ESQUISTOSSOMOSE MANSÔNICA

II — EVOLUÇÃO DOS NÍVEIS DE PROTEÍNAS SÉRICAS E DO PERFILELETROFORÉTICO POR TÉCNICAS DE IMUNOELETROFORESE QUANTITATIVA

Ajax Mercês Atta *Luiz Augusto Magalhães **Humberto de Araujo Rangel ***

ATTA, A.M. et al. Esquistossomose mansônica. II — Evolução dos níveis de proteínasséricas e do perfil eletroforético por técnicas de imunoeletroforese quantitativa.Rev. Saúde públ., S. Paulo, 15:194-204, 1981.

RESUMO: Camundongos Swiss foram infectados com 100 cercárias dalinhagem mineira (BH) do Schistosoma mansoni e sacrificados semanalmenteno período de 8 semanas de infecção. Os níveis de proteínas séricas totaisdestes animais não diferiram dos apresentados pelos animais controles. Osníveis de albumina sérica determinados por "Rocket immunoelectrophoresis"acharam-se diminuídos nas 5.ª, 6.ª e 7.ª semanas de infecção. O perfil obtido porimunoeletroforese cruzada revelou alterações em componentes séricos com mo-bilidade nas regiões de gama, beta e em menor grau de alfa-globulinas, apósa oviposição do parasito.

UNITERMOS: Schistosoma mansoni. Camundongos. Proteínas do sangue,eletroforese.

* Da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal da Bahia (Pós-graduando), edo Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biologia da UniversidadeEstadual de Campinas — Cidade Universitária Barão Geraldo — Caixa Postal 1409 — 13100— Campinas, SP — Brasil.

** Do Departamento de Parasitologia do Instituto de Biologia da UNICAMP — Cidade Universi-tária Barão Geraldo — Caixa Postal 1409 — 13100 — Campinas, SP — Brasil.

*** Do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biologia da UNICAMP— Cidade Universitária Barão Geraldo — Caixa Postal 6109 — 13100 — Campinas, SP— Brasil.

INTRODUÇÃO

Diversos autores estudaram as alteraçõesdos níveis de proteínas séricas e seu perfileletroforético tanto na esquistossomose man-sônica humana como experimentalmente emroedores de laboratório.

Fiorillo 5 (1954) foi o primeiro a utilizara técnica de eletroforese no estudo da pato-genia do S. mansoni em pacientes esquis-tossomóticos. Evans e Stirewalt4 (1957),utilizando camundongos infectados experi-mentalmente por S. mansoni, concluiram que

existiam modificações no per f i l eletroforé-tico obtido pela técnica de eletroforese empapel, nas regiões de gama e beta-globu-linas além de decréscimo relativo em albu-mina.

De Witt e Warren 3 (1959) observaramque os perfis eletroforéticos dos soros decamundongos infectados experimentalmentepor S. mansoni apresentavam as regiões degama e beta-globulinas aumentadas, en-quanto que pouca ou quase nenhuma modi-

ficação foi verificada na região de alfa--globulinas e albumina, devendo-se a in-versão da relação A/G ao aumento des-compensado das globulinas.

Kagan e Goodchild9 (1961) confirmaramos achados destes autores acrescentando aobservação de que em camundongos o au-mento das proteínas com mobilidade nasregiões de gama e beta-globulinas estavacorrelacionado com o aparecimento de anti-corpos contra cercárias do S. mansoni.

Sadun e Williams16 (1966) observaramque o aumento das proteínas séricas totaisse dava em camundongos esquistossomóticosa partir da 8.ª semana de infecção, assimcomo existiam modificações nas regiões degama, beta e alfa 2-globulinas. Segundoestes autores a inversão da relação A/Gtornava-se mais pronunciada com a evoluçãoda doença, particularmente nos soros dosanimais portadores de carga parasitáriaalta.

Hillyer e Frick 7 (1967) através de imu-noeletroforese observaram que os soros decamundongos com esquistossomose mansô-nica apresentavam aumento em IgG1 , IgA,IgM e IgG 2, sendo que esta última já seencontrava elevada na 6.ª semana de infec-ção. Fizeram estes autores alusão ao au-mento de uma alfa1-globulina rápidana 8.ª semana de infecção.

