estudo de caracterização e associação de marcadores moleculares relacionados à leptina para...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE ZOOTECNIA E ENGENHARIA DE ALIMENTOS

ROULBER CARVALHO GOMES DA SILVA

Estudo de caracterização e associação de marcadores moleculares relacionados à leptina para características

de crescimento e precocidade de acabamento em bovinos da raça Nelore

Pirassununga – SP

2008

ROULBER CARVALHO GOMES DA SILVA

Estudo de caracterização e associação de marcadores moleculares relacionados à leptina para características de crescimento e precocidade de acabamento em bovinos da

raça Nelore

Dissertação apresentada à Faculdade de Zootecnia e

Engenharia de Alimentos da Universidade de São

Paulo, como parte dos requisitos para a obtenção do

Título de Mestre em Zootecnia.

Área de Concentração: Qualidade e Produtividade Animal Orientador: Prof. Dr. José Bento Sterman Ferraz

Pirassununga – SP

2008

2

AGRADECIMENTOS

A Deus por abençoar minha família, meu caminho e minhas escolhas.

Aos meus Pais e meus irmãos, pelo apoio, amor e confiança que depositaram em mim, em momentos complicados de minha vida.

À minha namorada Patricia, que mesmo estando longe, me apoiou em todos os

momentos críticos do trabalho.

À Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos - FZEA, pela realização do Mestrado.

Ao professor orientador, Dr. José Bento Sterman Ferraz, pela orientação e pelo

enorme aprendizado pessoal e científico neste tempo de convivência.

Ao professor, Dr. Júlio Balieiro, pela amizade, paciência, disponibilidade e

conhecimentos transmitidos durante todo o tempo de mestrado.

Ao professor, Dr. Joanir P. Eler, pela amizade e conhecimentos transmitidos.

Aos amigos do Grupo de Melhoramento Animal - GMA pela convivência, amizade

e aprendizado em todos os aspectos

Aos amigos da República Pantanera pelo prazeroso convívio durante todo o tempo em que estive naquele lar.

Aos amigos Diego Cucco e Luís Fernando pela disponibilidade em ajudar sempre

durante a realização desse trabalho.

À MERIAL/IGENITY, em especial, aos amigos Dr. Henry Berger e Dr. Edson Bordin pela amizade e confiança.

À Agro-pecuária CFM e à Fazenda Mundo Novo pela cessão dos dados dos

animais possibilitando a realização desse trabalho.

À Fundação de Pesquisas Cientificas de Ribeirão Preto – FUNPEC - RP, pelo

apoio financeiro.

A todos que de uma forma ou de outra colaboraram para a realização

deste trabalho, muito obrigado.

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RESUMO

SILVA, R. C. G. Estudo de caracterização e associação de marcadores moleculares relacionados à leptina para características de crescimento e precocidade de acabamento em bovinos da raça Nelore. 2008. 71f. Dissertação

(Mestrado) – Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de

São Paulo, Pirassununga, 2008.

Tendo em vista a possibilidade da utilização de marcadores moleculares

relacionados à leptina em programas de melhoramento genético no Brasil, com o

objetivo de auxiliar a seleção de bovinos da raça Nelore para características de

importância econômica e, particularmente, para aquelas relacionadas ao

crescimento e precocidade de acabamento, a proposta do presente trabalho foi

caracterizar as freqüências gênicas e genotípicas de alguns polimorfismos e estudar

seus efeitos nas características de precocidade de acabamento e crescimento em

bovinos da raça Nelore. Foram avaliadas as associações dos marcadores

moleculares com medidas de ultra-som de área de olho de lombo (AOL), espessura

de gordura subcutânea (EGS), espessura de gordura da picanha (EGP), peso à

desmama (PD), peso ao sobreano (PS), ganho de peso da desmama ao sobreano

(GPS) e circunferência escrotal ao sobreano (CE). Para a caracterização dos

marcadores na população Nelore foram avaliadas as freqüências genotípicas e

gênicas, testes de equilíbrio de Hardy-Weinberg, heterozigoses, diversidades

alélicas e conteúdos de informação polimórfica. A análise dos efeitos dos diferentes

genótipos dos marcadores moleculares foi realizada através da análise de variância,

desvios de dominância, efeitos aditivos e efeitos médios de substituição. As

freqüências genotípicas e gênicas demonstraram que alguns alelos de

determinados marcadores moleculares se encontram em baixa freqüência na

população, porém apresentam os mesmos polimorfismos já relatados em bovinos

de raças européias. Os marcadores A1457G, C963T e UASMS1 apresentaram

associação significativa com características avaliadas por ultra-som. Os marcadores

4

E2JW, A59V e T945M apresentaram associação significativa com características de

crescimento. O marcador E2FB apresentou associações significativas apenas pela

análise de efeito médio de substituição. Estes achados reforçam o potencial de

utilização dos marcadores moleculares ligados a leptina na melhoria das

características economicamente importantes em animais da raça Nelore. A seleção

assistida por marcadores de animais portadores de alelos favoráveis pode impactar

positivamente na cadeia produtiva de bovinos de corte em todos os seus

segmentos.

Palavras-chave: Bos indicus, gado de corte, polimorfismos, snp, ultra-som

5

ABSTRACT

SILVA, R. C. G. Characterization and association of molecular markers linked to leptin with growth and finishing traits in Nelore cattle. 2008. 71f. Dissertation

– Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo,

Pirassununga, 2008.

Considering the possibility of utilization of molecular markers linked to leptin in

animal breeding programs from Brazil and aiming to aid in the selection of Nellore

cattle to economic traits and particularly, for those related to growth and finishing

traits, the purpose of this research was to characterize the allelic and genotypic

frequencies and associate with growth and finishing in Nellore cattle. There were

evaluated the associations of the molecular markers on the ultrasound Longissimus

muscle area (AOL), ultrasound backfat thickness (EGS), ultrasound fat thickness in

Biceps femoris muscle, weaning weight (PD), yearling weight (PS), weight gain from

weaning to yearling (GPS) and yearling scrotal circumference (CE). The

characterization of the molecular markers in Nellore cattle was evaluated through of

the allelic and genotypic frequencies, Hardy-Weinberg equilibrium tests,

heterozigosity, allelic diversity and polymorphism information content. The different

genotype effects of the molecular markers were evaluated through ANOVA,

dominance deviation, additive and substitution effect. The allelic and genotype

frequencies shown some alleles of the molecular markers were low frequencies in

Nellore cattle. However there were identified the same polymorphisms described in

taurine cattle. Markers A1457G, C963T and UASMS1 demonstrated significant

association with ultrasound measurement traits. The E2JW, A59V and T945M

markers showed significant association with growth traits. The E2FB marker showed

significant effects when it was evaluated for substitution effect. These findings

emphasize the potential utilization of molecular markers linked to leptin in the

improvement of economic traits in the Nellore cattle. The improvement this traits

through marker assisted selection of carrier animals of desirable alleles might

positively aid the whole beef cattle productive chain.

6

Keywords: Bos indicus, beef cattle, polymorphisms, snp, ultrasound

7

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................................... 8

2. REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................................................ 10

2.1. A importância da raça Nelore para a pecuária de corte brasileira......................................... 10 2.2. Seleção Assistida por Marcadores (SAM) ............................................................................. 11 2.3. Leptina.................................................................................................................................... 13 2.4. Polimorfismos relacionados à produção de leptina................................................................ 15 2.5. Polimorfismos presentes nos exons do gene da leptina........................................................ 16 2.6. Polimorfismos presentes na região promotora do gene da leptina........................................ 18 2.7. Polimorfismos presentes no gene do receptor da leptina...................................................... 21 2.8. Ultra-sonografia na avaliação de precocidade de acabamento e crescimento em

bovinos de corte ............................................................................................................................ 21 2.9. Características de crescimento ou desenvolvimento ponderal.............................................. 23

3. HIPÓTESES...................................................................................................................................... 25

4. OBJETIVOS...................................................................................................................................... 26

5. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................................. 27

5.1. Animais avaliados .................................................................................................................. 27 5.2. Coleta de amostras de sangue, extração de DNA, caracterização e

determinação dos genótipos para os marcadores SNP avaliados ............................................... 27 5.3. Metodologia de coleta dos dados de ultra-som ..................................................................... 30 5.4. Avaliação das características de desenvolvimento ponderal ................................................ 32 5.5. Metodologia de análise dos resultados.................................................................................. 32 5.6. Determinação das freqüências genotípicas, gênicas e estimação da

variabilidade genética da população............................................................................................. 33 5.7. Efeito dos marcadores SNP sobre as características precocidade e de

desenvolvimento ponderal ............................................................................................................ 34 6. RESULTADOS.................................................................................................................................. 37

6.1. Freqüências genotípicas, gênicas e estimação da variabilidade genética da

população ...................................................................................................................................... 37 6.2. Análise de efeitos dos marcadores nas características avaliadas......................................... 40

7. DISCUSSÃO ..................................................................................................................................... 51

7.1. Freqüências genotípicas, gênicas e estimação da variabilidade genética da

população ...................................................................................................................................... 51 7.2. Análise de efeitos dos marcadores nas características avaliadas......................................... 55

8. CONCLUSÕES ................................................................................................................................. 60

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................................ 62

8

1. INTRODUÇÃO

A pecuária de corte nacional, devido a sua adequação às exigências de

qualidade determinadas pelo mercado, vem se tornando cada vez mais

especializada em virtude da abertura de novos mercados consumidores que exigem

carne de alta qualidade. Existe também a preocupação com o aumento da

produtividade dos animais, visando sempre diminuir os custos produtivos da

produção da carne.

Embora o Brasil tenha o maior rebanho comercial bovino do mundo, com

cerca 200 milhões de cabeças (ANUALPEC, 2007), e seja o maior exportador

mundial de carne, com cerca de 1.384.708 toneladas de carne de janeiro a outubro

de 2007 (ABIEC, 2007), esses aspectos colocam toda a cadeia produtiva da carne, e

principalmente o pecuarista, frente a grandes desafios. Para que possamos nos

tornar mais competitivos internacionalmente, torna-se indispensável o

desenvolvimento e a implantação de tecnologias que possam auxiliar a melhoria da

qualidade e eficiência da produção de carne.

Na busca do aumento de produtividade é indispensável o uso do

melhoramento genético na pecuária de corte. Em programas de melhoramento

genético de qualquer espécie é fundamental realizar a seleção genética de

indivíduos geneticamente superiores para as características de interesse.

O objetivo da seleção pelo mérito genético é escolher indivíduos

geneticamente superiores que se tornarão os pais da próxima geração, promovendo

assim alterações nas freqüências dos genes de interesse e o conseqüente

melhoramento genético de determinada característica de importância econômica

numa dada população. Atualmente, existem diversas ferramentas para auxiliar a

seleção genética em um rebanho, entre elas, a seleção assistida por marcadores

moleculares (SAM). Essa ferramenta tem por objetivo aumentar a acurácia da

seleção, principalmente para as características com expressão fenotípica tardia,

como por exemplo, a deposição de gordura subcutânea.

A leptina é um hormônio produzido principalmente pelos adipócitos. Esse

hormônio está relacionado à regulação do apetite, balanço energético, crescimento,

deposição de gordura, características de carcaça e características reprodutivas em

9

diversas espécies, inclusive em bovinos (CLARKE; HENRY, 1999; HOUSEKNECHT

et al, 1998; MÁCAJOVÁ; LAMOSOVA; ZEMAN, 2004; NEGRÃO; LICINIO, 2000).

Alguns estudos indicaram a associação de marcadores moleculares à produção da

leptina e às características de precocidade de acabamento e crescimento,

principalmente, em bovinos de raças européias, mantidos em sistema de

confinamento (BUCHANAN et al, 2002; FITZSIMMONS et al, 1998; NKRUMAH et al,

2004; NKRUMAH et al, 2005).

Considerando que a grande maioria do rebanho brasileiro é constituído de

bovinos de genótipo Bos indicus, principalmente, da raça Nelore e seus cruzamentos

e a possibilidade de utilização de alguns marcadores relacionados ao gene da

leptina em programas de melhoramento genético no Brasil, visando auxiliar a

seleção de bovinos da raça Nelore para características de importância econômica, a

proposta do presente trabalho foi caracterizar as freqüências gênicas e genotípicas

dos polimorfismos e relacionar suas freqüências às características de precocidade

de acabamento e crescimento em bovinos da raça Nelore, sob a hipótese de que

marcadores moleculares ligados à leptina e descritos na espécie Bos taurus possam

influenciar características de crescimento e precocidade de acabamento em bovinos

da raça Nelore.

10

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. A importância da raça Nelore para a pecuária de corte brasileira

Os primeiros exemplares de gado zebuíno foram trazidos ao Brasil pelos

portugueses nos séculos XVIII e XIX de colônias portuguesas da África e da Índia,

uma vez que o Brasil era domínio político, comercial e administrativo dos mesmos

(PARDI et al, 1996). Entre 1890 e 1921, mais de 5.000 animais zebuínos originários

da Índia foram trazidos para o Brasil, sendo que o primeiro registro de animais da

raça Nelore no Brasil foi em 1868 (SANTIAGO, 1985). Porém, segundo Santos

(1995), a importação de animais provindos da Índia realizada em 1930, por Manoel

Oliveira Prata e Francisco Ravísio Lemos, foi de importância fundamental para o

desenvolvimento da raça no Brasil. Nessa importação chegaram animais que

tiveram influência decisiva na formação dos plantéis nacionais, como Marajá – um

dos pilares da raça Nelore e Rajá – que juntamente com Sheik consolidaram o

padrão racial do Nelore no Brasil. De acordo com Lima (1989), a raça Nelore

multiplicou-se com uma velocidade espantosa a partir dos núcleos que se formaram

logo após as importações da Índia. Essa expansão foi uma conseqüência dos

elevados índices de desempenhos reprodutivos e produtivos alcançados pelo Nelore

em climas tropicais (OLIVEIRA; MAGNABOSCO; BORGES, 2002).

