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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

Laboratório de Neuroanatomia e Neuropsicobiologia

ENVOLVIMENTO DE RECEPTORES OPIÓIDES µ1 E DAS

REDES NEURAIS DO COLÍCULO INFERIOR

NA ANALGESIA PÓS-ICTAL

Tatiana Tocchini Felippotti

Dissertação apresentada ao Departamento de Neurologia,

Psiquiatria e Psicologia Médica da Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São

Paulo (USP), como requisito para a obtenção do grau de

Mestre em Ciências Médicas.

Área de Pós-graduação: Neurologia.

Ribeirão Preto – SP

2005

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

Laboratório de Neuroanatomia e Neuropsicobiologia

ENVOLVIMENTO DE RECEPTORES OPIÓIDES µ1 E DAS

REDES NEURAIS DO COLÍCULO INFERIOR

NA ANALGESIA PÓS-ICTAL

Tatiana Tocchini Felippotti

Dissertação apresentada ao Departamento de Neurologia,

Psiquiatria e Psicologia Médica da Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São

Paulo (USP), como requisito para a obtenção do grau de

Mestre em Ciências Médicas.

Área de Pós-graduação: Neurologia.

Orientador: Prof. Dr. Norberto Cysne Coimbra

Ribeirão Preto – SP

2005

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Dedicatória

Dedico aos meus pais, Sidnéa e André e,

à minha irmã, Giovanna.

Que foram os meus primeiros mestres.

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“A mente de um indivíduo, uma vez desenvolvida por uma idéia nova, nunca recupera suas

dimensões originais.”

Oliver Wendell Holmes

“Golpe a golpe, passo a passo, Caminhante, não há caminho, o caminho é feito ao andar.

Andando, se faz o caminho e se você olhar para trás tudo que verá são as marcas de passos que

algum dia seus pés tornarão a percorrer. Caminhante, não há caminho, o caminho é feito ao

andar.”

Antônio Machado

5

AGRADECIMENTOS

� A Deus, pelo dom da vida.

� Aos meus pais, Sidnéa e André, pela vida, pela luta dia-a-dia, por ensinar a superar os

limites e por acreditarem em mim.

� À minha irmã, Giovanna, pela nossa união, amizade e cumplicidade.

� Aos meus avós (in memorian), pela simplicidade e por fazerem de nós, pessoas saudáveis.

� Ao Prof. Dr. Norberto Cysne Coimbra, pela orientação e, pela preocupação e dedicação em

fazer de nós pesquisadores, o que me faz ter muito orgulho de ser sua aluna.

� À tia “Morena” (Shirlene), pelo carinho, que junto com minha mãe, são meus maiores

exemplos de mulheres fortes, dedicadas e determinadas.

� Ao tio “Samu” (Samuel), por ser presente em nossas vidas com sua generosidade.

� Aos meus primos, Fellipe e Fabíola, pelo carinho que me é muito importante.

� Às minhas “paixões”: Pity, Bobby e Pingo, por me receberem com alegria todos os dias.

� À tia Heloísa, pelas orações.

� Aos professores do Curso de Biologia do Centro Universitário Barão de Mauá, em especial,

aos Profs. Abbud e Fernando, pela colaboração na agilização do certificado de conclusão

de curso, o que possibilitou minha matrícula na pós-graduação.

� Aos amigos do LNN (Laboratório de Neuroanatomia e Neuropsicobiologia): Andressa,

Renato, Daoud, Rithiele, Célio, Ricardo, Tati Paschoalin, Valéria, Raquel, Priscila, Juliana,

Fabrício, Leonardo, Valdir, Walter e Gabriel, pela amizade, pelas brincadeiras e boas risadas

que tornaram o ambiente mais agradável, e pelo auxílio na realização desse trabalho,

6

cada qual à sua maneira. Em especial, aos amigos: Renato, pela consideração ao iniciar

minha caminhada científica e, Andressa, que além de sua amizade e auxílio, foi o meu

porto seguro, por me encorajar em todos os sentidos.

� Aos amigos da “Força Metra”: Elynton, Rodolfo, Viviana, Vanessa Kataguiri, Guilherme,

Cleber e Luís Carlo, pela amizade e pelos momentos divertidos.

� À amiga Dani Ribeiro (Cuti), por sua amizade sincera e apoio nas dificuldades.

� Aos amigos do Departamento de Neurologia: Malu, Drica, Andressa, Fabrício, Karina,

Carol, Bruno, Maira, Poliana, Simone e Franco, pela iniciativa e empenho nas reuniões

científicas e, pela organização da comissão discente, que foram importantes para a

integração dos alunos de pós-graduação desse departamento.

� Aos professores da banca, Profa. Dra. Christie Ramos Andrade Leite Panissi e Prof. Dr.

Américo Ceiki Sakamoto, pela compreensão e contribuição nesse momento tão

importante.

� À Vani e Izilda, técnicas do Departamento de Morfologia dessa faculdade, pelo apoio e

disponibilidade em ajudar.

� Ao Rubinho, técnico do Departamento de Fisiologia dessa faculdade, pela dedicação e

disponibilidade em ajudar.

� À Eleni, técnica do Departamento de Farmacologia, pelo apoio.

� À Bete, secretária do curso de pós-graduação do Departamento de Neurologia, pelas

informações e ajuda.

� Aos responsáveis pelo Biotério, do Departamento de Farmacologia (Inês e Eliana) e do

Departamento de Biologia Celular e Molecular (Domingos), pelo cuidado com os animais

no período dos experimentos.

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� Ao Departamento de Neurologia, pela iniciativa de um curso de nivelamento, para integrar

as diversas especialidades das áreas biológicas e da saúde.

� Ao Departamento de Farmacologia, onde se encontra o LNN, por propiciar o

desenvolvimento do projeto.

� À FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) pelo apoio

financeiro, que é totalmente necessário para a realização de pesquisa científica.

� Aos animais de laboratório.

� A todos aqueles que contribuíram com a minha formação profissional, permitindo que

eu leve conhecimento àqueles que anseiam por ele.

8

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO ..........................................................................10

1 – Dor................................................................................................................................................11

2 – Opióides e analgesia ...................................................................................................................18

3 – Colículo inferior ..........................................................................................................................21

4 – Crises convulsivas e analgesia pós-ictal ...................................................................................23

OBJETIVOS............................................................................... 27

1. Objetivos gerais .............................................................................................................................28

2. Objetivos específicos ....................................................................................................................28

MATERIAIS E MÉTODO ........................................................ 29

1) Animais...........................................................................................................................................30

2) Testes nociceptivos.......................................................................................................................30

3) Testes comportamentais ..............................................................................................................31

4) Equipamentos ...............................................................................................................................31

5) Procedimentos...............................................................................................................................32

6) Drogas ............................................................................................................................................34

7) Análise estatística ..........................................................................................................................34

8) Histologia .......................................................................................................................................34

RESULTADOS........................................................................... 36

RESUMO.................................................................................... 56

ABSTRACT ................................................................................ 59

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................... 62

ANEXOS .................................................................................... 84

9

LISTA DE ABREVIATURAS AP: antero-posterior

CDME: corno dorsal da medula espinhal

CI: colículo inferior

CPCS: camadas profundas do colículo superior

CS: colículo superior

DV: dorso-ventral

EPM: Erro Padrão da Média

FDL: funículo dorso-lateral

GABA: ácido gama-aminobutírico

h: horas

IP: intraperitoneal

kg: kilograma

LC: locus coeruleus

LRC: latência de retirada de cauda

mg: miligrama

min: minutos

ML: médio-lateral

mm: milímetro

NCCI: núcleo central do colículo inferior

NCDCI: núcleo cortical dorsal do colículo inferior

NCECI: núcleo cortical externo do colículo inferior

NDR: núcleo dorsal da rafe

NMgR: núcleo magno da rafe

PTZ: pentilenotetrazol

SCP: substância cinzenta periaquedutal

SN: substância negra

seg: segundos

TM: teto mesencefálico

µg: micrograma

µl: microlitro

µm: micrômetro

10

INTRODUÇÃO

__________________________________________________________________Introdução

11

1 – Dor

1.1 – Transmissão da dor

A dor é definida pela Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP)

como uma “experiência sensorial e emocional desagradável associada a uma lesão tecidual

real ou potencial, ou descrita nestes termos” (MERSKEY, 1986; FLÓREZ, 1993). A dor,

portanto, é uma percepção subjetiva com dimensão psicológica. Por outro lado, a

nocicepção constitui a percepção pelos nociceptores de estímulos que codificam sinais para

fornecer informação o sistema nervoso central da existência de uma injúria tissular

associada a um estímulo nocivo. A dor tem sido considerada como consistindo de dois

componentes: perceptivo-discriminativo, que permite ao indivíduo reconhecer o estímulo

como doloroso e localizá-lo em regiões do corpo, e o aversivo-cognitivo-motivacional ou

reacional, que compreende uma variedade de comportamentos, os quais, por sua vez,

envolvem fatores inatos de cada espécie, aprendizagem e memória (BRANDÃO, 1995).

Segundo NOBACK e col. (1996), dor seria o termo mais adequado para o homem,

enquanto que nocicepção seria mais indicado para modelos experimentais. Não obstante,

surpreendentemente subsídios neuromorfológicos funcionais que embasam os aspectos

subjetivos da dor foram primeiramente descritos em animais de laboratório (HAMMOND,

1989), o que sugere-nos cautela durante qualquer tentativa em restringir os aspectos

emocionais da dor exclusivamente a seres humanos.

Os neurotransmissores envolvidos nas aferências nociceptivas primárias são

diversos, particularmente, a substância P (HÖKFELT e col., 1975; FURST, 1999),

somatostatina, colecistoquinina, glutamato (JESSEL & DODD, 1986), neurocinina-A e

neurocinina-B. Estes parecem ser transmissores das aferências primárias ou facilitadores da

expressão de estímulos nociceptivos (FURST, 1999).

__________________________________________________________________Introdução

12

Os nociceptores distribuem-se por praticamente todos os tecidos do organismo, com

exceção do tecido nervoso. Estão presentes na superfície cutânea, na parede das vísceras ocas,

no parênquima das vísceras sólidas, na vasculatura, nos ossos e nas articulações, na córnea, nas

raízes dentárias (MILLAN, 1999). Os nociceptores são terminações livres de neurônios

pseudounipolares associados a fibras não mielinizadas (fibras C) ou mielinizadas (fibras Aδ).

As fibras C respondem a estímulos nocivos de origem térmica, mecânica ou química e por isso,

são chamados de polimodais. Já as fibras Aδ, respondem mais fortemente a estímulos nocivos

térmicos e pressórios e com menor intensidade a estímulos químicos (RANG e col., 1991).

Tanto as fibras Aδ como as fibras C são largamente distribuídas na pele e em tecidos

profundos (JESSEL & KELLY, 1991).

A atividade gerada pelo nociceptor é transferida, após processamento complexo e

ativo no corno dorsal da medula espinhal (CDME), diretamente ou via núcleos do tronco

encefálico, aos núcleos inespecíficos do tálamo ou ao núcleo talâmico ventral póstero-lateral, e

então para o córtex, onde a percepção da dor é gerada. Impulsos paralelos do CDME passam

para o corno ventral da medula espinhal e ativam neurônios motores reflexos, os quais geram o

reflexo flexor de retirada (WOOLF, 1994).

A informação nociceptiva é convertida em impulsos pelos nociceptores e transmitida

pelos nervos espinhais e cranianos aos núcleos na medula espinhal e tronco cerebral. No

interior da substância cinzenta do corno dorsal da medula espinhal, a projeção aferente do

neurônio primário faz sinapse com os neurônios secundários. A substância cinzenta da medula

espinhal foi dividida por Rexed em dez lâminas ou camadas (BESSON & CHAOUCH, 1987;

DUBNER & BENNETT, 1983; REXED, 1952; WILLIS & COGGESHALL, 1991): as

lâminas I a VI compõem o CDME. Os corpos celulares dos neurônios secundários estão

localizados na lâmina I (zona marginal), II (substância gelatinosa) e V (camada profunda). As

fibras finas do neurônio primário geralmente terminam nas camadas mais superficiais, e as

__________________________________________________________________Introdução

13

fibras mais grossas na camada profunda. (WILLIS & WESTLUND, 1997; MILLAN, 1999). As

lâminas I e II de Rexed recebem fibras C e algumas fibras Aδ. Outras fibras Aδ penetram mais

profundamente no CDME (lâmina V) (MILLAN, 1999), já as fibras mielinizadas grossas Aα e

Aβ são responsáveis em transmitir as informações não-nociceptivas (FIELDS & BASBAUM,

1978; ALBE-FESSARD e col., 1985; BESSON & CHAOUCH, 1987; FITZGERALD &

WALL, 1980; BRANDÃO, 1995). Essas fibras sensoriais de alto limiar ativam um grande

número de interneurônios de segunda ordem e neurônios de projeção na medula espinal,

alguns deles ativados exclusivamente por estímulos nocivos (denominados de neurônios

nociceptivos específicos ou NS – nociceptive-specific) e outros são ativados por estímulos de alta

ou baixa intensidade (denominados de faixa dinâmica ampla ou WDR – wide-dynamic-range). As

células presentes nas lâminas I e V dão origem às principais vias de projeção do CDME para o

tálamo (MILLAN, 1999). A informação neural se projeta, então, do tálamo para as áreas

sensoriais do córtex cerebral, onde as várias submodalidades da sensibilidade nociceptiva,

como qualidade, intensidade, localização e o seu aspecto emocional ou afetivo são integrados

na experiência da percepção (NOBACK e col., 1996). Essas fibras constituem os tratos espino-

talâmicos, espino-mesencefálico, espino-reticular (WILLIS, 1985), espino-límbico, espino-

cervical e coluna dorsal pós-sináptica (WILLIS & WESTLUND, 1997).

