estudo teÓrico de inibidores da proteÍna quinase...
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1
UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
INSTITUTO DE QUÍMICA
Tese de Doutorado
ESTUDO TEÓRICO DE INIBIDORES
DA PROTEÍNA QUINASE DE
ADESÃO FOCAL
DANIEL AUGUSTO BARRA DE OLIVEIRA
Orientador:
PROF. DR. JOÃO BATISTA LOPES MARTINS
Brasília, 01 de novembro de 2013
2
Universidade de Brasília
Programa de Pós-Graduação em Química
ESTUDO TEÓRICO DE INIBIDORES
DA PROTEÍNA QUINASE DE
ADESÃO FOCAL
Daniel Augusto Barra de Oliveira
Orientador: Prof. Dr. João Batista Lopes Martins
Brasília 01 de novembro de 2013
Tese apresentada ao programa de Pós-Graduação
em Química da Universidade de Brasília, como
requisito parcial à obtenção do título de Doutor.
3
Agradecimentos
À Deus, por tudo.
Ao professor João Batista por todo o aprendizado, pela paciência e
dedicação em elucidar vários problemas corriqueiros deste trabalho.
À minha família pelo apoio durante todo o doutorado.
À minha esposa pela paciência.
Aos meus amigos do laboratório: Victor Bonfim, Jussara, Elton e Marcos,
que além de colaborarem com a execução deste trabalho, propiciaram
momentos divertidos e descontraídos.
À Secretaria de Pós-Graduação do Instituto de Química pela ajuda na
elucidação de problemas administrativos.
4
Resumo
As proteínas quinases são importantes por atuar em processos
biológicos conhecidos, como a transdução de sinais. Esses processos estão
intimamente relacionados com o desenvolvimento de neoplasias malignas.
Desse modo, o conhecimento da atuação de drogas, relacionadas com essas
proteínas, é relavante para o tratamento de alguns tipos de câncer. Neste
trabalho, procurou-se estudar inibidores da proteína quinase de adesão focal
(FAK), a fim de correlacionar propriedades teóricas, obtidas pela química
computacional, com atividades biológicas calculadas a partir do IC50, para
auxiliar no entendimento entre essas drogas e a FAK. Para realizar os cálculos
foram usadas diversas aproximações de modelagem molecular, dentre as
quais, mecânica molecular, métodos ab initio, e métodos híbridos. Para a
aproximação de mecânica quântica foram usados os métodos Hartree-Fock,
teoria do funcional de densidade, e semi-empíricos PM3, PM6 e MNDO, para
descrever a interação entre o sítio catalítico da FAK e os inibidores. O
programa O programa auto-docking Vina foi usado para o ancoramento rígido.
As atividades de inibidores da classe 7-h-pirrolo-pirimidina foram comparadas
com dados provenientes da mecânica quântica, cujo resultado mostrou a
importância dos orbitais de fronteira próximos ao aminoácido Cys502. Quanto
mais estendidos esses orbitais, maior poderá ser atividade de inibição da FAK.
São ainda observadas interações moleculares com os aminoácidos Arg424 e
Lys454. Os inibidores dasatinib, sulfonamida e tiazole também foram
estudados com métodos de química quântica. Esses inibidores mostram
tendências químicas semelhantes com aqueles da classe pirrolo pirimidina, no
que se refere às interações com os aminoácidos da tríade catalítica,
enfatizando a necessidade dessas interações na construção de novos
inibidores. Além disso, a partir da análise de componentes principais, foi
mostrada uma correlação entre atividades e propriedades eletrônicas. A soma
de todos esses estudos leva a novas fronteiras para o entendimento da
interação de fármacos inibidores da proteína quinase e, consequentemente, a
compreensão da inibição da metástase, que são uma das maiores causas de
morte no mundo moderno.
5
Palavras-chave: FAK, inibidores, química computacional, câncer.
6
Abstract
The kinases proteins play important role acting in known biological
process, as the signal transduction. These processes are strongly related to the
development of malignant neoplasms. Therefore, the knowledge of the drug
action related to the kinase protein is relevant for the cancer treatment. In this
work, it was studied inhibitors of focal adhesion kinase (FAK) protein in order to
correlate theoretical properties with biological activity via IC50, to understand
the interaction between these drugs with FAK. In order to perform the
calculations it was employed several approaches of molecular modeling, as
molecular mechanics, ab initio and hybrid methods. For the quantum
mechanical approach we have used Hartree-Fock, density functional theory and
semi-empirical PM3, PM6, MNDO methods to describe the interaction between
the catalytic site of FAK binding and the selected inhibitors. Auto Docking Vina
program was employed to perform the rigid docking. The inhibitor activities of 7-
h-pirrole-pirimidines were compared to the results of quantum mechanical
approaches, and these results shows the important relation to the frontier
orbitals close to the Cys502 aminoacid. The largest contribution of these
orbitals is closely related to the FAK inhibition. The molecular interaction with
Arg454 and Lys454 aminoacids were also showed. Dasatinib, sulfonamide and
thiazole inhibitors also presents these main interactions, emphasizing the
relevance of catalytic site interaction of FAK with new inhibitors. Furthermore,
from the principal component analysis, it was shown a correlation between
activity and electronic properties. The present study leads to new frontiers for
the understanding the interaction between focal adhesion kinase and the
inhibitors, which is related to the metastase, one o the main reason of death in
the world
Keywords: FAK, inhibitors, computational chemistry, cancer.
7
Sumário
Introdução ....................................................................................................... 14
O que é câncer? ............................................................................................. 17
Estímulos ambientais..................................................................................... 18
As proteínas G acopladas e a transdução de sinais ................................... 19
Receptores Tirosina Quinase ........................................................................ 19
Integrinas ........................................................................................................ 20
As proteínas quinases e o câncer ................................................................ 20
A proteína quinase de adesão focal ............................................................. 22
A proteína quinase de adesão focal e o desenvolvimento do câncer. ...... 24
Inibidores de tirosina quinase ....................................................................... 25
Alguns inibidores da proteína quinase de adesão focal ............................. 26
Fármaco 7-h-pirrolo-pirimidina .................................................................. 26
O Fármaco Dasatinibe ................................................................................ 28
Bis Anilino Pirimidina ................................................................................. 29
Metanosulfonamida diaminopirimidina ..................................................... 30
Pirrolo 2,3 d tiazole ..................................................................................... 31
IC50 Concentração de Inibição a 50% ............................................................ 33
A química computacional e o estudo de alvos moleculares ...................... 33
Fundamentos da teoria quântica ............................................................... 34
8
Métodos Ab initio ........................................................................................ 35
Métodos Semi-Empíricos ........................................................................... 41
Mecânica Molecular .................................................................................... 43
A aproximação MP2 Moller-Plesset ........................................................... 45
Simulação de Solventes ............................................................................. 46
O método ONIOM ........................................................................................ 48
Termodinâmica estatística ......................................................................... 50
A Dinâmica molecular ................................................................................. 52
Docking Molecular ...................................................................................... 53
Análise de Componentes Principais ......................................................... 54
Objetivos ......................................................................................................... 31
Protocolos Utilizados ..................................................................................... 56
Metodologia 1 (Estudo dos inibidores pirrolo-pirimidinas) ..................... 56
Protocolo 2 (Estudo da molécula Dasatinibe) .......................................... 60
Protocolo 3 (Estudo dos complexos bis-anilino-piridina) ....................... 63
Protocolo 4 (Estudo do complexo 2-3-d-tiazole) ...................................... 64
Protocolo 5 ( Estudo da interação da molécula de ATP com a proteína
FAK). ............................................................................................................ 65
Resultados e discussão................................................................................. 67
Estrutura eletrônica e atividade das moléculas pirrolo-pirimidina ......... 69
Estrutura eletrônica e docking molecular da molécula dasatinibe ........ 83
Estrutura eletrônica e docking molecular da molécula sulfonamida ..... 89
9
Estrutura eletrônica e docking molecular da molécula ATP ................... 92
Estrutura eletrônica do complexo bis-anilino-pirimidina ........................ 96
Estrutura eletrônica da molécula pirrolo 2,3 d tiazole ............................. 99
Análise geral dos resultados obtidos ..................................................... 102
Conclusões ................................................................................................... 107
Perspectivas ................................................................................................. 110
Bibliografia .................................................................................................... 111
10
Lista de Tabelas
Tabela 1: Volume Molecular dos inibidores da proteína FAK .................... 68
Tabela 2: Ligações de hidrogênio realizadas entre os aminoácidos da
enzima FAK e as moléculas da classe pirrolopirimidina ............................ 69
Tabela 3: Energias de interação obtidas com diversos métodos e bases 77
Tabela 4: Resultados dos cálculos de energia livre usando o método
B3lYP/6-31g para a interação inibidor/aminoácidos do sítio ativo. ........... 80
Tabela 5: Contribuição entálpica e entrópica para a formação do
complexo inibidor/aminoácidos. ................................................................... 81
Tabela 6: Desvio de planaridade do fármaco dasatinibe utilizando
diferentes aproximações ............................................................................... 85
Tabela 7: Distâncias interatômicas das ligações de hidrogênio
estabelecidas entre o fármaco dasatinibe e os aminoácidos listados. ..... 87
Tabela 8: Distâncias de ligação entre o inibidor sulfonamida e os
aminoácidos da proteína quinase de adesão focal. .................................... 91
Tabela 9: Distâncias de ligações de hidrogênio realizada pela molécula de
ATP no sítio catalítico da proteína FAK. ...................................................... 94
Tabela 10: Aminoácidos da proteína quinase de adesão focal que
interagem com a molécula bis-anilino-pirimidina. ...................................... 97
11
Lista de Figuras
Figura 1. Modo de interação da enzima FAK com as demais proteínas
participantes do mecanismo de transdução de sinais ............................... 23
Figura 2. Estrutura molecular de molécula 7-h-pirrolo-pirimidina ............. 27
Figura 3. Estrutura molecular da molécula de dasatinibe. ......................... 29
Figura 4. Estrutura da molécula bis anilino pirimidina ............................... 30
Figura 5. Exemplo de uma curva dose/resposta para um inibidor ........ Erro!
Indicador não definido.
Figura 6. Diagrama esquemático do método ONIOM para uma proteína. . 49
Figura 7. Inibidores selecionados para o estudo de docking molecular
com proteína quinase de adesão focal......................................................... 57
Figura 8. Geometria otimizada dos inibidores estudados. ......................... 67
Figura 9. Potencial eletrostático calculado para os inibidores 1 e 16i. ..... 71
Figura 10. Orbitais de Fronteira calculados para a interação entre os
aminoácidos do sítio catalítico da proteína FAK com o inibidor 7-h-pirrolo-
pirimidina. ....................................................................................................... 72
Figura 11. Orbitais de Fronteira calculados para a interação entre os
aminoácidos do sítio catalítico da proteína FAK com o inibidor 7-h-pirrolo-
pirimidina. ....................................................................................................... 73
Figura 12. Orbitais de fronteira para inibidor 18i. ........................................ 73
Figura 13. Orbitais HOMO e LUMO para os inibidores 18i e 16i,
respectivamente. ............................................................................................ 74
12
Figura 14. Disposição dos orbitais HOMO e LUMO para o inibidor 32. ..... 75
Figura 15. Potencial eletrostático gerado para a interação entre o inibidor
17i e os aminoácidos Lys454, Arg412 e Cys502. ......................................... 76
Figura 16. Gráfico de componentes principais para os inibidores da classe
pirrolo pirimidina. ........................................................................................... 82
Figura 17. Droga dasatinibe ancorada ao sítio catalítico da proteína. ...... 84
Figura 18. Grupos químicos que apresentaram rotação dos diedros
durante a dinâmica molecular. ...................................................................... 86
Figura 19. Ligação de hidrogênio associada com a rotação do ângulo
diedro do grupo hidroxila do fármaco dasatinib. ........................................ 86
Figura 20. Mapa de potencial eletrostático obtido para o sítio da proteína
FAK com o fármaco dasatinibe obtido via a aproximação PM6. ................ 88
Figura 21. Inibidor sulfonamida ancorado ao sítio catalítico da proteína
quinase de adesão focal. ............................................................................... 90
Figura 22. Orbitais de Fronteira para interação entre o inibidor
sulfonamida e o sítio catalítico da proteína quinase de adesão focal. ...... 92
Figura 23. Interação da molécula de ATP com a proteína quinase de
adesão focal . .................................................................................................. 93
Figura 24. Orbitais de fronteira calculados para a interação da molécula
de ATP com o sítio da proteína FAK............................................................. 95
Figura 25. Potencial eletrostático calculado para a molécula de ATP
interagindo com o sítio catalítico da proteína FAK. .................................... 96
Figura 26. Orbitais de fronteira da molécula bis anilino pirimidina ........... 98
Figura 27. Potencial eletrostático obtido para interação entre o fármaco
bis-anilino-pirimidina. .................................................................................... 99
13
Figura 28. Fármaco 2,3 d tiazole complexado ligando-se ao aminoácido
Cys502 ........................................................................................................... 100
Figura 29. Orbitais de Fronteira para interação entre o fármaco 2,3,d
tiazole e o sítio catalítico da proteína quinase de adesão focal. .............. 101
14
Lista de Abreviaturas e Acrônimos
ALA - Alanina
ARG – Arginina
ASP – Aspartato
ATP – Adenosina Trisfosfato
CYS – Cisteína
DFT – Teoria do Funcional de Densidade
FAK – Focal Adhesion Kinase
GLU – Glutamina
HF – Hartre-Fock
IC50 – Inibição da Concentração de 50%
LEU - Leucina
LYS – Lisina
MET - Metionina
MP2 – Método Pertubacional de Segunda Ordem
Oniom-Own-m-Layered-Integrated – Molecular Orbital and Molecular
Mechanics
PCA – Análise de Componentes Principais
PCM – Modelo Contínuo
PHE - Fenilamina
QM/MM – quantum mechanics/molecular mechanics
RTK – Receptores Tirosina Quinase
SCF – Teoria do Campo Autoconsistente
SER – Serina
15
THR – Tirosina
UFF – Universal Force Field
16
Introdução
O estudo teórico de inibidores da proteína quinase de adesão focal
remete ao estudo de novas drogas contra o câncer. Essas drogas têm sido
utilizadas de modo diversificado no tratamento de tumores em estágio
avançado, tornando-se alternativas aos atuais tratamentos, como a
quimioterapia e a radioterapia. Inibir a atividade do processo bioquímico
conhecido como transdução de sinais é um pressuposto para construção de
novas moléculas, cuja função é bloquear a atividade do ATP e
consequentemente a metástase. Nesse sentido, será abordada nesse trabalho
uma definição gradual do câncer, iniciando-se com a definição macroscópica
em nível de tecido, passando pelo nível bioquímico e chegando a inibição em
nível molecular, que é a conjectura para o entendimento de inibição da
metástase.