Utilizando eletroforese em acetato decelulose, Page e col.15 (1972) verificaramque as alterações nos níveis de proteínasséricas, na fase pré-postural de infecçõesintensas por S. mansoni em camundongos,faziam-se às custas do aumento em alfa 1,alfa 2, beta e gama-globulinas, existindotambém nos soros destes animais inversãoda relação A/G.

A utilização de técnicas de imunoeletro-forese quantitativa nas análises das pro-teínas séricas (Weeke 20,21, 1973) tem pos-sibilitado informações mais precisas dosníveis destas macromoléculas em diversosestados patológicos. Por outro lado, flutua-ções nos níveis séricos de imunoglobulinas

de camundongos, na ausência de infecçãoe associadas com a idade dos animais, foramverificadas por Kalpaktsoglou e col.10

(1973).Levando em consideração estas observa-

ções, o presente trabalho tem por objetivoverificar as possíveis alterações nos níveisdas proteínas séricas de camundongos in-fectados experimentalmente por S. mansoninos períodos pré e pós-postural da infecção,utilizando lotes de animais da mesma idadee técnicas de imunoeletroforese quantitativa.

MATERIAL E MÉTODOS

Animal experimental. Cento e sessentacamundongos Swiss de 30 dias de idadeforam utilizados no presente trabalho.Formaram-se 8 lotes de animais infectadosconstituídos de 5 machos e 5 femeas, lotesestes designados pela sigla In, correspon-dendo n à semana da infecção em que foirealizado o sacrifício.

Paralelamento foram utilizados comogrupo controle, 8 lotes constituídos, cadaum, de 10 animais não infectados (5 machose 5 femeas). Estes grupos foram identi-ficados pela sigla Cn. Como para os animaisinfectados, n correspondeu à semana dosacrifício.

Cercárias de Schistosoma mansoni. Nainfecção experimental dos camundongosforam utilizadas cercárias da linhagem mi-neira (BH) de S. mansoni procedentes deBiomphalaria glabrata.

Infecção experimental. Na infecção ex-perimental dos animais foi utilizada a téc-nica de imersão da cauda em suspensãocercariana de S. mansoni, usando-se 100cercárias por animal. O número de cercáriasque penetraram foi calculado através dométodo preconizado por Magalhães12

(1969).Obtenção e contagem de vermes. A carga

parasitária dos animais infectados por S.mansoni foi determinada pela contagem dosvermes obtidos através da perfusão do

sistema porta de acordo com Yolles 22

(1947) seguida pelo esmagamento do fígadoentre lâminas de vidro, segundo técnica deStanden19 (1953) e Hill 6 (1956). Os vermesobtidos foram separados e contados deacordo com o sexo, sendo aplicada a deno-minação de esquistossomulos para os vermesobtidos nas semanas iniciais de infecção enas quais não foi possível a identificaçãodo sexo em virtude do pouco desenvolvi-mento do aparelho reprodutor.

Soro de camundongo. Animais previa-mente anestesiados sofreram sangria brancapelo plexo vascular braquial. O sangueassim colhido foi deixado coagular à tempe-ratura ambiente e os soros obtidos foramreunidos em "pools" por lotes. Estes "pools"foram centrifugados durante 15 minutos a270 X g a 0°C, sendo posteriormente con-gelados a -20°C até a hora de sua utilização.

Dosagem de proteínas séricas. As pro-teínas séricas dos soros representativos dasdiversas semanas de infecção, oriundos dosanimais controles e infectados, foram deter-minadas pela reação com o biureto, segundoa técnica de Weichselbaun modificada porDittembrandt (Oliveira Lima e Dias daSilva14, 1970). Para a realização das do-sagens de proteínas utilizou-se uma curvapadrão traçada a partir de uma soluçãode soroalbumina bovina previamente dosadapelo processo de micro Kjeldahl segundoKabat e Mayer8 (1968).