Atualmente, o Brasil possui o maior rebanho comercial bovino do mundo, com

cerca 200 milhões de cabeças (ANUALPEC, 2007). Segundo Josahkian (2000),

estima-se que desse total, mais de 80% seja constituído de bovinos com genótipo

Bos indicus, sendo que grande parte dessa contribuição é da raça Nelore.

A raça Nelore representa a grande maioria dos bovinos nacionais, isso se deve

à fertilidade, rusticidade e adaptação (SANTIAGO, 1987). O Nelore é a raça com

maior número de criadores no Brasil e corresponde por quase 80% do rebanho

zebuíno brasileiro (OLIVEIRA; MAGNABOSCO; BORGES, 2002; SANTOS, 1998).

11

O Nelore é a raça de maior importância no sistema de produção de carne

brasileiro devido às suas características como adaptabilidade ao ambiente tropical,

resistência aos parasitas, rusticidade e produtividade.

2.2. Seleção Assistida por Marcadores (SAM)

A seleção de indivíduos manifestando fenótipos específicos, que os diferem

de seus contemporâneos, tem despertado o interesse do homem desde a

domesticação das primeiras espécies. A essência dos programas de seleção animal

tem sido a mesma até os dias atuais, consistindo basicamente em observar

populações, identificar indivíduos de melhor expressão de características

importantes, acasalamento de indivíduos excelentes e aumento das freqüências dos

alelos favoráveis desses genes no rebanho (OLIVEIRA; HENKES, 2002).

No moderno sistema produtivo de carne bovina, identifica-se a importância

cada vez maior de produção eficiente, caracterizada pelo encurtamento do ciclo de

produção e por produtos de melhor qualidade, obtidos pelo uso de animais

geneticamente superiores em condições ambientais adequadas (BONILHA, 2003).

Segundo Euclides Filho (1999), a seleção é a escolha dos melhores

indivíduos avaliados, os quais serão os responsáveis pela produção da próxima

geração. É o processo decisório que indica quais animais de uma geração se

tornarão pais da próxima geração.

De acordo com van der Werf (2006), embora a idéia de seleção genética seja

aumentar a proporção de genes favoráveis na população, esses genes não são de

fato observados nos métodos clássicos de avaliação genética. A seleção clássica

quantitativa é baseada no efeito final de todos os genes em conjunto, sendo

observado o desempenho fenotípico da característica.

Atualmente, existe a seleção assistida por marcadores moleculares (SAM)

que visa aumentar a acurácia na avaliação e seleção dos animais (PAZ et al, 2004).

A seleção assistida por marcadores está relacionada com a idéia da possível

existência de genes com efeitos significativos sobre a expressão de determinadas

características e que podem ser explorados no processo de seleção (VAN DER

12

WERF, 2006). Bourdon (2000) define SAM como a seleção de animais portadores

de alelos específicos usando marcadores moleculares que estão ligados ou

próximos suficientemente de QTL (Quantitative Trait Loci) de interesse que possam

ser usados para identificar alelos desejáveis nesse loci. Segundo Meuwissen (2003),

os maiores benefícios da SAM são esperados em características em que a

mensuração do fenótipo a ser selecionado ocorre após a época de seleção, tais

como características reprodutivas, produção de leite ou características de difícil

avaliação, como precocidade de acabamento de carcaça. Se a acurácia de predição

dos efeitos dos marcadores é alta, os mesmos podem ser usados para seleção de

animais antes da avaliação do fenótipo (MEUWISSEN; GODDARD, 1996).

Davis, D’Occhio e Hetzel (1997) afirmam que a seleção assistida por

marcadores moleculares fornece informações para a rápida introgressão do gene

e/ou a seleção da característica levando a rápida geração de progênies de pais com

alto padrão genético, sendo eficiente para seleção entre e dentro de famílias,

linhagens ou raças. Segundo Dekkers e Hospital (2002), estes avanços têm

permitido a oportunidade de melhorar os programas de melhoramento genético nos

rebanhos pela seleção direta de genes ou regiões ligadas às características de

interesse econômico através da SAM e da introgressão desses genes na população.

A integração de novas tecnologias genéticas e reprodutivas (ex: SAM e

produção de embriões) resultariam em significativos aumentos nas taxas de ganhos

genéticos quando utilizada com os métodos de avaliações genéticas convencionais

(DAVIS; D’OCCHIO; HETZEL, 1997).

O uso dos marcadores moleculares pode evitar os empecilhos da avaliação

de características de composição de carcaça e qualidade da carne, fornecendo

informações suficientemente corretas para analisar as características de interesse

nos animais (MORRIS et al, 2001). Jeon et al. (2006) descreveram a utilização da

SAM em bovinos de corte e suínos do Instituto Nacional de Pesquisa Agropecuária

(National Livestock Research Institute) e Universidade Nacional de Gyeonsang na

Coréia do Sul. Eles relataram que apesar da implantação da SAM ter sido recente e

as conclusões do uso ainda serem limitadas, há expectativa de que a SAM contribua

maximizando o melhoramento de características economicamente importantes,

principalmente aquelas com baixa herdabilidade e que apresentam dificuldade de

13

mensuração. Gao et al. (2007) ressaltam que a SAM deve ser uma importante

ferramenta para auxiliar as técnicas de seleção tradicionais e não para substituí-las.

2.3. Leptina

A leptina é um hormônio protéico de 162 aminoácidos com peso de 16 kDa

produzida pelo gene ob ou gene da leptina. Essa proteína é produzida

principalmente pelos adipócitos e a sua descoberta se deu devido às investigações

realizadas em camundongos, utilizados como modelos experimentais de obesidade,

numa série de estudos de parabiose entre duas linhagens de camundongos, porém

a leptina ainda era chamada de fator ob (COLEMAN, 1973; COLEMAN; HUMMEL,

1973). Zhang et al. (1994) relataram a clonagem do gene deste fator, denominado

de proteína ob ou leptina (do grego leptos que significa magro).

Diversos estudos demonstraram homologia entre o gene da leptina de

diversas espécies. O gene da leptina humana tem 84% de homologia quando

comparado com o gene da leptina de camundongos e 83% de homologia quando

comparado ao de ratos. Bovinos e suínos apresentam 85% de homologia quando

comparados ao gene da leptina humano (DOYON et al, 2001; ZHANG et al, 1994).

O tecido adiposo branco é responsável pela maior parte da leptina produzida

pelo organismo, sendo sintetizada em menores quantidades no tecido adiposo

marrom e em outros tecidos do trato gastrointestinal, músculo esquelético, placenta,

epitélio das glândulas mamárias, hipófise e cérebro (BADO et al, 1998; CASABIELL

et al, 1997; CINTI et al, 1997; MASUZAKI; OGAWA; SAGAWA, 1997; MORASH;

JOHNSTONE; LEOPOLD, 2000; WANG et al, 1998). Conforme os adipócitos

aumentam em massa, as concentrações periféricas de leptina aumentam (AHIMA;

FLIER, 2000; CONSIDINE; CARO, 1997). Segundo Auwerx e Staels (1998), o

aumento ocorre porque o tamanho do adipócito influencia a síntese e a secreção da

leptina, pois os maiores adipócitos contém mais RNA mensageiro (mRNA).

A síntese da leptina é estimulada pela obesidade, insulina, glicocorticóides,

processos infecciosos, endotoxinas, citocinas, glicose e estrogénos (GRUNFELD et

al, 1996; SALADIN et al, 1995; SLIEKER et al, 1996; WANG et al, 1998). A síntese

14

de leptina é inibida pelo jejum, frio, atividades físicas, testosterona, hormônios da

tireóide e agonistas β-adrenérgicos (CASTRACANE et al, 1998; ESCOBAR-

MORREALE et al, 1997; LI ;MATHENY; SCARPACE, 1997).

Diversos estudos têm relacionado a leptina à regulação do apetite, balanço

energético, crescimento, deposição de gordura, características de carcaça e

características reprodutivas em diversas espécies, inclusive em bovinos (CLARKE;

HENRY, 1999; HOUSEKNECHT et al, 1998; MÁCAJOVÁ; LAMOSOVA; ZEMAN,

2004; NEGRÃO; LICINIO, 2000).

Dentro do sistema nervoso central, o hipotálamo é o principal sitio de ação da

leptina, controlando a ingestão de alimentos e o metabolismo energético. Diversos

estudos avaliaram a presença de mRNA do receptor da leptina no hipotálamo de

diversas espécies incluindo humanos (CONSIDINE et al, 1996), roedores (BROGAN;

GROVE; SMITH, 2000; GARCIA et al, 2000; SEEBER; SMITH; WADDELL, 2002) e

ruminantes (DYER et al, 1997; REN et al, 2002). Os efeitos da leptina foram

observados em ruminantes pela administração de leptina recombinante humana em

ovelhas durante três dias, causando diminuição de aproximadamente 1/3 da

ingestão normal de matéria seca (HENRY et al, 1999). No entanto, esses efeitos não

foram observados em ovelhas subnutridas (HENRY et al, 2001).

Diversos estudos encontraram correlação positiva entre concentração

plasmática de leptina e porcentagem de tecido adiposo corporal, crescimento e

lactação em ruminantes (BLACHE et al, 2000; CHILLIARD; BOCQUIER, 2000).

Correlações positivas significantes entre concentrações plasmáticas de leptina e

porcentagem de tecido adiposo corporal foram descritas em ovinos (DELAVAUD et

al, 2000) e no crescimento de bovinos (EHRHARDT et al, 2000). Yamada, Kawakami

e Nakanishi (2003) estudaram a correlação entre as concentrações plasmáticas de

leptina e deposição de gordura em cruzamentos F1 de Japanese Black Cattle X

Holandês criados em confinamento. Eles verificaram que existem correlações

significantes entre níveis plasmáticos de leptina e características de carcaça

relacionadas com deposição de gordura (marmoreio, porcentagem de gordura). Um

estudo de Geary et. al. (2003), com cruzamentos de gado europeu criado em

confinamento, concluiu que altas concentrações de leptina sérica é um forte

indicativo de grande deposição de gordura em gado confinado, no entanto, existe

15

uma correlação negativa entre área do músculo Longissimus dorsi (Área de olho de

lombo) e concentrações plasmáticas de leptina.

2.4. Polimorfismos relacionados à produção de leptina

Segundo Clarke e Henry (1999), desde que a leptina foi identificada como um

fator de controle do apetite e relacionada aos níveis de gordura corporal, um volume

substancial de trabalhos tem apresentado seu papel na regulação do apetite e em

várias outras funções, e inclusive aumentaram as pesquisas na área de biologia

molecular na tentativa de descobrir polimorfismos relacionados à produção da

leptina.

O gene da leptina está localizado no cromossomo 4 de bovinos sendo

constituído por três exons separados por dois introns, dos quais o exon 1 não é

transcrito para sintetizar a leptina (STONE; KAPPES, 1996; ZHANG et al, 1994).

Para entender a regulação da transcrição do gene da leptina, a região promotora foi

isolada e caracterizada. Importantes domínios de ligação de fatores de transcrição

foram identificados na região promotora de humanos, roedores e ruminantes (GONG

et al, 1996; HWANG et al, 1996; MILLER et al, 1996; TANIGUCHI et al, 2002).

Em 1995, o gene receptor da leptina foi isolado por Tartaglia et al. (1995).

Esse gene está localizado no cromossomo 3 de bovinos e é constituído por 20

exons. O receptor da leptina é uma glicoproteína com uma simples região de ligação

transmembrana, sendo que existem seis diferentes isoformas desse receptor,

diferenciando-se apenas pelo domínio intracelular desse receptor e nos tecidos em

que estão presentes (TARTAGLIA, 1997).

Diversos marcadores microssatélites polimórficos presentes no gene da

leptina foram descritos por Pomp et al. (1997), Stone e Kappes (1996) e Wilkins e

Davey (1997). Fitzsimmons et al. (1998) relatou que variantes do marcador

microssatélite BM1500 foram associadas à deposição de gordura em gado de corte

em animais das raças Angus, Charolês, Simental e Hereford. Diversos marcadores

SNP (single nucleotide polymorphism) foram relatados nos introns e exons do gene

16

da leptina e do gene do receptor da leptina (KONFORTOV; LICENCE; MILLER,

1999; LIEN et al, 1997).

2.5. Polimorfismos presentes nos exons do gene da leptina

A investigação de marcadores SNP nos exons é importante, pois nessa

região se encontram os marcadores funcionais, isto é, marcadores cujas variações

no DNA causam diferenças funcionais no gene, alterando a seqüência do mRNA e

posteriormente, a seqüência de aminoácidos da proteína que o gene codifica (VAN

DER WERF, 2006).

