ensaios analÍticos para pesquisa de alprazolam em urina de...
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DA PARAIacuteBA
CENTRO DE CIEcircNCIAS BIOLOacuteGICAS E DA SAUacuteDE
DEPARTAMENTO DE FARMAacuteCIA
CURSO DE BACHARELADO EM FARMAacuteCIA
MONALISA MACIEL COSTA
ENSAIOS ANALIacuteTICOS PARA PESQUISA DE ALPRAZOLAM
EM URINA DE PACIENTES INTOXICADOS
CAMPINA GRANDE -PB
2012
MONALISA MACIEL COSTA
ENSAIOS ANALIacuteTICOS PARA PESQUISA DE ALPRAZOLAM
EM URINA DE PACIENTES INTOXICADOS
Trabalho de Conclusatildeo de Curso apresentado ao Curso
de Graduaccedilatildeo em Farmaacutecia da Universidade Estadual
da Paraiacuteba em cumprimento agrave exigecircncia para obtenccedilatildeo
do grau de Bacharel em Farmaacutecia
Orientadora Profordf Drordf Sayonara Maria Lia Fook
CAMPINA GRANDE-PB
2012
FICHA CATALOGRAacuteFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL ndash UEPB
C837e Costa Monalisa Maciel
Ensaios analiacuteticos para pesquisa de Alprazolam em urina
de pacientes intoxicados [manuscrito] Monalisa Maciel
Costa ndash 2012
29 f il color
Digitado
Trabalho de Conclusatildeo de Curso (Graduaccedilatildeo em
Farmaacutecia) ndash Universidade Estadual da Paraiacuteba Centro de
Ciecircncias Bioloacutegicas e da Sauacutede 2012
ldquoOrientaccedilatildeo Profa Dra Sayonara Maria Lia Fook
Departamento de Farmaacuteciardquo
1 Intoxicaccedilatildeo 2 Medicamento 3 Cromatografia 4
Espectroscopia I Tiacutetulo
21 ed CDD 6159
ENSAIOS ANALIacuteTICOS PARA PESQUISA DE ALPRAZOLAM
EM URINA DE PACIENTES INTOXICADOS
Costa Monalisa Maciel1 Fook Sayonara Maria Lia
2
RESUMO
Os medicamentos se apresentam como o principal agente toacutexico responsaacutevel pelos casos de
intoxicaccedilotildees humanas constituindo portanto um grande desafio para os que trabalham com a
Sauacutede Puacuteblica Todavia a ausecircncia de um serviccedilo especializado de anaacutelises toxicoloacutegicas
dificulta um diagnoacutestico mais preciso dos casos As teacutecnicas cromatograacuteficas e
espectrofotomeacutetricas podem auxiliar na confirmaccedilatildeo do diagnoacutestico A Cromatografia em
Camada Delgada Comparativa (CCDC) eacute uma teacutecnica de separaccedilatildeo simples de baixo custo e de
boa sensibilidade A identificaccedilatildeo do faacutermaco pode ser alcanccedilada tanto quantitativamente como
qualitativamente atraveacutes da Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier
(FTIR) Esta pesquisa teve como proposta avaliar duas teacutecnicas para identificaccedilatildeo de Alprazolam
em urina de pacientes com exposiccedilatildeo toxica por medicamentos avaliando a seletividade
exatidatildeo limite de detecccedilatildeo limite de quantificaccedilatildeo e robustez nas teacutecnicas cromatograacuteficas O
meacutetodo foi otimizado validado e aplicado de acordo com a Resoluccedilatildeo RDC ndeg 899 de 29 de
maio de 2003 O ensaio utilizou placas cromatograacuteficas de Siacutelica Gel G-60 eluiccedilatildeo em
clorofoacutermio-metanol 91(vv) e como agente cromogecircnico o Reativo de Dragendorff A presenccedila
do faacutermaco foi confirmada por analises no FTIR O meacutetodo mostrou-se seletivo nas condiccedilotildees
cromatograacuteficas estabelecidas apresentando Limite de Quantificaccedilatildeo e Detecccedilatildeo de 200μgml e
100μgml respectivamente Dentre as amostras dos pacientes intoxicados por medicamentos natildeo
se obtive resultados positivo para o Alprazolam As anaacutelises no FTIR mostraram que o faacutermaco
natildeo sofreu degradaccedilatildeo no processo de extraccedilatildeo O meacutetodo demonstrou atender aos requisitos de
boas praacuteticas exigidos pela RDC ndeg 899 de 29 de maio de 2003 sendo sensiacutevel e exato
Palavras-Chave Alprazolam Espectroscopia Cromatografia Intoxicaccedilatildeo
___________________________________________________________________
1 Acadecircmica de Farmaacutecia Generalista Universidade Estadual da Paraiacuteba (UEPB) monalisa_macielmsncom
2 Doutora em Farmacologia (UFPB) Coordenadora do Centro de Assistecircncia Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox
CG) Departamento de Farmaacutecia ndash Universidade Estadual da Paraiacuteba (UEPB)
3
1 INTRODUCcedilAtildeO
Os benzodiazepiacutenicos estatildeo entre os medicamentos mais utilizados em todo o mundo
estima-se que entre 1 e 3 de toda a populaccedilatildeo ocidental jaacute tenha consumido
benzodiazepiacutenicos regularmente por mais de um ano Em virtude do menor potencial de causar
dependecircncia e maior iacutendice terapecircutico essas substacircncias tonaram-se os mais utilizados entre os
medicamentos com propriedades sedativas (HUF LOPES ROSENFELD 2000)
O Alprazolam eacute um faacutermaco que se apresenta em forma de cristais branco praticamente
insoluacutevel em aacutegua sendo soluacutevel em metanol e etanol Este faacutermaco eacute um anaacutelogo triazolo 14
benzodiazepina apresentando polimorfismo Pertence ao grupo dos benzodiazepiacutenicos de alta
potecircncia indicado para o tratamento dos transtornos de ansiedade do pacircnico e de ansiedade
associada agrave depressatildeo que apresenta menor efeito sedativo em comparaccedilatildeo a outros
medicamentos da mesma classe Eacute considerado um benzodiazepiacutenico de alta potecircncia e meia-vida
intermediaacuteria entre 12 e 16 horas (STOPPE 2004 KASSAB 2009)
O Alprazolam atua de modo seletivo sobre os receptores Aacutecido Gama-Aminobutiacuterico tipo
A (GABAA) alterando sua conformaccedilatildeo e aumentando a frequecircncia de abertura dos canais de
cloro potencializando assim o efeito inibitoacuterio do GABA provocando efeitos ansioliacuteticos e
sedativos caracteriacutesticos das benzodiazepinas Eacute metabolizado no fiacutegado pelo complexo do
citocromo P450 e biotransformado em dois importantes mataboacutelitos ativos a α-
hidroxialprazolam e 4-hidroxialprazolam Eacute excretado principalmente na urina sob a forma de
glucuroniacutedeos mas pode ainda ser eliminado atraveacutes do suor saliva e leite materno
(GONCcedilALVES CARVALHO BATISTA 2008)
O Relatoacuterio Anual de 2009 da Associaccedilatildeo Americana dos Centros de Controle de
Envenenamento registrou aproximadamente 25 milhotildees de eventos toacutexicos em humanos Destes
526 ocorreram em crianccedilas menores de 5 anos de idade e envolveram principalmente
medicamentos e cosmeacuteticos No Brasil o Sinitox consolidou a ocorrecircncia de aproximadamente
102 mil casos de intoxicaccedilatildeo humana Deste total os medicamentos responderam por 2647 e a
faixa etaacuteria mais acometida foi a de crianccedilas de 1 a 4 anos de idade (AMERICAN 2012
SISTEMA 2012)
4
O fato dos medicamentos serem apontados como a principal causa das intoxicaccedilotildees no
Brasil nas uacuteltimas deacutecadas aumenta o desafio dos laboratoacuterios de anaacutelises toxicoloacutegicas a
desenvolverem metodologias analiacuteticas para a pronta pesquisa e identificaccedilatildeo de faacutermacos
envolvidos nos casos de intoxicaccedilatildeo aguda (AMEacuteRICO MOSSIN NISHIYAMA 2008)
Afirma Karp (2005) que a cromatografia por se tratar de um meacutetodo fiacutesico-quiacutemico pode
ser utilizada para analisar identificar ou separar os componentes de uma mistura em amostras
bioloacutegicas A separaccedilatildeo de dois ou mais compostos estaacute fundamentada na distribuiccedilatildeo
diferencial dos componentes entre duas fases uma estacionaacuteria e outra moacutevel imisciacutevel
A Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC) pode ser utilizada no
diagnoacutestico de exposiccedilotildees toacutexicas por medicamentos por apresentar procedimentos analiacuteticos
raacutepidos de faacutecil execuccedilatildeo abrangentes de baixo custo auxiliando na identificaccedilatildeo de
psicofaacutermacos como o Alprazolam (TRUJILLO et al 2007 AMEacuteRICO MOSSIN
NISHIYAMA 2008)
A Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier - FTIR pode ser usada
para identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo de compostos orgacircnicos inorgacircnicos e polimeacutericos
Basicamente o que se mede nesta anaacutelise eacute a fraccedilatildeo da energia transmitida ou absorvida em
relaccedilatildeo agrave incidente em determinado comprimento de onda ou nuacutemero de onda
Ateacute recentemente a espectroscopia na regiatildeo do infravermelho era pouco utilizada em
anaacutelises quantitativas em decorrecircncia de algumas limitaccedilotildees inerentes agrave teacutecnica Poreacutem com a
utilizaccedilatildeo da transformada de Fourier aliada agrave evoluccedilatildeo de teacutecnicas quimiomeacutetricas ao advento
dos microprocessadores digitais e de teacutecnicas computacionais avanccediladas permitiu-se a anaacutelise de
misturas complexas como os medicamentos (SOUZA et al 2004) A identificaccedilatildeo destas
substacircncias pode ser alcanccedilada tanto quantitativamente como qualitativamente atraveacutes da
espectroscopia por refletacircncia difusa no infravermelho com transformada de Fourier Diffuse
Reflectance Infrared Fourier Transform Spectroscopy - DRIFTS (YANG IRUDAYARAJ
2002)
Entretanto para garantia da seguranccedila dos resultados de doseamento os meacutetodos para a
determinaccedilatildeo quantitativa ou semi-quantitativa de faacutermacos devem ser validados para que se
tornem uacuteteis e confiaacuteveis e possam ser utilizados na rotina laboratorial (ROCA et al 2007
MOJSIEWICZ-PIEŃKOWSKA 2011)
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A validaccedilatildeo consiste no ato de tornar legiacutetimo ou legal um meacutetodo equipamento sistema
ou metodologia atraveacutes do estabelecimento de documentaccedilotildees visando diminuir ou controlar os
fatores que levam agrave imprecisatildeo ou inexatidatildeo para garantir a confiabilidade e rastreabilidade dos
dados gerados Para validar um meacutetodo eacute essencial que sejam incluiacutedos pelo menos os seguintes
paracircmetros exatidatildeo precisatildeo fidelidade linearidade limite de detecccedilatildeo e limite de
quantificaccedilatildeo sensibilidade especificidade recuperaccedilatildeo robustez estabilidade e intervalo de
aplicaccedilatildeo (RIBANI et al 2004 LANCcedilAS 2004 VALENTINI SOMMER MATIOLI 2007)
A otimizaccedilatildeo das metodologias analiacuteticas possibilita a aplicaccedilatildeo de teacutecnicas
cromatograacuteficas e espectrofotomeacutetricas em amostras bioloacutegicas na rotina de um laboratoacuterio de
emergecircncia toxicoloacutegica e nos serviccedilos puacuteblicos de sauacutede auxiliando na confirmaccedilatildeo do
diagnoacutestico e no prognoacutestico dos pacientes com histoacuterico de exposiccedilatildeo toacutexica por medicamentos
Assim esta pesquisa teve como objetivo realizar ensaios cromatograacuteficos avaliando a
seletividade exatidatildeo limite de detecccedilatildeo limite de quantificaccedilatildeo e robustez para pesquisa de
Alprazolam em amostras bioloacutegicas de pacientes com diagnoacutestico de exposiccedilatildeo toacutexica a
medicamentos A confirmaccedilatildeo dos resultados foi realizada atraveacutes da Espectroscopia
Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR)
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
No Brasil e outros paiacuteses como Alemanha Canadaacute e Inglaterra os medicamentos vecircm
preocupando as autoridades e os profissionais de sauacutede pois se apresentam como o principal
agente toacutexico responsaacutevel pelos casos de intoxicaccedilotildees humanas constituindo portanto um
grande desafio para os que trabalham com a Sauacutede Puacuteblica (FALCAtildeO 2004 SISTEMA
2012)
Vaacuterios episoacutedios histoacutericos marcaram acidentes com medicamentos em 1937 mais de 100
crianccedilas morreram nos Estados Unidos pelo uso de um elixir sulfanilamida que continha como
veiacuteculo o dietilenoglicol Em 1938 como consequecircncia deste evento foi aprovada nos Estados
Unidos a lei que criou a ldquoFood and Drug Administrationrdquo (FDA) obrigando as induacutestrias
farmacecircuticas a fornecer informaccedilotildees a esta instituiccedilatildeo dados cliacutenicos sobre novos
6
medicamentos Um dos acidentes marcantes relacionado ao uso de medicamentos aconteceu na
Alemanha Oriental em 1961 pelo uso da Talidomida um hipnoacutetico natildeo barbituacuterico prescrito na
eacutepoca para tratar naacuteuseas e vocircmitos em mulheres graacutevidas aproximadamente 12000 crianccedilas
nasceram com focomelia (termo Grego que significa membro de focas e caracteriza um processo
de deformidade dos membros) Atraveacutes de estudos epidemioloacutegicos foi comprovado o efeito
teratogecircnico da Talidomida e como consequecircncia entre 1961 a 1962 foi retirada do mercado em
quase todo o mundo
Um marco na histoacuteria da organizaccedilatildeo da Assistecircncia Farmacecircutica no Brasil foi a
aprovaccedilatildeo da Poliacutetica Nacional de Medicamentos em 30 de outubro de 1998 pela Portaria nordm
3916 Esta Portaria contempla diretrizes como Adoccedilatildeo de Relaccedilatildeo de Medicamentos Essenciais
(Rename) Regulamentaccedilatildeo Sanitaacuteria de Medicamentos Reorientaccedilatildeo da Assistecircncia
Farmacecircutica Promoccedilatildeo do Uso Racional de Medicamentos Desenvolvimento Cientiacutefico e
Tecnoloacutegico Promoccedilatildeo da Produccedilatildeo de Medicamentos Garantia da Seguranccedila Eficaacutecia e
Qualidade dos Medicamentos e Desenvolvimento e Capacitaccedilatildeo de Recursos Humanos aleacutem de
definir prioridades relacionadas agrave legislaccedilatildeo incluindo Revisatildeo da Rename Assistecircncia
Farmacecircutica Promoccedilatildeo do Uso Racional de Medicamentos e a Organizaccedilatildeo das Atividades de
Vigilacircncia Sanitaacuteria de Medicamentos (BRASIL 2006)
Uma significativa parcela dos medicamentos prescritos no Brasil eacute da classe dos
psicofaacutermacos Estima-se que pelo menos 13 do total de faacutermacos consumidos no nosso paiacutes
envolva Benzodiazepiacutenicos Antidepressivos e Neuroleacutepticos Anticonvulsivantes ou estimulantes
do Sistema Nervoso Central (SNC) (LUCHETTI et al 2010)
Rodrigues et al (2006) afirmam que esse percentual estaacute relacionado ao aumento da
frequecircncia de diagnoacutesticos de transtornos psiquiaacutetricos na populaccedilatildeo agrave introduccedilatildeo de novos
psicofaacutermacos no mercado farmacecircutico e agraves novas indicaccedilotildees terapecircuticas de psicofaacutermacos jaacute
existentes
Os benzodiazepiacutenicos estatildeo entre as drogas mais prescritas no mundo Satildeo utilizados
principalmente como ansioliacuteticos e hipnoacuteticos aleacutem de possuir accedilatildeo miorrelaxante e
anticonvulsivante (AUCHEWSKI et al 2004)
Apoacutes sua comercializaccedilatildeo no iniacutecio dos anos 60 os Benzodiazepiacutenicos (BZD)
substituiacuteram praticamente todas as drogas utilizadas no tratamento da ansiedade - Barbituacutericos
Meprobamato Hidrato de Cloral e outros que provocavam seacuterios efeitos colaterais Isso ocorreu
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em virtude do maior iacutendice terapecircutico dessas substacircncias menor potencialidade de provocar
acidentes fatais e menor tendecircncia para produzir siacutendromes de abstinecircncia e toleracircncia
farmacoloacutegica (FORSAN 2010)
Embora sejam drogas relativamente seguras restriccedilotildees agrave sua utilizaccedilatildeo tecircm sido cada vez
maiores devido agrave incidecircncia dos efeitos colaterais relacionados agrave depressatildeo do sistema nervoso
central Dentre eles os principais satildeo a diminuiccedilatildeo da atividade psicomotora o prejuiacutezo na
memoacuteria a desinibiccedilatildeo paradoxal e a potencializaccedilatildeo do efeito depressor pela interaccedilatildeo com
outras drogas depressoras principalmente o aacutelcool Aleacutem disso a depressatildeo e a distimia (tipo de
depressatildeo crocircnica) podem ocorrer consequumlentemente ao uso de alprazolam e clonazepam
(LACERDA et al 2004)
Esta classe de faacutermacos constitui a primeira causa de exposiccedilotildees toacutexicas dentre os outros
grupos de medicamentos em nosso meio No entanto as intoxicaccedilotildees por essa classe
farmacoloacutegica excepcionalmente tecircm evoluccedilatildeo letal Exercem accedilatildeo sobre o sistema nervoso
central atraveacutes da ligaccedilatildeo aos receptores benzodiazepiacutenicos no complexo do receptor dos canais
de cloro do Aacutecido Gama-Aminobutiacuterico (GABA) As principais manifestaccedilotildees das intoxicaccedilotildees
por benzodiazepiacutenicos satildeo a depressatildeo neuroloacutegica da resposta ventilatoacuteria ao CO2 e diminuiccedilatildeo
da frequecircncia respiratoacuteria (OLIVEIRA et al 2010)
O diagnoacutestico das intoxicaccedilotildees pode ser realizado atraveacutes da histoacuteria do paciente
(anamnese) dos sinais cliacutenicos e laboratoriais
8
A Cromatografia em Camada Delgada (CCD) eacute uma teacutecnica de adsorccedilatildeo do tipo soacutelido-
liacutequida Nesse caso a separaccedilatildeo se daacute pela diferenccedila de afinidade dos componentes de uma
mistura pela fase estacionaacuteria (DEGANI CASS VIEIRA 1998) A fase estacionaacuteria
corresponde a uma camada fina formada por um soacutelido granulado geralmente siacutelica depositado
sobre uma placa de vidro alumiacutenio ou outro suporte inerte Este meacutetodo merece atenccedilatildeo especial
pela sua versatilidade rapidez sensibilidade e nitidez das separaccedilotildees (EIZENDEHER 2005)
A Espectroscopia Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) pode ser usada para
identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo de compostos orgacircnicos inorgacircnicos e polimeacutericos Basicamente o
que se mede nesta anaacutelise eacute a fraccedilatildeo da energia transmitida ou absorvida em relaccedilatildeo agrave incidente
em determinado comprimento de onda ou nuacutemero de onda (EVORA et al 2002)
A espectrometria FTIR permite a determinaccedilatildeo automatizada dos paracircmetros de maior
importacircncia na caracterizaccedilatildeo de amostras Hoje os instrumentos de FTIR satildeo informatizados o
que os torna mais raacutepidos e mais sensiacuteveis do que os instrumentos mais antigos dispersivos Ele
pode ser aplicado agrave anaacutelise de soacutelidos liacutequidos e gases Trata-se de uma metodologia que origina
rapidamente uma informaccedilatildeo sumaacuteria de 30 segundos por amostra eacute uma teacutecnica natildeo poluente jaacute
que natildeo utiliza reagentes aleacutem de natildeo necessitar de pessoal especializado para ser operada em
rotina (MOREIRA MARCOS BARROS 2002)
Para garantir que um novo meacutetodo analiacutetico gere informaccedilotildees confiaacuteveis e interpretaacuteveis
sobre a amostra ele deve passar por um processo de validaccedilatildeo A validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos
eacute o processo pelo qual eacute estabelecido por estudos de laboratoacuterio que as caracteriacutesticas
executadas do meacutetodo satisfazem aos requisitos para as aplicaccedilotildees analiacuteticas praticadas (RIBANI
et al2004 VALENTINI SOMMER MATIOLI 2007)
3 REFERENCIAL METODOLOacuteGICO
31 Dados epidemioloacutegicos
9
311 Delineamento do estudo e instrumento de coleta de dados
Tratou-se de uma pesquisa prospectiva descritiva e analiacutetica Os dados epidemioloacutegicos
foram coletados dos pacientes admitidos com histoacuteria de exposiccedilatildeo e ou intoxicaccedilatildeo por
medicamentos no Hospital de Emergecircncia e Trauma de Campina Grande atendidos e notificados
pelo Centro de Informaccedilatildeo Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) nos meses de agosto
e setembro de 2012 Utilizou-se a ficha do Sistema Nacional de Agravos de Notificaccedilatildeo
(Sinan)MS para a coleta dos dados epidemioloacutegicos desses pacientes (Anexo A)
312 Variaacuteveis demograacuteficas e socioeconocircmicas
Gecircnero
Faixa Etaacuteria
Ocupaccedilatildeo
313 Variaacuteveis relativas ao evento
Circunstacircncia
314 Variaacutevel relativa ao Agente Toacutexico
Os grupos de medicamentos foram classificados em categorias terapecircuticas segundo o
Anatomical-Therapeutical-ChemicalClassification System (ATC)
Os medicamentos pertencentes ao nono niacutevel dessa classificaccedilatildeo satildeo classificados como
os medicamentos que atuam no sistema nervoso central representado pela letra N Neste niacutevel
estatildeo incluiacutedos os psicodisleacutepticos ansioliacuteticos (NO5B) antipsicoacuteticos (NO5A) hipnoacutetico-
sedativos (NO5C) e os psicoanaleacutepticos antidepressivos (NO6A) e
estimulantespsicoestimulantes (NO6B)
315 Variaacuteveis relativas agrave intoxicaccedilatildeo
Avaliar os sinais e sintomas
Classificar os casos quanto agrave gravidade
10
Quanto ao item gravidade adotamos o seguinte criteacuterio com base no trabalho de King e
Palmisano 1989
Grave o paciente que permanece internado apoacutes procedimentos do tipo lavagem gaacutestrica
ou observaccedilatildeo meacutedica
Moderada ocorre algum procedimento do tipo lavagem gaacutestrica ou observaccedilatildeo meacutedica
mas sem internaccedilatildeo
Leve a famiacutelia recebe somente orientaccedilatildeo ou acompanhamento por telefone e nenhum
procedimento
Ignorada natildeo eacute possiacutevel classificar a extensatildeo do dano
Evoluccedilatildeo
Alta meacutedica (Cura)
Transferecircncia para outra unidade hospitalar
Ignorado
Oacutebito
32 DADOS EXPERIMENTAIS
321 Ensaios de Desenvolvimento e Validaccedilatildeo da Metodologia
Local da Pesquisa Laboratoacuterio de Desenvolvimento e Certificaccedilatildeo de Biomaterias do
Nordeste unidades da UEPB e UFCG
Materiais
Solventes reagentes e outros aparatos
-Alprazolam (faacutermaco) doaccedilatildeo feita pelo Nuacutecleo de odontologia e medicina Legal - NUMOL
-Medicamento (Medley) Alprazolam
-Acetona Vetec
11
-Clorofoacutermio Vetec
-Sulfato de Soacutedio Anidro Vetec
-Metanol (HPLC) Paneac
-Placas de Siacutelica Gel ALUGRAM SIL G 60F de (20x20) cm
2 foram adquiridas da Macherey-
Nagel (REF 818033)
-Cubas Cromatograacuteficas
-Papel de filtro Qualy
Equipamentos
-Estufa Med Clav
-Banho de Ultra-Som ULTRAsonic 1440A
-Centrifuga DCS-16 RV
-Cacircmera de Luz UV (λ=264nm)
-Espectrocircmetro FTIR SPECTRUM 400 Perkin-Elmer (4000 a 600 cm-1 para anaacutelise das
caracteriacutesticas do grupos funcionais dos faacutermacos)
322 Preparaccedilatildeo dos padrotildees
As soluccedilotildees estoque do faacutermaco foram preparadas pela dissoluccedilatildeo de cada composto em
metanol para obter a concentraccedilatildeo de 400 microg mL
323 Preparaccedilatildeo das Amostras
Procedimento de Extraccedilatildeo Extraccedilatildeo Liacutequido-Liacutequido (ELL)
Na fase de desenvolvimento do meacutetodo um importante passo foi a retirada dos
interferentes das amostras Para isto foram realizados vaacuterios procedimentos de Clean-up usando
ELL Para a ELL foi usado o meacutetodo de Stas-Otto que considera o caraacuteter aacutecidobase de cada
substacircncia do meio em que essa se encontra o seu grau de ionizaccedilatildeo como fatores influentes em
sua solubilidade em solventes orgacircnicos pois a partir de mistura desses em proporccedilotildees
adequadas pode-se submeter agraves amostras agrave ELL (FIGURA 01)
Terminada a extraccedilatildeo por sonicaccedilatildeo ou centrifugaccedilatildeo a fase orgacircnica foi recolhida
evaporada e ressuspendida para anaacutelise cromatograacutefica e espectrofotomeacutetrica
12
324 Teacutecnicas
Anaacutelise por CCD
A anaacutelise por CCD foi baseada na metodologia claacutessica descrita por Moraes (1991) com
adaptaccedilatildeo
Os resiacuteduos obtidos por ELL foram ressuspendidos em MetanolAacutegua (91) e aplicados
nas placas cromatograacuteficas previamente ativadas em estufas a 105ordmC por 30 minutos Aplicaram-
se nas placas aliacutequotas de 20 microL dos extratos obtidos por ELL Foi utilizado o sistema solvente
constituiacutedo de mistura de clorofoacutermio-metanol (91) e clorofoacutermio-acetona (41)
Os cromatogramas foram revelados usando meacutetodos quiacutemicos (agentes cromogecircnicos
Reativo de Dragendorff Difenilcarbazona Nitrato de Prata 1 e Cloreto Feacuterrico 5) e meacutetodo
fiacutesico (Cacircmera de Luz UV (λ=264nm)
Figura 01 - Esquema de extraccedilatildeo amostras
FONTE MORAES 1991
325 Estudo de seletividade e recuperaccedilatildeo
Seletividade
A seletividade do meacutetodo foi avaliada atraveacutes da extraccedilatildeo de 6 amostras diferentes de
urinas (n=6) por LLE e depois analisadas por CCDC
25 ml
13
Recuperaccedilatildeo
A extraccedilatildeo para avaliar a recuperaccedilatildeo foi realizada pela anaacutelise de amostras em
triplicatas contaminadas (fortificadas) em trecircs concentraccedilotildees do padratildeo de Alprazolam (baixa=
100microgml meacutedia=200 microgml e alta= 400 microgml)
326 O Limite de Detecccedilatildeo (LD) e o Limite de Quantificaccedilatildeo (LQ)
O Limite de Detecccedilatildeo eacute a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser
detectada mas natildeo necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento
experimental O Limite de Quantificaccedilatildeo eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia
em exame que pode ser medida utilizando um determinado procedimento experimental
O LD foi determinado por anaacutelise de urina contaminada em concentraccedilotildees decrescentes
de faacutermaco e medicamento ateacute a concentraccedilatildeo possiacutevel de se detectar a presenccedila de ambos O LQ
foi determinado por analise de urina contaminada em concentraccedilotildees decrescentes de faacutermaco e
medicamento ateacute a concentraccedilatildeo possiacutevel de se quantificar a presenccedila de ambos
327 Robustez
Na avaliaccedilatildeo da robustez foram utilizados como solventes o metanol a aacutegua uma soluccedilatildeo
de clorofoacutermio- acetona (41) e uma soluccedilatildeo de clorofoacutermio-metanol (91) para preparaccedilatildeo dos
padrotildees de Alprazolam
328 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier - FTIR
Foram feitas anaacutelises de soluccedilotildees metanoacutelicas ( 10 mgmL n=3) do faacutermaco padratildeo e suas
extraccedilotildees utilizando a faixa de varredura de 4000 a 500 cm-1
em temperatura ambiente
4 DADOS E ANAacuteLISE DA PESQUISA
41 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
No periacuteodo de agosto a setembro de 2012 o Ceatox-CG registrou 28 casos com histoacuteria
de intoxicaccedilatildeo por medicamentos Destes 18 casos foram classificados como
14
neuropsicofaacutermacos Na anaacutelise dos casos do uso isolado de medicamentos os Antiepileacutepticos
assim como os Ansioliticos foram os responsaacuteveis pelo maior nuacutemero de ocorrecircncias com um
percentual de 22 (n=4) cada um Um estudo realizado com crianccedilas no estado de Mato Grosso
do Sul verificou que os anticonvulsivantes foram os principais responsaacuteveis pelos eventos toacutexicos
por medicamentos que agem no SNC (MATOS et al 2008)
Ao analisarmos as associaccedilotildees de medicamentos (n=7-39) nos chama a atenccedilatildeo o
nuacutemero de ocorrecircncias por tentativa de suiciacutedio (n=10-557) Bernades Turini e Matsuo
(2010) afirmam que pacientes que tentam suiciacutedio em sua grande maioria fazem uso de mais de
um tipo de substacircncia quiacutemica ndash medicamentosa ou natildeo ndash quando o meacutetodo eacute a intoxicaccedilatildeo
voluntaacuteria
Os eventos toxicoloacutegicos foram mais comuns em mulheres (556) por tentativa de
