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Scientia Chromatographica 2015; 7(1):31-52Instituto Internacional de Cromatografiahttp://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.015ISSN 1984-4433

PREPARO DE AMOSTRAS

Scientia Chromatographica 2015; 7(1) 31

ResumoAs micotoxinas são compostos produzidos por fungos, sendo potencialmente perigosos à saúde humana e animal. A Ocratoxina A (OTA) é uma das micotoxinas mais amplamente estudadas, sendo encontrada em várias matrizes, como cereais, vinho, especiarias, frutas secas, cerveja, etc. A concentração dessa micotoxina nos alimentos é geralmente muito baixa (da ordem de ng g-1), sendo, portanto, necessário o emprego de técnicas de preparos de amostras que realizem a purificação e pré-concentração no analito na amostra. Os métodos de separação e detecção empregados na análise de OTA também devem oferecer alta sensibilidade para adequada quantificação do analito. Dessa forma, esse trabalho discute as técnicas de preparo de amostra mais utilizadas na determinação dessa micotoxina em matrizes alimentícias, as quais são as colunas de imunoafinidade (Imunoaffinity Columns – IACs), Polímero Molecularmente Impresso no formato de Extração em Fase Sólida (Molecularly Imprinted Polymers – Solid Phase Extration, MIP-SPE), Microextração em Fase Sólida (Solid Phase Microextraction – SPME) e a Microextração Líquido-Líquido Dispersiva (Dispersive Liquid Liquid Microextraction – DLLME). Também é discutido os métodos separação e detecção comumente usados, sendo que para esse micotoxina a técnica mais utilizada é a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detecção de Fluorescência (High Performance Liquid Chromatography – Fluorescence Detection, HPLC-FLD).Palavras-chave: Ocratoxina A, alimentos, preparo de amostra, cromatografia líquida, fluorescência.

AbstractMycotoxins are compounds produced by fungus, being a potential danger to human and animal health. Ochratoxin A (OTA) is a mycotoxin widely studied, being found in a varied of matrices such as cereals, wine, spices, dried fruits, beer, etc. OTA concentration in food is generally low (the order of ng g-1) being, therefore, necessary the use of sample preparation techniques to perform the analyte purification and pre-concentration in the analyzed sample. The separation and detection methods used in OTA analysis also should offer high sensitivity in order to quantify the analyte adequately. Thus, this work discusses the most used sample preparation techniques to determining this mycotoxin in food, which are Immunoaffinity Chromatography (IACs), Molecularly Imprinted Polymers – Solid Phase Extraction (MIP – SPE), Solid Phase Microextraction (SPME) and Dispersive Liquid Liquid Microextraction (DLLME). The methods of separation and detection commonly used are also presented, and for this mycotoxin the most applied technique is High Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detection (HPLC-FLD).Keywords: Ochratoxin A, food, sample preparation, liquid chromatography, fluorescence.

Mariane A. Andrade Fernando M. Lanças*

Universidade de São Paulo, Instituto de Química de São Carlos13560-970 São Carlos (SP) Brasil* [email protected]

Recebido: 10-06-2015Aceito: 25-06-2015

Estado-da-arte na análise cromatográfica de Ocratoxina A em amostras de alimentosState-of-the-art in the chromatographic analysis of Ochratoxin A in food samples

Andrade MA, Lanças FM Análise cromatográfica de OTA

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1. IntroduçãoConsiderando sua vasta extensão territorial, solo

apropriado, clima adequado, e tecnologia de ponta o Brasil tornou-se, nas últimas décadas, um dos maiores produtores e exportadores de alimentos do mundo. Vanguarda na produção de vários alimentos de origem vegetal, consolidou-se também como um grande produtor de alimentos de origem animal, não apenas in natura como, igualmente, alimentos industrializados.

O consumo mundial de alimentos tem aumentado significativamente com o acelerado aumento da população. Atualmente, a China (nação mais populosa do mundo) e Índia (segunda mais populosa) já representam parcela significativa da população mundial (quase ¼ do total), com projeção de aumento significativo da mesma para as próximas 3 décadas – com possível inversão da “pole position” entre essas duas nações. Várias projeções baseadas em modelos científicos atuais sugerem que a população mundial neste período deverá ser próximo de 10 bilhões de habitantes. Não é difícil imaginar a quantidade de alimentos de origem vegetal e animal que deverá ser produzida para atender a demanda gerada por este aumento populacional.

Considerando as técnicas atuais de produção de alimentos em larga escala, conforme necessidade atual e projeção de aumento para o futuro próximo, não se antevê uma diminuição da necessidade de uso de agrotóxicos e de medicamentos veterinários para assegurar a produtividade necessária para alimentar a população mundial. Portanto, as melhores previsões não conseguem excluir e nem mesmo diminuir a necessidade destes agentes químicos nos alimentos, cujos resíduos podem levar a sérios problemas de saúde para os consumidores. Esta é uma das principais preocupações da área de alimentos atualmente denominada segurança alimentar (“food safety”).

Além das fraudes, adulteração deliberada com o intuito de tirar proveito econômico, os alimentos podem também apresentar ainda resíduos provenientes do uso de substâncias químicas como agrotóxicos e medicamentos

veterinários, entre outros, além de contaminações as quais podem aparecer surgir durante a produção do alimento, estocagem inadequada ou processamento industrial dos mesmos. Um exemplo que tem se tornado muito importante recentemente é um grupo de contaminantes denominados genericamente de micotoxinas, objetivo do presente trabalho.

As micotoxinas (mykes = fungo; toxicun = veneno) são metabólitos secundários de alguns fungos, de baixa massa molecular (~ 700 u), sendo uma potencial ameaça à saúde humana e animal quando alimentos contaminados com as mesmas são ingeridos, causando várias doenças e até morte[1,2]. A produção de micotoxinas pode ocorrer durante as fases de crescimento, colheita e estocagem de alimentos, podendo ser encontradas nos mesmos ainda que os fungos que as produziram sejam destruídos[2].

O homem é contaminado pelas micotoxinas principalmente pela ingestão de alimentos processados ou in natura contaminados podendo, também, ocorrer pela ingestão de carne, leite e ovos de animais que foram alimentados com ração contaminada[3]. Os principais alimentos fonte de micotoxinas são cereais, amendoim, castanhas, frutas secas, café, cacau, temperos, óleos de sementes, ervilhas secas, feijão. Além disso, são encontradas em frutas como maçã e em bebidas como cerveja e vinho, porque usam malte de cevada e cereais e uvas possivelmente contaminados, respectivamente[1]. Na Tabela 1 são apresentados os alimentos mais comumente contaminados por micotoxinas, seus fungos produtores e seus efeitos em homens e animais.

