que o epitélio sulcular gengival dos ratos é

queratinizado. Porém, estudos mostram que não se deve pensar que a barreira funcional

gengival é diferente nos ratos e nos seres humanos, embora a extensão da área afetada seja

maior no homem (KLAUSEN, 1991). Além disso, a ligadura age tanto como um fator

promotor da formação do biofilme dental, como por trauma mecânico na região gengival

(SALLAY et al., 1982). Dessa forma, o modelo aqui utilizado foi capaz de reproduzir as

principais características encontradas na periodontite em humanos, sendo apropriado para o

estudo dessa doença (BEZERRA et al., 2000; LIMA et al., 2000) e para a investigação dos

efeitos da droga em questão.

No rato, a perda óssea alveolar e a perda de inserção ocorrem de maneira

previsível em um período de 7 dias (BEZERRA et al., 2002; LOHINAI et al., 1998;

NOWOTNY; SANAVI, 1983), embora alguns investigadores tenham conduzido seus

experimentos com tempos bem mais longos (KUHR et al., 2004; NOCITI et al., 2001;

ROVIN et al., 1966). Neste trabalho, de forma semelhante a estudos anteriores (BEZERRA et

al., 2000; LIMA et al., 2000), observou-se uma significativa perda óssea alveolar no 11° dia

após a indução da doença periodontal experimental (DPE), a qual foi avaliada através da área

de perda óssea e da análise histopatológica.

101

6 DISCUSSÃO

De maneira semelhante à periodontite humana, a fase destrutiva da doença

periodontal experimental induzida por ligadura (DPE) está associada a uma intensa resposta

do hospedeiro, conforme visualizado pela formação de um infiltrado inflamatório e pela

extensa destruição dos tecidos de suporte do dente. A DPE envolve o recrutamento de células

inflamatórias, geração de prostanoides e citocinas, elaboração de enzimas líticas, peroxidação

lipídica e ativação dos osteoclastos, o que leva à reabsorção alveolar e à perda de inserção

(DE MENEZES et al., 2012). Usando este modelo experimental altamente reprodutível, o

presente trabalho investigou o efeito da sinvastatina na patogênese da doença periodontal,

através do estudo dos possíveis mecanismos de ação da droga.

As estatinas são fármacos altamente efetivos, utilizados na redução dos níveis

plasmáticos de colesterol e, consequentemente, na prevenção primária e secundária das

doenças cardiovasculares. Recentes estudos têm demonstrado que as estatinas possuem efeitos

imunomodulatórios, o que amplificou a possibilidade de uso dessa classe de fármacos em

diversas doenças inflamatórias e autoimunes (BLANCO-COLIO et al., 2003; DINARELLO,

2010). Além disso, efeitos positivos no metabolismo ósseo também têm sido verificados, em

estudos in vitro e in vivo (HORIUCHI; MAEDA, 2006).

Esses mecanismos de ação despertaram pesquisadores para a possibilidade de uso

das estatinas na prevenção da perda óssea alveolar característica da periodontite e na

regeneração de defeitos periodontais. Embora alguns estudos em animais e humanos mostrem

alguma melhora periodontal associada ao uso dessas drogas, nenhum estudo até o momento

verificou os efeitos da sinvastatina administrada sistemicamente nos diversos elementos que

compõem a fisiopatologia da doença induzida por ligadura em ratos.

Dentre esses elementos, inclui-se sua ação nos níveis de mediadores pró-

inflamatórios e de biomarcadores de estresse oxidativo, no influxo neutrofílico, na expressão

de enzimas e de fatores ósseos destrutivos envolvidos no processo inflamatório, bem como na

atividade das enzimas séricas indicativas de função hepática e de formação óssea.

Tendo como base estudos prévios, os quais se utilizaram de altas doses de

estatinas para a constatação de seus efeitos anabólicos sobre o osso (ANBINDER et al., 2007;

AYUKAWA et al., 2010; HO et al., 2009; JUNQUEIRA et al., 2002; MARITZ et al., 2001;

NASSAR et al., 2009; OXLUND; ANDREASSEN, 2004; SKOGLUND et al., 2002), três

doses de sinvastatina foram testadas: 3, 10 e 30 mg/kg. No presente trabalho observou-se que

a administração de sinvastatina, um inibidor da HMGCoA redutase, mostrou um efeito

protetor no que diz respeito às alterações morfológicas da doença periodontal. Nas doses de

10 e 30 mg/kg, a estatina foi capaz de reduzir de forma significativa a área de perda óssea

102

6 DISCUSSÃO

alveolar (POA), quando administrada de maneira preventiva durante os 11 dias da

periodontite experimental.

Os efeitos biológicos das estatinas no metabolismo ósseo foram primeiramente

relatados em 1999, quando Mundy e colaboradores observaram que as estatinas eram potentes

estimuladores da formação óssea in vitro. Mundy et al. (1999) mostraram que as estatinas

aumentaram a expressão do RNAm para BMP-2 em culturas de células ósseas humanas e de

camundongos e promoveram formação óssea em calvárias murinas mantidas em cultura de

órgão, sugerindo fortemente que essas drogas poderiam ter um efeito benéfico na saúde óssea.

Adicionalmente, esses autores demonstraram que sinvastatina e lovastatina foram capazes de

aumentar a formação óssea, quando injetadas subcutaneamente sobre a calvária dos

camundongos, e que as estatinas causam um acréscimo no volume ósseo trabecular quando

administradas oralmente nas doses de 5 e 10 mg/kg a ratas oforectomizadas osteopênicas.

No trabalho de Nassar et al. (2009), a observação histológica do periodonto de

ratos submetidos a um modelo de perda óssea alveolar induzida por ciclosporina-A revelou

que a administração oral de sinvastatina na dose de 20 mg/kg/dia neutralizou os efeitos

deletérios da ciclosporina na estrutura óssea periodontal. Adicionalmente, a sinvastatina

reduziu os níveis de IL-1β e PGE-2 nos tecidos gengivais dos animais tratados com

ciclosporina-A.