Da medula espinhal, a informação nociceptiva ascende para o encéfalo por

algumas vias, das quais a mais importante é a via espinotalâmica, que se divide

filogeneticamente, em duas projeções: a via paleo-espinotalâmica (mais antiga) e a via neo-

espinotalâmica (mais recente, na escala filogenética). O trato espinotalâmico conduz a

informação nociceptiva e outras informações sensoriais da periferia para o tálamo. É

constituído primariamente de axônios de células das lâminas I e V, mas também os corpos

desses neurônios são encontrados nas lâminas II, IV, VI, VII, VIII e X (ZHANG e col., 2000).

Baseado na origem e no modelo de projeções das fibras Aδ e C, alguns autores descreveram

__________________________________________________________________Introdução

14

três formas de aferências do trato espinotalâmico. Uma é a via neo-espinotalâmica

monossináptica, ou trato espinotalâmico ventral, que se projeta diretamente para núcleos do

complexo lateral do tálamo, envolvendo o componente sensório-discriminativo da dor. Outra

é a via paleo-espinotalâmica multissináptica, ou trato espinotalâmico dorsal, que projeta para

núcleos do complexo intralaminar e posterior medial do tálamo, envolvidos no aspecto

afetivo-motivacional da dor. E, finalmente, uma via espinotalâmica monossináptica

projetando-se diretamente para núcleos central e medial do tálamo, envolvidos no componente

afetivo da experiência dolorosa (TEIXEIRA, 1990; ZHANG e col., 1999).

Além do trato espinotalâmico, a informação nociceptiva pode ascender pelo trato

espinorreticular, cujas células de origem se localizam principalmente nas lâminas V, VII e VIII,

e também nas lâminas I e X (KEVETTER e col., 1982; WILLIS & WESTLUND, 1997).

Também existem projeções diretas da medula para sítios mesencefálicos. Em

primatas, a maioria das células de origem do trato espino-mesencefálico está localizada nas

lâminas I e IV a VI. As projeções espino-mesencefálicas terminam na substância cinzenta

periaquedutal (SCP), núcleo cuneiforme, camadas profundas do colículo superior (CPCS),

núcleos pré-tectal anterior e posterior, núcleo intercolicular e núcleo rubro, entre outros

(WIBERG & BLOMQVIST, 1984; para revisão, ver WILLIS & WESTLUND, 1997). É muito

importante destacar a existência do trato espino-límbico, pois projeções espinotalâmicas e

espino-amigdalinas diretas também já foram descritas (WILLIS & WESTLUND, 1997). As

células de origem desse trato estão localizadas nas lâminas I, VII e X (para revisão, ver WILLIS

& WESTLUND, 1997). Algumas projeções espinhais também alcançam o núcleo accumbens e

os núcleos septais (BURSTEIN & GIESLER, 1989). Essas conexões, diretas ou indiretas com

estruturas relacionadas ao controle das emoções, sugerem que tais projeções devem estar

ligadas aos aspectos motivacionais da dor.

Além disso, o trato espino-cervical origina-se principalmente das lâminas III e IV e

__________________________________________________________________Introdução

15

em menor extensão, das lâminas I, II e V (MILLAN, 1999). As funções relatadas para este

trato são as características autonômicas, sensório-discriminativas e afetivo-motivacionais da

dor, como também, esse trato atua como integrador sensorial e modulador das aferências da

medula espinhal.

1.2 – Modulação da dor

Um importante componente da resposta do organismo a situações de emergência é a

redução da capacidade de perceber a dor (COIMBRA e col., 1992; MENESCAL-DE-

OLIVEIRA e col., 1993; COIMBRA & BRANDÃO, 1997). Assim, a antinocicepção pode ser

definida como redução na resposta do sistema sensorial a estímulos nocivos (FANSELOW &

BOLLES, 1979).

Existem mecanismos analgésicos endógenos, ou seja, um sistema de regiões neurais

conectadas às vias aferentes nociceptivas, e que modulam, ou bloqueiam completamente a

passagem das informações da dor em sua trajetória em direção ao córtex cerebral. O primeiro

desses mecanismos é muito simples e atua logo na entrada das vias nociceptivas na medula

espinhal. As sinapses destas com os neurônios de segunda ordem estão localizadas no CDME.

Esses neurônios, no entanto, recebem também sinapses inibitórias de interneurônios situados

nas redondezas, os quais, por sua vez, são ativados pelas fibras Aβ, que veiculam as

informações táteis quando chegam à medula espinhal ao mesmo tempo que os impulsos

dolorosos (cada um através de suas vias aferentes específicas), e podem inibir a transmissão

sináptica entre o neurônio primário nociceptivo e o neurônio de segunda ordem (MELZACK

& WALL, 1965). Mais recentemente, descobriu-se que as sinapses moduladoras da dor não

estão presentes apenas na medula espinhal, mas nos vários níveis das vias nociceptivas e que a

origem dos circuitos inibitórios não se restringe às fibras Aβ. De fato, sabe-se, hoje, que

__________________________________________________________________Introdução

16

existem vias descendentes moduladoras da dor que se originam no córtex somestésico e no

hipotálamo, projetando-se para a SCP, e desta para diferentes núcleos bulbares, especialmente

os núcleos da rafe, como por exemplo, o núcleo dorsal da rafe (NDR), cuja estimulação

elétrica desperta forte analgesia, uma região mesencefálica especializada, situada ventralmente

na SCP (OLIVERAS e col., 1979). Eferências do NDR atingem estruturas pontinas e bulbares

mais caudais. Do núcleo magno da rafe (NMgR) ou do locus coeruleus (LC), dois importantes

exemplos dessas estruturas mais caudais, fibras serotoninérgicas ou noradrenérgicas,

respectivamente, descem, através do funículo dorso-lateral (FDL) da medula espinhal com

destino à substância gelatinosa do CDME. Essas vias ainda podem se projetar sobre

interneurônios encefalinérgicos que, por sua vez, hiperpolarizam os neurônios responsáveis

pela transmissão da mensagem nociceptiva (BASBAUM & FIELDS, 1978; MELZACK e col.,

1982), provocando o bloqueio da dor.

A dor normalmente promove um conjunto de reflexos de retirada, fuga, retraimento,

entre outros comportamentos recuperativos. Seria mais razoável, portanto, que essas reações

fossem suprimidas automaticamente em favor de respostas mais adaptativas. Se, dessa forma, a

resposta natural do organismo a situações de emergência inclui uma diminuída sensibilidade a

impulsos nociceptivos, parece plausível que o sistema de inibição de dor seja recrutado em tais

situações (COIMBRA, 1995; COIMBRA e col., 2005), e possivelmente também em situações

patológicas, como durante aquelas que evocam as crises epilépticas, onde a movimentação

vigorosa e rápida, pode não somente extenuar o paciente mas também ser seguida, durante e

após a síndrome de imobilidade pós-ictal, do recrutamento de mecanismos de inibição da dor,

por meio da ativação completa ou parcial do sistema endógeno de inibição da dor. A

serotonina e a noradrenalina são fortes candidatos a neurotransmissores envolvidos nessa rede

neural (OLIVEIRA, 2003; FERREIRA, 2004). Contudo, estudos dos mecanismos neurais e

hormonais têm apresentado provas do envolvimento de ß-endorfina e encefalinas, além de

__________________________________________________________________Introdução

17

corticotrofinas e corticosterona em algumas formas de antinocicepção (BASBAUM &

FIELDS, 1989; MILLER, 1981; JONES e col., 1992, 1994), o que sugere o envolvimento de

outros neurotransmissores nesse processo.

Há estudos que sugerem a participação de neurônios encefalinérgicos da substância

gelatinosa no controle da transmissão nociceptiva, inibindo as aferências primárias Aδ e C,

através de projeções pré-sinápticas sobre seu primeiro contato neural com células nociceptivas

localizadas no núcleo espinhal do nervo trigêmeo e, muito provavelmente, no CDME

(JESSEL & IVERSEN, 1977). Esse mecanismo tomaria como base o bloqueio do influxo de

íons cálcio em terminais axônicos de células do gânglio da raiz dorsal, por onde trafegam

impulsos nociceptivos, realizado por neurotransmissores opióides, como as encefalinas e

endorfinas (MUDGE e col., 1979).

As reações comportamentais e autonômicas induzidas pela estimulação do teto

mesencefálico (TM) têm sido descritas como sendo similares àquelas observadas em

decorrência da estimulação nociceptiva aguda (SPIEGEL e col., 1954; KEENE &

FIGUEROA, 1986). É também conhecido que, em humanos, tais estimulações eliciam

sensações desagradáveis associadas ao sofrimento causado pela dor (NASHOLD e col., 1969).

Processos antinociceptivos podem ser gerados por estimulação não somente das diversas

regiões da SCP, mas também das CPCS (GEBHART & TOLEIKIS, 1978; COIMBRA e col.,

1992; COIMBRA & BRANDÃO, 1997; COIMBRA e col., 2005). Essas áreas também têm

sido implicadas com processos convulsivos (DE PAULIS e col., 1990), assim como o colículo

inferior (CI) (CARDOSO e col., 1994).

Como provável base neuroanatômica desse fenômeno antinociceptivo, podemos

salientar as conexões, basicamente serotoninérgicas, de núcleos da formação reticular, tais

como os núcleos da rafe, núcleo paragigantocelular e gigantocelular parte alfa, com o colículo

superior (CS) e SCP (BEITZ, 1986; COIMBRA e col., 2005). Esses núcleos bulbares, assim

__________________________________________________________________Introdução

18

como a SCP, fazem parte do sistema endógeno que modula a percepção de estímulos

nociceptivos (WILLIS & WESTLUND, 1997). A SCP foi uma das primeiras regiões a serem

implicadas na modulação da dor (REYNOLDS, 1969; MAYER e col., 1971). Muito embora

alguns sítios mais rostrais sejam mais usualmente estimulados, há evidências de que a analgesia

eliciada nesses sítios é transmitida através da SCP (RHODES, 1979). Processos

antinociceptivos podem ser gerados em todas as regiões da SCP, apesar de haver relatos na

literatura apontando a região ventro-lateral como sendo mais efetiva em produzir analgesia

(GEBHART & TOLEIKIS, 1978), ao lado de sítios localizados nas colunas dorso-medial e

dorso-lateral da SCP (COIMBRA e col., 1992; COIMBRA e col., 1997).

2 – Opióides e analgesia

Os opióides foram, com toda a probabilidade, estudados mais intensamente do que

qualquer outro grupo de drogas, na tentativa de se compreender seus poderosos efeitos em

termos moleculares, bioquímicos e fisiológicos, visando utilizar essa compreensão no

desenvolvimento de agentes opióides como analgésicos dotados de vantagens significativas

em relação à morfina. (DUGGAN & NORTH, 1984; PASTERNAK, 1993; YAKSH, 1997;

RANG, e col., 2001).

MARTIN (1983) propôs a existência de múltiplas classes de receptores para os

opióides, o que foi posteriormente comprovado com estudos de ligação de drogas a

receptores e com a clonagem de pelo menos cinco tipos de receptores para opióides,

nomeados com as letras gregas µ, κ, δ, σ e ε. Para os três primeiros tipos, já foram

demonstrados diferentes subtipos de receptores, nomeados µ1 e µ2, κ1, κ2 e κ3, e δ1 e δ2,

respectivamente. De modo geral, as drogas utilizadas clinicamente são ativas em mais de um

__________________________________________________________________Introdução

19

receptor, e a distribuição de receptores opióides no sistema nervoso central guarda estreita

relação com os efeitos farmacológicos dos analgésicos opióides. Diversos agonistas e

antagonistas opióides com elevada seletividade pelos diferentes tipos de receptores estão hoje

disponíveis como subsídios farmacológicos eficazes para o estudo das ações opióides. O uso

dessas drogas em modelos animais permitiu estabelecer qual tipo de receptor está envolvido

em cada um dos diferentes efeitos de opiáceos (TSENG, 2001; QUIRION, 1984).

A pesquisa dos neurotransmissores envolvidos na mediação de processos

antinociceptivos tem despertado o interesse de muitos neurocientistas, sendo de crucial

importância a investigação dos pontos do neuro-eixo em que a percepção da dor pode ser

eficientemente modulada. Nos últimos anos têm-se acumulado evidências sugestivas da ação

de opióides em determinados sítios do sistema nervoso periférico e central. Receptores

opióides foram identificados em terminais de pequeno diâmetro na medula espinhal e sobre o

soma de neurônios localizados no gânglio da raiz dorsal (STEIN e col., 1990). Sob uma vasta

gama de condições experimentais e clínicas, uma série de opióides e seus antagonistas

evidenciam efeitos analgésicos e algésicos periféricos (RUSSELL e col., 1987; STEIN e col.,

1991; STEIN, 1993; CZLONKOWSKI e col., 1993).

Um grande avanço na elucidação dos mecanismos endógenos de inibição de dor foi

obtido com a descoberta dos peptídeos opióides e seus efeitos. Assim a busca de opióides

naturais logo foi coroada com a descoberta das encefalinas, endorfinas, a dinorfina e, mais

recentemente, a nociceptina (HENDERSON & McKINGHT, 1997), que são encontrados na

SCP, núcleos da rafe e no CDME, exercendo função moduladora nas sinapses entre vias

nociceptivas (PERT e col, 1976).