A produção das micotoxinas é dependente das condições ambientais como temperatura, atividade de água (a

w), substrato, pH, interação microbiana,

entre outras. A temperatura ideal para a produção de micotoxinas está entre a temperatura mínima e máxima para o crescimento fúngico, variando entre as espécies. Entretanto, alimentos provenientes de regiões tropicais e semi-tropicais apresentam altos níveis de contaminação, uma vez que o clima favorece o desenvolvimento de fungos toxicogênicos. As toxinas podem ser produzidas

Análise cromatográfica de OTA Andrade MA, Lanças FM

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):31-52 33

quando os valores aw variam entre 0,60 a 0,90 em

alimentos de umidade intermediária. Já os alimentos com maior pré-disposição à contaminação são aqueles com alto teor de carboidratos[2]. Os alimentos que são estocados por mais de alguns dias tornam-se alvo do crescimento desses fungos, tornando-os alimentos potencialmente contaminados[1]. Na Tabela 2 são apresentadas as condições ótimas de temperatura e a

w

para a produção de algumas micotoxinas.

As micotoxinas consideradas de maior risco a saúde humana e animal pela Agência Internacional de Pesquisa sobre Câncer (International Agency for Reseach on Cancer - IARC) são as Aflatoxinas (AFLA), a Ocratoxina A (OTA), a Zearalenona (ZON), o Desoxinivalenol (DON) e as Fumonisinas (FUMO)[2].

1.1. Ocratoxina AO grupo das Ocratoxinas compreende compostos

que apresentam uma β-fenilalanina ligada uma diidroisocumarina através de uma ligação amida. São elas a Ocratoxina A (OTA), a Ocratoxina B e a Ocratoxina C (Figura 1)[5].

Tabela 1. Principais micotoxinas com seus respectivos fungos produtores, substratos e seus efeitos no homem e animais[3].

Principais substratos Principais fungos produtores Principal toxina Efeitos

Amendoim e milhoAspergillus flavus

Aspergillus parasiticusAflatoxina B1

Hepatotóxica, nefrotóxica e carcinogênica

Trigo, aveia, cevada, milho e arroz

Penicillium citrinum Citrinina Nefrotóxica para suínos

Centeio e grãos em geral

Claviceps purpurea ErgotaminaGangrena de extremidades

e convulsões

Milho Fusarium verticillioides Fumonisinas Câncer de esôfago

Cevada, café e vinho

Aspergillus ochraceusAspergillus carbonarius

OcratoxinaHepatotóxica, nefrotóxica

e carcinogênica

Frutas e sucos de frutas

Penicillium expansumPenicillium griseofulvum

PatulinaToxicidade vagamente

estabelecida

Milho, cevada, trigo, aveia e centeio

Fusarium spMyrothecium spStrachybotrys spTrichothecium sp

TricotecenosT2, Neosolaniol

Fusanona x, NivalenolDeoxinivalenol

Hemorragias, vômitos e dermatites

Cereais Fusarium graminearum ZearalenonaBaixa toxicidade; síndrome da

masculinização e feminização em suínos

Tabela 2. Condições ótimas de temperatura e atividade de água (aw)

para a produção de micotoxinas[4].

Micotoxina Temperatura (ºC) aw

Aflatoxina 33 0,99

Ocratoxina 25-30 0,98

Fumonisina 15-30 0,9-0,995

Zearalenona 25 0,96

Deoxinivalenol 26-30 0,995

Citrinina 20-30 0,75-0,85

Figura 1. Estrutura Química das Ocratoxinas.

A OTA é produzida principalmente por fungos do gênero Aspergillus e Penicillium. A OTA foi detectada primeiramente em fungos da espécie Aspergillus



ochraceus, sendo que outras espécies no mesmo gênero também a produz, como o A. alliaceus, A. auricomus, A. carbonarius, A. citricus, A. ostianus, A. sulphureus, A. fonsecaeus, A. petrakii, A. glaucus, A. melleus e A. niger. Já o principal produtor de OTA nos fungos do gênero Penicillium é o Penicillium verrucosum[6]. Algumas espécies de fungos se desenvolvem preferencialmente em alguns alimentos específicos, como mostrado na Tabela 3. A ocorrência natural desses dois fungos é ampla, uma vez que esses crescem em variadas condições de substrato, pH, temperatura e umidade[1]. Porém os dois gêneros de fungos crescem em condições distintas. Em regiões de clima temperado, a OTA é mais produzida por fungos do gênero Penicillium, enquanto que em regiões de climas tropicais e subtropicais, os do gênero Aspergillus são mais responsáveis pelo aparecimento de OTA nos alimentos[7]. Na Tabela 4 são apresentadas as principais características dos fungos produtores de OTA.

Os alimentos mais facilmente contaminados por OTA são cereais e outros alimentos ricos em amido. A OTA também tem sido encontrada em amostras de café, temperos, frutas secas, cerveja e vinho, e em carne animal[1]. Os cereais são a maior fonte de contaminação

por OTA, sendo que 50% da ingestão humana diária

dessa micotoxina é devido ao consumo de derivados

de cereais. A segunda maior fonte de contaminação por

OTA é o vinho, o qual colabora com a porcentagem de

10-15% do total de OTA ingerido diariamente[1,9]. Em um

estudo realizado na União Européia nos anos de 1999 e

2000 foi verificado contaminação por OTA em 48% das

amostras analisadas, sendo que os alimentos com maior

grau de contaminação são mostrados na Tabela 5[6].

A especial estabilidade da OTA a altas

temperaturas e acidez faz com que sua presença em

alimentos a serem processados seja também preocupante.

Uma vez que o alimento está contaminado, é difícil a

remoção dessa micotoxina da matriz[5]. Estudos têm

mostrado que processo de lavagem de grãos de cevada

reduz em somente 2-3% a quantidade total de OTA

nos grãos. O processo de moagem tende a redistribuir

e concentrar as micotoxinas nos moinhos. Assim, um

teor mais alto de OTA foi encontrado em trigo, cevada

e outros cereais moídos. Durante o processo cervejeiro,

especialmente durante a fermentação, cerca de 20-30%

de OTA pode ser removida do mosto. Ao assar um

pão, cozinhar feijão sob pressão e a tostar café, todos

contaminados com OTA, há diminuição de cerca de 0,

84 e 13-93% da quantidade total da micotoxina presente,

respectivamente, nesses alimentos. Com esses dados

pode-se observar que a OTA mostra-se moderadamente

estável ao processamento, tendo sua concentração

reduzida somente em condições mais extremas (ex:

temperatura acima de 150 ºC)[10].

Tabela 3. Espécie de fungo responsável pela contaminação de diferentes alimentos[8].

