ensaios+imunoquÍmicos+1+ (1)

ENSAIOS IMUNOQUMICOS Tcnicas Imunolgicas Ensaios Hormonais

BIOMEDICINA FIELDAISY DE SOUZA ARAJOPATOLOGISTA-CLNICO

Reaes imunoqumicasReao - ANTGENO + ANTICORPO princpio bsico: deteco deste complexo

Reao qumica especial

Reconhecimento do antgeno (depende do tipo de antgeno a ser pesquisado))

Superfcie da clula Disperso em soluo Sensibilidade (anticorpos policlonais ou monoclonais, classe deanticorpo)

Parmetros que dependem do Anticorpo Utilizado

Especificidade anticorpos policlonais ou monoclonais, classe deanticorpo)

Afinidade Avidez DiversidadePATOLOGISTA-CLNICO

DAISY DE SOUZA ARAJO

Classificao dos ImunoensaiosClassificaoREAGENTES Precipitao NO MARCADOS Aglutinao de Partculas Radio-imunoensaio

SinalizadorNenhum Ltex, gelatina Cluas Radioistopos Enzimas

Deteo do sinalvisual (olho nu) turbidez, nefelometria visual (olho nu) contagem de partculas Contagem ftons

Sensibilidade10 microgramas/mL

Automatizvel?

No No No SIM SIM SIM SIM

5 microgramas/mL 5 picogramas/mL

REAGENTES MARCADOS

Enzimticos Fluorescentes Quimioluminescentes

Espectrofotometria Fluorometeia 0,1 picogramas/mL Contagem ftons Fluorometria Fluorforos 5 picogramas/mL Contagem ftons Compostos Fluorometria 5 picogramas/mL quimioluminescentes Contagem ftons Combinados

Combinados (Axsym) Combinados

varivel


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Reaes de PrecipitaoQUANTIFICAO dos complexos formados pela reaoAntgeno+anticorpo que se precipitam no meio.

Reao Antgeno x Anticorpo REVERSVELO precipitado se dissolve quando h excesso de um dos componentes: FENMENO PR0-ZONA

Desnecessria separao do complexo antgeno+anticorpo (fase ligada) das substncias livres no meio COMPLEXO ANTGENO-ANTICORPO pode ser quantificado:

visualmente a olho nu visualmente usando um microscpio por medida da turbidez (turbidimetria) quantificado por nefelometriaPATOLOGISTA-CLNICO


Reaes de PrecipitaoFatores interferentes:

Concentraes do antgeno e do anticorpo presentes no sistema (amostra+reagente) Outros fatores fsico-qumicos (temperatura, pH) Precipitao mxima: concentraes equivalentes de Antigeno (Ag) e Anticorpo (Ac)

Sensibilidade:

10 microgramas/mLPATOLOGISTA-CLNICO



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triagem inicial p/ SFILIS OU LUES

Reaes de Precipitao Direta Clssica

Mtodos no treponmicos e INESPECFICOS Sensibilidade:

VDRL Venereal Desease Research Laboratory RPR Reagina Plasmtica Rpida RPS - Reagina Para Sfilis medido nestas reaes: presena de anticorpos para o material lipoproteico das clulas danificadas pela doena. presena de anticorpos para a cardiolipina dos Treponemas

78% na fase primria (74 a 87%) 100% na fase secundria 95% na fase latente (88 a 100%) 71% na fase tardia (37 a 94%)PATOLOGISTA-CLNICO


Reaes de Precipitao DERIVADASMANUAIS

Imunodifuso Imuno-eletroforese (contra imuno eletroforese) Imunofixao Eletroimunodifuso

UTILIZADAS EM LABORATRIOS DE PESQUISA

AUTOMATIZADAS

NEFELOMETRIA E TURBIDIMETRIA

UTILIZADAS EM GRANDES LABORATRIOS


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Nefelometria e TurbidimetriaPossibilidade de Automao total Nefelmetros Equipamentos de bioqumica (turbidimetria) Dosagem de protenas em sangue e outros fluidos (exemplo LCR)

Alfa 1 glicoprotena cida (mucoprotena) Fator Reumatide Microalbumina Protena C Reativa Apoliproprotena inmeras outras substncias (imunoglobulinas, transferrina etc)PATOLOGISTA-CLNICO



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Reaes de AglutinaoFormao de agregados grandes de partculas com mltiplos determinantes antignicos interligados por pontes moleculares de anticorpos; Ligao: stios antignicos iguais em diferentes partculas Detectam tanto a presena de IgM quanto de IgG Visualizao: depende do tamanho dos agregados formados Pode ser realizadas em placas, tubos ou lminas:DAISY DE SOUZA ARAJOPATOLOGISTA-CLNICO

Reaes de Aglutinao Fatores interferentes:Classe do Anticorpo envolvido; Eletrlitos; Macromolculas Hidroflicas; Enzimas; pH (6 a 8); Tempo; TemperaturaDAISY DE SOUZA ARAJOPATOLOGISTA-CLNICO


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Falso NegativasQuantidade pequena de anticorpos:

a partcula ficar com o anticorpo preso a sua superfcie (sensibilizada), no formando pontes e no aglutinando;

Quantidade muito grande de anticorpos (fenmeno Pr-zona)DAISY DE SOUZA ARAJOPATOLOGISTA-CLNICO

TIPOS DE PARTICULAS UTILIZADAS1.