Através de uma análise radiográfica digital, Goes et al. (2010) demonstraram que

a atorvastatina aplicada por via oral na dose de 9 mg/kg foi eficaz em prevenir a perda óssea

alveolar em um modelo de periodontite induzida por ligadura. Os resultados de maior

densidade radiográfica foram corroborados pelos achados macroscópicos, que indicaram uma

redução de 47% na área de perda óssea no grupo tratado pela estatina, resultados bem

semelhantes aos observados no presente estudo.

Um estudo piloto controlado mostrou os efeitos do tratamento sistêmico com





Um recente estudo de Subramanian et al. (2013), envolvendo 83 indivíduos com

fatores de risco para aterosclerose ou com aterosclerose estabelecida, investigou o efeito de

baixas (10 mg) e altas (80 mg) de atorvastatina nos níveis de inflamação arterial e de perda

óssea periodontal. Verificou-se que a atorvastatina em altas doses reduziu o processo

103

6 DISCUSSÃO

inflamatório periodontal, e que esse efeito se correlacionou com as mudanças observadas na

inflamação da carótica.

Nos últimos dez anos, vários autores dedicaram-se a investigar os possíveis

mecanismos pelos quais as estatinas teriam um efeito protetor nas doenças ósseas, como por

exemplo, a osteoporose. Estudos in vitro e in vivo mostram que as estatinas são capazes de

promover a formação óssea, em associação com um aumento na expressão de fatores

anabólicos ósseos, como BMP-2 e o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF)

(MAEDA et al., 2003; MUNDY et al., 1999).

As proteínas morfogenéticas ósseas são glicoproteínas pertencentes à família do

fator de crescimento transformador beta (TGF-β), encontradas em altas concentrações no

tecido ósseo. São responsáveis pelo recrutamento de células osteoprogenitoras para os locais

de formação óssea, sendo consideradas as responsáveis pela habilidade indutiva e

regenerativa dos enxertos ósseos. A atividade osteoindutiva das BMP, somada à sua presença

no tecido ósseo, sugere que elas são importantes reguladores no processo de reparação óssea e

podem estar envolvidas na manutenção destes tecidos (WOZNEY, 1998).

Em nosso estudo, observamos maior marcação para BMP-2 nos tecidos

periodontais de animais submetidos à doença periodontal e tratados com sinvastatina, em

comparação com o grupo de animais que recebeu apenas salina. Kim et al. (2011)

demonstraram, através de um estudo com cultura de células de ligamento periodontal de

camundongos, que a lovastatina e a sinvastatina aumentaram a expressão do RNAm para

fosfatase alcalina, osteocalcina e BMP-2 nas células e, adicionalmente, promoveram um

acréscimo na atividade da FAT, na formação de nódulos de mineralização no meio, bem

estimularam a fosforilação de ERK1/2. Ayukawa et al. (2009) verificaram que a sinvastatina

promoveu reparo ósseo em defeitos criados cirurgicamente na tíbia de ratos, bem como

aumentou a expressão de BMP-2 e fosfatase alcalina nos defeitos em cicatrização.

Como já relatado anteriormente, as estatinas inibem a enzima HMG-CoA redutase

e, consequentemente, suprimem a produção dos metabólitos intermediários da via do

mevalonato. À semelhança dos bifosfonatos, as estatinas compartilham a capacidade de inibir

a formação do geranilgeranil pirofosfato (GGPP), interferindo na prenilação de algumas

proteínas, tais como a Rho p21, fundamentais para a manutenção do citoesqueleto e da

consequente sobrevivência dos osteoclastos (HORIUCHI; MAEDA, 2006; VAN BEEK et al.,

1999). A supressão dos derivados isoprenoides farnesil pirofosfato e geranilgeranil pirofosfato

pela sinvastatina inibe a formação e atividade dos osteoclastos em culturas de células e em

animais (HUGHES et al., 2007; STAAL et al., 2003), o que poderia, pelo menos em parte,

104

6 DISCUSSÃO

explicar o efeito protetor da sinvastatina sobre a perda óssea alveolar observada no presente

trabalho.

Embora alguns estudos tenham demonstrado que as estatinas administradas

sistemicamente possam melhorar a osteoporose e a doença periodontal in vivo, os resultados

de experimentos em animais são conflitantes. Maritz et al. (2001) demonstraram que a

sinvastatina administrada por via oral (20 mg/kg/dia) não foi capaz de prevenir a perda óssea

causada pela oforectomia em ratas e não mostrou efeito anabólico in vivo sobre o osso dos

animais. Em contraste, Oxlund et al. (2001) encontraram que a sinvastatina, na dose oral de

10 mg/kg aumentou o osso trabecular em 23% e a força compressiva desse osso em 24% nas

vértebras de ratas envelhecidas não-oforectomizadas.

Uma razão para esses efeitos contraditórios pode ser o fato de que a maioria das

preparações de estatinas são administradas oralmente e sofrem, portanto, extenso

metabolismo de primeira passagem no fígado, órgão alvo para a inibição da enzima

HMGCoA redutase e a consequente redução da formação do colesterol. Como mencionado

anteriormente, alguns fármacos, como por exemplo, a sinvastatina, são pró-drogas, cujo efeito

depende da metabolização hepática (VAZIRI et al., 2007). Sendo assim, a concentração das

estatinas em outros tecidos é muito menor do que nas células do fígado, o que dificulta os

efeitos extra-hepáticos dessas drogas, embora a inibição da via do mevalonato no fígado possa

se refletir em outros órgãos (MUNDY et al., 1999).

Dessa maneira, apenas pequena parte da droga administrada oralmente estará

disponível para atuar em outros tecidos, como por exemplo, o osso. Um estudo sobre a

deposição e metabolismo da atorvastatina em ratos mostrou que 73% da dose oral da estatina

foi excretada na bile, e que a administração de múltiplas doses não altera os perfis

metabólicos biliares (BLACK et al., 1999). No caso da sinvastatina, menos de 5% da dose

oral alcança a circulação sistêmica. As concentrações das estatinas na medula óssea ainda não

estão bem estabelecidas, mas acredita-se que os osteoblastos e osteoclastos possam estar

expostos a concentrações muito baixas de estatina com os regimes orais existentes (PARK,

2009).

