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UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO

SEMIÁRIDO

CRISTIANE MARIA SOUZA DE CASTRO RODRIGUES

ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE

BIOLÓGICA DE Annona leptopetala (Annonaceae)

Petrolina – PE

2016




Dissertação apresentada à Universidade

Federal do Vale do São Francisco, como

parte dos requisitos do Programa de Pós-

Graduação em Recursos Naturais do

Semiárido, para obtenção do título de

Mestre em Recursos Naturais.

Orientador: Prof. Dr. Jackson Roberto

Guedes da Silva Almeida.

Petrolina – PE

2016

Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Integrado de Bibliotecas da UNIVASF.

Bibliotecária: Luciana Souza Oliveira CRB5/1731

Rodrigues, Cristiane Maria Souza de Castro

R696e Estudo fitoquímico e avaliação da atividade biológica de Annona leptopetala (R.E.F.Fr.) H. Rainer / Cristiane Maria

Souza de Castro Rodrigues – Petrolina, 2016. xii, 209 f.

Dissertação (Mestrado em Recursos Naturais do

Semiárido) - Universidade Federal do Vale do São Francisco, Campus Petrolina, Petrolina- PE, 2016. Orientador: Prof. Dr. Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida.

1. Annona leptopetala 2. Alcaloides. 3. Atividade biológica. I. Título. II. Universidade Federal do Vale do São Francisco.

CDD 581.634




Dissertação apresentada à Universidade

Federal do Vale do São Francisco, como

parte dos requisitos do Programa de Pós-

Graduação em Recursos Naturais do

Semiárido, para obtenção do título de Mestre

em Recursos Naturais.

APROVADA EM 31 DE MARÇO DE 2016.

______________________________________________________

Prof. Dr. Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida - UNIVASF

(Orientador)

______________________________________________________

Prof. Dr. Emmanoel Vilaça Costa - UFAM

(1º Examinador)

________________________________________________

Prof. Dra. Xirley Pereira Nunes - UNIVASF

(2º Examinador)

Ao meu filho amado, Guilherme,

pelo amor incondicional e por compreender, mesmo tão pequeno, as longas

horas de ausência de sua mãe;

Aos meus queridos pais,

por me ensinarem o verdadeiro valor dos estudos;

Ao meu querido esposo Renato,

pelo amor e companheirismo,

Dedico.

Ao Pai celestial,

por sempre estar ao meu lado, principalmente nas horas que menos mereci

e quem tornou esse sonho possível.

Ofereço.

AGRADECIMENTOS

Ao Senhor Deus, que todos os dias da minha vida me encheu de ânimo e cuidou

da minha família para eu nunca desistir, e por colocar tantos anjos na minha vida.

O meu sincero e imenso agradecimento, ao meu querido e maravilhoso filho

Guigui, por compreender a minha ausência, para que este trabalho fosse conduzido.

Pelo seu imenso amor, energia concedida através de sorrisos, beijos e abraços e

por me fazer a mãe mais feliz desse mundo, eu o agradeço de todo o meu coração.

Aos meus queridos pais, Cristiano e Maria de Jesus, agradeço de uma maneira

especial pela vida, pelo amor incondicional e valores ensinados, e principalmente a

minha rainha (mãe), que fez tudo o que era possível para me manter estudando, por

acreditar que a educação é um bem valioso. É o meu maior exemplo!

Ao meu digníssimo esposo, meu sincero agradecimento pela enorme paciência

com a minha “chatura”, pela imensa ajuda, apoio e carinho dedicados nessa etapa

da minha vida e acima de tudo por ser esse grande pai.

Meu sincero agradecimento ao meu orientador inoxidável, Prof. Dr. Jackson

Roberto Guedes da Silva Almeida, pela oportunidade concedida, pelos

ensinamentos compartilhados com maestria e pela forma de fazer ciência com tanta

dedicação.

Ao Prof. Dr. Emmanoel Vilaça Costa (UFAM) pelos conhecimentos

compartilhados e por ser tão acessível. Obrigada por confiar no meu potencial e ter

tornado a convivência com a espécie Annona leptopetala prazerosa e promissora.

O reconhecido agradecimento a uma “anja”, chamada Lívia Dutra, que sempre se

colocou à disposição para ajudar. Agradeço imensamente, pelo tempo dedicado nas

análises de RMN e ajuda nas elucidações estruturais.

A todos os meus professores que passaram pela minha vida e deixaram seu

exemplo, os levo no meu coração e lhes serei eternamente grata pela minha

formação profissional.

Aos meus familiares, tios e irmãos, Tiago e Dani, pelo amor e apoio dedicados a

mim, e em especial ao meu tio José Neto, maior incentivador e provedor dos meus

estudos e à minha irmã, que para mim é mais que uma “anja”.

À minha turma do mestrado, pelo companheirismo, ajuda e por tornar essa

jornada mais prazerosa e em especial, à Iza Miranda e Cárita Piauilino, por quem

tenho grande apreço e carinho.

Aos amigos que conquistei no meio acadêmico, que mesmo sem citar nomes,

podem reconhecer que tenho por eles muito carinho e apreço.

A todos os colegas do NEPLAME e do laboratório de Química Orgânica, que

sempre se disponibilizaram a ajudar e pelos conhecimentos divididos, além dos

momentos de descontração, tornando a convivência prazerosa e divertida.

Um agradecimento especial às meninas super poderosas, Ana Paula de Oliveira,

Mariana Gama e Érika Lavor, pelo tempo dedicado na realização dos ensaios

biológicos.

Às professoras Edigênia Cavalcante, Larissa Rolim e Xirley Nunes, pela

colaboração e esclarecimentos, e de uma forma carinhosa ao meu conterrâneo,

Prof. Wagner Félix, por me proporcionar momentos de grande alegria, nas suas

aulas fantásticas.

Às professoras Dra. Marcília Costa (UFPI) e Cláudia Pessoa (UFC), pelos

ensaios biológicos no Laboratório Nacional de Oncologia experimental (LabNOE-

UFC).

Ao Programa de Pós-Graduação em Recursos Naturais do Semiárido pela

oportunidade da pesquisa.

Ao órgão de fomento FACEPE pela bolsa concedida.

Ao CNPQ pelo apoio financeiro desta pesquisa.

Aos colaboradores nas análises de RMN: Prof. Dr. Andersson Barison (UFPR),

Prof. Dr. Raimundo Braz Filho (UENF) e aos técnicos, pela elaboração dos

espectros.

Ao analista ambiental André Paviotti, pela coleta e identificação do material

botânico.

Agradeço imensamente a todos que direta ou indiretamente, contribuíram para

que este trabalho fosse desenvolvido.

―Cada pessoa deve trabalhar para o seu

aperfeiçoamento e, ao mesmo tempo, participar da

responsabilidade coletiva por toda a humanidade”.

(Marie Curie)

RESUMO

Annona leptopetala (R.E.Fr.) H. Rainer, espécie pertencente à família Annonaceae,

é empregada como digestivo e no tratamento de tumores e inflamações, segundo a

medicina tradicional. O presente trabalho descreve os resultados obtidos a partir do

estudo fitoquímico e biológico das folhas e ramos de A. leptopetala, no qual foram

investigadas as atividades citotóxica, antibacteriana e antioxidante. A partir do

material vegetal, coletado em Custódia-PE, obtiveram-se os extratos hexânico e

metanólico e as frações alcaloídica e neutra das folhas e ramos de A. leptopetala. A

investigação fitoquímica de EHF resultou no isolamento do sesquiterpeno

espatulenol (SBF II-3) e de FALCF resultou na identificação de três alcaloides

aporfínicos: anonaina, nornuciferina e norannuradapurina e no isolamento de

laurotetanina. Destes norannuradapurina está sendo descrita pela primeira vez no

gênero e laurotetanina e nornuciferina, descritas pela primeira vez na espécie. As

substâncias foram identificadas por técnicas espectroscópicas de RMN de 1H e 13C

1D/2D, bem como por comparação com dados da literatura. No ensaio de atividade

antioxidante, pelo método DPPH, o EMF (CE50 = 10,10 µg.mL-1), mostrou-se

comparável ao BHT, enquanto no ensaio de inibição da co-oxidação do -caroteno/

ácido linoleico, todas as amostras apresentaram boa inibição (77-93%). No ensaio

de atividade citotóxica in vitro EHF, EHR, FNF, FNR, FALCAF e FALCR

apresentaram elevada atividade contra células tumorais de sarcoma-180, com

inibição do crescimento celular entre 76 e 92%. Já FNF e FALCR frente às células

de câncer colorretal (HCT-116) e leucemia (HL-60) e FALCF contra a linhagem HCT-

116, exibiram potente efeito citotóxico com inibição do crescimento acima de 80%. O

espatulenol (50 µg.mL-1) monstrou significativa atividade antiproliferativa, com

inibição de crescimento superior a 97% frente às linhagens tumorais HCT-116, HL-

60 e glioblastoma (SF-295). No ensaio antibacteriano, as amostras no geral exibiram

atividade moderada, com destaque para FALCF, que apresentou valores de CIM

inferiores a 1000 µg.mL-1, demonstrando assim uma boa atividade, além de exibir

efeito biocida frente as bactérias do ensaio. Desta forma, os resultados confirmam

que A. leptopetala é uma espécie típica da família Annonaceae, bem como

apresenta substâncias com potencial terapêutico.

PALAVRAS-CHAVE: Annonaceae; Annona leptopetala; sesquiterpenos; alcaloides;

atividade citotóxica; atividade antibacteriana.

ABSTRACT

Annona leptopetala (R.E.Fr.) H. Rainer, species belonging to the family Annonaceae,

is used as a digestive and treatment of tumors and inflammation, according to the

traditional medicine. This paper describes the results obtained from the

phytochemical and biological study of the leaves and branches of A. leptopetala,

which investigated the cytotoxic, antibacterial and antioxidant. From the plant

material collected in Custody-PE afforded the hexane and methanol extracts and

alkaloidal and neutral fractions of leaves and branches of A. leptopetala. The

phytochemical investigation of EHF resulted in the isolation of the sesquiterpene

spathulenol (PBS II-3) and of FALCF resulted in the identification of three aporphine

alkaloids: anonaine, nornuciferine, and norannuradhapurine and in the isolation of

the laurotetanine. These norannuradhapurine is described for the first time in the

genus and laurotetanine and nornuciferine described for the first time in the species.

The compounds were identified by spectroscopic techniques, mainly 1H NMR and

13C 1D / 2D as well as by comparison with literature data. In the test the antioxidant

activity by DPPH, EMF (CE50 = 10.10 μg.mL-1) was shown to be comparable to BHT,

while in the inhibition assay of co-oxidation of -carotene / linoleic acid every the

samples showed a good inhibition (77-93%). In the cytotoxic activity test in vitro EHF,

EHR, FNF, FNR, FALCAF, and FALCR showed high activity against tumor sarcoma

S-180 cells, with inhibition of cell growth between 76 and 92%. Since FNF and

FALCR front of colorectal cancer cells (HCT116) and leukemia (HL-60) and FALCF

against HCT-116 strain exhibited strong cytotoxic effect on growth inhibition above

80%. The spathulenol (50 μg.mL-1) showed significant ant proliferative activity, with

higher growth inhibition of 97% compared to tumor cell lines HCT-116, HL-60 and

glioblastoma (SF-295). In the antibacterial test, the samples generally exhibited

moderate activity, especially FALCF, which had lower MICs 1000 μg.mL-1,

demonstrating a good activity, in addition to displaying biocide effect front bacteria

test. Thus, the results confirm that A. leptopetala is a typical species of the family

Annonaceae and has substances with therapeutic potential.

KEY-WORDS: Annonaceae; Annona leptopetala; sesquiterpenes; alkaloids;

cytotoxic activity; antibacterial activity.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Distribuição geográfica de espécies da família Annonaceae no mundo. .................. 26

Figura 2: Estrutura química dos flavonoides kanakugina e kanakugiol. .................................... 34

Figura 3: Monoterpenos e sesquiterpenos isolados em espécies de Annona. ......................... 37

Figura 4: Núcleo básico de alcaloide isoquinolínico. .................................................................... 38

Figura 5: Biossíntese de alcaloides isoquinolínicos a partir do precursor (S)-reticulina .......... 39

Figura 6: Representação do núcleo de alcaloide aporfínico. ...................................................... 41

Figura 7: Sumário de esqueletos protoberberínicos descritos no gênero Annona. ................. 50

Figura 8: Alcaloide norushinsunina e acetogenina neoannonina. .............................................. 58

Figura 9: Alcaloides isoquinolínicos isolados de A. salzmannii. ................................................. 60

Figura 10: Estrutura do padrão ácido ascórbico e butenolídeo. ................................................. 66

Figura 11: Estrutura da ascorbigena. ............................................................................................. 66

Figura 12: Representação gráfica da espécie A. leptopetala: a) flor, b) frutos, c) folhas, d)

parte aérea. ........................................................................................................................................ 68

Figura 13: Mapa de distribuição geográfica da espécie A. leptopetala. .................................... 69

Figura 14: Estruturas dos compostos isolados das folhas de A. leptopetala. ......................... 106

Figura 15: Espectro de RMN de 1H de ALC8 (CDCl3, 600 MHz) e expansões dos sinais de

ALC8-S1. .......................................................................................................................................... 107

Figura 16: Ampliação do mapa de correlação 1H x 13C-HSQC (CDCl3, 600 e 150 MHz,

respectivamente) referente aos carbonos metilênicos de ALC8-S1 (H-4, H5 e H-7). ........... 108

Figura 17: Expansão da região de acoplamento entre H-3 e C-3 de ALC8-S1 no espectro de

correlação 1H x 13C-HSQC (CDCl3, 600 e 150 MHz, respectivamente). ................................. 109

Figura 18: Expansão da região do mapa de contorno 1H x 13C-HMBC, ilustrando as

correlações de H-3 de ALC8-S1. .................................................................................................. 109

Figura 19: Espectro de RMN de 1H (600 MHz, CDCl3) e ampliação das regiões referentes

aos hidrogênios do grupo metilenodioxi de ALC8-S1. ............................................................... 110

Figura 20: Ampliação do espectro de correlação 1H x 13C-HSQC (CDCl3, 600 e 150 MHz,

respectivamente) relativo ao grupo metilenodioxi de ALC8-S1. ............................................... 111

Figura 21: Ampliação do mapa de correlação 1H x 13C-HMBC de ALC8 (CDCl3, 600 e

150MHz, respectivamente) destacando as correlações dos hidrogênios do grupo

metilenodioxi com C-1 e C-2 de ALC8-S1. .................................................................................. 111

Figura 22: Ampliação da região entre δ 8,10-7,20 pelo mapa de correlação HMBC (1H, 600

MHz;13C, 150 MHz, CDCl3) de ALC8, com destaque das correlações de ALC8-S1. ........... 112

Figura 23: Espectro de correlação 1H x 13C-HSQC de ALC8 (1H: 600 MHz, 13C: 150 MHz,

CDCl3). .............................................................................................................................................. 113

Figura 24: Espectro de correlação 1H x 13C-HSQC de ALC8 (1H: 600 MHz, 13C: 150 MHz,

CDCl3, respectivamente) e ampliação da região de acoplamentos dos carbonos aromáticos.

........................................................................................................................................................... 113

Figura 25: Mapa de correlação HMBC (1H, 600 MHz;13C, 150 MHz, CDCl3) de ALC8. ....... 114

Figura 26: Principais correlações observadas pelo espectro HMBC de ALC8-S1. ................ 114

Figura 27: Estrutura da anonaina. ................................................................................................. 115

Figura 28: Ampliação do espectro de RMN de 1H (600 MHz, CDCl3), referente aos

hidrogênios da ponte metilenodioxi de ALC8-S2. ....................................................................... 117

Figura 29: Ampliação do mapa de contorno 1H x 13C – HSQC (CDCl3, 600 e 150 MHz,

respectivamente), referente às correlações do grupo metilenodioxi em ALC8-S2. ............... 118

Figura 30: Ampliação do espectro de correlação HSQC, relativa ao acoplamento entre H-3 e

C-3 de ALC8-S2. ............................................................................................................................. 119

Figura 31: Ampliação do mapa de contorno HMBC (1H: 600 MHz, 13C: 150 MHz, CDCl3),

ilustrando as correlações de H-3 em ALC8-S2. .......................................................................... 119

Figura 32: Ampliação do mapa de correlação HMBC (1H: 600 MHz, 13C: 150 MHz, CDCl3)

destacando as correlações entre dos hidrogênios do grupo metilenodioxi, com C-1 e C-2 na

amostra ALC8-S2. ........................................................................................................................... 120

Figura 33: Correlações dos carbonos não hidrogenados do anel D e de C-1a de ALC8-S2,

no espectro HMBC de ALC8.......................................................................................................... 121

Figura 34: Expansão do mapa de correlação HMBC de ALC8-S2, evidenciando o

acoplamento entre o grupo metóxi e o carbono C-9. ................................................................. 121

Figura 35: Espectro de RMN de 1H de ALC8-S2 (600 MHz, em CDCl3) e suas expansões.122

Figura 36: Expansões do espectro de correlação 1H x 13C-HSQC, referente aos sinais de

ALC8-S2. .......................................................................................................................................... 123

Figura 37: Mapa de correlação heteronuclear HSQC (1H: 600 MHz, 13C: 150 MHz, CDCl3) de

ALC8. ................................................................................................................................................ 123

Figura 38: Mapa de correlação heteronulear HMBC (1H: 600 MHz, 13C: 150 MHz, CDCl3) de

ALC8. ................................................................................................................................................ 124

Figura 39: Principais correlações observadas no mapa de correlação HMBC de ALC8-S2.

........................................................................................................................................................... 124

Figura 40: Estrutura da norannuradapurina. ................................................................................ 125

Figura 41: Espectro de RMN de 1H (600 MHz, CDCl3) e as expansões de ALC8-S3. .......... 128

Figura 42: Ampliação da região aromática do mapa de correlação HMBC (1H: 600 e 13C: 150

MHz, CDCl3) de ALC8-S3. ............................................................................................................. 129

Figura43: Ampliação do mapa de contornos HSQC (1H: 600 e 13C: 150 MHz, CDCl3)

referente aos acoplamentos dos hidrogênios metilênicos e de H-6a de ALC8-S3. ............... 130

Figura 44: Ampliação da região do espectro HMBC indicativa das correlações de H-3 em

ALC8-S3 ........................................................................................................................................... 131

Figura 45: Ampliação do mapa de contorno HSQC (1H: 600 e 13C: 150 MHz, CDCl3),

destacando a região de correlação entre H-3 e C-3 de ALC8-S3. ........................................... 131

Figura 46: Ampliação do mapa de contornos HMBC (1H: 600 e 13C: 150 MHz, CDCl3) relativa

aos hidrogênios metoxílicos de ALC8-S3. ................................................................................... 132

Figura 47: Ampliação do mapa de contorno HSQC (1H: 600 e 13C: 150 MHz, CDCl3),

referente aos sinais de hidrogênio das metoxilas de ALC8-S3. ............................................... 133

Figura 48: Principais correlações observadas no HMBC para ALC8-S3. ............................... 133

Figura 49: Estrutura da nornuciferina (ALC8-S3)........................................................................ 134

Figura 50: Alcaloides aporfínicos identificados na fração ALC8. .............................................. 136

Figura 51: Espectro de RMN de 1H de ALC4 (600 MHz, CDCl3). ............................................. 137

Figura 52: Ampliação do mapa de contornos HSQC (1H: 600 e 13C: 150 MHz, CDCl3),

referente às correlações dos H aromáticos de ALC4. ................................................................ 137

Figura 53: Espectro de correlação HSQC (1H: 600 e 13C: 150 MHz, CDCl3) e expansão da

região dos acoplamentos dos grupos metoxila de ALC4........................................................... 138

Figura 54: Espectro de correlação HMBC de ALC4 (1H: 600 e 13C: 150 MHz, CDCl3) e

expansões das regiões dos acoplamentos de H-3 e dos hidrogênios de metoxilas.............. 139

Figura 55: Espectro de correlação HMBC de ALC4 (1H: 600 e 13C: 150 MHz, CDCl3) e

expansões das regiões de acoplamentos dos H aromáticos H-8 e H-11. ............................... 140

Figura 56: Ampliação na região dos hidrogênios diasteroisotópicos pelo mapa de correlação

HSQC (1H, 600 MHz e 13C, 150 MHz; CDCl3) de ALC4. ............................................................ 141

Figura 57: Principais correlações observadas por HMBC para o composto ALC4. ............... 141

Figura 58: Estrutura do alcaloide Laurotetanina. ........................................................................ 142

Figura 59: Espectro de RMN de 13C-DEPTQ (100 MHz, CDCl3) de SBF II-3. ........................ 144

Figura 60: Espectro de correlação 1H x 13C-HSQC de SBFII-3 (CDCl3, 600 e 150 MHz,

respectivamente) e expansão da região dos acoplamentos dos hidrogênios olefínicos. ...... 145

Figura 61: Espectro de RMN de 1H de SBF II-3 (600 MHz, CDCl3) com destaque das regiões

dos hidrogênios do anel ciclopropano e expansões. .................................................................. 146

Figura 62: Espectro 1H x 13C-HMBC (CDCl3, 600 e 150 MHz, respectivamente) e suas

expansões. ....................................................................................................................................... 147

Figura 63: Algumas correlações observadas no HMBC para a amostra SBF II-3. ................ 148

Figura 64: Estrutura do espatulenol .............................................................................................. 148

Figura 65: Correlação entre o teor de fenóis totais e CE50 dos extratos hexânico e metanólico

das folhas e dos ramos de A. leptopetala. ................................................................................... 153

Figura 66: Alcaloides fenólicos presentes em A. leptopetala. ................................................... 154

Figura 67: Análise dos grupos da atividade antioxidante em sistema da co-oxidação do β-

caroteno/ácido linoleico dos extratos em intervalos de 30 min. ................................................ 157

Figura 68: Inibição do crescimento (IC) dos extratos e das frações no ensaio com 3-(4,5-

dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenill)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio (MTS). .................... 163

Figura 69: Inibição do crescimento (IC) dos extratos e das frações no ensaio com brometo 3-

(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT)......................................................................... 163

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Espécies da família Annonaceae com fins terapêuticos segundo a etnobotânica.

............................................................................................................................................................. 29

Tabela 2 - Flavonoides de ocorrência no gênero Annona. Adaptado de Araújo (2013). ........ 32

Tabela 3 - Propriedades biológicas e farmacológicas de alcaloides isoquinolínicos presentes

em Annona. ........................................................................................................................................ 44

Tabela 4 - Alcaloides protoberberínicos presentes no gênero Annona e suas propriedades

biológicas. ........................................................................................................................................... 51

Tabela 5 - Relação dos grupos de frações do extrato hexânico das folhas de A. leptopetala

(EHF) e revelação com o reagente de Dragendorff...................................................................... 94

Tabela 6 - Prospecção fitoquímica dos extratos de A. leptopetala. ......................................... 104

Tabela 7– Dados de RMN de 1H (600 MHz) e 13C (150 MHz) para ALC8-S1 em CDCl3,

incluindo os resultados dos experimentos 2D heteronucleares 1H x 13C - nJCH (n=1, HSQC,

n= 2 e 3, HMBC). ............................................................................................................................. 116

Tabela 8- Dados de RMN de 1H (600 MHz) e 13C (150 MHz) para ALC8-S2 em CDCl3,


n= 2 e 3, HMBC) e dados da literatura. ........................................................................................ 127

Tabela 9 - Dados de RMN de 1H (600 MHz) e 13C (150 MHz) para ALC8-S3 em CDCl3,



Tabela 10 - Dados de RMN de 1H (600 MHz) e 13C (150 MHz) para ALC4 em CDCl3,



Tabela 11 - Dados de RMN de 1H (600 MHz) e 13C (150 MHz) para ALC4 em CDCl3,



Tabela 12 - Atividade antioxidante (CE50), conteúdo de fenóis totais e flavonoides totais dos

extratos de A. leptopetala............................................................................................................... 152

Tabela 13 - Inibição da oxidação em sistema -caroteno/ácido linoleico dos extratos e fases

de A. leptopetala. ............................................................................................................................. 158

Tabela 14 - Parâmetros cinéticos caracterizando a inibição da oxidação do sistema β-

caroteno/ácido linoleico pelas amostras de A. leptopetala. ....................................................... 159

Tabela 15 - Inibição do crescimento (%IC) de extratos e frações de A. leptopetala pelo

método do MTT e do MTS frente a quatro linhagens de células tumorais. ............................. 162

Tabela 16 - Concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM)

de extratos e frações de folhas e ramos de A. leptopetala. ...................................................... 169

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E FÓRMULAS

% AA Porcentagem de atividade antioxidante

ABTS 2,2´-azinobis-3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico

BHA Butil-hidroxi-anisol

BHT Butil-hidroxi-tolueno

CBM Concentração bactericida mínima

CC Cromatografia em coluna

CCDA Cromatografia em camada delgada analítica

CCDP Cromatografia em camada delgada preparativa

CDCl3 Clorofórmio deuterado

CE50 Concentração efetiva 50%

CHCl3 Clorofórmio

d dupleto

dd duplo dupleto

ddd duplo duplo dupleto

ddt duplo duplo tripleto

DEPTQ Distortionless Enhancement by Polarization Transfer Including

the Detection of Quaternary Nuclei

DMSO Dimetilsulfóxido

DPPH• 2,2-difenil-1-picrilhidrazil

EHF Extrato hexânico das folhas

EHR Extrato hexânico dos ramos

EMF Extrato metanólico das folhas

EMR Extrato metanólico dos ramos

m Multipleto

mg EqAG/g Miligramas de equivalentes de ácido gálico por grama de amostra

mg EqC/g Miligramas de equivalentes de catequina por grama de amostra

MRSA Methicillin resistant Staphylococcus aureus

MTT Brometo 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio

MTS 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil) -

2H-tetrazólio

ppm Partes por milhão

RMN de 13C Ressonância magnética nuclear de carbono

RMN de 1H Ressonância magnética nuclear de hidrogênio

s Simpleto

t Tripleto

UV Ultravioleta

δC Deslocamento químico de carbono em ppm

δH Deslocamento químico de hidrogênio em ppm

OBS: as abreviaturas e os símbolos utilizados neste trabalho e que não constam

nesta relação, encontram-se descritas no texto ou são convenções adotadas

universalmente.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................................. 20

2. OBJETIVOS ................................................................................................................................... 23

2.1. Geral ........................................................................................................................................ 24

2.2. Específicos.............................................................................................................................. 24

3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA .................................................................................................. 24

3.1. Considerações sobre a família Annonaceae ..................................................................... 26

3.2. Considerações sobre o gênero Annona ............................................................................. 30

3.2.1. Constituintes químicos no gênero Annona ................................................................. 31

3.2.1.1. Considerações sobre os alcaloides ...................................................................... 38

3.2.1.2. Considerações sobre as acetogeninas ................................................................ 54

3.3. Propriedades biológicas e farmacológicas de compostos bioativos em anonáceas .... 57

3.4. A espécie Annona leptopetala (R.E.Fr.) H. Rainer ............................................................ 67

3.5. Breve consideração sobre antioxidantes ............................................................................ 76

4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ......................................................................................... 82

4.1. Suportes para cromatografia ................................................................................................ 82

4.2. Equipamentos ........................................................................................................................ 82

4.3. Material Botânico ................................................................................................................... 83

4.3.1. Coleta e identificação do material botânico ................................................................ 83

4.3.2. Processamento do material vegetal ............................................................................. 83

4.4. Obtenção dos extratos .......................................................................................................... 83

4.5. Prospecção fitoquímica ......................................................................................................... 85

4.6. Avaliação da atividade antioxidante in vitro ...................................................................... 85

4.6.1. Ensaio para avaliação da redução do radical DPPH ................................................. 85

4.6.2. Determinação da atividade antioxidante por meio do sistema de co-oxidação β-

caroteno/ácido linoleico. ........................................................................................................... 86

4.6.2.1. Estudo cinético da atividade antioxidante no sistema β-caroteno/ácido

linoleico ................................................................................................................................... 87

4.7. Determinação de fenóis totais (FT) ..................................................................................... 88

4.8. Determinação do teor de flavonoides totais (FVT) ............................................................ 90

4.9. Extração das bases (alcaloides) presentes nos extratos metanólicos (EM). ................ 91

4.10. Fracionamento do extrato hexânico das folhas (EHF) ................................................... 93

4.10.1. Estudo cromatográfico de G2 ..................................................................................... 94

4.11. Estudo fitoquímico da fase alcaloídica das folhas (FALCF) .......................................... 96

4.12. Ensaio para a atividade antibacteriana ............................................................................. 98

4.13. Avaliação da atividade citotóxica ....................................................................................... 99

4.13.1. Ensaio da atividade citotóxica in vitro pelo método do MTT .................................. 99

4.13.2. Ensaio de citotoxicidade frente a células da linhagem sarcoma S-180 .............. 101

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................................ 104

5.1. Prospecção fitoquímica ....................................................................................................... 104

5.2. Isolamento e determinação estrutural dos compostos de A. leptopetala..................... 105

5.2.1. Identificação dos alcaloides presentes em ALC8 (ALC8-S1, ALC8-S2 e ALC8-S3).

................................................................................................................................................... 107

5.2.2. Determinação estrutural de ALC4 .............................................................................. 136

5.2.3. Determinação estrutural de SBFII-3 ........................................................................... 144

5.3. Ensaios de avaliação da atividade antioxidante in vitro. ................................................ 151

5.3.1 Ensaio para avaliação da redução do radical DPPH ................................................ 151

5.3.2 Inibição da oxidação acoplada ao sistema -caroteno/ácido linoleico ................... 155

5.4. Avaliação da atividade citotóxica in vitro de A. leptopetala pelo ensaio do MTT e do

MTS ............................................................................................................................................... 161

5.5. Ensaio da atividade antibacteriana.................................................................................... 167

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS....................................................................................................... 174

REFERÊNCIAS ............................................................................................................................... 177

APÊNDICE ....................................................................................................................................... 206

NH

O

O

H

1

23

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

1

23

3b

3a

4

5

6a

77a

8

9

10

11

11a

1a

OH

NH

O

O

H

OCH3

1

2

3

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

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10

11

11a

1a

NH

H

H3CO

H3CO

1

2

3 4

5

6a NH

H3CO

OH

3a

3b

7

7a

8

9

10

11

11a

1aH3CO

H3CO

OH H

H

H

H

12

3

4

5

6

7

8

910

15

13

12

14

11

1. Introdução

20

1. INTRODUÇÃO

Os produtos naturais são utilizados pela humanidade desde os primórdios. A

busca por alívio e cura de doenças por meio da ingestão de ervas e folhas talvez

tenha sido uma das primeiras formas de utilização de produtos naturais (VIEGAS JR

et al., 2006).

Diversas publicações reafirmam a importância dos produtos naturais como fonte

de fármacos (COSTA-LOTUFO et al., 2010; SRIVASTAVA et al., 2005; OBERLIES

et al., 2004; FANG, LIANG, 2005), uma vez que a maioria deles, em uso clínico, ou

são de origem natural ou foram desenvolvidos por síntese química planejada a partir

de produtos naturais (BARREIRO et al., 2009). Concretamente, na área do câncer e

de doenças infecciosas se encontram mais de 60 e 75%, respectivamente, de

fármacos de origem natural (CABEDO et al., 2011).

Inúmeros são os exemplos de bioprodutos fornecidos pelos produtos naturais,

como Acheflan, anti-inflamatório de uso tópico obtido de Cordia verbenácea DC, o

diterpeno paclitaxel, de Taxus brevifolia Nutt., que é um medicamento utilizado no

tratamento de tumores sólidos; o anti-hipertensivo captopril, obtido do veneno da

jararaca (Bothrops jararaca); a camptotecina, alcaloide extraído de Camptotheca

acuminata Decne. que inspirou inúmeros derivados antineoplásicos, além das

estatinas, como a atorvastatina, que rendeu ao mercado farmacêutico, em 2008,

US$ 13,8 bilhões, dentre muito outros (BARREIRO et al., 2009).

Segundo estimativas da Conveção da Diversidade Biológica (CDB), o Brasil

hospeda entre 15 e 20% de toda a biodiversidade mundial, sendo considerada a

maior do planeta em número de espécies endêmicas (LEWINSOHN, PRADO, 2002).

Tal biodiversidade é considerada uma fonte de substâncias biologicamente ativas,

com enorme potencial como fonte de novos fármacos (BARREIRO, FRAGA, 2002).

As fontes naturais encontram-se disponíveis em abundância e correspondem às

melhores alternativas na obtenção de substâncias de interesse terapêutico (COSTA-

LOTUFO et al., 2010).

A natureza, de maneira geral, tem produzido grande parte das substâncias

orgânicas conhecidas, entretanto, o reino vegetal é o que mais tem contribuído para

o fornecimento de substâncias úteis ao tratamento de enfermidades que acometem

21

os seres humanos contando com ampla diversidade química registrada na literatura

(PHILLIPSON; ADERSON, 1989, VIEGAS JR et al., 2006). A fantástica variedade e

complexidade de metabólitos especiais biossintetizados pelas plantas teriam se

formado e evoluído como mecanismo de defesa desses vegetais às condições

ambientais ricas em microrganismos, insetos, animais e também às condições de

adaptação e regulação (VIEGAS JR et al., 2006). No auge desse processo evolutivo,

as angiospermas alcançaram, sem dúvida, um desenvolvimento ímpar, pela

ocorrência de micromoléculas distintas e complexas, com vários centros

estereogênicos; provavelmente, devido a essas características, sejam-lhes

atribuídas inúmeras finalidades alelopáticas e biológicas (ROSENTHAL,

BERENBAUM, 2012).

Entre as angiospermas, destaca-se a família Annonaceae, por apresentar

espécies muito conhecidas, tanto no aspecto econômico por proporcionarem frutos

comestíveis e óleos essenciais, como por seu uso medicinal tradicional, na forma de

pesticida e antiparasitário. As plantas pertencentes a esta família se caracterizam

por sua grande variedade de esqueletos químicos com múltiplas propriedades

farmacológicas. Dentre os metabólitos secundários ativos descritos neste táxon,

destacam-se as acetogeninas, estiril-lactonas, benzopiranos prenilados, alcaloides

isoquinolínicos, entre outros (CABEDO et al., 2011).

O estudo dos usos tradicionais de plantas e seus produtos na Região Nordeste

têm aumentado gradualmente nos últimos anos, evidenciado pelo número de

publicações nesta área (AGRA et al., 2008). Nessa região, o ecossistema principal é

o bioma Caatinga (AGRA et al., 2007), considerado uma vegetação altamente

ameaçada e uma fonte valiosa de recursos naturais pouco estudados (DE LIMA

ARAÚJO et al., 2007; DE ALBUQUERQUE et al., 2007).

Entre as espécies investigadas nativas deste bioma e com indicações de uso

terapêutico, destaca-se a espécie Annona leptopetala, apontada na medicina

tradicional para o tratamento de inflamações, tumores e como digestivo (AGRA et

al., 2007; DE ALBUQUERQUE et al., 2007).

Estudos prévios conduzidos com A. leptopetala (sinonímia: Rollinia leptopetala

R. E. Fr.) demonstraram seu potencial larvicida (FEITOSA et al., 2009), bem como

seu efeito modulador da resistência bacteriana ao norfloxacino, além de um

considerável efeito antitumoral in vivo (COSTA et al., 2008b, 2012a). Com relação

22

ao estudo fitoquímico, foram reportados o isolamento de alcaloides aporfínicos e

tetrahidroprotoberberínicos, além de acetogeninas e uma xantona (SETTE et al.,

2000a,b; ARRIAGA et al., 2008; COSTA et al., 2012a).

Considerando o relevante potencial químico e farmacológico apresentado por

várias espécies da família Annonaceae, a exemplo de A. leptopetala, e por ser essa

planta nativa da Caatinga, com indicações de uso terapêutico, esta espécie foi

selecionada para a condução de estudos químicos e biológicos, na busca por

constituintes bioativos e que pudessem comprovar seu uso terapêutico na medicina

tradicional. Além de contribuir para a quimiotaxonomia da família.

NH

O

O

H

1

23

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

1

23

3b

3a

4

5

6a

77a

8

9

10

11

11a

1a

OH

NH

O

O

H

OCH3

1

2

3

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

NH

H

H3CO

H3CO

1

2

3 4

5

6a NH

H3CO

OH

3a

3b

7

7a

8

9

10

11

11a

1aH3CO

H3CO

OH H

H

H

H

12

3

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5

6

7

8

910

15

13

12

14

11

2. Objetivos

24

2. OBJETIVOS

2.1. Geral

Investigar a composição química e as atividades antibacteriana e citotóxica da

espécie A. leptopetala.