suiciacutedio (557) e entre adultos e jovens (389) (Tabela 01) Um estudo realizado entre os anos
de 1997 e 2007 no Centro de Controle de Intoxicaccedilatildeo (CCI) em Londrina Paranaacute analisando as
tentativas de suiciacutedio por sobredose intencional de medicamentos com relaccedilatildeo ao gecircnero condiz
com dados aqui obtidos (BERNADES TURINI MATZUO 2010) Por outro lado Gandolfi e
Andrade (2006) mostra o ldquoacidente individualrdquo como principal fator responsaacutevel pelas exposiccedilotildees
toacutexicas a medicamentos em Satildeo Paulo seguido pela tentativa de suiciacutedio
Graacutefico 01 - Grupos farmacoloacutegicos de acordo com a classificaccedilatildeo da ATC responsaacuteveis pelas
intoxicaccedilotildees registradas no Ceatox-CG entre agosto a setembro de 2012 (N= 18)
2239
1722
Associaccedilotildees
N05A
N03A
N05B
NOTA N05A Antipsicoacuteticos N03A Antiepileacuteptico NO5B Ansioliacuteticos e associaccedilatildeo
15
Acerca da ocupaccedilatildeo dos pacientes os estudantes foram os mais frequentes (n=6-333)
Este dado entra em desacordo com a mesma variaacutevel analisada no estudo de Turini et al (2010)
em que mostra que a ocupaccedilatildeo mais relevante nos seu estudo eacute a de empregado (Tabela 01)
Observando-se os sinais e sintomas das intoxicaccedilotildees as Siacutendromes Toacutexicas por
Superdosagem de Sedativos (pupilas mioacuteticas tremor hipotensatildeo confusatildeo mental e sonolecircncia)
e a Extrapiramidal (choro monoacutetono opistoacutetomo e distonia) foram predominantes O quadro
toacutexico se desenvolve dependendo da dose do subgrupo terapecircutico e do tempo entre a exposiccedilatildeo
e o atendimento Os ansioliacuteticos principalmente os Benzodiazepiacutenicos (BZD) satildeo compostos
que apresentam maior iacutendice terapecircutico e menor potencialidade de provocar acidentes fatais e
menor tendecircncia para produzir toleracircncia farmacoloacutegica (FORSAN 2010)
Tabela 01 ndash Frequecircncia do tipo de circunstacircncia da faixa etaacuteria do gecircnero e da ocupaccedilatildeo dos pacientes intoxicados
atendidos no Ceatox-CG
Variaacutevel
N
Circunstacircncia (N=18)
Tentativa de Suiciacutedio 10 557
Acidental 1 57
Outra 7 389
Faixa Etaacuteria (anos) (N=18)
1---9 3 166
10---19 5 278
20---39 7 389
gt 40 3 167
Gecircnero (N=18)
Masculino 8 444
Feminino 10 556
Ocupaccedilatildeo (N=18)
Estudante 6 333
Do lar 4 222
Outra 8 444
16
Em relaccedilatildeo agrave variaacutevel evoluccedilatildeo natildeo se registrou nenhum oacutebito no periacuteodo estudado
Dados nacionais entre os anos de 2007 a 2009 mostram que os medicamentos apresentaram
baixo coeficiente de letalidade meacutedio quando comparado aos agrotoacutexicos de uso agriacutecola e as
drogas de abuso (SISTEMA2012) Um estudo realizado por Mota et al (2012) usando dados
secundaacuterios do Sistema Informaccedilatildeo de Mortalidade (SIM)MS entre 1996 a 2005 identificou
4403 oacutebitos relacionados a medicamentos entretanto natildeo foi possiacutevel estabelecer qual a
principal classe de medicamentos nem o princiacutepio ativo envolvido com o agravo
42 Dados Experimentais
Para otimizaccedilatildeo do meacutetodo vaacuterios procedimentos foram realizados seguindo os
paracircmetros analiacuteticos de validaccedilatildeo objetivando detectar a presenccedila de Alprazolam em urina de
paciente com histoacuterico de exposiccedilatildeo toxica a esse faacutermaco A metodologia desenvolvida e
validada mostrou-se em conformidade com as especificaccedilotildees da Resoluccedilatildeo RDC nordm899 de 29 de
maio de 2003 (BRASIL 2003)
Na avaliaccedilatildeo da seletividade nas amostras de urina analisadas natildeo foram detectados
interferentes nas condiccedilotildees de extraccedilatildeo estabelecidas Assim o meacutetodo mostrou-se seletivo jaacute
que as amostras natildeo mostraram nenhum spot(mancha) semelhante aos desenvolvidos pelos
padrotildees No processo de validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos a especificidade ou seletividade eacute o
primeiro passo para o desenvolvimento de um meacutetodo este paracircmetro deve ser avaliado
continuamente para assegurar a precisatildeo e exatidatildeo deste durante sua validaccedilatildeo (SILVA et al
2010) (Tabela 02)
Para os ensaios de recuperaccedilatildeo foi observada a intensidade do spot desenvolvido em cada
amostra para cada niacutevel de fortificaccedilatildeo Nas amostras fortificadas com 200 microg do padratildeo
obtivemos uma recuperaccedilatildeo de 917 enquanto que nas amostras fortificadas com 400 microg do
mesmo o percentual meacutedio obtido foi de 967 demonstrando assim a exatidatildeo do meacutetodo
Segundo a Resoluccedilatildeo RDC nordm 899 de 29 de maio de 2003 a exatidatildeo se daacute pela concordacircncia
entre o resultado de um ensaio e um valor de referecircncia
17
Tabela 02 ndash Avaliaccedilatildeo da seletividade comparando-se spot e Rf (Relative Front) dos padrotildees de
Alprazolam e amostras branco
Sistema-solvente Agente cromogecircnico
Clorofoacutermio-metanol(91v v)
DI
Clorofoacutermio-acetona(41vv)
DI
FaacutermacoAmostras Rf e Cor Rf e Cor
Padratildeo Alprazolam faacutermaco
Padratildeo Alprazolam comprimido
ABal1
ABal2
ABal3
ABal4
ABal5
05 + c
026 + c
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Nota DI = Dragendorff iodado ABal = amostra branco alcalina Rf = fator de retenccedilatildeo c = cor
castanha
O Limite de Detecccedilatildeo e o Limite de Quantificaccedilatildeo para o Alprazolam foram de
100microgmL e 200 microgmL respectivamente Ribani et al (2004) define o Limite de Detecccedilatildeo (LD)
como sendo a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser detectada mas natildeo
necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento experimental O Limite
de Quantificaccedilatildeo (LQ) eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode
ser medida utilizando um determinado procedimento experimental (Figura 01)
O meacutetodo de extraccedilatildeo utilizado particcedilatildeo liacutequido-liacutequido demonstrou-se eficaz pois a
solubilidade do faacutermaco avaliado possui uma elevada afinidade pela mistura de solventes
utilizados nesse procedimento Na separaccedilatildeo do analito da matriz a sonicaccedilatildeo que eacute o processo
que utiliza a energia das ondas sonoras mais comumente a ultrassom se mostrou mais eficaz que
a centrifugaccedilatildeo
O sistema formado pelos solventes clorofoacutermio-metanol (91 vv) obteve o melhor
resultado em relaccedilatildeo ao sistema solvente clorofoacutermio-acetona(41 vv) tendo em vista melhor
resultado na separaccedilatildeo dos padrotildees e amostras
18
Figura 01-Identificaccedilatildeo de Alprazolam em trecircs niacuteveis de fortificaccedilatildeo (n = 3) alta meacutedia e baixa
Dentre os agentes cromogecircnicos utilizados na revelaccedilatildeo apenas o Reativo de Dragendorff
se mostrou eficaz Observou-se atraveacutes do meacutetodo fiacutesico utilizando a Cacircmera de Luz UV que o
Alprazolam faacutermaco e o Alprazolam comprimido natildeo transmite fluorescecircncia no comprimento
de onda de 366nm
Para avaliaccedilatildeo da Robustez as soluccedilotildees-padratildeo (faacutermaco e medicamento) foram
dissolvidas em diversos solventes como apresentado na Tabela 03 O metanol foi o solvente em
que houve revelaccedilatildeo na placa cromatograacutefica tanto do faacutermaco como do medicamento
Tabela 03 - Anaacutelise dos diferentes solventes da soluccedilatildeo estoque padratildeo puro do faacutermaco e do medicamento de
Alprazolam a partir do Rf
NOTA Rf = Relative Front spot= cormancha
Solvente Alprazolam faacutermaco Alprazolam medicamento
Rf Rf
Metanol 05 026
Aacutegua 06 -
ClorofoacutermioAcetona
(41)
056 -
ClorofoacutermioMetanol
(41)
052 -
AMOSTRAS
PADRAtildeO
19
Os testes de robustez satildeo de fundamental importacircncia para que os analistas conheccedilam
quais fatores devem ser estritamente controlados durante a execuccedilatildeo de um meacutetodo Se as
alteraccedilotildees das condiccedilotildees de anaacutelise produzirem resultados dentro dos limites aceitaacuteveis de
seletividade exatidatildeo e precisatildeo o meacutetodo pode ser considerado robusto e tais variaccedilotildees podem
ser incorporadas ao procedimento (CASSIANO et al 2009)
Apesar do meacutetodo ter se mostrado seletivo para o Alprazolam ele natildeo eacute especifico apenas
para esse faacutermaco Sendo assim o meacutetodo foi aplicado em 7 (sete) amostras de pacientes com
histoacuterico de exposiccedilatildeo toacutexica por medicamentos atendidos pelo Centro de Informaccedilatildeo
Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) poreacutem natildeo foi possiacutevel obter a recuperaccedilatildeo dos
faacutermacos Acredita-se que a quantidade ingerida dos medicamentos pelos pacientes foi baixa ou
que pela demora da coleta da amostra os faacutermacos tenham sido metabolizado pelo organismo
Nos ensaios de confirmaccedilatildeo por FTIR observou-se que o Alprazolam padratildeo apresentou as
seguintes vibraccedilotildees moleculares A deformaccedilatildeo angular N-H de amina secundaacuteria eacute observada na
banda em 1660 cm-1
Em 1647 cm-1
aparece uma banda que pode ser atribuiacuteda ao estiramento
C=N da imina e em 1397 cm-1
aparece uma banda atribuiacuteda ao estiramento C-N das aminas A
banda caracteriacutestica do estiramento =C-H de carbono sp2 do anel aromaacutetico se encontra em 3275
cm-1
O espectro do faacutermaco extraiacutedo da matriz bioloacutegica mantecircm as mesmas caracteriacutesticas do
faacutermaco padratildeo Dessa forma podemos afirmar que a moleacutecula natildeo sofreu alteraccedilatildeo durante o
processo de extraccedilatildeo (Figura 02)
Figura 02 - Espectro da analise no FTIR do padratildeo de Alprazolam faacutermaco e de amostra extraiacuteda
20
5 CONCLUSAtildeO
O meacutetodo demonstrou atender aos requisitos de boas praacuteticas exigidos pela Resoluccedilatildeo
RDC 899 de 29 de maio de 2003 sendo exato e sensiacutevel
Dentre as amostras de pacientes intoxicados por medicamentos natildeo se obteve resultados
positivos para o Alprazolam
Os medicamentos constituem como um dos principais meios utilizado para tentativa de
suiciacutedio tendecircncia que eacute observada nos paiacuteses de terceiro mundo entre eles os psicofaacutermacos os
mais utilizados Haacute necessidade de uma melhor formaccedilatildeo e atualizaccedilatildeo dos profissionais assim
como de informaccedilatildeo aos usuaacuterios e medidas de prevenccedilatildeo que poderiam alertar sobre os riscos e
monitorar o uso desses medicamentos
O Brasil em agosto de 2006 deu o primeiro passo lanccedilando a Portaria nordm 1876 com as
diretrizes nacionais para Prevenccedilatildeo do Suiciacutedio nas trecircs esferas da gestatildeo Portanto estudar e
prevenir as tentativas de suiciacutedio eacute um desafio pois envolve recursos financeiros e sensibilidade
da parte dos profissionais envolvidos
Por outro lado aleacutem do conhecimento dos dados epidemioloacutegicos eacute necessaacuteria a
identificaccedilatildeo dos grupos terapecircuticos responsaacuteveis pelas intoxicaccedilotildees As teacutecnicas
cromatograacuteficas e espectrofotomeacutetricas possuem uma extensa aplicabilidade em pesquisas
cientiacuteficas anaacutelise quiacutemica teste de controle de qualidade de medicamentos entre outros Isso se
daacute por serem teacutecnicas altamente sensiacuteveis de alta resoluccedilatildeo e por ser um meacutetodo mais raacutepido e
preciso Ao analisar traccedilos de compostos em amostras complexas como sangue e urina as
anaacutelises toxicoloacutegicas auxiliam no prognoacutestico e diagnoacutestico de intoxicaccedilotildees uma vez que eacute
possiacutevel identificaccedilatildeo destes compostos em amostras bioloacutegicas
O meacutetodo por CCDC tem caraacuteter semindashquantitativo jaacute que a quantificaccedilatildeo dos faacutermacos eacute
baseada apenas na comparaccedilatildeo visual dos ldquoSpotsrdquo das amostras e dos padrotildees Embora o meacutetodo
seja adequado para triagem os resultados mostram que a quantificaccedilatildeo de faacutermacos por meacutetodos
baseados no uso de CCDC deve possuir uma interpretaccedilatildeo bem cautelosa especialmente devido agrave
incerteza associada a este tipo de comparaccedilatildeo
Se faz necessaacuterio a confirmaccedilatildeo da identidade do faacutermaco por outras teacutecnicas eou outros
meacutetodos de anaacutelise como a Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia (CLAE) e Cromatografia
21
Gasosa (CG) sendo assim possiacutevel correlacionar os perfis cromatograacuteficos entre as diferentes
teacutecnicas
ABSTRACT
The medicines are presented as the main toxic agent responsible for cases of human poisoning
thus constituting a major challenge for those working with Public Health However the absence
of a specialized toxicological analysis hinders a more accurate diagnosis of cases The
spectrophotometric and chromatographic techniques may assist in confirming the diagnosis A
Comparative Thin Layer Chromatography (CCDC) is a separation technique simple low cost and
good sensitivity The identification of the drug can be achieved both quantitatively and
qualitatively by infrared spectroscopy Fourier transform (FTIR) This research proposal was to
evaluate two techniques for identification of Alprazolam in urine of patients with toxic exposure
to drugs assessing the selectivity accuracy limit of detection limit of quantification and
robustness in chromatographic techniques The method was optimized validated and applied in
accordance with Resolution RDC Nordm 899 of May 29 2003 The chromatographic assay used
plates of Silica Gel G-60 elution with chloroform-methanol 91 (v v) and as a chromogenic
agent the Reactive Dragendorff The presence of the drug was confirmed by the FTIR analysis
The method proved to be selective chromatographic conditions established by presenting Limit
Detection and Quantification 200μgml and 100μgml respectively Among the patient samples
drug poisoning no positive results obtained for Alprazolam The FTIR analysis showed that the
drug did not undergo degradation in the extraction process The method has proven to meet the
requirements of good practice required by RDC Nordm 899 of 29 May 2003 being sensitive and
accurate
KEYWORDS Alprazolam Spectroscopy Chromatography Intoxication
REFEREcircNCIAS
AMERICAN ASSOCIATION OF POISON CENTERS TOXIC EXPOSURE SURVEILLANCE
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de setembro de 2012
22
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YANG H IRUDAYARAJ J Rapid determination of vitamin C by NIR MIR and FT-Raman
techniques Journal of Pharmacy and Pharmacology London v 54 n 9 p 1247-1255 2002
27
ANEXO A
28
MONALISA MACIEL COSTA
ENSAIOS ANALIacuteTICOS PARA PESQUISA DE ALPRAZOLAM
EM URINA DE PACIENTES INTOXICADOS
Trabalho de Conclusatildeo de Curso apresentado ao Curso
de Graduaccedilatildeo em Farmaacutecia da Universidade Estadual
da Paraiacuteba em cumprimento agrave exigecircncia para obtenccedilatildeo
do grau de Bacharel em Farmaacutecia
Orientadora Profordf Drordf Sayonara Maria Lia Fook
CAMPINA GRANDE-PB
2012
FICHA CATALOGRAacuteFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL ndash UEPB
C837e Costa Monalisa Maciel
Ensaios analiacuteticos para pesquisa de Alprazolam em urina
de pacientes intoxicados [manuscrito] Monalisa Maciel
Costa ndash 2012
29 f il color
Digitado
Trabalho de Conclusatildeo de Curso (Graduaccedilatildeo em
Farmaacutecia) ndash Universidade Estadual da Paraiacuteba Centro de
Ciecircncias Bioloacutegicas e da Sauacutede 2012
ldquoOrientaccedilatildeo Profa Dra Sayonara Maria Lia Fook
Departamento de Farmaacuteciardquo
1 Intoxicaccedilatildeo 2 Medicamento 3 Cromatografia 4
Espectroscopia I Tiacutetulo
21 ed CDD 6159
ENSAIOS ANALIacuteTICOS PARA PESQUISA DE ALPRAZOLAM
EM URINA DE PACIENTES INTOXICADOS
Costa Monalisa Maciel1 Fook Sayonara Maria Lia
2
RESUMO
Os medicamentos se apresentam como o principal agente toacutexico responsaacutevel pelos casos de
intoxicaccedilotildees humanas constituindo portanto um grande desafio para os que trabalham com a
Sauacutede Puacuteblica Todavia a ausecircncia de um serviccedilo especializado de anaacutelises toxicoloacutegicas
dificulta um diagnoacutestico mais preciso dos casos As teacutecnicas cromatograacuteficas e
espectrofotomeacutetricas podem auxiliar na confirmaccedilatildeo do diagnoacutestico A Cromatografia em
Camada Delgada Comparativa (CCDC) eacute uma teacutecnica de separaccedilatildeo simples de baixo custo e de
boa sensibilidade A identificaccedilatildeo do faacutermaco pode ser alcanccedilada tanto quantitativamente como
qualitativamente atraveacutes da Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier
(FTIR) Esta pesquisa teve como proposta avaliar duas teacutecnicas para identificaccedilatildeo de Alprazolam
em urina de pacientes com exposiccedilatildeo toxica por medicamentos avaliando a seletividade
exatidatildeo limite de detecccedilatildeo limite de quantificaccedilatildeo e robustez nas teacutecnicas cromatograacuteficas O
meacutetodo foi otimizado validado e aplicado de acordo com a Resoluccedilatildeo RDC ndeg 899 de 29 de
maio de 2003 O ensaio utilizou placas cromatograacuteficas de Siacutelica Gel G-60 eluiccedilatildeo em
clorofoacutermio-metanol 91(vv) e como agente cromogecircnico o Reativo de Dragendorff A presenccedila
do faacutermaco foi confirmada por analises no FTIR O meacutetodo mostrou-se seletivo nas condiccedilotildees
cromatograacuteficas estabelecidas apresentando Limite de Quantificaccedilatildeo e Detecccedilatildeo de 200μgml e
100μgml respectivamente Dentre as amostras dos pacientes intoxicados por medicamentos natildeo
se obtive resultados positivo para o Alprazolam As anaacutelises no FTIR mostraram que o faacutermaco
natildeo sofreu degradaccedilatildeo no processo de extraccedilatildeo O meacutetodo demonstrou atender aos requisitos de
boas praacuteticas exigidos pela RDC ndeg 899 de 29 de maio de 2003 sendo sensiacutevel e exato
Palavras-Chave Alprazolam Espectroscopia Cromatografia Intoxicaccedilatildeo
___________________________________________________________________
1 Acadecircmica de Farmaacutecia Generalista Universidade Estadual da Paraiacuteba (UEPB) monalisa_macielmsncom
2 Doutora em Farmacologia (UFPB) Coordenadora do Centro de Assistecircncia Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox
CG) Departamento de Farmaacutecia ndash Universidade Estadual da Paraiacuteba (UEPB)
3
1 INTRODUCcedilAtildeO
Os benzodiazepiacutenicos estatildeo entre os medicamentos mais utilizados em todo o mundo
estima-se que entre 1 e 3 de toda a populaccedilatildeo ocidental jaacute tenha consumido
benzodiazepiacutenicos regularmente por mais de um ano Em virtude do menor potencial de causar
dependecircncia e maior iacutendice terapecircutico essas substacircncias tonaram-se os mais utilizados entre os
medicamentos com propriedades sedativas (HUF LOPES ROSENFELD 2000)
O Alprazolam eacute um faacutermaco que se apresenta em forma de cristais branco praticamente
insoluacutevel em aacutegua sendo soluacutevel em metanol e etanol Este faacutermaco eacute um anaacutelogo triazolo 14
benzodiazepina apresentando polimorfismo Pertence ao grupo dos benzodiazepiacutenicos de alta
potecircncia indicado para o tratamento dos transtornos de ansiedade do pacircnico e de ansiedade
associada agrave depressatildeo que apresenta menor efeito sedativo em comparaccedilatildeo a outros
medicamentos da mesma classe Eacute considerado um benzodiazepiacutenico de alta potecircncia e meia-vida
intermediaacuteria entre 12 e 16 horas (STOPPE 2004 KASSAB 2009)
O Alprazolam atua de modo seletivo sobre os receptores Aacutecido Gama-Aminobutiacuterico tipo
A (GABAA) alterando sua conformaccedilatildeo e aumentando a frequecircncia de abertura dos canais de
cloro potencializando assim o efeito inibitoacuterio do GABA provocando efeitos ansioliacuteticos e
sedativos caracteriacutesticos das benzodiazepinas Eacute metabolizado no fiacutegado pelo complexo do
citocromo P450 e biotransformado em dois importantes mataboacutelitos ativos a α-
hidroxialprazolam e 4-hidroxialprazolam Eacute excretado principalmente na urina sob a forma de
glucuroniacutedeos mas pode ainda ser eliminado atraveacutes do suor saliva e leite materno
(GONCcedilALVES CARVALHO BATISTA 2008)
O Relatoacuterio Anual de 2009 da Associaccedilatildeo Americana dos Centros de Controle de
Envenenamento registrou aproximadamente 25 milhotildees de eventos toacutexicos em humanos Destes
526 ocorreram em crianccedilas menores de 5 anos de idade e envolveram principalmente
medicamentos e cosmeacuteticos No Brasil o Sinitox consolidou a ocorrecircncia de aproximadamente
102 mil casos de intoxicaccedilatildeo humana Deste total os medicamentos responderam por 2647 e a
faixa etaacuteria mais acometida foi a de crianccedilas de 1 a 4 anos de idade (AMERICAN 2012
SISTEMA 2012)
4
O fato dos medicamentos serem apontados como a principal causa das intoxicaccedilotildees no
Brasil nas uacuteltimas deacutecadas aumenta o desafio dos laboratoacuterios de anaacutelises toxicoloacutegicas a
desenvolverem metodologias analiacuteticas para a pronta pesquisa e identificaccedilatildeo de faacutermacos
envolvidos nos casos de intoxicaccedilatildeo aguda (AMEacuteRICO MOSSIN NISHIYAMA 2008)
Afirma Karp (2005) que a cromatografia por se tratar de um meacutetodo fiacutesico-quiacutemico pode
ser utilizada para analisar identificar ou separar os componentes de uma mistura em amostras
bioloacutegicas A separaccedilatildeo de dois ou mais compostos estaacute fundamentada na distribuiccedilatildeo
diferencial dos componentes entre duas fases uma estacionaacuteria e outra moacutevel imisciacutevel
A Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC) pode ser utilizada no
diagnoacutestico de exposiccedilotildees toacutexicas por medicamentos por apresentar procedimentos analiacuteticos
raacutepidos de faacutecil execuccedilatildeo abrangentes de baixo custo auxiliando na identificaccedilatildeo de
psicofaacutermacos como o Alprazolam (TRUJILLO et al 2007 AMEacuteRICO MOSSIN
NISHIYAMA 2008)
A Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier - FTIR pode ser usada
para identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo de compostos orgacircnicos inorgacircnicos e polimeacutericos
Basicamente o que se mede nesta anaacutelise eacute a fraccedilatildeo da energia transmitida ou absorvida em
relaccedilatildeo agrave incidente em determinado comprimento de onda ou nuacutemero de onda
Ateacute recentemente a espectroscopia na regiatildeo do infravermelho era pouco utilizada em
anaacutelises quantitativas em decorrecircncia de algumas limitaccedilotildees inerentes agrave teacutecnica Poreacutem com a
utilizaccedilatildeo da transformada de Fourier aliada agrave evoluccedilatildeo de teacutecnicas quimiomeacutetricas ao advento
dos microprocessadores digitais e de teacutecnicas computacionais avanccediladas permitiu-se a anaacutelise de
misturas complexas como os medicamentos (SOUZA et al 2004) A identificaccedilatildeo destas
substacircncias pode ser alcanccedilada tanto quantitativamente como qualitativamente atraveacutes da
espectroscopia por refletacircncia difusa no infravermelho com transformada de Fourier Diffuse
Reflectance Infrared Fourier Transform Spectroscopy - DRIFTS (YANG IRUDAYARAJ
2002)
Entretanto para garantia da seguranccedila dos resultados de doseamento os meacutetodos para a
determinaccedilatildeo quantitativa ou semi-quantitativa de faacutermacos devem ser validados para que se
tornem uacuteteis e confiaacuteveis e possam ser utilizados na rotina laboratorial (ROCA et al 2007
MOJSIEWICZ-PIEŃKOWSKA 2011)
5
A validaccedilatildeo consiste no ato de tornar legiacutetimo ou legal um meacutetodo equipamento sistema
ou metodologia atraveacutes do estabelecimento de documentaccedilotildees visando diminuir ou controlar os
fatores que levam agrave imprecisatildeo ou inexatidatildeo para garantir a confiabilidade e rastreabilidade dos
dados gerados Para validar um meacutetodo eacute essencial que sejam incluiacutedos pelo menos os seguintes
paracircmetros exatidatildeo precisatildeo fidelidade linearidade limite de detecccedilatildeo e limite de
quantificaccedilatildeo sensibilidade especificidade recuperaccedilatildeo robustez estabilidade e intervalo de
aplicaccedilatildeo (RIBANI et al 2004 LANCcedilAS 2004 VALENTINI SOMMER MATIOLI 2007)
A otimizaccedilatildeo das metodologias analiacuteticas possibilita a aplicaccedilatildeo de teacutecnicas
cromatograacuteficas e espectrofotomeacutetricas em amostras bioloacutegicas na rotina de um laboratoacuterio de
emergecircncia toxicoloacutegica e nos serviccedilos puacuteblicos de sauacutede auxiliando na confirmaccedilatildeo do
diagnoacutestico e no prognoacutestico dos pacientes com histoacuterico de exposiccedilatildeo toacutexica por medicamentos
Assim esta pesquisa teve como objetivo realizar ensaios cromatograacuteficos avaliando a
seletividade exatidatildeo limite de detecccedilatildeo limite de quantificaccedilatildeo e robustez para pesquisa de
Alprazolam em amostras bioloacutegicas de pacientes com diagnoacutestico de exposiccedilatildeo toacutexica a
medicamentos A confirmaccedilatildeo dos resultados foi realizada atraveacutes da Espectroscopia
Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR)
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
No Brasil e outros paiacuteses como Alemanha Canadaacute e Inglaterra os medicamentos vecircm
preocupando as autoridades e os profissionais de sauacutede pois se apresentam como o principal
agente toacutexico responsaacutevel pelos casos de intoxicaccedilotildees humanas constituindo portanto um
grande desafio para os que trabalham com a Sauacutede Puacuteblica (FALCAtildeO 2004 SISTEMA
2012)
Vaacuterios episoacutedios histoacutericos marcaram acidentes com medicamentos em 1937 mais de 100
crianccedilas morreram nos Estados Unidos pelo uso de um elixir sulfanilamida que continha como
veiacuteculo o dietilenoglicol Em 1938 como consequecircncia deste evento foi aprovada nos Estados
Unidos a lei que criou a ldquoFood and Drug Administrationrdquo (FDA) obrigando as induacutestrias
farmacecircuticas a fornecer informaccedilotildees a esta instituiccedilatildeo dados cliacutenicos sobre novos
6
medicamentos Um dos acidentes marcantes relacionado ao uso de medicamentos aconteceu na
Alemanha Oriental em 1961 pelo uso da Talidomida um hipnoacutetico natildeo barbituacuterico prescrito na
eacutepoca para tratar naacuteuseas e vocircmitos em mulheres graacutevidas aproximadamente 12000 crianccedilas
nasceram com focomelia (termo Grego que significa membro de focas e caracteriza um processo
de deformidade dos membros) Atraveacutes de estudos epidemioloacutegicos foi comprovado o efeito
teratogecircnico da Talidomida e como consequecircncia entre 1961 a 1962 foi retirada do mercado em
quase todo o mundo
Um marco na histoacuteria da organizaccedilatildeo da Assistecircncia Farmacecircutica no Brasil foi a
aprovaccedilatildeo da Poliacutetica Nacional de Medicamentos em 30 de outubro de 1998 pela Portaria nordm
3916 Esta Portaria contempla diretrizes como Adoccedilatildeo de Relaccedilatildeo de Medicamentos Essenciais
(Rename) Regulamentaccedilatildeo Sanitaacuteria de Medicamentos Reorientaccedilatildeo da Assistecircncia