Alimento Espécie de Fungo

Cereais P. verrucosum

Carne e Queijo P. nordicum

Uvas e Vinho A. niger e A. carbonarius

Café e Temperos A.ochraceus, A. niger e A. carbonarius

Figos A. alliaceus

Tabela 4. Principais características do fungos produtores de OTA[6].

Gênero Aspergillus Gênero Penicillium

Crescimento a temperaturas mais altas:A. ochraceus - 8-37ºC (Max 31ºC); aw até 0,77A. carbonarius - 32-35ºC; aw 0,82A. niger - 8-47ºC (Max. 37ºC); aw até 0,72Contaminante de café, uvas passasRegiões mais quentes e dos trópicos

Crescimento a temp. <30ºC (Max. a 20ºC)aw até 0,8; pH entre 6,0-7,0Contaminante de cereais armazenados e carneNorte e centro da Europa e Canadá



A toxicidade da OTA foi amplamente descrita em uma monografia da IARC (International Agency for Research on Cancer) em 1993, sendo classificada na classe 2B, como possível carcinogênico humano. O principal efeito já observado pela exposição por ingestão de OTA é o desenvolvimento de doenças nos rins, sendo ela sugerida como fator contribuinte para o desenvolvimento da Nefropatia Endêmica dos Balcãs (Balkan Endemic Nephropathy - BEN), doença crônica em que os rins são diminuídos de tamanho e peso, com difusa fibrose, e tumores no trato urinário[11]. Estudos também tem revelado uma conexão com a exposição de OTA e câncer no fígado, rins, glândulas mamárias e testículos em animais. A OTA também possui efeito neurotóxico, afetando várias áreas do sistema nervoso[12]. Além disso, efeitos imunotóxicos e teratogênicos já foram evidenciados em pesquisas. A carcinogenicidade em ratos foi observada com doses relativamente baixas (70 μg kg-1 de peso corporal). A teratogenicidade

foi verificada principalmente no sistema nervoso central, mas com concentrações muito superiores às normalmente presentes nos alimentos (1 mg kg-1). Podem ser observados efeitos imunotóxicos com concentrações relativamente baixas de OTA, na ordem dos ng mL-1. Concentrações na ordem dos 5 ng de OTA/kg de peso corporal originam imunossupressão em ratos[6].

Vários países tem estabelecido os níveis máximos de OTA em alimentos, incluindo o Brasil, Israel, Suíça, Uruguai e União Europeia. Os Estados Unidos ainda não determinaram os níveis aceitáveis de OTA em alimentos e sementes[13]. No Brasil, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) determinou através da Resolução RDC n º 7, de 18 de Fevereiro de 2011[14], os níveis de OTA em alimentos com aplicação imediata (2011) e para aplicação a partir de Janeiro de 2014. Já na União Europeia, os níveis máximos de OTA nos alimentos foi determinada pela Autoridade de Segurança Alimentar Europeia (European Food Safety Authority - EFSA) através da Comissão Reguladora EC nº 1881/2006, de 19 de Dezembro de 2006[15]. A EFSA também determina o valor de ingestão semanal tolerável provisória de OTA sendo igual a 120 ng kg -1 de peso corpóreo. Na Tabela 6 são compilados os níveis máximos permitidos para OTA em alguns alimentos no Brasil e na Europa.

Tendo em vista a importância do controle de OTA nos alimentos, os métodos de preparo de amostra, separação e detecção mais utilizados atualmente para a determinação dessa micotoxina serão discutidos nesse trabalho.

Tabela 5. OTA em diferentes gêneros alimentícios[6].

Presença de Ocratoxina A em diferentes gêneros alimentícios na União Europeia

Cereais e produtos à base de cereais 50%

Vinho 13%

Especiarias 8%

Cerveja 5%

Cacau 4%

Frutas secas 3%

Carne 1%

Tabela 6. Limites Máximos Tolerados (em μg kg-1) de OTA em alguns alimentos aceitos no Brasil e na União Europeia[14,15].

Alimento Brasil União Europeia

Cerais não processados 10,0 5,0

Derivados de cereais não processados 10,0 3,0

Frutas secas 10,0 10,0

Grão de café e café torrado 10,0 5,0

Café solúvel 10,0 10,0

Vinho e suco de uva 2,0 2,0

Alimentos à base de cereais para alimentação infantil (lactentes e crianças de primeira infância)

2,0 0,50

Cerveja, Cacau, Produtos com cacau Não determinado Não determinado



2. Métodos Analíticos para a determinação de Ocratoxina A em Alimentos

Um grande número de artigos tem sido publicado

todos os anos descrevendo a identificação de OTA em

diferentes alimentos e bebidas. Não diferente de outras

análises, um bom preparo de amostra se faz necessário

para análise de micotoxinas, uma vez que essas se

encontram em concentrações geralmente muito baixa

(da ordem de ng g-1) nas matrizes estudadas. Por isso,

métodos de preparo de amostra que realizem um bom

clean-up e concentração dos analitos são priorizados na

determinação desse tipo de contaminação. A escolha do

método de separação e detecção também é de extrema

importância para o sucesso da análise, pois esses devem

garantir sensibilidade adequada ao método para a correta

quantificação desses analitos.

A seguir são apresentados os principais métodos

de preparos de amostra, assim como os métodos de

separação e detecção mais comumente descritos na

literatura para a determinação de OTA em alimentos.

Destacam-se as micro técnicas de preparo de amostra

que estão em constante ascensão.

2.1. Preparo de Amostra

2.1.1. Colunas de Imunoafinidade

A técnica mais utilizada ainda hoje para o preparo

de amostra na determinação de OTA em alimentos

envolve coluna de imunoafinidade (Immunoaffinity

Columns – IACs)[16]. As IACs contém anticorpos

imobilizados que exclusivamente retém certa micotoxina,

ou classe de micotoxinas, através da ligação específica

entre o anticorpo e o analito[17,18]. Os anticorpos anti-

micotoxinas são imobilizados em um suporte sólido,

usualmente contido em um cartucho de plástico.

Passando a amostra através do cartucho, os anticorpos

imobilizados irão capturar os analitos de interesse,

extraindo-os e concentrando-os. Na etapa de lavagem,

as impurezas do extrato são removidas e um solvente

orgânico como, por exemplo, metanol é percolado pela

coluna, liberando os analitos de interesse na etapa de

eluição (Figura 2). Dessa forma, as IACs podem ser

usadas para a purificação e concentração de micotoxinas

antes da análise por técnicas cromatográficas ou outras,

como apresentado em trabalhos publicados, utilizando

fluorimetria[18-20].

