estudo dos efeitos vasculares e renais causados … · departamento de fisiologia e farmacologia...

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

ANTONIO GOMES DA SILVA NETO

ESTUDO DOS EFEITOS VASCULARES E RENAIS CAUSADOS

PELO 6-GINGEROL ISOLADO DO GENGIBRE.

FORTALEZA

2012

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ESTUDO DOS EFEITOS VASCULARES E RENAIS CAUSADOS PELO 6-

GINGEROL ISOLADO DO GENGIBRE.

Dissertação apresentada à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em

Farmacologia do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade federal do

Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em

Farmacologia.

Orientadora:

Profa. Dra. Helena Serra Azul Monteiro

FORTALEZA

2012

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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação

Universidade Federal do Ceará

Biblioteca de Ciências da Saúde

S582e Silva Neto, Antonio Gomes da.

Estudo dos efeitos vasculares e renais causados pelo 6 – gingerol isolado do gengibre /

Antonio Gomes da Silva Neto. – 2012. 103f. : il. co lor., enc. ; 30 cm.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Departamento de Fisio logia e

Farmacologia, Programa de Pós-Graduação de Farmacologia, Fortaleza, 2012.

Orientação: Profa. Dra. Helena Serra Azul Monteiro.

1. Gengibre. 2. Rim. 3. Farmacologia. I. Título.

CDD 616.1

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ESTUDO DOS EFEITOS VASCULARES E RENAIS CAUSADOS PELO 6-

GINGEROL ISOLADO DO GENGIBRE.

Dissertação apresentada à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Farmacologia do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade federal do Ceará, como requisito parcial para a

obtenção do título de Mestre em Farmacologia.

Aprovada em: ____/____/______.

BANCA EXAMINADORA

________________________________________________ Profª. Drª. Helena Serra Azul Monteiro (Orientadora)


________________________________________________ Profª. Drª. Renata de Sousa Alves


________________________________________________

Prof. Dr. Alexandre Havt Bindá Universidade Federal do Ceará

5

AGRADECIMENTOS

A Deus que está sempre ao meu lado abençoando-me.

À minha orientadora Profa. Dra. Helena Serra Azul Monteiro pela

atenção, otimismo e dedicação oferecidas.

À Profa. Dra. Janaina Serra Azul Monteiro Evangelista pelo carinho,

disponibilidade, apoio e amizade desde minha infância.

Ao meu amigo e companheiro de jornada doutorando Rafael Matos

Ximenes pelos conhecimentos compartilhados que foram valiosos para realização deste trabalho e pelo auxílio sempre que precisei.

Ao Prof. Dr. Paulo Cesar Vieira e ao Dr. James Almada da Silva por

terem cedido a substância isolada para a realização dos testes farmacológicos

e pela oportunidade de trabalhar em uma nova parceria.

À minha namorada Natássia que sempre esteve ao meu lado nos momentos difíceis juntamente com seus familiares.

Ao Prof. Dr. Dalgimar Beserra De Menezes pelas análises histopatológicas e amizade.

A todo corpo docente do Curso de Pós-graduação em Farmacologia da

Universidade Federal do Ceará, em especial Dr. Alexandre Havt Bindá, pela

atenção fornecida em todos os momentos que busquei.

À Profa. Dra. Renata de Sousa Alves pela amizade e apoio que sempre me deu.

Ao amigo e doutorando Antonio Rafael Coelho Jorge pelo companheirismo e apoio.

Aos demais companheiros de jornada do Laboratório de Farmacologia

Venenos e Toxinas (LAFAVET), da iniciação científica e pós-graduação que

proporcionaram momentos felizes e de crescimento profissional e pessoal.

Aos Funcionários Silvia Helena, Aura Rhanes, Jossiê e Bento por toda a ajuda.

Ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) pelo apoio financeiro.

A todos os meus amigos pelo companheirismo e presteza.

6

―Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo, qualquer um

pode começar agora e fazer um novo fim‖.

Chico Xavier

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RESUMO

O gengibre possui em sua composição inúmeras substâncias voláteis e não

voláteis. Dentre as substâncias não-voláteis destacam-se, principalmente, os

gingerols, sendo o 6-gingerol o composto mais abundante e o responsável pela

grande maioria das atividades farmacológicas descritas, como a anti-

hipertensiva. Neste trabalho, foram investigados os efeitos renais, vasculares e

em cultura de células tubulares renais do tipo MDCK (Madin-Darby Canine

Kidney) causados pelo 6-gingerol. Foram utilizados ratos Wistar machos

pesando entre 250 e 300g, cujos rins foram isolados e perfundidos com

Solução de Krebs-Hanseleit contendo 6%p/v de albumina bovina previamente

dialisada. Foram investigados os efeitos do 6-gingerol (3 μM, 10 μM, 30 μM;

n=6) sobre a Pressão de Perfusão (PP), Resistência Vascular Renal (RVR),

Fluxo Urinário (FU), Ritmo de Filtração Glomerular (RFG), Percentual de

Transporte Tubular de Sódio (%TNa+), de Potássio (%TK+) e de Cloreto

(%TCl-). O 6-gingerol foi adicionado após 30 minutos de controle interno. As

células MDCK foram cultivadas em meio de cultura RPMI 1640 suplementado

com 10% v/v de Soro Bovino Fetal e então avaliadas na presença do composto

em diversas concentrações em dois períodos de incubação, 6 (seis) e 24 (vinte

e quatro) horas. Após esses períodos, foram realizados ensaios de viabilidade

celular. Foi avaliada a resposta do 6-gingerol em diversas concentrações na

pressão arterial média de ratos wistar normotensos anestesiados. Os

resultados encontrados na pressão arterial dos animais foi uma queda

acentuada de maneira dose-dependente na pressão arterial destes animais.

Em relação à perfusão renal, o 6-gingerol mostrou-se um potente diurético e

com baixíssimos danos renais tanto nos dados encontrados no perfil

histológico, como nos experimentos de avaliação de viabilidade celular em

células MDCK o que está em consonância com o conhecimento da medicina

tradicional.

Os resultados encontrados não foram totalmente abolidos pelo inibidor

específico do receptor TRPV1 utilizado no estudo, demonstrando que o 6-

gingerol possui outras vias renais a serem exploradas em estudos posteriores.

Palavras-chave: 6-gingerol. Gengibre. Rim.

8

ABSTRACT

Ginger has many volatile and nonvolatile substances in its composition. Among

the non-volatile substances stand out, especially the gingerols, 6-gingerol being

the compound most abundant and responsible for the vast majority of

pharmacological activities described, such as anti-hypertensive. In this study,

we investigated the renal and vascular effects besides the effect in renal tubular

cell culture of the type MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) caused by 6-

gingerol. Male Wistar rats weighing between 250 and 300, whose kidneys were

isolated and perfused with Krebs-Hanseleit containing 6% w / v pre-dialysed

with bovine serum albumin. We investigated the effects of 6-gingerol (3 mM, 10

mM, 30 mM, n = 6) on the perfusion pressure (PP), renal vascular resistance

(RVR), urinary flow (FU), glomerular filtration rate (GFR), percentage of tubular

transport of sodium (Tna +%), potassium (TK +%) and chloride (TCL-%). The 6-

gingerol was added after 30 minutes of internal control. MDCK cells were grown

in RPMI 1640 culture medium supplemented with 10% v / v fetal bovine serum

and then evaluated in the presence of compound at various concentrations in

two incubation periods, 6 (six) and 24 (twenty four) hours . After these periods,

we performed cell viability assays. The response was evaluated in 6-gingerol at

various concentrations in mean blood pressure of normotensive anaesthetized

Wistar rats. The results found in animals' blood pressure was a sharp drop in a

dose-dependent way. With regard to renal perfusion, 6-gingerol proved to cause

a potent diuretic and very low renal damage in histological profile, as in the

experiments for evaluating cell viability in MDCK cells which are according to

the traditional medical knowledge.

The results were not totally abolished by specific inhibitor of the receiver TRPV1

used in this study, demonstrating that the 6-gingerol has other pathways renal

to be explored in subsequent studies.

Keywords: 6-gingerol. Ginger. Kidney.

9

LISTA DE FIGURAS

1. Rizoma do gengibre (Moraes, 2008) ................................................................19

2. Principais atividades descritas sobre o gengibre ..............................................20

3. Representação das cadeias laterais dos componentes do gengibre (Modificado de Reinhard, 2005) .......................................................................................... 21

4. Estrutura molecular do 6-gingerol .................................................................... 23

5. Representação simplificada da conversão dos gingerols em outras formas homólogas (Modificado de Reinhard, 2005) .................................................... 24

6. Regiões importantes para a interação com o receptor .................................... 30

7. Representação espacial da estrutura das diferentes famílias de receptores TRP. Adaptado de Montell, 2005 ..................................................................... 32

8. Sistema de perfusão renal. Fonte: LAFAVET – UFC .......................................39

9. Desenho esquemático do sistema de perfusão de rim isolado. Fonte: LAFAVET – UFC .............................................................................................................. 40

10. Valores de pressão de perfusão (PP) registrados durante a calibração do sistema (n=6).................................................................................................... 41

11. Valores registrados pelo fluxômetro (L/min) durante a calibração do sistema (n=6) ................................................................................................................. 41

12. Valores de volume de solução (mL/min) registrados durante a calibração do sistema (n=6) ................................................................................................... 42

13. Administração de manitol (100mg/mL – 3mL independentemente do peso) pela veia femoral no animal anestesiado ................................................................ 43

14. Identificação e dissecação do ureter (A) e ureter canulado (B) ....................... 44

15. Visualização da artéria mesentérica (A), da artéria renal (B) e também da artéria aorta (C) ................................................................................................ 45

16. Canulação da artéria renal realizada através da artéria mesentérica .......................................................................................................................... 45

17. Rim de rato isolado no sistema de perfusão .................................................... 46

18. Localização anatômica da artéria e veia femural e posicionamento dos cateteres arterial (vermelho) e venoso (azul) .................................................. 50

19. Sistema de aquisição de dados ....................................................................... 51

10

20. Fluxograma do cultivo e tratamento das células MDCK. Fonte: LCC – Laboratório de Cultivo Celular ......................................................................... 53

21. Efeitos do 6-gingerol em célula tubulares renais (MDCK). Ensaio com MTT .......................................................................................................................... 56

22. Efeitos da Capsazepina em células tubulares renais (MDCK). Ensaio com MTT ............................................................................................... ...........................57

23. Efeitos do 6-gingerol + Capsazepina em células tubulares renais (MDCK). Ensaio com MTT ............................................................................................. 57

24. Efeitos do 6-gingerol em células tubulares renais (MDCK). Ensaio com MTT ......................................................................................................................... 58

25. Efeitos da Capsazepina em células tubulares renais (MDCK). Ensaio com MTT .............................................................................................. ...........................59

26. Efeitos do 6-gingerol + Capsazepina em células tubulares renais (MDCK). Ensaio com MTT ........................................................................................... 60

27. Relação dose-efeito da administração de 6-gingerol, em bolus, em ratos anestesiados com pentobarbital sódico (50 mg/Kg), no percentual de redução da pressão arterial. Dados expressos como média ± E.P.M. e analisados por análise de variância (ANOVA), com pós-teste de Bonferroni, e pelo teste t de Studente, com *p < 0,05 ................................................................................. 61

28. Relação dose-efeito da administração de 6-gingerol, em bolus, em ratos anestesiados com pentobarbital sódico (50 mg/Kg), na pressão arterial média. Dados expressos como média ± E.P.M. e analisados por análise de variância (ANOVA), com pós-teste de Bonferroni, e pelo teste t de Studente, com *p < 0,05 ................................................................................................................. 62

29. Aspecto morfológico normal do tecido cardíaco do grupo analisado através de microscopia óptica (aumento de 400x e coloração de hematoxilina-eosina) ......................................................................................................................... 63

30. Aspecto morfológico normal dos rins do grupo analisado através de microscopia óptica (aumento de 400x e coloração de hematoxilina- eosina) ............................................................................................................. 64

31. Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol nas concentrações de 3 µM, 10µM, 30 µM e DMSO utilizado como diluente na pressão de

perfusão................................................................................................. 66

32. Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol nas concentrações de 3 µM, 10µM, 30 µM e DMSO utilizado como diluente na resistência vascular renal ......................................................................................................................... 67

11

33. Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol nas concentrações de 3 µM,

10µM, 30 µM e DMSO utilizado como diluente no fluxo urinário ... ....... 68

34. Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol nas concentrações de 3 µM, 10µM, 30 µM e DMSO utilizado como diluente no ritmo de filtração glomerular ......................................................................................................................... 68

35. Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol nas concentrações de 3 µM, 10µM, 30 µM e DMSO utilizado como diluente no percentual de

transporte de sódio ............................................................................... 69

36. Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol nas concentrações de 3 µM, 10µM, 30 µM e DMSO utilizado como diluente no percentual de transporte de potássio .......................................................................................................................... 70

37. Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol nas concentrações de 3 µM, 10µM, 30 µM e DMSO utilizado como diluente no percentual de transporte de cloreto .......................................................................................................................... 70

38. Corte histopatológico de rim perfundido com solução de Krebs-Hanseleit modificada e DMSO 1% por 120min (n=6, coloração de hematoxilina-eosina, aumento 100x) ................................................................................................. 71