Farmacecircutica Promoccedilatildeo do Uso Racional de Medicamentos Desenvolvimento Cientiacutefico e
Tecnoloacutegico Promoccedilatildeo da Produccedilatildeo de Medicamentos Garantia da Seguranccedila Eficaacutecia e
Qualidade dos Medicamentos e Desenvolvimento e Capacitaccedilatildeo de Recursos Humanos aleacutem de
definir prioridades relacionadas agrave legislaccedilatildeo incluindo Revisatildeo da Rename Assistecircncia
Farmacecircutica Promoccedilatildeo do Uso Racional de Medicamentos e a Organizaccedilatildeo das Atividades de
Vigilacircncia Sanitaacuteria de Medicamentos (BRASIL 2006)
Uma significativa parcela dos medicamentos prescritos no Brasil eacute da classe dos
psicofaacutermacos Estima-se que pelo menos 13 do total de faacutermacos consumidos no nosso paiacutes
envolva Benzodiazepiacutenicos Antidepressivos e Neuroleacutepticos Anticonvulsivantes ou estimulantes
do Sistema Nervoso Central (SNC) (LUCHETTI et al 2010)
Rodrigues et al (2006) afirmam que esse percentual estaacute relacionado ao aumento da
frequecircncia de diagnoacutesticos de transtornos psiquiaacutetricos na populaccedilatildeo agrave introduccedilatildeo de novos
psicofaacutermacos no mercado farmacecircutico e agraves novas indicaccedilotildees terapecircuticas de psicofaacutermacos jaacute
existentes
Os benzodiazepiacutenicos estatildeo entre as drogas mais prescritas no mundo Satildeo utilizados
principalmente como ansioliacuteticos e hipnoacuteticos aleacutem de possuir accedilatildeo miorrelaxante e
anticonvulsivante (AUCHEWSKI et al 2004)
Apoacutes sua comercializaccedilatildeo no iniacutecio dos anos 60 os Benzodiazepiacutenicos (BZD)
substituiacuteram praticamente todas as drogas utilizadas no tratamento da ansiedade - Barbituacutericos
Meprobamato Hidrato de Cloral e outros que provocavam seacuterios efeitos colaterais Isso ocorreu
7
em virtude do maior iacutendice terapecircutico dessas substacircncias menor potencialidade de provocar
acidentes fatais e menor tendecircncia para produzir siacutendromes de abstinecircncia e toleracircncia
farmacoloacutegica (FORSAN 2010)
Embora sejam drogas relativamente seguras restriccedilotildees agrave sua utilizaccedilatildeo tecircm sido cada vez
maiores devido agrave incidecircncia dos efeitos colaterais relacionados agrave depressatildeo do sistema nervoso
central Dentre eles os principais satildeo a diminuiccedilatildeo da atividade psicomotora o prejuiacutezo na
memoacuteria a desinibiccedilatildeo paradoxal e a potencializaccedilatildeo do efeito depressor pela interaccedilatildeo com
outras drogas depressoras principalmente o aacutelcool Aleacutem disso a depressatildeo e a distimia (tipo de
depressatildeo crocircnica) podem ocorrer consequumlentemente ao uso de alprazolam e clonazepam
(LACERDA et al 2004)
Esta classe de faacutermacos constitui a primeira causa de exposiccedilotildees toacutexicas dentre os outros
grupos de medicamentos em nosso meio No entanto as intoxicaccedilotildees por essa classe
farmacoloacutegica excepcionalmente tecircm evoluccedilatildeo letal Exercem accedilatildeo sobre o sistema nervoso
central atraveacutes da ligaccedilatildeo aos receptores benzodiazepiacutenicos no complexo do receptor dos canais
de cloro do Aacutecido Gama-Aminobutiacuterico (GABA) As principais manifestaccedilotildees das intoxicaccedilotildees
por benzodiazepiacutenicos satildeo a depressatildeo neuroloacutegica da resposta ventilatoacuteria ao CO2 e diminuiccedilatildeo
da frequecircncia respiratoacuteria (OLIVEIRA et al 2010)
O diagnoacutestico das intoxicaccedilotildees pode ser realizado atraveacutes da histoacuteria do paciente
(anamnese) dos sinais cliacutenicos e laboratoriais
8
A Cromatografia em Camada Delgada (CCD) eacute uma teacutecnica de adsorccedilatildeo do tipo soacutelido-
liacutequida Nesse caso a separaccedilatildeo se daacute pela diferenccedila de afinidade dos componentes de uma
mistura pela fase estacionaacuteria (DEGANI CASS VIEIRA 1998) A fase estacionaacuteria
corresponde a uma camada fina formada por um soacutelido granulado geralmente siacutelica depositado
sobre uma placa de vidro alumiacutenio ou outro suporte inerte Este meacutetodo merece atenccedilatildeo especial
pela sua versatilidade rapidez sensibilidade e nitidez das separaccedilotildees (EIZENDEHER 2005)
A Espectroscopia Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) pode ser usada para
identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo de compostos orgacircnicos inorgacircnicos e polimeacutericos Basicamente o
que se mede nesta anaacutelise eacute a fraccedilatildeo da energia transmitida ou absorvida em relaccedilatildeo agrave incidente
em determinado comprimento de onda ou nuacutemero de onda (EVORA et al 2002)
A espectrometria FTIR permite a determinaccedilatildeo automatizada dos paracircmetros de maior
importacircncia na caracterizaccedilatildeo de amostras Hoje os instrumentos de FTIR satildeo informatizados o
que os torna mais raacutepidos e mais sensiacuteveis do que os instrumentos mais antigos dispersivos Ele
pode ser aplicado agrave anaacutelise de soacutelidos liacutequidos e gases Trata-se de uma metodologia que origina
rapidamente uma informaccedilatildeo sumaacuteria de 30 segundos por amostra eacute uma teacutecnica natildeo poluente jaacute
que natildeo utiliza reagentes aleacutem de natildeo necessitar de pessoal especializado para ser operada em
rotina (MOREIRA MARCOS BARROS 2002)
Para garantir que um novo meacutetodo analiacutetico gere informaccedilotildees confiaacuteveis e interpretaacuteveis
sobre a amostra ele deve passar por um processo de validaccedilatildeo A validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos
eacute o processo pelo qual eacute estabelecido por estudos de laboratoacuterio que as caracteriacutesticas
executadas do meacutetodo satisfazem aos requisitos para as aplicaccedilotildees analiacuteticas praticadas (RIBANI
et al2004 VALENTINI SOMMER MATIOLI 2007)
3 REFERENCIAL METODOLOacuteGICO
31 Dados epidemioloacutegicos
9
311 Delineamento do estudo e instrumento de coleta de dados
Tratou-se de uma pesquisa prospectiva descritiva e analiacutetica Os dados epidemioloacutegicos
foram coletados dos pacientes admitidos com histoacuteria de exposiccedilatildeo e ou intoxicaccedilatildeo por
medicamentos no Hospital de Emergecircncia e Trauma de Campina Grande atendidos e notificados
pelo Centro de Informaccedilatildeo Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) nos meses de agosto
e setembro de 2012 Utilizou-se a ficha do Sistema Nacional de Agravos de Notificaccedilatildeo
(Sinan)MS para a coleta dos dados epidemioloacutegicos desses pacientes (Anexo A)
312 Variaacuteveis demograacuteficas e socioeconocircmicas
Gecircnero
Faixa Etaacuteria
Ocupaccedilatildeo
313 Variaacuteveis relativas ao evento
Circunstacircncia
314 Variaacutevel relativa ao Agente Toacutexico
Os grupos de medicamentos foram classificados em categorias terapecircuticas segundo o
Anatomical-Therapeutical-ChemicalClassification System (ATC)
Os medicamentos pertencentes ao nono niacutevel dessa classificaccedilatildeo satildeo classificados como
os medicamentos que atuam no sistema nervoso central representado pela letra N Neste niacutevel
estatildeo incluiacutedos os psicodisleacutepticos ansioliacuteticos (NO5B) antipsicoacuteticos (NO5A) hipnoacutetico-
sedativos (NO5C) e os psicoanaleacutepticos antidepressivos (NO6A) e
estimulantespsicoestimulantes (NO6B)
315 Variaacuteveis relativas agrave intoxicaccedilatildeo
Avaliar os sinais e sintomas
Classificar os casos quanto agrave gravidade
10
Quanto ao item gravidade adotamos o seguinte criteacuterio com base no trabalho de King e
Palmisano 1989
Grave o paciente que permanece internado apoacutes procedimentos do tipo lavagem gaacutestrica
ou observaccedilatildeo meacutedica
Moderada ocorre algum procedimento do tipo lavagem gaacutestrica ou observaccedilatildeo meacutedica
mas sem internaccedilatildeo
Leve a famiacutelia recebe somente orientaccedilatildeo ou acompanhamento por telefone e nenhum
procedimento
Ignorada natildeo eacute possiacutevel classificar a extensatildeo do dano
Evoluccedilatildeo
Alta meacutedica (Cura)
Transferecircncia para outra unidade hospitalar
Ignorado
Oacutebito
32 DADOS EXPERIMENTAIS
321 Ensaios de Desenvolvimento e Validaccedilatildeo da Metodologia
Local da Pesquisa Laboratoacuterio de Desenvolvimento e Certificaccedilatildeo de Biomaterias do
Nordeste unidades da UEPB e UFCG
Materiais
Solventes reagentes e outros aparatos
-Alprazolam (faacutermaco) doaccedilatildeo feita pelo Nuacutecleo de odontologia e medicina Legal - NUMOL
-Medicamento (Medley) Alprazolam
-Acetona Vetec
11
-Clorofoacutermio Vetec
-Sulfato de Soacutedio Anidro Vetec
-Metanol (HPLC) Paneac
-Placas de Siacutelica Gel ALUGRAM SIL G 60F de (20x20) cm
2 foram adquiridas da Macherey-
Nagel (REF 818033)
-Cubas Cromatograacuteficas
-Papel de filtro Qualy
Equipamentos
-Estufa Med Clav
-Banho de Ultra-Som ULTRAsonic 1440A
-Centrifuga DCS-16 RV
-Cacircmera de Luz UV (λ=264nm)
-Espectrocircmetro FTIR SPECTRUM 400 Perkin-Elmer (4000 a 600 cm-1 para anaacutelise das
caracteriacutesticas do grupos funcionais dos faacutermacos)
322 Preparaccedilatildeo dos padrotildees
As soluccedilotildees estoque do faacutermaco foram preparadas pela dissoluccedilatildeo de cada composto em
metanol para obter a concentraccedilatildeo de 400 microg mL
323 Preparaccedilatildeo das Amostras
Procedimento de Extraccedilatildeo Extraccedilatildeo Liacutequido-Liacutequido (ELL)
Na fase de desenvolvimento do meacutetodo um importante passo foi a retirada dos
interferentes das amostras Para isto foram realizados vaacuterios procedimentos de Clean-up usando
ELL Para a ELL foi usado o meacutetodo de Stas-Otto que considera o caraacuteter aacutecidobase de cada
substacircncia do meio em que essa se encontra o seu grau de ionizaccedilatildeo como fatores influentes em
sua solubilidade em solventes orgacircnicos pois a partir de mistura desses em proporccedilotildees
adequadas pode-se submeter agraves amostras agrave ELL (FIGURA 01)
Terminada a extraccedilatildeo por sonicaccedilatildeo ou centrifugaccedilatildeo a fase orgacircnica foi recolhida
evaporada e ressuspendida para anaacutelise cromatograacutefica e espectrofotomeacutetrica
12
324 Teacutecnicas
Anaacutelise por CCD
A anaacutelise por CCD foi baseada na metodologia claacutessica descrita por Moraes (1991) com
adaptaccedilatildeo
Os resiacuteduos obtidos por ELL foram ressuspendidos em MetanolAacutegua (91) e aplicados
nas placas cromatograacuteficas previamente ativadas em estufas a 105ordmC por 30 minutos Aplicaram-
se nas placas aliacutequotas de 20 microL dos extratos obtidos por ELL Foi utilizado o sistema solvente
constituiacutedo de mistura de clorofoacutermio-metanol (91) e clorofoacutermio-acetona (41)
Os cromatogramas foram revelados usando meacutetodos quiacutemicos (agentes cromogecircnicos
Reativo de Dragendorff Difenilcarbazona Nitrato de Prata 1 e Cloreto Feacuterrico 5) e meacutetodo
fiacutesico (Cacircmera de Luz UV (λ=264nm)
Figura 01 - Esquema de extraccedilatildeo amostras
FONTE MORAES 1991
325 Estudo de seletividade e recuperaccedilatildeo
Seletividade
A seletividade do meacutetodo foi avaliada atraveacutes da extraccedilatildeo de 6 amostras diferentes de
urinas (n=6) por LLE e depois analisadas por CCDC
25 ml
13
Recuperaccedilatildeo
A extraccedilatildeo para avaliar a recuperaccedilatildeo foi realizada pela anaacutelise de amostras em
triplicatas contaminadas (fortificadas) em trecircs concentraccedilotildees do padratildeo de Alprazolam (baixa=
100microgml meacutedia=200 microgml e alta= 400 microgml)
326 O Limite de Detecccedilatildeo (LD) e o Limite de Quantificaccedilatildeo (LQ)
O Limite de Detecccedilatildeo eacute a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser
detectada mas natildeo necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento
experimental O Limite de Quantificaccedilatildeo eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia
em exame que pode ser medida utilizando um determinado procedimento experimental
O LD foi determinado por anaacutelise de urina contaminada em concentraccedilotildees decrescentes
de faacutermaco e medicamento ateacute a concentraccedilatildeo possiacutevel de se detectar a presenccedila de ambos O LQ
foi determinado por analise de urina contaminada em concentraccedilotildees decrescentes de faacutermaco e
medicamento ateacute a concentraccedilatildeo possiacutevel de se quantificar a presenccedila de ambos
327 Robustez
Na avaliaccedilatildeo da robustez foram utilizados como solventes o metanol a aacutegua uma soluccedilatildeo
de clorofoacutermio- acetona (41) e uma soluccedilatildeo de clorofoacutermio-metanol (91) para preparaccedilatildeo dos
padrotildees de Alprazolam
328 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier - FTIR
Foram feitas anaacutelises de soluccedilotildees metanoacutelicas ( 10 mgmL n=3) do faacutermaco padratildeo e suas
extraccedilotildees utilizando a faixa de varredura de 4000 a 500 cm-1
em temperatura ambiente
4 DADOS E ANAacuteLISE DA PESQUISA
41 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
No periacuteodo de agosto a setembro de 2012 o Ceatox-CG registrou 28 casos com histoacuteria
de intoxicaccedilatildeo por medicamentos Destes 18 casos foram classificados como
14
neuropsicofaacutermacos Na anaacutelise dos casos do uso isolado de medicamentos os Antiepileacutepticos
assim como os Ansioliticos foram os responsaacuteveis pelo maior nuacutemero de ocorrecircncias com um
percentual de 22 (n=4) cada um Um estudo realizado com crianccedilas no estado de Mato Grosso
do Sul verificou que os anticonvulsivantes foram os principais responsaacuteveis pelos eventos toacutexicos
por medicamentos que agem no SNC (MATOS et al 2008)
Ao analisarmos as associaccedilotildees de medicamentos (n=7-39) nos chama a atenccedilatildeo o
nuacutemero de ocorrecircncias por tentativa de suiciacutedio (n=10-557) Bernades Turini e Matsuo
(2010) afirmam que pacientes que tentam suiciacutedio em sua grande maioria fazem uso de mais de
um tipo de substacircncia quiacutemica ndash medicamentosa ou natildeo ndash quando o meacutetodo eacute a intoxicaccedilatildeo
voluntaacuteria
Os eventos toxicoloacutegicos foram mais comuns em mulheres (556) por tentativa de
suiciacutedio (557) e entre adultos e jovens (389) (Tabela 01) Um estudo realizado entre os anos
de 1997 e 2007 no Centro de Controle de Intoxicaccedilatildeo (CCI) em Londrina Paranaacute analisando as
tentativas de suiciacutedio por sobredose intencional de medicamentos com relaccedilatildeo ao gecircnero condiz
com dados aqui obtidos (BERNADES TURINI MATZUO 2010) Por outro lado Gandolfi e
Andrade (2006) mostra o ldquoacidente individualrdquo como principal fator responsaacutevel pelas exposiccedilotildees
toacutexicas a medicamentos em Satildeo Paulo seguido pela tentativa de suiciacutedio
Graacutefico 01 - Grupos farmacoloacutegicos de acordo com a classificaccedilatildeo da ATC responsaacuteveis pelas
intoxicaccedilotildees registradas no Ceatox-CG entre agosto a setembro de 2012 (N= 18)
2239
1722
Associaccedilotildees
N05A
N03A
N05B
NOTA N05A Antipsicoacuteticos N03A Antiepileacuteptico NO5B Ansioliacuteticos e associaccedilatildeo
15
Acerca da ocupaccedilatildeo dos pacientes os estudantes foram os mais frequentes (n=6-333)
Este dado entra em desacordo com a mesma variaacutevel analisada no estudo de Turini et al (2010)
em que mostra que a ocupaccedilatildeo mais relevante nos seu estudo eacute a de empregado (Tabela 01)
Observando-se os sinais e sintomas das intoxicaccedilotildees as Siacutendromes Toacutexicas por
Superdosagem de Sedativos (pupilas mioacuteticas tremor hipotensatildeo confusatildeo mental e sonolecircncia)
e a Extrapiramidal (choro monoacutetono opistoacutetomo e distonia) foram predominantes O quadro
toacutexico se desenvolve dependendo da dose do subgrupo terapecircutico e do tempo entre a exposiccedilatildeo
e o atendimento Os ansioliacuteticos principalmente os Benzodiazepiacutenicos (BZD) satildeo compostos
que apresentam maior iacutendice terapecircutico e menor potencialidade de provocar acidentes fatais e
menor tendecircncia para produzir toleracircncia farmacoloacutegica (FORSAN 2010)
Tabela 01 ndash Frequecircncia do tipo de circunstacircncia da faixa etaacuteria do gecircnero e da ocupaccedilatildeo dos pacientes intoxicados
atendidos no Ceatox-CG
Variaacutevel
N
Circunstacircncia (N=18)
Tentativa de Suiciacutedio 10 557
Acidental 1 57
Outra 7 389
Faixa Etaacuteria (anos) (N=18)
1---9 3 166
10---19 5 278
20---39 7 389
gt 40 3 167
Gecircnero (N=18)
Masculino 8 444
Feminino 10 556
Ocupaccedilatildeo (N=18)
Estudante 6 333
Do lar 4 222
Outra 8 444
16
Em relaccedilatildeo agrave variaacutevel evoluccedilatildeo natildeo se registrou nenhum oacutebito no periacuteodo estudado
Dados nacionais entre os anos de 2007 a 2009 mostram que os medicamentos apresentaram
baixo coeficiente de letalidade meacutedio quando comparado aos agrotoacutexicos de uso agriacutecola e as
drogas de abuso (SISTEMA2012) Um estudo realizado por Mota et al (2012) usando dados
secundaacuterios do Sistema Informaccedilatildeo de Mortalidade (SIM)MS entre 1996 a 2005 identificou
4403 oacutebitos relacionados a medicamentos entretanto natildeo foi possiacutevel estabelecer qual a
principal classe de medicamentos nem o princiacutepio ativo envolvido com o agravo
42 Dados Experimentais
Para otimizaccedilatildeo do meacutetodo vaacuterios procedimentos foram realizados seguindo os
paracircmetros analiacuteticos de validaccedilatildeo objetivando detectar a presenccedila de Alprazolam em urina de
paciente com histoacuterico de exposiccedilatildeo toxica a esse faacutermaco A metodologia desenvolvida e
validada mostrou-se em conformidade com as especificaccedilotildees da Resoluccedilatildeo RDC nordm899 de 29 de
maio de 2003 (BRASIL 2003)
Na avaliaccedilatildeo da seletividade nas amostras de urina analisadas natildeo foram detectados
interferentes nas condiccedilotildees de extraccedilatildeo estabelecidas Assim o meacutetodo mostrou-se seletivo jaacute
que as amostras natildeo mostraram nenhum spot(mancha) semelhante aos desenvolvidos pelos
padrotildees No processo de validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos a especificidade ou seletividade eacute o
primeiro passo para o desenvolvimento de um meacutetodo este paracircmetro deve ser avaliado
continuamente para assegurar a precisatildeo e exatidatildeo deste durante sua validaccedilatildeo (SILVA et al
2010) (Tabela 02)
Para os ensaios de recuperaccedilatildeo foi observada a intensidade do spot desenvolvido em cada
amostra para cada niacutevel de fortificaccedilatildeo Nas amostras fortificadas com 200 microg do padratildeo
obtivemos uma recuperaccedilatildeo de 917 enquanto que nas amostras fortificadas com 400 microg do
mesmo o percentual meacutedio obtido foi de 967 demonstrando assim a exatidatildeo do meacutetodo
Segundo a Resoluccedilatildeo RDC nordm 899 de 29 de maio de 2003 a exatidatildeo se daacute pela concordacircncia
entre o resultado de um ensaio e um valor de referecircncia
17
Tabela 02 ndash Avaliaccedilatildeo da seletividade comparando-se spot e Rf (Relative Front) dos padrotildees de
Alprazolam e amostras branco
Sistema-solvente Agente cromogecircnico
Clorofoacutermio-metanol(91v v)
DI
Clorofoacutermio-acetona(41vv)
DI
FaacutermacoAmostras Rf e Cor Rf e Cor
Padratildeo Alprazolam faacutermaco
Padratildeo Alprazolam comprimido
ABal1
ABal2
ABal3
ABal4
ABal5
05 + c
026 + c
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Nota DI = Dragendorff iodado ABal = amostra branco alcalina Rf = fator de retenccedilatildeo c = cor
castanha
O Limite de Detecccedilatildeo e o Limite de Quantificaccedilatildeo para o Alprazolam foram de
100microgmL e 200 microgmL respectivamente Ribani et al (2004) define o Limite de Detecccedilatildeo (LD)
como sendo a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser detectada mas natildeo
necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento experimental O Limite
de Quantificaccedilatildeo (LQ) eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode
ser medida utilizando um determinado procedimento experimental (Figura 01)
O meacutetodo de extraccedilatildeo utilizado particcedilatildeo liacutequido-liacutequido demonstrou-se eficaz pois a
solubilidade do faacutermaco avaliado possui uma elevada afinidade pela mistura de solventes
utilizados nesse procedimento Na separaccedilatildeo do analito da matriz a sonicaccedilatildeo que eacute o processo
que utiliza a energia das ondas sonoras mais comumente a ultrassom se mostrou mais eficaz que
a centrifugaccedilatildeo
O sistema formado pelos solventes clorofoacutermio-metanol (91 vv) obteve o melhor
resultado em relaccedilatildeo ao sistema solvente clorofoacutermio-acetona(41 vv) tendo em vista melhor
resultado na separaccedilatildeo dos padrotildees e amostras
18
Figura 01-Identificaccedilatildeo de Alprazolam em trecircs niacuteveis de fortificaccedilatildeo (n = 3) alta meacutedia e baixa
Dentre os agentes cromogecircnicos utilizados na revelaccedilatildeo apenas o Reativo de Dragendorff
se mostrou eficaz Observou-se atraveacutes do meacutetodo fiacutesico utilizando a Cacircmera de Luz UV que o
Alprazolam faacutermaco e o Alprazolam comprimido natildeo transmite fluorescecircncia no comprimento
de onda de 366nm
Para avaliaccedilatildeo da Robustez as soluccedilotildees-padratildeo (faacutermaco e medicamento) foram
dissolvidas em diversos solventes como apresentado na Tabela 03 O metanol foi o solvente em
que houve revelaccedilatildeo na placa cromatograacutefica tanto do faacutermaco como do medicamento
Tabela 03 - Anaacutelise dos diferentes solventes da soluccedilatildeo estoque padratildeo puro do faacutermaco e do medicamento de
Alprazolam a partir do Rf
NOTA Rf = Relative Front spot= cormancha
Solvente Alprazolam faacutermaco Alprazolam medicamento
Rf Rf
Metanol 05 026
Aacutegua 06 -
ClorofoacutermioAcetona
(41)
056 -
ClorofoacutermioMetanol
(41)
052 -
AMOSTRAS
PADRAtildeO
19
Os testes de robustez satildeo de fundamental importacircncia para que os analistas conheccedilam
quais fatores devem ser estritamente controlados durante a execuccedilatildeo de um meacutetodo Se as
alteraccedilotildees das condiccedilotildees de anaacutelise produzirem resultados dentro dos limites aceitaacuteveis de
seletividade exatidatildeo e precisatildeo o meacutetodo pode ser considerado robusto e tais variaccedilotildees podem
ser incorporadas ao procedimento (CASSIANO et al 2009)
Apesar do meacutetodo ter se mostrado seletivo para o Alprazolam ele natildeo eacute especifico apenas
para esse faacutermaco Sendo assim o meacutetodo foi aplicado em 7 (sete) amostras de pacientes com
histoacuterico de exposiccedilatildeo toacutexica por medicamentos atendidos pelo Centro de Informaccedilatildeo
Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) poreacutem natildeo foi possiacutevel obter a recuperaccedilatildeo dos
faacutermacos Acredita-se que a quantidade ingerida dos medicamentos pelos pacientes foi baixa ou
que pela demora da coleta da amostra os faacutermacos tenham sido metabolizado pelo organismo
Nos ensaios de confirmaccedilatildeo por FTIR observou-se que o Alprazolam padratildeo apresentou as
seguintes vibraccedilotildees moleculares A deformaccedilatildeo angular N-H de amina secundaacuteria eacute observada na
banda em 1660 cm-1
Em 1647 cm-1
aparece uma banda que pode ser atribuiacuteda ao estiramento
C=N da imina e em 1397 cm-1
aparece uma banda atribuiacuteda ao estiramento C-N das aminas A
banda caracteriacutestica do estiramento =C-H de carbono sp2 do anel aromaacutetico se encontra em 3275
cm-1
O espectro do faacutermaco extraiacutedo da matriz bioloacutegica mantecircm as mesmas caracteriacutesticas do
faacutermaco padratildeo Dessa forma podemos afirmar que a moleacutecula natildeo sofreu alteraccedilatildeo durante o
processo de extraccedilatildeo (Figura 02)
Figura 02 - Espectro da analise no FTIR do padratildeo de Alprazolam faacutermaco e de amostra extraiacuteda
20
5 CONCLUSAtildeO
O meacutetodo demonstrou atender aos requisitos de boas praacuteticas exigidos pela Resoluccedilatildeo
RDC 899 de 29 de maio de 2003 sendo exato e sensiacutevel
Dentre as amostras de pacientes intoxicados por medicamentos natildeo se obteve resultados
positivos para o Alprazolam
Os medicamentos constituem como um dos principais meios utilizado para tentativa de
suiciacutedio tendecircncia que eacute observada nos paiacuteses de terceiro mundo entre eles os psicofaacutermacos os
mais utilizados Haacute necessidade de uma melhor formaccedilatildeo e atualizaccedilatildeo dos profissionais assim
como de informaccedilatildeo aos usuaacuterios e medidas de prevenccedilatildeo que poderiam alertar sobre os riscos e
monitorar o uso desses medicamentos
O Brasil em agosto de 2006 deu o primeiro passo lanccedilando a Portaria nordm 1876 com as
diretrizes nacionais para Prevenccedilatildeo do Suiciacutedio nas trecircs esferas da gestatildeo Portanto estudar e
prevenir as tentativas de suiciacutedio eacute um desafio pois envolve recursos financeiros e sensibilidade
da parte dos profissionais envolvidos
Por outro lado aleacutem do conhecimento dos dados epidemioloacutegicos eacute necessaacuteria a
identificaccedilatildeo dos grupos terapecircuticos responsaacuteveis pelas intoxicaccedilotildees As teacutecnicas
cromatograacuteficas e espectrofotomeacutetricas possuem uma extensa aplicabilidade em pesquisas
cientiacuteficas anaacutelise quiacutemica teste de controle de qualidade de medicamentos entre outros Isso se
daacute por serem teacutecnicas altamente sensiacuteveis de alta resoluccedilatildeo e por ser um meacutetodo mais raacutepido e
preciso Ao analisar traccedilos de compostos em amostras complexas como sangue e urina as
anaacutelises toxicoloacutegicas auxiliam no prognoacutestico e diagnoacutestico de intoxicaccedilotildees uma vez que eacute
possiacutevel identificaccedilatildeo destes compostos em amostras bioloacutegicas
O meacutetodo por CCDC tem caraacuteter semindashquantitativo jaacute que a quantificaccedilatildeo dos faacutermacos eacute
baseada apenas na comparaccedilatildeo visual dos ldquoSpotsrdquo das amostras e dos padrotildees Embora o meacutetodo
seja adequado para triagem os resultados mostram que a quantificaccedilatildeo de faacutermacos por meacutetodos
baseados no uso de CCDC deve possuir uma interpretaccedilatildeo bem cautelosa especialmente devido agrave
incerteza associada a este tipo de comparaccedilatildeo
Se faz necessaacuterio a confirmaccedilatildeo da identidade do faacutermaco por outras teacutecnicas eou outros
meacutetodos de anaacutelise como a Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia (CLAE) e Cromatografia
21
Gasosa (CG) sendo assim possiacutevel correlacionar os perfis cromatograacuteficos entre as diferentes
teacutecnicas
ABSTRACT
The medicines are presented as the main toxic agent responsible for cases of human poisoning
thus constituting a major challenge for those working with Public Health However the absence
of a specialized toxicological analysis hinders a more accurate diagnosis of cases The
spectrophotometric and chromatographic techniques may assist in confirming the diagnosis A
Comparative Thin Layer Chromatography (CCDC) is a separation technique simple low cost and
good sensitivity The identification of the drug can be achieved both quantitatively and
