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Universidade Federal de Ouro Preto

Escola de Farmácia

Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

CIPHARMA

ESTUDO QUÍMICO E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES

ANTIMICROBIANA E ANTICOLINESTERÁSICA DE

EXTRATOS BRUTOS ACETATO DE ETILA E

METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DO FUNGO

Paecilomyces lilacinus

Ana Paula Campos Teles

Ouro Preto - Minas Gerais

2012

Universidade Federal de Ouro Preto

Escola de Farmácia

Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

CIPHARMA

ESTUDO QUÍMICO E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES

ANTIMICROBIANA E ANTICOLINESTERÁSICA DE

EXTRATOS BRUTOS ACETATO DE ETILA E

METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DO FUNGO

Paecilomyces lilacinus

Ana Paula Campos Teles

Orientadora: Profa. Drª. Jacqueline Aparecida Takahashi

Ouro Preto - Minas Gerais

2012

Dissertação apresentada à Escola de

Farmácia da Universidade Federal de

Ouro Preto como parte dos requisitos

necessários para obtenção do grau de

Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Catalogação: www.sisbin.ufop.br

T269e Teles, Ana Paula Campos. Estudo químico e avaliação das atividades antimicrobiana eanticolinesterásica de extratos brutos acetato de etila e metabólitos secundáriosdo fungo Paecilomyces lilacinus [manuscrito] / Ana Paula Campos Teles. -2012. 160f.: il.: color; grafs; tabs.

Orientadora: Profa. Dra. Jacqueline Aparecida Takahashi.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Escola deFarmácia. Departamento de Farmácia. Programa de Pós-graduação emCiências Farmacêuticas. Área de Concentração: Fármacos e Medicamentos.

1. Alzheimer, Doença de. 2. Análise cromatográfica. 3. Fungos. 4.Antibióticos. I. Takahashi, Jacqueline Aparecida. II. Universidade Federal deOuro Preto. III. Titulo.

CDU: 543.544

AGRADECIMENTOS

À Deus, pelo dom da vida e por ter me dado oportunidade e sabedoria para a

realização deste trabalho;

Aos meus pais Ana e Maurício, pelo constante amor, apoio, compreensão,

incentivo e palavras de estímulo em todos os momentos da minha vida, sendo meus

exemplos de vida e perseverança;

À Professora Drª Jacqueline Aparecida Takahashi, pela oportunidade e confiança,

pelos ensinamentos, mas principalmente pela amizade e conselhos sempre acolhedores;

Aos meus irmãos Rose e Rogério, fontes de carinho, apoio e amizade. Irmã, muito

obrigada por tudo que sempre fez e faz por mim, obrigada por cada conversa, por cada

conselho, por não me deixar nunca desistir e por fazer de mim uma pessoa melhor.

Ao Cassio, por todo o carinho, incentivo, apoio e por estar sempre presente na

minha vida apesar da distância;

Aos colegas da turma 2010/2012 do Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas da UFOP;

Às amigas do mestrado Leidiane, Bruna Pitol, Danielle e Juliana, por todo o

acolhimento e amizade, por terem compartilhado comigo, de alguma forma, os momentos

de conquistas, frustrações e cansaço durante esse período de descobertas e

aprendizagem;

Aos amigos do Laboratório de Bioensaios e Biotecnologia do Departamento de

Química da UFMG, principalmente à Karine, Ana Sarah, Adriana, Dhionne, Bruna Gomes,

Paulo, Mirra, Arthur e Jo pela ajuda no desenvolvimento do trabalho e por me

proporcionarem um ambiente sempre agradável para o trabalho e por todas as risadas;

Às amigas Bruna Fernandes, Amanda, Juliana Campos e Larissa, pelo apoio e

sincera amizade durante todos esses anos;

Aos Professores e amigos do Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas da UFOP, em especial, ao Bibo, Dênia e Célia;

À Ivana e ao Ricardo, pela obtenção dos espectros de RMN;

À Líliam, pela ajuda na utilização do HPLC;

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da UFOP;

À Universidade Federal de Ouro Preto, pela bolsa concedida;

À todos que, de uma forma ou de outra me permitiram concluir esse trabalho,

nunca me deixando desistir.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS .............................................................................................................i

LISTA DE GRÁFICOS .........................................................................................................iii

LISTA DE TABELAS ...........................................................................................................iv

LISTA DE ABREVIATURAS ................................................................................................vi

RESUMO ...........................................................................................................................viii

ABSTRACT .........................................................................................................................ix

Capítulo 1

1 INTRODUÇÃO

1.1. Produtos naturais como fonte de fármacos ..............................................................2

1.2. Os fungos e sua relação com substâncias bioativas ................................................4

1.3. O fungo Paecilomyces lilacinus ..............................................................................14

1.4. Antibacterianos ......................................................................................................17

1.5. Anticolinesterásicos ...............................................................................................20

1.6. Técnica OSMAC .....................................................................................................23

Capítulo 2

2 OBJETIVO

2.1. Objetivo geral ..........................................................................................................28

2.2. Objetivos específicos ..............................................................................................28

Capítulo 3

3 PARTE EXPERIMENTAL

3.1. Equipamentos ........................................................................................................30

3.2. Reagentes ...............................................................................................................31

3.3. Meios de cultura .....................................................................................................32

3.3.1. Meio de cultura BHI ................................................................................................32

3.3.2. Meio de cultura sólido antibiótico ............................................................................32

3.3.3. Meio de cultura caldo batata dextrosado ................................................................32

3.3.4. Meio de cultura ágar batata dextrosado ..................................................................32

3.4. Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à detector de arranjo de diodos

(CLAE-PDA)........................................................................................................................33

3.5. Cromatografia a gás (CG) .......................................................................................33

3.5.1. Preparo das amostras para análise em CG ............................................................34

3.6. Ressonância Magnética Nuclear (RMN) .................................................................34

3.7. Espectroscopia de massas por ionização por electrospray (EM-ESI) ....................35

3.8. Manutenção dos micro-organismos ........................................................................35

3.9. Cultivo dos micro-organismos .................................................................................35

3.9.1. Inoculação da bactéria Salmonella tiphymurium .....................................................35

3.9.2. Cultivo do fungo Paecilomyces lilacinus ..................................................................36

3.10. Testes de atividade biológica ..................................................................................39

3.10.1. Avaliação da atividade antimicrobiana - Técnica de difusão em placa utilizando

discos de papel (BAUER et al.,1966).................................................................................39

3.10.2. Avaliação da atividade antimicrobiana – Técnica de microdiluição em

caldo...................................................................................................................................41

3.10.3. Avaliação da atividade de inibição de acetilcolinesterase em cromatografia em

camada delgada (CCD) - Método de Ellmann ...................................................................43

3.10.4. Avaliação da atividade de inibição de acetilcolinesterase em microplaca – Método

de Ellmann..........................................................................................................................44

3.11. Fracionamento dos extratos do fungo P. lilacinus ....................................................45

3.11.1. Fracionamento do extrato 5 SA .............................................................................45

3.11.2. Fracionamento do extrato 8 SA .............................................................................48

Capítulo 4

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Análise da influência das condições de cultivo de P. lilacinus na produção de

metabólitos secundários, via perfis cromatográficos (CLAE-PDA) ....................................52

4.2. Cromatografia a gás ...................................................................................................59

4.3. Caracterização de P18 ...............................................................................................72

4.4. Testes de atividade biológica ......................................................................................77

4.4.1. Avaliação da atividade antimicrobiana - Técnica de difusão em placa utilizando

discos de papel (BAUER et al., 1966) ...............................................................................77

4.4.1.1. Análise Estatística .................................................................................................81

4.4.2. Avaliação da atividade antimicrobiana – Técnica de microdiluição em caldo

............................................................................................................................................82

4.4.3. Avaliação da atividade de inibição de acetilcolinesterase em cromatografia em

camada delgada (CCD)- Método de Ellmann ....................................................................89

4.4.4. Avaliação da atividade de inibição de acetilcolinesterase em microplaca – Método

de Ellmann..........................................................................................................................92

Capítulo 5

5 CONCLUSÃO .................................................................................................................97

Capítulo 6

6 REFERÊNCIAS ............................................................................................................100

ANEXOS ..........................................................................................................................113

i

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Classes de metabólitos secundários fúngicos .....................................................5

Figura 2. Linha de tempo apresentando as classes de antibióticos utilizadas na

clínica....................................................................................................................................9

Figura 3. Foto da aparência do fungo P. lilacinus cultivado em meio de cultura ágar batata

dextrosado (A) e microfotografia dos conidióforos (B) .....................................................15

Figura 4. Esquema de uma microplaca usada no ensaio antibacteriano e antifúngico com

as amostras em uma concentração fixa ............................................................................42

Figura 5. Cromatograma do extrato 1SA (sem agitação) .................................................53

Figura 6. Cromatograma do extrato 1CA (com agitação) .................................................53

Figura 7. Cromatograma do extrato 3 SA (sem agitação).................................................54

Figura 8. Cromatograma do extrato 3 CA (com agitação) ................................................54

Figura 9. Cromatograma do extrato 5 SA (sem agitação) ................................................55

Figura 10. Cromatograma do extrato 5 CA (com agitação) ..............................................55

Figura 11. Cromatograma do extrato 9 SA (sem agitação) ..............................................56

Figura 12. Cromatograma do extrato 8 CA (com agitação) ..............................................57

Figura 13. Cromatograma do extrato 10 CA (com agitação) ............................................57

Figura 14. Cromatograma do extrato 12 SA (sem agitação) ............................................58



Figura 17. Cromatograma da fração P01 obtido por CG em comparação com padrões de

ésteres de ácidos graxos....................................................................................................62


ésteres de ácidos graxos ...................................................................................................62









ii

Figura 23. Cromatograma da fração FH obtido por CG em comparação com padrões de


Figura 24. Cromatograma da fração C01 obtido por CG em comparação com padrões de
















Figura 32. Fragmentos propostos para P18 estabelecidos com base nas correlações 1H-

1H COSY ............................................................................................................................73

Figura 33. Correlações espaciais para P18 baseadas no espectro de NOESY ...............75

Figura 34 (A) e (B). Correlações espaciais para P18 baseadas no espectro de

NOESY...............................................................................................................................75

Figura 35. Espectro de massas (ESI +) da substância P18 ..............................................76

Figura 36. Reações envolvidas no método de Rhee ........................................................89

Figura 37. (A) Foto da placa do teste de Inibição da AchE em CCD (extratos cultivados

sob agitação) e (B) Foto da placa do teste de Inibição da AchE em CCD (extratos

cultivados sob condição estática) ......................................................................................90

iii

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1. Novos fármacos obtidos entre 01/1981 e 06/2006 (N=1184) ............................2

Gráfico 2. Distribuição da produção de antibióticos por micro-organismos ......................20

Gráfico 3. Percentual de inibição antimicrobiana dos extratos 1, 3, 5 e 6, cultivados sob

agitação orbital, após 24 h .................................................................................................83


agitação orbital, após 48 h .................................................................................................83

Gráfico 5. Percentual de inibição antimicrobiana dos extratos 8, 10, 12 e 13, cultivados

sob agitação orbital, após 24 h ..........................................................................................84


sob agitação orbital, após 48 h ..........................................................................................84


condição estática, após 24 h .............................................................................................85


condição estática, após 48 h..............................................................................................85


sob condição estática, após 24 h .......................................................................................86


sob condição estática, após 48 h .......................................................................................86

Gráfico 11. Percentual de inibição da enzima AchE pelos extratos, substâncias P18 e

C09, eserina e MeOH ........................................................................................................94

iv

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Principais classes e alvos de antibióticos ..........................................................18

Tabela 2. Condições de inoculação do fungo P. lilacinus .................................................37

Tabela 3. Massas dos extratos do fungo P. lilacinus ........................................................38

Tabela 4. Dados do fracionamento do extrato 5 S.A (1,098 g) do fungo P. lilacinus por

cromatografia em coluna de sílica gel................................................................................46

Tabela 5. Dados do fracionamento da fração P19 (52,0 mg) por cromatografia em coluna

de sílica ―flash‖ ...................................................................................................................48

Tabela 6. Dados do fracionamento do extrato 8 S.A (1,26 g) do fungo P. lilacinus por

cromatografia em coluna de sílica gel ...............................................................................49

Tabela 7- Composição de ácidos graxos nas frações analisadas.....................................68

Tabela 8- Composição de ácidos graxos nas frações P12, P13 e P14 ............................70

Tabela 9. Dados de RMN de 1H e de 13C, 1H-1H COSY e HMBC para a substância

P18......................................................................................................................................74

Tabela 10. Média dos halos de inibição do crescimento microbiano (em mm) para os

extratos obtidos do fungo P. lilacinus, sob condição de agitação ......................................77

Tabela 11. Média dos halos de inibição do crescimento microbiano (em mm) para os

extratos obtidos do fungo P. lilacinus, sob condição estática ............................................79

Tabela 12. Média dos halos de inibição do crescimento microbiano (em mm) para as

substâncias P18 e C09 isoladas de extratos do fungo P. lilacinus ....................................80

Tabela 13. Agrupamento, resultante da análise estatística dos resultados do teste de

atividade antimicrobiana dos extratos obtidos do fungo P. lilacinus, sob condição de

agitação .............................................................................................................................82

Tabela 14. Agrupamento, resultante da análise estatística dos resultados do teste de

atividade antimicrobiana dos extratos obtidos do fungo P. lilacinus, sob condição

estática................................................................................................................................82

Tabela 15. Percentual (%) de inibição antimicrobiana das substâncias P18 e C09, após 24

h do início do experimento .................................................................................................88

Tabela 16. Percentual (%) de inibição antimicrobiana das substâncias P18 e C09, após 48

h do início do experimento .................................................................................................88

Tabela 17. Valores dos fatores de retenção (Rf) das substâncias ativas no teste de

inibição da AchE ................................................................................................................91

v

Tabela 18. Percentual (%) de inibição das amostras no ensaio anticolinesterásico em

microplaca pelo método de Ellmann ..................................................................................93

vi

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

Ach Acetilcolina

AchE Acetilcolinesterase

AcOEt Acetato de etila

ACTI Iodeto de acetilcolina

BHI Brain Heart Infusion

BuchE Butirilcolinesterase

13C Carbono-13

CCD Cromatografia em camada delgada

CCS Cromatografia em coluna de sílica

CG Cromatografia a gás

CHCl3 Clorofórmio

CLAE-PDA Cromatografia Líquida de Alta Eficiência- Photo Diode Array Detector

cm Centímetro

COSY Correlation Spectroscopy

DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DMSO Dimetilsulfóxido

DNA Ácido Desoxirribonucléico

DTNB Ácido 5,5‘-ditiobis-[2- nitrobenzóico]

EM-ESI Espectroscopia de massas por ionização por electrospray

FDA Food and Drug Administration

g Grama

h Hora

1H Hidrogênio- 1

HCl Ácido clorídrico

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HMG-Co-AR 3-hidroxi-3-metil-glutaril Co-A redutase

HSQC Heteronuclear Single- Quantum Correlation

IAchE Inibidor da acetilcolinesterase

iPrOH Isopropanol

L Litro

µL Microlitro

µg Micrograma

vii

MeOH Metanol

mg Miligrama

MHz Megahertz

min Minuto

mL Mililitro

mm Milímetro

nm Nanômetro

NOESY Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy

PDA Ágar batata dextrosado

PDB Caldo batata dextrosado

ppm Parte por milhão

Pyr Piridina

q.s.p. Quantidade suficiente para

Rf Fator de Retenção

RMN Ressonância Magnética Nuclear

RMN de 13C Ressonância Magnética Nuclear de carbono- 13

RMN de1H Ressonância Magnética Nuclear de hidrogênio- 1

RNA Ácido ribonucléico

OSMAC One strain-many active compounds

s Segundo

TMS Tetrametilsilano

UFC Unidades formadoras de colônia

UV Ultra-violeta

ºC Graus Celsius

δ Deslocamento químico

viii

RESUMO

A utilização de produtos naturais pela humanidade, em busca por alívio e cura de

doenças é prática antiga, principalmente devido à vasta riqueza de espécies vegetais e de

micro-organismos pertencentes ao país. Os fungos são importantes organismos utilizados

nesta prática, devido aos avanços no campo da biotecnologia e à capacidade destes de

produzirem uma variedade de metabólitos secundários. Utilizando-se técnicas como

OSMAC (one strain-many active compounds), são obtidos diversos protótipos bioativos,

que podem ser utilizados na prevenção e no tratamento de uma gama de enfermidades,

entre elas encontram-se as doenças infecciosas e a doença de Alzheimer. Este trabalho

teve como objetivo avaliar os diferentes extratos obtidos do cultivo de Paecilomyces

lilacinus quanto às ações antibacteriana, antifúngica e inibidores da acetilcolinesterase,

enzima representativa no Mal de Alzheimer, além de isolar e identificar os metabólitos

secundários. Os resultados dos ensaios biológicos realizados com os extratos brutos e os

cromatogramas, estes últimos obtidos por CLAE, mostraram que, variando-se as

condições de cultivo, houve variação do perfil químico dos extratos de P. lilacinus. No

teste antimicrobiano utilizando o método de difusão em placa, a maioria dos extratos

testados mostrou satisfatória atividade para as bactérias Staphylococcus aureus, Listeria

monocytogenes e para a levedura Candida albicans. Utilizando a metodologia de

microdiluição em caldo, os extratos mostraram inibição de até 100% do crescimento

microbiano. Para a avaliação qualitativa de inibição da enzima AchE, dos vinte e oito

extratos brutos testados, utilizando o método de Ellmann, dezesseis apresentaram tal

atividade; no método quantitativo, o percentual de inibição variou entre 78 e 97%. Três

substâncias foram isoladas, por métodos cromatográficos, das quais uma foi identificada

como sendo uma δ-lactama. Duas substâncias isoladas foram bioensaiadas para as

atividades acima citadas, apresentando resultados significativos para o teste de inibição

da enzima AchE. Em ambos os testes antimicrobianos, uma substância mostrou atividade

antibacteriana, contra as bactérias Gram-positivas S. aureus e L. monocytogenes.

ix

ABSTRACT

The use of natural products by the humanity, searching for relief and cure of diseases is

an old practice, mainly due to the vast diversity of plants and micro-organisms belonging to

the country. Fungi are important organisms used in this practice, due to the advances in

biotechnology and to their ability to produce a variety of secondary metabolites. The use of

techniques such as OSMAC (one strain-many active compounds) it is possible to generate

diverse bioactive prototypes, which can be used in the prevention and treatment of a range

of diseases, like infectious diseases and Alzheimer‘s diseases. This work aimed to

evaluate the different extracts obtained from the cultivation of Paecilomyces lilacinus for

antibacterial, antifungal activities and inhibition of acetylcholinestersae, the enzyme in

Alzheimer‘s representative, and to isolate and to identify secondary metabolites. The

results of biological assays performed with crude extracts, and their respective

chromatograms obtained by HPLC, showed that varying the growth conditions there was

variation in the chemical profile of P. lilacinus extracts. In the antimicrobial test using plate

diffusion method most of the extracts showed satisfactory activity against Staphylococcus

aureus, Listeria monocytogenes and Candida albicans. Using the broth microdilution

method, the extracts showed up 100% inhibition of microbial growth. For the qualitative

evaluation of AchE enzyme inhibition , from the twenty-eight crude extracts tested, using

the method of Ellmann, sixteen showed such activity, and in the quantitative method, the

percentage of inhibition varied between 78 an 97%. Three substances were isolated by

chromatographic methods, which one was identified as a δ-lactam. Two substances were

isolated bioassayed for the activities above mentioned, with significant results for the test

of inhibition of AchE. In the both antimicrobial testing, one substance showed antibacterial

activity against Gram-positive S. aureus and L. monocytogenes.