Devido a sua alta especificidade, esse tipo de

preparo de amostra produz um extrato limpo, com

níveis mínimos de interferentes da matriz e excelente

relação sinal-ruído quando comparado a sorventes

menos seletivos de Extração de Fase Sólida (Solid Phase

Extraction – SPE)[17].

O uso das IACs oferece cromatogramas mais

limpos para a análise de OTA em cereais, uva passa e

grão de café verde, o que permite a quantificação da

ordem de ng g-1, enquanto que com o uso das colunas

multifuncionais, os cromatogramas apresentaram

múltiplos picos, muitas vezes eluindo na calda do pico da

OTA. Entretanto, quando o método original da Associação

Oficial de Químicos Analíticos (Association of Official

Analytical Chemists – AOAC) para a determinação de

OTA em grão de café verde (extração com clorofórmio

e retroextração com solução de bicarbonato) foi

Figura 2. Princípio de funcionamento da Imunoafinidade para o preparo de amostras de micotoxinas[18].



comparado com o uso das IACs, alguns pesquisadores

preferiram o método original. Nos testes houve alto grau

de contaminação e poucos benefícios das IACs foram

reconhecidos. Quando duas IACs comerciais foram

comparadas (Ochraprep® e OchraTest TM) para a análise

de vinho, a recuperação e precisão foram comparáveis

entre as duas e resultado quantitativo similar foi obtido

para amostras naturalmente contaminadas de vinho tinto

e branco. Também foi proposto que a Microextração em

Fase Sólida (Solid Phase Microextraction – SPME) é

mais simples e oferece maior custo-benefício que as IAC

para a análise de vinho, apesar de que com a SPME o

limite de detecção foi sete vezes maior que com a IAC e

os cromatogramas apareceram mais “sujos” que aqueles

apresentados pela IAC[19].

Uma das maiores desvantagens das IACs é

a desnaturação dos anticorpos imobilizados mesmo

na presença de solventes orgânicos em baixas

concentrações. Uma maneira de contornar esse problema

é a diluição de amostra, porém isso pode causar perda da

sensibilidade[21].

Algumas aplicações mais atuais das IACs

como preparo de amostra para a análise de OTA em

diversas matrizes (Tabela 7) evidenciam que as taxas

recuperação obtidas nas extrações são elevadas, o

que se faz necessário, uma vez que a quantidade

de OTA encontrada nos alimentos é baixa. Outro

fato interessante é que, apesar de as IACs poderem

ser fabricadas nos próprios laboratórios, a maioria

dos trabalhos publicados utilizam IACs comerciais,

mesmo considerando que detalhes das preparações são

apresentadas em artigos[19]. Além disso, a determinação

conjunta de OTA e Aflatoxinas tem ganho destaque,

uma vez já existe comercialmente disponível uma IAC

específica para esse fim.

Mesmo com a problemática envolvendo a

comparação das IACs com outros métodos de preparo

de amostra, e a crescente necessidade da análise de

multi-micotoxinas, elas ainda são muito utilizadas para a

determinação tanto da OTA como outras micotoxinas de

modo singular, por serem de utilização rápida e adequada

para a quantificação.

2.1.2. Polímero Molecularmente Impresso na Extração em Fase Sólida

A Extração em Fase Sólida (Solid Phase

Extraction – SPE) é também outra técnica bastante

Tabela 7. Algumas aplicações de IACs para a extração de OTA em alimentos nos anos de 2015 e 2014.

Matriz Recuperaçãoa (%) Marca Referência

Farinha de trigo 93.6 – 93-9 OchraTest™ [22]

Farinha de milho 92,2 – 93,7 OchraTest™ [22]

Farinha de arroz 94-1 – 95,3 OchraTest™ [22]

Especiarias 71,9 – 94-2 b AflaOchra HPLC™ [23]

Farinha de Castanha 94,4 Ochratest™ WB [24]

Vinho 93,4 – 95,1 Ochraprep® [25]

Cereais 89 – 110 c OchraTest™ [26]

Leite humano 70,6 – 76,9 AflaOchra HPLC™ [27]

Cereais 94,8 – 98,0 OchraTestTM WB [28]

Pólen de Abelha 78,5-82,6 ToxinFast® [29]

Café solúvel 96,5 Ochraprep ® [30]

Milho 85 – 90 AflaOchra-Test [31]

Café torrado e café instantâneo 68,49 – 99,28 OchraStar COIAC 2000 [32]apara diferentes níveis de spiking; bpara várias especiarias diferentes; c para cereais diferentes.



utilizada para a determinação de OTA em alimentos, seja

com a utilização de fases não específicas (fase normal,

fase reversa, troca iônica, etc.) ou fases mais específicas

como os materiais de Imunoafinidade e os Polímeros

Molecularmente Impressos (Molecularly Imprinted

Polymers – MIPs)[21].

As fases não específicas são mais usadas para

a determinação multi-micotoxinas, seguida da análise

por LC-MS/MS, onde um fator limitante da análise é a

seletividade do sorvente[21]. Leitner et al.[33] demonstrou

que o uso da fase C-18 combinada com a Espectrometria

de Massas para a extração de OTA em vinho ofereceu

bons resultados, com detecção de concentração sub-

ppb, que são comparáveis com a determinação de OTA

utilizando imunosorventes específicos.

Os MIPs são materiais sintéticos que possuem

sítios de ligação artificiais capazes de reconhecer

moléculas-alvo[21]. A síntese típica de um MIP utiliza

o modelo da molécula de interesse, monômeros

funcionais, agente de ligação cruzada e iniciadores

de polimerização. O método de impressão molecular

envolve a polimerização dos monômeros funcionais e

dos iniciadores de polimerização ao redor do modelo da

molécula de interesse[34] (Figura 3).

Tipicamente, um pequena quantidade de MIP

(15 – 500 mg em média) é empacotada em cartuchos de

polietileno ou polipropileno. Em seguida, realizam-se as

etapas de condicionamento, carregamento com amostra,

lavagem e eluição, sendo que o analito eluido já pode ser

introduzido no sistema analítico[36].

A principal vantagem que os MIPs tem a oferecer

para a SPE é uma significativa melhora na seletividade

da extração, uma vez que o sorvente fornece uma maior

retenção para o analito de interesse do que para o restante

dos compostos também presentes na amostra[36]. Além

disso, comparado com os anticorpos utilizados em IAC,

o MIP oferece alta estabilidade em altas temperaturas,

valores altos e baixos de pH e alta concentração de

solventes orgânicos. Porém, os MIPs comumente podem sofrer de efeito de memória, que acontece quando as etapas de lavagem não conseguem remover totalmente a molécula modelo do sítio de seletivo. Na determinação de analitos em baixas concentrações (nível de traços), esse efeito pode levar à erros na quantificação. Uma forma de evitar esse problema é o uso de uma molécula estruturalmente análoga ao analito de interesse, que não co-elui com com o analito de interesse durante a análise cromatográfica[37].