17
O que é câncer?
O termo tumor (ou neoplasia) é usado para indicar um aumento de uma
parte ou totalidade de um tecido, podendo ser devido às chamadas neoplasias
malignas, o qual denominamos de câncer. Este é na realidade o termo usado
para um conjunto de mais de 100 doenças, nas quais as células se dividem
sem controle, sendo capazes de invadir outros tecidos 1. O câncer não é uma
única doença, mas várias, cujas denominações estão orientadas ao órgão ou
tecido lesado, como por exemplo, carcinoma, sarcoma, leucemia, linfoma e
melanoma e no sistema nervoso central. No organismo, as células crescem e
se dividem de uma maneira controlada, criando assim novas células 2.
Chegando por fim à morte celular que pode ser classificada de acordo com
sua aparência, tal qual, apoptose, necrose, autofágica, ou associada com a
mitose 3. Estudos sobre a apoptose aumentaram bastante desde a década de
1990, com o prêmio Nobel de medicina em 2002 para o trabalho que
identificava os genes relacionados ao controle da apoptose. A importância dos
estudos de apoptose levou a criação de periódicos especializados nesse tema
tais como: Cell Death and Differentiation da Nature e a revista Apoptosis da
Springer, desde 1996. O câncer tem início nas células, quando alterações
genéticas levam o DNA dessas células a produzir mutações, as quais afetam
um amplo espectro de funções destas células, como proliferação, migração,
diferenciação e morte celular. As novas células formam um tumor que pode ser
benigno ou maligno, que no último caso é denominado de câncer.
18
A propagação do câncer para outros tecidos do corpo se dá mediante a
chamada metástase. A origem da metástase está intimamente correlacionada a
reações bioquímicas que ocorrem dentro das células. Essas envolvem a
comunicação celular mediante a transdução de sinais, que ocorre quando um
sinal extracelular ativa uma proteína receptora presente na superfície das
células. A ativação se dá pela mudança conformacional da proteína receptora,
desencadeando dessa forma uma resposta física por parte da célula. Essas
respostas podem ser dadas na forma de multiplicação celular ou mesmo a
morte programada (apoptose).
Uma breve explanação acerca dos estímulos ambientais associado ao
processo de transdução de sinais demonstrará como se inicia esse processo
bioquímico de transdução de sinais. Em seguida serão demonstrados os
caminhos ulteriores percorridos pela transdução de sinais.
Estímulos ambientais
Há vários modos de iniciar o processo de transdução de sinais. Fótons
advindos do ambiente externo podem interagir com as células da retina do
olho, desencadeando respostas bioquímicas, cuja finalização resultará na
formação das imagens que enxergamos. Esse processo é conhecido como
fototransdução. Pode-se ainda ressaltar, a título de exemplo, a nossa
percepção acerca dos odores. Nesse mecanismo bioquímico, o estímulo
ambiental ocorre pela interação das moléculas odorantes com receptores no
epitélio nasal4. Essas realidades demonstram a vitalidade desse processo
bioquímico na percepção do mundo pelos seres vivos.
19
De modo análogo aos exemplos anteriores, porém essencialmente
deletério, verifica-se a existência de desordens transducionais propiciadas pelo
meio externo à célula e aos tecidos. Nesses processos, verifica-se uma
desordem no processo de transdução de sinais, cujo resultado é conhecido
como câncer. Mutações no DNA, propiciadas pelos fótons ambientais,
alimentos e certos organismos como vírus, têm sido correlacionadas com o
descontrole do mecanismo de comunicação celular 3.
O fenômeno de transdução de sinais envolve uma série de moléculas
bioquímicas cuja ênfase se faz necessária para o entendimento de processos
bioquímicos que propiciam a metástase.
As proteínas G acopladas e a transdução de sinais
A sinalização celular inicia-se com uma proteína do tipo G acoplada
inativa, que são proteínas transmembranares. Um ligante do meio exterior se
liga à proteína G, levando a mudanças conformacionais nessa molécula,
tornando-a ativa. Essas mudanças conformacionais propiciam a interação das
proteínas G acopladas com outras moléculas 5. O tempo total de atuação das
proteínas do tipo G é mediado pela interação molécula/receptor.
Receptores Tirosina Quinase
Receptores tirosina quinase (RTK) são proteínas transmembranares,
com um domínio quinase intracelular e extracelular, que se liga aos íons ou
moléculas específicas. Como exemplo podemos citar as proteínas de fator de
crescimento, capazes de estimular o crescimento celular, ou mesmo receptores
de insulina, que regulam o metabolismo de carboidratos e gorduras no corpo 6.
20
A fim de realizar a transdução de sinais, as proteínas RTK precisam
formar dímeros na membrana plasmática. Esses dímeros são estabilizados por
moléculas específicas que se ligam ao receptor 7. A interação dessas
proteínas, com o meio citoplasmático, estimula à auto fosforilação de tirosinas
dentro do domínio das proteínas RTK, causando mudanças conformacionais.
Os receptores quinase são subsequentemente ativados, iniciando a cascata de
sinais, via fosforilação no citoplasma, que facilita vários processos celulares,
tais quais a diferenciação celular e o metabolismo 6.
Integrinas
As integrinas são produzidas por grande variedade de células, cuja
função é a adesão celular e a transdução de sinais provenientes da matriz
extracelular. De forma análoga as RTKs, as integrinas são ativadas via ligação
de moléculas específicas a sua cavidade catalítica, propiciando mudanças
conformacionais na estrutura proteica, cuja resposta é a inicialização da
transdução de sinais. Essas proteínas têm sido correlacionadas com o
desenvolvimento da metástase.
As proteínas quinases e o câncer
As proteínas quinases são enzimas que catalisam as reações de
fosforilação entre proteínas. Essas entidades macromoleculares propiciam a
transferência de um grupo fosfato para os aminoácidos Thr e Ser.
O grupo de enzimas denominadas quinases constitui uma família muito
numerosa de proteínas em eucariotos 8 e é o cerne da comunicação e
regulação intracelular. O mecanismo regulador envolve fenômenos variados,
21
que vão desde a alteração de estruturas proteicas até o controle transcricional.
Por isso, um entendimento detalhado dessas enzimas, bem como dos seus
respectivos mecanismos de atuação, tem sido foco de constantes pesquisas
científicas, principalmente na descoberta de novos fármacos 9. A importância
singular, desse ramo científico da bioquímica, ainda pode ser vislumbrada pela
existência de várias revistas científicas, de alto impacto acadêmico, dedicadas
ao processo de transdução de sinais 10,11.
A participação de proteínas quinases no desenvolvimento da metástase
está bem estabelecida, pois verifica-se que essas enzimas se encontram
desreguladas em tumores, mantendo a fosforilação, que leva aos sinais de
transdução a um estado permanentemente ativado 12.
Atualmente há inúmeros medicamentos antitumorais cuja atuação se dá
em nível do processo de transdução de sinais. Dentre esses medicamentos
pode-se destacar o imatinibe (Gleevec)® que teve grande relevância para o
tratamento da leucemia mielóide crônica. O imatinibe inibe especificamente a
enzima BCR-ABL, uma tirosina quinase que participa do processo de
transdução de sinais, bem como no desenvolvimento de tumores 13. Esse
medicamento teve especial importância no desenvolvimento de moléculas
inibidoras de quinase 14 15.
Apesar da singularidade dessa molécula, cuja inibição se dá em alvos
enzimáticos específicos, tem se verificado um aumento da resistência ao
tratamento com esse fármaco. Essa resistência se dá através da aquisição de
mutações secundárias nas quinases, aumento do fluxo e metabolismo dos
fármacos, bem como a utilização de vias oncogênicas distintas 9. Diante dessa
22
realidade, são propostos outros fármacos inibidores de proteínas quinases,
cuja inibição ocorre em diferentes tipos de enzimas 16.
A proteína quinase de adesão focal
As enzimas quinases de adesão focal (FAK) se localizam no meio
citoplasmático, conectadas com as integrinas. O aumento da fosforilação da
proteína FAK tem sido correlacionado com a interação das integrinas com a
fibronectina, que é uma proteína adesiva que ajuda as células a aderirem a
matriz celular 17.
A enzima FAK faz parte da família dos receptores de tirosinas quinases.
Essa é encontrada em muitos tipos de tecidos e células e é conservada em
mamíferos bem como em eucariotos como as drosófilas 18.
A estrutura da enzima FAK compreende um domínio catalítico, ao lado
de domínios não catalítico de terminais N-C, que são os átomos finalizadores
da cadeia polipeptídica 19. Possui uma massa de 125kDa e é encontrada no
citosol. Em geral, os membros dessa família são ligados à glicoproteínas
transmembranares. In vitro verifica-se que os domínios N terminais se ligam às
subunidades das integrinas 20, embora essa interação in vivo ainda seja
desconhecida. O domínio N terminal, da enzima FAK, também regula a
interação com as proteínas de fator de crescimento epidérmicas, embora ainda
não seja claro onde ocorra essa interação 21.
A fosforilação da proteína FAK é uma reposta da interação das proteínas
integrinas com sinalizadores químicos, cuja continuidade induz mudanças
conformacionais que promovem a interação com outras proteínas,
23
prosseguindo dessa forma, o mecanismo de transdução de sinais. Essa
realidade é mais bem contemplada com o auxílio da Figura 1.
Figura 1. Modo de interação da enzima FAK com as demais proteínas participantes do mecanismo de transdução de sinais
Consideráveis evidências mostram que a proteína FAK está intimamente
envolvida no processo de regulação da migração celular. Quando se verifica a
deficiência da proteína FAK, as células se espalham mais lentamente, exibindo
dessa forma mais adesões celulares 23.
Pode-se verificar, portanto que a enzima FAK é um componente crucial
na sinalização celular, ativando numerosos estímulos e biosensores integrados
com o controle da motilidade celular. Através das múltiplas conexões
moleculares, a enzima FAK pode influenciar o citoesqueleto, estruturas de
adesão celular e sítios regulam o movimento celular 24.
24
A proteína quinase de adesão focal e o desenvolvimento do câncer.
A enzima FAK é uma importante mediadora nos processos de
proliferação celular, sobrevivência celular e migração celular. Dado que o
desenvolvimento de tumores malignos está associado com a perturbação
nesses processos, não é surpreendente o fato de que a atividade da proteína
FAK esteja alterada em células cancerígenas.
Modelos usando ratos têm mostrado que a FAK está envolvida na
formação e progressão de tumores. Outros estudos mostram ainda que a super
expressão da FAK é observada em tumores malignos, tornando a FAK, dessa
forma, um alvo interessante no desenvolvimento de fármacos contra o câncer
25.
Estudos sobre a expressão anormal da FAK demonstraram alterações
fenotípicas nas células, bem como em outras funções celulares. Em vários
tipos de tumores como os de tireoide, próstata, cólon e ovário observa-se uma
expressão elevada da proteína FAK correlacionando-se ainda com o aumento
substancial da metástase 26 27 28 29 30 . Em adição, a FAK regula a formação do
tumor e a progressão do mesmo 31. Nesse sentido, a inibição da proteína FAK
é evidenciada como uma nova estratégia para o tratamento do câncer 25.
As proteínas quinases existem em duas conformações de equilíbrio:
uma é ativa e a outra inativa 32. A ativação da FAK se dá pela fosforilação de
aminoácidos no conhecido laço de ativação. Essa parte da proteína contém
três resíduos altamente conservados que formam o motivo DFG, que são
curtas sequências de aminoácidos que se repetem em outras proteínas. A
conformação derivada da fosforilação do laço de ativação é a estrutura da FAK
25
ativada. A conformação ativa do padrão DFG é muito similar entre as quinases.
Desse modo, muitos inibidores da proteína FAK são construídos a fim de inibir
a ativação da proteína FAK, via alvos moleculares no padrão DFG. Essas
moléculas são conhecidas como inibidores do tipo I. Inibidores dessa categoria
se ligam diretamente ao sítio de ligação do ATP, competindo diretamente com
o mesmo.
Inibidores de tirosina quinase
Existem no mercado vários fármacos para o tratamento de tumores
específicos, cujo enfoque é a inibição de proteínas quinases. Dentre esses
podemos destacar a droga imatinibe, cujo desenvolvimento se deu para o
tratamento do câncer de mieloide, e inaugurou a era das drogas do tipo tinibes
33.
O exacerbado uso desse medicamento gerou a resistência por parte das
doenças tratáveis, o que levou ao aparecimento de novas drogas no mercado.
Surgiram, dessa maneira, as drogas inibidoras de multiquinases. Dentre essas
podemos destacar o lapatinibe 34, carnetinibe 35, nilotinibe 36 e o dasatinibe
conhecido como sprycel® 37.
A observação das estruturas moleculares desses fármacos revelam
estruturas farmocofóricas comuns entre eles. O carnetinibe e o lapatinibe
possuem núcleos quinazolínicos. Essas características farmacofóricas em
comum foram inseridas, a fim de mimetizar o anel de adenina do substrato ATP
facilitando assim a ligação na região de dobradura, conectando os domínios N
e C terminal do sítio catalítico 10.
26
Geralmente os inibidores de proteína quinase competem pelo sítio da
ligação da molécula de ATP, possuindo aspectos terapêuticos garantidos,
podendo ser combinados com outros tipos de tratamento como aqueles
provenientes de fontes radioativas e aqueles de quimioterápicos 38.
Existem mais de noventa proteínas quinases, cujo modo de ativação se
dá pela transferência de grupos fosfato, provenientes do seu sítio catalítico.