O fato de que a microinjeção de opióides (MURFIN e col., 1976) ou a estimulação

elétrica da SCP geram analgesia (através de vias que compõem o FDL) e hiperpolarizam alguns

neurônios localizados no CDME (LIEBESKIND e col., 1973) vai ao encontro do ponto de

__________________________________________________________________Introdução

20

vista de alguns autores de que analgesia opióide e analgesia induzida por estimulação elétrica da

SCP possuem um substrato neural comum (MAYER & LIEBESKIND, 1974; MAYER &

HAYES, 1975; MAYER & PRICE, 1976). O substrato anatômico dessas duas formas de

analgesia pode, entretanto, não ser completamente similar. Em alguns estudos encontrou-se

que há sítios na SCP que são mais propensos à analgesia induzida por estimulação elétrica do

que a uma analgesia eliciada por ativação de mecanismos estritamente opióides, pois esses

efeitos podem ser antagonizados pela depleção de monoaminas (TENEN, 1968).

Há evidências de que processos antinociceptivos ativados por aplicações centrais ou

periféricas de drogas opióides, como encefalina e endorfina, assim como a analgesia induzida

por estimulação de determinados sítios encefálicos podem vir a ter um substrato neural

comum, possivelmente ativado não somente após a eliciação de analgesia na SCP, na região

dorsal ou ventral (NICHOLS e col., 1989; COIMBRA e col., 1992), próximo ou na intimidade

do NDR (rico em serotonina e envolvido em processos de inibição de dor) (WANG &

NAKAI, 1994), mas também em se estimulando as estruturas periventriculares, que se

estendem rostralmente em direção ao encéfalo (RHODES, 1979). Sabe-se que dor de origem

visceral e somática pode ser prontamente inibida com a estimulação dessas áreas

(REYNOLDS e col., 1969, BAIK e col., 1995).

Há considerável evidência de que a analgesia induzida pela estimulação elétrica da SCP

ventral primeiramente ativa fibras contendo peptídeos opióides, as quais se projetam ao NMgR

e a outras estruturas da formação reticular (YAKSH, 1980; BASBAUM & FIELDS, 1984). As

fibras serotoninérgicas da rafe, por sua vez, projetam-se, através do funículo lateral, a

neurônios do CDME, produzindo um efeito analgésico que não é reversível pelo naloxone

(CANNON e col., 1982). Em recentes relatos na literatura, tem sido sugerido que, pelo menos,

parte dessa analgesia não-opióide poderia ser mediada por mecanismos serotoninérgicos, pois

é inibida por administrações sistêmicas de metisergida, um bloqueador inespecífico de

__________________________________________________________________Introdução

21

receptores para serotonina (NICHOLS e col., 1989).

Tem sido relatado que várias formas de estresse podem causar analgesia, por ativação

de mecanismos opióides e não-opióides, dependendo da natureza e da intensidade do estímulo

(BODNAR e col., 1980; TERMAN e col., 1984; PAVONE e col., 1986; DE LIMA & RAE,

1991), assim como, uma ação opióide protetora, sensível ao naloxone, durante o estresse

causado por convulsões audiogênicas (CHEN e col., 1976), espontâneas (MELDRUN e col.,

1979; BAJOREK e col., 1984), ou induzidas pelo pentilenotetrazol (ADLER e col., 1976) e por

eletrochoque (PUGLISI-ALLEGRA e col., 1984).

3 – Colículo inferior

O mesencéfalo, que é o mais curto segmento do tronco encefálico, estende-se da ponte

até o diencéfalo e o terceiro ventrículo, e tem sido alvo de inúmeras investigações, cuja

abordagem é centralizada em mecanismos neuroniais envolvidos tanto na elaboração de

processos antinociceptivos, dos comportamentos de defesa (BRANDÃO e col., 1993), quanto

no desencadear de crises audiogênicas (FAINGOLD e col., 1992; GARCIA-CAIRASCO e

col., 1993). Esta região pode ser dividida em duas sub-regiões: o tegmento e o teto

mesencefálico, onde se encontra a lâmina quadrigêmina que contém os colículos inferiores e os

colículos superiores.

O CI, estrutura bilateral e relé das fibras auditivas que ascendem em direção ao córtex

auditivo, está localizado no mesencéfalo dorsal onde ocupa uma posição fundamental na

recepção e processamento dos sinais auditivos. Inicialmente, foi verificada a existência de três

principais subdivisões do CI em mamíferos: o núcleo central, núcleo externo e o núcleo

pericentral (RAMON Y CAJAL, 1909). Na literatura, podemos encontrar outras subdivisões e

__________________________________________________________________Introdução

22

nomenclaturas para o CI, tais como as sugeridas por MORREST & OLIVER (1984) que

distinguiram duas regiões distintas no CI de gatos; uma região tectal, composta pelo núcleo

central (e seus subnúcleos medial, central, lateral e ventral), um córtex (com suas partes dorsal

e caudal), e um núcleo pericentral (composto pelos subnúcleos comissural, dorsomedial,

rostral, lateral e ventrolateral) e outra região tegmental (composta basicamente por áreas

pericoliculares e o núcleo do braço do CI). Posteriormente, HUFFMAN & HENSON (1990)

adotaram uma subdivisão em três principais núcleos: núcleo central, e os núcleos corticais

externo (NCECI) e dorsal (NCDCI), divisão utilizada neste trabalho.

Tem sido descrito que os colículos inferiores são estruturas relacionadas com a

elaboração dos comportamentos de defesas (BRANDÃO e col., 1988; COIMBRA e col., 2000;

OSAKI e col., 2003), assim como com a organização da analgesia eliciada pela estimulação

elétrica (COIMBRA e col.,1992).

COIMBRA & BRANDÃO (1997) e CASTILHO & BRANDÃO (2001)

caracterizaram as bases farmacológicas da antinocicepção que é iniciada pelo comportamento

de fuga em resposta à estimulação do teto mesencefálico. Segundo esses autores, nesse

processo antinociceptivo, há o envolvimento do sistema serotoninérgico e particularmente de

receptores do tipo 5-HT2, os quais medeiam respostas antinociceptivas exibidas durante

comportamentos de fuga desencadeados por estimulação elétrica e pelo bloqueio de receptores

GABAérgicos do tipo A em estruturas mesencefálicas. Efetivamente, há evidências prévias de

que comportamentos induzidos por estímulos aversivos, como aqueles evocados através do

estímulo elétrico do TM, são seguidos de antinocicepção (FARDIN e col., 1984; COIMBRA e

col., 1992; COIMBRA & BRANDÃO, 1997).

As CPCS, assim como diversas regiões da SCP, encontram-se envolvidas com a

elaboração de processos antinociceptivos, que são gerados através de estimulação elétrica e

química dessas áreas (GEBHART & TOLEIKIS, 1978; COIMBRA e col., 1992; COIMBRA

__________________________________________________________________Introdução

23

& BRANDÃO, 1997; COIMBRA e col., 2005). Segundo DE PAULIS e col. (1990), essas

áreas também têm sido implicadas em processos convulsivos, onde o CI possui uma relevante

inserção (CARDOSO e col., 1994). Comportamentos induzidos por estímulos aversivos ou

convulsivos estressantes, são seguidos de antinocicepção (FARDIN e col., 1984; COIMBRA e

col., 1992; COIMBRA & BRANDÃO, 1997), algumas vezes precedidas por crises convulsivas

tônico-clônicas (GARCIA-CAIRASCO, 2002; De FREITAS e col., 2004; FREITAS e col.,

2005).

Recentes achados (OSAKI e col., 2003; FREITAS e col., 2005) têm demonstrado

conexões entre os aspectos dorsais e ventrais da SCP com sítios do CI, cuja estimulação elicia

reações convulsivas (CARDOSO e col., 1994). Quando estimulados, os corpos quadrigêmeos

induzem crises convulsivas tônico-clônicas (CARDOSO e col., 1994; GARCIA-CAIRASCO e

col., 1996a). Com efeito, recentes estudos têm implicado essas regiões com reações

nociceptivas (COIMBRA e col., 1992; COIMBRA & BRANDÃO, 1997; FREITAS e col.,

2005).

4 – Crises convulsivas e analgesia pós-ictal

O aminoácido gama-aminobutírico (GABA) é o neurotransmissor mais amplamente

distribuído no sistema nervoso central dos vertebrados (BORMANN, 2000), e está presente

em 30-50% das terminações nervosas (ROBERTS & FRANKEL, 1950). No sistema nervoso,

o GABA atua em duas famílias de receptores: os do tipo A (GABAA) e os do tipo B (GABAB).

Esses dois receptores têm sido classificados de acordo com critérios farmacológicos e segundo

a natureza dos mecanismos efetores. O receptor GABAA está diretamente acoplado a um canal

de cloro, enquanto que o receptor GABAB está diretamente acoplado a canais de potássio e

__________________________________________________________________Introdução

24

cálcio por meio de uma proteína G (SHOEFIELD, 1987; BOWERY, 1989; BOWERY &

PRATT, 1992). As estruturas localizadas no TM possuem altas concentrações desse

neurotransmissor (OKADA, 1974; SANDNER e col., 1981), particularmente o CI

(SHIRAISHI e col., 2001).

Alguns estudos sugerem a presença de GABA nos interneurônios corticais e

hipocampais, assim como em algumas células da retina, no núcleo accumbens, no núcleo reticular

do tálamo e nos neurônios de Purkinje. Evidências indicam, ainda, que neurônios

GABAérgicos estejam presentes também, no complexo estriado-palidal, estriado-nigral e

projeções coliculares (OKADA e col., 1971; DE PAULIS e col., 1990; FLOREY, 1991).

Existem, também, interneurônios GABAérgicos nos núcleos da rafe, interagindo com

neurônios serotoninérgicos e encefalinérgicos do prosencéfalo, e também com neurônios

colinérgicos (NISIKAWA & SCATTON, 1983; GRIDITTI e col., 1993; WANG & NAKAI,

1993).

A diminuição da neurotransmissão do GABA tem sido envolvida na etiologia de várias

doenças neurológicas, tal como a epilepsia, pois que a atividade desse sistema transmissor está

com o nível anormalmente baixo nos epilépticos. Alguns investigadores têm avaliado a

concentração de GABA no líquido encéfalo-raquidiano de epilépticos, como uma forma de

aferir a atividade neuronial GABAérgica. Encontrou-se uma redução da concentração desse

neurotransmissor no líquor de indivíduos epilépticos (MANYAM e col., 1980), embora um

estado anterior não relatou essa diferença em pacientes epilépticos (ENNA e col., 1977).

Epilepsia é uma descarga elétrica cerebral desorganizada que se propaga para todas as

regiões do encéfalo e leva a uma alteração de toda a atividade cerebral. A convulsão é uma das

tantas formas de manifestação de epilepsia. Tem sido visto que crises epilépticas podem ser

induzidas experimentalmente por inibição do GABA ou por bloqueio de receptores de

membrana relacionados a esse neurotransmissor, por qualquer antagonista GABAérgico

__________________________________________________________________Introdução

25

competitivo ou não competitivo, assim como o pentilenotetrazol (PTZ). Portanto, não há

dúvida que a manipulação do sistema GABAérgico possa influenciar grandemente a

excitabilidade do cérebro e promover crises, tanto em animais como no homem. Uma outra

forma de indução de crises epilépticas consiste em aplicar um estímulo sonoro de alta

intensidade, o que desperta convulsões tônico-clônicas em animais sensíveis (TSUTSUI e col.,

1992; RIBAK E MORIN, 1995; RIBAK e col., 1997), um fenômeno que também pode estar

sob controle de vias ricas em GABA (GARCIA-CAIRASCO e SABBATINI, 1991).

O PTZ é um antagonista não competitivo, GABAérgico, que não interage diretamente

com o receptor do GABA, mas sim bloqueia o influxo de Cl- mediado pelo GABA. A injeção,

por via periférica, de PTZ, em ratos, provoca convulsões tônico-clônicas (SCHOFIELD,

1987; DE LIMA & RAE, 1991).

De acordo com alguns achados, mecanismos GABAérgicos da substância negra (SN)

estão envolvidos no controle de crises convulsivas generalizadas (DINGLEDINE e col., 1978;

GARCIA-CAIRASCO e col., 1996a), o que comprovam outros estudos neurais e hormonais

segundo os quais injeções bilaterais de agonistas GABA dentro do sistema nervoso central

(prosencéfalo e cerebelo), possuem a propriedade de deprimir crises convulsivas

(DINGLEDINE e col., 1978). Na literatura, descreve-se um duplo elo estriadonigral-

nigrotectal que consiste em duas sucessivas vias inibitórias GABAérgicas. Está bem

estabelecido que os neurônios GABAérgicos do estriado que enviam conexões à SN

(CROSSMAN e col., 1973; RINVIC e col., 1976; BROWNSTEIN e col., 1977; OERTEL e

col., 1981), exercem influência inibitória sobre a parte reticulada dessa estrutura (FELTZ, 1971;

PRESCHT & YOSHIDA, 1971; CROSSMAN e col., 1973; DRAY e col., 1976). A parte

reticulada da SN envia projeções também GABAérgicas aos corpos quadrigêmeos (COIMBRA

e col., 1989; COIMBRA & BRANDÃO, 1993). Essas regiões induzem crises convulsivas

quando estimuladas (CARDOSO e col., 1994; GARCIA-CAIRASCO e col., 1996a). Esses

__________________________________________________________________Introdução

26

dados sustentam a hipótese de que a saída nigral deve funcionar como um mecanismo de

barreira para as crises generalizadas (DINGLEDINE e col., 1978). Repetidas estimulações

acústicas em ratos susceptíveis geneticamente à epilepsia evocam alterações neuroquímicas e

límbicas, as quais são abolidas por microinjeção de agonistas GABA (GARCIA-CAIRASCO e

col., 1996b).

Assim também, mecanismos serotoninérgicos e opióides têm sido implicados na

elaboração da analgesia pós-ictal (COIMBRA e col., 2001a, b), onde os corpos quadrigêmeos

podem apresentarem-se como importantes substratos neurais (CARDOSO e col., 1994;

GARCIA-CAIRASCO e col., 1996a; FREITAS e col., 2005). Com efeito, o CS e o núcleo

intercolicular, são importantes componentes da rede mesencefálica das crises convulsivas

(MERRILL e col., 2003), como também a SCP (DE PAULIS e col., 1990) e o CI (CARDOSO

e col., 1994). É possível que esses sítios possam funcionar também como sede da ação

convulsiva do PTZ, assim como da analgesia pós-ictal.