Soro imune de coelho anti-proteínas sé-ricas de camundongo. Com a finalidade deobtenção de anti-soro anti-proteínas séricasde camundongo, um coelho albino de cercade 3 Kgs de peso corporal foi imunizadopor meio de injeções intramusculares de 10mg de proteínas obtidas de soro de camun-dongo, emulsionadas em igual volume deadjuvante completo de Freund. Decorridos30 dias, este animal foi imunizado nova-mente, por via subcutânea, com o antígenonas mesmas condições da primeira imuni-zação. Vinte e um dias após a segunda doseimunizante, o soro obtido deste animalapresentou, utilizando-se a técnica de Ouch-

terlony (Oliveira Lima e Dias da Silva14,1970), título de 1:32 frente a 500 micro-gramas do antígeno por ml. Nesta ocasiãoo coelho imunizado sofreu sangria branca.

Determinação dos níveis de albumina sé-rica. Os níveis de albumina sérica nos ca-mundongos infectados por S. mansoni e noscamundongos controles foram determinadosem triplicata através da técnica de "Rocketimmunoelectrophoresis" segundo Weeke 21

(1973). Volumes de um microlitro de umadiluição a 1:16 em tampão barbital-glici-na/tris (pH 8.6, força iônica 0.02) de"pools" de soros de animais controles einfectados foram submetidos à eletroforeseem agarose a 1% no referido tampão, con-tendo soro imune de coelho anti-proteínasséricas de camundongo na diluição de 1:35.

A eletroforese foi realizada usando-seuma diferença de potencial de 6 volts/cmdurante 3 h. Após revelação da placa ondese processou a eletroforese, os picos corres-pondentes à albumina tiveram suas alturasdeterminadas em milímetros. Como reveladorfoi utilizado Coomassie Blue a 0,1% emetanol-ácido acético.

Imunoeletroforese cruzada. Os soros doscamundongos infectados e dos animais dosgrupos controle foram analisados quanto aoperfil eletroforético, através da técnica deimunoeletroforese cruzada segundo Week 20

(1973).Em todos os procedimentos foram utili-

zados volumes de um microlitro de soro decamundongo e o soro imune de coelho anti--proteínas séricas de camundongo na dilui-ção de 1:35 em agarose a 1% em tampãobarbital-glicina/tris (pH 8.6, força iônica0.02). A utilização dos soros dos animaisinfectados e controles de uma mesma se-mana pós-infecção, em uma única placa,visou eliminar as possíveis variações decor-rentes do procedimento técnico usado paraa reação de imunoprecipitação.

As eletroforeses realizaram-se em pri-meira dimensão sob uma diferença de po-tencial de 8 volts/cm por 1 h enquanto que,em segunda dimensão, a diferença de po-

tendal utilizada foi de 6 volts/cm durante3 h. Como revelador foi ut i l izado CoomassieBlue na concentração de 0,1% em etanol--ácido acético.

Análise estatística. Para a avaliação dasdeterminações dos níveis de proteínas sé-ricas totais e dos níveis de albumina dosdiversos grupos de animais foi uti l izado oteste U de Mann e Whi tney 1 3 (1947).

RESULTADOS

Determinação da carga parasitária. Onúmero de cercárias penetradas, assim comoas médias dos vermes recuperados por per-fusão nas diversas semanas pós-infecção,são apresentados na (Tabela 1).

Através da referida Tabela observa-seque as médias das cercárias que penetraram

não difer i ram signif icat ivamente quandocomparados os lotes dos animais sacrifica-dos nas diferentes semanas. A carga para-sitária representada pelo número de vermestotais recuperados apresentou valoresmédios variáveis, tendo sido observado quesó a partir da 4.ª semana de infecção foipossível a identificação do sexo, apesar dapresença concomitante em alguns casos, deesquistossômulos e esquistossomos, revelan-do um assincronismo na maturação do S.mansoni.