2.2. Específicos

Realizar o estudo fitoquímico das folhas e ramos de A. leptopetala;

Avaliar o potencial antioxidante, antibacteriano e citotóxico dos extratos e

fases obtidas por partição;

Isolar e identificar as substâncias presentes nos extratos ativos, através de

métodos cromatográficos, e espectroscópicos, como ressonância magnética

nuclear (RMN) de 1H e 13C, utilizando técnicas uni e bidimensionais como

HSQC e HMBC.

Quantificar o teor de fenóis e de flavonoides totais nos extratos brutos de A.

leptopetala.

NH

O

O

H

1

23

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

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10

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11a

1a

1

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3b

3a

4

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OH

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O

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OCH3

1

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3

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3a

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5

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11a

1a

NH

H

H3CO

H3CO

1

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3 4

5

6a NH

H3CO

OH

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7

7a

8

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11a

1aH3CO

H3CO

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H

H

H

12

3

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910

15

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12

14

11

3. Fundamentação teórica

26

3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

3.1. Considerações sobre a família Annonaceae

A família Annonaceae pertence ao grupo das Eudicotiledôneas, clado das

magnolídeas, o qual é constituído por quatro ordens: Canallales, Laurales,

Magnoliales e Piperales, sendo a ordem Magnoliales representada pelas famílias

Annonaceae, Magnoliaceae e Myristicaceae. As anonáceas estão sistematicamente

inseridas na classe Magnoliopsida e subclasse Magnolidae (BARON, 2010).

A família Annonaceae apresenta distribuição pantropical, sendo a América

Central e a do Sul, a África e a Ásia os principais centros de diversidade desse

grupo (MAAS et al., 2011; CHATROU et al., 2012; CHATROU et al., 2004), conforme

indicado na Figura 1.

Figura 1: Distribuição geográfica de espécies da família Annonaceae no mundo.

Fonte: Missouri Botanical Garden, 2015.

Há, no Brasil, 29 gêneros e 392 espécies de Anonáceas (MAAS et al., 2015a),

distribuídas principalmente na Amazônia, mas também na Mata Atlântica e no

Cerrado. As Annonaceae estão classificadas em quatro subfamílias,

27

Anaxagoreoideae, Annonoideae, Ambavioideae e Malmeoideae. Anaxagoreoideae

inclui apenas o gênero Anaxagorea, com 14 espécies no Brasil. Ambavioideae é

composta por nove gêneros, mas apenas Tetrameranthus ocorre no Brasil, com três

espécies. Annonoideae é a maior subfamília, com 51 gêneros, dos quais 12 ocorrem

no Brasil. Estão aqui incluídos Annona, Duguetia, Guatteria e Xylopia, os gêneros

mais representativos da família na flora brasileira. Malmeoideae inclui principalmente

gêneros asiáticos, e apenas os representantes da tribo Malmeeae, com 13 gêneros,

ocorrem no Brasil (LOPES; MELLO-SILVA, 2014).

A Amazônia abriga três quartos da diversidade de Annonaceae, com 27 gêneros

e 280 espécies, e a Mata Atlântica, a maior parte restante: 15 gêneros e 91 espécies

(LOPES; MELLO-SILVA, 2014).

Destes, o gênero Annona é o de maior importância como fonte de frutos

comestíveis (BARON, 2010), seguido de Cananga (LUNA, 2006) e Duguetia

(MOSCA; CAVALCANTE; DANTAS, 2006).

Esta família caracteriza-se por apresentar, quase que exclusivamente, hábito

arborescente, arvoretas ou, raramente, na forma de lianas. Destaca-se por

apresentar fibras longas, tricomas e escamas estreladas (CÔRREA et al., 2007).

As flores podem ser isoladas ou reunidas em inflorescências, andrógenas, com

perianto diferenciado no cálice e corola, em geral são trímeras e carnosas, estames

numerosos e livres e distribuídos de forma espiralada (JOLY, 2002). As flores são de

tamanhos diversos e coloração variada, podendo ser esbranquiçada, amarelo-

creme, alaranjada, esverdeada e até cor-de-vinho. As flores emanam odores que, a

depender da espécie, simulam o odor de frutos maduros (RINALDI, 2007).

Os frutos podem ter aspectos apocárpicos ou sincárpicos, carnosos indeiscentes

ou deiscentes (JOLY, 2002).

As anonáceas têm sido alvo de pesquisas devido à sua ampla pluralidade

química, atribuída à produção de metabólitos secundários, tais como: alcaloides

(GUINAUDEAU et al., 1979; SCHIFF, 1991; PÉREZ; CASSELS, 2010; LÚCIO et al.,

2015), flavonoides (LEBOEUF et al., 1982; VEGA et al., 2007; FORMAGIO et al.,

2013; DOS REIS NUNES et al., 2012; KOTKAR et al, 2001), acetogeninas, inerentes

apenas a esta família (ALALI et al., 1999; BERMEJO et al., 2005; DOS SANTOS

LIMA et al., 2009; LE VEN et al., 2012) e terpenos (ANDRADE et al., 2003).

28

Embora menos frequentes compostos de outras classes têm sido reportados

nesta família, tais como, carboidratos, aminoácidos, lipídeos, proteínas, vitaminas,

carotenos, esteroides, poliacetilenos, catequinas, ácidos fenólicos, taninos,

compostos aromáticos, lactonas, saponinas, triterpenos, lignanas, xantonas dentre

outros (COSTA et al., 2011b, LUNA, 2006; WÉLÉ et al., 2005, 2005a, YANG et al.,

2004; AKENDENGHE et al., 2002; DIAZ et al., 1997).

Os óleos voláteis desta família são responsáveis por conferir o odor característico

a certas espécies, sendo bem explorados na perfumaria. Os constituintes destes

óleos são predominantemente mono e sesquiterpenos ou compostos aromáticos

(FOURNIER et al., 1999).

Dentre os mais de 200 compostos identificados nos óleos de espécies de

anonáceas, observou-se a predominância de certos constituintes, neste táxon, como

os monoterpenos e -pineno, mirceno, linalol, 1,8-cineol, limoneno e os

sesquiterpenos (E)-cariofileno e óxido de cariofileno, além do aromático p-cimeno

(FOURNIER et al., 1999; EKUNDAIO et al., 1989). Certos constituintes minoritários,

no entanto, são mais abundantes em determinados gêneros (FOURNIER et al.,

1999).

Segundo Fournier et al. (1999), a depender do órgão vegetal de onde é extraído

o óleo, certos compostos são mais predominantes. Sendo assim, nos óleos obtidos

a partir de frutos e sementes houve uma prevalência de hidrocarbonetos

monoterpênicos, nas folhas, hidrocarbonetos sesquiterpênicos e a partir das cascas

e raízes, sesquiterpenos oxigenados.

Dentre os compostos aromáticos encontrados na família Annonaceae, pode-se

citar: etilbenzeno, 1-etil-2-metil-benzeno, trimetilbenzeno, metilbenzoato, acetato de

benzila, 2-feniletanol e 2-fenil-etilacetato (MARCHESE, 2009; JURGENS et al.,

2000). Nesse contexto, algumas espécies de Annona são aromáticas devido à

presença de óleos essenciais e seus compostos aromáticos, como os benzoatos

(DOS REIS NUNES et al., 2012).

Com base no conhecimento etnobotânico, várias espécies desta família são

empregadas na cura de certos males. Na tabela 1 são citadas algumas espécies e

sua indicação de uso.

29

Tabela 1 - Espécies da família Annonaceae com fins terapêuticos segundo a etnobotânica.

Fonte: Autoria própria.

Nome Científico/ Nome Vulgar

Indicações terapêuticas

Parte usada Preparo Referência

Annona dioica St. Hil. (araticum)

a. Diarreia crônica b. Emoliente c. Reumatismo

a. sementes b. fruto c. folhas

a Infuso b. Cataplasma c. Infuso ou tisana

(RODRIGUES; CARVALHO, 2001)

Annona sylvatica (A.St.-Hil.) Martius (coresma),

Baixar pressão Folhas - (VENDRUSCOLO; MENTZ, 2006)

Annona crassiflora Mart.(marolo)

Diarreia crônica Sementes Decocto ou infuso

(RODRIGUES; CARVALHO, 2001)

Duguetia furfuracea (St. Hil.) Benth. & Hook (araticum-seco)

Reumatismo Ramos com Folhas

Infuso ou tisana (RODRIGUES; CARVALHO, 2001)

Xylopia aromatica ( Lam. ) Mart. (pimenta-de-macaco)

a. digestivo b. anti-inflamatório c. antimalárico d. carminativo, estimulante e afrodisíaco

a. frutos b. folhas e casca do caule c. casca do caule

a. Decocto ou infuso b. Infuso ou tisana

(RODRIGUES; CARVALHO, 2001, BLAIR et al., 1991, SUFFREDINI et al., 2007)

Annona muricata L. (graviola)

ameba, gripe, hemorroidas, para perder peso doenças no coração

folha, casca vitaminas, sucos, chá

(FREITAS et al., 2012)

Annona squamosa L. (pinha/ata)

a. ameba, dor na coluna b. aftas, antitérmico, diurético, insônias leves c. Insônias graves, dor de cabeça e emagrecedor d. Parasiticida, antirreumática e antinevrálgica

a. folhas b. frutos c. folhas secas d. folhas

a. vitaminas, sucos, chás b. suco c. Infusão d. Decocto

(FREITAS et al., 2012, DI STASI; HIRUMA-LIMA, 2003)

Annona leptopetala (Sin. R. leptopetala (R.E. Fr.) H. Rainer (ata-brava)

digestivo - - (AGRA et al, 2007)

Annona sp (jaca de pobre)

febre folhas - (NETO et al., 2014)

Xylopia aethiopica (Dunal) A. Rich

Dor de cabeça e neuralgia, tratamento de feridas; dores no estômago, bronquite e disenteria.

a. Sementes, extrato das cascas

- (IRVINE, 1961, BOYOM et al., 2003).

30

3.2. Considerações sobre o gênero Annona

O gênero Annona, da tribo Annoneae, possui cerca de 200 espécies nos trópicos

das Américas e na África (MAAS, 2009). Annona inclui agora as 44 espécies antes

classificadas no gênero Rollinia, aquelas com pétalas externas unidas, formando

uma estrutura como pás de hélice (RAINER, 2007).

No Brasil ocorrem 82 espécies encontradas na Caatinga, Cerrado, Mata

Amazônica, Mata Atlântica e Pantanal. Destas, 24 são endêmicas (MAAS et al.,

2015b).

Dentre as espécies do gênero, as mais cultivadas na região tropical, devido aos

seus frutos comestíveis, são: Annona squamosa (fruta-do-conde, ata ou pinha), A.

muricata (graviola), A. reticulata (condessa) e A. cherimola (cherimóia), todas essas

exóticas (MOSCA, CAVALCANTE, DANTAS, 2006). Essas espécies são

consideradas importantes devido ao seu valor comercial e suas propriedades

nutricionais, podendo ser consumidas tanto na forma in natura, como no preparo de

sucos e sorvetes (LORENZI, MATOS, 2002).

O gênero Annona tem sido largamente estudado devido à presença marcante de

certas classes de metabólitos, com propriedades terapêuticas bem consolidadas na

literatura. Dentre elas, destacam-se as acetogeninas, com potente ação citotóxica,

antineoplásica, antimicrobiana, antiparasitária, pesticida, imunossupressora e

antimalárica (GUINAUDEAU et al., 1988, CHEN et al., 2011, RINALDI, 2007,

BARRETO, 2014). Os alcaloides isoquinolínicos desempenham papel relevante no

gênero, sendo atribuídos a esses compostos efeitos farmacológicos tais como

antibacteriano, antifúngico, antiplaquetário, anti-inflamatório, gastroprotetor,

antiúlcera, ansiolítico e citotóxico, frente a diversas linhagens celulares cancerosas

como a de pulmão, cólon e leucemia, (GUINADEAU; LEBOEUF; CAVÉ, 1988, CHEN

et al., 2011, STÉVIGNY et al., 2005, CUSTÓDIO, 2014, SURESH, 2012, DE

SOUSA FALCÃO, 2008, YADAV, 2011, CHAVES, 2010, COSTA, 2013a, COSTA,

2010; COSTA, 2009a; TAN-LI, 2013; CUNHA et al., 2005; LÚCIO et al., 2015). O

gênero destaca-se também pela presença de diterpenos do tipo ent-cauranos,

esteroides, monoterpenos, sesquiterpenos, triterpenos, lactonas, flavonoides,

cetonas, além de vários estudos com óleos essenciais (DUTRA, 2014).

31

3.2.1. Constituintes químicos no gênero Annona

No gênero Annona foram encontrados constituintes com valor nutricional

relevante e de importância econômica como açúcares, proteínas, lipídeos, ácido

ascórbico, taninos, aminoácidos, pectinas, polifenóis, carotenoides e vitaminas do

complexo B (DI STASI, LIMA, 2003; LORENZI, MATOS, 2002).

Santos e Salatino (2000) isolaram e identificaram um total de 76 flavonas e,

flavonóis a partir das folhas de espécies de Annonaceae, sendo a maior parte,

glicosídeos. A classe de flavonoides predominante no gênero são os flavonóis

(ramnetina, quercetina, rutina, isoramnetina e canferol), sobressaindo-se os

derivados glicosilados de quercetina e canferol (3-O-glicosídeos) (SANTOS;

SALATINO, 2000, ARAÚJO, 2013; DOS REIS NUNES et al., 2012, VEGA et al.,

2007). Alguns deles encontram-se ilustrados na Tabela 2 e no Quadro 1.

32

Tabela 2 - Flavonoides de ocorrência no gênero Annona. Adaptado de Araújo (2013).

O

R3

R6

R5

R4

OH O

R1

R22

345

6

78 1'

2'

3'

4'

5'

6'

a Posição relativa do açúcar não definida

Flavonoide R1 R2 R3 R4 R5 R6

Isoramnetina-3-O-galactosil galactosídeo OH OCH3 O-galactose-galactose H OH H

Isoramnetina-3-O-glicosídeo OH OCH3 O-glicose H OH H

Isoramnetina-3-O-ramnosil glicosídeo OH OCH3 O-ramnose-glicose H OH H

Canferol-3-O-(arabinose-glicose)a H OH O-arabinose-glicose H OH H

Canferol-3-O-galactosídeo H OH O-galactose H OH H

Canferol-3-O-galactosil glicosídeo H OH O-galactose-glicose H OH H

Canferol-3-O-glicosídeo H OH O-glicose H OH H

Canferol-3-O-glicosil glicosídeo H OH O-glicose-glicose H OH H

Canferol-3-O-ramnosil glicosídeo H OH O-ramnose-glicose H OH H

Luteolina-7-O-glicosídeo OH OH H H O-glicose H

Quercetina-3-O-arabinosídeo OH OH O-arabinose H OH H

Quercetina-3-O-arabinosil arabinosídeo OH OH O-arabinose-arabinose H OH H

Quercetina-3-O-arabinosil galactosídeo OH OH O-arabinose-galactose H OH H

Quercetina-3-O-galactosídeo OH OH O-galactose H OH H

Quercetina-3-O-galactosil ramnosídeo OH OH O-galactose-ramnose H OH H

33

Quadro 1 - Estruturas de alguns flavonoides presentes no gênero Annona.

Canferol – A. dioica

Canferol-3-O-ramnosilglicosídeo -

A. tomentosa

Quercetina-3-O-glicosídeo -

A. crassiflora

Quercetina 3-O-ramnosídeo (quercitrina) - A. warmingiana

Quercetina 3-O-galactosídeo (hiperina) –

A. crassiflora

Quercetina 3-O-arabinosídeo (guaijaverina) –

A. crassiflora

O

O

OH

OH

OH

O

O OH

OH

OH

OH

http://www.molbase.com/en/name-quercetin-3-glucoside.html

34

Alguns gêneros de Annonaceae são produtores de flavonoides relativamente

pouco polares e com um padrão incomum de substituição como, por exemplo, a

ausência de oxigenação no anel B, exemplificado na Figura 2 (SOARES et al., 2000;

HARBORNE,1994).

Uma estratégia metabólica de proteção do núcleo flavonoídico contra a

degradação oxidativa é a proteção das hidroxilas fenólicas (SOARES, 1996). Em

espécies de Annonaceae pode-se observar frequentemente a produção de

derivados no qual essa proteção é feita pela formação de éteres metílicos

(substituição do tipo O-metila) como é o caso das substâncias kanakugina e

kanakugiol (Figura 2) (SOARES et al., 2000).

Figura 2: Estrutura química dos flavonoides kanakugina e kanakugiol.

O

O

H3CO

H3CO

H3CO

H3CO

A C

BOH

O

H3CO

H3CO

HO

H3CO

A C

B

Outra relevante classe de metabólitos secundários isolados da família

Annonaceae é a dos terpenoides. Uma compilação realizada por Andrade et al.

(2003), revisou os terpenos isolados nesta família entre 1954 e 2001, indicando um

total de 518 terpenos identificados, distribuídos em 11 tipos de esqueletos

diferentes. A predominância de diterpenos do tipo caurano foi significativa, com 152

citações (LUNA, 2006). Assim como os alcaloides, os diterpenos são marcantes no

gênero Annona e podem ser considerados marcadores quimiotaxonômicos (DUTRA,

2014).

Muitos diterpenos são descritos em outros gêneros da família Annonaceae, tais

como Xylopia (SILVA et al., 2012; MOREIRA et al., 2007; ANDRADE et al, 2004;

Kanakugina Kanakugiol

35

MELO et al., 2001;), Polyalthia (SASHIDHARA et al., 2009; HAO et al., 1995), entre

outros, podendo ser considerados marcadores também na família (DUTRA, 2014).

Os diterpenos do tipo caurano são relatados em muitas espécies do gênero

Annona (LÓPEZ et al., 2002), tais como, A. reticulata L., A. senegalensis Pers. A.

amazonica R. E., Fries, A. glabra L., A. cherimola Mill. (ETSE et al., 1987; ESHIET

et al., 1971; FATOPE et al., 1996; CHANG et al., 1998; CHEN et al., 2004;

MIYASHITA et al., 2010), A. vepretorum (DUTRA et al., 2014a). Com base nesses

estudos fitoquímicos, observa-se uma predominância desses compostos nos frutos,

seguido pelas cascas e menos frequentemente nas folhas. Alguns desses

diterpenos encontram-se representados no Quadro 2.

Quadro 2 – Diterpenos ent –caurano presentes em espécies do gênero Annona.

OH

OHH

H

H

OH

OH

O

H

H

H

OH

O

Annosquamosina C Annoglabasina E Ácido caurenóico

H

H

HH

H

H

H

H

OH

H

HOH

HOH

OH

Annoglabayina Cauranol Annosquamosina B

OH

O

O

O

O

HH

H

H

H

H

O

H

H

O

O

O

O

Annomosina A Annoglabasina A

36

A composição química do óleo essencial de diferentes órgão vegetais de várias

espécies de Annona foi avaliada (COSTA et al., 2013a, COSTA et al., 2011;

SIQUEIRA et al., 2011; NKOUNKOU et al., 2010; FEITOSA et al., 2009; COSTA et

al., 2009; ANDRADE et al., 2007), constatando-se que na maior parte das espécies

analisadas, os sesquiterpenos são predominantes em relação aos monoterpenos

(OLIANE, 2012).

Dentre os constituintes terpênicos mais frequentes no gênero, destacam-se os

sesquiterpenos, -cadineno, -cadineno, -cadinol, E-cariofileno, óxido de

cariofileno, -elemeno, elemol, espatulenol, germacreno D e -humuleno,

representados na Figura 3 (COSTA et al., 2013a; COSTA et al., 2011; SIQUEIRA et

al., 2011; NKOUNKOU et al., 2010; FEITOSA et al., 2009; COSTA et al., 2009;

ANDRADE et al., 2007).

No levantamento realizado por Rabêlo et al. (2015a) sobre os óleos essenciais

de algumas espécies de Annona, também foi evidenciado que a constituição química

dos óleos é predominantemente de mono e sesquiterpenos. Esse estudo aponta

ainda como constituintes majoritários o -pineno, -pineno, mirceno, p-cimeno,

limoneno, linalol, 1,8-cineol, cariofileno e óxido de cariofileno (Figura 3).

37

Figura 3: Monoterpenos e sesquiterpenos isolados em espécies de Annona.

H

H

H

OH

H

H

H

H

-cadineno

-cadineno

-cadinol

(E)-cariofileno

OH

H

OH

OH H

HH

H

óxido de cariofileno -Elemeno elemol espatulenol

germacreno D -humuleno -pineno -pineno

OH

mirceno p-cimeno limoneno linalol

O

1,8-cineol

38

Vale salientar que dentre os compostos presentes nas espécies de Annona

estudadas, a presença de alguns deles foi marcante, como óxido de cariofileno e

(E)-cariofileno, sendo considerados marcadores quimiotaxonômicos. Da mesma

forma, o sesquiterpeno espatulenol foi considerado marcador na família Annonaceae

(COSTA et al., 2009).

3.2.1.1. Considerações sobre os alcaloides

Os alcaloides são compostos com ampla distribuição na natureza e representam

uma das classes mais generalizadas de compostos, dotados de propriedades

biológicas. São metabólitos secundários com nitrogênio heterocíclico, derivados de

aminoácidos ou por processo de transaminação, o que confere o caráter básico

(ANISZEWSKI, 2015). Estão presentes principalmente nas angiospermas, embora

essa distribuição não seja uniforme. Apesar dos alcaloides ocorrerem geralmente

em plantas, há registros do isolamento desses compostos em insetos, algas,

animais marinhos e terrestres, microrganismos e fungos (MANN, 1994). Podem ser

encontrados em várias partes do vegetal, apresentando como função na planta, a

proteção contra patógenos e herbívoros (HENRIQUES et al., 2004).

A caracterização do perfil fitoquímico da família Annonaceae demonstra a

prevalência de alcaloides do tipo isoquinolínicos, com predominância de aporfínicos

e oxoaporfínicos (LEBOEUF et al., 1982). Cerca de 934 alcaloides já foram

caracterizados em 254 espécies distribuídas em 59 gêneros dessa família

(CORDELL et al., 2001; LÚCIO et al., 2015; BARRETO et al., 2015). Esses

alcaloides são biossintetizados a partir do aminoácido aromático L-tirosina, o qual

deriva do ácido chiquímico como mostra a Figura 4. (HENRIQUES et al., 2004).

Figura 4: Núcleo básico de alcaloide isoquinolínico.

L-Tirosina Isoquinolina

39

No caso dos sistemas isoquinolínicos, a maior parte resulta da condensação de

dopamina com um aldeído (BENTLEY, 1998). A dopamina é obtida da hidroxilação e

descarboxilação da tirosina. O segundo intermediário p-hidroxifenilacetaldeído é

formado por transaminação, descarboxilação e hidroxilação da tirosina (DIAZ et al.,

2015). A condensação desses intermediários através de ciclizações via reação de

Mannich leva à formação do intermediário 1-benzil-tetrahidroisoquinolina, (S)-

norcoclaurina, que corresponde à unidade básica formadora de uma extensiva e

excepcional variedade de alcaloides (BENTLEY, 1998), que após uma sequência de

etapas (hidroxilação e metilação), resulta em (S)-reticulina, um intermediário

biossintético dos alcaloides isoquinolínicos (DIAZ et al., 2015), a partir do qual

resultam as séries dos alcaloides aporfínicos, tetrahidroprotoberberínicos e

protoberberínicos (BENTLEY et al., 1998). A Figura 5 detalha a rota biossintética a

partir de L-tirosina, para a formação da estrutura benziltetrahidroisoquinolínica e os

seus derivados, segundo Diaz et al. (2015).

Figura 5: Biossíntese de alcaloides isoquinolínicos a partir do precursor (S)-reticulina

(Fonte: Diaz et al., 2015).

Aporfínicos

Tetrahidroprotoberberínicos

Protoberberínicos

tirosina

descarboxilase

L-tirosina

transaminase,

descarboxilase

norcoclaurina sintase Dopamina

4-hidroxifenil-acetaldeído

(S)-norcoclaurina

norcoclaurina 6-O-metiltransferase

coclaurina N-metiltransferase

N-metilcoclaurina

3’-hidroxilase

3’-hidroxi-N-metilcoclaurina 4’-O-metiltransferase

(S)-reticulina

40

Os alcaloides benziltetrahidroisoquinolínicos (BTIQ) são considerados

excelentes marcadores quimiossistemáticos para a famíla Annonaceae, visto que

sua ocorrência e distibuição é ampla e variada nos diferentes representantes dos

grupos vegetais (KAPLAN et al., 2015)

No gênero Annona, aporfinoides são considerados os representantes mais

significativos, seguido pelos benziltetrahidroisoquinolínicos e benzilisoquinolínicos,

proaporfínicos e fenantrênicos (KAPLAN et al., 2015), além de alcaloides não

isoquinolínicos, protoberberínicos, tetrahidroprotoberberínicos, dehidroaporfínicos,

aporfínicos 4 ou 7 substituídos e isoquinolínicos simples. Essa classes encontram-se

representadas no Quadro 3.

Quadro 3 - Núcleo de alcaloides presentes no gênero Annona.

Fenantreno

NH

O

Aristololactama

N+

Protoberberínico

R4

N R6

R7

Aporfínico 4 ou 7 substituído

N

O

OxoaporfínicoDehidroaporfínico

N

R

R1

N R

Benziltetrahidroisoquinolínico

N

Benzilisoquinolínico

N

O

R

Proaporfínico

NR

Aporfínico

N

R

CH3

Fenantreno

N

Tetrahidroprotoberberínico

41

Segundo Dutra (2014), os aporfinoides de maior ocorrência no gênero são os

aporfínicos asimilobina, anonaina, isoboldina, nornuciferina, norushinsunina e

oliveridina; os oxoaporfínicos liriodenina, lanuginosina, lisicamina e O-metil-

moscatolina e os fenantrenos argentinina e aterosperminina.

Os alcaloides aporfínicos representam uma importante classe de metabólitos

secundários ativos com significativas propriedades biológicas, exibindo potentes

efeitos citotóxicos, o que os tornam alvo de estudo para concepção de agentes anti-

câncer (STÉVIGNY et al., 2005).

Quimicamente falando, aporfínicos (stricto sensu) são bases tetracíclicas,

formadas pela ligação direta dos anéis aromáticos A e C, típicos do núcleo

benzilisoquinolínico. O sistema de numeração mais comum está representado na

Figura 6 (STÉVIGNY et al., 2005).

Figura 6: Representação do núcleo de alcaloide aporfínico.

NR

1

2

3 4

3a

1b

5

6

6a

7

7a

8

9

11a

1a

A B

C

D10

11

O átomo de nitrogênio na posição 6 geralmente é terciário na forma de base,

mas também pode ser quaternário, menos frequentemente acetilado ou formilado. O

alcaloide é dito noraporfina, quando apresenta nitrogênio secundário (STÉVIGNY et

al., 2005).

Nas aporfinas naturais, as posições 1 e 2 são sempre substituídas por grupo

hidroxila, metóxi ou metilenodioxi. O núcleo tetracíclico pode ser substituído em

diferentes locais, nas posições 10 e 11 e menos frequentemente nas posições 3 e 8,

e em algun casos, a posição 7 (ou 4) é oxigenada. Os aporfínicos são opticamnete

ativos, apresentando uma configuração absoluta, que pode ser (S) ou (R), a

depender da estereoquímica de C6a (STÉVIGNY et al., 2005).

42

Aporfinoides englobam as aporfinas (1) e os alcaloides biogeneticamente

relacionados, tais como as proaporfinas (2) e derivados metabólicos, como os

oxoaporfínicos (3) e os fenantrenos (4). Formas diméricas e dehidroaporfínicos (5),

caracterizadas por uma insaturação adicional em C-6a, estão incluídos neste grupo

(STÉVIGNY et al., 2005), conforme ilustração do Quadro 4.

Quadro 4 - Exemplos de alguns aporfinoides.

O

O

NH

H

H3CO

OH

O

N

H

Anonaina (1) Glaziovina (2)

H3CO

H3CO

O

N

OH

N

H3CO

Lisicamina (3) Argentinina (4)

O

O

NH

OCH3

Dehidroxilopina (5)

43

Os aporfinoides exibem uma vasta gama de propriedades biológicas (RIOS et

al., 1989; RABÊLO, 2014a; LÚCIO et al., 2015). Alguns deles são bons agentes

dopaminérgicos e podem apresentar atividade sobre transmissões serotonérgica e

adrenérgica. Outros possuem efeito vasodilatador e antiagregante plaquetário.

Também são descritos na literatura, propriedades antioxidantes de aporfínicos

fenólicos e não-fenólicos, bem como atividades antimicrobianas, antivirais e

citotóxicas (STÉVIGNY et al., 2005). Na Tabela 3 estão relacionadas alguns

alcaloides isoquinolínicos, cuja atividade biológica e/ou farmacológica foram

comprovadas.

44

Tabela 3 - Propriedades biológicas e farmacológicas de alcaloides isoquinolínicos presentes em Annona. Composto Fonte Atividade Referência

Estefolidina A. cherimola Bloqueador de recepto -adrenérgico;

antipirético, hipotensivo, narcótico,

neuroprotetor, espasmolítico

Cunha et al. (2005)

Discretamina A. cherimola, A. leptopetala Antinociceptivo Simeon et al. (1990), Arriaga

et al. (2008)

Roemerina A. glabra, A. squamosa, A. senegalensis Antifúngico, adjuvante quimiopreventivo Udvardy et al. (2014);

Stévigny et al. (2005)

Laurotetanina A. cherimola Citotóxico Stévigny et al. (2005)

Nornuciferina A. pickelii, A. sericea, A. glabra, A. hayesii,

A. muricata

Antinociceptivo, antioxidante, anti-

Leishmania, antidepressor, citotóxico

Liu et al. (2014), Lúcio et al.

(2015), Moghadamtousi et al.

(2015), Stévigny et al. (2005)

O-metilmoscatolina A. ambotay, A. foetida Antimicrobiano, citotóxico, tripanocida,

leishmanicida

Costa et al. (2009), Lúcio et

al. (2015)

Coreximina A. montana, A. muricata, A. paludosa Antimicrobiano, leishmanicida Costa et al., (2010), Cunha et

al. (2005)

N-metil coridaldina A. squamosa Gastroprotetor Yadav et al. (2011)

(Continua)

45

Propriedades biológicas e farmacológicas de alcaloides isoquinolínicos presentes em Annona.

(Continuação) Composto Fonte Atividade Referência

Isocoridina A. purpurea, A. squamosa Gastroprotetor, antiproliferativo,

antiarrítmico, antimicrobiano,

antitussígeno, depressor do SNC,

hipotensor, parassimpático e

espasmódico.

Yadav et al. (2011), Sun et al.

(2012), Rios et al. (1989)

O-metil armepavina A. squamosa Gastroprotetor Yadav et al. (2011),

Glaziovina A. purpurea, A. cherimola Antiúlcera, ansiolítico, antimicrobiano,

citotóxico, antidepressivo, hipotensor,

psicotrópico, tranquilizante

Falcão et al. (2008), Rios et

al. (1989)

Palmatina A. paludosa Anti-inflamatório, citotóxico Souto et al. (2011),

N-metil

laurotetanina

A. purperea Antiplaquetário Chaves et al. (2010)

Lisicamina A. pickelii, A. acuminata, A. cherimola, A.

hayesii, a. purpurea, A. sericea

Antimicrobiano, antioxidante Costa et al. (2010)

Liriodenina A. bullata, A. cacans, A. cherimola, A.

classiflora, A. cristalensis, A. dioica, A.

foetida, A. glabra, A. hayesii, A. montana, A.

leptopetala

analgésico, antibacteriano, antifúngico,

antiplaquetário, antileishmanico,

antitumoral, antileucêmico, sedativo,

hipotensor, estimulante respiratório,

antimalárico, citotóxico, antiproliferativo

Lúcio et al. (2015), Costa et

al. (2006), Rios et al. (1989),

Suresh et al. (2012a), Nordin

et al. (2015), Arriaga et al.

(2008)

(Continua)

46

Propriedades biológicas e farmacológicas de alcaloides isoquinolínicos presentes em Annona. (Continuação)

(Continua)

Composto Fonte Atividade Referência

Corituberina

A. cherimola

Citotóxico, bloqueador muscular

Sun et al. (2014), Rios et al.

(1989)

7-hidroxi-

dehidrotalicsimidina

A. purpurea Antiplaquetário Chang et al. (1998a)

Talicsimidina A. purpurea Antiproliferativo Chang et al. (1998a)

Norpurpureina A. purpurea Antiproliferativo Chang et al. (1998a)

Lirinidina A. purpurea Antiproliferativo, antagonista de

serotonina, espasmódico e hipotensor

Chang et al. (1998a), Rios et

al. (1989)

N-metilasimilobina A. purpurea, A. cherimola Antiproliferativo Chang et al. (1998a)

Anonaina A. cherimola, a. bullata, A. classiflora, A.

glabra, A. hayesii, A. montana, A. muricata,

A. paludosa, A. purpurea, A. rugulosa, A.

salzmannii, A. senegalensis, A. spinoscens,

A. squamosa

Antimicrobiano, anti-Plasmodium,

antioxidante, anticâncer, vasorelaxante,

antidepressivo, hipotensor, citotóxico

Li et al. (2013), Rios et al.

(1989), Stévigny et al. (2005)

Anolobina A. cherimola, A. glabra Antimicrobiano Rios et al. (1989)

Asimilobina A. cacans, A. montana, A. muricata, A.

paludosa, A. pickelii, A. salzmannii, A.

classiflora, A. glabra, A. hayesii, A.

paludosa, A. reticulata, A. rugulosa

Antagonista de serotonina,

antimicrobiano, anti-helmíntico

Rios et al. (1989), Lin et al.

(2014)

47



Boldina

A. coriacea

Antialérgico, antiviral, inibidor de enzima

microssomal hepática, hipotensor,

sedativo , antioxidante, coletérico, anti-

inflamatório, citotóxico

Siqueira et al. (2010),

Stévigny et al. (2005),

Custódio et al. (2014)

Coridina A. cherimola, A. reticulata, A. squamosa Antitumoral, antitussígeno ,a ndrnérgico,

antimicrobiano, bloqueador muscular,

hipotensor

Rios et al. (1989)

Estefarina A. glabra, A. hayesii, A. spinscens, A.

cherimola

Serotoninérgico, parassimpaticolítico,

hipotensor, inibidor da

acetilcolinesterase

Rios et al. (1989)

Glaucina A. squamosa Analgésico, adrenégico, anti-trombínico,

antitussígeno, anti-inflamatório,

hipotérmico, sedativo, eleva níveis de

dopamina, depressor do SNC,

espasmódico, parassimpaticomimético,

teratogênico

Rios et al. (1989)

Isoboldina A. montana, A. salzmannii, A. glabra, A.

rugulosa, A. senegalensis, A. sericea, A.

cherimola

Hipotensor, espasmódico, hipotérmico,

inseticida

Rios et al. (1989)

(Continua)

48



Lanuginosina A. rugulosa, a. squamosa, A. cherimola Antimicrobiano e antileucêmico Rios et al. (1989)

N-metil

lactinodafnina

A. glabra Antimicrobiano e citotóxico Rios et al. (1989)

Norcoridina A. muricata, A. reticulata, A. squamosa Hipotérmico, espasmódico, hipotensor Rios et al. (1989)

Nornantenina A. rugulosa, A. sericea Antimicrobiano Rios et al. (1989)

Nuciferina A. hayesii, A. cherimola Analgésico, anticonvulsivante,

antimicrobiano, anti-inflamatório,

antitetânico, antitussígeno, depressor do

SNC, sedativo, agonista dopaminérgico,

antagonista de serotonina

Rios et al. (1989)

Oxopurpureína A. purpurea Citotóxico Lúcio et al. (2015)

Xilopina A. monstana, A. salzmannii, A. rugulosa, A.

cherimola, A. classiflora, A. reticulata, A.

squamosa

Antimicrobiano, antiparasitário,

analgésico, espasmódico, sedativo

Rios et al. (1989), Lúcio et al.