Buchanan et al. (2002) descreveram um marcador SNP localizado na posição

73 no Exon 2 do gene da leptina, identificado atualmente como E2FB. O

polimorfismo localizado no Exon 2 envolve a substituição C →T que está associada

à alteração do aminoácido arginina para uma cisteína na leptina. As freqüências

gênicas encontradas foram de 0,54 para o alelo C e 0,46 para o alelo T. O alelo T

estava associado a maiores níveis de gordura corporal que o alelo C. Nesse estudo

não houve análise das proporções do Equilíbrio de Hardy-Weinberg. Outra

observação interessante foi a maior expressão de mRNA da leptina em animais

homozigotos para o alelo T. Esse achado sugere que essa mutação esta associada

à maior expressão de leptina.

Nkrumah et al. (2004) estudaram a associação do marcador E2FB com

características de importância econômica em animais de raças de origem européia.

Eles observaram diferenças significativas entre os seus genótipos para ganho diário

de gordura subcutânea (P=0,02), grau de cobertura de gordura na carcaça

(P=0,005), grau de rendimento de carcaça (P=0,01) e rendimento de carne

comerciais (P=0,007). O alelo T se mostrou favorável para as características de

deposição de gordura e desfavorável para características de rendimento de carcaça

quando comparado ao alelo C. Relataram ainda, freqüências gênicas de 0,48 para o

alelo C e de 0,52 para o alelo T e a distribuição das freqüências genotípicas estavam

de acordo com as proporções de Equilíbrio de Hardy-Weinberg.

17

Schenkel et al (2005) estudaram o marcador E2FB em animais de diversas

raças de origem européia e relataram freqüências gênicas de 0,58 para o alelo C e

de 0,42 para o alelo T. As freqüências estavam de acordo com as proporções do

Equilíbrio de Hardy-Weinberg. Os genótipos do marcador E2FB apresentaram

diferenças significativas para rendimento de carne (P=0,038), rendimento de gordura

(P=0,013) e escore de gordura (P=0,016).

Com o objetivo de estudar as variações genéticas presentes no gene da

leptina de Bos indicus, Bos taurus e seus cruzamentos, Choudhary et al. (2005),

relataram a ausência da mutação C → T, isto é, a mudança da base citosina para

uma timina, em animais de origem Bos indicus sugerindo que essa mutação tenha

ocorrido após a separação evolutiva de taurinos e zebuínos. No entanto, Meirelles et

al. (1999), estudando o mtDNA (DNA mitocondrial) de animais da raça Nelore, Gir e

Brahman, confirmaram que uma grande proporção do zebu nacional é decorrente do

cruzamento absorvente de fêmeas de origem européia, portadoras de mtDNA

europeu com machos de origem indiana, portadores de mtDNA do Bos indicus.

Em estudo recente, com vacas multíparas das raças Aberdeen Angus e

Charolesa foi investigado o marcador E2FB e verificou-se que as freqüências

gênicas foram de 0,58 para o alelo T e de 0,42 para o alelo C nas vacas da raça

Aberdeen Angus. Nas vacas da raça Charolesa foram descritas freqüências gênicas

de 0,37 para o alelo T e de 0,63 para o alelo C. Nesse estudo, Almeida et al. (2007),

avaliaram as associações desse marcador à média de ganho de peso diário e ao

desempenho reprodutivo em vacas pós-parto, porém essa associação não foi

verificada.

Lusk (2007) relatou que o marcador E2FB não apresentou associação

significativa com estimativas de curva de crescimento e de deposição de gordura em

animais cruzados provenientes de rebanhos comerciais do oeste do estado de

Kansas nos Estados Unidos da América, mantidos em confinamento.

Lagonigro et al. (2003) relataram a presença de uma mutação na posição 252

do exon 2 do gene da leptina. A mutação presente é a substituição de uma adenina

para uma timina (A →T), levando a substituição do aminoácido tirosina para

fenilananina. As freqüências gênicas foram 0,06 para o alelo T e 0,94 para o alelo A.

Esse marcador apresentou diferença significativa entre os genótipos para média de

ingestão de alimentos (P=0,043).

18

O marcador na posição 252 do exon 2 do gene da leptina, chamado de E2JW

por Schenkel et al. (2005), foi investigado em bovinos de raças européias e seus

cruzamentos. As diferenças entre seus genótipos foi significativa para rendimento de

carne e de gordura. Esses autores relataram que as freqüências gênicas

encontradas foram 0,04 para o alelo T e de 0,96 para o alelo A, sendo que as

freqüências genotípicas estavam de acordo com as proporções do teste de

Equilíbrio de Hardy-Weinberg.

Uma mutação C → T na posição 321 do exon 3 que codifica uma mudança

de aminoácidos de alanina para valina foi identificado por Buchanan et al. (2002).

Esses autores, porém, não analisaram a freqüência e nem a associação desse

marcador com características de interesse. Liefers et al, 2002 verificaram que esse

marcador, chamado de A59V, apresentou diferenças significativas entre seus

genótipos para concentração plasmática em vacas Holandesas, principalmente

durante a prenhez, sendo o alelo T favorável ao aumento da concentração

plasmática de leptina. As freqüências gênicas para o alelo T foi de 0,25 e para o

alelo C foi de 0,75, porém não foram analisadas as proporções do teste de Equilibrio

de Hardy-Weinberg. Nkrumah et al.(2006) estudaram o marcador A59V e verificaram

diferenças significativas entre os genótipos do marcador para concentração

plasmática de leptina (P=0,0029), média de ganho de peso diário (P=0,039),

medidas de área de olho de lombo (P=0,014) e gordura subcutânea (P=0,014) por

ultra-som em bovinos de corte das raças Angus e Charolesa. As freqüências gênicas

para o alelo T foi de 0,75 e para o alelo C foi de 0,25, sendo que as freqüências

estavam de acordo com as proporções do teste de Equilíbrio de Hardy-Weinberg.

2.6. Polimorfismos presentes na região promotora do gene da leptina

A região promotora regula o processo de transcrição do DNA para RNA. São

seqüências especificas do DNA, onde a RNA polimerase se liga e é direcionada

para a as regiões codificadoras. Essa região é muito importante na regulação da

expressão gênica (NELSON; COX, 2001).

19

Estudos em humanos e outras espécies têm demonstrado que polimorfismos

presentes na região promotora do gene da leptina podem ser de grande importância,

pois alguns polimorfismos são geralmente associados com fatores de regulação da

expressão gênica e podem alterar significantemente a expressão gênica (MILLER et

al, 1996). A região promotora do gene da leptina foi seqüenciada por Tanigushi et al.

(2002).

Nkrumah et al. (2005) identificaram três polimorfismos na região promotora

do gene da leptina. Os marcadores SNP identificados foram chamados de UASMS1,

UASMS2 e UASMS3, localizados nas posições 207 (substituição C→T), 528

(substituição C→T) e 1759 (substituição A→G), respectivamente, na região

promotora do gene da leptina. Em sua análise UASMS1 e UASMS3 apresentaram

herança mendeliana e associação idêntica às características. O estudo foi realizado

com bovinos produtos de cruzamentos de diversas raças de origem européia

provindos de rebanhos comerciais e experimentais. Para o marcador UASMS1 foram

descritas freqüências gênicas para o alelo T de 0,59 (rebanhos experimentais) e

0,48 (rebanhos comerciais) e para o alelo C a variação foi entre 0,41 (rebanhos

experimentais) e 0,62 (rebanhos comerciais). Para o marcador UASMS2, as

freqüências gênicas para o alelo T variaram de 0,21 (rebanhos experimentais) a 0,20

(rebanhos experimentais) e para o alelo C a variação foi entre 0,79 (rebanhos

experimentais) e 0,80 (rebanhos comerciais). As freqüências genotípicas dos dois

marcadores não apresentaram desvios na distribuição de acordo com as proporções

do teste de Equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE). O marcador UASMS1 apresentou

efeito significativo para peso corporal final (P=0,04), ingestão de matéria seca

(P=0,007), tempo de alimentação por dia (P=0,005) e espessura de gordura

subcutânea medida por ultra-som (P=0,04). O marcador UASMS2 apresentou efeito

significativo de diferença entre seus genótipos para concentração plasmática de

leptina (P<0,001), média de ganho de peso diário (P=0,002), ingestão de matéria

seca (P=0,001), tempo de alimentação por dia (P=0,02), espessura de gordura

subcutânea (P=0,001) e escore de marmoreio (P=0,01) medidos por ultra-som.

No estudo de Schenkel et al. (2005) foram analisados os marcadores

UASMS1 e UASMS2 em animais das raças Angus, Limousin, Charolesa, Simental e

seus cruzamentos. Para o marcador UASMS1, a freqüência gênica foi de 0,61 para

o alelo T e para o alelo C foi 0,39. Para o marcador UASMS2, o alelo T apresentou

20

freqüência gênica de 0,74 e para o alelo C de 0,26. As freqüências genotípicas dos

dois marcadores não apresentaram desvios na distribuição de acordo com as

proporções do teste de Equilíbrio de Hardy-Weinberg. O UASMS1 apresentou

diferenças significativas entre os seus diferentes genótipos para rendimento de

gordura (P=0,012) e o marcador UASMS2 não apresentou efeito significativo para

nenhuma das características avaliadas.

Nkrumah et al. (2006) relataram que o marcador UASMS2 apresentou

freqüência gênica para o alelo T de 0,18 e para o alelo C de 0,82. As freqüências

genotípicas do marcador não apresentaram desvios nas suas distribuições de

acordo com as proporções do teste de Equilíbrio de Hardy-Weinberg. O marcador

UASMS2 apresentou associação significativa para concentração plasmática de

leptina (P<0,001), ingestão de matéria seca (P=0,036) e para todas as

características envolvendo deposição de gordura subcutânea e marmoreio (P<0,05).

Em estudo recente, o marcador UASMS2 foi associado com estimativas de

curvas de crescimento e de deposição de gordura em animais cruzados,

provenientes de rebanho comerciais. O alelo C foi favorável para a melhoria dos

parâmetros de crescimento e o alelo T favorável para a deposição de gordura

(LUSK, 2007).

Liefers et al. (2005), estudando vacas Holandesas prenhes, identificaram dois

polimorfismos na região promotora do gene da leptina. Foram denominados de

A1457G (localizado na posição 1457 na região promotora do gene da leptina -

substituição A →G) e C963T (localizado na posição 963 na região promotora do

gene da leptina - substituição C →T). O marcador A1457G apresentou freqüência

gênica para o alelo A de 0,54 e para o alelo G de 0,46, o marcador C963T

apresentou freqüência gênica para o alelo T de 0,33 e para o alelo C de 0,87. Os

dois marcadores apresentaram associação para concentração plasmática de leptina

durante a prenhez. O marcador A1457G apresentou associação significativa para

primeira atividade luteal pós-parto (P=0,017) e peso vivo da vaca na 1ª semana de

lactação (P=0,027). O marcador C963T apresentou associação significativa para

ingestão de matéria seca (P=0,03) e primeiro estro observado pós-parto (P=0,007).

Porém, nenhum outro trabalho foi encontrado avaliando esses marcadores descritos

por Liefers et al (2005).

21

2.7. Polimorfismos presentes no gene do receptor da leptina

O gene do receptor da leptina está localizado no cromossomo 3 e consiste de

20 exons (PFISTER-GENSKOW et al, 1997). Liefers et al. (2004), estudando o gene

do receptor da leptina de vacas da raça Holandesa, relataram a presença do

polimorfismo (T945M) na posição 115 (substituição T→C). O estudo foi conduzido

com a genotipagem de 323 vacas, sendo que 93% apresentaram o genótipo CC e

7% apresentaram genótipo CT. Nenhum animal apresentou o genótipo TT. Porém

suas distribuições estavam de acordo com as proporções do teste de Equilíbrio de

Hardy-Weinberg. Os animais heterozigotos CT apresentaram maiores concentrações

plasmáticas de leptina durante a prenhez que o homozigoto CC (P<0,05).

No trabalho de Schenkel et al. (2006) foi estudado o marcador T945M, citado

como LEPR SNP, e verificou-se que a freqüência gênica do alelo T foi de 0,04 e o

alelo C foi de 0,96. O marcador apresentou associação significativa escore de

deposição de gordura subcutânea (P=0,005), espessura de gordura subcutânea

(P=0,019) e rendimento de gordura de carcaça (P=0,034).

2.8. Ultra-sonografia na avaliação de precocidade de acabamento e crescimento em bovinos de corte

A produção de carcaças de peso adequado e com quantidade mínima de

gordura subcutânea, de forma a garantir a qualidade da carne durante o processo de

resfriamento, é um dos principais pontos de interesse para a cadeia produtiva da

carne. A determinação do ponto ideal de abate dos animais de diferentes grupos

genéticos em cada um dos diversos sistemas de produção disponíveis torna-se

ferramenta importante para determinar a qualidade do produto (SUGUISAWA,

2002).

Metodologias utilizando medidas realizadas diretamente na carcaça

apresentam uma boa correlação com a composição da mesma, entretanto, exigem o

22

abate do animal, demandam muito tempo e são de alto custo (HEDRICK, 1983;

SILVA, 2002).

Isso levou a procura por métodos não invasivos ou indiretos, como a

avaliação de carcaça por ultra-sonografia in vivo possibilitando determinar o grau de

terminação e de desenvolvimento muscular dos animais, sem os empecilhos de

outras metodologias (SILVA, 2002). O monitoramento de características como área

de olho de lombo (AOL), espessura de gordura subcutânea (EGS) e espessura de

gordura sobre o músculo Bíceps femoris ou picanha (EGP), além de auxiliar a

escolha dos animais a serem abatidos, também fornece informações para serem

incorporadas tanto em modelos de crescimento como de seleção animal (BERGEN

et al, 1996).