Determinação dos níveis de proteínas sé-ricas totais. Os níveis de proteínas séricastotais nas semanas pós-infecção não dife-riram significativamente quando compara-dos os resultados das dosagens efetuadas

semanalmente com "pools" de soros dosanimais infectados e controles (Tabela 2).

A relação entre os níveis de proteínasséricas totais dos animais infectados econtroles (I /C), nas oito semanas que seseguiram à infecção, apresentou valorescompreendidos entre 0,9 e 1,15 (Tabela 2),sugerindo que o aumento na concentraçãode alguns componentes séricos foi compen-sado fisiologicamente, não se ref le t indo naconcentração proteíca sérica total.

Determinação dos níveis de albumina sé-rica. Os níveis de albumina sérica, deter-minados por "Rocket immunoelectrophoresis"em "pools" semanais de soros dos camun-dongos controles e infectados não difer i ramsignificat ivamente quando analisadas as oitosemanas.

Estudando a relação entre o nível dealbumina sérica dos animais infectados e oapresentado pelos animais controles, emcada semana isoladamente, verificou-se quehouve diminuição na concentração destaproteína nos soros dos animais infectadosnas 5.ª, 6a e 7.ª semanas (Tabela 3). Houveretorno aos níveis normais na 8.ª semanade infecção. Aparentemente a hipoalbumi-nemia observada nestas semanas de in fec -ção está associada com a oviposição doparasi to, sendo porém corr ig ida f i s io log ica -

mente pelo hospedeiro à medida que a in-fecção evolui .

Análise do perfil eletroforético. Os perf iseletroforéticos dos soros dos camundongosinfectados, determinados por imunoeletro-forese cruzada, quando comparados aos dosan imais controles apresentaram alteraçõesna concentração de alguns componentesséricos em função do tempo de infecção.

As alterações mais evidentes correrampor conta de qua t ro componentes, sendoque dois destes possuíam mobi l idade ele-

troforética na região de gama-globulinasenquanto que os outros dois migravam naregião de beta-globulinas. Com a finalidadede facilitar a observação dessas alterações,estes componentes foram arbitrariamentedesignados com os números 1, 2, 3 e 4,em ordem crescente de migração no sentidoanódico do campo elétrico em que se rea-lizou a corrida eletrofórética em primeiradimensão.

Na fase pré-postural da infecção por S.mansoni os componentes 1 e 2 apresenta-ram-se nas mesmas condições que os seuscorrespondentes nos soros controles nas 1.ª,2.ª e 3.ª semanas, notando-se porém umadiminuição destas proteínas na 4.ª semanade infecção (Figs. 1a,b,c,d). Os componentes3 e 4, estiveram aumentados nas 1.ª e 2.[semanas, retornando aos níveis normais apóseste período, com exceção do componente4 que registrou um novo aumento na 4.ªsemana de infecção (Figs. 1a,b,c,d).

Além do aparente desdobramento docomponente 4, observado tanto nos sorosinfectados como nos controles, a 5.ª semanaregistrou uma diminuição no componente 1da região de gama-globulinas e de formamenos evidente, modificações em algunscomponentes da região de alfa-globulinas(Fig. 2a).

Concomitante com o aparecimento degranulomas hepáticos, foi verificado umaumento progressivo dos componentes 1 e2 da região de gama e dos componentes 34 da região de beta-globulinas (Figs. 2b,c, d). Com relação à região de alfa-glo-bulinas alguns componentes estiveramaparentemente aumentados nas 6.ª e 7.ªsemanas de infecção (Figs. 2b,c).

Analisando isoladamente os perfis apre-sentados pelos soros controles nas diferentessemanas, foi verificado que os componentes1, 2, 3 e 4 apresentaram flutuações nos seusníveis no período de observação utilizado.