Observa-se desse modo que a topologia do sítio catalítico nessas enzimas é
bastante similar, porém altamente seletiva, constituindo, desse modo, um
desafio à construção de moléculas que inibam a atividade dessas enzimas 39 40
41.
Para a molécula de ATP são observadas ligações com o sítio através
dos aminoácidos Asp381, Phe382 e Gly383.
Alguns inibidores da proteína quinase de adesão focal
Como seria demasiado longo trabalhar atomisticamente com todos os
inibidores da proteína quinase de adesão focal, podendo dizer que é não
tratável nas condições atuais, restringir-se-á este trabalho a algumas moléculas
de aplicabilidade mais recente na indústria farmacêutica.
Fármaco 7-h-pirrolo-pirimidina
A molécula 7-h-pirrolopirimidina, produzida pela indústria Astrazeneca,
tem sido correlacionada com a inibição da proteína FAK. Estudos em ratos,
utilizando células de melanoma humano, mostraram que o bloqueio da
atividade da enzima FAK propicia a inibição do crescimento de tumores
27
primários e virtualmente eliminam a metástase 42. Por conseguinte, o fármaco
da classe 7-h-pirrolopirimidina atua como uma importante regra no tratamento
desses tipos de cânceres. A estrutura molecular dessa droga é mostrada na
Figura 2:
MeOMeO OMe
NHN
N
N
N
Figura 2. Estrutura molecular de molécula 7-h-pirrolo-pirimidina
Nesse trabalho foram escolhidas as drogas da classe 7-h-pirropirimidina
sintetizadas por Choi e colaboradores 42, cuja diferenciação se dá pelo
acréscimo do grupo carboxilato em diferentes posições no anel piridínico.
Nesse artigo, essas drogas foram denominadas utilizando a mesma notação do
autor, 1, 16i, 18i, 17g, 17h, 17i e 3242. A disposição do grupo carboxilato em
diferentes substituições no anel piridínico, associada com o computo do IC50
para cada droga, foi associada nesse trabalho com a energia de interação.
Esse estudo teve o intuito de estabelecer uma possível relação entre energia
de interação inibidor/sítio com o IC50, seguindo trabalho estudos da literatura 42.
28
Para estes inibidores procedeu-se ainda estudos estatísticos, cujo
resultado propicia o agrupamento desses fármacos de acordo com suas
atividades.
O Fármaco Dasatinib
Dasatinibe é uma droga produzida pela indústria farmacêutica Bristol-
Myers Squibb®, a qual é utilizada para o tratamento do câncer de mielóide e
próstata. A venda dessa droga se dá sobre o nome de Sprycel. Essa molécula
tem conhecida atividade inibitória de receptores tirosina quinase. De modo
específico, está correlacionada com inibição das enzimas BCR/ABL, Src e c-Kit.
O fármaco Dasatinibe foi escolhido pois apresenta também atividade
inibitória para a proteína FAK 43. Portanto, o uso dessa droga poderia se
estender ao tratamento de outros tipos de câncer, tais quais os relacionados ao
pulmão, esôfago, tireóide, mama entre outros 44 45 . A estrutura do fármaco
dasatinibe pode ser vislumbrada na Figura 3. Nesse trabalho, a droga dasatinib
foi ancorada ao sítio catalítico da proteína quinase de adesão focal, com o
intuito de estabelecer quais aminoácidos poderiam interagir com essa
molécula, no sítio catalítico. A fim de auxiliar na busca de uma conformação de
equilíbrio para o complexo inibidor/proteína, foram empregados métodos
quânticos semi-empíricos para a otimização do complexo molecular. Uma
dinâmica molecular foi ainda empregada para a busca de possíveis ligações
fora do equilíbrio. Cálculos de propriedades eletrônicas foram usados para
corroborar esses resultados, que podem ser comparados com aqueles das
drogas da classe pirropirimidina.
29
Figura 3. Estrutura molecular da molécula de dasatinibe.
Bis Anilino Pirimidina
O fármaco da classe bis anilino pirimidina 46 inibe a autofosforilação da
matriz celular induzida, pela proteína quinase de adesão focal. Essa droga
retarda o crescimento de células tumorais, atenua a progressão do ciclo celular
e, ainda, inibe a invasão da célula tumoral, em pelo menos 50%. Pode ser
utilizado no tratamento de tumores de mama e de pulmão. A estrutura dessa
droga pode ser visualizada na Figura 4. Esta droga apresenta um padrão
molecular semelhante a dasatinib, portanto também foi selecionada para o
cálculo de estrutura e atividade.
30
Figura 4. Estrutura da molécula bis anilino pirimidina
Neste trabalho foram realizados cálculos de estrutura eletrônica para
essa droga ancorada ao sítio catalítico, na intenção de determinar possíveis
interações com aminoácidos encontrados em outras classes de drogas como
aquelas provenientes da estrutura da 7-h-pirrolopirimidina.
Metanosulfonamida diaminopirimidina
A molécula da classe metanosulfonamida diaminopirimidina 47 é um
potente inibidor competitivo da molécula de ATP, apresentando inibição robusta
da proteína quinase de adesão focal em ensaios celulares. Tem aplicações no
tratamento de câncer de cólon e pulmão.
No presente trabalho, a droga metanosulfonamida foi estudada ancorada
ao sítio catalítico da proteína FAK, empregando-se cálculos de estrutura
eletrônica que pudessem determinar interações com aminoácidos específicos
presentes no sítio catalítico. A realização desses cálculos teve o intuito de
verificar interações dessa droga com aminoácidos presentes em outros
inibidores da FAK.
31
Pirrolo 2,3 d tiazole
O composto 2,3 d tiazole é capaz de induzir a morte programada das
células em diferentes linhas de células antitumorais 48. A droga foi estudada
nesse trabalho ancorada ao sítio catalítico da proteína FAK, empregando-se
cálculos de estrutura eletrônica para encontrar geometrias de equilíbrio. Esse
estudo teve o objetivo de confrontar as interações presentes no complexo
droga/enzima com interações presentes em outros inibidores da proteína FAK.
IC50 Concentração de Inibição a 50%
O IC50 será utilizado ao longo deste estudo como uma base para acessar
a informação de atividade da droga. Esta é uma medida de efetividade de um
composto na inibição de atividades biológicas ou bioquímicas. Essa medida
quantitativa indica quanto de uma droga ou substância particular é necessário
para inibir uma resposta bioquímica pela metade. Em outras palavras, é a
metade de máxima inibição de uma substância. Essa medida experimental é
utilizada como medida do potencial de drogas na pesquisa farmacológica. O
IC50 de uma droga pode ser determinado construindo-se a curva dose-resposta,
e verificando o efeito de diferentes concentrações do antagonista invertendo a
atividade do agonista, conforme o gráfico ilustrativo presente na Figura 5.
32
Figura 5. Exemplo de uma curva dose/resposta para um inibidor
Os valores de IC50 são dependentes das condições nos quais eles são
aferidos. Além disso, dependendo do tipo de inibição, outros fatores podem
influenciar os valores de IC50. Para enzimas dependentes de ATP, os valores
de IC50 tem interdependência com a concentração de ATP, principalmente se a
inibição deles é competitiva. O IC50 pode der usado para comparar o potencial
de dois ou mais antagonistas.
Objetivos
Objetivo Geral
Esse trabalho tem como objetivo correlacionar às propriedades
biológicas dos inibidores da proteína quinase de adesão com determinadas
propriedades eletrônicas, procurando-se estabelecer padrões que ajudem na
construção de novas moléculas inibidores da enzima FAK.
Objetivos específicos
a) Comparação da atividade biológicas (IC50) dos inibidores da classe
pirrolopirimidina com propriedades eletrônicas derivadas de cálculos de
estrutura eletrônica.
33
b) Estudo da interação fármaco/receptor para a droga dasatinib, com
consequente obtenção de propriedades químicas e eletrônicas via cálculos de
estrutura eletrônica.
c) Estudo teórico do ATP, da droga sulfonamida, anilinopirimidina, e
tiazole com o intuito de obter uma descrição química e eletrônica da interação
fármaco receptor.
d) Inferir características químicas e eletrônicas comuns, que tornam os
inibidores estudados em potenciais drogas para o combate do câncer,
auxiliando dessa forma na construção de novas drogas com maior potencial de
inibição para a enzima quinase de adesão focal.
Fundamentação Teórica
A química computacional e o estudo de alvos moleculares
As proteínas possuem alta especialização em relação às reações que
catalisam, bem como na interação com o substrato que interage com o seu
sítio catalítico. Nesse sentido, os inibidores devem possuir geometria
complementar ao do sítio catalítico das enzimas, de modo a propiciar um dos
requisitos que é a interação fármaco-receptor com menor energia livre possível,
podendo estar associada ainda a ganhos entrópicos pela desordem de águas
de solvatação. Esse tipo de interação é analisado mediante a técnica de
docking molecular, que é uma técnica computacional que prediz a melhor
orientação da droga em relação ao sítio catalítico da enzima estudada 49. A
34
interação da molécula alvo com o sítio catalítico da enzima pode ser utilizada
na predição da afinidade e a atividade da droga.
O uso da técnica de docking molecular requer conhecimento da
estrutura eletrônica de átomos e moléculas, cujas orientações e disposições no
espaço são descritas pela mecânica clássica. Nesse sentido, serão avaliados
alguns conceitos e metodologias essenciais para o cálculo de estruturas
eletrônicas que figuram em uma importante regra na obtenção das
propriedades de átomos e moléculas. Esses métodos diferem essencialmente
na exatidão da obtenção de certas propriedades, estabelecendo uma relação
inversamente proporcional com o custo computacional exigido para a obtenção
dessas propriedades.
Fundamentos da teoria quântica
A fim de descrever sistemas microscópicos, faz-se o uso da mecânica
quântica. Essa ciência foi erguida sobre as controvérsias experimentais do
início do século XX, cujos resultados divergiam inesperadamente dos
resultados previstos pela mecânica clássica. Dentre esses, merece destaque o
experimento da radiação do corpo negro, que é aquele que absorve toda
radiação eletromagnética. Muitos estudiosos tentaram conciliar o conceito do
corpo negro com a distribuição de energia prevista pela termodinâmica, porém
essas explicações resultaram em divergências como a conhecida catástrofe do
ultravioleta. Planck sanou o problema em 1901, ao introduzir a constante de
Planck como mero recurso matemático, bem como introduziu a quantização de
energia. Essa ideia inicial levaria aos fundamentos da mecânica quântica. De
35
Broglie demonstrou mais tarde que a matéria se comporta como onda e
partícula baseando-se no conceito de quanta desenvolvido por Planck na
radiação do corpo negro e por Einstein no experimento do efeito fotoelétrico.
Em 1927 Werner Heisenberg, trabalhando com variáveis observáveis, enuncia
o Princípio da Incerteza. Existe uma incerteza na determinação do momento da
partícula quando se determina a posição da mesma. Baseado em tais
realidades, foi desenvolvido o conceito de função de onda Ψ, cuja aplicação de
um operador retorna uma propriedade observável. O quadrado dessa função
de onda é a probabilidade de encontrar a partícula em um elemento diferencial
de espaço.
Métodos Ab initio
Os métodos ab initio são aqueles cuja obtenção das propriedades
eletrônicas de átomos e moléculas, é feita a partir das equações da mecânica
quântica 50. A implementação da mecânica quântica para átomos e moléculas
se dá pela resolução da equação de Schröndinger.
),(),(ˆ rRErRH (1)
onde R e r representam as coordenadas nucleares e eletrônicas do sistema
molecular, respectivamente.
A energia do sistema é obtida através da solução da Equação 1, com a
atuação do operador hamiltoniano descrito pela Equação 2 sobre a função de
36
onda ( em unidades atômicas). O hamiltoniano (Equação 2) descreve uma
molécula constituída por elétrons e núcleos.
A AB AB
BA
i j iji A iA
AiA
R
ZZ+
r+
r
Z=H
1
2
1
2M
1
A i
22
A (2)
Nessa equação, o primeiro termo representa a energia cinética dos
elétrons, o segundo termo diz respeito à energia cinética dos núcleos. O
terceiro termo representa a interação entre núcleos e elétrons. O quarto termo
denota a interação dos elétrons. O quinto termo é a interação entre os núcleos.
A Equação 1, com o hamiltoniano dado pela Equação 2, não tem
solução analítica para sistemas de muitos corpos, tanto analiticamente quanto
computacionalmente. Dessa forma, aproximações se fazem necessárias.
Em 1926, Max Born e Robert Oppenheimer propuseram uma
aproximação para equação de Schrödinger para o movimento dos núcleos.
Usando a expansão adiabática descrita pela equação 3 na equação1, é
possível desacoplar a equação de Schrödinger em duas outras: Uma
eletrônica e outra nuclear. Esta aproximação é conhecida como aproximação
de Born-Oppenheimer.
ψ(R,r)=Qnúcleos (R)Felétrons( R,r) (3)
A equação eletrônica irá assumir uma dependência paramétrica em relação a
posição do núcleo. Pode-se agora resolver a equação eletrônica e nuclear
separadamente.
37
Uma segunda aproximação remete ao problema de muitos corpos
presente nos problemas de química quântica desde o advento dessa ciência na
segunda década do século XX 51. Para sistemas multieletrônicos a solução das
integrais de interação entre dois ou mais elétrons é o problema de interação
entre muitos corpos. Essa dificuldade física é o gargalo temporal dos cálculos
computacionais de química quântica, cujas aproximações para contornar essa
realidade vão caracterizar o surgimento de múltiplos métodos de química
computacional.
Os cientistas Hartree e Fock propuseram um método alternativo para
tratar o problema de interação entre muitos elétrons. Nesse método, cada
elétron interage com o campo médio gerado pelos demais elétrons (Hartree),
seguido da antissimetrização (Fock). Essa metodologia negligencia o efeito de
correlação que existe na interação entre dois elétrons.
Outro método que se vale de aproximações para contornar o problema
de correlação eletrônica é o método DFT (Density Functional Theory). A teoria
do funcional de densidade é uma alternativa aos cálculos de estruturas
eletrônicas. Essa metodologia propicia um ganho de tempo computacional e
uma redução do uso de memória na execução de cálculos de estruturas
eletrônicas.