39. Corte histológico de rim direito pefundido com 6-gingerol 3 µM (n=6, coloração hematoxilina-eosina, aumento400x) ................................................................ 72

40. Corte histológico de rim direito perfundido com 6-gingerol 10 µM. (n=6, coloração de hematoxilina-eosina, aumento 400X) .............................. 73

41. Corte histológico de rim direito perfundido com 6-gingerol 30 µM (n=6, coloração de hematoxilina-eosina, aumento 400X) ......................................... 74

42. Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol na concentração de 10µM e frente ao bloqueio com capzasepina na concentração de 30 µM na pressão de perfusão ............................................................................. 75

43. Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol na concentração de 10µM e frente ao bloqueio com capzasepina na concentração de 30 µM na resistência vascular renal ................................................................................................................. 76

44. Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol na concentração de 10µM e frente ao bloqueio com capzasepina na concentração de 30 µM no fluxo urinário .................................................................................................. 77

45. Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol na concentração de 10µM e

frente ao bloqueio com capzasepina na concentração de 30 µM no ritmo de filtração glomerular ........................................................................... 78

12

46. Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol na concentração de 10µM e frente ao bloqueio com capzasepina na concentração de 30 µM no percentual de transporte de sódio .......................................................................................... 79

47. Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol na concentração de 10µM e frente ao bloqueio com capzasepina na concentração de 30 µM no

percentual de transporte de potássio ...................................... .............. 80

48. Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol na concentração de 10µM e frente ao bloqueio com capzasepina na concentração de 30 µM no

percentual de transporte de sódio ......................................................... 81

13

LISTA DE QUADROS

1. Cálculos para determinação dos parâmetros funcionais renais .............43

14

ABREVIATURAS

μg Micrograma

_ Alfa °C Grau(s) centígrado(s) %TCl- Percentual de cloro tubular total transportado %pTCl- Percentual de cloro tubular proximal transportado %TK+ Percentual de potássio tubular total transportado %pTK+ Percentual de potássio tubular proximal transportado %TNa+ Percentual de sódio tubular total transportado %pTNa+ Percentual de sódio tubular proximal transportado AMPc Adenosina 3´, 5´ – Monofosfato Cíclica ANOVA Análise de varância C60 Valores do controle no período de 60 minutos C90 Valores do controle no período de 90 minutos C120 Valores do controle no período de 120 minutos CNP Peptídio natriurético do tipo c Cosm Clearance osmótico COX Ciclooxigenase COX-1 Ciclooxigenase - 1 COX-2 Ciclooxigenase - 2 ECl- Cloreto excretado EK+ Potássio excretado ENa+ Sódio excretado E.P.M Erro padrão médio

PLA2 Fosfolipase A2 FU Fluxo urinário HE Hematoxilina-Eosina IL Interleucina IRA Insuficiência Renal Aguda LAFAVET Laboratório de Farmacologia em Venenos e Toxinas min. ou min Minuto (s) mL Mililitros mmHg Milímetros de mercúrio MDCK Células tubulares renais do tipo Madin-Darby Canine Kidney MS Ministério da Saúde MTT 3-(4,5-dimetilazil-2-il)-2,5 difenil tetrazólico NO Óxido nítrico NOS Óxido Nítrico Sintetase PGE2 Prostaglandina E2 PGI2 Prostaglandina I2 ou prostaciclina pH Potencial de hidrogênio PP Pressão de Perfusão p/v Peso/volume RFG Ritmo de Filtração Glomerular RVR Resistência Vascular Renal SBF Soro Bovino Fetal TNF Fator de Necrose Tumoral v/v Volume/volume

16

SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 18

1.1 Aspectos Gerais da Fitoterapia ......................................................................... 18

1.2 Composição Química do Gengibre ................................................................... 20

1.3 Atividades Farmacológicas .....................................................................23

1.3.1 Atividade Anti-emética ............................................................................ 23

1.3.2 Atividades Antiinflamatória e antioxidante .............................................. 24

1.3.3 Atividade Antimicrobiana ........................................................................ 25

1.3.4 Estudos no Combate ao Câncer .................................................. ........... 26

1.3.5 Cardioprotetora e Anti-hipertensiva ........................................................ 27

1.4 Família de Receptores de Potencial Transiente (TRP) .................................... 28

2. JUSTIFICATIVA ..................................................................................................... 33

3. OBJETIVOS ........................................................................................................... 35

3.1 Objetivo Geral ........................................................................................ ..........35

3.2 Objetivos Específicos ........................................................................................35

4. MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 37

4.1 Perfusão de Rim Isolado .................................................................................. 37

4.1.1 Animais de experimentação ................................................................... 37

4.1.2 Substâncias Utilizadas ........................................................................... 37

4.1.3 Ensaios Biológicos ................................................................................. 37

4.1.4 Preparo da Solução Perfusora ............................................................... 38

4.1.5 Sistema de Perfusão Renal .................................................................... 39

4.1.6 Calibração do Sistema de Perfusão de Rim Isolado de Rato .................41

4.1.7 Técnica Cirúrgica ................................................................................... 46

4.1.8 protocolo Experimental .......................................................................... 46

4.1.9 Análises Bioquímicas ............................................................................. 47

4.1.10 Cálculo dos Parâmetros Funcionais Renais ........................................ 48

4.1.11 Análise Histológica ............................................................................... 48

4.2 Efeitos na Pressão Arterial Média de Ratos Anestesiados .............................. 48

4.2.1 Animais de Experimentação ................................................................... 48

4.2.2 Técnica Cirúrgica .................................................................................... 48

4.2.3 Protocolo Experimental ........................................................................... 49

17

4.2.4 Sistema de Aquisição de Dados ............................................................. 50

4.2.5 Análise Histológica .................................................................................. 50

4.3 Avaliação da Atividade do 6-gingerol sobre as Células Tubulares Renais

(MDCK) ................................................................................................................... 51

4.3.1 Linhagem Celular .................................................................................... 51

4.3.2 Cultivo e Tratamento das Células MDCK ............................................... 51

4.3.3 Ensaio Colorimétrico com Sal de Tetrazolium (MTT) ............................ .52

4.3.4 Aspectos Éticos ...................................................................................... 53

5. RESULTADOS ....................................................................................................... 55

5.1 Avaliação da Atividade do 6-gingerol e da Capzasepina sobre as Células MDCK

................................................................................................................................. 55

5.2 Experimento com Incubação de 6 horas .......................................................... 55

5.3 Experimento com 24 horas de Incubação ........................................................ 57

5.4 Avaliação da Atividade do 6-gingerol na Pressão Arterial Média de Ratos

Anestesiados .......................................................................................................... 59

5.5 Análise Histológica ............................................................................................ 61

5.6 Perfusão de Rim Isolado Frente ao 6-gingerol ................................................. 64

5.7 Efeitos do 6-gingerol nos Parâmetros Renais .................................................. 65

5.8 Análise histológica dos grupos da perfusão renal ............................................ 70

5.9 Efeitos do 6-gingerol frente ao Bloqueio do TRPV1 com Capzasepina

................................................................................................................................. 73

6. DISCUSSÃO ........................................................................................................... 82

7. CONCLUSÃO ......................................................................................................... 90

8. REFERÊNCIAS....................................................................................................... 92

18

INTRODUÇÃO

19

1. INTRODUÇÃO

1.1 Aspectos Gerais da Fitoterapia

O uso de produtos naturais, principalmente as com atividades

medicinais, são utilizadas a mais de cinco mil anos por diversas civilizações.

Entretanto, suas atividades começam a serem estudas mais profundamente

pela medicina ocidental na busca por novas moléculas ativas e no

desenvolvimento de novas drogas com potencial terapeutico melhor e com

menos efeitos colaterais (CRAGG et al., 1997; DE SMET, 1997; SHU, 1998).

Na década de 60, em países como Alemanha e França, e

posteriormente transferindo-se para outras regiões da Europa e da América do

Norte, demonstrou-se um interesse crescente pela fitoterapia e, ao invés de

utilizar a infusão, cozimento ou tintura dos fármacos vegetais, bastante

utilizadas no passado, as formas farmacêuticas encapsuladas ou comprimidos

eram mais bem aceitas pela população. (CUNHA et al., 2003). Este interesse

surgiu principalmente devido às pessoas acreditarem que os fitoterápicos são

isentos ou possuem poucos efeitos colaterais, e que são aparentemente

―milagrosos‖ nos casos onde a medicina tradicional não alcançou resultados

esperados. Infelizmente nem sempre esses efeitos são confirmados pelas

pesquisas científicas que avaliam a eficácia e a segurança desses fitoterápicos

(CALIXTO, 2000; CARVALHO et al., 2008).

No Brasil, a utilização de plantas medicinais foi iniciada pelos povos

indígenas. Nosso país é rico em diversidade além de possuir em seu território

cinco principais biomas sendo designados como floresta amazônica, cerrado,

mata atlântica, pantanal e caatinga com milhares de espécies nativas. Isso

demonstra o grande potencial de diversidade e incontáveis moléculas com

potencial terapêutico ainda podem ser encontradas (CALIXTO, 2000; RATES,

2001; VEIGA-JUNIOR, 2008).

Entre inúmeras espécies utilizadas destaca-se, o gengibre que é

uma planta herbácea aromática, perene, de rizoma articulado, septante,

carnoso, revestido de epiderme rugosa, de onde desenvolve o caule aéreo

(JOLY, 2002). Na parte inferior, possui muitos rizomas cilíndricos, horizontais,

20

distribuídos lateralmente, com ramificações situadas num mesmo plano,

digitiformes, no vértice das quais se encontram cicatrizes do caule foliáceo de

14 a 16 cm de comprimento por 4 a 20 mm de espessura (FERNANDES,

2006).

Figura 1 - Rizoma do gengibre (Moraes, 2008).

O botânico Inglês William Roscoe (1753-1831) lhe deu esse nome

em uma publicação no ano de 1807,

a partir do sânscrito STRINA: ―com um corpo como um chifre‖.

O gengibre (Zingiber officinale) é uma planta utilizada como

condimento e como erva medicinal desde a antiguidade pelos povos do oriente.

Na época das grandes navegações possuía uma importante representação nas

especiarias. (Boletim, 2004). Hoje ela é encontrada comercialmente na forma

crsitalizada, pó seco e até na forma de óleo essencial, sendo que nesta forma

está contida em bebidas, ingredientes de alimentos e em produtos de higiene e

cosmética (ELPO, 2004; NEGRELLE et al., 2005; SACCHETTI et al., 2005).

Além dessa utilização como condimento, o gengibre possui

atividades farmacológicas já descritas na literatura científica. Dentre elas, estão

incluídas atividades, como analgésica, antiúlcera, antiemética, antimicrobianas,

21

ansiolíticas antilipidêmica, antihipertensiva, cardiotônica e imunoestimulante

(SUEKAWA et al., 1984; KIUCHI et al., 1992; SHUKLA e SINGH, 2007) (Fig.

2).

Figura 2 - Principais atividades descritas sobre o gengibre.

1.2 Composição Química do Gengibre

Mais de 400 compostos químicos foram isolados e identificados em

extratos de rizomas de gengibre, e os novos ainda estão sendo detectados.

Evidências atuais sugerem que uma fração contendo os compostos que possuem

estrutura relacionada com os gingerols, shogaols e paradols são responsáveis

pelas ações terapêuticas do gengibre (TJENDRAPUTRA, 2001).

O gengibre apresenta em sua composição química, componentes

voláteis (terpenos), não voláteis (compostos fenólicos e alcalóides) além das

Gengibre

Anti- inflamatório

Antioxidante

Analgésico

Antilipidêmico

Anti-hipertensivo

Cardiotônico

Antimicrobiano

Antiemético

22

oleorresinas extraíveis, gorduras, ceras, carboidratos, vitaminas e minerais e no

rizoma também contém uma enzima proteolítica potente chamada de zingibain

(JOLAD et al., 2005).

Esses compostos são descritos como secundários e embora não sejam

necessários ao ciclo da vida da planta, desempenham papel na interação com o

meio ambiente (PERES, 2004).

No grupo dos constituintes voláteis encontramos sesquiterpenos de

hidrocarbonetos: zingeberene (35%), curcumeno (18%), farneseno (10%); e mais

de 40 substâncias diferentes, se destacando o linalol, 1,8 cineol (SHUKLA et al.,

2007; SANTOS et al., 2004). Muitos destes componentes voláteis contribuem

para o distinto aroma e sabor de gengibre (JOLAD et al., 2004; JOLAD et al.

2005).

Dentre os compostos não-voláteis merecem destaque os gingerols,

shagaols e paradols. Estes compostos compartilham uma porção cetona

aromática, mas são diferentes no comprimento da sua cadeia lateral alquil e o

padrão de substituição na cadeia lateral (Fig. 3). Outros compostos fenólicos que

fazem parte da composição química do gengibre são: os gingerdiois e os

diarilheptanoides (JOLAD et al., 2005).