1

Capítulo 1

INTRODUÇÃO

2

1. INTRODUÇÃO

1.1. PRODUTOS NATURAIS COMO FONTE DE FÁRMACOS

A utilização de produtos naturais pela humanidade, em busca por alívio

e cura de doenças, pela ingestão de ervas e folhas, é prática muito antiga

(VIEGAS Jr. et al., 2006). No Brasil, a pesquisa de produtos naturais como

fonte de fármacos é crescente, devido a fatores como o alto custo de

medicamentos industrializados, a vasta riqueza de espécies vegetais e de

micro-organismos pertencentes ao país, visto que, aqui se encontra quase um

terço da flora mundial representada por dez biomas com uma biodiversidade

exuberante (BÔAS, GADELHA, 2007). NEWMAN e CRAGG (2007)

constataram que, entre os anos de 1981 e 2006, mais da metade das novas

substâncias químicas encontradas no mercado eram derivadas de produtos

naturais ou sintetizadas a partir destes (Gráfico 1), sendo que, diversos

fármacos, que se consagraram medicamentos industrializados, foram

resultantes de sínteses direcionadas para reproduzir a ação das moléculas

encontradas na natureza.

B - Biológico N - Produto Natural ND - Derivado de Produto Natural S - Fármaco totalmente sintético S* - Sintetizado tendo como

modelo um produto natural V - Vacina NM – Miméticos de produtos

naturais

Gráfico 1. Novos fármacos obtidos entre 01/1981 e 06/2006 (n=1184).

FONTE: NEWMAN e CRAGG, 2007.

3

Os extratos obtidos de fontes naturais podem servir como ponto de partida

para a obtenção de metabólitos secundários a partir dos quais podem ser

preparados derivados sintéticos. Alguns extratos exibem atividade biológica maior

ou diferente de seus componentes isolados por apresentarem uma rica diversidade

de moléculas químicas como polifenóis, alcalóides, peptídeos e terpenóides, que

podem atuar na manutenção e/ou correção das condições fisiológicas de humanos

e animais (LAMPÉN, 2009).

Atualmente, o cenário da pesquisa de produtos naturais está sendo

modernizado com a utilização de técnicas de química combinatória, a fim de

otimizar o estudo da parte ativa da molécula e sua estrutura (NEWMAN, CRAGG,

2007) e se obter o maior número de substâncias bioativas possível (VIEGAS Jr. et

al., 2006). Outra perspectiva do ponto de vista de inovação nessa área é a

pesquisa utilizando micro-organismos como fontes naturais bioativas, devido ao

fato de serem amplamente disseminados no ecossistema e de, nos últimos anos,

de vários terem tido seus genomas seqüenciados (NEWMAN, CRAGG, 2007),

encorajando esta vertente.

O isolamento de substâncias naturais com atividades biológicas, seja de

origem vegetal ou de outras fontes, como micro-organismos, apresenta várias

vantagens em relação ao uso de extratos, visto que a substância bioativa pode ser

administrada e/ou quantificada de forma reprodutível e em doses exatas, gerando

benefícios do ponto de vista experimental e terapêutico (VOLPATO, 2005). Além

disto, apresentam alta afinidade por respectivos receptores específicos, que

geralmente são proteínas, podendo ativá-los ou inibí-los, e possuem ampla

variabilidade química, sendo utilizadas para a prevenção e tratamento de uma

gama de enfermidades (COS et al., 2006; MOLINARI, 2009; KINGSTON, 2011).

Os produtos naturais isolados de micro-organismos têm importância no

desenvolvimento de agroquímicos menos danosos à saúde humana, mas

principalmente, no desenvolvimento de medicamentos, sendo, os fungos,

importantes organismos utilizados nesta prática (PINTO et al., 2002). Esse fato

advém dos avanços no campo da biotecnologia, aliado ao emprego de técnicas

modernas de fracionamento químico, elucidação estrutural e ―screening‖ na busca

por novos protótipos bioativos (VIEGAS Jr. et al., 2006). Outro ponto relevante e

inovador nessa área é a possibilidade de se trabalhar com uma mesma espécie de

4

micro-organismo submetendo-o a diferentes condições de cultivo, para que assim,

possa se obter uma diversidade de metabólitos secundários, candidatos a novas

moléculas bioativas, técnica conhecida como OSMAC (one strain, many active

compounds).

1.2. OS FUNGOS E SUA RELAÇÃO COM SUBSTÂNCIAS

BIOATIVAS

Fungos são classificados como seres eucarióticos, uninucleados, como as

leveduras, ou multinucleados, como se observa em fungos filamentosos ou bolores

(MARINHO et al., 2007). Os fungos filamentosos possuem hifas e estas podem

crescer formando uma massa filamentosa, o micélio (BRIDGE, SPOONER, 2001).

São aeróbios, com nutrição heterotrófica por absorção e armazenamento de

glicogênio (LACAZ et al., 2002), são encontrados em diversos ambientes, como em

água salgada e doce, solo, plantas, animais, alimentos, entre outros. São

classificados ainda, de acordo com as características dos esporos sexuais e corpos

de frutificação, com os ciclos de vida e com as características morfológicas dos

micélios, sendo denominados fungos perfeitos e imperfeitos, que apresentam todos

os estágios sexuais e os que não os apresentam, respectivamente (MADINGAN et

al., 2004). Estima-se que o ecossistema detenha cerca de 1,5 milhões de espécies

fúngicas diferentes, no entanto somente 5% desse total foram descritos, e apenas

16% desse percentual foram estudados (PINTO et al., 2002).

Historicamente, os fungos têm-se apresentado como um dos organismos

mais importantes na produção de metabólitos secundários, representando 38%

desse total (GUNATILAKA, 2006; BÉRDY, 2005). A grande contribuição para a

pesquisa se baseia na produção de novos produtos de aplicação na agricultura, na

nutracêutica, nas aplicações industriais diversas e na medicina. Isto porque as

moléculas produzidas possuem grande diversidade química, como exemplificada

na Figura 1, devido à possibilidade de variações do meio e condições de cultivo às

quais o fungo está submetido.

5

Figura 1. Classes de metabólitos secundários fúngicos.

FONTE: Adaptado de KELLER et al., 2005.

6

Apesar dessa gama de aplicações atribuídas aos produtos naturais

originários de fungos, os medicamentos são, sem dúvida, os alvos mais

importantes na pesquisa, devido à necessidade de novas farmacoterapias e ao

mercado financeiro que os medicamentos movimentam. Um exemplo disto é o fato

de que, em pesquisa publicada em 2002, apontou-se que, no mercado mundial,

seis dos vinte medicamentos mais vendidos, foram obtidos in natura ou por

transformação química de metabólitos provenientes de fungos (PINTO et al,. 2002).

Muitas classes de fármacos originárias de metabólitos fúngicos podem ser citadas,

como antifúngicos, antitumorais, imunossupressores, inibidores enzimáticos,

hipocolesterolêmicos, antiparasitários, anti-inflamatórios, mas principalmente,

antibióticos (DEMAIN, SANCHEZ, 2009; KINGSTON, 2011).

A pesquisa por metabólitos secundários de fungos é antiga, porém, o

primeiro deles de notória eficácia na indústria farmacêutica foi a penicilina,

substância produzida pelo fungo Penicillium chrysogenun (TAKAHASHI, LUCAS,

2008), descoberta acidentalmente pelo pesquisador Fleming em 1928, que

impulsionou o interesse em se estudar micro-organismos como fonte de novos

antibióticos.

Apesar de descoberta no final da década de 20, somente em 1940 a

penicilina G (1) foi introduzida no mercado. Esta substância, isolada como um pó

amarelo, foi amplamente utilizada como um potente agente antibacteriano de

amplo espectro durante a 2ª guerra mundial, impedindo a morte de muitos

soldados (DEMAIN, SANCHEZ, 2009; GUIMARÃES et al., 2010).

O

HN

N

O

S

OH

O

1

Penicilinas são classificadas de várias formas, como, por exemplo, quanto à

sua origem, podendo ser naturais, como é o caso da penicilina G (1) ou semi-

sintéticas, como a amoxicilina (13) e a oxacilina (14). As penicilinas possuem, em

sua estrutura, um núcleo formado por um anel tiazolidina fundido a um anel β-

7

lactâmico, ao qual se liga uma cadeia lateral sendo, este último, junto com a

distorção da geometria planar do sistema bicíclico, essenciais para atividade

antibacteriana das penicilinas (MOORE, NYGREN, 2004; MOREIRA, 2009). Além

disso, a cadeia lateral é responsável por determinar as características

antibacterianas e farmacológicas de cada uma das penicilinas (MOREIRA, 2009).

Para a síntese de penicilinas, utilizam-se como precursores, substâncias contendo

anéis β-lactâmicos produzidas microbiologicamente que são subseqüentemente

derivatizados.

OH

NH2HN

N

O

S

O

OH

N

O

S

O

OH

HN C

OHC N

O

13 14

São conhecidas seis diferentes tipos de penicilinas de origem natural, das

quais duas são usadas como medicamentos antibacterianos, a benzilpenicilina

(penicilina G) (1) e a fenoximetilpenicilina (penicilina V) (15) (MOORE, NYGREN,

2004).

O

O

HN

N

O

S

OH

O 15

Outro antibiótico β-lactâmico produzido por micro-organismos, a

cefalosporina C (16), pertence à classe das cefalosporinas, consideradas

antibióticos β-lactâmicos de 2ª geração. A cefalosporina C foi isolada pela primeira

vez do fungo Cephalosporium acremonium em 1955 e deu origem a vários outros

antibióticos semi-sintéticos. Cefalosporinas também possuem, em sua estrutura,

um anel β-lactâmico, porém este se encontra ligado a um anel di-hidrotiazina

8

(BRULE, MARCHLAND-BRYNAERT, 2007). As cefalosporinas semi-sintéticas são

classificadas em cefalosporinas de primeira geração (ex. cefalotina), de segunda

geração (ex. cefaclor), de terceira geração (ex. cefotaxima) e de quarta geração

(ex. cefepima) (BRUGUERAS, GARCÍA, 1998), possuindo, todas, a mesma

estrutura básica com variações nos substituintes (R1 e R2) (17).

Uma 3ª geração de antibióticos β-lactâmicos são os carbapenemos (18),

descobertos na década de 70. Os carbapenemos possuem, igualmente aos outros

antibióticos β-lactâmicos, o anel β-lactâmico, porém este está fundido a um anel

carbocíclico de cinco membros. Como fármaco representante dessa classe, pode

ser citado o imipenemo (19) (SINGH, BARRETT, 2006).

S

N

HN

O

OCOOH

O

O

HO

O

NH2

S

N

HN

R2

COOH

O

R1

O

16 17

NR

CO2H

H

O

OH

H

N

H3C

COOHO

OHH H

S

HN

NH

19

18

Além dos β-lactâmicos, antibióticos pertencentes a outras classes e com

relevante importância clínica, foram também isolados de micro-organismos. A

Figura 2 ilustra agentes antibacterianos obtidos de fontes naturais e de origem

sintética, descobertos e produzidos, respectivamente, ao longo dos anos.

9

Figura 2. Linha de tempo apresentando as classes de antibióticos utilizados na

clínica. Compostos listados em fonte normal são derivados de produtos naturais e,

os listados em itálico são derivados de origem sintética.

FONTE: Adaptado de SINGH e BARRETT, 2006.

Outra classe de substâncias biotivas produzidas por fungos filamentosos são

os antifúngicos. A descoberta de antibióticos antifúngicos data de 1939 com o

isolamento do primeiro antifúngico, a griseofulvina (20), isolada do fungo

Penicillium griseofulvum. A griseofulvina inibe o crescimento de várias espécies

fúngicas, como Epidermophyton, Microsporum e Trichophyton, agindo como

fungistático e, dependendo da concentração usada, pode inibir a divisão celular

(GUPTE et al., 2002).

20

O

O

OCH3OOCH3

Cl

H3CO

H3C H

1930 1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000

Sulfa 1936

Fenilpropanóides Cloranfenicol

1946

Aminoglicosídeos Estreptomicina

1946-1960

Macrolídeos Eritromicina

1952

2ª geração β-lactâmicos Cefalosporinas

1962

Β-lactâmicos Penicilina 1929-1941

Policetídeos Tetraciclinas

1949

Glicopeptídeos Vancomicina 1956-1975

Quinolonas Ácido nalidíxico

1960-1962

Oxazolidinonas Linezolida 1979-2000

3ª geração β-lactâmicos Carbapenemos

1975-1985

Daptomicina 2003

10

Nistatina (21) e anfotericina B (22), também são substâncias com atividade

antifúngica, pertencentes ao grupo dos macrolídeos poliênicos, porém, têm o uso

clínico restrito, devido à alta toxicidade e baixa especificidade (GUPTE et al., 2002).

21

CH3

O

OH

O

O

O

CH3

HO

H3C

OH OH OH OH

OH

O OH

COOH

NH2

OH

CH3

OH

22

Atualmente, inibidores da síntese de β-D-glucano na parede celular dos

fungos estão sendo utilizados no tratamento de aspergilose invasiva em pacientes

que apresentam intolerância aos tratamentos convencionais (BOWMAN et al.,

2002). Um importante grupo desses inibidores é o das equinodinas, que englobam

moléculas que contem, em sua estrutura, um anel hexapeptídico N-acetilado e que

se diferenciam entre si pelos substituintes ligados a esse anel (VICENTE et al,.

2003). Um fármaco pertencente a esse grupo é a caspofugina (23), que exibe

atividade in vitro contra uma ampla variedade de leveduras, fungos filamentosos e

dimórficos clinicamente importantes, inclusive Candida spp. e Aspergillus spp

(BERGOLD, GEORGIADIS, 2004). Outro fármaco deste grupo é a micafugina (24),

originada do antibiótico FR901379, produzido pelo fungo Coleophoma empedri;

micafugina também mostrou atividade contra Candida spp. e Aspergilus spp. in

vitro (TAWARA et al., 2000), além de ser eficaz em animais (MATSUNOTO et

al.,1998). Quando aplicada em população com o vírus da AIDS, micafugina foi

11

efetiva na melhora ou eliminação dos sinais clínicos e sintomas da candidíase

(WAKAI et al., 1998).

HO

NH

O

N

HN

CH3HO

NH

R5

OH

R4

HN

O

N

NH

R2

O

R1

HO

OH

OH

OHR3

O

OO

R1 R2 R3 R4 R5

23 H NH2(CH2)2CHOH H NH(CH2)2NH

O

24 OHSO3 NH2(CO)CH2CHOH CH3 OH

O

N O

O

Fungos filamentosos também produzem estatinas, substâncias com ação

hipocolesterolêmica, ou seja, que agem reduzindo os níveis sanguíneos de

colesterol. Em 1975, no Japão, isolou-se, pela primeira vez, do fungo Penicillum

brevicompactum, a mevastatina (25), posteriormente obtida também de Penicilium

citrinum (DEWICK, 2002). Lovastatina (12), outra substância hipocolesterolêmica

foi isolada posteriormente de culturas de Aspergillus terreus e Monascus ruber com

estrutura semelhante à mevastatina (possui um grupo 6´-metílico adicional), mas

com potência superior, levando à sua aprovação como medicamento, em 1987,

pelo FDA (Food and Drug Administration), enquanto a mevastatina foi abandonada

devido a efeitos indesejáveis em animais (CAMPO, CARVALHO, 2007). Estudos de

otimização levaram à síntese da simvastatina (26), análogo sintético da lovastatina,

que ingressou no mercado farmacêutico na década de 70 como o primeiro fármaco

antilipidêmico sintético, atuando como inibidor da 3-hidroxi-3-metil-glutaril Co-A

redutase (HMG-Co-AR), enzima cineticamente limitante da biossíntese do

12

colesterol, tendo como substrato natural o hidroxi-metil-glutaril-Co-A, levando ao

ácido mevalônico ou à mevalo-lactona. Este fármaco representa uma autêntica

inovação terapêutica para controle do colesterol plasmático (VIEGAS Jr. et al.,

2006).

HO

OO

OHO

HO

O

H3C

O

OHO

H3C

CH3CH3

HO

OO

OHO

25 12 26

Outras substâncias com importantes atividades biológicas também isoladas

de micro-organismos são os imunossupressores ciclosporina A (3), rapamicina (27)

e ácido micofenólico (28), tendo, este último, originado o fármaco semi-sintético

micofenolato de mofetila (29) (USUI, et al., 2006).