A medida da AOL pelo método de ultra-som é realizada entre a 12ª e 13ª

costelas, pois é de fácil localização e diversos estudos relatam correlação positiva

entre AOL em relação ao peso vivo, musculosidade, quantidade e porcentagem de

porção comestível (HEDRICK, 1983; LUCHIARI FILHO, 2000; SILVA et al, 2003;

SUGUISAWA, 2002).

A deposição de gordura na carcaça é amplamente variável ao longo do

processo de crescimento do animal. À medida que a gordura corporal aumenta,

ocorre diminuição da porcentagem de carne magra (BERG; BUTERFIELD, 1979). A

deposição de gordura é importante tanto para o produtor quanto para a indústria

frigorífica. Do ponto de vista da indústria frigorífica, um nível mínino de gordura de

cobertura é importante para proteção da carcaça durante o resfriamento evitando a

desvalorização do produto (LUCHIARI FILHO, 2000). Do ponto de vista do produtor,

diminuindo os custos de alimentação e determinando o grau de acabamento de

carcaça para o abate (SUGUISAWA, 2002).

A EGS, medida a ¾ da borda medial sobre o músculo Longissimus dorsi é um

eficiente indicador de acabamento de carcaça, sendo inversamente correlacionada à

porcentagem de porção de cortes comerciais (HEDRICK, 1983; SILVA et al, 2003;

SILVA et al, 2004; SUGUISAWA, 2002). A medida da espessura de gordura

subcutânea sobre o terço superior do músculo Biceps femoris é um bom indicador

da gordura total da carcaça, explicando uma grande proporção da variação na

porcentagem de gordura na carcaça (BAUD, 1998; WILLIAMS, 1992).

23

Em programas de melhoramento genético, a técnica de ultra-sonografia é um

importante instrumento por apresentar vantagens na seleção de animais para

características de precocidade de acabamento e crescimento, pois estão

correlacionadas com o rendimento de cortes cárneos e precocidade de acabamento

em carcaças de bovinos de corte (SUGUISAWA, 2002).

2.9. Características de crescimento ou desenvolvimento ponderal

Os critérios de seleção de bovinos de corte no Brasil tem se baseado, quase

que exclusivamente, em pesos corporais em diferentes idades ou função destes

pesos, como ganhos médios diários ou dias para atingir determinado peso e em

perímetro escrotal mensurado aproximadamente aos 18 meses, o qual é

correlacionado com idade à puberdade, fertilidade, desenvolvimento ponderal e

precocidade sexual das filhas (KARSBURG, 2003). Segundo Sarmento et al. (2003),

o ganho de peso rápido é uma característica desejável em bovinocultura de corte,

pois animais que tem maior capacidade de crescimento precisam de menor período

para atingir o peso de abate.

A seleção para aumento de peso vem sendo amplamente aplicada nos

programas de melhoramento genético de bovinos de corte (ELER et al, 1996).

Estudos de crescimento, por meio das medidas de peso, envolvendo zebuínos são

bastante expressivos na literatura (KOURY FILHO, 2001).

O peso ao nascimento e o peso à desmama refletem, de maneira geral, a

habilidade materna da vaca e um pouco a capacidade do animal em se desenvolver

(KOURY FILHO, 2001).

O peso ao sobreano e ganho de peso pós-desmama são extremamente

importantes, sob o ponto de vista do melhoramento genético, pois determinam o

desenvolvimento do animal, sem influência de efeitos maternos, tendo em vista que

o animal já foi desmamado, na maioria das vezes, a mais de um ano, medindo o

potencial de desenvolvimento do animal em diferentes ambientes, refletindo o

potencial de ganho de peso após o desmame (PEDROSA, 2006).

24

A seleção para ganho de peso da desmama ao sobreano é o melhor indicador

da capacidade de adaptação dos animais, às diversas condições de clima e

ambiente (ALBUQUERQUE e FRIES, 1998). Segundo Ledic e Deragon (1997), a intensa seleção no Brasil para tamanho

corporal implica em um alerta para aumentar os estudos para testar as correlações

entre peso final e as características de acabamento de carcaça e precocidade

sexual.

25

3. HIPÓTESES

- Existem polimorfismos dos marcadores relacionados à leptina, já avaliados em

animais de raças de origem taurina, em animais da raça Nelore?

- Existe associação entre os marcadores estudados e seus diferentes genótipos com

precocidade de acabamento e características de desenvolvimento ponderal em

bovinos da raça Nelore?

26

4. OBJETIVOS

Face à escassez de informações na caracterização da freqüência de

polimorfismos de genes ligados às características relacionadas à precocidade de

acabamento e de crescimento, e tendo em vista o potencial de utilização de

marcadores moleculares em animais da raça Nelore no Brasil, este estudo teve

como objetivos:

(i) Caracterizar as freqüências de polimorfismos em marcadores moleculares

relacionados à leptina e com potencial de uso para seleção para precocidade de

acabamento e de desempenho em bovinos da raça Nelore;

(ii) Relacionar as freqüências genotípicas e gênicas dos diferentes marcadores à

precocidade de acabamento e outras características de crescimento pós-

desmama, como os de peso à desmama, ganho de peso da desmama ao

sobreano, peso ao sobreano e circunferência escrotal ao sobreano.

27

5. MATERIAL E MÉTODOS

5.1. Animais avaliados

Foram utilizados 2.162 bovinos machos não castrados da raça Nelore, criados

em pastagem até aproximadamente os 18 meses. Os animais eram provenientes da

Agro-pecuária CFM Ltda, com propriedades nos Estados de São Paulo e Mato

Grosso do Sul, e da Fazenda Mundo Novo, localizada no Estado de Minas Gerais.

As medidas de ultra-som foram realizadas em 1.856 animais pertencentes à

Fazenda São Francisco, da Agro-pecuária CFM Ltda, localizada em Magda, SP

(20º38'38"S 50º13'34"W, com altitude de 526 metros). Informações de 2.162 animais

referentes às características de desenvolvimento ponderal foram obtidos junto ao

Laboratório de Melhoramento Genético “Dr. Gordon Dickerson”, pertencente ao

Departamento de Ciências Básicas da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de

Alimentos da Universidade de São Paulo, localizado em Pirassununga, no Estado de

São Paulo. As informações de genótipos dos animais para os marcadores

estudados, desenvolvimento ponderal e medidas de ultra-som foram incluídas em

banco de dados para a realização da análise dos resultados.

5.2. Coleta de amostras de sangue, extração de DNA, caracterização e determinação dos genótipos para os marcadores SNP avaliados

Foram coletadas amostras de aproximadamente 10 ml de sangue dos animais

pela veia jugular com tubos coletores a vácuo contendo EDTA. Após a coleta, os

tubos foram refrigerados e encaminhados ao laboratório para a extração de DNA,

através do método de extração e precipitação de NaCl, descrito por Olerup e

Zetterquist (1992).

28

A caracterização e determinação dos genótipos para os marcadores SNP foi

realizada por meio de PCR em Tempo Real utilizando o equipamento ABI Prism®

7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems®). Para isto, foi utilizado o

sistema de detecção TaqMan™ em que primers e sonda que pareiam na região do

DNA, permitem a identificação dos diferentes alelos. Foram sintetizadas sondas de

forma a parear seletivamente no DNA molde onde se encontram os polimorfismos

de interesse. A proporção de indivíduos heterozigotos e homozigotos para um de

seus genótipos foi estimada por meio das leituras de fluorescências das sondas.

Para a reação de PCR foi utilizado aproximadamente 120 ng de DNA para

uma reação de 25 µl, contendo 0,2 µM de cada dNTP, 0,5 U de Taq DNA polimerase

e 0,2 µM de cada oligonucleotídeo iniciador em 32 ciclos de 1 minuto à 94°C, 30

segundos à 58°C e 1 minuto à 72°C. A seqüência de bases dos oligonucleotídeos

iniciadores específicos (primers) para cada gene estudado, estão apresentadas na

Tabela 1.

A genotipagem das amostras foi realizada, nos Estados Unidos da América,

pelos laboratórios licenciados pela IGENITY™, uma unidade de negócios da Merial

Ltda., detentora de licenças de exploração dos citados marcadores moleculares e

para facilidade de padronização dos resultados.

29

Tabela 1 - Identificação dos marcadores, localização gênica, primers, substituição de base e referências bibliográficas

SNP Localização Primers (5’ – 3’) Substituição Referências Bibliográficas

E2FB Cromossomo 4 Posição 73 no exon 2 do

gene da leptina

F AAGGAAAATGCGCTGT R ACGGTTCTACCTCGTC

C→T Kononoff et al. (2005)

E2JW Cromossomo 4 Posição 252 no exon 2

do gene da leptina

F GATTCCGCCGCACCTCTC R GGCTGTGCAGCCTTGCACAGG

A→T Lagonigro et al. (2003)

A59V Cromossomo 4 Posição 321 no exon 3

do gene da leptina

F GGGAAGGGCAGAAAGATAG R TGGCAGACTGTTTGAGGATC

C→T Haegeman, Zeveren e Peelman (2000)

UASMS1 Cromossomo 4

Posição 207 da região promotora do gene da

leptina

F GGCACAATCCTGTGTATTGGTAAGA R GTCCATGTACCATTGCCCAATTTT

C→T Nkrumah et al. (2005)

UASMS2 Cromossomo 4


leptina

F AGGTGCCCAGGGACTCA R CAACAAAGGCCGTGTGACA

C→T Nkrumah et al. (2005)

C963T Cromossomo 4


leptina

F AAGTCCCCTGTAGTTTTTATG R GCCTGGTTGTTTTGCTTTTA

C→T Liefers et al. (2005)

A1457G Cromossomo 4

Posição 1.457 da região promotora do gene da

leptina

F GGGGGAGGCGGAGAGGAG R TACATGGCCACTAAAAAGGTTG

A→G Liefers et al. (2005)

T945M Cromossomo 3

Posição115 do exon 20 do gene do receptor da

leptina

F ACCACAGAATCAGGAAGGACACA R GACAGGCCTTTCATTATTATTTTC

C→T Liefers et al. (2004)

30

5.3. Metodologia de coleta dos dados de ultra-som

Foram utilizados 1.856 bovinos não castrados da raça Nelore de 18 a 30

meses de idade. Os animais utilizados para colheita de dados de ultra-som, foram

colocados em sistema de confinamento com dieta de alta energia aproximadamente

30 dias antes das medições com ultra-sonografia em tempo real, mas haviam sido

criados a pasto desde o seu nascimento. As imagens de ultra-som foram obtidas

através de um equipamento de ultra-som marca Piemedical, modelo Scanner 200

VET, com um transdutor de 3,5 MHz e 178 mm de comprimento, com uma guia

acústica acoplada para melhor adaptação a anatomia do corpo do animal.

Após a imobilização do animal em um tronco de contenção, o espaço entre a

12ª e 13ª costela foi localizado, através de palpação. Sobre o local da medida foi

utilizado óleo vegetal com objetivo de atuar como acoplante acústico. Então era

realizada a obtenção das imagens de área de olho de lombo (AOL) e espessura de

gordura subcutânea (EGS) com o transdutor localizado transversalmente ao animal

no espaço entre a 12ª e 13ª costelas do animal (Figura1).

Para a colheita da imagem de espessura de gordura sobre o músculo Bíceps

femoris (EGP), colocou-se o transdutor, sem a guia acústica, sobre o músculo

Bíceps femoris, em linha reta entre o íleo e o ísquio, para a determinação da

espessura de gordura subcutânea (Figura 2).

As imagens obtidas foram gravadas em microcomputador portátil acoplado ao

aparelho de ultra-som e posteriormente, foram analisados através de programa

computacional específico para esta finalidade desenvolvido no GMA/FZEA.

31

Figura 1 – Obtenção das imagens de área de olho de lombo

(AOL) e espessura de gordura subcutânea (EGS)

Figura 2 – Obtenção das imagens de espessura de gordura

sobre o músculo Bíceps femoris (EGP)

32

5.4. Avaliação das características de desenvolvimento ponderal

As informações de desenvolvimento ponderal utilizadas foram peso a

desmama (PD), peso aos 18 meses ou sobreano (PS), ganho de peso da desmama

até os 18 meses ou sobreano (GPS) e circunferência escrotal aos 18 meses ou

sobreano (CE). Esses dados foram coletados nas fazendas onde se encontravam

alocados os animais. Todas as informações utilizadas no estudo possuíam divisão

por grupos contemporâneos caracterizados por animais nascidos em mesmo

rebanho, no mesmo ano, na mesma estação, de mesmo sexo, de mesmo grupo de

manejo até a desmama e pertencentes ao mesmo grupo de manejo da desmama ao

sobreano. As informações estão incluídas no banco de dados pertencente à Agro-

Pecuária CFM Ltda, controlado pelo Laboratório de Melhoramento Genético “Dr.

Gordon Dickerson”, do Departamento de Ciências Básicas da Faculdade de

Zootecnia e Engenharia de Alimentos da Universidade de São Paulo.

5.5. Metodologia de análise dos resultados

As análises das informações foram realizadas pelo programa Statistical

Analysis System, versão 9.1.3 (SAS INSTITUTE INC, 2004), utilizando-se os

módulos SAS/STAT 9.1.3 e SAS/Genetics 9.1.3. As análises de freqüências gênicas

e genotípicas, teste de Equilíbrio de Hardy-Weiberg, heterozigose, diversidade

alélica e conteúdo de informação polimórfica dos marcadores avaliados foram

realizadas através do procedimento PROC ALLELE do módulo SAS/Genetics 9.1.3.