Diferente das metodologias provenientes do método Hartree-Fock-
Roothaan e pós-Hartree-Fock, o método DFT usa a densidade eletrônica como
entidade mecânico-quântico em vez da função de onda presente nos outros
métodos de cálculo de estrutura eletrônica. A teoria do DFT foi inicialmente
desenvolvida por P. Hohenberg e W. Kohn. A partir desse estudo foram
38
desenvolvidas equações auto-consistentes para o tratamento do efeito de troca
e correlação 52. De modo geral, o método DFT é regido por dois postulados
essenciais:
1) A função de onda do estado fundamental, e daí todas as
propriedades desse estado são funcionais da densidade eletrônica.
2) A energia do estado fundamental de um sistema multieletrônico
sob um potencial elétrico V(r), pode ser escrita como:
)()()()]([ FdrrrvrEv (4)
Onde F é o funcional universal de que independe de v(r).
Um problema inerente à equação (4) é a obtenção da função analítica
que represente . Essa representação é geralmente derivada de um cálculo do
tipo HF (Hartree-Fock) através de um método auto-consistente de modo que a
função de onda esteja no mínimo de energia.
Para se iniciar um cálculo do tipo DFT, procede-se a escolha das bases
atômicas, para construção dos orbitais moleculares de acordo com a Equação
5.
M
ii C
(5)
A aplicação do método variacional conduz a equação matricial (6)
SCChKS
(6)
onde
39
KShh
S
xcneKS Vdrrr
rVh ´
´
)́(
2
1 2
Nessa equação h é o operador hamiltoniano para a teoria do funcional de
densidade, e S é a integral de sobreposição dos orbitais atômicos. O operador
h contém a energia cinética dos elétrons, a interação núcleo-elétron, interação
elétron-elétron e o conhecido potencial de troca. A resolução da equação
matricial é análoga àquela aplicada à matriz de Fock. Temos ainda que a
resolução das partes que correspondem à energia cinética eletrônica e a
interação de Coulomb são idênticas aos dos elementos da matriz de Fock.
Todavia, o termo de troca e correlação é dado em termos da densidade
eletrônica, podendo envolver a derivada da densidade eletrônica como
mostrado na equação 7.
drrrrVr xc )()(),()((7)
O funcional xcVdepende da integração de variáveis implícitas via obtenção da
densidade eletrônica. Essas integrais geralmente não podem ser calculadas
analiticamente, mas precisam ser geradas por uma integração numérica.
40
kkk
G
k
kxcxc vrrrrVdrrrrVr )()()(),()()(),()(1 (8)
Como o número de pontos da malha vai para o infinito, a aproximação se torna
exata. No ambiente computacional o número de pontos da malha vai depender
da precisão que se almeja no resultado final.
Metodologias para a resolução da equação de energia no
método DFT
Uma das diferenças do método DFT em relação aos demais métodos ab
initio é o uso de funções matemáticas para representar os termos que
compõem o funcional de energia. A partir da equação 5 pode-se descrever o
funcional F( ) pela soma dos funcionais de energia cinética T( ) e de
repulsão eletrônica V( ), assim a energia eletrônica se torna:
eeel VdrrvrTE )()()()((9)
A descrição de cada termo do funcional energia denotará uma
metodologia diferente para a obtenção das propriedades eletrônicas na teoria
do DFT.
Nesse trabalho será utilizada a aproximação GGA (Generalized
Gradient Approximation) para a correção do termo de troca e correlação devido
à repulsão eletrônica 53. A energia de correlação irá depender não somente de
41
densidade eletrônica, mas também da derivada da densidade. Esse método
apresenta ainda tratamento exato para energia cinética com uma descrição
simples para o termo de troca e correlação dada pela equação (9).
drsFrpECGA
x )()(3
4
3][ 3
43
1
(10)
Onde s é igual
)(2
)(
rK
rs
F
Métodos Semi-Empíricos
Os cálculos de estrutura eletrônica que fazem o uso da teoria do DFT
ainda são excessivamente complexos para serem aplicados a moléculas
biológicas como proteínas. Dessa forma, novas aproximações são necessárias
para tornar os métodos de mecânica quântica aplicáveis ao estudo de
estruturas de macromoléculas biológicas. Por conseguinte, é recorrente o uso
dos métodos semi-empíricos, os quais utilizam dados experimentais para
simplificar o cálculo de integrais de dois elétrons, diminuindo substancialmente
o tempo computacional para o cálculo de estruturas eletrônicas.
Porém, esses cálculos, apesar de serem mais robustos que aqueles
ditos ab initio, apresentam dificuldades quanto ao tempo computacional quando
aplicados a maior número de átomos, pois apresentam escalonamento
42
quadrático quanto ao uso da memória devido à diagonalização da matriz de
Fock.
Com efeito, atualmente estão sendo desenvolvidos algoritmos de
escalonamento linear para contornar o problema de diagonalização da matriz
de Fock. No presente trabalho, será utilizado o método de escalonamento
linear desenvolvido por Stewart 54. Este método de escalonamento, proposto
por Stewart e colaboradores, aplica as rotações de Jacobi ao bloco ocupado
virtual da matriz de Fock em orbitais moleculares localizados. Esses tipos de
orbitais moleculares são limitados a uma região específica da molécula a
exemplo de ligações específicas, ou um par de elétrons isolados.
Orbitais moleculares localizados (LMO) são obtidos pela transformação
unitária sobre um conjunto de orbitais moleculares canônicos 55. A
transformação geralmente envolve a otimização do valor esperado de um
determinado operador. De modo genérico, a forma do operador de localização
L pode ser escrito como (equação 11):
n
i
iiii LL1
(11)
Onde é o orbital molecular espacial.
A qualidade dos resultados de cálculos de estrutura eletrônica que
fazem uso dos métodos semi-empíricos, dependerá da escolha de uma
aproximação que possa descrever de forma acurada as propriedades das
macromoléculas biológicas. Neste trabalho, será utilizada a aproximação PM6,
AM1, MNDO, PM3 presentes no programa Cache 56 e Gaussian. Cada uma
43
dessas aproximações semi-empíricas apresenta tratamentos distintos na
parametrização e funções usadas para substituir as integrais. No método
MNDO (Modified Neglect of Diatomic Overlap), tem-se o negligenciamento da
integral diatômica de sobreposição. O método PM3 (Parameterized Mode) e o
AM1 (Austin Model) usam a mesma aproximação que o método MNDO, o
diferencial reside nas parametrizações e nas funções para representar a
repulsão dos elétrons do caroço, que foram corrigidas devido aos erros em
sistemas com ponte de hidrogênio. No método PM3 são usadas duas
gaussianas, enquanto no método AM1 usa-se de três a quatro funções
gaussianas por elemento. Outra diferença substancial reside na abordagem
filosófica dos métodos. Enquanto no método AM1 existem parâmetros
oriundos de dados experimentais, no método PM3 esses foram reotimizados.
O método PM6 incorpora a filosofia do método PM3, porém com a
parametrização para mais de 70 átomos, melhorias nos mesmos.
Mecânica Molecular
Os métodos semi-empíricos têm conquistado um espaço
relevante no cálculo de estruturas moleculares com grande número de átomos.
Entretanto, tais métodos ainda são limitados quando o sistema molecular é
excessivamente grande ou demanda uma evolução temporal do sistema, com
o uso da dinâmica molecular. A fim de contornar essa problemática, tem-se
utilizado a mecânica molecular para cálculos de estruturas moleculares com
milhares e até milhões de átomos.
44
A mecânica molecular é um método de química computacional
que se vale das leis clássicas da física propostas por Robert Hooke. Nessa
metodologia, a descrição da ligação química é feita através do uso de funções
harmônicas. Tais funções são parametrizadas por métodos quânticos a fim de
representar o comportamento da molécula. Cálculos que se valem dessa
aproximação, apresentam escalonamento linear no tempo de cálculo
computacional.
A essência da mecânica molecular é a construção de um campo
de força clássico, através do somatório de diversas funções harmônicas e
termos de interação de van der Walls e eletrostáticos. De modo mais particular,
deve-se realizar o somatório de funções que representem o estiramento das
ligações químicas, a deformação angular, a deformação de diedros, bem como
componentes que representem a interação entre os átomos. Nesse caso,
constroem-se funções que envolvem o potencial eletrostático e interações de
curto e longo alcance. Em geral, pode-se representar um campo de força da
seguinte forma:
1
1 1 0
6
0
12
0
0,
2
0
2
0
42
)](cos1[2
1)(
2
1)(
2
1)(
N
j
N
ji ij
ji
ij
ij
ij
ij
ji
TORSÕES
N
ÂNGULOS
a
LIGAÇÕES
B
N
r
r
r
r
r
VKllKrV
(12)
O primeiro termo descreve o estiramento das ligações químicas, o
segundo a deformação angular, o terceiro os ângulos diedros, o quarto o
45
potencial de Lernad Jones e o quinto a interação eletrostática existente entre
as moléculas.
A aproximação MP2 Moller-Plesset
A aplicabilidade dos métodos de química computacional em moléculas
biológicas não se restringe a sistemas moleculares com milhares de átomos,
mas também se dá em sistemas com pouco mais de cem átomos. Nessa
situação, métodos mais refinados de cálculo são utilizados para estimar
propriedades que são dependentes do efeito de correlação eletrônica.
Um dos vários métodos que consideram o efeito de correlação
eletrônica é o método MP2 ( Moller-Plesset Theory) 58. Assim, os efeitos de
correlação eletrônica são adicionados através da teoria de perturbação de
Rayleigh–Schrödinger. Nessa aproximação, adiciona-se uma perturbação ao
operador Hamiltoniano, cuja simulação é conhecida, para simular a correlação
eletrônica, como pode ser visto na Equação 13.
VHH ˆˆ0
(13)
Nesta equação o H0 é o operador não perturbado e V̂ é uma perturbação
externa corrigida pelo parâmetro . A energia e a função de onda são
perturbadas pela expansão em série em torno de , segundo a equação 14:
46
n
i
ii
n
n
i
ii
n
EE0
)(
0
)(
lim
lim
(14)
A substituição dessas séries na equação de Schröndinger, independente
do tempo, nos dá uma nova equação.
)()())(ˆ(0
)(
0 0
)()(
0
n
i
iin
i
n
i
iiii EVH
(15)
Igualando os termos de perturbação i
nessa equação, obtém-se a ordem de
perturbação. Nesse trabalho, será utilizado a perturbação de ordem 2 para
calcular as propriedades eletrônicas dos sistemas biológicos em estudo, para
incluir a correlação no cálculo da energia de interação fármaco/receptor.
Simulação de Solventes
Foram apresentados diversos métodos de química computacional que
permitem estimar as propriedades de estruturas eletrônicas. Nestes, o cálculo
quântico é feito considerando que a molécula ou o átomo esteja no vácuo.
Todavia, esse ambiente é bastante diferenciado dos ambientes biológicos, os
47
quais estão essencialmente solvatados por moléculas de água. Dessa maneira,
surge a necessidade de simular solventes em cálculos de estrutura eletrônica.
Existem basicamente duas formas de simular solventes em cálculos de
estrutura eletrônica. A primeira faz o uso da adição de águas explícitas no
sistema molecular em estudo. São adicionadas geralmente condições de
contorno, que são moléculas de águas envoltas por uma caixa de dimensões
compatíveis com o sistema de interesse, que ajudarão a aproximar o problema
do meio biológico. A segunda maneira é a simulação implícita do solvente, os
quais usam modelos teóricos para simular um meio contínuo que leva em conta
a constante dielétrica do solvente, com o soluto considerado numa cavidade. A
definição dessa cavidade é o que fundamentalmente difere os vários métodos.
A inclusão de um solvente explícito é a aproximação mais próxima de um
sistema biológico, porém demandará maior tempo computacional de cálculo,
pois se estará adicionando mais átomos e moléculas ao sistema molecular. A
utilização de meios contínuos uma alternativa computacionalmente mais
exequível e serve para estimar propriedades como a energia livre do complexo
inibidor/receptor 59,60.
Um dos modelos mais simples para a simulação de solvente implícito é o
COSMOS (Conductor-like-Screening Model), que é um método de cálculo
utilizado para estimar a interação eletrostática entre o soluto e o solvente.
Nessa metodologia, o solvente é tratado como um contínuo com
permissividade . Deste modo, aproxima-se o solvente por um contínuo
dielétrico fora da cavidade molecular 61. Com este método é utilizada a
equação (16) de Poisson para descrever o meio contínuo.
48
0
2 )()(
rr
(16)
onde representa a densidade eletrônica do soluto, 2 (r) gradiente do
potencial eletrostático e 0 é o fator de permissividade.
Porém os métodos que usam dessa aproximação podem dissimular
alguns resultados nos cálculos teóricos que envolvem a interação de
moléculas, pois a contribuição termodinâmica para a formação de interações
químicas pode estar associada ao aumento entrópico de águas explícitas. Além
disso, há a dificuldade da construção do grid, que denotará a área de influência
do solvente sobre o soluto trabalhado. Dessa forma o uso dessa aproximação
requer prévios estudos com o objetivo de adequar uma boa proposta de
simulação para o sistema.
O método ONIOM
A combinação de aproximações clássicas com aproximações quânticas
é uma alternativa para moléculas com elevado número de elétrons, cuja
essência catalítica esteja restrita a uma parte do sistema molecular. Dentro
dessa perspectiva, os métodos de cálculo de estrutura eletrônica podem ser
utilizados para a descrição do sítio catalítico da proteína, e os métodos
clássicos provenientes de campos de força, são utilizados para tratar o resto da
proteína.
49
O método ONIOM (Our own n-layered Integrated Molecular Orbital
and Molecular Mechanics) 62 é um método que permite tratar o sistema em até
3 camadas, atribuindo a cada camada um grau de acurácia nos cálculos de
modelagem molecular. Segundo essa metodologia, qualquer sistema molecular
pode ser separado em diferentes níveis ligados de acordo com uma ordem pré-
estabelecida para o tratamento do problema. Portanto o primeiro problema
tratado para usar o ONIOM é a partição/corte do sistema, principalmente para
ligações covalentes, onde uma partição deve ser bem analisada. Ao integrar os
resultados obtidos nas diferentes camadas, obtém-se uma extrapolação
chegando-se a valores mais acurados sobre todo o sistema molecular
estudado 63. Quando dois métodos são combinados na metodologia ONIOM,
segue o modelo apresentado na Figura 6:
Figura 6: Diagrama esquemático do método ONIOM para uma proteína.