NN

N

HN

NN

O O O

OH

HOO

O

N

HN

NH

NNH

O O

O

O

O

OMe

OHOMe

OH

O

O

OOMe

H OH

Me

O

N

O

Me

Me OMe Me Me

Me

3 27

13

O

O

O

OH

OH

O

O

O

O

OH

O

O

N O

28 29

No entanto, alguns fungos produzem também substâncias tóxicas para os

seres vivos, denominadas micotoxinas. As micotoxinas são substâncias naturais

produzidas pela estrutura micelial dos fungos filamentosos, não tendo significado

bioquímico no crescimento e desenvolvimento destes (HUSSEIN, BRASEL, 2001).

São encontrados mais de 400 destes compostos e estes são classificados de

acordo com suas características químicas e origem biossintética (BENNETT,

KLICH, 2003). Entre as micotoxinas mais importantes encontram-se as aflatoxinas,

como a aflatoxina B1 (10), ocratoxinas, como a ocratoxina A (30), citreoviridinas,

como a citrinina (31), fuminosinas, como a fuminosina B1 (32), patulina (33) e

alcalóides do ergot, como a ergotamina (34) (PINTO et al., 2002; BENNETT,

KLICH, 2003). Surpreendentemente, algumas micotoxinas, como a di-

hidroergotamina (35) e a metilergonovina (36) possuem relevantes propriedades

farmacológicas, sendo utilizadas na medicina humana no tratamento da enxaqueca

e no controle de hemorragias pós-parto, respectivamente (MOSS, 2002;

MOREIRA, 2009).

O O

O

O O

OCH3

NH

OH

O

O

Cl

O

H

CH3

COOH

10 30

14

O

OH

HOOC

O

CH3 CH3

CH3

CH3

H3C

O C C

OHOH

CH3

O

CH3 OH

O C OH OH

O O

O

OH

O

OH

NH2

31 32

O

O

O

OH 33

HN

N

HCH3

H

O

NH

CH3

O

N

O

OH

N

H

H CH2

O

34

HN

N

HCH3

H

O

NH

CH3

O

N

O

OH

N

H

H CH2

O

HN

H

N

O NH

OH

35 36

1.3. O FUNGO Paecilomyces lilacinus

Paecilomyces lilacinus (Figura 3) é uma espécie de fungo filamentoso que

pertence ao filo Ascomycota, classe Euascomycete, ordem Eurotiales, família

Trichocomaceae, gênero Paecilomyces e espécie lilacinus (GABOARDI, 2007).

15

As colônias de espécies deste gênero apresentam inicialmente formas

planas e flocosas, mas à medida que amadurecem, desenvolvem textura

aveludada ou pulverulenta. A cor das colônias pode ser altamente variada

(FISHER, COOK, 2001), sendo que as colônias de Paecilomyces lilacinus

apresentam conidióforo pigmentado, parede rugosa e reverso incolor ou púrpura

(LACAZ et al., 2002).

Figura 3. Foto da aparência do fungo P. lilacinus cultivado em meio de cultura ágar

batata dextrosado (A) e microfotografia dos conidióforos (B).

FONTES:http://www.biotec.or.th/tncc/dbstore/StrainDetails.asp?Genus=Paecilomyces&Species=lil

acinus&id=82&DB=BCC [acessado em: 12/07/11]

http://www.pf.chiba-u.ac.jp/gallery/fungi/p/Paecilomyces_lilacinus_SEM.htm [acessado em 12/07/11]

O gênero Paecilomyces é morfologicamente similar ao gênero Penicillium e,

no ano de 1971, já eram descritas 31 espécies diferentes. As espécies mais

comuns são P. variotti e P. lilacinus (SAMSON, 1974), podendo esta última, no

Brasil, ser encontrada em diferentes tipos de solo, cultivados ou não, em

profundidades variáveis de 0-40 cm ou mais (CARNEIRO, 1986) e em estruturas

marinhas, como esponjas e outros (ELBANDY et al., 2009).

Fungos deste gênero são capazes de produzir uma diversidade de

metabólitos secundários de diferentes classes químicas e com diferentes atividades

biológicas, como antimicrobiana, citotóxica e imunoestimulante (KIONG et al.,

2001). Estudos mostram a produção de paeciloquinonas, antraquinonas inibidoras

da enzima tirosina quinase por P. carneus P-177 (FRENDENHAGEN et al., 1995);

paecilosetina (37), um ácido tetrâmico produzido por P. farinosus (LANG et al.,

2005), uma série de tricotecanos de P. tenuipes (KIKUSHI et al., 2004);

cornexistina (38) e 14-hidroxicornexistina (39), fitotoxinas, produzidas por P. variotii

http://www.biotec.or.th/tncc/dbstore/StrainDetails.asp?Genus=Paecilomyces&Species=lilacinus&id=82&DB=BCC

http://www.biotec.or.th/tncc/dbstore/StrainDetails.asp?Genus=Paecilomyces&Species=lilacinus&id=82&DB=BCC

http://www.pf.chiba-u.ac.jp/gallery/fungi/p/Paecilomyces_lilacinus_SEM.htm

16

(FIELDS et al., 1996), além de α-pironas (40-41) e ciclo-hexenonas (42-43),

isoladas de P. lilaninus, derivados de uma esponja marinha (ELBANDY et al.,

2009). Outras substâncias foram isoladas, recentemente, de Paecilomyces sp.

SC0924, seis novas lactonas β-resorcíclicas (44-49) denominadas paecilomicinas

A-F e outras cinco já conhecidas, na qual, algumas mostraram atividade anti-

plasmodial contra Plasmodium falciparum (XU et al., 2010).

H

H

HO

NH

HO

O

OO

O

O

OH

OH

R

37 38 R = CH3 / 39 R = CH2OH

O

O

R2

R1

R3

O

R3

O

R1

OCH3

R2

40 R1 = OH, R2 = CH3, R3 = H 42 R1 = O

O

, R2 = OOH, R3 = OCH3 41 R1 = CH3, R2 = H, R3 = H

43 R1 = OOH, R2 =O

O

, R3 = OCH3

O

OOH

OHH3COO OH

H

OH 44 45

O

O

H3CO

OH

O

HO OH

OH

17

O

OH

H3CO

OH OHR1R2 OH

O

OH

O

OOH

OHH3CO

R1

R2

OH

46 R1 = H, R2 = OH

47 R1 = OH, R2 = H

48 R1 = H, R2 = OH

49 R1 = OH, R2 = H

P. lilacinus possui distribuição cosmopolita e seus metabólitos secundários

são amplamente utilizados no controle biológico de nematóides, sendo, muitas

vezes, a produção desses metabólitos induzida pela presença dos nematóides no

meio (SANTIAGO et al., 2006). Os metabólitos secundários produzidos por esta

espécie são diversos, variando com o meio e as condições às quais estão

submetidos os micro-organismos.

1.4. ANTIBACTERIANOS

As doenças infecciosas representam, atualmente, umas das principais

causas de morte da população humana, devido ao surgimento de micro-

organismos multirresistentes aos antibióticos, ocasionada por diversos fatores,

entre eles, o uso constante e irracional de antibióticos (DAFFRE et al., 2001;

ANTUNES et al., 2006), o surgimento de organismos oportunistas fatais,

associadas à AIDS, quimioterapia anti-neoplásica e transplantes (PENNA et al.,

2001). Diante de tal situação, a pesquisa por novos agentes antimicrobianos

eficazes é de grande relevância, alargando o campo da pesquisa nesta área.

O interesse pelo isolamento de metabólitos secundários de fungos, capazes

de inibirem outros micro-organismos, tem aumentado na pesquisa aplicada e na

investigação acadêmica (LIMA et al., 2004). O uso de fungos para este fim, por

exemplo, em substituição às plantas é benéfico, pois micro-organismos não

acarretam danos ao serem isolados de um dado ecossistema, como pode ocorrer

18

com a retirada de plantas e algas da natureza, além de os fungos, poderem ser

cultivados em grande escala em fermentadores (TAKAHASHI, LUCAS, 2008).

Os antibióticos são compostos naturais ou sintéticos que inibem o

crescimento ou provocam a morte de bactérias e fungos (GUIMARÃES et al.,

2010), sendo, as principais classes, mostradas na Tabela 1.

Tabela 1. Principais classes e alvos de antibióticos

Antibióticos Alvo

β-lactâmicos (penicilinas, cefalosporinas,carbapeninas, monobactamas)

Enzima transpeptidase

β-lactâmicos (oxapeninas, sulfoxapeninas)

Enzima β-lactamase

Macrolídeos, lincosamidas, estreptograminas (dalfopristina e quinupristina), cloranfenicol,

oxazolidinonas (linezolida)

Subunidade 50S ribossômica

Aminoglicosídeos, tetraciclinas

Subunidade 30S ribossômica

Glicopeptídeos (vancomicina, teicoplanina)

Dipeptídeo terminal D-Ala-D-Ala do peptideoglicano

Peptídeos não ribossomais (bacitracina, gramicidina C, polimixina B)

Membrana plasmática

Lipodepsipeptídeos (daptomicina)

Membrana plasmática

Rifampicina

RNA polimerase dependente de DNA

Fluoroquinolonas

Enzima DNA girase

Sulfonamidas

Enzima di-hidropteroato sintetase

FONTE: Adaptado de GUIMARÃES et al., 2010.

Para o tratamento de infecções fúngicas, os principais medicamentos

utilizados são a anfotericina B (22) e os azóis [cetoconazol (50), fluconazol (51),

itraconazol (52), e outros], que têm como alvo a membrana celular dos fungos

(BERGOLD, GEORGIADIS, 2004). A anfotericina B é um potente fungicida de

amplo espectro, mas seu uso pode causar efeitos adversos significantes, como

nefrotoxicidade e febre devido à reação aguda à sua infusão intravenosa; já os

azóis, compostos totalmente sintéticos, causam menos reações adversas, sendo

preferencialmente escolhidos no tratamento de infecções fúngicas sistêmicas. Há,

19

N N O

O

O

NN

Cl

ClO

H3C

Cl

Cl

N

N

NO

O

O N N N

N

N

O

F

F

OH

NN

N

N

N

N

no mercado, novos fármacos antifúngicos como as aureobasidinas, que agem

inibindo a síntese da membrana plasmática dos fungos (PELÁEZ, OLGA, 2009) e

o posaconazol, um triazólico de segunda geração (TELLES, 2007).

50

51

52

As fontes de antibióticos são, entre outras, os estreptomicetos, os

actinomicetos raros, os fungos e as bactérias (BÉRDY, 2005). O Gráfico 2 ilustra a

distribuição da produção de antibióticos por esses organismos.

20

Gráfico 2. Distribuição da produção de antibióticos por micro-organismos.

As infecções são causadas por uma variedade de micro-organismos, sendo

alguns mais patogênicos que outros. Colombo e Guimarães (2003) mostraram que

as leveduras do gênero Candida são responsáveis por cerca de 80% das infecções

fúngicas hospitalares, sendo a principal causa de infecção fúngica sistêmica, com

taxa de mortalidade geral de fungemias da ordem de 40 a 60%. Quanto às

infecções bacterianas, algumas das espécies mais patogênicas compreendem

Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Diante o

exposto, faz-se necessária a descoberta de novas substâncias antibióticas que

atuem combatendo as infecções.

1.5. ANTICOLINESTERÁSICOS

A doença de Alzheimer é uma afecção neuro-degenerativa progressiva e

irreversível, que acarreta perda da memória e diversos distúrbios cognitivos

(SMITH, 1999). Esta patologia acomete cerca de 1,5% da população com idade

entre 65-69 anos, 21% entre 85-86 e 39% acima dos 90 anos, sendo presente em

aproximadamente 15 milhões de pessoas em todo o mundo (VIEGAS Jr. et al.,

2004). Os sinais e sintomas estão relacionados à redução de neurotransmissores

cerebrais, como acetilcolina, noradrenalina e serotonina (BRYNE, 1998).

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

40%

45%

50%

Bactérias Fungos Actinomycetales (Estreptomicetos +

Actinomicetos raros)

Porc

enta

ge

m d

a p

rod

ução d

e

antibió

ticos p

or

mic

ro-o

rga

nim

os

em

2005

Micro-organismo

21

NH2

O

NH

Me

O

N N

H

Me

MeMe

O tratamento da doença de Alzheimer é baseado na tentativa de restauração

da função colinérgica. Dessa forma, a elevação do nível da acetilcolina é realizado

pela utilização de inibidores da acetilcolinesterase (IAchEs), enzima que atua na

degradação desses neurotransmissores na fenda sináptica. Atualmente, há uma

diversidade de substâncias sendo pesquisadas para tal fim, o que se tornou

possível graças à modernização dos ensaios, que agora permitem a utilização da

enzima AchE para avaliação rápida de grandes quantidades de amostras. Este

bioensaio sensível é capaz de detectar e selecionar amostras com ação

anticolinesterásica (TREVISAN, 2003).

A tacrina (53) foi o primeiro fármaco sintético aprovado pelo FDA para o

tratamento da doença de Alzheimer, porém apresenta sérios efeitos colaterais.

Outros fármacos, como fisostigmina (54) e rivastigmina (55) também tem sido

utilizados. Porém, a galantamina (56), um alcalóide isolado de plantas da família

Amaryllidaceae, apresenta ação seletiva, reversível e competitiva para inibir a

acetilcolinesterase (TREVISAN et al., 2006), sendo considerada mais efetiva do

que a fisostigmina e a tacrina (INGKANINAN et al., 2000; RHEE et al., 2001). A

galantamina tem sido utilizada como protótipo para novos fármacos

anticolinesterásicos. Outra substância anticolinesterásica é a Huperzina-A (57),

isolada de Huperzia serrata. Esta substância mostrou potente atividade IAhE e seu

uso sistêmico pode aumentar a liberação de ACh, dopamina e norepinefrina, sendo

que o aumento da concentração de ACh pode persistir por até 6 h após a

administração do chá desta planta (CHANG , 2000; RAJENDRAN et al., 2002).

A atividade anticolinesterásica de extratos da planta Ginkgo biloba (VIEGAS

Jr., et al., 2004), aliada à diversidade estrutural dos IAchEs conhecidos e à

possibilidade de se estudar diferenciados modos de ação, estimularam o estudo

químico de várias espécies vegetais e de micro-organismos, que pudessem

fornecer novas substâncias anticolinesterásicas.

53 54

22

O

O

N

CH3

CH2CH3

H3C

CH3

CH3 O

MeO

H

N

OH

Me

55 56

H2NH3C

NH

O

CH3

57

Trevisan e colaboradores (2003) realizaram um estudo com 50 extratos de

38 espécies de variados gêneros vegetais, para identificar, nestes extratos,

substâncias inibidoras da enzima AchE. Para a pesquisa, foram utilizados o ensaio

bioautográfico de Rhee et al e o ensaio de Ellmann, em microplacas. Os autores

observaram que Paullinia cupana (guaraná), Amburana cearensis (cumaru) e

Lippia sidoides (alecrim-pimenta) foram as espécies que demonstraram os

melhores resultados, inibindo de 65-100% da atividade enzimática.

Produtos naturais produzidos por micro-organismos também são candidatos

a novas fontes de substâncias anticolinesterásicas, como as quinolactacina A1 (58)

e quinolactacina A2 (59) isoladas de uma cultura de Penicillium citrinum 90648

(KIM et al., 2001) . Estudos como estes evidenciam a contribuição e a relevância

da pesquisa de metabólitos fúngicos com a finalidade de sua utilização no

desenvolvimento de novos fármacos anticolinesterásicos.

N

HN

OO

CH3

H3C

CH3

N

HN

OO

CH3H3C

H3C

58 59

23

1.6. TÉCNICA ―OSMAC‖ (One strain-many active compounds)

Como visto anteriormente, produtos naturais produzidos por micro-

organismos são alvos de grande interesse de pesquisadores e da indústria

farmacêutica, principalmente após a descoberta do antibiótico penicilina, isolado de

um fungo. Este fato pode ser atribuído a fatores como a alta diversidade química

das moléculas produzidas no metabolismo de micro-organismos e à facilidade de

manuseio, pouco tempo e espaço que demandam o cultivo dos mesmos (ELIAS et

al., 2006). Além disso, técnicas estão sendo desenvolvidas para otimizar, direcionar

e/ou diversificar a produção de metabólitos secundários de micro-organismos,

sendo que essas técnicas podem ser divididas em dois tipos: técnicas moleculares

e técnicas de cultivo onde parâmetros do mesmo são alterados (GROSS, 2007).

Esta última vem sendo utilizada há algum tempo por pesquisadores que trabalham

com produtos naturais de micro-organismos e é denominada OSMAC (one strain-

many active compounds).

O método OSMAC baseia-se no cultivo de uma determinada espécie de

micro-organismo variando-se alguma (s) condição (ões) de incubação. São vários

os parâmetros que podem ser variados, dentre eles, a composição do meio de

cultura, aeração do meio, alterando a rota metabólica daquele micro-organismo

(SALEEM et al., 2009), período de cultivo, pH, temperatura e a adição de agentes

para induzir ou inibir a produção de determinado (s) metabólito (s) (BODE et al.,

2002; BUGNI, IRELAND, 2004). Uma importante ferramenta aliada ao OSMAC é a

utilização de modelos estatísticos para se delinear experimentos (PIMENTA, et al.,

2010), o que pode otimizar o crescimento microbiano, aumentando a produção de

metabólitos bioativos e direcionando a pesquisa para a produção de determinada

(s) substância (s) (COCKSHOTT, SULLIVAN, 2001; CHAKRAVARTI, SAHAI, 2002;

FURTADO et al., 2005; SAYYAD et al., 2007; TULLY et al., 2007).

Cueto e colaboradores (2001) realizaram um importante trabalho, no qual

um potente antibiótico foi obtido a partir da técnica de OSMAC. Pestalone (60),

uma benzofenona clorada, foi isolada a partir de uma mistura contendo o fungo

marinho Pestalotia sp. (linhagem CNL-365) e uma bactéria marinha não

identificada, antibiótico-resistente, sendo que, quando a espécie fúngica era

cultivada individualmente, essa substância não era produzida.

24

HO

OH

CHO

O OH

Cl

Cl

RO

60

Fatos como este demonstram que a produção de substâncias antibióticas

pode ser induzida em resposta ao antagonismo microbiano (BURGESS et al.,

1999) e que a produção de metabólitos secundários específicos pode ser

aumentada 400 vezes quando espécies são cultivadas na presença de um

antagonista (SONNENBICHLER et al., 1994). Pestalone mostrou potente atividade

antibacteriana contra Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MIC = 37

ng/mL) e Enterococcus faecium resistente à vancomicina (MIC = 78 ng/mL).

