estudo longitudinal da infecÇÃo por hantavirus em … · facilidades que nos foram concedidas....

MINISTÉRIO DA SAÚDE

FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ

INSTITUTO OSWALDO CRUZ

PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA

ESTUDO LONGITUDINAL DA INFECÇÃO POR HANTAVIRUS EM

ROEDORES SILVESTRES NO ESTADO DO PARANÁ

BERNARDO RODRIGUES TEIXEIRA

Rio de Janeiro

Outubro de 2013

ii






Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Biologia Parasitária do Instituto Oswaldo Cruz como

parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor

em Ciências

Orientador: Prof. Dr. Paulo Sérgio D’Andrea

Rio de Janeiro

Outubro, 2013

Ficha catalográfica elaborada pelaBiblioteca de Ciências Biomédicas/ ICICT / FIOCRUZ - RJ

T266 Teixeira, Bernardo Rodrigues

Estudo longitudinal da infecção por hantavirus em roedores silvestres no estado do Paraná / Bernardo Rodrigues Teixeira. – Rio de Janeiro, 2013.

xvi, 139 f. : il. ; 30 cm.

Tese (Doutorado) – Instituto Oswaldo Cruz, Pós-Graduação em Biologia Parasitária, 2013.

Bibliografia: f. 118-139

1. Hantavírus. 2. Roedores silvestres. 3. Paraná. 4. Ecologia. 5. Microhabitat. I. Título.

CDD 616.918

iv



TESE DE DOUTORADO




ORIENTADOR: Prof. Dr. Paulo Sérgio D’Andrea

Aprovada em: _____/_____/_____

EXAMINADORES:

_____________________________________________________

Profª. Drª. Elizabeth Ferreira Rangel – Presidente

Instituto Oswaldo Cruz – IOC/FIOCRUZ

_____________________________________________________

Profª. Drª. Alzira Maria Paiva de Almeida – Membro (Revisora)

Universidade Estadual do Rio de Janeiro - UERJ

_____________________________________________________

Profª. Drª. Helena de Godoy Bergallo – Membro


_____________________________________________________

Prof. Dr. Darcílio Fernandes Baptista – Suplente

Instituto Oswaldo Cruz – IOC/FIOCRUZ

_____________________________________________________

Profª. Drª. Maja Kajin – Suplente


Rio de Janeiro, 31 de outubro de 2013

v

AGRADECIMENTOS

Ao Dr. Paulo Sérgio D’Andrea, por ter me orientado não somente nesta tese, mas por ser

meu orientador desde a iniciação científica. Obrigado pela confiança, pelas oportunidades

profissionais ao longo de todos estes anos, pela visão interdisciplinar e por investir na minha

formação científica e até mesmo na área de gestão.

À Drª Elba Lemos pela co-orientação nesta tese e parceria neste e em outros projetos,

permitindo que todas as análises diagnósticas fossem realizadas em seu laboratório. Obrigado

pelo apoio em todos os momentos de desenvolvimento deste trabalho e pela confiança depositada

em minhas idéias.

À Drª Ana Maria Jansen pela orientação durante parte desta tese. Obrigado pelo apoio

quando do meu ingresso nesta pós-graduação e pelo incentivo e contribuições principalmente no

seminário discente.

À minha esposa Cecília Siliansky pelas contribuições essenciais na análise de dados, pelo

amor, apoio incondicional, carinho e paciência durante todos estes anos. Aos meus pais, irmã e

avós pelo constante apoio em todos os campos da minha vida e por todo esforço e dedicação na

minha formação.

À Liana Strecht, meu braço direito, que contribuiu em todas as etapas de

desenvolvimento desta tese, participando de todas as excursões de campo, da coleta dos dados de

micro-habitat, organização das amostras, análises sorológicas e como minha aluna de iniciação

científica desenvolvendo parte deste trabalho.

À Drª Rosana Gentile pela parceria em todas as análises de dados desta tese, na

orientação de alunos e na avaliação do texto final, melhorando a forma de interpretação dos

dados.

À Drª Cláudia Santos e equipe do Instituto Carlos Chagas, FIOCRUZ-PR, Sônia Raboni,

Suzana Carstensen e Vanessa Stella, pela parceria estabelecida em parte deste projeto.

À Gisélia Rubio, chefe da Divisão de Zoonoses e Intoxicações da Secretaria de Saúde do

Estado do Paraná (SESA-PR), que acreditou neste projeto e contribuiu com toda a logística

necessária para realização das excursões de campo. A parceria de Gisélia e toda sua equipe foi

fundamental para a viabilização desta tese.

Aos profissionais da SESA-PR que participaram de todas as expedições de campo e

formaram uma equipe de alto nível para coleta de dados, principalmente em General Carneiro,

aonde o volume de trabalho era pesado! Obrigado a todos da equipe “Ratos do Asfalto” pelo

vi

profissionalismo e por tornar o ambiente de trabalho sempre agradável: Edison Santos, Edilsom

Semczuk (SMS Foz do Iguaçu), Ricardo Matsuo, Joel Lopes, Luiz Eduardo e Elizeu Silva.

Aos profissionais das Regionais e Secretarias Municipais de Saúde dos municípios

envolvidos (Paranaguá, Itambaracá, Jaguariaíva, Curitiba, Araucária e Foz do Iguaçu), em

especial para as equipes da 6ª Regional de Saúde – União da Vitória e Secretaria Municipal de

Saúde de General Carneiro/PR pelo apoio durante o estudo de 2 anos em General Carneiro.

Aos proprietários das áreas de estudo em todos os municípios de trabalho, em especial

aos de General Carneiro (Fazenda São Zacharias e Madeireira Pizzatto). À Luciano Pizzatto por

ter cedido o espaço e estrutura para montagem do laboratório de campo, além de todas as

facilidades que nos foram concedidas. Agradeço ao apoio de sua equipe: Luciane Dubinski,

Adrineu, Gladys Freitas, Luiza Pizzatto e Amarildo.

À Nathalie Loureiro, aluna de iniciação científica sob minha orientação em parceria com

a Drª Rosana Gentile, pela organização dos dados populacionais dos roedores e contribuição para

a discussão final dos resultados obtidos.

À toda equipe do LHR, em especial Renata Oliveira, Alexandro Guterres, Jorlan

Fernandes e Luciana Mattos, pelo apoio na realização dos testes diagnósticos, pelo aprendizado

em biologia molecular e pelas discussões que tanto contribuíram para o desenvolvimento desta

tese.

À Drª Cibele Rodrigues Bonvicino e toda equipe do Instituto Nacional do Câncer pelo

apoio e orientação na sistemática de roedores, principalmente em técnicas citogenéticas.

Ao Dr. Arnaldo Maldonado Júnior, chefe do Laboratório de Biologia e Parasitologia de

Mamíferos Silvestres Reservatórios, pelo incentivo, discussões e sugestões. À todos os amigos

do LABPMR em especial a Michele Santos, Jonathan Gonçalves, Sócrates Neto e Jeiel Gabrir

pelo apoio nas excursões de campo e na preparação da coleção científica de roedores.

Ao grande amigo Fabiano Fernandes pelo apoio em diversos momentos desta tese, em

especial pela ajuda no sequenciamento de DNA dos roedores infectados por hantavírus.

À Drª Helena Bergallo e Natalie Olifiers pelas contribuições e apoio nas análises

estatísticas de ecologia de comunidades.

À Fabiana Caramaschi pelo apoio na identificação específica dos marsupiais coletados.

À Drª. Marli Maria Lima, minha primeira orientadora na FIOCRUZ, pelo incentivo e por

permitir que eu utilizasse o espaço do seu laboratório nos momentos de reclusão para escrever

esta tese.

À Carolina Valença pela ajuda no sequenciamento de DNA dos roedores infectados por

hantavírus.

vii

À Isabel Homczinski e Poliana Sidol, da Universidade de União da Vitória, pelo apoio na

coleta de dados de micro-habitat e pela identificação das espécies de vegetais das áreas de

estudo.

Às amigas Marlene Burack e Linda Burack, que tornaram nosso ambiente de trabalho em

General Carneiro mais agradável e mais bem nutrido.

Aos amigos André Roque, Vanderson Vaz, Júlio Vilela, Marconny Gerhardt, Pedro

Estrela, Fabiana Rocha, Mario Gatti e Riccardo Mugnai, pelo incentivo, discussões e boas idéias

para o desenvolvimento deste e de outros projetos.

Aos motoristas Jorge Pinto, Jorge Paixão e José Wandique, pela amizade e ajuda em

todas as etapas dos trabalhos de campo.

Aos Professores do Programa de Pós-graduação em Biologia Parasitária pelo

enriquecimento científico nas aulas ministradas durante o curso e aos colegas de curso pela

amizade durante estes quatro anos.

Ao INMET e SIMEPAR pelas informações climáticas das áreas de estudo.

Ao IAP, IBAMA, ICMBIO e administração do Parque Nacional do Iguaçu e Parque

Estadual do Cerrado pelas licenças concedidas e suporte logístico durante as expedições de

campo.

À CAPES, FIOCRUZ e CNPq pelo suporte financeiro sem o qual nada disso seria

possível.

Aos membros da banca pelas contribuições à versão final desta tese.

viii

ESTUDO LONGITUDINAL DA INFECÇÃO POR HANTAVIRUS EM ROEDORES

SILVESTRES NO ESTADO DO PARANÁ

Tese de Doutorado / Bernardo Rodrigues Teixeira

RESUMO

A Síndrome Cardio-Pulmonar por Hantavírus (SPH) é uma zoonose cuja emergência está

relacionada a alterações ambientais que modificam os padrões de riqueza e abundância das

espécies. Nestas situações, espécies de hábitos generalistas/oportunistas podem ser

favorecidas, como é o caso das principais espécies de roedores hospedeiros de hantavírus no

Brasil. Em geral os hantavírus apresentam uma associação específica entre o genótipo viral e a

espécie de roedor hospedeiro, entretanto trabalhos recentes vêm reportando a ocorrência de

spillover em hospedeiros secundários. No Brasil, são conhecidos nove genótipos virais, sendo

cinco associados a roedores e casos de SPH e quatro associados apenas a roedores

hospedeiros. O Estado do Paraná é o 4º em número de casos de SPH no Brasil e o município

de General Carneiro se localiza na região da Floresta Ombrófila Mista, região que concentra a

maioria dos casos do Estado. Este trabalho teve como objetivos: (1) Caracterizar a fauna de

pequenos mamíferos e determinar a taxa de infecção por hantavírus em roedores silvestres em

quatro unidades de paisagem do Estado do Paraná; (2) realizar um estudo das populações de

roedores silvestres e de sua infecção por hantavírus, no município de General Carneiro/PR,

considerando os parâmetros populacionais, as variáveis de micro-habitat e a estrutura das

comunidades, ao longo de dois anos. A identificação taxonômica foi baseada na análise

cariotípica e, quando necessário, pela análise da morfologia craniana. Os espécimes infectados

por hantavírus tiveram sua identificação específica confirmada por sequenciamento do gene

Citocromo b. O diagnóstico de infecção por hantavírus foi realizado através de ensaio

imunoenzimático ELISA, utilizando o antígeno Araraquara, e sequenciamento de DNA. O

levantamento de espécies foi realizado em sete municípios do Estado do Paraná e o estudo

temporal em General Carneiro foi realizado em seis áreas com diferentes graus de

conservação. Foram encontradas no total 14 espécies de roedores e 7 de marsupiais, todas de

ocorrência frequente no Estado do Paraná. As principais espécies hospedeiras foram os

roedores Akodon montensis e Oligoryzomys nigripes, associados aos genótipos virais Jaborá

(JABV) e Juquitiba (JUQV), respectivamente. O grau de conservação das áreas não

influenciou a composição das espécies ou a ocorrência de hantavírus no estudo temporal. As

quatro espécies infectadas (Akodon serrensis, Akodon montensis, Akodon paranaensis,

Oligoryzomys nigripes) apresentaram maiores prevalências de infecção na primavera/verão,

estações com maior atividade reprodutiva, maior quantidade de indivíduos adultos e menores

tamanhos populacionais. Maiores tamanhos populacionais ocorreram no outono/inverno

devido à grande quantidade de indivíduos jovens recrutados. Estes padrões populacionais

foram semelhantes também para Oxymycterus judex e Thaptomys nigrita. No estudo total

foram identificadas infecções spillover em A. montensis/JUQV, O. judex/JUQV, A.

serrensis/JABV, A. paranaensis/JABV e A. paranaensis/JUQV. Estas infecções spillover

ocorrem em períodos de baixa prevalência nos hospedeiros primários, sendo importantes na

manutenção dos genótipos JABV e JUQV no ambiente. A infecção spillover entre A. serrensis

e A. montensis está relacionada a ocupação do micro-habitat por estas espécies. A infecção por

JABV em roedores está relacionada à uma menor abundância de A. serrensis, à presença de

roedores machos adultos e à ocorrência da espécie A. montensis nas áreas de estudo.

ix

LONGITUDINAL STUDY OF HANTAVIRUS RODENT HOSTS IN THE

STATE OF PARANÁ

Tese de Doutorado / Bernardo Rodrigues Teixeira

ABSTRACT

Hantavirus cardio-pulmonary syndrome (HPS) is a zoonosis whose emergence is associated to

habitat disturbance that alter diversity and abundance of natural communities, thereby

favoring generalist/opportunistic rodent species, as is the case of the main species of

hantavirus rodent hosts in Brazil. Each hantavirus genotype is associated predominantly with a

specific rodent host species; however, an increasing number of studies have reported the

occurrence of hantavirus spillover to secondary hosts. Until now, there are nine known viral

genotypes in Brazil, five of them are associated with rodents and HPS cases, and the

remaining are associated with rodent hosts only. The state of Paraná has one of the highest

incidences of HPS in Brazil and the General Carneiro municipality is located in Mixed

Ombrophilous Forest, a biome with the highest incidence of HPS in Paraná. This study

purpose was (1) to conduct a survey of small mammals and their hantavirus infection in the

State of Paraná, southern Brazil; (2) to analyze population dynamics, micro-habitat

associations and community structure of rodent hosts and hantavirus infection over a two-year

period in General Carneiro municipality. All species were identified by karyotyping or cranial

morphology/morphometry. Hantavirus antibody-positive specimens were confirmed by

molecular analysis (amplification of the cytochrome b gene). Serum and tissue samples

obtained from rodents were submitted to IgG enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA),

using N-Araraquara hantavirus recombinant nucleocapsid protein, and DNA sequencing,

respectively. The species survey was conducted in seven counties and the two-year study in

General Carneiro was conducted in six sites with different vegetational types. Fourteen rodent

species and seven marsupial species were captured, all of them considered common species in

Paraná. The main host species were Akodon montensis and Oligoryzomys nigripes associated

with Jaborá Virus genotype (JABV) and Juquitiba virus genotype (JUQV), respectively. The

species composition and the occurrence of hantavirus were not correlated to any vegetation

type in two-year study. A clear pattern of higher hantavirus prevalence in seasons with higher

reproductive activity, greater numbers of adult individuals and lower population size was

observed for the hantavirus infected species (A. serrensis, A. montensis, A. paranaensis, O.

nigripes). Increases in rodent abundance occurred in cooler months with higher numbers of

younger individuals. These population patterns were also similar for Oxymycterus judex and

Thaptomys nigrita. Spillover infections of A. montensis/JUQV, O. judex/JUQV, A.

serrensis/JABV, A. paranaensis/JABV and A. paranaensis/JUQV were observed. The

spillover infections to secondary hosts took place during periods of low prevalence in the

primary host, which suggest that secondary hosts may play an important role for maintaining

JABV and JUQV sylvatic cycles. The spillover infection between A. serrensis and A.

montensis is related to micro-habitat preferences of these species. The JABV infection in

rodents is related to a lower abundance of A. serrensis and the occurrence of adult male

rodents and A. montensis in the study areas.

x

SUMÁRIO

RESUMO ...................................................................................................................... vii

ABSTRACT ................................................................................................................. viii

INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 1

Transmissão para o homem .............................................................................................. 1

Alterações ambientais........................................................................................................ 2

Casos de SPH no Brasil ................................................................................................... 2

Roedores Hospedeiros de Hantavírus ............................................................................... 4

Ecologia de populações de roedores hospedeiros ............................................................ 6

Ecologia de comunidades, efeito diluidor e micro-habitat ............................................... 8

JUSTIFICATIVA ......................................................................................................... 10

OBJETIVOS GERAIS ................................................................................................. 11

MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 12

Estudos de campo ........................................................................................................... 12

Identificação Taxonômica .............................................................................................. 13

Diagnóstico de infecção por hantavirus .......................................................................... 15

CAPÍTULO 1 - Levantamento de espécies de pequenos mamíferos e infecção por

hantavírus em roedores silvestres no Estado do Paraná ........................................... 20

OBJETIVOS .................................................................................................................. 21


RESULTADOS ............................................................................................................. 30

Floresta Ombrófila Mista (Municípios de General Carneiro, Curitiba e Araucária) .... 33

Floresta Ombrófila Densa (Município de Paranaguá) ................................................... 34

Floresta Estacional Semidecidual (Municípios de Itambaracá e Foz do Iguaçu) .......... 34

Remanescentes de Cerrado e Fragmentos Florestais (Município de Jaguariaíva) ........ 36

DISCUSSÃO ................................................................................................................. 37

xi

Riqueza e composição de espécies das áreas estudadas no Estado do Paraná .............. 37

Unidades de Paisagem e Regiões Estudadas .................................................................. 38

Espécies Amostradas e Áreas de Ocorrência .................................................................. 39

Diagnóstico de Infecção por Hantavirus ......................................................................... 42

ARTIGO 1. Short Communication - Phylogenetic characterization of hantaviruses

from wild rodents and hantavirus pulmonary syndrome cases in the state of

Paraná (southern Brazil) ............................................................................................... 44

Abstract ............................................................................................................................ 44

ARTIGO 2. Hantavirus infection prevalence in wild rodents and human anti-

hantavirus serological profiles from different geographic areas of South Brazil ... 50

Abstract ............................................................................................................................ 50

Introduction ..................................................................................................................... 50

Material and Methods ..................................................................................................... 50

Results .............................................................................................................................. 51

Discussion ........................................................................................................................ 54

CAPÍTULO 2 - Ecologia de populações de roedores silvestres e dinâmica temporal

de infecção por hantavírus, no município de General Carneiro, sul do Estado do

Paraná ............................................................................................................................ 58

ARTIGO 3. Population ecology of hantavirus rodent hosts in Southern Brazil ..... 60

Abstract ............................................................................................................................ 61

Introduction ..................................................................................................................... 61

Material and Methods ..................................................................................................... 63

Results .............................................................................................................................. 65

Discussion ........................................................................................................................ 67

ANEXO ........................................................................................................................... 85

CAPÍTULO 3 - Ecologia de comunidades de roedores hospedeiros de hantavírus,

no município de General Carneiro, sul do Estado do Paraná ................................... 89

OBJETIVOS .................................................................................................................. 90


Área de estudo ................................................................................................................. 90

Desenho Amostral e Esforço de Captura ........................................................................ 97

xii

Estudo do Micro-habitat .................................................................................................. 98

Análise de parâmetros de comunidades ........................................................................ 100

Análise de parâmetros da infecção por hantavírus ....................................................... 101

RESULTADOS ........................................................................................................... 102

Classificação das áreas de estudo ................................................................................. 102

Comunidades de pequenos mamíferos .......................................................................... 103

Estudo do Micro-habitat ................................................................................................ 105



DISCUSSÃO ............................................................................................................... 110

Comunidades de pequenos mamíferos .......................................................................... 110


Estudo do Micro-habitat ................................................................................................ 113

Co-ocorrência de espécies ............................................................................................. 114


CONCLUSÕES ........................................................................................................... 117

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 118

xiii

LISTA DE FIGURAS

INTRODUÇÃO

Figura 1. Número de casos de SPH no Estado do Paraná entre 1999 e 2013 .................... 3

Figura 2. Distribuição de casos de hantavirose no Estado do Paraná. ............................... 4

CAPÍTULO 1

Figura 1.1. Localização dos municípios de coleta no estudo de levantamento de espécies

hospedeiras de hantavírus ................................................................................................ 23

Figura 1.2. Áreas estudadas no município de General Carneiro/PR .............................. 26

Figura 1.3. Áreas estudadas no município de Paranaguá/PR ......................................... 26

Figura 1.4. Áreas estudadas no município de Itambaracá/PR. ........................................ 27

Figura 1.5. Áreas estudadas no município de Foz do Iguaçu/PR ................................... 27

Figura 1.6. Áreas estudadas no município de Jaguariaíva/PR . ....................................... 28

Figura 1.7. Áreas estudadas na zona metropolitana da capital do Estado do Paraná ..... 29

Figura 1.8. Aspecto geral das áreas estudadas ................................................................. 30

Figura 1.9. Abundância relativa das espécies de pequenos mamíferos capturadas nas

unidades de paisagem do Estado do Paraná ................................................................... 32

ARTIGO 1. Figure 1. Maximum-likelihood tree based on a 312 nt alignment of the S

segment, depicting phylogenetic relationships among hantavirus sequences from Paraná,

southern Brazil, and a reference panel of sequences obtained from GenBank ............... 46

ARTIGO 1. Figure 2. Maximum-likelihood trees depicting phylogenetic relationships

between the ARAUV complete segment M sequence ..................................................... 47

ARTIGO 2. Figure 1. State of Paraná, Brazil ................................................................ 51

ARTIGO 2. Figure 2. Bayesian phylogenetic analysis of partial S segment sequences

from rodents captured in different Paraná localities ....................................................... 54

ARTIGO 2. Figure 3. Bayesian phylogenetic analysis of partial S segment sequences

from rodents captured in different Paraná localities ....................................................... 55

CAPÍTULO 2

ARTIGO 3. Figure 1. General Carneiro municipality, State of Paraná, southern Brazil

........................................................................................................................................ 82

xiv

ARTIGO 3. Figure 2. Climatic diagram of the study area obtained from December 2009

to December 2011 ........................................................................................................... 82

ARTIGO 3. Figure 3. Population sizes, proportion of reproducing females and

prevalences of hantavirus infection ................................................................................. 83

ARTIGO 3. Figure 4. Age structure ............................................................................... 84

ANEXO. Figura 5. Relações filogenéticas dos hantavírus, inferidas por análise

Bayesiana, implementado na ferramenta Mr. Bayes 3.1.2, comparando 380 nucleotídeos

do segmento S da região codificante do nucleocapsídeo ................................................ 86

ANEXO. Figura 6. Expansão do clado Jaborá Virus (JABV) ....................................... 87

ANEXO. Figura 7. Expansão do clado Juquitiba Virus (JUQV) ................................... 88

CAPÍTULO 3

Figura 3.1. Áreas estudadas no período 2009-2011, no município de General

Carneiro/PR: Araucárias, Alagado, Bomba, RPPN, Escadaria e São Zacharias ............ 91

Figura 3.2. Detalhe das áreas Araucárias e Alagado, no município de General

Carneiro/PR .................................................................................................................... 91

Figura 3.3. Detalhe das áreas Bomba, RPPN e Escadaria, no município de General

Carneiro/PR ................................................................................................................... 92

Figura 3.4. Detalhe da área São Zacharias, no município de General Carneiro/PR ........ 92

Figura 3.5. Áreas amostradas no estudo realizado entre 2009 e 2011 no município de

General Carneiro/PR ....................................................................................................... 97

Figura 3.6. Gráfico NMDS (Escalonamento multidimensional) indicando a similaridade

entre as áreas estudadas de acordo com as variáveis da paisagem ................................ 103

Figura 3.7. Gráfico NMDS (Escalonamento multidimensional) indicando a similaridade

entre as áreas estudadas de acordo com a abundância das espécies .............................. 108

Figura 3.8. Prevalência de infecção por JABV e prevalência total de infecção por

hantavírus de acordo com a abundância de A. serrensis em cada área de estudo ......... 108

xv

LISTA DE TABELAS

INTRODUÇÃO

Tabela 1. Genótipos de hantavírus de ocorrência no Brasil, com seus respectivos

roedores hospedeiros e distribuição geográfica ................................................................. 5

CAPÍTULO 1

Tabela 1.1. Informações gerais sobre o levantamento de espécies de pequenos

mamíferos no Estado do Paraná, com descrição das áreas de estudo ............................. 22

Tabela 1.2. Espécies de pequenos mamíferos coletadas no Estado do Paraná, de acordo

com as unidades de paisagem estudadas ........................................................................ 31

Tabela 1.3. Pequenos mamíferos coletados em áreas de Floresta Ombrófila Mista

(Floresta com Araucárias), nos municípios de General Carneiro, Curitiba e Araucária,

Estado do Paraná ............................................................................................................. 33

Tabela 1.4. Pequenos mamíferos coletados em áreas de Floresta Estacional

Semidecidual, nos municípios de Itambaracá e Foz do Iguaçu, Estado do Paraná ......... 35

Tabela 1.5. Pequenos mamíferos coletados no Parque Estadual do Cerrado e em

fragmentos florestais nos arredores, no município de Jaguariaíva, Estado do Paraná ... 36

ARTIGO 1. Table 1. Brazilian hantaviruses and their putative reservoirs ..................... 45

ARTIGO 2. Table 1. Small mammals captured in State of Paraná, Southern Brazil,

2006–2009 ....................................................................................................................... 52

ARTIGO 2. Table 2. Collection locations, numbers of small mammals captured, rodent

seroprevalence, positive species, hantavirus genotype, and human seroprevalence ...... 53

CAPÍTULO 2

ARTIGO 3. Table 1. Species prevalence, sex and hantavirus genotype of infected

specimens (seropositives and PCR confirmed) .............................................................. 81

CAPÍTULO 3

Tabela 3.1. Características gerais das seis áreas de estudo em General Carneiro/PR .... 94

Tabela 3.2. Porcentagem de cada variável da paisagem e índices de heterogeneidade e

complexidade presentes em cada uma das seis áreas de estudo ................................... 102

xvi

Tabela 3.3 – Número total de animais capturados por espécie em cada área de estudo em

General Carneiro/PR, de dezembro de 2009 a dezembro de 2011 ............................... 104

Tabela 3.4 – Índices de heterogeneidade e complexidade em cada uma das seis áreas de

estudo, do município de General Carneiro/PR ............................................................. 105

Tabela 3.5. Análise de co-ocorrência entre A. serrensis e A. montensis no município de

General Carneiro/PR ...................................................................................................... 106

Tabela 3.6. Análise de co-ocorrência, entre as espécies capturadas no município de

General Carneiro/PR ...................................................................................................... 107

Tabela 3.7. Modelo descritivo de ocorrência de hantavírus na região de estudo, baseado

em seleção stepwise e no Critério de Informação de Akaike (AIC) ............................. 109

1

INTRODUÇÃO

Zoonoses são doenças transmitidas naturalmente ao homem a partir de infecções que

circulam entre animais (OMS 2011). Mais de 60% dos patógenos que afetam a saúde humana

são de origem zoonótica, sendo em sua grande maioria de origem viral (Woolhouse &

Gowtage-Sequeria 2005). Estima-se ainda que pelo menos 320 mil vírus desconhecidos

estejam associados a mamíferos como hospedeiros (Anthony et al. 2013). Uma das principais

zoonoses, de ampla distribuição em todo o mundo, é a hantavirose, cuja transmissão é

associada principalmente a roedores silvestres e sinantrópicos de diferentes espécies, embora

o vírus tenha sido associado também a musaranhos (Superordem Insectivora) (Arai et al.

2007, Kang et al. 2009) e morcegos (Guo et al. 2013). A hantavirose é causada por um vírus

do gênero Hantavírus, família Bunyaviridae, que pode acarretar duas formas clínicas

distintas: a Febre Hemorrágica com Síndrome Renal (FHSR) e a Síndrome Pulmonar por

Hantavírus (SPH), também conhecida como Síndrome Cardio-Pulmonar por Hantavírus. A

primeira, com ocorrência na Europa e Ásia, reconhecida desde 1930 (Lee et al. 1978, Ruo et

al. 1994, Olsson et al. 2010, Reusken & Heyman 2013) e a segunda, com ocorrência nas

Américas, tem sido registrada desde 1993 (Nichol et al. 1993, Hjelle et al. 1994). No Brasil,

durante o mesmo ano, a SPH foi registrada em casos ocorridos no interior de São Paulo (Silva

et al. 1997). A SPH apresenta-se, de uma forma geral, como doença febril aguda caracterizada

pelo grave comprometimento cardiovascular e respiratório, com um período de incubação que

varia entre 9 a 33 dias (média de 14 a 17 dias) (Jonsson et al. 2010).

Transmissão para o homem

A transmissão dos hantavírus para o homem ocorre de maneira acidental,

principalmente pela inalação de partículas virais presentes em aerossóis de excretas de

roedores silvestres infectados (Lednicky 2003). Outras vias de infecção menos frequentes já

documentadas são através de mordeduras de roedores infectados, além da infecção por

contato pessoa-pessoa pelo vírus Andes, documentada na Argentina (Padula et al. 1998, Enria

& Levis 2004).

A transmissão é facilitada pelo contato com roedores, como ocorre em áreas rurais,

principalmente em locais fechados como galpões para armazenamento de grãos, depósitos de

fazendas, e habitações construídas próximas a ambientes silvestres. Em locais fechados pode

ocorrer uma concentração de aerossóis com partículas virais, tornando este ambiente um local

2

de risco. Assim, quaisquer atividades realizadas nestes ambientes, como por exemplo limpeza,

demolições ou remoção de grãos, constituem fatores de risco para a transmissão desta doença

(Zeitz et al. 1995, Mills et al. 2002).

Alterações ambientais

A emergência de SPH, assim como outras zoonoses, tem sido relacionada a situações

de perturbações ambientais que em geral resultam na formação de mosaicos de paisagem

entre remanescentes de mata nativa e áreas de atividade rural ou de ocupação humana. Estas

alterações ambientais causadas pelas atividades humanas têm alterado os padrões de riqueza

(redução e perda de espécies) e abundância das espécies, que por sua vez influenciam na

dinâmica natural de transmissão de ciclos silvestres de parasitas (Kruse et al. 2004, Mills

2006). Nestas situações, em habitats alterados, poucas espécies de animais

(generalistas/oportunistas) são frequentemente favorecidas, possibilitando o incremento de

suas densidades e a dispersão para áreas rurais e de interface entre o ambiente silvestre e

ambientes peridomiciliares (Mills 2006), resultando em uma maior probabilidade de contato

entre populações humanas e parasitos antes restritos aos ciclos silvestres (Fayer 2000, Daszak

et al. 2000). Se estas espécies favorecidas forem as mais competentes para a transmissão

destes parasitas, poderá haver uma maior eficiência da transmissão, aumentando as taxas de

prevalência entre as espécies vetoras e/ou hospedeiras e, por consequência, maior risco de

transmissão a seres humanos. Por outro lado, em ambientes com uma maior diversidade de

espécies (vetores e hospedeiros), o ciclo de transmissão pode ocorrer entre hospedeiros muito

competentes, menos competentes, ou mesmo não-competentes (espécies que não são capazes

de retransmitir o vírus e que são chamadas de “dead-ends”), controlando a dispersão do

parasito (“efeito diluidor”) (Schmidt & Ostfeld 2001, Ostfeld & Keesing 2012). De fato, no

caso dos hantavírus no Brasil, as principais espécies hospedeiras vêm sendo descritas como

espécies de hábitos generalistas/oportunistas, como os roedores Oligoryzomys nigripes e

Necromys lasiurus (Suzuki et al. 2004, Dalmagro & Vieira 2005, Rocha et al. 2011).