Assim, o estudo de mecanismos GABAérgicos, opióides, serotoninérgicos e até mesmo

colinérgicos pode oferecer dados elucidativos acerca da neuroquímica da analgesia pós-ictal.

Com efeito, opióides endógenos, serotonina, acetilcolina parecem estar criticamente implicados

em processos antinociceptivos induzidos por estimulação de estruturas de onde também se

podem obter crises convulsivas (CARDOSO e col., 1992; OLIVEIRA & PRADO, 1994;

COIMBRA E BRANDÃO, 1997). Entretanto, encontra-se, na literatura, grande escassez de

trabalhos que tratem da analgesia induzida por convulsão. Desta maneira, a analgesia que

segue as crises convulsivas induzidas experimentalmente ou por processos naturais ainda

necessita ser melhor elucidada, assim como o substrato neural desse processo de inibição de

dor.

27

OBJETIVOS

___________________________________________________________________Objetivos

28

1. Objetivos gerais

• Este trabalho foi realizado com o objetivo de investigar se as crises convulsivas

induzidas por drogas, como o pentilenotetrazol, são seguidas de antinocicepção,

reversível pelo antagonismo de receptores opióides por via periférica e central.

2. Objetivos específicos

• Caracterizada a analgesia pós-ictal, a neuroquímica subjacente a essa antinocicepção

foi investigada com o uso de um antagonista farmacológico específico, opióide,

como o naloxonazine, que promove ligações covalentes irreversíveis com

receptores µ1. A participação desse subtipo de receptores opióides na analgesia pós-

ictal foi avaliada em um modelo experimental de epilepsia induzida por droga, e o

bloqueador foi administrado por via periférica.

• Também foi investigada parte do substrato neural responsável pela organização da

analgesia pós-ictal, avaliando o envolvimento do núcleo central do colículo inferior

(NCCI) na analgesia que segue crises convulsivas induzidas pelo bloqueio ionóforo

de canais de cloro ligados ao ácido gama-aminobutírico. Com esse intuito,

microinjeções centrais de naloxonazine, em diferentes doses, foram realizadas no

CI.

29

MATERIAIS E MÉTODO

____________________________________________________________Materiais e Método

30

1) Animais

Foram utilizados ratos albinos (Rattus norvegicus, Rodentia, Muridae), da linhagem Wistar,

pesando entre 200-250g. Esses animais foram colocados em caixas com quatro exemplares, os

quais tiveram acesso à comida e água, durante todo o experimento, e foram mantidos em

ambiente com ciclo claro escuro de 12/12h (luzes ligadas das 7h às 19h), e temperatura

constante de 25°C±1°C. Os experimentos foram realizados em harmonia com os princípios

elaborados pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da FMRP-USP.

2) Testes nociceptivos

Todos os ratos tiveram seus limiares nociceptivos aferidos, utilizando-se para o isso o

teste de retirada de cauda. Cada animal foi colocado em uma cela de contenção com paredes de

acrílico, e teve sua cauda colocada sobre o sensor de uma fonte de calor (Tail-Flick Analgesia

Instrument; Ugo Basile), cuja elevação progressiva de calorimetria (proporção de 9ºC/s) era

automaticamente interrompida, tão logo o animal retirava a cauda do dispositivo. Um pequeno

ajuste da intensidade e corrente foi realizado, quando necessário, no início do experimento,

com o propósito de se obterem três latências consecutivas de retirada de cauda, entre 2,5 e 3,5

s. Caso o animal não removesse a cauda da fonte de calor dentro de 6 s, o dispositivo era

desligado para prevenir danos teciduais. Toda a latência de retirada de cauda (LRC) foi

normalizada em um índice de analgesia (IA) usando-se para isso a seguinte fórmula:


31

)controleLRC( - 6

)controleLRC(-)teste

(LRC=IA

A linha de base foi formada pela média de três LRC, tomadas em intervalos de 5 min.

O limiar nociceptivo foi igualmente aferido em seqüência às crises convulsivas, induzidas pelo

PTZ.

3) Testes comportamentais

Os testes comportamentais foram realizados no interior de uma arena circular (open-

field), cujas paredes, de acrílico transparente, medem 60 cm de diâmetro e 50 cm de altura, e

cujo assoalho é dividido em 12 secções iguais. Essa arena é situada em um compartimento

experimental e iluminada por lâmpada fluorescente. O efeito das drogas administradas (efeito

do PTZ, do bloqueador farmacológico e salina), foi estudado no interior desse aparato, e os

comportamentos convulsivos registrados através de uma câmera filmadora (Panasonic).

4) Equipamentos

As cirurgias estereotáxicas foram realizadas por meio de um estereotáxico ultra-preciso,

desenvolvido para pequenos animais (David Kopf, 902, EEUU).

Os testes antinociceptivos foram realizados através de um analgesímetro para realização

do teste de retirada da cauda (Ugo Basile, 21025, Itália).

A análise histológica foi feita através de um micrótomo de congelação (HM 505 E,

Zeiss, Alemanha), e os resultados foram avaliados através de um microscópio de luz (Axioplan,

Zeiss).


32

5) Procedimentos

5.1) Estudo do efeito do bloqueio de receptores opióides, por via periférica, sobre a analgesia pós-ictal.

Inicialmente, foi feita uma linha de base do teste de retirada de cauda com todos os

animais de cada grupo (N=8). Os animais dos grupos controles receberam injeção

intraperitoneal (IP) de salina, após 10 min (N=14) ou 24h (N=8), foi administrado por via

periférica, PTZ em todos os animais. Após haver recebido a droga, os animais foram

colocados na arena, onde permaneceram até o término da crise convulsiva e tiveram seus

limiares nociceptivos aferidos através do teste de retirada de cauda, tão logo a ativação

comportamental chegasse ao seu fim; portanto, imediatamente após as crises, 10, 20, 30, 40,

60, 70, 80, 90, 100, 120, 140 e 160 min após as convulsões.

Grupos independentes de animais receberam aplicações periféricas de naloxonazine,

nas doses de 10 mg/kg (N=8, para 10 min e 24h), 20 mg/kg (N=8 para 10 min e 24h) e 30

mg/kg (N= 10 para 10 min e 24h), seguindo-se, após 10 min ou 24h, a aplicação periférica de

pentilenotetrazol. O limiar nociceptivo foi aferido imediatamente após o término da crise

convulsiva, e nos tempos estipulados anteriormente.

5.2) Estudo do efeito do bloqueio central de receptores opióides µ1 sobre a analgesia pós-ictal

Inicialmente, após o período de recuperação pós-operatória da cirurgia estereotáxica (3

a 5 dias), foi feita uma linha de base para o teste de retirada de cauda com todos os animais de

cada grupo. Os animais do grupo sham (N=5) foram operados e, sem receberem injeção de

droga, por via central, foram tratados apenas com PTZ, administrado por via IP. Após haver


33

recebido a droga, os animais foram colocados na arena, onde permaneceram até o término da

crise convulsiva, determinando-se então sua LRC, tão logo a ativação comportamental

chegasse ao seu fim; portanto, imediatamente após as crises, 10, 20, 30, 40, 60, 70, 80, 90, 100,

120, 140 e 160 min após as convulsões. Grupos independentes de animais receberam

aplicações centrais (no NCCI ou, nos NCDCI ou NCECI) de naloxonazine, nas doses de

1µg/0,2µl (N=8), 2µg/0,2µl (N=8) e 3µg/0,2µl (N=7), ou salina (NaCl a 0,9%; 0,2µl; N=9),

seguindo-se, após 24h (em grupos independentes de animais), a aplicação por via IP de PTZ

(64 mg/kg). O limiar nociceptivo foi aferido imediatamente após o término da crise

convulsiva, e nos tempos estipulados anteriormente. As crises convulsivas tônico-clônicas

foram registradas através de uma câmera filmadora, e os resultados foram analisados através da

observação dos comportamentos quanto à duração do processo convulsivo em segundos (seg).

5.2.1) Intervenções cirúrgicas

Os animais foram anestesiados, com cetamina (10%, Agener) e xilasina (2%, Dopaser),

colocados no aparelho estereotáxico e a calvária, exposta. Foram feitas duas trepanações no

crânio, para a introdução de um parafuso de ancoragem de uma prótese de fixação (feita de

resina autopolimerizável) e de uma cânula-guia, a qual foi direcionada para o NCCI, segundo as

seguintes coordenadas: AP: - 8,8mm; ML: 1,6mm; DV: 4,5mm. Tomando-se a linha interaural

como referência e estando bregma e lambda em um mesmo plano experimental. A cânula-guia

foi confeccionada com agulha de injeção intradérmica (25X6mm), de aço inoxidável, com

l5mm de comprimento. Um fio de aço foi introduzido na luz da cânula, para protegê-la de

impurezas.

Para a microinjeção das drogas, uma microagulha (Mizzi), conectada a uma microseringa

(Hamilton, l0µl) foi introduzida na cânula, e ultrapassou a sua extremidade final em l mm. Um


34

cateter de polietileno foi acoplado a microagulha para monitorização das microinjeções, que

eram feitas através de uma bomba de infusão de drogas (Stoelting). Após oito dias de

sobrevivência, os animais foram anestesiados, sacrificados, e tiveram seus encéfalos removidos

para a realização das análises morfológicas, em nível de microscopia de luz.

6) Drogas

Foram utilizados o pentilenotetrazol (PTZ, Sigma) e o naloxonazine (RBI) dissolvidos

em solução salina (NaCl a 0,9 %); esta foi igualmente utilizada como controle do veículo das

drogas injetadas.

Os bloqueadores farmacológicos foram administrados perifericamente em dose única,

no caso do PTZ (64 mg/kg) e em três doses, no caso do naloxonazine (10 mg/kg, 20 mg/kg e

30 mg/kg). O antagonista de receptores opióides também foi utilizado centralmente (no CI),

nas seguintes doses: 1µg/0,2µl, 2µg/0,2µl e 3µg/0,2µl.

7) Análise estatística

Os dados foram avaliados pelo teste de análise de variância de medidas repetidas

(MANOVA), seguido, quando apropriado, pelo teste post-hoc de Duncan.

8) Histologia

Após a finalização dos experimentos, os animais (Rattus norvegicus) foram anestesiados

com pentobarbital sódico (45 mg/kg) até atingir uma depressão respiratória letal, seguida de


35

uma incisão no tórax, com exposição do mediastino. O próximo passo foi clampear a aorta

descendente torácica libertando o coração do envoltório pericárdico, para o puncionamento do

ventrículo esquerdo, por meio de um equipo sanguíneo conectado a uma seringa de 60ml, e foi

feita uma incisão no átrio direito, quando então os encéfalos foram perfundidos com solução

salina a 0,9%, seguida por solução de paraformaldeído a 4%. Em seguida, os encéfalos foram

removidos, seccionados em cortes coronais, para separação do tecido mesencefálico do

restante do tecido nervoso. O bloco assim obtido foi levado ao criostato, onde secções

seriadas de 40µm foram realizadas e adequadamente montadas em lâminas gelatinizadas;

posteriormente desidratadas, diafanizadas e coradas com hematoxilina/eosina (HE). Em

seguida, foram analisadas ao microscópio de luz (Axioplan), e os sítios de microinjeção de

drogas puderam ser assinalados em diagramas do Atlas de Paxinos & Watson (1997).

36

RESULTADOS

________________________________________________________________Resultados

37

Neste trabalho foi investigado o efeito do pré-tratamento com um bloqueador de

receptores opióides µ1, o naloxonazine, na analgesia pós-ictal induzida por ataques epilépticos,

evocados por um bloqueio sistêmico de canais Cl– ligados a sinapses GABAérgicas no sistema

nervoso central. O PTZ induziu crises tônico-clônicas, seguidas de analgesia em todos os

animais do presente estudo e, as convulsões não foram precedidas por corridas selvagens.

A administração periférica de naloxonazine em todas as doses (10 mg/kg, 20mg/kg e

30 mg/kg) apresentou efeitos significativos em relação ao grupo controle (salina, NaCl 0,9%),

causando diminuição da LRC observada no teste de retirada de cauda (tail-flick), após 24h da

administração de naloxonazine mas não após 10 min.

O pré-tratamento com naloxonazine 10 minutos antes da administração IP de

PTZ não alterou a LRC. A análise de variância de uma via (“One Way ANOVA”) não mostrou

efeito estatisticamente significante do tratamento [F (3,47) = 1,72; p> 0,05], nem interação

tratamento x tempo [F (36,104) = 1,42; p> 0,05]. Dados mostrados na figura 1.

Contudo, o pré-tratamento com naloxonazine 24h antes da administração IP de PTZ

causou diminuição das LRC. Houve efeito estatisticamente significante do tratamento

farmacológico com naloxonazine [F (3,30) = 6,19; p< 0,01], do tempo [F (12,19) = 90,88; p<

0,0001] e interação tratamento x tempo [F (36,53) = 3,94; p< 0,0001]. A análise post-hoc

mostrou que o bloqueio de receptores µ1-opióides causou redução da analgesia aferida de 0 a

160 min do período pós-ictal [F (3,30) variando de 4,29 a 12,79; p< 0,05]. Esse efeito foi

evidenciado mais precisamente de 30 a 80 min (naloxonazine a 10 mg/kg, naloxonazine a 20

mg/kg e naloxonazine a 30 mg/kg x salina) do período pós-ictal. O teste post-hoc mostrou,

ainda, que 20 min após as convulsões já houve diferenças entre as maiores doses de

naloxonazine (20 mg/kg e 30 mg/kg), em relação ao controle [Duncan; p< 0,05; em todos os

casos], como mostrado na figura 2.