23

Figura 3 - Representação das cadeias laterais dos componentes do gengibre

(Modificado de Reinhard, 2005)

Entre os gingerois, o 6-gingerol é o composto mais abundante

encontrado no gengibre e o responsável pela grande maioria das atividades

farmacológicas descritas (YOUNG e CHEN, 2002). Outros gingerois presentes no

gengibre, porém em menor quantidade são o 4-gingerol, o 8-gingerol, o 10-

gingerol e o 12-gingerol. Esses compostos em altas temperaturas sofrem

desidratação e se transformam nos shogaols. Esses últimos quando sofrem

hidrogenação formam os paradols (JOLAD et al., 2004; JOLAD et al., 2005)

(Fig.4).

24

Figura 4 - Estrutura molecular do 6-gingerol.

Shogaols e paradols apresentam pequenas quantidades no gengibre

fresco, mas estão presentes em altas concentrações no gengibre armazenado.

Essa conversão é provável que tenha um impacto significativo sobre os efeitos

nas preparações de gengibre, pois os compostos podem variar na sua

biodisponibilidade, farmacocinética e propriedades farmacológicas (Reinhard et al,

2005). Já a quantidade de gingerols presente, determina a pungência (sensação

de ―queimação‖ sentida na boca e no nariz) do rizoma. Essa varia de acordo com

a região geográfica de onde a planta é colhida e se os rizomas são frescos ou

secos (PRATO, 2010).

O OH

OH

O

CH3

CH3

25

Figura 5 – Representação simplificada da conversão dos gingerols em outras formas homólogas (Modificado de Reinhard, 2005).

1.3 Atividades Farmacológicas

1.3.1 Atividade Anti-emética

Na medicina oriental, o gengibre é uma das ervas mais

comumente utilizadas para o tratamento de náuseas e vômitos da gravidez

(ALLAIRE et al., 2000).

O mecanismo exato dessa atividade ainda não está totalmente elucidado,

mas tudo indica que seja um efeito gástrico local, por aumentar o peristaltismo e

tônus muscular. Com o efeito local, ocorre grande diminuição dos efeitos

indesejáveis causados por antieméticos de ação central, como xerostomia e

sonolência (MICKLEFIELD, 2000).

Estudo realizado com 60 mulheres em pós-cirurgia (Obstetrícia e

Ginecologia) comparou a utilização de metoclopramida, gengibre e placebo na

incidência de eventos relacionados à atividade antiemética. O gengibre demonstrou

ser capaz de reduzir a incidência de náuseas quando comparado com o placebo.

(CH2)n

O OH

CH3

OH

O

CH3

(CH2)n

O

CH3

OH

O

CH3

(CH2)n

O

CH3

OH

O

CH3

Hidrogenação

Desidratação

Gingerois

(n = 2, 4, 6, 8, 10)

Shogaois

(n = 2, 4, 6, 8, 10)

Paradois

(n = 2, 4, 6, 8, 10)

26

Entretanto, a incidência de náuseas foi estatisticamente igual nos grupos que

utilizaram tanto gengibre quanto metoclopramida (BONE et al., 1990).

Em 2004, Smith e colaboradores compararam a redução das náuseas

com a vitamina B6 em um grupo composto de 291 mulheres com menos de 16

semanas de gestação. Constataram que o gengibre foi equivalente em reduzir as

náuseas nesse grupo em média de 20%, sendo mais eficaz na redução de náuseas

acompanhadas de vômito (50%). Nas pacientes em que as náuseas não foram

acompanhadas de vômitos a diferença foi de 30%.

1.3.2 Atividades Antiinflamatória e Antioxidante

Estudos demonstraram que o gengibre foi capaz de inibir a expressão de

COX-2 induzida por LPS (lipopolissacarídeo) e inibir a produção de PGE2

(prostaglandina E2) e estudos ―in vivo ” demonstraram que o extrato aquoso de

Zingiber officinale a quente inibiu as atividades da ciclooxigenase e lipoxigenase

sobre o ácido araquidônico (UTPALENDU et al., 1999; LANTZ et al., 2007).

A inibição da enzima cox, in vitro, pelo 6-gingerol mostrou-se dependente

da concentração, sendo 0,5 – 1,0 mM, a faixa que mostrou o melhor resultado na

inibição da quebra do ácido araquidônico (SHUKLA et al., 2007).

Em 2010 Dugasani e colaboradores provaram que o 6-gingerol possui

atividade antiinflamatória, mas quando comparado ao 6-shogaol ele perde em

atividade antiinflamatória. Isso leva a hipótese que o 6-shogaol seria um melhor

protótipo para a síntese de drogas na indústria. No entanto, mais estudos devem ser

realizados.

A atividade antioxidante está relacionada com a presença de compostos

fenólicos. O gengibre, rico nesses compostos, portanto, apresenta significativa

atividade antioxidante (JUSTO et al., 2009).

Ahmed e colaboradores (2000) induziram estresse oxidativo utilizando

pesticida (malation) em ratos e verificaram que a introdução de gengibre na dieta

desses animais abolia esse efeito. Neste mesmo estudo, foi demonstrado que o

efeito de redução da peroxidação lipídica do gengibre é tão eficaz quanto àquela

27

obtida com o ácido ascórbico. Esse efeito influenciou nos níveis enzimáticos da

superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase.

1.3.3 Atividade Antimicrobiana

O consumo de mais de uma tonelada diária de antibióticos em alguns

países da Europa tem resultado na resistência de populações bacterianas, causando

assim um sério problema de saúde pública. Isso leva à pesquisa de novas drogas e,

consequentemente, o estudo de plantas que possuem essa atividade na medicina

popular (BAQUERO e BLAZQUEZ, 1997).

Avaliações etnobotânicas do gengibre demonstraram a capacidade de

inibição de inúmeros fungos e bactérias patogênicas no homem (F ICKER et al.,

2003; JAMES et al., 1999).

Estudo realizado por James e colaboradores em 1999, demonstrou que o

gengibre foi capaz de inibir a multiplicação de bactérias fermentadoras de

carboidratos não digeridos no cólon e é capaz de inibir, in vitro, o crescimento de

Escherichia coli, Proteus sp, Staphylococcus sp, Streptococcus sp e Salmonela sp.

Estudos mais recentes mostraram que os componentes da raiz do

gengibre possuem atividade antibacteriana sobre M. luteus, B. cereus, B. subfilis,

Enterobacter aerogenes, Burkholderia pseudomalle, Staphylococcus aureu

(PEREIRA, 2002; RUFF et al., 2006).

Aguiar e colaboradores 2009 relataram que o extrato glicólico de gengibre

e o hipoclorito de sódio têm ação fungicida sobre Candida albicans oral. Entretanto,

essa atividade foi superior com o hipoclorito de sódio, pois a atividade fungicida do

extrato glicólico de gengibre está limitada à sua concentração máxima de 12,5%.

Isso ocorre, pois em maiores concentrações o efeito pungente seria muito

pronunciado e poderia ocorrer dano a mucosa bucal.

.

1.3.4 Estudos no Combate ao Câncer

O 6-gingerol possui inúmeras aplicações na medicina oriental,

principalmente, como erva que ―previne‖ vários tipos de câncer. Existem inúmeros

28

tipos de câncer, mas, no Brasil, o câncer de pele é o tipo de mais freqüente,

correspondendo a cerca de 25% de todos os tumores malignos registrados no Brasil

(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2010).

Kim e colaboradores (2007; 2005) demonstraram que o pré-tratamento

com o 6-gingerol foi capaz de reduzir, in vitro, os níveis intracelulares de espécies

reativas de oxigênio, induzidas por raios utra-violeta tipo B (UVB).

Outro estudo reportou que o 6-gingerol em concentrações de até 25µM foi

capaz de induzir apoptose em células da linhagem JB6 (referencia) e que em

concentrações a partir de 50µM causou morte dessas células aparentemente por

necrose (HUANG et al., 1996).

Estudo recente mostrou que o 6-gingerol inibiu a adesão celular, a

invasão celular e a atividade de metaloproteinases de matriz na linhagem MDA-MB-

231 de células tumorais de mama humanas (LEE et al., 2008).

Em 2003, Mahady e colaboradores relataram que o Helicobacter pylori é o

principal agente associado a úlceras pépticas e posterior desenvolvimento de câncer

gástrico e do cólon. O 6-gingerol inibiu o crescimento de cepas de Helicobacter pylori

CagA+. Essa atividade protetora pode ser benéfica contra o câncer de cólon

(ISHIGURO et al., 2007).

Em outro experimento realizado em 2009, Chung-Yi e colaboradores

mostraram que o 10-gingerol (50-100µM), em concentração dependente, diminuiu a

viabilidade celular de câncer colorretal da linhagem SW480.

Em modelos de câncer pulmonar uma preparação fitoterápica utilizada na

medicina chinesa, composta por cinco ervas, dentre elas o gengibre, inibiu a

metástase pulmonar de células de melanoma B16F10 em camundongos através da

estimulação de células TCD8 (SUZUKI et al., 1997).

Utilizando o 6-gingerol isolado, foi observado que essa substância foi

capaz de inibir a angiogênese, consequentemente, diminuir as metástases, quando

os camundongos receberam células de melanoma da linhagem B16F10 por via

intravenosa (KIM et al., 2005). Com esse resultado foi confirmada a ação dos

29

componentes do gengibre no resultado encontrado em 1997 por Suzuki e

colaboradores.

Alguns estudos sugerem que o 6-gingerol pode diminuir inflamações na

próstata, além de elevar os níveis de prote ínas, como a caspase 9 e a caspase 3,

que estão relacionadas a apoptose em células sensíveis a testosterona via

upregulacion de p53 (NONN et al., 2007; SHUKLA et al., 2007).

1.3.5 Atividade cardioprotetora e Anti-hipertensiva

Estudo mostrou que o gengibre possui efeito sinérgico à nifedipina quanto

ao efeito antiagregante plaquetário em voluntários normais e em pacientes

hipertensos. Os autores mostraram que a porcentagem da agregação plaquetária

induzida por colágeno, ADP e epinefrina em pacientes hipertensos foi maior, em

relação aos voluntários normais. Nesse mesmo estudo demonstrou-se que tanto

aspirina quanto gengibre poderiam potencializar o efeito antiagregante da nifedipina

nos grupos estudados. Uma combinação de 1g de gengibre administrado com 10mg

de nifedipina, por dia, pode ser valioso para prevenção de complicações

cardiovasculares, devido ao poder da associação na redução na agregação

plaquetária (BORDIA et al., 1997).

Estudo realizado na Arábia Saudita avaliou o efeito cardioprotetor do 6-

gingerol frente à Doxorubicina (DOX) - representante da classe das antraciclinas -

que possui elevado potencial cardiotóxico, o que limita seu uso clínico (STEARE et

al., 1995).

Ratos wistar, após administração de DOX (20mg/Kg) por via

intraperitonial, demonstraram aumento significativo da enzima lactato desidrogenase

(LDH) sérica 24 horas a administração. Essa elevação foi inibida quando os animais

receberam 6-gingerol (10mg/Kg) como pré-tratamento cinco dias antes da aplicação

da DOX (MANSOUR et al., 2008).

Nesse mesmo estudo Mansour e colaboraradores (2008) constataram que

a aplicação DOX (20mg/Kg) causou aumento de cinco vezes, após 48 horas, da

isoenzima cardíaca da creatinoquinase (CK-MB) no soro dos animais e quando o 6-

30

gingerol (10mg/Kg) foi utilizado como pré-tratamento de forma semelhante à anterior,

ocorreu uma redução de 58% na atividade dessa enzima.

Ghayur e colaboradores (2005) relataram que o extrato de gengibre

possui um efeito hipotensor importante e que os canais de cálcio dependentes de

voltagem podem estar envolvidos no mecanismo de relaxamento e vasodilatação.

Estudos com ratos wistar mostraram a utilização do extrato de gengibre

aceleram a taxa a taxa de bombeamento do cálcio, aumentando sua concentração

intracelular, sem interferir no seu efluxo, através da ativação da bomba Ca+2-ATPase

do retículo sarcoplasmático e que o gengibre possui efeito sinérgico em pacientes

que fizeram a combinação de 1g do rizoma com 10mg de nifedipina, por dia

(YOUNG et al., 2006, KOBAYSHI et al, 1988; IWASAKI et al, 2006).

Ghayur et al., (2005) demonstraram que o extrato de gengibre é capaz de

inibir canais de cálcio e que o extrato seco não possuía nenhuma ação sobre a

frequência cardíaca e pressão arterial em ratos wistar normotensos.

Entretanto, alguns estudos realizados com o extrato do gengibre

explorando o potencial anti-hipertensivo mostram resultados controversos, como

vasodilatação inicial e posterior vasoconstrição em modelos de anel de aorta

(IWASAKI et al. 1988; KOBAYSHI et al. 2006). Por isso, mais pesquisas tem que ser

realizadas com as moléculas que estão sendo isoladas para que, com isso, seja

mais seguro propor um mecanismo para seu efeito anti-hipertensivo em animais com

hipertensão pré-estabelecida.

1.4 Família de Receptores de Potencial Transiente (TRP)

Após análise dos resultados obtidos no sistema de perfusão renal, surgiu

a hipótese que o 6-gingerol estava agindo através de receptores do tipo TRPV1 que

atualmente estão ganhando repercussão por suas ações renais (CATERINA et al,

2007).