Casos de SPH no Brasil

Nesse cenário, a SPH apresenta-se como uma das principais doenças infecciosas

emergentes da atualidade no Brasil devido a sua alta taxa de mortalidade, alta morbidade, e de

3

crescente ocorrência em praticamente todo o território nacional e ausência de medicação

específica.

No Brasil, desde os primeiros registros em 1993 até maio de 2013, 1640 casos de SPH

foram confirmados pelo Ministério da Saúde, com ampla distribuição entre a maioria dos

estados brasileiros e alta taxa de letalidade (aproximadamente 40%; 653 óbitos) (Ministério

da Saúde, 2013). Região Sul (583 casos /190 óbitos): Rio Grande do Sul (101/42), Santa

Catarina (264/73), Paraná (218/75); Região Sudeste (468/209): Minas Gerais (278/108), São

Paulo (190/101); Região Centro-Oeste (412/171): Mato Grosso (248/97), Distrito Federal

(88/35), Goiás (75/38), Mato Grosso do Sul (1/1); Região Nordeste (14/8): Maranhão (11/5),

Rio Grande do Norte (2/2), Bahia (1/1); e Região Norte (101/45): Pará (91/42), Amazonas

(6/2), Rondônia (4/1); Identidade ignorada (63/30).

O Estado do Paraná, região de estudo desta tese, é o 4º em número de casos de SPH no

Brasil, sendo o primeiro caso registrado em 1999. Até o momento 218 casos com 75 óbitos

foram registrados (Figura 1), principalmente na região centro sul do Estado (Figura 2), região

de distribuição da Floresta Ombrófila Mista.

Figura 1. Número de casos de SPH no Estado do Paraná entre 1999 e 2013 (Barras escuras:

número de casos que vieram a óbito; Barras claras: número de casos não letais). Dados

cedidos pela Secretaria de Saúde do Estado do Paraná.

4

Figura 2. Distribuição de casos de hantavirose no Estado do Paraná. Fonte: Secretaria de

Saúde do Estado do Paraná

Roedores Hospedeiros de Hantavírus

A transmissão dos hantavírus entre os roedores se dá pela transmissão horizontal,

através de encontros agonísticos ou através da inalação de aerossóis contaminados (Mills et

al. 1999). A presença de cicatrizes em roedores infectados, particularmente nos machos, vem

sendo utilizada como um indicativo indireto de encontros agonísticos entre roedores (Glass et

al. 1988, Calisher et al. 1999, Hinson et al. 2004, Pereira et al. 2007), reforçando a

importância da transmissão mecânica por mordidas e agressões. A transmissão vertical não

tem sido observada, possivelmente pela proteção pós-natal oferecida por anticorpos maternos

nos roedores neonatos (Kallio et al. 2006, 2010).

Em geral os hantavírus apresentam uma associação específica entre o genótipo viral e

a espécie de hospedeiro, devido provavelmente a um processo de co-divergência (Plyusnin et

al. 1996, Jackson & Charleston 2004). Mais de 40 genótipos de hantavírus foram

reconhecidos no continente Americano, sendo a maioria descritos na América do Sul, muitos

comprovadamente causadores da SPH e associados a diferentes espécies de roedores (Hjelle

& Torres-Pérez 2010). Todos os hantavírus que causam SPH no Brasil estão ligados a

roedores da subfamília Sigmodontinae, apresentando uma associação entre o genótipo viral e

a espécie de roedor.

5

No Brasil, são conhecidos até o momento nove genótipos virais, sendo cinco

associados a casos de SPH (Tabela 1): Vírus Juquitiba (JUQV) Vírus Araraquara (ARAV),

Vírus Laguna Negra-like (LNV), Vírus Castelo dos Sonhos (CASV) e Vírus Anajatuba

(ANAJV). Quatro outros genótipos virais foram descritos apenas em roedores não tendo sido

associados à infecção humana no Brasil: Vírus Seoul (SEOV), Vírus Rio Mearim (RIMEV),

Vírus Rio Mamoré (RMV) e Vírus Jaborá (JABV). Entretanto SEOV e RMV são associados à

infecção humana em outros países (Chan et al. 1987, Casapia et al. 2012). Evidências

sorológicas, porém sem detecção e caracterização molecular, foram também encontradas em

Calomys tener, Oxymycterus rutilans (Suzuki et al. 2004), Sooretamys angouya (Oliveira et

al. 2011) e Akodon cursor (Sobreira et al. 2008).

Tabela 1. Genótipos de hantavírus de ocorrência no Brasil, com seus respectivos roedores

hospedeiros e distribuição geográfica.

Genótipo Viral Reservatório primário Distribuição no Brasil Referência

Juquitiba Oligoryzomys nigripes Mata Atlântica

(Sul e Sudeste)

Suzuki et al. 2004,

Raboni et al. 2005

Araraquara Necromys lasiurus Cerrado

(Brasil Central e Sudeste)

Suzuki et al. 2004

Laguna Negra Calomys callidus Transição Cerrado e

Amazônia

(restrito ao Mato Grosso)

Raboni et al. 2009a,

Rosa et al. 2012

Castelo dos

Sonhos

Oligoryzomys

utiaritensis

Amazônia e Transição

com o Cerrado

(Pará e Mato Grosso)

Johnson et al. 1999,

Rosa et al. 2011,

Agrellos et al. 2012

Anajatuba Oligoryzomys fornesi Áreas de baixada da

Amazônia (Maranhão)

Rosa et al. 2005

Seoul Rattus norvegicus Amazônia (Pará) Leduc et al. 1985,

Xiao et al. 1992

Rio Mearim Holochilus sciureus Áreas de baixada da

Amazônia (Maranhão)

Rosa et al. 2005

Rio Mamore Oligoryzomys microtis Amazônia

(Amazonas e Rondônia)

Firth et al. 2012

Jaborá Akodon montensis Mata Atlântica

(Região Sul)

Oliveira et al. 2011

Apesar do conceito geral de co-divergência e especificidade entre genótipo viral e

espécie de hospedeiro, recentes estudos colocam em discussão a hipótese de co-divergência

entre sigmodontíneos e hantavírus considerando as taxas de evolução mais rápidas dos vírus

(Ramsden et al. 2008). Da mesma forma, a especificidade da relação hantavirus-hospedeiro

vem também sendo reavaliada considerando os frequentes spillovers encontrados em

6

hospedeiros secundários (Hjelle & Torres-Pérez 2010). O termo spillover se refere à infecção

de um ou mais hospedeiros secundários por um genótipo viral associado à outra espécie

(hospedeiro primário).

No Brasil a ocorrência de spillover foi observada no roedor Calomys callidus

infectado pelo vírus Laguna Negra (LNV) (Rosa et al. 2012), cujo hospedeiro primário é

Calomys laucha identificado no Paraguai (Johnson et al. 1997). A espécie Calomys callosus

também foi encontrada infectada por LNV na Bolivia (Carroll et al. 2005). Neste caso, como

C. callosus e C. laucha não apresentam sobreposição na sua distribuição geográfica, os

autores sugerem que LNV infectava o ancestral comum destas espécies e permaneceu

associada a ambas. O vírus Anajatuba foi também encontrado em outra espécie (N. lasiurus)

que não o seu reservatório primário (O. fornesi), bem como o vírus Araraquara, cujo

reservatório primário é N. lasiurus, reportado nos roedores A. montensis, O. nigripes,

Thaptomys nigrita e Juliomys sp. e Oryzomys sp. (Figueiredo et al. 2009, Araujo et al. 2011),

além de espécies de marsupiais (Micoureus paraguayanus, Monodelphis iheringi e Didelphis

aurita) e morcegos (Diphylla ecaudata, Diphylla ecaudata e Anoura caudifer) (Araujo et al.

2012). Entre os genótipos virais distribuídos na região da Mata Atlântica, JABV foi reportado

associado a A. paranaensis (Oliveira et al. 2012) e JUQV a O. nasutus no Uruguai (Delfraro

et al. 2008), bem como a Oligoryzomys fornesi e Oryzomys sp. no Paraguai (Chu 2009).

Entretanto poucas informações a respeito da ecologia e história natural deste tipo de infecção

estão disponíveis (Jonsson et al. 2010).

Ecologia de populações de roedores hospedeiros

Apesar da grande riqueza de espécies de roedores, dos diversos genótipos virais

descritos e das frequentes ocorrências de spillovers, estudos de hantavírus no Brasil são em

geral pontuais identificando os padrões de infecção momentâneos relacionados, geralmente, à

emergência de casos humanos em alguma localidade, não levando em consideração a

dinâmica temporal dos ciclos de transmissão entre vírus-hospedeiro. Estudos de longo prazo

são fundamentais para se compreender os padrões estacionais da infecção nas comunidades e

populações de roedores hospedeiros. Assim, dados relativos à infecção como, caracterização

de genótipos virais, especificidade parasita-hospedeiro e variação das taxas de infecção

podem ser associados aos dados climáticos (Donalisio & Peterson 2011, Oliveira 2013) e/ou

populacionais como época reprodutiva, picos populacionais, deslocamentos, recrutamento e

densidade, esclarecendo aspectos da dinâmica temporal do ciclo de transmissão (Boone et al.

7

1998, Mills et al. 1999, 2007, Yahnke et al. 2001, Suárez et al. 2003, Owen et al. 2010, Piudo

et al. 2011, Vadell et al. 2011, Palma et al. 2012).

No Brasil, estudos com pequenos mamíferos têm elucidado muitos aspectos da

ecologia de populações de roedores sigmodontíneos, em áreas de Mata Atlântica (Cerqueira et

al. 1993, D’Andrea et al. 1999, 2007, Gentile et al. 2000, Feliciano et al. 2002, Bonecker et al.

2009, Antunes et al. 2010), e particularmente em áreas de Floresta Ombrófila Mista (Feliciano

et al. 2002, Cademartori et al. 2004, 2005, Galiano et al. 2013). De maneira geral, a

reprodução de muitas espécies de sigmodontíneos parece ocorrer de forma continuada ao

longo de todo o ano nas regiões de Mata Atlântica, com picos em determinadas épocas. Em

regiões do sul e sudeste do Brasil, estudos determinaram o pico das populações de algumas

espécies de sigmodontíneos (como Oligoryzomys nigripes, Akodon montensis e Akodon

cursor), ocorrendo nas épocas de junho-agosto, indicando um pico de atividade reprodutiva

no final do verão (Gentile et al. 2000, Cademartori et al. 2004, Galiano et al. 2013). A redução

da atividade reprodutiva no período de inverno está relacionada ao aumento de indivíduos

jovens na população (aumento da população) (Fonseca & Kierulff 1989, Pereira et al. 1993,

Gentile et al. 2000, Cademartori et al. 2004). A atividade reprodutiva continuada em regiões

de Mata Atlântica é atribuída a estabilidade na disponibilidade de recursos e de habitats

durante o ano (Fonseca & Kierulff 1989, Gentile et al. 2000).

A fauna de pequenos mamíferos do Estado do Paraná, em particular roedores

sigmodontíneos, é bastante diversificada, tendo sido registradas aproximadamente 25 espécies

deste grupo de roedores no Estado (Tiepolo 2007). Esta riqueza está relacionada ao fato de o

Paraná possuir diferentes unidades de paisagem (Floresta Ombrófila Densa, Floresta

Ombrófila Mista, Floresta Estacional Semidecidual, Cerrado, Campos Gerais), em diferentes

altitudes, algumas com espécies endêmicas ou ameaçadas (Boldrini 2009, Ribeiro & Vieira

2012). Particularmente, a fauna de mamíferos da região da Floresta Ombrófila Mista

representa 24% do total de espécies de mamíferos do Brasil, apresentando uma alta riqueza de

espécies considerando a sua extensão (Ribeiro & Vieira 2012).

Características gerais da biologia dos sigmodontíneos como rápida maturação sexual,

curto período de gestação, grande tamanho das ninhadas e a ocorrência de estro pós-parto

permitem que explosões populacionais ocorram em determinados períodos de oferta

abundante e eventual de recursos, fenômeno conhecido como “ratada”. No Brasil, algumas

ratadas foram relacionadas a ciclos sincronizados de floração e frutificação de espécies de

taquaras (bambus) que podem ter intervalos com reprodução assexuada de até 30 anos

aproximadamente (Jaksic & Lima 2003). Ao final do ciclo reprodutivo das taquaras e da

8

oferta extraordinária de sementes, as superpopulações de roedores acabam se deslocando e

ocupando áreas peridomiciliares e rurais como plantações e depósitos de grãos (Oliveira

2013). Este fenômeno foi considerado como um dos possíveis fatores determinantes do

primeiro surto de SPH ocorrido no Brasil, no município de Juquitiba/SP (Silva et al. 1997).

Quanto aos estudos que associam dados populacionais dos roedores hospedeiros aos

dados de infecção por hantavírus no Brasil, Oliveira (2012) teve como foco o monitoramento

ao longo de 3 anos destas populações no município de Jaborá/SC, localizado na região de

Floresta Ombrófila Mista de Santa Catarina. Foram determinados os padrões de flutuação

populacional das principais espécies de roedores hospedeiros (A. montensis e O. nigripes) e a

dinâmica da infecção por hantavírus ao longo de três anos. Ambas espécies apresentaram

padrão de reprodução nos meses mais quentes e aumento dos tamanhos populacionais nos

meses de inverno, entretanto O. nigripes apresentou maiores prevalências de infecção no

período primavera-verão e A. montensis teve maiores prevalências na primavera (no primeiro

ano do estudo) e no inverno (no último ano do estudo). Da mesma forma Limongi (2013), em

estudo de um ano no Cerrado do município de Uberlândia, Minas Gerais, determinou maiores

tamanhos populacionais no mês de agosto e maior prevalência no mês de novembro. Pereira

et al. (2007) em estudo relacionado à vigilância epidemiológica em várias áreas de ocorrência

de SPH no sul e sudeste do Brasil, observou maior prevalência de infecção em roedores

machos adultos e com presença de cicatrizes, determinando maiores prevalências no inverno e

verão para N. lasiurus (ARAV) e na primavera para O. nigripes (JUQV).

Ecologia de comunidades, efeito diluidor e micro-habitat

Além dos estudos populacionais, estudos de comunidades de roedores, comparando

áreas com diferentes graus de preservação são importantes para se determinar os padrões de

associação das espécies à diferentes paisagens e habitats (Mills et al. 1997, Calderón et al.

1999, Ruedas et al. 2004, Goodin et al. 2006, Armién et al. 2009, Voutilainen et al. 2012,

Andreo et al. 2012). Alguns exemplos de áreas com diferentes gradientes de preservação são

áreas de agricultura, bordas de remanescentes florestais e áreas de mata contínua, as quais

podem representar diferentes situações eco-epidemiológicas em uma mesma região.

Alguns estudos reportam uma relação entre a infecção por hantavírus e a riqueza e

abundância das espécies através do efeito diluidor, de modo que áreas com alta riqueza de

espécies em geral apresentam menor prevalência de infecção nas espécies hospedeiras devido

a uma maior pressão de competição (Mills 2006, Peixoto & Abramson 2006). Desta forma,

9

em situações de baixa diversidade de espécies há uma diminuição ou extinção de espécies

competidoras ou predadoras (Terborgh et al. 2001, Mills 2006). Assim, a abundância dos

hospedeiros de hantavírus (em geral, espécies de hábitos generalistas) tende a aumentar,

aumentando assim a probabilidade de encontros intraespecíficos, consequentemente levando a

uma maior probabilidade de transmissão (Tersago et al. 2008, Suzán et al. 2009, Clay et al.

2009, Dizney & Ruedas 2009, Dearing & Dizney 2010).

Outro aspecto importante dos estudos de roedores hospedeiros é a análise do habitat

das espécies. Os padrões de ocupação do habitat estão associados à coexistência de espécies e

a estruturação das comunidades, estando relacionados à ocorrência de competição

interespecífica (Alho 2005). Além disso, a complexidade e a heterogeneidade do habitat

podem influenciar diretamente na riqueza e abundância das espécies, de modo que ambientes

mais complexos e heterogêneos podem oferecer uma maior variedade de habitats potenciais

do que ambientes mais simples (Fahrig & Paloheimo 1988, Gentile & Fernandez 1999).

A epidemiologia da SPH está portanto também relacionada à ecologia dos roedores

hospedeiros, sendo as infecções por hantavírus associadas não somente a fatores

populacionais e de comunidades, mas também a parâmetros climáticos e de micro-habitat.

10

JUSTIFICATIVA

O Estado do Paraná é o quarto Estado do Brasil em número de casos de SPH e até o

início deste estudo não havia sido realizado um levantamento abrangente das principais

espécies de roedores hospedeiros no Estado e dos principais genótipos virais associados. Estas

lacunas de conhecimento foram abordadas e os conhecimentos gerados estão apresentados no

capitulo 1 e nos artigos em anexo.

Desta forma, a partir dos resultados apresentados no Capítulo 1 desta tese, foi

direcionado um estudo temporal (2 anos) no município de General Carneiro, localizado na

região da Floresta Ombrófila Mista (Floresta com Araucárias), região que concentra a maioria

dos casos de SPH do Estado. A Floresta com Araucárias vem sofrendo ações antropogênicas,

tais como a introdução de espécies exóticas a partir do avanço de culturas de Pinus e

construções de hidrelétricas (Boldrini, 2009). General Carneiro é o segundo município em

número de casos no Estado (26 casos). Os casos de SPH em General Carneiro estão

relacionados principalmente a trabalhadores rurais cujas atividades são o plantio e manejo de

Pinus elliotti e Pinus taeda. Considerando que neste município a ocorrência de casos era

constante desde o primeiro caso em 1999 até 2006, fica evidente a manutenção do ciclo

silvestre pelos hospedeiros vertebrados nesta área e o risco potencial de infecção humana.

Os estudos prévios realizados neste município indicaram a ocorrência de infecções

spillover além das associações esperadas vírus-hospedeiro, demonstrando que várias espécies

participam do ciclo do hantavírus nesta região. Estudos temporais podem fornecer

informações acerca da ecologia dos hospedeiros e padrões relacionados às flutuações nas suas

taxas de infecção, de suma importância para a compreensão dos ciclos silvestres desta

zoonose e determinantes para o risco da ocorrência de casos humanos.

Os dados gerados nesta tese são importante fonte de informação não só para a

vigilância epidemiológica da SPH no Estado do Paraná, como também contribuem para a

compreensão dos processos envolvidos na dinâmica dos ciclos silvestres de hantavírus, além

de incrementar o conhecimento da fauna de pequenos mamíferos e sua ecologia.

11

OBJETIVOS GERAIS

(1) Caracterizar a fauna de pequenos mamíferos e determinar suas taxas de infecção por

hantavírus e os genótipos virais associados em quatro unidades de paisagem do Estado do

Paraná

(2) Realizar um estudo das populações de roedores silvestres e de sua infecção por hantavírus,

no município de General Carneiro/PR, considerando os parâmetros populacionais, as

variáveis de habitat e a estrutura das comunidades, ao longo de dois anos.

12

MATERIAL E MÉTODOS

Os procedimentos descritos neste item se referem à metodologia geral, comum a todos

os três capítulos da tese, e estão relacionadas aos procedimentos de captura de pequenos

mamíferos e coleta de amostras, a saber: armadilhas e isca utilizadas, coleta de amostras para

diagnóstico de infecção por hantavirus, coleta de dados bionômicos e reprodutivos,

preservação de material testemunho, identificação taxonômica e diagnóstico de infecção por

hantavírus.

Estudos de campo

Em cada município foram estabelecidos entre 10 e 16 transectos, variando de 5 a 20

estações de captura. Em cada transecto foram utilizadas armadilhas de alumínio (modelo

Sherman) média (7,62cm x 9,53cm x 30,48cm) e adicionalmente, armadilhas aramadas

(modelo Tomahawk) de 40,64cm x 12,70cm x 12,70cm. Como isca foi utilizada uma pasta

composta por uma mistura de paçoca de amendoim, banana, aveia e bacon.

Os animais capturados foram removidos dos transectos, para uma base laboratorial de

campo. Como anestésico foi utilizado Dopalen

injetável (cloridrato de Ketamina), com dose

de 60mg por quilo de massa corpórea, por via intramuscular, de acordo com orientação

veterinária. Após a coleta de amostras de sangue para diagnóstico sorológico de infecção por

hantavírus, os animais foram eutanasiados para coleta das seguintes amostras: medula do

fêmur para confirmação taxonômica dos roedores por técnica citogenética; amostras de fígado

preservadas em etanol e armazenadas a -20°C, para identificação taxonômica através de

sequenciamento de DNA dos roedores infectados e posteriores estudos filogenéticos; e

fragmentos de vísceras (rim, fígado, baço, pulmão e coração) armazenados criogenicamente,

para confirmação da infecção viral por diagnóstico molecular.

Todos os animais foram pesados, medidos (corpo, cauda, pata e orelha) e verificados

quanto ao sexo e atividade reprodutiva. A atividade reprodutiva foi constatada pela ocorrência

de lactação e/ou gestação nas fêmeas de roedores, e pela presença de filhotes na bolsa dos

marsupiais ou pelo intumescimento das tetas indicando presença de leite e desmame recente.

Todos os procedimentos de coleta de amostras, de dados biológicos e bionômicos

foram realizados no laboratório de campo e utilizando-se equipamentos de proteção individual

com nível de biossegurança 3 (jaleco, capuz fechado, traquéia para condução do ar, unidade

turbo e filtro de ar motorizado de alta eficiência, para coleta de material biológico). As

13

expedições de coleta foram realizadas sob a Licença Permanente para coleta de material

zoológico n° 13373 IBAMA/ICMBIO/SISBIO e seguem protocolo aprovado pela Comissão

de Ética no Uso de Animais da Fundação Oswaldo Cruz, Licença nº L-049/08 CEUA-

FIOCRUZ.

Todos os animais eutanasiados foram preservados em álcool 70% ou foram

taxidermizados e seus esqueletos preparados para, ao término dos estudos, serem depositados

como material testemunho na coleção científica zoológica do Museu Nacional, UFRJ.

Identificação Taxonômica

A identificação taxonômica foi baseada inicialmente na morfologia externa. Desta

forma, todos os espécimes coletados foram identificados em nível de gênero, sendo possível

apenas para algumas espécies a identificação em nível específico. A identificação específica

da maioria das espécies só é possível através da análise cariotípica por técnicas citogenéticas

e, quando necessário, pela análise da morfologia craniana e técnicas moleculares.

A técnica de cariotipagem visa determinar o número cromossômico diplóide e

fundamental, com objetivo de descrever e associar cada complemento cromossômico à

espécie confirmando a identificação morfológica. A metodologia é aplicada segundo

(Bonvicino 2011): As células em suspensão são obtidas por cultura de medula óssea por 2

horas a 37ºC realizadas em campo com meio estéril previamente preparado em tubos de

prolipropileno de 15 ml contendo RPMI1640 (80%), soro bovino fetal (20%), colchicina (10-

6M) e brometo de etídio (5ug/ml). Após incubação os tubos foram centrifugados por 5-10

minutos e re-suspendido em 10 ml de solução hipotônica fresca (KCl 0,075M). Após 30

minutos de hipotonização à temperatura ambiente uma fixação inicial foi feita adicionando 1

ml de Carnoy fresco (3 Metanol:1 Ácido Acético) na solução hipotônica, seguido de

centrifugação por 5-10 minutos. O material foi então fixado em 10 ml de Carnoy para

posterior processamento em laboratório. No laboratório, amostras das células em suspensão

são preparadas em lâminas e coradas com Giemsa (4%) em tampão fosfato. Após a

preparação das lâminas as imagens das metáfases são obtidas via microscópio óptico acoplado

com câmara digital. Após a obtenção das fotografias das metáfases, os cariótipos são

montados seguindo uma ordem decrescente de tamanho dos autossomos, sendo que os

cromossomos sexuais são colocados a parte.

As análises morfológica e morfométrica do crânio foram utilizadas para diferenciar

alguns espécimes do gênero Akodon, os quais não puderam ser identificados através do

14

cariótipo. A diferenciação foi feita com base na morfologia da dentição, morfometria da série

molar e morfometria da menor largura do interorbital segundo Gonçalves et al. (2007) e

Christoff et al. (2000). Os marsupiais Gracilinanus sp. e Monodelphis dimidiata foram

identificados com base em Costa et al. (2003), Voss et al. (2005) e Creighton & Gardner

(2008) para os espécimes de Gracilinanus sp. e com base em Pine & Handley (2008) e Vilela

et al. (2010) para Monodelphis dimidiata.

A confirmação da identificação taxonômica através de análises moleculares foi

realizada somente para as espécies infectadas. As amostras de DNA foram extraídas com um

kit (Promega Wizard) seguindo o protocolo proposto pelo fabricante. As relações

interespecíficas foram realizadas utilizando fragmentos de Citocromo b (cyt b) com

aproximadamente 400 pares de base. A amplificação destes fragmentos foi realizada

utilizando os iniciadores (primers) MVZ 05 (5’- CGA AGC TTG ATA TGA AAA ACC ATC

GTT – 3’) e MVZ 16 (5’- TAG GAA RTA TCA YTC TGG TTT RAT – 3’) (Smith & Patton

1993). As amplificações por PCR foram realizadas em um volume final de 24 µl contendo de

20-80 ng de DNA, 0.2 µM de cada primer, 0.2 µM dNTP, 10x PCR buffer, 1.5 mM MgCl2 e

1.0 unidade de Taq DNA polimerase (GIBCO-BRL Life Sciences/Invitrogen®, Carlsbad,

California). O ciclo do PCR começa por 1 minuto a 95ºC; seguido por 10 ciclos de 1 minuto a

95ºC (desnaturação), 1 minuto a 50ºC (anelamento) e 1 minuto a 72ºC (extensão); 15 ciclos

de 1 minuto a 95ºC (desnaturação), 1 minuto a 48ºC (anelamento) e 1:30 minutos a 72ºC

(extensão); e ainda 15 ciclos de 1 minuto a 95ºC (desnaturação), 1 minuto a 45ºC

(anelamento) e 1:30 minutos a 72ºC (extensão); e, finalmente 5 minutos a 75ºC. Os produtos

amplificados foram visualizados em gel de agarose a 1%, foram purificados utilizando o kit

GE Healthcare® (EUA), sendo quantificados no espectofotômetro Nanodrop 1000c

(Uniscience®). As reações de sequenciamento foram realizadas no sequenciador ABI 377

(Applied Biosystems Inc.®). As seqüências foram visualizadas através de eletroferogramas,

alinhadas através da ferramenta Clustal W no programa Mega 5.05 e então comparadas com

sequências depositadas no GenBank por meio da ferramenta Blast

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov).

Todas as identificações taxonômicas foram realizadas no Laboratório de Biologia e

Parasitologia de Mamíferos Silvestres Reservatórios, IOC/FIOCRUZ, Rio de Janeiro/RJ, sob

a supervisão do Dr. Paulo Sérgio D’Andrea e da Dra. Cibele Rodrigues Bonvicino.

15

Diagnóstico de infecção por hantavirus

O diagnóstico de infecção de todas as etapas desta tese (levantamento de espécies

hospedeiras e estudo temporal) foi realizado no Laboratório de Hantaviroses e Rickettsioses,

IOC/FIOCRUZ, sob a coordenação da Dra Elba R. S. Lemos. As análises dos dois primeiros

meses de coleta do estudo temporal (dezembro/2009 e março/2010), bem como as análises do

levantamento de espécies nos outros municípios do Estado, foram também realizadas pelo

Instituto Carlos Chagas - ICC/FIOCRUZ-PR, sob a coordenação da Dra Claudia Nunes

Duarte dos Santos. A metodologia de diagnóstico realizada pelo ICC/FIOCRUZ está descrita

nas publicações referentes ao capítulo 1 (Raboni et al. 2009b, 2012). A metodologia realizada

no LHR/IOC/FIOCRUZ está descrita abaixo:

Analise sorológica

A análise sorológica foi realizada através do ensaio imunoenzimático – ELISA - para

detecção de anticorpos anti-hantavírus da classe IgG, utilizando o antígeno Araraquara

fornecido pelo Prof. Dr Luiz Tadeu Figueiredo da USP/Ribeirão Preto, São Paulo (Figueiredo

et al. 2009). Para realização do teste, placas de 96 poços foram sensibilizadas com proteína

recombinante do nucleocapsídeo do hantavírus Araraquara (ARAV-N) na metade superior

(linhas A, B, C e D) e extrato de E. coli usado como controle negativo na metade inferior

(linhas E, F, G e H) diluídos em solução tampão carbonato-bicarbonato na concentração de

0,2µg/ µL, durante incubação por uma noite “overnight” a 4°C. Em seguida, após lavar a

placa por 5 vezes com PBS pH 7.4 acrescido de Tween (PBS-T) 1X a 0,05%, foi adicionada

solução de bloqueio ( leite em pó desnatado a 10% em PBS-T). Após incubação da placa a

37°C por duas horas e subsequente etapa de lavagem, as amostras de soro sabidamente

positivas e negativas utilizadas como controle do teste, e as amostras em teste foram

adicionadas na diluição de 1/400 em solução de bloqueio. Após nova incubação a 37°C por

uma hora e etapa de lavagem por 6 vezes, anticorpos secundários anti-Peromyscus leucopus e

anticorpos anti-Rattus rattus marcados com peroxidase foram utilizados como conjugado na

diluição de 1/3000 em solução de bloqueio. Em continuação, após incubar e lavar novamente

a placa, um substrato cromogênico (o-phenylenediamine = OPD) diluido em solução Citrato-

Fostato (pH 4,9 a 5,2) foi adicionado acrescido de peróxido de hidrogênio e a placa então foi

incubada por 15 a 20min a 37°C. Após o bloqueio da placa com adição de HCl a 1M, a

absorbância foi mensurada a 490 nm em espectrofotômetro. A diluição do soro foi

16

considerada positiva quando a densidade ótica (DO) foi superior a 0,3. A DO final de cada

diluição de soro foi calculada como a diferença entre o valor da DO mensurada nos poços

sensibilizados com a proteína ARAV-N e aqueles sensibilizados com o antígeno controle

negativo. Um título > 1: 400 foi considerado positivo.

Extração do RNA viral

As amostras de fragmentos de tecidos (pulmão, rim ou fígado) de roedores,

previamente identificados como sororreativos, foram submetidas à extração do RNA viral

pelo kit comercial PureLinkTM (Invitrogen) seguindo o protocolo do fabricante, descrito em

seguida. Para a extração foram obtidos aproximadamente 50 mg de tecido que foram

macerados com um pistilo em banho de nitrogênio líquido (NL), em uma primeira etapa. Em

seguida foi adicionado 120μl de Trizol® (Invitrogen) no tubo e o tecido foi macerado

complementarmente.

Posteriormente, 880μl de Trizol® foram adicionados e após homogeneização em

vortex o material foi incubado à temperatura ambiente por 5 minutos. Na etapa seguinte 200μl

de clorofórmio foram adicionados, o tubo agitado por 15 segundos e incubado por 3 minutos à

temperatura ambiente. As amostras foram centrifugadas a 12.000x g por 15 minutos a 4°C

com a transferência em seguida de 400μl da fase aquosa para um novo tubo. Uma quantidade

de 400μl de etanol a 70% foi adicionada e após homogeneização da amostra em vortex, o tubo

foi invertido para dispensar qualquer precipitado. Subsequentemente 700μl da mistura foram

transferidos para uma coluna com tubo coletor, submetidos à centrifugação a 12.000x g por

15 segundos à temperatura ambiente e o líquido do tubo coletor foi desprezado e a coluna

recolocada no mesmo tubo coletor. Essas etapas foram repetidas a partir da adição de 700μl

da mistura.