________________________________________________________________Resultados

38

A administração central de naloxonazine em todas as doses estudadas (1µg/0,2µl;

2µg/0,2µl; 3µg/0,2µl) apresentou efeitos significativos em relação ao grupo controle (salina,

NaCl 0,9%) e ao grupo sham, causando diminuição da LRC observada no teste de tail-flick,

após 24h da administração de naloxonazine.

Houve efeito estatisticamente significante do tratamento farmacológico com

naloxonazine [F (4,32) = 25,10; p< 0,0001], do tempo [F (12,21) = 73,97; p< 0,0001] e

interação tratamento x tempo [F (48,78) = 2,63; p< 0,0001]. A análise post-hoc mostrou que o

bloqueio de receptores µ1-opióides no CI causou redução da analgesia aferida de 0 a 160 min

do período pós-ictal [F (4,32) variando de 3,83 a 35,51; p< 0,05]. Esse efeito foi evidenciado

mais precisamente de 20 a 140 min (naloxonazine a 1µg/0,2µl, naloxonazine a 2µg/0,2µl e

naloxonazine a 3µg/0,2µl x salina e sham) do período pós-ictal. O teste post-hoc mostrou ainda

que, 60, 70, 90 e 120 min após as convulsões houve diferenças entre os grupos salina e sham

(Figura 3).

Contudo, o pré-tratamento prolongado (24h) com naloxonazine em todas as doses

estudadas (1µg/0,2µl; 2µg/0,2µl; 3µg/0,2µl) apresentou efeitos significativos em relação ao

grupo controle (salina, NaCl 0,9%), causando diminuição do tempo de processo convulsivo

avaliado após a administração IP de PTZ, observado nos registros dos comportamentos

convulsivos.

Houve efeito estatisticamente significante do tratamento farmacológico com

naloxonazine [F (4,32) = 3,79; p< 0,05]. A análise post-hoc mostrou que o bloqueio de

receptores µ1-opióides no CI causou redução do tempo de processo convulsivo aferido após a

administração IP de PTZ aferido no intervalo entre o primeiro comportamento (mioclonia de

mandíbula) e o fim do processo convulsivo (comportamento exploratório do animal na arena

circular – open field). Dados mostrados na Figura 4.

________________________________________________________________Resultados

39

Os presentes resultados apontam para a participação de receptores opióides µ1 na

analgesia pós-ictal envolvendo as redes neurais do CI, assim como na modulação das crises

convulsivas tônico-clônicas, induzidas pelo bloqueio do sistema GABAérgico.

Todos os sítios estudados foram localizados no NCECI, no NCDCI e no NCCI (como

mostrado na figura 5). Um resumo da localização dos sítios de microinjeção do antagonista

farmacológico e de seu veículo, assim como do grupo “cirurgia fictícia” (sham) é mostrada na

figura 6.

________________________________________________________________Resultados

40

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160

tempo (min)

Índ

ice

de

An

alg

esia

(IA

)

Salina fisiológica + PTZ (64 mg/kg) Naloxonazine (10 mg/kg) + PTZ (64 mg/kg)

Naloxonazine (20 mg/kg) + PTZ (64 mg/kg) Naloxonazine (30 mg/kg) + PTZ (64 mg/kg)

FIGURA 1 – Ausência de efeito do pré-tratamento por via intraperitoneal com salina

fisiológica + pentilenotetrazol (PTZ 64 mg/kg) (□-□) (N=14); naloxonazine (10 mg/kg) +

PTZ (64 mg/kg) (■-■) (N=8); naloxonazine (20 mg/kg) + PTZ (64 mg/kg) (▲-▲) (N=8) e

naloxonazine (30 mg/kg) + PTZ (64 mg/kg) (∆-∆) (N=10) na analgesia pós-ictal. Os dados

foram apresentados como média ± EPM, p>0,05. O bloqueio de canais de cloro ligados ao

GABA, com PTZ, foi realizado 10 min após o antagonismo de receptores opióides µ1, com

naloxonazine, ou 10 min após administração de seu veículo.

________________________________________________________________Resultados

41

-0,4

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160

tempo (min)

Ind

ice

de

An

alg

esia

(IA

)

Salina fisiológica + PTZ (64 mg/kg) Naloxonazine (10mg/kg) + PTZ (64 mg/kg)

Naloxonazine (20mg/kg) + PTZ (64 mg/kg) Naloxonazine (30mg/kg) + PTZ (64 mg/kg)

**

* * *

**

*

** *

*

***

**

FIGURA 2 – Efeito do pré-tratamento por via intraperitoneal com salina fisiológica +

pentilenotetrazol (PTZ; 64 mg/kg) (□-□) (N=8); naloxonazine (10 mg/kg) + PTZ (64 mg/kg)

(■-■) (N=8); naloxonazine (20 mg/kg) + PTZ (64 mg/kg) (▲-▲) (N=8) e naloxonazine (30

mg/kg) + PTZ (64 mg/kg) (∆-∆) (N=10) na analgesia pós-ictal. Os dados foram apresentados

como média ± EPM., * (p< 0,05) quando comparado com o controle (□-□), segundo o teste

post hoc de Duncan. O bloqueio de canais de cloro ligados ao GABA, com PTZ, foi realizado

24 h após o antagonismo de receptores opióides µ1, com naloxonazine, ou 24 h após

administração de seu veículo.

________________________________________________________________Resultados

42

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160

tempo (min)

Índ

ice

de

An

alg

esia

(IA

)

Sham + PTZ (64 mg/kg) Salina Fisiológica + PTZ (64 mg/kg)

Naloxonazine (1µg/0,2µl) + PTZ (64 mg/kg) Naloxonazine (2µg/0,2µl) + PTZ (64 mg/kg)

Naloxonazine (3µg/0,2µl) + PTZ (64 mg/kg)

*

*#

§

*#

§

*#

*

#

§

*

#

*

#

*

#

#

*

*

*

*

*

#*

#

*#

*

*

#*

#*

#

*#

* #

*#

*

*

*

*

# **

*

*

**

*

FIGURA 3 - Efeito do pré-tratamento prolongado, sobre o colículo inferior, com salina

fisiológica + pentilenotetrazol (PTZ; 64 mg/kg) (□-□) (N=9); naloxonazine (1µg/0,2µl) +

PTZ (64 mg/kg) (■-■) (N=8); naloxonazine (2µg/0,2µl) + PTZ (64 mg/kg; i.p.) (●-●) (N=8);

naloxonazine (3µg/0,2µl) + PTZ (64 mg/kg; i.p.) (▲-▲) (N=7) e sham (∆-∆) (N=5) na

analgesia pós-ictal. Os dados foram apresentados como média ± EPM.; * (p< 0,05) quando

comparado com o grupo salina + PTZ (64 mg/kg) (□-□), # (p<0,05) quando comparado ao

grupo sham (∆-∆), § (p<0,05) quando comparado com o grupo naloxonazine (1µg/0,2µl) +

PTZ (64 mg/kg) (■-■), segundo o teste post hoc de Duncan. O bloqueio de canais de cloro

ligados ao GABA, com PTZ, foi realizado, por via intraperitoneal, 24h após o antagonismo

opióide ou após administração de seu veículo, ou ainda 24 h após a introdução da microagulha

no teto mesencefálico.

________________________________________________________________Resultados

43

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

Tem

po

de

pro

cess

o c

on

vuls

ivo

(seg

)

SH SL NLX 1 NLX 2 NALX 3

*

*

*

FIGURA 4 – Efeito do pré-tratamento prolongado, sobre o colículo inferior, com salina

fisiológica + pentilenotetrazol (PTZ; 64 mg/kg) (SL) (N=9); naloxonazine (1µg/0,2µl) + PTZ

(64 mg/kg) (NLX 1) (N=8); naloxonazine (2µg/0,2µl) + PTZ (64 mg/kg; i.p.) (NLX 2)

(N=8); naloxonazine (3µg/0,2µl) + PTZ (64 mg/kg; i.p.) (NLX 3) (N=7) e sham (SH) (N=5)

no tempo de processo convulsivo. Os dados foram apresentados como média ± EPM; * (p<

0,05) quando comparado com o grupo salina + PTZ (64 mg/kg) (SL), segundo o teste post hoc

de Duncan. O bloqueio de canais de cloro ligados ao GABA, com PTZ, foi realizado, por via

intraperitoneal, 24h após o antagonismo opióide ou após administração de seu veículo, ou

ainda 24 h após a introdução da microagulha no teto mesencefálico. Compreende-se pelo

tempo de processo convulsivo o intervalo entre a primeira crise (mioclonia de mandíbula) e a

completa exacerbação das crises (comportamente exploratório do animal pela arena).

________________________________________________________________Resultados

44

A

C

B

FIGURA 5 – Fotomicrografias de cortes transversais do mesencéfalo de rato Wistar, onde se vêem (setas)

sítios representativos das microinjeções realizadas no núcleo cortical dorsal do colículo inferior em A, no

núcleo central do colículo inferior em B e no núcleo cortical externo do colículo inferior em C. Barra: 519

µm em A, 983 µm em B e 504 µm em C.

________________________________________________________________Resultados

45

FIGURA 6 – Representação esquemática dos sítios de microinjeção de salina (□), naloxonazine 1µg/0,2µl

(■), naloxonazine 2µg/0,2µl (●), naloxonazine 3µg/0,2µl (▲) e sham (∆) realizadas no colículo inferior,

segundo o Atlas de Paxinos & Watson, 1997.

Bregma - 9,30 mm

Bregma - 8,30 mm

Bregma - 9,16 mm

Bregma - 9,68 mm

Bregma - 9,80 mm

46

DISCUSSÃO

___________________________________________________________________Discussão

47

Os presentes achados sugerem o envolvimento do sistema opioidérgico, mais

especificamente de receptores µ1, nos processos antinociceptivos induzidos por reações

convulsivas. Essa antinocicepção foi estudada através do teste de retirada de cauda (tail-flick),

que utiliza reflexos medulares, em detrimento de outros clássicos testes de analgesia, como o

teste da placa quente (hot-plate) ou de formalina, que requerem a participação de mecanismos

supra-espinais (DICKENSON e col., 1979; LE BARS e col., 2001).

Primeiramente descritos em estudos de binding (WOLOZIN & PASTERNACK, 1981;

NISHIMURA e col., 1984; ZANG & PASTERNACK, 1981a,b) os receptores µ1 têm sido

implicados em numerosas ações opióides, tais como analgesia supra-espinal, modulação do

comportamento alimentar, liberação de prolactina, e nos muitos mecanismos de dependência

física a drogas opiáceas (PASTERNACK e col., 1980 a,b; ZANG & PASTERNACK, 1981

a,b; SPIEGEL e col., 1982; LING & PASTERNACK, 1983; LING e col., 1984, 1985;

SIMONE e col., 1985). A capacidade dos antagonistas inespecíficos , como o naloxone, ou

seletivos , como o naloxonazine (PASTERNACK & HAHN, 1980; PASTERNACK e col.,

1980 a,b; HAHN e col., 1982), de antagonizar os receptores µ1, facilitou grandemente estudos

sobre a ação dos opióides. Embora ambos os compostos possuam propriedades

farmacológicas similares, o naloxonazine é o mais potente in vivo e in vitro (LING e col.,

1986).

Em nossos resultados pudemos observar que o naloxonazine foi capaz de antagonizar

a analgesia induzida pelas crises convulsivas tônico-clônicas. Essa antagonização teve efeito

estatisticamente significante após 24h da administração de naloxonazine em todas as doses

estudadas. O antagonismo opióide após 10 minutos, não foi estatisticamente significante,

muito embora tenha havido tendência a diminuição da analgesia induzida pelas crises

___________________________________________________________________Discussão

48

convulsivas. Esse fato pode ter sido devido a ação inespecífica do tratamento agudo com

naloxonazine sobre receptores opióides (LING e col., 1986), os quais podem desempenhar

efeitos antagônicos nas redes neurais em que se situam.

Os resultados obtidos no presente trabalho indicam que os receptores opióides µ1 estão

envolvidos na analgesia pós-ictal, embora seja prudente considerarmos também a possibilidade

do envolvimento de outros mecanismos opióides na elaboração da analgesia induzida pelas

crises convulsivas tônico-clônicas.

LING e col. (1986), caracterizaram a ação do naloxonazine em camundongos e

ratos. O naloxonazine antagonizou a analgesia induzida por morfina por 24h sem alterar a

letalidade causada por intoxicação aguda por opiáceos. Essa ação prolongada não poderia ser

facilmente explicada por uma lenta taxa de eliminação, já que a meia-vida de eliminação

terminal foi estimada em menos de 3h. Em acréscimo, a seletividade da ação do naloxonazine

é dose-dependente, pois quanto maior a dose, maior é a sua seletividade (LING e col., 1986).

Curiosamente, o naloxonazine liga-se reversivelmente a outros subtipos de receptores opióides

a uma potência similar à do naloxone. Entretanto, sob circunstâncias específicas, o

naloxonazine bloqueia os receptores µ1 de uma maneira mais prolongada, pois esse bloqueador

farmacológico tem ação irreversível ao se ligar cronicamente a esse subtipo de receptor

(HAHN e col., 1982; JOHNSON & PASTERNAK, 1984). Esse fato permite-nos considerar

seguramente o envolvimento de receptores µ1 em redes neurais de estruturas envolvidas na

elaboração do processo de analgesia pós-ictal, após os resultados obtidos com o tratamento

mais prolongado com naloxonazine, como antagonista opióide.