A pelve renal é bastante inervada por nervos sensoriais aferentes e essa

estrutura renal é considerada importante na detecção de estímulos mecânicos, bem

como, estímulos químicos que levam a alteração renal da função excretora, incluindo

31

diurese e natriurese (AVELINO et al, 2002; KOOP et al, 1984; GONTIJO et al,

1994).

Estudos na literatura demonstram que o TRPV1 pode ser ativado por

diversos estímulos, como o calor, compostos com baixo pH, metabólitos derivados

dos lipídeos e desequilíbrio osmótico Gonti jo, et al; (1994) e Yi e Wang, (2008)

demonstraram que a ativação dos receptores TRPV1 causava diurese e natriurese.

Zhu et al, 2005 perfundiram capsaicina na pelve renal de ratos e

demonstraram que um aumento no fluxo de urina em ambos os rins e que estes

achados foram abolidos com sucesso pelo bloqueador deste receptor a

capsazepina.

Os gingerols possuem uma porção vanílica (Figura 6, a região A), que é

considerada importante para a ativação do responsável por conferir afinidade ao

sítio vanilóide, e também na região B, responsável por conferir uma conformação

estruturar favorável a interação da molécula com o receptor (WALPOLE et al., 1993).

A B

Figura 6 - Regiões importantes para a interação com o receptor

A história dos receptores de potencial transitório (TRP) começa na década

de 1960, quando Cosens e Manning (1969) descreveram pela primeira vez a

existência de uma variante mutante de Drosophila meganobaster que se

apresentava cega. Analisando seu sistema visual, foi observado que o fotoceptor

apresentava uma resposta transiente à estimulação luminosa prolongada, enquanto

O OH

OH

O

CH3

CH3

32

que o fotoceptor normal apresentava uma resposta contínua. Já em (1989) os

pesquisadores Montell e Rubin descreveram a presença de uma proteína composta

por 1275 aminoácidos dispostos em aproximadamente oito segmentos transmembra,

sem homologia a outros receptores descritos na literatura da época. Essas

descobertas levaram os pesquisadores na busca do gene que codificava esta

proteína e em 1992 Phillips e colaboradores encontraram o gene que foi

denominado trp-like (trpl), e, também, foi observado que esta proteína possuía

homologia com a região do sensor de voltagem de alguns canais de cálcio,

sugerindo que este gene poderia codificar subunidades de um canal permeável a

cálcio.

Atualmente, compreende-se que os receptores de potencial transitório

(TRP) são uma família de canais iônicos com a capacidade de permear cátions,

principalmente cálcio. Apesar das teorias iniciais descreverem a existência de oito

domínios transmembrana, técnicas de imagem por microscopia eletrônica e

bioquímica demonstraram que na verdade, os canais TRP são formados por seis

domínios transmembrana com a região formadora do poro entre as regiões cinco e

seis, e a região sensor de voltagem entre as regiões um e quatro (LATORRE et al,

2009). A cauda C e N terminal apresentam-se voltadas para o lado intracelular, com

caráter fortemente hidrofóbico (Fig. 7) (GAUDET, 2009).

A região C terminal apresenta variação dentre os diferentes tipos de

canais TRP, apresentando diferentes sítios e também uma região conservada

(domínio TRP ou TRP box). Esta última região apresenta-se conservada em 11 das

13 isoformas conhecidas em mamíferos atualmente, sendo utilizada como marcador

para o rastreamento destes canais. Além disso, alguns canais ainda apresentam

sítio de ligação para calmodulina, como o TRPV, ou domínios enzimáticos, como os

TRPM (Zhu, 2005). Acredita-se também que estes canais possam se apresentar

como homômeros tetraméricos (STRUBING et al., 2001).

A região N terminal apresenta-se formada por uma série de resíduos de

anquirina, presente na maioria dos canais TRP. Estes resíduos estão dispostos

como tijolos empilhados, formando uma superfície estável e rígida para o

acoplamento de diversas proteínas ao receptor. Além disso, estes domínios servem

como âncoras para o transito do receptor de vesículas até a membrana plasmática,

33

e também para a sua estabilização com a mesma e o cito esqueleto celular. Para

alguns receptores, como os TRPVs, alterações nesta região implicam em uma não

funcionalidade do mesmo (MONTELL et al., 2005).

Figura 7 - Representação espacial da estrutura das diferentes famílias de receptores TRP. Adaptado de Montell, 2005.

34

JUSTIFICATIVA

35

2. JUSTIFICATIVA

A ciência se dedica ao estudo de muitas substâncias derivadas de

microrganismos, plantas e animais e o conhecimento dos mecanismos envolvidos

em suas ações se faz necessário, pois provenientes destes organismos milhares de

substâncias podem ser extraídas e servirem de ferramentas farmacológicas no

tratamento de inúmeras enfermidades. Entre esses organismos as plantas são

muito importantes, pois diversas culturas as utilizam há milênios com resultados

excelentes do ponto de vista terapêutico, mas com poucos dados científicos

relacionados com suas ações.

O uso de gengibre em doenças cardiovasculares é conhecido há muito

tempo na medicina tradicional paquistanesa, pelo seu efeito diurético e por causar

redução da pressão arterial (TYLER et al, 1993; MILLER et al, 1998).

Curiosamente, alguns estudos foram realizados para tentar elucidar o

efeito hipotensor do extrato de gengibre e suas atividades, mas alguns resultados

encontrados eram contraditórios (WEIDMAR et al, 2000).

Em relação a sua ação diurética conhecida na medicina tradicional, quase

nenhum dado científico é conhecido, mas algumas moléculas com características

parecidas com o 6-gingerol, como é o caso da capsaisina (extraído da pimenta),

estão sendo estudadas por inúmeros grupos de cientistas em todo mundo e em

(2008) Li e Wang demonstraram que essa substância aumenta e ritmo de fi ltração

glomerular e a excreção de eletrólitos na perfusão de rim isolado. Entretanto, o uso

desta substância como diurética é limitado por possuir um elevado efeito irritante.

Portanto este trabalho objetiva avaliar os efeitos renais e pressóricos

promovidos pelo o 6-gingerol isolado do gengibre, além de avaliar se o efeito

diurético promovido pelo gengibre é causado pelo 6-gingerol.

36

OBJETIVOS

37

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Avaliar os efeitos renais, cardíacos e pressóricos do 6-gingerol isolado do gengibre

(Zingiber officinale Rosce) em animais normais e hipertensos, visando obter

resultados que possam subsidiar a elucidação de seu mecanismo de ação

fisiológico, bem como confirmar aspectos farmacológicos descritos na medicina

popular na busca de novas ferramentas farmacológicas.

3.2 Objetivos Específicos

- Estudar os efeitos renais do 6-gingerol em rim isolado de rato;

- Avaliar as alterações na pressão arterial promovidas pelo 6-gingerol em ratos

anestesiados;

- Observar as alterações histológicas em rim e coração após o tratamento com o 6-

gingerol.

- Estudar o efeito do 6-gingerol sobre a viabilidade de células tubulares (MDCK);

38

MATERIAIS E MÉTODOS

39

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Perfusão de Rim Isolado

4.1.1 Animais de Experimentação

Serão utilizados ratos Wistar adultos, machos, entre 250 e 300g. Os

animais serão mantidos em jejum durante as 12 horas que antecedem cada

experimento apenas com água ―ad libitum” e os grupos experimentais (n = 6).

4.1.2 Substâncias Utilizadas

Foi utilizado o 6-gingerol que gentilmente foi fornecido pelo professor

pesquisador Dr. Paulo Cezar Vieira e o Dr. Jame’s Almada da Silva da Universidade

Federal de São Carlos.

No procedimento cirúrgico foram utilizados pentobarbital sódico a 3%

(Cristália), manitol (Reagen) e heparina (Cristália).

A solução empregada nos experimentos foi a de Krebs-Henseleit modificada

contendo as seguintes substãncias com suas respectivas concentrações: 114.0mM

de NaCl; 4.96mM de KCl; 1.24mM de KH2PO4; 0.5mM de MgSO4.7H2O; 24.99mM

de NaHCO3; 2.10mM de CaCl2.2H2O; 3.60mM de glicose e albumina bovina a 6%

peso por volume.

4.1.3 Preparo da Solução Perfusora

A solução de Krebs-Henseleit modificada (FONTELES, 1998),

concentrada 20x, continha NaCl = 138g, KCl = 7g, NaH2PO4.H2O = 3,2g, MgSO4. 7

H2O = 5,8g e Uréia = 10g. Quarenta e oito horas antes dos experimentos, 100mL

desta solução foram separados e acrescidos de NaHCO3 = 4,2g , CaCl2 . 2 H2O =

0,74g, glicose = 2g, e penicilina G potássica cristalina = 0,05g. Em seguida, o

volume foi completado para 2000 mL com água bidestilada. Foram retirados 300 mL

desta solução, aos quais se adicionou albumina bovina (6g%). Em seguida, solução

foi dializada com albumina, auxi liada por um homogeneizador. A diálise tem como

40

objetivo retirar substâncias contaminantes como piruvatos, citratos e lactatos

(HANSON e BALLAR, 1968; COHEN, KOOK e LITTLE,1977; ROSS, 1978).

A solução de Krebs-Henseleit para a diálise foi trocada com 24 horas. No

final, após 48 horas de diálise, a solução perfusora foi acrescida com 0,15g de

inulina. O pH da solução perfusora foi ainda ajustado entre os valores de 7,3 e 7,4.

4.1.4 Sistema de Perfusão Renal

Necessidade do conhecimento dos mecanismos de controle da função

renal levou inúmeros pesquisadores a desenvolverem a técnica de perfusão de rim

isolado. Esta técnica permite o estudo da função renal na ausência de influências

sistêmicas (NIZET, 1975). O nosso sistema consiste na perfusão de rim isolado com

recirculação (FONTELES et al., 1983) com dois subsistemas, um in situ e outro em

circuito fechado, para perfusão in vitro, ambos mantidos à temperatura de 37 ºC.

Este sistema apresenta a vantagem da manutenção constante de

parâmetros funcionais renais com utilização de albumina na solução perfusora, em

menor volume, mantendo constante as substâncias dialisáveis com oxigenação

adaptada ao próprio sistema como demonstrado nas figuras 8 e 9.

Figura 8 - Sistema de perfusão renal. Fonte: LAFAVET – UFC

41

Figura 9 - Desenho esquemático do sistema de perfusão de rim isolado. Fonte: LAFAVET – UFC.

4.1.5 Calibração do Sistema de Perfusão de Rim Isolado de Rato

A calibração do sistema foi realizada antes de cada experimento com uma

solução de cloreto de sódio a 0,9% mantida a 37°C. Foram observados para cada

unidade da bomba de perfusão (1, 2, 3, 4 e 5) a pressão de perfusão (mmHg), o

fluxo da solução no sistema (L/min) e o volume de solução coletado em um minuto

42

(mL/min). Para uma melhor adaptação do sistema às unidades, a coleta de dados foi

realizada em intervalos de 2 minutos. As figuras 10, 11 e 12 mostram que o sistema

manteve-se constante em todos os grupos experimentais.

Figura 10- Valores de pressão de perfusão (PP) registrados durante a calibração do sistema (n=6).

Figura 11 - Valores registrados pelo fluxômetro (L/min.) durante a calibração do sistema (n=6).

43

Figura 12- Valores de volume de solução (mL/min) registrados durante a calibração do sistema (n= 6).

4.1.6 Técnica Cirúrgica

As cirurgias foram realizadas segundo o método descrito por Balhlmann et

al. (1967); Nishiitsutji-Uwo et al. (1967); Ross, (1978) e Fonteles et al. (1983). Os

animais (n=6) foram anestesiados com pentobarbital sódico na dose de 50mg/Kg de

peso corporal. Inicialmente, a veia femoral foi isolada e manitol (100mg/mL – 3 mL

independentemente do peso) foi administrado (Figura 13), a fim de facilitar a

visualização e a fixação da cânula ao ureter.

Após assepsia da parede abdominal, procedeu-se uma incisão mediana e

duas incisões perpendiculares à linha alba para uma melhor observação das

estruturas anatômicas.

44

Figura 13 - Administração de manitol (100mg/mL – 3mL independentemente do peso) pela veia femoral no animal anestesiado.

Com uma lupa (aumento de 7 vezes) o ureter foi identificado, dissecado e

canulado – tubo de polietileno PE-30 (Fig. 11), bem como a artéria mesentérica

superior, artéria renal (Fig. 12) e a glândula supra-renal identificadas. O rim direito foi

descapsulado e a glândula supra-renal isolada. Outra cânula metálica foi introduzida

na artéria mesentérica superior até a artéria renal, onde foi fixada (Fig. 13).

45

Figura 14 - Identificação e dissecação do ureter (A) e ureter canulado (B).

46

Figura 15 - Visualização da artéria mesentérica (A), da artéria renal (B) e também da artéria aorta (C).

Figura 16 - Canulação da artéria renal realizada através da artéria mesentérica.

47

Durante o procedimento cirúrgico, uma parte da solução já oxigenada

(40mL) foi desviada para o sistema de perfusão in situ, para perfundir o rim ainda in

vivo, evitando qualquer isquemia ao órgão. Finalmente, o rim foi transportado para o

sistema de perfusão in vitro, sem a interrupção do fluxo (Fig. 17).

Figura 17 - Rim de rato isolado no sistema de perfusão.