Em sequência, adicionou-se 700μl do tampão de lavagem I na coluna e centrifugou-se

a 12.000x g por 15 segundos à temperatura ambiente, com o descarte do tubo coletor seguido

pela colocação da coluna em um novo tubo coletor. Na etapa seguinte 500μl do tampão de

lavagem II foram adicionados na coluna e submetidos à centrifugação a 12.000x g por 15

segundos a temperatura ambiente. O líquido do tubo coletor foi desprezado e a coluna foi

recolocada no mesmo tubo coletor. Os passos foram repetidos a partir da adição de 500μl do

tampão de lavagem II. Por fim as amostras foram centrifugadas a 12.000x g por um minuto à

temperatura ambiente para secagem da membrana com RNA aderido, com posterior descarte

do tubo coletor. A coluna foi colocada em um tubo de 1,5mL e adicionados 30μl de água livre

17

de nuclease, seguida da incubação à temperatura ambiente por um minuto e centrifugação da

coluna com tubo de 1,5mL a 12.000x g por 2 minutos à temperatura ambiente. O RNA

extraído foi aliquotado e armazenado no freezer -80°C.

Transcrição Reversa do RNA (RT) com posterior Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR)

A partir do RNA total extraído foram realizadas a síntese e posterior amplificação do

cDNA em uma única etapa (One Step PCR) com utilização do Mini Kit SuperScript IIITM

Reverse Transcriptase One Step (Invitrogen) e de primers específicos para o segmento S viral.

Na PCR, tubos de 0,5 mL foram utilizados para preparar a solução contendo: 0,5 μl (100

pmol/μl) do primer H04-25F (5’- TAGTAGACTCCTTGAKAAGCT – 3’), 0,4 μl (100

pmol/μl) do primer H733-752R (5’ – TCWATCCTTTCCATCCARTC – 3’) (Guterres et al.

2013), 0,5 μl de SuperScript® III One-Step RT-PCR System with Platinum® Taq DNA

Polymerase, 12,5 μl (0,4 mM de dNTP + 3,2 mM de MgSO4) de 2X Mix da reação, 8,9 μl de

água nuclease-free e 0,2 μl (50mM) de Cloreto de Magnésio (MgSO4), com um volume total

de 23 μl. Esta mistura era então distribuída em microtubos para PCR (0,2 mL) e então era

acrescentados 2 μl de RNA da amostra, totalizando um volume final de 25 μl. Os tubos eram

então alocados em um termociclador GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems)

que realizava uma primeira etapa de 48°C por 45 minutos para amplificação do cDNA,

seguida de uma fase inicial de 94°C por 2 minutos, seguida de 40 ciclos de 94°C por 30

segundos, 51°C por 40 segundos, 68°C por 50 segundos, finalizando com uma etapa de

extensão de 68°C por 5 minutos e uma temperatura final de 4°C.

Uma PCR Semi-Nested foi realizada para aumentar a sensibilidade da amplificação.

Tubos de 0,5 mL foram utilizados para preparar a solução contendo: 0,25 μl (100 pmol/μl) do

primer H274-791F (5’- CCACTTGATCCAACAGGG – 3’), 0,25 μl (100 pmol/μl) do primer

H733-752R (5’ – TCWATCCTTTCCATCCARTC – 3’) (Raboni et al. 2005, Guterres et al.

2013), 0,1 μl (5U/μl) de Taq platinum DNA polimerase (Invitrogen), 0,25μl de dNTP

(20mM), 2,5 μl de tampão PCR 10X, 0,75 μl (50mM) de Cloreto de Magnésio (MgSO4) e

18,9 μl de água nuclease-free, com um volume total de 23 μl. Esta mistura era então

distribuída em microtubos para PCR (0,2 mL) e então era acrescentado 2 μl do produto da

primeira PCR da amostra, com um volume final de 25 μl. Os tubos eram então alocados em

um termociclador GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems) que realizava uma

primeira etapa de 94°C por 2 minutos seguida por 25 ciclos de 94°C por 30 segundos, 54°C

18

por 30 segundos, 72°C por 30 segundos, uma extensão de 72°C por 5 minutos e uma

temperatura final de 4°C.

Análise de DNA em gel de agarose

O gel de agarose a 1,5% foi preparado em tampão TBE 0,5X. Os produtos da PCR

foram aplicados no gel e submetidos à eletroforese em tampão TBE 1X. A visualização do

DNA foi realizada após o gel ter sido submetido ao banho de GelRedTM (Uniscience)

durante 10 minutos, através da luz ultravioleta por meio de transluminador.

Purificação e Sequenciamento nucleotídico

Os DNAs obtidos foram purificados utilizando o kit comercial Wizard® Genomic

DNA Purification (PROMEGA), segundo o protocolo do fabricante. Os fragmentos obtidos

na PCR foram visualizados em gel de agarose 1,5%. As bandas de interesse foram excisadas

dos géis, pesadas e transferidas para tubos de 1,5 mL. O tampão de solubilização

(PROMEGA) foi adicionado a cada tubo na proporção de 10μl/10mg de gel e incubados a

65°C até estar completamente dissolvido.

A mistura foi então colocada na coluna disposta sobre os tubos coletores de 2,0 mL,

incubados por um minuto à temperatura ambiente e centrifugados por um minuto a 16.000x g.

Os filtrados foram descartados e, logo em seguida, adicionados 700μl de tampão de lavagem

PROMEGA para remover todo resíduo da agarose, seguido de centrifugação por um minuto a

16.000x g e o filtrado descartado. Novamente 500μl de tampão de lavagem foram adicionados

com subsequente centrifugação por 5 minutos a 16.000x g. Uma nova centrifugação de 1

minuto a 16.000x g foi realizada agora sem a tampa interna da centrifuga para total

evaporação residual do etanol. As colunas foram transferidas para tubos de 1,5mL estéreis e

identificados. Em uma nova etapa foram adicionados 50μl de água livre de nuclease

(PROMEGA), seguida de incubação por um minuto à temperatura ambiente e centrifugação a

16.000x g por um minuto. A coluna foi descartada e o filtrado contendo o DNA a ser

sequenciado foi estocado a -20°C.

O DNA purificado foi submetido ao sequenciamento utilizando o kit comercial

BigDye® TerminatorTM v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). O volume final

de cada reação foi de 20μl, contendo: (i) DNA purificado a ser sequenciado, na concentração

de 100-200ng; (ii) 3,2 pmol dos primers senso e antisenso (utilizado separadamente), (iii) 2μl

19

da mistura Big Dye terminator e (iv) 3μl de tampão fornecido pelo kit. O protocolo foi

seguido, segundo o fabricante e a reação foi processada em um termociclador 9700

GeneAmp® sob as seguintes condições: 30 ciclos de 96°C por 10 segundos, 50°C por 5

segundos e 60°C por 4 minutos. As sequências nucleotidicas foram obtidas em sequenciador

automático, modelo ABI PRISM® 3130x (Applied Biosystems).

Análise do sequenciamento

As sequências de nucleotídeos e seus eletroferogramas de sequenciamento dos

fragmentos amplificados do segmento genômico S foram analisados por meio do programa

MEGA 5.0 (Tamura et al. 2011). Inicialmente as sequências foram analisadas contra o banco

de dados depositado no GenBank utilizando a ferramenta BLASTn. Em seguida, as

sequências obtidas foram manipuladas no programa MEGA 5.0. Após a localização dos

iniciadores por meio dos quais o fragmento foi inicialmente amplificado, as sequências foram

alinhadas entre si por meio da ferramenta MUSCLE (Edgar 2004) no programa MEGA 5.0.

Uma sequência consenso foi estabelecida, e as divergências de nucleotídeos entre as

sequências foram esclarecidas pela análise dos eletroferogramas de sequenciamento.

Análise filogenética

Para todas as análises filogenéticas realizadas, as sequências obtidas no

sequenciamento e as obtidas em bancos de dados foram alinhadas pela ferramenta MUSCLE

(Edgar 2004) no programa Seaview4 (Gouy et al. 2010). As relações filogenéticas foram

estimadas pelo método de Monte Carlo via Cadeias de Markov (MCMC) implementado em

MrBayes v3.1.2 (Ronquist & Huelsenbeck 2003), usando o modelo GTR+G de substituição

de nucleotídeos.

As configurações MCMC consistiam em duas corridas simultâneas independentes,

com quatro cadeias cada, que foram executadas por 10 milhões de gerações e amostrados a

cada 100 gerações, produzindo 100 mil árvores. Depois de eliminar 25% das amostras como

“burn-in” uma árvore consenso foi construída. O suporte estatístico dos clados foi medido

pelo teste de razão de verossimilhança aproximada (Anisimova & Gascuel 2006) e as

probabilidades posteriores bayesianas. Para as análises, sequências do vírus Haantan

(NC005218) e o vírus Seoul (AY027040) foram utilizadas como grupo externo.

20

CAPÍTULO 1

Levantamento de espécies de pequenos mamíferos e infecção por hantavírus em

roedores silvestres no Estado do Paraná

Este capítulo apresenta o levantamento de espécies de pequenos mamíferos em quatro

unidades de paisagem, incluindo lista de espécies e taxas de infecção por hantavírus visando

caracterizar a fauna de hospedeiros silvestres no Estado do Paraná. É discutida a ocorrência das

espécies de pequenos mamíferos, considerando habitat e distribuição geográfica no Estado.

Adicionalmente, são apresentados dois artigos científicos publicados durante o período de

desenvolvimento desta tese, referentes à infecção por hantavírus em roedores silvestres no Estado

do Paraná. Até o início deste projeto apenas estudos relacionados à infecção em humanos haviam

sido publicados, portanto estas publicações contribuíram para o conhecimento sobre as espécies de

roedores hospedeiros, bem como os genótipos virais associados, circulantes no Estado.

21

CAPÍTULO 1

Levantamento de espécies de pequenos mamíferos e infecção por hantavírus em roedores

silvestres no Estado do Paraná

OBJETIVOS

Realizar um levantamento de espécies de pequenos mamíferos e determinar suas taxas de

infecção por hantavírus e os genótipos virais associados em quatro unidades de paisagem do Estado

do Paraná: Floresta Ombrófila Mista, Floresta Ombrófila Densa, Floresta Estacional Semidecidual e

Remanescentes de Cerrado.

MATERIAL E MÉTODOS

O levantamento de espécies de pequenos mamíferos e potenciais hospedeiras de hantavírus

foi realizado em 7 municípios do Estado do Paraná, pertencentes a quatro unidades de paisagem do

Estado (IBGE 2004) (Tabela 1.1, Figura 1.1):

(1) Floresta Estacional Semidecidual, localizada no Norte/Oeste do Estado, também conhecida

como hylaea meridional. Esta formação possui maior afinidade com o Cerrado do que com a Mata

Atlântica (Tiepolo 2007);

(2) Floresta Ombrófila Mista, localizada no Centro/Sul do Estado, distribuída por planaltos

recobertos pela Floresta com Araucárias, representando a maior unidade de paisagem do estado,

embora fragmentada naturalmente pelos Campos Gerais (Tiepolo 2007);

(3) Floresta Ombrófila Densa, localizada na região litorânea. Também conhecida como Mares de

Morros é o domínio das regiões serranas tropicais úmidas, incluindo a Serra do Mar (Tiepolo 2007);

(4) Remanescentes de Cerrado, localizados no leste do Paraná, representados principalmente pelo

Parque Estadual do Cerrado, uma das últimas áreas deste tipo de vegetação no Estado (Linsingen et

al. 2006).

22

Tabela 1.1. Informações gerais sobre o levantamento de espécies de pequenos mamíferos no Estado

do Paraná, com descrição das áreas de estudo.

Município

de coleta

Período de

Coleta

Unidade de

Paisagem

Cobertura por

remanescentes

Florestais*

Casos de

Hantavirose

no município**

Esforço de

Captura Total#

General

Carneiro

Nov 2006

(Primavera)

FM 22% 24 1426

(5 noites)

Paranaguá Dez 2007

(Final da

Primavera)

FD 48% 1 1250

(5 noites)

Itambaracá Out 2008

(Primavera)

FS 1% - 1250

(5 noites)

Jaguariaíva Jul 2009

(Inverno)

CE e outras 9% - 1200

(5 noites)

Curitiba/

Araucária

Set 2009

(Final do

Inverno)

FM 1-2% 1 460

(3 noites)

Foz do

Iguaçu

Abr 2010

(Outono)

FS 22% - 1075

(5 noites)

Obs: *Segundo dados da Fundação SOS Mata Atlântica (SOSMA 2012); **Até 2012 (fonte SESA-

PR); #Armadilhas-Noite; FM=Floresta Ombrófila Mista, FD=Floresta Ombrófila Densa,

FS=Floresta Estacional Semidecidual, CE=Remanescentes de Cerrado

23

Figura 1.1. Localização dos municípios de coleta no estudo de levantamento de espécies

hospedeiras de hantavírus de acordo com, A) Mapa político do Estado do Paraná (áreas de estudo

em destaque); B) Principais unidades de paisagem do Estado do Paraná (Amarelo=Floresta

Estacional Semidecidual; Marrom=Floresta Ombrófila Mista; Verde=Campos Gerais; Magenta=

Remanescentes de Cerrado; Laranja= Floresta Ombrófila Densa)

A)

B)

24

A escolha dos municípios de coleta (General Carneiro, Paranaguá, Itambaracá, Jaguariaíva,

Curitiba/Araucária e Foz do Iguaçu) seguiu demandas da Secretaria da Saúde do Estado do Paraná

para realização de investigação sobre ocorrência de possíveis reservatórios de hantavírus em locais

com notificação de casos humanos de SPH. Sempre que possível, a investigação era realizada logo

após a notificação e parte das armadilhas eram dispostas próximas aos locais de provável infecção

(LPI). Destes, apenas Foz do Iguaçu não foi posteriormente confirmado como sendo o município de

infecção do paciente. Municípios sem casos de SPH registrados foram também investigados:

Itambaracá por ser uma região com alto índice de fragmentação florestal e atividade humana

relacionada à colheita e estocagem de grãos (atividade de risco de exposição), e Jaguariaíva por ser

o último remanescente de Cerrado no Estado do Paraná (pesquisa de prospecção em área com

potencial risco de transmissão).

Em General Carneiro (Figura 1.2) foram estudadas áreas nativas de Mata de Araucárias com

presença de taquaras (1196 armadilhas-noite) (26°23'40.70"S 51°22'12.10"W), e áreas de divisa

entre mata nativa degradada e plantações de Pinus elliotti e Pinus taeda (230 armadilhas-noite)

(26°33'12.00"S 51°23'46.10"W). Em Paranaguá (Figura 1.3) todas as áreas de estudo eram

semelhantes. Foram amostradas bordas de fragmentos de floresta (peridomicílios) conectados a uma

área contínua nos arredores do Parque Nacional Saint Hilaire e da Área de Proteção Ambiental de

Guaratuba (1250 armadilhas-noite) (25°34'34.80"S 48°38'0.20"W). Em Itambaracá (Figura 1.4)

todas as áreas eram também semelhantes entre si e se caracterizavam como bordas de fragmentos

florestais localizados em áreas peridomiciliares rurais, com alto grau de antropização e matriz

representada por plantações de cana-de-açúcar e milho (1250 armadilhas-noite) (22°56'36.30"S

50°24'45.10"W). Em Foz do Iguaçu (Figura 1.5) foram amostradas áreas no Parque Nacional do

Iguaçu (500 armadilhas-noite) (25°36'47.40"S 54°25'50.60"W), na zona de influência da Usina

Hidrelétrica Itaipu Binacional (150 armadilhas-noite) (25°26'28.80"S 54°30'56.40"W) e em

peridomicílios e borda de remanescentes florestais (425 armadilhas-noite) (25°28'32.90"S

54°31'9.70"W). Em Jaguariaiva (Figura 1.6), foram estudadas áreas remanescentes de Cerrado

localizadas no Parque Estadual do Cerrado (PEC) (750 armadilhas-noite) (24°10'59.50"S

49°39'36.30"W) e fragmentos florestais (450 armadilhas-noite) na Fazenda Querência do Jerivá,

localizada nos arredores do Parque. Estes fragmentos eram circundados por uma matriz de

plantação de Sorgo (Sorghum sp.) e pastagens com presença de gado (24° 8'56.10"S

49°40'57.50"W), e estão localizados em uma região considerada de tensão ecológica com as regiões

da Floresta Ombrófila Mista, Floresta Estacional Semidecidual e Estepes Ombrófilas (Leite 2002,

Tiepolo 2007). A coleta na zona metropolitana da capital (Figura 1.7) foi realizada em peridomicílio

e borda de remanescentes de mata em uma área urbanizada de Curitiba (250 armadilhas-noite)

25

(25°34'56.20"S 49°20'34.00"W) e em uma área rural do município de Araucária, próximas a

plantações de trigo (210 armadilhas-noite) (25°39'32.40"S 49°24'1.00"W).

De uma maneira geral, o desenho amostral buscou abranger principalmente áreas de borda

de fragmentos florestais, áreas próximas a peridomicílios e/ou áreas de atividades rurais (Figura

1.8), pois é aonde se observa a ocorrência das principais espécies potenciais hospedeiras de

hantavírus. Todas as áreas de estudo nos municípios de Itambaracá, Curitiba, Araucária e áreas fora

de unidades de conservação em Foz do Iguaçu e Jaguariaíva possuíam este mesmo perfil. Áreas

com um perfil diferenciado foram amostradas nas duas unidades de conservação estudadas, Parque

Nacional do Iguaçu (PNI) e Parque Estadual do Cerrado (PEC), e nos municípios de General

Carneiro e Paranaguá. Entretanto, destas, apenas o PNI configura uma área com alto grau de

preservação. O PNI possui uma área de 185.262,20 ha (=1852,62 Km²) representando uma das

últimas áreas preservadas da Floresta Atlântica do Alto do Paraná (cuja vegetação predominante é a

Floresta Estacional Semidecidual). Já o PEC possui uma área de apenas 420,40 ha (=4,20 Km²),

estando cercado por propriedades rurais que utilizam espécies exóticas, para fins agrícolas,

pecuários e silviculturais. Foi ainda relatada a ocorrência de espécies invasoras como Pinus sp.,

Eucalyptus sp. e Brachiaria sp. na área do Parque (IAP 2002). General Carneiro é uma região de

atividades relacionadas a silvicultura sem a presença de outros tipos de atividades (agricultura ou

pecuária extensiva). Portanto a vegetação forma um mosaico de áreas de mata nativa de Araucárias

e áreas de reflorestamento de Pinus. Paranaguá é o município de maior percentual de remanescentes

florestais do Estado. As áreas estudadas, mesmo sendo bordas de floresta e peridomicílio estavam

conectadas a uma área de vegetação contínua.

A riqueza de espécies foi quantificada pelo número total de espécies coletadas em cada

unidade de paisagem. A prevalência da infecção foi calculada para cada espécie e sexo. Os roedores

Mus musculus e Rattus rattus não foram incluídos nas análises por serem espécies sinantrópicas e

por sua captura estar restrita ao intra e peridomicilio.

26

Figura 1.2. Áreas estudadas no município de General Carneiro/PR: áreas nativas de Mata de

Araucárias (em vermelho) e divisa entre mata nativa degradada e áreas manejadas para plantio de

Pinus (em amarelo). Imagem modificada do Google Earth®.

Figura 1.3. Áreas estudadas no município de Paranaguá/PR (em vermelho). Imagem modificada do

Google Earth®.

27

Figura 1.4. Áreas estudadas no município de Itambaracá/PR (em vermelho). Imagem modificada do

Google Earth®.

Figura 1.5. Áreas estudadas no município de Foz do Iguaçu/PR: áreas na zona urbana do município

(em amarelo) e áreas do Parque Nacional do Iguaçu (em vermelho). Imagem modificada do Google

Earth®.

28

Figura 1.6. Áreas estudadas no município de Jaguariaíva/PR: (A) Fragmentos florestais (em

amarelo) e Parque Estadual do Cerrado (PEC) (em vermelho). Imagem modificada do Google

Earth®. (B) Áreas estudadas no PEC de acordo com o tipo de vegetação (em vermelho). Imagem

modificada de IAP (2002).

B)

A)

29

Figura 1.7. Áreas estudadas na zona metropolitana da capital do Estado do Paraná: (A)

Peridomicílio e borda de remanescentes florestal em uma área urbanizada de Curitiba (em

vermelho). (B) Área rural do município de Araucária (em amarelo). Imagens modificadas do

Google Earth®.

A)

B)

30

Figura 1.8. Aspecto geral das áreas estudadas: A) Mata de Araucárias, General Carneiro/PR; B)

Divisa entre mata nativa degradada e plantação de Pinus, General Carneiro/PR; C) Fragmento

florestal em área urbana, Curitiba/PR; D) Fragmento florestal em área rural, Araucária/PR; E) Área

de Floresta Ombrófila Densa próxima a residência, Paranaguá/PR; F) Fragmento florestal em área

rural, Itambaracá/PR; G) Parque Nacional do Iguaçu, Foz do Iguaçu/PR; H) Fragmentos florestais

em área rural, Jaguariaíva/PR; I) Parque Estadual do Cerrado, Jaguariaíva/PR.

RESULTADOS

Foi coletado um total de 446 espécimes, resultando em uma riqueza total de 11 espécies de

roedores sigmodontíneos, 2 espécies de roedores muríneos sinantrópicos e 3 espécies de marsupiais

(Tabela 1.2, Figura 1.9). Deste total, 10 espécimes pertencentes a 3 espécies (Oligoryzomys

nigripes, Akodon montensis e Oxymycterus judex) estavam infectadas por hantavírus, representando

2,43% de roedores infectados (sendo 3,08% de sigmodontíneos infectados). Todos os roedores

infectados eram machos.

A) B) C)

D) E) F)

G) H) I)

31

Tabela 1.2. Espécies de pequenos mamíferos coletadas no Estado do Paraná, de acordo com as

unidades de paisagem estudadas: FM = Floresta Ombrófila Mista (municípios de General Carneiro,

Curitiba e Araucária), FD = Floresta Ombrófila Densa (município de Paranaguá), Floresta

Estacional Semidecidual (municípios de Itambaracá e Foz do Iguaçu), CE = Remanescentes de

Cerrado (município de Jaguariaiva) e FJ = Fragmentos Florestais de Jaguariaíva

*Não foram incluídas as espécies sinantrópicas M. musculus e R. rattus.

Espécies FM FD FS CE FJ

Rodentia: Sigmodontinae

Akodon montensis 50 25 76 1 20

Akodon paranaensis 16 - - - -

Akodon serrensis 20 - - - -

Calomys tener - - - 12 -

Euryoryzomys russatus - 4 - - 8

Nectomys squamipes - 8 - - -

Oligoryzomys nigripes 22 18 15 2 4

Oxymycterus judex 2 - - - -

Oxymycterus sp. - - - - 5

Sooretamys angouya 2 1 - - -

Thaptomys nigrita 3 9 2 - -

Rodentia: Murinae

Mus musculus 10 - 69 - -

Rattus rattus - 3 4 - -

Didelphimorphia: Didelphinae

Didelphis aurita - 3 2 - -

Didelphis albiventris - - 21 2 -

Monodelphis dimidiata 7 - - - -

Riqueza Sigmodontinae 7 6 5 3 4

Riqueza Didelphinae 1 1 2 2 -

Riqueza Total* 8 7 7 5 4

Prevalência A. montensis 4% 4% 1,04% - 5%

Prevalência O. nigripes - 16,7% 15,8% - 25%

32

F

igu

ra 1

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ânci

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á

33

Floresta Ombrófila Mista (Municípios de General Carneiro, Curitiba e Araucária)

Foi coletado um total de 132 espécimes, resultando em uma riqueza total nesta paisagem de

9 espécies: Rodentia, Sigmodontinae: 50 Akodon montensis (29M/21F), 20 A. serrensis (11M/9F),

16 A. paranaensis (7M/9F), 22 Oligoryzomys nigripes (10M/12F), 3 Thaptomys nigrita (3M), 2

Sooretamys angouya (2F) e 2 Oxymycterus judex (2M); Rodentia – Murinae: 10 Mus musculus

(06M/04F); Didelphimorphia - Didelphidae: 7 Monodelphis dimidiata (7M).

As espécies mais abundantes foram: Akodon montensis e O. nigripes, representando 37,9% e

16,7% do total de espécimes capturados, respectivamente (Tabela 1.3) em um sucesso de captura

total de 9,4%. Em General Carneiro não foi observado um padrão específico de associação das

espécies encontradas com algum tipo de vegetação, já que todas as espécies ocorreram tanto nas

áreas de mata nativa de Araucárias quanto na divisa entre mata nativa degradada e áreas manejadas

para o plantio de Pinus. Na região metropolitana a espécie Monodelphis dimidiata ocorreu apenas

nos remanescentes de mata de Curitiba enquanto que as outras espécies ocorreram tanto em Curitiba

quanto no município de Araucária.

Tabela 1.3. Pequenos mamíferos coletados em áreas de Floresta Ombrófila Mista (Floresta com

Araucárias), nos municípios de General Carneiro, Curitiba e Araucária, Estado do Paraná

Espécies

General Carneiro Região Metropolitana

Mata

Nativa

Divisa

Mata-Pinus

Remanescentes

Urbanos

Remanescentes

Rurais

Akodon montensis 27 4 7 12

Akodon serrensis 14 6 - -

Akodon paranaensis 3 1 7 5

Oligoryzomys nigripes 2 5 6 9

Thaptomys nigrita 2 1 - -

Sooretamys angouya 1 1 - -

Oxymycterus judex 1 1 - -

Mus musculus - - 3 7

Monodelphis dimidiata 2 1 4 -

Legenda: Mata Nativa e plantações de Pinus de General Carneiro = área extensa de mata de

Araucárias entremeada por áreas de plantio de Pinus; Remanescentes urbanos = áreas

peridomiciliares e borda de remanescentes de floresta em uma área urbanizada de Curitiba;

Remanescentes rurais = áreas peridomiciliares e borda de remanescentes florestais em uma área

com plantação de trigo do município de Araucária.

34

Foram observados 02 Akodon montensis e 01 Oxymycterus judex sororeativos e com

confirmação pela RT-PCR, todos na região de General Carneiro, representando 2,6% do total de

roedores sigmodontíneos. As análises de seqüenciamento genético indicaram que um A. montensis e

um O. judex apresentaram infecção pelo vírus Juquitiba (JUQV) enquanto que o outro A. montensis

apresentou infecção pelo vírus Jaborá (JABV). Um A. montensis infectado foi capturado na divisa

entre mata nativa degradada e área de Pinus, enquanto que os outros 2 roedores foram capturados

nas áreas de Mata de Araucárias. Todos os roedores infectados eram machos escrotados, não

apresentando cicatrizes na pele do animal. Nenhum dos roedores capturado na região metropolitana

apresentou infecção por hantavírus.

Floresta Ombrófila Densa (Município de Paranaguá)

Foi coletado um total de 71 espécimes, resultando em uma riqueza total de 08 espécies:

Rodentia – Sigmodontinae: 25 Akodon montensis, 18 Oligoryzomys nigripes, 09 Thaptomys nigrita,

04 Euryoryzomys russatus, 08 Nectomys squamipes e 01 Sooretamys angouya; Rodentia – Murinae:

03 Rattus rattus; e Didelphimorphia - Didelphidae: 03 Didelphis aurita.

As espécies mais abundantes foram Akodon montensis e Oligoryzomys nigripes

representando 36% e 25% do total de espécimes capturados, respectivamente em um sucesso de

captura total de 5,7%.

Três espécimes de Oligoryzomys nigripes e 01 Akodon montensis apresentaram sorologia

reativa para infecção por hantavírus, representando 5,9% do total de roedores sigmodontíneos

capturados. Dois O. nigripes apresentaram confirmação da infecção pela RT-PCR, tendo sido

confirmada infecção por JUQV em ambos espécimes. Os outros dois espécimes soropositivos (um

O. nigripes e um A. montensis) não apresentaram confirmação de infecção pela RT-PCR. Todos os

roedores infectados eram machos escrotados, sendo que 02 O. nigripes e 01 A. montensis

apresentaram cicatrizes.

Floresta Estacional Semidecidual (Municípios de Itambaracá e Foz do Iguaçu)

Foi coletado um total de 189 espécimes, resultando em uma riqueza total de 7 espécies:

Rodentia – Sigmodontinae: 75 Akodon montensis (42M/33F), 12 Oligoryzomys nigripes (9M/6F) e

3 Thaptomys nigrita (1M/2F); Rodentia – Murinae: 69 Mus musculus (44M/25F), 04 Rattus rattus

35

(2M/2F); e Didelphimorphia - Didelphidae: 02 Didelphis aurita (2F) e 21 Didelphis albiventris

(7M/14F).

As espécies mais abundantes foram Akodon montensis e o roedor sinantrópico Mus

musculus representando 39,7% e 36,5% do total de espécimes capturados, respectivamente (Tabela

1.4), em um sucesso de captura total de 8,1%. As espécies T. nigrita e D. aurita ocorreram apenas

na área preservada (Parque Nacional do Iguaçu) enquanto que D. albiventris e o roedor sinantrópico

M. musculus ocorreram apenas na zona rural do município de Foz do Iguaçu e nos fragmentos

florestais de Itambaracá. Não foi capturado nenhum pequeno mamífero na área de influência da

Usina Hidrelétrica Itaipu Binacional.

Tabela 1.4. Pequenos mamíferos coletados em áreas de Floresta Estacional Semidecidual, nos

municípios de Itambaracá e Foz do Iguaçu, Estado do Paraná

Espécies Fragmentos

Florestais de

Itambaracá

Parque Nacional

do Iguaçu

Zona

Rural de Foz

do Iguaçu

Akodon montensis 13 29 33

Oligoryzomys nigripes 12 2 1

Thaptomys nigrita - 3 -

Mus musculus 25 - 44

Rattus rattus 4 - -

Didelphis aurita - 2 -

Didelphis albiventris 20 - 1

Legenda: Fragmentos florestais de Itambaracá = borda de remanescentes florestais em área rural,

com plantação de milho e cana-de-açúcar; Parque Nacional do Iguaçu = área contínua preservada;

Zona rural de Foz do Iguaçu = peridomicílios e borda de remanescentes de floresta em uma área

urbanizada

Apenas um espécime de O. nigripes, proveniente de Itambaracá, apresentou sorologia

reativa para infecção por hantavírus e confirmação pela RT-PCR, representando 1,1% do total de

roedores sigmodontíneos. Foi confirmada infecção por JUQV, sendo que o roedor infectado era um

macho escrotado. Nenhum dos roedores capturados nas duas áreas do município de Foz do Iguaçu

apresentou infecção por hantavírus.

36

Remanescentes de Cerrado e Fragmentos Florestais (Município de Jaguariaíva)

Foi capturado um total de 54 espécimes de pequenos mamíferos, pertencentes as seguintes

espécies: Rodentia – Sigmodontinae: 21 Akodon montensis (13M/08F), 12 Calomys tener

(07M/05F), 06 Oligoryzomys nigripes (4M/2F), 08 Euryoryzomys russatus (4M/4F), 05

Oxymycterus sp. (4M/1F), e Didelphimorphia - Didelphidae: 02 Didelphis albiventris (2F).