Além de mecanismos opióides, sistemas monoaminérgicos e colinérgicos têm sido

implicados na elaboração da analgesia pós-ictal (COIMBRA e col., 2001a, b; OLIVEIRA,

2003; FERREIRA, 2004; DE FREITAS e col., 2004). Recentes relatos na literatura sugerem a

participação de prolactina, vasopressina e opióides endógenos na analgesia pós-ictal induzida

___________________________________________________________________Discussão

49

por eletrochoque (PORTUGAL-SANTANA e col., 2004). Como sugerido por COIMBRA e

col. (2001a), opióides endógenos, como encefalina e endorfina, podem não participar de

estágios iniciais da analgesia pós-ictal, sendo tais neurotransmissores recrutados num estágio

tardio, considerando os primeiros 30 minutos de período pós-ictal, pois o pré-tratamento

periférico com antagonista opióide inespecífico, naloxone, em sua menor dose, não produziu

efeito sobre a antinocicepção evocada por crises convulsivas tônico-clônicas. Portanto,

receptores opióides kappa, delta e µ, podem estar envolvidos em mecanismos mais tardios do

período pós-ictal, ao passo que, as monoaminas e a acetilcolina estariam envolvidas no início

da antinocicepção que segue as crises convulsivas (COIMBRA e col., 2001b ; DE FREITAS e

col., 2004). Corroborando esses achados, nossos dados demonstram o bloqueio de receptores

opióides µ1, dose-dependente, por meio de administrações centrais de naloxonazine,

microinjetado em núcleos específicos do CI de ratos, sobre a analgesia pós-ictal.

Dentre as vantagens oferecidas pela microinjeção central de drogas, está a de tornar

possível a aplicação de substâncias diretamente no tecido nervoso, evitando as limitações

decorrentes da administração periférica, como, por exemplo, os efeitos de fármacos em

diversos sítios, os processos de metabolização e a seleção pela barreira hemato-encefálica. Esse

método apresenta ainda aspectos positivos quando comparado aos outros procedimentos

adotados quando se trata do tecido nervoso, como por exemplo, lesões teciduais e estimulação

elétrica, porque restringe os sítios encefálicos relacionados à atividade em estudo e evita a

ativação de fibras de passagem. Além disso, é possível recrutar número suficiente de neurônios

capazes de alterar uma resposta comportamental, entre elas a redução da resposta aos

estímulos nociceptivos (YAKSH & RUDY, 1978).

O mesencéfalo tem sido alvo de considerável atenção nos estudos de comportamento

de fuga e crises audiogênicas, tanto na região do teto (BRANDÃO e col., 1993; FAINGOLD e

col, 1992; GARCIA-CAIRASCO e col., 1993), quanto do tegmento mesencefálicos

___________________________________________________________________Discussão

50

(FAINGOLD & RANDALL, 1995; LIU e col., 1999; ISHIMOTO e col., 2000), assim como,

tem sido postulado seu envolvimento em processos antinociceptivos (GEBHART &

TOLEIKIS, 1978; COIMBRA e col., 1992; COIMBRA & BRANDÃO, 1997; CASTILHO e

col., 1999). Os dados obtidos no presente trabalho sugerem que os receptores opióides µ1

encontram-se envolvidos nesse processo antinociceptivo, podendo elaborar a antinocicepção

que se estabelece após a síndrome de imobilidade pós-ictal por meio de todo o contínuum do

TM, onde a presença de neurotransmissores representados por polipeptídeos opióides

endógenos já foram amplamente demonstrados (EICHENBERGER e col., 2002; OSAKI e

col., 2003), embora seja prudente considerarmos a possibilidade do envolvimento de outros

mecanismos opióides na elaboração da analgesia induzida pelas crises convulsivas tônico-

clônicas.

Os presentes resultados ainda indicam o envolvimento dos núcleos do CI na

elaboração da analgesia pós-ictal, pois a microinjeção de naloxonazine sobre as redes neurais

do CI antagonizou a antinocicepção eliciada pelas crises convulsivas tônico-clônicas,

evidenciando seu efeito específico após 24h, como descrito por LING e col. (1986).

Achados na literatura demonstram processos antinociceptivos em modelos

experimentais de epilepsia, nos quais receptores opióides µ1 e receptores colinérgicos

muscarínicos e nicotínicos podem estar envolvidos (COIMBRA e col., 1996, 2001 a ; DE

FREITAS e col., 2004). Na verdade, algumas estruturas e redes neurais mesencefálicas, assim

como o CI, SCP, NDR, núcleo paragigantocelular, parte alfa e LC possuem mecanismos

opióides, monoaminérgicos e colinérgicos envolvidos no controle da dor (AZAMI e col., 2001;

BASBAUM & FIELDS, 1989; LI e col., 1993; MAMEDE-ROSA e col., 1998), defesa

(COIMBRA e col., 2000; EICHENBERGER e col., 2002; MONASSI e col., 1997; OSAKI e

col., 2003), e epilepsia (CARDOSO e col., 1994; GARCIA-CAIRASCO e col., 1993;

PETERSON e col., 2000). Em vista disso, os presentes resultados também apontam para o

___________________________________________________________________Discussão

51

envolvimento dos receptores µ1-opióides e de tais núcleos do CI na elaboração do processo

convulsivo induzido pelo PTZ, pois o tempo total de processo convulsivo foi reduzido pela

microinjeção de naloxonazine quando administrado no CI.

Alguns cientistas descrevem que o CI, uma estrutura que participa da elaboração de

processos antinociceptivos, possui neurônios positivos para β-endorfina e leu-encefalina

(EICHENBERGER e col., 2002; OSAKI e col., 2003). Entretanto, o CI recebe aferências

GABAérgicas da parte reticulada da SN (COIMBRA e col., 1989; COIMBRA & BRANDÃO,

1993). Tem sido descrito que essa estrutura mesencefálica está intimamente relacionada com a

indução de crises convulsivas (MCCOWN e col., 1987, 1984; CARDOSO e col., 1994;

GARCIA-CAIRASCO e col., 1996a ), sugerindo que, as eferências nigrais funcionem como

uma barreira na indução das crises generalizadas (DINGLEDINE e col., 1978). Portanto,

podemos sugerir que, o bloqueio de receptores opióides µ1 sobre as redes neurais do CI estaria

modulando tais mecanismos GABAérgicos oriundos da SN. Esses dados corroboram estudos

que postulam a hipótese de que o sistema opióide que elabora a antinocicepção evocada por

situações de estresse, tenha função pró-convulsivante, cujo pré-tratamento com naloxone

atrasou a ativação das crises convulsivas induzidas pelo PTZ (DE LIMA & RAE, 1991). Outro

estudo demonstrou ainda, que agonistas opióides, podem inibir a liberação de GABA via

ativação de receptores µ-opióides no CI (TONGJAROENBUNGAM e col., 2004).

É sabido que uma mesma dose de encefalina pode causar analgesia, sem convulsões,

quando injetada na SCP, como também pode causar convulsões, sem analgesia, quando

administrada no núcleo dorso-medial do tálamo (FRENK e col., 1978). Tanto a SCP, como a

região dorso-medial do tálamo, contêm sítios de ligantes para opióides endógenos, como as

encefalinas e β-endorfinas (FRENK e col., 1978). Estudos realizados anteriormente revelam

que receptores opióides mediando analgesia e convulsão não somente são localizados em

diferentes áreas do encéfalo, mas também diferem uns dos outros farmacologicamente

___________________________________________________________________Discussão

52

(FRENK e col., 1978).

Muitos estudiosos têm investigado as bases neurais e neuroquímicas que embasam a

analgesia pós-ictal, evidenciando que lesões neuroquímicas do LC e também do NMgR

diminuíram a magnitude da analgesia pós-ictal, sugerindo o envolvimento desses núcleos nesse

processo antinociceptivo (FREITAS e col., 2005). Outras evidências têm mostrado a ligação

entre o TM e o NMgR, um importante núcleo do sistema de inibição de dor (COIMBRA e

col., 2005; FREITAS e col., 2005). Através de estudos de neurotraçamento, tem sido mostrado

interconexões entre CS, SCP partes dorsal e ventral e CI. Substratos defensivos do CI, também

envolvidos com corrida selvagem e epilepsia, enviam projeções para o NMgR e LC, que são

núcleos ricos em monoaminas e, que por sua vez, enviam projeções para outros núcleos

monoaminérgicos do mesencéfalo envolvidos com o controle da transmissão nociceptiva no

CDME (FREITAS e col., 2005), nas sinapses entre o primeiro e segundo neurônio da via

nociceptiva espino-talâmica (AZAMI e col., 2001; BASBAUM & FIELDS, 1989; LI e col.,

1993; MAMEDE-ROSA e col., 1998).

O estudo de mecanismos opióides pode oferecer dados elucidativos sobre a

neuroquímica da analgesia pós-ictal. Na realidade, opióides endógenos parecem estar

implicados criticamente na antinocicepção (FRENK e col., 1978; NICHOLS e col., 1989;

ROYCHOWDHURY & FIELDS, 1996) e em processos defensivos (CARDOSO e col., 1992;

COIMBRA e col., 2000) induzidos por excitação de estruturas onde também é possível induzir

ataques convulsivos (CARDOSO e col., 1992; GARCIA-CAIRASCO & SABATINI, 1991;

RIBAK e col., 1997; TERRA & GARCIA-CAIRASCO, 1994). Estudos imunoistoquímicos

(TONGJAROENBUNGAM e col., 2004) demonstraram que agonistas opióides no CI de

ratos podem inibir a liberação de GABA induzida por canais de cloro, via ativação de

receptores opióides do subtipo µ..

___________________________________________________________________Discussão

53

As bases neurais da analgesia (BASBAUM & FIELDS, 1984, 1989) e os substratos

neurais envolvidos na eliciação e propagação da atividade epileptogênica no sistema nervoso

central (RIBAK e col., 1997; TSUTSUI e col., 1992) são o foco de muitas investigações na área

de neurociências e neurologia experimental (MARGERISON & CORSELLIS, 1966; SAGAR

& OXBURY, 1987). Estudos pioneiros demonstraram a correlação entre epilepsia do lobo

temporal em adultos e a ocorrência de crise e status epilepticus (MARGERISON &

CORSELLIS, 1966; SAGAR & OXBURY, 1987). Limiares nociceptivos parecem ser

espontaneamente altos em pacientes com epilepsia do lobo temporal (GUIEU e col., 1992).

A completa elucidação da neuroquímica do processo antinociceptivo evocado pelas

crises convulsivas pode representar importante passo para o entendimento das bases neurais

do controle da dor e dos mecanismos da epilepsia. O substrato neural discutido no presente

trabalho reforça o envolvimento do sistema endógeno de inibição da dor no controle da

sensibilidade álgica e que os receptores opióides µ1 participam ativamente como parte

importante da citoarquitetura que regula a analgesia pós-ictal.

Portanto, o estudo dos mecanismos subjacentes à elaboração da analgesia pós-ictal

pode oferecer nova compreensão dos mecanismos endógenos de inibição de dor e pode

estabelecer as bases neurais e psicofarmacológicas envolvidas nessa rede neural endógena

inibitória da dor, esclarecendo quais mediadores neurais são recrutados neste fenômeno

analgésico. Assim, esta investigação poderá ser capaz de gerar dados elucidativos para o

desenvolvimento de drogas efetivas para o tratamento da dor crônica e melhor controle dos

mecanismos que geram a epilepsia, além de oferecer novos subsídios para a compreensão e

tratamento de alguns relatos de pró-nocicepção ictal ou mesmo oscilações do limiar

nociceptivo no período pós-ictal.

54

CONCLUSÕES

__________________________________________________________________Conclusões

55

• As crises convulsivas evocadas pelo pentilenotetrazol foram capazes de gerar

analgesia em todos os animais estudados no presente trabalho.

• A injeção intraperitoneal de naloxonazine, em todas as doses estudadas, foi capaz

de antagonizar a analgesia que segue as crises convulsivas tônico-clônicas, após 24h, mas não

após 10 min de bloqueio opióide.

• A microinjeção de naloxonazine em núcleos do CI, em todas as doses estudadas,

foi capaz de antagonizar a analgesia pós-ictal, após 24h de bloqueio opióide.

• O sistema opioidérgico encontra-se crucialmente envolvido na elaboração da

analgesia pós-ictal.

• Receptores opióides do subtipo µ1, localizados nas redes neurais do CI (núcleos

cortical dorsal, central e externo do colículo inferior) encontram-se implicados na elaboração

da analgesia pós-ictal, assim como, na modulação das crises convulsivas tônico-clônicas.

56

RESUMO

____________________________________________________________________Resumo

57

A antinocicepção é descrita como redução na capacidade de perceber a dor, sendo

importante componente para o organismo, quando este está envolvido em situações de

emergência. Muitos neurotransmissores e seus receptores estão envolvidos nas diversas formas

de analgesia, como por exemplo, monoaminas, acetilcolina e opióides endógenos. A analgesia

pós-ictal é uma das tantas formas de antinocicepção em que a participação de cada um desses

neurotransmissores é descrita.

Algumas evidências mostram o envolvimento de estruturas mesencefálicas em

processos antinociceptivos (GEBHART & TOLEIKIS, 1978; COIMBRA e col., 1992;

COIMBRA & BRANDÃO, 1997; CASTILHO e col., 1999) O colículo inferior é a estrutura

mesencefálica responsável pela origem e expressão de crises audiogênicas (MCCOWN e col,

1987). Estruturas como a substância cinzenta periaquedutal, camadas profundas do colículo

superior e núcleo central do colículo inferior, têm sido implicadas em processos convulsivos

(DE PAULIS e col., 1990; CARDOSO e col., 1994, MCCOWN e col., 1984). Alguns

cientistas descrevem que a estimulação dessas estruturas, em cujo substrato neural há

neurônios positivos para β-endorfina e leu-encefalina (EICHENBERGER e col., 2002;

OSAKI e col., 2003) pode gerar processos antinociceptivos (CASTILHO e col., 1999;

GEBHART & TOLEIKIS, 1978), seja de natureza opióide (NICHOLS e col., 1989), seja de

natureza monoaminérgica (COIMBRA e col., 1992; COIMBRA & BRANDÃO, 1997).