48

4.1.7 Protocolo Experimental

Os experimentos foram iniciados após a estabilização e adaptação do

órgão às novas condições. Após os 30 minutos iniciais, considerados como controle

interno, foi adicionada a substância-teste e observadas as mudanças nos

parâmetros renais até os 120 minutos.

A cada cinco minutos foram registrados a pressão de perfusão e o fluxo

de perfusão em manômetro e fluxômetro, respectivamente. Amostras de urina e

perfusato foram coletadas a cada dez minutos, e depois congeladas a -20 °C para

posterior dosagem de sódio, potássio, cloreto, inulina e osmolaridade, importantes

no cálculo dos parâmetros da função renal.

4.1.8 Análises Bioquímicas

Nas amostras de urina e perfusato foram realizadas determinações de

sódio, potássio e cloreto pelo método do íon eletrodo seletivo (RapidChem 744 -

Bayer®diagnóstica). Essas determinações foram realizadas no Laboratório de

Análises Clínicas e Toxicológicas da Faculdade de Farmácia, Odontologia e

Enfermagem da Universidade Federal do Ceará.

A inulina do perfusato e da urina foi determinada por hidrólise direta,

conforme Walser et al. (1955) e Fonteles et al. (1983), com modificações que

reduziram as quantidades de amostras e reagentes utilizados. Esse parâmetro foi

determinado no Laboratório de Farmacologia de Venenos e Toxinas (LAFAVET) do

Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da

Universidade Federal do Ceará.

A osmolaridade das amostras de urina e perfusato foram medidas

utilizando um osmômetro (Osmômetro de Pressão a Vapor - modelo WESCOR®

Vapro 5520).

49

4.1.9 Cálculo dos Parâmetros Funcionais Renais

1. FU (mL.g-1

. min-1

) = Fluxo urinário

FU = (Peso do volume urinário / Peso do rim esquerdo) x 10

2. PP (mmHg) = Pressão de perfusão. Leitura em manômetro

3. RFG (mL.g-1

.min-1

) = Ritmo de filtração glomerular

RFG = (DOU in / DOP in x FU) sendo DOU in = densidade ótica da inulina na urina e DOP in =

densidade ótica da inulina no perfusato

4. FPR (mL.g-1

.min-1

) = Fluxo de perfusão renal (registrado a cada 10 min/peso do rim/intervalo de

tempo)

5. RVR (mmHg/mL.g-1

.min-1

) = Resistência vascular renal

RVR = PP (mmHg) / FPR

6. FNa+ (μEq.g

-1. min

-1) = Sódio filtrado

FNa+ = RFG x PNa+ (PNa

+ = Concentração de sódio no perfusato)

7. ENa+ (μEq.g

-1. min

-1) = Sódio excretado

ENa+ = FU x UNa

+ (UNa

+ = Concentração de sódio na urina)

8. TNa+ (μEq.g

-1. min

-1) = Sódio transportado

TNa+ = FNa

+ - ENa

+

9. %TNa+ = Percentual de sódio transportado

%TNa+ = TNa

+ x 100 / FNa

+

10. %TpNa+ = Percentual de sódio proximal transportado

%TpNa+ = TpNa

+ x 100 / FNa

+

11. FK+ (μEq.g

-1. min

-1) = Potássio filtrado

FK+ = RFG x PK

+ (PK

+ = concentração de potássio no perfusato)

12. EK+ (μEq.g

-1. min

-1) = Potássio excretado

EK+ = FU x UK

+ (UK

+ = Concentração de potássio na urina)

13. TK+ (μEq.g

-1. min

-1) = Potássio transportado

TK+ = FK

+ - EK

+

14.TK+ = Percentual de potássio transportado

%TK+ = TK

+ x 100 / FK

+

15. %TpK+ = Percentual de potássio proximal transportado

%TpK+ = TpK

+ x 100 / FK

+

16. TCl- (μEq.g-1

. min-1

) = Cloreto transportado

TCl – = FCl

– - ECl

–

17. % TCl- = Percentual de cloreto transportado

% TCl – = TCl

– x 100 / F TCl

–

18. % TpCl- = Percentual de cloreto proximal transportado

% TpCl – = TpCl

– x 100 / F TCl

–

Quadro 1 - Cálculos para determinação dos parâmetros funcionais renais.

50

4.1.10 Análise Histológica

Após cada experimento, ambos, rim direito (perfundido) e rim esquerdo

(controle), foram coletados e fixados numa solução de formal a 10%, para posterior

análise histológica.

Os fragmentos obtidos foram submetidos à desidratação, diafanização, e,

em seguida, cortados em uma espessura de 5μm. Foram realizadas colorações de

hematoxi lina-eosina (HE) e as lâminas analisadas através de um microscópio óptico

(NIKON). Todas as lâminas foram confeccionadas e analisadas no Laboratório de

Patologia-BIOPSE pelo Prof. Dr. Dalgimar Beserra de Menezes.

4.1.11 Análise Estatística

Foi usado o programa estatístico GraphPrism 5.0 para análise dos dados,

que foram expressos como a média ± erro padrão da média (E.P.M.) de seis

experimentos em cada grupo.

Todas as tabelas e gráficos que avaliaram os parâmetros renais foram

estudados de acordo com a variável tempo, compilados em quatro grupos de 30

minutos denominados: 30, 60, 90 e 120 minutos. Os dados foram avaliados através

de Análise da Variância (ANOVA), com pós-teste de Dunnett´s (múltipla comparação

entre os grupos) e teste t de Student como comparativo entre os grupos controle e

tratado. O critério de significância utilizado foi p<0,05.

4.2 Efeitos na Pressão Arterial Média de Ratos Anestesiados

4.2.1 Animais de Experimentação

Ratos Wistar, machos, pesando de 250-300 g foram submetidos a jejum de

24 horas.

4.2.2 Técnica Cirúrgica

Após o jejum os animais foram anestesiados com pentobarbital sódico (50

mg/kg) e submetidos à cirurgia. A traquéia foi isolada e uma curta cânula de

polietileno (PE 120) foi inserida nos animais por meio de traqueostomia, permitindo

51

um fluxo respiratório espontâneo e a fácil aspiração de eventuais secreções

brônquicas.

Figura 18 - Localização anatômica da artéria e veia femural e posicionamento dos cateteres

arterial (vermelho) e venoso (azul).

Após a traqueostomia, dois cateteres de polietileno (PE10 conectado a

PE50) pré-enchidos com heparina (500 UI.mL-1 em salina isotônica) foram

implantados na aorta abdominal (para registro da Pressão Arterial Média e

Frequência Cardíaca) e na veia cava inferior (para administração de drogas), ambos

1 cm abaixo da artéria renal, conforme técnica descrita previamente (LAHLOU et al.,

1999; SIQUEIRA, 2005).

4.2.3 Protocolo Experimental

Foram utilizadas quatro doses para executar a curva dose-resposta 30,

100, 300 e 1000 µg/Kg e os resultados foram expressos em percentagem de queda

frente ao valor basal.

52

4.2.4 Sistema de Aquisição de Dados

No momento do experimento, o cateter aórtico foi acoplado a um

transdutor de pressão piezo-elétrico (Braile BXSN) acoplado ao sistema de

amplificação de sinal com interface USB (DATAQ DI-148U) e utilizando o software

de aquisição de dados WinDaq/Lite. A P.A.M. e a F.C. foram diretamente calculadas

pelo software (Figura 19).

Figura 19 - Sistema de aquisição de dados.

4.2.5 Análise Histológica

Após cada experimento os rins e o coração foram coletados e fixados em

uma solução de formal a 10%, para posterior análise histológica.

Os fragmentos obtidos foram submetidos à desidratação, diafanização, e,

em seguida, cortados em uma espessura de 5μm. Foram realizadas colorações de

hematoxi lina-eosina (HE) e as lâminas analisadas através de um microscópio óptico

(NIKON). Todas as lâminas foram confeccionadas e analisadas no Laboratório de

Patologia-BIOPSE pelo Prof. Dr. Dalgimar Beserra De Menezes.

53

4.3 Avaliação da Atividade do 6-gingerol sobre as Células Tubulares Renais

(MDCK)

4.3.1 Linhagem Celular

As células utilizadas foram células tubulares renais do tipo MDCK (Madin-

Darby Canine Kidney) que foram cultivadas no Laboratório de Cultura Celular (LCC)

do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da Universidade Federal do

Ceará.

4.3.2 Cultivo e Tratamento das Células MDCK

Foram cultivadas em garrafas de polietileno para cultura (volume de

250mL) e o meio de cultura usado foi o RPMI 1640 (Gibco) suplementado com 10%

v/v de Soro Bovino Fetal (SBF), penicilina (100UI/mL) e estreptomicina (100μg/mL).

As células foram incubadas a 37ºC, em atmosfera com 95% de umidade e 5% de

CO2.

Antes de cada experimento as células foram armazenadas em meio sem

SBF por 24h para a obtenção de células na fase G0 do ciclo celular. Para cada

experimento o meio de cultura foi removido e as células foram incubadas com

tripsina-EDTA (0,25/0,02% v/v) a 37ºC por aproximadamente 10min. A tripsina foi

inativada adicionando o mesmo volume de meio com SBF. A suspensão foi então

centrifugada a 200g por 10min (MARTINS et al. 2005; CHAIM, 2005). O

sobrenadante foi descartado e as células re-suspensas em meio de cultura. As

células foram então quantificadas em câmara de Neubauer e plaqueadas

(1x105céls/poço) permitindo o crescimento confluente por 2h.

As células então foram avaliadas na presença de diferentes

concentrações de 6-gingerol, solubilizadas em DMSO a 1% e pH 7.4. Foram

realizados experimentos com os tempos de 6 horas e 24 horas. Após esses períodos

também foram realizados ensaios de viabilidade (Figura 26).

54

Figura 20 – Fluxograma do cultivo e tratamento das células MDCK. Fonte: LCC – Laboratório de

Cultivo Celular.

As alíquotas de células para estoque foram mantidas em meio de cultura

RPMI 1640 acrescido de SBF a 50% e DMSO a 10%, congeladas primeiramente à -

80°C e mantidas em nitrogênio líquido (FRESHENEY, 2000).

4.3.3 Ensaio Colorimétrico com Sal de Tetrazolium (MTT)

As células MDCK foram divididas em três grupos:

Grupo 1: Células tratadas com 6-gingerol nas concentrações (1µM; 3 µM; 10

µM; 30 µM; 100 µM)

Grupo 2: Células tratadas com Capzasepina nas concentrações (1 µM; 3 µM;

10 µM; 30 µM; 100; 300 µM)

Grupo 3: Células tratadas com 6-gingerol (10 µM), capzasepina (30 µM) e

combinação destas.

55

Antes dos tratamentos as células foram adicionadas a placas de 96 poços

com densidade de 1 x 105 e tratadas de acordo com os grupos citados acima em

dois tempos de encubação; 6 horas e 24 horas. Após a exposição das células as

substâncias, 100μL de sobrenadante de cada poço foi retirado e então adicionado 3-

(4,5-dimetilazil-2-il)-2,5 difenil tetrazólico (MTT) (Sigma) 2,5 mg/mL dissolvido em

PBS. Este método baseia-se na atividade metabólica de células viáveis, formando

um produto colorido (sal de formazan, que é insolúvel em água). Após incubação por

4 horas, à 37ºC, em estufa com 5% de CO2, o sobrenadante foi removido e então foi

adicionado dodecil sulfato de sódio 10% (SDS – 10%) em HCL 0,01N para

solubilizar os cristais de formazan formados. As placas foram incubadas por 17h e

em seguida foi realizada a leitura em espectrofotômetro (570nm). Os ensaios foram

realizados em triplicata (MOSMANN,1983) e a viabilidade celular foi determinada por

comparação entre as absorbâncias encontradas nos grupos tratados e a

absorbância média do grupo controle (representa 100% de células viáveis).

4.3.4 Aspectos Éticos

Todos os nossos experimentos foram feitos de acordo com as

recomendações do Comitê de Ética em Pesquisa com Animais (CEPA) da

Universidade Federal do Ceará, sob o número 55/09.

56

RESULTADOS

57

5. RESULTADOS

5.1 Avaliação da Atividade do 6-gingerol e da Capzasepina sobre as Células

MDCK

O 6-gingerol apresentou redução da viabilidade apenas na dose de 30µM

no período de incubação de 6 (seis) horas, quando comparados com o controle

(Controle: 100,0 ±1,024; 1µM: 112,7 ± 7,736; 3µM 107,2 ± 0,1138; 10µM 111,4 ±

3,640; 30µM 92,95* ± 0,2275) (Fig. 21).

Não foi observada redução da viabilidade das células MDCK no grupo da

capzasepina e no grupo da combinação das duas substâncias quando comparados

ao controle (Figura. 21 e Figura. 22, respectivamente).

5.2 Experimento com 6 horas de Incubação

Figura 21 - Efeitos do 6-Gingerol em células tubulares renais (MDCK). Ensaio com MTT os dados

são expressos por média ± Erro Padrão Médio (E.P.M.) da absorbância e representam o percentual

de células viáveis após um período de incubação de 6 horas. Os dados foram avaliados através de

Análise da Variância (ANOVA), com pós-teste de Dunnett´s (múltipla comparação entre os grupos). O

critério de significância utilizado foi de p<0,05. * significa p<0,05 em relação ao grupo controle (n=9).