As espécies mais abundantes foram Akodon montensis e Calomys tener representando 39% e

22% do total de espécimes capturados, respectivamente (Tabela 1.5). Observou-se um sucesso total

de captura de 4,5%. Em relação aos tipos de vegetação presentes na área de estudo, A. montensis, O.

nigripes, Oxymycterus sp. e E. russatus, ocorreram apenas em fragmentos florestais. Calomys tener

e o marsupial D. albiventris ocorreram apenas em vegetação de Campo Cerrado e Campo Sujo

presentes no Parque Estadual do Cerrado.

Tabela 1.5. Pequenos mamíferos coletados no Parque Estadual do Cerrado e em fragmentos

florestais nos arredores, no município de Jaguariaíva, Estado do Paraná

Espécies

Parque Estadual

do Cerrado

Fragmentos Florestais

de Jaguariaíva

Akodon montensis 01 20

Calomys tener 12 -

Euryoryzomys russatus - 08

Oligoryzomys nigripes 02 04

Oymycterus sp. - 05

Didelphis albiventris 02 -

Legenda: Parque Estadual do Cerrado = unidade de conservação com presença de Cerrado relictual;

Fragmentos florestais de Jaguariaíva = remanescentes de mata em área de tensão ecológica com

influência de características de três unidades de paisagem diferentes

Foi diagnosticada infecção por JABV em um espécime de A. montensis e por JUQV em um

espécime de O. nigripes. Os dois espécimes infectados ocorreram na área de fragmentos florestais.

Ambos indivíduos infectados eram machos com cicatrizes, entretanto apenas o espécime de O.

nigripes era escrotado.

37

DISCUSSÃO

Riqueza e composição de espécies das áreas estudadas no Estado do Paraná

A riqueza total de espécies capturadas (11 roedores e 4 marsupiais) foi baixa considerando a

extensão e abrangência deste estudo (realizado em 7 municípios, distribuídos por 4 unidades de

paisagem do Estado). Em sua maioria as espécies encontradas são as de ocorrência mais frequente

no Estado do Paraná (Tiepolo 2007). Em seu trabalho de revisão Tiepolo (2007) apresenta 25

espécies de roedores sigmodontíneos de ocorrência para o Estado.

A composição de espécies encontrada pode estar relacionada ao fato de a maioria das áreas

estudadas serem locais aonde se observa frequentemente maior abundância de algumas espécies de

hábitos generalistas (A. montensis, O. nigripes, O. judex, D. aurita, D. albiventris) e ocorrência

eventual ou menos abundante de espécies de habitat restrito ou relacionadas à áreas com maior grau

de conservação. Desta forma, espécies de ocorrência esperada em algumas destas unidades de

paisagem não foram capturadas, como os roedores Akodon cursor, Oligoryzomys flavescens,

Delomys sublineatus, Holochilus brasiliensis, Hylaeamys megacephalus, Juliomys pictipes,

Scapteromys sp., Wilfredomys oenax, além de 6 espécies do gênero Oxymycterus (O. quaestor, O.

nasutus, O. dasythrichus, O. delator, O. misionalis, O. nasutus) e os marsupiais Gracilinanus

microtarsus, Marmosa paraguayana e Caluromys lanatus (Dias & Mikich 2006, Tiepolo 2007,

Vogel et al. 2010, Silveira 2012).

Outros fatores restritivos para a observação de uma maior riqueza de espécies podem ter

sido o emprego de uma única técnica de amostragem (armadilhas "live trap" em solo) (Umetsu et al.

2006) e a realização de uma única coleta em cada município. De fato no estudo populacional

realizado em General Carneiro (Capítulos 2 e 3 desta tese) a riqueza de espécies neste município

aumentou de 8 para 14 espécies entre a coleta piloto realizada em 2006 e a última coleta realizada

em 2011.

Todas as espécies capturadas eram esperadas para as regiões de estudo, com exceção de A.

montensis para a qual observamos uma extensão da sua área de distribuição para a região norte do

Estado (município de Itambaracá) (Bonvicino et al. 2008). Já a espécie C. tener, encontrada na

região de Cerrado (município de Jaguariaíva), apesar de não apresentar registros publicados para o

Estado do Paraná, foi reportada por Tiepolo (2007) e Carmignotto (2004) nesta mesma área de

estudo. Para ambas espécies esta extensão de distribuição já era esperada uma vez que A. montensis

é um roedor generalista que ocorre em toda a região de Mata Atlântica e C. tener um roedor típico

de Cerrado (Bonvicino et al. 2003). As outras espécies de roedores apresentaram ocorrência de

38

acordo com a distribuição conhecida para o Estado (Bonvicino et al. 2008): A. paranaensis nas

regiões Centro-Sul e Leste (FM e FD), A. serrensis, S. angouya e T. nigrita nas regiões Leste e Sul

(FD e porção Sul da FM), E. russatus na porção Leste do Estado (FD e parte Leste da FS), N.

squamipes (todo o Estado), O. nigripes nas regiões Centro-Sul e Leste (FM, FD e parte de FS) e O.

judex (todo o Estado menos porção Norte).

Unidades de Paisagem e Regiões Estudadas

A maior riqueza de espécies foi observada na região de Floresta Ombrófila Mista (FM) (9

espécies). Entretanto, os municípios estudados desta região apresentaram resultados diferentes entre

si. General Carneiro foi o município com maior riqueza de espécies de pequenos mamíferos neste

estudo (8 espécies). Neste município não foi observada diferença na composição de espécies entre

as áreas de mata nativa de Araucárias e as áreas de transição entre mata nativa degradada e

reflorestamento de Pinus, já que as 8 espécies capturadas ocorreram em ambos os tipos de

vegetação. Este resultado sugere que não há diferença na composição de espécies de pequenos

mamíferos entre ambas áreas. A baixa riqueza de espécies e a fauna composta basicamente por

espécies generalistas em Curitiba e Araucária foram resultados esperados devido à baixa

porcentagem de remanescentes de Mata Atlântica nestes municípios (SOSMA 2012) e porque são

áreas localizadas na região metropolitana da capital do Estado, portanto sob forte influência da

urbanização.

As regiões de Floresta Ombrófila Densa (FD) e Floresta Estacional Semidecidual (FS)

apresentaram igual riqueza de espécies (7 espécies cada). Entretanto, é válido ressaltar que em FS

três municípios foram amostrados, enquanto que em FD apenas o município de Paranaguá foi

estudado. Esta alta riqueza em apenas um município de FD pode estar relacionada ao fato de esta

região apresentar alto percentual de remanescentes de Mata Atlântica em comparação com a região

de FS (SOSMA 2012). De fato, ao analisarmos cada município de FS em separado observamos uma

baixa riqueza de espécies em Itambaracá (3 espécies) e Foz do Iguaçu (5 espécies). Da mesma

forma que os municípios de Curitiba e Araucária em FM, Itambaracá possui baixa porcentagem de

remanescentes de Mata Atlântica (SOSMA 2012), o que pode explicar a baixa riqueza de espécies e

a fauna composta basicamente por espécies generalistas. Já a riqueza de espécies em Foz do Iguaçu

foi abaixo do esperado, principalmente nas áreas do Parque Nacional do Iguaçu (PNI) onde foram

capturadas apenas 4 espécies sendo 3 consideradas de hábitos generalistas (A. montensis, O.

nigripes e D. aurita), além de T. nigrita, espécie comum em outras regiões de Mata Atlântica.

Entretanto, segundo o plano de manejo do PNI (IBAMA 1999) outras espécies são esperadas para a

39

área do Parque como os marsupiais Didelphis albiventris (capturado em nosso estudo em áreas

peridomiciliares do município, fora do PNI) e Caluromys lanatus, e os roedores Akodon serrensis,

Holochilus brasiliensis, Nectomys squamipes e Oligoryzomys flavescens. A baixa riqueza de

espécies observada, em comparação com a lista disponível no plano de manejo, pode estar

relacionada ao fato de a amostragem ter sido realizada apenas nas áreas mais próximas à sede do

PNI (Figura 1.5). Áreas de mais difícil acesso e com menor influência de atividades de turismo não

foram amostradas.

O município de Jaguariaíva apresentava tanto áreas de fragmentos florestais quanto áreas de

remanescentes de Cerrado (Parque Estadual do Cerrado). Foi observada a ocorrência de 6 espécies

de pequenos mamíferos sendo que 4 destas ocorreram no Parque Estadual do Cerrado (PEC).

Dentre estas últimas, apenas C. tener é uma espécie típica deste bioma, sendo D. albiventris uma

espécies de ocorrência em Caatinga, Cerrado e em Mata de Araucárias e as outras duas espécies, A.

montensis e O. nigripes típicas de áreas de Mata Atlântica. Comparando-se os animais coletados

neste estudo com a riqueza de espécies apontada no plano de manejo do PEC (IAP 2002), observa-

se que O. nigripes e D. albiventris eram esperados para a região. A partir deste estudo, a espécie A.

montensis foi descrita pela primeira vez para a área do Parque Estadual do Cerrado, aumentando a

lista de espécies desta Unidade de Conservação. Outras espécies esperadas (IAP 2002, Tiepolo

2007) não foram capturadas como o marsupial Gracilinanus agilis e os roedores Akodon serrensis,

Necromys lasiurus, Nectomys squamipes, Oligoryzomys flavescens e Thaptomys nigrita. Dentre

estas, apenas as espécies do gênero Calomys e N. lasiurus podem ser consideradas espécies típicas

do bioma Cerrado. A baixa riqueza de espécies típicas de Cerrado pode estar relacionada aos

impactos decorrentes da pressão de atividades agrícolas no entorno do PEC ou ainda ao fato de

estas áreas serem na verdade refúgios disjuntos de Cerrado relictual, remanescentes dos processos

de retração pós-glacial (Straube 1998, Straube et al. 2005).

Espécies Amostradas e Áreas de Ocorrência

As espécies de roedores, Akodon montensis e Oligoryzomys nigripes ocorreram em todas as

unidades de paisagem e em todas as diferentes áreas de estudo, desde ambientes silvestres com

matas mais preservadas até áreas de bordas de mata e de interface entre o ambiente silvestre e o

ambiente rural/peridomiciliar. Estas espécies são consideradas de hábitos generalistas (Dalmagro &

Vieira 2005, Umetsu & Pardini 2007, Püttker et al. 2008, Goodin et al. 2009, Owen et al. 2010) e

em geral ocorreram em altas abundâncias com exceção das áreas remanescentes de Cerrado onde

suas abundâncias foram baixas.

40

A espécie Thaptomys nigrita também apresentou ampla distribuição ocorrendo em 3

municípios pertencentes a 3 unidades de paisagem diferentes (FM, FD e FS), desde áreas mais

preservadas (mata nativa de General Carneiro, mata contínua de Paranaguá e PNI) até áreas

alteradas (divisa entre mata nativa degradada e reflorestamento de Pinus). Entretanto em todas as

áreas de estudo apresentou baixas abundâncias. Segundo Oliveira & Bonvicino (2011), T. nigrita

pode ocorrer desde vegetação conservada a alterada, sendo muito comum em algumas áreas e rara

ou pouco abundante em outras, dependendo da região de estudo. Umetsu & Pardini (2007), em

estudo realizado em uma região de transição entre FD e FS no Estado de São Paulo observaram

uma maior vulnerabilidade de T. nigrita a fragmentação florestal e Pardini et al. (2005)

relacionaram a presença desta espécie a áreas mais preservadas e a interior de florestas maduras. Já

Tiepolo (2007) encontrou esta espécie em áreas de vegetação secundária e em regeneração na FD

do Paraná, ressaltando sua tolerância em ocupar ambientes antropizados, além de relacioná-la a

eventos de “ratada” em uma área de FM no Estado do Paraná, que é a explosão populacional

sincrônica à frutificação de taquaras.

Os roedores Euryoryzomys russatus e Sooretamys angouya e os marsupiais Didelphis aurita

e Didelphis albiventris se distribuíram em mais de uma unidade de paisagem. Euryoryzomys

russatus foi encontrado em FD e FJ (Paranaguá e em fragmentos florestais de Jaguariaíva,

respectivamente), e S. angouya foi encontrado em FD e FM (Paranaguá e General Carneiro,

respectivamente). As duas espécies apresentaram baixas abundâncias. As informações acerca da

tolerância de Euryoryzomys russatus a alterações ambientais são controversas. Passamani &

Fernandez (2011), estudando áreas fragmentadas em uma região de Mata Atlântica (Santa

Teresa/ES), observaram tolerância de E. russatus à fragmentação florestal, uma vez que apresentou

correlação negativa entre abundância e tamanho do fragmento. Entretanto outros estudos realizados

em áreas fragmentadas e contínuas na Mata Atlântica do Estado de São Paulo observaram ser E.

russatus uma espécie sensível à fragmentação florestal, sendo significativamente mais comum em

áreas contínuas (Pardini et al. 2005, Umetsu & Pardini 2007, Naxara et al. 2009). Sooretamys

angouya é uma espécie considerada comum mas não abundante (Bonvicino et al. 2002, Lima et al.

2010), sendo encontrada em fragmentos em estágio inicial de regeneração ou sujeitos a altos graus

de alteração, apresentando entretanto, maiores abundâncias em fragmentos conectados a outros

(Pardini et al. 2005, Umetsu & Pardini 2007).

As duas espécies do gênero Didelphis são reconhecidamente de hábitos generalistas,

tolerantes a fragmentação e à áreas perturbadas, além de possuir a capacidade de atravessar

diferentes tipos de matrizes (Fonseca & Kierulff 1989, Passamani & Ribeiro 2009, Passamani &

Fernandez 2011). Em nosso estudo ambas ocorreram em áreas de peridomicílio e bordas de

41

fragmentos florestais embora D. aurita tenha sido encontrado também no Parque Nacional do

Iguaçu.

Akodon paranaensis e o marsupial M. dimidiata, apesar de ocorrerem em mais de uma

região de estudo, eram restritas a uma mesma unidade de paisagem (FM), tendo sido encontrados

tanto em áreas de mata nativa em General Carneiro, quanto em áreas modificadas (divisa mata

nativa degradada/Pinus em General Carneiro, área urbana de Curitiba e fragmentos florestais do

município de Araucária). De fato em outros estudos, Akodon paranaensis foi encontrada tanto em

áreas preservadas de mata nativa (Pedó et al. 2010) quanto em áreas arbustivas de campos não

cultivados, sendo muito abundante nesta última (Scheibler & Christoff 2007). Da mesma forma, o

marsupial M. dimidiata foi encontrado por outros autores tanto em áreas nativas de Campos Gerais

(Pedó et al. 2010, Baladrón et al. 2012) quanto em áreas fragmentadas na Mata Atlântica do Estado

de São Paulo (Püttker et al. 2012).

Todas as outras espécies apresentaram distribuição restrita a apenas uma região de estudo.

Os roedores Akodon serrensis e Oxymycterus judex ocorreram tanto nas áreas nativas de Araucárias

quanto na divisa entre mata nativa degradada e áreas de silvicultura em General Carneiro, sendo que

apenas A. serrensis apresentou altas abundâncias. A restrição de Akodon serrensis a esta região está

associada ao fato de esta espécie ocorrer principalmente em regiões de maior altitude (Olifiers et al.

2007, Tiepolo 2007). Oxymycterus judex é uma espécie encontrada em áreas de florestas, mas

principalmente em áreas impactadas como bordas de fragmentos, áreas abertas de agricultura e

áreas de vegetação alterada (Silva 2001, Graipel et al. 2006, Vaz et al. 2007, Rossi 2011).

Calomys tener e Oxymycterus sp. ocorreram apenas na região de Jaguariaíva, sendo que a

primeira nas áreas de Cerrado do PEC e a segunda nos fragmentos florestais. Calomys tener é uma

espécie típica de Cerrado podendo ocorrer também em áreas abertas de Floresta Estacional

Semidecidual (Umetsu & Pardini 2007, Martin et al. 2012). Possui hábitos generalistas e na Mata

Atlântica ocorre principalmente em áreas alteradas como pastagens, áreas de agricultura, áreas de

silvicultura em estágios iniciais de crescimento, além de áreas rurais próximas a habitações

humanas (Bonvicino et al. 2002, Umetsu & Pardini 2007, Gheler-Costa et al. 2012, Martin et al.

2012). Além disso, é usada como espécie indicadora de ambientes alterados em áreas perturbadas e

afetadas por fogo (Briani et al. 2004, Henriques et al. 2006).

Nectomys squamipes foi encontrado somente em FD (Paranaguá). É uma espécie de hábitos

semi-aquáticos, sendo geralmente encontrada próxima a cursos d’água (D’Andrea et al. 2007,

Gentile et al. 2010). Em nosso estudo N. squamipes foi capturado em áreas com e sem a presença de

cursos d’água. Possui ampla distribuição geográfica ocorrendo em vegetação alterada e conservada

ao longo de sua distribuição (Bonvicino et al. 2002, Oliveira & Bonvicino 2011).

42

Diagnóstico de Infecção por Hantavírus

Os resultados da infecção por hantavírus nos roedores citados acima foram publicados em

Raboni et al. (2009b) e Raboni et al. (2012), artigos que fazem parte dos resultados deste capítulo.

As espécies A. montensis e O. nigripes são as principais espécies hospedeiras de hantavírus

no Estado do Paraná, considerando que 9 espécimes destas duas espécies foram encontradas

infectadas (Akodon montensis/JABV e Oligoryzomys nigripes/JUQV). A. montensis e O. nigripes

são espécies de hábitos generalistas, sendo muitas vezes encontradas próximas de habitações

humanas (Suzuki et al. 2004), o que reforça sua importância na transmissão de SPH. O fato de

terem sido observadas infectadas em diferentes ambientes demonstra que o ciclo de transmissão de

hantavírus entre os roedores ocorre independente do grau de conservação da área ou mesmo da

unidade de paisagem. Assim, o comportamento de risco humano, por exemplo, tipo de atividade

laboral, é um fator determinante para a ocorrência da transmissão dos hantavírus dos roedores para

o homem.

Em relação às outras espécies capturadas, apenas um indivíduo de Oxymycterus judex foi

encontrado infectado por JUQV, no município de General Carneiro. Esta infecção caracteriza um

spillover já que O. nigripes é considerado o hospedeiro primário deste genótipo viral. A

caracterização de O. nigripes como hospedeiro primário não se deve apenas ao fato desta espécie ter

sido a primeira descrita como hospedeira de JUQV (Suzuki et al. 2004). Outras características

ecológicas importantes podem confirmar esta hipótese, como a abrangência geográfica desta

associação, sendo esta espécie encontrada infectada em diversas regiões de Mata Atlântica (Suzuki

et al. 2004, Pereira et al. 2007, Oliveira et al. 2009), ou ainda seu caráter temporal, sendo O.

nigripes encontrado infectado por JUQV ao longo do ano (Oliveira 2012). No município de General

Carneiro outra associação do tipo spillover ocorreu, tendo sido encontrado um espécime de A.

montensis também infectado por JUQV. Da mesma forma, A. montensis pode ser considerado o

hospedeiro primário de JABV, já que neste estudo identificamos esta associação em diversas

regiões (Raboni et al. 2012), além de confirmarmos seu caráter temporal (ver capítulo 2).

Outras espécies observadas neste estudo como S. angouya e C. tener já foram reportadas

com infecção por hantavírus em estudos anteriores. Em S. angouya foi reportada sororreatividade

para hantavírus, entretanto sem confirmação molecular, na região de Jaborá/SC (Oliveira et al.

2011), e em C. tener foi reportada sororreatividade para hantavírus (Suzuki et al. 2004, Limongi et

al. 2013) e confirmação de infecção spillover pelo Vírus Araraquara (ARAV) (Figueiredo et al.

2010) em áreas de Cerrado de São Paulo e Minas Gerais.

43

Ferimentos provenientes de encontros agonisticos são considerados a principal forma de

transmissão de hantavírus entre os roedores, mais frequentemente observados em machos adultos

(Glass et al. 1988, Boone et al. 1998, Yahnke et al. 2001, Mills et al. 2007, Piudo et al. 2011, Vadell

et al. 2011). Neste estudo, todos os 10 animais encontrados infectados eram machos e 50% destes

apresentavam cicatrizes, forma indireta de se determinar a ocorrência de encontros agonísticos.

Dentre os 10 animais sororreativos, dois espécimes (um O. nigripes e um A. montensis provenientes

de Paranaguá) não apresentaram confirmação de infecção através da RT-PCR.

A partir dos resultados gerados neste estudo observou-se um perfil diferenciado na relação

especifica hospedeiro-vírus, nas áreas de estudo do município de General Carneiro. Diferente das

outras regiões, aonde aparentemente havia uma especificidade entre genótipo viral e espécie de

roedor hospedeiro, em General Carneiro foi observada a ocorrência de spillover de JUQV em duas

espécies (A. montensis e O. judex), diferentes do hospedeiro primário O. nigripes. Estes resultados

motivaram o estabelecimento de novos objetivos para melhor compreensão do complexo ciclo de

hantavírus nesta região, gerando um estudo de ecologia de populações e de comunidades de

roedores hospedeiros (capítulos 2 e 3 desta tese).

ShortCommunication

Phylogenetic characterization of hantaviruses fromwild rodents and hantavirus pulmonary syndromecases in the state of Parana (southern Brazil)

Sonia Mara Raboni,1,2 Federico G. Hoffmann,1 Renata C. Oliveira,3

Bernardo R. Teixeira,3 Cibele R. Bonvicino,4 Vanessa Stella,1

Suzana Carstensen,1 Juliano Bordignon,1 Paulo S. D’Andrea,3

Elba R. S. Lemos3 and Claudia Nunes Duarte dos Santos1

Correspondence

Claudia Nunes Duarte

dos Santos

[email protected]

1Instituto Carlos Chagas, ICC/Fiocruz/PR, Brazil

2Universidade Federal do Parana, Brazil

3Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, Rio de Janeiro, Brazil

4Instituto Nacional de Cancer, Rio de Janeiro, Brazil

Received 6 March 2009

Accepted 10 May 2009

Over 1100 cases of hantavirus pulmonary syndrome (HPS) have occurred in Brazil since 1993,

but little is known about Brazilian hantaviruses, and many of their rodent hosts remain unknown.

The Araucaria hantavirus (ARAUV) was described recently from HPS patients from Parana, in

southern Brazil, but its host could not be identified. In this study, rodents were captured from

regions with high HPS prevalence to address this issue. ARAUV RNA was detected in three

distantly related rodent species: Oligoryzomys nigripes, Oxymycterus judex and Akodon

montensis. Furthermore, a specimen of A. montensis was infected with a Jabora-like virus,

implying that A. montensis can be infected by at least two different hantaviruses. The presence of

the same hantavirus strain in three different rodent species and the co-circulation of two different

strains in the same rodent species highlight the potential for genomic reassortment, which could

have an impact on hantavirus transmission dynamics in nature and on human epidemiology.

Hantaviruses belong to the genus Hantavirus in the familyBunyaviridae and are found throughout most of the world.Similar to other members of the family, hantaviruses areenveloped viruses with an RNA genome comprised of threenegative-sense, single-stranded segments. The large (L)RNA segment encodes an RNA-dependent RNA polymer-ase, the medium (M) segment encodes two envelopeglycoproteins – Gn and Gc – processed from oneprecursor, and the small (S) segment encodes thenucleocapsid protein (N) (Plyusnin et al., 1996).

Hantaviruses use small mammals as vectors, and in thewild, most of the different hantaviruses have been found toassociate predominantly with a specific rodent species thatacts as the host in a given geographical region (Plyusnin &Morzunov, 2001). Although sporadic spillover betweenrodents species has been suggested (Childs et al., 1994;Delfraro et al., 2008; Sousa et al.,. 2008), conclusiveevidence that the studied viruses can establish productiveinfections in more than one rodent host species is stillmissing.

Hantaviruses are transmitted to humans mainly throughthe inhalation of contaminated aerosols of rodent excreta(Lednicky, 2003; Schmaljohn & Patterson, 2001), buthuman-to-human transmission has also been described(Padula et al., 1998). These viruses are associated with twoclinical syndromes, haemorrhagic fever with renal syn-drome, described in Europe and Asia with a mortality rateof 1–15 %, and hantavirus pulmonary syndrome (HPS),described in the Americas with a mortality rate rangingfrom 40 to 60 % (Lundkvist & Niklasson, 1994; Johnsonet al., 1999).

Despite the increasing incidence of HPS in Brazil(Elkhoury, 2005), little is known about the genetic diversityof its causative agents, Brazilian hantaviruses (Table 1), andidentification of their rodent hosts remains incomplete.The south-western region of the state of Parana (southernBrazil, 26u 079 S 51u 319 W) is one of the most heavilyaffected areas of Brazil, with a high number of HPS cases:168 cases have been reported since 1993, 52 of which werefatal (Elkhoury, 2005). Two rodent species hostinghantavirus antibodies have been identified in the region:Oligoryzomys nigripes and Akodon sp. (Suzuki et al., 2004).In addition, our group recently described the complete S

The GenBank/EMBL/DDBJ accession numbers for the sequencesreported in this paper are FJ409556–FJ409561, FJ798975 andFJ798976.

Journal of General Virology (2009), 90, 2166–2171 DOI 10.1099/vir.0.011585-0

2166 011585 G 2009 SGM Printed in Great Britain

sequence of a hantavirus termed Araucaria (ARAUV)isolated from HPS patients from Parana state, anddemonstrated that it is closely related to the O. nigripes-associated strains ITA37 and ITA38 from neighbouringParaguay (Raboni et al., 2005). Unfortunately, we were notable to identify the rodent species that was locallyassociated with ARAUV at the time or to characterize theother genomic fragments of ARAUV. The latter isimportant to permit comparison with viruses for whichonly sequences of the M segment are known, and to be ableto detect genomic reassortment among the segments. Thecurrent study focused on elucidating the local rodent hostof ARAUV and characterizing the M segment of thegenome from viruses isolated in rodents and in humanpatients.

To identify the rodent species acting as host to ARAUV, wesampled rodents in Parana and searched for the presence ofARAUV-like RNA in seropositive rodents. Collectingefforts were maximized in areas with reported HPS cases.Fieldwork was conducted in November 2006 and rodentswere captured by using Tomahawk (40.6612.7612.7 cm)and Sherman (7.669.5630.5 cm) live traps set in six sites(in rural and natural environments) in areas of HPSinfection. Capture sessions were carried out in a total of 16linear transects with 20 capture stations on each at 10 mintervals, for five nights, for a total of 1426 trap-nights forthe whole study. The most abundant species were Akodonmontensis and Akodon serrensis and the overall capturesuccess was 5 %. Six different genera and at least eightdistinct species (seven rodent and one marsupial species)were recorded: A. montensis (31 specimens), A. serrensis(19), Akodon paranaensis (five), O. nigripes (seven),Thaptomys nigrita (three), Oxymycterus (Oxy.) judex(two), Sooretamys angouya (two) and two marsupials ofthe genus Monodelphis. Of the 69 captured rodent speci-mens from the subfamily Sigmodontinae, three had IgGantibodies against hantavirus (two specimens of A.montensis and one specimen of Oxy. judex).

All specimens were identified initially using external andcranial morphological analysis, and the identification ofseropositive individuals was confirmed by karyological andmolecular comparisons using the primers and conditionsdescribed by Delfraro et al. (2008). Seropositive animalswere deposited as voucher specimens at the NationalMuseum (MN), State of Rio de Janeiro; the remainder of

the specimens will be deposited once their taxonomicstatus is resolved.

Blood and tissue samples were obtained following standardfield biosafety procedures (Mills et al., 1995) and stored inliquid nitrogen for further processing. All blood sampleswere screened by enzyme immunoassay for hantavirusantibodies using both ARAUV (Raboni et al., 2007) andAndes virus (ANDV) (Padula et al., 2000) antigens. ViralRNA was extracted from the lungs and kidneys ofseropositive rodents using TRIzol (Gibco) and submittedto RT-PCR to detect and amplify fragments of the viralgenome. Amplicons for a fragment of the viral S segmentwere obtained using the primers and conditions describedby Raboni et al. (2005). To complement the geneticcharacterization, we sequenced a rodent-derived M seg-ment from the specimen with the highest quality viralRNA: the specimen of Oxy. judex. In addition to studiesabout the local hosts of ARAUV, we also improved on thegenomic characterization of the viral strain responsible forthe HPS cases in the vicinity where rodents were captured.We sequenced the complete M segment from one of theseHPS patients (HRP/02-72) and partially sequenced the Msegment of two patients from the same area (HPR/02-71and HPR/03-97). For the human-derived viruses, viralRNA was extracted from blood samples of HPS patientsusing a high pure viral RNA kit (Roche Applied Science).cDNA corresponding to the complete M segment wassynthesized using a specific primer and an ImProm-IIreverse transcription system (Promega), following themanufacturer’s protocol. The resulting cDNA was sub-jected to PCR. Two fragments, of 1679 and 2019 bp, weregenerated and these covered the complete M segment. Inall cases, fragments were sequenced with BigDye3 (AppliedBiosystems) using PCR primers (sequences available onrequest). The resulting chromatographs were verifiedvisually using vector NTI software (Invitrogen).

The largest open reading frame of the 3417 nt M segmentfrom patient HRP/02-72 encoded a glycoprotein precursorfrom nt 52 to 3468. The ARAUV Gn glycoprotein extendedfrom aa 1 to 651 (nt 52–2004), including the conservedputative cleavage WAASA motif (aa 647–651), and the Gcglycoprotein extended from aa 652 to 1139 (nt 2005–3466).Five putative N-linked glycosylation sites at residues 138,350, 402, 524 and 930 were predicted for ARAUVglycoprotein precursor as well as the three main O-

Table 1. Brazilian hantaviruses and their putative reservoirs

Hantavirus Putative reservoir Place of detection (Brazil) Reference

Juquitiba-like virus Oligoryzomys nigripes Parana and Santa Catarina Suzuki et al. (2004)

Araraquara virus Necromys lasiurus Sao Paulo and Minas Gerais Suzuki et al. (2004)

Castelo dos Sonhos Unknown Para Figueiredo et al. (2009)

Anajatuba virus Oligoryzomys fornesi Maranhao Rosa et al. (2005)

Rio Mearin virus Holochilus sciureus Maranhao Rosa et al. (2005)

Laguna Negra-like virus Calomys laucha Mato Grosso Figueiredo et al. (2009)

Jabora virus Akodon montensis Santa Catarina Padula et al. (2007)

Characterization of hantaviruses in southern Brazil

http://vir.sgmjournals.org 2167

glycosylation clusters at residues 96, 306 and 582 (Tischleret al., 2003).

In our study, we found two specimens of A. montensis(10027 and 10028) and one of Oxy. judex (10056) that werepositive by enzyme immunoassay for ARAUV and ANDVhantavirus IgG antibodies and viral RNA, indicating thatthey were infected with hantavirus. The seropositiverodents were collected on different days in the sametrapping period and on different transects of capture. Thevoucher numbers and capture coordinates of infectedrodents were: MN 71600 (A. montensis 10027), which wascaptured in a mixed forest of pines and bamboos (26u 339

12.00 S 51u 239 46.10 W); MN 71601 (A. montensis 10028),which was captured in an area of forest regrowth (26u 249

36.90 S 051u 239 43.30 W); and MN 71602 (Oxy. judex10056), which was captured in an area of primary forestwith large trees (26u 289 49.40 S 051u 199 17.80 W). Nucleicacid extractions and PCR assays of seropositive rodentswere performed in three independent laboratories withdifferent unopened aliquots, and identical results wereobserved in all cases, thus confirming the findings.