Nesse trabalho, foi realizado o estudo periférico para investigar o envolvimento, mais

especificamente, dos receptores opióides µ1 na analgesia que segue as crises convulsivas

evocadas pela administração de um antagonista de canais de Cl- ligados ao GABA, como é o

caso do pentilenotetrazol, por via intraperitoneal, após o pré-tratamento com o bloqueador

opióide específico, o naloxonazine, administrado em diferentes doses. Assim como, a

____________________________________________________________________Resumo

58

participação do colículo inferior nesse processo de inibição de dor, evidenciado pelo teste de

retirada de cauda.

O pré-tratamento com naloxonazine, administrado por via intraperitoneal por tempo

prolongado (24h), mas não agudamente (10 min), antagonizou a antinocicepção evocada por

convulsões tônico-clônicas. Como também, as microinjeções de naloxonazine realizadas nos

núcleos central, cortical externo e cortical dorsal do colículo inferior antagonizaram a analgesia

induzida por crises convulsivas tônico-clônicas, efeito que segue uma curva dose-resposta, bem

como, a redução do tempo de processo convulsivo. Em vista disso, podemos sugerir o

envolvimento de receptores µ1-opióides e das redes neurais do colículo inferior na elaboração

da analgesia pós-ictal, e na modulação de crises convulsivas tônico-clônicas.

Palavras-chave: naloxonazine, opióides, receptores µ1, analgesia pós-ictal.

59

ABSTRACT

___________________________________________________________________Abstract

60

The post-ictal analgesia is one of many kinds of antinociception, in which the

involvement of many neural systems has been demonstrated. Some evidences have been

showed the involvement of mesencephalic structures in antinociceptive processes. The inferior

colliculus is the brainstem structure responsible for the origin and elaboration of convulsive

responses (MCCOWN e col, 1987) in the presence of audiogenic stimulus or during the

treatment of supralimiar administration of GABAergic antagonists. Mesencephalic structures

such as the periaqueductal gray matter, the deep layers of the superior colliculus and the central

nucleus of the inferior colliculus, have been implicated in convulsive processes (DE PAULIS e

col., 1990; CARDOSO e col., 1994, MCCOWN e col., 1984). The stimulation of these areas, in

whose neural substrates there are β-endorphin- and leu-enkephalin-positive neurons

(EICHENBERGER e col., 2002; OSAKI e col., 2003) can generate antinociceptive processes

(CASTILHO e col., 1999; GEBHART & TOLEIKIS, 1978), of either opioid (NICHOLS e

col., 1989) or monoaminergic (COIMBRA e col., 1992; COIMBRA & BRANDÃO, 1997)

nature.

The aim of the present work is to investigate the involvement of the µ1-opioid

receptor-mediated system in the post-ictal analgesia. The antinociceptive responses were

recorded by the tail-flick test, after the pre-treatment with the specific opioid antagonist

naloxonazine, administered either by peripheral (intraperitoneally) or central (into the inferior

colliculus neural networks) way, in different doses.

The peripheral long-lasting (24h) but not acute (10 min) pre-treatment with naloxonazine

antagonized the analgesia evoked by tonic-clonic convulsions. Such as, the microinjections of

naloxonazine in the central, dorsal cortical and external cortical nuclei of inferior colliculus

antagonized the analgesia induced by tonic-clonic convulsive reactions, whose effect followed

a dose-response curve. Also, the microinjections of naloxonazine reduced the time of

___________________________________________________________________Abstract

61

convulsive reactions. These findings suggest the involvement of µ1-opiate receptors and the

neural networks of the inferior colliculus in this antinociceptive phenomenon, and in addition,

the involvement of these receptors in the modulation of tonic-clonic convulsive reactions.

Thus, we can suggest that the endogenous opioid peptides-mediated systems of the neural

networks of the inferior colliculus are implicated in the elaboration of the post-ictal

antinociception and in the modulation of tonic-clonic convulsions. In these processes, µ1-

opioid receptors of the central nucleus, as well as of the cortical dorsal and cortical external

nuclei of the inferior colliculus are crucially involved.

Key-words: naloxonazine, opioid, µ1-receptors, post-ictal analgesia.

62

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84

ANEXOS

___________________________________________________________________________________________________________Anexos

85

Animal Média

LRC 0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160

1 2,80 6,00 6,00 5,80 4,30 3,60 3,50 5,10 4,30 4,30 3,60 3,90 2,80 2,60

2 2,66 6,00 6,00 6,00 5,90 4,00 4,60 4,70 3,90 3,90 4,50 4,00 3,50 3,70

3 3,03 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 5,80 5,80 4,20 4,10 4,10 3,90 3,30

4 2,96 6,00 3,80 6,00 5,90 5,30 6,00 6,00 4,60 4,00 4,30 3,30 2,50 3,20

5 2,83 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 4,20 4,00 6,00 6,00 5,80 6,00 3,50 2,70

6 2,70 6,00 6,00 6,00 6,00 5,50 5,30 4,80 3,90 6,00 5,20 5,20 5,90 4,20

7 3,06 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 5,30 6,00 4,80 3,90 4,30 3,70 2,60 2,50

8 2,76 6,00 6,00 6,00 6,00 4,70 5,00 3,80 3,90 3,60 3,10 3,20 3,00 2,80

9 2,83 6,00 6,00 6,00 6,00 5,40 3,90 4,60 4,90 6,00 4,10 4,20 3,70 3,20

10 2,66 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 5,00 3,20 3,20

11 2,93 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 5,90 6,00 4,10 5,20 2,60 2,60

12 3,10 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 5,80 5,20 4,90 3,70 3,20

13 2,80 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 5,90 3,60 3,30

14 2,96 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 5,70 5,80 4,90 4,30 4,20 2,60

IA 0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160

Média 1 0,9486 0,9957 0,9579 0,8343 0,7721 0,7964 0,7236 0,7129 0,5686 0,5164 0,1907 0,0636

EPM 0 0,0514 0,0043 0,0376 0,0667 0,0747 0,0678 0,0726 0,0875 0,0757 0,0767 0,0763 0,0463

Tabela 1: Resultados individuais correspondentes ao grupo controle (injeção de salina fisiológica), durante o tempo de exposição ao teste de tail-

flick, após pré-tratamento de 10 min por via intraperitoneal.

___________________________________________________________________________________________________________Anexos

86

Animal Média LRC

0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160

15 3,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 4,30 2,70 3,90 4,40 6,00 3,50 2,30 3,50

16 2,80 6,00 3,30 3,10 4,40 3,50 3,40 2,50 4,30 4,00 4,90 4,00 3,70 2,30

17 2,67 4,40 6,00 5,80 5,80 5,00 3,50 2,80 2,40 3,00 3,60 2,30 2,90 2,60

18 2,90 6,00 6,00 6,00 4,80 4,60 2,00 2,80 2,80 3,80 3,90 2,40 2,90 2,40

19 2,63 6,00 3,90 5,10 2,90 2,50 2,20 1,80 3,40 2,30 2,90 2,20 2,40 2,60

20 2,73 6,00 6,00 4,30 3,30 2,40 2,60 2,50 3,40 2,90 2,60 2,60 3,00 2,60

21 2,87 5,50 6,00 6,00 3,30 2,70 2,50 2,30 2,40 3,30 2,40 2,60 2,70 1,90

22 3,07 6,00 4,20 3,20 2,50 2,00 2,30 2,70 2,20 2,50 2,60 1,90 2,80 2,00

IA 0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160

Média 1 0,924 0,8933 0,862 0,77 0,7787 0,5353 0,664 0,452 0,2173 0,3773 0,078 0,1073

EPM 0 0,0417 0,0703 0,0713 0,0882 0,0791 0,0707 0,1092 0,0857 0,0781 0,1105 0,0641 0,0445

Tabela 2: Resultados individuais correspondentes ao grupo tratado com naloxonazine na dose de 10mg/kg, durante o tempo de exposição ao

teste de tail-flick, após pré-tratamento de 10 min por via intraperitoneal.

___________________________________________________________________________________________________________Anexos

87

Animal Média LRC

0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160

23 3,03 6,00 4,80 3,40 3,40 3,10 3,50 2,60 3,60 3,30 3,00 3,00 3,30 3,40

24 2,83 6,00 6,00 4,20 4,20 3,10 3,00 2,40 3,40 2,50 2,20 3,10 2,00 1,90

25 2,73 5,70 5,60 3,20 2,90 3,80 2,40 2,20 2,20 2,60 2,00 2,20 2,60 2,20

26 2,93 6,00 6,00 6,00 4,50 4,70 4,30 3,30 3,00 2,30 2,50 2,20 2,20 2,90

27 2,93 6,00 3,80 3,20 2,80 2,90 2,80 2,90 2,30 2,90 2,40 2,50 3,40 2,40

28 2,90 6,00 6,00 5,60 6,00 6,00 3,50 6,00 4,70 4,80 3,80 3,50 3,10 3,00

29 2,76 6,00 2,60 2,70 3,20 2,30 3,50 3,10 2,40 3,00 2,80 2,80 2,60 2,00

30 3,13 6,00 4,90 5,60 3,20 2,80 3,00 2,60 2,60 2,90 2,00 3,30 2,90 2,80

IA 0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160

Média 0,9577 0,8323 0,8862 0,7092 0,7062 0,7746 0,63 0,5769 0,7023 0,4508 0,4792 0,4 0,3977

EPM 0,0399 0,0729 0,065 0,1101 0,1062 0,0944 0,1074 0,1019 0,0922 0,1009 0,1274 0,0819 0,1102



___________________________________________________________________________________________________________Anexos

88

Animal Média LRC

0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160

31 3,16 6,00 6,00 3,50 3,20 2,30 2,70 3,20 3,50 2,70 2,60 2,70 2,90 2,60

32 2,70 6,00 6,00 3,00 2,10 2,40 2,40 2,50 2,40 2,50 2,30 2,80 2,00 2,40

33 2,63 6,00 4,80 3,90 4,20 4,60 3,70 3,30 2,90 3,40 3,10 3,90 2,30 3,10

34 2,70 5,70 6,00 5,60 4,50 6,00 3,10 3,10 2,80 4,40 3,40 4,30 4,20 3,80

35 2,87 6,00 6,00 3,80 4,30 4,10 2,90 2,50 2,50 3,30 3,40 3,20 2,60 2,50

36 2,73 6,00 5,80 5,30 3,40 3,00 3,00 2,90 2,80 2,70 2,30 2,10 2,60 2,30

37 3,00 4,50 5,00 5,20 4,50 3,50 2,80 2,60 2,70 2,80 3,10 2,50 2,10 2,50

38 2,80 5,90 4,80 4,60 6,00 3,80 3,30 3,60 3,20 2,40 3,50 3,00 3,30 3,80

39 2,87 5,70 5,50 3,80 3,50 3,20 3,00 2,80 2,60 2,20 2,90 2,80 2,40 3,50

40 2,80 6,00 5,80 4,50 2,80 4,50 3,20 3,60 3,00 3,20 3,00 3,60 4,00 3,70

IA 0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160

Média 0,8678 0,7533 0,6978 0,6433 0,7167 0,6833 0,6211 0,42 0,5678 0,3511 0,4889 0,1956 0,1878

EPM 0,0883 0,1229 0,139 0,119 0,1298 0,1381 0,1247 0,1319 0,1125 0,1356 0,1365 0,0867 0,0847



___________________________________________________________________________________________________________Anexos

89

Animal Média LRC

0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160

41 2,73 6,00 6,00 5,70 4,60 5,50 3,30 4,40 5,20 3,30 3,50 3,30 3,00 2,50

42 3,30 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 4,00 6,00 5,10 4,00 4,00 3,20 3,40 3,10

43 2,96 4,00 6,00 5,60 6,00 6,00 6,00 5,10 6,00 6,00 3,30 2,60 3,30 2,90

44 2,80 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 4,50 4,90 3,10 3,40 2,50 3,30 2,50 3,20

45 3,13 6,00 5,90 6,00 4,80 3,90 5,20 3,20 5,60 2,60 2,70 3,50 2,90 3,00

46 2,93 6,00 6,00 6,00 6,00 3,90 4,20 4,40 3,70 2,90 2,10 2,70 2,70 2,60

47 2,83 6,00 5,40 6,00 5,00 6,00 3,60 3,90 5,80 3,40 3,10 4,30 3,20 3,30

48 2,93 5,40 6,00 6,00 5,10 3,80 4,40 4,60 4,80 3,20 3,30 3,40 3,20 2,90

IA 0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160

Média 0,8295 0,9725 0,9725 0,8175 0,715 0,4763 0,5313 0,6475 0,2125 0,0387 0,105 0,0205

-0,0063

EPM 0,0827 0,0235 0,0184 0,0709 0,1258 0,098 0,1005 0,1148 0,1228 0,067 0,0652 0,0319 0,0338

Tabela 5: Resultados individuais correspondentes ao grupo controle (salina fisiológica), durante o tempo de exposição ao teste de tail-flick, após

pré-tratamento de 24h por via intraperitoneal.

