ENZIMAS

Glicose + O2 CO2 + H2O

Energia

Seres vivos usam energia provida do ambiente

Precisa ser catalisada para ocorrer de forma rápida

Os organismos vivos são capazes de extrair energia livre do ambiente e utilizá-la para manter suas funções

As reações químicas que devem atender duas exigências fundamentais:

• precisam ser altamente específicas de modo a gerar produtos definidos

• devem ocorrer a velocidades adequadas à fisiologia da célulaAs reações químicas são catalisadas

ENZIMAS

Quase todas as reações químicas que acontecem dentro das células só ocorrem em velocidade adequada porque são catalisadas.

Enzimas são catalisadores que aumentam a velocidade da reação de 5 à 17 ordens de grandeza.

Triose isomerase fosfato

Dihidroxiacetona fosfato

Gliceraldeido 3-fosfatoV= 4,3 x 10-6/s

V = 4300/s

Estrutura das enzimas

Quase todas as enzimas são proteínas, como tal sua função depende da sua estrutura. A estrutura da enzima dependerá da seqüência primária; secundária; terciária e quartenária.

A enzima é constituída por partes importantes:

Apoenzima – parte protéica de uma enzima

Sítio ativo – região que forma a maquinaria para a reação química de catálise, é constituída por grupo de aminoácidos.

Muitas enzimas necessitam de cofatores para sua atividade

Os cofatores podem ser divididos em dois grupos:

• Metais•Moléculas orgânicas (coenzimas)

HOLOENZIMA

Íons metálicos

Moléculas orgânicas

Coenzimas

Porção protéicaAPOENZIMA CofatorCofator

Quando o cofator está ligado fortemente a parte proteica da enzima ele é chamado de grupo prostético.

Anidrase carbônica

Classificação das enzimasAs enzimas são classificadas de acordo com o tipo de reação que catalisam.• Oxido-redutases – enzimas que catalisam reações de óxido-redução, transferência de elétrons.

lactato piruvato

lactato desidrogenas

e

• Transferases – catalisam a transferência de um grupamento de uma molécula a outra.

alaninaα-

cetoglutaratoL-

glutamato

piruvato

alanina aminotransfera

se

• Hidrolases – catalisam a reação de hidrólise de uma única ou várias ligações covalentes por introdução de uma molécula de água.

peptidase

• Liases – catalisam reações adicionando ou removendo grupamentos.

piruvato

acetaldeído

piruvato carboxilase

H2O

• Isomerases – catalisam reações transferindo grupos dentro da mesma molécula formando isômeros.

Fosfoglicose isomerase

• Ligases – catalisam reações que ligam 2 moléculas

+

Acetil-CoA

acetil CoA carboxilas

e

Como as enzimas funcionam?

A e B precisam colidir em uma orientação favorável

O complexo A+B precisam atingir um certo nível de energia necessário para que a reação ocorra: ENERGIA DE ATIVAÇÂO

A + B C + D

Enegia de ativação

As enzimas aceleram as reações pela facilitação da formação do estado de transição

As enzimas se ligam ao substrato de forma com que estes Se disponham na orientação correta

Estabiliza o estado de transição

Reduz a energia de ativação necessária para atingir o estado de transição

As enzimas aceleram as reações pela facilitação da formação do estado de transição

Como a energia de ativação é menor, um maior número de moléculas têm a energia necessária para atingir o estado de transição.

As enzimas só alteram a velocidade, não o equilíbrio da reação

S P

A primeira etapa da catálise enzimática é a formação do complexo enzima-substrato

O substrato se liga ao centro ativo da enzima. O centro ativo é uma fenda tridimensional que possui aminoácidos que participam diretamente na geração e quebra de ligações.

Os substratos se ligam à enzima por vários tipos de interações fracas

Modelos para explicar a formação do complexo Enzima-Substrato

Modelo chave e fechadura – o sítio catalítico é rígido e complementar à forma e ao tamanho do substrato.

Modelo encaixe induzido – o sítio catalítico não está totalmente pré-formado, a enzima se ajustaria ao substrato.

Formação do complexo ES

Mecanismos principais através dos quais as enzimas aceleram uma reação

Catálise Ácido-Base 

Catálise Covalente

Catalise por ion metálico

Catálise Ácido-Base – que ocorre com a participação de aminoácidos com cadeias laterais ionizáveis, capazes de doar ou liberar prótons durante a catálise para estabilizar os intermediários (H+, OH-).