As análises de variância, desvios de dominância ou de aditividade, efeitos de

aditividade e efeitos médio de substituição dos marcadores foram avaliados através

do procedimento PROC MIXED do módulo SAS/STAT 9.1.3.

33

5.6. Determinação das freqüências genotípicas, gênicas e estimação da variabilidade genética da população

As estimativas das freqüências gênicas e genotípicas foram estimadas para

cada loco, por contagem simples dos alelos e dos diferentes genótipos,

respectivamente, conforme descrito por Falconer (1987). Entende-se aqui por

freqüência gênica como a proporção dos diferentes alelos de um gene na

população, enquanto que freqüência genotípica é a proporção dos genótipos.

O Equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE) consiste na teoria de que uma grande

população, sob acasalamento ao acaso, na ausência de migração, mutação e

seleção, tantos as freqüências gênicas como as freqüências genotípicas são

constantes, de geração em geração, e as freqüências genotípicas são determinadas

pelas freqüências gênicas (FALCONER, 1987). A probabilidade de Equilíbrio de

Hardy-Weinberg associado às freqüências genotípicas observadas foram testadas

por duas metodologias. Uma das metodologias utilizadas foi a do teste 2χ (Qui-

Quadrado) de aderência. Outra metodologia foi o Teste Exato por Permutação,

descrito por Guo e Thompson (1992). Foi considerado como hipótese H0 a

população apresentar suas freqüências genotípicas de acordo com as proporções

do equilíbrio de Hardy-Weinberg, sendo que valores significativos (P<0,05) rejeitam

H0.

O nível de heterozigose (Het), também chamado de heterozigosidade

observada, é a simples proporção de heterozigotos dentro de uma população, sendo

calculada pela equação 1:

∑=

−=k

uuuFHet

11

(1)

em que,

Fuu é a freqüência genotípica dos homozigotos

34

A diversidade alélica (Div), também chamada de heterozigosidade esperada,

é a proporção de heterozigotos na população quando se mantém as proporções do

equilíbrio de Hardy-Weinberg, sendo calculada pela equação 2:

∑=

−=k

uufDiv

1

21 (2)

em que,

fu é freqüência gênica de cada alelo

O conteúdo de informação polimórfica (PIC) é definido como a probablidade

que um dado genótipo de uma progênie permitirá deduzir o genótipo parental para o

marcador avaliado (REGITANO; COUTINHO, 2001; SHETE; TIWARI; ELSTON,

1999). Segundo a classificação de Botstein et al. (1980), PIC varia de 0 a 1 e pode

ser classificado como pouco informativo (PIC<0,25), razoavelmente informativo

(0,25<PIC<0,5) e altamente informativo (PIC>0,5). O calculo do valor de PIC é

definido pela equação 3:

∑ ∑= +=

−−=k

u

k

uvvuu fffPIC

1 1

222 21 (3)

em que,

fu é freqüência gênica do alelo u;

fv é freqüência gênica do alelo v;

5.7. Efeito dos marcadores SNP sobre as características precocidade e de desenvolvimento ponderal

Para análise das implicações dos resultados moleculares sobre as

características de interesse, as informações obtidas por ultra-sonografia e de

desenvolvimento ponderal foram utilizadas como variáveis dependentes. Os efeitos

dos genótipos encontrados para os diferentes marcadores, foram avaliados a partir

35

do modelo proposto Kononoff et al. (2005), Nkrumah et al. (2004) e Nkrumah et al.

(2005). O modelo estatístico proposto é apresentado abaixo:

( ) ijklijklkjiijkl eIIMSCY +−++++= 1βµ

em que,

=ijklY é o valor fenotípico observado para as características relacionadas a

precocidade e de desenvolvimento ponderal;

µ = é uma constante inerente a todas as observações;

Ci = é o efeito fixo de grupo de contemporâneos e de classe de idade da mãe para

peso ao desmame;

Sj = é o efeito aleatório de reprodutor, com média 0 e variância σ2s;

Mk = é o efeito fixo do genótipo do marcador avaliado;

1β = é coeficientes de regressão linear da característica Yijkl em relação à idade do

animal a mensuração, incluído no modelo como covariável;

ijklI = é a idade do animal a mensuração;

I = é a média de idade a mensuração dos animais avaliados;

eijkl = efeito aleatório residual associado à característica ijklY , com média 0 e

variância σ2e.

Os grupos contemporâneos para as características medidas por ultra-som foram

caracterizados por animais nascidos em mesmo rebanho, no mesmo ano, na mesma

estação, de mesmo sexo, de mesmo grupo de manejo até o desmame, de mesmo

grupo de manejo da desmama ao sobreano e pertencentes ao mesmo o grupo de

manejo do sobreano a mensuração ultra-sonográfica. Os grupos contemporâneos

para a característica de desenvolvimento ponderal foram caracterizados por animais

nascidos em mesmo rebanho, no mesmo ano, na mesma estação, de mesmo sexo,

de mesmo grupo de manejo até ao desmame, e pertencentes ao mesmo grupo de

manejo da desmama ao sobreano.

36

As análises de variância foram avaliadas por meio de modelos mistos, sendo

calculadas as estimativas das médias de quadrados mínimos para cada genótipo de

cada marcador. As diferenças entre as estimativas de médias de quadrados

mínimos, quando necessárias, foram avaliadas por meio do Teste t de Student

(P<0,05).

A estimativas do efeito aditivo (α) para cada marcador foram estimadas pela

diferença entre os valores genotípicos dos homozigotos, como demonstrado na

equação 4. A estimativa dos valores do desvio de dominância (δ) foi calculado

através da diferença entre o valor genotípico dos heterozigotos e da média dos

valores genótipicos dos homozigotos, como demonstrado na equação 5

(FALCONER, 1987). Os contrastes foram testados pelo Teste F.

vvuu Φ−Φ=α (4)

2/)( vvuuuv Φ−Φ−Φ=δ (5)

em que,

Φ é o valor genotípico

O efeito médio de substituição é calculado através de uma equação de

regressão ajustada aos genótipos de cada marcador, pelo método de quadrados

mínimos, sendo cada ponto ponderado pelos valores genotípicos de cada genótipo,

considerando o número de alelos favoráveis existente no genótipo. A estimativa do

efeito médio de substituição é dada por β1 (FALCONER, 1987).

37

6. RESULTADOS

6.1. Freqüências genotípicas, gênicas e estimação da variabilidade genética da população

As estimativas das freqüências genotípicas, gênicas e as probabilidades

associadas aos Testes de Equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE) estão apresentadas

na Tabela 2. A maioria dos marcadores apresentou freqüência genotípica baixa para

os alelos menos freqüentes e em alguns casos, o alelo mais freqüente se

apresentou, praticamente, fixado na população estudada, demonstrando baixa

variabilidade dentro da população para alguns marcadores avaliados.

Os marcadores E2JW, A59V e UASMS2 não tiveram nenhum individuo

homozigoto portador do alelo menos freqüente. O marcador T945M, presente no

gene do receptor da leptina, e o marcador A1457G tiveram suas freqüências

genotípicas e gênicas melhores distribuídas entre seus genótipos e alelos que os

demais marcadores avaliados, conforme demonstrado na Tabela2.

O teste da probabilidade das proporções para o Equilíbrio de Hardy-Weinberg

demonstrou que as freqüências genotípicas dos marcadores C963T e UASMS1 não

se encontravam distribuídas de acordo com as proporções de Equilíbrio de Hardy-

Weinberg quando avaliados pelo teste 2χ (Qui-Quadrado). Os outros marcadores se

encontraram distribuídos de acordo com as proporções de Equilíbrio de Hardy-

Weinberg quando avaliados pelo teste 2χ (Qui-Quadrado). Quando a probabilidade é

calculada pelo Teste Exato de Permutações, descrito por Guo e Thompson (1992),

todos os marcadores se apresentam distribuídos de acordo com as proporções do

Equilíbrio de Hardy-Weinberg. Em ambos testes foi considerado como H0 a

probabilidade de que as freqüências genotípicas estão de acordo com as proporções

do equilíbrio de Hardy-Weinberg (P<0,05).

38

Tabela 2. Freqüências genotípicas, gênicas e probabilidades de HWE

Teste para HWE SNP

Freqüência Genotípica

Freqüência Gênica 2χ

ProbabilidadeExata

E2FB (n = 2.152)

F(CC) = 0,876

F(CT) = 0,119

F(TT) = 0,005

f (C) = 0,936

f (T) = 0,064 0,46 0,47

E2JW (n = 1.931)

F(AA) = 0,998

F(AT) = 0,002

f (A) = 0,999

f (T) = 0,001 0,97 1,00

A59V (n = 1.887)

F(CC) = 0,998

F(CT) = 0,002

f (C) = 0,999

f (T) = 0,001 0,97 1,00

C963T (n = 2.095)

F(CC) = 0,960

F(CT) = 0,038

F(TT) = 0,002

f (C) = 0,979

f (T) = 0,021 0,02* 0,06

A1457G (n = 2.138)

F(AA) = 0,602

F(AG) = 0,340

F(GG) = 0,058

f (A) = 0,772

f (G) = 0,228 0,11 0,12

UASMS1 (n = 2.116)

F(CC) = 0,001

F(CT) = 0,041

F(TT) = 0,958

f (C) = 0,022

f (T) = 0,978 0,04* 0,07

UASMS2 (n = 2.108)

F(CC) = 0,995

F(CT) = 0,005

f (C) = 0,997

f (T) = 0,003 0,90 1,00

T945M (n = 1.871)

F(CC) = 0,773

F(CT) = 0,213

F(TT) = 0,014

f (C) = 0,880

f (T) = 0,120 0,67 0,74

n = número de animais; * (P<0,05); HWE = Equilíbrio de Hardy-Weinberg

Para avaliação da variabilidade genética da população foram calculadas as

estimativas de heterozigose, diversidade alélica e conteúdo de informação

polimórfica. Os resultados estão descritos na Tabela 3.

39

Tabela 3. Estimativas de heterozigose (Het), diversidade

alélica (Div) e conteúdo de informação

polimórfica (PIC)

Marcador Het Div PIC

E2FB 0,1185 0,1204 0,1132

E2JW 0,0016 0,0016 0,0016

A59V 0,0016 0,0016 0,0016

A1457G 0,3400 0,3521 0,2901

C963T 0,0382 0,0402 0,0394

UASMS1 0,0425 0,0406 0,0416

UASMS2 0,0052 0,0052 0,0052

T945M 0,1889 0,2133 0,1889

De um modo geral, a heterozigose da população, quando considerado cada

marcador individualmente, é relativamente baixa, excluindo-se os marcadores

A1457G e T945M que apresentaram estimativas de heterozigose e diversidade

alélica relativamente alta. É interessante observar através desse resultado que a

população encontra-se com uma baixa freqüência de indivíduos heterozigotos para a

maioria dos marcadores avaliados nesse estudo. A diversidade alélica, sendo

definida como a proporção esperada de heterozigotos quando mantidas as

proporções de equilíbrio de Hardy-Weinberg, demonstra que a freqüência de

heterozigotos não apresentaria grandes alterações, inclusive, as estimativas de

heterozigose e diversidade alélica dos marcadores E2JW e A59V são iguais

numericamente.

As estimativas do conteúdo de informação polimórfica demonstraram que os

polimorfismos são pouco informativos para informação do genótipo parental, com

exceção do marcador A1457G que pela sua estimativa seria considerado

razoavelmente informativo, segundo as definições de Botstein et al. (1980).

40

6.2. Análise de efeitos dos marcadores nas características avaliadas

6.2.1. Análise dos efeitos dos marcadores nas características avaliadas por ultra-som

O número de animais avaliados, média, desvios padrão, coeficiente de

variação, valor mínimo e máximo das medidas AOL, EGS e EGP avaliadas por ultra-

som estão descritas na Tabela 4. EGS e EGP mostraram variação considerável

entre os animais, sendo isso desejável para comparação dos animais com diferentes

genótipos. AOL apesar de apresentar menor variação, avaliada pelo coeficiente de

variação, apresenta uma grande amplitude em suas informações, sendo bastante

informativo, se considerarmos as baixas freqüências de alguns genótipos.

Tabela 4. Número de animais avaliados, média da característica, desvio padrão,

coeficiente de variação, valor mínimo e máximo das medidas AOL (área

de olho de lombo), EGS(espessura de gordura subcutânea) e EGP

(espessura de gordura na picanha)

Característica n m̂ σ̂ CV min max

AOL (cm²) 1.856 65,09 7,42 11,40 40,20 93,80

EGS (mm) 1.856 2,17 1,27 58,75 0,00 7,60

EGP (mm) 1.856 3,82 1,86 48,75 0,00 11,90

n = número de animais avaliados; m̂ = média da característica; σ̂ = desvio padrão

da característica; CV = coeficiente de variação da característica; min = valor mínimo

da característica; max = valor máximo da característica

As probabilidades obtidas nas análises de variância para os efeitos dos

marcadores nas medidas de ultra-som estão apresentados na Tabela 5. Observa-se,

na Tabela 5, que os marcadores C963T e UASMS1 foram significativamente

41

associados com AOL (P<0,05). Já o marcador A1457G apresentou resultados

significativos para a característica EGS (P<0,05).