Essas diferentes características farmacocinéticas e farmacodinâmicas das estatinas

nos tecidos corpóreos poderiam explicar os efeitos contraditórios dessas drogas in vivo e os

melhores resultados verificados no tecido ósseo com a utilização de doses mais altas das

estatinas. Além disso, Horiuchi e Maeda (2006) enfatizam que é provável que diferentes

locais do esqueleto, com densidades ósseas minerais variáveis, possam responder de maneira

distinta às drogas utilizadas. Os autores afirmam ainda que o osso mandibular, por exemplo, é

105

6 DISCUSSÃO

menos susceptível a agentes antireabsortivos e a drogas com efeito anabólico sobre o osso, em

comparação com as vértebras e osso longos, justificando o uso doses maiores de estatinas em

experimentos na cavidade bucal.

No presente estudo, à semelhança do observado nos trabalhos com osteoporose,

também se verificou um melhor efeito da sinvastatina nas doses mais altas (10 e 30 mg/kg),

embora o tempo de administração da sinvastatina (11 dias) tenha sido bem mais curto do que

a maioria dos protocolos de tratamento descritos na literatura para osteoporose, que utilizam

períodos bem mais longos de administração da droga (HANAYAMA et al., 2009; HO et al.,

2009; MARITZ et al., 2001; MUKHERJEE et al., 2006; OXLUND et al., 2001; PYTLIK et

al., 2003; SKOGLUND et al., 2002). A despeito das altas doses empregadas, o estudo em

questão não notou efeitos colaterais ou uma maior mortalidade dos animais, e nenhuma

diferença foi observada nos níveis de transaminases hepáticas entre os grupos avaliados.

É relatado que as enzimas séricas hepáticas podem aumentar durante a terapia

com estatinas, e que as “transaminasites” estão entre os efeitos adversos mais frequentemente

apontados a estes fármacos (KIORTSIS et al., 2007). No entanto, dados da literatura obtidos a

partir de estudos clínicos mostram que as estatinas não são hepatotóxicas e eventuais

alterações do perfil enzimático não são, necessariamente, indicadoras de toxicidade hepática

(COHEN; ANANIA; CHALASANI, 2006; ESCOBAR; ECHARRI; BARRIOS, 2008).

O risco de aumento das transaminases hepáticas está direta e intimamente

relacionada com a dose (por cada 10% de redução do LDL-C, a taxa de elevação das enzimas

hepáticas é cerca de 2,5 vezes maior quando se usam doses mais elevadas de estatina) e,

possivelmente, com o tipo de estatina usada (as estatinas hidrofílicas parecem determinar um

ligeiro acréscimo do risco absoluto de elevação das aminotransferases) (DALE et al., 2007). É

válido notar que a sinvastatina é uma estatina lipofílica, o que poderia pelo menos em parte

explicar os nossos achados bioquímicos.

Em ratos, as estatinas parecem exercer um papel protetor na elevação das

aminotransferases causada pela diabetes experimental (MOHAMADIN et al., 2011), pela

injúria hepática e pulmonar (DIBAZAR et al., 2008) e pelo álcool (KOLOVOU et al., 2003).

Abel et al. (2009) observaram que o tratamento com sinvastatina em pacientes com doença

gordurosa do fígado não-alcoólica causou um significativo decréscimo nos níveis séricos de

ALT e AST após 6 meses de terapia.

Além dos possíveis efeitos diretos da sinvastatina no metabolismo ósseo, é

provável que grande parte da ação anti-reabsortiva da estatina neste estudo se deva às suas

propriedades antiinflamatória, antioxidante e imunomodulatória. Já está bem elucidado que as

106

6 DISCUSSÃO

estatinas exercem efeitos imunomodulatórios e antiinflamatórios nas doenças

cardiovasculares, reduzindo a disfunção endotelial e o risco de formação de trombos,

diminuindo os níveis de proteína C reativa, de metaloproteinases de matriz e de produtos

intermediários, como TNF-α (BLANCO-COLIO et al., 2003; DINARELLO, 2010).

A análise histopatológica do periodonto de animais submetidos à DPE e que

receberam apenas salina mostrou a presença de intenso infiltrado celular inflamatório no 11°

dia após a cirurgia, além de destruição total do processo alveolar e perda acentuada do

cemento, achados esses já observados anteriormente nos estudos de Lima et al. (2000) e

Leitão et al. (2004). O periodonto dos animais que receberam sinvastatina na dose de

30mg/kg apresentou diminuição do infiltrado celular inflamatório e preservação parcial do

processo alveolar e cemento radicular, o que mostra um efeito antiinflamatório da estatina e

sua consequente capacidade de proteger as estruturas calcificadas.

Vaziri et al. (2007) avaliou o efeito da sinvastatina aplicada subperiostealmente na

reabsorção óssea induzida por ligadura na mandíbula de ratas oforectomizadas. As análises

histológicas mostraram que o grupo tratado com a sinvastatina desenvolveu um menor

desarranjo periodontal, com menores índices de perda óssea alveolar, em comparação ao

grupo controle. Utilizando o mesmo modelo, Seto et al. (2008) avaliaram o efeito da

sinvastatina na recuperação óssea após 20 dias de periodontite experimental. Posteriormente à

remoção da ligadura, os autores injetaram a sinvastatina topicamente na gengiva vestibular

dos ratos durante 70 dias e, subsequentemente, analisaram os tecidos histologicamente e por

tomografia computadorizada. As imagens da tomografia revelaram que o tratamento com

sinvastatina recuperou a reabsorção óssea induzida pela ligadura, tendo mostrado 46% de

reversão da altura óssea.

No presente estudo também foi demonstrada, através da coloração com tricrômico

de Mallory, uma acentuada destruição das fibras colágenas nos grupos de ratos que receberam

salina. Segundo Keles et al. (2005), os componentes da matriz extracelular dos tecidos

periodontais, especialmente o colágeno, parecem ser os principais alvos da degradação

tecidual na periodontite. Durante a progressão da doença, a destruição das fibras colágenas dá

origem a espaços que vão sendo ocupados por células inflamatórias e tecido conjuntivo

frouxo periodontal. A sinvastatina, na dose de 30 mg/kg, preservou parcialmente as fibras

colágenas do ligamento periodontal, observação que foi confirmada pela análise dos

espécimes em microscópio confocal. Além da menor desorganização e destruição das fibras

colágenas, a microscopia confocal também confirmou a preservação dos tecidos duros de

sustentação do dente, nos ratos tratados com sinvastatina.