(2015)

Reticulina A. cherimola, A. classiflora, A. glabra, A.

montana, A. muricata, A. paludosa, A.

purpurea, A. reticulata, A. rugulosa, A.

salmannii, A. sericea, A. spinescens

Vasorelaxante e depressor do SNC Rios et al. (1989), Lúcio et al.

(2015)

Oxoglaucina A. glabra, a. purpurea Citotóxico e antimicrobiano Rios et al. (1989)

(Continua)

49


(Conclusão) Composto Fonte Atividade Referência

Tetrahidropalmatina A. paludosa, A. cherimola Analgésico, antibacteriano, inibidor de

atividade antigênica, citotóxico, inibidor

de agregação palquetária, tóxico,

bloqueador andrenérgico,

antiesquémico, antimalárico, bloqueador

de canais de cálcio, efeito

cardiovascular, bloqueador do receptor

de dopamina, hipotensivo, mutagênico,

neuroexcitatório, espasmolítico

Cunha et al. (2005)

Norisocordina A. cherimola, A. rugulosa, A.

squamosa, A. leptopetala

Antinociceptivo e potente antioxidante Zhao et al. (2006), Costa et al,

(2012)

(-)-3-hidroxinornuciferina A. sericea, A. reticulata, A. leptopetala Tripanocida Mahiou et al. (1994), Lúcio et

al. (2015), Costa et al.,

(2012a)

Coripalmina A. cherimola, A. leptopetala Bloqueador do receptor de dopamina Cunha et al. (2005), Sette et

al. (2000a,b)

Fonte: Autora própria.

50

Na compilação realizada por Cunha e colaboradores (2005), sobre alcaloides

protoberberínicos, de 310 plantas estudadas, pertencentes a 13 famílias, um total de

138 alcaloides haviam sido descritos, contando com mais de 580 citações, entre

1986 e 2001. Nesse estudo, a família Annonaceae, com 30 gêneros investigados,

revelou 30 espécies produtoras dessa classe de alcaloides. O gênero Annona,

considerado o mais estudado, reportou quatro espécies contendo alcaloides

protoberberínicos, com oito citações.

Os protoberberínicos são compostos por um sistema de anel tetracíclico que se

baseia no sistema dibenzenoquinolizidina. Esses alcaloides tetracíclicos são

derivados de benzilisoquinolinas (CUNHA et al., 2005).

Este grupo de alcaloides consiste de uma série de variações no principal sistema

de anel tetracíclico. Com base na revisão de Cunha et al. (2005) e de Lúcio e

colaboradores (2015), quatro tipos de esqueletos protoberberínicos foram descritos

no gênero Annona, os quais estão representados na Figura 7.

Figura 7: Sumário de esqueletos protoberberínicos descritos no gênero Annona.

Os alcaloides protoberberínicos descritos no gênero Annona, com base no

levantamento realizado por Cunha et al. (2005) e Lúcio et al. (2015), bem como sua

propriedades biológicas estão detalhados na Tabela 4.

NN

N+

N+

Tipo I Tipo II

Tipo III Tipo IV

51

Tabela 4 - Alcaloides protoberberínicos presentes no gênero Annona e suas propriedades biológicas.

Alcaloide Atividade biológica Ocorrência Referência

Coreximina

H3CO

N

OH

OH

OCH3

Anti-hipertensivo, estimulante respiratório

A. montana,

A. paludosa,

A. muricata

Lúcio et al. (2015),

Cunha et al. (2005)

NOH

OHEstefolidina

H3CO

OCH3

Bloqueador de receptor alfa-adrenérgico

Anti-isquemico, antipirético, bloqueador de canais de cálcio,

cataléptico, inibidor da síntese de DNA, bloqueador de receptor de

dopamina, dopaminérgico, narcótico, neuroexcitatório,

neuroprotetor, tranquilizante, espasmolítico, hipotensivo

A. cherimolia

Cunha et al. (2005)

Pessoína

NOH

OH

OH

H3CO

Anti-tripanossoma

A. spinescens

Lúcio et al. (2015), Cunha et al. (2005)

(Continua)

52

Alcaloides protoberberínicos presentes no gênero Annona e suas propriedades biológicas. (Continuação)


Espinosina

N

OH

OH

H3CO

H3CO

-

A. spinescens


Cunha et al. (2005)

Escoulerina

NOH

OH

H3CO

OCH3

Antifúngico

A. paludosa

Cunha et al. (2005)

Tetrahidropalmatina

NH

3CO

H3CO

OCH3

OCH3

Analgésico, antibacteriano, inibidor de ativação antigênica,

citotóxico, inibidor de agregação plaquetária, tóxico, bloqueador -

adrenérgico, anti-isquêmico, antimalárico, bloqueador de canais

de Ca2+

, efeito cardiovascular, bloqueador do receptor de

dopamina, mutagênico, hipotensivo, neuroexcitatório,

espasmolítico

A paludosa,

A. cherimolia


Cunha et al. (2005)

(Continua)

53

Alcaloides protoberberínicos presentes no gênero Annona e suas propriedades biológicas (Conclusão)


Dehidrocoridalmina

N

OH

H3CO

H3CO

OCH3

-

A. glabra

Cunha et al. (2005)

Palmatina

N+

OCH3

OCH3

H3CO

H3CO

Inibidor de acetilcolinesterase, bloqueador do receptor -

adrenérgico, analgésico, antiarrítmico, leishmanicida, antimalárico,

antiespasmódico, antiespermatogênico, antitumoral, inibidor de

apoptose, inibidor de lipase, Inibidor de agregação plaquetária,

redutor de atividade locomotora, inibidor de síntese de dopamina,

inibidor de topoisomerase I

A. paludosa


Cunha et al. (2005)

N+

Dehidropalmatina OCH3

H3CO

H3CO

OCH3

-

A. paludosa


Cunha et al. (2005)

Fonte: Autoria própria.

54

Investigações farmacológicas prévias sobre os alcaloides protoberberínicos têm

apontado um número crescente e relevante de atividades biológicas atribuídas a

estes alcaloides como, antisséptica, antiparasitária, antitripanossoma, inseticida,

antifúngica, leishmanicida, antiaminésica, antineurotóxica, narcótica, antiarrítmica,

antiespasmódica, anti-hemorrágica, vaso relaxante, hipotensiva, hipoglicêmica,

antihipercolesterolêmica, anti-inflamatória, antigênica, antiproliferativa, antitumoral,

indutora de apoptose, antidiarreica, antiúlcera, dentre outras.

3.2.1.2. Considerações sobre as acetogeninas

A investigação do potencial antitumoral de espécies de anonáceas teve início

com o isolamento da primeira acetogenina citotóxica, a uvaricina, oriunda da espécie

Uvaria acuminata em 1982 (JOLAD et al., 1982). Desde então, mais de 500

acetogeninas de anonáceas foram caracterizadas a partir de 51 espécies em 13

gêneros (GONZÁLEZ–ESQUINCA et al., 2014; BARRETO et al., 2015).

No gênero Annona há relatos na literatura do isolamento de inúmeras

acetogeninas tetrahidrofurânicas com potencial anti-parasitário (LEBOEUF et al.,

1982; BERMEJO et al., 2005; RINALDI, 2007), além de outras com atividades

biológicas como, citotóxica, pesticida, vermicida, imunossupressora, antiemética,

inibidora do apetite, antimalárica e inibidoras de células resistente a múltiplos

fármacos (DERBRÉ et al., 2008; McLAUGHLIN, 2008; ALALI et al., 1999; GU et al.,

1995).

Este gênero é o que mais contribui em número de acetogeninas isoladas (289

acetogeninas em 20 espécies estudadas), correspondendo a aproximadamente 65%

daquelas descritas desde o relato da primeira, em 1982 (RUPPRECHT et al., 1990;

FANG et al., 1993; ZENG et al., 1996; CAVÉ et al., 1997; ALALI et al., 1999;

CORTES et al, 2005).

As acetogeninas de anonáceas constituem uma classe de produtos naturais

isolados exclusivamente da família Annonaceae. Elas se caracterizam

estruturalmente por ter um esqueleto de natureza alifática com 35 a 37 átomos de

carbono (C), com uma -lactona-4-metil terminal, geralmente ,-insaturada. Elas

são derivadas de ácidos graxos de cadeias longas (C32 a C34) ligadas

55

covalentemente a uma unidade de 2-propanol em C-2, formando uma -lactona com

substituinte metila (ALALI et al., 1999).

As acetogeninas de anonáceas podem ter ao longo da sua cadeia alquila, um,

dois, ou três anéis tetrahidrofurânicos, alguns substituintes oxigenados e em alguns

casos, insaturações e/ou epóxidos. As acetogeninas podem ser classificadas em

vários subgrupos: com anel mono-tetrahidrofurânico (THF) (1), com anéis bis-

tetrahidrofurânicos adjacentes (2), com anéis bis-(THF) não adjacentes (3), com

anéis THF e tetraidropirânicos (THP, 4) lineares (5), epóxidos (6) e com três anéis

(7), representados no Quadro 5 (CAVÉ et al., 1997; ALALI et al., 1999; WONGSA et

al., 2011; MELOT et al., 2009; BERMEJO et al., 2005).

56

Quadro 5 - Alguns subgrupos da classe das acetogeninas.

OH

O

H H

OH

OH OHO

OOH

(1)

O

O

OH

OH

OH OHO

O

H

H

H

(2)

OO

O

OH

O

OHOH

OH

(3)

OO

OH

OH OHO

OHH

H

H

(4)

O

O

(5)

O

O

O(6)

OO

O

OHOO

H H

(7)

57

As acetogeninas são conhecidas por serem potentes compostos citotóxicos. O

mecanismo de ação dessas substâncias foi investigado através de inúmeros

estudos, os quais demonstraram que elas inibem a adenina nicotinamida

dinucleotídeo, forma reduzida-NADH: ubiquinona oxirredutase do complexo I, que é

uma proteína da membrana ligada ao sistema de transporte de elétrons mitocondrial

e à membrana plasmática de células neoplásicas, responsável pela produção de

energia na célula. Portanto, sua inibição leva à depleção dos níveis de ATP,

reduzindo a proliferação celular, principalmente de células tumorais que precisam de

um elevado nível de energia metabólica e, consequentemente, induzem a apoptose.

Em concentrações nanomolares, as acetogeninas são consideradas as mais

potentes, dentre os diversos inibidores do complexo I, representando, assim, uma

interessante perspectiva para o desenvolvimento de uma nova geração de drogas

antitumorais (GONZÁLEZ et al., 1997; IGNEY et al., 2002; ALALI et al.,1999;

McLAUGHLIN, 2008).

3.3. Propriedades biológicas e farmacológicas de compostos bioativos em

anonáceas

Estudos com os extratos de várias partes de Annona reticulata têm exibido

efeitos como antihiperglicêmico (RAHMAN et al., 2011), citotóxico, inibidor da

caspase recombinate (MONDA et al., 2007), antinociceptivo (ISLAM et al., 2012),

analgésico e depressor do SNC (BHALKE et al., 2011.), anti-inflamatório (CHAVAN

et al., 2011), inibidor tumoral (SURESH et al., 2011) e antiproliferativo (SURESH et

al., 2012a). Estudos fitoquímicos desta espécie revelam a presença de dopamina,

salsolinol, coclaurina, sesquiterpenos e acetogeninas como os metabólitos bioativos,

comumente presentes nas folhas (OGUNWANDE et al., 2006).

Suresh et al. (2012) investigando o potencial antiproliferativo de A. reticulata,

revelou que os alcaloides aporfínicos liriodenina, norushinsunina, reticulina e a

acetogenina neoannonina, isoladas a partir das raízes, testados contra linhagens

tumorais humanas cervical (HeLa), carcinoma de pulmão (A 549), leucemia mieloide

crônica (K-562), adenocarcinoma mamário (MDA-MB) e células normais, exibiram

proeminente citotoxicidade concentração-dependente contra todas as linhagens

tumorais testadas, com destaque para neoannonina, com CI50 variando de 5,8-6,9

58

µg.mL-1. Simultaneamente, o efeito de todos os compostos nas células sadias, em

relação às tumorais, foi inferior.

Entre os alcaloides aporfínicos testados, a presença de um grupo hidroxila em C-

7, em norushisunina [1], pode estar relacionada à sua ação pronunciada, enquanto a

existência de duas hidroxilas adjacentes ao anel tetrahidrofurânico, no composto

neoannonina [2], pode ser responsável pela sua elevada atividade, como pode ser

visto na Figura 8. Assim o significativo efeito antiproliferativo dos compostos

testados em várias linhagens do câncer humano de pulmão, leucemia mieloide

crônica, cérvix e mama, associado também à sua baixa citotoxidade em células

sadias, torna A. reticulata e seus compostos isolados, candidatos a agentes

quimiopreventivos na terapia do câncer (SURESH et al., 2012).

Figura 8: Alcaloide norushinsunina e acetogenina neoannonina.

OH

O

O

NH

H

H

[1]

O

O

OH

OH

O

O

[2]

Outro estudo com A. reticulata realizado por Jamkhande e colaboradores (2014),

revelou que o extrato metanólico das folhas apresentou elevado potencial

antimicrobiano contra várias linhagens de bactérias e fungos patógenos, além de

significante atividade antioxidante, sendo atribuído aos compostos fenólicos e

polifenóis o potente efeito inibidor. Essa atividade, no entanto, está condicionada à

concentração e à susceptibilidade do patógeno aos fitoquímicos presentes no

extrato. Bansal et al. (2013) também afirmam que compostos polifenólicos são

biologicamente ativos e possuem propriedades antimicrobianas.

Ye et al. (2013) revelam ainda que compostos que têm propriedades

antioxidantes podem apresentar atividade antimicrobiana adicional. Além disso,

Kannan et al. (2013) afirmam que os antioxidantes desempenham várias funções no

59

sistema biológico, que envolvem principalmente a proteção de lesão oxidativa e em

vias de sinalização celular.

Vários estudos prévios revelaram que a atividade antimicrobiana de muitos

extratos de plantas é devido à presença de alcaloides (SINGH et al., 2002),

saponinas (BARILE et al., 2007; AUGUSTIN et al., 2011) e flavonoides (CUSHNIE,

LAMB, 2005). Alguns flavonoides cuja ação antimicrobiana foi confirmada são

apigenina, naringina e naringenina, epigalocatequina galato e derivados, luteolina e

luteolina 7-glicosídeo, quercetina e seus derivados glicosilados, canferol e seus

derivados, flavonóis, flavonóis glicosilados, dentre outros (CUSHNIE; LAMB, 2005).

Entre os flavonoides bioativos citados, muitos são comuns entra as espécies do

gênero Annona, principalmente quercetina, kaempferol e seus respectivos derivados

glicosilados (DUTRA, 2014).

Estudos conduzidos com Guatteria hispida por Costa et al. (2010), avaliaram o

potencial antioxidante e antimicrobiano de alguns alcaloides, demostrando que

lisicamina, 9-metóxi-isomoscatolina, coreximina e isocoreximina, apresentaram

significante capacidade antioxidante. Os oxoaporfínicos O-metilmoscatolina,

lisicamina e liriodenina foram ativos contra S. epidermidis e C. dubliniensis. Fazendo

uma breve comparação entre os alcaloides oxoaporfínicos, percebe-se que o

composto lisicamina tem como diferencial a presença de hidrogênio em C-3, com

grupos metóxi em C-1 e C-2, podendo tal condição ser favorável tanto para a

atividade antioxidante como antimicrobiana (COSTA et al., 2010).

Com relação à capacidade antioxidante e antimicrobiana de Annona salzmannii,

foi verificado que o alcaloide aporfínico asimilobina apresentou maior atividade

antioxidante em relação aos alcaloides liriodenina, reticulina e cleistofolina, enquanto

que a anonaina foi considerada moderadamente ativa (COSTA et al., 2013).

As relações de estrutura e atividade estabelecidas por estes alcaloides levaram

às seguintes observações: foi proposto que a atividade da asimilobina pode estar

associada à presença de uma hidroxila em C-1, adjacente ao grupo metóxi no anel

A, enquanto que a anonaina exibe nas mesmas posições um grupo metilenodióxi,

conforme ilustrado na Figura 8. A presença dessa hidroxila fenólica pode estar

promovendo a capacidade antioxidante da molécula. Com relação ao ensaio

antimicrobiano, todos os alcaloides foram ativos frente aos microrganismos testados.

Os mais ativos foram liriodenina, anonaina e asimilobina. Anonaina foi mais ativa

60

que o controle cloranfenicol, enquanto a reticulina foi mais sensível contra as

linhagens de Candida (COSTA et al., 2013).

Figura 9: Alcaloides isoquinolínicos isolados de A. salzmannii.

Fonte: (COSTA et al., 2013)

Silva et al. (2009) mensuraram a atividade antioxidante do alcaloide

tetrahidroprotoberberínico discretamina, isolado de Xylopia langsdorfianna,

determinando uma porcentagem de atividade acima de 90% em todas as

concentrações testadas, comparável ao padrão ácido ascórbico e quercetina pelo

ensaio do sequestro do radical livre DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil).

Em levantamento realizado por Tan-Li e colaboradores (2013) são citadas

diversas atividades biológicas para o alcaloide anonaina que são atividade inibidora

contra Bacillus cereus, Escherichia coli, Microccus sp, Staphylococcus aureus, ação

antifúngica contra Tricophyton rubrum, Microsporum gypseum, efeito anti-

Plasmodium contra linhagens de Plasmodium falciparum resistentes à cloroquina,

além de propriedades anticâncer, efeito citotóxico, antidrepessor, dentre outras.

Estudos químicos e farmacológicos têm revelado importantes atividades, tais

como antimicrobiano, antioxidante, antiprotozoários frente Leishmania sp, P.

falciparum e Trypanossoma cruzi, associados especialmente a alcaloides

isoquinolínicos e seus derivados (RABELO et al., 2014).

Rabelo et al. (2014) confirmou o potencial antimalárico de Guatteria citrioda,

atribuindo o efeito à presença de alcaloides protoberberínicos e derivados fenólicos

de alcaloides 7,7-dimetilaporfínicos e 7-hidróxi-7-metilaporfínico.

Estudos anteriores também relataram atividade anti-Plasmodium para os

alcaloides lisicamina, liriodenina e palmatina (GRAZIOSE et al., 2011; MARLEBO et

al., 2013).

Liriodenina Anonaina Asimilobina Reticulina Cleistofolina

61

Sener e colaboradores (2003) sugerem que o grupo metilenodioxi e o nitrogênio

terciário não metilado contribuem para a alta atividade dessa classe de alcaloides.

Outro grupo de estudo avaliando a atividade anti-Plasmodium de alguns grupos

de alcaloides, aponta que a presença do nitrogênio quaternário aumenta a atividade

dos protoberberínicos. No grupo dos aporfínicos, os autores sugerem que a função

amina secundária ou um substituinte fenólico garante maior efeito anti-Plasmodium

in vitro em relação às aminas terciárias e substituintes metoxilados, os quais foram

cerca de sete vezes menos ativos (WRIGHT et al., 2003).

Pesquisas têm constatado a resistência de bactérias Gram (-), como E. coli e

Pseudomonas aeruginosa, aos alcaloides isoquinolínicos, como O-metil-

moscatolina, lisicamina, isomoscatolina, isocoreximina e liriodenina (COSTA et al.,

2010, COSTA et al., 2011b, PÉREZ et al., 2004).

Na investigação da atividade antiproliferativa de Guatteria blepharophilla, Costa

e colaboradores (2011b) evidenciaram que o alcaloide oxaporfínico liriodenina

apresentou efeito superior à doxorrubicina, frente a células de mama (MCF-7),

sendo também ativo a isomoscatolina. O alcaloide lisicamina mostrou ser ativo

contra linhagem de células do pulmão (NCI H460). Os autores sugerem que um

substituinte metoxilado em C-3, reduz a atividade antiproliferativa, ou mesmo inativa,

mas um grupo OH em C-3 favorece a atividade, apontam também que os melhores

resultados foram obtidos para o grupo metilenodióxi ou grupos metóxi em C-1 e C-2.

Costa et al. (2006) reportaram a atividade leishmanicida dos alcaloides

annomontina e liriodenina isolados de A. foetida, contra formas promastigotas de L.

brazilienis.

Estudos fitoquímicos da espécie Guatteria friesiana levaram ao isolamento de

diversos alcaloides, destre eles, palmatina, que apresentou efeito citostático para

linhagens de mama (MC-7) e glioma (U251) com valores de CI50 abaixo de 25

g.mL-1 (COSTA et al., 2013c).

No estudo realizado por Yadav et al. (2011), os compostos isolados de A.

squamosa, (+)-O-metilarmepavina, N-metoxicoridaldina e isocoridina, revelaram

potencial antiúlcera.

Investigações recentes demonstraram que a isocoridina, não só inibe a

proliferação celular em linhagens celulares de hepatocarcinoma por indução da

suspensão da fase G2/M do ciclo celular e apoptose, como também tem como alvo o

62

lado da população celular resistente a medicamentos (ou células tronco

cancerosas), através de indução de apoptose relacionada à PDCD4. O que sugere

que a isocoridina é uma droga com potencial terapêutico, tendo como alvo linhagens

celulares de carcinoma hepatocelular (ZHONG et al., 2014). Estudos anteriores

desenvolvidos por Sun et al. (2012) e Lu et al. (2012) também confirmam o potencial

anticâncer da isocoridina.

O extrato acetato de etila do pericarpo de A. muricata apresentou atividade in

vivo contra as formas promastigotas de L. braziliensis e L. panamensis e também

contra a linhagem celular U937, mostrando-se mais ativo que a substância de

referência glucantima. O estudo químico posterior levou ao isolamento das

acetogeninas annonacina, annonina A e annomoricina A (PADMA et al., 1998).

O óleo essencial de G. friesiana mostrou elevado efeito antimicrobiano,

apresentando como constituintes majoritários o -eudesmol (51,6%), -eudesmol

(23,7%) e -eudesmol (14,5%) (COSTA et al., 2008a).

Os óleos essenciais de A. salzmannii e A. pickelli, cuja composição é

predominantemente de sesquiterpenos, revelaram potente efeito tripanocida e

antitumoral. Na análise antitumoral, o óleo de A. salzmanni mostrou ser o mais

potente, com CI50 abaixo de 50 g.mL-1 frente a linhagens de células tumorais de

melanoma (UACC-62), glioma (U251), mama (MCF-7), pulmão (NCI 460) e cólon

(HT), enquanto para o óleo essencial de A. pickelli foram as linhagens (U251) e de

rim (786-0). Outro estudos com os óleos essenciais destas espécies revelaram seu

potencial antimicrobiano e antioxidante (COSTA et al., 2011).

Chavan e colaboradores (2010) atribuíram o efeito analgésico e anti-inflamatório

do extrato de éter de petróleo das cascas de A. squamosa ao sesquiterpeno óxido

de cariofileno.

O composto cariofileno, muito presente nos óleos essenciais de várias plantas,

assim como em espécies de Annona, é considerado um fitocanabinoide (RUSSO et

al., 2011), apresentando aplicações em dermatites de contato (KARSAK et al.,

2007). Trabalhos subsequentes demonstram que este componente na dieta produz

efeitos anti-inflamatório e analgésico (GERTSCH et al, 2008) e apresenta efeito

citoprotetor gástrico (TAMBE et al., 1996).

63

Estudos com a espécie A. senegalenis indicaram que esta apresenta atividade

antibiótica, anti-helmítica e antitumoral, devido à presença de diterpenos do tipo ent-

cauranos, principalmente referente ao ácido caurenoico (ALAWA et al., 2003).

O ácido caurenoico tem ampla ocorrência no gênero Annona (DUTRA, 2014).

Este composto tem despertado interesse devido ao vasto número de propriedades

biológicas conferidas a ele, que são citotóxica, hemolítica, embriotóxica (COSTA-

LOTUFO, et al., 2008; CHAVEZ et al. 1997; ZHANG et al., 2004; DAVINO et al.,

1989; PERUZZO et al., 1986), inibidor da replicação do HIV em linfócitos (CHANG

et al., 1998), antiproliferativo (ZHOU et al., 2013), entre outros efeitos.

Zhang e colaboradores (2004) atribuíram o efeito inibitório sobre células tumorais

aos compostos ácido caurenoico e ácido ent-cauran-19-al-17-oico, isolados de A.

glabra. Outro estudo com o extrato das sementes desta mesma espécie, constatou

sua potente atividade larvicida, com valor de CI50 de 0,06 g.mL-1 (OMENA et al.,

2007).

Dutra et al. (2014a) reportam o isolamento de diversos diterpernos com

esqueleto ent-caurano, bem como avaliam potencial citotóxico desses compostos

frente a células tumorais de melanoma (B16-F10), carcinoma hepatocelular (HEP

G2), leucemia mielóide crônica (K 562), leucemia promielocítica (HL-60) e linhagem

de células normais. Entre eles o ent-3-hidroxi-caur-16-em-19-al foi o composto que

apresentou pronunciada atividade citotóxico sobre a linhagem celular K562 (CI50 de

2,49 g.mL-1).

Inúmeras são as propriedades farmacológicas reportadas na literatura para A.

squamosa, dentre elas, antidiabética, hipoglicemiante, antitumoral, pesticida,

antiparasitária, analgésica, anti-inflamatória, hepatoprotetora, entre outras (GUPTA

et al., 2005; PANDEY, BARVE, 2011).

Plantas da família Annonaceae apresentam em sua composição diversas

substâncias com potencial inseticida, dentre elas destacam-se as acetogeninas, por

apresentarem bioatividade contra diversas espécies de insetos (ALALI et al., 1999).

Na literatura são reportadas 42 espécies de Annonaceae com potencial

inseticida, distribuídas em 14 gêneros (Annona, Duguetia, Rollinia, Asimina, Xylopia,

Cardiopetalum, Dennettia, Guatteria, Monodora, Artabotrys, Mkilua, Oxandra,

Polyalthia e Unonopsis). Com destaque das espécies Annona muricata Linnaeus

(graviola) e Annona squamosa Linnaeus (fruta-do-conde, pinha), por serem

64

atualmente as espécies mais utilizadas para estudos de potencial inseticida

(KRINSKI et al.2014).

Estudos desenvolvidos por Cantrell et al. (2005) na busca por agentes com ação

repelente e inseticida, verificaram a atividade repelente de alguns terpenos, dentre

eles, o espatulenol, que exibibiu significativa ação repelente contra os mosquitos A.

aegypti e Anopheles stephensis. Também são mencionadas na literatura outras

propriedades farmacológicas para o referido composto, que são antiúlcera, anti-

inflamatória e antiespasmódica (PEREZ-HERNADEZ et al., 2008)

Feitosa e colaboradores investigando a espécie A. leptopetala (Sinonímia: R.

leptopetala) verificaram o efeito inseticida do extrato metanólico das raízes, dos

óleos essenciais das folhas e galhos e do alcaloide liriodenina. Tanto o extrato

metanólico como os óleos foram considerados ativos com Cl50 de 64,6 e 34,7 ppm,

respectivamente. O alcaloide liriodenina por sua vez, apresentou uma significativa

atividade larvicida, com Cl50 de 3,6 ppm. Tendo em vista esses resultados, os

autores sugerem que esta espécie tem grande potencial como fonte de inseticidas

naturais.

Huang e Wang (2004) e Novoa et al. (2011) avaliaram o potencial antioxidante

de diversos extratos lipofílicos pelo método de peroxidação lipídica através do

sistema -caroteno/ácido linoleico, sendo constatado que os ácidos graxos

insaturados (AGI) eram os principais compostos que contribuíam com a atividade

antioxidante dos extratos.

A avaliação da atividade antioxidante do extrato lipofílico das sementes de A.

crassiflora foi mensurada pelo sequestro do radical DPPH. Também foi quantificado

o teor de fitoesteróis, tocoferol, carotenoides e ácidos graxos presentes no extrato,

estabelecendo-se uma correlação entre essas classes com o efeito antiradicalar.

Demonstrou-se, dessa forma, que a capacidade sequestrante do extrato estava

diretamente relacionada à presença de fitoesteróis, enquanto que a baixa eficiência

antiradicalar foi atribuída principalmente aos ácidos graxos presentes no mesmo

(LUZIA, JORGE et al., 2013).

Lima et al. (2012) descrevem pela primeira vez na literatura o efeito citotóxico de

ésteres metílicos de ácidos graxos sobre linhagens de células tumorais humanas.

Foi confirmado o efeito citotóxico nas três linhagens celulares testadas: melanoma

(UACC-62), carcinoma renal (TK-10) e câncer de mama (MCF-7). Além disso, os

65

ésteres exibiram potente efeito antiradicalar na presença do radical livre DPPH. As

sementes de A. cornifolia mostraram ser ricas em ácidos graxos insaturados

(71,4%). Chaboune et al. (2006) também constataram que os ésteres metílicos de

ácidos graxos apresentaram citotoxicidade superior a das acetogeninas em células

tumorais de mama.

Um vasto estudo conduzido por McLaughlin (2008), com a caracterização de

mais de 150 acetogeninas, revelou que esses compostos são potentes inibidores do

complexo I da cadeia respiratória mitocondrial, bem como da produção de adenosina

trifosfato (ATP) citoplasmática (anaeróbica). A poderosa atividade antitumoral in vivo,

citotóxica, pesticida, antimalárica, anti-helmíntica, antiviral e efeitos antimicrobianos,

indicou uma ampla gama de aplicações potencialmente úteis para essa classe de

compostos.

Luna-Cazáres e colaboradores (2011) investigaram o efeito de rolliniastatina-2,

obtida de A. diversifolia, sobre bactérias Gram (+), Bacillus subtilis, S. aureus e S.

epidermidis, neste estudo foi constatado que a atividade desse composto foi maior

nas menores concentrações, independente do tempo de exposição e que com um

inóculo e concentrações mais baixas ocorreu o retardo do início da fase logarítmica

de crescimento bacteriano, estes resultados sugerem que a parede celular das

bactérias ensaiadas funciona com barreira para entrada de acetogeninas.

Lima et al. (2010) avaliaram pela primeira vez a atividade antioxidante de

acetogeninas. Nesse estudo, as acetogeninas 9-hidroxi-folianina, folianina A e B, 4-

desoxi-longimicina, squamocina M e L e annofolina, obtidas a partir da fração

hexânica das sementes e isolongimicina B, cornifolina, bulatacina, asimicina e

annotacina, oriundas da fração clorofórmica, foram avaliadas pelo ensaio de captura

de radicais livres DPPH, fazendo uso dos padrões BHT, ácido ascórbico e

butenolídeo. Os valores de CI50 para esses compostos variaram de 0,99 a 1,95

µg.mL-1. Observou-se para esses compostos um efeito anti-radicalar superior ao

BHT, e comparáveis ao ácido ascórbico (AA) e ao butenolídeo, embora menos

concentração-dependentes. Com isto, pôde-se inferir que o efeito anti-radicalar das

acetogeninas frente ao radical DPPH, pode ser atribuído à posição do anel lactônico

,-insaturado, por esta porção ser comum ao AA e ao butenolídeo, representados

na Figura 10.

66

O mecanismo de ação antioxidante proposto para AA estabelece uma reação da

base conjugada AH- (forma sob a qual a estrutura do eno-diol AA existe, em pH

fisiológico), doando um elétron para estabilizar o radical livre, convertendo-se em

radical ascarbonila, AH• (AH- + X

• AH

• + X-). Este radical se desprotona em A

• -,

que é altamente estabilizado, devido à deslocalização eletrônica (WAGNER et al.,

2008). No entanto, o mecanismo de ação in vitro de AA deve ser mais parecido com

da peroxidação lipídica, em que hidrogênios alílicos estão envolvidos. Acetogeninas

deverão atuar da mesma maneira, uma vez que elas também possuem hidrogênios

alílicos, bem como a estabilização via deslocamento eletrônico no anel lactônico ,-

insaturado (LIMA et al., 2010).

Uma evidência em parte, para apoiar estas observações, é a ascorbigena,

mostrada na Figura 11, que ocorre naturalmente nas espécies do gênero Brassica, e

contém grupos hidroxila ligados a um anel lactona saturado. Este composto exibiu

baixíssima atividade sequestrante de radicais livres DPPH (WAGNER et al., 2008).

Figura 11: Estrutura da ascorbigena.

O

OOH O

OH

NH

OH

H

Butenolídeo Ácido ascórbico (AA)

Figura 10: Estrutura do padrão ácido ascórbico e butenolídeo.

67

São reportados entre as espécies de anonáceas, compostos de ampla

ocorrência e que apresentam diversas bioatividades, tais como o esteroide -

sitosterol isolado de várias espécies de Annona, como A. muricata (RAGASA et al.,

2013), A. pickelii (DUTRA et al., 2012), A. salzmannii (DA CRUZ et al., 2011), A.

amazonica (PINHEIRO et al., 2009), A. glabra (HSIEH et al., 2004), dentre outras, o

qual demonstrou inibir a proliferação e induzir a apoptose de tumores sólidos

humanos de cólon e mama (PARK et al., 2007).

Outros compostos como o esteroide -sitostenona, que exibiu significante efeito

hipoglicêmico (ALEXANDER-LINDO et al., 2007), antiarrítmico (HOTTA et al., 2003)

e antitubercular (SALUDES et al., 2002), além dos triterpenos, -amirina e -amirina,

mencionados na literatura por sua propriedade anti-inflamatória (RECIO et al., 1995;

MEDEIROS et al., 2007) e analgésica (OTUKI et al., 2005; SOLDI et al., 2008), e o

esqualeno que exibiu efeito cardioprotetor, relacionado a suas propriedades

antioxidantes e hipolipemiantes (FARVIN et al., 2006), foram isolados dos frutos de

A. squamosa (RAGASA et al., 2013).

Outro esteroide bastante comum entre as espécies de anonáceas, bem como de

outras famílias, o estigmasterol, exibiu propriedades anti-inflamatória, anti-catabólica

e potencial efeito antiosteoartrítico (GABAY et al., 2010); exibe também

propriedades hipoglicêmica, inibidor da tireóide, antioxidante (antiperoxidativa),

atuando sobre a diminuição da peroxidação lipídica hepática, com efeito pró-

oxidante em altas concentrações (PANDA et al., 2009). Este composto também

diminui os níveis de colesterol no plasma, bem como inibe a absorção de colesterol

intestinal, tem a capacidade de suprimir a síntese de colesterol hepático e de sais

biliares (BATTA et al., 2006). Assim como outros fitosteróis, estigmasterol exibe

propriedades antitumorais (GHOSH et al., 2011).

3.4. A espécie Annona leptopetala (R.E.Fr.) H. Rainer

A espécie até recentemente classificada como Rollinia leptopetala R. E. Fries,

após inclusão do gênero Rollinia ao gênero Annona, passa a ser denominada

Annona leptopetala (R.E.Fr.) H. Rainer (RAINER, 2007).

68

Trata-se de uma planta de origem nativa, endêmica do Brasil, que ocorre na

forma de arbustos ou árvores de 2 a 9 m de altura, folhas elípticas a ovais,

densamente recobertas por pilosidade na face inferior. Frutos apocárpicos (15 a 20

carpelos) amarelos, laranja ou vermelhos. Flores vermelhas, característica inerente

apenas a esta espécie (MAAS et al., 2001) (Figura 12). Floração e frutificação de

novembro a abril (MAAS et al., 1992). Ocorre em floresta e nanofloresta

semidecíduas superomontanas, floresta decídua (mata seca), savana florestada

(cerradão) (OLIVEIRA-FILHO et al., 2008). A espécie é registrada também em

ambientes de Caatinga a 1.000 m de altura (MAAS et al., 1992), e ocorre nos

estados da Bahia, Piauí, Ceará, Pernambuco e Minas Gerais (MAAS, 2015),

destacados na Figura 12.

folhas, d) parte aérea.

Fonte: (a) Katarina Pinheiro; (b) Marcondes Oliveira (2010); (c) J.A. Siqueira Filho

(2011); (d) F.F.S. Silva (2011).

Photo: Katarina Pinheiro

(a) (b)

(c) (d)

Figura 12: Representação gráfica da espécie A. leptopetala: a) flor, b) frutos, c) folhas, d) parte aérea.

69

(Fonte: CNCFLORA) Centro Nacional de Conservação da Flora (2015).

Esta espécie é conhecida popularmente como "ata-brava", "banana-de-macaco",

"bananinha", "bananinha-de-macaco", "bananinha-de-quemquem", "fruta-de-

macaco", "pereiro" (MAAS et al., 1992).