A equação para a energia final do sistema contendo duas camadas pode
ser descrita como:
50
elSLrealLelSH EEEE mod,,mod, (17)
Onde H (high) e L (Low) dizem respeito aos níveis de teoria alto e baixo de
aproximação respectivamente, enquanto Smodel (small) e Real referem-se ao
tamanho do sistema, pequeno e “real” respectivamente. Aqui é importante frizar
que a palavra real não deve ser entendida na sua definição, mas sim dentro de
um modelo, a parte indicada como real seria todo o modelo, enquanto que a
parte pequena é apenas uma parte do modelo.
Termodinâmica estatística
Os programas de química computacional se valem da termodinâmica
estatística para a computação de propriedades termoquímicas de sistemas
moleculares. O ponto de partida da termodinâmica estatística é a construção
da função de partição, que é uma grandeza que descreve as propriedades
estatísticas de um sistema em equilíbrio termodinâmico.
Existem vários tipos de função de partição, as quais correspondem a
diferentes ensembles. A função de partição canônica, por exemplo, aplica-se
ao ensemble canônico, que é um sistema que permite troca de calor com o
ambiente, mantendo-se a temperatura, o volume e o número de partículas fixas
(NVT). Matematicamente a função de partição canônica pode ser descrita
como:
j
E jeZ(18)
51
Onde E é a energia total do sistema quando está no microestado j e é a
temperatura inversa definida como:
TkB
1
(19)
Onde kB é a constante de Boltzmann.
Para os sistemas moleculares, existem contribuições na função da
partição originadas dos movimentos rotacionais, translacionais, vibracionais e
eletrônica. A soma dessas contribuições poderá ser computada na função de
partição total, podendo-se derivar algumas funções básicas da termodinâmica,
tais quais a energia (Equação 20), capacidade calorífica (Equação 21), entropia
(Equação 22), e energia de Helmholtz (Equação 23).
ZE
ln
(20)
2
2
1E
TkT
EC
B
V
(21)
)ln()(ln ZkT
EZkS BB
(22)
ZTkTSEA B ln
(23)
52
A Dinâmica molecular
A dinâmica molecular é uma técnica muito utilizada para o estudo de
macromoléculas biológicas 64 65 66 67, bem como no desenho e planejamento de
novas drogas 68 69.
A dinâmica molecular é uma técnica que propicia a evolução temporal do
sistema microscópico via a integração das equações de Newton 70 56 71 68 64
passo a passo no tempo. Essas equações são descritas abaixo.
i
ii
iii
r
rVtF
amtF
)(
)(
)(
Onde Fi é a força que atua sobre cada partícula em um instante de
tempo t, ai é a aceleração do átomo i de massa mi. A função V é um campo de
força clássico como aquele definido na Equação 12. Para calcular a força,
calcula-se a derivada da energia em relação às posições dos átomos do
sistema molecular. O cálculo da força gera automaticamente a aceleração. A
partir desta, pode se obter a integração das equações do movimento e
consequentemente a velocidade, cuja integração propicia a mudança de
posição dos átomos. Com as novas posições atômicas, calcula-se a energia
cinética e potencial do sistema molecular em estudo. Aplicando-se esse
procedimento gera-se uma trajetória, que nada mais é que o conjunto de
posições e velocidades dos átomos em cada tempo.
A integração das equações do movimento é feita via algoritmos
baseados nos métodos da diferenças finitas, nos quais a integração é dividida
53
em pequenos intervalos de tempo da ordem de femtosegundos a fim de poder
computar as vibrações associadas ao átomo de hidrogênio 72. Um dos métodos
mais comuns aplicados na integração das equações do movimento é o
algoritmo de Verlet, que utiliza as posição e acelerações dos átomos no tempo
t e as posições do passo anterior r( t-t), para determinar as novas posições no
tempo t+ t de acordo com a equação abaixo.
2)(')(2)( ttartrttr
Em sistemas biológicos é comum o uso de ensembles NVT e NVP.
Docking Molecular
Uma metodologia essencial usada no desenvolvimento de novos
fármacos é o ancoramento molecular, conhecida como docking em inglês. O
objetivo do cálculo do tipo ancoramento molecular consiste na avaliação das
interações energéticas de algumas conformações moleculares em relação a
outras, a busca de conformação é feita segunda uma contagem de funções.
Para as melhores soluções de docking, os programas quantificam estimativas
aproximadas da energia livre.
Para realizar este feito, as moléculas são descritas como corpos rígidos
em uma primeira aproximação. Nesse sentido, o ancoramento molecular pode
ser entendido como um problema de interação química de moléculas à
cavidade catalítica de uma determinada proteína
54
No entanto, essa aproximação não é suficiente para a determinação de
uma configuração inicial satisfatória, especialmente para sistemas envolvendo
interações de pequenas moléculas no sítio catalítico de enzimas. Pode-se,
então, escolher modelos que levem em conta a flexibilidade das moléculas.
Nesse modo de atuação, as moléculas sofrerão transições conformacionais de
maneira a alcançar um melhor ajuste para as interações moleculares.
Nesta técnica, as interações químicas são computadas pela contribuição
dos termos de van der Walls e eletrostáticos, sem considerar os demais termos
de um campo de força clássico, ou seja, usa-se para este fim um campo de
força clássico simplificado, que descreverá a energia dos ligantes e receptores.
A inserção de solventes torna a aproximação mais realística por computar o
ganho entrópico de águas de solvatação associada à perda entrópica do
ligante. Nessa aproximação há um excessivo ganho de custo computacional
associado ao cálculo de energias de interação.
Estas interações são computadas dentro de uma grade que envolverá
parte do sistema estudado, como por exemplo, a cavidade catalítica da enzima
a ser estudada. A construção da grade de energia depende do campo de força
estudado 73.
Análise de Componentes Principais
Dentre os métodos de natureza multivariada destaca-se a análise de
componentes principais, a qual é amplamente utilizada para a construção de
modelos teóricos que relacionem atividade do inibidor a propriedades
descritivas. Essas propriedades podem ser log p, que é a partição
molécula/octanol, energia dos orbitais HOMO e LUMO, número heteroátomos,
55
volume das moléculas, peso molecular, entre outros milhares de descritores.
Por isso a análise de componentes principais é muito aplicada no estudo de
fármacos.
O PCA é uma maneira de identificar a relação entre
características extraídas de descritores. A componente principal é o arranjo que
melhor representa a distribuição dos dados e a componente secundária é
perpendicular a componente principal. Os passos para calcular as
componentes principais são:
Obtém-se os dados ou as M amostras de vetores de dimensão M.
Calcula-se a média ou o vetor médio destes dados.
Subtrai-se a média de todos os dados.
Calcula-se a matriz de covariância usando todas as subtrações. Ela é
o resultado da média do produto de cada subtração por ela mesma, e
terá dimensão MxN.
Calcula-se os autovalores e autovetores da matriz covariância.
O auto vetor com o maior autovalor associado, corresponde a componente
principal do conjunto de dados utilizados.
A aplicação desse método tem duas importantes metas: Diminuir a
quantidade de dados em problemas que envolvam estudos de análise multi-
variacional, bem como filtrar as propriedades mais descritivas do problema
multivariado.
56
Protocolos Utilizados
Como neste trabalho foram utilizadas técnicas e moléculas
diferenciadas, o capítulo relativo às metodologias será separado em
subcapítulos, detalhando os métodos aplicados, bem como as abordagens dos
problemas dentro do âmbito da química computacional.
Metodologia 1 (Estudo dos inibidores pirrolo-pirimidinas)
O estudo dos inibidores pirrolo-pirimidinas da proteína quinase de
adesão focal foi realizado da seguinte forma.
Foram selecionados 7 inibidores da classe pirrolo-pirimidina com
substituintes do tipo carboxila em diferentes posições do anel
aromático piridinico 74 75 segundo a Figura 7.
Todas as moléculas selecionadas foram submetidas a
otimização de geometria com o método DFT/B3LYP 6-31* (d)
utilizando a camada fechada para a distribuição dos elétrons na
molécula. Os cálculos foram realizados no programa Gaussian
2009 76.
57
Figura 7. Inibidores selecionados para o estudo de docking molecular
com proteína quinase de adesão focal.
Nas geometrias de equilíbrio foram adicionados comandos no
programa Gaussian09 fim de se obter a distribuição dos orbitais
moleculares, cargas do tipo Chelpg bem como o potencial
eletrostático.
Em seguida, foi selecionada a proteína quinase de adesão focal
do site de banco de dados www.pdb.org 54,77. O código de
58
acesso para a proteína quinase de adesão focal foi o 2ETM 77
com inibidor 7-h-pirrolo-pirimidina complexado no sítio catalítico.
Tendo como base o inibidor 7-h-pirrolopirimidina foram
ancoradas as demais moléculas descritas na Figura 7 ao sítio
catalítico da proteína quinase de adesão focal utilizando o
programa Auto-Docking Vina 78.
Após esse procedimento, os complexos formados pela proteína
FAK e os demais inibidores foram otimizados utilizando o campo
de força clássico AMBER presente no programa Hyperchem. Em
seguida, procedeu-se à análise das interações e ligações
moleculares presentes entre os inibidores e a proteína FAK,
selecionando dessa forma os aminoácidos que se ligam
quimicamente com as moléculas estudadas.
Os complexos aminoácidos/inibidores foram separados do resto
da proteína. Nessa estrutura molecular foram realizados cálculos
de estrutura eletrônica com o método B3LYP/6-31g(p).
Utilizando o método B3LYP e a mesma função de base da etapa
anterior foram extraídas informações relativas aos orbitais de
fronteira, densidade eletrônica, bem como o potencial
eletrostático do complexo fármaco/receptor.
Associado às propriedades eletrônicas foram obtidas
informações relativas à energia livre de Gibbs de interação,
entalpia e entropia de interação fármaco/receptor através do
cálculo das frequências no programa Gaussian 09 para o
complexo aminoácidos/inibidores. Foram realizados cálculos de
59
estrutura eletrônica para o complexo fármaco/receptor. A
energia foi computada como diferença entre aquela dos
produtos (complexos) menos dos reagentes (fármaco e sítio).
Esses cálculos foram realizados com o uso do método DFT e os
seguintes funcionais – LANLDZ, B3LYP, M06. Foram também
computadas energias de interação com o método MP2 com o
objetivo de verificar se o fator de correlação eletrônica era
essencial na descrição da interação química.
Os resultados advindos da etapa anterior foram comparados
com as atividades das drogas em estudo.
Todos os cálculos anteriores foram realizados utilizando o
modelo de solvente polarizado contínuo IEFPCM (water) 79.
A fim de se comparar as moléculas da classe pirrolo-pirimidina foi
realizado um estudo com a análise de componentes principais (PCA)
como um método de análise multivariada. Para esse fim, foram utilizadas
as seguintes propriedades: Topologia da superfície polar, log de p,
volume molecular, número de ângulos diedros, número de átomos
passivos de realizar ligações de hidrogênio, número de doadores de
ligação de hidrogênio. Essas propriedades foram obtidas utilizando o
pacote computacional Property Calculation Service. As propriedades
obtidas por esse pacote computacional, associadas às propriedades
energéticas e termodinâmicas de interação foram utilizadas no cálculo
PCA.
60
Protocolo 2 (Estudo da molécula Dasatinibe)
Nessa etapa, é descrito o protocolo aplicado ao docking do fármaco
Dasatinibe no sítio catalítico da proteína quinase de adesão focal.
Em uma primeira etapa foi selecionada a proteína FAK do banco
de dado dados www.pdb.org, cuja abreviatura é 2ETM.
À essa enzima foi aplicada um campo de força clássico, com o
intuito de obter o relaxamento da estrutura molecular via
otimização de geometria. Para esse fim, foi utilizado o campo de
força AMBER presente no programa Hyperchem.
Em uma etapa ulterior, foi desenhado o fármaco Dasatinibe
usando o programa Cache.
A molécula de Dasatinibe e a proteína FAK foram convertidas
para o arquivo do tipo pdbqt, o qual é utilizado pelo programa
Auto-Docking Vina.
De posse das estruturas em formato de arquivo adequado, foi
realizado o docking molecular do fármaco Dasatinibe ao sítio
catalítico da FAK. Nessa etapa, foram permitidas rotações nos
ângulos diedros e ângulos de deformações durante a realização
do ancoramento do ligante. A descrição dos dados
computacionais do ancoramento são descritos abaixo.
No programa Auto-Docking Vina definiu-se um grid com
as seguintes dimensões em angstrons: x=-18, y=22 e
z =16.
61
Esse grid foi centrado no centro da proteína FAK de modo
a abranger toda a cavidade catalítica.
O grid foi orientado segundo os seguintes pontos:
x=-0.444, y=10.627 e z=6.613.
O tempo utilizado para a procura exaustiva das
conformações do ligante no sítio catalítico foi de 500
segundos.
Após o ancoramento do fármaco ao sítio catalítico da enzima, foi
realizada a otimização de geometria do complexo utilizando o
campo de força clássico AMBER.
A fim de se obter uma descrição quântica do complexo
Dasatinibe-FAK, foi realizado um cálculo do tipo QM/MM
utilizando o programa ONIOM presente no programa Gaussian
09. Aos aminoácidos Cys502, Lys454, Met499, Arg426, Ala 452,
Glu506, Glu471, Arg508, Arg550, Asp564, Leu501, Glu430,
Thr605 e ao fármaco Dasatinibe foi aplicado à aproximação
quântico semi-empírica PM6, definindo dessa forma a camada
alta do cálculo. Ao restante da proteína foi aplicado um campo
de força clássico, definindo dessa forma a camada baixa do
cálculo. Em seguida, se averiguou quais aminoácidos do sítio
catalítico da proteína FAK podem ligar-se ao fármaco Dasatinib.