qualitatively by infrared spectroscopy Fourier transform (FTIR) This research proposal was to
evaluate two techniques for identification of Alprazolam in urine of patients with toxic exposure
to drugs assessing the selectivity accuracy limit of detection limit of quantification and
robustness in chromatographic techniques The method was optimized validated and applied in
accordance with Resolution RDC Nordm 899 of May 29 2003 The chromatographic assay used
plates of Silica Gel G-60 elution with chloroform-methanol 91 (v v) and as a chromogenic
agent the Reactive Dragendorff The presence of the drug was confirmed by the FTIR analysis
The method proved to be selective chromatographic conditions established by presenting Limit
Detection and Quantification 200μgml and 100μgml respectively Among the patient samples
drug poisoning no positive results obtained for Alprazolam The FTIR analysis showed that the
drug did not undergo degradation in the extraction process The method has proven to meet the
requirements of good practice required by RDC Nordm 899 of 29 May 2003 being sensitive and
accurate
KEYWORDS Alprazolam Spectroscopy Chromatography Intoxication
REFEREcircNCIAS
AMERICAN ASSOCIATION OF POISON CENTERS TOXIC EXPOSURE SURVEILLANCE
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27
ANEXO A
28
FICHA CATALOGRAacuteFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL ndash UEPB
C837e Costa Monalisa Maciel
Ensaios analiacuteticos para pesquisa de Alprazolam em urina
de pacientes intoxicados [manuscrito] Monalisa Maciel
Costa ndash 2012
29 f il color
Digitado
Trabalho de Conclusatildeo de Curso (Graduaccedilatildeo em
Farmaacutecia) ndash Universidade Estadual da Paraiacuteba Centro de
Ciecircncias Bioloacutegicas e da Sauacutede 2012
ldquoOrientaccedilatildeo Profa Dra Sayonara Maria Lia Fook
Departamento de Farmaacuteciardquo
1 Intoxicaccedilatildeo 2 Medicamento 3 Cromatografia 4
Espectroscopia I Tiacutetulo
21 ed CDD 6159
ENSAIOS ANALIacuteTICOS PARA PESQUISA DE ALPRAZOLAM
EM URINA DE PACIENTES INTOXICADOS
Costa Monalisa Maciel1 Fook Sayonara Maria Lia
2
RESUMO
Os medicamentos se apresentam como o principal agente toacutexico responsaacutevel pelos casos de
intoxicaccedilotildees humanas constituindo portanto um grande desafio para os que trabalham com a
Sauacutede Puacuteblica Todavia a ausecircncia de um serviccedilo especializado de anaacutelises toxicoloacutegicas
dificulta um diagnoacutestico mais preciso dos casos As teacutecnicas cromatograacuteficas e
espectrofotomeacutetricas podem auxiliar na confirmaccedilatildeo do diagnoacutestico A Cromatografia em
Camada Delgada Comparativa (CCDC) eacute uma teacutecnica de separaccedilatildeo simples de baixo custo e de
boa sensibilidade A identificaccedilatildeo do faacutermaco pode ser alcanccedilada tanto quantitativamente como
qualitativamente atraveacutes da Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier
(FTIR) Esta pesquisa teve como proposta avaliar duas teacutecnicas para identificaccedilatildeo de Alprazolam
em urina de pacientes com exposiccedilatildeo toxica por medicamentos avaliando a seletividade
exatidatildeo limite de detecccedilatildeo limite de quantificaccedilatildeo e robustez nas teacutecnicas cromatograacuteficas O
meacutetodo foi otimizado validado e aplicado de acordo com a Resoluccedilatildeo RDC ndeg 899 de 29 de
maio de 2003 O ensaio utilizou placas cromatograacuteficas de Siacutelica Gel G-60 eluiccedilatildeo em
clorofoacutermio-metanol 91(vv) e como agente cromogecircnico o Reativo de Dragendorff A presenccedila
do faacutermaco foi confirmada por analises no FTIR O meacutetodo mostrou-se seletivo nas condiccedilotildees
cromatograacuteficas estabelecidas apresentando Limite de Quantificaccedilatildeo e Detecccedilatildeo de 200μgml e
100μgml respectivamente Dentre as amostras dos pacientes intoxicados por medicamentos natildeo
se obtive resultados positivo para o Alprazolam As anaacutelises no FTIR mostraram que o faacutermaco
natildeo sofreu degradaccedilatildeo no processo de extraccedilatildeo O meacutetodo demonstrou atender aos requisitos de
boas praacuteticas exigidos pela RDC ndeg 899 de 29 de maio de 2003 sendo sensiacutevel e exato
Palavras-Chave Alprazolam Espectroscopia Cromatografia Intoxicaccedilatildeo
___________________________________________________________________
1 Acadecircmica de Farmaacutecia Generalista Universidade Estadual da Paraiacuteba (UEPB) monalisa_macielmsncom
2 Doutora em Farmacologia (UFPB) Coordenadora do Centro de Assistecircncia Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox
CG) Departamento de Farmaacutecia ndash Universidade Estadual da Paraiacuteba (UEPB)
3
1 INTRODUCcedilAtildeO
Os benzodiazepiacutenicos estatildeo entre os medicamentos mais utilizados em todo o mundo
estima-se que entre 1 e 3 de toda a populaccedilatildeo ocidental jaacute tenha consumido
benzodiazepiacutenicos regularmente por mais de um ano Em virtude do menor potencial de causar
dependecircncia e maior iacutendice terapecircutico essas substacircncias tonaram-se os mais utilizados entre os
medicamentos com propriedades sedativas (HUF LOPES ROSENFELD 2000)
O Alprazolam eacute um faacutermaco que se apresenta em forma de cristais branco praticamente
insoluacutevel em aacutegua sendo soluacutevel em metanol e etanol Este faacutermaco eacute um anaacutelogo triazolo 14
benzodiazepina apresentando polimorfismo Pertence ao grupo dos benzodiazepiacutenicos de alta
potecircncia indicado para o tratamento dos transtornos de ansiedade do pacircnico e de ansiedade
associada agrave depressatildeo que apresenta menor efeito sedativo em comparaccedilatildeo a outros
medicamentos da mesma classe Eacute considerado um benzodiazepiacutenico de alta potecircncia e meia-vida
intermediaacuteria entre 12 e 16 horas (STOPPE 2004 KASSAB 2009)
O Alprazolam atua de modo seletivo sobre os receptores Aacutecido Gama-Aminobutiacuterico tipo
A (GABAA) alterando sua conformaccedilatildeo e aumentando a frequecircncia de abertura dos canais de
cloro potencializando assim o efeito inibitoacuterio do GABA provocando efeitos ansioliacuteticos e
sedativos caracteriacutesticos das benzodiazepinas Eacute metabolizado no fiacutegado pelo complexo do
citocromo P450 e biotransformado em dois importantes mataboacutelitos ativos a α-
hidroxialprazolam e 4-hidroxialprazolam Eacute excretado principalmente na urina sob a forma de
glucuroniacutedeos mas pode ainda ser eliminado atraveacutes do suor saliva e leite materno
(GONCcedilALVES CARVALHO BATISTA 2008)
O Relatoacuterio Anual de 2009 da Associaccedilatildeo Americana dos Centros de Controle de
Envenenamento registrou aproximadamente 25 milhotildees de eventos toacutexicos em humanos Destes
526 ocorreram em crianccedilas menores de 5 anos de idade e envolveram principalmente
medicamentos e cosmeacuteticos No Brasil o Sinitox consolidou a ocorrecircncia de aproximadamente
102 mil casos de intoxicaccedilatildeo humana Deste total os medicamentos responderam por 2647 e a
faixa etaacuteria mais acometida foi a de crianccedilas de 1 a 4 anos de idade (AMERICAN 2012
SISTEMA 2012)
4
O fato dos medicamentos serem apontados como a principal causa das intoxicaccedilotildees no
Brasil nas uacuteltimas deacutecadas aumenta o desafio dos laboratoacuterios de anaacutelises toxicoloacutegicas a
desenvolverem metodologias analiacuteticas para a pronta pesquisa e identificaccedilatildeo de faacutermacos
envolvidos nos casos de intoxicaccedilatildeo aguda (AMEacuteRICO MOSSIN NISHIYAMA 2008)
Afirma Karp (2005) que a cromatografia por se tratar de um meacutetodo fiacutesico-quiacutemico pode
ser utilizada para analisar identificar ou separar os componentes de uma mistura em amostras
bioloacutegicas A separaccedilatildeo de dois ou mais compostos estaacute fundamentada na distribuiccedilatildeo
diferencial dos componentes entre duas fases uma estacionaacuteria e outra moacutevel imisciacutevel
A Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC) pode ser utilizada no
diagnoacutestico de exposiccedilotildees toacutexicas por medicamentos por apresentar procedimentos analiacuteticos
raacutepidos de faacutecil execuccedilatildeo abrangentes de baixo custo auxiliando na identificaccedilatildeo de
psicofaacutermacos como o Alprazolam (TRUJILLO et al 2007 AMEacuteRICO MOSSIN
NISHIYAMA 2008)
A Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier - FTIR pode ser usada
para identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo de compostos orgacircnicos inorgacircnicos e polimeacutericos
Basicamente o que se mede nesta anaacutelise eacute a fraccedilatildeo da energia transmitida ou absorvida em
relaccedilatildeo agrave incidente em determinado comprimento de onda ou nuacutemero de onda
Ateacute recentemente a espectroscopia na regiatildeo do infravermelho era pouco utilizada em
anaacutelises quantitativas em decorrecircncia de algumas limitaccedilotildees inerentes agrave teacutecnica Poreacutem com a
utilizaccedilatildeo da transformada de Fourier aliada agrave evoluccedilatildeo de teacutecnicas quimiomeacutetricas ao advento
dos microprocessadores digitais e de teacutecnicas computacionais avanccediladas permitiu-se a anaacutelise de
misturas complexas como os medicamentos (SOUZA et al 2004) A identificaccedilatildeo destas
substacircncias pode ser alcanccedilada tanto quantitativamente como qualitativamente atraveacutes da
espectroscopia por refletacircncia difusa no infravermelho com transformada de Fourier Diffuse
Reflectance Infrared Fourier Transform Spectroscopy - DRIFTS (YANG IRUDAYARAJ
2002)
Entretanto para garantia da seguranccedila dos resultados de doseamento os meacutetodos para a
determinaccedilatildeo quantitativa ou semi-quantitativa de faacutermacos devem ser validados para que se
tornem uacuteteis e confiaacuteveis e possam ser utilizados na rotina laboratorial (ROCA et al 2007
MOJSIEWICZ-PIEŃKOWSKA 2011)
5
A validaccedilatildeo consiste no ato de tornar legiacutetimo ou legal um meacutetodo equipamento sistema
ou metodologia atraveacutes do estabelecimento de documentaccedilotildees visando diminuir ou controlar os
fatores que levam agrave imprecisatildeo ou inexatidatildeo para garantir a confiabilidade e rastreabilidade dos
dados gerados Para validar um meacutetodo eacute essencial que sejam incluiacutedos pelo menos os seguintes
paracircmetros exatidatildeo precisatildeo fidelidade linearidade limite de detecccedilatildeo e limite de
quantificaccedilatildeo sensibilidade especificidade recuperaccedilatildeo robustez estabilidade e intervalo de
aplicaccedilatildeo (RIBANI et al 2004 LANCcedilAS 2004 VALENTINI SOMMER MATIOLI 2007)
A otimizaccedilatildeo das metodologias analiacuteticas possibilita a aplicaccedilatildeo de teacutecnicas
cromatograacuteficas e espectrofotomeacutetricas em amostras bioloacutegicas na rotina de um laboratoacuterio de
emergecircncia toxicoloacutegica e nos serviccedilos puacuteblicos de sauacutede auxiliando na confirmaccedilatildeo do
diagnoacutestico e no prognoacutestico dos pacientes com histoacuterico de exposiccedilatildeo toacutexica por medicamentos
Assim esta pesquisa teve como objetivo realizar ensaios cromatograacuteficos avaliando a
seletividade exatidatildeo limite de detecccedilatildeo limite de quantificaccedilatildeo e robustez para pesquisa de
Alprazolam em amostras bioloacutegicas de pacientes com diagnoacutestico de exposiccedilatildeo toacutexica a
medicamentos A confirmaccedilatildeo dos resultados foi realizada atraveacutes da Espectroscopia
Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR)
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
No Brasil e outros paiacuteses como Alemanha Canadaacute e Inglaterra os medicamentos vecircm
preocupando as autoridades e os profissionais de sauacutede pois se apresentam como o principal
agente toacutexico responsaacutevel pelos casos de intoxicaccedilotildees humanas constituindo portanto um
grande desafio para os que trabalham com a Sauacutede Puacuteblica (FALCAtildeO 2004 SISTEMA
2012)
Vaacuterios episoacutedios histoacutericos marcaram acidentes com medicamentos em 1937 mais de 100
crianccedilas morreram nos Estados Unidos pelo uso de um elixir sulfanilamida que continha como
veiacuteculo o dietilenoglicol Em 1938 como consequecircncia deste evento foi aprovada nos Estados
Unidos a lei que criou a ldquoFood and Drug Administrationrdquo (FDA) obrigando as induacutestrias
farmacecircuticas a fornecer informaccedilotildees a esta instituiccedilatildeo dados cliacutenicos sobre novos
6
medicamentos Um dos acidentes marcantes relacionado ao uso de medicamentos aconteceu na
Alemanha Oriental em 1961 pelo uso da Talidomida um hipnoacutetico natildeo barbituacuterico prescrito na
eacutepoca para tratar naacuteuseas e vocircmitos em mulheres graacutevidas aproximadamente 12000 crianccedilas
nasceram com focomelia (termo Grego que significa membro de focas e caracteriza um processo
de deformidade dos membros) Atraveacutes de estudos epidemioloacutegicos foi comprovado o efeito
teratogecircnico da Talidomida e como consequecircncia entre 1961 a 1962 foi retirada do mercado em
quase todo o mundo
Um marco na histoacuteria da organizaccedilatildeo da Assistecircncia Farmacecircutica no Brasil foi a
aprovaccedilatildeo da Poliacutetica Nacional de Medicamentos em 30 de outubro de 1998 pela Portaria nordm
3916 Esta Portaria contempla diretrizes como Adoccedilatildeo de Relaccedilatildeo de Medicamentos Essenciais
(Rename) Regulamentaccedilatildeo Sanitaacuteria de Medicamentos Reorientaccedilatildeo da Assistecircncia
Farmacecircutica Promoccedilatildeo do Uso Racional de Medicamentos Desenvolvimento Cientiacutefico e
Tecnoloacutegico Promoccedilatildeo da Produccedilatildeo de Medicamentos Garantia da Seguranccedila Eficaacutecia e
Qualidade dos Medicamentos e Desenvolvimento e Capacitaccedilatildeo de Recursos Humanos aleacutem de
definir prioridades relacionadas agrave legislaccedilatildeo incluindo Revisatildeo da Rename Assistecircncia
Farmacecircutica Promoccedilatildeo do Uso Racional de Medicamentos e a Organizaccedilatildeo das Atividades de
Vigilacircncia Sanitaacuteria de Medicamentos (BRASIL 2006)
Uma significativa parcela dos medicamentos prescritos no Brasil eacute da classe dos
psicofaacutermacos Estima-se que pelo menos 13 do total de faacutermacos consumidos no nosso paiacutes
envolva Benzodiazepiacutenicos Antidepressivos e Neuroleacutepticos Anticonvulsivantes ou estimulantes
do Sistema Nervoso Central (SNC) (LUCHETTI et al 2010)
Rodrigues et al (2006) afirmam que esse percentual estaacute relacionado ao aumento da
frequecircncia de diagnoacutesticos de transtornos psiquiaacutetricos na populaccedilatildeo agrave introduccedilatildeo de novos
psicofaacutermacos no mercado farmacecircutico e agraves novas indicaccedilotildees terapecircuticas de psicofaacutermacos jaacute
existentes
Os benzodiazepiacutenicos estatildeo entre as drogas mais prescritas no mundo Satildeo utilizados
principalmente como ansioliacuteticos e hipnoacuteticos aleacutem de possuir accedilatildeo miorrelaxante e
anticonvulsivante (AUCHEWSKI et al 2004)
Apoacutes sua comercializaccedilatildeo no iniacutecio dos anos 60 os Benzodiazepiacutenicos (BZD)
substituiacuteram praticamente todas as drogas utilizadas no tratamento da ansiedade - Barbituacutericos
Meprobamato Hidrato de Cloral e outros que provocavam seacuterios efeitos colaterais Isso ocorreu
7
em virtude do maior iacutendice terapecircutico dessas substacircncias menor potencialidade de provocar
acidentes fatais e menor tendecircncia para produzir siacutendromes de abstinecircncia e toleracircncia
farmacoloacutegica (FORSAN 2010)
Embora sejam drogas relativamente seguras restriccedilotildees agrave sua utilizaccedilatildeo tecircm sido cada vez
maiores devido agrave incidecircncia dos efeitos colaterais relacionados agrave depressatildeo do sistema nervoso
central Dentre eles os principais satildeo a diminuiccedilatildeo da atividade psicomotora o prejuiacutezo na
memoacuteria a desinibiccedilatildeo paradoxal e a potencializaccedilatildeo do efeito depressor pela interaccedilatildeo com
outras drogas depressoras principalmente o aacutelcool Aleacutem disso a depressatildeo e a distimia (tipo de
depressatildeo crocircnica) podem ocorrer consequumlentemente ao uso de alprazolam e clonazepam
(LACERDA et al 2004)
Esta classe de faacutermacos constitui a primeira causa de exposiccedilotildees toacutexicas dentre os outros
grupos de medicamentos em nosso meio No entanto as intoxicaccedilotildees por essa classe
farmacoloacutegica excepcionalmente tecircm evoluccedilatildeo letal Exercem accedilatildeo sobre o sistema nervoso
central atraveacutes da ligaccedilatildeo aos receptores benzodiazepiacutenicos no complexo do receptor dos canais
de cloro do Aacutecido Gama-Aminobutiacuterico (GABA) As principais manifestaccedilotildees das intoxicaccedilotildees
por benzodiazepiacutenicos satildeo a depressatildeo neuroloacutegica da resposta ventilatoacuteria ao CO2 e diminuiccedilatildeo
da frequecircncia respiratoacuteria (OLIVEIRA et al 2010)
O diagnoacutestico das intoxicaccedilotildees pode ser realizado atraveacutes da histoacuteria do paciente
(anamnese) dos sinais cliacutenicos e laboratoriais
8
A Cromatografia em Camada Delgada (CCD) eacute uma teacutecnica de adsorccedilatildeo do tipo soacutelido-
liacutequida Nesse caso a separaccedilatildeo se daacute pela diferenccedila de afinidade dos componentes de uma
mistura pela fase estacionaacuteria (DEGANI CASS VIEIRA 1998) A fase estacionaacuteria
corresponde a uma camada fina formada por um soacutelido granulado geralmente siacutelica depositado
sobre uma placa de vidro alumiacutenio ou outro suporte inerte Este meacutetodo merece atenccedilatildeo especial
pela sua versatilidade rapidez sensibilidade e nitidez das separaccedilotildees (EIZENDEHER 2005)
A Espectroscopia Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) pode ser usada para
identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo de compostos orgacircnicos inorgacircnicos e polimeacutericos Basicamente o
que se mede nesta anaacutelise eacute a fraccedilatildeo da energia transmitida ou absorvida em relaccedilatildeo agrave incidente
em determinado comprimento de onda ou nuacutemero de onda (EVORA et al 2002)
A espectrometria FTIR permite a determinaccedilatildeo automatizada dos paracircmetros de maior
importacircncia na caracterizaccedilatildeo de amostras Hoje os instrumentos de FTIR satildeo informatizados o
que os torna mais raacutepidos e mais sensiacuteveis do que os instrumentos mais antigos dispersivos Ele
pode ser aplicado agrave anaacutelise de soacutelidos liacutequidos e gases Trata-se de uma metodologia que origina
rapidamente uma informaccedilatildeo sumaacuteria de 30 segundos por amostra eacute uma teacutecnica natildeo poluente jaacute
que natildeo utiliza reagentes aleacutem de natildeo necessitar de pessoal especializado para ser operada em
rotina (MOREIRA MARCOS BARROS 2002)
Para garantir que um novo meacutetodo analiacutetico gere informaccedilotildees confiaacuteveis e interpretaacuteveis
sobre a amostra ele deve passar por um processo de validaccedilatildeo A validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos
eacute o processo pelo qual eacute estabelecido por estudos de laboratoacuterio que as caracteriacutesticas
executadas do meacutetodo satisfazem aos requisitos para as aplicaccedilotildees analiacuteticas praticadas (RIBANI
et al2004 VALENTINI SOMMER MATIOLI 2007)
3 REFERENCIAL METODOLOacuteGICO
31 Dados epidemioloacutegicos
9
311 Delineamento do estudo e instrumento de coleta de dados
Tratou-se de uma pesquisa prospectiva descritiva e analiacutetica Os dados epidemioloacutegicos
foram coletados dos pacientes admitidos com histoacuteria de exposiccedilatildeo e ou intoxicaccedilatildeo por
medicamentos no Hospital de Emergecircncia e Trauma de Campina Grande atendidos e notificados
pelo Centro de Informaccedilatildeo Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) nos meses de agosto
e setembro de 2012 Utilizou-se a ficha do Sistema Nacional de Agravos de Notificaccedilatildeo
(Sinan)MS para a coleta dos dados epidemioloacutegicos desses pacientes (Anexo A)
312 Variaacuteveis demograacuteficas e socioeconocircmicas
Gecircnero
Faixa Etaacuteria
Ocupaccedilatildeo
313 Variaacuteveis relativas ao evento
Circunstacircncia
314 Variaacutevel relativa ao Agente Toacutexico
Os grupos de medicamentos foram classificados em categorias terapecircuticas segundo o
Anatomical-Therapeutical-ChemicalClassification System (ATC)
Os medicamentos pertencentes ao nono niacutevel dessa classificaccedilatildeo satildeo classificados como
os medicamentos que atuam no sistema nervoso central representado pela letra N Neste niacutevel
estatildeo incluiacutedos os psicodisleacutepticos ansioliacuteticos (NO5B) antipsicoacuteticos (NO5A) hipnoacutetico-
sedativos (NO5C) e os psicoanaleacutepticos antidepressivos (NO6A) e
estimulantespsicoestimulantes (NO6B)
315 Variaacuteveis relativas agrave intoxicaccedilatildeo
Avaliar os sinais e sintomas
Classificar os casos quanto agrave gravidade
10
Quanto ao item gravidade adotamos o seguinte criteacuterio com base no trabalho de King e
Palmisano 1989
Grave o paciente que permanece internado apoacutes procedimentos do tipo lavagem gaacutestrica
ou observaccedilatildeo meacutedica
Moderada ocorre algum procedimento do tipo lavagem gaacutestrica ou observaccedilatildeo meacutedica
mas sem internaccedilatildeo
Leve a famiacutelia recebe somente orientaccedilatildeo ou acompanhamento por telefone e nenhum
procedimento
Ignorada natildeo eacute possiacutevel classificar a extensatildeo do dano
Evoluccedilatildeo
Alta meacutedica (Cura)
Transferecircncia para outra unidade hospitalar
Ignorado
Oacutebito
32 DADOS EXPERIMENTAIS
321 Ensaios de Desenvolvimento e Validaccedilatildeo da Metodologia
Local da Pesquisa Laboratoacuterio de Desenvolvimento e Certificaccedilatildeo de Biomaterias do
Nordeste unidades da UEPB e UFCG
Materiais
Solventes reagentes e outros aparatos
-Alprazolam (faacutermaco) doaccedilatildeo feita pelo Nuacutecleo de odontologia e medicina Legal - NUMOL
-Medicamento (Medley) Alprazolam
-Acetona Vetec
11
-Clorofoacutermio Vetec
-Sulfato de Soacutedio Anidro Vetec
-Metanol (HPLC) Paneac
-Placas de Siacutelica Gel ALUGRAM SIL G 60F de (20x20) cm
2 foram adquiridas da Macherey-
Nagel (REF 818033)
-Cubas Cromatograacuteficas
-Papel de filtro Qualy
Equipamentos
-Estufa Med Clav
-Banho de Ultra-Som ULTRAsonic 1440A
-Centrifuga DCS-16 RV
-Cacircmera de Luz UV (λ=264nm)
-Espectrocircmetro FTIR SPECTRUM 400 Perkin-Elmer (4000 a 600 cm-1 para anaacutelise das
caracteriacutesticas do grupos funcionais dos faacutermacos)
322 Preparaccedilatildeo dos padrotildees
As soluccedilotildees estoque do faacutermaco foram preparadas pela dissoluccedilatildeo de cada composto em
metanol para obter a concentraccedilatildeo de 400 microg mL
323 Preparaccedilatildeo das Amostras
Procedimento de Extraccedilatildeo Extraccedilatildeo Liacutequido-Liacutequido (ELL)
Na fase de desenvolvimento do meacutetodo um importante passo foi a retirada dos
interferentes das amostras Para isto foram realizados vaacuterios procedimentos de Clean-up usando
ELL Para a ELL foi usado o meacutetodo de Stas-Otto que considera o caraacuteter aacutecidobase de cada
substacircncia do meio em que essa se encontra o seu grau de ionizaccedilatildeo como fatores influentes em
sua solubilidade em solventes orgacircnicos pois a partir de mistura desses em proporccedilotildees
adequadas pode-se submeter agraves amostras agrave ELL (FIGURA 01)
Terminada a extraccedilatildeo por sonicaccedilatildeo ou centrifugaccedilatildeo a fase orgacircnica foi recolhida
evaporada e ressuspendida para anaacutelise cromatograacutefica e espectrofotomeacutetrica
12
324 Teacutecnicas
Anaacutelise por CCD
A anaacutelise por CCD foi baseada na metodologia claacutessica descrita por Moraes (1991) com
adaptaccedilatildeo
Os resiacuteduos obtidos por ELL foram ressuspendidos em MetanolAacutegua (91) e aplicados
nas placas cromatograacuteficas previamente ativadas em estufas a 105ordmC por 30 minutos Aplicaram-
se nas placas aliacutequotas de 20 microL dos extratos obtidos por ELL Foi utilizado o sistema solvente
constituiacutedo de mistura de clorofoacutermio-metanol (91) e clorofoacutermio-acetona (41)
Os cromatogramas foram revelados usando meacutetodos quiacutemicos (agentes cromogecircnicos
Reativo de Dragendorff Difenilcarbazona Nitrato de Prata 1 e Cloreto Feacuterrico 5) e meacutetodo
fiacutesico (Cacircmera de Luz UV (λ=264nm)
Figura 01 - Esquema de extraccedilatildeo amostras
FONTE MORAES 1991
325 Estudo de seletividade e recuperaccedilatildeo
Seletividade
A seletividade do meacutetodo foi avaliada atraveacutes da extraccedilatildeo de 6 amostras diferentes de
urinas (n=6) por LLE e depois analisadas por CCDC
25 ml
13
Recuperaccedilatildeo
A extraccedilatildeo para avaliar a recuperaccedilatildeo foi realizada pela anaacutelise de amostras em
triplicatas contaminadas (fortificadas) em trecircs concentraccedilotildees do padratildeo de Alprazolam (baixa=
100microgml meacutedia=200 microgml e alta= 400 microgml)
326 O Limite de Detecccedilatildeo (LD) e o Limite de Quantificaccedilatildeo (LQ)
O Limite de Detecccedilatildeo eacute a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser
detectada mas natildeo necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento
experimental O Limite de Quantificaccedilatildeo eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia
em exame que pode ser medida utilizando um determinado procedimento experimental
O LD foi determinado por anaacutelise de urina contaminada em concentraccedilotildees decrescentes
de faacutermaco e medicamento ateacute a concentraccedilatildeo possiacutevel de se detectar a presenccedila de ambos O LQ
foi determinado por analise de urina contaminada em concentraccedilotildees decrescentes de faacutermaco e
medicamento ateacute a concentraccedilatildeo possiacutevel de se quantificar a presenccedila de ambos
327 Robustez
Na avaliaccedilatildeo da robustez foram utilizados como solventes o metanol a aacutegua uma soluccedilatildeo
de clorofoacutermio- acetona (41) e uma soluccedilatildeo de clorofoacutermio-metanol (91) para preparaccedilatildeo dos
padrotildees de Alprazolam
328 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier - FTIR
Foram feitas anaacutelises de soluccedilotildees metanoacutelicas ( 10 mgmL n=3) do faacutermaco padratildeo e suas
extraccedilotildees utilizando a faixa de varredura de 4000 a 500 cm-1
em temperatura ambiente
4 DADOS E ANAacuteLISE DA PESQUISA
41 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
No periacuteodo de agosto a setembro de 2012 o Ceatox-CG registrou 28 casos com histoacuteria
de intoxicaccedilatildeo por medicamentos Destes 18 casos foram classificados como
14
neuropsicofaacutermacos Na anaacutelise dos casos do uso isolado de medicamentos os Antiepileacutepticos
assim como os Ansioliticos foram os responsaacuteveis pelo maior nuacutemero de ocorrecircncias com um
percentual de 22 (n=4) cada um Um estudo realizado com crianccedilas no estado de Mato Grosso
do Sul verificou que os anticonvulsivantes foram os principais responsaacuteveis pelos eventos toacutexicos
por medicamentos que agem no SNC (MATOS et al 2008)
Ao analisarmos as associaccedilotildees de medicamentos (n=7-39) nos chama a atenccedilatildeo o