Na medicina tradicional o decocto das cascas do caule de A. leptopetala é

empregado como digestivo, no tratamento de tumores e inflamações (AGRA et al.,

2007). Segundo Feitosa et al. (2009) essa planta, quando ingerida por animais,

demonstra elevada toxicidade.

Estudos prévios com esta espécie, conduzidos por Feitosa et al. (2009),

descreveram a composição química dos óleos essenciais obtidos das folhas e do

caule, bem como avaliaram a atividade larvicida dos óleos essenciais, do extrato

metanólico e do alcaloide liriodenina, ambos oriundos das raízes, contra larvas de

Figura 13: Mapa de distribuição geográfica da espécie A. leptopetala.

70

terceiro estágio de Aedes aegypti. Com isso, foi constatada a atividade do extrato

metanólico das folhas, com CL50 de 64,6 ppm e o elevado efeito de liriodenina, com

CL50 de 3,6 ppm. Os óleos essenciais também foram ativos, cujos valores de CL50

foram 104,7 e 34,7 ppm, respectivamente. Os autores ressaltaram que o óleo

essencial do caule, o qual foi mais efetivo, apresentava em sua composição a

prevalência de sesquiterpenos oxigenados, tendo como constituinte majoritário o

espatulenol (1) com teor de 63,9%. Consideram ainda, que esta espécie é uma fonte

potencial de larvicidas naturais.

Foi verificado que a composição química dos óleos essenciais das folhas, nos

estudos desenvolvidos por Costa et al. (2008b) e Feitosa et al. (2009), apresentaram

variação quali e quantitativa, enquanto no primeiro estudo, os contituítes majoritários

foram o biciclogermacreno (2), seguido pelo cis-4-tujanol (3), -terpineol (4) e

germacreno D (5), no segundo trabalho, constataram linalol (6) e 1,8-cineol (7),

como constituintes majoritários (DIAS et al., 2015).

Em outro estudo com as casca de A. leptopetala, Arriaga et al. (2008) relataram

a caracterização de alcaloides tetrahidroprotoberberínicos e aporfínicos,

correspondentes a dehidrodiscretamina (8), discretamina (9), liriodenina (10), das

acetogeninas, molvizarina (11), rolliniastatina-1 (12), annonacina (13), bullatacina

(14) e da liquexantona (15). Nesse estudo também foi avaliado o efeito larvicida do

extrato diclorometânico, que apresentou CL50 de 1,44 ppm, sendo esta atividade

atribuída à presença de acetogeninas no extrato.

Os alcaloides tetrahidrojatrorrizina (coripalmina, 16), anonaina (17), discretamina

e roemerina (18) isolados do caule de A. leptopetala, com exceção de

tetrahidrojatrorrizina, previamente caracterizada nesta planta por Sette et al. (2000b),

foram descritos pela primeira vez nesta espécie por Sette et al. (2000a).

A partir do óleo essencial obtido das folhas de A. leptopetala, Costa et al.

(2008b) avaliaram a ação moduladora do mesmo, frente a linhagens de

Staphylococcus aureus potadores de bomba de efluxo, resistentes ao norfloxacino.

Foi então constatada a ação moduladora do óleo, tendo em vista a redução

significativa da concentração inibitória mínima da droga de referência. Esse efeito

pode, segundo os autores, estar relacionado à inibição de bomba de efluxo.

A continuidade dos estudos desta espécie por Costa et al. (2012a), resultaram

na caracterização de um derivado cafeico, cafeato de -terpineol (19), três

71

ssquiterpenos espatulenol, -cariofileno (20), 4,10-aromadendrano-diol (21) e dois

alcaloides, (-)-3-hidroxi-nornuciferina (22) e (+) norisocoridina (23), a partir das

folhas. O mesmo grupo também avaliou o efeito antitumoral in vitro e in vivo do

extrato etanólico das folhas em células e em tumor sólido de sarcoma-180,

respectivamente. Os resultados indicaram que apesar do extrato não apresentar

atividade antitumoral in vitro sobre a linhagem celular testada, um significativo efeito

in vivo foi observado, através da redução no tamanho do tumor sólido,

possivelmente devido à ativação metabólica, por via enzimática. O estudo ressalta

ainda que compostos presente em A. leptopetala podem necessitar de ativação

enzimática, para apresentarem efeito.

As estruturas dos compostos identificados nesta nesta espécie estão

representadas no Quadro 6.

72

Quadro 6 - Compostos isolados de A. leptopetala.

OH H

HH

H

(1)(2)

OHH

(3) OH

(4)

(5)

OH

(6)

O

(7)

O

O

O

N

(10)

O O

OH OH

OH

O

O

(11)

O O

OH OH

OH

O

O

HHH H

(12)

(9)

H3CO

OCH3

OH

OHN

H

O

OH OH

O

O

OH OH

H H

(13)

N+

OH

OH

(8)

OCH3

H3CO

73

Quadro 6 - Compostos identificados em A. leptopetala.

Continuação...

O

O

OH

OH

OH

O

O

(14)

(15)

O

O OH

H3CO OCH

3

OH

N

(16)

H3CO

OCH3

OCH3

O

O

N

(18)

(23)

NH

OHH

H3CO

H3CO

H3CO

O

O

NH

H

(17)

H

H

(20)

OH

H

OH

H

(21)

OH

NH

H

(22)

H3CO

H3CO

O

O

OH

OH

(19)

74

Dentre os compostos anteriormente isolados desta espécie, destacam-se as

acetogeninas, rolliniastatina-1, acetogenina bis-tetrahidrofurânica (bis THF), com

comprovada ação leishmanicida (RAYNAUD-LE GRANDIC et al., 2004) e citotóxica

(RUPPRECHT et al., 1990), antiproliferativo contra células SW 480 (câncer de cólon

humano), com CI50 de 0,7.10-7 µM e efeito citotóxico sobre células Hep-G2 (DE

PEDRO et al., 2013), bullatacina com ação citotóxica sobre células de leucemia (50

µg.kg-1) (RUPPRECHT et al., 1990), além de potente efeito antitumoral frente a

células de hepatocarcinoma humano (CHIH et al, 2001; CHIU et al., 2003),

annonacina com efeito neurotóxico, moluscicida (MOGHADAMTOUSI et al., 2015) e

inibidor do complexo I mitocondrial (BARRETO, 2014).

Entre os compostos isolados desta espécie, os alcaloides são apontados por sua

ação farmacológica relevante, como anonaina com ação anticâncer e efeitos

citotóxicos em diferentes linhagens celulares de câncer, incluindo HeLa (câncer

cervical humano), HepG2 (carcinoma de fígado humano), hepatócitos de ratos e

H1299 (câncer de pulmão humano) (CHEN et al., 2011; MOHAMED et al., 2010;

CHEN et al., 2008), efeito vasorelaxante (VALIENTE et al., 2004), antioxidante

(UBEDA et al., 1993; MARTÍNEZ et al., 1992), atuação sobre o SNC (MARTÍNEZ-

VÁZQUEZ et al., 2012) e efeito antiparasitário e antimicrobiano (PAULO et al., 1992;

TSAI et al., 1989; COSTA et al., 2013; LI et al., 2013).

Destacando-se também a liriodenina com uma ampla gama de atividades tais

como ação antibacteriana (HUFFORD et al., 1975, 1980; VILLAR et al., 1987;

RAHMAN et al., 2005; WIRASATHIEN et al., 2006), antifúngica (HUFFORD et

al,1980; RAHMAN et al., 2005), ação sobre fitopatógenos (Cruz-Chacón et al. 2011),

efeito antiprotozoário (WAECHTER et al., 1999; WIRASATHIEN et al., 2006)

citotóxico (SIQUEIRA et al., 1998, CHANG et al., 2004, WIRASATHIEN et al., 2006)

e efeito antiproliferativo frente a diversas linhagens de células de câncer, com baixa

toxicidade em relação a células sadias, o que viabiliza seu uso como agente

quimiopreventivo na terapia do câncer Suresh et al. (2012a).

Outro alcaloide relatado nesta espécie com promissora atividade antibacteriana

foi a roemerina, mostrando-se efetivo contra cepas de Staphylococcus aureus in

vitro e in vivo contra S. aureus resistentes à meticilina (MRSA) (YIN et al., 2015),

além de propriedades antifúngica, antibacteriana (UDVARDY et al., 2014) e

adjuvante quimiopreventivo (STÉVIGNY et al., 2005).

75

O alcaloide (-)-3-hidroxi-nornuciferina também caracterizado na espécie A.

leptopetala, demonstrou atividade tripanocida (MAHIOU et al., 1994), enquanto que

para discretamina são citadas as seguintes atividades: antinocipetiva (ALMEIDA et

al, 2011), bloqueadora de receptor -adrenérgico (KO et al., 1993), antioxidante

(SILVA et al., 2009), e de inibição da topoisomerase I comparável à da

camptotecina, droga de referência, sendo esta atividade atribuída ao íon amônio,

com base num estudo preliminar da relação estrutura-atividade, o qual pode

desempenhar um papel importante na inibição da topoisomerase I (CHENG et al.,

2008).

Cheng et al. (2008) também comprovou o potencial antitumoral de

dehidrodiscretamina, por inibição específica da topoisimerase I em DNA humano,

através da estabilização do complexo enzima-DNA.

O alcaloide norisocoridina demonstrou elevado efeito antinociceptivo, bem como

apresentou grande poder de captura de radicais livres DPPH, com CE50 de 14,1

µg.mL-1. Com base nesses resultados e pelas relações de estrutura-atividade, os

autores sugeriram que essas atividades avaliadas, podem estar correlacionadas

entre si (ZHAO et al., 2006).

O gênero Rollinia, ao qual A. leptopetala pertencia, é um dos 13 gêneros, num

universo de 130 da família Annonaceae, reconhecido pela marcante produção de

acetogeninas (GONZÁLEZ–ESQUINCA et al., 2014), contando com o isolamento de

65 acetogeninas a partir de dez espécies (DIAS et al., 2015). Isto torna a espécie de

estudo um importante recurso na obtenção dessas substâncias, além de outros

compostos relevantes.

Dada a importância taxonômica da família Annonaceae, somada à presença

marcante de compostos bioativos como acetogeninas, alcaloides e terpenos em A.

leptopetala, revelam o elevado potencial biológico desta espécie, na busca por

modelos moleculares que possam atuar como agentes anti-câncer, antimicrobianos,

inseticidas naturais, dentre outras aplicações.

76

3.5. Breve consideração sobre antioxidantes

O processo respiratório e diversas reações oxidativas que ocorrem em nível

celular por via aeróbica desencadeiam a formação de radicais livres, que provocam

danos ao organismo e contribuem para o surgimento de várias doenças, tais como:

inflamações, mal de Alzheimer, tumores malignos e doenças cardiovasculares, além

de acelerarem o processo de envelhecimento (SIKORA et al;., 2008). Devido a isto,

as células necessitam de mecanismos antioxidantes que ofereçam a proteção contra

efeitos nocivos de radicais livres e espécies reativas de oxigênio (EROs) inerentes

ao processo aeróbico, bem como oriundos de fontes exógenas (BIANCHI,

ANTUNES, 1999; McLEAN et al., 2005). Para promover uma proteção eficiente, os

tecidos dispõem de um sistema antioxidante integrado, constituído por um arranjo de

vários componentes lipossolúveis (carotenoides e vitamina E), hidrossolúveis (ácido

ascórbico; glutationa) e enzimáticos (glutationa peroxidase, superóxido dismutase e

catalase) (McLEAN et al., 2005).

O estresse oxidativo por sua vez, ocorre quando há um desbalanço entre os

sistemas antioxidantes e a concentração de compostos oxidativos (radicais livre e

EROs), o qual tem sido associado a diversas doenças de cunho multifatorial, por

promover alterações oxidativas em moléculas críticas que incluem, proteínas,

carboidratos, ácidos nucleicos, além de substâncias envolvidas na modulação

gênica e resposta inflamatória (KAWANISHI et al., 2002, LAGUERRE, LECOMTE,

VILLENEUVE, 2007; SILVA et al., 2010).

Diversos estudos já comprovaram que antioxidantes exógenos oriundos,

sobretudo de produtos vegetais, são essenciais para a resistência ao estresse

oxidativo, estando relacionado a uma diminuição no risco de uma série de doenças

crônicas como câncer e aterosclerose (PODSEDEK, 2007).

Os principais antioxidantes presentes nos vegetais são as vitaminas C e E, os

carotenoides e os compostos fenólicos, com destaque para os flavonoides. Esses

antioxidantes têm capacidade de absorver radicais livres, inibindo a cadeia de

iniciação ou interrompendo a cadeia de propagação das reações oxidativas

desencadeadas por esses radicais (PODSEDEK, 2007).

77

É considerado um antioxidante qualquer substância capaz de retardar ou

impedir danos causados pela oxidação, estando presente em concentrações

inferiores ao do agente oxidante. As substâncias antioxidantes podem exibir várias

propriedades protetivas e atuarem em várias etapas do processo oxidativo, por

diferentes mecanismos, sendo, portanto classificadas em duas categorias principais:

antioxidantes primários e secundários. Os antioxidantes são considerados primários,

quando são capazes de inibir ou retardar a oxidação através da inativação de

radicais livres por doação de átomos de hidrogênio ou de elétrons, convertendo-os

em espécies estavéis. Os antioxidantes secundários, por sua vez, apresentam uma

maior variedade de mecanismos de ação: ligação a íons metálicos, inativação de

EROs, conversão de hidroperóxidos em espécies não-radicalares ou absorção de

radiação UV (MAISUTHISAKUL et al., 2007; SILVA et al., 2010).

Os compostos fenólicos atuam como bons agentes antioxidantes não só pela

habilidade em doar hidrogênios ou elétrons, como também em razão dos seus

radicais intermediários estáveis, impedirem a oxidação de várias substâncias e em

particular de lipídios (BRAND-WILLIAMS et al., 1995), fazendo deles bons

antioxidantes primários e secundários. Esses compostos podem impedir o processo

de oxidação em determinados sistemas, mas isso não implica dizer que eles

protegem as células e os tecidos de quaisquer danos oxidativos.

Os compostos fenólicos podem apresentar efeito pró-oxidantes em

determinadas condições (DEKER et al., 2007). Segundo Silva et al. (2010) esta

classe de compostos é bem diversificada e divide-se em flavonoides (polifenóis) e

não-flavonoides (fenóis simples ou ácidos). Os flavonoides atuam como

antioxidantes na inativação de radicais livres, em ambos os sistemas celulares

lipofílicos e hidrofílicos (BIANCHI; ANTUNES, 1999).

Os carotenoides têm como característica estrutural comum, uma cadeia polieno,

um sistema de ligação dupla conjugada, que é responsável pela atividade

antioxidante desses compostos, tanto na absorção do oxigênio singlete quanto de

radicais livres, para interromper reações em cadeia onde estão envolvidos (SIKORA

et al., 2008). A presença dessas ligações também possibilita a oxidação dos

carotenoides, o que resulta na sua descoloração. Além da proteção celular e in vitro

frente à espécie de oxigênio singlete, os carotenoides inibem a peroxidação de

lipídios em baixas concentrações de oxigênio (DAMODARAN et al., 2007).

78

Entre os antioxidantes naturais mais utilizados podem ser citados os tocoferóis.

O tocoferol é amplamente aplicado como meio para inibir a oxidação dos óleos e

gorduras comestíveis prevenindo a oxidação dos ácidos graxos insaturados. A

atividade antioxidante desses compostos é principalmente devida à capacidade de

doar seus hidrogênios fenólicos aos radicais livres lipídicos interrompendo a

propagação em cadeia (RAMALHO; JORGE, 2006).

Além dessas classes, outras também são reconhecidas na literatura pelo seu

elevado desempenho como agentes antioxidantes, como é o caso dos estilbenos,

cumarinas, lignanas, taninos (SOUSA et al., 2007), acetogeninas e alcaloides

(LIMA et al., 2010; RAČKOVÁ et al., 2004; CASSELST et al., 1995).

Levando em conta as diferenças entre o vasto número de sistemas de testes

disponíveis, os resultados de um único teste podem dar apenas uma sugestão das

propriedades antioxidantes das amostras testadas em relação a tantas matrizes,

sejam biológicas ou alimentares e devem ser interpretados com cautela. Além disso,

a complexidade química dos extratos vegetais, muitas vezes uma mistura de

dezenas de compostos com grupos funcionais, polaridade e comportamento químico

variado, poderia levar a resultados dispersos, dependendo do teste empregado.

Portanto, uma abordagem com vários ensaios em trabalho de triagem é altamente

recomendável.

3.6. Breve consideração sobre o câncer e os produtos naturais como fonte de

agentes antineoplásicos

O câncer abrange um conjunto de doenças que se caracterizam pela presença

de células em cresimento contínuo, com propriedade de invasão e destruição do

tecido adjacente, assim como de proliferação em outros sítios distintos do tumor

primário (metastização) (HANAHAN et al., 2000).

Os tumores malignos acometem um número expressivo e crescente de pacientes

em todo o mundo e representam a segunda causa de morte da população mundial

(SRIVASTAVA et al., 2005). Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS),

houve 14,1 milhões de casos novos e um total de 8,2 milhões de mortes por câncer,

em todo o mundo, em 2012. Em 2030, estima-se que a carga global será 21,4

79

milhões de casos novos de câncer e 13,2 milhões de mortes por câncer (INCA,

2014). Ainda segundo o INCA (2014), no Brasil, a estimativa para 2014/2015 é de

aproximadamente 576 mil novos casos de câncer, segundo esta publicação é

incontestável o fato de que hoje, no Brasil, o câncer é considerado um problema de

saúde pública e, por isso, seu controle e prevenção devem ser priorizados no país.

A terapêutica do câncer baseia-se, no geral, na associação da recessão cirúrgica

dos tumores ao tratamento radioterápico e a quimioterapia, sendo posteriormente

incluído o tratamento adjuvante. No entanto, muitos tumores ainda se mostram

resistentes aos tratamentos clássicos (COSTA-LOTUFO et al., 2010). Portanto, se

faz necessário a busca por alvos terapêuticos que ofereçam respotas no controle de

células neoplásicas.

Nesse tocante, a pesquisa na área de produtos naturais tem mostrado avanços

extraordinários no campo da oncologia, propiciando a descoberta de substâncias

com potencial antineoplásico, correspondendo em torno de 60% dos fármacos

anticâncer introduzidos na terapia nas últimas décadas (BUTLER, 2008; HARVEY,

2008; NEWMAN, CRAGG, 2007). Dentre estes, destacam-se vincristina (Oncovin),

vimblastina (Velban), paclitaxel (Taxol) podofilotoxina (Etopophos), camptotecina

(Hycamtin) e irinotecano (Camptosar). Esses medicamentos e seus análogos

movimentam anualmente um montante de aproximadamente 60 bilhões de dólares

(PINTO et al., 2002).

As fontes naturais ainda encontram-se disponíveis em abundância e oferecem

as melhores possibilidades de descoberta de substâncias com potencial terapêutico

(COSTA-LOTUFO et al., 2010). Até o momento, estima-se que menos de 2% das

plantas superiores foram investigadas para a detecção de contituintes com atividade

antineoplásica, referentes apenas à atividade citotóxica (ZHANG et al., 2002).

Entre as estratégias de busca para a descobertas de novos fámacos, destaca-se

o conhecimento etnobotânico (AGRA et al., 2008) e os programas de prospecção,

que incluem uma etapa inicial de testes in vitro em linhagens tumorais humanas, de

forma automatizada, o que resulta num elevado número de moléculas promissoras

(NEWMAN et al., 2003; CRAGG et al., 2006), aliada a este estratégia é importante

salientar as suposições quanto à eficácia dos produtos naturais, em função do

conhecimento etnobotânico, sendo este mais uma ferramenta que deve ser

considerada na busca por agentes terapêuticos.

80

Desta maneira, a espécie alvo deste estudo A. leptopetala, por ser apontada

pela medicina tradicional no tratamento de tumores (AGRA et al., 2008) foi

submetida à avaliação preliminar através de ensaios de citotoxicidade in vitro.

NH

O

O

H

1

23

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

1

23

3b

3a

4

5

6a

77a

8

9

10

11

11a

1a

OH

NH

O

O

H

OCH3

1

2

3

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

NH

H

H3CO

H3CO

1

2

3 4

5

6a NH

H3CO

OH

3a

3b

7

7a

8

9

10

11

11a

1aH3CO

H3CO

OH H

H

H

H

12

3

4

5

6

7

8

910

15

13

12

14

11

4. Procedimento experimental

82

4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

4.1. Suportes para cromatografia

Cromatografia em coluna (CC). Os fracionamentos cromatográficos foram

realizados em coluna de vidro, utilizando como fase estacionária sílica gel 60 com

partículas entre 0,063-0,200 mm (70-230 mesh) da Merck. O comprimento e

diâmetro das colunas variaram em função das quantidades de amostras a serem

cromatografadas. A proporção de sílica empregada foi cerca de 20 vezes a massa

do produto bruto a ser purificado (MATTOS, 1997).

Cromatografia em camada delgada analítica (CCDA). As análises em camada

delgada analítica foram realizadas em cromatofolhas de sílica gel 60, com indicador

de fluorescência F254, com suporte em alumínio e 0,2 mm de espessura.

Cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP). As análises em

escala preparativa foram desenvolvidas em cromatoplacas de vidro de tamanho 20 x

20 cm com espessura de 1,0 mm. As placas foram preparadas usando cerca de 20 g

de sílica gel 60 da Merck e 50 mL de água destilada. Estas foram mantidas à

temperatura ambiente para evaporação parcial da água e em seguida ativada em

estufa a 120 ºC. A visualização das bandas foi efetuada com auxílio de luz

ultravioleta (254 e 366 nm). A recuperação das amostras foi realizada utilizando

como solventes: hexano, clorofórmio, diclorometano, acetona e metanol, puros e/ou

em misturas binárias.

Reveladores: A revelação das faixas foi efetuada sob luz ultravioleta em 254 e

366 nm, por meio do uso de solução de vanilina, reagente de Dragendorff e reagente

de Kedde.

4.2. Equipamentos

Os espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) foram realizados no

Depatamento de Química da Universidade Federal do Paraná (UFPR) em

colaboração com o Prof. Dr. Andersson Barison registrados em aparelhos Bruker

Avance DRX-400 operando a 600 MHz para RMN de 1H e 150 MHz para RMN de

83 13C. As amostras foram solubilizadas em clorofórmio deuterado (CDCl3). Os

deslocamentos químicos estão expressos em ppm (δ) e as multiplicidades dos sinais

indicadas segundo a convenção: s (simpleto), sl (simpleto largo), d (dupleto), dd

(duplo dupleto), ddd (duplo duplo dupleto), dddd ( duplo duplo duplo dupleto), dl

(dupleto largo), dm (duplo multipleto), t (tripleto) e tl (tripleto largo). As constantes de

acoplamento (J) foram registradas em Hertz (Hz).

4.3. Material Botânico

4.3.1. Coleta e identificação do material botânico

Folhas e ramos de A. leptopetala foram coletados no Reservatório Copiti,

coordenadas [08° 14’ 98,5’’S – 37°42’ 46,9’’ W], no município de Custódia-PE, em

abril de 2014. O material vegetal foi identificado por André Paviotti Fontana, botânico

e analista ambiental do Programa de Conservação de Fauna e Flora/PCFF da

Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF). Uma exsicata do

material em estudo foi depositada no Herbário do Trópico do Semiárido (HTSA) –

Embrapa Semiárido, com número de tombo HTSA 6184.

4.3.2. Processamento do material vegetal

Após a coleta, os ramos e as folhas foram separados e colocados para secar em

estufa com ar circulante a 40 °C por 72 horas, a fim de garantir a estabilização da

droga vegetal, sendo após esse período, triturados em moinho de facas.

4.4. Obtenção dos extratos

Os ramos e as folhas de A. leptopetala após secos, moídos e pesados, foram

separadamente, submetidos à extração exaustiva a frio pelo método de maceração,

utilizando solventes em ordem crescente de polaridade (hexano e metanol) com

renovação do solvente em intervalo de 72 horas. Os resíduos remanescentes de

cada extrato foram desprezados (ESQUEMA 1). As soluções extrativas resultantes

foram concentrados em evaporador rotativo à pressão reduzida, a uma temperatura

entre 40-50oC, e, em seguida secos em dessecador. Após completa secagem e

cálculo dos rendimentos obtidos, pequenas quantidades (100 mg) dos extratos

foram reservadas para a realização de ensaios biológicos.

.

84

Esquema 1- Fluxograma de obtenção dos extratos.

Extração com metanol P.A

01 extração/72h (total = 05 extrações)

Filtração e concentração do solvente

Ramos (213,3g)

Extrato hexânico – Ramos (EHR)

m=2,29g (1,07%)

Extrato hexânico - Folhas (EHF)

m= 12,17g (5,81%)

Torta

Extrato metanólico - Ramos (EMR)

m= 24,19g (11,3%)

Resíduo

desprezado

Extração com hexano

01 extração/72h (total = 05 extrações)

Filtração e concentração do solvente

Folhas (209,4g)

Extrato metanólico - Folhas (EMF)

m= 53,31g (25,4%)

85

4.5. Prospecção fitoquímica

Na análise fitoquímica preliminar com o intuito de investigar as possíveis classes

de metabólitos secundários presentes nos extratos EHF, EHR, EMF e EMR foram

empregados testes qualitativos preconizados por Wagner & Bladt (1996). Para isto,

foi utilizada a CCDA, sistemas de eluição de acordo com cada classe de metabólito

investigada, reveladores específicos e irradiação ultravioleta. Nessa prospecção as

seguintes classes foram investigadas: alcaloides, estilbenos, compostos fenólicos,

cumarinas, flavonoides, lignanas, mono e sesquiterpenos, naftoquinonas, saponinas,

taninos condensados, taninos hidrolisáveis, triterpenos, esteroides e xantinas.

4.6. Avaliação da atividade antioxidante in vitro

4.6.1. Ensaio para avaliação da redução do radical DPPH

A atividade antioxidante foi determinada através da capacidade dos

antioxidantes presentes nas amostras em sequestrar o radical estável DPPH• (2,2-

difenil-1-picrilidrazil) pelo método espectrofotométrico segundo Mensor et al. (

2001). Neste ensaio a atividade foi mensurada através da medida do decréscimo da

absorbância de soluções em diferentes concentrações, em espectrofotômetro UV-

Vis no comprimento de onda de 518 nm, tendo como controle positivo o padrão

ácido ascórbico, butilhidroxianisol (BHA) e butilhidroxitolueno (BHT).

As amostras-teste submetidas ao ensaio foram os extratos EHF, EHR, EMF e

EMR. Foi preparada uma solução etanólica de DPPH• a 50 µg.mL-1 e soluções

estoque de 1 mg.mL-1 em etanol para os padrões (BHA, BHT e ácido ascórbico) e

extratos (amostras-teste), a partir das soluções-estoque foram realizadas diluições,

obtendo-se as concentrações de 243, 81, 27, 9,3 e 1 µg.mL-1 em etanol.

Para efetuar as leituras, adicionou-se em cada cubeta 1,0 mL da solução de

DPPH• e 2,5 mL de etanol para o controle, ou o mesmo volume para as soluções

padrão e soluções das amostras-teste, nas diferentes concentrações. Decorridos 30

minutos de reação, foram tomados os valores de absorbância em triplicata.

86

Etanol foi usado para calibrar o espectrofotômetro, tendo como branco as

soluções testes de cada extrato sem adição do DPPH, visando minimizar a

interferência de componentes dos extratos na leitura. Os resultados foram expressos

como média (coeficiente de variação percentual CV%) e concentração eficiente CE50

(µg.mL-1), utilizando o programa GraphPad Prism 6.

O decaimento da absorbância das amostras (Absam) correlacionado ao

decaimento da absorbância do controle (Absc) resulta na porcentagem de sequestro

de radicais livres (% SRL), que pode ser expressa através da equação.

% SRL = 100 – {[(Absam – Absbranco) x 100]/Absc}.

4.6.2. Determinação da atividade antioxidante por meio do sistema de co-oxidação

β-caroteno/ácido linoleico.

A capacidade dos extratos de A. leptopetala em prevenir a oxidação do β-

caroteno foi avaliada de acordo com metodologia descrita por Wannes et al. (2010),

com adaptações segundo Duarte-Almeida et al. (2006). Para este ensaio foram

avaliadas as seguintes amostras EHF, EHR, EMF, EMR, FNF e FNR (fase neutra

das folhas e ramos), FALCF e FALCR (frações alcaloídicas das folhas e ramos).

Para o preparo da mistura reativa, adicionou-se 44 μL de ácido linoleico e 380 μL

de Tween 40 a 2 mL de solução de β-caroteno a 0,2 mg.mL-1 em clorofórmio.

Posteriormente, a mistura foi submetida à completa evaporação do clorofórmio sob

vácuo a 40 °C. A esta mistura isenta de clorofórmio, adicionou-se cerca de 100 mL

de água destilada, em seguida promoveu-se a aeração do meio por dois minutos.

As soluções das amostras-teste e dos padrões (ácido ascórbico, BHA e BHT)

foram preparadas em etanol P.A na concentração de 1 mg.mL-1. Para determinar as

absorbâncias, em cada cubeta foram adicionados 3 mL desta mistura reativa e 120

μL de etanol (controle) ou o mesmo volume para as soluções padrão ou extratos das

amostras.

Leituras iniciais das absorbâncias foram realizadas em 470 nm e, em seguida as

cubetas foram incubadas a 45 °C para acelerar as reações de oxidação e iniciar o

descoramento do β-caroteno. Foram realizadas quatro leituras de absorbância em

87

espectrofotômetro, com intervalo de 30 minutos entre cada leitura, totalizando 120

minutos de análise.

As percentagens de inibição da oxidação foram calculadas a partir do

decaimento da densidade ótica (A0) do controle, sendo (A00− At

0) considerando como

100% de oxidação. Assim, a queda na leitura da densidade ótica das amostras-

teste em relação ao controle estabeleceu a porcentagem de inibição da oxidação (%

I), subtraindo-se a percentagem de oxidação de cada extrato de 100%, através da

equação. Além da verificação da ação antioxidante das amostras-teste, foram

concomitantemente mensuradas a atividade antioxidante dos padrões sintéticos

BHT, BHA e AA para efeito comparativo.

%I = 1−(A0− At)/ (A00− At

0) ×100

Onde, A0 corresponde a absorbância inicial e At a absorbância final medida para

a amostra de teste, enquanto A00 e At

0, tratam-se da absorbância inicial e

absorbância final medida para o controle negativo (branco).

Os resultados foram expressos como porcentagem de inibição da oxidação (% I),

referente à concentração de 200 mg.mL-1. Foi estabelecida essa concentração, para

fins de comparação com os padrões sintéticos, visto que a legislação brasileira

estabelece esta concentração, como limite de adição do antioxidante sintético em

alimentos (NASCIMENTO et al., 2010). Os testes foram realizados em triplicata,

acompanhados por um controle sem antioxidante. Os resultados referem-se à média

de três determinações.

4.6.2.1. Estudo cinético da atividade antioxidante no sistema β-caroteno/ácido

linoleico

A eficiência da atividade antioxidante dos extratos foi estimada pelo método das

tangentes descrito por Yanishilieva e Marinova (1995) e modificado por Moreira

(1999) e Moreira e Mancini-Filho (2003) em duas partes das curvas cinéticas obtidas

na realização da atividade antioxidante em sistema β-caroteno/ácido linoleico das

amostras ensaiadas.

Na primeira parte da curva (entre 0 e 30 minutos, após o início da reação), foi

medida a eficiência do antioxidante de bloquear a reação em cadeia através da

88

interação com os radicais peróxidos. Essa eficiência é medida pela relação entre as

tangentes das curvas cinéticas das amostras (meio de reação mais o extrato) e o

controle sem antioxidante, sendo os valores obtidos denominados fator 1 (F1):

F1 = tangente do extrato (0-30)

tangente do controle(0-30)

Na segunda parte da curva (entre 60 e 120 min) foi medida a possibilidade de o

antioxidante participar de outras reações (degradação de peróxidos) durante o

processo oxidativo. Essa medida é obtida pela relação entre as tangentes das

curvas cinéticas das amostras (meio de reação mais o extrato) e o controle sem

antioxidantes. Os valores encontrados foram denominados de fator 2 (F2):

F2 = tangente do extrato (60-120)

tangente do controle (60-120)

4.7. Determinação de fenóis totais (FT)

A quantificação espectrométrica de compostos fenólicos é realizada por meio de

uma variedade de técnicas, todavia, a que utiliza o reagente de Folin-Ciocalteu

figura entre as mais extensivamente utilizadas (NACZK, SHAHIDI, 2004; BONOLI et

al., 2004; ROGINSKY, LISS 2005). O reagente consiste da mistura dos ácidos

fosfomolíbdico e fosfotúngstico, no qual o molibdênio e o tungstênio encontram-se

no estado de oxidação 6+ porém, em presença de certos agentes redutores, como

os compostos fenólicos, formam-se os chamados molibdênio azul e tungstênio azul,

nos quais a média do estado de oxidação dos metais está entre 5 e 6 e cuja

coloração permite a determinação da concentração das substâncias redutoras, que

não necessariamente precisam ter natureza fenólica (NACZK, et al., 2004).

Os extratos submetidos à quantificação de fenóis totais foram EHF, EHR, EMF e

EMR. O conteúdo de compostos fenólicos totais foi medido em triplicata para cada

extrato, conforme o método de Slinkard e Singleton (1977), com adaptações

89

propostas por Almeida et al. (2011a), usando o reagente de Folin-Ciocalteu e

soluções-padrão de ácido gálico na faixa de concentração de 50-1000 mg.L-1 em

etanol em meio básico, proporcionado pela adição de solução de carbonato de

sódio. As soluções das amostras-teste foram submetidas ao mesmo procedimento.

As leituras das absorbâncias em função da concentração foram feitas em

espectrofotômetro UV-VIS Quimis em 765 nm. O teor de fenóis totais, expresso em

mg de equivalentes de ácido gálico por grama de amostra (mg EqAG/g), foi

calculado por interpolação da absorbância das amostras contra uma curva de

calibração do ácido gálico, obtida a partir da equação da reta por regressão linear,

descrita abaixo:

A = 0,0012C – 0,0579, R2= 0,9926

Onde

A, representa a medida da absorbância, C a concentração de equivalentes de ácido

gálico e R o coeficiente de correlação.

Para tanto, foram preparadas soluções estoque de 5000 ppm dos extratos e do

padrão ácido gálico. As amostras foram dissolvidas em um volume de etanol

correspondente a 10% do volume final e em seguida completadas com água

destilada. Estas soluções foram posteriormente diluídas com água em seis novas

concentrações (50, 100, 150, 250, 500 e 1.000 mg.L-1). Alíquotas de 40 μL de cada

concentração foram adicionadas em cubetas de vidro com 1 cm de caminho óptico,

juntamente com 3,16 mL de água destilada, 200 μL do reagente de Folin-Ciocalteu e

depois de um intervalo de aproximadamente 8 minutos, 600 μL da solução de

carbonato de sódio a 20% preparada no dia anterior, foi adicionada. Após a adição

de todos os reagentes, o conteúdo total de todas as cubetas foi homogeneizado.

Decorridos duas horas de reação à temperatura ambiente, foram realizadas leituras

em espectrofotômetro em 765 nm. O branco desta análise foi preparado sob as

mesmas condições das demais amostras sendo o volume destas substituído por

água destilada.

90

4.8. Determinação do teor de flavonoides totais (FVT)

O conteúdo total de flavonoides foi determinado usando método colorimétrico

previamente descrito por Eberhardt et al. (2000), Zhishen et al.(1999) e adaptado por

Dewanto et al. (2002), com adequações. Para isto, foram empregadas soluções-

padrão de catequina na faixa de concentração de 50-1.000 mg.L-1, sendo adotadas

as mesmas concentrações para as amostras-teste, preparadas de acordo com o

método anterior, exceto pelo solvente, pois neste foi empregado metanol. Em

alíquotas de 0,30 mL de cada amostra, nas diferentes concentrações, foi adicionado

1,50 mL de água, homogeneizou-se bem, em seguida adicionou-se 90 µL de

solução de NaNO2 a 5%. Após 6 minutos, 180 µL de solução de AlCl3.6H2O a 10%

foi adicionada, a mistura permaneceu em repouso por cinco minutos, e logo após,

acrescentou-se 600 µL de NaOH 1,0 mol.L-1. Ao final adicionou-se 330 µL de água

destilada, homogeneizando-se bem a mistura. A absorbância foi medida

imediatamente, frente ao branco em 510 nm em espectrofotômetro UV-VIS Quimis

comparando-se as absorbâncias para as concentrações do padrão catequina. Os

resultados foram expressos como média (micrograma de equivalente de catequina

por grama de amostra-mg EqC/g).