107

6 DISCUSSÃO

A fim de confirmar os dados obtidos através da análise histológica, foi realizada

uma imunohistoquímica para a marcação da metaloproteinase-1/-8 (MMP-1/-8). A MMP-1

(tipo fibroblasto) e a MMP-8 (tipo neutrofílico), juntamente com a MMP-13 e a MMP-18,

constituem o grupo de metaloproteinases denominado de colagenases (DAHAN et al., 2001).

Segundo Golub et al. (2008), a MMP-8 compreende 80% do total das colagenases

encontradas no fluido gengival crevicular, seguida de quantidades bem menores de MMP-13 e

MMP-1 (nesta ordem) em pacientes com periodontite crônica. Em nosso estudo, a gengiva

dos animais submetidos à DPE e que receberam apenas salina apresentou grande quantidade

de células imunomarcadas para MMP-1/-8, mostrando que no tecido gengival inflamado os

níveis destas proteínas estão aumentados. Estudos demonstram que elevados níveis de MMP-

8 têm sido encontrados na saliva, bolsa periodontal ou plasma de pacientes com periodontite,

quando comparados com pessoas periodontalmente saudáveis; além disso, esses níveis

diminuem após terapia periodontal (KINANE et al., 2003; MARCACCINI et al., 2010; RAI

et al., 2008). Kinane et al. (2003) sugeriram, inclusive, que a MMP-8 pode ser considerada

um bom marcador para a detecção de sítios periodontais em pacientes com doença ativa.

Nossas análises histológicas e por imunohistoquímica demonstraram apenas uma

pequena perda de fibras colágenas e reduzida marcação da colagenase nos tecidos gengivais

de ratos submetidos à doença periodontal e tratados com sinvastatina (30 mg/Kg). Já foi

observado que nas placas ateroscleróticas as estatinas diminuem os níveis de metaloproteases,

de LDL oxidado, do conteúdo lipídico e dos macrófagos, e aumentam o conteúdo de colágeno

na matriz da placa, efeitos estes que aumentam a estabilidade do ateroma (CRISBY et al.,

2001).

Cipollone et al. (2003) também verificaram menor imunorreatividade para COX-

2, PGE sintase, MMP-1, MMP-9 e maior conteúdo de colágeno nas placas ateroscleróticas de

pacientes submetidos a endarterectomia e que haviam recebido previamente à cirurgia quatro

meses de tratamento com sinvastatina (40 mg/dia). Adicionalmente, os autores verificaram in

vitro que a inibição de COX-2 e PGE sintase foi completamente revertida pela adição de

mevalonato ao meio de cultura.

Um recente estudo in vitro mostrou que a sinvastatina e a mevastatina inibiram

significativamente a degradação do colágeno induzida por IL-1 e oncostatina M (OSM); esse

evento foi acompanhado de um marcado decréscimo na atividade de colagenase e de

gelatinase na cartilagem nasal bovina. As estatinas também diminuíram de maneira

significativa a expressão de MMP-1 e MMP-13 na cartilagem articular humana e nos

108

6 DISCUSSÃO

condrócitos estimulados por IL-1 + OSM, e bloquearam a ativação de vias de sinalização pró-

inflamatórias críticas para a expressão de metaloproteases (BARTER et al., 2010).

Sundararaj et al. (2008) verificaram que a sinvastatina inibiu efetivamente a

expressão de MMP-1, MMP-8 e MMP-9 estimulada por LPS em células mononucleares

U937. Além disso, os autores verificaram que a adição de geranilgeranil pirofosfato reduziu o

efeito inibitório da sinvastatina na expressão de MMP-1 induzida por LPS, e que a estatina

também inibiu a ativação de Ras e Rac.

A acentuada redução da marcação para as colagenases MMP-1/-8 verificada na

gengiva dos animais que receberam sinvastatina pode estar relacionada, pelo menos em parte,

à diminuição da infiltração neutrofílica observada nesse grupo de ratos através da análise

histopatológica e da dosagem de MPO, embora a imunohistoquímica tenha sido realizada

apenas no 11º da indução da doença.

Os neutrófilos constituem a primeira linha de defesa do hospedeiro, em especial

pela sua habilidade em fagocitar microrganismos. Contudo, essas células podem produzir

mediadores inflamatórios, promovendo uma auto-amplificação do recrutamento e da ativação

dos PMNs, perpetuando a resposta inflamatória e a destruição tecidual. Além disso, os

neutrófilos ativados liberam radicais de oxigênio e enzimas proteolíticas, os quais também

podem induzir ao dano periodontal (VAN DYKE; SERHAN, 2003).

Considerando que a MPO é um indicador do acúmulo de neutrófilos no tecido e

que tem sido apontada como um indicador da patogênese periodontal (MIYASAKI et al.,

1997; OVER et al., 1993), esta enzima foi dosada na gengiva dos animais submetidos à DPE.

Houve um aumento significativo da atividade de MPO nos grupos de animais com DPE e

tratados com salina, em relação ao grupo naïve. Esses dados são confirmados por trabalhos

anteriores que mostram que a atividade da MPO apresenta-se aumentada tanto no fluido

gengival como na gengiva de pacientes com doença periodontal e que a atividade desta

enzima diminuiu significativamente após terapia periodontal (BORGES et al., 2007;

MARCACCINI et al., 2010; ÖVER et al., 1993). Os animais aos quais foi administrada

sinvastatina (nas doses de 10 e 30 mg/kg) apresentaram uma redução significativa da

atividade de MPO no tecido gengival, após seis horas da indução da doença.