To characterize the genetic diversity of the viral strainsisolated in the state of Parana and assess their phylogeneticrelationships, we compared the obtained sequences to areference panel that covered most hantavirus diversityfrom South America. Reference sequences were down-loaded from public databases for the two segments used inthis study (M and S). Bayesian estimations of phylogenieswere conducted in MrBayes version 3.1.2 (Ronquist &Huelsenbeck, 2003), running four simultaneous chains for26106 generations, sampling trees every 1000 generationsand using default priors. We used a general time-reversiblemodel of nucleotide substitution (Rodriguez et al., 1990) inwhich rate variation followed a discrete gamma distri-bution. We assessed convergence by measuring thestandard deviation of the split frequency among parallelchains. Chains were considered to have converged once themean split frequency was lower than 0.01. We summarizedthe results with a majority-rule consensus of 1500 treescollected after convergence was reached; trees collectedbefore chains reached convergence were discarded.Maximum-likelihood searches were conducted inTreefinder (October 2008 version; Jobb et al., 2004),selecting the best-fitting model of nucleotide substitutionusing the Bayesian Information Criterion model selectionroutine in Treefinder. We evaluated support for the nodeswith 1000 bootstrap pseudoreplicates.

In all sequence comparisons of the viral S segment, weincluded the sequence from a specimen of O. nigripes(10091) trapped in another region of Parana state, as Ssegment sequences from the O. nigripes-associated ARAUVreported by Suzuki et al. (2004) do not overlap with thefragment used in this study. The viral strains isolated fromOxy. judex (10056), O. nigripes (10091) and A. montensis(10028) were all very similar (99 % sequence identity inpairwise comparisons), and phylogenies based on the

partial S segment sequences (Fig. 1) indicated that theywere all closely related to the other ARAUV sequencespreviously characterized from HPS patients (Raboni et al.,2005) and to some recently reported Juquitiba virus(JUQV)-like S segment sequences (Delfraro et al., 2008).This result shows the epidemiological link betweenARAUV from HPS patients and ARAUV found in therodents, which was missing in our previous report (Raboniet al., 2007).

Fig. 1. Maximum-likelihood tree based on a 312 nt alignment ofthe S segment, depicting phylogenetic relationships amonghantavirus sequences from Parana, southern Brazil, and areference panel of sequences obtained from GenBank. Samplesin bold correspond to sequences added in this study from the stateof Parana, Brazil. Support for relevant nodes is provided asmaximum-likelihood bootstrap support values (above) andBayesian posterior probabilities (below). Nodes with supportbelow 50 % were collapsed. Phylogenetic resolution other thangrouping strains from Parana with other strains is limited due to thelimited amount of sequence data available in public databases.Bar, 0.1 nucleotide substitutions per site.

S. M. Raboni and others

2168 Journal of General Virology 90

During our routine epidemiological assessments in thesame region of rodent capture, we found a relatively highlevel of human hantavirus seroprevalence in individualswho had never reported HPS symptoms (Raboni et al.,2007). We found that an A. montensis specimen (10027) inthis area was infected with a hantavirus genotype that was25 % different from ARAUV at the nucleotide level in thefragment of the S segment analysed. The virus fromspecimen 10027 was most closely related to Jabora virus(JABV; ~ 90 % sequence identity), isolated in SantaCatarina state (southern border of Parana state; GenBankaccession no. EF495338), and was also phylogeneticallyclose to a strain from Paraguay, on the border to the westof Parana (Chu et al., 2003). In both reports, the identifiedrodent species was A. montensis. Until now, these viruseshave not been related to human disease. The co-circulationof two hantaviruses exhibiting differences in virulencecould explain the high seroprevalence (8.4 %) observed inindividuals without disease history in this region (Raboniet al., 2007).

The complete coding region of the M segment from thehuman sample HPS/02-72 showed 73 % identity withLaguna Negra virus and 49.5 % with Seoul virus at theRNA level, and 88 and 58 % identity, respectively, at theamino acid level. Phylogenies based on the complete HPS-derived viral M segment showed that ARAUV groupedwithin the South American hantaviruses (Fig. 2a), anddistance comparisons of the complete and partial Msegment sequences of ARAUV with the reference sequencesrevealed that ARAUV was very similar to the partial JUQV-like sequences from O. nigripes trapped in this same region(Suzuki et al., 2004), corroborating the data we obtainedpreviously using the complete viral S segments from thesame HPS patients (Raboni et al., 2005). A more detailedanalysis that included partial sequences derived from twoadditional human patients (HPR/02-71 and HPR/03-97)and a rodent (Oxy. judex 10056) provided further evidenceof the strong phylogenetic affinities and high sequencesimilarities between the JUQV-like sequence reported bySuzuki et al. (2004) and the ARAUV-like virus isolatedfrom rodents and humans from Parana (Fig. 2b). Takentogether, our analyses of S and M segments demonstratedthat the sequences of ARAUV isolates were very similar toJUQV isolates reported by others (Delfraro et al., 2008;Suzuki et al., 2004), and, due to historical precedence, wepropose that ARAUV should be named JUQ-like virus.

This study provides additional evidence that the scenario ofhantavirus transmission in South America could be morecomplex than previously thought. We found highly similarhantaviruses (JUQ-like virus) occurring in three distantlyrelated rodent species (O. nigripes, A. montensis and Oxy.judex) in the same location, in agreement with theidentification of a JUQ-like virus in two different speciesin Uruguay: O. nigripes and Oxymycterus nasutus (Delfraroet al., 2008). This could be due to an incidental infection ofA. montensis and Oxy. judex with a JUQ-like virus from O.nigripes (the presumed reservoir for JUQ-like virus).

Alternatively, it could imply that host switching is morecommon than previously believed. It is worth noting thatnone of the O. nigripes specimens trapped in the area ofHPS was positive for hantavirus antibodies. In fact, JUQ-like RNA in the HPS area was obtained from A. montensisand Oxy. judex specimens, suggesting that chronicinfection in the two species is possible. We can onlyspeculate that these two rodents act as primary reservoirhosts (able to maintain and transmit the virus for longperiods), as there are few data from in vivo studies of South

Fig. 2. Maximum-likelihood trees depicting phylogenetic relation-ships between the ARAUV complete segment M sequence (a) andbased on a 500 nt alignment of the M segment, depictingphylogenetic relationships among hantavirus sequences fromParana, southern Brazil (b), compared with a reference panel ofsequences obtained from GenBank. Samples in bold correspondto sequences from this study from the state of Parana (HPRindicates sequences that are from human patients). Support forrelevant nodes is provided as maximum-likelihood bootstrapsupport values (above) and Bayesian posterior probabilities(below). Nodes with support below 50 % were collapsed. Bars,0.1 nucleotide substitutions per site.



American species. The possibility of human infectionthrough contact with these infected rodents is real, andtherefore further investigation of this issue is needed. Thefact that Oxy. judex could act as a hantavirus reservoirdeserves consideration, as this species has broad geograph-ical distribution in areas of HPS transmission in the southof Brazil (Hoffmann et al., 2002).

We found two distantly related viruses (JUQ-like virus andJABV) infecting the same rodent host species: A. montensis.Previously, JABV (GenBank accession no. EF492471) RNAwas isolated from A. montensis rodents in southern Brazil,and Chu et al. (2006) found RNA from a hantavirus similarto JABV (strain IP16, GenBank accession no. DQ345764)in A. montensis specimens from Paraguay. More recently,an IP16-related hantavirus, strain AC210py (GenBankaccession no. EU373732), was identified from a specimenof Akodon cursor from Paraguay (Padula et al., 2007). Sofar, no Akodon-borne hantavirus has been reported to beassociated with HPS cases in South America (Padula et al.,2007), but precise determination of the true reservoir ofJAB-like viruses is needed if we are to elucidate thetransmission cycle and role of these viruses in nature.Infection of the same species by distantly related hanta-viruses could be interpreted as incidental, but theepidemiological relevance of this infection is not clear.However, the co-circulation of two distinct hantavirusgenotypes with the associated potential for genomicreassortment could have an impact on hantavirus trans-mission dynamics in nature, and thus on humanepidemiology.

Acknowledgements

We are indebted to Giselia Rubio and Edson dos Santos from

Departamento de Vigilancia, SESA-PR, Edilsom Semczuk from

Centro de Controle de Zoonoses of Foz do Iguacu for helping with

rodent trapping logistics. We are also grateful to Drs Adriana Delfraro

and Juan Arbiza from Universidad de la Republica, Montevideo,

Uruguay, for confirming viral sequencing data and Dr Christian

Probst for helpful discussions. We thank Paulo Arauco for technical

assistance in sequencing. The authors thank CNPq, CNPq/Prosul,

Fiocruz, Fundacao Araucaria, CYTED/RIVE and Fundo Parana for

financial support. C. N. D. S., P. S. D. and C. R. B. are CNPq fellowship

recipients.

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Sonia M. Raboni, Adriana Delfraro, Luana de Borba, Bernardo R. Teixeira, Vanessa Stella, Marina R. de Araujo,Suzana Carstensen, Giselia Rubio, Angela Maron, Elba R. S. Lemos, Paulo S. D’Andrea, and Claudia N. Duarte dos Santos*

Instituto Carlos Chagas, Fiocruz, Parana, Brazil; Universidade Federal do Parana, Parana, Brazil; Universidad de la Republica,Montevideo, Uruguay; Programa de Pos Graduacao em Biologia Parasitaria, Fiocruz, Rio de Janeiro, Brazil;Secretaria de Saude do Estado do Parana, Brazil; Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, Rio de Janeiro, Brazil

Abstract. Parana state presents the fourth highest number of accumulated cases of hantavirus pulmonary syndromein Brazil. To map the risk areas for hantavirus transmission we carried out a study based on rodent trapping anddetermined the anti-hantavirus seroprevalence in these animals and in the inhabitants of these localities. Overallseroprevalence in rodents and humans were 2.5% and 2.4%, respectively. Eighty-two percent of the seropositive rodentswere genetically analyzed. Phylogenetic analyses revealed that hantaviruses from rodent samples cluster with Araucaria(Juquitiba-like) or Jabora hantavirus genotypes. The Jabora strain was identified in Akodon serrensis and Akodonmontensis, whereas the Araucaria strain was detected in Oligoryzomys nigripes, Oxymycterus judex, A. montensis, andAkodon paranaensis, with the latter species being identified for the first time as a natural host. These findings expose thecomplex relationships between virus and reservoirs in Brazil, which could have an impact on hantavirus transmissiondynamics in nature and human epidemiology.

INTRODUCTION

Hantaviruses (Bunyaviridae) are emerging rodent-borneand soricomorpha-borne viruses. Two diseases related to han-tavirus infection are known, hemorrhagic fever with renalsyndrome (HFRS) occurring in Eurasia, and hantavirus pul-monary syndrome (HPS), in the Americas.1,2 New Worldhantaviruses are hosted by rodents of the Cricetidae family(subfamilies Sigmodontinae, Arvicolinae, and Neotominae),and by Soricomorpha mammals (families Soricidae andTalpidae). Sigmodontine and neotomine rodents are the mainhosts of hantaviruses known to cause HPS. The hantavirusgenus, includes pathogenic and non-pathogenic viruses, withmore than 21 species and 30 genotypes.3–5

Since the first description of HPS in the Americas, hanta-virus infections are considered a reportable disease in Brazil.Until October 2011, a total of 1,404 cases were confirmed inthe country, with a 39% mortality rate (Secretary of HealthSurveillance, Brazilian Health Ministry, 2011). Southern Brazilreports the highest number of hantavirus infection in Brazil(~40%) and 38% of these cases occur in the state of Parana.In previous studies, we reported the complete genetic char-

acterization of the S and M segments from the Araucaria(Juquitiba-like) hantavirus involved in HPS cases in Paranastate, South Brazil.6,7 This region borders Paraguay andArgentina in the West and the states of Santa Catarina (South)and Sao Paulo (North). Its main economic activities are agricul-ture, reforestation, and ecotourism. Over the last 7 years ourgroup has monitored HPS cases reported in Parana by per-forming genetic analyses to determine the viral genotypes asso-ciated with these cases and rodent trapping to identify thespecies involved in hantavirus transmission. Epidemiologicalstudies have revealed substantial differences in antibody preva-lence in humans and rodents among the various regions of SouthBrazil, indicating that some communities are experiencing highfrequencies of virus exposures7–9 Since 2008, a collaborative

network involving our institute, the State Health Departmentof Parana and the Laboratory of Biology and Parasitology ofWild Mammals Reservoirs in Fiocruz, Rio de Janeiro hasbeen responsible for carrying out programmed collections ofwild rodents in different ecosystems throughout the state ofParana and for collecting sera from individuals living in theseareas. The aims of this program are to determine the distri-bution of wild rodents, the prevalence of anti-hantavirus anti-bodies in rodents and humans, and to identify the virusgenotypes circulating in the surveyed areas. This informationis then used to delineate necessary control measures.

MATERIAL AND METHODS

A cross-sectional study was conducted from November2006 through March 2011 to measure the anti-hantavirus IgGantibody prevalence in rodents and human population. Inaddition, the detected viruses were genetically characterized.The procedures involving the use of human serum samples

and the manipulation of small mammals were reviewed andapproved by the Ethical Committee from the BrazilianMinistryof Health (CONEP) under protocol no. 10573 for the humansamples, and no. IAP/PR 292/11 for the animal handling.Study locations. Expedition sites were defined on the basis

of reported cases of HPS and on the environmental diversityof the locations, taking into account vegetation type, eco-nomic activity, and population density.Rodent capture.A professional staff trained in the capturing

and handling of small mammals captured the animals usingTomahawk (40.6 cm + 12.7 cm + 12.7 cm; Tomahawk, WI)and Sherman (7.6 cm + 9.5 cm + 30.5 cm; Tallahassee, FL)live traps set at different sites ranging from wild environmentsto peridomestic areas (including altered habitats, secondaryforests, and rural areas. In addition, in the municipalities withreported human cases, live traps were also set around probableinfection sites. Traps were baited with a mixture of peanutbutter, banana, oats, and bacon. The animals were identifiedby morphologic characteristics and further by karyological andgenetic analyses. Blood and organs (lung, liver, kidney, andspleen) were collected aseptically. Tissues were frozen in liquid

* Address correspondence to Claudia N. Duarte dos Santos, InstitutoCarlos Chagas/Fiocruz PR, Rua Prof. Algacyr Munhoz Mader 3775 –

CIC, 81350-010, Curitiba, PR, Brazil. E-mail: [email protected]

371

nitrogen and blood was kept at 4°C during transport to thelaboratory facilities. All procedures were performed after pre-viously reported standards of biosafety.10

Antibodies assays.Rodent blood samples were screened forimmunoglobulin G (IgG) anti-hantavirus antibodies using anindirect enzymatic immunoassay kit (Hantec, Curitiba, Parana,Brazil) employing a recombinant Araucaria nucleoprotein,according to the manufacture’s instructions.8 The rodentsfound to be seropositive and reverse transcription-polymerasechain reaction (RT-PCR) positive to hantavirus were furtherconfirmed at species level by mitochondrial DNA (cyto-chrome B) sequencing.11 Serum samples were collected frommembers of the resident population by peripheral blood col-lection, after they had signed a consent form to participate inthe study. Individuals < 18 years of age were excluded fromthe study. Human sera samples were collected depending onthe availability of health care professionals to perform veinpuncture procedure at the same locals of rodent trapping.Sampling of humans and rodents were done at same time.Blood samples were screened for IgG anti-hantavirus anti-bodies using the Hantec kit and positive samples were con-firmed by an immunoblotting assay.Hantavirus genetic characterization. Tissues (lung, liver,

and/or kidney) from antibody-positive rodents were analyzedby RT-PCR to amplify the partial S segment. The moleculartests were carried out using various sets of primers that havebeen described previously.6,7,12 The PCR products were puri-fied (High Pure PCR kit, Roche Inc., Mannheim, Germany)and both strands were sequenced by the commercial Macrogenfacility (Seoul, Republic of Korea).Sequence analyses. Genomic sequences of the partial S seg-

ment were aligned with hantavirus sequences retrieved fromGenBank. A total of 60 S segment sequences were analyzed,including the main South American hantavirus genotypes, andrepresentative virus genotypes from North American and

Eurasia (see figure legends for details). Alignments wereconstructed using the BioEdit v7.0.9.0 package. For phyloge-netic inferences, the best-fit model of evolution and associatedparameters were calculated using ModelGenerator software(http://bioinf.may.ie/software/modelgenerator). Phylogenies wereconstructed using the Bayesian inference method (MrBayesv3.1.2; http://mrbayes.csit.fsu.edu) and the maximum likeli-hood (ML) method (PhyML v3.0.13 Bayesian analyses wereconducted under the general time reversible + gamma + pro-portion invariant model. Two runs of four chains each (onecold, three heated, temperature 0.20) were run for three mil-lion generations; trees were sampled every 100 generations.Convergence was assessed by using the average standarddeviation in partition frequency values across independentanalyses with a threshold value of 0.01; burn-in was set to25%. For the ML estimation of phylogeny, the model of evo-lution and parameters used were as described above, initialtrees were calculated using the BioNJ option and the treesearching option was set to NNI. For both analyses, sequencesof the Hantaan and Seoul hantaviruses were used as outgroupspecies. The node supports were calculated using the approx-imate likelihood ratio test (aLRTs).14

RESULTS

Places of collection.A total of 11 trapping expeditions werecarried out until March 2011 with a general trap success near4.5%. Figure 1 shows the regions studied and those havinghantavirus-positive results. Seven hundred forty-eight smallmammals were captured during the study; 667 of them wererodents. The genus and/or species of these animals and theirdistribution by region are shown in Table 1.Prevalence of anti-hantavirus IgG in rodent and human

populations. A total of 2.5% (17 of 667) of the trappedrodents were anti-hantavirus IgG-positive and 88% (15 of 17)

Figure 1. State of Parana, Brazil.▴: Places of collections. ª: Rodents with positive serology for hantavirus.

372 RABONI AND OTHERS

were also found to be hantavirus-positive by RT-PCR. Humanseroprevalence analysis was performed for a total of 1,038 serarandomly collected from adults (> 18 years of age) withoutreported classical HPS signs, in which an overall of 2.4%(25 of 1,038) were anti-hantavirus IgG-positive (Table 2).General Carneiro county, located in the southern area of

Parana, is the region with the highest incidence of HPS cases.In this locality, three capture expeditions were conducted atthree different times (November 2006, December 2009, andMarch 2010). Regarding the other regions reported in thisstudy, one capture expedition was performed per locality.The original vegetation of General Carneiro county wasAtlantic interior forest, but this has been gradually replacedby pine tree reforestation, which represents the main eco-nomic activity. The majority of the HPS patients in this regionworked in wood extraction in the secondary growth forests.7

A total of 214 small mammals were captured in three expedi-tions and their identification is displayed in Table 1. Eightseropositive rodents were detected in General CarneiroCounty and this locality displayed the highest prevalence ofanti-hantavirus antibodies in human population, comparedwith the other studied areas (8.4%), (Table 2).

Table 1

Small mammals captured in State of Parana, Southern Brazil,2006–2009

Place and date of collectionTotal of collection Small mammals N (%)

SouthernGeneral Carneiro(26 °25¢3900S 51 °18¢5600W)November, 2006 N = 72

RODENTIAAkodon montensis 31 (44%)Akodon serrensis 20 (28%)Akodon paranaensis 4 (6%)Oligoryzomys nigripes 7 (10%)Thaptomys nigrita 3 (4%)Oxymycterus judex 2 (2%)Sooretamys angouya 2 (2%)DIDELPHIMORPHIAMonodelphis sp. 3 (4%)

General CarneiroDecember, 2009 N = 57

RODENTIAAkodon serrensis 30 (53%)Akodon montensis 10 (18%)Akodon paranaensis 4 (7%)Oxymycterus judex 7 (12%)Thaptomys nigrita 3 (5%)Sooretamys angouya 1 (2%)DIDELPHIMORPHIAMonodelphis sp. 2 (3%)

General CarneiroMarch, 2010 N = 85

RODENTIAAkodon serrensis 26 (31%)Akodon montensis 24 (28%)Akodon paranaensis 6 (7%)Oxymycterus judex 18 (21%)Oligoryzomys nigripes 2 (2%)DIDELPHIMORPHIAPhilander frenatus 4 (5%)Monodelphis sp. 4 (5%)Lutreolina crassicaudata 1 (1%)

NortheasternItambaraca(22 °58¢2100S 50 °28¢4400W)N = 74

RODENTIAAkodon montensis 14 (19%)Mus musculus 25 (34%)Oligoryzomys nigripes 11 (15%)Rattus rattus 4 (5%)DIDELPHIMORPHIADidelphis albiventris 20 (27%)

Jaguariaıva(24 °15¢0400S 49 °42¢2100W)N = 54

RODENTIAAkodon montensis 21 (39%)Calomys tener 12 (22%)Oligoryzomys nigripes 6 (11%)Euryoryzomys russatus 8 (15%)Oxymycterus sp. 5 (9%)DIDELPHIMORPHIADidelphis albiventris 2 (4%)

NorthwesternPorto Rico(22 °46¢2000S 53 °16¢0100W)N = 45

RODENTIAOligoryzomys sp. 18 (40%)Akodon sp. 10 (22%)Oecomys bicolor 6 (13%)Thaptomys nigrita 5 (11%)Mus musculus 3 (7%)Calomys tener 2 (5%)Rattus rattus 1 (2%)

WesternFoz do Iguacu(25 °32¢5200S 54 °35¢1700W)N = 115

RODENTIAAkodon montensis 62 (54%)Mus musculus 44 (39%)Oligoryzomys nigripes 3 (2%)Thaptomys nigrita 3 (2%)DIDELPHIMORPHIA 2 (2%)Didelphis aurita 1 (1%)Didelphis albiventris

(Continued)

TABLE 1Continued

Place and date of collectionTotal of collection Small mammals N (%)

Central-WesternLaranjal/Palmital

(24 °53¢1200S 52 °28¢1000W/24 °53¢3500S 52 °12¢1000WN = 25

RODENTIAAkodon sp. 17 (68%)Mus musculus 6 (24%)DIDELPHIMORPHIAMonodelphis sp. 2 (8%)

EasternParanagua (Coast)

(25 °31¢1200S 48 °30¢3300W)N = 71

RODENTIAAkodon montensis 25 (35%)Oligoryzomys nigripes 18 (25%)Thaptomys nigrita 9 (13%)Nectomys squamipes 8 (11%)Euryoryzomys russatus 4 (6%)Rattus rattus 3 (4%)Sooretamys angouya 1 (2%)DIDELPHIMORPHIADidelphis sp. 3 (4%)

Curitiba(25 °25¢4000S 49 °16¢2300W)N = 27

RODENTIAAkodon montensis 7 (26%)Akodon paranaensis 7 (26%)Oligoryzomys nigripes 6 (22%)Mus musculus 3 (11%)DIDELPHIMORPHIAMonodelphis sp. 4 (15%)

Araucaria(25 °35¢3500S 49 °24¢3700W)N = 33

RODENTIAAkodon montensis 12 (37%)Akodon paranaensis 5 (15%)Oligoryzomys nigripes 9 (27%)Mus musculus 7 (21%)

Campina Grande do Sul(25 °18¢2000S 49 °03¢1900W)N = 90

RODENTIAAkodon sp. 54 (60%)Thaptomys nigrita 16 (18%)Rattus rattus 7 (8%)Oxymycterus sp. 4 (5%)Nectomys squamipes 3 (3%)Rattus rattus 1 (1%)Oligoryzomys flavescens 1 (1%)Oryzomys russatus 1 (1%)Oryzomys angouya 1 (1%)DIDELPHIMORPHIAMonodelphis sp. 2 (2%)

ANTI-HANTAVIRUS SEROLOGICAL PROFILES IN SOUTH BRAZIL 373

The municipalities of Itambaraca and Jaguariaıva, located inthe northeastern portion of Parana, are both areas of savannahand Atlantic forest fragments, where agriculture is the maineconomic activity. A total of 128 small mammals were capturedin Itambaraca and Jaguariaıva during the study (Table 1). Anti-hantavirus antibodies were found in 5% of the captured ani-mals, and no HPS cases have been reported in these areas. Noseropositive human samples were found in Itambaraca but1.3% of the serum samples from Jaguariaıva were positive.Porto Rico county, located in the northwest part of Parana,

borders with Mato Grosso do Sul. Tourism is its main sourceof income. Only one rodent capture expedition was carriedout in this region, and the seropositivity prevalence for theseanimals was 4.4% (Table 1).Foz do Iguacu (Iguacu Falls), located in the western part of

the state, is a plateau region with a subtropical climate anda subtropical rain forest, and is bordered by Paraguay andArgentina. The main economic activity is tourism, electricitygeneration, and trade. One hundred fifteen small mammalswere captured (Table 1) and all were found to be negative forhantavirus antibodies. One seropositive human serum samplewas found in this region (0.5%).Palmital and Laranjal counties are both located in Midwest-

ern region of Parana. Twenty-three rodents were trapped inthis region (Table 1), but none were positive for anti-hantavirusIgG. However, HPS cases have been reported in this localityand the human anti-hantavirus seroprevalence was 3.3%.The city of Paranagua is located in eastern Parana on the

Atlantic coast. The main economic activities of the region arerelated to the Paranagua port and trade. Seventy-two smallmammals were caught here (Table 1), four of them werepositive for anti-hantavirus IgG (5.6%). Hantavirus pulmo-nary syndrome cases have been reported in this locality.

Curitiba (the state capital of Parana) and the metropolitanregion (Araucaria and Campina Grande do Sul), located in theeastern part of the state, have a humid subtropical climate. InCuritiba, animals were trapped in peridomestic habitats nearthe home of a patient who died of HPS. One hundred forty-nine animals were caught (Table 1), however none of themwere found to be seropositive for anti-hantavirus antibodies.Phylogenetic relationships among hantaviruses. The Bayes-

ian phylogenies of hantavirus partial S segment sequences areshown in Figures 2 and 3. In Figure 2 the phylogenetic treecorresponds to a 631 nt alignment, spanning nucleotides 152–782 of S segment, and in Figure 3 the tree was constructedusing a subset of sequences from Figure 2, spanning nucleo-tides 978–1,250 of S segment (nucleotide positions relative toARAUV strain AY740633). In both trees, genomic sequencesof hantaviruses identified in rodents from different localitiesof Parana grouped with high statistical support into theAraucaria (ARAUV) and Jabora (JABV) clades. The major-ity (7 of 12) of the S sequences belonged to the Araucariaclade. They were retrieved from two Oligoryzomys nigripes

specimens trapped in Paranagua (10104 and 10091) and fromrodents 10056 (Oxymycterus judex) and 10028 (Akodonmontensis) collected in General Carneiro. Two additionalsequences were found in O. nigripes specimens captured atJaguariaiva (10351) and Itambaraca (10217) also belong tothis clade (Figure 2). An additional sequence retrieved froma rodent captured in General Carneiro groups within theARAUV clade (Figure 3) with a posterior probability (pp) of1. This rodent was identified as A. paranaensis by its morphol-ogy, karyotype, and cytochrome B gene sequence.Three viral genomic S sequences from rodents trapped in

General Carneiro in March 2010 and one collected inJaguariaıva are placed in the Jabora clade, with significant

Table 2

Collection locations, numbers of small mammals captured, rodent seroprevalence, positive species, hantavirus genotype, and humanseroprevalence, Brazil

Region of state of Parana Cities Total small mammalsRodent seroprevalence

N (% positive) Species (N) Hantavirus genotypeHuman seroprevalence

N (% positive) HPS reported area

SouthernGeneral Carneiro 214 8 (3.7%) N = 107 Yes

– Oxymycterus judex (01) Araucaria (01) 8.4%Akodon montensis (05) Araucaria (01)

Jabora (04)Akodon serrensis (01) Jabora (01)

Palmas Akodon paranaensis (01) Araucaria (01) N = 145 Yes– – 2.7%

Northeastern 1 (1.3%) N = 164 NoItambaraca 74 Oligoryzomys nigripes (01) Araucaria (01) 0%Jaguariaıva 54 2 (3.7%) N = 153 No

Akodon montensis (01) Jabora (01) 1.3%Oligoryzomys nigripes (01) Araucaria (01)

NorthwesternPorto Rico 45 2 (4.4%) Not done Yes

Oligoryzomys nigripes (02) Araucaria (02)Western – N = 199 YesFoz do Iguacu 115 0 (0%) 0.5%Central-Western – N = 270 YesPalmital/Laranjal 25 0 (0%) 3.3%EasternParanagua (Coast) 71 4 (5.6%) Not done Yes

Akodon montensis (01) –

Oligoryzomys nigripes (03) Araucaria (02)Curitiba 27 0 (0%) Not done YesAraucaria 33 0 (0%) Not done NoCampina Grande do Sul 90 0 (0%) Not done Yes


statistical support (P = 0.99), together with Jabora strainsfrom Brazil and Paraguay. An additional viral S sequencefrom an A. serrensis specimen, collected in General Carneiroin December 2009 is placed into Jabora clade. All these ani-mals were identified as A. montensis and A. serrensis by theirmorphologies, karyotypes, and cytochrome B gene sequences(Figure 2).Maximum likelihood analyses (not shown, available upon

request) were also performed. Phylogenies obtained underthis method displayed the same topology as the Bayesiananalysis at the relevant nodes.

