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OTIMIZAO DA PRODUO, CARACTERIZAO ENZIMTICA E

PURIFICAO DE QUERATINASES DE FUNGOS PROCEDENTES DO

SOLO, ESTOCADOS NA MICOTECA URM

MINELLI ALBUQUERQUE SOUSA

RECIFE

12/2011

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS

DEPARTAMENTO DE MICOLOGIA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM BIOLOGIA DE FUNGOS

OTIMIZAO DA PRODUO, CARACTERIZAO ENZIMTICA E PURIFICAO

DE QUERATINASES DE FUNGOS PROCEDENTES DO SOLO, ESTOCADOS NA

MICOTECA URM

Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao

em Biologia de Fungos do Departamento de

Micologia do Centro de Cincias Biolgicas da

Universidade Federal de Pernambuco, como parte

dos requisitos para a obteno do ttulo de Doutor

em Biologia de Fungos.

rea de Concentrao: Micologia

Nome do aluno: Minell i Albuquerque

Sousa

Orientador: Crist ina Maria de Souza

Motta

Co-orientadores: Ana Lcia Figueiredo

Porto; Adalberto Pessoa Jr.

RECIFE

12/2011

Catalogao na fonte Elaine Barroso

CRB 1728

Sousa, Minelli Albuquerque

Otimizao da produo, caracterizao enzimtica e purificao de queratinases de fungos procedentes do solo, estocados na Micoteca URM / Minelli Albuquerque Sousa- Recife: O Autor, 2011.

142 folhas: il., fig., tab. Orientadora: Cristina Maria de Souza Motta Coorientadores: Ana Lcia Figueiredo Porto e Adalberto Pessoa Jnior Tese (doutorado) Universidade Federal de Pernambuco. Centro de

Biocincias. Biologia de Fungos, 2011. Inclui referncias

1. Fungos filamentosos 2. Enzimas proteolticas 3. Biotecnologia I. Motta, Cristina Maria de Souza (orient.) II. Porto, Ana Lcia Figueiredo (coorient.) III. Pessoa Jnior, Adalberto (coorient.) IV. Ttulo

579.5 CDD (22.ed.) UFPE/CB-2017- 433

OTIMIZAO DA PRODUO, CARACTERIZAO ENZIMTICA E PURIFICAO

DE QUERATINASES DE FUNGOS PROCEDENTES DO SOLO, ESTOCADOS NA

MICOTECA URM

MINELLI ALBUQUERQUE SOUSA

Data da defesa: 20/12/2011

COMISSO EXAMINADORA

MEMBROS TITULARES

______________________________________________

Dra. Cristina Maria de Souza Motta (Orientador)

Universidade Federal de Pernambuco

_______________________________________________

Dra. Oliane Maria Correia Magalhes

Universidade Federal de Pernambuco

_______________________________________________

Dra. Keila Aparecida Moreira

Universidade Federal Rural de Pernambuco

_______________________________________________

Dra. Tatiana Souza Porto

Universidade Federal Rural de Pernambuco

_______________________________________________

Dra. Janete Magali de Arajo

Universidade Federal de Pernambuco

Vencers

No desanimes.

Persiste mais um tanto .

No cult ive pessimismo.

Centraliza-te no bem a fazer .

Esquece as sugestes do medo .

Avana, ainda que entre lgrimas .

Edif ica sempre.

No desista da pacincia .

No creia em realizao sem esforo .

Perdo as ofensas .

Estuda, buscando aprender .

Conserve o hbito da orao .

Rsguarda-te em Deus.

Ama sempre.

Age auxil iando. Serve sem apego.

E assim vencers.

Emmanuel

Psicografia de Chico Xavier

Agradecimentos

quele que esteve presente em todos os momentos especialmente os difceis, concedendo

oportunidade de aprendizado, revelando seu poder e sua glria a cada instante da minha vida: Deus.

Aos meus pais, Carlos Augusto Tavares de Sousa e Maria do Socorro Albuquerque

Sousa, pois sem este apoio eu nada seria.

As minhas irms, Mirelli Albuquerque Sousa e Camylla Karine Albuquerque Sousa,

pela ajuda, compreenso, carinho e incentivo fundamentais para a realizao desta dissertao.

Ao meu amor, Davi Rodrigo Lucena Silva, pela ajuda, compreenso, carinho, incentivo e

especialmente pela grande pacincia.

minha orientadora, Dra. Cristina Maria de Souza Motta e co-orientadores Dra. Ana

Lcia Figueiredo Porto e Dr. Adalberto Pessoa Jnior pela excelente orientao, dedicao,

compreenso e incentivo fundamentais para a realizao desta dissertao.

A professora Dr. Tatiana Porto, da Universidade Federal Rual de Pernambuco, Centro

Acadmico de Garanhuns, pelo apoio, ensinamentos e grande colaborao para realizao desta

dissertao.