Wang e colaboradores (2011) realizaram uma pesquisa na qual, utilizando a

técnica OSMAC, isolaram três novas citocalasinas (alcalóides fúngicos) (61, 62 e

63) e cinco novos análagos, as aspocalasinas, de uma cultura de Spicaria elegans.

A obtenção desses produtos foi decorrente da variação do meio de cultivo e da

adição de aminoácidos precursores dessa molécula, pois o tipo de citocalasina

produzido depende do aminoácido incorporado à sua estrutura. As moléculas 61,

62 e 63 foram avaliadas quanto à atividade citotóxica, contra linhagens celulares.

HNO

OH

O

OH

HO

HNO

O

O

O OH

O

61 62

25

HNO

O

O

O

O

OH 63

As substâncias 61 e 62 mostraram grande atividade citotóxica contra a linhagem A-

549 com IC50 de 8,2 µM e 20,0 µM, respectivamente.

Em outro estudo, realizado por Bode e colaboradores (2000), induziu-se a

mutação do fungo Sphaeropsidales sp. (linhagem F-249707) por exposição à luz

UV. Esta espécie de fungo, produtora de espirobisnaftalenos, policetídeos com

diferentes atividades biológicas, como por exemplo, a cladospirona bisepóxido (64),

após mutação, produziu um novo policetídeo, denominado mutolide (65). A nova

substância foi submetida ao teste antibacteriano, contra B. subtilis e E. coli,

produzindo halo de inibição de 10 mm na placa.

O OO

OH OH

O O

O O

OH

OH

H3C

64 65

Na pesquisa realizada por Scherlach e Hertweck (2006), quatro novas

aspoquinolononas (66–69) foram obtidas a partir de uma cultura de Aspergillus

nidulans, submetida à técnica de OSMAC. Um total de 40 extratos foi preparado

em 40 diferentes condições de cultivo (seis diferentes meios de cultura, cultivo sob

agitação e condição estática, além de variação no tempo de cultivo).

26

NH

HO

O

OCH3

OCH3

H

OHO

NH

HO

O

OCH3

OCH3

H

OHO

66 67

NH

HO

O

OCH3

OCH3

H

OHOHO

diasteroisômeros 68-69

As aspoquinolonas 66 e 67 exibiram grande atividade citotóxica contra células

fibroblásticas L-929 de ratos com IC50 de 10,6 e 11,4 lg mL-1, respectivamente e

bom efeito antiproliferativo de células leucêmicas K-562 (IC50 =17,8/21,2 lg mL-1),

respectivamente.

27

Capítulo 2

OBJETIVO

28

2. OBJETIVO

2.1. OBJETIVO GERAL

Realizar o estudo químico de metabólitos secundários do fungo

filamentoso Paecilomyces lilacinus, utilizando-se a técnica OSMAC em

seu cultivo, para a obtenção de substância (s) com atividade (s)

antibacteriana (s), antifúngica (s) e anticolinesterásica (s).

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Cultivar o fungo P. lilacinus, em diferentes condições, para a obtenção

dos extratos brutos;

Selecionar, por meio de testes biológicos, as condições de cultivo que

levarem aos extratos mais ativos;

Produzir os extratos mais ativos em quantidades adequadas ao seu

fracionamento;

Submeter os extratos brutos selecionados à técnicas de cromatografia

para o isolamento de constituintes químicos;

Elucidar a estrutura das substâncias isoladas utilizando técnicas

espectrométricas;

Realizar testes biológicos (atividade antibacteriana, antifúngica e inibição

de acetilcolinesterase) para as substâncias isoladas.

29

Capítulo 3

PARTE EXPERIMENTAL

30

3. PARTE EXPERIMENTAL

3.1. EQUIPAMENTOS

Agitador de tubos Phoenix, modelo AP 56, série 10359;

Agitador magnético Corning;

Autoclave vertical Fanen, modelo 415/3, série J03610;

Balança analítica Quimis, modelo Q-ILA2104, 210g/0,1 mg;

Balança eletrônica Digimed KN1000C, classe exatidão II, série 04G6;

Banho Büchi waterbath B-480;

Banho de ultra-som UltraCleaner 800ª com aquecimento;

Bomba de pressão Quimis, modelo Q-355B1, série 806377;

Bomba de pressão Millipore WP6111560;

Bomba de vácuo Tecnal TE-0581;

Capela de exaustão em madeira;

Cabine de segurança biológica VECO, modelo JLF 912, série FL 5799;

Câmera fotográfica Sony Cyber-shot 7.2 mega pixels;

Chapa de aquecimento Laboratory Stirrer, modelo PC-320, série 440893;

Cromatógrafo a gás HP5890;

Cromatógrafo líquido Waters Alliance 2695;

Colunas de vidro;

Espectrofotômetro Bioespectro, modelo SP-22;

Espectrômetros BRUKER AVANCE DPX200 e DRX400;

Espectrômetro de massas MicroTOF, Bruker Daltonics;

Estufa de secagem Fanen Ltda, modelo 002 CB;

Estufa para meio de cultura Quimis Q-316.12, série 807.131;

Estufa para placa cromatográfica Quimis G-317 8122;

Incubadora B.O.D. MA 415/ Marconi;

Lâmpada UV 254 nm Mineralight UVG-54;

Leitora de microplaca Thermo Plate, modelo: TP-READER;

Mesa agitadora Tecnal, modelo TE-421;

Mesa agitadora Cientec CT- 712;

31

Microondas Máster Cooking CCE M-500;

Micropipeta automática Digipet de 5-50 µL, série 05012635;

Micropipeta automática Finnpipette 4027, Labsystems de 200-1000 µL, série

E19971;

Micropipeta automática Kacil de 100 µL, série 0037201;

Micropipeta automática multicanal Digipet de 20-100 µL;

Paquímetro digital 150 mm/0,01mm, Jomarca;

Placas de vidro para CCD;

Ponto de fusão Gehaka, modelo PF 1000, série 0530/06001020;

Purificador de água Millipore- Milli Q;

Refrigerador Consul Pratice 230;

Refrigerador Eletrolux Double D440;

Rotavapor Büchi Waterbath, modelo B-480;

Rotavapor Fisaton, modelo 802, série 531782;

Termômetro Incoterm, série 313675.

3.2. REAGENTES

Ágar batata dextrosado- PDA, Acumedia;

Caldo de batata dextrosado- PDB, Acumedia;

Caldo infusão de cérebro e coração- BHI, Acumedia;

Cloreto de Sódio, Vetec;

Discos com cloranfenicol (30 µg/disco), Sensidisc;

Discos com miconazol (50 µg/disco), Sensifungidisc- CECON;

Iodo sublimado;

Meio de cultura antibiótico, Difco TM ;

Sílica gel para CCS, Vetec;

Sílica gel para CCD, Sigma;

Solventes P.A: acetato de etila, acetona, álcool isopropílico, álcool metílico,

clorofórmio, diclorometano, dimetilsulfóxido, éter etílico, hexano, piridina;

Solvente grau HPLC: álcool metílico;

32

Kit SIGMA para teste de inibição da enzima aceticolinesterase: Albumina

bovina sérica B4287-25G, Ácido 5,5‘-ditiobis- [2-nitrobenzóico] (DTNB) D8130-

5G, Tris/HCl 0,1 M pH 8, Iodeto de acetilcolina (ACTI) A5751-5G,

Acetilcolinesterase liofilizada tipo V-S C2888.

3.3. MEIOS DE CULTURA

3.3.1. Meio de cultura BHI

BHI (Brain heart infusion) .......... 37,0 g/L

Água destilada qsp

3.3.2. Meio de cultura sólido antibiótico

Meio antibiótico .......... 30,5 g/L

Água destilada qsp

3.3.3. Meio caldo batata dextrosado

Caldo batata dextrosado .......... 24,0 g/L

Água destilada qsp

3.3.4. Meio ágar batata dextrosado

Ágar batata dextrosado .......... 39,0 g/L

Água destilada qsp

33

3.4. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA ACOPLADO À

DETECTOR DE ARRANJO DE DIODOS (CLAE-PDA)

Os extratos brutos, obtidos a partir do cultivo do fungo P. lilacinus em

diferentes condições, foram analisados por CLAE-PDA para a obtenção dos perfis

cromatográficos dos mesmos, a fim de se verificar o perfil da produção de

metabólitos secundários em função dos parâmetros estudados. As amostras

analisadas por CLAE-PDA foram devidamente filtradas com unidades filtrantes

MILLEX LCR (0,45µm) PTFE modificadas para solventes orgânicos - Millipore. Os

extratos fúngicos foram analisados utilizando-se um cromatógrafo líquido Waters

Alliance 2695, equipado com bomba quaternária, auto-injetor, detector de arranjo

diodo (PDA) e forno para coluna. As separações foram realizadas em uma coluna

de fase reversa C18 Shimadzu ODS (150 x 4,6 mm; 5 µm). O volume de amostra

injetado foi de 20,0 µL, na concentração de 1,0 mg/mL. O sistema cromatográfico

foi operado utilizando-se o software EMPOWER.

O método empregado na corrida cromatográfica apresentou as seguintes

características: a fase móvel consistiu de uma mistura de H2O e metanol e o

gradiente linear de eluição usado foi H20-MeOH 90:10 a 0:100 em 30 min. O

gradiente foi retornado ao valor inicial e mantido por 5 min, para equilíbrio do

sistema, antes da injeção da próxima amostra. A fase móvel utilizada (H20 –

MeOH) foi filtrada e desgaseificada por 30 min em banho de ultra-som antes do

experimento. O fluxo do eluente foi de 0,8 mL/min.

3.5. CROMATOGRAFIA A GÁS (CG)

As análises por CG foram realizadas em um cromatógrafo a gás HP5890

equipado com detector por ionização de chamas. Utilizou-se uma coluna HP-

INNOWax (HP) 15 m X 0,25 mm com gradiente de temperatura: 150ºC, 1 min, 7

ºC/min até 240 ºC; injetor (split de 1/50) a 250 ºC e detector a 250 ºC. Hidrogênio

como gás de arraste (2,0 mL/min) e volume de injeção de 2,0 l. A identificação

dos picos foi feita por comparação com padrões de ácidos graxos metilados

SUPELCO37. As porcentagens de acilglicerídios e/ou ácidos graxos livres foram

34

comparadas com óleo de soja (12,0 mg) hidrolizado, metilado e analisado sob as

mesmas condições.

3.5.1. Preparo das amostras para análise em CG

I. Hidrólise de lipídeos

Dissolveram-se, em tubo criogênico de capacidade de 2,0 mL, ~10,0 mg do

óleo em 100 µL de uma solução de etanol (95%)/ hidróxido de potássio 1 mol/L

(5%). Após agitação em vórtex por 10 s, o óleo foi hidrolisado em um forno de

micro-ondas doméstico (Panasonic Piccolo), à potência de 80 W (Potência 2),

durante 5 min. Após resfriamento, adicionaram-se 400 L de ácido clorídrico a

20%, uma ponta de espátula de NaCl e 600 L de acetato de etila. Após agitação

em vórtex por 10 s e repouso por 5 min, uma alíquota de 300 L da camada

orgânica foi retirada, colocada em tubos de microcentrífuga e seco por evaporação,

obtendo-se assim os ácidos graxos livres (adaptado de W. W. Christie, Gas

Chromatography and Lipids, 1989, Pergamon Press).

II. Metilação dos ácidos graxos

Os ácidos graxos livres foram metilados com 100 µL BF3 / metanol (14%),

usando-se aquecimento durante 10 min em banho de água a 80 ºC. Foram, em

seguida, analisados por cromatografia a gás.

3.6. RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN)

Os espectros de RMN de 1H, RMN de 13C, subespectros DEPT 135 e os

mapas de contornos HSQC, HMBC, COSY e NOESY foram obtidos em

espectrômetros BRUKER AVANCE DPX200 e DRX400 no Laboratório de

Ressonância Magnética de Alta Resolução (LAREMAR) do Departamento de

Química- ICEx- da Universidade Federal de Minas Gerais. Os deslocamentos

químicos (δ) foram registrados em ppm e as constantes de acoplamento em Hertz

(Hz). O tetrametilsilano, TMS, foi usado como padrão de referência interno para

deslocamento químico (δ 0).

35

3.7. ESPECTROSCOPIA DE MASSAS POR IONIZAÇÃO POR

ELECTROSPRAY (EM-ESI)

Os espectros de massas foram obtidos em espectrômetro de massas marca

Bruker Daltonics, modelo MicroTOF, equipado com fonte de ionização electrospray

operando no modo positivo em alguns espectros e no modo negativo em outros, no

Laboratório Central Analítica do Instituto de Química da Universidade de São

Paulo. Soluções MeOH/água dos compostos foram preparadas e analisadas na

faixa de m/z entre 200 e 500 daltons.

3.8. MANUTENÇÃO DOS MICRO-ORGANISMOS

Os micro-organismos utilizados neste trabalho pertencem à coleção

microbiológica do Laboratório de Biotecnologia e Bioensaios do Departamento de

Química da Universidade Federal de Minas Gerais. Os fungos encontravam-se

armazenados na forma de suspensão de esporos em glicerol 12% a -86 ºC. Para a

utilização diária, estes se encontravam armazenados em geladeira (a 8 ºC), em

tubos de ensaio contendo ágar batata dextrosado.

3.9. CULTIVO DOS MICRO-ORGANISMOS

Todo o procedimento de obtenção do pré-inóculo e inóculo da bactéria e do

fungo foi realizado em cabine de segurança biológica sob condições assépticas,

próximo à chama do bico de Bunsen. Os materiais e reagentes utilizados foram

previamente esterilizados em autoclave a 121 ºC durante 20 min.

3.9.1. Inoculação da bactéria Salmonella typhimurium

Preparo do pré-inóculo: com o auxílio de uma alça de platina, retirou-se uma

quantidade suficiente de bactéria (S. typhimurium), armazenada em tubo de ensaio

e inoculou-se em outro tubo de ensaio contendo 3,0 mL de meio de cultura BHI. O

tubo foi incubado em estufa a 37 ºC, durante 8-18 h.

36

Preparo do inóculo: o pré-inóculo contendo a bactéria (S. typhimurium) foi

transferido para um Erlenmeyer contendo 200 mL de meio de cultura (BHI), em

duplicata. Após inoculação da bactéria, os frascos foram incubados em estufa a 37

ºC, durante 24 h.

3.9.2. Cultivo do fungo Paecilomyces lilacinus

Preparo do pré-inóculo I: com o auxílio de uma alça de platina, foi realizada

a raspagem do micro-organismo armazenado em um tubo de ensaio, mantido em

geladeira (a 8 ºC). O micro-organismo foi, em seguida, inoculado em outro tubo de

ensaio contendo meio de cultura ágar batata dextrose (PDA). O fungo foi cultivado

durante sete dias, sem agitação, à temperatura ambiente (25 ºC).

Preparo do pré-inóculo II: após o crescimento do fungo, o mesmo foi

inoculado em Erlenmeyers contendo 200 mL de meio de cultura líquido caldo

batata dextrose (PDB). Em seguida, foi realizada a homogeneização do meio com

o micro-organismo. O fungo foi cultivado durante sete dias, sob agitação, à

temperatura ambiente (25 ºC). Este procedimento foi realizado para que se

obtivesse quantidade suficiente de biomassa, para que pudesse então, ser iniciado

o experimento de cultivo do fungo em diferentes condições.

Preparo dos inóculos: após obtenção da biomassa do fungo, o mesmo foi

inoculado em Erlenmeyers contendo meio de cultura líquido caldo batata dextrose

(PDB). Em seguida, foi realizada a homogeneização do meio com o micro-

organismo.

O experimento foi iniciado com o preparo de 28 frascos (14 frascos sob

condição estática e 14 frascos sob condição de agitação em agitador orbital). O

fungo foi cultivado durante 21 dias, à temperatura ambiente (25 ºC).

Os frascos foram numerados de 1 a 14 S.A (sem agitação) e 1 a 14 C.A

(com agitação), e inoculados conforme a seqüência apresentada na Tabela 2.

37

Tabela 2. Condições de inoculação do fungo P. lilacinus

Frasco Conteúdo

1 PDB + fungo

2 PDB, controle

3 PDB + 1 mL do inóculo bacteriano e fungo

4 PDB + 1 mL do inóculo bacteriano

5 PDB + 1 mL do inóculo bacteriano, adicionou-se o fungo após 7 h;

6 PDB + 1 mL do inóculo bacteriano, após 7 h, autoclavou-se o frasco

e inoculou-se o fungo

7 PDB + 1 mL do inóculo bacteriano, após 7 h autoclavou-se o frasco

8 PDB + fungo, após 8 dias, inoculou-se 1 mL do inóculo bacteriano

9 PDB, após 8 dias, inoculou-se 1 mL do inóculo bacteriano

10 PDB + fungo, após 8 dias, inocularam-se 10 mL do inóculo

bacteriano

11 PDB, após 8 dias, inoculou-se 1 mL do inóculo bacteriano


bacteriano autoclavado


bacteriano submetido à irradiação de micro-ondas

14 PDB, após 8 dias, inocularam-se 10 mL do inóculo bacteriano

submetido à irradiação de micro-ondas

PDB= caldo de batata dextrosado

Oito dias após o inicio do experimento, os frascos contendo os inóculos da

bactéria usados no início do experimento foram utilizados da seguinte forma, o

primeiro foi submetido à irradiação de micro-ondas por 2 min e, o segundo,

autoclavado a 121 ºC, por 20 min. Estes procedimentos foram realizados a fim de

se interromper o crescimento bacteriano, para que se pudesse trabalhar somente

com o material genético bacteriano. Em seguida, os inóculos bacterianos tratados

foram adicionados nos respectivos frascos.

Preparo do extrato fúngico: após o período de 21 dias, o crescimento dos

micro-organismos foi interrompido adicionando-se acetato de etila. Os meios de

38

cultura foram filtrados a vácuo com o auxílio de funil e papel de filtro, separando-se

o filtrado do micélio. O filtrado foi extraído com acetato de etila utilizando-se funil de

separação. O procedimento foi realizado por três vezes. O micélio também foi

submetido à extração com acetato de etila, e seu extrato combinado com o filtrado

orgânico. Em seguida, os extratos orgânicos obtidos foram concentrados em

rotavapor a vácuo e transferidos para frascos limpos e previamente pesados. As

massas de extratos obtidas encontram-se listadas na Tabela 3.