Tabela 5. Valores de probabilidade da análise de variância

para testar os efeitos dos marcadores moleculares

nas características AOL (área de olho de lombo),

EGS (espessura de gordura subcutânea) e EGP

(espessura de gordura de picanha)

Marcador AOL EGS EGP

E2FB 0,0823 0,0788 0,1013

E2JW 0,3702 0,3030 0,4422

A59V 0,2761 0,7339 0,6073

A1457G 0,1417 0,0192* 0,2551

C963T 0,0451* 0,9256 0,9834

UASMS1 0,0176* 0,8688 0,7187

UASMS2 0,7345 0,6767 0,9884

T945M 0,5124 0,7251 0,3423

* diferenças significativas P<0,05

Na Tabela 6 estão apresentadas as estimativas das médias de quadrados

mínimos e erros padrão para os marcadores que apresentaram diferença

significativa entre seus respectivos genótipos (P<0,05). O marcador A1457G foi

associado significativamente com EGS, apresentando aumento da EGS para

animais portadores do alelo A (Tabela 5), sendo que os homozigotos AA e

heterozigotos AG não diferiram significantemente entre si (P<0,05). Os animais

heterozigotos CT apresentaram maior AOL que os animais homozigotos CC para o

marcador C963T, sugerindo que o alelo T do marcador C963T seja favorável para o

aumento da AOL. O marcador UASMS1 também mostrou associação significativa

para AOL, sendo que os animais heterozigotos apresentaram maior AOL,

demonstrando o efeito favorável do alelo C (Tabela 6).

42

Tabela 6. Estimativa das médias de quadrados mínimos e erros padrão associados

aos efeitos dos genótipos dos marcadores que demonstraram diferenças

(P<0,05) entre seus genótipos para as avaliações ultra-sonográficas de

AOL (cm²), EGS (mm) e EGP (mm)

Marcador Genótipos AOL ± EP EGS ± EP

AA 2,32 ± 0,10 a

AG 2,30 ± 0,11 a A1457G

GG

_

1,88 ± 0,18 b

CC 64,48 ± 0,53 b C963T

CT 66,56 ± 1,15 a _

TT 64,50 ± 0,53 b UASMS1

CT 66,84 ± 1,11 a _

a,b Médias acompanhadas por letras diferentes na mesma coluna, para cada

marcador, diferem entre si (P<0,05); AOL = Área de olho de lombo; EGS =

espessura de gordura subcutânea; EGP = Espessura de gordura da picanha.

As probabilidades para os Testes F relacionados aos efeitos aditivo (α) e

desvios de dominância (δ) para os marcadores avaliados, em relação a

características ultra-sonográficas de AOL, EGS e EGP, bem como, as estimativas

desses efeitos, encontram-se na Tabela 7 e 8, respectivamente.

O marcador A1457G demonstrou significante desvio de dominância (P<0,05)

para AOL, demonstrando que o marcador pode demonstrar efeito de dominância

entre seus alelos para AOL (δ = 0,95 ± 0,48), apesar de não ter sido demonstrado

efeito na análise de variância para essa característica (P<0,05). Esse marcador

também apresentou significante efeito aditivo (α = 0,44 ± 0,16) e de desvio de

dominância (δ =0,20 ± 0,92) para EGS (P<0,01 e P<0,05, respectivamente). Os

marcadores C963T e UASMS1 apresentaram significativos desvios de dominância

para AOL, sendo que para C93T a estimativa foi δ = 2,08 ± 1,04 (P<0,05) e para o

marcador UASMS1 foi δ = -2,35 ± 0,99 (P<0,05).

43

Tabela 7. Probabilidades dos Testes F associados aos contrastes para os

efeitos aditivos (α) e desvios de dominância (δ) dos marcadores,

segundo as características ultra-sonográficas avaliadas de AOL

(área de olho de lombo), EGS (espessura de gordura subcutânea)

e EGP (espessura de gordura de picanha)

AOL EGS EGP Marcador

α δ α δ α δ

E2FB 0,3292 0,9053 0,3305 0,0922 0,3316 0,8791

E2JW - 0,3702 - 0,3030 - 0,4422

A59V - 0,2761 - 0,7339 - 0,6073

A1457G 0,1838 0,0484* 0,0052* 0,0281* 0,1173 0,1384

C963T - 0,0451* - 0,9256 - 0,9834

UASMS1 - 0,0176* - 0,8688 - 0,7187

UASMS2 - 0,7345 - 0,6767 - 0,9884

T945M 0,6553 0,8999 0,4686 0,6800 0,3744 0,8366

- sem estimativa da probabilidade por ausência de um dos genótipos


Tabela 8. Estimativas do efeito aditivo (α) e desvio de dominância (δ) e

erros padrão (EP) associados dos marcadores que mostraram

diferenças (P<0,05) entre seus genótipos para as avaliações

ultra-sonográficas de AOL (área de olho de lombo) e EGS

(espessura de gordura subcutânea)

AOL EGS Marcador

α ± EP δ ± EP α ± EP δ ± EP

A1457G - 0,95 ± 0,48 0,44 ± 0,16 0,20 ± 0,92

C963T - 2,08 ± 1,04 - -

UASMS1 - -2,35 ± 0,99 - -

Todos os marcadores foram testados para efeito médio de substituição,

através de uma equação de regressão linear ajustada aos genótipos de cada

44

marcador, considerando o número de alelos favoráveis presentes no genótipo do

anima l, e encontra-se na Tabela 9.

Na Tabela 10, verifica-se que o marcador E2FB apresentou efeito médio de

substituição significativo para AOL (P<0,05) e EGP (P<0,05), apesar de não

demonstrar efeito significativo na análise de variância (P<0,05). Os marcadores

C963T e UASMS1 apresentaram efeito médio de substituição significativo para AOL

(P<0,05) (tabela 9). A estimativa de efeito médio de substituição e seu respectivo

erro padrão do marcador E2FB para AOL foi 1,05 ± 0,47 e para EGP 0,28 ± 0,13.

Para o marcador C963T, a estimativa de efeito médio de substituição e seu

respectivo erro padrão para AOL foi 2,08 ± 1,04 e o marcador UASMS1 apresentou

efeito médio de substituição e respectivo erro padrão para AOL foi 2,35 ± 0,99..

Tabela 9. Probabilidades do teste F associado ao efeito

médio de substituição dos marcadores para as

avaliações ultra-sonográficas de AOL (área de

olho de lombo), EGS (espessura de gordura

subcutânea) e EGP (espessura de gordura de

picanha)

Marcador AOL EGS EGP

E2FB 0,0256* 0,1339 0,0328*

E2JW 0,3702 0,3030 0,4422

A59V 0,2761 0,7339 0,6073

A1457G 0,9124 0,0792 0,4640

C963T 0,0451* 0,9256 0,9834

UASMS1 0,0176* 0,8688 0,7187

UASMS2 0,7345 0,6767 0,9884

T945M 0,2503 0,4916 0,1470


45

Tabela 10. Estimativas de efeito médio de substituição (β1) e erro padrão

(EP) associados dos marcadores que mostraram diferenças

(P<0,05) entre seus genótipos para as avaliações ultra-

sonográficas de AOL (área de olho de lombo) e EGP

(espessura de gordura de picanha)

AOL EGP Marcador

β 1 ± EP β 1 ± EP

E2FB 1,05 ± 0,47 0,28 ± 0,13

C963T 2,08 ± 1,04 -

UASMS1 2,35 ± 0,99 -

6.2.2. Análise dos efeitos dos marcadores nas características de crescimento

O número de animais avaliados, média, desvios padrão, coeficiente de

variação, valor mínimo e máximo das medidas PD, PS, GPS e CE estão descritos na

Tabela 11. As informações fenotípicas dos animais demonstraram maior variação

para GPS quando comparada as outras características. A variação é importante

para comparação dos animais com diferentes genótipos. As probabilidades obtidas para análise de variância para os efeitos dos

marcadores nas características de desenvolvimento ponderal estão apresentados na

Tabela 12.

O marcador E2JW apresentou efeito significativo entre seus genótipos para

PD (P<0,05) e CE (P<0,01). O marcador A59V apresentou efeito significativo entre

seus genótipos para GPS (P<0,05) e o marcador T945M apresentou efeito

significativo entre seus genótipos para GPS (P<0,01).

46

Tabela 11. Números de animais avaliados, média da característica, desvio

padrão, coeficiente de variação, valor mínimo e máximo das

medidas PD (peso à desmama), PS (peso aos 18 meses ou

sobreano), GPS (ganho de peso da desmama até os 18 meses

ou sobreano) e CE (circunferência escrotal aos 18 meses ou

sobreano)

Característica n m̂ σ̂ CV min max

PD (kg) 2.162 196,04 27,48 14,02 89,00 294,00

PS (kg) 2.154 322,20 47,08 14,61 162,00 510,00

GPS (kg) 2.151 126,77 32,54 25,67 25,90 338,70

CE (cm) 2.143 27,50 3,25 11,80 17,00 38,00

n = número de animais avaliados; m̂ = média da característica; σ̂ = desvio

padrão da característica; CV = coeficiente de variação da característica;

min = valor mínimo da característica; max = valor máximo da característica

Tabela 12. Valores de probabilidade associados aos efeitos dos

marcadores pela análise de variância para as

características PD (peso à desmama), PS (peso aos 18

meses ou sobreano), GPS (ganho de peso da

desmama até os 18 meses ou sobreano) e CE

(circunferência escrotal aos 18 meses ou sobreano)

Marcador PD PS GPS CE

E2FB 0,2381 0,7432 0,1244 0,5448

E2JW 0,0163* 0,2727 0,3407 0,0014**

A59V 0,9831 0,1116 0,0290* 0,5927

A1457G 0,8684 0,5475 0,3195 0,6569

C963T 0,2467 0,3797 0,1497 0,1891

UASMS1 0,2486 0,2553 0,2059 0,2325

UASMS2 0,3878 0,6226 0,8928 0,3694

T945M 0,5985 0,3226 0,0076** 0,9623

* diferenças significativas P<0,05; ** diferenças significativas P<0,01

47

A estimativa de média de quadrados mínimos e erro padrão dos efeitos dos

genótipos para os marcadores E2JW, A59V e T945M estão representados na tabela

13. O alelo T do marcador E2JW demonstrou ser favorável para PD e CE. Os

animais com genótipo heterozigoto AT foram 13% mais pesados para PD que os

homozigotos AA, considerando a estimativa de média de quadrados mínimos. O

alelo T do marcador E2JW também foi favorável para CE, sendo os animais

heterozigotos AT superiores em aproximadamente 16% para CE que os animais

homozigotos AA.

Tabela 13. Estimativas de médias de quadrados mínimos e erros padrão

associado aos efeitos dos genótipos dos marcadores que

demonstraram diferenças (P<0,05) entre seus genótipos para PD

(kg), GPS (kg) e CE (cm)

Marcador Genótipos PD ± EP GPS ± EP CE ± EP

AA 196,49 ± 0,63 b 29,41 ± 0,20 b E2JW

AT 221,67 ± 20,09 a_

34,00 ± 1,45 a

CC 134,18 ± 1,56 a A59V

CT _

108,77 ± 11,72 b _

TT 155,98 ± 4,64 a

CT 146,52 ± 1,98 b T945M

CC

_

144,02 ± 1,76 c

_

a,b,c Médias acompanhadas por letras diferentes na mesma coluna, para cada

marcador, diferem entre si (P<0,05); PD = peso à desmama; GPS = ganho de peso

da desmama até os 18 meses ou sobreano; CE = Circunferência escrotal aos 18

meses ou sobreano

As probabilidades associadas ao Teste F para os efeitos aditivo (α) e desvios

de dominância (δ), segundo os marcadores avaliados para as características PD,

PS, GPS e CE, bem como as particulares estimativas desses efeitos, encontram-se

nas Tabelas 14 e 15 respectivamente.

Verifica-se pela Tabela 14, que alelo T do marcador E2JW demonstrou ter

efeito de dominância para PD e CE. Para GPS, o alelo C do marcador A59V foi

48

associado significantemente ao incremento da característica em aproximadamente

23%, além de apresentar efeito significativo de dominância como representado na

tabela 14 e 15 (P<0,05). O marcador T945M também demonstrou associação

significativa para GPS, sugerindo que o alelo T seja favorável ao incremento da

característica (P<0,01), apresentando efeito aditivo para a característica.