A todos os professores do programa de ps-graduao em Biologia de Fungos da

Universidade Federal de Pernambuco, pelos ensinamentos passados e principalmente pela amizade

e incentivo durante toda a minha permanncia no Departamento de Micologia.

Aos meus queridos amigos do departamento, pela amizade, incentivo, fora e pelos

momentos de descontrao fundamentais para a realizao desta dissertao.

A Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES) pela bolsa de

doutorado concedida, ao Programa de Ps-Graduao em Biologia de Fungos (PPGBF), a Micoteca

URM da Universidade Federal de Pernambuco, a Fundao de Amparo Cincia e Tecnologia do

Estado de Pernambuco (FACEPE) e Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP) pelo apoio

financeiro.

RESUMO GERAL

Materiais queratinosos so insolveis e resistentes degradao por enzimas proteolticas comuns, tornando-

se importante o estudo de microrganismos produtores de queratinases para ser usado na indstria

biotecnolgica. O objetivo deste estudo foi selecionar fungos isolados do solo armazenados na Micoteca

URM, para ser empregado na sntese de queratinases extracelular, caracterizar as cepas quanto a capacidade

queratinoltica, efeito de diferentes substratos, da composio do meio e das condies de cultivo na

produo de queratinase em cultivo submerso, otimizara aproduo, caracterizar e purificar a enzima. Para a

determinao da capacidade de utilizar substratos queratinosos, 50 cepas fngicas foram utilizadas. Elas

foram cultivadas em fermentao submersa em meio contendo sais e penas durante 10 dias a 30 C em

agitador orbital a 120 rpm. Para avaliar a capacidade queratinoltica e o efeito de diferentes substratos na

produo da queratinase foram utilizadas as seguintes cepas: Aspergillus sulphureus URM 5029, A.

avenaceus URM5051, A. sclerotiorum URM5586 e Trichoderma aureoviride URM5574. Com a linhagem

que apresentou a melhor produo e o melhor substrato, foi realizado estudos do efeito da composio do

meio, condies de cultivo na produo da queratinase, otimizao da produo, caracterizao e purificao

da enzima. Aspergillus sulphureus, Trichoderma aureoviride, Aspergillus avenaceus e A. sclerotiorum

mostraram os melhores resultados com 7,35 U /ml, 7,2 U/ml, 6,7 U/ml e 6,05 U/ml de atividade

queratinoltica, respectivamente. As espcies testadas se destacaram na colonizao dos diferentes substratos

queratinosos e o melhor substrato para a produo de queratinase foi a pena de frango. A produo de

queratinase por A. sulphureus foi incrementada nas seguintes condies: 2 g/50 ml de pena de frango, 0,1

g/50 ml de NaNo3, 0,001 g/50 ml de CaCl2, pH 7,8, 35C, 160 rpm e 106 esporos/ml em cultivo lquido

submerso em 10 dias de incubao. A partir desses resultados foi realizado um planejamento fatorial

completo 24, para otimizar a produo da queartinase, e as melhores condies de produo foram: pH 8,0,

36 C, 120 rpm, 2,5% (p/v) de penas de frango em 10 dias, com a mxima atividade de 10,06 U/ml,

mostrando um aumento de 1,44 vezes. A queratinase de A. sulphureus apresentou melhor atividade em pH

10,0 e 35 C e pouco inibida na presena de ons metais (Co2+

, Mg2+

, Cu2+

, Zn2+

, Mn2+

, Ca2+

) e PMSF e

fortemente inibida por EDTA, sugerindo ser uma metaloprotease. As melhores condies para purificao da

queratinase de Aspergillus sulphureus, aps anlise estatstica, foram: massa molecular do PEG, 8000;

concentrao do PEG, 20% e concentrao de citrato 15%, apresentando aumento de pureza e recuperao

queratinoltica de 25,04 e 184,9%, respectivamente. Com base nos resultados, conclumos que a preservao,

sob leo mineral satisfatrio para manter a viabilidade e a taxonomia das culturas por longos perodos de

tempo e os microorganismos do solo podem ser uma interessante fonte de fungos produtores de queratinases.

Alm disso a capacidade da queratinase de A. sulphureus ser estvel em uma ampla faixa de pH (6,59,0) e

temperatura (2560 C) sugere o uso desta cepa em processos biotecnolgicos industriais.

Palavras-chave: queratinases, produo, purificao, fungos filamentosos.

ABSTRACT

Keratinous materials are insoluble and resistant to degradation by common proteolytic enzymes, making it

important to study keratinases producing microorganisms for use in the biotechnology industry. The aim of

this study was to select fungi isolated from soil stored in the URM Culture Collection, to be employed in the

synthesis of extracellular keratinases, characterize the strains and the ability queratinoltica, effect of

different substrates, the medium composition and cultivation conditions in the production of keratinase in

submerged culture, aproduo optimize, characterize and purify the enzyme. To determine the ability to use

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