Os extratos foram submetidos aos testes biológicos e aqueles que

apresentaram a melhor combinação dos resultados (maior atividade e perfil por

CCD) foram novamente preparados, em escala ampliada, para as etapas

posteriores.

Tabela 3. Massa dos extratos do fungo P. lilacinus

Extrato Código do extrato

Meio de cultura (L)

Massa do extrato (mg)

1 1 S.A 1,0 115,0

2 2 S.A 1,0 3,7

3 3 S.A 1,0 327,0

4 4 S.A 1,0 265,0

5 5 S.A 1,0 278,0

6 6 S.A 1,0 238,0

7 7 S.A 1,0 12,0

8 8 S.A 1,0 127,0

9 9 S.A 1,0 213,0

10 10 S.A 1,0 206,0

11 11 S.A 1,0 66,0

12 12 S.A 1,0 109,0

13 13 S.A 1,0 106,0

14 14 S.A 1,0 51,0

15 1 C.A 0,2 18,7

16 2 C.A 0,2 4,1

17 3 C.A 0,2 33,7 Continua página 39…

39

C.A = com agitação S.A = sem agitação

3.10. TESTES DE ATIVIDADE BIOLÓGICA

3.10.1. Avaliação da atividade antimicrobiana – Técnica de difusão em placa

utilizando discos de papel (BAUER et al., 1966)

Para a realização do teste de atividade antimicrobiana foram utilizadas as

bactérias Gram-positivas Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes, as

bactérias Gram-negativas Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa, e a

levedura Candida albicans. Discos de papel contendo 30 µg de cloranfenicol foram

utilizados como controle positivo para as bactérias e discos contendo 50 µg de

miconazol para o fungo; como controle negativo foram utilizados discos de papel

contendo o solvente usado na dissolução das amostras.

CONSIDERAÇÕES:

I. Foram utilizadas placas de Petri previamente esterilizadas;

II. O teste foi realizado em duplicata;

III. Os halos de inibição formados foram mensurados utilizando-se um

paquímetro digital;

… continuação Tabela 3

18 4 C.A 0,2 17,0

19 5 C.A 0,2 23,1

20 6 C.A 0,2 20,3

21 7 C.A 0,2 48,4

22 8 C.A 0,2 6,0

23 9 C.A 0,2 15,2

24 10 C.A 0,2 5,7

25 11 C.A 0,2 13,2

26 12 C.A 0,2 14,6

27 13 C.A 0,2 6,0

28 14 C.A 0,2 7,7

40

IV. Os extratos e as substâncias testadas foram consideradas ativas

quando o halo de inibição apresentou valor igual ou maior que 7,5 mm.

Preparo das amostras: uma quantidade de 2,0 mg de cada amostra foi

pesada e solubilizada em 1,0 mL de clorofórmio, e 50,0 µL de cada solução

foi quantitativamente aplicada em um disco de papel resultando em uma

concentração final de 100,0 µg/disco. O solvente foi removido por ar seco.

Todo o procedimento de obtenção do pré-inóculo e inóculo do fungo e da

bactéria foi realizado em cabine de segurança biológica sob condições assépticas,


previamente autoclavados a 121 ºC durante 20 min.

Preparo do pré-inóculo bacteriano: as bactérias estocadas em tubos de

ensaio foram raspadas com o auxílio de uma alça de platina e inoculadas

em tubos de ensaios pequenos contendo 3,0 mL de meio de cultura BHI. Em

seguida, os tubos foram incubados em estufa a 37 ºC durante 8-18 h.

Preparo do inóculo bacteriano: com o auxílio de uma micropipeta, 500 µL do

pré-inóculo bacteriano foram transferidos para tubos de ensaio contendo 4,5

mL de água destilada estéril. Os tubos foram homogeneizados e a

concentração ajustada comparando-se com o tubo 0,5 da escala de

McFarland de turbidez padrão (108 UFC/mL).

Com o auxílio de uma micropipeta, foram transferidos 500 µL do inóculo

bacteriano padronizado para tubos de ensaio contendo 7,5 mL de meio de cultura

antibiótico. Em seguida, os tubos foram agitados no vórtex e o meio de cultura

transferido para placas de Petri previamente esterilizadas. Após a solidificação do

meio semi-sólido, foram colocados, com auxílio de uma pinça estéril, os discos de

papel contendo as amostras, sendo que em cada placa foram colocados cinco

discos, o controle positivo e o negativo. As placas de Petri foram incubadas em

estufa a 37 ºC. Após 24 h foi realizada a primeira leitura do teste medindo-se o

41

diâmetro dos halos de inibição e, após 48 h, foi realizada uma nova leitura para a

determinação de cepas resistentes.


Para a realização do ensaio da atividade antibacteriana foram utilizadas as

bactérias Gram-positivas S. aureus e L. monocytogenes, as bactérias Gram-

negativas E. coli e P. aeruginosa, e a levedura C. albicans.

Todo o procedimento de obtenção do pré-inóculo e inóculo do fungo e da

bactéria foi realizado em cabine de segurança biológica sob condições assépticas,


previamente autoclavados a 121 ºC durante 20 min.

CONSIDERAÇÕES:

I. Foram utilizadas microplacas de 96 poços (12 colunas e 8 linhas);

II. Foram realizados controles;

III. O teste foi realizado em quintuplicata;

IV. Os extratos brutos foram testados em uma concentração fixa de

1000 μg/mL e as substâncias isoladas em uma concentração de 250 μg/mL;

V. Os resultados do teste foram mensurados por Leitor de microplacas

Thermo Plate.

Preparo das amostras: as amostras foram pesadas e solubilizadas

em DMSO, resultando em uma concentração de 50 mg/mL e 12,5 mg/mL,

para os extratos brutos e substâncias isoladas, respectivamente.

Preparo do pré-inóculo bacteriano: as bactérias estocadas em tubos de

ensaio foram raspadas com o auxílio de uma alça de platina e inoculadas

em tubos de ensaios pequenos contendo 3,0 mL de meio de cultura BHI. Em

seguida, os tubos foram incubados em estufa a 37 ºC durante 8-18 h.

42

Preparo do inóculo bacteriano: com o auxílio de uma micropipeta, 500 µL do

pré-inóculo bacteriano foram transferidos para tubos de ensaio contendo 4,5

mL de água destilada estéril. Os tubos foram homogeneizados e a

concentração ajustada comparando-se com o tubo 0,5 da escala de

McFarland de turbidez padrão (108 UFC/mL). Após, 500 µL do inóculo

preparado foram adicionados a 4,5 mL de meio de cultura BHI, obtendo-se

assim, os inóculos bacterianos utilizados no teste.

PROCEDIMENTOS:

Placa teste:

I. Em cada placa teste foram testados 12 extratos, ou seja, um em cada

coluna, utilizando-se, assim, três placas para teste com cada micro-

organismo.

Figura 4. Esquema de uma microplaca usada no ensaio antibacteriano e

antifúngico com as amostras em uma concentração fixa.

II. Em cada poço foram adicionados 100 µL da solução de trabalho (40 µL

de solução do extrato + 960 µL de meio de cultura BHI) e 100 µL de

inóculo do micro-organismo testado.

quintuplicata

43

Placa de controle de crescimento do micro-organismo:

I. Adicionaram-se, a cada poço da placa de controle de crescimento do

micro-organismo, 100 µL de inóculo do micro-organismo em teste e 100

µL de meio de cultura BHI.

Placa do branco:

I. Adicionaram-se, a cada poço das placas do branco, 100 µL da solução

de trabalho (40 µL da solução do extrato + 960 µL de meio de cultura

BHI) e 100 µL de água destilada estéril.

Placa de controle de esterilidade do meio de cultura BHI:

I. Adicionaram-se a cada poço da placa de controle de esterilidade do meio

de cultura, 100 µL de meio de cultura BHI e 100 µL de água destilada

estéril.

As microplacas foram incubadas em estufa a 37 ºC e após 24 h foi realizada

a primeira leitura do teste em leitor de microplacas. Após 48 h foi realizada uma

nova leitura, finalizando o teste. As leituras foram realizadas em comprimento de

onda fixo de 492 nm.

3.10.3. Avaliação da atividade de inibição de acetilcolinesterase em cromatografia

em camada delgada (CCD) – Método de Ellmann

O ensaio para a avaliação qualitativa da atividade anticolinesterásica foi

realizado seguindo-se a metodologia de Ellmann (1961), adaptada por Rhee et al.

(2001), para cromatografia em camada delgada, utilizando-se placas

cromatográficas de sílica gel.

Procedimentos:

I. Aplicaram-se, na placa cromatográfica, 5 µL de amostra (extratos brutos

dissolvidos em MeOH) e do padrão na concentração de 10 mg/mL;

II. A placa foi eluída com solvente apropriado;

44

III. Após a secagem, à temperatura ambiente, borrifou-se a placa com

solução 1:1 de ácido 5,5‘-ditiobis-[2- nitrobenzóico] (DTNB) (1mM) e

iodeto de acetilcolina (ACTI) (1mM);

IV. Após a secagem por 5 min, à temperatura ambiente, a placa foi borrifada

com a enzima (3U/mL) em tampão Tris/HCl (50mM) pH 8 contendo 0,1%

p/v de albumina sérica bovina;

V. A observação da presença de halos brancos, após 10 min, em meio ao

fundo amarelo, na placa, indicou a inibição da enzima acetilcolinesterase.

Observação: O padrão utilizado foi uma solução de cafeína.

3.10.4. Avaliação da atividade de inibição de acetilcolinesterase em microplaca –

Método de Ellmann

O ensaio para a avaliação quantitativa da atividade anticolinesterásica foi

realizado seguindo-se a metodologia de Ellmann (1961) para microplacas, fazendo-

se a leitura utilizando-se uma microplaca, absorbância a 406 nm.

Esse teste foi realizado para os extratos que apresentaram resultados

positivos no ensaio qualitativo de inibição da enzima AchE e para as substâncias

isoladas. Foi realizado em quintuplicata e, utilizando-se como padrão positivo de

inibição da enzima AchE, uma solução de eserina na concentração de 10 mg/mL e

como controle negativo o solvente utilizado para solubilizar as amostras.

Procedimentos:

I. Preparo da solução de trabalho:

a. Foram solubilizados 10 mg de amostra em 1 mL de DMSO,

resultando em solução de concentração de 10 mg/mL;

b. Retiraram-se 25 µL dessa solução, que após, foi diluída em 225 µL de

solução tampão Tris/HCl (50 mM), obtendo-se, assim, a solução de

trabalho ;

45

II. Adicionaram-se 25 µL da solução de trabalho aos poços da placa de

Elisa;

III. Adicionaram-se ao mesmo poço:

a. 25 µL da solução de ACTI;

b. 125 µL da solução de DTNB;

c. 50 µL de Tris/HCl (50mM) pH 8,0 com albumina sérica bovina

0,1% (p/v);

IV. Mediu-se a absorbância a 406 nm a cada 1 minuto por 8 vezes;

V. Adicionaram-se 25 µL da solução de AchE (0,222 U/mL) em Tris/HCl pH

8,0 (contendo albumina sérica bovina 0,1% p/v) aos poços da microplaca;

VI. Mediu-se novamente a absorbância a 406 nm a cada 1 minuto por 10

vezes.

3.11. FRACIONAMENTO DOS EXTRATOS DO FUNGO P. lilacinus

Após a etapa de triagem dos testes biológicos, utilizando-se os extratos do

fungo P. lilacinus, os extratos obtidos de acordo com as condições 5 e 8 de

inoculação (Tabela 2, página 37) e sob condição estática (5 SA e 8 SA), foram

novamente preparados, em escala ampliada, para as etapas posteriores.

3.11.1. Fracionamento do extrato 5 S.A

O extrato do fungo P. lilacinus obtido de acordo com a condição 5 de

inoculação (Tabela 2, página 37) e sob condição estática (5 S.A) foi preparado em

escala ampliada, produzindo um rendimento de 1,098 g. Este foi, então, fracionado

empregando-se técnicas cromatográficas. Inicialmente, o extrato foi solubilizado em

clorofórmio e, logo, incorporou-se uma quantidade de sílica que ocupasse

aproximadamente o mesmo volume de extrato utilizado. Após a evaporação do

46

solvente, realizada em rotavapor, a sílica incorporada ao extrato foi adicionada

lentamente ao topo da coluna, para que pudesse ser iniciado o fracionamento

desse material em cromatografia em coluna de sílica, utilizando-se eluentes de

polaridade crescente, na seguinte ordem, hexano, acetato de etila e metanol.

Foram coletadas 138 frações de 100 mL que foram combinadas em 32 grupos

após a obtenção do perfil cromatográfico em cromatografia em camada delgada e

revelação em vapor de iodo. As frações, eluentes e massas estão apresentadas na

Tabela 4.

Tabela 4. Dados do fracionamento do extrato 5 S.A (1,098 g) do fungo P. lilacinus por cromatografia em coluna de sílica gel

Código Frações Eluente Massa (mg)

P01 1 – 4 Hexano 100% 17,0

P02 5 Hexano/AcOEt 85:15 13,0

P03 6 – 8 Hexano/AcOEt 85:15 15,0

P04 9 – 10 Hexano/AcOEt 85:15 13,0

P05 11 – 18 Hexano/AcOEt 85:15 26,0

P06 19 – 21 Hexano/AcOEt 70:30 15,0

P07 22 – 25 Hexano/AcOEt 70:30 22,0

P08 26 – 30 Hexano/AcOEt 70:30 61,0

P09 31 – 33 Hexano/AcOEt 70:30 14,0

P10 34 – 38 Hexano/AcOEt 55:45 42,0

P11 39 – 41 Hexano/AcOEt 55:45 31,0

P12 42 – 44 Hexano/AcOEt 55:45 250,0

P13 45 Hexano/AcOEt 55:45 13,0

P14 46 – 63 Hexano/AcOEt 40:60 93,0

P15 64 – 67 AcOEt 100% 16,0

P16 68 AcOEt 100% 19,0

P17 69 – 78 AcOEt 100% 49,0

P18 79 – 80 AcOEt/MeOH 95:05 69,0

P19 81 – 82 AcOEt/MeOH 95:05 52,0

P20 83 – 86 AcOEt/MeOH 95:05 18,0

Continua página 47...

47

... continuação Tabela 4

P21 87 AcOEt/MeOH 95:05 10,0

P22 88 – 90 AcOEt/MeOH 95:05 9,0

P23 91 – 93 AcOEt/MeOH 95:05 16,0

P24 94 – 99 AcOEt/MeOH 80:20 42,0

P25 100 – 105 AcOEt/MeOH 80:20 23,0

P26 106 – 109 AcOEt/MeOH 80:20 17,0

P27 110 – 112 AcOEt/MeOH 50:50 30,0

P28 113 – 118 AcOEt/MeOH 50:50 44,0

P29 119 – 123 AcOEt/MeOH 50:50 23,0

P30 124 – 125 MeOH 100% 7,0

P31 126 – 127 MeOH 100% 6,0

P32 128 – 138 MeOH 100% 15,0

Amostras contendo 10 mg das frações P01, P02, P03, P04, P05 e P06 foram

enviadas ao Laboratório de Cromatografia Gasosa do Departamento de Química

da Universidade Federal de Minas Gerais, para análise.

As frações P12 (250,0 mg) e P13 (13,0 mg) foram caracterizadas como

sólidos amarelos, e quando analisada por CCD e revelada com vapor de iodo, a

fração P13 produziu uma mancha única na cromatoplaca. Após, ambas as frações

foram enviadas para a obtenção dos espectros de RMN de 1H, de 13C e DEPT.

As frações P14 (93,0 mg) e P18 (69,0 mg) tiveram um rendimento superior

comparado às outras frações, sendo, então, enviadas para a obtenção dos

espectros de RMN.

A fração P19 (52,0 mg) foi fracionada por CCS usando-se sílica para

cromatografia em coluna ―flash‖. Utilizou-se uma mistura de hexano/isopropanol em

polaridade crescente. Foram coletadas 55 frações de 13 mL que, após obtenção do

perfil cromatográfico em CCD e revelação em vapor de iodo, foram agrupadas em

7 subgrupos. A CCD da fração AC-05 indicou tratar-se de substância pura após

revelação com vapor de iodo, e então, foi enviada para a obtenção dos espectros

de RMN. Os dados da coluna cromatográfica da fração P19 estão apresentados na

Tabela 5.

48

Tabela 5. Dados do fracionamento da fração P19 (52,0 mg) por cromatografia em coluna de sílica ―flash‖


AC-01 1 – 2 Hexano/iPrOH 90:10 2,0

AC-02 3 – 4 Hexano/iPrOH 90:10 3,0

AC-03 5 – 20 Hexano/iPrOH 90:10 8,0

AC-04 21 – 29 Hexano/iPrOH 50:50 5,0

AC-05 30 – 40 Hexano/iPrOH 50:50 19,0

AC-06 41 – 45 Hexano/iPrOH 50:50 1,0

AC-07 46 – 55 iPrOH 100% 2,0

3.11.2. Fracionamento do extrato 8 S.A

O extrato do fungo P. lilacinus obtido de acordo com a condição 8 de

inoculação (Tabela 2, página 37) e sob condição estática (8 S.A) foi preparado em

escala ampliada, com um rendimento de 1,5 g.

Anteriormente ao processo de fracionamento foi realizada uma extração

utilizando-se aproximadamente 20 mL de hexano, com o objetivo de extrair parte

da porção oleosa presente na amostra, para ser analisada por cromatografia a gás.