Determinantes antignicos Naturais:Eritrcitos humanos determinao grupo sangneo ABOBactrias SLIDEX meningites Protozorios

2. Partculas inertes revestidasLtex (mais comum) teste de gravidezGelatina Betonita, polipeptdeos3.

Clulas antigenicamente no relacionadasClulas revestidas com antgenos solveis: ou com antgenos solveis adsorvidos ou fixados Hemcias e bactrias


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Aglutinao: Tcnicas mais Utilizadas

Aglutinao direta : ex teste de gravidez Aglutinao passiva Hemaglutinao direta: ABO RH Hemaglutinao indireta: Toxoplasmose Hemaglutinao Passiva Inibio de Hemaglutinao Inibio de Hemaglutinao passivaDAISY DE SOUZA ARAJOPATOLOGISTA-CLNICO


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Imunofluorescncia Manual 1Baseia-se na capacidade das molculas de anticorpo se ligarem covalentemente a fluocromos, mantendo a especificidade contra o antgeno. Reagentes Utilizados:

Anticorpos Marcados (Fluocromos Isotiocianato de Fluorescena* ) Glicerina Alcalina Corantes (Azul de Evans)PATOLOGISTA-CLNICO


Imunofluorescncia Manual 2 - DIRETAA reao Ag-Ac detectada pela emisso de fluorescncia Pesquisa de antgeno amostra (Ag??) + Ac especfico conjugado a substncia fluorescente (conjugado)* microscpio de fluorescnciaDAISY DE SOUZA ARAJOPATOLOGISTA-CLNICO


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Imunofluorescncia Manual 3 IFI - INDIRETAA- pesquisa de antgeno amostra (Ag??) + Ac especfico Ag-Ac * Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina * microscpio de fluorescncia * lavagens B- pesquisa de anticorpos Ag (lmina) + soro do paciente (Ac??) Ag-Ac * Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina * microscpio de fluorescncia determinao do ttulo e classe do AcDAISY DE SOUZA ARAJOPATOLOGISTA-CLNICO


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IMUNO-ENSAIOS QUANTITATIVOS classificao tipo de reao (cintica)COMPETITIVOS

H competio entre a substncia presente na amostra (ou o padro) e outro marcado com alguma substncia geradora de sinal, por uma quantidade limitada de anticorpos especficos variante: Radioimunoensaio (RIA).So utilizados dois anticorpos, um ligado fase slida e outro marcado com alguma substncia geradora de sinal, que se ligam a SUBSTNCIA em estudo - Mais preciso e reprodutvel, e possui nveis de sensibilidadeanaltica superiores. Desvantagem, precisam ter dois eptodos. Variante: ImunomtricoPATOLOGISTA-CLNICO

NO COMPETITIVOS:



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Competitivo ou noCompetitivo:

No Competitivo

Quanto maior a concentrao do analito menor a contagem do sinal Amostras positivas tem leitura abaixo do valor limiar ou cutoff

Quanto maior a concentrao do analito maior a contagem do sinal Amostras positivas tem leitura acima do valor limiar ou cutoff


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IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOS:

COMPETITIVOS

anticorpo primrio na fase slida (pag963) e antgeno marcado 964) e antgeno marcado

anticorpo secundrio na fase slida (pag

NO COMPETITIVOSSEQUENCIAL SANDUCHE


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IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOS:Marcador radioativo: Radioimunoensaio (RIE) Imunorradiomtrico (IRMA) Marcador enzimtico Enzimaimunoensaio (EIA) ELISA - Ensaio imunoenzimtico MEIA - Ensaio imunoenzimtico de micropartculas Marcador FLUORESCENTE Imunofluoromtrico (IFMA) FPIA Fluorescence polarization immunoassay ELFA - Enzyme Linked Fluorescent Assay Marcador QUIMIOLUMINESCENTE Quimioluminescncia convencional EQL, Eletroquimioluminescncia (ECLIA) Ensaio imunolgico quimioluminescente magntico CMIADAISY DE SOUZA ARAJOPATOLOGISTA-CLNICO

CLASSIFICAO TIPOS / SIGLAS


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IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOS:

Fatores Interferentes:Reao cruzada: Ocorrem devido a, baixaespecificidade dos anticorpos utilizados e o uso de anticorpos policlonais.