Jodlbauer et al.[38] sintetizou várias moléculas análogas da OTA e novos monômeros funcionais e testou diferentes solventes para obter um MIP com alta afinidade de ligação para a OTA em condição prótica polar. No trabalho seguinte[39], a aplicabilidade do MIP sintetizado foi testada como preparo de amostra para a análise OTA em vinhos tintos. Com a inserção direta da amostra no cartucho de MIP no formato SPE, baixos valores de recuperação foram obtidos (< 60 %). Por isso, foi necessária a remoção dos interferentes da amostra com uma prévia extração com C-18, o que melhorou a recuperação da extração pelo MIP (> 90%). Um teste com um Polímero Não Impresso (Non-Imprinted Polymer – NIP), mostrou que também houve retenção de OTA

Figura 3. Esquema genérico da síntese de um MIP: MF: Monômero Funcional; MM: Molécula Modelo; ALC: Agente de Ligação Cruzada; SS: Sítio Seletivo[35,36].



nesse material, evidenciando que a ligação específica da

OTA com o sítio seletivo não é responsável, nesse caso,

pela extração e concentração do analito.

Trabalhos publicados mais recentemente[40,41],

os quais utilizam o mesmo mimético da OTA como

molécula modelo e monômeros funcionais, diferentes

dos utilizados por Jodlbauer et al., mostram que a OTA

possui alta afinidade pelo MIP quando comparada

ao NIP, garantindo que existe ligação entre o sítio de

reconhecimento do polímero e o analito.

Já existe disponível comercialmente um MIP

no formato SPE para a determinação de OTA. Alguns

artigos retratam os resultados obtidos com a utilização

desse produto, evidenciando que o polímero é capaz de

reter a OTA nos sítios seletivos[42], com boa recuperação

e a reutilização dos cartuchos de 14[43] a 40[44] vezes

obtendo recuperação de até 80 %.

Na Tabela 8 são apresentados os trabalhos

publicados nos anos de 2012 a 2014 que utilizam MIP

no formato SPE feito nos próprios laboratórios, assim

como os que utilizam MIP comercialmente disponível.

Mesmo ainda com a grande utilização das IACs,

o MIP no formato SPE se mostra bastante interessante,

pois confere a especificidade necessária para a análise

de OTA em alimentos, aliada à vantagens que IACs

não podem oferecer, como alta reutilização e o uso de

solventes orgânicos.

2.1.3. Microtécnicas de ExtraçãoMesmo não sendo tão comuns para a análise

de OTA em alimentos, as microtécnicas de preparo de amostra vem ganhando bastante destaque nos últimos anos, por serem técnicas menos dispendiosas, mais simples e com consumo menor de solventes orgânicos. Por isso, destacamos as principais microtécnicas de preparo de amostra para a determinação de OTA.

2.1.3.1. Microextração em Fase SólidaA Microextração em Fase Sólida (Solid Phase

Microextration – SPME) é uma microtécnica de extração e concentração de analitos, que apresenta várias vantagens com relação aos métodos convencionais de extração, incluindo o rápido processo operacional, possibilidade de automação, reutilização das fibras extratoras e uso sem solventes orgânicos (em Cromatografia Gasosa) ou diminuta quantidade de solventes orgânicos (em Cromatografia Líquida) 45,46. O dispositivo básico de SPME consiste geralmente de uma fibra de sílica fundida de 10 mm de comprimento e de 110 a 160 μm de diâmetro, recoberta com polímeros sorventes ou sólidos adsorventes, com espessuras de 7 a 100 μm[46].

Existem outras configurações da SPME (Figura 4), como o uso de um segmento de um tubo capilar de Cromatografia Gasosa (Gas Chromatography – GC) associado a um sistema de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (High Performance Liquid Chromatography – HPLC), caracterizando o sistema de extração no tubo (in-tube SPME) (Figura 5).

Tabela 8. Algumas aplicações de MIP-SPE para a extração de OTA em alimentos nos anos de 2012 a 2014.

Matriz Recuperaçãoa (%) Marca Referência

Vinho 92 – 100 Home-made [40]

Trigo 92,1 – 94,3 Home-made [41]

Trigo 86,9 – 102,7 AFFINIMIP™ OTA [42]

Gengibre 87,6 – 94,5 AFFINIMIP® SPE OTA [43]

Cerveja 96,6 – 99,8 AFFINIMIP® SPE OTA [44]

Vinho 93,5 – 101,7 AFFINIMIP® SPE OTA [44]

Suco de uva 91,6 – 96,9 AFFINIMIP® SPE OTA [44]apara diferentes níveis de spiking.



Figura 4. Configurações da SPME[47].

Figura 5. Sistema in-tube SPME em ciclos aspirar/dispensar. a) Posição carregar (extração); b) Posição injetar (dessorção)[48].

A SPME baseia-se no processo de equilíbrio entre fases, tendo duas etapas: a partição dos analitos entre o recobrimento polimérico da fibra e a amostra, seguida pela dessorção do extrato concentrado dentro do instrumento analítico. No primeiro passo, a fibra recoberta é exposta dentro da amostra, o que faz com

que os analitos de interesse saiam da matriz e sejam absorvidos ou adsorvidos pelo polímero que recobre a fibra. No segundo passo, a fibra, tendo os analitos concentrados é transferida para um instrumento para dessorção, onde a separação e quantificação do analito ocorre[49].

A SPME é uma técnica de extração que apresenta inúmeras vantagens em relação às técnicas convencionais, das quais se destacam: fácil manipulação, elevada sensibilidade e reprodutibilidade, extração altamente seletiva, versatilidade, tempo de extração relativamente curto, não requerer etapas prévias de limpeza da amostra, permite que a análise seja facilmente automatizada em combinação com vários tipos de equipamentos como (GC, HPLC, LC-MS etc.)[50].

O primeiro trabalho sobre a determinação de OTA, simultaneamente com outros compostos, utilizando a SPME foi publicado em 2003[51] sendo, portanto, uma técnica recente. Na Tabela 9 são apresentados



os trabalhos publicados nos anos de 2006 a 2012 que utilizam SPME como preparo de amostra para a análise de OTA nas matrizes alimentícias.

A maioria dos trabalhos que utilizam SPME para a extração e pré-concentração de OTA usam a SPME convencional (fibra com recobrimento polimérico), sendo a fase extratora mais comum, nesse caso, a dimetilpolisiloxano/divinilbenzeno (PDMS/DVB)[52-54]. Existe somente um trabalho relatando o uso do sistema in-tube SPME no modo de operação em ciclos aspirar/dispensar, o qual utiliza uma coluna de GC do tipo tubular aberta com camada porosa (Porous Layer Open Tubular – PLOT)[55]. Nesse trabalho, também foram testadas colunas do tipo tubular aberta com parede recoberta (Wall Coated Open Tubular – WCOT), porém essas apresentaram menor recuperação do analito, por terem menor área superficial para a extração quando comparadas com a coluna PLOT.