Após, a fração resultante (1,26 g) foi, então, fracionada empregando-se técnicas

cromatográficas. Inicialmente, o extrato foi solubilizado em clorofórmio e, logo,

incorporou-se uma quantidade de sílica que ocupasse aproximadamente o mesmo

volume de extrato utilizado. Após a evaporação do solvente, realizada em

rotavapor, a sílica incorporada ao extrato foi adicionada lentamente ao topo da

coluna, para que pudesse ser iniciado o fracionamento desse material em

cromatografia em coluna de sílica. Utilizaram-se eluentes em polaridade crescente,

na seguinte ordem, hexano, acetato de etila e metanol. Foram coletadas 172

frações de 100 mL que foram combinadas em 24 grupos após a obtenção do perfil

cromatográfico em cromatografia em camada delgada e revelação em vapor de

iodo. As frações, eluentes e massas estão apresentadas na Tabela 6.

49

Tabela 6. Dados do fracionamento do extrato 8 S.A (1,26 g) do fungo P. lilacinus por cromatografia em coluna de sílica gel


C01 3 – 6 Hexano 100% 9,0

C02 7 – 10 Hexano/AcOEt 90:10 27,0

C03 11 – 18 Hexano/AcOEt 90:10 16,0

C04 19 – 26 Hexano/AcOEt 80:20 45,0

C05 27 – 30 Hexano/AcOEt 80:20 8,0

C06 31 – 38 Hexano/AcOEt 65:35 76,0

C07 39 – 43 Hexano/AcOEt 65:35 35,0

C08 44 – 49 Hexano/AcOEt 50:50 27,0

C09 50 – 60 Hexano/AcOEt 50:50 27,0

C10 61 – 64 Hexano/AcOEt 35:65 8,0

C11 65 – 72 Hexano/AcOEt 35:65 17,0

C12 73 – 75 Hexano/AcOEt 35:65 5,0

C13 76 – 82 AcOEt 100% 20,0

C14 83 – 91 AcOEt 100% 20,0

C15 92 – 96 AcOEt/MeOH 95:05 57,0

C16 97 - 103 AcOEt/MeOH 95:05 31,0

C17 104 – 105 AcOEt/MeOH 85:15 13,0

C18 106 – 118 AcOEt/MeOH 85:15 73,0

C19 119 – 133 AcOEt/MeOH 70:30 90,0

C20 134 – 147 AcOEt/MeOH 50:50 121,0

C21 148 – 154 AcOEt/MeOH 25:75 42,0

C22 155 – 160 AcOEt/MeOH 25:75 17,0

C23 161 – 166 MeOH 100% 33,0

C24 167 – 172 MeOH 100% 6,0

Amostras contendo 10 mg das frações C01, C02, C03, C04 e C05 foram

enviadas ao laboratório de Cromatografia Gasosa do Departamento de Química da

Universidade Federal de Minas Gerais, para análise.

A fração C09 (27,0 mg) foi caracterizada como um pó fino amarelo, e com

ponto de fusão na faixa entre 92-97 °C e quando analisada por CCD e revelada

50

com vapor de iodo, produziu uma mancha única na cromatoplaca, sendo então

enviada para a obtenção dos espectros de RMN de 1H, de 13C e DEPT.

A fração C16 apresentou duas manchas bem distintas quando analisadas

por CCD e revelada com vapor de iodo e luz UV. Sendo assim, fez-se

cromatografia de camada delgada preparativa utilizando-se alumina, como fase

estacionária, e sistema de fase móvel constituído por AcOEt/Hexano 9:1 (100 mL).

A amostra foi solubilizada em CHCl3/MeOH e aplicada na parte inferior da placa. A

mancha de interesse foi raspada da placa e extraída com CHCl3/MeOH e, após

filtração à vácuo, fez-se concentração do material purificado (C16-P), obtendo-se

um rendimento de 3,0 mg. A substância C16-P apresentou um Rf de 0,7 e mostrou-

se positiva frente a revelação com Reagente de Dragendorff.

No entanto, infelizmente, devido à falta de dados espectroscópicos

suficientes, as substâncias C09 e C16-P não puderam ser identificadas.

51

Capítulo 4

RESULTADOS E DISCUSSÃO

52

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DAS CONDIÇÕES DE CULTIVO DE P.

lilacinus NA PRODUÇÃO DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS, VIA PERFIS

CROMATOGRÁFICOS (CLAE-PDA)

A análise dos extratos do fungo P. lilacinus, cultivado em diferentes

condições, pela técnica de OSMAC, foi realizada por CLAE-PDA. Estas análises

foram realizadas com o objetivo de investigar se as diferentes condições de cultivo

de P. lilacinus interferiram nos perfis químicos dos extratos brutos obtidos. Dessa

forma, não foram utilizados padrões internos ou externos, visto que, o objetivo não

foi identificar substâncias indiretamente.

Os cromatogramas foram obtidos na faixa entre 190 e 600 nm, no entanto,

226 nm foi o comprimento de onda escolhido para a apresentação dos

cromatogramas, pois é conhecido que a maioria dos metabólitos secundários

naturais podem ser analisados próximos a região de 210-215 nm (FURTADO et al.,

2005). A variedade de metabólitos produzidos foi associada ao número de picos

detectados nos cromatogramas, visto que, diferentes compostos apresentam

diferentes índices de retenção (RI).

P. lilacinus foi cultivado em meio de cultura líquido caldo batata dextrose,

variando-se, aeração do meio (cultivo sob agitação e sem agitação), co-adição de

material genético bacteriano ao meio, quantidade de inóculo bacteriano (1 ou 10

mL), condição do inóculo (bactéria viva, exposta à autoclave e exposta à irradiação

de micro-ondas) e diferentes tempos de inoculação pois, diferentes condições de

crescimento podem influenciar drasticamente o perfil dos metabólitos produzidos

por fungos e bactérias (SCHERLACH, HERTWECK, 2006).

Os cromatogramas dos extratos de P. lilacinus mostraram-se com um nível

de complexidade relevante, devido ao fato de serem extratos brutos, podendo

conter moléculas de classes variadas. Algumas substâncias parecem ter sido

produzidas em praticamente todas as condições de cultivo, pois alguns extratos

apresentaram cromatogramas com picos com o mesmo tempo de retenção, como

por exemplo, a substância que mostrou tempo de retenção de aproximadamente

22,5 min. No entanto, variação na produção de metabólitos foi observada ao se

53

analisar os cromatogramas. A produção de metabólitos secundários por P. lilacinus

foi influenciada qualitativa e quantitativamente pela aeração do meio, cultivo sob

agitação e sem agitação, em praticamente todas as condições comparadas, como

é mostrado nas Figuras 5 a 10. Nestas, as setas apontam picos referentes a

substâncias diferentes, enquanto elipses indicam a presença de picos referentes a

substâncias comuns nos cromatogramas dos diferentes extratos.

1S.A 226 nm

Figura 5. Cromatograma do extrato 1S.A (sem agitação) 1C.A 226 nm

Figura 6. Cromatograma do extrato 1C.A (com agitação)

AU

0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

0,050

0,060

Minutes

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00

AU

0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

0,050

0,060

Minutes

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00

54

3 S.A 226 nm

Figura 7. Cromatograma do extrato 3 S.A (sem agitação) 3 C.A 226 nm

Figura 8. Cromatograma do extrato 3 C.A (com agitação)

AU

0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

Minutes

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00

AU

0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

0,050

0,060

0,070

0,080

Minutes

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00

55

5 S.A 226nm

Figura 9. Cromatograma do extrato 5 S.A (sem agitação)

5 C.A 226 nm


A substância que apresentou tempo de retenção de aproximadamente 14,0

min é um bom exemplo, pois os picos referentes a ela são notáveis nos

cromatogramas dos extratos obtidos sem agitação (Figuras 5, 7 e 9), enquanto,

nos obtidos sob agitação não foi detectado o mesmo pico (Figuras 6 e 8), com

exceção do extrato 5 C.A. Isto pode ser atribuído ao fato de que a oxigenação do

AU

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

Minutes

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00

AU

0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

0,050

0,060

0,070

Minutes

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00

56

meio altera a velocidade de crescimento dos fungos e, conseqüentemente, a

produção de metabólitos.

No que se refere à co-adição de material genético bacteriano ao meio, os

perfis cromatográficos também se mostraram diferentes, sendo assim, a presença

da bactéria pode ter induzido a produção de determinadas substâncias. O

cromatograma do extrato 3 S.A, apresentado na Figura 7, foi obtido de um meio,

nos quais foram cultivados o fungo P. lilacinus e a bactéria S. tiphymurium

concomitantemente, enquanto, o cromatograma do extrato 1 S.A, apresentado na

Figura 5, foi obtido do cultivo individual do fungo. Nestes, notou-se diferença das

substâncias produzidas, pois foram observados picos em diferentes tempos de

retenção em ambos cromatogramas, indicando diferentes moléculas nos extratos.

Diferentes perfis cromatográficos também foram encontrados quando a bactéria foi

cultivada separadamente (condição 9), em relação ao cultivo de P. lilacinus e a

bactéria S. tiphymurium concomitantemente (condição 3) (Figuras 7 e 11).

9 S.A 226 nm


Dado que os antibióticos podem ser produzidos na natureza para fornecer

vantagem competitiva para determinado micro-organismo, é possível que as vias

responsáveis pela biossíntese de certos compostos sejam reguladas por fatores

provocados por outros micro-organismos, sendo assim, a produção de antibióticos

AU

0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

0,050

Minutes

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00

57

pode ser induzida em resposta a um antagonismo microbiano (CUETO et al.,

2001).

Quanto ao parâmetro quantidade de inóculo bacteriano adicionado ao meio,

os perfis cromatográficos apresentaram-se muito semelhantes, mostrando que a

quantidade de inóculo adicionado [1 mL (condição 8) e 10 mL (condição 10)] não

interferiu significativamente na produção de metabólitos (Figuras 12 e 13).

8 C.A 226 nm

Figura 12. Cromatograma do extrato 8 C.A (com agitação) 10 C.A 226 nm


Em relação às diferentes condições da bactéria inoculada (viva, exposta à

autoclave e exposta à irradiação de micro-ondas), os perfis químicos obtidos,

quando comparados, mostraram a seguinte informação: os extratos obtidos a partir

AU

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

Minutes

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00

AU

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

Minutes

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00

58

da adição de bactéria exposta à autoclave ou ao à irradiação de micro-ondas, ao

meio, mostraram-se muito semelhantes (Figuras 14 e 15); por outro lado, os

extratos obtidos a partir de cultivo com bactéria viva, mostraram perfis químicos

com menor semelhança quantitativa das substâncias em relação aos outros dois

(Figura 12). Sendo assim, a presença do material genético bacteriano no meio,

mesmo após sofrer danos físicos, foi capaz de induzir a produção de substâncias

pelo fungo.

12 S.A 226 nm


13 S.A 226 nm


AU

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

Minutes

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00

AU

0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

0,050

0,060

Minutes

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00

59

10 S.A

226 nm


Os diferentes perfis obtidos apontam que a técnica OSMAC foi efetiva para

gerar diversidade da produção de metabólitos por um mesmo micro-organismo.

4.2. CROMATOGRAFIA A GÁS (CG)

Ao longo do desenvolvimento do trabalho foi observado que as frações

obtidas a partir do fracionamento dos extratos do fungo P. lilacinus possuíam

significante concentração de acilgliceróis e ácidos graxos, logo este fungo mostrou

boa capacidade em sintetizar os mesmos. Portanto, as frações menos polares

(eluídas com hexano) das colunas dos extratos 5 S.A e 8 S.A foram analisadas por

CG. As frações P01, P02, P03, P04, P05 e P06 obtidas do fracionamento do

extrato 5 S.A, a fração resultante da extração com hexano (FH) do extrato 8 S.A, e

as frações C01, C02, C03, C04 e C05 obtidas do fracionamento do extrato 8 S.A,

foram enviadas para obtenção do perfil de ácidos graxos das mesmas. Antes da

análise, realizou-se uma reação de derivatização (produção dos ésteres metílicos

dos ácidos graxos presentes nos acilgliceróis- procedimento descrito em 3.5.1) dos

acilgliceróis e ácidos graxos livres das amostras.

AU

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

Minutes

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00

60

Os espectros de RMN de 1H, de 13 C e DEPT das frações P12 (anexos 1.1,

1.2 e 1.3, páginas 114, 115 e 116), P13 (anexos 2.1, 2.2 e 2.3, páginas 117, 118

e 119) e P14 (anexos 3.1, 3.2 e 3.3, páginas 120, 121 e 122) apresentaram sinais

característicos de ácidos graxos livres. No espectro de RMN de 1H foram

observados sinais entre δ 1,27-1,31 ppm, atribuíveis aos átomos de hidrogênio de

grupos metilênicos e entre δ 0,8-0,9 ppm, atribuíveis aos átomos de hidrogênio

metílicos. Nos espectros de RMN de 13C foram observados, entre δ 173,4-176,3

ppm, os sinais correspondentes à carbono de carbonilas, na região entre δ 22,9-

32,14 ppm, os sinais dos átomos de carbono metilênicos e, em δ 14,3 ppm, sinal

característico de grupos metila terminais.

Ácidos graxos são ácidos carboxílicos com cadeia carbônica variando entre

12 e 36 átomos de carbono, sendo que esta cadeia pode ser ramificada e

totalmente saturada ou pode conter insaturações, com uma ou mais ligações

duplas. Em micro-organismos, estes ácidos graxos costumam estar dispostos

quimicamente ligados à membrana celular (FILHO, 2010).

O estudo do perfil de ácidos graxos livres ou presentes nos glicerídios tem

ampla utilização, como, por exemplo, a literatura apresenta métodos de

classificação e diferenciação de micro-organismos de acordo com a presença ou

ausência de determinados ácidos graxos em sua composição (STAHL, 1996). Além

da aplicação como marcadores quimiotaxonômicos, diferenciando espécies

distintas de fungos, ácidos graxos de micro-organismos podem ser aplicados como

matrizes novas e promissoras em processos que envolvem a produção de

biocombustíveis (VICENTE, 2009).

A cromatografia a gás é uma técnica muito importante na análise de

compostos facilmente volatilizáveis e termicamente estáveis. Esta técnica possui

ampla aplicabilidade, sensibilidade, rapidez nas análises, boa precisão quantitativa

e um alto poder de resolução (FILHO, 2010). A partir da utilização de padrões de

ácidos graxos metilados, como o SUPELCO 37, utilizado neste trabalho, os picos

das substâncias podem ser comparados e identificados.

A análise dos cromatogramas obtidos em comparação com o cromatograma

de ésteres de ácidos graxos revelou que as frações P01, P02, P03, P04, P05, P06,

a fração FH e as frações C01, C02, C03, C04 e C05 eram compostas por uma

mistura de ácidos graxos, formados principalmente pelos ácidos palmítico (C16:0)

61

(1), esteárico (C18:0) (2), oléico (C18:1 ∆9 cis) (3), linoléico (C18:2

∆9,12 cis) (4) e linolênico

(C18:3), este último apresenta-se como uma mistura de isômeros, o isômero alfa-

linolênico (C18:3 ∆9,12,15 cis) (ALA) (5) e o isômero gama-linolênico (C18:3

∆6,9,12 cis)

(GLA) (6) (Figuras 17 a 28 e Tabela 7).

HO

O

1

HO

O

2

HO

O

3

HO

O

4

HO

O

5

HO

O

6

62

Figura 17. Cromatograma da fração P01 obtido por CG em comparação com

padrões de ésteres de ácidos graxos



63





64





65

Figura 23. Cromatograma da fração FH obtido por CG em comparação com


Figura 24. Cromatograma da fração C01 obtido por CG em comparação com


66





67





68

Tabela 7- Composição de ácidos graxos nas frações analisadas

Frações

% de ácido graxo na fração

Palmítico

(C16:0)

Esteárico

(C18:0)

Oléico

(C18:1∆9 cis)

Linoléico

(C18:2∆9,12 cis)

Linolênico

(C18:3)

Outros

P01 18,99 14,08 N.D. N.D. N.D. 66,93

P02 31,29 8,63 17,54 18,45 0,71 23,38

P03 38,2 9,43 4,9 5,94 10,64 30,84

P04 40,97 5,17 4,83 7,37 0,91 40,71

P05 22,49 8,95 8,16 5,52 N.D. 54,88

P06 23,14 8,39 7,44 N.D. 1,71 59,32

FH 24,12 2,63 10,81 50,82 0,94 10,68

C01 25,51 8,21 6,4 4,05 N.D. 55,83

C02 20,17 4,65 11,28 29,21 N.D. 34,69

C03 32,31 6,34 13,99 14,45 N.D. 32,91

C04 34,0 3,54 12,31 37,49 0,46 12,2

C05 10,12 2,66 4,42 65,37 3,71 13,72

N.D.= não detectado

Através dos cromatogramas, foi observado que as frações P12, P13 e P14

(Figuras 29-31 e Tabela 8) possuem constituições muito semelhantes às amostras

anteriores. No entanto, foi detectado um pico bastante significativo no tempo de

retenção de aproximadamente 1 min, compondo entre 40 a 70% das amostras,

porém este não apresentou correlação com nenhum ácido graxo presente no

padrão utilizado, não sendo, então, identificado.

69





70



Tabela 8 - Composição de ácidos graxos nas frações P12, P13 e P14

Frações

% de ácido graxo na fração

Pico não

identificado

Palmítico

(C16:0)

Esteárico

(C18:0)

Oléico

(C18:1∆9 cis)

Linoléico

(C18:2∆9,12 cis)

Linolênico

(C18:3)

P12 60,15 9,78 8,04 0,85 0,74 0,65

P13 71,83 3,72 5,53 0,89 0,74 1,21

P14 42,16 12,99 11,63 7,68 2,3 0,53

Os acilgliceróis constituem-se a mais importante forma de armazenamento

de energia e ácidos graxos em células eucarióticas, correspondendo à classe de

lipídios mais comumente isolada de fungos (SORGER, DAUM, 2002). Vários micro-

organismos oleaginosos, tais como leveduras, fungos, bactérias e microalgas

podem acumular alto nível de lipídios em sua biomassa. Dentre estes, fungos e

leveduras têm sido considerados fontes potenciais e economicamente viáveis para

a produção de compostos lipídicos, visto que têm grandes rendimentos e um

71

potencial enorme de custo/eficiência da produção desses compostos. Várias

moléculas de lipídios sintetizadas por fungos têm recebido grande atenção na

produção de óleos e gorduras como uma alternativa das fontes agrícolas e animais,

na biotecnologia como fatores especiais na dieta ou como agentes farmacológicos,

como é o caso dos ácidos graxos insaturados γ-linolênico (AGL) e araquidônico

(AA). O primeiro é de interesse farmacológico, pois é precursor das

prostaglandinas da série PGE1 e é o principal componente em preparações

farmacêuticas que apresentam efeitos benéficos nos tratamentos de eczema

atópico, doenças cardiovasculares, diabetes, síndrome pré-menstrual, câncer

dentre outras condições (WAINWRIGHT, 1992; SANCHOLLE; LÖSEL, 1995;

WELLBAUM, 2006).