Provavelmente os componentes designadosarbitrariamente com os números 1, 2, 3 e 4

correspondem à imunoglobulinas não apenastendo-se em vista a mobilidade eletroforé-tica como também as modificações apresen-tadas durante a infecção. Considerando talhipótese, existiriam dois estímulos antigê-nicos ao nível humoral durante a infecção;o primeiro surgiria imediatamente após ainfecção do hospedeiro pelo S. mansoni edeterminaria um aumento nas imunoglobu-linas com mobilidade na região de beta-glo-bulinas; enquanto que o segundo estímulo,aparentemente mais efetivo, seria determi-nado pela presença dos ovos do parasitoe provocaria um aumento além das imuno-globulinas com mobilidade na região beta,de duas outras com mobilidade na regiãode gama-globulinas.

DISCUSSÃO

As alterações observadas em alguns com-ponentes séricos e o decréscimo do nívelde albumina nas 5.ª, 6.ª e 7.ª semanas deinfecção parecem ter sido compensadosfisiologicamente, pois a concentração dasproteínas séricas totais nos camundongosinfectados não apresentaram variaçõessignificativas. Aparentemente esta verifica-ção foi em decorrência da pequena cargaparasitária apresentada pelos camundongos,pois tem sido observado que o aumento naconcentração das proteínas séricas totaisse dá mais rapidamente nas infecções in-tensas (Sadun e Williams16, 1966; Pagee col.15, 1972).

A queda transitória verificada no nívelde albumina sérica dos camundongos infec-tados não está de acordo com o observadopor Evans e Stirewalt4 (1957) e De Witte Warren3 (1958). Kagan e Goodchild9

(1961) e Sadun e Williams16 (1966) veri-ficaram que o decréscimo na concentraçãoda albumina sérica de camundongos comesquistossomose mansônica ocorria simulta-neamente ao aumento das globulinas, tor-nando-se mais pronunciado com a evoluçãoda infecção.

Os níveis de albumina sérica nos trabalhosacima citados foram obtidos de forma in-direta, relacionando-se os resultados obtidospor eletroforese com as dosagens de pro-teínas séricas totais, não oferecendo por-tanto a sensibilidade apresentada pela imu-noeletroforese quantitativa cujo princípioreside numa reação antígeno-anticorpo.

Os resultados aqui apresentados concor-dam com a hipótese defendida por Smitherse Walker1 8 (1961) de que a h ipoalbumi-nemia esquistossomótica é transitória, cor-respondendo ao aumento temporário nocatabolismo desta proteína não compensadopelo anabolismo. Por outro lado, pareceimprovável que as lesões teciduais observa-das no fígado sejam responsáveis pelodecréscimo de albumina, pois desde a 1.ªsemana de infecção já são verificadas áreasde necrose neste órgão, como tambémgranulomas hepáticos continuaram a ocor-rer após esta proteína ter retornado aosníveis normais (At ta 1 , 1979).

A análise do perfil eletroforético revelouque as alterações ao nível das proteínasséricas, decorrentes da infecção de camun-dongos por 100 cercárias de S. mansoni,localizaram-se principalmente nas regiõesde gama e beta-globulinas além do já men-cionado decréscimo transitório da albumina.Provavelmente os componentes designadospelos números 1, 2, 3 e 4 são imunoglo-bulinas pois as modificações experimentadaspor estes componentes séricos equivalem àsobservadas por Bastos2 (1979) no seu es-tudo quantitativo das imunoglobulinas en-volvidas na resposta imune de camundongosao S. mansoni.

Aparentemente na fase pré-postural dainfecção, com exceção dos aumentos mode-rados e iniciais dos componentes 3 e 4 daregião de beta-globulinas, as modificaçõespatológicas não se exteriorizaram no perf i leletroforético. Possivelmente a diminuiçãona concentração dos componentes da regiãode gama-globulinas nas 3.ª e 4.ª semanas deinfecção não reflete um estado de imunode-

pressão e sim uma tolerância ao parasitoem nível humoral, que foi quebrada como advento da oviposição.

Os aumentos progressivos nos compo-nentes de gama e beta-globulinas nas 6.ª,7.ª e 8.ª semanas de infecção, provavelmentesão o resultado da formação de anticorpos,não só dirigidos contra os antígenos do ovodo S. mansoni como também para outrosestágios do parasito, o que tem sido con-f i rmado por Hillyer e Fr ick 7 (1967), Shere col.1 7 (1977) e mais recentemente porBastos2 (1979) trabalhando com os sorosdos animais utilizados no presente trabalho.