nuacutemero de ocorrecircncias por tentativa de suiciacutedio (n=10-557) Bernades Turini e Matsuo
(2010) afirmam que pacientes que tentam suiciacutedio em sua grande maioria fazem uso de mais de
um tipo de substacircncia quiacutemica ndash medicamentosa ou natildeo ndash quando o meacutetodo eacute a intoxicaccedilatildeo
voluntaacuteria
Os eventos toxicoloacutegicos foram mais comuns em mulheres (556) por tentativa de
suiciacutedio (557) e entre adultos e jovens (389) (Tabela 01) Um estudo realizado entre os anos
de 1997 e 2007 no Centro de Controle de Intoxicaccedilatildeo (CCI) em Londrina Paranaacute analisando as
tentativas de suiciacutedio por sobredose intencional de medicamentos com relaccedilatildeo ao gecircnero condiz
com dados aqui obtidos (BERNADES TURINI MATZUO 2010) Por outro lado Gandolfi e
Andrade (2006) mostra o ldquoacidente individualrdquo como principal fator responsaacutevel pelas exposiccedilotildees
toacutexicas a medicamentos em Satildeo Paulo seguido pela tentativa de suiciacutedio
Graacutefico 01 - Grupos farmacoloacutegicos de acordo com a classificaccedilatildeo da ATC responsaacuteveis pelas
intoxicaccedilotildees registradas no Ceatox-CG entre agosto a setembro de 2012 (N= 18)
2239
1722
Associaccedilotildees
N05A
N03A
N05B
NOTA N05A Antipsicoacuteticos N03A Antiepileacuteptico NO5B Ansioliacuteticos e associaccedilatildeo
15
Acerca da ocupaccedilatildeo dos pacientes os estudantes foram os mais frequentes (n=6-333)
Este dado entra em desacordo com a mesma variaacutevel analisada no estudo de Turini et al (2010)
em que mostra que a ocupaccedilatildeo mais relevante nos seu estudo eacute a de empregado (Tabela 01)
Observando-se os sinais e sintomas das intoxicaccedilotildees as Siacutendromes Toacutexicas por
Superdosagem de Sedativos (pupilas mioacuteticas tremor hipotensatildeo confusatildeo mental e sonolecircncia)
e a Extrapiramidal (choro monoacutetono opistoacutetomo e distonia) foram predominantes O quadro
toacutexico se desenvolve dependendo da dose do subgrupo terapecircutico e do tempo entre a exposiccedilatildeo
e o atendimento Os ansioliacuteticos principalmente os Benzodiazepiacutenicos (BZD) satildeo compostos
que apresentam maior iacutendice terapecircutico e menor potencialidade de provocar acidentes fatais e
menor tendecircncia para produzir toleracircncia farmacoloacutegica (FORSAN 2010)
Tabela 01 ndash Frequecircncia do tipo de circunstacircncia da faixa etaacuteria do gecircnero e da ocupaccedilatildeo dos pacientes intoxicados
atendidos no Ceatox-CG
Variaacutevel
N
Circunstacircncia (N=18)
Tentativa de Suiciacutedio 10 557
Acidental 1 57
Outra 7 389
Faixa Etaacuteria (anos) (N=18)
1---9 3 166
10---19 5 278
20---39 7 389
gt 40 3 167
Gecircnero (N=18)
Masculino 8 444
Feminino 10 556
Ocupaccedilatildeo (N=18)
Estudante 6 333
Do lar 4 222
Outra 8 444
16
Em relaccedilatildeo agrave variaacutevel evoluccedilatildeo natildeo se registrou nenhum oacutebito no periacuteodo estudado
Dados nacionais entre os anos de 2007 a 2009 mostram que os medicamentos apresentaram
baixo coeficiente de letalidade meacutedio quando comparado aos agrotoacutexicos de uso agriacutecola e as
drogas de abuso (SISTEMA2012) Um estudo realizado por Mota et al (2012) usando dados
secundaacuterios do Sistema Informaccedilatildeo de Mortalidade (SIM)MS entre 1996 a 2005 identificou
4403 oacutebitos relacionados a medicamentos entretanto natildeo foi possiacutevel estabelecer qual a
principal classe de medicamentos nem o princiacutepio ativo envolvido com o agravo
42 Dados Experimentais
Para otimizaccedilatildeo do meacutetodo vaacuterios procedimentos foram realizados seguindo os
paracircmetros analiacuteticos de validaccedilatildeo objetivando detectar a presenccedila de Alprazolam em urina de
paciente com histoacuterico de exposiccedilatildeo toxica a esse faacutermaco A metodologia desenvolvida e
validada mostrou-se em conformidade com as especificaccedilotildees da Resoluccedilatildeo RDC nordm899 de 29 de
maio de 2003 (BRASIL 2003)
Na avaliaccedilatildeo da seletividade nas amostras de urina analisadas natildeo foram detectados
interferentes nas condiccedilotildees de extraccedilatildeo estabelecidas Assim o meacutetodo mostrou-se seletivo jaacute
que as amostras natildeo mostraram nenhum spot(mancha) semelhante aos desenvolvidos pelos
padrotildees No processo de validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos a especificidade ou seletividade eacute o
primeiro passo para o desenvolvimento de um meacutetodo este paracircmetro deve ser avaliado
continuamente para assegurar a precisatildeo e exatidatildeo deste durante sua validaccedilatildeo (SILVA et al
2010) (Tabela 02)
Para os ensaios de recuperaccedilatildeo foi observada a intensidade do spot desenvolvido em cada
amostra para cada niacutevel de fortificaccedilatildeo Nas amostras fortificadas com 200 microg do padratildeo
obtivemos uma recuperaccedilatildeo de 917 enquanto que nas amostras fortificadas com 400 microg do
mesmo o percentual meacutedio obtido foi de 967 demonstrando assim a exatidatildeo do meacutetodo
Segundo a Resoluccedilatildeo RDC nordm 899 de 29 de maio de 2003 a exatidatildeo se daacute pela concordacircncia
entre o resultado de um ensaio e um valor de referecircncia
17
Tabela 02 ndash Avaliaccedilatildeo da seletividade comparando-se spot e Rf (Relative Front) dos padrotildees de
Alprazolam e amostras branco
Sistema-solvente Agente cromogecircnico
Clorofoacutermio-metanol(91v v)
DI
Clorofoacutermio-acetona(41vv)
DI
FaacutermacoAmostras Rf e Cor Rf e Cor
Padratildeo Alprazolam faacutermaco
Padratildeo Alprazolam comprimido
ABal1
ABal2
ABal3
ABal4
ABal5
05 + c
026 + c
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Nota DI = Dragendorff iodado ABal = amostra branco alcalina Rf = fator de retenccedilatildeo c = cor
castanha
O Limite de Detecccedilatildeo e o Limite de Quantificaccedilatildeo para o Alprazolam foram de
100microgmL e 200 microgmL respectivamente Ribani et al (2004) define o Limite de Detecccedilatildeo (LD)
como sendo a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser detectada mas natildeo
necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento experimental O Limite
de Quantificaccedilatildeo (LQ) eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode
ser medida utilizando um determinado procedimento experimental (Figura 01)
O meacutetodo de extraccedilatildeo utilizado particcedilatildeo liacutequido-liacutequido demonstrou-se eficaz pois a
solubilidade do faacutermaco avaliado possui uma elevada afinidade pela mistura de solventes
utilizados nesse procedimento Na separaccedilatildeo do analito da matriz a sonicaccedilatildeo que eacute o processo
que utiliza a energia das ondas sonoras mais comumente a ultrassom se mostrou mais eficaz que
a centrifugaccedilatildeo
O sistema formado pelos solventes clorofoacutermio-metanol (91 vv) obteve o melhor
resultado em relaccedilatildeo ao sistema solvente clorofoacutermio-acetona(41 vv) tendo em vista melhor
resultado na separaccedilatildeo dos padrotildees e amostras
18
Figura 01-Identificaccedilatildeo de Alprazolam em trecircs niacuteveis de fortificaccedilatildeo (n = 3) alta meacutedia e baixa
Dentre os agentes cromogecircnicos utilizados na revelaccedilatildeo apenas o Reativo de Dragendorff
se mostrou eficaz Observou-se atraveacutes do meacutetodo fiacutesico utilizando a Cacircmera de Luz UV que o
Alprazolam faacutermaco e o Alprazolam comprimido natildeo transmite fluorescecircncia no comprimento
de onda de 366nm
Para avaliaccedilatildeo da Robustez as soluccedilotildees-padratildeo (faacutermaco e medicamento) foram
dissolvidas em diversos solventes como apresentado na Tabela 03 O metanol foi o solvente em
que houve revelaccedilatildeo na placa cromatograacutefica tanto do faacutermaco como do medicamento
Tabela 03 - Anaacutelise dos diferentes solventes da soluccedilatildeo estoque padratildeo puro do faacutermaco e do medicamento de
Alprazolam a partir do Rf
NOTA Rf = Relative Front spot= cormancha
Solvente Alprazolam faacutermaco Alprazolam medicamento
Rf Rf
Metanol 05 026
Aacutegua 06 -
ClorofoacutermioAcetona
(41)
056 -
ClorofoacutermioMetanol
(41)
052 -
AMOSTRAS
PADRAtildeO
19
Os testes de robustez satildeo de fundamental importacircncia para que os analistas conheccedilam
quais fatores devem ser estritamente controlados durante a execuccedilatildeo de um meacutetodo Se as
alteraccedilotildees das condiccedilotildees de anaacutelise produzirem resultados dentro dos limites aceitaacuteveis de
seletividade exatidatildeo e precisatildeo o meacutetodo pode ser considerado robusto e tais variaccedilotildees podem
ser incorporadas ao procedimento (CASSIANO et al 2009)
Apesar do meacutetodo ter se mostrado seletivo para o Alprazolam ele natildeo eacute especifico apenas
para esse faacutermaco Sendo assim o meacutetodo foi aplicado em 7 (sete) amostras de pacientes com
histoacuterico de exposiccedilatildeo toacutexica por medicamentos atendidos pelo Centro de Informaccedilatildeo
Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) poreacutem natildeo foi possiacutevel obter a recuperaccedilatildeo dos
faacutermacos Acredita-se que a quantidade ingerida dos medicamentos pelos pacientes foi baixa ou
que pela demora da coleta da amostra os faacutermacos tenham sido metabolizado pelo organismo
Nos ensaios de confirmaccedilatildeo por FTIR observou-se que o Alprazolam padratildeo apresentou as
seguintes vibraccedilotildees moleculares A deformaccedilatildeo angular N-H de amina secundaacuteria eacute observada na
banda em 1660 cm-1
Em 1647 cm-1
aparece uma banda que pode ser atribuiacuteda ao estiramento
C=N da imina e em 1397 cm-1
aparece uma banda atribuiacuteda ao estiramento C-N das aminas A
banda caracteriacutestica do estiramento =C-H de carbono sp2 do anel aromaacutetico se encontra em 3275
cm-1
O espectro do faacutermaco extraiacutedo da matriz bioloacutegica mantecircm as mesmas caracteriacutesticas do
faacutermaco padratildeo Dessa forma podemos afirmar que a moleacutecula natildeo sofreu alteraccedilatildeo durante o
processo de extraccedilatildeo (Figura 02)
Figura 02 - Espectro da analise no FTIR do padratildeo de Alprazolam faacutermaco e de amostra extraiacuteda
20
5 CONCLUSAtildeO
O meacutetodo demonstrou atender aos requisitos de boas praacuteticas exigidos pela Resoluccedilatildeo
RDC 899 de 29 de maio de 2003 sendo exato e sensiacutevel
Dentre as amostras de pacientes intoxicados por medicamentos natildeo se obteve resultados
positivos para o Alprazolam
Os medicamentos constituem como um dos principais meios utilizado para tentativa de
suiciacutedio tendecircncia que eacute observada nos paiacuteses de terceiro mundo entre eles os psicofaacutermacos os
mais utilizados Haacute necessidade de uma melhor formaccedilatildeo e atualizaccedilatildeo dos profissionais assim
como de informaccedilatildeo aos usuaacuterios e medidas de prevenccedilatildeo que poderiam alertar sobre os riscos e
monitorar o uso desses medicamentos
O Brasil em agosto de 2006 deu o primeiro passo lanccedilando a Portaria nordm 1876 com as
diretrizes nacionais para Prevenccedilatildeo do Suiciacutedio nas trecircs esferas da gestatildeo Portanto estudar e
prevenir as tentativas de suiciacutedio eacute um desafio pois envolve recursos financeiros e sensibilidade
da parte dos profissionais envolvidos
Por outro lado aleacutem do conhecimento dos dados epidemioloacutegicos eacute necessaacuteria a
identificaccedilatildeo dos grupos terapecircuticos responsaacuteveis pelas intoxicaccedilotildees As teacutecnicas
cromatograacuteficas e espectrofotomeacutetricas possuem uma extensa aplicabilidade em pesquisas
cientiacuteficas anaacutelise quiacutemica teste de controle de qualidade de medicamentos entre outros Isso se
daacute por serem teacutecnicas altamente sensiacuteveis de alta resoluccedilatildeo e por ser um meacutetodo mais raacutepido e
preciso Ao analisar traccedilos de compostos em amostras complexas como sangue e urina as
anaacutelises toxicoloacutegicas auxiliam no prognoacutestico e diagnoacutestico de intoxicaccedilotildees uma vez que eacute
possiacutevel identificaccedilatildeo destes compostos em amostras bioloacutegicas
O meacutetodo por CCDC tem caraacuteter semindashquantitativo jaacute que a quantificaccedilatildeo dos faacutermacos eacute
baseada apenas na comparaccedilatildeo visual dos ldquoSpotsrdquo das amostras e dos padrotildees Embora o meacutetodo
seja adequado para triagem os resultados mostram que a quantificaccedilatildeo de faacutermacos por meacutetodos
baseados no uso de CCDC deve possuir uma interpretaccedilatildeo bem cautelosa especialmente devido agrave
incerteza associada a este tipo de comparaccedilatildeo
Se faz necessaacuterio a confirmaccedilatildeo da identidade do faacutermaco por outras teacutecnicas eou outros
meacutetodos de anaacutelise como a Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia (CLAE) e Cromatografia
21
Gasosa (CG) sendo assim possiacutevel correlacionar os perfis cromatograacuteficos entre as diferentes
teacutecnicas
ABSTRACT
The medicines are presented as the main toxic agent responsible for cases of human poisoning
thus constituting a major challenge for those working with Public Health However the absence
of a specialized toxicological analysis hinders a more accurate diagnosis of cases The
spectrophotometric and chromatographic techniques may assist in confirming the diagnosis A
Comparative Thin Layer Chromatography (CCDC) is a separation technique simple low cost and
good sensitivity The identification of the drug can be achieved both quantitatively and
qualitatively by infrared spectroscopy Fourier transform (FTIR) This research proposal was to
evaluate two techniques for identification of Alprazolam in urine of patients with toxic exposure
to drugs assessing the selectivity accuracy limit of detection limit of quantification and
robustness in chromatographic techniques The method was optimized validated and applied in
accordance with Resolution RDC Nordm 899 of May 29 2003 The chromatographic assay used
plates of Silica Gel G-60 elution with chloroform-methanol 91 (v v) and as a chromogenic
agent the Reactive Dragendorff The presence of the drug was confirmed by the FTIR analysis
The method proved to be selective chromatographic conditions established by presenting Limit
Detection and Quantification 200μgml and 100μgml respectively Among the patient samples
drug poisoning no positive results obtained for Alprazolam The FTIR analysis showed that the
drug did not undergo degradation in the extraction process The method has proven to meet the
requirements of good practice required by RDC Nordm 899 of 29 May 2003 being sensitive and
accurate
KEYWORDS Alprazolam Spectroscopy Chromatography Intoxication
REFEREcircNCIAS
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27
ANEXO A
28
ENSAIOS ANALIacuteTICOS PARA PESQUISA DE ALPRAZOLAM
EM URINA DE PACIENTES INTOXICADOS
Costa Monalisa Maciel1 Fook Sayonara Maria Lia
2
RESUMO
Os medicamentos se apresentam como o principal agente toacutexico responsaacutevel pelos casos de
intoxicaccedilotildees humanas constituindo portanto um grande desafio para os que trabalham com a
Sauacutede Puacuteblica Todavia a ausecircncia de um serviccedilo especializado de anaacutelises toxicoloacutegicas
dificulta um diagnoacutestico mais preciso dos casos As teacutecnicas cromatograacuteficas e
espectrofotomeacutetricas podem auxiliar na confirmaccedilatildeo do diagnoacutestico A Cromatografia em
Camada Delgada Comparativa (CCDC) eacute uma teacutecnica de separaccedilatildeo simples de baixo custo e de
boa sensibilidade A identificaccedilatildeo do faacutermaco pode ser alcanccedilada tanto quantitativamente como
qualitativamente atraveacutes da Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier
(FTIR) Esta pesquisa teve como proposta avaliar duas teacutecnicas para identificaccedilatildeo de Alprazolam
em urina de pacientes com exposiccedilatildeo toxica por medicamentos avaliando a seletividade
exatidatildeo limite de detecccedilatildeo limite de quantificaccedilatildeo e robustez nas teacutecnicas cromatograacuteficas O
meacutetodo foi otimizado validado e aplicado de acordo com a Resoluccedilatildeo RDC ndeg 899 de 29 de
maio de 2003 O ensaio utilizou placas cromatograacuteficas de Siacutelica Gel G-60 eluiccedilatildeo em
clorofoacutermio-metanol 91(vv) e como agente cromogecircnico o Reativo de Dragendorff A presenccedila
do faacutermaco foi confirmada por analises no FTIR O meacutetodo mostrou-se seletivo nas condiccedilotildees
cromatograacuteficas estabelecidas apresentando Limite de Quantificaccedilatildeo e Detecccedilatildeo de 200μgml e
100μgml respectivamente Dentre as amostras dos pacientes intoxicados por medicamentos natildeo
se obtive resultados positivo para o Alprazolam As anaacutelises no FTIR mostraram que o faacutermaco
natildeo sofreu degradaccedilatildeo no processo de extraccedilatildeo O meacutetodo demonstrou atender aos requisitos de
boas praacuteticas exigidos pela RDC ndeg 899 de 29 de maio de 2003 sendo sensiacutevel e exato
Palavras-Chave Alprazolam Espectroscopia Cromatografia Intoxicaccedilatildeo
___________________________________________________________________
1 Acadecircmica de Farmaacutecia Generalista Universidade Estadual da Paraiacuteba (UEPB) monalisa_macielmsncom
2 Doutora em Farmacologia (UFPB) Coordenadora do Centro de Assistecircncia Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox
CG) Departamento de Farmaacutecia ndash Universidade Estadual da Paraiacuteba (UEPB)
3
1 INTRODUCcedilAtildeO
Os benzodiazepiacutenicos estatildeo entre os medicamentos mais utilizados em todo o mundo
estima-se que entre 1 e 3 de toda a populaccedilatildeo ocidental jaacute tenha consumido
benzodiazepiacutenicos regularmente por mais de um ano Em virtude do menor potencial de causar
dependecircncia e maior iacutendice terapecircutico essas substacircncias tonaram-se os mais utilizados entre os
medicamentos com propriedades sedativas (HUF LOPES ROSENFELD 2000)
O Alprazolam eacute um faacutermaco que se apresenta em forma de cristais branco praticamente
insoluacutevel em aacutegua sendo soluacutevel em metanol e etanol Este faacutermaco eacute um anaacutelogo triazolo 14
benzodiazepina apresentando polimorfismo Pertence ao grupo dos benzodiazepiacutenicos de alta
potecircncia indicado para o tratamento dos transtornos de ansiedade do pacircnico e de ansiedade
associada agrave depressatildeo que apresenta menor efeito sedativo em comparaccedilatildeo a outros
medicamentos da mesma classe Eacute considerado um benzodiazepiacutenico de alta potecircncia e meia-vida
intermediaacuteria entre 12 e 16 horas (STOPPE 2004 KASSAB 2009)
O Alprazolam atua de modo seletivo sobre os receptores Aacutecido Gama-Aminobutiacuterico tipo
A (GABAA) alterando sua conformaccedilatildeo e aumentando a frequecircncia de abertura dos canais de
cloro potencializando assim o efeito inibitoacuterio do GABA provocando efeitos ansioliacuteticos e
sedativos caracteriacutesticos das benzodiazepinas Eacute metabolizado no fiacutegado pelo complexo do
citocromo P450 e biotransformado em dois importantes mataboacutelitos ativos a α-
hidroxialprazolam e 4-hidroxialprazolam Eacute excretado principalmente na urina sob a forma de
glucuroniacutedeos mas pode ainda ser eliminado atraveacutes do suor saliva e leite materno
(GONCcedilALVES CARVALHO BATISTA 2008)
O Relatoacuterio Anual de 2009 da Associaccedilatildeo Americana dos Centros de Controle de
Envenenamento registrou aproximadamente 25 milhotildees de eventos toacutexicos em humanos Destes
526 ocorreram em crianccedilas menores de 5 anos de idade e envolveram principalmente
medicamentos e cosmeacuteticos No Brasil o Sinitox consolidou a ocorrecircncia de aproximadamente
102 mil casos de intoxicaccedilatildeo humana Deste total os medicamentos responderam por 2647 e a
faixa etaacuteria mais acometida foi a de crianccedilas de 1 a 4 anos de idade (AMERICAN 2012
SISTEMA 2012)
4
O fato dos medicamentos serem apontados como a principal causa das intoxicaccedilotildees no
Brasil nas uacuteltimas deacutecadas aumenta o desafio dos laboratoacuterios de anaacutelises toxicoloacutegicas a
desenvolverem metodologias analiacuteticas para a pronta pesquisa e identificaccedilatildeo de faacutermacos
envolvidos nos casos de intoxicaccedilatildeo aguda (AMEacuteRICO MOSSIN NISHIYAMA 2008)
Afirma Karp (2005) que a cromatografia por se tratar de um meacutetodo fiacutesico-quiacutemico pode
ser utilizada para analisar identificar ou separar os componentes de uma mistura em amostras
bioloacutegicas A separaccedilatildeo de dois ou mais compostos estaacute fundamentada na distribuiccedilatildeo
diferencial dos componentes entre duas fases uma estacionaacuteria e outra moacutevel imisciacutevel
A Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC) pode ser utilizada no
diagnoacutestico de exposiccedilotildees toacutexicas por medicamentos por apresentar procedimentos analiacuteticos
raacutepidos de faacutecil execuccedilatildeo abrangentes de baixo custo auxiliando na identificaccedilatildeo de
psicofaacutermacos como o Alprazolam (TRUJILLO et al 2007 AMEacuteRICO MOSSIN
NISHIYAMA 2008)
A Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier - FTIR pode ser usada
para identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo de compostos orgacircnicos inorgacircnicos e polimeacutericos
Basicamente o que se mede nesta anaacutelise eacute a fraccedilatildeo da energia transmitida ou absorvida em
relaccedilatildeo agrave incidente em determinado comprimento de onda ou nuacutemero de onda
Ateacute recentemente a espectroscopia na regiatildeo do infravermelho era pouco utilizada em
anaacutelises quantitativas em decorrecircncia de algumas limitaccedilotildees inerentes agrave teacutecnica Poreacutem com a
utilizaccedilatildeo da transformada de Fourier aliada agrave evoluccedilatildeo de teacutecnicas quimiomeacutetricas ao advento
dos microprocessadores digitais e de teacutecnicas computacionais avanccediladas permitiu-se a anaacutelise de
misturas complexas como os medicamentos (SOUZA et al 2004) A identificaccedilatildeo destas
substacircncias pode ser alcanccedilada tanto quantitativamente como qualitativamente atraveacutes da
espectroscopia por refletacircncia difusa no infravermelho com transformada de Fourier Diffuse
Reflectance Infrared Fourier Transform Spectroscopy - DRIFTS (YANG IRUDAYARAJ
2002)
Entretanto para garantia da seguranccedila dos resultados de doseamento os meacutetodos para a
determinaccedilatildeo quantitativa ou semi-quantitativa de faacutermacos devem ser validados para que se
tornem uacuteteis e confiaacuteveis e possam ser utilizados na rotina laboratorial (ROCA et al 2007
MOJSIEWICZ-PIEŃKOWSKA 2011)
5
A validaccedilatildeo consiste no ato de tornar legiacutetimo ou legal um meacutetodo equipamento sistema
ou metodologia atraveacutes do estabelecimento de documentaccedilotildees visando diminuir ou controlar os
fatores que levam agrave imprecisatildeo ou inexatidatildeo para garantir a confiabilidade e rastreabilidade dos
dados gerados Para validar um meacutetodo eacute essencial que sejam incluiacutedos pelo menos os seguintes
paracircmetros exatidatildeo precisatildeo fidelidade linearidade limite de detecccedilatildeo e limite de
quantificaccedilatildeo sensibilidade especificidade recuperaccedilatildeo robustez estabilidade e intervalo de
aplicaccedilatildeo (RIBANI et al 2004 LANCcedilAS 2004 VALENTINI SOMMER MATIOLI 2007)
A otimizaccedilatildeo das metodologias analiacuteticas possibilita a aplicaccedilatildeo de teacutecnicas
cromatograacuteficas e espectrofotomeacutetricas em amostras bioloacutegicas na rotina de um laboratoacuterio de
emergecircncia toxicoloacutegica e nos serviccedilos puacuteblicos de sauacutede auxiliando na confirmaccedilatildeo do
diagnoacutestico e no prognoacutestico dos pacientes com histoacuterico de exposiccedilatildeo toacutexica por medicamentos
Assim esta pesquisa teve como objetivo realizar ensaios cromatograacuteficos avaliando a
seletividade exatidatildeo limite de detecccedilatildeo limite de quantificaccedilatildeo e robustez para pesquisa de
Alprazolam em amostras bioloacutegicas de pacientes com diagnoacutestico de exposiccedilatildeo toacutexica a
medicamentos A confirmaccedilatildeo dos resultados foi realizada atraveacutes da Espectroscopia
Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR)
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
No Brasil e outros paiacuteses como Alemanha Canadaacute e Inglaterra os medicamentos vecircm
preocupando as autoridades e os profissionais de sauacutede pois se apresentam como o principal
agente toacutexico responsaacutevel pelos casos de intoxicaccedilotildees humanas constituindo portanto um
grande desafio para os que trabalham com a Sauacutede Puacuteblica (FALCAtildeO 2004 SISTEMA
2012)
Vaacuterios episoacutedios histoacutericos marcaram acidentes com medicamentos em 1937 mais de 100
crianccedilas morreram nos Estados Unidos pelo uso de um elixir sulfanilamida que continha como
veiacuteculo o dietilenoglicol Em 1938 como consequecircncia deste evento foi aprovada nos Estados
Unidos a lei que criou a ldquoFood and Drug Administrationrdquo (FDA) obrigando as induacutestrias
farmacecircuticas a fornecer informaccedilotildees a esta instituiccedilatildeo dados cliacutenicos sobre novos
6
medicamentos Um dos acidentes marcantes relacionado ao uso de medicamentos aconteceu na
Alemanha Oriental em 1961 pelo uso da Talidomida um hipnoacutetico natildeo barbituacuterico prescrito na
eacutepoca para tratar naacuteuseas e vocircmitos em mulheres graacutevidas aproximadamente 12000 crianccedilas
nasceram com focomelia (termo Grego que significa membro de focas e caracteriza um processo
de deformidade dos membros) Atraveacutes de estudos epidemioloacutegicos foi comprovado o efeito
teratogecircnico da Talidomida e como consequecircncia entre 1961 a 1962 foi retirada do mercado em
quase todo o mundo
Um marco na histoacuteria da organizaccedilatildeo da Assistecircncia Farmacecircutica no Brasil foi a
aprovaccedilatildeo da Poliacutetica Nacional de Medicamentos em 30 de outubro de 1998 pela Portaria nordm
3916 Esta Portaria contempla diretrizes como Adoccedilatildeo de Relaccedilatildeo de Medicamentos Essenciais
(Rename) Regulamentaccedilatildeo Sanitaacuteria de Medicamentos Reorientaccedilatildeo da Assistecircncia
Farmacecircutica Promoccedilatildeo do Uso Racional de Medicamentos Desenvolvimento Cientiacutefico e
Tecnoloacutegico Promoccedilatildeo da Produccedilatildeo de Medicamentos Garantia da Seguranccedila Eficaacutecia e
Qualidade dos Medicamentos e Desenvolvimento e Capacitaccedilatildeo de Recursos Humanos aleacutem de
definir prioridades relacionadas agrave legislaccedilatildeo incluindo Revisatildeo da Rename Assistecircncia
Farmacecircutica Promoccedilatildeo do Uso Racional de Medicamentos e a Organizaccedilatildeo das Atividades de
Vigilacircncia Sanitaacuteria de Medicamentos (BRASIL 2006)
Uma significativa parcela dos medicamentos prescritos no Brasil eacute da classe dos
psicofaacutermacos Estima-se que pelo menos 13 do total de faacutermacos consumidos no nosso paiacutes
envolva Benzodiazepiacutenicos Antidepressivos e Neuroleacutepticos Anticonvulsivantes ou estimulantes
do Sistema Nervoso Central (SNC) (LUCHETTI et al 2010)