58

% Viabilidade capsazepina

Controle 1 3 10 300

50

100

150

Concentrações (/M)

Via

bilid

ad

e c

elu

lar

(%)

Figura 22 - Efeitos da Capsazepina em células tubulares renais (MDCK). Ensaio com MTT os dados





% Viabilidade combinação

Controle 6-Ging 10 Cap 30 Cap+6-Ging

0

50

100

150

Concentrações (/M)

Via

bilid

ad

e c

elu

lar

(%)

Figura 23 - Efeitos do 6-Gingerol + Capsazepina em células tubulares renais (MDCK). Ensaio com

MTT os dados são expressos por média ± Erro Padrão Médio (E.P.M.) da absorbância e representam

o percentual de células viáveis após um período de incubação de 6 horas. Os dados foram avaliados

através de Análise da Variância (ANOVA), com pós-teste de Dunnett´s (múltipla comparação entre os

grupos). O critério de significância utilizado foi de p<0,05. * significa p<0,05 em relação ao grupo

controle (n=9).

59

5.3 Experimento com 24 horas de Incubação

O 6-gingerol causou uma redução da viabilidade das células MDCK

analisadas nas concentrações de 30 µM e 100 µM (30 µM 65,22* ± 2,47; 100 µM

6,347* ± 0,03534) (Figura 24).

A capsazepina causou uma redução da viabilidade das células MDCK nas

doses de 100 µM e 300 µM (100 µM 73,793* ± 2,13; 300 µM 40,293* ± 1,88) (Figura

25).

No grupo de união das duas substâncias 6-gingerol 10 µM e capsazepina

30 µM não houve redução significativa da viabilidade (Figura 26). Neste mesmo

gráfico pode ser visto um aumento da viabilidade com a capsazepina na dose de 30

µM.

Figura 24 - Efeitos do 6-Gingerol em células tubulares renais (MDCK). Ensaio com MTT os dados





60

Figura 25 - Efeitos da Capsazepina em células tubulares renais (MDCK). Ensaio com MTT os dados





Figura 26 - Efeitos do 6-Gingerol + Capsazepina em células tubulares renais (MDCK). Ensaio com MTT os dados são expressos por média ± Erro Padrão Médio (E.P.M.) da absorbância e representam

o percentual de células viáveis após um período de incubação de 24 horas. Os dados foram avaliados através de Análise da Variância (ANOVA), com pós-teste de Dunnett´s (múltipla comparação entre os grupos). O critério de significância utilizado foi de p<0,05. * significa p<0,05 em

relação ao grupo controle (n=9).

61

5.4 Avaliação da Atividade do 6-gingerol na Pressão Arterial Média de Ratos

Anestesiados

Administrações consecutivas de doses crescentes do 6-gingerol

produziram redução significativa da pressão arterial média em relação ao controle

em todas as doses utilizadas. A análise estatística destes percentuais máximos de

redução da pressão arterial mostrou que a redução foi significativa em relação aos

valores da dose imediatamente menor em todas as doses utilizadas, conforme

ilustrado na Figura 27.

Os percentuais de redução foram: dose 30 µg/Kg (19,47 ± 3,055); dose 100

µg/Kg (24,09 ± 3,644 ); 300 µg/Kg (41,00 ± 6,092 ); 1000 µg/Kg (52,88 ± 3,372).

Figura 27 - Relação dose-efeito da administração de 6-gingerol, em bolus, em ratos anestesiados com pentobarbital sódico (50 mg/Kg), no percentual de redução da pressão arterial. Dados expressos como média ± E.P.M. e analisados por análise de variância (ANOVA), com pós -teste de Bonferroni, e

pelo teste t de Studente, com *p < 0,05.

A figura 28 demonstra a redução significativa na pressão arterial média em

valores absolutos quando comparados com controle.

As médias dos grupos controle (120,30 ± 3,022); (121,95 ± 3,055); (117,60 ±

4,644); (116,20 ± 4,092); (119,40 ± 5,372) e tratados com o 6-gingerol nas doses de

30 µg/Kg, 100 µg/Kg, 300 µg/Kg, 1000 µg/Kg, respectivamente: (119,84 ± 3,049);

(98,100* ± 3,001); (94,950** ± 3,644); (81,550** ± 6,092); (56,670*** ± 4,372).

6-GINGEROL

30 100 300 1000-60

-40

-20

0

Dose (g/kg)

P

ressão

Art

eri

al

(%)

*

*

*

62

Pressão Arterial em Valores Abasolutos

0 30 100 300 10000

20

40

60

80

100

120

140 Controle

Tratado

Dose (g/kg)

***

****

Pre

ssão

Art

eri

al

Figura 28 - Relação dose-efeito da administração de 6-gingerol, em bolus, em ratos anestesiados com pentobarbital sódico (50 mg/Kg), na pressão arterial média. Dados expressos como média ±

E.P.M. e analisados por análise de variância (ANOVA), com pós-teste de Bonferroni, e pelo teste t de Studente, com *p < 0,05.

5.5 Análise Histológica

Na análise histológica do tecido cardíaco após o experimento de

pressão arterial com 6-gingerol não foi observada nenhuma alteração. (Figura 29).

63

Figura 29 - Aspecto morfológico normal do tecido cardíaco do grupo analisado através de microscopia óptica (aumento de 400x e coloração de hematoxilina-eosina).

Na análise histológica dos rins após o experimento de pressão arterial com 6-

gingerol não foi observada nenhuma alteração. Os glomérulos e túbulos não

apresentaram deposição de material proteináceo e os vasos e o interstício

apresentaram aspecto normal. (Figura. 29).

64

Figura 30 - Aspecto morfológico normal dos rins do grupo analisado através de microscopia óptica (aumento de 400x e coloração de hematoxilina-eosina).

5.6 Perfusão de Rim Isolado Frente ao 6-gingerol

Com a realização deste estudo pode-se observar um aumento na pressão

de perfusão aos 90 e 120 minutos na dose de 3µM quando comparada ao grupo

controle interno (c) (PPc 101.0 ± 1.615; PP90’108.5* ± 1.889; PP120’ 118.2** ± 2.949;

p<0,05, ** p<0,01; *** p<0,0001). Em relação às outras doses utilizadas 10 µM e 30

µM houve aumento significativo em todos os tempos estudados quando comparados

ao grupo controle interno (PPc 108.2 ± 2.322; PP60 113.7 ± 5.975** ; PP90 124.9 ±

4.346**; PP120 133.5 ± 3.947**); (PPc 94.08 ± 1.669; PP60 101.1 ± 1.834**; PP90

109.9 ± 2.714***; PP120 119.4 ± 3.856***) (Fig. 31).

65

A resistência vascular renal sofreu aumento significativo em nossos

estudos apenas nos tempos de 90 e 120 minutos quando comparados com o

controle interno na dose de 10 µM (RVRc 5.416 ± 0.4566; RVR90 6.417 ± 0.431*;

RVR120 6.644 ± 0.423*) (Fig. 32).

O fluxo urinário mostrou aumento significativo nos tempos de 90 e 120

minutos quando comparados com o controle interno, nas doses de 10 µM e 30 µM

(FUc 0.09042 ± 0.007655; FU60 0.1198 ± 0.01258**; FU90 0.1494 ± 0.01426**; FU120

0.1759 ± 0.01473***); (FUc 0.06346 ± 0.002895; FU60 0.07322 ± 0.002686**; FU90

0.1249 ± 0.008615***; FU120 0.1785 ± 0.02449***) (Fig. 33).

Outro parâmetro estudado e que sofreu redução significativa em todas as

doses utilizadas 3 µM, 10 µM e 30 µM e em todos os períodos analisados, quando

foram comparados com o controle interno, foi o ritmo de filtração glomerular (RVRc

0.4260 ± 0.035200; RVR60 0.1810 ± 0.018330***; RVR90 0.1815 ± 0.007558***;

RVR120 0.1944 ± 0.023520***); (RVRc 0.40950 ± 0.05275; RVR60 0.26820 ±

0.04320**; RVR90 0.24630 ± 0.03700**; RVR120 0.20250 ± 0.02703***); (RVRc

0.41080 ± 0.02037; RVR60 0.29120 ± 0.02258**; RVR90 0.30513 ± 0.01768**;

RVR120 0.28280 ± 0.02631**) (Fig.34).

O transporte tubular de sódio foi reduzido de forma significativa em todas

as doses 3 µM, 10 µM e 30 µM utilizadas e em todos os tempos estudados quando

comparados com o controle interno (%TNac 81.88 ± 1.856; %TNa60 63.30 ±

2.312***; %TNa90 63.38 ± 2.316***; %TNa120 61.32 ± 3.494***); (%TNac 83.13 ±

1.856; %TNa60 68.93 ± 3.627**; %TNa90 69.06 ± 1.600**; %TNa 120 46.47 ±

2.907***); (%TNac 83.51 ± 2.541; %TNa60 61.78 ± 5.842***; %TNa90 62.20 ± 4.255

***; %TNa120 61.30 ± 3.943 **) (Fig.35).

O transporte tubular de potássio sofreu alterações da mesma forma que o

transporte de sódio, ocorrendo redução de maneira semelhante: (%TKc 70.21 ±

2.596; %TK60 39.75 ± 4.264 ***; %TK90 41.22 ± 3.495***; %TK120 39.56 ± 4.560***);

(%TKc 72.08 ± 4.108; %TK60 45.21 ± 5.822 **; %TK90 46.23 ± 2.523 **; %TK120

37.78 ± 2.259***); (%TKc 65.28 ± 4.321; %TK60 34.78 ± 6.734 ***; %TK90 33.05 ±

7.716***; %TK120 39.68 ± 5.918**) (Fig. 36).

66

O transporte de cloretos também foi reduzido em todos os tempos

estudados e com as doses utilizadas 3 µM, 10 µM e 30 µM de 6-gingerol (%TClc

78.25± 4.284; %TCl60 51.79 ± 1.675***; %TCl90 51.80 ± 1.060***; %TCl120 52.62 ±

2.302***); (%TClc 80.95 ± 2.955; %TCl60 64.14 ± 4.572**; %TCl90 66.42 ± 2.410**;

%TCl120 36.08 ± 3.974***); (%TClc 81.27 ± 2.567; %TCl60 60.78 ± 4.999**; %TCl90

56.95 ± 4.598**; %TCl120 61.09 ± 5.209**) (Fig. 37).

5.7 Efeitos do 6-gingerol nos Parâmetros Renais.

Figura 31 - Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol nas concentrações de 3 µM, 10µM, 30 µM e DMSO utilizado como diluente na pressão de perfusão os dados são expressos por média ± Erro

Padrão Médio (E.P.M.) compilados em quatro períodos de 30 minutos (30, 60, 90 e 120 minutos). A análise estatística foi feita por ANOVA e teste t de student com *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001.

67

RVR

30 60 90 1200

2

4

6

8DMSO

3

10

30*

*

Tempo (min)

RV

R (

mm

Hg

.mL

/g/m

in)

Figura 32 - Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol nas concentrações de 3 µM, 10µM, 30 µM e

DMSO utilizado como diluente na resistência vascular renal os dados são expressos por média ± Erro

Padrão Médio (E.P.M.) compilados em quatro períodos de 30 minutos (30, 60, 90 e 120 minutos). A

análise estatística foi feita por ANOVA e teste t de student com p<0,05. * significa p<0,05 em re lação

ao controle interno (n=6).

Figura 33 - Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol nas concentrações de 3 µM, 10µM, 30 µM e DMSO utilizado como diluente no fluxo urinário os dados são expressos por média ± Erro Padrão Médio (E.P.M.) compilados em quatro períodos de 30 minutos (30, 60, 90 e 120 minutos). A análise

estatística foi feita por ANOVA e teste t de student com p<0,05. * significa p<0,05 em relação ao controle interno.

68

Figura 34 - Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol nas concentrações de 3 µM, 10µM, 30 µM e DMSO utilizado como diluente no ritmo de filtração glomerular os dados são expressos por média ± Erro Padrão Médio (E.P.M.) compilados em quatro períodos de 30 minutos (30, 60, 90 e 120

minutos). A análise estatística foi feita por ANOVA e teste t de student com p<0,05. * significa p<0,05 em relação ao controle interno (n=6).


DMSO utilizado como diluente no percentual de transporte de sódio os dados são expressos por média ± Erro Padrão Médio (E.P.M.) compilados em quatro períodos de 30 minutos (30, 60, 90 e 120 minutos). A análise estatística foi feita por ANOVA e teste t de student com p<0,05. * significa p<0,05

em relação ao controle interno (n=6).

69


DMSO utilizado como diluente no percentual de transporte de potássio os dados são expressos por média ± Erro Padrão Médio (E.P.M.) compilados em quatro períodos de 30 minutos (30, 60, 90 e 120 minutos). A análise estatística foi feita por ANOVA e teste t de student com p<0,05. * significa p<0,05

em relação ao controle interno (n=6).