___________________________________________________________________________________________________________Anexos

90

Animal Média LRC

0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160

49 3,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 4,30 2,70 3,90 4,40 6,00 3,50 2,30 3,50

50 2,80 6,00 3,30 3,10 4,40 3,50 3,40 2,50 4,30 4,00 4,90 4,00 3,70 2,30

51 2,66 4,40 6,00 5,80 5,80 5,00 3,50 2,80 2,40 3,00 3,60 2,30 2,90 2,60

52 2,90 6,00 6,00 6,00 4,80 4,60 2,00 2,80 2,80 3,80 3,90 2,40 2,90 2,40

53 2,63 6,00 3,90 5,10 2,90 2,50 2,20 1,80 3,40 2,30 2,90 2,20 2,40 2,60

54 2,73 6,00 6,00 4,30 3,30 2,40 2,60 2,50 3,40 2,90 2,60 2,60 3,00 2,60

55 2,86 5,50 6,00 6,00 3,30 2,70 2,50 2,30 2,40 3,30 2,40 2,60 2,70 1,90

56 3,06 6,00 4,20 3,20 2,50 2,00 2,30 2,70 2,20 2,50 2,60 1,90 2,80 2,00

IA 0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160

Média 0,92 0,7413 0,6613 0,4063 0,24 0,005 -0,1 0,0813 0,1425 0,2488

-0,0405

-0,0012

-0,1113

EPM 0,0605 0,1286 0,1439 0,151 0,165 0,0912 0,0313 0,0911 0,0807 0,145 0,0815 0,0531 0,0611


teste de tail-flick, após pré-tratamento de 24h por via intraperitoneal.

___________________________________________________________________________________________________________Anexos

91

Animal Média LRC

0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160

57 3,03 6,00 4,80 3,40 3,40 3,10 3,50 2,60 3,60 3,30 3,00 3,00 3,30 3,40

58 2,83 6,00 6,00 4,20 4,20 3,10 3,00 2,40 3,40 2,50 2,20 3,10 2,00 1,90

59 2,73 5,70 5,60 3,20 2,90 3,80 2,40 2,20 2,20 2,60 2,00 2,20 2,60 2,20

60 2,93 6,00 6,00 6,00 4,50 4,70 4,30 3,30 3,00 2,30 2,50 2,20 2,20 2,90

61 2,93 6,00 3,80 3,20 2,80 2,90 2,80 2,90 2,30 2,90 2,40 2,50 3,40 2,40

62 2,90 6,00 6,00 5,60 6,00 6,00 3,50 6,00 4,70 4,80 3,80 3,50 3,10 3,00

63 2,76 6,00 2,60 2,70 3,20 2,30 3,50 3,10 2,40 3,00 2,80 2,80 2,60 2,00

64 3,13 6,00 4,90 5,60 3,20 2,80 3,00 2,60 2,60 2,90 2,00 3,30 2,90 2,80

IA 0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160

Média 0,9888 0,6663 0,4363 0,2788 0,22 0,1112 0,0737 0,0388 0,0412

-0,1038

-0,205

-0,0463

-0,1025

EPM 0,0112 0,1368 0,1465 0,1241 0,1401 0,0647 0,1388 0,0952 0,088 0,0716 0,051 0,0522 0,0491



___________________________________________________________________________________________________________Anexos

92

Animal Média LRC

0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160

65 3,16 6,00 6,00 3,50 3,20 2,30 2,70 3,20 3,50 2,70 2,60 2,70 2,90 2,60

66 2,70 6,00 6,00 3,00 2,10 2,40 2,40 2,50 2,40 2,50 2,30 2,80 2,00 2,40

67 2,63 6,00 4,80 3,90 4,20 4,60 3,70 3,30 2,90 3,40 3,10 3,90 2,30 3,10

68 2,70 5,70 6,00 5,60 4,50 6,00 3,10 3,10 2,80 4,40 3,40 4,30 4,20 3,80

69 2,86 6,00 6,00 3,80 4,30 4,10 2,90 2,50 2,50 3,30 3,40 3,20 2,60 2,50

70 2,73 6,00 5,80 5,30 3,40 3,00 3,00 2,90 2,80 2,70 2,30 2,10 2,60 2,30

71 3,00 4,50 5,00 5,20 4,50 3,50 2,80 2,60 2,70 2,80 3,10 2,50 2,10 2,50

72 2,80 5,90 4,80 4,60 6,00 3,80 3,30 3,60 3,20 2,40 3,50 3,00 3,30 3,80

73 2,86 5,70 5,50 3,80 3,50 3,20 3,00 2,80 2,60 2,20 2,90 2,80 2,40 3,50

74 2,80 6,00 5,80 4,50 2,80 4,50 3,20 3,60 3,00 3,20 3,00 3,60 4,00 3,70

IA 0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160

Média 0,928 0,866 0,468 0,321 0,278 0,054 0,056 0,006 0,038 0,039 0,077 0,002 0,056

EPM 0,0491 0,0504 0,0871 0,1089 0,1173 0,0443 0,0452 0,0296 0,07 0,0473 0,0735 0,0785 0,0681



___________________________________________________________________________________________________________Anexos

93

Animal Média LRC

0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160

75 2,53 6,00 6,00 6,00 6,00 5,50 5,40 4,70 5,90 5,40 6,00 3,80 4,00 2,60

76 2,83 6,00 5,30 5,40 4,30 4,00 2,50 3,10 2,70 6,00 2,50 4,70 3,20 3,40

77 3,20 6,00 4,00 4,50 3,50 2,70 5,40 3,60 4,70 3,70 3,00 4,40 4,20 3,40

78 2,93 6,00 5,60 4,10 5,90 3,90 5,80 5,30 4,10 3,20 3,80 3,30 3,00 3,70

79 2,66 6,00 6,00 4,50 4,20 5,40 4,40 4,30 3,40 4,20 2,80 2,80 3,20 3,00

80 3,06 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 4,00 3,60 5,30 4,10 4,20 3,80 3,20 2,60

81 3,00 6,00 6,00 6,00 4,50 5,10 4,60 3,80 3,40 6,00 3,70 3,80 3,60 3,80

IA 0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160

Média 1 0,832 0,678 0,708 0,564 0,678 0,442 0,574 0,382 0,328 0,242 0,202 0,056

EPM 0 0,1378 0,1342 0,1814 0,2187 0,1123 0,1235 0,1333 0,1292 0,187 0,0733 0,0808 0,0662

Tabela 9: Resultados individuais do teste de retirada de cauda, correspondentes ao grupo sham (“cirurgia fictícia”), no CI, após administração

intraperitoneal de PTZ.

___________________________________________________________________________________________________________Anexos

94

Animal Média LRC

0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160

82 3,23 6,00 6,00 6,00 6,00 4,40 6,00 6,00 3,70 6,00 6,00 6,00 3,90 2,80

83 3,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 5,20 4,50 6,00 3,90 5,90 2,80

84 2,86 6,00 6,00 4,00 4,10 6,00 6,00 5,00 4,80 4,90 3,90 5,50 4,00 2,90

85 2,70 6,00 3,40 6,00 6,00 4,60 6,00 4,80 3,60 3,40 3,90 4,10 3,20 3,90

86 3,26 6,00 4,30 6,00 6,00 6,00 5,40 6,00 6,00 4,10 4,90 3,60 5,90 6,00

87 2,93 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 5,00 6,00 4,50 3,90

88 2,86 6,00 6,00 6,00 4,00 6,00 5,80 6,00 6,00 6,00 4,90 4,20 3,80 2,90

89 2,86 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 4,60 2,60 2,10 2,70

90 3,26 6,00 6,00 5,80 5,90 5,30 4,90 4,60 6,00 5,50 3,80 5,80 4,10 2,70

IA 0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160

Média 1 0,8433 0,9211 0,8567 0,86 0,9244 0,8678 0,7544 0,7211 0,5956 0,5511 0,3956 0,1356

EPM 0 0,1046 0,0706 0,0912 0,0749 0,0472 0,0682 0,1116 0,1057 0,0928 0,1348 0,1274 0,1258

Tabela 10: Resultados individuais do teste de retirada de cauda, correspondentes ao grupo controle (microinjeção de salina fisiológica), no CI,

após administração intraperitoneal de PTZ.

___________________________________________________________________________________________________________Anexos

95

Animal Média LRC

0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160

91 3,00 6,00 5,90 3,70 3,20 3,30 3,60 3,40 2,80 3,00 4,50 3,10 3,20 2,70

92 2,80 6,00 6,00 3,90 3,10 5,50 3,70 4,30 3,10 2,70 3,90 2,80 3,50 2,60

93 3,00 6,00 4,90 4,80 4,50 3,70 3,70 2,60 2,80 2,50 3,20 3,10 2,70 3,00

94 2,76 6,00 5,80 5,10 4,10 3,20 2,90 2,50 3,10 2,60 2,70 2,80 3,10 2,80

95 2,70 6,00 5,00 5,00 3,00 3,60 2,60 3,40 2,90 2,80 2,80 2,70 2,60 2,90

96 2,66 6,00 6,00 6,00 4,10 2,90 3,10 2,50 3,20 2,60 2,70 3,30 2,90 2,90

97 2,76 6,00 6,00 4,80 5,00 3,30 3,40 3,30 2,90 3,40 3,10 3,40 2,70 3,00

98 2,83 6,00 5,70 6,00 6,00 4,90 4,80 3,70 3,20 3,40 2,80 3,30 3,30 2,80

99 3,00 6,00 6,00 6,00 6,00 3,70 5,80 3,70 4,00 3,40 2,60 3,50 2,80 3,40

IA 0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160

Média 1 0,8938 0,6525 0,41 0,3088 0,2088 0,155 0,0987 0,0525 0,1375 0,1113 0,0925 0,0488

EPM 0 0,516 0,0971 0,1161 0,0995 0,069 0,0995 0,0617 0,0852 0,0971 0,0723 0,0744 0,0635

Tabela 11: Resultados individuais do teste de retirada de cauda, correspondentes ao grupo microinjeção de naloxonazine 1µg/0,2µl, no CI, após

administração intraperitoneal de PTZ.

___________________________________________________________________________________________________________Anexos

96

Animal Média LRC

0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160

103 3,00 6,00 5,30 3,50 3,20 3,10 2,90 2,60 2,70 2,90 2,50 2,50 2,80 2,90

100 2,90 4,70 3,60 3,40 2,80 3,00 3,50 2,80 3,50 2,50 3,20 2,60 2,90 2,50

101 2,56 6,00 6,00 3,80 2,70 2,80 3,30 2,80 2,80 3,20 2,70 3,40 3,10 3,20

102 2,90 6,00 6,00 4,60 3,50 3,70 2,70 2,60 3,50 2,50 3,10 2,50 2,60 3,20

103 2,83 6,00 5,90 4,20 3,40 3,40 3,10 3,20 2,90 3,20 3,30 3,00 2,80 2,70

104 3,06 6,00 4,50 2,80 1,90 2,10 2,20 2,50 3,70 3,00 3,00 3,10 1,80 2,80

105 3,16 6,00 3,60 3,60 2,50 3,20 2,90 2,80 3,50 3,20 3,20 2,90 3,10 3,00

106 2,63 6,00 6,00 3,10 2,40 2,60 2,60 2,30 1,80 2,40 2,10 2,50 1,80 2,30

107 2,63 6,00 2,90 2,60 3,20 3,00 3,30 2,90 2,60 3,30 3,50 2,70 3,50 2,60

IA 0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160

Média 0,9475 0,5863 0,215 0 0,045 0,0288

-0,0388 0,0875 0,0263 0,0538

-0,0213

-0,0263

-0,0087

EPM 0,0525 0,1405 0,077 0,0744 0,0615 0,0631 0,0411 0,0399 0,0463 0,0446 0,0465 0,0717 0,037



___________________________________________________________________________________________________________Anexos

97

Animal Média LRC

0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160

108 2,63 6,00 3,60 2,60 2,50 3,10 3,00 2,50 3,60 2,60 2,50 2,90 2,60 2,50

109 2,76 6,00 4,90 5,40 4,80 3,80 2,80 3,80 4,00 2,50 2,70 3,00 3,50 3,40

110 2,80 6,00 3,60 3,90 2,70 3,60 3,40 3,00 2,90 3,50 2,90 2,50 2,90 2,90

111 2,90 6,00 6,00 4,70 5,70 3,20 3,20 3,10 4,20 3,20 2,80 3,20 3,10 3,40

112 2,76 6,00 6,00 6,00 4,00 4,00 2,80 3,50 2,90 2,50 3,00 2,80 3,00 3,30

113 3,00 5,30 3,00 2,60 1,50 2,20 2,00 2,30 1,60 2,60 2,50 2,10 2,70 2,90

114 2,80 3,20 3,20 2,90 3,50 3,00 1,30 2,60 2,70 1,10 1,40 2,10 1,60 1,70

IA 0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160

Média 0,8429 0,4757 0,3743 0,2229 0,14

-0,0543 0,0486 0,0943

-0,0729

-0,0857 -0,05

-0,0143 0,0214

EPM 0,1231 0,1555 0,1651 0,1762 0,0814 0,0936 0,0697 0,1162 0,0889 0,0654 0,0598 0,0716 0,0708



___________________________________________________________________________________________________________Anexos

98

Grupo Tempo de processo convulsivo (seg)

Média ± EPM.

Sham (SH) 723 ± 126,96

Salina fisiológica (SL) 1388,11 ± 431,92

Naloxonazine 1µg/0,2µl (NLX 1) 405,05 ± 32,22



Tabela 14: Resultados individuais do tempo de processo convulsivo, correspondentes aos grupos sham (SH), salina fisiológica (SL), microinjeção

de naloxonazine 1µg/0,2µl (NLX 1), naloxonazine 2µg/0,2µl (NLX 2) e naloxonazine 3µg/0,2µl (NLX 3), no CI, após administração

intraperitoneal de PTZ.

___________________________________________________________________________________________________________Anexos

99

Artigo Científico Publicado

DE FREITAS e col., Pharmacology, Biochemistry and Behavior, 79: 367-376, 2004.

Co-autora

(FELIPPOTTI, T.T.)

envolvimento de receptores opiÓides µ e das … · reflexo flexor de retirada (woolf, 1994). a...

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