A técnica baseia-se na medida da absorbância em 510 nm, do complexo

formado entre o flavonoide e o alumínio do reagente de cor, formando compostos de

coloração amarelada (SOUSA DE SÁ et al., 2012).

O teor de flavonoides foi calculado a partir da equação da curva de calibração da

catequina, obtida por regressão linear abaixo.

A = 0,0019C + 0,0781, R2= 0,9938

Onde

A representa a absorbância, C a concentração de equivalente de catequina e R o

coeficiente de correlação.

91

4.9. Extração das bases (alcaloides) presentes nos extratos metanólicos (EM).

Nos ensaios de prospecção fitoquímica houve indícios da presença de alcaloides

mediante uso do reagente de Dragendorff, nos extratos metanólicos de folhas e

ramos, EMF e EMR, respectivamente. Estes então foram submetidos,

separadamente, à extração ácido-base de acordo com metodologia proposta por

Costa et al. (2006). Primeiramente, cada extrato foi ressolubilizado em

diclorometano (CH2Cl2). A solução extrativa diclorometânica resultante, tanto das

folhas como dos ramos, foi sucessivamente extraída com solução de ácido clorídrico

a 3% v/v, obtendo-se duas fases: a fase aquosa ácida (FAA) e a fase

diclorometânica neutra (FN), sendo a mesma reservada. A FAA foi basificada com

hidróxido de amônio concentrado (NH4OH) até pH 12 e extraída sucessivas vezes

com CH2Cl2, levando a duas novas fases: a fase de alcaloides totais (FALC) e a fase

aquosa básica (FAB) que foi desprezada (Esquema 2). A fase de alcaloides totais

(FALC) e a fase neutra (FN) das folhas e dos ramos, foram submetidas a testes de

atividade biológica, além de ensaio de atividade antioxidante discriminados no

Esquema 2.

92

Esquema 2 - Marcha ácido-base para extração de alcaloides.

Extrato metanólico –

Folhas (EMF) 43,8 g

Solução diclorometânica

HCl a 3%

Fase neutra

- Folhas (FNF) 4,0 g

(9,3%)

- Ramos (FNR) 1,16 g

(2,95%)

?? (ramos)- FNR

Fase aquosa ácida

(FAA)

NH4OH (pH 12)

Solubilizado

CH2Cl2

Fase aquosa

básica

(Desprezada)

Fase alcaloides totais (FAT)

- Folhas (FALCF) 94,4 mg

(0,21%)

- Ramos (FALCR) 90,0 mg

(0,23%)

Extrato metanólico – Ramos (EMR) 39,2 g

CH2Cl2

Dragendorff

CHCl3/MeOH

(95:5)

Ensaios

Citotoxicidade

Antibacteriano

Antioxidante

(-caroteno)

93

4.10. Fracionamento do extrato hexânico das folhas (EHF)

Uma parte do EHF (8 g) foi submetido ao fracionamento por meio de uma coluna

cromatográfica (CC, x h de 5 x 60 cm) de sílica gel 60 com 0,063-0,200 mm (70-

230 mesh) e eluída com hexano, tolueno, clorofórmio e metanol puros, em ordem

crescente de polaridade, obtendo-se 207 frações de aproximadamente 10 mL cada

(Esquema 3). As frações obtidas foram analisadas por CCDA e as que

apresentaram padrão de similaridade e/ou mesmo Rf foram reunidas.

Extrato hexânico (EHF) – (8 g)

CC em sílica gel 60

Fr. 1-4

Hexano

Fr. Hexano:Tolueno

5-17 (50:50)

18-36 (30:70)

37-45 (15:85)

Fr. –Tolueno:CHCl3

55-63- (90:10)

64-72- (70:30)

73-81- (50:50)

Fr. 46-54

Tolueno 100 %

Fr. 82-90

CHCl3

Fr. CHCl::MeOH

91-110 (97:3)

111-148 (95:5)

149-158 (93:7)

159-167 (90:10)

168-174 (80:20)

175-181 (70:30)

182-192 (50:50)

Fr. 193-207

MeOH

Esquema 3.- Série eluotrópica do fracionamento cromatográfico de EHF.

94

Tabela 5 - Relação dos grupos de frações do extrato hexânico das folhas de A. leptopetala (EHF) e revelação com o reagente de Dragendorff.

Grupo de frações Frações Rendimento (mg) Dragendorff

G1 1-7 20,3 -

G2 8-34 1080,0 ++

G3 35-43 36,4 -

G4 44-52 22,9 -

G5 53-63 31,9 -

G6 64-79 26,9 +

G7 80-98 168,0 +

G8 99-125 90,8 +

G9 126-143 182,0 ++

G10 144-146 51,3 -

G11 147-152 263,0 I

G12 153-174 3700,0 I

G13 175-182 484,0 -

G14 183-188 35,8 -

G15 189-205 99,0 -

I: resultado indefinido.

4.10.1. Estudo cromatográfico de G2

No Esquema 4 é descrito o procedimento de estudo fitoquímico de G-2 (1,08 g),

que resultou no isolamento das amostras codificadas a seguir, SBF D1, SBF- D2,

SBF-D3 e SBF II-(3), essas amostras foram submetidas à analise de RMN de 1H e

13C.

95

Revelações

G2

m= 915,5 mg

CLV (Cromatografia líquida sob vácuo)

Sub-fração 1

100%

Hexano

m = 15,0 mg

Sub-fração 2

Hexano:CH2Cl2

(1:1)

m = 107,7 mg

Sub-fração 3

100% CH2Cl2

m = 75,8 mg

Sub-fração 4

CH2Cl2:MeOH

(1:1)

m = 504,0 mg

Sub-fração 5

100% MeOH

m = 21,9 mg

Sistema: 100% CHCl3

SBF-1 SBF2 SBF3 SBF4 SBF5 SBF6

Kedde

SBF-1 SBF2 SBF3 SBF4 SBF5 SBF6

UV 254

SBF2 SBF3

Kedde Vanilina

SBF2 SBF3 SBF2 SBF3

CCDP

SBF2

m = 86,8 mg

Sistema: 100%

CHCl3

CCDP

SBF3

m = 75,8 mg

SBF II -3

m = 20,3 mg

(CITO – RMN)

SBF D-1 m = 32,0 mg (CITO –RMN) SBF D-2 m = 19,7 mg (CITO – RMN) SBF D-3 m = 11,0 mg (RMN)

Kedde

D1 D2 D3 D1 D2 D3

UV 254

D1 D2 D3 SBF II 3

Análise comparativa dos

compostos isolados.

Esquema 5 - Estudo cromatográfico de G2.

Dragen.

IV III II I

96

4.11. Estudo fitoquímico da fase alcaloídica das folhas (FALCF)

A fase alcaloídica das folhas (94,4 mg), sob revelação com reagente de

Dragendorff, apresentou forte indício da presença de alcaloides. Devido à pequena

quantidade de amostra (45,4 mg), esta foi submetida à cromatografia em camada

delgada preparativa (CCDP), para fins de purificação, empregando-se como sistema

de eluição CHCl3:MeOH (95:5). O fracionamento dos componentes na placa foi

guiado com base nas bandas de absorção visualizadas sob radiação UV em 365 e

254 nm. As subfrações resultantes desta separação, depois de extraídas em

acetona e filtradas, foram analisadas por CCDA, a fim de observar o perfil de

purificação. A partir dessa análise foram selecionadas as amostras codificadas como

ALC4 (1,7 mg), ALC6 (2,0 mg), ALC7 (2,1 mg), ALC8 (4,8 mg), ALC9 (2,7 mg),

ALC10 (3,0 mg) e ALC12 (1,6 mg) e encaminhadas para análise de RMN de 1H e

13C. O esquema 6 descreve o processo de obtenção das amostras.

97

Esquema 6 - Estudo fitoquímico da fração alcaloídica das folhas (FALCF).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 15 16 17 PA

1 2

3

4

5

6

7

8

9 11

12

15

16

17 PA

Visualização sob luz UV

RMN 1H e 13C

Filtração a vácuo

Visualização sob luz UV

Dragendorff

10

14

CCDP

CCDP

CCDA

CCDA

98

4.12. Ensaio para a atividade antibacteriana

Para a execução dos bioensaios foram utilizados os seguintes microorganismos:

Staphylococcus aureus ATCC (American Type Culture Collection) 25923 e

Enterococcus faecalis (ATCC 19433), Escherichia coli (ATCC 25922), Klebsiella

pneumoniae (ATCC 13883), Salmonela enterica (ATCC 10708), Serratia marcescens

(ATCC 13880), Shigella flexneri (ATCC 12022), obtidas do Instituto Nacional de

Controle de Qualidade em Saúde (INCQS/Fiocruz-Brasil). A ação antibacteriana foi

determinada pelo método da microdiluição (SANTOS et al., 2012), como

recomendado pelo The National Committee for Clinical Laboratory Standards (CLSI,

2003).

Para a preparação do inóculo, no dia anterior ao teste, foram realizados repiques

das bactérias a serem avaliadas em meio de cultura ágar Müeller-Hinton, contidas

em placas de Petri. Após isso, as placas inoculadas foram mantidas em estufa a 37

°C por 24 h para desenvolvimento bacteriano.

Decorrido 24 h, alíquotas das bactérias cultivadas foram transferidas,

individualmente, para tubos de ensaio contendo solução salina a 0,9% de modo a se

obter suspensões com 5x106 UFC.mL-1. Posteriormente, 100 µL da suspensão de

cada bactéria foram transferidos para tubos de ensaio contendo 9,90 mL de caldo

Müeller-Hinton, obtendo-se assim, inóculo com 5x105 UFC.mL-1, correspondendo a

0,5 na escala de McFarland. Realizado este procedimento, 10 µL do inóculo foram

adicionados em cada poço, proporcionando a análise de cada bactéria frente a todos

os extratos e fases testadas.

Nesse teste as amostras ensaiadas foram os extratos hexânicos e metanólicos

das folhas e dos ramos EHF, EHR, EMF e EMR, além da fração G-2, oriunda do

EHF e das frações alcaloídicas FALCF e FALCR e suas respectivas fases neutras,

provenientes do tratamento ácido-base. Inicialmente foram preparadas soluções-

estoque de 10 mg.mL-1 para os extratos, as fases e a fração G2, e de 3,33 mg.mL-1,

para as frações alcaloídicas, utilizando uma solução aquosa de DMSO a 20% (v/v).

Numa placa de 96 poços de microdiluição estéril, foi adicionada uma alíquota de

100 L do caldo Müeller-Hinton por poço, seguido de 100 μL das soluções-estoque,

referente a cada extrato, fase e fração. Logo após, diluições seriadas foram

realizadas e as concentrações resultantes para os extratos, as fases e a fração G2

99

foram de 5,0; 2,5; 1,25; 0,625 e 0,312 mg.mL-1, enquanto para as frações

alcaloídicas foram de 1,66; 0,83; 0,41; 0,20; 0,10 e 0,05 mg.mL-1. Ao final, adicionou-

se 10 μL da suspensão de microrganismos com turvação equivalente ao padrão 0,5

da escala de McFarland. As microplacas foram incubadas sob condições de

aerobiose durante 24 h a 37 °C. Decorrido o período de incubação, 10 µL de cloreto

de 2,3,5-trifenil-tetrazólio (CTT) a 2% foram adicionados a cada poço para a

detecção de mudança de cor do CTT (incolor) para vermelho, que reflete o

metabolismo bacteriano ativo.

O efeito da ação antibacteriana foi mensurado como concentração inibitória

mínima (CIM), correspondendo à menor concentração onde se observava a

presença de inibição do desenvolvimento microbiano conforme Salvador et al.

(2002). Para verificar o efeito biocida ou não e expressá-lo na forma de

concentração bactericida mínima (CBM), alíquotas de 10 μL foram retiradas de cada

um dos poços do ensaio anterior contendo as amostras de teste e transferidas com

o auxílio de um replicador para placas de Petri com ágar Müeller-Hinton. As placas

foram incubadas durante 24 horas a 37 °C, em seguida foi verificado o efeito

bactericida das drogas-testes, sendo considerada como CBM, a menor

concentração que impediu o crescimento bacteriano em 99,9%. Como controle

negativo foi utilizado o diluente DMSO/água estéril a 20%, além do controle do

inoculo e do controle do meio de cultura. Os resultados foram expressos em termos

de CIM (mg.mL-1). Os experimentos foram realizados em triplicata, para cada cepa

indicadora utilizada.

4.13. Avaliação da atividade citotóxica

Neste trabalho a atividade citotóxica das amostras foi avaliada mediante dois

ensaios com linhagens celulares diferentes, tendo ambos como parâmetro a

conversão de um determinado sal por via enzimática.

4.13.1. Ensaio da atividade citotóxica in vitro pelo método do MTT

Este ensaio teve como objetivo avaliar a citotoxicidade in vitro das amostras-

testes frente a três linhagens tumorais humanas. Essa análise faz parte de uma

100

estudo preliminar acerca do potencial citotóxico destas amostras através do método

MTT, proposto por Mossman et al. (1983), o qual tem a capacidade de analisar a

viabilidade e o estado metabólico da célula. É uma análise colorimétrica baseada na

conversão do sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2H-brometo de tetrazólio (MTT)

em azul de formazan, a partir de enzimas mitocondriais presentes somente nas

células metabolicamente ativas. O estudo citotóxico pelo método do MTT permite

definir facilmente a citotoxicidade, mas não o mecanismo de ação (BERRIDGE et al.,

1996).

As linhagens de células tumorais humanas empregadas nos ensaios foram SF-

295 (glioblastoma), HL-60 (leucemia) e HTC-116 (colo retal), foram cedidas pelo

Instituto Nacional do Câncer (EUA). Tendo sido cultivadas em meio RPMI 1640,

suplementados com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos, mantidas em

estufa a 37 °C e atmosfera contendo 5% de CO2.

As drogas-teste avaliadas segundo método MTT foram as seguintes: fase neutra

ramos (FNR), fase neutra folhas (FNF), fração de alcaloides totais folhas (FALCF),

fração de alcaloides totais ramos (FALCR), extrato metanólico das folhas (EMF),

extrato metanólico dos ramos (EMR), extrato hexânico dos ramos (EHR), extrato

hexânico das folhas (EHF), fração G2 e suas subfrações, correspondentes aos

compostos isolados (SBF-II-3), SBF-D1 e SBF-D2. As amostras foram diluídas em

DMSO P.A. estéril e testadas na concentração única de 50 μg.mL-1.

As linhagens celulares utilizadas foram plaqueadas nas concentrações de 0,7 x

106 céls.mL

-1 (HCT-116), 0,3 x 10

6 céls.mL

-1 (HL-60) e 0,1 x 10

5 céls.mL

-1 (SF-295).

As placas foram incubadas por 72 horas em estufa a 5% de CO2 a 37 °C. Ao término

deste, as mesmas foram centrifugadas e o sobrenadante foi removido. Em seguida,

foram adicionados 150 µL da solução de MTT (sal de tetrazólio), e as placas foram

incubadas por 3 h. A absorbância foi lida após dissolução do precipitado com 150 µL

de DMSO puro em espectrofotômetro de placa em 595 nm.

Os experimentos foram analisados segundo a média ± desvio padrão da média

(DPM) da porcentagem de inibição do crescimento celular usando o programa

GraphPad Prism. Cada amostra foi testada em triplicata em dois experimentos

independentes.

101

Esses testes foram realizados no laboratório de Oncologia Experimental do

Curso de Medicina da Universidade Federal do Ceará, com a colaboração da Profª

Marcília Costa e da Prof.ª Cláudia Pessoa.

Para ambos os testes de citotoxicidade in vitro uma escala de intensidade foi

utilizada para avaliar o potencial citotóxico das amostras testadas. Amostras sem

atividade (SA), com pouca atividade (PA, inibição de crescimento celular variando de

1 a 50%), com atividade moderada (MO, inibição de crescimento celular variando de

50 a 75%) e com muita atividade (MA, inibição de crescimento variando de 75 a

100%).

4.13.2. Ensaio de citotoxicidade frente a células da linhagem sarcoma S-180

Células da linhagem sarcoma S-180, mantidas em cultura in vivo, foram

utilizadas para o ensaio antitumoral in vitro. As células foram retiradas do peritônio

de animais portadores do tumor ascítico (desenvolvidos por 7 dias) com auxílio de

seringa estéril. O líquido peritoneal (2 mL) foi transferido para tubo de centrífuga de

15 mL (BD/Labware®) e a ele foram adicionados 8 mL de solução tampão fosfato

(PBS). Após centrifugação (1.200 rpm por 3 minutos), o sobrenadante foi

desprezado e as células ressuspensas em meio RPMI-1640 (Nutricell®)

suplementado com 25 mM de HEPES, 2 mM L-glutamina, 100 UI/mL de penicilina,

100 µg/mL de estreptomicina (Sigma-Aldrich®) e 10% de soro fetal bovino

(Nutricell®).

Para avaliar a viabilidade das células tumorais, utilizou-se uma alíquota de 5 µL

da suspensão celular aos quais foram adicionados 45 µL de azul de Tripan (Sigma-

Aldrich®) (0,4%). A suspensão resultante foi observada em câmara de Neubauer sob

microscopia óptica.

Após a avaliação da viabilidade celular, as células tumorais foram plaqueadas

a uma densidade de 1 x 105 células/poço em placas de 96 poços (BD/Labware®) e

incubadas por 4 horas a 37 °C. Após esse período adicionou-se 100 µL das

soluções testes na concentração de 50 µg.mL-1 para os extratos e de 5 µg.mL-1 para

os compostos puros, solubilizados em meio de cultura.

O ensaio de citotoxicidade utilizado na triagem farmacológica foi o de redução

do 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenill)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio

102

(MTS) e um agente acoplador de elétrons, o metasulfato de fenanzina (PMS)

(Promega®).

Nesse teste foram avaliadas as mesmas amostras do ensaio anterior, exceto a

amostra SBF-II-3. As análises foram realizadas em triplicata e os resultados

expressos como percentual de inibição de crescimento celular (%IC). Essas análises

foram conduzidas no Laboratório de Oncologia Experimental da Universidade

Federal do Vale do São Francisco, em parceria com a Prof.ª Rosemairy Mendes.

O MTS é um corante amarelo, que é bioreduzido por células que mantém a

integridade mitocondrial para um composto roxo (formazan), solúvel em solução

aquosa o qual pode ser determinado por leitura espectroscópica de ultravioleta.

Dessa forma, a redução do sal tetrazólio MTS para um produto formazan, pela

enzima mitocondrial succinato desidrogenase é muito utilizado em ensaios de

avaliação de sobrevivência e proliferação celular, uma vez que somente as células

metabolicamente ativas conseguem reduzir o MTS (amarelo) para o formazan (roxo),

sendo assim, a quantidade de formazan produzido é diretamente proporcional ao

número de células viáveis presentes no meio.

O ensaio de redução do sal tetrazólio foi realizado como descrito por Melo e

colaboradores (2003). A partir da placa de 96 poços com as células sob 24 horas de

tratamento retirou-se uma alíquota de 20 µL de cada poço e então se adicionou 20

µL de MTS (5 mg.mL-1) em cada poço e posteriormente as placas foram submetidas

a agitação em agitador de microplacas Biomax®, e incubadas por 3 horas a 37 °C. A

absorbância foi mensurada a 492 nm em leitora de microplacas Thermoplate®. Os

testes foram realizados em triplicata e expressos na forma de percentual de inibição

celular, calculado a partir da fórmula:

Onde:

Abs. células tratadas = Absorbância dos poços com as amostras teste.

Abs. branco = Absorbância dos poços contendo apenas o meio de cultura e MTS.

Abs. controle negativo = Absorbância dos poços contendo a suspensão celular e

sem tratamento.

Inibição do crescimento = (Abs. controle negativo - Abs. células tratadas - Abs. branco)

(Abs. controle negativo - Abs. branco) x 100

NH

O

O

H

1

23

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

1

23

3b

3a

4

5

6a

77a

8

9

10

11

11a

1a

OH

NH

O

O

H

OCH3

1

2

3

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

NH

H

H3CO

H3CO

1

2

3 4

5

6a NH

H3CO

OH

3a

3b

7

7a

8

9

10

11

11a

1aH3CO

H3CO

OH H

H

H

H

12

3

4

5

6

7

8

910

15

13

12

14

11

5. Resultados e discussão

104

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Prospecção fitoquímica

Através da análise fitoquímica preliminar dos extratos, segundo metodologia

preconizada por Wagner e Bladt (1996), foi possível identificar as principais classes

de metabólitos secundários presentes nos extratos, as quais se encontram

sumarizadas na Tabela 6.

Tabela 6 - Prospecção fitoquímica dos extratos de A. leptopetala.

Classe Química EMR EMF EHF EHR

Estilbenos - ++ ++ -

Cumarinas - ++ ++ -

Flavonoides (aglicona) ++ ++ + +

Lignanas + ++ - -

Mono e sesquiterpenos + + +++ ++

Naftoquinona - - - -

Saponina + ++ - -

Taninos hidrolisáveis + + - -

Triterpenos e esteroides ++ ++ ++ +

Compostos Fenólicos ++ +++ + +

Taninos condensados ++ - - -

Alcaloides + + - -

Xantina + + - -

Os critérios foram estabelecidos com base na intensidade da pigmentação das substâncias nas placas, frente aos eluentes e reveladores específicos, em que (+) equivale à presença do constituinte em menor concentração, (++) em concentração moderada, (+++) em maior concetração e (-) ausência do constuinte químico.

O estudo preliminar, embora seja apenas uma análise simples e qualitativa,

fornece bons indícios dos possíveis metabólitos presentes em extratos vegetais.

Algumas das classes apontadas por esta triagem podem ser confirmadas por dados

da literatura, como flavonoides, lignanas, mono e sesquiterpenos, compostos

105

fenólicos e alcaloides. No estudo realizado por Ragasa et al. (2013) foi reportado o

isolamento de vários esteroides e triterpenos no extrato diclorometânico dos frutos

de A. squamosa. Vega et al. (2007) descrevem o isolamento de flavonoides obtidos

a partir de A. dioica, e lignanas foram isoladas de A. squamosa (YANG et al., 2005).

O isolamento de quatro alcaloides das folhas de A. leptopetala, neste estudo,

confirma a presença dessa classe química na espécie.

Muitas vezes, devido ao caráter inespecífico do teste, algumas classes resultam

em falso positivo, ou mesmo devido à intensa complexidade da matéria-prima e

pigmentação, também podem levar a resultados falso-negativos. Esses resultados

foram considerados na escolha dos extratos submetidos ao estudo fitoquímico.

5.2. Isolamento e determinação estrutural dos compostos de A. leptopetala.

A partir do estudo fitoquímico de A. leptopetala foi possível isolar do extrato

hexânico das folhas quatro compostos (SBF II-3, SBF-D1, SBF-D2 e SBF D-3).

Destes, apenas a substância SBF II-3 foi identificada como sendo o sesquiterpeno

oxigenado espatulenol. Os demais apontam características de natureza terpênica.

Da fase alcaloídica das folhas foi possível identificar quatro alcaloides aporfínicos,

sendo três obtidos da fração ALC8, designados como anonaina (ALC8-S1),

norannuradapurina (ALC8-S2) e nornuciferina (ALC8-S3) e o quarto alcaloide

isolado, codificado como ALC4, identificado como laurotetanina.

Com exceção da anonaina, a presença desses alcaloides em A. leptopetala é

reportada pela primeira vez neste estudo, bem como os dados de RMN de 13C para

norannuradapurina, com base em experimentos de RMN-2D.

A seguir são mostradas as estruturas das substâncias isoladas das folhas de A.

leptopetala (Figura 14).

106

Figura 14: Estruturas dos compostos isolados das folhas de A. leptopetala.

NH

O

O

H

1

23

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

1

2

3

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

NH

H

H3CO

H3CO

1

23

3b

3a

4

5

6a

77a

8

9

10

11

11a

1a

OH

NH

O

O

H

OCH3

Anonaina Nornuciferina Norannuradapurina

1

2

3 4

5

6a NH

H3CO

OH

3a

3b

7

7a

8

9

10

11

11a

1aH3CO

H3CO

OH H

H

H

H

12

3

4

5

6

7

8

910

15

13

12

14

11

Laurotetanina Espatulenol

107

5.2.1. Identificação dos alcaloides presentes em ALC8 (ALC8-S1, ALC8-S2 e ALC8-

S3).

A amostra codificada como ALC8 (4,8 mg), apresentou-se como um sólido

amorfo marrom. Através do espectro de RMN de 1H (600 MHz, CDCl3) (Figura 16) e

do mapa de correlação heteronuclear de hidrogênio e carbono 13, 1H x 13C - nJCH

(n=1, HSQC e n=2, HMBC) foi possível observar que a amostra tratava-se de um

mistura de quatro alcaloides.

Na identificação de ALC8-S1, pela análise do espectro de RMN de 1H e HSQC,

verificou-se a presença de sinais de hidrogênios referentes a três grupos metilênicos

em H 3,05, 2,68; H 3,05, 3,43 e H 2,85, 2,94, correspondentes aos hidrogênios

metilênicos, H-4, H-5 e H-7, correlacionados respectivamente aos carbonos C-4 (

28,9), C-5 ( 43,0) e C-7 ( 36,5), além de um sinal em 4,01 (m, 1H), referente a

um hidrogênio metínico, correlacionado ao sinal em 53,3, típico de H-6a ligado a C-

6a (Figuras 15, 16 e 17). Esses sinais são característicos de alcaloide aporfínicos

segundo Costa et al. (2015).

Figura 15: Espectro de RMN de 1H de ALC8 (CDCl3, 600 MHz) e expansões dos sinais de ALC8-S1.

108

Figura 16: Ampliação do mapa de correlação 1H x 13C-HSQC (CDCl3, 600 e 150 MHz, respectivamente) referente aos carbonos metilênicos de ALC8-S1 (H-4, H5 e H-7).

Outro sinal foi observado no espetro HSQC em 6,57, atribuído a H-3,

acoplando com um carbono na região de aromático em 107,8 (C-3) (Figura 17).

Este sinal de hidrogênio, por sua vez, foi observado no espectro HMBC acoplando a

(3JCH) e a (2JCH) com um sinal de carbono metilênico em 28,9, referente à C-4,

sendo também localizado um acoplamento com um carbono não hidrogenado em

127,5, relacionado à C-3b, bem como com os carbonos oxigenados em 142,7 e

147,1 (Figura 18).

109

Figura 17: Expansão da região de acoplamento entre H-3 e C-3 de ALC8-S1 no

espectro de correlação 1H x 13C-HSQC (CDCl3, 600 e 150 MHz, respectivamente).

4.85.05.25.45.65.86.06.26.46.66.87.07.27.4f2 (ppm)

95

100

105

110

115

120

125

130

135

140

145

f1 (

ppm

)

6.606.646.68f2 (ppm)

106

107

108

109f1

(ppm

)

H-3/C-3

{6,57, 107,8}

NH

O

O

H

1

23

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

Figura 18: Expansão da região do mapa de contorno 1H x 13C-HMBC, ilustrando as correlações de H-3 de ALC8-S1.

6.5806.5906.6006.6106.6206.6306.6406.650f2 (ppm)

0

50

100

150

f1 (

ppm

)

H-3/ C-4

H-3/ C-3b

H-3/ C-1H-3/ C-2

NH

O

O

H

1

23

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

110

Através do espectro de RMN de 1H (Figura 19) e do mapa de contornos HSQC

foram localizados sinais de dupletos característicos de grupo metilenodioxi em 6,08

(1H, d, 1,5 Hz) e 5,94 (1H, d, 1,5 Hz), os quais acoplavam a (1JCH) com um carbono

metilênico em 100,9 (Figura 20), estes sinais de hidrogênio foram observados por

meio do espectro de correlação HMBC, acoplando com os carbonos oxigenados em

142,7 e 147,1, sendo estes sinais atribuídos a C-1 e C-2, respectivamente (Figura

21). Com base nesses dados foi possível atribuir as substituições no anel A do

núcleo aporfínico de ALC8-S1, confirmando assim a presença de um grupo

metilenodioxi, ligado aos carbonos C-1 e C-2, conforme descrito na Tabela 7.

Figura 19: Espectro de RMN de 1H (600 MHz, CDCl3) e ampliação das regiões referentes aos hidrogênios do grupo metilenodioxi de ALC8-S1.

NH

O

O

H

1

23

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

5.75.85.96.06.16.26.36.46.56.66.76.86.97.07.17.27.3f1 (ppm)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

55005.9

272

5.9

297

5.9

381

5.9

405

6.0

600

6.0

625

6.0

838

6.0

862

7.2

597

Solvente

CDCl3

6.086.10f1 (ppm)

1.0

0

1.2

9

(d)6.08

6.0

838

6.0

862

5.9355.9405.945f1 (ppm)

1.1

4

(d)

5.94

5.9

381

5.9

405

111

Figura 20: Ampliação do espectro de correlação 1H x 13C-HSQC (CDCl3, 600 e 150 MHz, respectivamente) relativo ao grupo metilenodioxi de ALC8-S1.

5.45.55.65.75.85.96.06.16.26.3f2 (ppm)

98

99

100

101

102

103

104

105

f1 (

ppm

)

{6,08, 100,9} {5,94, 100,9}

NH

O

O

H

1

23

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

Figura 21: Ampliação do mapa de correlação 1H x 13C-HMBC de ALC8 (CDCl3, 600

e 150MHz, respectivamente) destacando as correlações dos hidrogênios do grupo

metilenodioxi com C-1 e C-2 de ALC8-S1.

112

A presença de um anel D totalmente livre de substituições do alcaloide ALC8-

S1 foi confirmada pelo mapa de correlação HMBC. Neste espectro foi localizado um

sinal de hidrogênio em 8,07 (H-11) correlacionando a (3JCH) com os sinais de

carbonos em 116,3 (C-1a), 127,8 (C-9) e 134,6 (C-7a) assim como, o sinal de

hidrogênio em 7,24 (H-8) correlacionando a (3JCH) com os sinais de cabonos em

36,5 (C-7), 127,2 (C-10) e 131,7 (C-11a) (Figura 22).

Figura 22: Ampliação da região entre δ 8,10-7,20 pelo mapa de correlação HMBC (1H, 600 MHz;13C, 150 MHz, CDCl3) de ALC8, com destaque das correlações de ALC8-S1.

Através dos mapas de contornos, HSQC e HMBC (Figuras 23, 24 e 25),

verificou-se para ALC8-S1 a presença de 17 carbonos, sendo 12 carbonos

aromáticos, compreendidos entre 147,1 e 108,0, três sinais de carbonos

metilênicos em 28,9; 36,5; 43,0, atribuídos a C-4, C-7 e C-5, respectivamente,

além de um metínico em 53,3, típico de C-6a e outro sinal em 100,9

característico de carbono de ponte metilenodioxi (OCH2O). Todas as determinações

para ALC8-S1 encontram-se descritas na Tabela 7, bem como algumas correlações

observadas no espectro HMBC estão destacadas na Figura 26.

113

Figura 23: Espectro de correlação 1H x 13C-HSQC de ALC8 (1H: 600 MHz, 13C: 150 MHz, CDCl3).

Figura 24: Espectro de correlação 1H x 13C-HSQC de ALC8 (1H: 600 MHz, 13C: 150 MHz, CDCl3, respectivamente) e ampliação da região de acoplamentos dos carbonos aromáticos.

114

Figura 25: Mapa de correlação HMBC (1H, 600 MHz;13C, 150 MHz, CDCl3) de ALC8.

NH

O

O

H

1

23

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a NH

O

O

H

1

23

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

Figura 26: Principais correlações observadas pelo espectro HMBC de ALC8-S1.

115

Com base nos dados fornecidos pelas análises de RMN de 1H e de 13C (2D) e

comparações com dados da literatura (Tabela 7), foi possível identificar a primeira

substância da amostra ALC8, que foi denominada como ALC8-S1, como sendo o

alcaloide aporfínico anonaina (Figura 27).

Figura 27: Estrutura da anonaina.

NH

O

O

H

1

23

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

Anonaina é considerada um marcador quimiotaxonômico para a família, bem

como para o gênero Annona (LÚCIO et al., 2015, DUTRA, 2014, LEBOUEF et al.,

1981, PAULO et al., 1999). As potencialidades biológicas desse composto têm sido

bastante exploradas, sendo demonstrado seu efeito antioxidante (MARTÍNEZ et al.,

1992), anti-Plamodium (LEVRIER et al., 2013), vaso-relaxante, sendo este efeito

atribuído à sua afinidade por receptores -adrenérgicos (VALIENTE et al., 2004),

propriedades anticâncer (CHEN et al., 2008), efeitos citotóxicos em diferentes

linhagens de células de câncer (LI et al., 2013), atividade antibacteriana (COSTA et

al., 2013; PAULO et al., 1992), dentre muitas outras.

Este alcaloide já foi descrito anteriormente a partir cascas de A. leptopetala

(SETTE et al., 2000b), sendo esta a primeira vez que o mesmo é identificado nas

folhas desta planta.

116

Tabela 7– Dados de RMN de 1H (600 MHz) e 13C (150 MHz) para ALC8-S1 em CDCl3, incluindo os resultados dos experimentos 2D heteronucleares 1H x 13C - nJCH (n=1, HSQC, n= 2 e 3, HMBC).

Posição ALC8-S1 Anonaina

1H (mult., J Hz)

a 13 C

a,b HMBC (

1H-

13C)

a,d 1H (mult., J em Hz)

c 13 C

c

1 - 142,7, C - - 142,5

1a - 116,3, C - - 116,1

2 - 147,1, C - - 146,8

3 6,57, s 107,8, CH C-4, C-3b,

C-1, C-2

6,57 (1H, s) 107,9

3a - 126,1, C - 126,4

3b - 127,5, C - 128,1

4 3,05 (1H, m)

2,68 (1H, m)

28,9, CH2 C-3a, C-3 2,67 (1H, m)

3,01 (1H, m)

29,0

5 3,05 (1H, m)

3,43 (1H, m)

43,0, CH2 C-4, C-3a,

C-6a

3,02 (1H, m)

3,41 (1H, m)

43,1

6a 4,01 (1H, m) 53,3, CH C-3a 4,00 (1H, dd, 14,2; 4,9) 53,3

7 2,85 (1H, m)

2,94 (1H, m)

36,5, CH2 C-7a, C-8 2,96 (dd, 14,2; 4,9)

2,83 (dd, 14,2; 14,2)

36,8

7a - 134,6, C - - 134,9

8 7,24 (1H, m) 127,5, CH C-7, C-10, C-11a 7,25 (1H, m) 128,1

9 7,23 (1H, m) 127,8, CH C-11, C-7a 7,22 (1H, m) 127,5

10 7,32 (1H, m) 127,2, CH C-8, C-11a 7,31 (1H, m) 127,0

11 8,07 (1H, dd, 7,9 e 1,6)

127,1, CH C-1a, C-7a, C-9 8,07 (1H, brd, 7,7) 127,0

11a - 131,7, C - - 131,1

O-CH2-O 6,08 (1H, d, 1,5)

5,94 (1H, d, 1,5)

100,9, CH2 C-1, C-2 6,09 (1H, d, 1,4)

5,94 (1H, d, 1,4)

100,6

a Experimento realizado a 600 MHz para

1H e 150 MHz para

13C em CDCl3, utilizando o TMS como

padrão interno. b Multiplicidades determinadas pelos espectros de

1H, HSQC e HMBC.

c Dados da

literatura de acordo com Costa et al. 2015 (H: 400 MHz e C: 100 MHz, CDCl3 com gotas de CD3OD). d

Correlações no espectro de HMBC. deslocamento químico em ppm. (-) não localizado.

117

Após atribuir os sinais da anonaina foram identificados quais sinais

correspondiam ao segundo composto ALC8-S2, o qual também se tratava de um

alcaloide aporfínico. Foram observados por meio do espectro de RMN de 1H (600

MHz, em CDCl3) e de correlação 1H x 13C – (1JCH) - HSQC (CDCl3, 600 e 150 MHz,

respectivamente) dois sinais de hidrogênios, na forma de dupletos, típicos de grupo

metilenodioxi, em 6,06 (1H, d, J= 1,5 Hz) e 5,93 (1H, d, J= 1,5 Hz) (Figura 28),

ligados ao carbono em 100,6 (Figura 29).