DISCUSSION

The HPS has been reported every year in the state ofParana since 1993, with the highest number of confirmedcases occurring in southern and southwestern regions. The

biogeography with its particular vegetation landscape andagricultural practices of these regions are distinct from otherregions in Parana. Nevertheless, there is little informationavailable on the epidemiology, severity of disease, and ecol-ogy of the hantavirus reservoirs.Previously, we had reported a correlation between rodent

density and virus transmission, with the description of out-breaks associated to pine tree reforestation area, with bambooblooming and mast seeding in southern Brazil.6 Subsequently,we demonstrated the presence of the same hantavirus in threedifferent rodent species, and the co-circulation of two differentstrains in the same rodent species, highlighting the complexityof hantavirus transmission dynamics in nature.7 Similar find-ings were previously reported for a Juquitiba-like hantavirusharbored by two different rodent species in Uruguay,15 stres-sing the point that hantavirus/reservoir species relationshipsin South America might be more complex than the typically

Figure 2. Bayesian phylogenetic analysis of partial S segment sequences from rodents captured in different Parana localities (in boldface). Forcomparison, a set of representative hantavirus sequences from Brazil, South America, North America, and Eurasia were included in the analysis.Alignment used in the analysis was 631 nt long, spanning nucleotides 152–782 of S segment, respect to ARAUV strain AY740633. Hantaan(HTNV) and Seoul (SEOV) sequences were used as outgroup species. Posterior probabilities (pp) are depicted above the nodes. GenBankaccession nos.: 12460: HQ337904; 10217: HQ337905; 10351: HQ337906; 10104: HQ3379047; 13663: JN252310; 13635: JN252313; 13651: JN252311;10299: JN252312.


predominant association of one hantavirus strain and onerodent reservoir species.The most abundant rodent species captured during this study

wereAkodon spp., followed byO. nigripes andOxymycterus sp.,both of the latter two have been previously implicated as poten-tial pathogenic hantavirus reservoirs.7,15 The mean hantavirusantibody seroprevalence found in rodents in this study was2.5% (with a regional range of 0% to 5.6%). Similar seroprev-alence values have been reported for other American coun-tries, such as 3.5% in Mexico,16 1.4% in Chile,17 5.6% inArgentina18 and 2.1% in Colombia.19 Recently, Armien andothers20 reported a rodent prevalence of antibodies againstChoclo virus ranging from 3% to 33% in neighborhoodswhere HPS cases have occurred in western Panama.The mean value for hantavirus antibody seroprevalence in

humans in Parana was 2.4%, but ranging from 0% to 8%,depending on the region. The highest seroprevalence wasfrom individuals living in areas where HPS cases have beenreported. Seroprevalence results from other South Americancountries and other regions in Brazil revealed different fre-quencies of hantavirus exposure, such as 32.9% in westernregion of Panama, 13.5% in Colombia,21 1.7% in Venezuela,22

4.7% in the Anajatuba municipality, state of Maranhao,Brazil,23 10.9% in rural residents of the Anajatuba municipal-ity,24 and 14.3% in Jardinopolis, southeastern Brazil.25 Such

differences in anti-hantavirus seroprevalence show high levelsof virus exposure in these populations and draw attention tothe possibility of asymptomatic or less virulent infections. Inagreement, a high incidence rate of hantavirus infectionswithout HPS was observed in four communities of westernPanama, where 70 individuals seroconverted during the sur-veyed period (2001–2007) without HPS classical signs.20

The results from this study suggest a positive correlationbetween the percentage of seropositive rodents and HPScases. On the other hand, anti-hantavirus IgG-positive rodentreservoirs were identified in areas without reported cases,suggesting that the geographic distribution of reservoir rodentspecies alone is not enough to link a particular area withdisease risk. Other factors, such as seasonality, populationdensity, and human behavior must be included in risk ana-lyses. Furthermore, HPS outbreaks have been linked to pre-cipitation; however, climatic factors alone have not beensufficient to predict the spatial-temporal dynamics of theenvironment-reservoir-virus system.26

In all studied areas, two hantavirus genotypes were identi-fied: Araucaria and Jabora. Phylogenetic analysis showed thatsix rodent-borne hantaviruses cluster together with high sta-tistical support with Araucaria (Juquitiba-like) virus identi-fied in HPS cases and rodents from Brazil and Paraguay. It isa homogenous group, sharing a 97%/100% of similarity at

Figure 3. Bayesian phylogenetic analysis of partial S segment sequences from rodents captured in different Parana localities (in boldface). Forcomparison, a subset of the sequences shown in Figure 2 (from Brazil, Parana, and Paraguay) was used in the analysis. Parana strains are 272 ntlong and spanned nucleotides 978–1,250 of S segment, respect to ARAUV strain AY740633. Hantaan (HTNV) and Seoul (SEOV) sequences wereused as outgroup species. Posterior probabilities (pp) are depicted above the nodes. GenBank accession nos.: 13636: JN252309.


nucleotide/amino acidic level. It can be considered as a sisterclade to a group formed by several South American hantavi-ruses, including pathogenic viruses like Andes, Lechiguanas,and Araraquara, as well as non-pathogenic hantaviruses likeMaciel or Pergamino. Another five rodent-borne hantavi-ruses from Parana state form a monophyletic group withJabora hantaviruses from Paraguay and Brazil (Santa Catarinastate). This group shares a 92%/99.9% identity at nucleotide/amino acidic level, respectively, and contains viruses collectedmostly from A. montensis, and one from A. serrensis. The par-tial S sequences analyzed here are not informative enough todetermine the relationships of this genotype with other SouthAmerican hantaviruses. It is noteworthy that the hantavirusesidentified in different Akodon species (A. montensis andA. serrensis) from General Carneiro are more closely relatedthan the A. montensis-borne hantavirus from Jaguariaıva(10299), raising the possibility of a spillover infection fromA. montensis to A. serrensis. The phylogenetic tree displayedin Figure 3 was constructed using a subset of sequencesencompassing nucleotides 978 to 1,250 from Araucaria virus(AY740633). In this analysis a hantavirus genomic sequenceretrieved from an A. paranaensis specimen collected in Gen-eral Carneiro was placed into the Araucaria group with highstatistical support (posterior probability of 1). The intra-genotypic identity was 99.5%/100% at nucleotide/amino acidiclevel, respectively.In some regions, viral co-circulation was observed in trapped

rodents and both genotypes have been previously describedin South Brazil.7,9 Nonetheless, only the Araucaria hantavirushas been detected in patients with HPS and the Jabora virushas not yet been associated with human diseases.9 Generally,sigmondontine rodents have been captured in disturbed habi-tats, such as cultivated fields, reforested areas, and peridomesticsettings. However, host population and pathogen prevalencemay vary locally and many rodent species show distinct habi-tat preferences. Thus, additional local studies are essential todefine the risk of human disease.27

The presence of different rodent species within the samenatural setting and are infected by the same hantavirusgenotype, has been previously reported.7,9,17,28 In this study,A. paranaensis was found for the first time to be infected withAraucaria hantavirus, making a total of four different rodentspecies that are associated with the same hantavirus genotype.The impact of this number of host species on the naturaltransmission cycle remains unclear. Jabora virus was foundin the previously reported host (A. montensis) and also inA. serrensis, which has not been previously identified as ahantavirus reservoir. Interestingly, both species were cap-tured in the same locality (General Carneiro) but in differentseasons (March 2010 and December 2009, respectively).Hantavirus infections have been described with a wide vari-

ety of clinical forms, from asymptomatic to the classical clini-cal manifestations of HFRS and HPS29,30 Although serologicevidence indicated that hantavirus circulated in human androdents populations in all regions of the Parana state, classicalHPS cases have not been reported in all regions (i.e., North-western and Northeastern Parana), suggesting that eitheroligo/asymptomatic infections occurs. It cannot be ruled outthat occasionally hantavirus infection are not recognized orreported. It seems likely that pathogen exposure varies amongthese different areas, which could have practical implicationson disease transmission.

Recently, several novel hantaviruses with unknown patho-genic potential were identified in widely separated geograph-ical regions in a variety of soricomorpha mammals. Nothing isknown about the pathogenicity of these hantaviruses at themoment, but finding these viruses among such evolutionarydivergent species, predicts that other groups of mammalscould also carry these viruses.31 Notably, in the Itambaracaregion, 27% of the animals captured was Didelphis albiventris.Although serologically positive rodents were detected in thisregion, RT-PCR analyses of lung samples from these animalswere negative for hantavirus.It is important to mention that the main objective of this

study was to determine the serological status of the humanpopulation and of the potential rodent reservoirs regardinghantavirus exposure in different biomes of Parana State. Forthis reason, some expeditions were performed only once perarea. Hence, we are aware that these particular data relateonly to one period and reflect the landscape only for thattime. However, human seroprevalence data (from individualswithout previous HPS classical clinical presentations) and thedistributions of seropositive reservoir species will assist healthauthorities in adjusting their prevention policies and defininga permanent surveillance program for the entire region.Although the impacts of environmental change and degra-

dation on the dispersion dynamics of the seropositive rodentreservoir have not been evaluated, it has been suggested thathabitat fragmentation and the loss of species diversity may bealtering hantavirus infection dynamics.32 In the last severaldecades, Parana has witnessed high rates of environmentaldegradation and human population growth. The impacts ofthe consequential losses in biodiversity on human healthshould be monitored and the complex factors involved in thedynamics of hantaviruses in nature.

Received December 6, 2011. Accepted for publication April 25, 2012.

Acknowledgments: We thank the Public Health Secretary of theState of Parana for their assistance in the rodent capture expeditionsand human blood collection.

Financial support: Fiocruz, CNPq, Fundacao Araucaria, CAPES. SMRand CNDS are sponsored by a CNPq fellowship.

Disclaimer: The authors have no competing financial interests.

Authors’ addresses: Sonia M. Raboni, Infectious Disease Department,Universidade Federal do Parana, Instituto Carlos Chagas, Fiocruz,Parana, Brazil, E-mail: [email protected]. Adriana Delfraro, Facultadde Ciencias, Universidad de la Republica, Montevideo, Uruguay,E-mail: [email protected]. Luana de Borba, Vanessa Stella, MarinaR. de Araujo, Suzana Carstensen, and Claudia N. Duarte dos Santos,Instituto Carlos Chagas, Fiocruz, Parana, Brazil, E-mails: [email protected], [email protected], [email protected], [email protected], and [email protected]. BernardoR. Teixeira,Programa de Pos graduacao em Biologia Parasitaria, Fiocruz, Rio deJaneiro; and Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, Rio de Janeiro, Brazil,E-mail: [email protected]. Giselia Rubio and Angela Maron, Secretariade Saude do Estado do Parana, Brazil, E-mails: [email protected] and [email protected]. Elba R. S. Lemos and PauloS. D’Andrea, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, Rio de Janeiro, Brazil,E-mails: [email protected] and [email protected].

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58

CAPÍTULO 2

Ecologia de populações de roedores silvestres e dinâmica temporal de

infecção por hantavírus, no município de General Carneiro, sul do Estado

do Paraná

Este capítulo está apresentado em forma de artigo científico, aceito para publicação no

periódico The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene (Fator de impacto 2,59).

Neste artigo é apresentado um estudo correlacional de 2 anos, realizado no município de

General Carneiro, associando-se a flutuação populacional, atividade reprodutiva e estrutura

etária dos roedores à prevalência de infecção por hantavírus nestas espécies. A área de estudo

foi determinada a partir do levantamento de espécies apresentado no capítulo 1 e foi escolhida

por apresentar um perfil diferenciado de infecção em roedores hospedeiros, com a ocorrência

de spillovers além das associações vírus-hospedeiro já conhecidas. Neste artigo são discutidas

também a ocorrência de infecções spillover ao longo do período de estudo e sua importância

para a manutenção dos genótipos virais encontrados, além da associação das informações

geradas de caráter ecológico ao perfil epidemiológico de SPH na área de estudo. A maioria

dos estudos de hantavírus no Brasil são pontuais, em geral com coletas únicas, portanto a

execução deste projeto possibilitou o conhecimento da dinâmica temporal de infecção por

hantavírus em roedores hospedeiros em uma área de ocorrência de SPH.

Os objetivos específicos deste capítulo são:

1) Determinar a variação estacional dos tamanhos populacionais, condição reprodutiva e

estrutura etária dos pequenos mamíferos do município de General Carneiro.

2) Determinar as prevalências de infecção por hantavírus, sua variação estacional e o genótipo

viral associado a cada espécie de roedores silvestres.

59

As hipóteses relacionadas a estes objetivos são:

1) Premissa: O tamanho, condição reprodutiva e estrutura etária das populações de pequenos

mamíferos variam conforme a estacionalidade. Hipótese: picos de reprodução ocorrem nos

meses mais quentes e maiores tamanhos populacionais ocorrem nos meses mais frios devido

ao recrutamento de indivíduos jovens.

2) Premissa: As prevalências de infecção por hantavírus entre os roedores silvestres variam

conforme o sexo e a estrutura etária. Hipótese: maiores prevalências de infecção ocorrem em

roedores machos adultos.

60

American Journal of Tropical Medicine & Hygiene

Population ecology of hantavirus rodent hosts in Southern Brazil

Journal: American Journal of Tropical Medicine & Hygiene

Manuscript ID: AJTMH-13-0465.R1

Manuscript Type: Original Research Paper

Date Submitted by the Author: n/a

Complete List of Authors: Teixeira, Bernardo; Instituto Oswaldo Cruz/FIOCRUZ, Laboratório de Biologia e Parasitologia de Mamíferos Silvestres Reservatórios; Instituto Oswaldo Cruz/FIOCRUZ, Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária Loureiro, Nathalie; Instituto Oswaldo Cruz/FIOCRUZ, Laboratório de Biologia e Parasitologia de Mamíferos Silvestres Reservatórios

Strecht, Liana; Instituto Oswaldo Cruz/FIOCRUZ, Laboratório de Hantaviroses e Rickettsioses Gentile, Rosana; Instituto Oswaldo Cruz/FIOCRUZ, Laboratório de Biologia e Parasitologia de Mamíferos Silvestres Reservatórios de Oliveira, Renata; Instituto Oswaldo Cruz, Laboratório de Hantaviroses e Rickettsioses Guterres, Alexandro; Instituto Oswaldo Cruz, Laboratório de Hantaviroses e Rickettsioses F ernandes, Jorlan; Instituto Oswaldo Cruz, Laboratório de Hantaviroses e Rickettsioses Mattos, Luciana Helena; Instituto Oswaldo Cruz, Laboratório de Hantaviroses e Rickettsioses

Raboni, Sonia; Instituto Carlos Chagas, FIOCRUZ/PR Rubio, Giselia; Secretaria de Saúde do Estado do Paraná, Divisão de Z oonoses e Intoxicações Bonvicino, Cibele; Instituto Oswaldo Cruz/FIOCRUZ, Laboratório de Biologia e Parasitologia de Mamíferos Silvestres Reservatórios; Instituto N acional de Câncer, Divisão de Genética Duarte dos Santos, Claudia; Instituto Carlos Chagas, FIOCRUZ/PR de Lemos, Elba; Instituto Oswaldo Cruz, Laboratório de Hantaviroses e Rickettsioses D'Andrea, Paulo; Instituto Oswaldo Cruz/FIOCRUZ, Laboratório de Biologia e Parasitologia de Mamíferos Silvestres Reservatórios

Key Words: Hantaviruses, Ecology/Natural History, Zoonotic Diseases

61

Population ecology of hantavirus rodent hosts in Southern Brazil

Bernardo R. Teixeira, Nathalie Loureiro, Liana Strecht, Rosana Gentile, Renata C. Oliveira,

Alexandro Guterres, Jorlan Fernandes, Luciana H. B. V. Mattos, Sonia M. Raboni, Giselia Rubio,

Cibele R. Bonvicino, Claudia N. Duarte dos Santos, Elba R. S. Lemos and Paulo S. D’Andrea

Laboratório de Biologia e Parasitologia de Mamíferos Silvestres Reservatórios, Instituto Oswaldo

Cruz, FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brazil; Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária,

Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brazil; Laboratório de Hantaviroses e

Rickettsioses, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brazil; Instituto Carlos Chagas,

FIOCRUZ, Paraná, Brazil; Secretaria de Saúde do Estado do Paraná, Paraná, Brazil; Divisão de

Genética, Instituto Nacional de Câncer, Rio de Janeiro, Brazil

ABSTRACT

In this study we analyze population dynamics of hantavirus rodent hosts and prevalence of

infection over a two year period in Southern Brazil, a region with a high incidence of

hantavirus pulmonary syndrome. The 14 small mammal species captured were composed of

10 rodents and 4 marsupials, the six most abundant species being Akodon serrensis,

Oxymycterus judex, Akodon montensis, Akodon paranaensis, Oligoryzomys nigripes and

Thaptomys nigrita. These species displayed a similar pattern with increasing population sizes

in fall/winter due to recruitment and both, increase in reproductive activity and higher

hantavirus prevalence in spring/summer. Specific associations between A. montensis/Jaborá

Virus (JABV) and O. nigripes/Juquitiba-like Virus (JUQV-like) were established as well as

spillover infections between A. paranaensis/JABV, A. serrensis/JABV and A.

paranaensis/JUQV-like. Spillover infection in secondary hosts seems to play an important

role in maintaining JABV and JUQV-like in the hantavirus sylvatic cycle mainly during

periods of low prevalence in primary hosts.

INTRODUCTION

Hantavirus pulmonary syndrome (HPS) in Brazil is a zoonosis usually associated with

rural activities in disturbed environments or in sylvatic interface areas.1,2

Since the first HPS

case in 1993, more than 1600 cases have been confirmed in Brazil, distributed among all

regions, mainly in the southern states of Paraná, Santa Catarina and Rio Grande do Sul.3 The

62

State of Paraná is the fourth in HPS occurrence with two hantavirus genotypes described,

Araucaria Virus (ARAUV) and Jaborá Virus (JABV).4–6

Since Araucaria Virus is recognized

as a Juquitiba-like Virus (JUQV-like), we adopt this nomenclature herein to report this

hantavirus genotype.

So far, five hantavirus genotypes associated to HPS cases have been described in

rodent hosts and humans in many Brazilian regions: 1) Juquitiba Virus (JUQV) distributed in

the Atlantic Forest in the South and Southeastern regions, the host being Oligoryzomys

nigripes,4,7

with seroprevalence of 2.5-18.3%,6–9

2) Araraquara Virus (ARAV) with a wide

distribution in the Cerrado Biome (Central plateau and Southeastern), transmitted by

Necromys lasiurus,7 with seroprevalence of 1.2-11%,

7,10–12 3) Laguna Negra-like Virus (LNV)

from a transition area of Cerrado and Amazon, restricted until now to Mato Grosso State in

Northwestern Brazil, associated to Calomys callidus,13,14

with a seroprevalence of 17.4%,13

4)

Castelo dos Sonhos Virus (CASV) from North and Northwestern Brazil in the Amazonian

State of Pará, and in a transition area with Cerrado in the State of Mato Grosso, harbored by

Oligoryzomys utiaritensis15–17

, with seroprevalence of 4.5%16

and 5) Anajatuba Virus

(ANAJV) from lowland areas of the Amazon Forest Biome in the Northeastern State of

Maranhão, transmitted by Oligoryzomys fornesi with seroprevalence of 41.7%.18

Another four

genotypes were described only in rodents without any human infection reported: 1) Seoul

Virus (SEOV) associated with the sinanthropic species Rattus norvegicus19,20

in the

Amazonian State of Pará in Northern Brazil, 2) Rio Mearim Virus (RIMEV) from the

lowlands of the Amazon Forest, sympatric to ANAJV in Northeastern Brazil, whose host is

Holochilus sciureus, with seroprevalence of 29.4%18

, 3) Rio Mamore Virus (RMV) from

North Brazil in the Amazon Forest, whose host is Oligoryzomys microtis21

and 4) Jaborá

Virus (JABV) distributed in the Atlantic Forest from the Southern region harbored by Akodon

montensis with seroprevalence of 14.5%.9 However, SEOV and RMV have also been

associated with human infection in other countries.22,23

Five of these nine genotypes are also present in rodent hosts from other South

American regions: 1) JUQV in Paraguay,24

Argentina25

and Uruguay26

with seroprevalence of

3.2 - 11.9% in O. nigripes25,26

and 6% in Oxymycterus sp.,26

2) LNV in Paraguay,24,27

Bolivia28

and Argentina,29

with seroprevalence of 5.1-8.1% in C. callosus28,29

and 23% in C.

laucha,30

3) RMV in Bolivia28,31,32

and Peru33

with seroprevalence of 7.7% in O. microtis,28

4)

JABV in Paraguay24

and 5) SEOV distributed worldwide.

Despite the general rule of specificity between hantavirus genotypes and rodent host

species, an increasing number of studies have reported hantavirus spillover into secondary

63

hosts.34

However, little information about natural history of spillover infection on the host

population dynamics is available. South American hantavirus genotypes do not correspond

with the same level of co-evolution in studies with hantaviruses in Europe and Asia, thus

affording great potential for host switching and adaptation35

. In Brazil, spillover has been

witnessed in many hantavirus genotypes and host species, like ARAV harbored by secondary

hosts, as A. montensis, O. nigripes, Thaptomys nigrita and Juliomys sp.36,37

as well as species

of marsupials and bats.38

Also, JUQV-like and JABV have been reported in secondary hosts

in Southern Brazil, JUQV-like associated with Akodon paranaensis,6 A. montensis and

Oxymycterus judex,5 and JABV with Akodon serrensis

6 and A. paranaensis.

39

Studies of small mammals have clarified many aspects on population ecology of

Brazilian rodents, mainly in the Atlantic Forest.40–49

Notwithstanding the great diversity of

rodents in Brazil (about 240 species),50,51

consequently providing a high potential for many

new hantavirus hosts, no studies have considered the infection dynamics. Population ecology

studies are crucial for understanding the temporal patterns of infection in host populations as

well as furnishing data on epidemiology, outbreak prediction and risk of human infection.52–60

In this study we analyze population dynamics of hantaviruses in wild rodent hosts and

prevalence of infection over a two year period from 12/2009 to 12/2011 in General Carneiro

municipality, State of Parana, Southern Brazil. This municipality has a high incidence of

HPS, mainly affecting rural workers of pine tree management. This region also is inhabited by

infected rodents with spillover infection of JUQV-like and JABV genotypes.5,6

MATERIALS AND METHODS

Field data: study area and small mammal sampling

The fieldwork was conducted in General Carneiro municipality, State of Paraná,

Southern Brazil (Figure 1), located in a Mixed Ombrophilous Forest region. We studied

different vegetation types, including native forests of Araucaria angustifolia (Bertol.) Kuntze

1898, native forest with anthropic disturbance and exotic pine tree reforestation areas (Pinus

elliotti and Pinus taeda) for timber trade.

The climate is humid subtropical (Cfa), according to the Köppen climate

classification, with mild summers and cold winters, without dry seasons.61

The Technological

Institute SIMEPAR provided monthly data of average temperature and accumulated rainfall

64

from December/2009 to December/2011 obtained from Palmas Station, Paraná (Figure 2), the

closest and most representative weather station in proximity to General Carneiro municipality.

Rodent sampling was conducted every three months from December 2009 to

December 2011, during five consecutive nights for each of the nine capture sessions. All

capture sessions took place at the end of each season as follows: December in late Spring,

March in late Summer, June in late Fall and September in late Winter. The capture effort was

constant in all capture sessions. We established twelve transects with 20 capture stations

setting Tomahawk® (40.64x12.70x12.70 cm) and Sherman

® (7.62x9.53x30.48 cm) traps, 300

traps in each capture night, baited with a mixture of bacon, peanut butter, banana and oatmeal.

Specimens were captured, anesthetized and euthanasied according to recommended

safety procedures62

and under the Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals,

Oswaldo Cruz Foundation, Brazil (FIOCRUZ, License number L-049/08). Animals were

captured with authorization of the Chico Mendes Institute for Biodiversity Conservation

(ICMBIO Authorization 13373). Specimens were then measured, weighed, sexed and

identified by both karyotyping63,64

and cranial morphology/morphometry. Hantavirus

antibody-positive specimens were confirmed by molecular analysis (amplification of the

cytochrome b gene).

Hantavirus infection analysis

Serum and tissue samples were obtained from all small mammals captured and

submitted to IgG enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of hantavirus

antibodies with the N-Araraquara hantavirus recombinant nucleocapsid protein.65

Samples of

December 2009 and March 2010 captures were also tested by Hantec Kit.66

Total RNA was

extracted from lung, liver or kidney tissue samples of hantavirus antibody-positive rodent

species with the PureLink Micro-to-Midi total RNA Purification Kit (Invitrogen, San Diego,

CA). The rodent samples were analyzed using the polymerase chain reaction with reverse

transcription (750bp) and nested reactions (478bp) of the S segment, with primers AG04-25F

(5’ TAGTAGACTCCTTGAKAAGCT 3’), AG733-752R (5’

GAYTGGATGGAAAGGATWGA 3’) and AG274-291F (5’ CCCTGTTGGATCAACTGG

3’).39,67

For purification we adopted Wizard®SV Gel and the PCR Clean-Up System kit

(Promega, Corp., Madison, WI, USA) and for sequencing the BiqDye® Terminator v3.1 Cycle

Sequencing Kit (Applied Biosystems). Virus sequences were analyzed with MEGA5

65

software, and hantavirus genotypes were identified with BLAST

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) through comparison with other hantavirus sequences.68,69

Data Analysis and Seasonal Patterns

Population size, reproductive status of females and age structure were analyzed by

species and year/season. Population size was estimated as the absolute number of captured

specimens over a constant trapping effort. Lactating and pregnant females were considered as

reproductively active. Females were classified as mated or unmated by uterus analysis, thus

females with tumescence and marks of previous pregnancy were classified as non-virgins.

Frequency of reproductively active females of the total number of mated females in each

capture session was calculated to determine reproductive season. Total sex ratio of each

species was tested in the expected 1:1, with a chi-square analysis. Age structures were based

on body weight (grams), dividing individuals into three classes with approximately the same

number of animals.54

We recorded the presence of wounds and scars on the tail or ear as indicative of

antagonistic encounters, the main form of hantavirus transmission among rodents.70

Prevalence of infection was calculated for each species, regarding sex, age class, number of

specimens and capture season. The chi-square test with Yates correction was adopted to test

the association with these data.

Influence of monthly rainfall, average monthly temperature and reproducing females

in population sizes was analyzed by multiple linear regression considering backward criterion

for a one, two and three month time lag. Population sizes were also included in this analysis

to verify influence of these variables on prevalence.

RESULTS

Population Analysis and Seasonal Patterns

The 14 small mammal species consisted of 10 rodents [Rodentia, Sigmodontinae:

Akodon serrensis (n = 401); Oxymycterus judex (n = 294); Akodon montensis (n = 253);

Akodon paranaensis (n = 87); Oligoryzomys nigripes (n = 73); Thaptomys nigrita (n = 70);

Sooretamys angouya (n = 13); Delomys dorsalis (n = 2); Nectomys squamipes (n = 2) and

Brucepattersonius iheringi (n = 2)] and 4 marsupials [Didelphimorphia, Didelphidae:

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/

66

Monodelphis dimidiata (n = 34); Philander frenatus (n = 9); Gracilinanus sp. (n = 5) and

Lutreolina crassicaudata (n = 1)].

Population dynamics and prevalence were analyzed for A. serrensis, O. judex, A.

montensis, A. paranaensis, O. nigripes and T. nigrita, the six most abundant species. All

species displayed similar seasonal patterns of population sizes, with higher values during the

cooler months (from June to September) (Figure 3). This pattern was emphasized by A.

serrensis, A. montensis, O. nigripes, T. nigrita and A. paranaensis, this latter species still

maintaining higher population values until December 2010. O. judex presented a quite

different pattern, with more homogeneous population sizes and less marked peaks (Figure 3).

All six species exhibited a reproductive pattern with higher reproductive frequency

during the warmer months (from December to March) (Figure 3). Akodon serrensis and A.

montensis also reproduced in June and September although at lower rates. Oxymycterus judex

presented a reproduction activity with similar rates throughout the year in accordance with

population size dynamics data.

Age classes were based on weight. A. serrensis males (♂) and females (♀) were

divided into Class I (11--22 g), Class II (23--26 g) and Class III (27--40 g for ♂ and 27--45 g

for ♀), A. montensis Class I (7--25 g ♂ and 8--21 g ♀), Class II (26--31 g ♂ and 22--28 g ♀)

and Class III (32--49 g ♂ and 29--44 g ♀), A. paranaensis Class I (14--31 g ♂ and 17--25 g

♀), Class II (32--41 g ♂ and 26--34 g ♀) and Class III (44--61 g ♂ and 35--48 g ♀), O. judex

Class I (22--82 g ♂ and 34--69 g ♀), Class II (83--110 g ♂ and 70--87 g ♀) and Class III

(111--160 g ♂ and 88--140 g ♀), O. nigripes Class I (10--20 g ♂ and 9--15 g ♀), Class II (21-

-25 g ♂ and 16--19 g ♀) and Class III (26--37 g ♂ and 20--31 g ♀) and T. nigrita Class I (11-

-17 g ♂ and 11--15 g ♀), Class II (18--20 g ♂ and 16--20 g ♀) and Class III (21--27 g ♂ and

21--24 g ♀).

A high frequency of young individuals (class I and II) was observed during the cooler

months (from June to September). This pattern was conspicuous mainly in A. serrensis and A.

montensis (Figure 4). Adults (class III) presented a more homogeneous distribution

throughout the year as expected due to population aging. However, peaks of higher adult

abundance were evident during the breeding season (December to March).

Five of the six most abundant species presented male sex bias: A. serrensis (χ2

= 4.611,

gl = 1, p = 0.0360), A. montensis (χ2

= 4.271, gl = 1, p = 0.0451), A. paranaensis (χ2

= 4.545,

gl = 1, p = 0.0428), O. judex (χ2

= 9.918, gl = 1, p = 0.002) and T. nigrita (χ2

= 4.629, gl = 1, p

= 0.0422).

67

We observed an inverse relationship between temperature and population sizes in A.

serrensis, A. montensis, O. nigripes and O. judex with a one month time lag (R² = 0.552, β = -

0.743, p = 0.022; R² = 0.580, β = -0.762, p = 0.017; R² = 0.748, β = -0.865, p = 0.003; R² =

0.532, β = -0.729, p = 0.026, respectively), in A. paranaensis with a one and two month time

lag (R² = 0.630, β = -0.793, p = 0.011; R² = 0.708, β = -0.841, p = 0.004 respectively) and in

T. nigrita with a two and three month time lag (R² = 0.829, β = -0.910, p = 0.001; R² = 0.874,

β = -0.768, p = 0.002, respectively). There was also an inverse relationship between rainfall

and T. nigrita population size with a three month time lag (R² = 0.874, β = -0.378, p = 0.045).

There was no significant influence of reproductive activity on population sizes whatsoever.

Hantavirus infection

We screened 26 hantavirus-infected rodents (ELISA and PCR confirmed) (Table 1),

proving statistically biased to males (χ2

= 7.3; gl = 1; p = 0.0121). Two hantavirus genotypes

were confirmed, establishing between a 95--99% identity with deposited sequences: i) Jaborá

Virus (JABV) in A. montensis, A. serrensis and A. paranaensis and ii) Juquitiba-like Virus

(JUQV-like) in O. nigripes and A. paranaensis. The other species, O. judex, T. nigrita, S.

angouya, D. dorsalis, N. squamipes and B. iheringi were not diagnosed seropositive.

Infection by JABV was apparent throughout the year with peaks during the warmer

months (December-March), especially in A. montensis, which rendered infected specimens in

eight of the nine trap sessions. Only four animals presented JUQV-like infection (Table 1) in

four different capture sessions, consequently the prevalence of JUQV-like species

corresponded always to only one infected animal in each capture session (Figure 3). Likewise

JABV, JUQV-like also had a similar pattern, with infection in warmer months (Figure 3e).

Akodon paranaensis was the only species that harbored two hantavirus genotypes, JUQV-like

(March 2010) and JABV (December 2010 and June 2011).

The majority of the infected animals belonged to class III (n = 23; χ2 = 32.462, df = 2,

p < 0.0001), two to class II (one A. montensis and one A. paranaensis) and only one to class I

(one O. nigripes). The scar analysis revealed that 60% of all infected A. montensis had ear/tail

scars, expressing a significant relationship between infection and scars (χ2 = 9.192; df = 1; p

= 0.0063). No significant influence of temperature, precipitation, population size and

reproductive activity on prevalence of A. montensis (the only species with sufficient data for

this analysis) was evident.

68

DISCUSSION

The six most abundant species displayed similar patterns of population dynamics, with

increasing population sizes in fall/winter (June to September) and increasing reproductive

activity in spring/summer (December to March), although reproductive activity throughout

the year was confirmed for A. serrensis, A. montensis and O. judex. Climate analysis

demonstrated the influence of the low temperature periods on population sizes, with

population increase in cooler months probably related to food availability, mainly seed

production of the Brazilian Pine, A. angustifolia. Some authors reported the availability of

mature seeds on the forest floor during fall and winter in other areas of Mixed Ombrophilous

forest46

and also associated this high seed production to rodent population increases.45

Other

studies have also reported A. angustifolia seeds as an important food source in the diet of

these rodent species.71–73

In fact, we found a great amount of A. angustifolia seeds on the

forest floor of the studied areas during late fall, many of which with rodent gnaw marks.