Esse dado está de acordo com vários outros estudos, que mostram que as estatinas

também inibem a atividade de MPO em ratos submetidos à injúria por reperfusão do músculo

esquelético (COWLED et al., 2007) e à injúria hepática induzida por colestase (DOLD et al.,

2009), na úlcera gástrica induzida experimentalmente (TARIQ et al., 2007), na colite induzida

por ácido trinitrobenzeno sulfônico (JAHOVIC et al., 2006) e no infarto do miocárdio

109

6 DISCUSSÃO

(TIEFENBACHER et al., 2003). Nezić et al. (2009), usando sinvastatina em uma variação de

dose de 5 – 30 mg/Kg, observaram que esta droga, de maneira dose dependente e

comparavelmente à indometacina, reduziu a infiltração de leucócitos polimorfonucleares no

modelo de edema de pata induzido por carragenina. Um trabalho de nosso grupo mostrou que

a atorvastatina, nas doses de 1 e 5 mg/kg, reduziu a atividade de MPO em um modelo de

mucosite oral induzida por 5-fluorouracil, após 5 e 10 dias da indução da doença

(MEDEIROS et al., 2011).

Em humanos, foi observada menor atividade de MPO na placa aterosclerótica de

pacientes submetidos a tratamento com sinvastatina (40 mg/dia) por quatro meses antes da

cirurgia de endarterectomia (CUCCURULLO et al., 2006). O tratamento com sinvastatina em

indivíduos com alto risco para aterosclerose foi eficiente em reduzir a quimiotaxia dos

neutrófilos e os níveis de IL-8 derivada de polimorfonucleares isolados desses pacientes,

dessa maneira afetando a sinalização pró-inflamatória a partir dessa citocina (GUASTI et al.,

2006). Um estudo transversal mostrou que neutrófilos isolados de pacientes em hemodiálise

prevalente sob tratamento com estatinas apresentam atividade de MPO significativamente

reduzida. (STENVINKEL et al., 2006).

Maher et al. (2009) demonstraram que pravastatina, sinvastatina e atorvastatina

reduziram in vitro a migração transendotelial neutrofílica em direção ao peptídeo

quimioatraente N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP). O efeito mostrou-se

independente de qualquer mudança na adesão neutrofílica ou na expressão de moléculas de

adesão, mas se relacionou com a habilidade das estatinas em reduzir a atividade de Rho

induzida pelo fMLP nos neutrófilos. Esse dado foi confirmado pela capacidade do precursor

de Rho, geranilgeranil pirofosfato, em prevenir a redução da migração transendotelial de

neutrófilos mediada pelas estatinas.

Dando continuidade à análise dos efeitos da droga sobre o grau de inflamação e

destruição do periodonto, nós também avaliamos a ação da sinvastatina nos níveis de

citocinas no tecido gengival. Como já foi discutido anteriormente, a periodontite é uma

doença crônica inflamatória, fortemente influenciada por diversas citocinas e mediadores

inflamatórios, tais como TNF-α, IL-1 e prostaglandinas (KENDALL et al., 2001; OATES;

GRAVES; COCHRAN, 2002). Em nosso estudo, demonstramos que a concentração de IL-1β

e TNF-α no tecido gengival de animais com DPE e pré-tratados com salina aumentou

significativamente em relação ao grupo naïve. Estudos anteriores mostram que, na doença

periodontal, há um aumento da citocina pró-inflamatória IL-1, cuja produção pode estar

relacionada a diferentes células, tais como monócitos, macrófagos e também neutrófilos

110

6 DISCUSSÃO

(BOCH; WARA-ASWAPATI; AURON, 2001; KJELDSEN et al., 1995; ZHANG et al.,

2003). Resultados prévios do nosso laboratório demonstraram que inibidores da síntese de

citocinas, tais como a pentoxifilina e, em particular, inibidores da síntese de TNF-α

(talidomida e clorpromazina) reduziram a destruição tecidual e a perda óssea na doença

periodontal experimental, o que ressalta a importância de citocinas na patogênese da DPE

(LIMA et al., 2000; LIMA et al., 2004).

No presente estudo, a sinvastatina (10 e 30 mg/kg) reduziu os níveis de citocinas

pró-inflamatórias (IL-1 e TNF-α) e, na dose de 30 mg/kg, aumentou o nível da citocina anti-

inflamatória IL-10 nos tecidos gengivais dos ratos submetidos à DPE. Esses dados são

confirmados pelos já discutidos achados de Nassar et al. (2009). Os autores verificaram que a

sinvastatina reduziu a expressão de IL-1β, PGE-2 e iNOS nos tecidos gengivais de ratos

submetidos a um modelo de perda óssea alveolar induzida por ciclosporina-A.

Sakoda et al. (2006) demonstraram que a sinvastatina promoveu um decréscimo

na produção de IL-6 e IL-8 por uma linhagem de células epiteliais humanas em cultura, em

resposta à IL-1α, um efeito revertido pela adição de mevalonato ou geranilgeranil pirofosfato.

Adicionalmente, os autores demonstraram que a sinvastina reduziu a ativação de NFκ-B e do

gene promotor do ativador da proteína-1 (AP-1) nessas células.

Em um modelo de aneurisma cerebral (AC) em ratos, as análises dos tecidos dos

aneurismas por PCR e imunohistoquímica mostraram que o tratamento dos animais com

sinvastatina inibiu a superexpressão de IL-1β, iNOS, MMP-2 e MMP-9 associada com a

progressão do AC. A zimografia revelou um decréscimo na atividade de MMP-2 e MMP-9 na

parede dos aneurismas referentes ao grupo de animais tratados com a estatina (AOKI et al.,

2008). Um recente estudo em humanos mostrou que os monócitos de pacientes pré-diabéticos

apresentando ou não hipercolesterolemia e sob tratamento com sinvastatina liberaram

menores quantidades de IL-1β, TNF-α, IL-6 e MCP-1 (proteína quimioatratora de monócitos),

quando comparados com o grupo controle (KRYSIAK et al., 2011).

Outros estudos indicam que as estatinas induzem uma mudança na produção de

citocinas pró-inflamatórias Th1 (IL-2, IL-12, IFN-γ e TNF-α) para a produção de citocinas

Th2 (IL-4, IL-5 e IL-10) no sistema nervoso central (ZHANG; MARKOVIC-PLESE, 2008).