Apesar de ser uma microtécnica de preparo de amostra bastante importante para análises ambientais, a SPME ainda não é muito utilizada para a determinação de OTA em matrizes alimentícias. O uso do MIP para SPME, seja na forma convencional ou in-tube, agregaria seletividade à todas as vantagens que a microtécnica oferece podendo tornar-se, no futuro, uma forma imbatível de preparo de amostra, tanto do ponto de vista analítico quanto ambiental, para esse tipo de determinação.

2.1.3.2. Microextração Líquido-Líquido DispersivaA Microextração Líquido-Líquido Dispersiva

(Dispersive Liquid Liquid Microextraction – DLLME)

é uma microtécnica de extração de pré-concentração de analitos a qual utiliza um solvente dispersor, miscível no solvente extrator (fase orgânica) e na amostra (fase aquosa), bem como um solvente extrator, imiscível na fase aquosa, sendo baseada em um sistema ternário de solventes[57].

O solvente dispersor e extrator são injetados rapidamente na amostra aquosa, formando finas gotas que são dispersadas na fase aquosa, formando uma nuvem, o que aumenta a área superficial onde ocorre a partição dos analitos. Desta forma, o equilíbrio é atingido rapidamente e a extração é quase instantânea, em uma só etapa, diferentemente da Extração Líquido- Líquido (Liquid Liquid Extraction – LLE). Depois da extração, a mistura é centrifugada e as finas gotas do solvente extrator se depositam no fundo do tubo, podendo ser injetados diretamente no sistema cromatográfico[57,58] (Figura 6). Como nessa microtécnica o volume do solvente extrator é bem menor do que o volume da amostra, o fator de pré-concentração é alto, sendo sua principal vantagem[58]. Além disso, atende aos requisitos de miniaturização, baixo custo, rapidez e eficiência de extração e com alto potencial para aplicação direta em campo[57].

Os primeiros trabalhos sobre a determinação de OTA em alimentos por DLLME começaram a serem publicados no ano de 2011[59], sendo, portanto, uma técnica muito recente. Na Tabela 10 são apresentadas algumas aplicações da DLLME nos anos de 2011 até o momento na análise de OTA em alimentos.

Na maioria das aplicações, o solvente extrator que apresentou o melhor resultado é o clorofórmio. Para

Tabela 9. Aplicações de SPME para extração de OTA em alimentos nos anos de 2006 a 2012.

Matriz Recuperaçãoa (%) Fase extratora Referência

Cerveja - PDMS/DVB [52]

Grão de café verde 92,8 % PDMS/DVB [53]

Vinho - PDMS/DVB [54]

Grãos e Castanhas > 80 % Carboxen-1006 PLOT (in-tube SPME) [55]

Queijo ~ 93 % Fibra de carbono [56]apara diferentes níveis de spiking.



Tabela 10. Aplicações da DLLME na determinação de OTA nos anos de 2011 até o momento;[HMIM][PF6] = Hexafluorofosfato de 1-hexil-3-

metilimidazol.

Matriz Solvente extrator (volume e/ou massa)

Solvente dispersor (volume)

Recuperaçãoa (%)*

Fator de pré concentração Referência

VinhoCHCl

3

(100 μL)Acetona(1,0 mL)

88 1,8 [59]

Vinho[HMIM][PF

6]

(100 mg)MeOH

(700 μL)81,3 – 94,2 5 [60]

Vinho de arroz[HMIM][PF

6]

(100 μL)EtOH

(1,0 mL)75,9 – 82,1 30 [61]

Uva passaCHCl

3

(200 μL)MeOH

(800 μL)68,6 – 85,2 b - [62]

Trigo, arroz e milhoC

2H

4Br

2

(150 μL)

MeOH(600 μL)

81,2 – 90,8 9 [63]

VinhoCHCl

3

(660 μL)ACN

(940 μL)91,7 – 98,1 5 [64]

Bebidas maltadasCHCl

3

(150 μL)Acetona(400 μL)

104,0 – 108,4 - [65]

a para diferentes níveis de spiking; b Recuperação intra e inter dias.

Figura 6. Diagrama simplificado das etapas da DLLME[57].

a injeção direta no sistema cromatográfico, o solvente extrator deve ser compatível com o mecanismo de separação sendo, no caso, incompatível com o mecanismo

de fase reversa[58]. No caso da análise da OTA, a maioria das publicações utiliza fase reversa, como será discutido adiante. Sendo assim, o extrato concentrado obtido



em clorofórmio pela DLLME não pode ser injetado diretamente no sistema cromatográfico, fazendo-se necessária a evaporação do solvente e sequente reconstituição em solvente adequado, geralmente na fase móvel.

Uma maneira de superar esse problema é realizando a DLLME em fase reversa (RP - DLLME), trocando o solvente extrator orgânico por água. Dessa forma, depois da centrifugação, a água se deposita no fundo do tubo, tendo os analitos pré-concentrados e purificados, podendo ser injetada diretamente no sistema cromatográfico. Uma desvantagem dessa forma de extração é o uso de maior quantidade de solvente orgânico; porém, ainda assim, em quantidade bem menor que técnicas convencionais, como a LLE[58].

Os Líquidos Iônicos (Ionic Liquids –ILs) começaram também a serem utilizados na DLLME na determinação de OTA em alimentos, substituindo os solventes extratores orgânicos clorados comumente utilizados, uma vez que são ambientalmente amigáveis[60]. Além disso, são compatíveis com o mecanismo de separação em fase reversa, sendo somente diluídos em solvente apropriado antes de serem injetados no sistema cromatográfico. Até o momento dessa publicação foram encontrados somente dois artigos utilizando a IL-DLLME paro o preparo de amostra visando a determinação de OTA em vinho e vinho de arroz[60,61], sendo que o último apresentou fator de concentração igual a 30.

Campone et al.[63] propuseram uma extração de OTA em cereais por DLLME controlada por pH em duas etapas. A OTA possui caráter ácido (pKa = 4,4) estando, portanto, ionizada em meio alcalino. Nessa condição, a solubilidade da OTA no solvente orgânico é diminuída e os interferentes da matriz (compostos hidrofóbicos) são concentrados no solvente extrator, caracterizando a primeira etapa. Na segunda etapa, o pH da solução aquosa é diminuído, deixando o analito na forma neutra, o que aumenta a sua solubilidade do solvente extrator orgânico, concentrando-o. Dessa forma, aumenta-se

a seletividade da extração e a sensibilidade pode ser

melhorada pelo aumento da relação matriz/solvente

na extração de matrizes sólidas. Com esse método,

os autores obtiveram boa recuperação e fator de pré-

concentração igual a 9.