Figura 28: Ampliação do espectro de RMN de 1H (600 MHz, CDCl3), referente aos hidrogênios da ponte metilenodioxi de ALC8-S2.

118

Figura 29: Ampliação do mapa de contorno 1H x 13C – HSQC (CDCl3, 600 e 150 MHz, respectivamente), referente às correlações do grupo metilenodioxi em ALC8-S2.

Na região de hidrogênios aromáticos no espectro HSQC, foi observado um sinal

de singleto em 6,52, ligado ao carbono em 107,0, atribuído a H-3 (Figura 30).

Este mesmo sinal, através do mapa de correlações no HMBC, aparece acoplando a

2JCH e a 3JCH, com os carbonos aromáticos oxigenados em 141,9 (C-1), 146,9 (C-

2), 126,4 e com o carbono metilênico em 28,8, comum a C-4 (Figura 31). Por

meio desses dados, bem como por comparação com dados da literatura (COSTA et

al., 2015) foi possível atribuir os sinais referentes ao anel A dissubstituído (Tabela 8).

119

Figura 30: Ampliação do espectro de correlação HSQC, relativa ao acoplamento entre H-3 e C-3 de ALC8-S2.

Figura 31: Ampliação do mapa de contorno HMBC (1H: 600 MHz, 13C: 150 MHz,

CDCl3), ilustrando as correlações de H-3 em ALC8-S2.

120

A localização do metilenodioxi em C-1 e C-2 foi estabelecida com base no mapa

de correlação heteronuclear 1H-13C a longa distância (HMBC). Neste, o hidrogênio

em 6,57 (H-3), bem como os hidrogênios do grupo metilenodioxi mostraram

correlação com os carbonos oxigenados em 141,9 (C-1) e 146,9 (C-2) (Figuras

31 e 32).

Figura 32: Ampliação do mapa de correlação HMBC (1H: 600 MHz, 13C: 150 MHz,

CDCl3) destacando as correlações entre dos hidrogênios do grupo metilenodioxi,

com C-1 e C-2 na amostra ALC8-S2.

Pela análise do mapa de contornos HMBC também foi possível identificar os

sinais de carbonos não hidrogenados para o anel D, com base nas correlações do

sinal em 8,01 (d, J=8,6 Hz, H-11), acoplando a (3JCH) com os sinais em 116,1 (C-

1a), 136,6 (C-7a) e 158,9 (C-9), bem como através dos acoplamentos entre

6,88 (H-10) com os carbonos em 129,4 (C-11a) e 144,2 (C-8). A posição da

metoxila em C-9 foi confirmada através do acoplamento entre um singleto em 3,85,

característico de grupo metoxi, com o carbono em 158,9, com isto foi possível

concluir, que o sinal em 144,2, típico de carbono oxigenado, era condizente com a

presença de um grupo hidroxila em C-8. Foi também levado em consideração os

valores de deslocamentos químicos típicos destas substituições, descritos na

literatura. (Figuras 33 e 34 e Tabela 8).

121

Figura 33: Correlações dos carbonos não hidrogenados do anel D e de C-1a de ALC8-S2, no espectro HMBC de ALC8.

Figura 34: Expansão do mapa de correlação HMBC de ALC8-S2, evidenciando o acoplamento entre o grupo metóxi e o carbono C-9.

122

Com base na análise dos espectros de RMN de 1H (Figura 35) e bidimensionais,

HSQC e HMBC (Figura 37 e 38), foi possível identificar 18 sinais de carbonos, dos

quais, 12 eram de aromáticos, sendo que destes, apenas três eram hidrogenados,

estando um localizado no anel A, em C-3 ( 107,0), e os outros dois no anel D, nas

posições C-10 ( 112,1) e C-11 ( 128,3), estes por sua vez, correlacionados aos

dupletos em 6,85 (1H, d, J= 8,6 Hz) e 8,01 (1H, d, J= 8,6 Hz), para H-10 e H-11,

respectivamente (Figura 36). Os demais sinais correspondiam a três carbonos

metilênicos em 28,8 (C-4), 42,9 (C-5) e 36,9 (C-7) (Figura 36), cujos

hidrogênios foram localizados no espectro de RMN de 1H, na região entre 3,50 e

2,70 (Figura 35). Pelo HSQC também foi observado um sinal em 53,6,

característico de carbono metínico C-6a, ligado a hidrogênio em 3,90 (1H, m).

Inclui também um sinal em 100,6, correlacionado ao grupo metilenodioxi e outro

sinal em 55,3 ligado a um singleto em 3,89, integrado para três hidrogênios,

típico de grupo metoxi (Figura 36).

Figura 35: Espectro de RMN de 1H de ALC8-S2 (600 MHz, em CDCl3) e suas expansões.

123

Figura 36: Expansões do espectro de correlação 1H x 13C-HSQC, referente aos

sinais de ALC8-S2.

Figura 37: Mapa de correlação heteronuclear HSQC (1H: 600 MHz, 13C: 150 MHz,

CDCl3) de ALC8.

124

Figura 38: Mapa de correlação heteronulear HMBC (1H: 600 MHz, 13C: 150 MHz,

CDCl3) de ALC8.

NH

O

O

H

1

23

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a NH

O

O

H

1

23

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

OH

OCH3

OCH3

OH

Figura 39: Principais correlações observadas no mapa de correlação HMBC de

ALC8-S2.

125

A partir da análise detalhada dos dados de RMN de 1H e 13C (2D) e por

comparação com dados da literatura, foi possível identificar o segundo composto da

amostra ALC8, codificado como ALC8-S2, como sendo norannuradapurina (Figura

40).

Norannuradapurina é um alcaloide noraporfínico fenólico isolado pela primeira

vez a partir das cascas e folhas de Polyalthia acuminata Thw. (Annonnaceae)

(ZARGA & SHARMMA, 1982) e posteriormente obtido das espécies Fissistigma

glaucescens (Hance) Merr, de F. oldhamii (Hemsl.) Merr (Annonaceae) (LU et al.,

1985a,b) e Goniothalamus amuyon (LU et al., 1985a). Nesses estudos apenas os

dados de RMN de 1H foram reportados para o composto natural, não há dados

prévios de RMN de 13C, para o alcaloide natural.

Nimgirawath et al. (2008) descreveram a caracterização química de

norannuradapurina sintética, no entanto os dados de RMN de 13C não foram

atribuídos aos respectivos carbonos. Nesse mesmo estudo os autores reportaram o

potencial anti-inflamatório deste composto, os quais o consideram raro na natureza.

Outros estudos conduzidos com norannuradapurina demonstraram sua elevada

ação antiplaquetária (CHEN et al., 1996), além de exibir amplo efeito inibitório sobre

o crescimento de células leucêmicas humanas e de murina, com valores de CI50 em

1

23

3b

3a

4

5

6a

77a

8

9

10

11

11a

1a NH

O

O

H

OCH3

OH

Figura 40: Estrutura da norannuradapurina.

126

torno de 3 mM, demonstrando também forte ação inibitória na biossíntese de DNA,

RNA e proteína (TZENG et al., 1990).

Segundo Lúcio et al. (2015) apenas quatro aporfínicos são substituídos na

posição C-8 e dentre eles está incluído norannuradapurina. Embora este alcaloide já

tenha sido descrito na literatura, os dados de RMN são incompletos e apresentam

ambiguidades, além de serem antigos. Portanto os dados de RMN completos para

este alcaloide foram revisados de acordo com experimentos de RMN 1D e 2D neste

trabalho. Ressalta-se que o alcaloide norannuradapurina está sendo descrito pela

primeira vez na literatura no gênero Annona, a partir da espécie A. leptopetala, no

presente estudo. Essa caracterização contribui de forma significativa para a

quimiotaxonomia do gênero bem como da família, revelando a espécie A.

leptopetala como uma fonte em potencial na obtenção de um composto considerado

raro e com excelente espectro de atividades.

Aspecto químico e dados de RMN 1H e 13C descritos para a norannuradapurina

sintética, segundo Nimgirawath et al. (2008): O composto apresenta-se na forma de

agulhas na cor púrpura. Dados de RMN 1H (300 MHz, CDCl3): δ 7,64 (1H,d, J = 8,40

Hz, H-11), 6,82 (1H, d, J = 8,40 Hz, H-10), 6,54 (1H, s, H-3), 6,00 (1H, AB q, J = 1,50

Hz, 2H, OCH2O), 3,92 (3H, s, OCH3), 3.88 (1H, dd, J = 13,80, 5.10 Hz, H-6a), 3,45-

2,34 (6H, m, CH2); RMN 13C (75 MHz, CDCl3): δ 146,5 (C), 145,9 (C), 142,2(C),

142,0 (C), 127,8 (C), 126,8 (C), 125,0 (C), 121,5 (C), 118,8 (CH), 116,4 (C), 108,4

(CH), 107,3 (CH), 100,5 (CH2), 56,0 (OCH3), 53,3 (CH), 43,5 (CH2), 29,6 (CH2), 29,2

(CH2).

Os valores dos deslocamentos químicos obtidos para a elucidação de ALC8-S2,

encontram-se sumarizados na Tabela 8, e estão de acordo com os dados da

literatura (Dutra et al., 2012).

127

Tabela 8- Dados de RMN de 1H (600 MHz) e 13C (150 MHz) para ALC8-S2 em CDCl3, incluindo os resultados dos experimentos 2D heteronucleares 1H x 13C - nJCH (n=1, HSQC, n= 2 e 3, HMBC) e dados da literatura.

Posição

ALC8-S2 Norannuradapurina

1H

(mult., J em Hz)a 13

C a,b

HMBCa

(1H-

13C)

a,c

1H

(mult., J em Hz)d

1H

(J em Hz)e

1 - 141,9, C -

1a - 116,1, C -

2 - 146,9, C -

3 6,52 (1H, s) 107,0, CH C-4, C-3b, C-1,

C-2

6,54(1H, s)

3a - 126,3, C -

3b - 126,4, C -

4 3,12 (1H, m)

2,74 (1H, m)

28,8, CH2 C-3a, C-3b, C-5

3,45-2,34 (6H, m, CH2)

5 3,02 (1H, m)

3,46 (1H, m)

42,9, CH2 C-4, C-3b, C-3a, C-6a

3,45-2,34 (6H, m, CH2)

6 -

6a 3,90 (1H, m) 53,6, CH - 3,88 (1H, dd, 13,8,

5,1)

7 2,89 (1H, m)

2,96 (1H, m)

36,9, CH2 C-7a, C-6a, C-3b

3,45-2,34 (6H, m, CH2)

7a - 136,6, C -

8 - 144,2 C -

9 - 158,9, C -

10 6,85 (1H, d, 8,6) 112,1 CH C-8, C-11a 6,82 (1H, d, 8,4) 6,82 (8,5)

11 8,01 (1H, d, 8,6) 128,3, CH - 7,64 (1H, d, 8,4) 7,64 (8,5)

11a - 129,4, C -

O-CH2-O 6,06 (1H, d, 1,5)

5,93 (1H, d, 1,5)

100,6, CH2 C-1, C-2 6,00 (1H, AB q,1,5) 6,08 (1,5)

5,94 (1,5)

9-OCH3 3,85 (3H, s) 55,3 C-9 3,92 (3H, s) 3,93 (3H, s)


1H e 150 MHz para



1H e HSQC.

c Correlações no

espectro de HMBC. d Dados de RMN (

1H: 300 MHz,

13C: 75 MHz, CDCl3) para o composto sintético

(NIMGIRAWATH et al., 2008); e Dados de RMN de

1H em CDCl3 (ZARGA & SHARMMA, 1982).

deslocamento químico em ppm. (-) não localizado.

128

Para o terceiro alcaloide presente na fração ALC8 foram observados sinais na

região de aromático para quatro hidrogênios em 7,25 (1H, m), 7,22 (1H, m),

7,31 (1H, m) e 8,39 (1H, dd, 7,9; 1,2), típícos de anel D de esqueleto aporfínico não

substituído (Figura 41), os quais foram atribuídos aos hidrogênios H-8, H-9, H-10 e

H-11, respectivamente, com base na comparação com dados da literatuta (DUTRA

et al., 2012).

A presença do anel D totalmente livre de substituições em ALC8-S3 foi

confirmada pelo mapa de correlação HMBC. Neste espectro foi possível localizar um

sinal de hidrogênio em δ 8,39 (H-11) correlacionando a (3JCH) com os sinais de

carbono em δ 127,4 (C-9) e δ 135,7 (C-7a), assim como o sinal de hidrogênio em δ

7,25 (H-8) correlacionando a (3JCH) com os sinais dos carbonos em δ 127,2 (C-10) e

δ 131,0 (C-11a) (Figura 42).

Figura 41: Espectro de RMN de 1H (600 MHz, CDCl3) e as expansões de ALC8-S3.

129

Figura 42: Ampliação da região aromática do mapa de correlação HMBC (1H: 600 e 13C: 150 MHz, CDCl3) de ALC8-S3.

Pôde-se observar a presença de hidrogênios diastereotópicos no qual o

alcaloide ALC8-S3, apresentou três grupos metilênicos em 2,74 (1H, m)/3,03 (1H,

m), 3,05 (1H, m)/ 3,45 (1H, m), 2,85 (1H, m)/ 2,99 (1H, m), típicos dos sinais de

hidrogênios H-4, H-5 e H-7, respectivamente, correlacionados aos sinais de

carbonos em 28,4 (C-4), 42,8 (C-5) e 37,0 (C-7) no mapa de correlação HSQC,

assim como um sinal de hidrogênio metínico em 4,04 (1H, m) acoplando com um

sinal de carbono em 53,4 característico de H-6a/C-6a. (Figura 43).

130

Figura43: Ampliação do mapa de contornos HSQC (1H: 600 e 13C: 150 MHz, CDCl3) referente aos acoplamentos dos hidrogênios metilênicos e de H-6a de ALC8-S3.

Pelo mapa de correlação HMBC, observou-se a correlação a (3JCH) do H-3 (

6,65) referenta à ALC8-S3, com os sinais de carbono em 145,5 (C-1), 127,7 (C-

3b) e 28,4 (C-4) e a (2JCH) com os sinais de carbono em 152,7 (C-2), confirmando

assim, a presença de substituintes oxigenados nos carconos C-1 e C-2 do anel A do

sitema aporfínico do alcaloide ALC8-S3. (Figura 44). Esse mesmo sinal de

hidrogênio em 6,65 (H-3) é observado através do mapa de contornos HSQC,

acoplando com um sinal de carbono em 111,9 (C-3) (Figura 45).

131

Figura 44: Ampliação da região do espectro HMBC indicativa das correlações de H-3 em ALC8-S3.

.

Figura 45: Ampliação do mapa de contorno HSQC (1H: 600 e

13C: 150 MHz, CDCl3),

destacando a região de correlação entre H-3 e C-3 de ALC8-S3.

132

Pela análise do mapa de correlação HMBC, verificou-se que o alcaloide ALC8-S3

apresentou correlação a (3 JCH) dos sinais relativos aos grupos metoxílicos em 3,67

(3H, s) e 3,89 (3H, s) com os sinais de carbonos em 145,5 e 152,7,

estabelecendo assim os grupos metoxílicos substituídos em C-1 e C-2,

respectivamente (Figura 46). Esses sinais de hidrogênio das metoxilas também

foram localizados pelo mapa de correlação HSQC, acoplando com sinais de carbono

em 55,9 (2-OCH3) e 60,2 (1-OCH3), sendo este último deslocamento químico

característico de grupo metoxila ligado a carbono aromático, estericamente impedido

em C-1 (Figura 47). Outras correlações significativas estão apresentadas na Tabela

9 e representadas pela Figura 48.

Figura 46: Ampliação do mapa de contornos HMBC (1H: 600 e 13C: 150 MHz, CDCl3) relativa aos hidrogênios metoxílicos de ALC8-S3.

133

Figura 47: Ampliação do mapa de contorno HSQC (1H: 600 e 13C: 150 MHz, CDCl3), referente aos sinais de hidrogênio das metoxilas de ALC8-S3.

NH

H

1

23

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

H3CO

H3CO

1

23

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a NH

H

H3CO

H3CO

Figura 48: Principais correlações observadas no HMBC para ALC8-S3.

134

A partir das análises dos dados espectrométricos, foi possível propor que o

terceiro composto codificado como ALC8-S3, presente na amostra ALC8, trata-se do

alcaloide aporfínico nornuciferina (Figura 49), o qual foi confirmado por comparação

com dados existentes na literatura (Tabela 9, DUTRA et al., 2012).

Este alcaloide é comumente encontado em vários gêneros da família

Annonaceae, tais como Guatteriopsis, Oxandra, Enantia, Guatteria, Duguetia,

Artabotrys, Dasymaschalon e principalmente em Annona, o que faz dele um

marcador quimiotaxonômico tanto do gênero como da família. Em Annona, esse

composto foi reportado nos frutos de A. muricata (HASRAT et al., 1997a); nas folhas

de A. pickelli (DUTRA et al., 2012), A. sericea (CAMPOS et al., 2008), atemoya (A.

squamosa x A. cherimola) (RABÊLO et al., 2015), nas cascas de A. glabra (YANG e

CHEN, 1973; CHANG et al., 2000) e de A. hayesii (RASAMIZAFY et al., 1987).

Para esse composto foram descritas atividade leishmanicida (MONTENEGRO et

al., 2003), efeito antidepressivo (HASRAT et al., 1997) e inibidor da proteína tirosina

fosfatase (MISKI et al., 1995).

NH

H

1

23

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

H3CO

H3CO

Figura 49: Estrutura da nornuciferina (ALC8-S3)

135

Tabela 9 - Dados de RMN de 1H (600 MHz) e 13C (150 MHz) para ALC8-S3 em CDCl3, incluindo os resultados dos experimentos 2D heteronucleares 1H x 13C - nJCH (n=1, HSQC, n= 2 e 3, HMBC) e dados da literatura.

Posição

ALC8-S3 Nornuciferina

1H


C a,b

HMBCa (

1H-

13C)

a,c 1H (J em Hz)

d

13C

d

1 - 145,5, C - - 145,5

1a - 126,7 C - - 126,7

2 - 152,7, C - - 152,5

3 6,65 (1H, s) 111,9, CH C-4, C-3b, C-1, C-2 6,65 (1H, s) 111,7

3a - 126,8, C - - 128,1

3b - 127,7, C - - 127,0

4 3,03 (1H, m)

2,74 (1H, m)

28,4, CH2 C-3b, C-5 3,12 (1H, m)

2,76 (1H, dd, 15,8; 2,6)

28,3

5 3,05 (1H, m)

3,45 (1H, m)

42,8, CH2 C-3a, C-4, C-6a 3,06 (1H, dd, 12,0; 2,6)

3,49 (1H, dd, 12,0; 5,0)

42,6

6a 4,04 (1H, m) 53,4, CH C-3a 3,93 (1H, dd, 13,7; 4,8) 53,4

7 2,85 (1H, m)

2,99 (1H, m)

37,0, CH2 C-7a, C-6a, C-3b 2,86 (1H, t, 13,7)

2,97 (1H, dd, 13,7; 4,8)

36,7

7a - 135,7, C - - 135,4

8 7,25 (1H, m) 128,0, C C-7, C-10, C-11a 7,23 (1H, m) 127,9

9 7,23 (1H, m) 127,4, C C-7a, C-10, C-11 7,23 (1H, m) 127,5

10 7,31 (1H, d, 7,9) 127,2 CH C-8, C-11a 7,31 (1H, m) 127,2

11 8,39 (1H, dd, 7,9; 1,2)

128,6, CH C-7a, C-9, 8,39 (1H, d, 7,7) 128,4

11a - 131,0, C - - 132,0

1-OCH3 3,67 (3H, s) 60,2, CH3 C-1 3,66 (3H, s) 60,2

2-OCH3 3,89 (3H, s) 55,9, CH3 C-2 3,89 (3H, s) 55,9


1H e 150 MHz para



1H e HSQC.

c Correlações no

espectro de HMBC. d (DUTRA et al, 2012,

1H: 400 MHz,

13C: 100 MHz, CDCl3). Deslocamento

químico em ppm. (-) não localizado.

136

A atribuição dos dados de RMN para os alcaloides na forma de mistura

presentes na fração ALC8 foi feita em combinação com as técnicas 2D e

comparação com dados descritos literatura que nos permitiram identificar a fração

ALC8 como sendo uma mistura de três alcaloides aporfínicos sensu sctricto: anonaina,

norannuradapurina e nornuciferina (Figura 50). Assim, os dados aqui apresentados visam

auxiliar outros grupos de pesquisa na identificação destes compostos.

Figura 50: Alcaloides aporfínicos identificados na fração ALC8.

.

NH

O

O

H

1

23

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

1

23

3b

3a

4

5

6a

77a

8

9

10

11

11a

1a

OH

NH

O

O

H

OCH3

1

2

3

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

NH

H

H3CO

H3CO

Anonaina Norannuradapurina Nornuciferina

5.2.2. Determinação estrutural de ALC4

A amostra codificada como ALC4 apresentava aspecto amorfo e coloração

marrom, a mesma apresentou resultavo positivo para alcaloide frente ao reagente de

Dragendorff (coloração vermelho-alaranjada).

No espectro de RMN de 1H (Figura 51) é possível observar sinais na região de

hidrogênios aromáticos referentes a três singletos em 8,08 (1H, s), 6,82 (1H, s),

6,61 (1H, s), os quais acoplam a uma ligação (1JCH) com os carbonos na região de

aromático C-11 ( 111,3), C-8 ( 114,1) e C-3 ( 110,5), com base no espectro de

137

correlação HSQC (Figura 52), confirmando o padrão de substituição 1, 2, 9 e 10 do

sistema aporfínico.

Figura 51: Espectro de RMN de 1H de ALC4 (600 MHz, CDCl3).

Figura 52: Ampliação do mapa de contornos HSQC (1H: 600 e 13C: 150 MHz,

CDCl3), referente às correlações dos H aromáticos de ALC4.

138

No espectro de RMN de 1H também foi possível observar sinais de metoxilas em

3,67 (3H, s), 3,89 (3H, s) e 3,90 (3H, s), estas por sua vez acoplando a (1JCH) com

os carbonos em 60,2, 56,0 e 55,9, respectivamente, de acordo com o espectro de

correlação HSQC (Figura 53).

Figura 53: Espectro de correlação HSQC (1H: 600 e 13C: 150 MHz, CDCl3) e

expansão da região dos acoplamentos dos grupos metoxila de ALC4.

As posições das metoxilas foram atribuídas com base no mapa de contornos

HMBC, ao serem observados sinais de hidrogênios de grupos metoxílicos em 3,69

(3H, s), 3,89 (3H, s) e 3,90 (3H, s) acoplando respectivamente com os sinais de

carbonos oxigenados em 144,9, 153,2 e 145,7, referentes à C-1, C-2 e C-10

respectivamente (Figura 54). Ressalta-se ainda que o valor do deslocamento

químico em 3,67 para grupo metoxila ligado ao anel aromático indica impedimento

estérico em C-1.

Por meio da análise do espectro HMBC também foram observadas correlações a

duas (2JCH) e a três ligações (3JCH) entre H-3 ( 6,61), com os carbonos aromáticos

em 122,4, 144,9 e 153,2, relativos aos carbonos C-3b, C-1, e C-2,

respectivamente, caracterizando assim o anel A, e outro acoplamento com carbono

metilênico em 26,4, atribuído a C-4 (Figuras 54).

139

Figura 54: Espectro de correlação HMBC de ALC4 (1H: 600 e 13C: 150 MHz, CDCl3) e expansões das regiões dos acoplamentos de H-3 e dos hidrogênios de metoxilas.

Outras correlações foram localizadas pelo mapa de contornos HMBC

envolvendo o sinal em 8,08 (H-11) com os carbonos aromáticos em 123,4 (C-1a),

127,8 (C-7a) e 145,3 (C-9), além dos acoplamentos entre um singleto em 6,82

(H-8) com os carbonos em 34,0 (C-7), 145,7 (C-10) e 123,4 (C-11a), bem como

a correlação entre os hidrogênios do grupo metoxi em 3,90 com o sinal de carbono

oxigenado em 145,7 (C-10). Com base nessas correlações foi possível atribuir as

substituições no anel D do sistema aporfínico de ALC4, sendo assim possível

confirmar a presença de um substituinte hidroxila em C-9 (Figura 55).

140

Figura 55: Espectro de correlação HMBC de ALC4 (1H: 600 e 13C: 150 MHz, CDCl3) e expansões das regiões de acoplamentos dos H aromáticos H-8 e H-11.

Pela análise do espectro de RMN de 1H (600 MHz, CDCl3) juntamente com a

análise do mapa de correlação HSQC verificou-se a presença de sinais de

hidrogênios diastereotópicos para três grupos metilênicos em δ 2,85 (1H, dd, J

=16,8; 3,6 Hz)/δ 3,46 (1H,m), δ 3,15 (1H, dd, J =12,7; 3,5 Hz)/δ 3,75 (1H,m) e δ 2,33

(1H,m)/δ 3,18 (1H, d, J =4, 1 Hz) típicos dos hidrogênios, H-4pax/H-4peq, H-5peq/H-

5pax e H-7peq/H-7pax correlacionados, respectivamente, aos sinais dos carbonos em

δ 26,4, δ 41,8 e δ 34,0, bem como um sinal de um hidrogênio metínico em δ 4,11

(1H, dd, J= 13,4 e 3,8 Hz), correlacionado ao sinal do carbono em δ 53,3

característico de H-6a/C-6a (COSTA, 2009a) (Figura 56).

141

Outras correlações significativas são mencionadas na Tabela 10, bem como se

encontram representadas na Figura 57.

Figura 56: Ampliação na região dos hidrogênios diasteroisotópicos pelo mapa de correlação HSQC (1H, 600 MHz e 13C, 150 MHz; CDCl3) de ALC4.

1

23

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a1

23

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1aNH

H

OH

H3CO

H3CO

H3CO

NH

H

H3CO

H3CO

H3CO

OH

Figura 57: Principais correlações observadas por HMBC para o composto ALC4.

142

A análise dos dados espectrais de RMN de 1H e 13C decritos na Tabela 10,

comparados com dados da literatura (COSTA et al., 2013b), permitiu identificar o

composto codificado como ALC4 como sendo o alcaloide aporfínico laurotetanina

(Figura 58), o qual está sendo pela primeira vez descrito em A. leptopetala no

presente estudo.

Este alcaloide já foi descrito em diversas espécies da família Annonaceae, como

Alphonsea sclerocarpa (TADIC et al., 1967), Guatteria guadotiana (CASTEDO et al.,

1991), Annona cherimola (CHEN et a., 1997c), sendo notória sua descrição entre

espécies do gênero Xylopia, tais como X. laevigata (COSTA et al., 2013b), X.

amazonica (MARTINS et al., 1995), X. benthamii (PIMENTA e MENDONÇA, 2012),

X. danguyella (HOCQUEMILLER et al., 1981) e X. parviflora (NISHYAMA et al.,

2006).

NH

H

1

23

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

OH

H3CO

H3CO

H3CO

Figura 58: Estrutura do alcaloide Laurotetanina.

143

Tabela 10 - Dados de RMN de 1H (600 MHz) e 13C (150 MHz) para ALC4 em CDCl3, incluindo os resultados dos experimentos 2D heteronucleares 1H x 13C - nJCH (n=1, HSQC, n= 2 e 3, HMBC) e dados da literatura.

Posição ALC4 Laurotetanina

1H


C a,b

HMBCa

(1H-

13C)

a,c 1H (J em Hz)

d

13C

d

1 - 144,9, C - - 144,3

1a - 123,4, C - - 127,1

2 - 153,2, C - - 152,2

3 6,61 (1H, s) 110,5, CH C-4, C-3b, C-1, C-2

6,61 (1H, s) 110,7

3a - 126,8, C - - 128,4

3b - 122,3, C - - 126,5

4 2,85 (1H, dd,16,8 3,6)

3,46 (1H, m)

26,4, CH2 C-5 2,75 (1H, m)

3,04 (1H, m)

28,2

5 3,15 (1H, dd, 12,6, 3,4)

3,75 (1H, m)

41,8, CH2 C-4, C-6a 3,02 (1H, m)

3,41 (1H, m)

42,5

6a 4,11 (1H, dd, 13,4, 3,8) 53,3, CH C-7 3,84 (1H, dd, 14,5, 4,9) 53,5

7 2,33 (1H, m)

3,18 (1H, d, 4,1)

34,0, CH2 C-6a 2,68 (1H, dd, 14,5, 13,8)

2,78 (1H, dd, 13,8, 4,9)

35,7

7a - 127,8, C - - 129,1

8 6,82 (1H, s) 114,1, C C-7, C-10, C-11a

6,77 (1H, s) 114,4

9 - 145,3, C - 145,6

10 - 145,7 CH - 146,1

11 8,08 (1H, s) 111,3, CH C-1a, C-7a, C-9,

8,06 (1H, s) 111,8

11a - 123,4, C - - 123,6

1-OCH3 3,67 (3H, s) 60,2, CH3 C-1 3,67 (3H, s) 60,2

2-OCH3 3,89 (3H, s) 56,0, CH3 C-2 3,89 (3H, s) 56,1

10-OCH3 3,90 (3H, s) 55,9 C-10 3,90 (3H, s) 55,9


1H e 150 MHz para



1H e HSQC.

c Correlações no

espectro de HMBC. d (COSTA et al, 2013b,

1H: 600 MHz,

13C: 150 MHz, CDCl3). deslocamento


144

5.2.3. Determinação estrutural de SBFII-3

A amostra SBF II-3 apresentava aspecto oleoso de odor marcante. O espectro

de RMN de 13C-DEPTQ (100 MHz em CDCl3), revelou a presença de quinze linhas

espectrais, correspondentes a três sinais de carbonos não hidrogenados, quatro de

carbonos metínicos, cinco de carbonos metilênicos e três de carbonos metílicos. O

sinal em 80,8 foi relacionado a carbono não hidrogenado ligado a oxigênio (Figura

59). A presença de sinais em 153,3 e 106,1 indicou para a existência de dupla

exocíclica.

Figura 59: Espectro de RMN de 13C-DEPTQ (100 MHz, CDCl3) de SBF II-3.

145

Por meio do espectro HSQC foram observados sinais em 4,66 (1H, tl, J =1,4

Hz) e 4,69 (1H, dl, J =1,4 Hz), relativos aos hidrogênios olefínicos, acoplando com

carbono em 106,1, confirmado assim a existência da dupla. Outras correlações

foram observadas pelo mapa de correlação envolvendo os sinais de hidrogênios

metílicos em 1,04 (3H, s), 1,05 (3H, s) e 1,28 (3H, s) acoplando a (1JCH), com os

sinais de carbonos em 16,1, 28,5 e 25,8 respectivamente. (Figura 60).

Figura 60: Espectro de correlação 1H x 13C-HSQC de SBFII-3 (CDCl3, 600 e 150 MHz, respectivamente) e expansão da região dos acoplamentos dos hidrogênios olefínicos.

No espectro de RMN de 1H (600 MHz, CDCl3) foram observadas absorções

características de anel ciclopropano em 0,47 (1H, dd, J = 11,2 e 9,5 Hz) e em 0,71

(1H, ddd, J = 11,2, 9,6 e 6,2 Hz), destacadas na Figura 61. Foram vistos neste

espectro, sinais de singletos em 1,05 e 1,04, com integração para três hidrogênios

cada, atribuídos a duas metilas geminadas, ligadas a carbono quaternário e outro

146

singleto em 1,28, referente à metila ligada a carbono oxigenado (Figura 61). Outras

correlações relevantes encontram-se descritas na Tabela 11.

Figura 61: Espectro de RMN de 1H de SBF II-3 (600 MHz, CDCl3) com destaque das regiões dos hidrogênios do anel ciclopropano e expansões.

147

Pelas ampliações do espectro HMBC (Figura 62) foram localizadas correlações

do sinal em 1,28 (3H, s) com 41,6 (C-3), 80,8 (C-4) e 54,2 (C-5), podendo-se

atribuir este sinal à metila (CH3-14). Também foram observados acoplamentos do

sinal em 1,04 (3H, s) com os carbonos em 20,1 (C-11), 27,4 (C-7) e 29,7 (C-

6), levando a atribuir este sinal de hidrogênio à metila em (CH3-13), os mesmos

acoplamentos foram vistos para o sinal em 1,05, o qual ainda acoplava a (3JCH)

com o sinal de carbono em 16,1 (C-13), correspondendo então este sinal a outra

metila geminada em (CH3-12). Neste mesmo espectro ainda foram observadas

correlações do sinal em 1,32 (H-5, dd, 1H, J =10,4; 9,5 Hz) com os carbonos em

20,1 (C-11), 29,7 (C-6), 53,2 (C-1) e 80,8 (C-4). Além dos acoplamentos entre os

hidrogênios ligados à C-9 em 2,42 e 2,04 e à C-1 em 2,21 com os carbonos

olefínicos em 153,3 (C-10) e 106,1 (C-15), confirmado assim a presença da ligação

dupla exocíclica. Outras correlações observadas pelo mapa de contornos HMBC

estão representadas na Figura 63 e na Tabela 11.

Figura 62: Espectro 1H x 13C-HMBC (CDCl3, 600 e 150 MHz, respectivamente) e suas expansões.

148

Figura 63: Algumas correlações observadas no HMBC para a amostra SBF II-3.

OH H

H

H

H

12

3

4

5

6

7

8

910

15

13

12

14

11

Com base nas análises dos dados de RMN de 1H e 13C (1D e 2D) e comparação

com dados da literatura (RAGASA et al., 2003), foi possível caracterizar o composto

SBF II-3 como sendo o sesquiterpeno oxigenado espatulenol (Figura 64).

Figura 64: Estrutura do espatulenol

OH H

H

H

H

12

3

4

5

6

7

8

910

15

13

12

14

11

Estudos prévios com os óleos essenciais das folhas de A. leptopetala revelaram

que a presença de espatulenol era de 0,7% (COSTA et al., 2008b), valor este

condizente com o teor de 1,1% encontrado por Feitosa et al. (2009), sendo que nas

cascas esse valor atingiu 63%, segundo estes autores. O espatulenol também foi

reportado na fase metanólica das folhas (COSTA et al., 2012a).

Vale salientar que muitos dos compostos presentes nos óleos essenciais são

comumente encontrados nos extratos apolares, a exemplo do espatulenol, isolado

no presente trabalho, a partir do extrato hexânico das folhas de A. leptopetala,

mostrando-se abundante neste extrato. Desta maneira, o extrato hexânico das

149

folhas de A. leptopetala, que está sendo pela primeira vez investigado no âmbito

químico e biológico, torna-se uma matéria-prima interessante na obtenção desse

composto com várias propriedades biológicas consolidadas na literatura e com

grande potencial ainda a ser explorado.

150

Tabela 11 - Dados de RMN de 1H (600 MHz) e 13C (150 MHz) para ALC4 em CDCl3, incluindo os resultados dos experimentos 2D heteronucleares 1H x 13C - nJCH (n=1, HSQC, n= 2 e 3, HMBC) e dados da literatura.