Rodrigues et al (2006) afirmam que esse percentual estaacute relacionado ao aumento da
frequecircncia de diagnoacutesticos de transtornos psiquiaacutetricos na populaccedilatildeo agrave introduccedilatildeo de novos
psicofaacutermacos no mercado farmacecircutico e agraves novas indicaccedilotildees terapecircuticas de psicofaacutermacos jaacute
existentes
Os benzodiazepiacutenicos estatildeo entre as drogas mais prescritas no mundo Satildeo utilizados
principalmente como ansioliacuteticos e hipnoacuteticos aleacutem de possuir accedilatildeo miorrelaxante e
anticonvulsivante (AUCHEWSKI et al 2004)
Apoacutes sua comercializaccedilatildeo no iniacutecio dos anos 60 os Benzodiazepiacutenicos (BZD)
substituiacuteram praticamente todas as drogas utilizadas no tratamento da ansiedade - Barbituacutericos
Meprobamato Hidrato de Cloral e outros que provocavam seacuterios efeitos colaterais Isso ocorreu
7
em virtude do maior iacutendice terapecircutico dessas substacircncias menor potencialidade de provocar
acidentes fatais e menor tendecircncia para produzir siacutendromes de abstinecircncia e toleracircncia
farmacoloacutegica (FORSAN 2010)
Embora sejam drogas relativamente seguras restriccedilotildees agrave sua utilizaccedilatildeo tecircm sido cada vez
maiores devido agrave incidecircncia dos efeitos colaterais relacionados agrave depressatildeo do sistema nervoso
central Dentre eles os principais satildeo a diminuiccedilatildeo da atividade psicomotora o prejuiacutezo na
memoacuteria a desinibiccedilatildeo paradoxal e a potencializaccedilatildeo do efeito depressor pela interaccedilatildeo com
outras drogas depressoras principalmente o aacutelcool Aleacutem disso a depressatildeo e a distimia (tipo de
depressatildeo crocircnica) podem ocorrer consequumlentemente ao uso de alprazolam e clonazepam
(LACERDA et al 2004)
Esta classe de faacutermacos constitui a primeira causa de exposiccedilotildees toacutexicas dentre os outros
grupos de medicamentos em nosso meio No entanto as intoxicaccedilotildees por essa classe
farmacoloacutegica excepcionalmente tecircm evoluccedilatildeo letal Exercem accedilatildeo sobre o sistema nervoso
central atraveacutes da ligaccedilatildeo aos receptores benzodiazepiacutenicos no complexo do receptor dos canais
de cloro do Aacutecido Gama-Aminobutiacuterico (GABA) As principais manifestaccedilotildees das intoxicaccedilotildees
por benzodiazepiacutenicos satildeo a depressatildeo neuroloacutegica da resposta ventilatoacuteria ao CO2 e diminuiccedilatildeo
da frequecircncia respiratoacuteria (OLIVEIRA et al 2010)
O diagnoacutestico das intoxicaccedilotildees pode ser realizado atraveacutes da histoacuteria do paciente
(anamnese) dos sinais cliacutenicos e laboratoriais
8
A Cromatografia em Camada Delgada (CCD) eacute uma teacutecnica de adsorccedilatildeo do tipo soacutelido-
liacutequida Nesse caso a separaccedilatildeo se daacute pela diferenccedila de afinidade dos componentes de uma
mistura pela fase estacionaacuteria (DEGANI CASS VIEIRA 1998) A fase estacionaacuteria
corresponde a uma camada fina formada por um soacutelido granulado geralmente siacutelica depositado
sobre uma placa de vidro alumiacutenio ou outro suporte inerte Este meacutetodo merece atenccedilatildeo especial
pela sua versatilidade rapidez sensibilidade e nitidez das separaccedilotildees (EIZENDEHER 2005)
A Espectroscopia Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) pode ser usada para
identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo de compostos orgacircnicos inorgacircnicos e polimeacutericos Basicamente o
que se mede nesta anaacutelise eacute a fraccedilatildeo da energia transmitida ou absorvida em relaccedilatildeo agrave incidente
em determinado comprimento de onda ou nuacutemero de onda (EVORA et al 2002)
A espectrometria FTIR permite a determinaccedilatildeo automatizada dos paracircmetros de maior
importacircncia na caracterizaccedilatildeo de amostras Hoje os instrumentos de FTIR satildeo informatizados o
que os torna mais raacutepidos e mais sensiacuteveis do que os instrumentos mais antigos dispersivos Ele
pode ser aplicado agrave anaacutelise de soacutelidos liacutequidos e gases Trata-se de uma metodologia que origina
rapidamente uma informaccedilatildeo sumaacuteria de 30 segundos por amostra eacute uma teacutecnica natildeo poluente jaacute
que natildeo utiliza reagentes aleacutem de natildeo necessitar de pessoal especializado para ser operada em
rotina (MOREIRA MARCOS BARROS 2002)
Para garantir que um novo meacutetodo analiacutetico gere informaccedilotildees confiaacuteveis e interpretaacuteveis
sobre a amostra ele deve passar por um processo de validaccedilatildeo A validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos
eacute o processo pelo qual eacute estabelecido por estudos de laboratoacuterio que as caracteriacutesticas
executadas do meacutetodo satisfazem aos requisitos para as aplicaccedilotildees analiacuteticas praticadas (RIBANI
et al2004 VALENTINI SOMMER MATIOLI 2007)
3 REFERENCIAL METODOLOacuteGICO
31 Dados epidemioloacutegicos
9
311 Delineamento do estudo e instrumento de coleta de dados
Tratou-se de uma pesquisa prospectiva descritiva e analiacutetica Os dados epidemioloacutegicos
foram coletados dos pacientes admitidos com histoacuteria de exposiccedilatildeo e ou intoxicaccedilatildeo por
medicamentos no Hospital de Emergecircncia e Trauma de Campina Grande atendidos e notificados
pelo Centro de Informaccedilatildeo Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) nos meses de agosto
e setembro de 2012 Utilizou-se a ficha do Sistema Nacional de Agravos de Notificaccedilatildeo
(Sinan)MS para a coleta dos dados epidemioloacutegicos desses pacientes (Anexo A)
312 Variaacuteveis demograacuteficas e socioeconocircmicas
Gecircnero
Faixa Etaacuteria
Ocupaccedilatildeo
313 Variaacuteveis relativas ao evento
Circunstacircncia
314 Variaacutevel relativa ao Agente Toacutexico
Os grupos de medicamentos foram classificados em categorias terapecircuticas segundo o
Anatomical-Therapeutical-ChemicalClassification System (ATC)
Os medicamentos pertencentes ao nono niacutevel dessa classificaccedilatildeo satildeo classificados como
os medicamentos que atuam no sistema nervoso central representado pela letra N Neste niacutevel
estatildeo incluiacutedos os psicodisleacutepticos ansioliacuteticos (NO5B) antipsicoacuteticos (NO5A) hipnoacutetico-
sedativos (NO5C) e os psicoanaleacutepticos antidepressivos (NO6A) e
estimulantespsicoestimulantes (NO6B)
315 Variaacuteveis relativas agrave intoxicaccedilatildeo
Avaliar os sinais e sintomas
Classificar os casos quanto agrave gravidade
10
Quanto ao item gravidade adotamos o seguinte criteacuterio com base no trabalho de King e
Palmisano 1989
Grave o paciente que permanece internado apoacutes procedimentos do tipo lavagem gaacutestrica
ou observaccedilatildeo meacutedica
Moderada ocorre algum procedimento do tipo lavagem gaacutestrica ou observaccedilatildeo meacutedica
mas sem internaccedilatildeo
Leve a famiacutelia recebe somente orientaccedilatildeo ou acompanhamento por telefone e nenhum
procedimento
Ignorada natildeo eacute possiacutevel classificar a extensatildeo do dano
Evoluccedilatildeo
Alta meacutedica (Cura)
Transferecircncia para outra unidade hospitalar
Ignorado
Oacutebito
32 DADOS EXPERIMENTAIS
321 Ensaios de Desenvolvimento e Validaccedilatildeo da Metodologia
Local da Pesquisa Laboratoacuterio de Desenvolvimento e Certificaccedilatildeo de Biomaterias do
Nordeste unidades da UEPB e UFCG
Materiais
Solventes reagentes e outros aparatos
-Alprazolam (faacutermaco) doaccedilatildeo feita pelo Nuacutecleo de odontologia e medicina Legal - NUMOL
-Medicamento (Medley) Alprazolam
-Acetona Vetec
11
-Clorofoacutermio Vetec
-Sulfato de Soacutedio Anidro Vetec
-Metanol (HPLC) Paneac
-Placas de Siacutelica Gel ALUGRAM SIL G 60F de (20x20) cm
2 foram adquiridas da Macherey-
Nagel (REF 818033)
-Cubas Cromatograacuteficas
-Papel de filtro Qualy
Equipamentos
-Estufa Med Clav
-Banho de Ultra-Som ULTRAsonic 1440A
-Centrifuga DCS-16 RV
-Cacircmera de Luz UV (λ=264nm)
-Espectrocircmetro FTIR SPECTRUM 400 Perkin-Elmer (4000 a 600 cm-1 para anaacutelise das
caracteriacutesticas do grupos funcionais dos faacutermacos)
322 Preparaccedilatildeo dos padrotildees
As soluccedilotildees estoque do faacutermaco foram preparadas pela dissoluccedilatildeo de cada composto em
metanol para obter a concentraccedilatildeo de 400 microg mL
323 Preparaccedilatildeo das Amostras
Procedimento de Extraccedilatildeo Extraccedilatildeo Liacutequido-Liacutequido (ELL)
Na fase de desenvolvimento do meacutetodo um importante passo foi a retirada dos
interferentes das amostras Para isto foram realizados vaacuterios procedimentos de Clean-up usando
ELL Para a ELL foi usado o meacutetodo de Stas-Otto que considera o caraacuteter aacutecidobase de cada
substacircncia do meio em que essa se encontra o seu grau de ionizaccedilatildeo como fatores influentes em
sua solubilidade em solventes orgacircnicos pois a partir de mistura desses em proporccedilotildees
adequadas pode-se submeter agraves amostras agrave ELL (FIGURA 01)
Terminada a extraccedilatildeo por sonicaccedilatildeo ou centrifugaccedilatildeo a fase orgacircnica foi recolhida
evaporada e ressuspendida para anaacutelise cromatograacutefica e espectrofotomeacutetrica
12
324 Teacutecnicas
Anaacutelise por CCD
A anaacutelise por CCD foi baseada na metodologia claacutessica descrita por Moraes (1991) com
adaptaccedilatildeo
Os resiacuteduos obtidos por ELL foram ressuspendidos em MetanolAacutegua (91) e aplicados
nas placas cromatograacuteficas previamente ativadas em estufas a 105ordmC por 30 minutos Aplicaram-
se nas placas aliacutequotas de 20 microL dos extratos obtidos por ELL Foi utilizado o sistema solvente
constituiacutedo de mistura de clorofoacutermio-metanol (91) e clorofoacutermio-acetona (41)
Os cromatogramas foram revelados usando meacutetodos quiacutemicos (agentes cromogecircnicos
Reativo de Dragendorff Difenilcarbazona Nitrato de Prata 1 e Cloreto Feacuterrico 5) e meacutetodo
fiacutesico (Cacircmera de Luz UV (λ=264nm)
Figura 01 - Esquema de extraccedilatildeo amostras
FONTE MORAES 1991
325 Estudo de seletividade e recuperaccedilatildeo
Seletividade
A seletividade do meacutetodo foi avaliada atraveacutes da extraccedilatildeo de 6 amostras diferentes de
urinas (n=6) por LLE e depois analisadas por CCDC
25 ml
13
Recuperaccedilatildeo
A extraccedilatildeo para avaliar a recuperaccedilatildeo foi realizada pela anaacutelise de amostras em
triplicatas contaminadas (fortificadas) em trecircs concentraccedilotildees do padratildeo de Alprazolam (baixa=
100microgml meacutedia=200 microgml e alta= 400 microgml)
326 O Limite de Detecccedilatildeo (LD) e o Limite de Quantificaccedilatildeo (LQ)
O Limite de Detecccedilatildeo eacute a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser
detectada mas natildeo necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento
experimental O Limite de Quantificaccedilatildeo eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia
em exame que pode ser medida utilizando um determinado procedimento experimental
O LD foi determinado por anaacutelise de urina contaminada em concentraccedilotildees decrescentes
de faacutermaco e medicamento ateacute a concentraccedilatildeo possiacutevel de se detectar a presenccedila de ambos O LQ
foi determinado por analise de urina contaminada em concentraccedilotildees decrescentes de faacutermaco e
medicamento ateacute a concentraccedilatildeo possiacutevel de se quantificar a presenccedila de ambos
327 Robustez
Na avaliaccedilatildeo da robustez foram utilizados como solventes o metanol a aacutegua uma soluccedilatildeo
de clorofoacutermio- acetona (41) e uma soluccedilatildeo de clorofoacutermio-metanol (91) para preparaccedilatildeo dos
padrotildees de Alprazolam
328 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier - FTIR
Foram feitas anaacutelises de soluccedilotildees metanoacutelicas ( 10 mgmL n=3) do faacutermaco padratildeo e suas
extraccedilotildees utilizando a faixa de varredura de 4000 a 500 cm-1
em temperatura ambiente
4 DADOS E ANAacuteLISE DA PESQUISA
41 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
No periacuteodo de agosto a setembro de 2012 o Ceatox-CG registrou 28 casos com histoacuteria
de intoxicaccedilatildeo por medicamentos Destes 18 casos foram classificados como
14
neuropsicofaacutermacos Na anaacutelise dos casos do uso isolado de medicamentos os Antiepileacutepticos
assim como os Ansioliticos foram os responsaacuteveis pelo maior nuacutemero de ocorrecircncias com um
percentual de 22 (n=4) cada um Um estudo realizado com crianccedilas no estado de Mato Grosso
do Sul verificou que os anticonvulsivantes foram os principais responsaacuteveis pelos eventos toacutexicos
por medicamentos que agem no SNC (MATOS et al 2008)
Ao analisarmos as associaccedilotildees de medicamentos (n=7-39) nos chama a atenccedilatildeo o
nuacutemero de ocorrecircncias por tentativa de suiciacutedio (n=10-557) Bernades Turini e Matsuo
(2010) afirmam que pacientes que tentam suiciacutedio em sua grande maioria fazem uso de mais de
um tipo de substacircncia quiacutemica ndash medicamentosa ou natildeo ndash quando o meacutetodo eacute a intoxicaccedilatildeo
voluntaacuteria
Os eventos toxicoloacutegicos foram mais comuns em mulheres (556) por tentativa de
suiciacutedio (557) e entre adultos e jovens (389) (Tabela 01) Um estudo realizado entre os anos
de 1997 e 2007 no Centro de Controle de Intoxicaccedilatildeo (CCI) em Londrina Paranaacute analisando as
tentativas de suiciacutedio por sobredose intencional de medicamentos com relaccedilatildeo ao gecircnero condiz
com dados aqui obtidos (BERNADES TURINI MATZUO 2010) Por outro lado Gandolfi e
Andrade (2006) mostra o ldquoacidente individualrdquo como principal fator responsaacutevel pelas exposiccedilotildees
toacutexicas a medicamentos em Satildeo Paulo seguido pela tentativa de suiciacutedio
Graacutefico 01 - Grupos farmacoloacutegicos de acordo com a classificaccedilatildeo da ATC responsaacuteveis pelas
intoxicaccedilotildees registradas no Ceatox-CG entre agosto a setembro de 2012 (N= 18)
2239
1722
Associaccedilotildees
N05A
N03A
N05B
NOTA N05A Antipsicoacuteticos N03A Antiepileacuteptico NO5B Ansioliacuteticos e associaccedilatildeo
15
Acerca da ocupaccedilatildeo dos pacientes os estudantes foram os mais frequentes (n=6-333)
Este dado entra em desacordo com a mesma variaacutevel analisada no estudo de Turini et al (2010)
em que mostra que a ocupaccedilatildeo mais relevante nos seu estudo eacute a de empregado (Tabela 01)
Observando-se os sinais e sintomas das intoxicaccedilotildees as Siacutendromes Toacutexicas por
Superdosagem de Sedativos (pupilas mioacuteticas tremor hipotensatildeo confusatildeo mental e sonolecircncia)
e a Extrapiramidal (choro monoacutetono opistoacutetomo e distonia) foram predominantes O quadro
toacutexico se desenvolve dependendo da dose do subgrupo terapecircutico e do tempo entre a exposiccedilatildeo
e o atendimento Os ansioliacuteticos principalmente os Benzodiazepiacutenicos (BZD) satildeo compostos
que apresentam maior iacutendice terapecircutico e menor potencialidade de provocar acidentes fatais e
menor tendecircncia para produzir toleracircncia farmacoloacutegica (FORSAN 2010)
Tabela 01 ndash Frequecircncia do tipo de circunstacircncia da faixa etaacuteria do gecircnero e da ocupaccedilatildeo dos pacientes intoxicados
atendidos no Ceatox-CG
Variaacutevel
N
Circunstacircncia (N=18)
Tentativa de Suiciacutedio 10 557
Acidental 1 57
Outra 7 389
Faixa Etaacuteria (anos) (N=18)
1---9 3 166
10---19 5 278
20---39 7 389
gt 40 3 167
Gecircnero (N=18)
Masculino 8 444
Feminino 10 556
Ocupaccedilatildeo (N=18)
Estudante 6 333
Do lar 4 222
Outra 8 444
16
Em relaccedilatildeo agrave variaacutevel evoluccedilatildeo natildeo se registrou nenhum oacutebito no periacuteodo estudado
Dados nacionais entre os anos de 2007 a 2009 mostram que os medicamentos apresentaram
baixo coeficiente de letalidade meacutedio quando comparado aos agrotoacutexicos de uso agriacutecola e as
drogas de abuso (SISTEMA2012) Um estudo realizado por Mota et al (2012) usando dados
secundaacuterios do Sistema Informaccedilatildeo de Mortalidade (SIM)MS entre 1996 a 2005 identificou
4403 oacutebitos relacionados a medicamentos entretanto natildeo foi possiacutevel estabelecer qual a
principal classe de medicamentos nem o princiacutepio ativo envolvido com o agravo
42 Dados Experimentais
Para otimizaccedilatildeo do meacutetodo vaacuterios procedimentos foram realizados seguindo os
paracircmetros analiacuteticos de validaccedilatildeo objetivando detectar a presenccedila de Alprazolam em urina de
paciente com histoacuterico de exposiccedilatildeo toxica a esse faacutermaco A metodologia desenvolvida e
validada mostrou-se em conformidade com as especificaccedilotildees da Resoluccedilatildeo RDC nordm899 de 29 de
maio de 2003 (BRASIL 2003)
Na avaliaccedilatildeo da seletividade nas amostras de urina analisadas natildeo foram detectados
interferentes nas condiccedilotildees de extraccedilatildeo estabelecidas Assim o meacutetodo mostrou-se seletivo jaacute
que as amostras natildeo mostraram nenhum spot(mancha) semelhante aos desenvolvidos pelos
padrotildees No processo de validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos a especificidade ou seletividade eacute o
primeiro passo para o desenvolvimento de um meacutetodo este paracircmetro deve ser avaliado
continuamente para assegurar a precisatildeo e exatidatildeo deste durante sua validaccedilatildeo (SILVA et al
2010) (Tabela 02)
Para os ensaios de recuperaccedilatildeo foi observada a intensidade do spot desenvolvido em cada
amostra para cada niacutevel de fortificaccedilatildeo Nas amostras fortificadas com 200 microg do padratildeo
obtivemos uma recuperaccedilatildeo de 917 enquanto que nas amostras fortificadas com 400 microg do
mesmo o percentual meacutedio obtido foi de 967 demonstrando assim a exatidatildeo do meacutetodo
Segundo a Resoluccedilatildeo RDC nordm 899 de 29 de maio de 2003 a exatidatildeo se daacute pela concordacircncia
entre o resultado de um ensaio e um valor de referecircncia
17
Tabela 02 ndash Avaliaccedilatildeo da seletividade comparando-se spot e Rf (Relative Front) dos padrotildees de
Alprazolam e amostras branco
Sistema-solvente Agente cromogecircnico
Clorofoacutermio-metanol(91v v)
DI
Clorofoacutermio-acetona(41vv)
DI
FaacutermacoAmostras Rf e Cor Rf e Cor
Padratildeo Alprazolam faacutermaco
Padratildeo Alprazolam comprimido
ABal1
ABal2
ABal3
ABal4
ABal5
05 + c
026 + c
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Nota DI = Dragendorff iodado ABal = amostra branco alcalina Rf = fator de retenccedilatildeo c = cor
castanha
O Limite de Detecccedilatildeo e o Limite de Quantificaccedilatildeo para o Alprazolam foram de
100microgmL e 200 microgmL respectivamente Ribani et al (2004) define o Limite de Detecccedilatildeo (LD)
como sendo a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser detectada mas natildeo
necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento experimental O Limite
de Quantificaccedilatildeo (LQ) eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode
ser medida utilizando um determinado procedimento experimental (Figura 01)
O meacutetodo de extraccedilatildeo utilizado particcedilatildeo liacutequido-liacutequido demonstrou-se eficaz pois a
solubilidade do faacutermaco avaliado possui uma elevada afinidade pela mistura de solventes
utilizados nesse procedimento Na separaccedilatildeo do analito da matriz a sonicaccedilatildeo que eacute o processo
que utiliza a energia das ondas sonoras mais comumente a ultrassom se mostrou mais eficaz que
a centrifugaccedilatildeo
O sistema formado pelos solventes clorofoacutermio-metanol (91 vv) obteve o melhor
resultado em relaccedilatildeo ao sistema solvente clorofoacutermio-acetona(41 vv) tendo em vista melhor
resultado na separaccedilatildeo dos padrotildees e amostras
18
Figura 01-Identificaccedilatildeo de Alprazolam em trecircs niacuteveis de fortificaccedilatildeo (n = 3) alta meacutedia e baixa
Dentre os agentes cromogecircnicos utilizados na revelaccedilatildeo apenas o Reativo de Dragendorff
se mostrou eficaz Observou-se atraveacutes do meacutetodo fiacutesico utilizando a Cacircmera de Luz UV que o
Alprazolam faacutermaco e o Alprazolam comprimido natildeo transmite fluorescecircncia no comprimento
de onda de 366nm
Para avaliaccedilatildeo da Robustez as soluccedilotildees-padratildeo (faacutermaco e medicamento) foram
dissolvidas em diversos solventes como apresentado na Tabela 03 O metanol foi o solvente em
que houve revelaccedilatildeo na placa cromatograacutefica tanto do faacutermaco como do medicamento
Tabela 03 - Anaacutelise dos diferentes solventes da soluccedilatildeo estoque padratildeo puro do faacutermaco e do medicamento de
Alprazolam a partir do Rf
NOTA Rf = Relative Front spot= cormancha
Solvente Alprazolam faacutermaco Alprazolam medicamento
Rf Rf
Metanol 05 026
Aacutegua 06 -
ClorofoacutermioAcetona
(41)
056 -
ClorofoacutermioMetanol
(41)
052 -
AMOSTRAS
PADRAtildeO
19
Os testes de robustez satildeo de fundamental importacircncia para que os analistas conheccedilam
quais fatores devem ser estritamente controlados durante a execuccedilatildeo de um meacutetodo Se as
alteraccedilotildees das condiccedilotildees de anaacutelise produzirem resultados dentro dos limites aceitaacuteveis de
seletividade exatidatildeo e precisatildeo o meacutetodo pode ser considerado robusto e tais variaccedilotildees podem
ser incorporadas ao procedimento (CASSIANO et al 2009)
Apesar do meacutetodo ter se mostrado seletivo para o Alprazolam ele natildeo eacute especifico apenas
para esse faacutermaco Sendo assim o meacutetodo foi aplicado em 7 (sete) amostras de pacientes com
histoacuterico de exposiccedilatildeo toacutexica por medicamentos atendidos pelo Centro de Informaccedilatildeo
Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) poreacutem natildeo foi possiacutevel obter a recuperaccedilatildeo dos
faacutermacos Acredita-se que a quantidade ingerida dos medicamentos pelos pacientes foi baixa ou
que pela demora da coleta da amostra os faacutermacos tenham sido metabolizado pelo organismo
Nos ensaios de confirmaccedilatildeo por FTIR observou-se que o Alprazolam padratildeo apresentou as
seguintes vibraccedilotildees moleculares A deformaccedilatildeo angular N-H de amina secundaacuteria eacute observada na
banda em 1660 cm-1
Em 1647 cm-1
aparece uma banda que pode ser atribuiacuteda ao estiramento
C=N da imina e em 1397 cm-1
aparece uma banda atribuiacuteda ao estiramento C-N das aminas A
banda caracteriacutestica do estiramento =C-H de carbono sp2 do anel aromaacutetico se encontra em 3275
cm-1
O espectro do faacutermaco extraiacutedo da matriz bioloacutegica mantecircm as mesmas caracteriacutesticas do
faacutermaco padratildeo Dessa forma podemos afirmar que a moleacutecula natildeo sofreu alteraccedilatildeo durante o
processo de extraccedilatildeo (Figura 02)
Figura 02 - Espectro da analise no FTIR do padratildeo de Alprazolam faacutermaco e de amostra extraiacuteda
20
5 CONCLUSAtildeO
O meacutetodo demonstrou atender aos requisitos de boas praacuteticas exigidos pela Resoluccedilatildeo
RDC 899 de 29 de maio de 2003 sendo exato e sensiacutevel
Dentre as amostras de pacientes intoxicados por medicamentos natildeo se obteve resultados
positivos para o Alprazolam
Os medicamentos constituem como um dos principais meios utilizado para tentativa de
suiciacutedio tendecircncia que eacute observada nos paiacuteses de terceiro mundo entre eles os psicofaacutermacos os
mais utilizados Haacute necessidade de uma melhor formaccedilatildeo e atualizaccedilatildeo dos profissionais assim
como de informaccedilatildeo aos usuaacuterios e medidas de prevenccedilatildeo que poderiam alertar sobre os riscos e
monitorar o uso desses medicamentos
O Brasil em agosto de 2006 deu o primeiro passo lanccedilando a Portaria nordm 1876 com as
diretrizes nacionais para Prevenccedilatildeo do Suiciacutedio nas trecircs esferas da gestatildeo Portanto estudar e
prevenir as tentativas de suiciacutedio eacute um desafio pois envolve recursos financeiros e sensibilidade
da parte dos profissionais envolvidos
Por outro lado aleacutem do conhecimento dos dados epidemioloacutegicos eacute necessaacuteria a
identificaccedilatildeo dos grupos terapecircuticos responsaacuteveis pelas intoxicaccedilotildees As teacutecnicas
cromatograacuteficas e espectrofotomeacutetricas possuem uma extensa aplicabilidade em pesquisas
cientiacuteficas anaacutelise quiacutemica teste de controle de qualidade de medicamentos entre outros Isso se
daacute por serem teacutecnicas altamente sensiacuteveis de alta resoluccedilatildeo e por ser um meacutetodo mais raacutepido e
preciso Ao analisar traccedilos de compostos em amostras complexas como sangue e urina as
anaacutelises toxicoloacutegicas auxiliam no prognoacutestico e diagnoacutestico de intoxicaccedilotildees uma vez que eacute
possiacutevel identificaccedilatildeo destes compostos em amostras bioloacutegicas
O meacutetodo por CCDC tem caraacuteter semindashquantitativo jaacute que a quantificaccedilatildeo dos faacutermacos eacute
baseada apenas na comparaccedilatildeo visual dos ldquoSpotsrdquo das amostras e dos padrotildees Embora o meacutetodo
seja adequado para triagem os resultados mostram que a quantificaccedilatildeo de faacutermacos por meacutetodos
baseados no uso de CCDC deve possuir uma interpretaccedilatildeo bem cautelosa especialmente devido agrave
incerteza associada a este tipo de comparaccedilatildeo
Se faz necessaacuterio a confirmaccedilatildeo da identidade do faacutermaco por outras teacutecnicas eou outros
meacutetodos de anaacutelise como a Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia (CLAE) e Cromatografia
21
Gasosa (CG) sendo assim possiacutevel correlacionar os perfis cromatograacuteficos entre as diferentes
teacutecnicas
ABSTRACT
The medicines are presented as the main toxic agent responsible for cases of human poisoning
thus constituting a major challenge for those working with Public Health However the absence
of a specialized toxicological analysis hinders a more accurate diagnosis of cases The
spectrophotometric and chromatographic techniques may assist in confirming the diagnosis A
Comparative Thin Layer Chromatography (CCDC) is a separation technique simple low cost and
good sensitivity The identification of the drug can be achieved both quantitatively and
qualitatively by infrared spectroscopy Fourier transform (FTIR) This research proposal was to
evaluate two techniques for identification of Alprazolam in urine of patients with toxic exposure
to drugs assessing the selectivity accuracy limit of detection limit of quantification and
robustness in chromatographic techniques The method was optimized validated and applied in
accordance with Resolution RDC Nordm 899 of May 29 2003 The chromatographic assay used
plates of Silica Gel G-60 elution with chloroform-methanol 91 (v v) and as a chromogenic
agent the Reactive Dragendorff The presence of the drug was confirmed by the FTIR analysis
The method proved to be selective chromatographic conditions established by presenting Limit
Detection and Quantification 200μgml and 100μgml respectively Among the patient samples
drug poisoning no positive results obtained for Alprazolam The FTIR analysis showed that the