Apesar de ser ainda uma microtécnica muito

recente na determinação de OTA em matrizes

alimentícias, a DLLME pode tornar-se substituinte de

métodos mais convencionais como a LLE, a qual utiliza

grandes quantidades de solvente, além de ser menos

laboriosa, uma vez que é realizada em somente uma

etapa e é de simples realização.

2.2. Método de Separação e Detecção

Dentre todas as técnicas cromatográficas

disponíveis hoje, a Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência (High Performance Liquid Chromatography –

HPLC) é a mais utilizada como ferramenta de separação

nas determinações de OTA em alimentos[16], sendo que

esse quadro, até o ano de 2014, não sofreu grandes

alterações[66]. Porém, é crescente o interesse na análise

de multi-micotoxinas, na qual a OTA também é inclusa,

além da grande variedade de alimentos que estão sendo

estudados como sorgo, vinho comum e vinho de arroz,

carne de porco e especiarias[66].

Nas aplicações das técnicas de preparo de amostra

apresentadas neste trabalho, a maioria das análises de

OTA por Cromatografia Líquida envolve o mecanismo de

separação em Fase Reversa. Para isso, a fase estacionária

comumente utilizada é a do tipo C-18[30,26,28,43], usada

em colunas empacatodas, que pode ser considerada

uma fase estacionária abrangente por ser utilizada para

a análise de variados compostos. Na técnica de HPLC,

o tipo de partícula mais usada nas aplicações estudadas

são esféricas porosas de 4 – 5 μm[22-25,27,30,32,40-42,44,53,55,56,59-

61,63,64]. As colunas do tipo superficialmente porosas[43]

(core-shell) e monolíticas[62,65] foram pouco utilizadas até

o presente, mesmo em trabalhos mais recentes, como os

utilizando a DLLME.



Figura 7. Ilustração das partículas porosas e superficialmente porosas e coluna monolítica.

As partículas do tipo superficialmente porosas, por terem o seu caminho de difusão diminuído, oferecem menor alargamento da banda, sendo bastante interessantes para a análise conjunta da OTA e outras micotoxinas. Para análises mais rápidas, as colunas monolíticas podem ser empregadas, uma vez que, com o aumento da permeabilidade, fluxos maiores de fase móvel podem ser utilizados, sem a perda de eficiência[67]. Na Figura 7 é apresentada uma ilustração das partículas porosas, superficialmente porosas, e monolitos utilizados na análise de OTA por HPLC.

Como fase móvel, geralmente é utilizada uma mistura de Água, Acetonitrila e Ácido Acético na proporção de 49,5:49,5:1 (v /v/ v)[26,42,61] respectivamente, tendo apenas pequenas variações. Essa proporção é utilizada quando a análise é realizada no modo isocrático, sendo necessária a realização de gradiente de eluição quando a OTA é determinada simultaneamente com outros compostos. A adição de ácido ou de tampão ácido deve ser realizada, pois a OTA é um ácido orgânico fraco, tendo valor de pKa igual a 4,4 e 7,5 para o grupo carboxílico e fenólico, respectivamente[52]. Dessa forma, para que haja adequada retenção do analito na fase estacionária, a OTA deve estar na sua forma neutra, o que ocorre em pHs menores que 4,4 (Figura 8).

Na Figura 9 é apresentado um gráfico com a distribuição das técnicas cromatográficas utilizadas nas aplicações apresentadas neste artigo associadas às técnicas de preparo de amostra (IACs, MIP-SPE, SPME e DLLME) empregadas na determinação da OTA.

Para a maioria das técnicas de preparo de amostras discutidas, a técnica cromatográfica mais utilizada é a HPLC, como esperado. Em técnicas mais recentes, como a SPME e a DLLME, o uso da Cromatografia Líquida de Ultra Alta Eficiência (Ultra High Performance Liquid Chromatography – UHPLC) ainda não foi descrito na literatura consultada. Porém, para técnicas de preparo de amostra mais consolidadas para a determinação de OTA, como as IACs e o MIP-SPE, a UHPLC foi utilizada, com partículas de fase estacionária apresentando diâmetro médio entre 1,7 e 1,9 μm[26,28,29,43]. Na técnica de DLLME, também fez-se uso da HPLC capilar, a qual oferece melhor resolução, limites de detecção mais baixos e menor consumo de solventes[60,64].

A UHPLC desenvolveu-se a partir do emprego de colunas com partículas de fase estacionária de tamanho menor ou igual à 2 μm (sub – 2 μm), baseando-se nos mesmos princípios de separação da HPLC. Com o uso de colunas com dimensões menores (5 – 10 cm



Figura 8. Equilíbrio ácido-base envolvendo a OTA.

Figura 9. Técnicas Cromatográficas mais utilizadas nos artigos apresentados como aplicações das técnicas de preparo de amostra até o momento, para as técnicas IACs, MIP-SPE, SPME e DLLME, respectivamente.

de comprimento e diâmetros internos de 1 – 2,1 mm),

recheadas com partículas de diâmetro sub – 2 μm, as

quais, juntamente com as altas velocidades lineares de

fase móvel aumentam a resolução e a detectabilidade,

diminuem o tempo das análises, porém geram um

aumento significativo na pressão cromatográfica. Por



isso, é necessário o uso de um equipamento adequado para operar em altas pressões (1000 bar ~ 15000 psi)[68]. Talvez esse seja um dos motivos pelas quais essa técnica foi pouco utilizada nas aplicações discutidas neste trabalho, além de já estar bem estabelecido que o uso da técnica HPLC é suficiente para a determinação da OTA em alimentos.

O uso HPLC capilar, a qual utiliza colunas de diâmetro interno de 0,15 e 0,5 mm, permite grande economia de solventes, uma vez que operam em fluxos baixos (abaixo de 10 μL/min), melhora a sensibilidade quando utilizada com detectores baseados em sensibilidade de massa (UV-vis, fluorescência e massas), acopla-se com o detector de massas sem a necessidade do uso da interface do tipo Electrospray, além de outras vantagens. Apesar de ser uma técnica que permite uma melhoraria na sensibilidade da análise, característica muito desejável para a determinação da OTA, ela exige uma instrumentação ainda menos robusta, compete com

técnicas similares de separação, como a eletroforese capilar, e possui um número limitado de aplicações prática[69]. Dessa forma, a HPLC capilar também mostrou-se pouco utilizada para a determinação de OTA nas aplicações apresentadas nesse trabalho.