Posição

SBF II-3 Espatulenol

1H (mult., J em Hz)

a 13 C

a,b

HMBCa

(1H-

13C)

a,c 1H (J em Hz)

d

13C

d

1 2,21 (1H, dd, 10,6 e 6,4) 53,2, CH C-2, C-5,

C-15, C-10

2,20 53,4

2 1,63 (1H, dddd, 11,8; 8,2 e

6,6,2,1)

1,91 (1H, ddd, 22,8, 11,6, 6,3)

26,5, CH2 C-3, C-1 e

C-4

1,64

1,91

26,7

3 1,58 (1H, m)

1,77 (1H, dddd,12,9;8,8;6,9, 2,1)

41,6, CH2 C-1, C-2 e

C-4

1,54

1,77

41,8

4 - 80,8, C - - 81,0

5 1,32 (dd, 10,4 e 9,5) 54,2, CH C-1, C-4

e C-6

1,31

54,4

6 0,47 (dd, 11,2 e 9,5) 29,7, CH C-4, C-5,

C-7 e C-11

0,47 (dd, 11,6; 9,6) 29,9

7 0,71 (ddd, 11,3; 9,6 e 6,1) 27,4, CH C-5, C-6

e C-11

0,71

(ddd, 11,2; 9,5; 6,1)

27,5

8 1,01 (1H, m)

1,98 (1H, dddd, 14,3; 12,5; 8,1 e

6,2)

24,7 CH2 C-6, C-9

e C10

1,01

1,96

24,8

9 2,04 (1H, ddd, 13,5; 12,5 e 1,3)

2,42 (1H, dddd, 13,5; 8,1; 6,2 e

1,6)

38,7, CH2 C-1, C-7,

C-8, C-10 e

C-15

2,05

2,42 (dd, 5,2, 13,6)

38,9

10 - 153,3, C - - 153,5

11 - 20,1, C - 20,3

12 1,05 (3H, s) 28,5 CH3 C-6, C-7,

C-11, C-13

1,05, (3H, s) 28,7

13 1,04 (3H, s) 16,1, CH3 C-6, C-7,

C-12

1,04 (3H, s) 16,3

14 1,28 (3H, s) 25,8, CH3 C-3, C-4 e

C-5

1,28 (3H, s) 26,1

15 4,69 (tl, 1,4)

4,66 (dl, 3,3 e 1,4)

106,1,CH2 C-1, C-8,

C-9 e C-10,

4,69

4,66

106,3


1H e 150 MHz para



1H e HSQC.

c Correlações no

espectro de HMBC. d (RAGASA et al, 2003,

1H: 400 MHz,

13C: 100 MHz, CDCl3). Deslocamento


151

5.3. Ensaios de avaliação da atividade antioxidante in vitro.

A atividade antioxidante in vitro dos extratos e frações de A. leptopetala foi

avaliada por dois métodos: o teste de sequestro do radical DPPH• e o ensaio de

oxidação do -caroteno, sendo que este permitiu acompanhar dois processos da

oxidação, primário e secundário, além de verificar a capacidade antioxidante de

compostos lipofílicos.

5.3.1 Ensaio para avaliação da redução do radical DPPH

Vários métodos são utilizados para determinar a atividade antioxidante em

extratos e substâncias isoladas, um dos mais usados consiste em avaliar a

capacidade de sequestro, do radical livre DPPH• (ROGINSKY, LISS, 2005) por ação

de um antioxidante (AH) ou uma espécie radicalar (R•), capaz de transferir elétrons

ao radical DPPH•, que ao se reduzir forma difenil-picril-hidrazina, de coloração

amarela, com consequente desaparecimento da coloração púrpura, podendo a

mesma ser monitorada pelo decréscimo da absorbância. Desta forma, este método

avalia apenas o poder redutor do antioxidante, e por esse motivo não detecta

substâncias pró-oxidantes (DUARTE-ALMEIDA et al., 2006). A partir dos resultados

obtidos determinou-se a porcentagem de atividade antioxidante ou sequestradora de

radicais livres e/ou a porcentagem de DPPH• remanescente no meio reacional

(BRAND-WILLIAMS et al., 1995, SÁNCHEZ-MORENO et al., 1998).

A porcentagem de atividade antioxidante (%AA) corresponde à quantidade de

DDPH reduzido pelo antioxidante, sendo que a quantidade de antioxidante

necessária para decrescer a concentração inicial de DPPH em 50% é denominada

concentração eficiente (CE50), também chamada de concentração inibitória (CI50).

Quanto maior a redução de DPPH por uma amostra, menor será a sua CE50 e maior

a sua atividade antioxidante (SOUSA et al., 2007).

As absorbâncias das amostras foram comparadas com as absorbâncias dos

padrões: ácido ascórbico, BHA e BHT. Os padrões sintéticos (BHA, BHT) foram

escolhidos por sua ampla utilização na indústria alimentícia, enquanto que os

152

naturais, por estarem normalmente presentes em frutas e vegetais (KAO et al.,

2005).

A quantidade de extrato testado capaz de decrescer a concentração inicial de

DPPH em 50%, CE50 (Tabela7), variou de 10,10 ± 1,96 a 59,10 ± 20,0 µg.mL-1,

sendo que o extrato EMF (CE50=10,10 ± 1,96 µg.mL-1) mostrou-se comparável ao

controle positivo BHT (CE50=10,75 ± 0,17 µg.mL-1). Esses resultados mostram que

todos os extratos têm atividade sequestradora do radical DPPH•.

Tabela 12 - Atividade antioxidante (CE50), conteúdo de fenóis totais e flavonoides totais dos extratos de A. leptopetala.

Os valores de CE50 foram obtidos por interpolação a partir da análise de regressão linear, com 95% de nível de confiança. CE50= Concentração eficiente capaz de decrescer em 50% a quantidade inicial de DPPH; Os valores são dados como média ± DP (n = 3). EHF: extrato hexânico das folhas; EHR: extrato hexânico dos ramos; EMF: extrato metanólico das folhas; EMR: extrato metanólico dos ramos; controles positivos – AA: ácido ascórbico; BHA: butilhidroxianisol; BHT: butilhidroxitolueno; mg EqAG: miligramas de equivalente de ácido gálico; mg EqC: miligramas de equivalente de catequina; DPPH: 2,2-difenil-1-picrilhidrazil; ID: indeterminado.

O DPPH pode reagir com compostos fenólicos, que nas plantas podem ser

enquadrados em diversas categorias, como fenóis simples, ácidos fenólicos

(derivados de ácido benzoico e cinâmico), cumarinas, flavonoides, estilbenos,

taninos condensados e hidrolisáveis, lignanas e ligninas, bem como com ácidos

aromáticos (NACZK; SHAHIDI, 2004), além de carotenoides (AJILA et al., 2007).

Os resultados obtidos na determinação dos fenóis totais e flavonoides totais,

apresentados na Tabela 12, mostram que os extratos EMF e EMR apresentaram

teores de compostos fenólicos e de flavonoides superiores aos extratos hêxanicos,

sendo estes resultados condizentes com dados de outras espécies de Annona

Amostras CE50 DP ( µg.mL-1) Fenóis

(mg EqAG.g-1)

Flavonoides

(mg EqC.g-1)

EHF 59,10 20,00 23,51 2,36 ID

EHR 53,93 0,89 11,01 0,83 39,25 1,84

EMF 10,10 1,96 125,9 7,34 160,7 10,35

EMR 55,43 1,21 184,6 8,42 160,3 2,49

AA 2,10 0,04 -- --

BHA 2,09 0,20 -- --

BHT 10,75 0,17 -- --

153

descritas na literatura (RABÊLO et al., 2014b, ALMEIDA et al., 2014, LOIZZO ET

AL., 2012, JULIÁN-LOAEZA ET AL., 2011,ROESLER et al., 2007).

Contudo observou-se uma correlação negativa entre fenóis totais e a CE50 para

todos os extratos testados, conforme mostrado na Figura 65, com base na equação

da reta proposta por Sousa et al. (2007), obtida a partir do padrão ácido gálico. Esta

análise sugere que existem constituintes que contribuem particularmente e mais

efetivamente para a ação sequestradora de radicais livres, os quais são comuns a

todos os extratos analisados.

Figura 65: Correlação entre o teor de fenóis totais e CE50 dos extratos hexânico e metanólico das folhas e dos ramos de A. leptopetala.

Correlação entre os fenóis totais expressos em equivalente de ácido gálico, EqAG e a atividade antioxidante expressa como concentração eficiente, CE50 dos extratos: (1) EHF: extrato hexânico das folhas, (2) EHR: extrato hexânico dos ramos; (3) EMF: extrato metanólico das folhas; e (4) EMR: extrato metanólico dos ramos.

Mesmo em menor proporação é possível considerar para os extratos

metanólicos a participação de compostos fenólicos na captura de radicais livres

DPPH, como flavonoides e alcaloides fenólicos, cujo efeito antiradicalar desse último

está relacionado particularmente à presença de grupos fenólicos livres, onde o

hidrogênio é facilmente abstraível (RACKOVÁ et al., 2004), como ocorre em

laurotetanina e norannuradapurina, identificadas neste estudo e discretamina

previamente reportada nesta espécie, com comprovada atividade antioxidante

0102030405060708090

100110120130140150

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900

Ati

vid

ade

anti

oxi

dan

te, C

E50

(g/

mL)

Fenóis totais (mg de EAG/g de extrato)

1 2

3

4

y= -0,164x + 153,946 R = -0,998

154

(SILVA et al., 2009), como pode ser observado na Figura 66 Esses alcaloides por

terem grupos metoxila em orto protegem o núcleo fenólico, conferindo a essas

moléculas propriedades antioxidantes interessantes (Cassels et al., 1995).

Figura 66: Alcaloides fenólicos presentes em A. leptopetala.

1

2

3 4

5

6a NH

H3CO

OH

3a

3b

7

7a

8

9

10

11

11a

1aH3CO

H3CO

1

23

3b

3a

4

5

6a

77a

8

9

10

11

11a

1a

OH

NH

O

O

H

OCH3

OH

OHN

H

H3CO

OCH3

Laurotetanina Norannuradapurina Discretamina

Destaca-se também o potencial antiradicalar de alcaloides não-fenólicos, devido

ao seu núcleo aporfínico (MARTINÉZ et al., 1992) capaz de deslocalizar elétrons

desemparelhados através da estrutura de ligações duplas conjugadas. Esses

compostos são bem representativos entre as espécies do gênero Annona, a

exemplo de A. leptopetala, que teve confirmada a presença dos alcaloides anonaina

e nornuciferina nas folhas, no presente estudo, os quais demonstraram ter ação

sequestratante frente ao radical DPPH segundo Liu et al. (2014).

Outros compostos que por exibirem atividade antioxidante, podem justificar o

efeito demonstrado pelos extratos são as acetogeninas, cuja característica estrutural

que lhes conferem atividade corresponde ao anel lactônico ,-insaturado, o qual

garante a estabilidade da molécula oxidada por meio de deslocamento eletrônico

(LIMA et al., 2010). Com destaque também para os tocoferóis e fitoesteróis como o

-sitosterol, estigmasterol e campesterol, que apresentaram ação antiradicalar frente

ao DPPH (LUIZA; JORGE, 2013), além de mono e sequiterpenos oxigenados

155

presentes em óleos essenciais (COSTA et al., 2011), ésteres benzílicos

(SACCHETTI et al., 2005), espatulenol com ação antiradicalar comprovada por

divesos estudos (DE SOUZA ARAÚJO et al., 2015, CHALESHTORI et al., 2013,

AYOUGHI et al., 2010, KIRCHNER et a., 2010), triterpenos e carotenoides.

Essas classes de compostos citadas acima são reconhecidas por suas

propriedades antioxidantes bem descritas na literatura, podendo as mesmas serem

as responsáveis pela ação observada nos extratos, tendo em vista que essas

classes foram apontadas nos extratos, através da prospecção fitoquímica.

5.3.2 Inibição da oxidação acoplada ao sistema -caroteno/ácido linoleico

A oxidação do ácido linoleico assim como de outros ácidos graxos poli-

insaturados resulta na formação de radicais peroxil (ROO•). Na ausência do

antioxidante, o ROO• pode retirar um átomo de hidrogênio de substratos próximos

como os lipídios, gerando um novo radical livre que leva à completa oxidação do

ácido linoleico, cujos produtos de degradação podem oxidar o β-caroteno. A

presença de substâncias antioxidantes, no entanto, pode impedir a oxidação do

ácido linoleico, retardando a reação em cadeia de radicais livres em uma ou mais

etapas (NASCIMENTO et al., 2010).

A eficiência antioxidante das amostras-teste foi avaliada em meio lipídico, tendo

como parâmetro o perfil antiradicalar dos padrões sintéticos BHA, BHT e ácido

ascórbico (AA). A atividade antioxidante das amostras-teste e dos padrões foi

verificada a cada 30 minutos, totalizando 120 minutos de análise, a qual foi expressa

na forma de percentual de inibição da oxidação (%I) e encontra-se representada na

Figura 67.

Os resultados apresentados na Figura 67 mostram que os padrões BHA e BHT

exibiram boa eficiência antioxidangte por este ensaio, o que está condizente com a

literatura (DUARTE-ALMEIDA et al., 2006), embora não tenham apresentado uma

linearidade (Figura 67), devido a existência de várias etapas na oxidação (iniciação,

propagação e fase terminal) e também pelas particilaridades dos antioxidantes.

156

O ácido ascórbico é amplamente conhecido por sua ação antioxidante e por isto

é empregado no tratamento de doenças degenerativas, em cosméticos (DUARTE-

ALMEIDA et al., 2006) e em alimentos (ANGELO; JORGE, 2007). Como pode ser

observado na Figura 67, o ácido ascóbico no sistema β-caroteno/ ácido linoleico

apresentou comportamento pró-oxidante, indicado pelo percentual negativo de

inibição da oxidação. Este resultado está coerente com outros estudos reportados

na literatura (DUARTE-ALMEIDA et al., 2006, HASIMOTO et al., 2005). Isso ocorre

porque o ácido ascórbico, após doar os dois hidrogênios, torna-se passível de

receber elétrons, devido ao radical ascorbila formado, que é um agente oxidante

(DUARTE-ALMEIDA et al., 2006, BORS; BUETTNER, 1997).

Um antioxidante é qualquer substância capaz de retardar ou impedir danos

devido àoxidação, estando presente em pequenas concentrações, em relação ao

agente oxidante (SILVA et al., 2010) e que na forma oxidade seja estável (RICE-

EVANS et al., 1996).

Com isso constata-se através dos resultados deste ensaio (Figura 67) que todas

as amostras avaliadas exibiram significativa habilidade de inibir a oxidação no

decorrer dos 120 min de análise, com percentuais de inibição no tempo final (t=120

min) que variaram de 79,5 ( 0,82) a 93,0% ( 1,14) (Tabela 13). Estes valores, por

sua vez, são mais condizentes com o dos padrões BHA e BHT. Destaca-se também

que essa atividade que se manteve durante toda a análise, indica que os compostos

presentes nas amostras-teste apresentam estabilidade oxidativa.

157

Figura 67: Análise dos grupos da atividade antioxidante em sistema da co-oxidação do β-caroteno/ácido linoleico dos extratos em intervalos de 30 min.

EHF: extrato hexânico das folhas; EHR: extrato hexânico dos ramos; EMF: extrato metanólico das folhas; EMR: extrato metanólico dos ramos; FNF: fase neutra das folhas; FNR: fase neutra dos ramos; FALCF: fração alcaloídica das folhas; FALCR: fração alcaloídica dos ramos; controles positivos – AA: ácido ascórbico; BHA: butilhidroxianisol; BHT: butilhidroxitolueno Os valores referem-se à média de três determinações.

BHA BHT AA FALCF FALCR EHF EHR EMF EMR FNF FNR-100

-50

0

50

100

150

30 60 90 120

% d

e a

tivid

ad

e a

nti

oxid

an

te

158

Tabela 13 - Inibição da oxidação em sistema -caroteno/ácido linoleico dos extratos e fases de A. leptopetala.

Os valores referem-se à média de três determinações (tempo t =120 mim). BHA: butilhidroxianisol; BHA: butilhidroxitolueno; AA: ácido ascóbico; FALCF: fração alcaloídica das folhas; FALCR: fração alcaloídica dos ramos; EHF: extrato hexânico das folhas; EHR: extratos hexânico dos ramos; EMR: extrato metanólico dos ramos; EMF: extrato metanólico das folhas; FNF: faae neutra das folhas; FNR: fase neutra dos ramos.

O mecanismo de ação dos antioxidantes foi acompanhado através de curvas

cinéticas construídas a partir do decaimento da absorbância do β-caroteno em

função do tempo, pelo método das tangentes, obtendo-se os fatores F1 e F2. De

acordo com os esses fatores (Tabela 14) foi demonstrado que os componentes das

amostras analisadas apresentaram eficiência no bloqueio da formação de peróxidos,

com base nos valores de F1, como também participaram de reções secundárias

durante o processo oxidativo, como decomposição de hidroperóxidos e estabilização

de compostos formados ao longo desse processo, evidenciado por F2. Lembrando

que se os valores de F1 e F2 forem superior a 1, então o antioxidante passa a

exercer um efeito contrário, ou seja, pró-oxidante (PO), contribuindo para as reações

oxidativas (GALVÃO et al., 2008, DUARTE-ALMEIDA et al., 2006, YANISHILIEVA;

MARINOVA, 1995), sendo este comportamento observado no presente estudo para

Amostras (%) inibição da peroxidação na concentração de 200 µg.mL

-1 (t =120min)

FALCF 79,52 (0,82)

FALCR 83,4 (1,32)

EHF 88,6 (1,67)

EHR 81,4 (2,66)

EMR 93,0 (1,04)

EMF 89,86 (3,21)

FNF 79,83 (6,11)

FNR 83,87 (1,14)

AA* 9,30 (6,48)

BHA* 103,9 (0,32)

BHT* 104,7 (0,67)

159

o ácido ascóbico, o qual já havia sido reportado na literatura (DUARTE-ALMEIDA et

al., 2006).

Desta maneira, a partir da análise dos fatores F1 e F2, mostrados na Tabela 14,

observa-se um comportamento cinético antioxidante relevante para todas as

amostras-teste ensaiadas, indicando que os compostos antioxidantes presentes são

bons sequestradores de radicais livres, capazes de bloquear as reações na etapa de

iniciação, bem como participam de reações secundárias, estabilizando espécies

reativas, caracterizando-se assim os compostos como antioxidantes primários e

secundários.

Tabela 14 - Parâmetros cinéticos caracterizando a inibição da oxidação do sistema β-caroteno/ácido linoleico pelas amostras de A. leptopetala.

F1= relação entre as tangentes das curvas cinéticas da solução padrão ou teste e o controle entre 0 e 30 min; F2= relação entre as tangentes das curvas cinéticas da solução-padrão ou teste e o controle entre 60 e 120 min. Os valores foram calculados a partir da média de três determinações. BHA: butilhidroxianisol; BHA: butilhidroxitolueno; AA: ácido ascóbico; FALCF: fração alcaloídica das folhas; FALCR: fração alcaloídica dos ramos; EHF: extrato hexânico das folhas; EHR: extratos hexânico dos ramos; EMR: extrato metanólico dos ramos; EMF: extrato metanólico das folhas; FNF: faae neutra das folhas; FNR: fase neutra dos ramos.

Fatores

Amostras F1 F2

FALCF 0,36 0,01

FALCR 0,30 0,04

EHF 0,14 0,05

EHR 0,21 0,22

EMR 0,12 0,06

EMF 0,12 0,04

FNF 0,27 0,09

FNR 0,31 0,10

AA* 1,64 0,04

BHA* 0,05 0,01

BHT* 0,04 0,02

160

Foi possível observar uma correlação positiva entre os resultados da

quantificação de fenóis e de flavonoides e a atividade antioxidante apresentada

pelos extratos metanólico EMF e EMR no ensaio do -caroteno/ ácido linoleico.

Sendo este um indício de que a atividade antioxidante desses extratos, assim como

dos seus derivados (FNF, FNR, FALCF e FALCR), pode ser atribuída à presença de

compostos fenólicos, além de outros constituintes não fenólicos. Para os extratos

hexânico EHF e EHR, essa correlação não foi observada. Ainda assim, é possível

que haja compostos fenólicos atuando nesses extratos, embora não tenham sido

detectados pelos métodos empregados neste estudo. Considera-se também que

haja nesses extratos apolares, outras classes com ação antioxidante, que não

necessariamente sejam substâncias fenólicas.

Dentre os compostos que podem justificar a atividade antioxidante dos extratos

metanólico e seus derivados, destacam-se os alcaloides aporfínicos, devido ao seu

núcleo aporfínico (MARTÍNEZ et al., 1998) capaz de estabilizar espécies reativas por

ressonância, e por apresentarem um hidrogênio benzílico, posicionado próximo ao

par de elétron do nitrogênio, sendo esta característica estrutural considerada a

possível chave para o efeito antioxidante de aporfinas não-fenólicas (CASSELS et

al., 1995). Apontam-se também os alcaloides fenólicos (COSTA et al., 2015), os

quais apresentarem hidroxilas redutoras, onde o hidrogênio ativo é abstraído pelos

radicais livres R• e ROO•, convertendo-se em um radical estabilizado por

ressonância e que não tem a capacidade de iniciar e de propagar reações

oxidativas.

Vários alcaloides aporfínicos já foram descritos na espécie A. leptopetala, a

exemplo de anonaina, que juntamente com nornuciferina, laurotetanna e

norannuradapurina, foram identificados nesta espécie no presente estudo. Anonaina,

por sua vez, teve o seu potencial antioxidante confirmado no sistema β-

caroteno/ácido linoleico (UBEDA etal., 1993, LIU et al., 2014). Somam-se a isso, as

características estruturais dos alcaloides fenólicos descritos neste estudo, que

atendem às relações de estrutura-atividade para atuarem como bons agentes

antioxidantes. Desta forma, era esperado que as frações alcaloídicas

demonstrassem elevada ação antiperoxidativa.

Outros compostos com propriedades antioxidantes reconhecidas e que podem

estar presentes nas amostras testadas correspondem aos derivados benzílicos,

161

constituintes de óleos essenciais, como mono e sesquiterpenos oxigenados,

triterpenos, esteroides, carotenoides, tocoferóis, podendo inclusive ser atribuído

particularmente aos compostos lipossolúveis citados a habilidade de proteção contra

a oxidação demonstrada pelos extratos EHF e EHR. Esses compostos juntamente

com constituintes fenólicos, como alcaloides e flavonoides, podem por sua vez ser

os responsáveis pela ação demonstrada pelos extratos metanólicos, EMF e EMR, e

pelas fases neutras (FNF e FNR).

Considerando os resultados dos dois ensaios antioxidantes, fica confirmado que

as amostras ensaiadas exibiram um bom efeito antiradicalar no ensaio da co-

oxidação do -caroteno, indicando que os compostos presentes nesses extratos e

fases têm grande habilidade na inibição da peroxidação lipídica, provavelmente

devido a maior especificidade do ensaio para compostos lipofílicos.

5.4. Avaliação da atividade citotóxica in vitro de A. leptopetala pelo ensaio do MTT e

do MTS

A avaliação citotóxica preliminar das amostras-teste envolveu quatro linhagens

de células tumorais humanas, através do método do MTT com as linhagens HCT-

116 (colorretal), HL-60 (leucemia) e SF-295 (glioblastoma) e do método MTS, com a

linhagem sarcoma S-180. Nos dois ensaios a citotoxicidade foi determinada como

percentual de inibição de crescimento celular (%IC), sendo este valor, utilizado para

determinar o potencial citotóxico com base numa escala de intensidade, já citada

anteriormente. Os experimentos foram analisados segundo a média desvio padrão

da média da porcentagem de inibição do crescimento celular, usando o programa

GraphPad Prism. No ensaio do MTT, cada amostra foi testada em triplicata em dois

experimentos independentes. A atividade citotóxica das amostras está representada

na Tabela 15, bem como os resultados referentes ao ensaio do MTT encontram-se

representados nas Figuras 68 e 69.

Notadamente, os extratos hexânicos apresentaram efeito citotóxico frente à

linhagem de sarcoma S-180, com %IC entre 80 e 90%, enquanto as amostras

162

oriundas de EHF, correspondentes à SBF-D1, SBF-D2 e espatulenol exibiram

elevado efeito antiproliferativo contra as linhagens tumorais humanas, HCT 116, HL-

60 e SF-295, conforme exposto na Tabela 15. Isto pode ser um indicativo de que no

extrato hexânico das folhas haja constituintes com certa seletividade frente às

células do sarcoma S-180.

As substâncias SBF-D1 e SBF-D2 por revelação com reagente de Kedde,

apresentaram indícios da presença de anel lactônico, o qual é comumente

encontrado em acetogeninas.

Tabela 15 - Inibição do crescimento (%IC) de extratos e frações de A. leptopetala pelo método do MTT e do MTS frente a quatro linhagens de células tumorais.

Ensaio MTT: média dos valores de %IC com um intervalo de confiança de 95% obtido por regressão não linear, feitos em triplicata em 3 linhagens tumorais testadas na concentração máxima de 50 μg/mL. MTS: amostras testadas na concentração de 50 μg/mL.

a composto puro: 5µg/mL;

b: baixa

solubilidade em DMSO (-): não avaliado. CN (controle negativo): suspensão celular sem tratamento

com 100% de células de viáveis. FALCF: fração alcaloídica das folhas; FALCR: fração alcaloídica dos ramos; EHF: extrato hexânico das folhas; EHR: extratos hexânico dos ramos; EMR: extrato metanólico dos ramos; EMF: extrato metanólico das folhas; FNF: faae neutra das folhas; FNR: fase neutra dos ramos. SBF-D1, SBF-D2: compostos isolados do EHF;

Amostras MTT MTS

HCT - 116 HL - 60 SF - 295 SARCOMA -180

SBF-D1 77,3 2,60 96,5 1,99 72,3 1,80 19,7a,b

SBF-D2 99,1 0,42 96,9 1,06 98,1 0,49 14,3a,b

Espetulenol 97,9 0,33 96,9 0,4 97,6 0,33 -

G-2 39,5 77,5 27,6 35,6

EHF 44,2 15,1 39,2 83,0

EHR 50,8 27,0 44,6 90,5

EMF 60,8 38,9 -212,2 64,8

EMR 62,5 19,0 48,7 76,9

FALCF 84,2 64,5 58,3 92,0

FALCR 82,7 81,8 61,4 79,5

Metotrexato - - - 52,7

163

Amostras testadas na concentração de 50 μg.mL

-1 para extratos e frações e de 5 µg.mL

-1(*) para

compostos puros no ensaio MTS. MTX: metotrexato; CN: controle negativo.

D a ta 1

A M O S T R A S

SB

F D

I

SB

F D

II

SB

F II-

3G

2

EH

F

EH

R

EM

F

EM

R

FA

LC

F

FA

LC

R

FN

F

FN

R

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

H C T -1 1 6

% I

C..

...

H L -6 0

A M O S T R A S

%IC

SB

F D

I

SB

F D

II

SB

F II-

3G

2

EH

F

EH

R

EM

F

EM

R

FA

LC

F

FA

LC

R

FN

F

FN

R

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

1 0 0

S A R C O M A -1 8 0

A M O S T R A S

%IC

SB

F D

I

SB

F D

IIG

2

EH

F

EH

R

EM

F

EM

R

FA

LC

F

FA

LC

R

FN

F

FN

R

MT

XC

N

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

1 0 0

**

Figura 68: Inibição do crescimento (IC) dos extratos e das frações no ensaio com 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenill)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio (MTS).

Figura 69: Inibição do crescimento (IC) dos extratos e das frações no ensaio com brometo 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT).

164

Por este estudo foi confirmado o potencial citotóxico do composto espatulenol,

codificado como SBF II-3, que apresentou valores de IC acima de 90%, frente a três

linhagens tumorais humanas, HCT-116, SF-295 e HL-60, na concentração de 50

µg.mL-1. Esse efeito antiproliferativo demonstrado por este composto está

condizente com dados reportados na literatura segundo Bomfim et al. (2015).

Assim como o espatulenol, o composto SBF D2 foi extremamente ativo frente às

mesmas células tumorais, como pode ser constatada na Tabela 15 e Figura 69,

apresentando também percentual de inibição superior a 90%. Inclusive este

composto, mostrou-se muito similar ao espatulenol, através de análise por CCD com

valores de Rf muito próximos.

Destaca-se também o elevado efeito do terceiro composto SBF D1, contra as

células de câncer HL-60, apresentando moderada atividade frente às linhagens

celulares de câncer SF-295 e HCT-116.

Vários estudos reportam compostos com potencial citotóxico presente no extrato

hexânico de anonáceas. A partir do extrato hexânico das cascas de Cananga

latifolia, foram isoladas acetogeninas lineares, as quais exibiram efeito citotóxico

sobre três linhagens de células de câncer, com valores de CI50 entre 16,0 e 129,7

µM (WONGSA et al., 2011). Outro trabalho desenvolvido por Lima et al. (2010),

S F -2 9 5

A M O S T R A S

%IC

SB

F D

I

SB

F D

II

SB

F II-

3G

2

EH

F

EH

R

EM

F

EM

R

FA

LC

F

FA

LC

R

FN

F

FN

R

-2 0 0

-1 5 0

-1 0 0

-5 0

0

5 0

1 0 0

165

descrevem o isolamento de várias acetogeninas, obtidas a partir do extrato hexânico

das sementes de A. cornifolia. Do Nascimento et al. (2003) também reportam o

isolamento de acetogeninas monotetrahidrofurânicas do extrato hexânico das folhas

de Annona laurifólia Dunal.

Somado a isto, análises com o óleo essencial de A. vepretorum confirmaram seu

potencial antitumoral in vivo e citotóxico in vitro, o qual apresentou em sua

composição a presença marcante de sesquiterpenos e de monoterpenos. Nesse

mesmo estudo foi confirmado o efeito citotóxico in vitro do composto espatulenol

(BOMFIM et al., 2015).

São citadas também outras classes químicas no extrato hexânico com

comprovada ação citotóxica como a dos diterpenos do tipo ent-caurano, muito

comuns em espécies do gênero Annona (DUTRA et al., 2014a) e de ésteres

metílicos de ácido graxos (LIMA et al., 2012). Um estudo recente com o extrato

hexânico de Guatteria blepharophylla revelou seu potente efeito citotóxico contra

várias linhagens de células tumorais, o qual apresentou como constituinte óxido de

cariofileno, -sitosterol, estigmasterol, lichexantona e espatulenol (COSTA et al.,

2011b). O composto liquexantona, por exemplo, já foi anteriormente descrito na

espécie A. leptopetala, obtido da fração alcaloídica das cascas (ARRIAGA et al.,

2008). Além disso, diversos trabalhos têm apontado a ação anticâncer de xantonas

(LIN et al., 1996, ASANO et al., 1996, PERMANA et al., 1994)

Com base nos dados da literatura bem como com os resultados da análise

fitoquímica preliminar, aponta-se como as possíveis classes responsáveis pelo efeito

citotóxico demostrado por EHF, EHR e por seus derivados, a dos mono e

sesquiterpenos, com destaque para o composto espatulenol, o qual foi isolado e

caracterizado neste estudo e que possui comprovada atividade citotóxica, além de

ésteres metílicos de ácidos graxos, acetogeninas, diterpenos do tipo ent-caurano e

xantonas.

Por meio do ensaio de citotoxicidade também foi avaliado o perfil dos extratos

metanólicos tanto das folhas como dos ramos, que embora tenham sido ativos, no

geral apresentaram efeito inferior em relação às suas respectivas frações

alcaloídicas e neutras. Ainda assim, destaca-se que a atividade dos extratos

metanólicos se deve em parte aos constituintes presentes nas fases neutras, bem

como aos alcaloides. Nota-se que os extratos EMF e EMR foram mais seletivos para

166

os grupos de células de câncer, HCT-116 e sarcoma-180, com atividade moderada.

Este resultado se refletiu nas amostras alcaloídicas, porém, observa-se uma

acentuada melhora no efeito, sendo estas consideradas altamente ativas, com

valores de IC em torno de 79,5 e 92% de acordo com a Tabela 15 e Figura 69. Além

disso, verificou-se que a fração FALCR, também demonstrou elevado efeito contra a

linhagem celular de câncer HL-60. O mesmo efeito também foi verificado para as

fases neutras, sendo a FNF, muito ativa frente às linhagens tumorais HCT 116 e HL-

60, com valores de IC de 86,6 e 90,21%, respectivamente, observou-se também que

esta amostra foi fortemente ativa contra células tumorais de sarcoma-180 (%IC =

87,16), já FNT demonstrou elevada atividade apenas contra células do sarcoma-

180, enquanto em relação às demais foi considerado moderadamente ativa.

Dentre os alcaloides previamente isolados desta espécie e que tiveram sua

atividade citotóxica confirmada, pode-se citar anonaina, que exibiu efeito citotóxico

frente a diversas linhagens de células tumorais (CHEN et al., 2011; MOHAMED et

al., 2010; CHEN et al., 2008), o qual também foi isolado neste estudo, a partir da

FALCF; o alcaloide oxaporfínico liriodenina, considerado um do alcaloides mais

estudados devido suas promissoras atividades citotóxicas e antitumorais (SILVA et

l., 2007, SIQUEIRA et al., 1998; CHANG et al., 2004). Este alcaloide também

demonstrou efeito antiproliferativo e baixa toxicidade frente a células sadias,

verificado por Suresh et al. (2012a). Nos oxoaporfínicos a planaridade tem papel de

destaque, em relação aos demais aporfínicos e esta se deve à presença de uma

carbonila em C-7 que favorece a extensão da conjugação no sistema aporfínico,

somado a isto, a inserção de substituintes 1,2-metilenodióxi contribui para a

atividade citotóxica desses alcaloides (SILVA et al., 2007).

Entre os tetrahiprotoberberínicos, destaca-se a dehidrodiscretamina que

demonstrou efeito antitumoral, relacionado à inibição específica de topoisomerase I

e os autores sugerem, com base em estudos de estrutura-atividade, que o íon

amônio pode desempenhar um papel importante na inibição da referida enzima,

nesse mesmo estudo verificaram que discretamina também apresentou o mesmo

efeito inibidor enzimático (CHENG et al., 2008).

Frente ao que fora exposto, concernete a atividade antiproliferativa de alcaloides

outrora identificados na espécie A. leptopetala, isto reflete o potencial anticâncer

apresentado pela mesma. Tendo em vista ainda, que no presente estudo, outros

167

alcaloides foram identificados, os quais também têm reconhecida ação citotóxica,

como laurotetanina segundo Chen et al. (1995), sendo inclusive considerado um

compostos com potencial anticâncer por Stévigny et al. (2005), assim como

norannuradapurina, a qual também teve seu efeito antiproliferativo constatado

(Tzeng et a., 1990). Com destaque também para nornuciferina, identificado neste

estudo e que apresenta comprovado efeito citotóxico (DUNAL ET AL., 2013). Tais

dados justificam a atividade citotóxica demonstrada pelas frações alcaloídicas.

Dados da literatura referentes à avaliação citotóxica de extratos metanólicos de

espécies da família Annonaceae, atribuem essa atividade principalmente a duas

importantes classes de compostos, a dos alcaloides, sendo os aporfínicos um dos

grupos mais citados (SURESH et al., 2014, SUN et al., 2014, COSTA et al., 2011b,

MOHAMED et al., 2010, STÉVIGNY et al, 2005) e das acetogeninas (SUN et al.,

2014a, SURESH et al., 2012, 2012a, OBERLIES et al.,1997). Tanto alcaloides

isoquinolícos, como acetogeninas presentes nesta espécie têm propriedades

citotóxicas confirmadas na literatura, como as acetogeninas rolliniastatina-1 com

comprovado efeito citotóxico (DE PEDRO et al., 2013; RUPPRECHT et al., 1990) e

bullatacina com ação antitumoral e citotóxica (CHIU et al., 2003; RUPPRECHT et al.,

1990), além de xantonas conhecidas por suas propriedades anticâncer (LIN et al.,

1996, ASANO et al., 1996), a exemplo da liquexantona, isolada desta espécie, como

já mencionado anteriormente. Tais compostos podem estar presentes nos extratos

metanólicos, bem como nas fases neutras, contribuindo para o seu efeito citotóxico.

5.5. Ensaio da atividade antibacteriana

Os extratos metanólicos, hexânico, fases neutras, frações alcaloídica das folhas

e ramos e a fração G2, foram avaliados quanto à sua atividade antibacteriana pelo

método da microdiluição (SANTOS et al., 2012). Os resultados foram expressos

como concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima

(CBM) em µg.mL-1. Os experimentos foram realizados em triplicata, para cada cepa

indicadora utilizada.

168

O critério adotado para classificar a atividade das amostras oriundas de A.

leptopetala foi a seguinte: CIM menor 1000 µg.mL-1, foi considerado como boa

atividade antibacteriana, para CIM entre 1000 e 5000 µg.mL-1, correspondia a

atividade moderada, para CIM entre 5000 e 10000 µg.mL-1, a atividade era

considerado fraca e para CIM acima de 10000 µg.mL-1, seria considerado inativo

(HOLETZ et al., 2002; PRETTO et al., 2004).

Na Tabela 16 são apresentados os resultados da atividade antibacteriana das

amostras obtidas de A. leptopetala.

169

Tabela 16 - Concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) de extratos e frações de folhas e ramos de A. leptopetala.

EF:Enterococcus faecalis; EC: Escherichia coli; KP: Klebsiella pneumoniae; SE: Salmonela enterica; SM,; Serratia marcescens; SF: Shigella flexneri; SA: Staphylococcus aureus. (-): sem atividade. Controle negativo (DMSO): indicou crescimento bacteriano ativo.