As variações observadas nos compo-nentes séricos das regiões de gama e beta--globulinas dos soros dos camundongoscontroles possivelmente representam flutua-ções fisiológicas normais, que são operadasnos níveis das imunoglobulinas de camun-dongos, conforme verificado por Kalpakt-soglou e col.10 (1973). Estas flutuações nosníveis destes componentes séricos eviden-ciaram a importância da utilização de ani-mais de mesma idade, em estudos que seproponham a avaliar os níveis séricos dasproteínas durante uma infecção.

As alterações observadas em algunscomponentes séricos da região de alfa-glo-bulinas nas 5.ª, 6.ª e 7.ª semanas de infecçãocoincidiram com as observações de outrosautores tais como Kagan e Goodchild9

(1961), Sadun e Williams 16 (1966), Hillyere F r i ck 7 (1967) e Lewert11 (1970). Apa-rentemente outros fatores, além dos danosteciduais provocados pelos ovos de S.mansoni, devem estar envolvidos na etiologiadestas alterações. Fortalece esta suposiçãoas observações de Page e col.15 (1972) deque o aumento destas proteínas séricas, emcamundongos portadores de carga parasi-tária alta, antecede a oviposição do S.mansoni.

Os resultados expostos evidenciaram aexistência de dois períodos durante a evo-lução da infecção pelo S. mansoni emcamundongos; um anterior e outro posterior

à oviposição. Aparentemente os estágiosevolutivos do parasito atuam de forma di-ferente sobre o sistema imune do hospedeiro,resultando desta atuação o estado de tole-rância humoral observado na fase pré-pos-tural da infecção e a hiperreatividade dafase pós-postural.

CONCLUSÕES

1. Os níveis de proteínas séricas totaisde camundongos Swiss infectados por100 cercárias da linhagem mineira deSchistosoma mansoni não diferiramsignificativamente quando comparados

aos apresentados pelos animais controlesno período de oito semanas de infecção.

Os níveis de albumina sérica dos ca-mundongos infectados, determinadospor imunoeletroforese quantitativa,acharam-se diminuídos nas 5.ª, 6.ª e 7.ªsemanas de infecção pelo S. mansoni.

A oviposição do S. mansoni provocaprofundas alterações no perfi l eletro-forético dos soros dos camundongosinfectados, observadas através dos au-mentos progressivos de componentescom mobilidade eletroforética nas re-giões de gama e beta-globulinas.

ATTA, A.M. et al. [Schistosomiasis mansoni. II — Evolution of the levels of serumproteins and of their electrophoretic pattern as traced by quantitative immunoelec-trophoresis]. Rev. Saúde públ., S. Paulo, 15:194-204, 1981.

ABSTRACT: Swiss mice were infected with 100 cercariae of the BeloHorizonte strain of Schistosoma mansoni and were sacrificed weekly duringeight weeks following of infection. The levels of serum protein totals in theseanimals did not differ from those presented by the control animals. However,serum albumin levels that were determined by rocket immunoelectrophoresiswere lower during the 5th, 6th, and 7th weeks of infection. The patterndetermined by crosed immunoelectrophoresis revealed alterations in serumcomponents with mobility in the gamma and beta regions and, to a lesserdegree, alpha-globulins, after oviposition by the parasite.

UNITERMS: Schistosoma mansoni. Mice. Blood protein electrophoresis.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. ATTA, A. M. Estudo sobre a evolução dainfecção de camundongos por Schistosomamansoni Sambon, 1907. São Paulo, 1979.[Dissertação de Mestrado — Instituto deBiologia da Universidade Estadual deCampinas].

2. BASTOS. O. C. Utilização de soros pluri--específicos no estudo da evolução dasimunoglobulinas envolvidas na respostaimune de camundongos ao Schistosomamansoni Sambon, 1907. São Paulo, 1979.[Tese de Doutoramento — Instituto deBiologia da Universidade Estadual deCampinas].