drug did not undergo degradation in the extraction process The method has proven to meet the
requirements of good practice required by RDC Nordm 899 of 29 May 2003 being sensitive and
accurate
KEYWORDS Alprazolam Spectroscopy Chromatography Intoxication
REFEREcircNCIAS
AMERICAN ASSOCIATION OF POISON CENTERS TOXIC EXPOSURE SURVEILLANCE
SYSTEM (AAPCC) Disponivel em lt httpwwwaapccorgdnndefaultaspx gt acessado em 18
de setembro de 2012
22
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27
ANEXO A
28
3
1 INTRODUCcedilAtildeO
Os benzodiazepiacutenicos estatildeo entre os medicamentos mais utilizados em todo o mundo
estima-se que entre 1 e 3 de toda a populaccedilatildeo ocidental jaacute tenha consumido
benzodiazepiacutenicos regularmente por mais de um ano Em virtude do menor potencial de causar
dependecircncia e maior iacutendice terapecircutico essas substacircncias tonaram-se os mais utilizados entre os
medicamentos com propriedades sedativas (HUF LOPES ROSENFELD 2000)
O Alprazolam eacute um faacutermaco que se apresenta em forma de cristais branco praticamente
insoluacutevel em aacutegua sendo soluacutevel em metanol e etanol Este faacutermaco eacute um anaacutelogo triazolo 14
benzodiazepina apresentando polimorfismo Pertence ao grupo dos benzodiazepiacutenicos de alta
potecircncia indicado para o tratamento dos transtornos de ansiedade do pacircnico e de ansiedade
associada agrave depressatildeo que apresenta menor efeito sedativo em comparaccedilatildeo a outros
medicamentos da mesma classe Eacute considerado um benzodiazepiacutenico de alta potecircncia e meia-vida
intermediaacuteria entre 12 e 16 horas (STOPPE 2004 KASSAB 2009)
O Alprazolam atua de modo seletivo sobre os receptores Aacutecido Gama-Aminobutiacuterico tipo
A (GABAA) alterando sua conformaccedilatildeo e aumentando a frequecircncia de abertura dos canais de
cloro potencializando assim o efeito inibitoacuterio do GABA provocando efeitos ansioliacuteticos e
sedativos caracteriacutesticos das benzodiazepinas Eacute metabolizado no fiacutegado pelo complexo do
citocromo P450 e biotransformado em dois importantes mataboacutelitos ativos a α-
hidroxialprazolam e 4-hidroxialprazolam Eacute excretado principalmente na urina sob a forma de
glucuroniacutedeos mas pode ainda ser eliminado atraveacutes do suor saliva e leite materno
(GONCcedilALVES CARVALHO BATISTA 2008)
O Relatoacuterio Anual de 2009 da Associaccedilatildeo Americana dos Centros de Controle de
Envenenamento registrou aproximadamente 25 milhotildees de eventos toacutexicos em humanos Destes
526 ocorreram em crianccedilas menores de 5 anos de idade e envolveram principalmente
medicamentos e cosmeacuteticos No Brasil o Sinitox consolidou a ocorrecircncia de aproximadamente
102 mil casos de intoxicaccedilatildeo humana Deste total os medicamentos responderam por 2647 e a
faixa etaacuteria mais acometida foi a de crianccedilas de 1 a 4 anos de idade (AMERICAN 2012
SISTEMA 2012)
4
O fato dos medicamentos serem apontados como a principal causa das intoxicaccedilotildees no
Brasil nas uacuteltimas deacutecadas aumenta o desafio dos laboratoacuterios de anaacutelises toxicoloacutegicas a
desenvolverem metodologias analiacuteticas para a pronta pesquisa e identificaccedilatildeo de faacutermacos
envolvidos nos casos de intoxicaccedilatildeo aguda (AMEacuteRICO MOSSIN NISHIYAMA 2008)
Afirma Karp (2005) que a cromatografia por se tratar de um meacutetodo fiacutesico-quiacutemico pode
ser utilizada para analisar identificar ou separar os componentes de uma mistura em amostras
bioloacutegicas A separaccedilatildeo de dois ou mais compostos estaacute fundamentada na distribuiccedilatildeo
diferencial dos componentes entre duas fases uma estacionaacuteria e outra moacutevel imisciacutevel
A Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC) pode ser utilizada no
diagnoacutestico de exposiccedilotildees toacutexicas por medicamentos por apresentar procedimentos analiacuteticos
raacutepidos de faacutecil execuccedilatildeo abrangentes de baixo custo auxiliando na identificaccedilatildeo de
psicofaacutermacos como o Alprazolam (TRUJILLO et al 2007 AMEacuteRICO MOSSIN
NISHIYAMA 2008)
A Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier - FTIR pode ser usada
para identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo de compostos orgacircnicos inorgacircnicos e polimeacutericos
Basicamente o que se mede nesta anaacutelise eacute a fraccedilatildeo da energia transmitida ou absorvida em
relaccedilatildeo agrave incidente em determinado comprimento de onda ou nuacutemero de onda
Ateacute recentemente a espectroscopia na regiatildeo do infravermelho era pouco utilizada em
anaacutelises quantitativas em decorrecircncia de algumas limitaccedilotildees inerentes agrave teacutecnica Poreacutem com a
utilizaccedilatildeo da transformada de Fourier aliada agrave evoluccedilatildeo de teacutecnicas quimiomeacutetricas ao advento
dos microprocessadores digitais e de teacutecnicas computacionais avanccediladas permitiu-se a anaacutelise de
misturas complexas como os medicamentos (SOUZA et al 2004) A identificaccedilatildeo destas
substacircncias pode ser alcanccedilada tanto quantitativamente como qualitativamente atraveacutes da
espectroscopia por refletacircncia difusa no infravermelho com transformada de Fourier Diffuse
Reflectance Infrared Fourier Transform Spectroscopy - DRIFTS (YANG IRUDAYARAJ
2002)
Entretanto para garantia da seguranccedila dos resultados de doseamento os meacutetodos para a
determinaccedilatildeo quantitativa ou semi-quantitativa de faacutermacos devem ser validados para que se
tornem uacuteteis e confiaacuteveis e possam ser utilizados na rotina laboratorial (ROCA et al 2007
MOJSIEWICZ-PIEŃKOWSKA 2011)
5
A validaccedilatildeo consiste no ato de tornar legiacutetimo ou legal um meacutetodo equipamento sistema
ou metodologia atraveacutes do estabelecimento de documentaccedilotildees visando diminuir ou controlar os
fatores que levam agrave imprecisatildeo ou inexatidatildeo para garantir a confiabilidade e rastreabilidade dos
dados gerados Para validar um meacutetodo eacute essencial que sejam incluiacutedos pelo menos os seguintes
paracircmetros exatidatildeo precisatildeo fidelidade linearidade limite de detecccedilatildeo e limite de
quantificaccedilatildeo sensibilidade especificidade recuperaccedilatildeo robustez estabilidade e intervalo de
aplicaccedilatildeo (RIBANI et al 2004 LANCcedilAS 2004 VALENTINI SOMMER MATIOLI 2007)
A otimizaccedilatildeo das metodologias analiacuteticas possibilita a aplicaccedilatildeo de teacutecnicas
cromatograacuteficas e espectrofotomeacutetricas em amostras bioloacutegicas na rotina de um laboratoacuterio de
emergecircncia toxicoloacutegica e nos serviccedilos puacuteblicos de sauacutede auxiliando na confirmaccedilatildeo do
diagnoacutestico e no prognoacutestico dos pacientes com histoacuterico de exposiccedilatildeo toacutexica por medicamentos
Assim esta pesquisa teve como objetivo realizar ensaios cromatograacuteficos avaliando a
seletividade exatidatildeo limite de detecccedilatildeo limite de quantificaccedilatildeo e robustez para pesquisa de
Alprazolam em amostras bioloacutegicas de pacientes com diagnoacutestico de exposiccedilatildeo toacutexica a
medicamentos A confirmaccedilatildeo dos resultados foi realizada atraveacutes da Espectroscopia
Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR)
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
No Brasil e outros paiacuteses como Alemanha Canadaacute e Inglaterra os medicamentos vecircm
preocupando as autoridades e os profissionais de sauacutede pois se apresentam como o principal
agente toacutexico responsaacutevel pelos casos de intoxicaccedilotildees humanas constituindo portanto um
grande desafio para os que trabalham com a Sauacutede Puacuteblica (FALCAtildeO 2004 SISTEMA
2012)
Vaacuterios episoacutedios histoacutericos marcaram acidentes com medicamentos em 1937 mais de 100
crianccedilas morreram nos Estados Unidos pelo uso de um elixir sulfanilamida que continha como
veiacuteculo o dietilenoglicol Em 1938 como consequecircncia deste evento foi aprovada nos Estados
Unidos a lei que criou a ldquoFood and Drug Administrationrdquo (FDA) obrigando as induacutestrias
farmacecircuticas a fornecer informaccedilotildees a esta instituiccedilatildeo dados cliacutenicos sobre novos
6
medicamentos Um dos acidentes marcantes relacionado ao uso de medicamentos aconteceu na
Alemanha Oriental em 1961 pelo uso da Talidomida um hipnoacutetico natildeo barbituacuterico prescrito na
eacutepoca para tratar naacuteuseas e vocircmitos em mulheres graacutevidas aproximadamente 12000 crianccedilas
nasceram com focomelia (termo Grego que significa membro de focas e caracteriza um processo
de deformidade dos membros) Atraveacutes de estudos epidemioloacutegicos foi comprovado o efeito
teratogecircnico da Talidomida e como consequecircncia entre 1961 a 1962 foi retirada do mercado em
quase todo o mundo
Um marco na histoacuteria da organizaccedilatildeo da Assistecircncia Farmacecircutica no Brasil foi a
aprovaccedilatildeo da Poliacutetica Nacional de Medicamentos em 30 de outubro de 1998 pela Portaria nordm
3916 Esta Portaria contempla diretrizes como Adoccedilatildeo de Relaccedilatildeo de Medicamentos Essenciais
(Rename) Regulamentaccedilatildeo Sanitaacuteria de Medicamentos Reorientaccedilatildeo da Assistecircncia
Farmacecircutica Promoccedilatildeo do Uso Racional de Medicamentos Desenvolvimento Cientiacutefico e
Tecnoloacutegico Promoccedilatildeo da Produccedilatildeo de Medicamentos Garantia da Seguranccedila Eficaacutecia e
Qualidade dos Medicamentos e Desenvolvimento e Capacitaccedilatildeo de Recursos Humanos aleacutem de
definir prioridades relacionadas agrave legislaccedilatildeo incluindo Revisatildeo da Rename Assistecircncia
Farmacecircutica Promoccedilatildeo do Uso Racional de Medicamentos e a Organizaccedilatildeo das Atividades de
Vigilacircncia Sanitaacuteria de Medicamentos (BRASIL 2006)
Uma significativa parcela dos medicamentos prescritos no Brasil eacute da classe dos
psicofaacutermacos Estima-se que pelo menos 13 do total de faacutermacos consumidos no nosso paiacutes
envolva Benzodiazepiacutenicos Antidepressivos e Neuroleacutepticos Anticonvulsivantes ou estimulantes
do Sistema Nervoso Central (SNC) (LUCHETTI et al 2010)
Rodrigues et al (2006) afirmam que esse percentual estaacute relacionado ao aumento da
frequecircncia de diagnoacutesticos de transtornos psiquiaacutetricos na populaccedilatildeo agrave introduccedilatildeo de novos
psicofaacutermacos no mercado farmacecircutico e agraves novas indicaccedilotildees terapecircuticas de psicofaacutermacos jaacute
existentes
Os benzodiazepiacutenicos estatildeo entre as drogas mais prescritas no mundo Satildeo utilizados
principalmente como ansioliacuteticos e hipnoacuteticos aleacutem de possuir accedilatildeo miorrelaxante e
anticonvulsivante (AUCHEWSKI et al 2004)
Apoacutes sua comercializaccedilatildeo no iniacutecio dos anos 60 os Benzodiazepiacutenicos (BZD)
substituiacuteram praticamente todas as drogas utilizadas no tratamento da ansiedade - Barbituacutericos
Meprobamato Hidrato de Cloral e outros que provocavam seacuterios efeitos colaterais Isso ocorreu
7
em virtude do maior iacutendice terapecircutico dessas substacircncias menor potencialidade de provocar
acidentes fatais e menor tendecircncia para produzir siacutendromes de abstinecircncia e toleracircncia
farmacoloacutegica (FORSAN 2010)
Embora sejam drogas relativamente seguras restriccedilotildees agrave sua utilizaccedilatildeo tecircm sido cada vez
maiores devido agrave incidecircncia dos efeitos colaterais relacionados agrave depressatildeo do sistema nervoso
central Dentre eles os principais satildeo a diminuiccedilatildeo da atividade psicomotora o prejuiacutezo na
memoacuteria a desinibiccedilatildeo paradoxal e a potencializaccedilatildeo do efeito depressor pela interaccedilatildeo com
outras drogas depressoras principalmente o aacutelcool Aleacutem disso a depressatildeo e a distimia (tipo de
depressatildeo crocircnica) podem ocorrer consequumlentemente ao uso de alprazolam e clonazepam
(LACERDA et al 2004)
Esta classe de faacutermacos constitui a primeira causa de exposiccedilotildees toacutexicas dentre os outros
grupos de medicamentos em nosso meio No entanto as intoxicaccedilotildees por essa classe
farmacoloacutegica excepcionalmente tecircm evoluccedilatildeo letal Exercem accedilatildeo sobre o sistema nervoso
central atraveacutes da ligaccedilatildeo aos receptores benzodiazepiacutenicos no complexo do receptor dos canais
de cloro do Aacutecido Gama-Aminobutiacuterico (GABA) As principais manifestaccedilotildees das intoxicaccedilotildees
por benzodiazepiacutenicos satildeo a depressatildeo neuroloacutegica da resposta ventilatoacuteria ao CO2 e diminuiccedilatildeo
da frequecircncia respiratoacuteria (OLIVEIRA et al 2010)
O diagnoacutestico das intoxicaccedilotildees pode ser realizado atraveacutes da histoacuteria do paciente
(anamnese) dos sinais cliacutenicos e laboratoriais
8
A Cromatografia em Camada Delgada (CCD) eacute uma teacutecnica de adsorccedilatildeo do tipo soacutelido-
liacutequida Nesse caso a separaccedilatildeo se daacute pela diferenccedila de afinidade dos componentes de uma
mistura pela fase estacionaacuteria (DEGANI CASS VIEIRA 1998) A fase estacionaacuteria
corresponde a uma camada fina formada por um soacutelido granulado geralmente siacutelica depositado
sobre uma placa de vidro alumiacutenio ou outro suporte inerte Este meacutetodo merece atenccedilatildeo especial
pela sua versatilidade rapidez sensibilidade e nitidez das separaccedilotildees (EIZENDEHER 2005)
A Espectroscopia Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) pode ser usada para
identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo de compostos orgacircnicos inorgacircnicos e polimeacutericos Basicamente o
que se mede nesta anaacutelise eacute a fraccedilatildeo da energia transmitida ou absorvida em relaccedilatildeo agrave incidente
em determinado comprimento de onda ou nuacutemero de onda (EVORA et al 2002)
A espectrometria FTIR permite a determinaccedilatildeo automatizada dos paracircmetros de maior
importacircncia na caracterizaccedilatildeo de amostras Hoje os instrumentos de FTIR satildeo informatizados o
que os torna mais raacutepidos e mais sensiacuteveis do que os instrumentos mais antigos dispersivos Ele
pode ser aplicado agrave anaacutelise de soacutelidos liacutequidos e gases Trata-se de uma metodologia que origina
rapidamente uma informaccedilatildeo sumaacuteria de 30 segundos por amostra eacute uma teacutecnica natildeo poluente jaacute
que natildeo utiliza reagentes aleacutem de natildeo necessitar de pessoal especializado para ser operada em
rotina (MOREIRA MARCOS BARROS 2002)
Para garantir que um novo meacutetodo analiacutetico gere informaccedilotildees confiaacuteveis e interpretaacuteveis
sobre a amostra ele deve passar por um processo de validaccedilatildeo A validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos
eacute o processo pelo qual eacute estabelecido por estudos de laboratoacuterio que as caracteriacutesticas
executadas do meacutetodo satisfazem aos requisitos para as aplicaccedilotildees analiacuteticas praticadas (RIBANI
et al2004 VALENTINI SOMMER MATIOLI 2007)
3 REFERENCIAL METODOLOacuteGICO
31 Dados epidemioloacutegicos
9
311 Delineamento do estudo e instrumento de coleta de dados
Tratou-se de uma pesquisa prospectiva descritiva e analiacutetica Os dados epidemioloacutegicos
foram coletados dos pacientes admitidos com histoacuteria de exposiccedilatildeo e ou intoxicaccedilatildeo por
medicamentos no Hospital de Emergecircncia e Trauma de Campina Grande atendidos e notificados
pelo Centro de Informaccedilatildeo Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) nos meses de agosto
e setembro de 2012 Utilizou-se a ficha do Sistema Nacional de Agravos de Notificaccedilatildeo
(Sinan)MS para a coleta dos dados epidemioloacutegicos desses pacientes (Anexo A)
312 Variaacuteveis demograacuteficas e socioeconocircmicas
Gecircnero
Faixa Etaacuteria
Ocupaccedilatildeo
313 Variaacuteveis relativas ao evento
Circunstacircncia
314 Variaacutevel relativa ao Agente Toacutexico
Os grupos de medicamentos foram classificados em categorias terapecircuticas segundo o
Anatomical-Therapeutical-ChemicalClassification System (ATC)
Os medicamentos pertencentes ao nono niacutevel dessa classificaccedilatildeo satildeo classificados como
os medicamentos que atuam no sistema nervoso central representado pela letra N Neste niacutevel
estatildeo incluiacutedos os psicodisleacutepticos ansioliacuteticos (NO5B) antipsicoacuteticos (NO5A) hipnoacutetico-
sedativos (NO5C) e os psicoanaleacutepticos antidepressivos (NO6A) e
estimulantespsicoestimulantes (NO6B)
315 Variaacuteveis relativas agrave intoxicaccedilatildeo
Avaliar os sinais e sintomas
Classificar os casos quanto agrave gravidade
10
Quanto ao item gravidade adotamos o seguinte criteacuterio com base no trabalho de King e
Palmisano 1989
Grave o paciente que permanece internado apoacutes procedimentos do tipo lavagem gaacutestrica
ou observaccedilatildeo meacutedica
Moderada ocorre algum procedimento do tipo lavagem gaacutestrica ou observaccedilatildeo meacutedica
mas sem internaccedilatildeo
Leve a famiacutelia recebe somente orientaccedilatildeo ou acompanhamento por telefone e nenhum
procedimento
Ignorada natildeo eacute possiacutevel classificar a extensatildeo do dano
Evoluccedilatildeo
Alta meacutedica (Cura)
Transferecircncia para outra unidade hospitalar
Ignorado
Oacutebito
32 DADOS EXPERIMENTAIS
321 Ensaios de Desenvolvimento e Validaccedilatildeo da Metodologia
Local da Pesquisa Laboratoacuterio de Desenvolvimento e Certificaccedilatildeo de Biomaterias do
Nordeste unidades da UEPB e UFCG
Materiais
Solventes reagentes e outros aparatos
-Alprazolam (faacutermaco) doaccedilatildeo feita pelo Nuacutecleo de odontologia e medicina Legal - NUMOL
-Medicamento (Medley) Alprazolam
-Acetona Vetec
11
-Clorofoacutermio Vetec
-Sulfato de Soacutedio Anidro Vetec
-Metanol (HPLC) Paneac
-Placas de Siacutelica Gel ALUGRAM SIL G 60F de (20x20) cm
2 foram adquiridas da Macherey-
Nagel (REF 818033)
-Cubas Cromatograacuteficas
-Papel de filtro Qualy
Equipamentos
-Estufa Med Clav
-Banho de Ultra-Som ULTRAsonic 1440A
-Centrifuga DCS-16 RV
-Cacircmera de Luz UV (λ=264nm)
-Espectrocircmetro FTIR SPECTRUM 400 Perkin-Elmer (4000 a 600 cm-1 para anaacutelise das
caracteriacutesticas do grupos funcionais dos faacutermacos)
322 Preparaccedilatildeo dos padrotildees
As soluccedilotildees estoque do faacutermaco foram preparadas pela dissoluccedilatildeo de cada composto em
metanol para obter a concentraccedilatildeo de 400 microg mL
323 Preparaccedilatildeo das Amostras
Procedimento de Extraccedilatildeo Extraccedilatildeo Liacutequido-Liacutequido (ELL)
Na fase de desenvolvimento do meacutetodo um importante passo foi a retirada dos
interferentes das amostras Para isto foram realizados vaacuterios procedimentos de Clean-up usando
ELL Para a ELL foi usado o meacutetodo de Stas-Otto que considera o caraacuteter aacutecidobase de cada
substacircncia do meio em que essa se encontra o seu grau de ionizaccedilatildeo como fatores influentes em
sua solubilidade em solventes orgacircnicos pois a partir de mistura desses em proporccedilotildees
adequadas pode-se submeter agraves amostras agrave ELL (FIGURA 01)
Terminada a extraccedilatildeo por sonicaccedilatildeo ou centrifugaccedilatildeo a fase orgacircnica foi recolhida
evaporada e ressuspendida para anaacutelise cromatograacutefica e espectrofotomeacutetrica
12
324 Teacutecnicas
Anaacutelise por CCD
A anaacutelise por CCD foi baseada na metodologia claacutessica descrita por Moraes (1991) com
adaptaccedilatildeo
Os resiacuteduos obtidos por ELL foram ressuspendidos em MetanolAacutegua (91) e aplicados
nas placas cromatograacuteficas previamente ativadas em estufas a 105ordmC por 30 minutos Aplicaram-
se nas placas aliacutequotas de 20 microL dos extratos obtidos por ELL Foi utilizado o sistema solvente
constituiacutedo de mistura de clorofoacutermio-metanol (91) e clorofoacutermio-acetona (41)
Os cromatogramas foram revelados usando meacutetodos quiacutemicos (agentes cromogecircnicos
Reativo de Dragendorff Difenilcarbazona Nitrato de Prata 1 e Cloreto Feacuterrico 5) e meacutetodo
fiacutesico (Cacircmera de Luz UV (λ=264nm)
Figura 01 - Esquema de extraccedilatildeo amostras
FONTE MORAES 1991
325 Estudo de seletividade e recuperaccedilatildeo
Seletividade
A seletividade do meacutetodo foi avaliada atraveacutes da extraccedilatildeo de 6 amostras diferentes de
urinas (n=6) por LLE e depois analisadas por CCDC
25 ml
13
Recuperaccedilatildeo
A extraccedilatildeo para avaliar a recuperaccedilatildeo foi realizada pela anaacutelise de amostras em
triplicatas contaminadas (fortificadas) em trecircs concentraccedilotildees do padratildeo de Alprazolam (baixa=
100microgml meacutedia=200 microgml e alta= 400 microgml)
326 O Limite de Detecccedilatildeo (LD) e o Limite de Quantificaccedilatildeo (LQ)
O Limite de Detecccedilatildeo eacute a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser
detectada mas natildeo necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento
experimental O Limite de Quantificaccedilatildeo eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia
em exame que pode ser medida utilizando um determinado procedimento experimental
O LD foi determinado por anaacutelise de urina contaminada em concentraccedilotildees decrescentes
de faacutermaco e medicamento ateacute a concentraccedilatildeo possiacutevel de se detectar a presenccedila de ambos O LQ
foi determinado por analise de urina contaminada em concentraccedilotildees decrescentes de faacutermaco e
medicamento ateacute a concentraccedilatildeo possiacutevel de se quantificar a presenccedila de ambos
327 Robustez
Na avaliaccedilatildeo da robustez foram utilizados como solventes o metanol a aacutegua uma soluccedilatildeo
de clorofoacutermio- acetona (41) e uma soluccedilatildeo de clorofoacutermio-metanol (91) para preparaccedilatildeo dos
padrotildees de Alprazolam
328 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier - FTIR
Foram feitas anaacutelises de soluccedilotildees metanoacutelicas ( 10 mgmL n=3) do faacutermaco padratildeo e suas
extraccedilotildees utilizando a faixa de varredura de 4000 a 500 cm-1
em temperatura ambiente
4 DADOS E ANAacuteLISE DA PESQUISA
41 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
No periacuteodo de agosto a setembro de 2012 o Ceatox-CG registrou 28 casos com histoacuteria
de intoxicaccedilatildeo por medicamentos Destes 18 casos foram classificados como
14
neuropsicofaacutermacos Na anaacutelise dos casos do uso isolado de medicamentos os Antiepileacutepticos
assim como os Ansioliticos foram os responsaacuteveis pelo maior nuacutemero de ocorrecircncias com um
percentual de 22 (n=4) cada um Um estudo realizado com crianccedilas no estado de Mato Grosso
do Sul verificou que os anticonvulsivantes foram os principais responsaacuteveis pelos eventos toacutexicos
por medicamentos que agem no SNC (MATOS et al 2008)
Ao analisarmos as associaccedilotildees de medicamentos (n=7-39) nos chama a atenccedilatildeo o
nuacutemero de ocorrecircncias por tentativa de suiciacutedio (n=10-557) Bernades Turini e Matsuo
(2010) afirmam que pacientes que tentam suiciacutedio em sua grande maioria fazem uso de mais de
um tipo de substacircncia quiacutemica ndash medicamentosa ou natildeo ndash quando o meacutetodo eacute a intoxicaccedilatildeo
voluntaacuteria
Os eventos toxicoloacutegicos foram mais comuns em mulheres (556) por tentativa de
suiciacutedio (557) e entre adultos e jovens (389) (Tabela 01) Um estudo realizado entre os anos
de 1997 e 2007 no Centro de Controle de Intoxicaccedilatildeo (CCI) em Londrina Paranaacute analisando as
tentativas de suiciacutedio por sobredose intencional de medicamentos com relaccedilatildeo ao gecircnero condiz
com dados aqui obtidos (BERNADES TURINI MATZUO 2010) Por outro lado Gandolfi e
Andrade (2006) mostra o ldquoacidente individualrdquo como principal fator responsaacutevel pelas exposiccedilotildees
toacutexicas a medicamentos em Satildeo Paulo seguido pela tentativa de suiciacutedio
Graacutefico 01 - Grupos farmacoloacutegicos de acordo com a classificaccedilatildeo da ATC responsaacuteveis pelas
intoxicaccedilotildees registradas no Ceatox-CG entre agosto a setembro de 2012 (N= 18)
2239
1722
Associaccedilotildees
N05A
N03A
N05B
NOTA N05A Antipsicoacuteticos N03A Antiepileacuteptico NO5B Ansioliacuteticos e associaccedilatildeo
15
Acerca da ocupaccedilatildeo dos pacientes os estudantes foram os mais frequentes (n=6-333)
Este dado entra em desacordo com a mesma variaacutevel analisada no estudo de Turini et al (2010)
em que mostra que a ocupaccedilatildeo mais relevante nos seu estudo eacute a de empregado (Tabela 01)
Observando-se os sinais e sintomas das intoxicaccedilotildees as Siacutendromes Toacutexicas por
Superdosagem de Sedativos (pupilas mioacuteticas tremor hipotensatildeo confusatildeo mental e sonolecircncia)
e a Extrapiramidal (choro monoacutetono opistoacutetomo e distonia) foram predominantes O quadro
toacutexico se desenvolve dependendo da dose do subgrupo terapecircutico e do tempo entre a exposiccedilatildeo
e o atendimento Os ansioliacuteticos principalmente os Benzodiazepiacutenicos (BZD) satildeo compostos
que apresentam maior iacutendice terapecircutico e menor potencialidade de provocar acidentes fatais e
menor tendecircncia para produzir toleracircncia farmacoloacutegica (FORSAN 2010)
Tabela 01 ndash Frequecircncia do tipo de circunstacircncia da faixa etaacuteria do gecircnero e da ocupaccedilatildeo dos pacientes intoxicados
atendidos no Ceatox-CG
Variaacutevel
N
Circunstacircncia (N=18)
Tentativa de Suiciacutedio 10 557
Acidental 1 57
Outra 7 389
Faixa Etaacuteria (anos) (N=18)
1---9 3 166
10---19 5 278
20---39 7 389
gt 40 3 167
Gecircnero (N=18)
Masculino 8 444
Feminino 10 556
Ocupaccedilatildeo (N=18)
Estudante 6 333
Do lar 4 222
Outra 8 444
16
Em relaccedilatildeo agrave variaacutevel evoluccedilatildeo natildeo se registrou nenhum oacutebito no periacuteodo estudado
Dados nacionais entre os anos de 2007 a 2009 mostram que os medicamentos apresentaram
baixo coeficiente de letalidade meacutedio quando comparado aos agrotoacutexicos de uso agriacutecola e as
drogas de abuso (SISTEMA2012) Um estudo realizado por Mota et al (2012) usando dados
secundaacuterios do Sistema Informaccedilatildeo de Mortalidade (SIM)MS entre 1996 a 2005 identificou
4403 oacutebitos relacionados a medicamentos entretanto natildeo foi possiacutevel estabelecer qual a
principal classe de medicamentos nem o princiacutepio ativo envolvido com o agravo
42 Dados Experimentais
Para otimizaccedilatildeo do meacutetodo vaacuterios procedimentos foram realizados seguindo os
paracircmetros analiacuteticos de validaccedilatildeo objetivando detectar a presenccedila de Alprazolam em urina de
paciente com histoacuterico de exposiccedilatildeo toxica a esse faacutermaco A metodologia desenvolvida e
validada mostrou-se em conformidade com as especificaccedilotildees da Resoluccedilatildeo RDC nordm899 de 29 de
maio de 2003 (BRASIL 2003)
Na avaliaccedilatildeo da seletividade nas amostras de urina analisadas natildeo foram detectados
interferentes nas condiccedilotildees de extraccedilatildeo estabelecidas Assim o meacutetodo mostrou-se seletivo jaacute