Figura 37 - Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol nas concentrações de 3 µM, 10µM, 30 µM e DMSO utilizado como diluente no percentual de transporte de cloreto os dados são expressos por média ± Erro Padrão Médio (E.P.M.) compilados em quatro períodos de 30 minutos (30, 60, 90 e 120


70

5.8 Análise histológica dos grupos da perfusão renal.

Na análise histológica dos rins perfundidos com 6-gingerol na dose

com DMSO 1% não apresentaram deposição de material proteináceo e os vasos e o

interstício apresentaram aspecto normal (Figura 38).

Figura 38 - Corte histopatológico de rim perfundido somente com solução de Krebs -Hanseleit

modificada e DMSO 1% por 120 min (n=6, coloração de hematoxilina-eosina, aumento 100X).

Na análise histológica dos rins perfundidos com 6-gingerol na dose de 3 µM

não foi observado nenhuma alteração nos glomérulos, túbulos, interstícios e vasos

(Figura 39).

71

Figura 39 - Corte histológico de rim direito perfundido com 6-gingerol 3 µM (n=6, coloração de

hematoxilina-eosina, aumento 400X).

Na análise histológica dos rins perfundidos com 6-gingerol na dose de 10

µM não foi observado nenhuma alteração nos glomérulos, túbulos, interstícios e

vasos (Figura 40).

72

Figura 40 - Corte histológico de rim direito perfundido com 6-gingerol 10 µM. (n=6, coloração de

hematoxilina-eosina, aumento 400X).

Na análise histológica dos rins perfundidos com 6-gingerol na dose de 30

µM foi observado deposição de material proteináceo no espaço de Bowman e

intensa deposição de material proteináceo nos túbulos. Entretanto, os vasos e os

interstícios não apresentaram nenhuma alteração (Figura 41).

73

Figura 41 - Corte histológico de rim direito perfundido com 6-gingerol 30 µM (n=6, coloração de hematoxilina-eosina, aumento 400X).

5.9 Efeitos do 6-gingerol frente ao Bloqueio do TRPV1 com Capzasepina.

A administração do 6-gingerol causou um aumento na pressão de

perfusão aos 60, 90 e 120 minutos na dose de 10 µM quando comparada ao grupo

controle interno (c) (PPc 94.08 ± 1.669; PP60’ 101.10* ± 1.834; PP90’ 109.90* ± 2.714;

PP120’ 119.40* ± 3.856) *p<0,05 (Figura 42).

No grupo controle com capsazepina 30 µM houve uma aumento

significativo apenas no tempo de 60 minutos (PP60 100.15* ± 4.800) (Figura 42)

O grupo da combinação do 6-gingerol 10 µM e da capsazepina 30 µM

demonstrou uma atenuação do aumento da pressão de perfusão nos tempos de 60

e 90 minutos, mas não no tempo de 120 minutos (PP90 115.90* ± 6.698) (Figura 42).

74

Figura 42 - Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol na concentração de 10µM e frente ao bloqueio com capzasepina na concentração de 30 µM na pressão de perfusão os dados são expressos por média ± Erro Padrão Médio (E.P.M.) compilados em quatro períodos de 30 minutos (30, 60, 90 e 120


A resistência vascular renal sofreu aumento significativo em todos os

tempos de 60, 90 e 120 minutos quando comparados com o controle interno na dose

de 10 µM (RVRc 3.973 ± 0.1700; RVR60 4.266 ± 0.1739*; RVR90 4.632 ± 0.1872*;

RVR120 5.039 ± 0.2480*) (Figura 43)..

A utilização da capsazepina 30 µM mostrou um aumento significativo na

resistência vascular renal no tempo de 60 minutos quando comparado com o

controle interno (RVR60 4.33 ± 0.187*) (Figura 43.

O grupo da combinação do 6-gingerol 10 µM e da capsazepina 30 µM não

conseguiu reverter o aumento da resistência vascular renal. No entanto, a

comparação entre grupos no mesmo período de tempo 120 minutos, demonstrou

uma redução significativa neste parâmetro. (RVR120 5.039 ± 0.2480; 4.933# ± 0.2429)

(Figura 43).

75

Figura 43 - Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol na concentração de 10µM e frente ao bloqueio com capzasepina na concentração de 30 µM na resistência vascular renal os dados são expressos

por média ± Erro Padrão Médio (E.P.M.) compilados em quatro períodos de 30 minutos (30, 60, 90 e 120 minutos). A análise estatística foi feita por ANOVA e teste t de student com p<0,05. * significa p<0,05 em relação ao controle interno (n=6); # significa p<0,05 em relação ao grupo tratamento (n=6)

no mesmo período avaliado.

O fluxo urinário foi aumento de forma significativa no grupo com 6-

gingerol na dose de 10 µM quando comparados de maneira tempo dependente (FUc

0.09942 ± 0.007655; FU60 0.11980 ± 0.010580*; FU90 0.14940 ± 0.012260*; FU120

0.17590 ± 0.012730*) (Figura 44).

A utilização da capsazepina 30 µM não demonstrou alteração significativa

no fluxo urinário nos tempos estudados (Figura 44).


conseguiu reverter o aumento do fluxo urinário. No entanto, a comparação entre

grupos no mesmo período de tempo 120 minutos, demonstrou uma redução

significativa neste parâmetro. (FU120 0.11000 ± 0.013600; 0.1466# ± 0.017600)

(Figura 44).

76

Figura 44 - Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol na concentração de 10µM e frente ao bloqueio

com capzasepina na concentração de 30 µM no fluxo urinário os dados são expressos por média ± Erro Padrão Médio (E.P.M.) compilados em quatro períodos de 30 minutos (30, 60, 90 e 120 minutos). A análise estatística foi feita por ANOVA e teste t de student com p<0,05. * significa p<0, 05

em relação ao controle interno (n=6); # significa p<0,05 em relação ao grupo tratamento (n=6) no mesmo período avaliado.

O ritmo de filtração glomerular foi reduzido em todos os tempos estudados

houve uma queda no grupo do 6-gingerol na dose 10 µM quando comparados com o

controle interno (RFGc 0.40500 ± 0.04875; RFG60 0.26820 ± 0.04320**; RFG90

0.24630 ± 0.03700**; RFG120 0.20250 ± 0.02703**) (Figura 45)..

O grupo da capsazepina 30 µM não alterou de forma significativa o ritmo

de filtração glomerular (Figura 45).


conseguiu reverter a queda do ritmo de filtração glomerular, mas o bloqueio com a

capsazepina consegui recuperar parcialmente este ritmo no tempo de 120 minutos

quando comparado com o grupo do 6-gingerol no mesmo período estudado, 120

minutos (RFG120 0.20250 ± 0.02703; 0.3308# ± 0.03859) (Figura 45).

77

Figura 45- Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol na concentração de 10µM e frente ao bloqueio com capzasepina na concentração de 30 µM no ritmo de filtração glomerular os dados são expressos por média ± Erro Padrão Médio (E.P.M.) compilados em quatro períodos de 30 minutos (30, 60, 90 e

120 minutos). A análise estatística foi feita por ANOVA e teste t de student com p<0,05. * significa p<0,05 em relação ao controle interno (n=6); # significa p<0,05 em relação ao grupo tratamento (n=6) no mesmo período avaliado.

.

O transporte tubular de sódio foi reduzido de forma significativa em todos

ostempos estudados na dose 10 µM utilizadas quando comparados com o controle

interno (%TNac 83.13 ± 1.856; %TNa60 72.93 ± 3.627*; %TNa90 75.06 ± 1.600*;

%TNa120 46.47 ± 2.907*) (Figura 46).

O percentual de transporte de sódio não foi alterado de forma significativa

no grupo com capsazepina 30 µM (Figura 46).


conseguiu reverter a redução do percentual de transporte tubular de sódio,mas o

bloqueio com a capsazepina consegui reduzir esta perca no tempo de 120 minutos

quando comparado com o grupo do 6-gingerol no mesmo período estudado, 120

minutos (%TNa120 46.47 ± 2.907; 56.65# ± 4.886) (Figura 46).

78

Figura 46- Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol na concentração de 10µM e frente ao bloqueio com capzasepina na concentração de 30 µM no percentual de transporte de sódio os dados são

expressos por média ± Erro Padrão Médio (E.P.M.) compilados em quatro períodos de 30 minutos (30, 60, 90 e 120 minutos). A análise estatística foi feita por ANOVA e teste t de student com p<0, 05. * significa p<0,05 em relação ao controle interno (n=6); # significa p<0,05 em relação ao grupo

tratamento (n=6) no mesmo período avaliado.

.

O transporte tubular de potá ssio foi reduzido de forma significativa em

todos ostempos estudados na dose 10 µM utilizadas quando comparados com o

controle interno (%TKc 76.08 ± 4.108; %TK60 54.21 ± 5.822*; %TK90 61.23 ± 2.523*;

%TK120 37.78 ± 2.259**) (Figura 47).

O percentual de transporte de potássio não foi alterado de forma

significativa no grupo com capsazepina 30 µM (Figura 47).


conseguiu reverter a redução do percentual de transporte tubular de potássio, mas o

bloqueio com a capsazepina potencializou a redução do transporte no tempo de 90

minutos quando comparado com o grupo do 6-gingerol no mesmo período estudado

(%TK90 61.23 ± 2.523; 39.44# ± 2.231) e voltou logo após, no tempo de 120 minutos,

houve uma recuperação em relação ao 6-gingerol no mesmo período estudado

(%TK120 37.78 ± 2.259; 41.54# ± 4.282) (Figura 47).

79

Figura 47 - Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol na concentração de 10µM e frente ao bloqueio com capzasepina na concentração de 30 µM no percentual de transporte de potássio os dados são expressos por média ± Erro Padrão Médio (E.P.M.) compilados em quatro períodos de 30 minutos

(30, 60, 90 e 120 minutos). A análise estatística foi feita por ANOVA e teste t de student com p<0,05. * significa p<0,05 em relação ao controle interno (n=6); # significa p<0,05 em relação ao grupo tratamento (n=6) no mesmo período avaliado.

O transporte tubular de cloreto foi reduzido de forma significativa em todos

os tempos estudados na dose 10 µM utilizadas quando comparados com o controle

interno (%TClc 80.95 ± 2.955; %TCl60 67.14 ± 4.572*; %TCl90 69.42 ± 2.410*;

%TCl120 36.08 ± 3.974*) (Figura 48).

O percentual de transporte de cloreto não foi alterado de forma

significativa no grupo com capsazepina 30 µM (Figura 48).


conseguiu reverter a redução do percentual de transporte tubular de cloreto, mas o

bloqueio com a capsazepina potencializou a redução do transporte no tempo de 90

minutos quando comparado com o grupo do 6-gingerol no mesmo período estudado

(%TK90 69.42 ± 2.410; 52.64# ± 2.339) e voltou logo após, no tempo de 120 minutos,

houve uma recuperação em relação ao 6-gingerol no mesmo período estudado

(%TK120 36.08 ± 3.974; 51.54# ± 4.036) (Figura 48).

80

Figura 48- Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol na concentração de 10µM e frente ao bloqueio com capzasepina na concentração de 30 µM no percentual de transporte de sódio os dados são

expressos por média ± Erro Padrão Médio (E.P.M.) compilados em quatro períodos de 30 minutos (30, 60, 90 e 120 minutos). A análise estatística foi feita por ANOVA e teste t de student com p<0,05. * significa p<0,05 em relação ao controle interno (n=6); # significa p<0,05 em relação ao grupo

tratamento (n=6) no mesmo período avaliado.

.

81

DISCUSSÃO

82

6. DISCUSSÃO

Os resultados encontrados de redução na pressão arterial demonstram

que o 6-gingerol possui excelente ação hipotensora, o que está de acordo com as

observações da medicina tradicional onde há muitos anos o gengibre é utilizado

para o tratamento de doenças cardiovasculares. É conhecido por ter um potencial

diurético na medicina oriental e ser capaz de reduzir a pressão arterial sanguínea,

sendo prescrito, na medicina paquistanesa, à pacientes hipertensos para utilização

após o jantar (GHAYUR et al, 2005; MILLER et al, 2000).

O gengibre também é recomendado pelos curandeiros no Sul da Ásia

para o uso em cardiopatias, hipertensão e para melhorar a circulação, devido ao seu

potencial de inibir a agregação plaquetária (KAPOOR, 1990; DUKE, 2002).

Segundo dados da Organização Mundial de Saúde (OMS, 2011), indicam

que a há cerca de 600 milhões de hipertensos no mundo e que a doença atinge, em

média, 25% da população brasileira, chegando a mais de 50% da população

brasileira e, supreerdentemente, a 5% dos 70 milhões de crianças e adolescentes do

Brasil.

A elevação prolongada da pressão arterial lesiona os vasos sanguíneos

por todo o corpo, principalmente em órgãos-alvo, como o coração, rins, cérebro e

olhos, além de provocar espessamento e perda de elasticidade das paredes arteriais

e aumento da resistência vascular periférica nos vasos acometidos. As

conseqüências usuais da hipertensão descontrolada prolongada são o infarto do

miocárdio, insuficiência cardíaca e renal, acidentes vasculares cerebrais e visão

prejudicada. O ventrículo esquerdo do coração pode ficar aumentado (hipertrofia

ventricular esquerda), à medida que age para bombear o sangue contra a pressão

elevada (POTTER e PERRY, 2001; SMELTZER e BARE, 2006).