No que concerne as tentativas de otimização, foram utilizados os
seguintes protocolos para o programa ONIOM.
AM1/UFF, B3LYP/3-21G, HF/LANL2DZ/UFF, MNDO/UFF
62
Em um passo posterior gerou-se um arquivo com a camada alta,
ou seja, aquela camada que continha os aminoácidos
selecionados e o fármaco dasatinibe.
Associado ao método ab initio foram calculadas as seguintes
propriedades da camada alta: Potencial eletrostático, Orbitais de
Fronteira e Densidade eletrônica da camada alta descrita pela
aproximação PM6.
Foram computadas ainda as propriedades termodinâmicas de
interação fármaco/receptor a partir da frequência e
termodinâmica estatística.
Os cálculos das propriedades acima mencionadas foram
realizados com o programa Materials Studio.
Realização de uma dinâmica molecular de 1nanosegundo em
todo o complexo FAK/dasatinib para verificar ligações de
hidrogênio não quantificadas pelo método ONIOM. Essa
dinâmica foi realizada utilizando o campo de força AMBER a
temperatura constante 300K. 100ps foram utilizados para o
banho térmico. Os passos utilizados para a dinâmica molecular
foram da ordem de 1femtosegundo
63
Protocolo 3 (Estudo dos complexos bis-anilino-piridina)
Foi selecionado o arquivo 2JKK 80 do banco de dados de
proteína (PDB).
A estrutura obtida foi otimizada utilizando o campo de força
clássico implementado no programa Hyperchem.
Posteriormente foi realizado um cálculo QM/MM para a
otimização do complexo inibidor/proteína utilizando o programa
Gaussian 09. A definição da camada alta e camada baixa, no
cálculo ONIOM, foram os mesmos que aqueles utilizados para o
fármaco dasatinib.
64
Protocolo 4 (Estudo do complexo 2-3-d-tiazole)
Foi selecionado o código de acesso 3PXK 1 do banco de dados
que contém a droga tiazole complexada com proteína FAK.
A estrutura obtida foi otimizada utilizando o campo de força
clássico AMBER e o programa Hyperchem.
Posteriormente foi realizado um cálculo QM/MM para a
otimização do complexo inibidor/proteína. Os protocolos de
cálculos para a definição da camada alta e camada baixa, no
cálculo tipo ONIOM, foram os mesmos que aqueles utilizados
para o fármaco dasatinib.
65
Protocolo 5 ( Estudo da interação da molécula de ATP com a proteína FAK).
Foi selecionado o código de acesso 2JIM 81 do banco de dados
pdb, que contém o complexo ATP interagindo com a proteína
FAK.
A estrutura obtida foi otimizada utilizando o campo de força
clássico AMBER implementado no programa Hyperchem.
Posteriormente foi realizado um cálculo. A definição da camada
alta e camada baixa no cálculo tipo ONIOM foram do tipo
HF/LANL2DZ:UFF.
66
Protocolo 6 ( Estudo da interação entre o complexo metano sulfonamida com a proteína FAK)
Foi selecionado o código de acesso 3BZ3 82 do pdb, que contém
o complexo cristalizada FAK/sulfonamida.
A estrutura obtida foi otimizada utilizando o campo de força
clássico AMBER implementado no programa Hyperchem
Posteriormente foi realizado um cálculo QM/MM para a
otimização do complexo inibidor/proteína. Os protocolos de
cálculos para a definição da camada alta e camada baixa no
cálculo tipo ONIOM foram os mesmos que aqueles utilizados
para o fármaco Dasatinibe.
67
Resultados e discussão
Volume molecular dos inibidores estudados
Os inibidores utilizados neste trabalho são ilustrados na Figura 8,
com suas respectivas geometrias otimizadas com o método semi
empírico PM6.
Figura 8. Geometria otimizada dos inibidores estudados.
Todos os inibidores, com exceção do fármaco dasatinibe, apresentam
em suas estruturas o anel de adenina presente no ATP. No que concerne a
geometria de equilíbrio, apenas os inibidores da classe pirrolo-pirimidina,
tiazole e amino-pirimidina apresentam estrutura planar. As demais estruturas
apresentam deformações angulares, para a estrutura de equilíbrio, fora do
68
plano. Esse fato gerou dificuldades particulares para a validação da otimização
de geometria com os cálculos do tipo QM/MM utilizando o programa ONIOM
presente no software Gaussian09. Isto porque a estrutura deverá ser
encaixada em uma cavidade pouco flexível. Essas dificuldades serão descritas
de modo mais adequado nos respectivos tópicos de estudo da interação de
cada inibidor com a proteína quinase de adesão focal.
A estrutura de cada inibidor difere substancialmente em termos de
volume molecular, o que suscitará também diversos tipos de interação
molecular com a proteína FAK, bem como problemas de otimização
concernentes a pouca mobilidade dessas drogas no sítio catalítico da proteína
quinase de adesão focal. Os volumes moleculares da cada inibidor são
ilustrados abaixo na Tabela 1.
Tabela 1: Volume Molecular dos inibidores da proteína FAK
Inibidor Volume Molecular A3
Pirrolo-pirimidina 1510,93
ATP 1044,64
Dasatinibe 2303,61
Tiazole 1411,87
Sulfonamida 3702,42
Amino-pirimidina 1260,35
69
Estrutura eletrônica e atividade das moléculas pirrolo-pirimidina
Os resultados devidos aos ancoramentos inibidor/enzima mostram que
as moléculas da classe pirrolo-pirimidina podem estabelecer ligações de
hidrogênio com os aminoácidos Cys502, Arg426 e Lys454, conforme pode ser
visto na Tabela 2. Essas ligações são computadas pelo programa Hyperchem a
partir do ângulo entre doadores e receptores de elétrons pelo programa
Hyperchem, bem como usando distâncias de até 2.5 A.
Tabela 2: Ligações de hidrogênio realizadas entre os aminoácidos da enzima FAK e as moléculas da classe pirrolo-pirimidina
Duas exceções são observadas para os inibidores 17i e 32, os quais
podem estabelecer ligações de hidrogênio com os aminoácidos Ser e Glu. A
substituição na posição orto e meta no anel aromático de pirimidina para o
inibidor 32 ou benzeno para os demais inibidores, permite a realização de mais
Inibidor
Ligações de Hidrogênio calculadas (Å)
Lys454 Lys454 Cys502 Arg424
16i 1,88 --- --- ---
17g 1,99 2,18 --- ---
17h 2,13 2,20 --- ---
17i 1,90 --- 2,20 1,74
18i 2,20 --- --- ---
32 2,18 2,01 2,05 1,74
70
ligações de hidrogênio. Em contraposição à substituição na posição para
presente no inibidor 18i resulta em poucas ligações de hidrogênio com o
aminoácido Lys454. Um entendimento mais refinado das ligações químicas
estabelecidas pelos aminoácidos e os inibidores pirrolo-pirimidina pode ser
contemplado pelos métodos ab initio.
Pode-se verificar através dos cálculos de potencial eletrostático obtidos
pelo método MP2, que o par de elétrons não ligados do átomo de nitrogênio
presente no anel pirimidínico apresenta interação com o aminoácido Lys454.
Interações com os aminoácidos Arg426 e Cys502 são também
observadas para o inibidor 1. A adição do substituinte na posição para no anel
benzênico no inibidor 16i pode ser visualizada pela concentração de densidade
eletrônica entre o grupo substituído carboxila e os hidrogênios do aminoácido
LYS. Essa concentração de carga negativa no inibidor 16i, bem como a
interação do inibidor 1 com o aminoácido Lys454 pode ser visualizado na
Figura 9. O resultado mostrado na figura 9 ressalta ainda o melhoramento da
interação com os aminoácidos Lys454, Arg412 e Cys502 mediante a clara
formação de uma ligação de hidrogênio com o aminoácido Lys454 quando se
adiciona o substituinte carboxila à molécula 7-h-pirrolo-pirimidina.
71
Figura 9. Potencial eletrostático calculado para os inibidores 1 e 16i.
No que concerne aos orbitais moleculares, o orbital HOMO do inibidor 1
está localizado sobre o anel pirimidínico, enquanto o LUMO está localizado
sobre o anel pirrólico. Esta disposição dos orbitais de fronteira mostra que as
principais ligações químicas são realizadas com os aminoácidos Lys454 e Cys
502, conforme pode ser visualizado na Figura 10. Essa disposição dos orbitais
confere ao inibidor 1 uma atividade de inibição intermediária quando
comparado às demais moléculas.
72
Figura 10. Orbitais de Fronteira calculados para a interação entre os aminoácidos do sítio catalítico da proteína FAK com o inibidor 7-h-pirrolo-
pirimidina.
No que reporta aos inibidores 18i e 16i o orbital HOMO está
essencialmente localizado sobre o grupo aril, e o orbital LUMO está situado
sobre o anel metoxifenil. Esses inibidores são os que apresentam maior IC50,
ou seja, são aqueles inibidores que inibem menos eficientemente a enzima
FAK, sendo necessário, portanto, doses relativamente altas dessas moléculas
para controlar o processo de transdução de sinais.
73
Figura 12. Orbitais de fronteira para inibidor 18i.
Figura 11: Orbitais de Fronteira calculados para a interação entre os aminoácidos do sítio catalítico da proteína FAK com o inibidor 7-h-pirrolo-
pirimidina.
74
Figura 13. Orbitais HOMO e LUMO para os inibidores 18i e 16i, respectivamente.
A analogia dos orbitais moleculares com as atividades dos demais
inibidores pode ser feita da mesma forma. Com efeito, verifica-se através dos
cálculos de estrutura eletrônica, que o orbital HOMO dos inibidores 17g,17h,17i
e 32 está localizado sobre o anel pirimidínico próximo ao aminoácido Cys502,
enquanto nos inibidores 16i e 18i os orbitais estão mais próximos do
aminoácido Lys454. Pode-se dizer dessa maneira, que o aumento da atividade
das drogas está correlacionado com ocupação de orbitais próximos ao
aminoácido Lys454. Essa realidade é verificada na disposição dos orbitais
moleculares do inibidor 32, que é aquele que apresenta o menor IC50, ou seja,
é a molécula que melhor inibe a enzima FAK. Na disposição dos orbitais
moleculares HOMO, verifica-se que a maior contribuição eletrônica se dá
75
próximo ao aminoácido Cys502 conforme pode ser verificado na Figura 14. O
aumento de densidade eletrônica próxima ao aminoácido Cys502 contribui de
maneira significativa para o melhoramento da atividade das drogas da classe
pirrolo-pirimidina.
Figura 14. . Disposição dos orbitais HOMO e LUMO para o inibidor 32.
A perda da atividade por parte dos inibidores 16i e 18i pode ser
visualizada também do ponto de vista do potencial eletrostático. Para o inibidor
16i o acréscimo do substituinte na posição meta enseja um aumento da
concentração de densidade eletrônica próxima ao aminoácido Lys454, com
consequente perda daquela, próxima ao aminoácido Cys502. Para a classe de
inibidores 17g, 17h,17i e 32 as densidades eletrônicas estão próximas do
aminoácido Cys502, conforme pode ser visualizado na Figura 15.
76
Figura 15. Potencial eletrostático gerado para a interação entre o inibidor 17i e os aminoácidos Lys454, Arg412 e Cys502.
Os resultados dos cálculos de energia de interação são mostrados na
Tabela 3:
77
Tabela 3: Energias de interação obtidas com diversos métodos e
bases em Kcal.
Inibidor IC50 contra
FAK* (μM)
M06
LANL2DZ
B3LYP
LANL2DZ
B3LYP
6-31G
MP2
6-31G
MP2
LANL2DZ
18i 2.84 419.15 –353.46 –310.54 –414.63
-99.86
16i 2.82 410.62 –351.04 –307.06 683.04
162.43
1 0.212 367.56 –337.82 –248.11 –368.40
158.46
17g 0.038 380.49 –329.28 –286.35 737.35
-114.81
17h 0.037 379.61 –309.45 –314.05 –456.89
152.788
17i 0.035 393.84 –340.74 –333.38 –452.58
-109.32
32 0.004 446.35 –380.70 –349.78 –490.66
-117.70
Energia de interação computada em unidades atômicas.
As energias derivadas do método MP2 com a base LANL2DZ não
apresentaram correlação com as atividades das moléculas da classe
pirrolopirimidina. As energias de interação para os inibidores 17h e 17i foram
positivas, caracterizando uma repulsão entre essas moléculas e os
aminoácidos pertencentes ao sítio catalítico da proteína, demonstrando a
ineficiência da metodologia na obtenção de uma linearidade entre energia de
interação e atividade da droga 7-h-pirrolopirimidina.
Em oposição aos resultados da aproximação MP2, os funcionais com
base 6-31g proporcionaram resultados mais relacionadas com dados de IC50,
não apresentando energias que caracterizassem repulsão entre os inibidores e
os aminoácidos componentes do sítio catalítico da proteína FAK. Os resultados
mostraram uma razoável conexão com os dados experimentais, com desvio de
linearidade entre relação atividade e energia de interação. A mais baixa energia
78
de interação foi obtida para o inibidor 32, podendo-se correlacionar esse
resultado com a boa atividade de inibição dessa droga. Em contraposição a
esses resultados, foram obtidas energias de interação não correlatas com as
suas respectivas atividades. O inibidor 18i não apresentou a energia de
interação mais baixa, não apresentando, dessa forma, uma correlação com
sua baixa atividade na inibição da proteína FAK.
Para os demais métodos, ocorreram problemas similares de relação
entre a atividade da droga com suas energias de interação, sugerindo dessa
forma que a energia de interação não é a única variável necessária para
caracterizar a atividade inibitória de uma droga. Atenta-se ao fato de que não
foram computadas águas explícitas no cálculo, podendo ser o fator entrópico
nesse caso mais importante que a energia de interação. O tamanho do sistema
molecular trabalhado pode ainda não ser representativo para esse tipo de
relação. Baseando-se nesses resultados, foram realizados cálculos
termodinâmicos relativos à ligação fármaco e receptor a fim de estudar a
relação de energia com a descrição das atividades das drogas. Esses cálculos
possibilitaram o conhecimento da contribuição de cada função de estado
termodinâmica para a realização da ligação química entre o inibidor e os
aminoácidos componentes do sítio catalítico da proteína FAK.