Catálise Covalente – Neste tipo de catálise é formado uma ligação covalente transitória entre a enzima e o substrato.

Quimiotripsina

Catálise por íons metálicos – metais firmemente ligados ao sítio catalítico interage entre a enzima e o substrato estabilizando o estado de transição.

Cinética enzimática

A velocidade da reação pode ser medida por:•Quantidade de produto formado por unidade de tempo

•Quantidade de substrato consumido por unidade de tempo

Estudo das velocidades das reações enzimáticas bem como os fatores que as influenciam

V = - S/ t = P/ t

Cinética enzimática

Um dos principais fatores que alteram a velocidade de uma reação é a concentração de substrato.

Para: S PΚ

V = [S]Κ

Cinética enzimática

A concentração de substrato afeta a velocidade da reação

Como medir a influência do substrato na velocidade da reação?

Pela medida de V0 ou velocidade inicial

Para uma determinada [S] inicial, haverá um intervalo de tempo em que a velocidade da reação será relativamente constante, chamada de Vinicial, V0 ou simplesmente V da reação

V0 varia com a concentração de substrato

V0 sobe linearmente a medida que se aumenta a concentração de substrato, e então começa a se nivelar e se aproximar e um ponto máximo onde a velocidade não aumenta mesmo em concentrações maiores de substrato.

Velocidade a reação é proporcional a S

Substrato satura todasAs enzimas

A relação entre concentração de substrato e velocidade inicial da reação pode ser expressa algebricamente pela equação de Michalis e Menten.

Velocidadeinicial

Concentração substrato

Constante de

Michaelis

Efeito da concentração do substrato na velocidade inicial

E + S ES E + PK1

K -1

K2

V0 – Velocidade Inicial

Estado estacionário – [ES] constante

Então Formação de [ES] = Degradação de [ES]

E + S ES E + PK1

K -1

K2

Vo = K2 [ES] [Et]=[E] + [ES]

V de Formação de ES = K1 [E] [S] V de degradação de ES = K –1[ES] + K2 [ES]

Já que Formação de [ES] = Degradação de [ES]

K1 ([Et]-[ES]) [S] = K –1[ES] + K2 [ES] K1[S][Et] - K1[S][ES] = (K –1+ K2) [ES]

[ES] = [Et] [S] [S] + (K –1+ K2) / k1)

Km

Se, [ES] = [Et] [S] Se, V0 = k2 [ES]

Km + [S]

Então: V0 = k2 [Et] [S]

Km +[S]

Em V máxima [Et] = [ES]

Então V max = k2 [Et]

Sendo assim Vo = Vmax [S]

Km +[S]

Quando V0 = Vm 2

Km= [S]

Vm = 2

Vm . [S]

Km +[S]2 . [S]Km +[S] =

2 . [S] - [S] Km =

Uma propriedade importante:

Propriedades importantes de Km:

• É numericamente igual a [S] É numericamente igual a [S] na qual a velocidade da reação na qual a velocidade da reação é metade da Vmax.é metade da Vmax.• Característico de cada Característico de cada enzima.enzima.• Reflete a afinidade da enzima Reflete a afinidade da enzima pelo seu substrato.pelo seu substrato.Km = [S]

1[S]

1 v

-1Km

11VmaxVmax

Gráfico Linewevear-Burk

Linearizando a equação de Michaelis e Menten

Y = ax +b

Consequências importantes de Km

Km Afinidade da enzima pelo substrato

Km Afinidade da enzima pelo substrato

Vmáx

v

V/2

1/V

Km Km -1/Km -1/Km1/s[S]

pH– A ionização de aa pode provocar modificações na conformação

da enzima.

Pepsina pH ótimo 1,5Tripsina pH ótimo 7,7

Fatores que influenciam na atividade enzimática

• pH do meio esta alcalino;• concentração reduzida de

íons H+ no meio;• os aa liberam H+, ficando

eletricamente negativo.

• pH do meio esta ácido;• excesso de íons H+ no

meio;• os aa recebem H+,

ficando eletricamente positivo.

pHA ionização de aa pode provocar modificações na conformação da enzima.

• Temperatura– A velocidade de reação aumenta com o aumento de

temperarura, como se observa na maioria das reações químicas;

– Após atingir uma temperatura crítica,a estabilidade da proteína decresce devido a desnaturação térmica.