During the spring/summer more individuals of age class III were apparent, which is in

agreement with the reproductive results, since reproductive activity occurs mainly in this age

class. Likewise, in the fall/winter, we observed predominance of individuals of age class I,

indicating that the population increase is due to the younger individual recruitment. These

population dynamics patterns agree with other studies on Sigmodontinae ecology in both

Atlantic Forest landscape types, Mixed Ombrophilous Forest45,48,49

and Dense Ombrophilous

Forest.44,47,74,75

Hantavirus exhibited a seasonal pattern with higher prevalence in spring/summer,

when population sizes were lower and both reproductive activity as well as numbers of adults

were higher. This pattern was also witnessed for other hantavirus genotypes in North52,56

and

South America54,55,59

.

Hantavirus transmission among rodents is largely accepted as a consequence of bites

and inoculation of the virus from the saliva, which contains higher levels of viral RNA than

urine.76

This transmission occurs in antagonistic encounters and many authors have

determined the presence of scars as indicative of this behavior.10,70,77,78

Aggressive encounters

occur mainly in breeding season79

and are more frequent in adult males.52,54,56,58,59

Our results

corroborated these postulations, with higher hantavirus prevalence found in spring/summer,

seasons with higher reproductive activity and higher prevalence of infection in males of age

class III (adults), with correlation between presence of scars and hantavirus infection.

69

Besides antagonistic encounters, inhalation of contaminated aerosols and ingestion of

contaminated shared food source might be important modes of transmission among hosts.76

Although A. paranaensis is not so dependent as O. nigripes on A. angustifolia seeds, this is an

important alternative food source in cooler months, when others decrease. Both species also

possessed a trophic niche overlap in the seasons without the A. angustifolia seeds (Perini AA,

unpublished data). Besides the common consumption of A. angustifolia seeds, other food

sources such as fruits, seeds and invertebrates are also shared by Akodon montensis and O.

nigripes.80

Thus, the oral route by mutual food source intake may also be contributing to both

intraspecific and spillover transmissions in the study area.

In addition to the already established host-parasite specific interactions between A.

montensis/JABV9 and O. nigripes/JUQV

7, we also observed spillover associations between A.

paranaensis/JABV, A. serrensis/JABV and A. paranaensis/JUQV-like. In previous studies in

General Carneiro municipality, we first presented these two latter associations6 as well as

spillover infections in A. montensis and O. judex, both infected by JUQV-like.5 During this

two-year study, only one in five A. paranaensis was infected by JUQV-like. Furthermore, no

spillover was observed in A. montensis and O. judex. Considering the low frequency, we

cannot confirm the importance of spillover on JUQV-like maintenance in the wild. However,

the occurrence of JUQV-like infection in three different genera of secondary hosts suggested

the adaptation of this genotype to genetically distinct rodent species. This scenario could be a

determinant to establish both hantavirus genetic diversity81

as well as the evolution of new

hantavirus genotypes.2 Also, in low prevalence times in the primary host, spillover infection

can be very important in maintaining the virus in the wild until spillback infection2, as was

likely the case for JUQV-like spillover in A. paranaensis, which took place in a month

without O. nigripes (primary host) infection.

We also attested to low relative abundance and disruptions in the population dynamics

of O. nigripes, with absence of animals on December 2009 and December 2011 capture

sessions, a pattern observed in other Atlantic Forest areas.47,75

Probably, this low abundance

and instability on O. nigripes populations are playing an important role to keep JUQV-like at

low frequency.

Spillover infections of JABV seem to be restricted to the three Akodon species. We

can speculate that JABV was harbored by the common ancestor of these species and remained

associated with them, a fact also discussed for spillover infections between Calomys laucha

and Calomys callosus, hosts of LNV in Paraguay.28

However, the geographic distribution of

these Calomys species does not overlap, unlike A. montensis, A. serrensis and A. paranaensis

70

which occurred in sympatry in our studied area, a pattern also reported for three

Reithrodontomys species hosts of Rio Segundo Virus (RSV) in Panama.82

Thus, infection of

A. serrensis and A. paranaensis by JABV may be related to overlap in habitat and food

sharing.

Despite the low frequency of spillover infection in A. serrensis, there were JABV

infections in all sampling months (regardless of host species) and a high prevalence of

infection in the secondary host, A. paranaensis. Moreover, the spillover A. paranaensis/JABV

was also reported in another area of the Mixed Ombrophilous Forest39

emphasizing the

importance of this species in maintaining JABV. As in JUQV-like, JABV spillover infections

seem to be important during periods of low viral prevalence in the primary host, since all

spillover infections occurred in months of low A. montensis infection.

JUQV-like is the genotype related to HPS cases in South and Southeastern Brazil.7,83,84

Hitherto, no studies have related JABV to HPS, even in endemic areas. HPS cases in General

Carneiro municipality appeared every year from 1999 to 2006, but no cases were reported

from 2007 to 2011, probably due to epidemiological vigilance by the Health Division of the

State of Paraná (SESA-PR). The main labor activity related to human infection in General

Carneiro municipality was Pine Tree (Pinus elliotti and Pinus taeda) management.83,85

Pine

tree workers usually occupied precarious, temporary structures near management areas,

storing food, and thus, attracting wild rodents, mainly the habitat generalist species O.

nigripes,85

thereby increasing probability of exposure to JUQV-like. From 2001, these

precarious structures were modified in order to prevent wild rodent invasion. This resulted in

a gradual decrease of HPS cases in the General Carneiro municipality (Health Division of

State of Parana, unpublished data).

Another explanation for the absence of HPS cases may be related to a possible change

in hantavirus transmission patterns among rodents, since in the current study (2009--2011) we

detected a higher prevalence of JABV (84.6% JABV and 15.4% JUQV-like), while in the

previous study (2006), where HPS cases were reported, the prevalence of JUQV-like was

higher (66.6%).5 So, we point out that epidemiological vigilance and the low frequency of

JUQV-like infection in rodents in the current study may be correlated to the absence of HPS

cases in this period.

The results described here reinforce the importance of pluri-annual studies on

hantavirus infection dynamics in rodent hosts. We observed a clear pattern of higher

hantavirus prevalence in seasons with higher reproductive activity, greater numbers of adults

71

and lower population size. Increases in population occurred in cooler months with higher

numbers of younger animals in accordance with resource availability.

Spillover infection reported in this study and in our previous study5 allows us to

speculate that this host-virus association is common in this area. Therefore, we can infer that

the spillover infection on secondary hosts plays an important role in maintaining JABV and

JUQV-like in the hantavirus sylvatic cycle until the spillback infection for primary hosts.

ACKNOWLEDGMENTS

We thank the Health Secretary of the State of Paraná and the technicians Edson dos

Santos, Edilsom Semczuk (Health Secretary of Foz do Iguaçu municipality), Ricardo Matsuo,

Joel Lopes, Luiz Eduardo Pereira, Elizeu da Silva, Jorge Pinto (FIOCRUZ) and Jorge da

Paixão (FIOCRUZ) for their assistance in the fieldwork expeditions. We are also greateful to

Health Secretary of General Carneiro municipality and Pizzatto Industries for assisting in the

rodent trapping logistics and Technological Institute SIMEPAR for climatic data. We thank

Dr. Fabiano Araújo Fernandes, BSc. Carolina Valença and Dra. Fabiana Pellegrini

Caramaschi for assistance in small mammal specific identification. English review and

revision by Prof. Mitchell Raymond Lishon, native of Chicago, Illinois, USA-UCLA 1969.

FINANCIAL SUPPORT

FIOCRUZ, PAPES V-CNPq/FIOCRUZ (403637/2008-2), CAPES (fellowship recipient for

BRT), CNPq (fellowship recipient for SMR, CRB, CNDS, ERSL and PSD) and FAPERJ

(fellowship recipient for CRB and PSD).

AUTHOR DISCLOSURE STATEMENT

The authors declare “No competing financial interests exist”.

AUTHORS’ ADDRESSES

Bernardo R. Teixeira, Laboratório de Biologia e Parasitologia de Mamíferos Silvestres Reservatórios,

Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brazil, Av. Brasil, 4365, Manguinhos, Zip

Code: 21040-360, Rio de Janeiro, RJ, Brazil and Programa de Pós-Graduação em Biologia

72

Parasitária, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brazil, E-mail:

[email protected]. Nathalie Loureiro, Rosana Gentile and Paulo S. D’Andrea,

Laboratório de Biologia e Parasitologia de Mamíferos Silvestres Reservatórios, Instituto Oswaldo

Cruz, FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brazil, E-mails: [email protected],

[email protected] and [email protected]. Liana Strecht, Renata C. Oliveira,

Alexandro Guterres, Jorlan Fernandes, Luciana H. B. V. Mattos and Elba R. S. Lemos, Laboratório de

Hantaviroses e Rickettsioses, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brazil, E-mails:

[email protected], [email protected], [email protected], [email protected],

[email protected] and [email protected]. Sonia M. Raboni and Cláudia N. Duarte dos

Santos, Instituto Carlos Chagas, FIOCRUZ, Rua Prof. Algacyr Munhoz Mader 3775 – CIC. Zip

Code: 81350-010, Curitiba, Paraná, Brazil, E-mails: [email protected] and [email protected].

Giselia Rubio, Secretaria de Saúde do Estado do Paraná, Divisão de Zoonoses e Intoxicações, Rua

Piquiri, 170, Zip Code: 80.230-140, Curitiba, Paraná, Brazil, E-mail: [email protected].

Cibele R. Bonvicino, Divisão de Genética, Instituto Nacional de Câncer, Rua André Cavalcante, 37,

Zip Code: 20231-050, Rio de Janeiro, RJ, Brazil, E-mail: [email protected].

CORRESPONDING AUTHORS

Paulo Sérgio D’Andrea and Bernardo R. Teixeira. Laboratório de Biologia e Parasitologia de

Mamíferos Silvestres Reservatórios, Instituto Oswaldo Cruz/FIOCRUZ - Av. Brasil, 4365,

Manguinhos, CEP: 21040-360, Rio de Janeiro, RJ, Brazil. Telephone: +55 21 2562-1325. E-

mails: [email protected] and [email protected]

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http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/ano02_n01_fatores_risco_hantavirus_pr.pdf.

81

Table 1. Species prevalence, sex and hantavirus genotype of infected specimens (seropositives

and PCR confirmed). M = males, F =females. Jaborá Virus (JABV), Juquitiba-like Virus

(JUQV-like)

Species Number of infected

rodents / total of

captured rodents

Gender Hantavirus genotype

Akodon montensis 16/253 (5.91%) 16M JABV

Akodon paranaensis 5/87 (5.68%) 2M/2F

1F

JABV

JUQV-like

Akodon serrensis 2/401 (0.74%) 1M/1F JABV

Oligoryzomys nigripes 3/73 (4.17%) 3M JUQV-like

TOTAL 26/814 (3.19%) 22M

4F

JABV

JUQV-like

82

Figure 1. General Carneiro municipality, State of Paraná, southern Brazil

Figure 2. Climatic diagram of the study area obtained from December 2009 to December

2011. Rainfall (mm) = gray bars; Average Temperature (°C) = Dark line

83

Figure 3. Population sizes, proportion of reproducing females and prevalences of hantavirus

infection for: a) Akodon serrensis, b) Akodon montensis, c) Akodon paranaensis, d)

Oligoryzomys nigripes, e) Oxymycterus judex and f) Thaptomys nigrita, in General Carneiro,

between December 2009 and December 2011. (Grey bars = Proportion of reproducing

females; Dotted line = Hantavirus prevalence; Continuous line = Population size)

84

Figure 4. Age structure of a) Akodon serrensis, b) Akodon montensis, c) Akodon paranaensis,

d) Oligoryzomys nigripes, e) Oxymycterus judex and f) Thaptomys nigrita, in General

Carneiro, between December 2009 and December 2011 (Black bar = Class I; Dark Grey bar =

Class II; Light Grey bar = Class III)

85

ANEXO

As relações filogenéticas entre os genótipos virais citados no Capítulo 2 estão

apresentadas nas Figuras 5, 6 e 7, em anexo. As sequências de JABV e JUQV encontradas

nos roedores de General Carneiro estão relacionadas à outras sequências depositadas no

GenBank, confirmando a identificação destes genótipos virais. Além disso nenhuma

estruturação foi observada em relação às seis áreas de estudo (ver Capítulo 3 para maiores

detalhes sobre as áreas), tanto nas infecções de hospedeiros primários quanto nas infecções

spillover.

86

Figura 5. Relações filogenéticas dos hantavírus, inferidas por análise Bayesiana,

implementado na ferramenta Mr. Bayes 3.1.2, comparando 380 nucleotídeos do segmento S

da região codificante do nucleocapsídeo. A barra de escala indica uma distância evolutiva de

0,2 substituições por posição na sequência. Os valores numéricos nos ramos representam a

probabilidade posterior de suporte dos ramos internos (≥0,7). As legendas, após o nome do

genótipo viral, em cada ramo, incluem o número de acesso da sequência no GenBank. Os

clados dos genótipos JABV (em verde) e JUQV (em vermelho) foram condensados, sendo

apresentados expandidos nas figuras 6 e 7.

87

Figura 6. Expansão do clado Jaborá (JABV), encontrado em verde na Figura 5. A barra de

escala indica uma distância evolutiva de 0,02 substituições por posição na sequência. Os

valores numéricos nos ramos representam a probabilidade posterior de suporte dos ramos

internos (≥0,7). As legendas, após o nome do genótipo viral, em cada ramo, incluem o

número de acesso da sequência no GenBank. As amostras sequenciadas neste estudo estão

representadas por: localidade de captura do roedor hospedeiro (Círculo Verde = Araucárias;

Círculo Cinza = Bomba; Círculo Branco = RPPN; Círculo Preto = Escadaria; Círculo Azul =

São Zacharias; Cìrculo Vermelho = Alagado); número de depósito do roedor na coleção

zoológica temporária do LABPMR, IOC/FIOCRUZ; espécie do roedor (Akm = Akodon

montensis; Aks = Akodon serrensis; Akp = Akodon paranaensis) e genótipo viral associado.

88

Figura 7. Expansão do clado Juquitiba (JUQV), encontrado em vermelho na Figura 5. A barra

de escala indica uma distância evolutiva de 0,01 substituições por posição na sequência. Os

valores numéricos nos ramos representam a probabilidade posterior de suporte dos ramos

internos (≥0,7). As legendas, após o nome do genótipo viral, em cada ramo, incluem o

número de acesso da sequência no GenBank. As amostras sequenciadas neste estudo estão

representadas por: localidade de captura do roedor hospedeiro (Círculo Verde = Araucárias;

Círculo Preto = Escadaria; Cìrculo Vermelho = Alagado); número de depósito do roedor na

coleção zoológica temporária do LABPMR, IOC/FIOCRUZ; espécie do roedor (Akp =

Akodon paranaensis; Oln = Oligoryzomys nigripes) e genótipo viral associado.

89

CAPÍTULO 3

Ecologia de comunidades de roedores hospedeiros de hantavírus, no

município de General Carneiro, sul do Estado do Paraná

Este capítulo apresenta análises complementares às apresentadas no capítulo 2. São

apresentadas as comparações entre as 6 áreas estudadas no município de General Carneiro. As

áreas de estudo foram classificadas de acordo com a paisagem e comparadas em relação à

composição, riqueza e abundância das espécies de roedores e sua associação com a

prevalência de infecção por hantavírus. A preferência por micro-habitat e a co-ocorrência das

espécies foi determinada e discutida em relação aos dados de infecção, além de ser

determinado um modelo descritivo de ocorrência de hantavírus nas espécies de roedores

hospedeiros.

90

CAPÍTULO 3

Ecologia de comunidades de roedores hospedeiros de hantavírus, no município de

General Carneiro, sul do Estado do Paraná

OBJETIVOS

1) Analisar comparativamente a composição, riqueza e abundância relativa das espécies de

roedores nas áreas de estudo e sua associação com a infecção por hantavírus.

2) Identificar as variáveis do micro-habitat determinantes da ocorrência das espécies de

pequenos mamíferos.

3) Definir um modelo descritivo de ocorrência de cada genótipo viral considerando dados

populacionais e de comunidades dos roedores.

HIPÓTESES

1) Premissa: A composição, riqueza e abundância relativa das espécies de roedores silvestres

variam conforme a área estudada. Hipótese: Áreas mais preservadas possuem maior riqueza,

além de possuir uma menor abundância relativa de espécies generalistas.

2) Premissa: A infecção por hantavírus entre os roedores silvestres variam conforme a riqueza

e a abundância relativa. Hipótese: Maiores prevalências de infecção nas espécies hospedeiras

ocorrem em áreas com menor riqueza de espécies e com maior abundância de machos adultos

de Akodon montensis e Oligoryzomys nigripes.

MATERIAL E MÉTODOS

Área de estudo

No município de General Carneiro foram escolhidas seis áreas com diferentes estados

de conservação para realização do estudo (Figura 3.1), sendo três áreas na Sede da Madeireira

Pizzatto (áreas Bomba, RPPN e Escadaria) (Figura 3.2), duas em Lageado Grande, também

pertencente às Indústrias Pizzatto (áreas Araucárias e Alagado) (Figura 3.3) e uma na

Madeireira São Zacharias (São Zacharias) (Figura 3.4).

91

Figura 3.1. Áreas estudadas no período 2009-2011, no município de General Carneiro/PR:

Araucárias, Alagado, Bomba, RPPN, Escadaria e São Zacharias. Imagem modificada do

Google Earth®.

Figura 3.2. Detalhe das áreas Araucárias e Alagado, no município de General Carneiro/PR.

Imagem modificada do Google Earth®.

92

Figura 3.3. Detalhe das áreas Bomba, RPPN e Escadaria, no município de General

Carneiro/PR. Imagem modificada do Google Earth®.

Figura 3.4. Detalhe da área São Zacharias, no município de General Carneiro/PR. Imagem

modificada do Google Earth®.

93

As áreas de estudo foram classificadas de acordo com suas características da

paisagem, com base em análise de imagens de satélite. Inicialmente foram obtidas as

coordenadas de todas as estações de captura ao longo de cada transecto. Estas informações

foram plotadas no software ArcMapTM

9.3 juntamente com as imagens de satélite da área de

estudo, cedidas pela Madeireira Pizzatto, ou plotadas no software Google Earth® no caso da

Fazenda São Zacharias. Foi então estabelecido um buffer de 100m em volta de cada transecto,

formando posteriormente um único buffer com as características de cada área de estudo. De

acordo com as análises in loco e com informações já contidas nas imagens cedidas, foram

definidas as variáveis da paisagem em cada buffer:

- Mata nativa: Áreas nativas de mata de Araucárias;

- Brejo: Áreas alagadas;

- Campo antrópico: Áreas degradadas de vegetação nativa, para uso como áreas de plantio de

Pinus elliotti e Pinus taeda;

- Pinus: Áreas de reflorestamento de Pinus elliotti e Pinus taeda;

- Estrada: Estradas de terra vicinais;

- Água: Rios, córregos ou lagos artificiais.

Foram estimadas as áreas (m²) relativas a cada variável da paisagem em cada buffer,

sendo então calculados os percentuais de cobertura de cada variável nas seis áreas de estudo.

Foi então realizada uma análise de NMDS (Escalonamento multi-dimensional) baseada em

uma matriz de distância euclidiana, no programa SYSTAT®, com o objetivo de analisar a

similaridade entre as seis áreas a partir destas características.

As características gerais das áreas de estudo estão descritas na tabela 3.1 e indicam o

tamanho das árvores predominantes (pequeno, médio e grande porte), o tipo de sub-bosque

(aberto, semi-aberto e fechado), o tipo de curso d’água (Rio, Córrego, Lago artificial ou

Brejo), o local de ocorrência do curso d’água (no transecto ou próximo ao transecto), a

quantidade de Araucárias, Taquaras e Pinus (Pouco, Regular, Muito) e o tipo de presença

humana observada (Colheita de Erva-Mate e Colheita de Pinus).

94

Tab

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3.1

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95

Área Araucárias: Localizada na Fazenda Lageado Grande. Área de Reserva Legal de

aproximadamente 690 ha, com vegetação nativa, próxima ao Rio Lageado Grande. Possui

relevo inclinado e uma espécie de taquara (Merostachys clausseni). Grande quantidade de

Araucárias, além de outras espécies como Asteraceae (Vassourão e Cambará), Moraceae

(Mamica de cadela), Mimosaceae (Bracatinga), Myrtaceae (Guamirim-branco), Arecaceae

(Butiá), Aquifoliaceae (Erva-Mate) e Euphorbiaceae (Branquilho) (Figura 3.5A).

Coordenadas: 26°18'21.24"S; 51°35'1.50"O.

Área Bomba: Localizada na Sede da Madeireira Pizzatto. Apesar de ter seu início localizado

em trilha arbustiva (Asteraceae) já aberta, possui extensa área de mata nativa, com árvores de

médio e grande porte e uma área total de aproximadamente 600 ha. Possui grande quantidade

de touceiras de taquaras em sua extensão (aproximadamente 3 espécies), presença de um

córrego próximo a alguns pontos de captura com troncos e pedras em sua margem, Araucárias

e espécies de Lauraceae (Canela), Myrtaceae (Cerejeira, Guamirim-branco, Uvaia,

Guabiroba) e Anacardiaceae (Aroeira-vermelha, Bugreiro) (Figura 3.5B). Coordenadas:

26°23'40.70"S; 51°22'12.10"O.

Área RPPN: Localizada na Sede da Madeireira Pizzatto. Área de Reserva Particular do

Patrimônio Nacional (RPPN) de aproximadamente 120 ha de mata nativa com sub-bosque

fechado. Foi observada uma grande presença de Araucárias, Asteraceae (Vassourinha,

Vassourão), Mimosaceae (Bracatinga), Lauraceae (Canela), Moraceae (Mamica de cadela),

Melastomataceae (Miconia), Solanaceae (Arrebenta-cavalo), Winteraceae (Casca de Anta),

Myrtaceae (Guamirim-branco) e Bignoniaceae (Figura 3.5C). Coordenadas: 26°23'55.70"S;

51°24'20.00"O.

Área Escadaria: Localizada na Sede da Madeireira Pizzatto. Área de mata nativa com um

transecto beirando um córrego e terminando em uma pequena cachoeira, e outro margeando

um lago artificial, apresentando folhiço, troncos e rochas em suas margens. Grande

quantidade de taquaras (Guadua chacoensis e Merostachys claussenii), além da presença de

Araucárias, Dicksoniaceae (Xaxim), Myrtaceae (Guamirim-branco), Aquifoliaceae (Erva-

Mate), Winteraceae (Casca de Anta), Euphorbiaceae (Branquilho) e alguns raros exemplares

de Pinus. Em todas as árvores observam-se fungos liquenizados (Figura 3.5D). Coordenadas:

26°24'37.60"S; 51°23'44.50"O.

96

Área São Zacharias: Localizada na Madeireira São Zacharias. Área modificada por

silvicultura, com plantio de Pinus em diversos estágios de crescimento. As armadilhas foram

dispostas tanto no interior das áreas de Pinus quanto em borda de plantação de Pinus com

remanescentes degradados e abertos de mata nativa. Presença de duas espécies de taquaras,

Asteraceae (Vassourinha, Vassourão), Aquifoliaceae (Erva-Mate), Solanaceae (Jurubeba) e

Cyperaceae (Capim-Navalha). Em algumas áreas remanescentes de mata nativa é possível

observar a presença de Araucárias esparsas. No interior da mata de Pinus a vegetação é

rasteira e aberta (Figura 3.5E). Coordenadas: 26°33'21.70"S; 51°23'38.00"O.

Área Alagado: Localizada na Fazenda Lageado Grande. Representa um mosaico de

remanescentes de vegetação nativa, campo degradado, área de brejo e borda de área de

silvicultura, próximas ao Rio Lageado Grande. Grande quantidade de touceiras de taquara

(Guadua chacoensis), além de exemplares de Mimosaceae (Bracatinga), Flacourtiaceae

(Guaçatunga), Asteraceae (Vassourão), Myrtaceae (Guamirim-branco), Arecaceae (Butiá) e

Bignoniaceae (Figura 3.5F). Coordenadas: 26°19'9.90"S; 51°35'8.50"O.

97

Figura 3.5. Áreas amostradas no estudo realizado entre 2009 e 2011 no município de General

Carneiro/PR: A) Araucárias; B) Bomba; C) RPPN; D) Escadaria; E) São Zacharias; F)

Alagado

Desenho Amostral e Esforço de Captura

Foram estabelecidos um total de 12 transectos nas seis áreas de estudo (2 transectos

por área). Cada transecto possuía 20 estações de captura espaçadas em cerca de 15 metros. Os

transectos foram estabelecidos por 5 noites consecutivas em cada expedição de coleta. O

esforço de captura total foi de 1500 armadilhas-noite em cada expedição e foi estimado

através do número de armadilhas estabelecidas, multiplicado pelo número de noites de

captura.

A) B) C)

D) E) F)

98

Estudo do Micro-habitat

Para a caracterização do micro-habitat das espécies de pequenos mamíferos, foram

consideradas diversas variáveis quantitativas do habitat, tomadas na expedição de setembro de

2010 e associadas aos dados de captura de pequenos mamíferos desta mesma expedição.

Foram medidas variáveis quantitativas tomadas em cinco pontos de cada estação de

captura da seguinte forma: central, norte, sul, leste e oeste. Os pontos adjacentes foram

posicionados a cerca de 1,5m do ponto central de acordo com Freitas et al. (2002) modificado,

formando uma área de 9 m² ao redor das armadilhas, sendo este considerado o microhabitat.

As variáveis estimadas foram medidas de acordo com Freitas et al. (2002) e englobam:

porcentagem de folhiço (FOL), de pedras (PED), de exposição do solo (SOLO), de água

(AGUA), de partes de plantas verdes (raízes e plântulas) (CHL) e de cobertura do dossel

(COB_DOSS); número de troncos caídos (TRON); altura do dossel (ALT_DOSS); densidade

de partes herbáceas e lenhosas em três diferentes alturas (OFV1, OFV2, OFV3); número de

Araucárias (ARA); número de Pinus (PIN) e número de árvores com diâmetro a altura do

peito maior que 5cm (DAP).

FOL – porcentagem de cobertura de folhiço em 1m²;

PED - porcentagem de cobertura de pedra em 1m²;

SOLO – porcentagem de exposição do solo em 1m²;

AGUA – porcentagem de água em 1m²;

CHL - porcentagem de partes de plantas verdes em 1m²;

COB_DOSS - porcentagem de cobertura de dossel em 1m²;

TRON – número de troncos caídos em uma area de 9m² area;

ALT_DOSS – altura de dossel;

OFV1 – porcentagem de obstrução foliar de 0 a 0,5m de altura em 1m²;

OFV2 - porcentagem de obstrução foliar de 0,5 a 1m de altura em 1m²;

OFV3 - porcentagem de obstrução foliar de 1 a 1,5m de altura em 1m²;

ARA - número de Araucárias em uma area de 9m²;

PIN - número de Pinus em uma area de 9m²;

DAP - número de árvores com diâmetro a altura do peito maior que 5cm em uma área de 9m²

99

As variáveis FOL, PED, SOLO, AGUA, CHL, COB_DOSS, OFV1, OFV2 e OFV3,

foram medidas com um quadrado de 1m², sendo que o centro da medição era o local das

armadilhas. O instrumento de medição constitui-se de um quadrado com bordas de madeira

(0,5 x 0,5 m), dividido em 100 quadrados menores confeccionados com arame de modo a

formar uma tela. As medições foram realizadas pela quantificação do número de obstrução

dos quadrados, sendo considerados visualmente obstruídos aqueles com mais de 50% de

obstrução ou vazios com menos de 50% de obstrução visual. O número de troncos caídos, de

Araucárias e de Pinus foram determinados por contagem direta e a altura do dossel foi

estimada a olho nu. Todas as variáveis, com exceção de ALT_DOSS, foram transformadas

em uma unidade de área padrão de acordo com (Cerqueira & Freitas 1999) de forma a

uniformizar sua quantificação.

A preferência de habitat pelas espécies de pequenos mamíferos foi analisada através

de regressão logística (stepwise backwards) no programa SPSS®, considerando-se a presença

ou ausência de cada indivíduo e as variáveis de cada ponto de captura. Para estas análises foi

feita uma matriz de correlação no programa BioEstat 5.0®

(Ayres et al. 2007) para se eliminar

as variáveis correlacionadas.

Índices de complexidade e de heterogeneidade do habitat foram calculados para cada

área de estudo. A complexidade do habitat é a proporção da densidade da vegetação total

encontrada em um dado estrato vertical, enquanto que a heterogeneidade indica a variação

horizontal nas características do habitat. A complexidade foi calculada de acordo com

(August 1983), através de uma Análise de Componentes Principais para as variáveis OFV1,

OFV2, OFV3, ALT_DOSS e DAP, sendo o índice de complexidade considerado como a

média dos valores do componente 1. A heterogeneidade foi determinada a partir das variáveis

FOL, PED, SOLO, AGUA, CHL, COB_DOSS, TRON e ARA, baseando-se no método

utilizado por (Paglia et al. 1995) que usou a variância das variáveis entre os pontos de

armadilhagem como medida para a heterogeneidade do habitat. Uma medida de

heterogeneidade foi determinada para cada área de estudo, dividindo-se a variância de cada

variável pela variância total de todos os pontos de captura, e por fim somando-se estes

quocientes.

100

Análise de parâmetros de comunidades

A riqueza de espécies dos roedores foi quantificada pelo número total de espécies

coletadas em cada área. A abundância foi determinada pelo número de indivíduos coletados

de cada espécie uma vez que o esforço de captura foi igual em todas as áreas.

A composição de espécies de roedores em cada área foi analisada através de um

NMDS (Escalonamento multidimensional) baseado em uma matriz de dissimilaridade de

Bray-Curtis (Legendre & Legendre 1998), no programa SYSTAT®, com o objetivo de

analisar o agrupamento entre as seis áreas a partir deste parâmetro. Uma análise de PCA

(Análise de Componentes Principais) das variáveis da paisagem foi realizada e os valores dos

dois componentes principais (factor scores) que mais explicaram a variação nos dados foram

relacionados aos dois eixos obtidos no NMDS através de uma regressão linear múltipla, com

o objetivo de verificar se há influência destas variáveis na composição de espécies.

A composição de espécies a partir da matriz de Bray-Curtis foi ainda relacionada aos

índices de Heterogeneidade e Complexidade a partir de matrizes de dissimilaridade. Para esta

análise foi realizado o teste de Mantel (Mantel 1967), utilizando correlação de Pearson e

10000 permutações, no programa XLSTAT®. Para construção das matrizes de dissimilaridade

das variáveis explicativas foi usado o índice de Gower (Legendre & Legendre 1998). Estas

matrizes foram calculadas através da fórmula D=1-S, sendo S o valor do índice de

similaridade e D a medida de dissimilaridade.