Presena de Anticorpos Heterfilos: Resultados falso positivos oualtos em pacientes transplantados ou submetidos a tratamento com antoicorpos monoclonais


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IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOS

Fatores interferentes IIContagem de fundo elevada (Background) Leituras mais elevadas do que as reais por ligao inespecfica de constituintes do soro ao suporte slido, lavagens inadequadas ou conjugados de pobre afinidade. Efeito HooK Resultados menores do que o esperado na quantificao de substncias que na realidade encontram- se elevadas, bloqueando a ligao.DAISY DE SOUZA ARAJOPATOLOGISTA-CLNICO


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Ensaios com marcadores RADIOATIVOS RIA, RIE, IRMApouco usado na rotina: exige profissional com credenciamento na CNEN (curso de seis meses em So Paulo) um dos componentes do sistema marcado com istopo radioativoensaios competitivos : o reagente marcado = substncia que se quer dosar (antgeno) (RIA/RIE) ensaios no competitivos: o reagente marcado um segundo anticorpo (IRMA) O radioistopo mais utilizado o I125 (57,5 dias)DAISY DE SOUZA ARAJOPATOLOGISTA-CLNICO

Ensaios com marcadores ENZIMTICOS EIA, ELISA, MEIA, ELFA

EIA MEIAELFA

Enzyme Imunoassay - Ensaio imunoenzimtico

ELISA -

Enzyme- Linked ImmunoSorbent Assay

Microparticule Enzyme Immuno Assay

ou Ensaio imunoenzimtico de micropartculas Enzyme- Linked Fluorescent Assay: Ensaio imuno-enzimtico fluorescente


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ETAPAS ELISA, EIAsensibilizao (ou cobertura) da fase slida: adio de Ag ou do Ac bloqueio (protena inerte: soro fetal bovino, leite desnatado) * adio da amostra (em diluente) * adio do conjugado: anticorpo purificado marcado com enzima (ex: peroxidase) * adio do substrato cromognico: peroxidase: H2O2 (substrato) + OPD (ortofenilenodiamina) interrupo da reao: SDS ou cido forte leitura: leitor de ELISA * lavagensDAISY DE SOUZA ARAJOPATOLOGISTA-CLNICO


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EIA ELISAVantagens e DesvantagensSensibilidade, especificidade e simplicidade da tcnica; Cuidados com interferentes, reaes cruzadas Versatilidade, rapidez, baixo custo e objetividade da leitura; Erros operacionais, variveis analticas Adaptao a diferentes graus de automao Instabilidade dos reagentes Influncia em manipulaes e do equipamentoDAISY DE SOUZA ARAJOPATOLOGISTA-CLNICO


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Ensaios com marcadores FLUORESCENTES MEIA, ELFA, FPIAMEIAELFA Microparticule Enzyme Immuno Assay ou Ensaio

imunoenzimtico de micropartculas (deteco fluorescente Axsym) (ABBOTT) Enzyme- Linked Fluorescent Assay: Ensaio imuno-

enzimtico fluorescente

IFMA: Immuno FluoroMetric Assay ou ensaioImunofluoromtrico

FPIA: Fluorescence Polarization ImmunoAssayDAISY DE SOUZA ARAJOPATOLOGISTA-CLNICO

Ensaios com marcadores

FLUORESCENTES

Utilizam enzimas com substratos Fluorescentes Utilizam aparelhos denominados de Fluormetros; As tcnicas diferem quanto ao suporte slido As tcnicas diferem tambm forma de ampliar o sinal; Exemplos: MEIA, ELFA, FEIA; FPIA Possui sensibilidade e especificidades elevadas; Bom mtodo para dosagens hormonaisDAISY DE SOUZA ARAJOPATOLOGISTA-CLNICO


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QUIMIOLUMINESCNCIA IReao entre o Ag/Ac, marcada com fosfatase alcalina. Hidrolisa o substrato Quimioluminescente gerando um produto instvel o qual aps estabilizao gera emisso de ftons de luz medida por FM, que tem a funo de transformar a luz emitida pelos ftons em impulsos eltricos(CPS). So reaes de oxidao luz no espectro visvel;DAISY DE SOUZA ARAJOPATOLOGISTA-CLNICO

QUIMIOLUMINESCNCIA IIA sensibilidade de um mtodo enzimtico aument cerca de dez vezes mais substituindo um substrato cromognico por um luminescente; a emisso de luz produzida em algumas reaes qumicas envolvendo molculas que emitem luz, quando passam do estado de excitao para o basal eletrnico; So altamente sensveis; Mtodo de escolha para quantificao de substncias, como hormnios e marcadores tumorais.DAISY DE SOUZA ARAJOPATOLOGISTA-CLNICO


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QUIMIOLUMINESCNCIAPra que serve??? Qual vantagem?1. UTILIDADES: Dosagem de marcadores tumorais (PSA, CA-125, CA 15-3, CA-19-9, CEA, AFP) HORMNIOS DOENAS INFECCIOSAS: HIV, Hepatites, VITAMINAS DOSAGEM DE IGE TOTAL HOMOCISTENA 2. VANTAGENS: Sensibilidade 10 x maior na troca de substrato cromognico por um luminescenteDAISY DE SOUZA ARAJOPATOLOGISTA-CLNICO

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