Fatores que influenciam na atividade enzimática

Temperatura ótima da reação

Fatores que influenciam na atividade enzimática

• Concentração da Enzima– A velocidade máxima da reação é uma função da quantidade

de enzima disponível (se há substrato em excesso ).

Reações enzimáticas com mais de um substrato

Sequencial (formação do complexo ternário)

Pingue-pongue ou duplo deslocamento

Reações enzimáticas com mais de um substrato

Inibição enzimática

Inibidores de enzimas são moléculas que interferem com a catálise diminuindo ou interrompendo as reações enzimáticas. Quanto ao tipo de inibição:• inibição inespecífica: diminuição da atividade de todas as enzimas por temperatura, pH ou agentes desnaturantes (ex. uréia).• inibição específica: agente inibidor diminui a atividade de uma enzima específica ou de um grupo restrito de enzimas. A inibição pode ser irreversível ou reversível.

Inibidores

Reversíveis

Irreversíveis Inib. Competitiva (freqüente)

Inib. Não-competitiva

Inib. Acompetitiva (quando o inibidor liga-se ao complexo ES , mas não a enzima livre)

Inibidor irreversível: liga - se a enzima levando a sua inativação definitiva

1

Exemplo: Inibição de Cisteino peptidases por iodoacetamida

Inibidor Competitivo: Inibidor compete com o substrato pelo mesmo sítio de ligação à enzima

•Km aumenta, mas Vmáx não é alterada.

•É necessário de [S] maior para deslocar o inibidor.

Inibidor Não-Competitivo: Inibidor se liga numa região deferente do sítio de ligação do substrato.

•Vmáx diminui, mas o Km não é alterado.

•[S] maior não diminui a inibição.

Inibidor acompetitivo: O inibidor se liga somente no complexo ES em sítio próprio.

•Inibidor não possui semelhança estrutural com o substrato.•Km e Vmáx da enzima diminuem.

Analgésicos

•Inibidor irreversível Ligação covalente

Ácido acetil salicílico

•Inibidor competitivo e reversível

Interações sem ligação covalente

Ácido mefenâmico

Sítio Ativo da Ciclooxigenase

Inibidores Competitivos de proteases do vírus HIVGag e Pol são clivados pela protease do vírus HIV em 9 pontos específicos para produzir proteínas funcionais. O precursor Gag vai originar proteínas estruturais e o precursor Pol vai originar enzimas como transcriptase reversa, integrase e proteases.

Amprenavir

Regulação da atividade enzimática

Alostérica: Funcionam através da ligação não-covalente e reversível de um metabólito regulador (modulador)

Covalente: Regulação da atividade enzimática por modificação covalente reversível

Proteolítica: O precursor inativo (zimogênio) é clivado para formar a enzima ativa

Um organismo regula a atividade de algumas enzimas para coordenar seus processos metabólicos

Regulação alostérica

enzimas alostéricas

•São maiores e mais complexas, possuem duas ou mais cadeias polipeptídicas.•Não obedecem a cinética de Michaelis-Menten.•Tipos de enzimas alostéricas: homotrópica (modulador é idêntico ao substrato); heterotrópica (modulador é diferente do substrato)

Um modulador alostérico pode ser tanto um inibidor quanto um ativador.

Fosfofrutokinase 1 (PFK-1)

A B C D E

-

Feedback negativo

Coordena o fluxo de enzimas por uma via metabólica.

Regulação por modificação covalente

Ex: Fosforilação, acetilação, ubiquitinação, etc

Fosforilação – Regula inúmeros processos metabólicos ativando enzimas chaves das vias metabólicas.

Glicogênio fosforilase

Ativação proteolítica

Aplicações das enzimasSetor industrial –

Saúde – são usadas para detectar algum tipo de doença, ou dano tecidual, ou como marcador de exames.

Infarto do miocárdio

Saúde: Algumas doenças são causadas pela falta de enzimas (ex. fenilcetonúria; intolerância a lactose).

Fenilcetonúria

acumula

FenilcetonasTÓXICAS

Atraso no desenvolvimentoMicrocefaléiaConvulsões

Saúde: Algumas doenças são causadas pela falta de enzimas (ex. fenilcetonúria; intolerância a lactose).

Intolerância a lactose

Não é degradada

Fermentadas porBactérias intestinais Gases

Diarréia