3. DE WITT, W. B. & WARREN, K. S. He-patosplenic schistosomiasis in mice. Amer.J. trop. Med. Hyg., 8:440-6, 1959.

4. EVANS, A. S. & STIREWALT, M. A. Sero-logic reactions in Schistosoma mansoniinfections. III. Ionographic fractionationof sera of mice with progressive disease.Exp. Parasit., 6:8-17, 1957.

5. FIORILLO, A. M. Estudo eletroforético dosoro de pacientes portadores de esquis-tossomose mansoni hepato-esplênica. Hos-pital, Rio de Janeiro, 45:647-51, 1954.

6. HILL. J. Chemotherapeutic studies withlaboratory infections of Schistosomamansoni. Ann. trop. Med. Parasit.,50:39-48, 1956.

7. HILLYER, G. V. & FRICK, L. P. Immuno-precipitins in Schistoma mansoni infec-tions. I. Mouse infections. Exp. Parasit.,20:321-5, 1967.

8 . RABAT, E. A. & MAYER, M. M. Immuno-quimica experimental. México, La PrensaMedica Mexicana, 1968.

9. KAGAN, J. G. & GOODCHILD, C. G. Paperelectrophoresis of sera from man and ex-perimental animals infected with varioushelminths. J. Parasit., 47:373-7. 1961.

10. KALPAKTSOGLOU, P. K. et al. The fiveclasses of immunoglobulins in normalC3H and BALB/c mice. J. Immunol.,24:303-14, 1973.

11. LEWERT, A. M. Schistosomes. In: Ja-ckson, G. J. et al., eds. Immunity toparasitic animals. New York, Appleton--Century Crofts, 1970. p. 981-1008.

12. MAGALHÃES, L. A. Técnica para a ava-liação da viabilidade de penetração decercárias de Schistosoma mansoni emMus musculus. Hospital, Rio de Janeiro,75:137-40,1969.

13. MANN, H. B. & WHITNEY, D. R. Ona test of whether one of two randomvariables is stochastically larger than theother. Ann. math. Statist., 18:52-4, 1947.

14. OLIVEIRA LIMA, A. & DIAS DA SILVA.W. Imunologia, imunopatologia e alergia.Rio de Janeiro, Ed. Guanabara-Koogan,1970.

15. PAGE, C. R. et al. Experimental prepatentschistosomiasis mansoni: quantitative

analyses of proteins, enzyme activity andfree amino acids in mouse serum. Exp.Parasit., 31:341-9, 1972.

16. SADUN, E. H. .& WILLIAMS, J. S. Bio-chemical aspects of Schistosomiasis man-soni in mice in relation to worm burdensand duration of infection. Exp. Parasit.,18:266-73, 1966.

17. SHER, A. et al. Schistosoma mansoni:kinetics and class specificity of hyper-gammaglobulinemia induced during mu-rine infection. Exp. Parasit., 41:415-22,1977.

18. SMITHERS, S. R. & WALKER. P. J. Serumprotein changes in monkeys infectedwith Schistosoma mansoni, with specialreference to the metabolism of albumin.Exp. Parasit., 11:39-49, 1961.

19. STANDEN, O. D. Experimental schistoso-miasis. III. Chemotherapy and mode ofdrug action. Ann. trop. Med. Parasit.,47:26-43, 1953.

20. WEEKE, B. Crossed immunoelectrophoresis.In : Axelsen, N. H. et al., eds. A manualof Quantitative immunoelectrophoresis.Oslo, Universitetsforlaget, 1973. p. 47-56.

21. WEEKE, B. Rocket immunoelectrophoresis.In: Axelsen, N. H. et al. eds. A manualof quantitative immunoelectrophoresis.Oslo. Universitetsforlaget, 1973. p. 37-46.

22. YOLLES, T. K. et al. A technique forthe perfusion of laboratory animals forthe recovery of schistosomes. J. Parasit.,33:419-26, 1947.

Recebido para publicação em 07/10/1980Aprovado para publicação em 08/12/1980