Além disso, as estatinas exercem ação antiinflamatória através da inibição da migração de

células do sangue periférico para os tecidos através do bloqueio das moléculas de adesão

LFA-1 na superfície dos linfócitos ativados (NISHIBORI; TAKAHASHI; MORI, 2003). A

sinvastatina pode também diminuir a expressão de P-selectina, ICAM-1 e iNOS nas células

endoteliais em estágios precoces da aterogênese (NACHTIGAL et al., 2005). Estatinas

111

6 DISCUSSÃO

reduziram os efeitos pró-inflamatórios induzidos pela histamina e pelo TNF, incluindo a

adesão e o rolamento dos neutrófilos, o que foi acompanhado por uma menor expressão de P-

e E-selectinas nas células endoteliais (ECCLES et al., 2008). A ativação de NFκ-B e a

expressão de CD32 induzida pela proteína C reativa nas células endoteliais foram inibidas

pela interferência na via do mevalonato (LIANG et al., 2008).

Embora as estatinas não diminuam os níveis de colesterol em ratos e

camundongos, suas propriedades antiinflamatórias são altamente consistentes em modelos

animais. Vários estudos demonstram uma redução da severidade da doença nos animais

tratados com estatinas em uma variedade de condições inflamatórias, incluindo colite, uveíte,

miocardite, encefalite alérgica experimental, sepse letal, rejeição alográfica e asma (ABELES;

PILLINGER, 2006).

Considerando ainda que citocinas são indutores da transcrição de iNOS,

analisamos a expressão dessa proteína no tecido periodontal através de imunohistoquímica.

Observou-se que a expressão de iNOS, enzima que sintetiza altas concentrações de NO sob

condições inflamatórias, aumentou significativamente no periodonto dos animais com DPE,

em comparação ao grupo naïve. Esses achados estão de acordo com outros estudos que

mostraram que a atividade de iNOS e a síntese de NO estão aumentadas nos tecidos

periodontais inflamados (KENDALL et al., 2000; LAPPIN et al., 2000; LOHINAI et al.,

1998; POPKOV et al., 2005; REHER et al., 2007; UĞAR-CANKAL; OZMERIC, 2006).

Batista et al. (2002) mostraram que a análise imunohistoquímica em tecido

gengival de pacientes com doença periodontal apresentou um significante aumento do número

de células positivas para iNOS em relação ao tecido gengival de pacientes saudáveis e que

estas células foram predominantemente PMN.

A imunohistoquímica realizada em tecido gengival de animais tratados com

sinvastatina demonstrou redução considerável da marcação para iNOS. Esses achados estão

em concordância com vários estudos in vitro e in vivo prévios, que mostram reduções de

iNOS pelas estatinas em modelos de inflamação das vias aéreas (AHMAD et al., 2011), de

injúria por reperfusão/isquemia hepática (TROCHA et al., 2010), nas lesões renal (LUO et

al., 2009) e pulmonar (BELLI et al., 2011) e na aterosclerose (CRISBY et al., 2001).

Em adição às análises das citocinas implicadas na doença periodontal, a dosagem

de nitrito (NO2-) e nitrato (NO3

-) foi obtida como um indicador da produção de óxido nítrico e

da ativação da iNOS. Corroborando com os dados acima expostos, observamos que houve um

aumento significativo da quantidade de nitrito/nitrato (NOx) nos grupos submetidos à DPE e

que receberam apenas salina. Similarmente, Popkov et al. (2005) mostraram que a

112

6 DISCUSSÃO

concentração dos metabólitos nitrito e nitrato estavam aumentados no soro de ratos

submetidos à periodontite experimental, proporcionalmente ao aumento da atividade de

iNOS. De Menezes et al. (2012) observaram maiores concentrações de nitrito e nitrato e

aumento na imunomarcação para iNOS na gengiva de ratos submetidos à doença periodontal

experimental induzida por ligadura. A administração de sinvastatina (30 mg/kg) aos animais

submetidos à doença experimental diminuiu a concentração de NOx na gengiva em relação ao

grupo salina, o que deve estar diretamente relacionado com a diminuição da expressão de

iNOS evidenciada pela imunohistoquímica.

Leung et al. (2011) verificaram in vitro que, na presença de sinvastatina no meio

de cultura, macrófagos estimulados por LPS apresentavam maior expressão e atividade de

heme-oxigenase 1 de uma maneira dose-dependente, em relação aos macrófagos não expostos

à estatina. Além disso, a sinvastatina inibiu significativamente a expressão de iNOS e a

formação de mediadores inflamatórios, incluindo TNF-α, nitrito e radicais livres, e aumentou

a produção de IL-10. A degradação de IκB-α e a ativação e translocação do NFκ-B causadas

pelo LPS também foram suprimidas pela sinvastatina.

Espécies reativas de oxigênio (ROS) também estão implicadas na destruição dos

tecidos durante a doença periodontal inflamatória, sendo o estresse oxidativo um importante

fator da patogênese da periodontite. Diferentes mecanismos podem causar o dano tecidual

através das ROS, incluindo dano ao DNA, peroxidação lipídica, dano protéico, oxidação

enzimática e estimulação de citocinas inflamatórias (GRANT et al., 2010). Dentro desse

contexto, a glutationa reduzida (GSH) é o principal antioxidante intracelular, importante em

muitas funções biológicas, tais como prevenção do dano oxidativo, remoção de

hidroperóxidos e desintoxicação e estabilização das membranas biológicas

(PANJAMURTHY; MANOHARAN; RAMACHANDRAN, 2005).

Neste estudo, observamos baixos níveis de GSH nos animais com DPE e que

receberam salina, em relação aos animais naïve. Estes achados estão de acordo com vários

trabalhos que mostram que a concentração de GSH é menor tanto no soro como no fluido

gengival de pacientes com periodontite quando comparado com pessoas periodontalmente

saudáveis (CHAPPLE et al., 2002; PANJAMURTHY; MANOHARAN;

RAMACHANDRAN, 2005; TSAI et al., 2005). Esses dados sugerem que grande quantidade

de GSH foi consumida durante a geração das ROS, levando a uma deficiência deste

antioxidante. Além disso, muitas bactérias na cavidade oral e na bolsa periodontal também

podem metabolizar a GSH. Em pacientes com periodontite, nos quais são encontradas

quantidades aumentadas de periodontopatógenos subgengivais, essa microbiota pode causar

113

6 DISCUSSÃO

uma depleção na GSH, com a consequente redução dos níveis deste antioxidante na saliva

e/ou no fluido crevicular gengival (TSAI et al., 2005).