Os ácidos graxos insaturados majoritários, detectados nos extratos de P.

lilacinus, são os conhecidos ômegas 3 (ácido alfa-linolênico), 6 (ácido linoléico) e 9

(ácido oléico) que podem auxiliar na redução dos níveis plasmáticos de

triglicerídeos e colesterol LDL, sendo também capazes de favorecer o aumento do

HDL. Possuem ainda, importante papel em alergias e processos inflamatórios, pois

são necessários para a formação das prostaglandinas inflamatórias, tromboxanos e

leucotrienos, como citado anteriormente (GARÓFOLO, PETRILLI, 2006).

Em pesquisa realizada por PARK e colaboradores (2004), foram isolados,

majoritariamente, de culturas de P. lilacinus, cultivo em caldo batata dextrose por 7

dias, os ácido oléico (C18:1 ∆9), linoléico (C18:2

∆9,12 ) e linolênico (C18:3), corroborando

com este trabalho.

http://pt.wikipedia.org/wiki/Triglicer%C3%ADdeo

http://pt.wikipedia.org/wiki/Colesterol

http://pt.wikipedia.org/wiki/LDL

http://pt.wikipedia.org/wiki/HDL

72

4.3. CARACTERIZAÇÃO DE P18

COOH

N O

H

OH1

2

4

35

6

12

10

9

7

11

8

A fração P18 não foi isolada como uma substância totalmente pura,

apresentando sinais de impurezas observados nos espectros de RMN de 1H, 13C e

sub-espectro DEPT-135. No entanto, os espectros apresentaram sinais bastante

representativos, o que permitiu uma proposta da estrutura da substância,

aparentemente, majoritária na fração. A fração apresentou-se como uma cera

amarela de característica oleosa.

No espectro de RMN de 1H (anexos 4.1 e 4.1.1, páginas 123 e 124) foram

observados vários sinais (multipletos) na região entre δ 1,0 ppm e δ 3,7 ppm

atribuíveis aos átomos de hidrogênio metilênicos. Na região entre δ 4,1 ppm e δ

4,6 ppm foram observados dois sinais de átomos de hidrogênio ligados a carbonos

terciários, de acordo com DEPT (anexo 4.3, página 126). Dois sinais presentes em

δ 7,2 ppm e δ 7,4 ppm foram caracterizados como sendo de átomos de hidrogênio

ligados a carbonos aromáticos. Foi observado, ainda, em δ 8,6 ppm, um sinal com

integração para um hidrogênio, atribuível a hidrogênio de grupo carboxílico.

No espectro de RMN de 13C (anexo 4.2, página 125) foram observados 12

sinais, sendo que quatro deles não apresentaram sinais no DEPT, permitindo

concluir que na molécula havia quatro átomos de carbono quaternários. Um sinal

de carbonila do grupo amida foi observado em δ 165,8 ppm, um sinal de carbonila

de grupo carboxílico em δ 169,8 e outros dois átomos de carbono quaternários

apresentaram sinais em δ 127,7 ppm e δ 157,8 ppm.

Dos oito átomos de carbono hidrogenados, quatro apresentaram sinais entre

δ 22,5 ppm e δ 45,3 ppm, sendo caracterizados como átomos de carbono

metilênicos. Sinais de quatro grupos metínicos foram observados em δ 57,0 ppm,

73

δ 59,4 ppm, δ 116,2 ppm e δ 131,3 ppm, estes dois últimos caracterizados como

átomos de carbono aromáticos.

A proposta da presença do átomo de nitrogênio foi feita com base no sinal

em δ 165,8 ppm, caracterizando um grupo amida na molécula (SILVERSTEIN,

1991), e ainda, com o resultado positivo frente à revelação com Reagente de

Dragendorff em CCD.

Na tentativa de elucidação estrutural das substâncias, os carbonos foram

numerados em ordem crescente de deslocamento químico e, através do mapa de

contornos HSQC (anexos 4.4 e 4.4.1, páginas 127 e 128), foram obtidas as

correlações entre carbonos e hidrogênios que participam da mesma ligação

química. A análise do espectro de 1H-1H COSY (anexo 4.5 e 4.5.1, páginas 129 e

130) permitiu correlacionar os hidrogênios acoplados e a análise do mapa de

contornos HMBC permitiu estabelecer a conectividade entre os carbonos da

molécula e os hidrogênios próximos. Os dados obtidos da numeração dos

carbonos e hidrogênios e as correlações estão apresentados na Tabela 9.

A análise dos dados da Tabela 9 (página 74) permitiu a montagem de dois

fragmentos da molécula, apresentados na Figura 32.

Figura 32. Fragmentos propostos para P18 estabelecidos com base nas

correlações 1H-1H COSY

COOH

H

H

H

H

H

H A

N

H

O

OH

B

Correlações 1H-

1H COSY

74

Tabela 9. Dados de RMN de 1H e de 13C, 1H-1H COSY e HMBC para a substância

P18

Nº Carbono Tipo δC (ppm) δH (ppm) COSY HMBC

1 CH2 22,5 H1a- 0,8

H1b- 1,6 H1a x C4

2 CH2 29,5 H2a- 1,9

H2b- 2,2

H2a x H2b

δ 2,2

H2a x C6,

C12

3 CH2 36,2 H3a- 3,3

H3b- 3,6

H3a x C5,

C8, C9

H3b x C9

4 CH2 45,3 H4a- 3,4

H4b- 3,7

H4a x H1b

δ 3,4

H4b x H1b

δ 3,65

H4b x C1

5 CH 57,0 4,6

H5 x H3a;

H5 x H3b

δ 4,6

6 CH 59,4 4,15 H6 x H2b

δ 4,2

H6 x C2,

C12

7 CH 116,2 7,15 H7 x C8,

C10,

8

C 127,7

9 CH 131,3 7,5 H9 x C3,

C10

10

C 157,8

11

C=O 165,8

12

COOH 169,8

75

O fragmento B corresponde a uma δ-lactama e apresenta correlação com o

fragmento A observada no mapa de contornos HMBC (anexos 4.6 e 4.6.1,

páginas 131 e 132). A análise do espectro de DEPT não mostrou a presença de

nenhum grupo metila, alem disso as poucas correlações observadas no mapa de

contornos 1H-1H COSY, levou à proposta de uma molécula bicíclica.

A conformação mais favorável de um cicloexano 1,2- dissubstituído seria

com os dois substituintes em posição equatorial. Esta proposta está de acordo com

as correlações visualizadas no mapa de contornos NOESY (anexos 4.7 e 4.7.1,

páginas 133 e 134), que mostrou as correlações entre H1b x H4a, H1b x H4b, H2b

X H6 e H3b x H5, conforme mostrado na Figura 33.

HH

H

H

H

H

H

H

H

COOH

H

R

6

21

43

5

R = NH

O

OH

Figura 33. Correlações espaciais para P18 baseadas no espectro de NOESY

Devido à possibilidade de rotação livre da ligação sigma C5-C10, podem

também ser observadas correlações no mapa de contornos NOESY entre H3a x

H9, H3b x H9 e H5 x H9, conforme Figuras 34 (A) E (B).

HH

H

H

H

H

H

H

H

H

3

5 NH

H

OHO

10

9

11

7

8

HH

H

H

H

H

H

H

H

H

5

NH

OH

OH

10

9 11

7

8

(A) (B)

Figura 34 (A) e (B). Correlações espaciais para P18 baseadas no espectro de

NOESY

76

No espectro de massas obtido da substância P18, de fórmula molecular

C12H15NO4, foi observado um pico em m/z 261,1284, atribuível à estrutura

proposta, com a possível integração de um íon Na+ à molécula, no momento do

desenvolvimento da técnica [238 + Na+] (Figura 35).

Figura 35. Espectro de massas (ESI +) da substância P18

A pesquisa por dados da literatura de estruturas semelhantes à proposta

levou à estrutura da ilicicolina H (70), um antibiótico com alta potência contra C.

albicans, isolado de micélio do fungo Cylindrocladium ilicicola (MATSUMOTO,

MAKOTO, 1979).

NH

HOOH

O

CO

CH3

HC CH

CH3

CH3

70

A produção quali e quantitativa de metabólitos secundários depende da

capacidade biossintética do micro-organismo e das condições de fermentação.

Assim, a manipulação dos parâmetros do processo fermentativo pode alterar a

expressão dos metabólitos secundários produzidos (TAKAHASHI, LUCAS, 2008),

sendo assim, pode haver alteração em alguma etapa da biossíntese de

determinados metabólitos, resultando em diferentes substâncias, ou concentração

destas.

207.1096 219.1128

240.1233261.1284

267.1139

283.1109

+MS, 0.2-0.5min #(14-30)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

5x10

Intens.

160 180 200 220 240 260 280 m/z

77

4.4. TESTES DE ATIVIDADE BIOLÓGICA

4.4.1. Avaliação da atividade antimicrobiana – Técnica de difusão em placa

utilizando discos de papel (BAUER et al., 1966)

Os extratos obtidos, nas diferentes condições de cultivo, do fungo P. lilacinus

e as substâncias isoladas (P18 e C09) foram avaliadas no teste de atividade

antimicrobiana utilizando-se as bactérias Gram-positivas S. aureus e L.

monocytogenes, as bactérias Gram-negativas P. aeruginosa e E. coli, além da

levedura C. albicans. Foram realizadas leituras 24 h e 48 h após a incubação das

placas em estufa a 37 ºC. Não foi observada diferença estatística dos valores das

duas mensurações, em função disso, serão apresentados, neste trabalho, somente

os resultados da leitura realizada após 24 h após o início do teste. Os valores das

médias dos halos de inibição produzidos pelas amostras, após 24 h, estão

apresentados nas Tabelas 10, 11 e 12.

Tabela 10. Média dos halos de inibição do crescimento microbiano (em mm) para

os extratos obtidos do fungo P. lilacinus, sob condição de agitação

Extrato

Halo de inibição de crescimento (mm)

S. aureus L. monocytegenes P. aeruginosa E. coli C. albicans

1 0,00 0,00 0,00 0,00 17,66

2 C.E.M. C.E.M. C.E.M. C.E.M. C.E.M.

3 9,39 8,21 0,00 0,00 21,96

4 8,57 7,66 0,00 0,00 14,57

5 20,76 18,79 0,00 0,00 0,00

6 14,16 9,40 0,00 0,00 19,47

7 8,52 8,00 0,00 0,00 18,99

8 8,13 8,83 0,00 0,00 23,27

9 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

10 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

11 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

12 8,98 0,00 0,00 0,00 21,47

Continua página 78...

78

... continuação Tabela 10

13 7,75 0,00 0,00 0,00 13,11

14 0,00 0,00 0,00 0,00 11,54

Controle

negativo

0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Controle

positivo

18,12 20,61 17,75 18,18 11,36

C.E.M. = Controle de esterilidade do meio de cultura

Dos treze extratos testados, oito apresentaram atividade contra a bactéria

Gram-positiva S. aureus e seis apresentaram atividade contra L. monocytogenes,

sendo que, todos os extratos ativos contra o último micro-organismo, também

foram ativos contra S. aureus. Portanto, dois extratos foram seletivamente ativos

contra S. aureus. Os extratos testados produziram halos de inibição significativos,

sendo que o extrato contendo o fungo P. lilacinus e a bactéria Salmonella

tiphymurium, ambos inoculados ao meio de cultura no mesmo dia (extrato 5),

apresentou a maior inibição das bactérias. visto que, no teste com S. aureus, o

valor médio dos halos de inibição produzidos pelo extrato (20,76 mm) foi maior do

que o valor médio dos halos apresentados pelo controle positivo (cloranfenicol,

18,12 mm). Não foram detectados halos de inibição para nenhuma das bactérias

Gram-negativas testadas. Nove extratos foram ativos contra C. albicans, sendo que

dois deles, mostraram atividade antifúngica. Praticamente todos os extratos ativos

contra C. albicans apresentaram halos de inibição maiores do que aquele

observado para o controle positivo utilizado (miconazol).

A presença do material genético bacteriano no meio de cultivo do fungo P.

lilacinus influenciou a atividade antimicrobiana dos extratos obtidos do mesmo, sob

condição de agitação, pois o extrato 1, obtido do cultivo individual do fungo,

somente apresentou atividade contra a levedura, enquanto, a maioria dos outros

extratos obtidos do co-cultivo de P. lilacinus e S. tiphymurium foram ativos contra

as bactérias Gram-positivas testadas, além da levedura.

79


os extratos obtidos do fungo P. lilacinus, sob condição estática

Extrato


S. aureus L. monocytegenes P. aeruginosa E. coli C. albicans

1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

2 C.E.M. C.E.M. C.E.M. C.E.M. C.E.M.

3 0,00 14,80 0,00 0,00 0,00

4 10,11 0,00 0,00 0,00 0,00

5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

6 0,00 10,87 0,00 0,00 0,00

7 9,11 0,00 0,00 0,00 0,00

8 8,34 0,00 0,00 0,00 0,00

9 0,00 9,48 0,00 0,00 10,76

10 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

11 0,00 12,50 0,00 0,00 0,00

12 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

13 0,00 10,44 0,00 0,00 11,42

14 8,25 9,54 0,00 0,00 0,00

Controle

negativo

0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Controle

positivo

22,65 34,22 27,01 21,21 16,38

C.E.M. = Controle de esterilidade do meio de cultura

Para os extratos obtidos do fungo P. lilacinus, cultivados sob condição

estática, foram observadas diferentes atividades contra as bactérias Gram-positivas

S. aureus, L. monocytogenes e contra a levedura C. albicans, em comparação com

os extratos cultivados sob condição de agitação orbital, mostrando que a aeração

do meio é um parâmetro que interfere na produção de metabólitos secundários

com atividade antimicrobiana. Em relação às bactérias Gram-negativas testadas,

P. aeruginosa e E. coli, os resultados foram similares, ou seja, não houve nenhum

extrato ativo contra esses micro-organismos.

80


as substâncias P18 e C09 isoladas de extratos do fungo P. lilacinus

Substância


S.

aureus L. monocytegenes P. aeruginosa E. coli C. albicans

P18 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

C09 0,0 9,5 0,0 0,0 0,0

Controle

positivo 28,4 33,0 22,1 23,2 14,1

Controle

negativo 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Como observado na Tabela acima, foi verificada atividade antimicrobiana

contra a bactéria Gram-positiva L. monocytogenes, pela substância C09. A partir

disto, propõe-se que, a atividade antimicrobiana observada pelos extratos brutos

ensaiados é causada pela presença de outras substâncias com tal atividade nos

extratos obtidos.

Estudo como o de Mori e colaboradores, realizado em 1982 no Japão, levou

ao isolamento de leucinostatina, uma mistura composta por várias substâncias

sendo as principais, as leucinostatinas A (71) e B, altamente potentes contra

bactérias Gram-positivas, fungos e com atividade antitumoral contra carcinoma de

Ehrlich (MORI et al., 1982).

71

81

Um estudo posterior, também no Japão, corroborou com os resultados

acima, obtendo também paecilotoxinas, peptídeos contendo um ácido graxo

insaturado e um resíduo de amina nos grupos N-terminal e C-terminal,

respectivamente, isolados de P. lilacinus, alguns dos quais, de origem clínica

(MIKAMI et al., 1989). As paecilotoxinas apresentam grande atividade

antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas e fungos, além de fitotoxicidade

(MIKAMI et al., 1984; MIKAMI et al., 1989). Leucinostatinas também foram

produzidas por culturas de P. lilacinus do solo e outros substratos na Austrália e

apresentaram atividade nematicida contra Caenorhabditis elegans (PARK et al.,

2004).

4.4.1.1. Análise estatística

Os resultados do teste de atividade antimicrobiana, para as bactérias Gram-

positivas e a levedura testada, utilizando-se a técnica de difusão em placa, foram

apresentados como média ± erro padrão da média com n=2 para cada extrato

obtido. Os resultados foram submetidos à análise de variância (One-way ANOVA)

seguida do teste de Tukey para análise múltipla de comparação das médias. Foi

adotado intervalo de confiança de 95 %, sendo as diferenças consideradas

significativas quando o valor P foi menor ou igual a 0,05 (P˂0,05). Para análise

estatística foi utilizado o Software GraphPad Prism 5.0.

Os resultados obtidos a partir do teste de Tukey, para análise múltipla de

comparação das médias, foram transpostos para uma planilha do programa

Microsoft Office Excel 2007, para melhor interpretação dos resultados. As médias

dos valores dos halos de inibição produzidos pelos extratos, para cada micro-

organismo testado, foram comparadas e agrupadas de acordo com a característica

de apresentarem médias estatisticamente iguais entre si (Tabelas 13 e 14).

82

Tabela 13. Agrupamento, resultante da análise estatística dos resultados do teste

de atividade antimicrobiana dos extratos obtidos do fungo P. lilacinus, sob condição

de agitação

Grupos

S. aureus L. monocytogenes C. albicans

Extratos

A 1, 9, 10, 11, 14, controle

negativo

1, 9, 10, 11, 12, 13,

14, controle negativo

5, 9, 10, 11,

controle negativo

B 13, 8, 7, 4, 12, 3 4, 7, 3, 8, 6 Controle positivo,

14, 13, 4

C 6, controle positivo 5, controle positivo 1, 7, 6, 12, 3, 8

D controle positvo, 5 --- ---

Tabela 14. Agrupamento, resultante da análise estatística dos resultados do teste

de atividade antimicrobiana dos extratos obtidos do fungo P. lilacinus, sob condição

estática

Grupos

S. aureus L. monocytogenes C. albicans

Extratos

A 1, 3, 5, 6, 9, 10, 11, 12,

13, controle negativo

1, 4, 5, 7, 8, 10, 12,

controle negativo

1, 3, 4, 5, 6, 7, 8,

10, 11, 12, 14,

controle negativo

B 14, 8, 7, 4 9, 14, 13, 6, 11, 3 9,13

C controle positivo, 3 controle positivo

D --- controle positivo ---


Os extratos obtidos, nas diferentes condições de cultivo, do fungo P. lilacinus

e as substâncias P18 e C09 foram submetidos à avaliação da atividade

antimicrobiana utilizando-se o método de microdiluição em caldo, testados a uma

concentração fixa de 1000 μg/mL e 250 μg/mL, respectivamente. Foram utilizadas

as bactérias Gram-positivas S. aureus e L. monocytogenes, as bactérias Gram-

83

negativas P. aeruginosa e E. coli, além da levedura C. albicans. Foram realizadas

leituras 24 h e 48 h após a incubação das placas em estufa a 37 ºC.