Na hipertensão arterial, o rim exibe um comportamento ambivalente,

podendo ao mesmo tempo ser a causa da hipertensão ou sofrer seus efeitos lesivos,

o que contribui, à medida que a lesão evolui. Por outro lado, além de sua função

excretora, o rim exerce importantes funções hormonais capazes de influenciar o

sistema cardiovascular como um todo, bem como é importante determinante do

83

comportamento farmacológico dos medicamentos, modificando sua absorção,

distribuição, concentração e meia-vida plasmática (CARVALHO e ALMEIDA, 2001).

Especula-se que as drogas empregadas para o tratamento anti-

hipertensivo não protegem o rim, ou que o tratamento deveria ser instituído mais

precocemente para melhoria da morbidade (MULINARI, 2000).

Estudos com ratos wistar mostraram a utilização do extrato de gengibre

aceleram a taxa a taxa de bombeamento do cálcio, aumentando sua concentração

intracelular, sem interferir no seu efluxo, através da ativação da bomba Ca+2-ATPase

do retículo sarcoplasmático e que o gengibre possui efeito sinérgico em pacientes

que fizeram a combinação de 1g do rizoma com 10mg de nifedipina, por dia

(YOUNG et al., 2006, KOBAYSHI et al, 1988; IWASAKI et al, 2006).

Muhammad et al., (2005) demonstraram que o extrato de gengibre é

capaz de inibir canais de cálcio e que o extrato seco não possuía nenhuma ação

sobre a frequência cardíaca e pressão arterial em ratos wistar normotensos.

Entretanto, alguns estudos realizados com o extrato do gengibre

explorando o potencial anti-hipertensivo mostram resultados controversos, como

vasodilatação inicial e posterior vasoconstrição em modelos de anel de aorta

(IWASAKI et al. 1988; KOBAYSHI et al. 2006).

Ghayur e Gilani,(2005) demonstraram que o extrato fenólico apresenta

efeito hipotensor em ratos anestesiados através de bloqueio de canais de cálcio,

além de possuir um componente colinérgico adicional. Vale salientar que essas

atividades dependem do sistema de extração utilizados, pois o componente

colinérgico está inserido na fase aquosa do extrato, enquanto o componente

bloqueador dos canais de cálcio é mais potente na fração não polar (GILANI et al,

2005).

Alguns estudos relatam que o 6-gingerol tem uma resposta inibitória sobre

contrações espontâneas em modelos que utilizam veias porta de camundongos

(Kimura et al.,1988). Outra observação importante é que a hipotensão em modelo

de aorta é depende do endotélio e que o 6-gingerol possui um componente

bloqueador de canais de cálcio (GHAYUR e GILANI, 2005).

84

Como foi visto o endotélio é importante na ação do 6-gingerol e estudos

demonstram que os receptores do tipo TRPV1 ao TRPV4 estão sendo relatados na

aorta e artéria pulmonar de ratos (INOUE et al., 2006). Isso nos traz mais uma via a

ser estudada em modelos de pressão arterial, pois o 6-gingerol é um potente

ativador desses receptores.

Os estudos em modelos animais que avaliam a pressão arterial trazem

grande ajuda na elucidação do mecanismo de ação do 6-gingerol, mas por ser um

componente que possui muitas atividades e potencial de ativar inúmeros receptores,

mais estudos têm de ser realizados para finalmente buscar um mecanismo principal

e seus auxi liares em sua ação hipotensora.

A descoberta de que os gingerols são potentes ativadores dos receptores

do tipo TRPV 1 serve como parâmetro de explicação para o uso do gengibre em

diversas doenças e inclusive em casos de hipertensão na medicina oriental.

(BLUMENTHAL e WERNER, 1998; SRIVASTAVA e MUSTAFA, 1992).

O principal ativador deste receptor, a capsaicina, possui excelente

afinidade, mas sua utilização na medicina é limitada, pois sua pungência e

neurotoxicidade são elevados (WOOD, 1993).

Um resultado importante no nosso estudo foi que o 6-gingerol não possui

efeito citotóxico nas células MDCK, nas doses utilizadas no experimento de perfusão

renal, em períodos de incubação de 6 (seis) horas e 24 (vinte e quatro) horas,

demonstrando que essa substância poderia ser uti lizada com segurança nos

experimentos de perfusão renal.

Sabe-se que o 6-gingerol exerce efeito inibitório sobre a síntese de DNA

de células cancerosas e causam apoptose em células de leucemia promielocítica da

linhagem humana (LEE, et al 1998).

Chen e colaboradores (2006) utilizaram células MDCK com 6-gingerol nas

doses de 5 µM a 20 µM para testar a influência dessa substância nestas células

tubulares, que possuem muitas semelhanças com as células humanas, e

demonstraram que as concentrações utilizadas de 6-gingerol induziram o aumento

intenso do influxo de cálcio nestas células.

85

Entretanto o trabalho supracitado não traz nenhum dado de biologia

molecular sobre os receptores envolvidos nesta ação e nenhum ensaio de

viabilidade sobre tais células.

Silva e colaboradores (2012) utilizaram alguns gingerols, dentre eles o 6-

gingerol, inibiu a proliferação de células da linhagem 231-MDA-MB com IC50 666.2 ±

134.6 µM. Outro dado encontro foi a inibição de fibroblastos humanos normais,

porém em concentrações maiores que 500 µM.

Estes resultados são um pouco diferentes dos encontrados pelo nosso

grupo, onde foi visto uma diminuição da viabilidade das células em concentrações

menores que 500 µM. No entanto, vale ressaltar que as células são de linhagens

diferentes e possuem suas particularidades.

Na experimentação em rim isolado de rato, a análise da urina, do

perfusato, dos parâmetros funcionais é útil para estabelecer um perfil razoável dos

efeitos funcionais e morfológicos de uma substância sobre o rim. Com as

informações obtidas dessas análises, pode-se estabelecer uma hipótese de

mecanismo de ação da substância estudada.

Os resultados encontrados demonstraram que o 6-gingerol possui várias

ações renais e uma potente ação diurética, confirmando algumas ações descritas

pela medicina oriental.

Com os resultados vasculares obtidos com a realização deste estudo

pode-se observar um aumento na pressão de perfusão aos 90 e 120 minutos na

dose de 3µM quando comparada ao grupo controle interno e com as outras doses

utilizadas 10 µM e 30 µM houve aumento significativo em todos os tempos

estudados, acompanhado do aumento significativo da resistência vascular renal nos

tempos de 90 e 120 minutos quando comparados com o controle interno na dose de

10 µM.

Esses dados são conflitantes quando comparados com os resultados

observados na pressão arterial de animais anestesiados que mostraram uma

redução da resistência vascular. Isso pode ser explicado, em parte, pela

86

complexidade do sistema renal que é controlado por milhares de vias de sinalização

endócrina.

Estudo recente demonstrou que a capsaicina, análogo do 6-gingerol e

agonista específico do receptor TRPV1, causou uma redução da pressão de

perfusão e aumento da taxa de fi ltração glomerular quando o rim era pré-contraído

com fenilefrina e que este mecanismo era pela liberação de substância P e

calcitonina por nervos sensoriais sensíveis a capsaicina (Li e Wang, 2008).

Entretanto, vale ressaltar que o 6-gingerol é ativador inespecífico deste

receptor e que quando foi realizado o antagonismo com capsazepina, antagonista

inespecífico do receptor TRPV1, não houve grande alteração na resposta inicial.

Baylie e Brayden (2011) relataram que a ativação do TRPV2 causa

aumento de uma corrente de cálcio em miócitos de aorta de rato e que isso poderia

proporcionar uma vasoconstrição, mas sua identificação em células renais ainda é

controversa.

Outros estudos realizados por Liu et al, 2001;. Sawynok e Liu, 2003,

mostraram que a ativação do TRPV1 na medula espinhal e na periferia promove a

liberação aumentada de adenosina, indicando que essa liberação também pode ser

promovida a nível renal, entretanto os dados na literatura ainda são insuficientes.

Vale ressaltar que estudos demonstram que a adenosina liberada poderia

participar de uma via de feedback do receptor TRPV1 (PUNTAMBEKAR et al.,

2004).

Adenosina atua na hemodinâmica de órgãos como rins, cérebro e

coração. Além disso, evidências obtidas nos anos 60 sugerem que a vasculatura

renal difere dos demais leitos vasculares e ação da adenosina no rim seria

potencialmente vasoconstrictor (HANSEM e SCHNERMANN, 2003).

Em relação ao fluxo urinário nossos resultados mostraram aumento

significativo nos tempos de 90 e 120 minutos quando comparados com o controle

interno, nas doses de 10 µM e 30 µM e que com o bloqueio do receptor TRPV1

houve uma redução significativa deste fluxo urinário no tempo de 120 minutos

quando comprado com o 6-gingerol no mesmo período de tempo. Confirmando o

87

conhecimento tradicional do efeito diurético do gengibre e mostrando que o bloqueio

do receptor TRPV1 pela capsazepina traz uma redução deste aumento de fluxo

urinário causado pelo 6-gingerol, mostrando sua importante participação neste

mecanismo.

O 6-gingerol também alterou o transporte tubular de sódio, potássio e

cloro. O transporte tubular de sódio foi reduzido de forma significativa em todas as

doses 3 µM, 10 µM e 30 µM utilizadas e em todos os tempos estudados quando

comparados com o controle e que esta redução do transporte de sódio foi atenuada

no tempo de 120minutos no grupo do bloqueio com capsazepina.

O transporte tubular de potássio sofreu alteração da mesma forma que o

transporte de sódio em todos os tempos estudados no grupo com 6-gingerol e

seguindo os resultados encontrados com o sódio e o potássio, os íons de cloro

também sofreram redução de transporte, demonstrando que o 6-gingerol aumentou

a excreção de todos os eletrólitos. Isso ratifica ainda mais sua ação diurética.

Lembrando que no grupo do bloqueio com a capsazepina, nos dois últimos

parâmetros citados ocorreu uma atenuação da redução do transporte desses dois

eletrólitos. Isso reforça a hipótese que o 6-gingerol está exercendo sua ação

diurética através da ativação do receptor TRPV1.

Zhu e colaboradores (2008) demonstraram que a ativação do receptor

TRPV1 na pelve renal leva a um aumento da natriurese e da diurese, indicando que

a ativação deste receptor que é expresso em nervos sensoriais renais, desempenha

um papel importante na modulação excretória a nível renal.

Em 2008, Jianping e Donna mostraram que a ativação do receptor TRPV1

no rim isolado pela capsaicina, agonista específico, causou um aumento do fluxo

urinário, consonantes com nossos dados, e elevação do ritmo de filtração glomerular

(RFG).

Este último parâmetro citado foi conflitante com os dados encontrados

pelo nosso grupo no estudo com o 6-gingerol que demonstrou uma redução

importante do RFG em todas as doses utilizadas. Entretanto, vale ressaltar que o 6-

gingerol é agonista inespecífico e isso pode influenciar em suas ações vasculares.

88

Wang e Zhu (2008) demonstraram que a ativação do TRPV1 aumenta a

excreção de água devido a um aumento da taxa de filtração glomerular e uma maior

entrega distal de sódio e não por supressão de reabsorção proximal, sendo que este

mecanismo ainda não é totalmente elucidado.

Essa entrega aumentada de sódio a nível distal pode explicar, em parte, a

redução de ritmo de filtração glomerular através da ativação do sistema de feedback

túbulo glomerular. Esse mecanismo de defesa é ativado em situações onde o aporte

de sódio está elevado na porção final do túbulo contorcido distal, mais

especificamente na mácula densa. O sinal liberado é a adenosina que através de

sua ação nos receptores A1 na arteríola aferente causa vasoconstrição de início

rápido e conseqüente redução do ritmo de filtração glomerular e diminuição na perca

de sódio e água pelos rins (OSSWALD et al., 1980).

A adenosina reduz o fluxo sanguíneo renal predominantemente do córtex

externo e ocasiona uma diminuição persistente na taxa de filtração glomerular

(VANDER et al., 1970).

Gutierrez e colaboradores (1999) demonstraram que a vasoconstrição

arteriolar aferente é acompanhado por um aumento sustentado do cálcio livre

citosólico.

Bloqueadores específicos A1 específicos demonstram inibir respostas de

queda no ritmo de filtração glomerular quando administrados diretamente no lúmem

tubular ou em capilares peritubulares (SCHNEMANN et al., 1990).

Portanto, mais estudos tem de ser realizados para elucidar e verificar a

participação destes mecanismos acessórios nas respostas induzidas pelo 6-gingerol.

89

CONCLUSÃO

90

7. CONCLUSÃO

O 6-gingerol mostrou potente ação diurética em todos os experimentos

realizados e uma importante redução da pressão arterial em ratos wistar

normotensos.

Outras importantes observações foram às baixas influências em células

renais, demonstrando sua segurança na utilização na medicina popular .

Contudo, mais estudos são necessários para a melhor elucidação dos

mecanismos envolvidos com a ação diurética, como estudo com outras doses,

modelos animais e estudos de modelagem molecular, serão necessários para

esclarecer o mecanismo de ação.

91

REFERÊNCIAS

92

8. REFERÊNCIAS

AGUIAR, A.P.S.; CAIRES, L.P.; MAEKAWA, L.E. et al. Avaliação in vitro da ação do

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