Em nosso estudo, observamos que a sinvastatina, nas doses de 10 e 30 mg/kg,

aumentou o nível de GSH no tecido gengival de forma estatisticamente diferente do grupo

salina. Similarmente, as estatinas foram capazes de aumentar os níveis teciduais de GSH em

outros modelos, como demência experimental em camundongos (DALLA et al., 2010),

injúria pulmonar em ratos (BELLI et al., 2011), injúria hepática e renal induzida por

cisplatina (IŞERI et al., 2007) e colite experimental em ratos (JAHOVIC et al., 2006).

Como já explicado anteriormente, o aumento na formação das espécies reativas de

oxigênio pode causar um dano ao tecido periodontal. Esse dano se torna evidente pelos altos

níveis de produtos de peroxidação lipídica formados nos sítios inflamados. Sendo assim, a

dosagem dos níveis dos produtos da peroxidação lipídica, como o malondialdeído (MDA,

C3H4O2), pode ser utilizada como indicador da ação dos radicais livres no organismo. O MDA

possui ação citotóxica e genotóxica, encontrando-se em níveis elevados em algumas

patologias associadas ao estresse oxidativo (ANTUNES et al., 2008).

Nosso estudo mostrou que, nos animais com DPE e tratados com salina, houve

um aumento na quantidade de MDA em relação ao grupo naïve, implicando que o dano

oxidativo aos tecidos está aumentado na inflamação periodontal. Tal resultado está de acordo

com o já citado estudo de De Menezes et al. (2012) e com estudos anteriores que mostram

que o conteúdo de MDA no fluido crevicular gengival e na saliva de pacientes com

periodontite crônica apresenta-se elevado em relação a pacientes periodontalmente saudáveis

(CANAKCI et al., 2009; TSAI et al., 2005). A sinvastatina (30 mg/kg) reduziu de forma

significativa os níveis de MDA, confirmando o dado anterior que mostrou o potencial

antioxidante da droga em questão. De forma semelhante ao resultado obtido com a

mensuração dos níveis de GSH, vários estudos in vivo confirmam os bons efeitos da

sinvastina em reduzir MDA e o subsequente dano tecidual (BELLI et al., 2011; DALLA et

al., 2010; JAHOVIC et al., 2006). Ceylan et al. (2003) observaram um efeito positivo do

tratamento com a sinvastatina no miocárdio de ratos diabéticos. Os autores verificaram

menores níveis de TBARS (substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico) e maiores

concentrações de enzimas antioxidantes no tecido cardíaco dos animais que receberam a

estatina; além disso, a droga atenuou parcialmente o processo aterogênico e angiopático nas

artérias coronárias dos ratos.

Em pacientes com dislipidemia sem sintomas clínicos de aterosclerose, o

tratamento com atorvastatina e sinvastatina diminuiu significativamente as concentrações de

114

6 DISCUSSÃO

TBARS na membrana dos eritrócitos isolados. Adicionalmente os autores observaram um

aumento na atividade das enzimas antioxidantes catalase (CAT), glutationa peroxidase (GSH-

Px) e superóxido dismutase (SOD) durante a terapia com estatinas (BRONCEL; KOTER-

MICHALAK; CHOJNOWSKA-JEZIERSKA, 2006).

Deskur-Smielecka et al. (2001) investigaram a influência de uma terapia curta

(doze semanas) com sinvastatina nos marcadores da inflamação e dos processos oxidativos

em pacientes com hipercolesterolemia. Os autores verificaram menores concentrações

plasmáticas de TBARS (malonaldeído) e NOx após a terapia, mas nenhuma mudança nos

níveis séricos de IL-6. Observou-se ainda uma correlação positiva entre os níveis de colesterol

total e NOx e de LDL e NOx no plasma.

Sabe-se que uma mudança nas condições teciduais de oxidação-redução pode,

além de levar a um dano tecidual, ativar o fator nuclear-κB. NFκ-B, por sua vez, coordena a

expressão de uma variedade de genes responsáveis pela inflamação, levando à produção e

ativação de diversos mediadores pró-inflamatórios, como moléculas de adesão intercelular e

citocinas (LEE; BURCKART, 1998). Além das ROS, o NFκ-B é primariamente ativado pelas

citocinas IL-β e TNF-α; no entanto, outras moléculas também presentes na periodontite

crônica (LPS, RANK-L, IL-6) podem ativar o fator em questão de minutos.

Sendo assim, nosso estudou analisou, através de western blot, a presença do p50

NLS, a fração dissociada do NFκ-B, nas gengivas dos animais submetidos à DPE. Observou-

se que a doença periodontal aumentou as concentrações dessa fração no periodonto, em

relação ao grupo naïve. Esse dado está de acordo com o estudo de Arabaci et al. (2010), que

mostrou, através de uma análise estereológica, maior expressão de p50, p65 e Iκ-B na gengiva

de pacientes com periodontite crônica, em relação aos pacientes saudáveis.

Em contrapartida, a sinvastatina (30 mg/kg), em nosso estudo, reduziu

significativamente os níveis gengivais de p50 no periodonto, quando comparada à salina

somente. Além dos trabalhos já citados anteriormente, que demonstraram in vitro menor

ativação de NFκ-B (SAKODA et al., 2006; LEUNG et al., 2011), Chen et al. (2009)

verificaram, em um modelo de injúria traumática cerebral, que a sinvastina marcadamente

inibiu a expressão de TLR4 (toll like receptor-4), NF-kappaB e dos mediadores inflamatórios

IL-1beta, TNF-alpha, IL-6 e ICAM-1 no cérebro dos ratos.

A inibição de NFκ-B promovida pela sinvastatina no presente estudo pode

explicar, pelo menos em parte, a ação da droga na inibição da síntese de citocinas e na menor

expressão de iNOS verificada no periodonto dos ratos submetidos à doença periodontal. Além

115

6 DISCUSSÃO

disso, a menor ativação do fator nuclear também pode estar relacionado a outra importante via

envolvida na patogênese da doença periodontal: a via OPG/RANK/RANKL.