No que se refere às propriedades termodinâmicas de um sistema
biológico, pode-se correlacionar a atividade de uma droga com a energia livre
do complexo enzima/inibidor através da Equação 24.
ΔG=−RT ln k i (24)
79
Onde ki é a constante afinidade da droga. Essa constante pode ser relacionada
com a constante de inibição aparente 15.
m
i
K
[S]+
IC=K
1
50 (25)
Essa relação matemática permite correlacionar a constante de afinidade
de uma droga com a propriedade IC50. A concentração do substrato S
bem como km (constante que denota atividade máxima da enzima) é
constante para o caso aqui exposto. Assim sendo, podem-se obter as
propriedades termodinâmicas com intuito de entender a correlação
existente entre a atividade biológica da droga, e sua interação com os
aminoácidos componentes do sítio catalítico da proteína FAK. Os
resultados referentes aos cálculos da energia livre são mostrados abaixo
na Tabela 4.
80
Tabela 4: Resultados dos cálculos de energia livre usando o
método B3lYP/6-31G para a interação inibidor/aminoácidos do sítio
ativo.
Inibidor IC50 contraFAK (μM) Energia Livre Teórica
(kcal/mol)
18i 2,84 -55,6
16i 2,82 -52,3
1 0,212 -11,1
17g 0,038 -74,4
17h 0,037 -71,2
17i 0,035 -58,2
32 0,004 -82,4
No que reporta aos resultados de energia livre, pode-se verificar que o
inibidor 32 é aquele com o resultado mais exergônico. Esse resultado é
correspondente com o fato dessa molécula ser aquela com o menor IC50. Os
inibidores 17g e 17h também foram bem correlacionados com a sua atividade
inibitória tendo em vista suas energias livres. Todavia, os inibidores 1, 17i
apresentaram energias livres não condizentes com suas atividades
intermediárias aos inibidores 18i e 16i.
A fim de se vislumbrar de modo mais sistemático a contribuição da
energia livre para os sistemas em estudo, foram também realizados cálculos
81
para verificar a contribuição da entropia e da entalpia. Os resultados referentes
a essas funções de estado termodinâmicas são mostradas na Tabela 5:
Tabela 5: Contribuição entálpica e entrópica para a formação do
complexo inibidor/aminoácidos.
Inibidor Entalpia
kcal/mol
Entropia
(cal/K.mol)
18i 1,0 189,8
16i -0,4 174,0
1 1,1 41,2
17g 3,0 259,6
17h 3,2 249,6
17i 0,0 195,5
32 -2,2 269,2
Os resultados mostram que o inibidor 32 apresenta a maior entropia e a
menor entalpia, colocando-o com o maior potencial de inibição da proteína
FAK. Para os demais inibidores, não se verifica a mesma correlação entre a
entalpia e a atividade das drogas. Observa-se, no entanto, que a função
entropia parece reger a interação inibidor/aminoácidos. Verifica-se que os
inibidores 17g, 17h e 17i, que tem potencial de inibição intermediário aos
demais inibidores, possuem contribuições entrópicas essencialmente maiores
que o 18i e 16i, os quais são os que apresentam alto IC50.
82
Através da análise de componentes principais podemos ter maior
entendimento das propriedades eletrônicas e estruturais. A Figura 16 abaixo
mostra as componentes principais 1 e 2 usando a energia dos orbitais HOMO
e LUMO, momento de dipolo, energias de interação ( M06/B3LYP/PM6) calor
de formação, nON, nOHN, nORTB e os resultados experimentais do IC50. Três
grupos de moléculas foram encontrados, independentemente de qual energia
de interação funcional de densidade era utilizada (B3LYP ou M06). O primeiro
foi composto pelas moléculas 17h, 17i e 32, que são as moléculas mais ativas,
e a segunda foi constituída por 16i, 18i e 17g que são as moléculas menos
ativas. A estrutura 1 ficou isolada, já que esta estrutura não tem grupo
carboxílico e tem o menor número de ligações de hidrogênio. A informação
acerca das atividades dos inibidores está espalhada entre a PC1 e PC2.
Figura 16. Gráfico de componentes principais para os inibidores da classe pirrolo pirimidina.
83
A componente principal 2 carrega informações acerca da atividade
inibitória e a estrutura 1 divide as moléculas com mais e menos atividades. No
entanto, a estrutura 32 que tem o grupo carboxila também divide o conjunto de
moléculas em mais menos ativas. É importante ressaltar que, apesar de não se
obter uma relação direta entre as componentes principais e os valores de IC50,
consegue-se agrupar as moléculas em relação a sua estrutura e atividade.
Além disso, para o inibidor 32 os valores das PC1 e PC2 encontra-se no
extremo esquerdo do gráfico, com o valor da PC1 mais afastado em relação
aos outros, o que conduz a correlacioná-los com a molécula de maior IC50, o
que que está em conformidade com a atividade esperada.
Estrutura eletrônica e docking molecular da molécula dasatinibe
A droga dasatinibe ocupa uma grande porção do sítio catalítico. Essa
situação ocasionou sucessivos problemas de convergência nos cálculos de
estrutura eletrônica do tipo QM/MM. No intuito de entender essa problemática,
foi realizado uma curta dinâmica molecular de 1 ns no programa Hyperchem,
cujo resultado certificou severas restrições no movimento do inibidor no sítio
catalítico. Essas restrições propiciaram inúmeros erros de otimização quando
da utilização do programa ONIOM e as aproximações combinadas AM1/MM,
PM3/MM e B3LYP/3-21g/MM, onde MM se refere ao campo de força UFF. O
uso dessas aproximações propiciou otimizações incompletas com erros
inerentes as coordenadas internas do sistema inibidor/proteína. Os resultados
84
relativos ao docking molecular do fármaco dasatinibe são mostrados na Figura
17.
Figura 17. Droga dasatinibe ancorada ao sítio catalítico da proteína.
No entanto, quando se fez o uso do método MNDO/MM e do método
HF/MM observou-se otimizações completas para o sistema inibidor/proteína.
Na interação entre a droga dasatinibe e a proteína FAK, verificou-se interações
do tipo π-stacking, que são interações entre a nuvem pi dos anéis aromáticos
com o nuvem eletrônica do sítio catalítico da proteína FAK. A aproximação
quântica HF e a aproximação semi-empírica possuem deficiências relativas à
descrição de ligações de hidrogênio, que são sanadas na maioria dos casos
pelos métodos pós-Hartree-Fock e por alguns funcionais de densidade. Esses
métodos apesar de apresentarem maior acurácia no cálculo de propriedades
eletrônicas, são essencialmente caros computacionalmente, sendo impraticável
em se tratando de moléculas biológicas. As outras aproximações cujo
resultado foi a não convergência do sistema fazem com que a droga dasatinibe
realize movimentos mais bruscos na cavidade catalítica, propiciando dessa
forma erros nos cálculos de otimização de estrutura eletrônica. Esses
85
movimentos bruscos associados a desvio de planaridade podem ser verificados
quando se realiza otimizações de geometria para os diferentes métodos
utilizando somente o fármaco dasatinibe. Os desvios de planaridade são
mostrados na Tabela 6 para os diferentes métodos utilizados neste trabalho.
Tendo em vista esses deslocamentos em relação ao plano, foi utilizado o
método quântico semi-empírico MNDO para o cálculo do tipo QM/MM, o qual
possui menores deslocamentos planares.
Tabela 6: Desvio de planaridade do fármaco dasatinibe utilizando diferentes aproximações
Método 1 LUMO
PM6 175,89 119,09 -0,3677 -0,4509
MNDO 158,93 136,62 -0,34708 -0,03196
AM1 132,57 102,91 -0,32586 -0,03548
PM3 132,57 102,91 -0,32705 -0,04244
HF 174,75 121,91 -0,31023 0,08797
M06 132,57 102,909 -0,22463 -0,0493
MP2 132,57 102,91 -0,8461 0,06146
Baseando-se no mínimo local encontrado pela aproximação MNDO, foi
realizada uma otimização com a aproximação semi-empírica PM6 obtendo-se
êxito nesses cálculos. As demais aproximações foram empregadas do mesmo
modo, porém não obtiveram êxito na otimização do sistema biológico, devido a
repetidas falhas na convergência do SCF.
Os cálculos relativos à dinâmica molecular propiciaram a visualização de
rotações de ângulos diedros, permitindo analisar as ligações de hidrogênio
antes não existentes. Os grupos químicos cuja rotação levou a ligações de
hidrogênio são mostrados na Figura 18.
86
Figura 18. Grupos químicos que apresentaram rotação dos diedros durante a dinâmica molecular.
Figura 19. Ligação de hidrogênio associada com a rotação do ângulo diedro do grupo hidroxila do fármaco dasatinib.
A rotação do ângulo diedro associado com o grupo hidroxila terminal do
fármaco dasatinibe propicia a formação de ligações de hidrogênio com o
aminoácido terminal Arg426 como mostrado na Figura 19. A ligação de
87
hidrogênio é vista através do formato molecular do tipo “esferas de
sobreposição” presente no programa Hyperchem.
Ligações de hidrogênio permanentes, ratificadas pelos cálculos de
otimização de geometria com a aproximação PM6/UFF para esse modelo
teórico, foram encontradas com os aminoácidos Glu18, Thr91, Asp152 e
Gly93. Na geometria de equilíbrio, o programa ONIOM não permitiu observar
ligações de hidrogênio com o grupo hidroxila terminal do fármaco dasatinibe.
As distâncias interatômicas estabelecidas para as ligações de hidrogênio são
mostradas na Tabela 7. Ressalta-se que a ligação com o aminoácido Cys502
tem sido encontrada em diversas interações entre drogas inibidoras da proteína
quinase de adesão focal 83 84.
Tabela 7: Distâncias interatômicas das ligações de hidrogênio estabelecidas entre o fármaco dasatinibe e os aminoácidos listados.
Aminoácidos Distância das Ligações de Hidrogênio (Å)
Glu(18) 2,80
Thr(91) 3,65
Asp(152) 1,60, 2,60
Gly(93) 3,39
O mapa de potencial eletrostático derivado de cálculos quânticos semi-
empíricos mostram que o fármaco dasatinibe pode estabelecer ligações de
hidrogênio com os aminoácidos Lys454 e Arg426. Essa interação pode ser
observada através do mapa de potencial eletrostático presente na Figura 20.
88
Figura 20. Mapa de potencial eletrostático obtido para o sítio da proteína FAK com o fármaco dasatinibe obtido via a aproximação PM6.
A ligação com o aminoácido Arg426 não é tão clara na geometria de
equilíbrio, porém o mapa de potencial eletrostático mostra densidade eletrônica
negativa no grupo hidroxila terminal. Essa interação se torna acessível quando
se verifica que o diedro associado ao grupo hidroxila terminal da molécula
dasatinibe pode rotacionar em direção ao aminoácido Arg426.
No que concerne aos resultados dos cálculos de estrutura eletrônica
para obtenção dos orbitais de fronteira, verifica-se que os mesmos se localizam
sobre o aminoácido Arg426 e o anel central heterocíclico do fármaco
dasatinibe, salientando dessa forma, a importância desse aminoácido na
descrição da interação dasatinibe/FAK.
89
Estrutura eletrônica e docking molecular da molécula sulfonamida
Para o cálculo de otimização de geometria do complexo sulfonamida/
FAK houve problemas devido à otimização de geometria utilizando o método
ONIOM. Os métodos PM6, B3LYP, PM3, AM1 combinados com um campo de
força clássico em cálculos do tipo QM/MM foram incapazes de propiciar uma
completa otimização de geometria, suscitando em diversos momentos, erros
nas coordenadas internas do sistema molecular. Somente o método HF e o
método MNDO foram capazes de propiciar uma otimização de energia
completa. O primeiro fato a destacar é o grande volume ocupado pela molécula
sulfonamida no sítio catalítico da proteína quinase de adesão focal quando
comparado ao volume da molécula de ATP, conforme a Tabela 1. Um segundo
fator, não menos importante, são as deformações angulares dos diedros fora
do plano molecular. Métodos mais recentes, como aqueles problemáticos no
que se refere à otimização de geometria do complexo sulfonamida/FAK,
apresentam melhor descrição das interações entre inibidor e enzima, aceitando
mudanças abruptas de geometria no sítio catalítico. Dessa forma, o uso dessas
metodologias se torna problemática quando aplicadas a sistemas moleculares
com essas características. De modo antagônico as aproximações quânticas HF
e MNDO possuem em suas aproximações, problemas relativos à descrição de
interações intermoleculares e intramoleculares como aquelas provenientes da
interação de um elétron com o campo gerado pelos demais elétrons no método
HF. Essa baixa descrição da interação do sistema faz com que hajam baixos
deslocamentos fora do plano molecular, propiciando otimizações completas de
geometria. Foi então utilizado o método quântico semi-empírcio MNDO como
90
primeira aproximação seguido do método HF com um pseudo potencial
LANLDZ. O uso do pseudo-potencial LANL2DZ, foi escolhido pelo fato de ser
um potencial que descreve orbitais do tipo d, ao mesmo tempo possui um baixo
custo computacional, quando comparado com outras funções de onda. As
ligações de hidrogênio formadas pela molécula sulfonamida são mostrados na
Figura 21.
Figura 21. Inibidor sulfonamida ancorado ao sítio catalítico da proteína quinase de adesão focal.
São observadas ligações de hidrogênio com o aminoácido Cys502,
Asp564 e Arg424. As distâncias de ligação relativas a essas ligações são
mostradas na Tabela 8.
91
Tabela 8: Distâncias de ligação entre o inibidor sulfonamida e os
aminoácidos da proteína quinase de adesão focal.
Aminoácidos Distância das ligações de hidrogênio (Å)
Cys502 2,3,1.9
Asp564 2,4
Arg424 1,9
Os orbitais de fronteira do sistema sulfonamida e o sítio catalítico da
proteína FAK são ilustrados na Figura 22. Como pode ser observado, o orbital
HOMO se encontra espalhado entre os aminoácidos Arg426 e Glu431,
enquanto os orbitais LUMO se encontram sobre o aminoácido Lys454.