A co-ocorrência das espécies foi analisada a partir de uma tabela de abundância de

cada espécie para cada ponto de captura. Foi utilizada uma matriz de correlação linear de

Spearman com o objetivo de avaliar a co-ocorrência (segregação espacial ou sobreposição) de

espécies de acordo com o estudo de Gentile & Fernandez (1999). As análises foram realizadas

no programa BioEstat 5.0 (Ayres et al. 2007) e foram calculadas para cada expedição de

captura em separado.

101

Análise de parâmetros da infecção por hantavírus

A prevalência total de infecção por hantavírus foi avaliada dividindo-se o número de

roedores infectados pelo número total de roedores analisados para cada área. Foi também

calculada a prevalência de infecção de JABV e JUQV em separado. Nestes casos a

prevalência foi avaliada dividindo-se o número de roedores infectados pelo número total de

indivíduos das espécies infectadas por cada genótipo viral.

Para identificar quais variáveis bióticas e abióticas (variáveis explicativas) estão

diretamente relacionadas com a ocorrência de infecção (variável dependente), foram

construídos modelos lineares generalizados (GLM) no programa R, com distribuição binomial

e função de ligação logit. O objetivo desta análise é gerar modelos descritivos da infecção por

hantavírus e por JABV e JUQV em separado. A análise foi realizada a partir do banco de

dados obtido contendo as seguintes variáveis explicativas: i) bióticas – espécie, sexo, classe

etária, condição reprodutiva e presença de cicatrizes; e ii) abióticas – estação do ano, área de

estudo, precipitação no mês anterior, temperatura no mês anterior, riqueza de espécies,

abundância de A. serrensis e abundância de A. montensis. Para seleção das variáveis nos

modelos foi realizada uma análise univariada a priori entre a variável dependente e cada

variável resposta. As variáveis significativas foram acrescentadas ao modelo e a partir do

método stepwise backwards foi considerado o modelo mais parcimonioso de acordo com o

decréscimo nos valores de AIC. O modelo escolhido foi validado através do teste de Hosmer-

Lemeshow que o compara com subgrupos do total de dados. Neste caso, para que o modelo

seja validado o p-valor do teste deve ser maior que 0,05, já que a hipótese nula é que o

modelo escolhido é adequado.

102

RESULTADOS

Classificação das áreas de estudo

As seis áreas de estudo foram classificadas de acordo com o grau de similaridade e

foram agrupadas em pares (Tabela 3.2; Figura 3.6). As áreas mais preservadas e com maior

extensão, Araucárias e Bomba, foram classificadas como mais similares entre si, bem como

RPPN e Escadaria, que são as áreas mais próximas entre si. São Zacharias e Alagado foram as

mais distintas dentre as seis áreas amostradas. Além destas últimas possuírem as menores

coberturas de mata nativa, São Zacharias é a única área com uma grande extensão de

plantação de Pinus e Alagado representa um mosaico de todas as variáveis da paisagem, com

uma grande área de brejo e a maior extensão de áreas abertas (campo antrópico) (Tabela 3.2).

Tabela 3.2. Porcentagem de cada variável da paisagem e índices de heterogeneidade e

complexidade presentes em cada uma das seis áreas de estudo.

Área

Mata

Nativa Água Brejo

Campo

Antrópico Pinus Estrada

Araucarias 89.78 3.70 0.00 2.72 0.00 3.80

Bomba 83.08 5.17 0.00 0.00 0.00 11.75

RPPN 83.96 0.00 0.00 15.49 0.00 0.55

Escadaria 83.29 1.12 0.00 13.35 0.00 2.24

São Zacharias 51.62 0.00 0.00 11.77 34.86 1.75

Alagado 41.05 1.08 28.12 21.67 6.13 1.96

103

Figura 3.6. Gráfico NMDS (Escalonamento multidimensional) indicando a similaridade entre

as áreas estudadas de acordo com as variáveis da paisagem.

Comunidades de pequenos mamíferos

A riqueza e abundância de espécies de roedores e marsupiais em cada área está

apresentada na Tabela 3.3. As seis espécies mais abundantes (Akodon serrensis, Akodon

montensis, Akodon paranaensis, Oxymycterus judex, Oligoryzomys nigripes e Thaptomys

nigrita) ocorreram nas seis áreas de estudo enquanto que as outras oito espécies apresentaram

baixas abundâncias. A área Bomba apresentou a maior riqueza, sendo que todas as 14

espécies capturadas no estudo ocorreram nesta área. As outras áreas de estudo apresentaram

riqueza de espécies semelhantes entre si. Na área São Zacharias 10 dos 40 pontos de captura

foram estabelecidos dentro da monocultura de Pinus. Desta forma, as seis espécies mais

abundantes ocorreram neste ambiente. Com exceção de O. nigripes, todas as outras espécies

apresentaram indivíduos da classe etária I (indivíduos jovens) dentro de reflorestamento de

Pinus. Além disso, foram observadas uma fêmea prenhe de A. serrensis, duas de A.

paranaensis, uma de O. judex e uma de O. nigripes,

104

Tabela 3.3 – Número total de animais capturados por espécie em cada área de estudo em

General Carneiro/PR, de dezembro de 2009 a dezembro de 2011

* A. paranaensis infectado por JUQV. Todos os outros espécimes de A. paranaensis, bem

como de A. serrensis e A. montensis, estavam infectados por JABV. Todos os espécimes de

O. nigripes estavam infectados por JUQV (Ver capítulo 2).

Espécies Áreas de Estudo

Araucárias Bomba RPPN Escadaria São

Zacharias

Alagado

Rodentia: Sigmodontinae

Akodon serrensis 44 101 43 49 144 20

Akodon montensis 4 52 75 67 29 26

Akodon paranaensis 17 8 1 14 34 13

Oxymycterus judex 95 61 24 14 79 21

Oligoryzomys nigripes 5 12 16 17 11 12

Thaptomys nigrita 11 10 11 26 11 1

Sooretamys angouya - 5 4 3 1 -

Nectomys squamipes - 1 - - - 1

Delomys dorsalis - 1 - 1 - -

Brucepattersonius iheringi - 2 - - - -

Didelphimorphia: Didelphinae

Monodelphis dimidiata 10 9 - 8 1 6

Philander frenatus 1 3 - 4 1 -

Gracilinanus sp. - 1 3 - - 1

Lutreolina crassicaudata - 1 - - - -

Riqueza Sigmodontinae 6 10 7 8 7 7

Riqueza Didelphinae 2 4 1 2 2 2

Riqueza Total* 8 14 8 10 9 9

Infecção por Hantavírus

Akodon serrensis 1 - - - 1 -

Akodon montensis - 3 6 3 1 3

Akodon paranaensis 1 - - 1* - 3

Oligoryzomys nigripes 1 - - 1 - 1

Prevalência de JABV 3.08% 1.86% 5.04% 2.31% 0.97% 10.17%

Prevalência de JUQV 4.55% - - 6.45% - 4.00%

Prevalência Total (JABV+JUQV) 1.70% 1.19% 3.41% 2.62% 0.65% 7.45%

105

Estudo do micro-habitat

A partir da matriz de correlação foram eliminadas as variáveis de micro-habitat CHL,

COB_DOSS e OFV1 por estarem correlacionadas com outras. Foi analisada a preferência de

micro-habitat para as seis espécies mais abundantes. As espécies A. serrensis e A. montensis

apresentaram relação significativa com obstrução foliar vertical nos estratos de 0,5 a 1m de

altura (OFV2) e de 1 a 1,5m de altura (OFV3). Enquanto a espécie A. serrensis (n = 63)

apresentou associação positiva com a variável OFV2 (B = 0,532; p < 0,001), A. montensis (n

= 25) apresentou relação negativa com a variável OFV3 (B = -0,663; p = 0,034). Entretanto A.

montensis também apresentou relação positiva, embora marginalmente significativa, com a

variável OFV2 (B = 0,463; p = 0,076). Em relação às outras espécies, a variável ALT_DOSS

foi relacionada negativamente com O. judex (n = 36) (B = -0,109; p = 0,026) enquanto que a

variável ARA foi relacionada positivamente com T. nigrita (n = 17) (B = 2,928; p = 0,032).

Nenhuma variável foi relacionada às espécies A. paranaensis (n = 17) e O. nigripes (n = 12).

O maior valor do índice de heterogeneidade foi encontrado na área menos preservada

(São Zacharias) (Tabela 3.4). Altos índices de heterogeneidade foram também encontrados

nas áreas Escadaria e Alagado. Já o índice de complexidade foi maior nas áreas RPPN e

Bomba (Tabela 3.4). Nenhuma relação foi encontrada entre a composição de espécies e a

heterogeneidade (r = -0,272; p = 0,324) ou a complexidade (r = -0,153; p = 0,568).

Tabela 3.4 – Índices de heterogeneidade e complexidade em cada uma das seis áreas de

estudo, do município de General Carneiro/PR.

Área Heterogeneidade Complexidade

Araucarias 4.41 0.23

Bomba 4.97 0.37

RPPN 3.70 0.46

Escadaria 10.78 0.26

São Zacharias 13.84 0.33

Alagado 6.03 0.23

106


A análise de co-ocorrência das espécies a partir dos pontos de captura indicou

segregação espacial (correlação negativa) entre A. serrensis e A. montensis em 8 das 9

expedições de coleta (Tabela 3.5). Outras associações indicando segregação espacial foram

observadas, entretanto ocorreram em no máximo três expedições e em geral em épocas de alta

populacional (Tabela 3.6):

Tabela 3.5. Análise de co-ocorrência entre A. serrensis e A. montensis no município de

General Carneiro/PR.

Expedição de Coleta Valor de r Valor de p

Dezembro/2009 -0.4493 0.0013

Março/2010 -0.3797 0.0011

Junho/2010 -0.325 < 0.0001

Setembro/2010 -0.2247 0.0094

Dezembro/2010 -0.3166 0.0033

Março/2011 -0.224 0.05

Junho/2011 -0.3084 0.0014

Setembro/2011 -0.0348 0.707

Dezembro/2011 -0.2625 0.0427

107

Tabela 3.6. Análise de co-ocorrência, entre as espécies capturadas no município de General

Carneiro/PR.

Espécies

A. serrensis

A. montensis

O. nigripes

T. nigrita

A. paranaensis Setembro/2010

(r = -0.2544

p = 0.0031)

Setembro/2010

(r = -0.1763

p = 0.0424)

O. judex

Junho/2010

(r = -0,2389

p = 0,0043)

Março/2011

(r = -0.3308

p = 0.0033)

Setembro/2011

(r = -0.2197

p = 0.0163)

Dezembro/2011

(r = -0.3531

p = 0.0056)

Junho/2011

(r = -0.2007

p = 0.041)

Setembro/2011

(r = -0.1806

p = 0.0493)

O. nigripes

Junho/2011

(r = -0.1994

p = 0.0423)

Setembro/2011

(r = -0.2346

p = 0.0102)

Os resultados apresentados na Tabela 3.3 dão suporte ao padrão de segregação espacial entre

A. serrensis e A. montensis. Nas áreas Araucárias, Bomba e São Zacharias a espécie A.

serrensis foi mais abundante do que A. montensis enquanto que nas áreas RPPN, Escadaria e

Alagado A. montensis foi mais abundante que A. serrensis.

A composição de espécies não apresentou associação com as variáveis da paisagem

(Dimensão 1 do NMDS x Componentes 1 e 2 da PCA: R² = 0,211; p = 0,70; Dimensão 2 do

NMDS x Componentes 1 e 2 da PCA: R² = 0,412; p = 0,45). Os Componentes 1 e 2 da PCA

explicaram 58,7% e 21,1% da variação, respectivamente. O gráfico NMDS da abundância das

espécies (Figura 3.7) não mostrou um agrupamento das áreas de acordo com o seu grau de

conservação.

108

Figura 3.7. Gráfico NMDS (Escalonamento multidimensional) indicando a similaridade entre

as áreas estudadas de acordo com a composição de espécies.


O número de espécimes infectados por hantavírus, a prevalência de infecção total e as

prevalências de JABV e JUQV estão apresentadas na Tabela 3.3. Foi possível observar uma

tendência à diminuição da prevalência de infecção total e por JABV, quanto maior era a

abundância de A. serrensis (Tabela 3.3; Figura 3.8).

Figura 3.8. Prevalência de infecção por JABV e prevalência total de infecção por hantavírus

de acordo com a abundância de A. serrensis em cada área de estudo.

109

A análise GLM corroborou esta tendência indicando uma correlação negativa entre

infecção por JABV e abundância de A. serrensis (Tabela 3.7). Por outro lado, estas

prevalências tendiam a aumentar quanto maior a abundância de A. montensis (Tabela 3.3).

Além da abundância de A. serrensis, as variáveis espécie, sexo e classe etária também foram

selecionadas no modelo descritivo de ocorrência de JABV em roedores silvestres. A espécie

A. montensis apresentou a maior prevalência de infecção por hantavírus em relação às outras

três espécies infectadas (A. serrensis, A. paranaensis e O. nigripes). A prevalência também

foi maior em indivíduos machos da classe etária III (adultos). Desta forma, segundo o modelo

descritivo, áreas com menores abundâncias de A. serrensis e com maior ocorrência de machos

adultos de A. montensis, apresentam maior probabilidade de ocorrência de JABV. A Tabela

3.7 indica os valores de AIC do modelo nulo, seguido do modelo incluindo as variáveis

selecionadas nas análises univariadas prévias e o modelo final selecionado após as análises

stepwise.

Tabela 3.7. Modelo descritivo de ocorrência de hantavírus na região de estudo, baseado em

seleção stepwise e no Critério de Informação de Akaike (AIC). ΔAIC representa a diferença

entre o AIC do valor de um modelo em relação ao modelo selecionado (de menor valor de

AIC)

Genótipo ΔAIC AIC Model Hosmer-Lemeshow

(HL)

JABV

59,98 221,51 Null Model

HL = 0,4627989

p = 0.9999

12,11 174,64 Espécie + Sexo + Classe

etária + Estação + Localidade

+ Condição reprodutiva +

Temperatura + Abundância

de Akodon serrensis

0 162,53 Espécie + Sexo + Classe

etária + (-) Abundância de

Akodon serrensis

JUQV 2,41 58,05 Espécie -

0 55,64 Modelo Nulo

110

Os dados de ocorrência de infecção por JUQV não puderam ser modelados devido ao

baixo número amostral (n=4). É válido ressaltar que a análise univariada entre a variável

dependente e a variável explicativa “Abundância de Akodon serrensis”, apresentou um nível

de significância marginal (p = 0,07), sugerindo que a mesma relação encontrada nas análises

de JABV pode ocorrer em JUQV.

DISCUSSÃO

Comunidade de pequenos mamíferos

Em comparação com o estudo prévio realizado em General Carneiro, foram

adicionadas à lista de espécies da região mais 3 espécies de roedores (Nectomys squamipes,

Delomys dorsalis e Brucepattersonius iheringi) e 3 de marsupiais (Philander frenatus,

Gracilinanus sp. e Lutreolina crassicaudata). Estas espécies ocorreram em baixas

abundâncias e portanto, só foi possível detectá-las a partir do estudo de dois anos. As seis

espécies mais abundantes (Akodon serrensis, Akodon montensis, Akodon paranaensis,

Oxymycterus judex, Oligoryzomys nigripes e Thaptomys nigrita) ocorreram em todas as áreas

de estudo corroborando o resultado encontrado no estudo prévio (Ver Capítulo 1), quando

estas mesmas espécies foram encontradas tanto em mata nativa quanto na divisa entre mata

nativa degradada e áreas de reflorestamento de Pinus. Outras espécies que ocorreram em

ambos estudos foram o roedor S. angouya e o marsupial M. dimidiata. No estudo 2009-2011

estas espécies também foram encontradas nos dois tipos de áreas, apesar de não terem

ocorrido em todas as seis áreas de estudo.

O roedor N. squamipes ocorreu apenas em áreas com presença de curso d’água

(Bomba) ou brejo (Alagado), considerando seus hábitos semi-aquáticos (D’Andrea et al.

2007, Gentile et al. 2010). O roedor Delomys dorsalis foi registrado apenas em áreas de mata

nativa, bem como o marsupial Gracilinanus sp. Apesar de D. dorsalis ser um roedor comum e

abundante em outras regiões de Floresta Ombrófila Mista (Cademartori et al. 2004, 2005,

2008, Iob 2007), tendo sido inclusive relacionado a eventos de ratada no Estado de São Paulo

(Jaksic & Lima 2003), esta espécie apresentou apenas dois indivíduos nas áreas amostradas. É

uma espécie considerada especialista na ocupação do habitat, estando relacionada à habitats

preservados (Dalmagro & Vieira 2005, Perini 2010). Outros estudos indicaram a presença de

111

D. dorsalis em áreas de floresta com baixa densidade de Araucárias e em áreas de campo

alagadiço (Cademartori et al. 2002, Marques et al. 2011).

O roedor B. iheringi e o marsupial L. crassicaudata só ocorreram em uma área mais

preservada (Bomba), sendo este último capturado em borda de córrego. Segundo outros

autores, L. crassicaudata é de fato, uma espécie mais comumente encontrada em habitats

próximos de cursos d’água ou de várzea (Bonvicino et al. 2002, Monteiro-filho et al. 2006).

Brucepattersonius iheringi foi também reportado em baixa abundância, em áreas protegidas

de Floresta com Araucárias no Rio Grande do Sul (Pedó et al. 2010). Outro marsupial que

habita áreas próximas a cursos d’água é P. frenatus. Esta espécie foi encontrada próxima de

córregos nas áreas Escadaria e Bomba, entretanto foi capturada também em áreas sem a

ocorrência de cursos d’água (São Zacharias). Philander frenatus é uma espécie considerada

comum e sem restrição no uso de habitat (Bonvicino et al. 2002), sendo encontrada em áreas

alteradas (matrizes de áreas fragmentadas, áreas de agricultura e plantação de Eucalyptus sp.)

ou contínuas de Mata Atlântica (Gentile et al. 2000, Silva 2001, Pires et al. 2002, D’Andrea et

al. 2007, Lira et al. 2007, Freitas et al. 2009, Prevedello et al. 2009, Passamani & Ribeiro

2009, Rossi 2011).

Apesar de alguns autores indicarem que áreas de reflorestamento de Pinus são menos

exploradas pela fauna por serem mais empobrecidas e apresentarem sub-bosque pouco

estruturado (Rosa & Vieira 2010, Bovolenta et al. 2011), as seis espécies mais abundantes do

estudo foram capturadas dentro destes ambientes. Estas espécies apresentaram indivíduos

jovens e/ou fêmeas prenhes capturadas dentro de monoculturas de Pinus, indicando que estão

efetivamente colonizando este habitat. Alguns estudos reportam ainda, a capacidade de

determinadas espécies de roedores se alimentarem de sementes ou casca de Pinus, o que pode

ser mais um indício de colonização deste ambiente (Gonçalves et al. 2007a, Vieira et al.

2011). Fonseca et al. (2009), em estudo comparativo da biodiversidade em área de Floresta

Ombrófila Mista, destacou a importância das monoculturas de Pinus como habitats

alternativos de algumas espécies de áreas florestadas, entretanto demonstrou que estes

ambientes possuem uma menor biodiversidade e identificou quase 40% de espécies exclusivas

de Floresta Ombrófila Mista em florestas nativas de Araucárias.

Contudo, em General Carneiro, a presença destas seis espécies em áreas modificadas

por Pinus pode estar relacionada a presença de remanescentes de mata nativa no seu entorno.

No estudo de Rosa & Vieira (2010), por exemplo, a presença de espécies silvestres foi

reduzida em áreas de P. elliottii mais afastadas de matas nativas.

112


O índice de heterogeneidade foi mais alto na área modificada por Pinus (São

Zacharias). Em alguns casos a modificação do ambiente pode resultar em ambientes mais

heterogêneos, sendo um indicador de áreas de borda ou perturbações no interior das áreas de

floresta. Os índices de complexidade não apresentaram variação entre as áreas de estudo de

acordo com o grau de conservação. Este índice pode variar não apenas com o número de

estratos verticais, mas também com a distribuição da vegetação ao longo destes estratos

(Gentile & Fernandez 1999). Assim, as áreas que apresentaram menor complexidade

(Araucárias e Alagado) foram aquelas que não apresentaram um adensamento da vegetação

nos estratos mais baixos e intermediários, apesar da presença de árvores de grande porte.

A abundância das espécies não apresentou associação com as variáveis da paisagem,

tampouco um padrão de similaridade em relação ao grau de conservação das áreas. Da mesma

forma, a composição de espécies não apresentou associação com a heterogeneidade e

complexidade. Estes resultados sugerem que o grau de conservação não influenciou a riqueza,

a composição e a abundância das espécies de roedores e que as áreas não foram

suficientemente heterogêneas a ponto de gerar uma diferença significativa nas comunidades

de roedores.

De fato, as seis espécies mais abundantes foram encontradas em todas as seis áreas de

coleta, sugerindo uma homogeneidade das áreas em relação à ocorrência das espécies mais

abundantes (Tabela 3.3). Foi possível observar durante o estudo, que mesmo as áreas

consideradas mais preservadas apresentavam evidências de atividade humana. A área

Araucárias, apesar de ser a mais afastada das áreas de plantio de Pinus, apresentou durante o

estudo a coleta seletiva de Erva-Mate em alguns pontos e a área Bomba, apesar de apresentar

a maior riqueza de espécies do estudo, era cortada por uma trilha por onde trabalhadores da

madeireira transitavam em anos anteriores aos deste estudo. Além disso, as áreas Bomba e

RPPN, apesar de não apresentarem indícios de manejo durante o período do estudo, estavam

próximas de áreas de plantio de Pinus. A área Bomba apresentou a maior riqueza de espécies,

entretanto as abundâncias das espécies exclusivas ou compartilhadas com até duas áreas eram

muito baixas (Tabela 3.3).

Segundo (Pardini et al. 2010) fragmentos florestais em uma paisagem com alta

cobertura de vegetação nativa são capazes de manter populações tanto em fragmentos

pequenos quanto em fragmentos grandes devido a maior proximidade entre os remanescentes.

113

Efeito semelhante pode estar ocorrendo em nossa região de estudo, não somente pela sua alta

porcentagem de vegetação nativa em comparação com outras regiões do Estado (SOSMA

2012), mas também por não haver uma matriz de vegetação aberta como é o caso da maioria

das áreas fragmentadas em Mata Atlântica. A região de General Carneiro é um mosaico de

remanescentes de vegetação nativa (Floresta com Araucárias) e áreas modificadas por plantio

de Pinus que podem estar realizando um papel importante na manutenção de algumas espécies

(Fonseca et al. 2009).

Estudo do Micro-habitat

O padrão de ocupação do micro-habitat mostrou uma diferença na ocorrência de A.

serrensis e A. montensis uma vez que estas espécies apresentaram padrões diferentes em

relação a variável Obstrução Foliar Vertical, A. serrensis apresentando associação com pontos

de maior adensamento de vegetação entre 0,5 e 1m (OFV2) e A. montensis com menor

adensamento de obstrução foliar entre 1 e 1,5m (OFV3). Entretanto A. montensis também

apresentou correlação marginalmente significativa com OFV2, sugerindo que em alguns

momentos possa haver sobreposição de micro-habitat com A. serrensis. Entretanto este tipo

de habitat não parece ser preferencial considerando que estas espécies apresentam segregação

espacial na maior parte do tempo. Estes resultados podem estar relacionados a uma associação

preferencial de A. montensis a habitats aonde haja menor probabilidade de competição com A.

serrensis.

Em outros estudos, A. montensis apresentou preferência de micro-habitat variando de

áreas com baixa cobertura de dossel e/ou densa cobertura vegetal próxima ao solo (Püttker et

al. 2008b, Goodin et al. 2009), até áreas com maior cobertura de dossel (Dalmagro & Vieira

2005), corroborando os hábitos generalistas desta espécie.

A espécie O. judex apresentou associação negativa à altura do dossel, sugerindo

preferência por áreas de vegetação mais baixa e menos complexas, enquanto que T. nigrita

apresentou associação com a quantidade de Araucárias, indicando preferência por habitats

com presença de mata nativa.

114

Co-ocorrência de espécies

As análises de co-ocorrência apresentaram segregação espacial entre as seis espécies

mais abundantes ao longo dos dois anos de estudo, reforçando os resultados encontrados que

indicam separação entre algumas espécies a partir do habitat. Em geral estas associações

ocorreram em períodos de alta populacional (Junho e Setembro), sugerindo que a segregação

entre as espécies está relacionada a um fator estacional. Nestas épocas há maior adensamento

populacional e consequentemente pode haver maior probabilidade de competição entre as

espécies. É válido ressaltar que estas análises não indicam a exclusão de uma espécie pela

outra e sim a menor abundância de uma dada espécie em pontos de maior abundância de

outra. Esta relação foi melhor observada para as espécies A. serrensis e A. montensis, cuja

relação de segregação espacial foi significativa em 8 das 9 expedições realizadas,

corroborando os resultados de preferência por micro-habitat. Estas análises, indicam portanto,

um padrão predominante de separação de habitat entre estas duas espécies, podendo haver

sobreposição em certos momentos.

Estes resultados reforçam a distribuição observada das abundâncias destas espécies em

relação às áreas de estudo, sendo A. serrensis mais abundante em Araucárias, Bomba e São

Zacharias, e A. montensis mais abundante em RPPN, Escadaria e Alagado.


Este padrão se refletiu também na ocorrência de infecção por hantavírus, sendo o

modelo de ocorrência de JABV inversamente relacionado à abundância de A. serrensis, de

modo que quanto menor a abundância desta espécie maior a probabilidade de ocorrência de

JABV. O modelo descritivo de ocorrência de JABV em roedores silvestres indicou ainda

correlação com as variáveis Espécie (A. montensis), Sexo (machos) e Classe Etária (Classe III

= adultos). Este modelo corrobora outros estudos que indicam que a infecção ocorre

principalmente durante a época reprodutiva (Escutenaire et al. 2002), devido ao

comportamento agonístico, mais comum em machos adultos (Boone et al. 1998, Yahnke et al.

2001, Mills et al. 2007, Piudo et al. 2011, Vadell et al. 2011). Segundo Klein et al. (2004)

Rattus norvegicus infectados com o genótipo de hantavírus Seoul são mais agressivos que

machos não infectados. Além disso, Lehmer et al. (2007) reportaram menor

imunocompetência em machos de Peromyscus maniculatus, hospeiro do genótipo de

115

hantavírus Sin Nombre, sugerindo maior suscetibilidade em machos em comparação com

fêmeas.

Resultado semelhante foi encontrado por Oliveira (2012) em estudo realizado na

Floresta com Araucárias de Santa Catarina, indicando abundância de A. montensis e sexo

(machos) como principais variáveis relacionadas à ocorrência de JABV. Já Orrock et al.

(2011), encontrou relação entre ocorrência de hantavírus e pluviosidade, tamanho da área e

menor presença de predadores em ilhas na costa da California.

Apesar do modelo proposto estar adequado para compreensão da dinâmica de

transmissão do hantavírus entre os hospedeiros silvestres, modelos determinantes de risco de

ocorrência de SPH devem também levar em consideração as atividades humanas de risco

(Goodin et al. 2009). A hipótese do efeito diluidor não foi confirmada nas áreas de estudo

considerando que o modelo descritivo não indicou influência da riqueza de espécies na

ocorrência de infecção.

As relações spillover encontradas podem ser explicadas de acordo com as

características das áreas de estudo, do micro-habitat e da co-ocorrência das espécies. No caso

do spillover A. serrensis/JABV, apesar de esta espécie ter sido encontrada infectada em duas

das três áreas em que sua abundância foi maior que a de A. montensis (Araucárias e São

Zacharias), sua infecção não parece estar relacionada com a abundância já que um dos dois

spillovers ocorreu em uma época de baixas populacionais (Dezembro/2009). Akodon serrensis

e A. montensis (hospedeiro primário de JABV), apresentaram segregação espacial e diferentes

preferências de micro-habitat. Entretanto, a ocorrência de sobreposição de habitats, embora

não predominante, pode ser determinante para a infecção spillover em A. serrensis. Segundo

Allen et al. (2009), este tipo de infecção é mais provável de ocorrer quando há sobreposição

no habitat. Roedores em estresse competitivo e que venham a ocupar habitats menos

preferenciais, o que pode ser o caso dos espécimes de A. montensis de General Carneiro,

podem apresentar mudanças comportamentais, como por exemplo aumento na agressividade,

aumentando com isso a probabilidade de transmissão intra e interespecífica do hantavírus

(Goodin et al. 2009)

Em relação ao spillover A. paranaensis/JABV, esta espécie foi encontrada infectada

por JABV em duas áreas (Araucárias e Alagado), concentrando três dos quatro indivíduos

infectados na área Alagado. Este spillover pode estar relacionado a recorrente ocorrência de

alagamento em alguns pontos desta área, o que pode diminuir os habitats disponíveis fazendo

com que haja sobreposição entre A. paranaensis e o hospedeiro primário de JABV, A.

116

montensis. De fato a única relação de segregação espacial encontrada nestas espécies ocorreu

em Setembro/2010, época de menor pluviosidade na região e subsequente a uma grande

enchente na área Alagado ocorrida em Março/2010.

A única infecção spillover encontrada entre A. paranaensis/JUQV, se deu em uma

área aonde O. nigripes, hospedeiro primário de JUQV foi também encontrado infectado,

entretanto não foi possível determinar a importância desta relação a partir das análises de co-

ocorrência e de micro-habitat.

Três das seis áreas estudadas foram também amostradas no estudo prévio realizado em

2006 (Bomba, Escadaria e São Zacharias). Duas destas, Escadaria e São Zacharias, já haviam

apresentado roedores infectados. Em São Zacharias fora encontrado um A. montensis

infectado por JABV e em Escadaria um A. montensis infectado por JUQV. No estudo

realizado em 2009-2011 um spillover de A. paranaensis/JUQV foi encontrado nesta mesma

área, demonstrando a provável ocorrência de interação entre estas espécies e o hospedeiro

primário de JUQV (Oligoryzomys nigripes), também encontrado infectado em Escadaria.

117

CONCLUSÕES

• As principais espécies hospedeiras de hantavírus no Estado do Paraná são os roedores

Akodon montensis e Oligoryzomys nigripes, associados aos genótipos virais Jaborá

Vírus (JABV) e Juquitiba Vírus (JUQV), respectivamente.

• A dinâmica de infecção por hantavírus nos roedores silvestres apresenta um padrão

estacional e relacionado ao sexo e a idade dos roedores (machos adultos), de modo que

maiores prevalências são observadas na primavera/verão.

• As seis espécies mais abundantes de roedores (Akodon serrensis, Oxymycterus judex,

Akodon montensis, Akodon paranaensis, Oligoryzomys nigripes e Thaptomys nigrita)

apresentaram dinâmica populacional semelhante (maior atividade reprodutiva, maior

quantidade de indivíduos adultos e menores tamanhos populacionais na

primavera/verão).

• O grau de preservação das áreas de estudo na Floresta Ombrófila Mista, não

influenciou a composição de espécies, demonstrando uma homogeneidade entre as

áreas.

• A infecção spillover entre A. serrensis e A. montensis está relacionada a ocupação do

micro-habitat por estas espécies.

• Infecções spillover ocorrem em períodos de baixa prevalência nos hospedeiros

primários, sendo importantes na manutenção dos genótipos JABV e JUQV no

ambiente.

• A infecção por JABV em roedores está relacionada à uma menor abundância de A.

serrensis, à presença de roedores machos adultos e à ocorrência da espécie A.

montensis nas áreas de estudo.

118

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