Esta via é um determinante crítico da integridade do esqueleto ósseo, uma vez que

controla a formação dos osteoclastos. A razão OPG/RANKL é uma chave para controlar a

atividade dessas células e a consequente reabsorção óssea. RANKL é um membro da

superfamília do TNF que estimula diretamente a diferenciação do progenitor do osteoclasto

pela sinalização através do fator de membrana RANK. Osteoprotegerina, por sua vez, liga-se

ao receptor RANK, impedindo a ativação celular induzida por RANKL (LEIBBRANDT;

PENNINGER, 2008).

Em nosso estudo, observamos aumento da expressão de RANK e RANKL nos

tecidos de ratos submetidos à periodontite experimental. Múltiplas linhas de evidência em

modelos de doença periodontal claramente indicam que um acréscimo na expressão do

RNAm para RANKL e na produção dessa proteína causam um aumento na razão

RANKL/OPG e estimulam a diferenciação das células precursores de macrófagos em

osteoclastos. O aumento de RANKL também estimula a maturação e a sobrevivência dos

osteoclastos, levando à perda óssea típica da periodontite. Estudos com animais transgênicos e

knockout para OPG ou RANKL provêem suporte adicional para o envolvimento dessas

moléculas na perda tecidual da doença periodontal (COCHRAN, 2008).

No presente trabalho, a sinvastatina reduziu de maneira marcante a expressão

aumentada de RANK e RANKL e aumentou a expressão de OPG no periodonto de animais

submetidos à DPE. Ahn et al. (2008) mostraram que a sinvastatina pode inibir a via de

ativação do NFκ-B induzida por RANKL, levando à supressão da osteoclastogênese in vitro.

Outros dados mostram um importante papel da sinvastatina no aumento dos níveis da OPG

derivada de osteoblastos, o que pode levar a uma significante redução em RANKL e,

conseqüentemente a um decréscimo na osteoclastogênese (KAJI et al., 2005; VIERECK et

al., 2005).

Ayukawa et al. (2009) demonstraram que a sinvastatina promoveu reparo ósseo

em defeitos criados cirurgicamente na tíbia de ratos, bem como aumentou a expressão de

BMP-2 e fosfatase alcalina nos defeitos em cicatrização. Além disso, os autores verificaram,

através de imunohistoquímica, que a expressão de RANKL no grupo da estatina foi

significativamente reduzida em comparação com grupo controle, e que esse dado foi

confirmado pelo aumento da área de osso neo-formada promovida pela droga.

Moon et al. (2011) verificaram in vitro que a sinvastatina diminuiu a expressão de

TRAP (fosfatase ácida resistente a tartarato), um marcador genético da diferenciação dos

116

6 DISCUSSÃO

osteoclastos, e inibiu a geração de ROS em células RAW 264.7 estimuladas por RANKL.

Além disso, a estatina inibiu a ativação de NFκ-B e das proteínas quinases B (AKT), bem

como as vias de sinalização das proteínas quinases ativadas por mitógenos c-JUN N-terminal

quinase e p38 MAP quinase, ou seja, as vias de sinalização ativadas pelas ROS.

Considerando que a fosfatase alcalina total e a fosfatase alcalina óssea (uma

isoenzima da fosfatase alcalina total) são considerados marcadores para a formação óssea

(COUTTENYE et al., 1996) e para a mineralização do osteóide (WATTS, 1999), nós também

acessamos a fosfatase alcalina total como marcador ósseo na periodontite em ratos. Gibert et

al. (2003) mostraram que a dosagem da fosfatase alcalina óssea no soro de pacientes com

doença periodontal é menor quando comparada com pacientes saudáveis. De acordo com

Keles et al. (2005), altos níveis séricos de FAO na periodontite experimental estão associados

com aumento da formação óssea. Sendo assim, a dosagem de FAO pode ser utilizada como

um marcador da atividade da doença ou como parâmetro de resposta ao tratamento instituído

(SARAIVA; LAZARETTI-CASTRO, 2002).

Em nossos experimentos, os animais tratados com sinvastatina (30 mg/kg)

tiveram seus valores de fosfatase alcalina sérica aumentados no dia 11, quando comparados

aos outros grupos, o que confirma nossos dados de diminuição da perda óssea promovida pela

estatina nesta concentração. Vários estudos in vivo demonstraram que estatinas aplicadas

oralmente ou topicamente aumentaram os níveis séricos de fosfatase alcalina total

(AYUKAWA et al., 2010; GALUS; WŁODARSKI, P.; WŁODARSKI, C., 2006; WANG et

al., 2007) e de fosfatase alcalina óssea (TIKIZ et al., 2004); adicionalmente alguns estudos in

vitro também mostraram aumento na expressão dessas enzimas em cultura de células ósseas

expostas à sinvastatina (MAEDA et al., 2001; VAZIRI et al., 2007).

Em resumo, nossos achados sugerem que as estatinas merecem investigação

adicional como agentes potenciais para prevenção da reabsorção óssea na doença inflamatória

periodontal. Embora as doses testadas em nosso modelo estejam acima da variação de

segurança recomendada para a redução de colesterol em humanos, esse estudo é útil no

entendimento dos mecanismos subjacentes a esse efeito protetor e pode guiar o

desenvolvimento de estatinas mais eficazes e seguras e que tenham como alvo o tecido ósseo

nos pacientes com periodontite crônica e outras doenças ósseas. Além disso, estudos

adicionais a respeito do efeito das estatinas no metabolismo ósseo poderão ser de grande valia

para a elucidação dos mecanismos de ativação e diferenciação dos osteoclastos.

117

7 CONCLUSÃO

7 CONCLUSÃO

Diante dos dados obtidos nesse trabalho, pode-se concluir que, dentro das

condições impostas pela doença periodontal experimental:

✓ A sinvastatina, aplicada profilaticamente nas doses de 10 e 30 mg/kg, foi capaz

de inibir a perda óssea alveolar;

✓ A menor progressão da doença nos animais tratados com a estatina pode ser

devida a uma ação antiinflamatória e antioxidante da droga;

✓ A estatina testada parece interferir positivamente nos parâmetros de formação e

reabsorção óssea;

✓ Novos estudos são necessários a fim de se verificar se as estatinas utilizadas

atualmente no controle das dislipidemias podem também contribuir para uma melhora nos

parâmetros clínicos da periodontite em humanos.

118

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