92
Figura 22. Orbitais de Fronteira para interação entre o inibidor sulfonamida e o sítio catalítico da proteína quinase de adesão focal.
Estrutura eletrônica e docking molecular da molécula ATP
A molécula de ATP (adenosina trifosfato) é aquela responsável pela
propagação dos sinais celulares mediante reações de fosforilação do
aminoácido Thr397, por isso é crucial a descrição de sua interação com a
enzima quinase de adesão focal no intuito de entender a ação desse substrato.
Devido aos problemas provenientes da estrutura obtida do banco de dados de
93
proteína, foram necessárias correções no que diz respeito à geometria da
molécula de ATP. Essas correções foram realizadas dentro do sítio catalítico
da proteína FAK, eliminando a sobreposição de átomos e proximidade
excessiva de ligações químicas. Após a eliminação desses problemas, se
tornou praticável a otimização de geometria utilizando o método QM/MM.
Seguindo o protocolo dos cálculos anteriores, foi utilizado o método MNDO
para uma primeira aproximação. Em seguida foi realizado um cálculo HF com o
pseudo-potencial LANL2DZ. Ambas as otimizações ocorreram sem os erros
nas coordenadas internas, observados nos cálculos dos sistemas anteriores.
As ligações de hidrogênio formadas entre a molécula de ATP e FAK são
mostradas na Figura 23.
Figura 23. Interação da molécula de ATP com a proteína quinase de adesão focal .
No que concerne à ligação da molécula de ATP com o sítio catalítico da
proteína quinase de adesão focal, são observadas as seguintes ligações de
hidrogênio conforme pode ser visualizado na Tabela 9.
94
Tabela 9: Distâncias de ligações de hidrogênio realizada pela molécula de
ATP no sítio catalítico da proteína FAK.
Aminoácidos Ligações de Hidrogênio (Å)
Met499 2,7
Gln432 1,8
Lys454 1,3
A energia livre de ligação calculada para interação entre a molécula de ATP e
os aminoácidos componentes do sítio catalítico da proteína FAK foi da ordem
de -58,91 kcal mostrando que essa interação química é favorável
termodinamicamente.
Os orbitais de fronteira calculados para a molécula de ATP são
mostrados abaixo na Figura 24. Os orbitais estão localizados sobre os grupos
fosfatos da molécula de ATP e os aminoácidos Glu 430, Phe 565 e Glu 506.
95
Figura 24. Orbitais de fronteira calculados para a interação da molécula de ATP com o sítio da proteína FAK.
Os cálculos de potencial eletrostático mostram uma concentração de
carga negativa sobre os anéis de adenina da molécula de ATP, ressaltando a
importância dessa estrutura molécula, presente na maioria dos fármacos
inibidores da enzima quinase de adesão focal. Essa relação é mostrada na
Figura 25.
96
Figura 25. Potencial eletrostático calculado para a molécula de ATP interagindo com o sítio catalítico da proteína FAK.
Estrutura eletrônica do complexo bis-anilino-pirimidina
Para a otimização de geometria do sistema bis-anilino-pirimidina não
foram encontrados problemas como erros de coordenadas internas. Esse fato é
explicado pelo pequeno volume molecular do inibidor quando comparado à
molécula de ATP, bem como com o baixo deslocamento fora do plano quanto à
movimentação dos diedros dessa molécula. Os protocolos de cálculos foram os
97
mesmos utilizados nos protocolos anteriores. Os resultados dos cálculos
provenientes da aproximação ONIOM mostram que são possíveis ligações de
hidrogênio com os aminoácidos Cys502 e Asp564. As distâncias de ligação
relativas a essa interação são mostradas na Tabela 10.
Tabela 10: Aminoácidos da proteína quinase de adesão focal que interagem com a molécula bis-anilino-pirimidina.
Aminoácidos Distância das Ligações de Hidrogênio (Å)
Cys502 2,29
Asp564 1,94
A energia livre de ligação entre o fármaco e o sítio catalítico da proteína
quinase de adesão focal é igual -157,087kcal/mol, sugerindo desta forma
espontaneidade da interação fármaco/receptor.
Com relação aos orbitais de fronteira é possível verificar que os orbitais
HOMO estão essencialmente dispostos sobre o fármaco bis-anilino-pirimidina
enquanto os orbitais LUMO estão localizados sobre o aminoácido Arg14,
conforme a Figura 26:
98
Figura 26. Orbitais de fronteira da molécula bis anilino pirimidina
99
Figura 27. Potencial eletrostático obtido para interação entre o fármaco bis-anilino-pirimidina.
Os resultados do cálculo de potencial eletrostático para a interação entre
o fármaco bis-anilino-pirimidina, verifica-se a interações da nuvem pi do anel
aromático com o substituinte cloro com o aminoácido Glu430.
Estrutura eletrônica da molécula pirrolo 2,3 d tiazole
Na otimização do sistema tiazole/FAK não foram observados problemas
procedentes dos cálculos de otimização do tipo QM/MM. Apesar de esse
inibidor apresentar um volume maior que o ATP, há baixos deslocamentos no
plano quanto a movimento dos diedros dessa molécula. O protocolo de cálculo
seguiu as mesmas aproximações e sequências dos demais, a fim de tornar os
resultados comparáveis. Para a molécula de tiazole só foi observada uma
100
única ligação de hidrogênio com o aminoácido Cys502 conforme mostrado na
Figura 28.
Figura 28. Fármaco 2,3 d tiazole complexado ligando-se ao aminoácido Cys502
Com respeito aos orbitais de fronteira podemos verificar que o orbital
HOMO está localizado sobre o inibidor 2,3 d tiazole em sua totalidade e o
orbital LUMO está localizado sobre o aminoácido Glu430. Essas informações
podem ser visualizadas na Figura 29:
101
Figura 29. Orbitais de Fronteira para interação entre o fármaco 2,3,d tiazole e o sítio catalítico da proteína quinase de adesão focal.
102
Análise geral dos resultados obtidos
Tendo previamente demonstrado os resultados procedentes dos
cálculos de estrutura eletrônica da interação entre fármaco/receptor, torna-se
factível uma análise crítica dos problemas abordados neste trabalho.
O mais notório dos fatos são as diferentes formas de atacar à
problemática da inibição de sinal, cuja consequência é a supressão da divisão
celular. O diferencial reside quimicamente nas diferentes disposições
moleculares de cada fármaco, construídos para inibir o mesmo alvo molecular.
Nota-se, neste sentido, a presença do grupo adenina na maioria dos fármacos
estudados neste trabalho, apesar de haver uma exceção à regra, que é o
fármaco dasatinibe. Esse resultado mostra que nem sempre as moléculas
inibidoras devem possuir essencialmente os mesmos grupos químicos que
aqueles encontrados no substrato original presente no sítio catalítico, que no
caso das proteínas quinases, propicia a evolução dos sinais celulares.
Porém, apesar das substanciais diferenças geométricas entre os
inibidores, encontram-se similaridades eletrônicas bastante relevantes. É
bastante perceptível a interação para todos os casos estudados dos inibidores
com os aminoácidos Cys502, Lys454 e Arg412. A construção dessas
moléculas é propositalmente realizada para estabelecer ligações de hidrogênio
com esses aminoácidos. Na maioria dos inibidores, com exceção do inibidor
tiazole, se encontram grupos COCH3, cuja clara função é interagir com os
aminoácidos terminais Arg424 e Lys454. Todavia, essa interação não pode
103
ocorrer de qualquer forma. O anel de adenina, presente em parte dos
inibidores, deve estar orientando a fazer uma ligação de hidrogênio com o
aminoácido Cys502. Os nitrogênios provenientes do anel de adenina devem
estar orientados para o aminoácido Cys502. Mesmo o fármaco dasatinibe, que
não possui um anel de adenina, realiza essa ligação obrigatoriamente. Essa
interação é feita com o anel pirimidina do fármaco dasatinibe, que deve ter sua
orientação privilegiada nesse sentido.
Um olhar sobre o estudo realizado com os inibidores da classe pirrolo-
pirimidina pode abrir algumas correlações com os demais resultados obtidos, já
que os mesmos possuem descrição de suas atividades biológicas na literatura.
Inicialmente percebe-se que a introdução de um grupo COCH3 próximo ao
aminoácido Lys454, torna a inibição da proteína quinase de adesão focal mais
efetiva. Essa “correlação” química coloca as demais drogas, excluindo-se a
molécula de tiazole, próxima aos inibidores mais potentes da classe pirrolo-
pirimidina. Todavia, averígua-se de forma contraditória que a adição de grupos
COO, em posições para no anel pirimidínico próximo ao aminoácido Lys454
torna a inibição biológica muito ruim para os inibidores da classe
pirrolopirimidina. No estudo de PCM verificou-se a separação dessas
moléculas do demais conjunto, quando são utilizadas variáveis teóricas tais
como energia de ligação e número de átomos de haletos. Apesar da baixa
linearidade obtida entre IC50 e energia de ligação, é plausível pensar que a
inibição também está norteada por um boa “adequação” entre a cavidade
catalítica e a geometria do inibidor associada com uma baixa energia de
ligação entre os mesmos.
104
A corroboração dessas interações para os inibidores estudados nem
sempre se deu através da medida de distâncias de ligação de hidrogênio.
Resultados provenientes de cálculos de orbitais de fronteira e potencial
eletrostático respaldaram a interação dos inibidores com os aminoácidos
Cys502 502, Arg424 e Cys502. No caso do fármaco dasatinib, o resultado foi
consolidado por cálculos de dinâmica molecular, que mostraram que a ligação
com o aminoácido Arg424, antes não realizada na geometria de equilíbrio,
pode ser realizada mediante a movimentação do ângulo diedro associado ao
grupo hidroxila terminal da molécula.
O aminoácido Asp564 apareceu na interação entre a proteína FAK e os
inibidores dasatinibe, sulfonamida e anillino-pirimidina. As demais ligações de
hidrogênio são características peculiares de cada inibidor.
Apesar de não ser o foco deste trabalho, a problemática de otimização
de sistemas biológicos, via QM/MM se tornou uma árdua tarefa para inibidores
que possuem excessivo volume quando comparados ao substrato original e
que possuem mudanças severas em seus diedros quando submetidos a
determinados tipos de aproximações quânticas. Os métodos quânticos
parecem aproximar os átomos desses inibidores de tal forma, que surgem
problemas de sobreposição de átomos e consequentemente erros nas
coordenadas internas. As aproximações utilizadas nesses métodos é o núcleo
de entendimento para sanar essas situações problemáticas. Se as interações
forem mais repulsivas, os métodos com pior descrição eletrônica dos sistemas
moleculares como MNDO e o HF propiciam baixo deslocamento de átomos
dentro do sítio catalítico da proteína quinase de adesão focal. De outro modo, o
uso de métodos como o funcional de densidade e os métodos semi-empíricos
105
PM6 e AM1 fazem com que a os inibidores se movimentem exacerbadamente,
levando a constantes erros de otimização de geometria.
106
107
Conclusões
Neste trabalho foram estabelecidas as principais ligações de hidrogênio
nas geometrias de equilíbrio dos inibidores da proteína quinase listado no
banco de dados de proteínas, bem como a determinação inédita da interação
dessa enzima com o fármaco dasatinib através da técnica de ancoramento
molecular seguido de cálculos de estrutura eletrônica com o método ONIOM,
bem como de uma curta dinâmica molecular.
Foram encontradas ligações de hidrogênio com os aminoácidos Lys 454,
Arg424 e Cys502 para a maioria dos inibidores, indicando a importância desses
aminoácidos na construção de novas drogas para o tratamento do câncer.
Mesmo com diferentes estruturas moleculares, as moléculas inibidoras da
proteína quinase de adesão focal possuem uma similaridade em relação à
interação com a proteína quinase de adesão focal. Essa correlação pode ser
verificada quando se verificam a disposição dos orbitais de fronteira e o
potencial eletrostático, cujos resultados levam a ratificação das interações com
os aminoácidos citados. O tamanho do orbital próximo a Cys502 está
correlacionado com as atividades de inibição dos inibidores da proteína
quinase de adesão focal.
A baixa correlação entre a energia de ligação dos inibidores com os
sítios catalíticos e a atividade de inibição das drogas pode estar correlacionada
a fatores entrópicos que não são passíveis de descrição com solventes
implícitos.
As variáveis obtidas neste trabalho, empregadas para a corroboração
das ligações químicas entre os inibidores da proteína quinase, podem ser
108
utilizadas para a construção de novas drogas inibidoras da proteína quinase de
adesão focal.
Os protocolos de otimização de geometria com os métodos estudados
neste trabalho podem ser utilizados para sanar problemas relativos ao
tratamento de biomoléculas. O método MNDO e HF são particularmente úteis
como ponto de partida para a otimização de geometria do complexo inibidor
interagindo com a FAK. Porém os resultados obtidos via essas aproximações
devem ser corroborados com cálculos mais avançados utilizando o funcional de
densidade B3LYP ou o método semi-empírico PM6, que levam em conta mais
variáveis eletrônicas para melhor descrição do complexo molecular.
109
110
Perspectivas
Na linha das questões em aberto para trabalhos futuros, temos o estudo
dinâmico de todos os sistemas inibidores deste trabalho na proteína quinase de
adesão focal, no intuito de identificar interações e ligações comuns. Para
execução dessa etapa, será necessária a construção de um campo de força
individual para cada inibidor estudado. A fim de construir esse campo de força,
serão utilizadas as bases de dados do campo de força CHARM, para a
definição dos potenciais harmônicos, associados aos cálculos quânticos para a
obtenção das cargas e do potencial de van der Walls.
De posse dos resultados dinâmicos, pode-se estimar a energia livre
dessas interações, bem como o IC50 associado a essas drogas, avaliando-se a
potencialidade das drogas na inibição do mecanismo de transdução de sinais.
Como os resultados provenientes dos cálculos de estrutura eletrônica
conseguem correlacionar a o tamanho dos orbitais próximos a Cys502 com a
atividade da droga, poderia realizar uma mutação nesse aminoácido a fim de
verificar se os inibidores atuais estariam adequado a uma possível mutação da
proteína quinase de adesão focal.
111
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