Tabela 14. Probabilidades do Teste F associados aos contrastes dos efeitos aditivo (α)

e desvios de dominância (δ) dos marcadores para PD (peso à desmama),

PS (peso aos 18 meses ou sobreano), GPS (ganho de peso da desmama

até os 18 meses ou sobreano) e CE (circunferência escrotal aos 18 meses

ou sobreano)

PD PS GPS CE Marcador

α δ α δ α δ α δ

E2FB 0,0987 0,1755 0,8053 0,5996 0,2281 0,6743 0,4184 0,6681

E2JW - 0,0163* - 0,2727 - 0,3407 - 0,0014**

A59V - 0,9831 - 0,1116 - 0,0290* - 0,5927

A1457G 0,5963 0,7580 0,2730 0,4561 0,1322 0,3864 0,7047 0,3770

C963T 0,3447 0,7103 0,2806 0,1839 0,0692 0,1526 0,1751 0,0863

UASMS1 0,3440 0,6924 0,2967 0,1515 0,0774 0,1143 0,0997 0,1706

UASMS2 - 0,3878 - 0,6226 - 0,8928 - 0,3694

T945M 0,5525 0,9172 0,1726 0,3941 0,0084** 0,1052 0,7956 0,8616

- sem estimativa da probabilidade por ausência de um dos genótipos


** diferenças significativas P<0,01

49

Tabela 15. Efeito aditivo (α) e desvio de dominância (δ) e os erros padrão (EP)

associados dos marcadores que mostraram diferenças (P<0,05) entre

seus genótipos para PD (peso à desmama), GPS (ganho de peso da

desmama até os 18 meses ou sobreano) e CE (circunferência escrotal

aos 18 meses ou sobreano)

PD GPS CE Marcador

α ± EP δ ± EP α ± EP δ ± EP α ± EP δ ± EP

E2JW - 27,13 ± 11,29 - - - 4,59 ± 1,43

A59V - - - -25,40 ± 11,62 -

T945M - - -11,96 ± 4,52 ± -

As probabilidades associadas ao Teste F para o efeito médio de substituição

dos marcadores estudados para as características PD, PS, GPS e CE, são

apresentados na Tabela 16. Todos os marcadores foram testados para efeito médio de substituição,

através de uma equação de regressão linear ajustada aos genótipos de cada

marcador, considerando a quantidade de alelos favoráveis presentes no genótipo do

animal.

Na Tabela 16, observa-se que os marcadores E2FB, A59V e T945M

apresentaram significativo efeito de substituição para GPS (P<0,05). O marcador

E2JW apresentou significativo efeito médio de substituição para PD e CE (P<0,05).

Na Tabela 17 encontram-se as estimativas dos efeitos médio de substituição dos

marcadores que apresentaram efeito significativo (P<0,05). O marcador E2FB

apesar de não ter apresentado efeito na análise de variância, apresentou efeito

médio de substituição significativo, sendo o alelo C considerado favorável para

incremento no GPS. O marcador E2JW apresentou efeito médio de substituição

significativo para PD e CE, sendo o alelo T favorável ao incremento dessas

características. O marcador A59V apresentou efeito médio de substituição

significativo para GPS e o alelo C foi favorável para a melhoria da característica. O

marcador T945M apresentou efeito médio de substituição significativo GPS e o alelo

T foi significativo para o aumento da GPS (Tabela 17).

50

Tabela 16. Probabilidades do Teste F associados aos efeitos médio

de substituição dos marcadores para as características

PD (peso à desmama), PS (peso ao sobreano), GPS

(ganho de peso da desmama até os 18 meses ou

sobreano) e CE (circunferência escrotal aos 18 meses ou

sobreano)

Marcador PD PS GPS CE

E2FB 0,3083 0,5727 0,0457* 0,3098

E2JW 0,0163* 0,2727 0,3407 0,0014**

A59V 0,9831 0,1116 0,0290* 0,5927

A1457G 0,6651 0,4201 0,2155 0,8067

C963T 0,1028 0,6794 0,1858 0,5336

UASMS1 0,1050 0,4120 0,4144 0,6491

UASMS2 0,3878 0,6226 0,8928 0,3694

T945M 0,3133 0,2147 0,0054** 0,8270


**diferenças significativas P<0,01

Tabela 17. Estimativa de efeito médio de substituição (β1) e erro padrão

(EP) associado dos marcadores que mostraram diferenças

(P<0,05) entre seus genótipos para PD (peso à desmama),

GPS (ganho de peso da desmama até os 18 meses ou

sobreano) e CE (circunferência escrotal aos 18 meses ou

sobreano)

PD GPS CE Marcador

β1 ± EP β1 ± EP β1 ± EP

E2FB - 2,71 ± 1,35 -

E2JW 27,13 ± 11,29 - 4,59 ± 1,43

A59V - 25,40 ± 11,62 -

T945M - 3,22 ± 1,16 -

51

7. DISCUSSÃO

7.1. Freqüências genotípicas, gênicas e estimação da variabilidade genética da população

De um modo geral, as freqüências genotípicas e gênicas encontradas nesse

estudo divergem dos relatos encontrados na literatura consultada. O marcador E2FB

avaliado em 154 bovinos das raças Angus, Charolesa, Hereford e Simental

apresentou freqüência gênica para o alelo T de 0,46 (BUCHANAN et al, 2002). Um

estudo do marcador E2FB de Kononoff et al. (2005), em animais cruzados de raças

britânicas e continentais (sem nenhuma participação de raças zebuínas),

encontraram freqüências gênicas e genotipicas semelhantes a Buchanan et al.

(2002). Schenkel et al. (2005) encontraram freqüência gênica do alelo T para o

marcador E2FB de 0,42 e analisando as freqüências genotípicas detectou que as

mesmas estavam em de acordo com as proporções de HWE (P>0,05). Em estudo

de freqüência genotípica e gênica de bovinos das raças Hariana, Sawihal, Gir e

Nimari, todas raças zebuínas, detectou-se a ausência da mutação C→T

(CHOULDHARY et al, 2005). Nkrumah et al. (2004), relataram freqüências gênicas

de 0,48 para o alelo C e de 0,52 para o alelo T e a distribuição das freqüências

genotípicas estavam de acordo com as proporções de Equilíbrio de Hardy-Weinberg.

Estudo apresentado em 2006, Schenkel et al. (2006) relataram que as freqüências

gênicas em bovinos da raça Angus, Charolês, Simental, Limousin e seus

cruzamentos foram similares aqueles encontrados por Schenkel et al. (2005). Como

verificado, em nossos resultados, a raça Nelore, a maior representante de raças

zebuínas no Brasil, apresentou a existência da mutação C→T em alguns indivíduos

da raça, sugerindo a hipótese de que os resultados obtidos por Choudhary et al.

(2005) divergiram dos resultados encontrados no presente estudo, devido a

participação de matriarcas Bos taurus na formação da população zebuína nacional

(MEIRELLES et al, 1999). O alelo T (f(T) = 0,064) se apresenta em menor freqüência

do que em animais de raças européias de acordo com os estudos consultados. Em

52

nosso estudo, as freqüências genotípicas do marcador E2FB encontram-se de

acordo com as proporções do HWE.

Lagonigro et al. (2003), estudando o marcador E2JW em cruzamentos F1 de

vacas Holandesas e touros Charolês, encontraram freqüências gênicas de 0,06 para

o alelo T e 0,94 para o alelo A. Outro estudo relatou freqüências gênicas 0,04 para o

alelo T e de 0,96 para o alelo A, sendo que as freqüências estavam de acordo com

as proporções do teste de Equilíbrio de Hardy-Weinberg (SCHENKEL et al, 2005).

De acordo com os achados no presente estudo, o alelo A (f(A) = 0,999) se encontra

em maior freqüência que o alelo T, estando de acordo com a tendência mostradas

nos estudos citados acima, porém, de 1.931 animais genotipados da raça Nelore,

apenas três animais apresentaram um alelo T em seu genótipo, sugerindo que o

alelo A está praticamente fixado no rebanho estudado.

Estudo do marcador A59V, presente no exon3 do gene da leptina, em vacas

Holandesas apresentou freqüências gênicas para o alelo T de 0,25 e para o alelo C

de 0,75, porém não foi analisado o Equilibrio de Hardy-Weinberg (LIEFERS et al,

2002). Nkrumah et al.(2006) estudaram o marcador A59V em animais das raças

Angus, Charolesa e seus cruzamentos e verificaram freqüências gênicas para o

alelo T de 0,75 e para o alelo C foi de 0,25, sendo que as freqüências estavam de

acordo com as proporções do teste de Equilíbrio de Hardy-Weinberg. Na raça

Nelore, o alelo T (f(T) = 0,001) se mostrou com uma freqüência baixíssima quando

comparado ao alelo C, demonstrando divergência dos estudos realizados em gado

de raças de origem européia.

Liefers et al. (2005), estudando vacas Holandesas, relataram freqüência

gênica para o alelo A de 0,54 e para o alelo G de 0,46 do marcador A1457G,

demonstrando superioridade da freqüência gênica do alelo A para esse marcador,

como o encontrado em nosso estudo, porém, na raça Nelore o alelo A estava com

freqüência bem superior a encontrada no estudo com vacas Holandesas. Para o

marcador C963T, apresentou freqüência gênica para o alelo T de 0,33 e para o alelo

C de 0,87 (LIEFERS et al, 2005). Na raça Nelore, o alelo C tem maior freqüência

que alelo T, sendo que a freqüência do alelo C na raça Nelore é superior que em

animais da raça Holandesa, como demonstrado no estudo.

Nkrumah et al. (2005) relataram freqüências gênicas para o alelo T de 0,59

(rebanhos experimentais) e 0,48 (rebanhos comerciais) e para o alelo C a variação

53

foi entre 0,41 (rebanhos experimentais) e 0,62 (rebanhos comerciais) para o

marcador UASMS1. Para o marcador UASMS2, as freqüências gênicas para o alelo

T variaram de 0,21 (rebanhos experimentais) a 0,20 (rebanhos comerciais) e para o

alelo C a variação foi entre 0,79 (rebanhos experimentais) e 0,80 (rebanhos

comerciais). As freqüências genotípicas dos dois marcadores não apresentaram

desvios na distribuição de acordo com as proporções do teste de Equilíbrio de

Hardy-Weinberg.

No estudo de Schenkel et al. (2005) foram estudados os marcadores

UASMS1 e UASMS2 em animais das raças Angus, Limousin, Charolês, Simental e

seus cruzamentos. Para o marcador UASMS1, a freqüência gênica foi de 0,61 para

o alelo T e para o alelo C foi 0,39. Para o marcador UASMS2, o alelo T apresentou

freqüência gênica de 0,74 e para o alelo C de 0,26. As freqüências genotípicas dos

dois marcadores não apresentaram desvios na distribuição para o Equilíbrio de

Hardy-Weinberg.

Nkrumah et al. (2006) avaliando o marcador UASMS2, verificaram que a

freqüência gênica para o alelo T de 0,18 e do alelo C de 0,82. As freqüências

genotípicas desse marcador não apresentaram desvios na sua distribuição quando

comparados ao Equilíbrio de Hardy-Weinberg.

No presente trabalho o alelo T do marcador UASMS1 (f(T) = 0,978) é mais

freqüente que o alelo C em bovinos da raça Nelore, sendo superior a sua freqüência

em rebanhos da raça Nelore, quando comparados aos resultados descritos na

literatura em bovinos de raças européias. Este fato demonstra menor variabilidade

para o marcador UASMS1 em animais da raça Nelore do que em animais de raça

européia. Para o marcador UASMS2, a freqüência gênica do alelo T encontrada em

animais da raça Nelore é bem menor quando comparados aos estudos em animais

de raças européias, sendo que em animais da raça Nelore a freqüência gênica do

alelo T foi de 0,003, divergindo aos resultados apresentados em trabalhos com

animais de raças européias.

Liefers et al. (2004) avaliando vacas da raça Holandesa e o marcador T945M

relataram freqüência genotípica para genótipo CC de 0,93 e 0,07 para o genótipo

CT. Nenhum animal apresentou o genótipo TT, porém suas distribuições estavam de

acordo com as proporções do teste de equilíbrio de Hardy-Weinberg. No trabalho de

Schenkel et al. (2006) foi estudado o marcador T945M, citado como LEPR SNP, e

54

verificou-se que a freqüência gênica do alelo T foi de 0,04 e o alelo C foi de 0,96. De

acordo com os achados do presente trabalho, o alelo C é mais freqüente na raça

Nelore, porém as freqüências genotípicas e gênicas do marcador T945M são bem

mais equilibradas entre os genótipos e os alelos quando comparados aos resultados

encontrados pelos dois estudos citados acima.

Para o Teste para Equilíbrio de Hardy-Weinberg, associados as freqüências

genotípicas, os trabalhos citados acima que o utilizaram a metodologia do Teste 2χ (Qui-Quadrado), não encontraram desvios das proporções de Equilíbrio de

Hardy-Weinberg (P>0,05). Porém, na raça Nelore, quando utilizada essa

metodologia, os marcadores C963T (P=0,02) e UASMS1 (P=0,04) apresentaram

desvios das proporções de Equilíbrio de Hardy-Weinberg. Segundo Guo e

Thompson (1992), esse Teste não é ineficiente para populações pequenas ou no

caso, em que a freqüência de algum dos alelos é muito baixa, sendo que a restrição

do Teste 2χ é associada à freqüência observada de no mínimo 5 indivíduos para

cada genótipo, que no caso não acontece com os marcadores C963T e UASMS1

que apresentam apenas três indivíduos com genótipos menos freqüente. Nesse

caso, em particular, recomenda-se a utilização do Teste Exato de permutação para

verificação do Equilíbrio de Hardy-Weinberg (GUO; THOMPSON, 1992). Utilizando o

Teste Exato de Permutações, o desvio do Equilíbrio de Hardy-Weinberg não foi

observados para nenhum dos marcadores avaliados (P<0,05).

As estimativas de heterozigose e diversidade alélica são comumente

investigadas para estimar a extensão da variabilidade genética de uma população,

informação que contribui na seleção dos animais a serem empregados como

genitores nas próximas gerações (MARSON, 2005). Segundo Machado et al. (2003),

as informações da heterozigose e da diversidade alélica, aliado as freqüências

gênicas bem distribuídas faz com que um loco ou marcador seja um bom candidato

para ser usado em testes de paternidade e em análises de segregação. As

estimativas de heterozigose, diversidade alélica e PIC não foram encontradas em

nenhum dos estudos que avaliaram os marcadores estudados no atual trabalho.