O detector mais utilizado para a análise de OTA é o Detector de Fluorescência (Fluorescence Detector – FLD)[16,66], uma vez que ele é mais sensível, alcançando limites de detecção mais baixos que o Detector de Massas, sendo ainda de fácil operação e menor custo[70], tornando-se ideal para esse tipo de análise devido à baixa concentração de OTA encontrada no alimentos. Para a análise utilizando o FLD, o comprimento de onda de excitação e emissão utilizados são 333 e 460 nm[32,40,43,54], tendo somente pequena variação nesses valores. Já quando se utiliza o Detector de Massas, o valor de m/z utilizado é 404, referente ao íon[M+H]+. Para a análise utilizando o Detector de Massas no modo sequencial (MS/MS), os fragmentos analisados mais abundantes

Figura 10. Detectores mais utilizados nos artigos apresentados como aplicações das técnicas de preparo de amostra até o momento, para as técnicas IACs, MIP-SPE, SPME e DLLME, respectivamente.



são com valores de m/z igual a 358 e 239, referentes aos íons[M+H-fenilalanina]+ e[M+H-HCOOH]+[24,28,29,44,56,59].

Na Figura 10 é apresentando um gráfico com a distribuição dos detectores utilizados na aplicações apresentadas neste artigo para os preparos de amostra (IACs, MIP-SPE, SPME e DLLME) na determinação da OTA.

O FLD foi utilizado em todas as aplicações discutidas nesse trabalho como detector padrão, sendo que para a técnica DLLME o Detector de Fluorescência Induzida por Laser (Laser Induced Fluorescence – LIF) foi utilizado juntamente a HPLC capilar[60,64]. Poucos foram os trabalhos que utilizaram Detectores de Massas juntamente com as técnicas IACs, SPME e DLLME. Para os trabalhos que utilizam MIP-SPE, o Detector de Massas foi utilizada somente para confirmação dos resultados obtidos pelo FLD[43,44].

Brera et al. realizou um estudo comparativo na determinação de OTA em presunto curado utilizando as técnicas HPLC-FLD (método 1) e UPLC-MS/MS (método 2). No primeiro método, a extração da OTA foi realizada utilizando uma IAC e o no segundo, o extrato do presunto curado foi diretamente injetado no sistema cromatográfico. O dois métodos mostraram-se adequados para a determinação de OTA, porém o método utilizando a técnica HPLC-FLD apresentou limites de detecção e quantificação menores que os apresentados pela técnica UPLC-MS/MS, uma vez que a etapa de purificação pelo uso da IAC permitiu a separação entre o analito e os interferentes da matriz. O método 1 também mostrou melhores exatidão e precisão. Por outro lado, o método 2 apresentou a vantagem e ser mais rápido e mais barato, uma vez que não foi necessário o uso da IAC. O autor conclui que a técnica HPLC-FLD é a melhor para atividades de controle de OTA, por ser menos afetada pelo efeito de matriz e leva a menores limites de detecção e quantificação, enquanto que para pesquisa e estudos de monitoramento, o uso do espectrômetro de massas é mais indicado pela economia de tempo por análise[71].

O uso do detector de fluorescência é suficiente para a análise de OTA em alimentos de modo singular sendo, geralmente, acompanhada por um preparo de amostra eficiente, o qual permite a purificação e a pré-concentração da amostra. Quando utilizado um preparo de amostra eficiente, o uso do detector de massas não se faz necessário, uma vez que o detector de fluorescência oferece resultados adequados. Porém, quando o preparo de amostra não é altamente eficiente ou quando não se faz um preparo de amostra, o detector de massas tem papel fundamental para a correta identificação e quantificação do analito estudado. Também, o detector de massas é bastante importante quando a análise envolve multi-micotoxinas.

3. ConclusõesTendo em vista as técnicas de preparo de amostra

discutidas, as quais são técnicas consolidadas (IACs e MIP-SPE) ou não (SPME e DLLME) para a análise de OTA em alimentos, pode-se dizer que o método de separação e detecção mais largamente utilizado para tal é a HPLC-FLD. Mesmo sendo o Detector de Massas uma ferramenta poderosa, a fluorescência natural da OTA permite que ela seja detectada de forma adequada e eficiente por um equipamento mais simples e com sensibilidade necessária para a detecção da OTA em níveis muito baixos.

As técnicas miniaturizadas de preparo de amostras discutidas no presente trabalho apresentam grande perspectiva de utilização no preparo de amostras para análise de OTA. Dentre suas principais vantagens destacam-se a menor (ou nenhuma) quantidade de solvente, menor exposição do analista a solventes tóxicos, maior rapidez na análise, maior facilidade de automação e custo menor por análise. Entretanto, essas técnicas ainda não ganharam popularidade na área, apesar de existirem alguns trabalhos publicados empregando-as. Uma das possíveis razões é o fato de que algumas dessas técnicas foram desenvolvidas recentemente (última década) e ainda não possuem grande disseminação entre os analistas. Adicionalmente, como a área de segurança



alimentar é bastante regulada por guias e legislações, é

necessário um reconhecimento dos órgãos internacionais

da área para que os métodos novos propostos tenham

grande aceitação.

Situação similar ocorre com relação aos modos e

colunas cromatográficas e detectores. Em praticamente

todos os casos a análise de OTA nas mais diversas

matrizes tem sido executada através de cromatografia

líquida de alta eficiência (HPLC). Apesar da comprovada

superioridade de colunas mais contemporâneas como as

baseadas em partículas superficialmente porosas (“core

shell” ou similares), U-HPLC, monólitos e outras,

a análise de OTA ainda é quase que exclusivamente

efetuada, com raras exceções, empregando-se colunas

com partículas de diâmetro tradicional (usualmente 5

mícrons) empacotadas em tubos de diâmetro interno de

4 ou 4,6 mm. A detecção é efetuada, em praticamente

todos os casos, com o uso de um detector convencional de fluorescência. Espera-se que, com a divulgação de outras possibilidades e o espírito de investigação dos químicos analíticos de alimentos, em breve tanto a etapa de preparo de amostras quanto a de separação cromatográfica incorporem estas inovações já amplamente empregada em outras áreas, notadamente na de análise de fármacos em fluidos biológicos, por exemplo. Idealmente, que se faça a unificação dos dois procedimentos, com a utilização de métodos “on-line”, ou seja, preparo de amostra-análise cromatográfica. Mas esta é outra história, para o futuro.

AgradecimentosOs autores agradecem ao CNPq pela bolsa de

estudos para M.A.A. (Proc. 132224/2014-3), assim como o apoio financeiro da FAPESP (2014/07347-9) e CNPq (Proc. 307293/2014-9).

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