Todos os extratos brutos apresentaram atividade antimicrobiana contra os

micro-organismos testados (Gráficos 3 a 10).


sob agitação orbital.

Obs: Valores da leitura realizada após 24 h do início do experimento


sob agitação orbital.

Obs: Valores da leitura realizada após 48 h do início do experimento.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

S. aureus L. monocytogenes

P. aeruginosa E. coli C. albicans

% d

e Inib

ição

Extrato 1

Extrato 3

Extrato 5

Extrato 6

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

S. aureus L. monocytogenes P. aeruginosa E. coli C. albicans

% d

e Inib

ição

Extrato 1

Extrato 3

Extrato 5

Extrato 6

84

Gráfico 5. Percentual de inibição antimicrobiana dos extratos 8, 10, 12 e 13,

cultivados sob agitação orbital.



cultivados sob agitação orbital.


0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


% d

e Inib

ição

Extrato 8

Extrato 10

Extrato 12

Extrato 13

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


% d

e Inib

ição

Extrato 8

Extrato 10

Extrato 12

Extrato 13

85


sob condição estática.



sob condição estática.


0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


% d

e Inib

ição

Extrato 1

Extrato 3

Extrato 5

Extrato 6

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


% d

e Inib

ição

Extrato 1

Extrato 3

Extrato 5

Extrato 6

86


cultivados sob condição estática.



cultivados sob condição estática.


0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


% d

e Inib

ição

Extrato 8

Extrato 10

Extrato 12

Extrato 13

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


% d

e Inib

ição

Extrato 8

Extrato 10

Extrato 12

Extrato 13

87

Os resultados do presente teste diferem daqueles encontrados no teste

antimicrobiano utilizando-se o método de difusão em placa com discos de papel,

visto que, no último, não foi observada nenhuma atividade antimicrobiana frente às

bactérias Gram-negativas testadas, P. aeruginosa e E. coli . Este fato pode ser

explicado em função das diferenças dos fundamentos existentes entre as duas

técnicas. O teste de difusão em placa com discos de papel é um método físico, no

qual a substância ativa presente no extrato precisa sofrer difusão no meio de

cultura sólido, de caráter hidrofílico, para inibir o crescimento do micro-organismo

em teste. Assim, o tamanho da zona de inibição de crescimento do mesmo, não

está relacionado somente com a concentração da substância ativa no extrato, mas

sim, com a propriedade dela de sofrer difusão no meio. Isto significa que, quanto

mais hidrossolúvel for a substância, maior a capacidade de difusão no meio de

cultura, maior a interação com o micro-organismo e, por conseqüência, maior o

halo de inibição de crescimento do micro-organismo. Desta forma, este método é

caracterizado como um método qualitativo. Na técnica de microdiluição em caldo

utiliza-se a amostra previamente solubilizada no meio de cultura, portanto a

substância não necessita sofrer difusão no meio, visto que ela está solubilizada ou

finamente suspendida no mesmo. Com isso, a interferência da propriedade química

da substância ensaiada é menor do que no primeiro teste. Neste método

considera-se a relação entre a proporção de crescimento do micro-organismo no

meio líquido e a concentração da substância testada, caracterizando-se como um

ensaio quantitativo.

Diante o exposto, observa-se que são vários os fatores interferentes em

ambos os testes, como concentração e origem dos meios de cultura,

principalmente no primeiro teste, disponibilidade de oxigênio, padronização do

inóculo, condições de incubação e garantia de esterilidade do meio de cultura

(PINTO et al., 2003; OSTROSKY et al., 2008).

Das substâncias testadas no teste antimicrobiano utilizando-se a

metodologia da microdiluição em caldo, foi observada atividade frente às bactérias

Gram-positivas, pela substância C09, como mostrado nas Tabelas que se seguem.

88

Tabela 15. Percentual (%) de inibição antimicrobiana das substâncias P18 e C09,

após 24 h do início do experimento

Amostra S. aureus L.

monocytogenes

P.

aeruginosa E. coli

C.

albicans

P18 0 0 0 0 0

C09 4,3 9,4 0 0 0

Tabela 16. Percentual (%) de inibição antimicrobiana das substâncias P18 e C09,

após 48 h do início do experimento

Amostra S. aureus L.

monocytogenes

P.

aeruginosa E. coli

C.

albicans

P18 0 0 0 0 0

C09 6,1 10,2 0 0 0

89

4.4.3. Avaliação da atividade de inibição de acetilcolinesterase em cromatografia

em camada delgada (CCD) – Método de Ellmann

A avaliação qualitativa da inibição da AchE foi realizada seguindo-se a

metodologia de Ellmann, adaptada por Rhee et al. para cromatografia em camada

delgada. Este método é baseado na hidrólise do ACTI pela AchE, produzindo

tiocolina, que reage com DTNB originando o composto 5-tio-2-nitro-benzoato

(Figura 36), que apresenta coloração amarela (SILVA, 2009). A visualização da

inibição da enzima foi constatada pela formação de halos brancos, que

desapareceram após 20 a 30 min da aplicação.

Figura 36. Reações envolvidas no método de Rhee (SILVA, 2009).

Os vinte e oito extratos brutos obtidos e o padrão cafeína foram testados na

concentração de 10 mg/mL, sendo uma quantidade de 5 µL aplicada nas placas de

testes. Do total testado, dezesseis extratos produziram halos brancos na placa,

indicando atividade de inibição da enzima AchE, como mostrado na Figura 37 (A)

e (B). O valor de Rf de cada amostra está indicado na Tabela 17.

90

Figura 37. (A) Foto da placa do teste de Inibição da AchE em CCD (extratos

cultivados sob agitação) e (B) Foto da placa do teste de Inibição da AchE em CCD

(extratos cultivados sob condição estática).

91

Tabela 17. Valores dos fatores de retenção (Rf) das substâncias ativas no teste de

inibição da AchE

Extrato

Fator de retenção (Rf)

Cultivo sob

agitação

Cultivo em

condição estática

1 0,05 0,25

2 N.D. N.D.

3 0,05 0,20 / 0,62

4 0,23 0,20 / 0,62

5 0,05 0,20 / 0,62

6 N.D. 0,18

7 N.D. N.D.

8 0,25 0,25

9 N.D. 0,06

10 N.D. N.D.

11 0,25 N.D.

12 N.D. 0,25

13 N.D. 0,25

14 0,25 0,25

Cafeína (padrão positivo) 0,45

N.D. = Não detectado

Estes resultados foram bastante satisfatórios, sendo quase 60% dos extratos

testados ativos na inibição da enzima AchE. Analisando-se a Tabela 17 pode-se

perceber que, em determinados extratos, existe mais de uma substância ativa,

afirmando a capacidade de micro-organismos em produzir substâncias

anticolinesterásicas.

Após a triagem com os vinte e oito extratos obtidos, o extrato 8, cultivado

sob condição estática, foi selecionado para produção em escala ampliada para que

92

se obtivesse quantidade adequada ao seu fracionamento e isolamento de

constituintes químicos.

4.4.4. Avaliação da atividade de inibição de acetilcolinesterase em microplaca –

Método de Ellmann

O teste de inibição da AchE em CCD, descrito no tópico 3.10.3, apresenta

apenas caráter qualitativo. Para quantificar o valor da inibição da enzima AchE

apresentado pelos extratos obtidos neste estudo, utilizou-se a metodologia de

Ellmann. Portanto o critério de escolha dos extratos testados por este método

baseou-se na triagem do primeiro ensaio, sendo então, dezesseis extratos

ensaiados. As substâncias isoladas, P18 e C09 também foram testadas nesse

bioensaio.

A primeira etapa do ensaio constituiu-se em medir a absorbância da solução

(solução de trabalho + solução de ACTI + solução de DTNB + tampão Tris/HCl pH

8,0) por oito vezes, obtendo-se, assim, para cada amostra, a média de quarenta

medidas de absorbância, visto que o teste foi realizado em quintuplicata. Na

segunda etapa, realizada após a adição da solução da enzima AchE aos poços

testes, foi mensurada a absorbância novamente, por dez vezes, resultando na

média de cinqüenta medidas para cada amostra.

As porcentagens de inibição foram calculadas comparando-se as taxas das

reações das amostras com a taxa de reação do controle (solvente utilizado para

solubilizar as amostras) através da fórmula: % inibição = 100 - (taxa da reação

amostra/taxa da reação controle x 100). Os resultados das avaliações do potencial

inibitório dos extratos e das substâncias P18 e 09 de P. lilacinus estão

apresentados a seguir.

93

Tabela 18. Percentual (%) de inibição das amostras no ensaio anticolinesterásico

em microplaca pelo método de Ellmann

Amostra % Inibição (média ± d.p.)

01 S.A 86 ± 1,87

03 S.A 80 ± 4,0

04 S.A 85 ± 2,73

05 S.A 91 ± 2,91

06 S.A 93 ± 4,73

08 S.A 97 ± 4,68

09 S.A 78 ± 2,30

12 S.A 81 ± 0,80

13 S.A 83 ± 1,75

14 S.A 79 ± 1,60

1 C.A 92 ± 3,52

4 C.A 87 ± 2,30

5 C.A 86 ± 1,10

8 C.A 86 ± 2,13

11 C.A 92 ± 2,07

14 C.A 88 ± 2,10

P18 57,5 ± 5,50

C09 67 ± 4,0

Controle

positivo

(eserina)

98 ± 1,66

Controle

negative 0 ± 0

*d.p.= desvio padrão

94

Gráfico 11. Percentual de inibição da enzima AchE pelos extratos, substâncias

P18 e C09, eserina e MeOH

Como pode ser observado, todos os extratos ensaiados apresentaram alto

potencial anticolinesterásico, visto que é descrito que extratos que apresentam

porcentagens de inibição maiores do que 50% têm potencial anticolinesterásico

considerado como alto e porcentagens de inibição entre 15 a 50% como de

atividade moderada a baixa (SEIDL, 2010). O extrato 8 S.A apresentou a maior

porcentagem de inibição, 98%, similar ao controle positivo, eserina. As substâncias

isoladas P18 e C09 também mostraram significativa atividade de inibição da

enzima AchE, como níveis de inibição de 57,5 e 67%, respectivamente.

Estudos realizados utilizando-se fungos como produtores de substâncias

anticolinesterásicas corroboram com essa pesquisa. Os diasteroisômeros

quinolactacina A1 (58) e quinolactacina A2 (59), isolados de uma cultura de

Penicillium citrinum 90648, apresentaram grande atividade inibitória da enzima

AchE, sendo a quinolactacina A2, ainda, seletiva para a AchE versus

butirilcolinesterase (BuchE), uma enzima semelhante à acetilcolinesterase, porém

com distribuição tecidual diferente da última, e sem real função definida. (KIM et al.

2001).

Em outras pesquisas, utilizando-se culturas do fungo Aspergillus terreus,

Kim e colaboradores (2002), isolaram um meroterpenóide, denominado

terreulactona A (72) e, em 2005, um novo meroterpenóide foi isolado, a

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% de inibição da enzima AchE %

95

O

O

R1

R2

R3O

O

OH

OH

isoterreulactona A (73). Ambas inibiram consideravelmente a enzima AchE, a

primeira com um IC50 de 0,2 µM e, a segunda, com IC50 de 2,5 µM.

O

O

O

O

O

OCH3

OH

OH

O

OO

OCH3

OH

O

H3CO

OO

72 73

Outro estudo que apresentou resultados positivos foi o de Sunazuka e

colaboradores (2004), que pesquisaram uma enorme variedade de fungos do solo,

na busca por produtores de inibidores de AChE. Neste trabalho, estes autores

isolaram (+)-arisugacinas A (74) e B (75), ciclofostina (76), territrems B (77) e C

(78) e a ciclopenina (79), todas com satisfatório poder de inibição de AchE. As

arisugacinas A e B e a ciclopenina foram seletivas, pois não inibiram a enzima

BuChE.

O

P

O

CH3

O

H

H3CO

O

76

N

N

O

HO

CH3

O

79

74 R1 = OCH3, R2 = OCH3, R3 = H

75 R1 = H, R2 = OCH3, R3 = H 77 R1 = OCH3, R2 = OCH3, R3 = OCH3

78 R1 = OCH3, R2 = OCH3, R3 = H

96

Capítulo 5

CONCLUSÃO

97

5. CONCLUSÃO

Nesse trabalho foi realizado o estudo da variação de parâmetros no cultivo

do fungo filamentoso Paecilomyces lilacinus, a fim de se obter diferentes extratos

brutos e testá-los quanto às atividades antimicrobiana e anticolinesterásica.

Os extratos brutos apresentaram atividade antibacteriana seletiva, no teste

antimicrobiano utilizando-se o método de difusão em ágar, sendo ativos somente

contra as bactérias Gram-positivas. Quando submetidos ao mesmo teste,

utilizando-se a metodologia de microdiluição em caldo, todos os extratos ensaiados

mostraram atividade antimicrobiana contra os micro-organismos utilizados no teste,

o que é explicado pela diferença dos fundamentos entre os dois testes. O extrato 5,

cultivado sob condição estática (5 S.A), foi selecionado para produção em escala

ampliada para que se obtivesse quantidade adequada ao seu fracionamento e

isolamento de constituintes químicos.

Dos vinte e oito extratos brutos obtidos e testados no teste de inibição da

enzima AchE, utilizando-se o método qualitativo em CCD, dezesseis extratos

apresentaram atividade de inibição da enzima AchE. Estes foram submetidos ao

teste quantitativo de inibição da mesma enzima, e apresentaram percentual de

inibição entre 78 e 97%. Em seguida às triagens, o extrato 8, cultivado sob

condição estática (8 S.A), foi selecionado para produção em escala ampliada para

que se obtivesse quantidade adequada ao seu fracionamento e isolamento de

constituintes químicos.

Análise dos extratos brutos, por CLAE-PDA, revelou que a variação de

alguns parâmetros de cultivo, como co-adição de material genético bacteriano ao

meio e aeração do meio, interferiu na produção de metabólitos pelo fungo

estudado, visto que os extratos obtidos deste apresentaram diferenças nos seus

perfis químicos.

Do fracionamento cromatográfico do extrato 5 S.A, foi isolada a substância

P18, para a qual baseando-se em dados espectroscópicos, foi proposta a estrutura

química de uma δ-lactama.

Do fracionamento cromatográfico do extrato 8 S.A, foram isoladas duas

substâncias, C09 e C16-P, para as quais, infelizmente, não se conseguiu dados

espectroscópicos suficientes para suas respectivas caracterizações.

98

As substâncias P18 e C09 foram submetidas aos testes antimicrobianos, por

ambas as metodologias citadas acima e ao teste de inibição da enzima AchE. Nos

testes antimicrobianos, foi observada atividade para a substância C09, contra as

bactérias Gram-positivas S. aureus, quando se utilizou a metodologia de

microdiluição em caldo e L. monocytogenes, em ambas as metodologias. Em

relação ao teste de atividade anticolinesterásica, ambas as substâncias

apresentaram relevante atividade de inibição da enzima, com percentual de

inibição de 57,5% e 67% para as substâncias P18 e C09, respectivamente.

99

Capítulo 6

REFERÊNCIAS

100

6. REFERÊNCIAS:

ANTUNES, R.M.P.; LIMA, E.O.; PEREIRA, M.S.V.; CAMARA, C.A.; ARRUDA, T.A.;

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113

ANEXOS

114

ANEXO 1. Espectros da fração P12

1.1 – Espectro de RMN de 1H (200 MHz, Pyr, δ)

115

1.2 – Espectro de RMN de 13C (50 MHz, Pyr, δ)

116

1.3 - Espectro de DEPT (50 MHz, Pyr, δ)

117


2.1 – Espectro de RMN de 1H (200 MHz, MeOH, δ)

118

2.2 – Espectro de RMN de 13C (50 MHz, MeOH, δ)

119

2.3 – Espectro de DEPT (50 MHz, MeOH, δ)

120


3.1 - Espectro de RMN de 1H (200 MHz, Pyr, δ)

121


122

3.3 – Espectro de DEPT (50 MHz, Pyr, δ)

123

ANEXO 4. Espectros da substância P18


124

4.1.1 – Expansão do espectro de RMN de 1H

125


126


127

4.4 – Mapa de contornos HSQC

128

4.4.1 – Expansão do mapa de contornos HSQC

129

4.5 – Mapa de contornos H-H COSY

130

4.5.1 – Expansão do mapa de contornos H-H COSY

131

4.6 – Mapa de contornos HMBC

132

4.6.1 – Expansão do mapa de contornos HMBC

133

4.7 – Mapa de contornos NOESY

134

4.7.1 – Expansão do mapa de contornos NOESY

135

ANEXO 5. Espectros da substância C09


136

5.2 - Espectro de RMN de 13C (50 MHz, Pyr, δ)

137

5.2.1 – Expansão do espectro de RMN de 13C

138


139

5.4 - Mapa de contornos HSQC

140

5.5 - Mapa de contornos H-H COSY

141

5.6 - Mapa de contornos HMBC

142

5.7 - Mapa de contornos NOESY

143

ANEXO 6. Espectros de RMN de AC-05

6.1 - Espectro de RMN de 1H (200 MHz, CDCl3, δ)

144

6.2 – Espectro de RMN de 13C (50 MHz, CDCl3, δ)

145

6.3 – Espectro de DEPT (50 MHz, CDCl3, δ)

estudo quÍmico e avaliaÇÃo das atividades …‡Ão... · universidade federal de ouro preto ......

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