Analisando a heterozigose e a diversidade alélica dos diferentes marcadores dentro

da raça Nelore podemos observar que a variabilidade para a maioria dos

marcadores é baixa, excluindo-se os marcadores A1457G e T945M que

apresentaram valores relativamente razoáveis. PIC é uma estimativa de

55

probabilidade de informação de um marcador para deduzir o genótipo dos

progentirores de uma determinada progênie.

Segundo os resultados obtidos no estudo, o marcador A1457G é

razoavelmente informativo para PIC, enquanto os outros são pouco informativos

devido ao PIC<0,25 (BOTSTEIN et al, 1980).

7.2. Análise de efeitos dos marcadores nas características avaliadas

O marcador E2FB apresentou associação com AOL, EGP e GPS para efeito

de substituição (P<0,05), porém não apresentou associação pela análise de

variância. Buchanan et al. (2002), em análise dos diferentes genótipos desse

marcador, relataram associação com níveis de mRNA da leptina e medidas de

gordura na carcaça pela análise de variância, sendo que o alelo T foi favorável para

ambas características avaliadas. Nkrumah et al. (2004) relataram diferenças

significativas entre os genótipos do marcador E2FB para ganho diário de gordura

subcutânea, grau de cobertura de gordura na carcaça, grau de rendimento de

carcaça e rendimento de cortes comestíveis. O alelo T se mostrou favorável para as

características de deposição de gordura e desfavorável para características de

rendimento de carcaça quando comparado ao alelo C.

Outro achado importante foi a verificação do desvio de dominância

significativo dos alelos favoráveis para todas as características que apresentaram

associação com o marcador E2FB (P<0,05).

Schenkel et al (2005) relataram que os genótipos do marcador E2FB

apresentaram diferenças significativas para rendimento de carne, rendimento de

gordura e escore de gordura, sendo que os alelos apresentaram efeito semelhantes

aos encontrados por Buchanan et al. (2002) e Nkrumah et al. (2004).

Em estudo recente com vacas multíparas das raças Aberdeen Angus e

Charolesa, o marcador E2FB sendo avaliadas as associações desse marcador à

média de ganho de peso diário e ao desempenho reprodutivo em vacas pós-parto.

Essa associação, porém, não foi verificado por Almeida et al (2007). Lusk (2007),

que estudou o efeito desse marcador nas curvas de crescimento e de deposição de

56

gordura, não verificou diferença significativa entre os genótipos de bovinos cruzados

em rebanhos comerciais.

De acordo com os resultados da análise do efeito médio de substituição do

marcador E2FB, onde o alelo T foi favorável para EGP (Tabelas 9 e 10) e GPS

(Tabelas 16 e 17), sendo que, na análise de variância, esse efeito não foi observado

(Tabelas 5 e 12). De acordo com as estimativas das análises de efeito médio de

substituição, cada alelo T presente no genótipo do animal pode aumentar a EGP em

aproximadamente 0,27 mm e o GPS em aproximadamente 2,71 kg. Para AOL o

alelo C foi favorável, sendo estimado aumento de aproximadamente 1,05 cm² para

cada alelo C presente no genótipo do animal. Os resultados obtidos diferem do

encontrado na literatura, considerando que os efeitos foram avaliados pela análise

de variância, porém esses efeitos descritos na literatura podem não ter sido

captados na análise de variância devido a baixa freqüência genotípica de TT,

aumentando o erro padrão estimado para esse genótipo, sendo captado efeito

apenas pelo efeito médio de substituição (análise de regressão linear).

O marcador E2JW apresentou efeito apenas para as características de

crescimento (PD e CE). Schenkel et al. (2005) relataram associação do marcador

com características de acabamento e rendimento de carcaça. Nesse estudo, não foi

encontrado efeito significativo do marcador E2JW para nenhuma das características

de precocidade de acabamento e rendimento avaliadas através do ultra-som (Tabela

9). Nenhum estudo de associação do marcador E2JW com características de

crescimento foi encontrado na literatura, sugerindo que esses são os primeiros

resultados apresentados de associação do E2JW com características de

crescimento, mais especificamente para PD e CE.

Liefers et al, 2002 verificaram que o marcador A59V, apresentou diferenças

significativas entre seus genótipos para concentração plasmática em vacas

Holandesas, principalmente durante a prenhez, sendo o alelo T favorável ao

aumento da concentração plasmática de leptina. Nkrumah et al.(2006) estudaram o

marcador A59V e verificou diferenças significativas entre os genótipos do marcador

para concentração plasmática de leptina, média de ganho de peso diário, medidas

de área de olho de lombo e gordura subcutânea por ultra-som em gado de corte das

raças Angus e Charolesa. Em animais da raça Nelore avaliados não foi observado

efeito do marcador A59V para características medidas pelo ultra-som, diferindo dos

57

resultados relatados por Nkrumah et al. (2006), porém foi encontrado efeito

significativo do marcador para GPS, sendo o alelo C favorável para essa

característica, divergindo do resultado citado na literatura. Isso sugere inversão dos

efeitos dos alelos na raça Nelore, quando comparado aos resultados em raças

européias. Esse efeito de inversão pode estar relacionado à interação genótipo

ambiente, porém maiores estudos devem ser realizados para esclarecer esse fato. O

fato de bovinos taurinos serem confinados logo após o desmama nos países frios do

hemisfério norte, onde a maioria dos marcadores foi descoberta, difere, e muito, dos

sistemas de produção brasileiros, onde o animal é recriado em condições de

pastagem, sofrendo os efeitos da seca num período crítico de seu crescimento, pode

alterar de forma drástica as rotas metabólicas envolvidas nos processos de

crescimento e terminação. Desta forma, discrepâncias entre as observações

relatadas na literatura e as encontradas neste trabalho podem ser justificáveis, mas

merecem estudos mais aprofundados.

Segundo Liefers et al. (2005), o marcador A1457G apresentou associação

significativa para concentração plasmática de leptina, sendo o alelo G favorável para

aumento da concentração plasmática.

Na presente pesquisa, o marcador apresentou efeito para EGS,

demonstrando efeito aditivo e de dominância significativos para a característica. O

alelo A estava relacionado ao aumento de EGS, sendo que os genótipos AA e AG

apresentaram médias de quadrados mínimos superiores aos animais com genótipo

GG. Considerando que a concentração de leptina está relacionada a maior

porcentagem de gordura corporal em bovinos (GEARY et al, 2003) e os resultados

apresentados por Liefers et al. (2005), então pode-se sugerir inversão dos efeitos

dos alelos na raça Nelore, quando comparado aos resultados encontrados em

animais de raças européias, possivelmente pelas diferenças nos sistemas de

criação. Animais que sofrem restrições alimentares, pela má qualidade das

pastagens tropicais no período de seca, podem se utilizar de outras rotas

metabólicas, com outros marcadores moleculares envolvidos ou até mesmo com

efeitos diversos dos relatados em Bos taurus.

O marcador C963T apresentou associação significativa para concentração

plasmática de leptina, sendo o alelo T favorável para aumento da concentração

plasmática, de acordo com Liefers et al (2005). Os resultados obtidos pelo estudo

58

com animais da raça Nelore demonstraram que o marcador C963T apresentou efeito

significativo para AOL na análise de variância, desvio de dominância e efeito médio

de substituição. Sendo o alelo T favorável para o aumento da AOL, sendo que o

alelo T apresentou efeito de dominância com relação ao alelo C. As estimativas do

efeito médio de substituição sugerem que cada alelo T presente no genótipo do

individuo pode aumentar aproximadamente 2,08 cm² de AOL.

Nkrumah et al. (2005) em estudo realizado com bovinos produtos de

cruzamentos de diversas raças de origem européia provindos de rebanhos

comerciais e experimentais relataram que o marcador UASMS1 apresentou efeito

significativo de diferença entre seus genótipos para peso corporal final e EGS

medidas por ultra-som, sendo o alelo T favorável para ambas características.

Também foi relatado efeito aditivo do alelo T para peso corporal final (P<0,01) e

efeito de dominância do alelo C para EGS (P<0,05). Em estudo realizado por

Schenkel et al. (2005), o marcador UASMS1 apresentou diferenças significativas

entre os seus diferentes genótipos para espessura de gordura subcutânea corporal.

Em ambos trabalhos o alelo T estava relacionado as características de deposição

gordura subcutânea e peso corporal final. De acordo com os resultados obtidos na

população avaliada de animais da raça Nelore, o marcador UASMS1 apresentou

efeito apenas para AOL, sendo o alelo C relacionado ao favorecimento da

característica, sugerindo que pela avaliação indireta de rendimento de cortes

comestíveis e de carcaça pela avaliação de ultra-som e considerando que a

quantidade de gordura na carcaça apresenta correlação negativa com rendimento

de cortes comestíveis, o marcador UASMS1 pode apresentar efeito para rendimento

de carcaça e de cortes comestíveis. Outro fato a ser considerado é o efeito de

dominância do alelo C para a característica AOL. Nkrumah et al. (2005) também

relatou efeito de dominância do alelo C para as características de peso corporal final

e EGS.

Em estudos publicados avaliando o marcador UASMS2, seus efeitos foram

significativos para diversas características de crescimento e precocidade de

acabamento (LUSK, 2007; NKRUMAH et al, 2005; NKRUMAH et al, 2006). Neste

estudo, o marcador UASMS2 não apresentou efeito significativo para nenhuma das

características avaliadas, porém o efeito pode não ter sido verificado devido a baixa

freqüência gênica para o alelo T encontrada no estudo.

59

Liefers et al. (2004), estudando o marcador T945M, relatou que os animais

heterozigotos CT apresentaram maiores concentrações plasmáticas de leptina

durante a prenhez que o homozigoto CC (P<0,05), sendo o alelo T favorável ao

aumento da concentração plasmática da leptina. No trabalho de Schenkel et al.

(2006) foi estudado o marcador T945M, citado como LEPR SNP, e verificou-se

associação significativa com escore de deposição de gordura subcutânea,

espessura de gordura subcutânea e rendimento de gordura de carcaça. De acordo

com os resultados apresentados na raça Nelore, o marcador T945M não apresentou

associação com nenhuma das características citadas na literatura, porém

apresentou efeito significativo para GPS. O alelo T apresentou efeito significativo na

análise de variância, efeito aditivo e efeito médio de substituição. Essa avaliação

permite sugerir que a seleção assistida por marcadores moleculares de animais

pode ser voltada para o alelo T do marcador T945M quando GPS está entre os

objetivos de seleção.

60

8. CONCLUSÕES

De acordo com os resultados apresentados foi verificada a presença dos

polimorfismos estudados em animais da raça Nelore, sendo que para os diferentes

marcadores foram encontradas as mesmas mutações descritas em animais de raças

européias. Porém, a variabilidade para a maioria dos marcadores é baixa, excluindo-

se os marcadores A1457G e T945M que apresentaram variabilidade relativamente

razoável dentro da população Nelore estudada. Apesar da pequena variabilidade, o

uso dos marcadores estudados apresenta grande potencial na seleção de animais

portadores de alelos favoráveis, podendo auxiliar significativamente o progresso

genético da raça Nelore para as características estudadas, já que a maioria dos

alelos favoráveis está em baixa freqüência na população estudada.

O estudo também demonstrou que a maioria dos marcadores estudados

presentes no gene da leptina e no gene do receptor da leptina apresentou

associação significativa para as características de crescimento e precocidade de

acabamento. O marcador E2FB apresentou associação com AOL, EGP e GPS na

análise de efeito médio de substituição, porém não apresentou associação

estatisticamente significativa pela análise de variância. O alelo T apresentou-se

favorável para EGP e GPS, sendo estimado que cada alelo T presente no genótipo

do animal pode contribuir com 0,27 mm de EGP e 2,71 kg para GPS. O alelo C

apresentou-se favorável para o aumento da AOL, sendo estimado que cada alelo C

presente no genótipo pode incrementar 1,05 cm2.

O alelo T do marcador E2JW apresentou associação favorável para PD e CE,

sendo que animais heterozigotos foram 13% mais pesados para PD e apresentaram

incremento de 16% para CE que animais homozigotos AA quando considerada a

estimativa de médias de quadrados mínimos.

O marcador A59V apresentou associação com GPS, sendo o alelo C

responsável pelo aumento de aproximadamente 23% da característica. Já o

marcador A1457G apresentou associação significativa com EGS, sendo o alelo A

responsável pelo incremento de aproximadamente 20% na característica. O alelo T

do marcador C963T apresentou associação favorável para AOL, sendo responsável

pelo aumento de aproximadamente 2,08 cm2 da característica. O marcador UASMS1

61

apresentou efeito significativo para AOL, sendo o alelo C favorável para o

incremento da característica. O marcador T945M associação significativa para GPS,

sendo o alelo T favorável para o incremento de aproximadamente 3,22 kg no ganho

de peso do animal.

A seleção de animais portadores de alelos favoráveis dos marcadores estudados

pode auxiliar fortemente a aceleração do progresso genético na raça Nelore. São

necessários estudos do efeito conjunto desses marcadores para essas

características, porém os resultados observados nesse estudo confirmam o

potencial de utilização dos marcadores moleculares estudados, via seleção assistida

por marcadores (SAM), em animais da raça Nelore. O uso desses marcadores

através da seleção assistida por marcadores de animais portadores de alelos

favoráveis pode impactar positivamente a cadeia produtiva de bovinos de corte em

todos os seus segmentos.

62

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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