TRATAMENO CIM (µg.mL-1

) CBM (µg.mL-1

)

EF EC KP SE SM SF SA EF EC KP SE SM SF SA

EHF 312 2500 5000 5000 312 312 312 312 2500 - - 5000 312 -

EHT 2500 5000 5000 - 312 312 2500 - 5000 - - 5000 5000 5000

EMF 2500 2500 2500 5000 312 312 625 5000 2500 - - 2500 2500 1250

EMT 5000 1250 - - 5000 312 5000 - 1250 - - 5000 5000 -

FNF 625 5000 1250 625 625 625 312 2500 5000 - 5000 - 5000 5000

FNT 2500 2500 5000 5000 2500 5000 5000 2500 2500 5000 5000 5000 5000 5000

G2 625 625 1250 5000 5000 5000 1250 625 625 5000 5000 5000 5000 1250

FALCF 416 833 416 416 833 52 208 410 833 416 416 833 833 208

FALCT 833 833 833 1660 1660 52 416 833 833 833 1660 1660 1660 416

170

Os resultados do ensaio antibacteriano (Tabela 16) demonstram que de todas as

amostras analisadas, apenas EHR não exibiu atividade contra Klebsiella

pneumoniae e EMR não foi ativo contra Salmonella enterica e K. pneumoniae. As

demais amostras foram ativas contra todas as cepas testadas.

O extratos hexânico, EHF e EHR, apresentaram boa atividade contra Serratia

marcescens, ambos com MIC de 312 µg.mL-1, sendo este efeito considerado

bactericida. EHF também foi ativo contra Enterococcus faecalis e Staphylococcus

aureus, na menor concentração testada (MIC 312 µg.mL-1), enquanto EHR, mostrou

efeito moderado frente às mesmas cepas. Esses resultados apontam que EHF tem

compostos com maior espectro de ação antibacteriana em relação ao EHR.

A fração G2 oriunda do EHF exibiu boa atividade inibitória de crescimento

bacteriano contra E. faecalis e Escherichia coli, e demonstrou efeito moderado em

relação às demais cepas. A partir desta fração foi isolado o composto espatulenol,

que correspondia a um dos constituintes majoritários. Vários estudos reportam a

atividade antibacteriana deste composto (HESS et al., 2007; GALVÃO et al., 2012),

frente a bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (CHINOU et al., 2004). Segundo

Galvão et al.(2012) isto pode ser explicado pela hidrofobicidade, uma característica

importante presente em amostras lipofílicas que lhes permitem interagir com a

membrana celular bacteriana, tornado-a mais permeável, levando à ruptura e

extravasamento do conteúdo celular, o que caracteriza o efeito biocida ou serem

capazes de se infiltrar na célula e interferir nos seus mecanismos metabólicos,

resultando em um efeito bacteriostático.

Desta forma a promissora atividade antibacteriana demonstrada pelos extratos

hexânicos, principalmente de EHF, pode ser atribuída à presença de compostos de

natureza predominantemente lipofílica, como terpenos, a exemplo dos mono e

sesquiterpenos, reportados nos óleos essenciais de várias espécies, (ALIGIANNIS

et al., 2004; GALVÃO et al., 2012), inclusive as do gênero Annona (COSTA et al.,

2008a; DE SOUZA ARAÚJO et al., 2015) por apresentarem promissora atividade

antimicrobiana, além de diterpenos do tipo ent-caurano (Padma et al., 1995) e de

ácidos graxos (SHANKER et al., 2007).

Também foi possível verificar que os extratos metanólicos, EMF e EMF, exibiram

efeito inibitório contra Shigella flexneri, na menor concentração avaliada, CIM = 312

µg.mL-1

, além da boa atividade demonstrada por EMF sobre S. marcescens e S.

171

aureus e moderadamente ativa para as demais. Tal evidência revela que EMF, em

relação à EMR, exibe constituintes com ampla ação antibacteriana.

Outra amostra resultante das folhas e que demonstrou significante ação

antibacteriana foi FNF, principalmente contra S. aureus com CIM de µg.mL-1, além

de exibir boa atividade contra a maioria das cepas, sendo considerada

moderadamente ativa apenas contra K. pneumoniae e S. marcescens. A FNR por

sua vez, mostrou atividade moderada frente a todas as cepas analisadas com CIM

variando de 2500 a 5000 µg.mL-1. Esses resultados reforçam a evidência de que as

folhas apresentam compostos com propriedades antibacterianas promissoras.

Destaca-se também que entre as amostras ativas, as que exibiram efeito

bacteriostático contra K. pneumoniae e S. enterica, foram EHF, EHR e EMF, sendo

também constatado o efeito bacteriostático de EHF e EMR, em relação a S. aureus

e de FNF, para K. pneumoniae e S. marcescens. As demais amostras mostraram

efeito biocida.

El-Changhaby et al. (2014) confirmaram que compostos fenólicos presentes em

A. squamosa, eram os principais responsáveis pela atividade antibacteriana.

Somado a isto, vários estudos com extratos de plantas atribuem a atividade

antibacteriana à presença de compostos bioativos como taninos, compostos

fenólicos, polifenóis e flavonoides (OUATTARA et al., 2011; CUSHINIE et al., 2005).

Com base em tais evidências sugere-se que o efeito antibacteriano dos extratos

metanólicos, deva-se à presença principalmente de compostos fenólicos, podendo

essa evidência ser embasada na quantificação de fenólicos e de flavonoides para

estes extratos. As fases neutras por sua vez, oriundas dos extratos metanólicos,

podem também ter suas atividades atribuídas aos compostos fenólicos, podendo

estes serem tanto flavonoides, como também alcaloides.

Quanto às frações alcaloídicas, estas exibiram os melhores resultados frentes a

todas as bactéria testadas, sendo a fração alcaloídica das folhas, a amostra com

significativa ação antibacteriana, com valores de CIM entre 52 e 833 µg.mL-1. Os

resultados obtidos nesse estudo confirmam o potencial das frações enriquecidas

com alcaloides, estando assim de acordo com o reportado na literatura. Os

alcaloides isoquinolícos, principalmente os aporfínicos, exibem potentes efeitos

antibacterianos bem consolidados na literatura, a exemplo da roemerina, alcaloide

aporfínico, já isolado desta espécie e que demonstrou potente efeito antibacteriano

172

contra cepas de S. aureus (MRSA) (YIN et al., 2015), além de liriodenina, também

obtida desta espécie e que tem elevada ação antibacterina (WIRASATHIEN et al.,

2006), dentre outros alcaloides, os quais justificam o incrível potencial antibacteriano

apresentado por essas frações.

Vale ressaltar que as amostras, no geral, demonstraram atividade antibacteriana

moderada, uma vez que das sete bactérias avaliadas, cinco correspondiam a Gram

(-) e segundo Chan et al., 2007, bactérias Gram (-) são menos sensíveis aos

extratos vegetais que as bactérias Gram (+). Sendo assim, A. leptopetala surge

como um recurso promissor na obtenção de compostos com ação sobre bactérias

Gram (+) e Gram (-).

NH

O

O

H

1

23

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

1

23

3b

3a

4

5

6a

77a

8

9

10

11

11a

1a

OH

NH

O

O

H

OCH3

1

2

3

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

NH

H

H3CO

H3CO

1

2

3 4

5

6a NH

H3CO

OH

3a

3b

7

7a

8

9

10

11

11a

1aH3CO

H3CO

OH H

H

H

H

12

3

4

5

6

7

8

910

15

13

12

14

11

6. Considerações finais

174

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS

O estudo fitoquímico das folhas de A. leptopetala resultou no isolamento do

sesquiterpeno oxigenado espatulenol (SBF II-3) a partir do extrato hexânico, na

identificação de três alcaloides aporfínicos: anonaina (ALC8-S1); norannuradapurina

(ALC8-S2); nornuciferina (ALC8-S3) e no isolamento e elucidação estrutural do

alcaloide apofínico laurotetanina (ALC-4) oriundos da fração alcaloídica das folhas.

Destes, nornuciferina e laurotetanina, estão sendo identificadas pela primeira vez na

espécie e norannuradapurina descrita pela primeiva vez no genêro.

Os alcaloides identificados neste estudo apresentam registros em outras

espécies de Annonaceae, tais como, Xylopia, Alphonsea, Guatteria, Fissistigma,

Goniothalamus, Polyalthia, Dughetia, Desmos dentre outros, indicando que A.

leptopetala é uma espécie típica da família Annonaceae, tornando este trabalho uma

contribuição significativa para o conhecimento quimiotaxonômco do gênero, bem

como da família.

A espécie A. leptopetala apresenta constituintes com potencial antiproliferativo,

demonstrado através da promissora atividade citotóxica dos seus extratos hexânico,

fases neutras e alcaloídicas, tanto das folhas como dos ramos.

O composto espatulenol exibiu potente efeito antiproliferativo, neste estudo,

ratificando a ação já citada na literatura.

Com relação à atividade antibacteriana as amostras foram consideradas

moderadamente ativas, com efeito satisfatório inclusive em relação às bactérias

Gram (-), que segundo a literatura, exibem pouca sensibilidade frente aos extratos

vegetais. Sendo EHF e FALCF as mais ativas.

Quanto à atividade antioxidante, dentre as amostras avaliadas, o EMF exibiu

significativo efeito antiradicalar frente ao radical livre DPPH, cuja ação pode ser

justificada pelo teor de flavonoides e de compostos fenólicos quantificados neste

extrato. Com relação à inibição da peroxidação lipídica, todas as amostras avaliadas

apresentaram promissora atividade antiperoxidativa, atuando nas duas etapas do

processo oxidativo. Com isso sugere-se que essa ação pode estar relacionada tanto

à presença de compostos fenólicos como de compostos lipofílicos nesses extratos.

Sugere-se com base nos resultados de atividade antibacteriana e antioxidante,

determinada por meio do ensaio da co-oxidação do sistema -caroteno/ácido

175

linoleico, que haja uma relação entre essas atividades, de forma que os compostos

que atuam na inibição da oxidação, também tenham ação antibacteriana.

No aspecto geral o potencial antioxidante, antiproliferativo e antibacteriano da

espécie A. leptopetala podem ser justificados pelos compostos identificados neste

estudo como os alcaloides aporfínicos (laurotetanina, norannuradapurina, anonaina

e nornuciferina) e o espatulenol, devido às suas propriedades bem consolidadas na

literatura, bem como por outros compostos já reportados previamente nesta espécie.

Sendo assim, os resultados obtidos neste estudo, tanto confirmam que a espécie

A. leptopetala é uma fonte promissora de substâncias bioativas, como fornecem

indícios que embasam o seu uso como anti-inflamatório e no tratamento de tumores,

na terapia tradicional.

NH

O

O

H

1

23

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

1

23

3b

3a

4

5

6a

77a

8

9

10

11

11a

1a

OH

NH

O

O

H

OCH3

1

2

3

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

NH

H

H3CO

H3CO

1

2

3 4

5

6a NH

H3CO

OH

3a

3b

7

7a

8

9

10

11

11a

1aH3CO

H3CO

OH H

H

H

H

12

3

4

5

6

7

8

910

15

13

12

14

11

Referências

177

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NH

O

O

H

1

23

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

1

23

3b

3a

4

5

6a

77a

8

9

10

11

11a

1a

OH

NH

O

O

H

OCH3

1

2

3

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

NH

H

H3CO

H3CO

1

2

3 4

5

6a NH

H3CO

OH

3a

3b

7

7a

8

9

10

11

11a

1aH3CO

H3CO

OH H

H

H

H

12

3

4

5

6

7

8

910

15

13

12

14

11

Apêndice

RESUMOS SIMPLES

208 ESTUDO FITOQUÍMICO E POTENCIAL CITOTÓXICO DE ANNONA LEPTOPETALA R. E.

FRIES (ANNONACEAE)

CRISTIANE MARIA SOUZA DE CASTRO RODRIGUES1; EMMANOEL VILAÇA COSTA2;

LÍVIA MACEDO DUTRA³; ANDERSSON BARISON3, CLÁUDIA DO Ó PESSOA4; JACKSON

ROBERTO GUEDES DA SILVA ALMEIDA1.

1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO

2 UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS

3 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

4 UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

Introdução: Annona leptopetala R. E. Fries, conhecida popularmente como “pinha brava” é endêmica no Brasil. Estudos fitoquímicos e farmacológicos prévios desta espécie descrevem o isolamento de alcaloides aporfínicos como liriodenina, com promissora atividade antibacteriana, citotóxica e larvicida, do tetrahidroprotoberberínico tetrahidrojathrorrizina, além de acetogeninas, tais classes destacam-se na família Annonaceae, devido as suas propriedades biológicas e farmacológicas como, citotóxica, leishmanicida, analgésica, narcótica, antitumoral, anti-inflamatória, dentre outras. Objetivos: Investigar o potencial químico e citotóxico das frações alcaloidicas de A. leptopetala. Métodos: O material botânico (folhas e talos) foi coletado e identificado pelo botânico André

Paviotti, em abril de 2014 (Custódia-PE). Folhas e talos, secos e pulverizados, individualmente, foram macerados com hexano e metanol. Os extratos metanólicos, após o tratamento ácido-base, forneceram as frações alcaloidicas das folhas FAF e talos FAT. A FAF foi submetida a CCDP, isolando-se o composto 1. O potencial citotóxico da FAF e FAT a 50 µg.mL-1 cada, foi investigado, contra três linhagens de células tumorais humanas, HCT-116, HL-60 e SF-295, pelo método do MTT e mensurado como percentual de inibição de crescimento (GI%). Resultados: O estudo fitoquímico da FAF, resultou no isolamento e

elucidação por técnicas de RMN (1D e 2D) do composto tetrahidrojathrorrizina. De acordo com os testes de citotoxicidade in vitro, FAF com GI% de 84,22% contra HCT-116 e FAT com GI% de 82,77 e 81,77%, frente a HCT-116 e HL-60, respectivamente, exibiram elevada ação, estando de acordo com a literatura. Essa atividade significativa pode estar associada a presença de alcaloides aporfínicos e tetrahidroprotoberberínicos. Conclusões: Dada as

aplicações destas classes de alcaloides e a escassez de estudos para a espécie, mais testes precisam ser conduzidos, a fim de descobrir novos agentes terapêuticos.

Palavras-chave: Annona leptopetala; tetrahidrojathrorrizina; efeito citotóxico.

Apoio Financeiro: FACEPE e CNPq.

Alkaloids from the leaves of Annona leptopetala (Annonaceae)

Cristiane Maria Souza de Castro Rodrigues a, Lívia Macedo Dutra

b, Andersson Barison

b

Emmanoel Vilaça Costa c and Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida

a,*

aNucleus for Study and Research of Medicinal Plants, Federal University of Vale do São

Francisco, 56.304-205, Petrolina, Pernambuco, Brazil.

bNMR Center, Federal University of Paraná,, PO Box 19081, 81531-990, Curitiba, Paraná,

Brazil.

cDepartment of Chemistry, Federal University of Amazonas, 69077-000, Manaus, Amazonas,

Brazil.

_____________________________

* Corresponding author: Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida


Francisco, Campus Universitário, Av. José de Sá Maniçoba, s/n, Centro, Petrolina, PE,

56.304-205, Brazil.

Tel./Fax: +55- 87-2101-6863

E-mail address: [email protected] (J.R.G.S. Almeida)

mailto:[email protected]

Abstract

The present work describes the isolation of corypalmine, laurotetanine, nornuciferine,

anonaine and norannuradhapurine from leaves of Annona leptopetala (R. E. Fr.) H. Rainer.

The structures were established after analysis of their NMR spectral data including 2D NMR

experiments. This is first report of laurotetanine in A. leptopetala and of the norannuradhapurine

in the Annona genus. The 13

C-NMR spectral data of the natural alkaloid norannuradhapurine are

reported here for the first time, as well as the NMR data for these compounds were reviewed.

Keywords: Alkaloids, Annona leptopetala; Chemotaxonomy; NMR.

1. Subject and source

Annona leptopetala belongs to the Annonaceae Family; which is the accepted name, with

the recent inclusion of the genus Rollinia to the Annona genus (Rainner, 2007). A. leptopetala

is an endemic tree or shrub Brazil, it is found in the states of Bahia, Pernambuco, Ceará and

Piauí, ocorring in the savanna region, and Minas Gerais (Maas et al., 2015). This species is

popularly as “ata-brava” and display intense toxicity when eaten by animals (Arriaga et al.,

2008). In popular medicine it is used as a digestive, in the treatment of tumors and

inflammation (Agra et al., 2007).

The leaves and branches de A. leptopetala were collected in Reservatório Copiti in Apryl

2014, in the city of Custódia [coordinates: 08° 14’98.5’’ S, 37° 42’ 46.9’’ W], Pernambuco

State, Brazil. The identification of the plant was confirmed by botanical André Paviotti

Fontana, of the Programa de Conservação de Fauna e Flora/PCFF, Universidade Federal do

Vale do São Francisco (UNIVASF), Brazil, and a voucher specimen (# HTSA 6184) has been

deposited in the Herbário do Trópico do Semiárido (HTSA) – Embrapa Semiárido.

2. Previous work

Previous phytochemical studies on this species described to the characterization of

tetrahydroprotoberberine and aporphine alkaloids, of the acetogenins, sequiterpenes and of

the essential oils, namely tethahydrojatrorrizine (corypalmine) (Sette et al., 2000a, 2000b),

liriodenine (Feitosa et al., 2009), discretamine, dehydrodiscretamine, rolliniastatin-1,

molvizarin, annonacin, bullatacin e lichexanthone (Arriaga et al., 2008), terpinyl-caffeate,

spathulenol, -caryophyllene, 4-10 aromadendrane, (-)-3-hydroxynornuciferine and (+)

norisocorydine (Costa et al., 2012) and essential oils (Feitosa et al., 2009; Costa et al., 2008)

3. Present study

The dried and powdered leaves of A. leptopetala (209 g) were extracted with hexane (1.5

L, five times), followed by MeOH (1.5 L, five times), yielding extracts of hexane (12.2 g) and

MeOH (53.3 g) after removal of each solvent.

TLC investigations indicated presence of alkaloids in the MeOH extract. Therefore, an

aliquot of the MeOH extract (43.8 g) was initially subjected to an acid-base extraction (Costa

et al., 2006) to give the alkaloid fraction (94.4 mg) and neutral fraction (3.99 g). An aliquot of

alkaloid fraction (45.4 mg) was directly subjected to preparative TLC eluted with CH2Cl2–

MeOH (95:05, v/v, three times), resulting in corypalmine (1, 1.6 mg; Sette et al., 2000a,

2000b), laurotetanine (2, 1.7mg; Costa et al., 2013) and a mixture containing three alkaloids

(4.8 mg) identified as anonaine (3, Ortiz et al., 2007), nornuciferine (4, Dutra et al., 2012)

and norannuradhapurine (5, Nimgirawath et al., 2008; Zarga & Sharmma, 1982) ( Figure 1).

Fig. 1. Isoquinoline alkaloids from the leaves of Annona leptopetala.

N

OCH3

OCH3

1

2

3

4 5

6

8

13 8a

9

1012

12a

14

14a

4aHO

H3CO

11

1

2

3 4

5

6a NH

H3CO

OH

3a

3b

7

7a

8

9

10

11

11a

1aH3CO

H3CO

Corypalmine Laurotetanine

NH

O

O

H

H

1

2

3

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

NH

H

1

2

3

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

H3CO

H3CO

H

Anonaine Nornuciferine

NH

O

O

H

H

H3CO

OH

1

2

3

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

Norannuradhapurine

All isolated compounds were identified by a series of spectrometric methods, mainly MS

and NMR (1D and 2D), as well as comparison with data reported in the literature. Therefore,

the complete and unequivocal NMR data for these alkaloids were reviewed according to 1D

and 2D NMR experiments (Table 1, 2, 3, 4 and 5).

Table 1

NMR data (600 MHz) for corypalmine (1).

a The experiments were obtained in CDCl3 at 293 K and the NMR chemical shift are given in ppm related to TMS signal at 0.00 ppm as

internal reference. b Multiplicities determined by HSQC NMR experiment. c The correct NMR chemical shifts of the carbon atoms were

obtained through one-bond 1H-13C (HSQC) and long-range 1H-13C (HMBC) experiments.

Position C mult.a,b,c H mult. (J in Hz)a

1 108.7, CH 6.73 s

2 147.5, C

3 147.6, C

4 111.4, CH 6.62 s

4a 126.7, C

5pseudo ax 29.0, CH2 3.14 dd (11.7; 5.0)

5pseudo eq 2.65 dd (11.1; 3.4)

6pseudo ax 51.5, CH2 2.67 m

6pseudo eq 3.21 dd (5.1; 3.5)

8pseudo ax 53.8, CH2 3.59 d (15.3)

8pseudo eq 4.21 d (15.4)

8a 127.3, C

9 143.2, C

10 146.5, C

11 114.0, CH 6.81 d (8.3)

12 124.9, CH 6.84 d (8.3)

13pseudo ax

13pseudo eq

36.2, CH2 2.82 dd (15.4; 11.7)

3.26 dd (15.8; 3.8)

14 59.4, CH 3.58 dd (11.5; 3.8)

14a 129.7, C

H3CO-2 56.3, CH3 3.91

H3CO-9 60.7, CH3 3.85

H3CO-10 55.7, CH3 3.90

Table 2.

NMR data (600 MHz) for laurotetanine (2).

a The experiments were obtained in CDCl3 at 293 K and the NMR chemical shift are given in ppm related to TMS signal at

0.00 ppm as internal reference. b Multiplicities determined by HSQC NMR experiment. c The correct NMR chemical shifts of

the carbon atoms were obtained through one-bond 1H-13C (HSQC) and long-range 1H-13C (HMBC) experiments.

Position C mult.a,b,c

H mult. (J in Hz)a

1 144.85, C

1a 123,42, C

2 153.29, C

3 110.53, CH 6.63 s

3a 126.8, C

3b 122.3, C

4 pseudoax 26.34, CH2 2.87dd (16.8; 3.6)

4 pseudo eq 3.45 m

5 pseudo ax 41.79, CH2 3.15 dd (12.6; 3.4)

5 pseudo eq 3.79 m

6a 53.28, CH 4.11 dd (13.4; 3.8)

7pseudo ax 34.02, CH2 2.35 m

7pseudo eq 3.07 d (13.5)

7a 127.79, C

8 114.1, CH 6.85 s

9 145.3, C

10 145.7, C

11 111.3, CH 8.10 s

11a

123.4, C

H3CO-1 60.2, CH3 3.69 s

H3CO-2 56.0, CH3 3.92 s

H3CO-10 55.9, CH3 3.93 s

Table 3.

NMR data (600 MHz) for anonaine (3).





H mult. (J in Hz)a

1 142.7, C

1a 116.3, C

2 147.1, C

3 107.5, CH 6.60 s

3a 126.1, C

3b 127.5, C

4 pseudo ax 28.0, CH2 2.68 m

4 pseudo eq 3.05m

5 pseudo ax 43.0, CH2 3.05 m

5 pseudo eq 3.43 m

6a 53.3, CH 4.01 m


7pseudo eq 2.94 m

7a 134.6, C

8 127.5, CH 7.24 m

9 127.8, CH 7.23 m

10 127.2, CH 7.32 m

11 127.1, CH 8.07 dd (7.9; 1.6)

11a 131.7, C

O-CH2-O 100.6, CH2 6.08 d (1,5)

5.94 d (1.5)

Table 4.

NMR data (600 MHz) for nornuciferine (4).





H mult. (J in Hz)a

1 145.5, C

1a 126.7 C

2 152.7, C

3 11.9, CH 6.65 s

3a 126.8, C

3b 127.7, C

4 pseudo ax 28.4, CH2 2.74 m

4 pseudo eq 3.03m

5 pseudo ax 42.8, CH2 3.05 m

5 pseudo eq 3.45 m

6a 53.4, CH 4.05 m


7pseudo eq 2.99 m

7a 135.7, C

8 128.0, CH 7.25 d (0.8)

9 127.4, CH 7.23 d (1.2)

10 127.2, CH 7.31 td (1.0)

11 128.6, CH 7.79 dd (7.7; 1.3)

11a 131.0, C

H3CO-1 60.2, CH3 3.67 s

H3CO-2 55.9, CH3 3.89 s

Table 5.

NMR data (600 MHz) for norannuradhapurine (5).





H mult. (J in Hz)a

1 141.9, C

1a 116.1, C

2 146.9, C

3 107.0, CH 6.55 s

3a 126.3, C

3b 126.4, C

4 pseudo ax 28.8, CH2 2.72 m

4 pseudo eq 3.10 m

5 pseudo ax 42.9, CH2 3.02 m

5 pseudo eq 3.46 m

6a 53.6, CH 3.90 m


7pseudo eq 2.99 m

7a 136.6, C

8 144.2, C

9 158.9, C

10 112.1, CH 6.88 d (8.6)

11 128.3, CH 8.03 d (8.6)

11a 129.40, C

O-CH2-O 100.6, CH2 6.06 d (1.4)

5.93 d (1.4)

H3CO-9 55.3, CH3 3.85 s

4. Chemotaxonomic significance

The present work reports the isolation and identification of two isoquinoline alkaloids;

one tetrahydroprotoberberínico, corypalmine (1) and four aporphine, laurotetanine (2),

anonaine (3), nornuciferine (4) and norannuradhapurine (5) from the leaves of A. leptopetala.

These alkaloids are very common in Annonaceae, and are found in several genera of this

family, such as Xylopia, Guatteria, Duguetia, Annona and Guatteriopsis, Fissistigma

glaucescens, among others (Leboeuf et al., 1982a, Leboeuf et al., 1982b, Hocquemiller et al.,

1981, Castelo et al., 1991; Martins et al., 1995; Nishiyama et al., 2006; Almeida et al., 2007;

Pimenta and Mendonça, 2012; Dutra et al., 2012). The laurotetanine compound is reported for

the first time in A. leptopetala and norannuradhapurine described for the first time in the

Annona genus.

Corypalmine was found in Duguetia gardneriana (Almeida et al., 2007), D. trunciflora

(Fechine et al., 2002), Guatteria discolor (Hocquemiller et al., 1984), Guatteriopsis friesiana

(Costa et al., 2009), Pachypodanthium confine (Andrade et al., 2003), Xylopia vieillard

(Jossang et al., 1991), X. discrete (Willaman & Schubert, 1961; Jossang et al., 1991) and

Annona cherimolia (Siméon et al., 1990). While laurotetanine was described in X. laevigata

(Costa et al., 2013) X. amazonica (Martins et al., 1995), X. benthamii (Pimenta and

Mendonça, 2012), X. danguyella (Hocquemiller et al., 1981; Leboeuf et al., 1982a) and X.

parviflora (Nishiyama et al., 2006), X. frutences (Leboeuf et al., 1982b), Palmeria fengeriana

(Johns et al., 1967), Peumus boldus (Hughes et al., 2006), Alphonsea scleropcarpa (Tadic et

al.,1967), Desmos tieaghiensis (Leboeuf et al., 1982 c), Guatteria gaudotiana (Castedo et al.,

1991), G. scandens (Hocquemiller et al., 1983) and in Annona cherimolia (Chen et al., 1997),

being notorious her occurrence in the genus Xylopia. Anonaine and nornuciferine have been

described in several species of Annona ( Rasamisafy et al., 1987; Simeon et al., 1989; Chang

et al., 2000; Campos et al., 2008, Cruz et al., 2011 , Vendramin et al., 2013; Rabêlo et al.,

2015; Dutra et al., 2012) and could be considered as chemotaxonomic markers of this genus.

Noranuradapurine is considered a scarce alkaloid in nature, having been reported only the

following species Fissistigma glaucescens, F. oldhamii (Lu et al., 1985 a,b) Goniothalamus

amuyon (Lu et al., 1985b)and Polyalthia acuminata (Zarga & Sharmma, 1982). It was found

in the literature, only one record for the 1H- NMR spectral data for the natural compound,

described by Zarga & Sharmma, 1982. The spectral data 13

C- NMR were not previously

reported for the natural alkaloid, only to the compound in synthetically (Nimgirawath et al.,

2009).

Through the results of this study, it was confirmed the high capacity of A. leptopetala of

biosynthesize isoquinoline alkaloids, a class of compounds peculiar to Annonaceae family as

well as his considerable chemotaxonomic correlation with other species of Annona.

Furthermore reveals the species as promising source to obtain this rare alkaloid

norannuradhapurine.

Acknowledgements

The authors are grateful to Brazilian agencies FACEPE, CNPq and CAPES by the

financial support and fellowships, as well as to UNIVASF and UFPR.

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Alkaloids from the leaves of Annona leptopetala (Annonaceae)

Cristiane Maria Souza de Castro Rodrigues a, Lívia Macedo Dutra

b, Andersson Barison

b,

Emmanoel Vilaça Costa c and Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida

a,*


Francisco56.304-205, Petrolina, Pernambuco, Brazil.

bNMR Center, Federal Universit of Paraná, PO Box 19081, 81531-990,Curitiba, Paraná,

Brazil.

cDepartment of Chemistry, Federal Universit of Amazonas 69077-000, Manaus, Amazonas,

Brazil.

_____________________________

* Corresponding author: Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida

aNucleus for Research and Study of Medicinal Plants, Federal University of Vale of São Francisco,

Campus Universitário, Av. José de Sá Maniçoba, s/n, Centro, Petrolina, PE, 56.304-205, Brazil.

Tel./Fax: +55- 87-2101-6863

E-mail address: [email protected] (J.R.G.S. Almeida)

mailto:[email protected]

Fig. 1. Isoquinoline alkaloids from the leaves of Annona leptopetala.

N

OCH3

OCH3

1

2

3

4 5

6

8

13 8a

9

1012

12a

14

14a

4aHO

H3CO

11

1

2

3 4

5

6a NH

H3CO

OH

3a

3b

7

7a

8

9

10

11

11a

1aH3CO

H3CO

Corypalmine Laurotetanine

NH

O

O

H

H

1

2

3

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

NH

H

1

2

3

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

H3CO

H3CO

H

Anonaine Nornuciferine

NH

O

O

H

H

H3CO

OH

1

2

3

3b

3a

4

5

6a

7

7a

8

9

10

11

11a

1a

Norannuradhapurine

Graphical Abstracts

Photo: Katarina Pinheiro

Photo: M. Oliveira Photo: J.A. Siqueira Filho

HHO

NH

O

O

H

NH

H

N

OCH3

OCH3

H3CO

OH

NH

NH

O

O

H

H

OH

H3CO

H3CO

H

H3CO

H3CO

H3CO

H3CO

Research highlights

Characterization of tetrahydroprotoberberine, corypalmine and of the aporphine alkaloids

laurotetanine, nornuciferine, anonaine and norannuradhapurine, isolated from leaves A.

leptopetala.

First description of the laurotetanine alkaloid in A. leptopetala and of the

norannuradhapurine in the Annona genus.

The alkaloids isolated in this plant, chemotaxonomic confirm their correlation with other

species of Annona.

The NMR data of corypalmine, laurotetanine, anonaine, nornuciferine and

nornnuradhapurine were reviewed.

The 13

C-NMR spectral data of the natural alkaloid norannuradhapurine it is reported here

for the first time.

Table 1. NMR data (CDCl3, 600 MHz) for the alkaloids corypalmine.

a The experiments were obtained in CDCl3 at 303 K and the NMR chemical shift are giving in ppm related to

TMS signal at 0.00 ppm as internal reference. b Multiplicities determined by DEPT 135 and HSQC NMR

experiment. c

The correct NMR chemical shifts of the carbon atoms were obtained through one-bond 1H-

13C

(HSQC) and long-range 1H-

13C (HMBC) experiments.


H mult. (J in Hz)a

1 108.7, CH 6.73 s

2 147.5, C

3 147.6, C

4 111.4, CH 6.62 s

4a 126.7, C

5pseudo ax 29.0, CH2 3.14 dd (11.7; 5.0)

5pseudo eq 2.65 dd (11.1; 3.4)


6pseudo eq 3.21 dd (5.1; 3.5)

8pseudo ax 53.8, CH2 3.59 d (15.3)

8pseudo eq 4.21 d (15.4)

8a 127.3, C

9 143.2, C

10 146.5, C

11 114.0, CH 6.81 d (8.3)

12 124.9, CH 6.84 d (8.3)

13pseudo ax

13pseudo eq

36.2, CH2 2.82 dd (15.4; 11.7)

3.26 dd (15.8; 3.8)

14 59.4, CH 3.58 dd (11.5; 3.8)

14a 129.7, C

H3CO-2 56.3, CH3 3.91

H3CO-9 60.7, CH3 3.85

H3CO-10 55.7, CH3 3.90

Table 2. NMR data (CDCl3, 600 MHz) for the alkaloid laurotetanine.


TMS signal at 0.00 ppm as internal reference. b Multiplicities determined by HSQC NMR experiment.

c The

correct NMR chemical shifts of the carbon atoms were obtained through one-bond 1H-

13C (HSQC) and long-

range 1H-



H mult. (J in Hz)a

1 144.85, C

1a 123.42, C

2 153.29, C

3 110.53, CH 6.63 s

3a 126.2, C

3b 122.3, C

4 pseudoax 26.34, CH2 2.87dd (16.8; 3.6)

4 pseudo eq 3.45 m

5 pseudo ax 41.79, CH2 3.15 dd (12.6; 3.4)

5 pseudo eq 3.79 m

6a 53.28, CH 4.11 dd (13.4; 3.8)

7pseudo ax 34.02, CH2 2.35 m

7pseudo eq 3.07 d (13.5)

7a 127.79, C

8 114.1, CH 6.85 s

9 145.3, C

10 145.7, C

11 111.3, CH 8.10 s

11a

123.4, C

H3CO-1 60.2, CH3 3.69 s

H3CO-2 56.0, CH3 3.92 s

H3CO-10 55.9, CH3 3.93 s

Table 3. NMR data (CDCl3, 600 MHz) for the alkaloid anonaine.



c The



range 1H-



H mult. (J in Hz)a

1 142.7, C

1a 116.3, C

2 147.1, C

3 107.5, CH 6.60 s

3a 126.1, C

3b 127.5, C

4 pseudoax 28.0, CH2 2.68 m

4 pseudo eq 3.05m

5 pseudo ax 43.0, CH2 3.05 m

5 pseudo eq 3.43 m

6a 53.3, CH 4.01 m


7pseudo eq 2.94 m

7a 134.6, C

8 127.5, CH 7.24 m

9 127.8, CH 7.23 m

10 127.2, CH 7.32 m

11 127.1, CH 8,07 dd (7.9; 1.6)

11a 131.7, C

O-CH2-O 100.6, CH2 6.08 d (1,5)

5.94 d (1.5)

Table 4. NMR data (CDCl3, 600 MHz) for the alkaloid nornuciferine.



c The



range 1H-



H mult. (J in Hz)a

1 145.5, C

1a 126.7, C

2 152.7, C

3 11.9, CH 6.65 s

3a 126.8, C

3b 127.7, C

4 pseudo ax 28.4, CH2 2.74 m

4 pseudo eq 3.03m

5 pseudo ax 42.8, CH2 3.05 m

5 pseudo eq 3.45 m

6a 53.4, CH 4.05 m


7pseudo eq 2.99 m

7a 135.7, C

8 128.0 CH 7.25 d (0.8)

9 127.4, CH 7.23 d (1.2)

10 127.2, CH 7.31 td (1.0)

11 128.6, CH 7.79 dd (7.7; 1.3)

11a 131.0, C

H3CO-1 60.2, CH3 3.67 s

H3CO-2 55.9, CH3 3.89 s

Table 5. NMR data (CDCl3, 600 MHz) for the alkaloid norannurdhapurine.



c The



range 1H-



H mult. (J in Hz)a

1 141.9, C

1a 116.1, C

2 146.9, C

3 107.0, CH 6.55 s

3a 126.3, C

3b 126.4, C

4 pseudoax 28.8, CH2 2.72 m

4 pseudo eq 3.10 m

5 pseudo ax 42.9, CH2 3.02 m

5 pseudo eq 3.46 m

6a 53.6, CH 3.90 m


7pseudo eq 2.99 m

7a 136.6, C

8 144.2, C

9 158.9, C

10 112.1, CH 6.88 d (8.6)

11 128.3, CH 8.03 d (8.6)

11a 129.40, C

O-CH2-O 100.6, CH2 6.06 d (1.4)

5.93 d (1.4)

H3CO-9 55,3, CH3 3.85, s

estudo fitoquÍmico e avaliaÇÃo da atividade …‡Ão... · por me ensinarem o verdadeiro valor...

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