que as amostras natildeo mostraram nenhum spot(mancha) semelhante aos desenvolvidos pelos
padrotildees No processo de validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos a especificidade ou seletividade eacute o
primeiro passo para o desenvolvimento de um meacutetodo este paracircmetro deve ser avaliado
continuamente para assegurar a precisatildeo e exatidatildeo deste durante sua validaccedilatildeo (SILVA et al
2010) (Tabela 02)
Para os ensaios de recuperaccedilatildeo foi observada a intensidade do spot desenvolvido em cada
amostra para cada niacutevel de fortificaccedilatildeo Nas amostras fortificadas com 200 microg do padratildeo
obtivemos uma recuperaccedilatildeo de 917 enquanto que nas amostras fortificadas com 400 microg do
mesmo o percentual meacutedio obtido foi de 967 demonstrando assim a exatidatildeo do meacutetodo
Segundo a Resoluccedilatildeo RDC nordm 899 de 29 de maio de 2003 a exatidatildeo se daacute pela concordacircncia
entre o resultado de um ensaio e um valor de referecircncia
17
Tabela 02 ndash Avaliaccedilatildeo da seletividade comparando-se spot e Rf (Relative Front) dos padrotildees de
Alprazolam e amostras branco
Sistema-solvente Agente cromogecircnico
Clorofoacutermio-metanol(91v v)
DI
Clorofoacutermio-acetona(41vv)
DI
FaacutermacoAmostras Rf e Cor Rf e Cor
Padratildeo Alprazolam faacutermaco
Padratildeo Alprazolam comprimido
ABal1
ABal2
ABal3
ABal4
ABal5
05 + c
026 + c
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Nota DI = Dragendorff iodado ABal = amostra branco alcalina Rf = fator de retenccedilatildeo c = cor
castanha
O Limite de Detecccedilatildeo e o Limite de Quantificaccedilatildeo para o Alprazolam foram de
100microgmL e 200 microgmL respectivamente Ribani et al (2004) define o Limite de Detecccedilatildeo (LD)
como sendo a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser detectada mas natildeo
necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento experimental O Limite
de Quantificaccedilatildeo (LQ) eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode
ser medida utilizando um determinado procedimento experimental (Figura 01)
O meacutetodo de extraccedilatildeo utilizado particcedilatildeo liacutequido-liacutequido demonstrou-se eficaz pois a
solubilidade do faacutermaco avaliado possui uma elevada afinidade pela mistura de solventes
utilizados nesse procedimento Na separaccedilatildeo do analito da matriz a sonicaccedilatildeo que eacute o processo
que utiliza a energia das ondas sonoras mais comumente a ultrassom se mostrou mais eficaz que
a centrifugaccedilatildeo
O sistema formado pelos solventes clorofoacutermio-metanol (91 vv) obteve o melhor
resultado em relaccedilatildeo ao sistema solvente clorofoacutermio-acetona(41 vv) tendo em vista melhor
resultado na separaccedilatildeo dos padrotildees e amostras
18
Figura 01-Identificaccedilatildeo de Alprazolam em trecircs niacuteveis de fortificaccedilatildeo (n = 3) alta meacutedia e baixa
Dentre os agentes cromogecircnicos utilizados na revelaccedilatildeo apenas o Reativo de Dragendorff
se mostrou eficaz Observou-se atraveacutes do meacutetodo fiacutesico utilizando a Cacircmera de Luz UV que o
Alprazolam faacutermaco e o Alprazolam comprimido natildeo transmite fluorescecircncia no comprimento
de onda de 366nm
Para avaliaccedilatildeo da Robustez as soluccedilotildees-padratildeo (faacutermaco e medicamento) foram
dissolvidas em diversos solventes como apresentado na Tabela 03 O metanol foi o solvente em
que houve revelaccedilatildeo na placa cromatograacutefica tanto do faacutermaco como do medicamento
Tabela 03 - Anaacutelise dos diferentes solventes da soluccedilatildeo estoque padratildeo puro do faacutermaco e do medicamento de
Alprazolam a partir do Rf
NOTA Rf = Relative Front spot= cormancha
Solvente Alprazolam faacutermaco Alprazolam medicamento
Rf Rf
Metanol 05 026
Aacutegua 06 -
ClorofoacutermioAcetona
(41)
056 -
ClorofoacutermioMetanol
(41)
052 -
AMOSTRAS
PADRAtildeO
19
Os testes de robustez satildeo de fundamental importacircncia para que os analistas conheccedilam
quais fatores devem ser estritamente controlados durante a execuccedilatildeo de um meacutetodo Se as
alteraccedilotildees das condiccedilotildees de anaacutelise produzirem resultados dentro dos limites aceitaacuteveis de
seletividade exatidatildeo e precisatildeo o meacutetodo pode ser considerado robusto e tais variaccedilotildees podem
ser incorporadas ao procedimento (CASSIANO et al 2009)
Apesar do meacutetodo ter se mostrado seletivo para o Alprazolam ele natildeo eacute especifico apenas
para esse faacutermaco Sendo assim o meacutetodo foi aplicado em 7 (sete) amostras de pacientes com
histoacuterico de exposiccedilatildeo toacutexica por medicamentos atendidos pelo Centro de Informaccedilatildeo
Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) poreacutem natildeo foi possiacutevel obter a recuperaccedilatildeo dos
faacutermacos Acredita-se que a quantidade ingerida dos medicamentos pelos pacientes foi baixa ou
que pela demora da coleta da amostra os faacutermacos tenham sido metabolizado pelo organismo
Nos ensaios de confirmaccedilatildeo por FTIR observou-se que o Alprazolam padratildeo apresentou as
seguintes vibraccedilotildees moleculares A deformaccedilatildeo angular N-H de amina secundaacuteria eacute observada na
banda em 1660 cm-1
Em 1647 cm-1
aparece uma banda que pode ser atribuiacuteda ao estiramento
C=N da imina e em 1397 cm-1
aparece uma banda atribuiacuteda ao estiramento C-N das aminas A
banda caracteriacutestica do estiramento =C-H de carbono sp2 do anel aromaacutetico se encontra em 3275
cm-1
O espectro do faacutermaco extraiacutedo da matriz bioloacutegica mantecircm as mesmas caracteriacutesticas do
faacutermaco padratildeo Dessa forma podemos afirmar que a moleacutecula natildeo sofreu alteraccedilatildeo durante o
processo de extraccedilatildeo (Figura 02)
Figura 02 - Espectro da analise no FTIR do padratildeo de Alprazolam faacutermaco e de amostra extraiacuteda
20
5 CONCLUSAtildeO
O meacutetodo demonstrou atender aos requisitos de boas praacuteticas exigidos pela Resoluccedilatildeo
RDC 899 de 29 de maio de 2003 sendo exato e sensiacutevel
Dentre as amostras de pacientes intoxicados por medicamentos natildeo se obteve resultados
positivos para o Alprazolam
Os medicamentos constituem como um dos principais meios utilizado para tentativa de
suiciacutedio tendecircncia que eacute observada nos paiacuteses de terceiro mundo entre eles os psicofaacutermacos os
mais utilizados Haacute necessidade de uma melhor formaccedilatildeo e atualizaccedilatildeo dos profissionais assim
como de informaccedilatildeo aos usuaacuterios e medidas de prevenccedilatildeo que poderiam alertar sobre os riscos e
monitorar o uso desses medicamentos
O Brasil em agosto de 2006 deu o primeiro passo lanccedilando a Portaria nordm 1876 com as
diretrizes nacionais para Prevenccedilatildeo do Suiciacutedio nas trecircs esferas da gestatildeo Portanto estudar e
prevenir as tentativas de suiciacutedio eacute um desafio pois envolve recursos financeiros e sensibilidade
da parte dos profissionais envolvidos
Por outro lado aleacutem do conhecimento dos dados epidemioloacutegicos eacute necessaacuteria a
identificaccedilatildeo dos grupos terapecircuticos responsaacuteveis pelas intoxicaccedilotildees As teacutecnicas
cromatograacuteficas e espectrofotomeacutetricas possuem uma extensa aplicabilidade em pesquisas
cientiacuteficas anaacutelise quiacutemica teste de controle de qualidade de medicamentos entre outros Isso se
daacute por serem teacutecnicas altamente sensiacuteveis de alta resoluccedilatildeo e por ser um meacutetodo mais raacutepido e
preciso Ao analisar traccedilos de compostos em amostras complexas como sangue e urina as
anaacutelises toxicoloacutegicas auxiliam no prognoacutestico e diagnoacutestico de intoxicaccedilotildees uma vez que eacute
possiacutevel identificaccedilatildeo destes compostos em amostras bioloacutegicas
O meacutetodo por CCDC tem caraacuteter semindashquantitativo jaacute que a quantificaccedilatildeo dos faacutermacos eacute
baseada apenas na comparaccedilatildeo visual dos ldquoSpotsrdquo das amostras e dos padrotildees Embora o meacutetodo
seja adequado para triagem os resultados mostram que a quantificaccedilatildeo de faacutermacos por meacutetodos
baseados no uso de CCDC deve possuir uma interpretaccedilatildeo bem cautelosa especialmente devido agrave
incerteza associada a este tipo de comparaccedilatildeo
Se faz necessaacuterio a confirmaccedilatildeo da identidade do faacutermaco por outras teacutecnicas eou outros
meacutetodos de anaacutelise como a Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia (CLAE) e Cromatografia
21
Gasosa (CG) sendo assim possiacutevel correlacionar os perfis cromatograacuteficos entre as diferentes
teacutecnicas
ABSTRACT
The medicines are presented as the main toxic agent responsible for cases of human poisoning
thus constituting a major challenge for those working with Public Health However the absence
of a specialized toxicological analysis hinders a more accurate diagnosis of cases The
spectrophotometric and chromatographic techniques may assist in confirming the diagnosis A
Comparative Thin Layer Chromatography (CCDC) is a separation technique simple low cost and
good sensitivity The identification of the drug can be achieved both quantitatively and
qualitatively by infrared spectroscopy Fourier transform (FTIR) This research proposal was to
evaluate two techniques for identification of Alprazolam in urine of patients with toxic exposure
to drugs assessing the selectivity accuracy limit of detection limit of quantification and
robustness in chromatographic techniques The method was optimized validated and applied in
accordance with Resolution RDC Nordm 899 of May 29 2003 The chromatographic assay used
plates of Silica Gel G-60 elution with chloroform-methanol 91 (v v) and as a chromogenic
agent the Reactive Dragendorff The presence of the drug was confirmed by the FTIR analysis
The method proved to be selective chromatographic conditions established by presenting Limit
Detection and Quantification 200μgml and 100μgml respectively Among the patient samples
drug poisoning no positive results obtained for Alprazolam The FTIR analysis showed that the
drug did not undergo degradation in the extraction process The method has proven to meet the
requirements of good practice required by RDC Nordm 899 of 29 May 2003 being sensitive and
accurate
KEYWORDS Alprazolam Spectroscopy Chromatography Intoxication
REFEREcircNCIAS
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27
ANEXO A
28
4
O fato dos medicamentos serem apontados como a principal causa das intoxicaccedilotildees no
Brasil nas uacuteltimas deacutecadas aumenta o desafio dos laboratoacuterios de anaacutelises toxicoloacutegicas a
desenvolverem metodologias analiacuteticas para a pronta pesquisa e identificaccedilatildeo de faacutermacos
envolvidos nos casos de intoxicaccedilatildeo aguda (AMEacuteRICO MOSSIN NISHIYAMA 2008)
Afirma Karp (2005) que a cromatografia por se tratar de um meacutetodo fiacutesico-quiacutemico pode
ser utilizada para analisar identificar ou separar os componentes de uma mistura em amostras
bioloacutegicas A separaccedilatildeo de dois ou mais compostos estaacute fundamentada na distribuiccedilatildeo
diferencial dos componentes entre duas fases uma estacionaacuteria e outra moacutevel imisciacutevel
A Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC) pode ser utilizada no
diagnoacutestico de exposiccedilotildees toacutexicas por medicamentos por apresentar procedimentos analiacuteticos
raacutepidos de faacutecil execuccedilatildeo abrangentes de baixo custo auxiliando na identificaccedilatildeo de
psicofaacutermacos como o Alprazolam (TRUJILLO et al 2007 AMEacuteRICO MOSSIN
NISHIYAMA 2008)
A Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier - FTIR pode ser usada
para identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo de compostos orgacircnicos inorgacircnicos e polimeacutericos
Basicamente o que se mede nesta anaacutelise eacute a fraccedilatildeo da energia transmitida ou absorvida em
relaccedilatildeo agrave incidente em determinado comprimento de onda ou nuacutemero de onda
Ateacute recentemente a espectroscopia na regiatildeo do infravermelho era pouco utilizada em
anaacutelises quantitativas em decorrecircncia de algumas limitaccedilotildees inerentes agrave teacutecnica Poreacutem com a
utilizaccedilatildeo da transformada de Fourier aliada agrave evoluccedilatildeo de teacutecnicas quimiomeacutetricas ao advento
dos microprocessadores digitais e de teacutecnicas computacionais avanccediladas permitiu-se a anaacutelise de
misturas complexas como os medicamentos (SOUZA et al 2004) A identificaccedilatildeo destas
substacircncias pode ser alcanccedilada tanto quantitativamente como qualitativamente atraveacutes da
espectroscopia por refletacircncia difusa no infravermelho com transformada de Fourier Diffuse
Reflectance Infrared Fourier Transform Spectroscopy - DRIFTS (YANG IRUDAYARAJ
2002)
Entretanto para garantia da seguranccedila dos resultados de doseamento os meacutetodos para a
determinaccedilatildeo quantitativa ou semi-quantitativa de faacutermacos devem ser validados para que se
tornem uacuteteis e confiaacuteveis e possam ser utilizados na rotina laboratorial (ROCA et al 2007
MOJSIEWICZ-PIEŃKOWSKA 2011)
5
A validaccedilatildeo consiste no ato de tornar legiacutetimo ou legal um meacutetodo equipamento sistema
ou metodologia atraveacutes do estabelecimento de documentaccedilotildees visando diminuir ou controlar os
fatores que levam agrave imprecisatildeo ou inexatidatildeo para garantir a confiabilidade e rastreabilidade dos
dados gerados Para validar um meacutetodo eacute essencial que sejam incluiacutedos pelo menos os seguintes
paracircmetros exatidatildeo precisatildeo fidelidade linearidade limite de detecccedilatildeo e limite de
quantificaccedilatildeo sensibilidade especificidade recuperaccedilatildeo robustez estabilidade e intervalo de
aplicaccedilatildeo (RIBANI et al 2004 LANCcedilAS 2004 VALENTINI SOMMER MATIOLI 2007)
A otimizaccedilatildeo das metodologias analiacuteticas possibilita a aplicaccedilatildeo de teacutecnicas
cromatograacuteficas e espectrofotomeacutetricas em amostras bioloacutegicas na rotina de um laboratoacuterio de
emergecircncia toxicoloacutegica e nos serviccedilos puacuteblicos de sauacutede auxiliando na confirmaccedilatildeo do
diagnoacutestico e no prognoacutestico dos pacientes com histoacuterico de exposiccedilatildeo toacutexica por medicamentos
Assim esta pesquisa teve como objetivo realizar ensaios cromatograacuteficos avaliando a
seletividade exatidatildeo limite de detecccedilatildeo limite de quantificaccedilatildeo e robustez para pesquisa de
Alprazolam em amostras bioloacutegicas de pacientes com diagnoacutestico de exposiccedilatildeo toacutexica a
medicamentos A confirmaccedilatildeo dos resultados foi realizada atraveacutes da Espectroscopia
Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR)
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
No Brasil e outros paiacuteses como Alemanha Canadaacute e Inglaterra os medicamentos vecircm
preocupando as autoridades e os profissionais de sauacutede pois se apresentam como o principal
agente toacutexico responsaacutevel pelos casos de intoxicaccedilotildees humanas constituindo portanto um
grande desafio para os que trabalham com a Sauacutede Puacuteblica (FALCAtildeO 2004 SISTEMA
2012)
Vaacuterios episoacutedios histoacutericos marcaram acidentes com medicamentos em 1937 mais de 100
crianccedilas morreram nos Estados Unidos pelo uso de um elixir sulfanilamida que continha como
veiacuteculo o dietilenoglicol Em 1938 como consequecircncia deste evento foi aprovada nos Estados
Unidos a lei que criou a ldquoFood and Drug Administrationrdquo (FDA) obrigando as induacutestrias
farmacecircuticas a fornecer informaccedilotildees a esta instituiccedilatildeo dados cliacutenicos sobre novos
6
medicamentos Um dos acidentes marcantes relacionado ao uso de medicamentos aconteceu na
Alemanha Oriental em 1961 pelo uso da Talidomida um hipnoacutetico natildeo barbituacuterico prescrito na
eacutepoca para tratar naacuteuseas e vocircmitos em mulheres graacutevidas aproximadamente 12000 crianccedilas
nasceram com focomelia (termo Grego que significa membro de focas e caracteriza um processo
de deformidade dos membros) Atraveacutes de estudos epidemioloacutegicos foi comprovado o efeito
teratogecircnico da Talidomida e como consequecircncia entre 1961 a 1962 foi retirada do mercado em
quase todo o mundo
Um marco na histoacuteria da organizaccedilatildeo da Assistecircncia Farmacecircutica no Brasil foi a
aprovaccedilatildeo da Poliacutetica Nacional de Medicamentos em 30 de outubro de 1998 pela Portaria nordm
3916 Esta Portaria contempla diretrizes como Adoccedilatildeo de Relaccedilatildeo de Medicamentos Essenciais
(Rename) Regulamentaccedilatildeo Sanitaacuteria de Medicamentos Reorientaccedilatildeo da Assistecircncia
Farmacecircutica Promoccedilatildeo do Uso Racional de Medicamentos Desenvolvimento Cientiacutefico e
Tecnoloacutegico Promoccedilatildeo da Produccedilatildeo de Medicamentos Garantia da Seguranccedila Eficaacutecia e
Qualidade dos Medicamentos e Desenvolvimento e Capacitaccedilatildeo de Recursos Humanos aleacutem de
definir prioridades relacionadas agrave legislaccedilatildeo incluindo Revisatildeo da Rename Assistecircncia
Farmacecircutica Promoccedilatildeo do Uso Racional de Medicamentos e a Organizaccedilatildeo das Atividades de
Vigilacircncia Sanitaacuteria de Medicamentos (BRASIL 2006)
Uma significativa parcela dos medicamentos prescritos no Brasil eacute da classe dos
psicofaacutermacos Estima-se que pelo menos 13 do total de faacutermacos consumidos no nosso paiacutes
envolva Benzodiazepiacutenicos Antidepressivos e Neuroleacutepticos Anticonvulsivantes ou estimulantes
do Sistema Nervoso Central (SNC) (LUCHETTI et al 2010)
Rodrigues et al (2006) afirmam que esse percentual estaacute relacionado ao aumento da
frequecircncia de diagnoacutesticos de transtornos psiquiaacutetricos na populaccedilatildeo agrave introduccedilatildeo de novos
psicofaacutermacos no mercado farmacecircutico e agraves novas indicaccedilotildees terapecircuticas de psicofaacutermacos jaacute
existentes
Os benzodiazepiacutenicos estatildeo entre as drogas mais prescritas no mundo Satildeo utilizados
principalmente como ansioliacuteticos e hipnoacuteticos aleacutem de possuir accedilatildeo miorrelaxante e
anticonvulsivante (AUCHEWSKI et al 2004)
Apoacutes sua comercializaccedilatildeo no iniacutecio dos anos 60 os Benzodiazepiacutenicos (BZD)
substituiacuteram praticamente todas as drogas utilizadas no tratamento da ansiedade - Barbituacutericos
Meprobamato Hidrato de Cloral e outros que provocavam seacuterios efeitos colaterais Isso ocorreu
7
em virtude do maior iacutendice terapecircutico dessas substacircncias menor potencialidade de provocar
acidentes fatais e menor tendecircncia para produzir siacutendromes de abstinecircncia e toleracircncia
farmacoloacutegica (FORSAN 2010)
Embora sejam drogas relativamente seguras restriccedilotildees agrave sua utilizaccedilatildeo tecircm sido cada vez
maiores devido agrave incidecircncia dos efeitos colaterais relacionados agrave depressatildeo do sistema nervoso
central Dentre eles os principais satildeo a diminuiccedilatildeo da atividade psicomotora o prejuiacutezo na
memoacuteria a desinibiccedilatildeo paradoxal e a potencializaccedilatildeo do efeito depressor pela interaccedilatildeo com
outras drogas depressoras principalmente o aacutelcool Aleacutem disso a depressatildeo e a distimia (tipo de
depressatildeo crocircnica) podem ocorrer consequumlentemente ao uso de alprazolam e clonazepam
(LACERDA et al 2004)
Esta classe de faacutermacos constitui a primeira causa de exposiccedilotildees toacutexicas dentre os outros
grupos de medicamentos em nosso meio No entanto as intoxicaccedilotildees por essa classe
farmacoloacutegica excepcionalmente tecircm evoluccedilatildeo letal Exercem accedilatildeo sobre o sistema nervoso
central atraveacutes da ligaccedilatildeo aos receptores benzodiazepiacutenicos no complexo do receptor dos canais
de cloro do Aacutecido Gama-Aminobutiacuterico (GABA) As principais manifestaccedilotildees das intoxicaccedilotildees
por benzodiazepiacutenicos satildeo a depressatildeo neuroloacutegica da resposta ventilatoacuteria ao CO2 e diminuiccedilatildeo
da frequecircncia respiratoacuteria (OLIVEIRA et al 2010)
O diagnoacutestico das intoxicaccedilotildees pode ser realizado atraveacutes da histoacuteria do paciente
(anamnese) dos sinais cliacutenicos e laboratoriais
8
A Cromatografia em Camada Delgada (CCD) eacute uma teacutecnica de adsorccedilatildeo do tipo soacutelido-
liacutequida Nesse caso a separaccedilatildeo se daacute pela diferenccedila de afinidade dos componentes de uma
mistura pela fase estacionaacuteria (DEGANI CASS VIEIRA 1998) A fase estacionaacuteria
corresponde a uma camada fina formada por um soacutelido granulado geralmente siacutelica depositado
sobre uma placa de vidro alumiacutenio ou outro suporte inerte Este meacutetodo merece atenccedilatildeo especial
pela sua versatilidade rapidez sensibilidade e nitidez das separaccedilotildees (EIZENDEHER 2005)
A Espectroscopia Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) pode ser usada para
identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo de compostos orgacircnicos inorgacircnicos e polimeacutericos Basicamente o
que se mede nesta anaacutelise eacute a fraccedilatildeo da energia transmitida ou absorvida em relaccedilatildeo agrave incidente
em determinado comprimento de onda ou nuacutemero de onda (EVORA et al 2002)
A espectrometria FTIR permite a determinaccedilatildeo automatizada dos paracircmetros de maior
importacircncia na caracterizaccedilatildeo de amostras Hoje os instrumentos de FTIR satildeo informatizados o
que os torna mais raacutepidos e mais sensiacuteveis do que os instrumentos mais antigos dispersivos Ele
pode ser aplicado agrave anaacutelise de soacutelidos liacutequidos e gases Trata-se de uma metodologia que origina
rapidamente uma informaccedilatildeo sumaacuteria de 30 segundos por amostra eacute uma teacutecnica natildeo poluente jaacute
que natildeo utiliza reagentes aleacutem de natildeo necessitar de pessoal especializado para ser operada em
rotina (MOREIRA MARCOS BARROS 2002)
Para garantir que um novo meacutetodo analiacutetico gere informaccedilotildees confiaacuteveis e interpretaacuteveis
sobre a amostra ele deve passar por um processo de validaccedilatildeo A validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos
eacute o processo pelo qual eacute estabelecido por estudos de laboratoacuterio que as caracteriacutesticas
executadas do meacutetodo satisfazem aos requisitos para as aplicaccedilotildees analiacuteticas praticadas (RIBANI
et al2004 VALENTINI SOMMER MATIOLI 2007)
3 REFERENCIAL METODOLOacuteGICO
31 Dados epidemioloacutegicos
9
311 Delineamento do estudo e instrumento de coleta de dados
Tratou-se de uma pesquisa prospectiva descritiva e analiacutetica Os dados epidemioloacutegicos
foram coletados dos pacientes admitidos com histoacuteria de exposiccedilatildeo e ou intoxicaccedilatildeo por
medicamentos no Hospital de Emergecircncia e Trauma de Campina Grande atendidos e notificados
pelo Centro de Informaccedilatildeo Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) nos meses de agosto
e setembro de 2012 Utilizou-se a ficha do Sistema Nacional de Agravos de Notificaccedilatildeo
(Sinan)MS para a coleta dos dados epidemioloacutegicos desses pacientes (Anexo A)
312 Variaacuteveis demograacuteficas e socioeconocircmicas
Gecircnero
Faixa Etaacuteria
Ocupaccedilatildeo
313 Variaacuteveis relativas ao evento
Circunstacircncia
314 Variaacutevel relativa ao Agente Toacutexico
Os grupos de medicamentos foram classificados em categorias terapecircuticas segundo o
Anatomical-Therapeutical-ChemicalClassification System (ATC)
Os medicamentos pertencentes ao nono niacutevel dessa classificaccedilatildeo satildeo classificados como
os medicamentos que atuam no sistema nervoso central representado pela letra N Neste niacutevel
estatildeo incluiacutedos os psicodisleacutepticos ansioliacuteticos (NO5B) antipsicoacuteticos (NO5A) hipnoacutetico-
sedativos (NO5C) e os psicoanaleacutepticos antidepressivos (NO6A) e
estimulantespsicoestimulantes (NO6B)
315 Variaacuteveis relativas agrave intoxicaccedilatildeo
Avaliar os sinais e sintomas
Classificar os casos quanto agrave gravidade
10
Quanto ao item gravidade adotamos o seguinte criteacuterio com base no trabalho de King e
Palmisano 1989
Grave o paciente que permanece internado apoacutes procedimentos do tipo lavagem gaacutestrica
ou observaccedilatildeo meacutedica
Moderada ocorre algum procedimento do tipo lavagem gaacutestrica ou observaccedilatildeo meacutedica
mas sem internaccedilatildeo
Leve a famiacutelia recebe somente orientaccedilatildeo ou acompanhamento por telefone e nenhum
procedimento
Ignorada natildeo eacute possiacutevel classificar a extensatildeo do dano
Evoluccedilatildeo
Alta meacutedica (Cura)
Transferecircncia para outra unidade hospitalar
Ignorado
Oacutebito
32 DADOS EXPERIMENTAIS
321 Ensaios de Desenvolvimento e Validaccedilatildeo da Metodologia
Local da Pesquisa Laboratoacuterio de Desenvolvimento e Certificaccedilatildeo de Biomaterias do
Nordeste unidades da UEPB e UFCG
Materiais
Solventes reagentes e outros aparatos
-Alprazolam (faacutermaco) doaccedilatildeo feita pelo Nuacutecleo de odontologia e medicina Legal - NUMOL
-Medicamento (Medley) Alprazolam
-Acetona Vetec
11
-Clorofoacutermio Vetec
-Sulfato de Soacutedio Anidro Vetec
-Metanol (HPLC) Paneac
-Placas de Siacutelica Gel ALUGRAM SIL G 60F de (20x20) cm
2 foram adquiridas da Macherey-
Nagel (REF 818033)
-Cubas Cromatograacuteficas
-Papel de filtro Qualy
Equipamentos
-Estufa Med Clav
-Banho de Ultra-Som ULTRAsonic 1440A
-Centrifuga DCS-16 RV
-Cacircmera de Luz UV (λ=264nm)
-Espectrocircmetro FTIR SPECTRUM 400 Perkin-Elmer (4000 a 600 cm-1 para anaacutelise das
caracteriacutesticas do grupos funcionais dos faacutermacos)
322 Preparaccedilatildeo dos padrotildees
As soluccedilotildees estoque do faacutermaco foram preparadas pela dissoluccedilatildeo de cada composto em
metanol para obter a concentraccedilatildeo de 400 microg mL
323 Preparaccedilatildeo das Amostras
Procedimento de Extraccedilatildeo Extraccedilatildeo Liacutequido-Liacutequido (ELL)
Na fase de desenvolvimento do meacutetodo um importante passo foi a retirada dos
interferentes das amostras Para isto foram realizados vaacuterios procedimentos de Clean-up usando
ELL Para a ELL foi usado o meacutetodo de Stas-Otto que considera o caraacuteter aacutecidobase de cada
substacircncia do meio em que essa se encontra o seu grau de ionizaccedilatildeo como fatores influentes em
sua solubilidade em solventes orgacircnicos pois a partir de mistura desses em proporccedilotildees
adequadas pode-se submeter agraves amostras agrave ELL (FIGURA 01)
Terminada a extraccedilatildeo por sonicaccedilatildeo ou centrifugaccedilatildeo a fase orgacircnica foi recolhida
evaporada e ressuspendida para anaacutelise cromatograacutefica e espectrofotomeacutetrica
12
324 Teacutecnicas
Anaacutelise por CCD
A anaacutelise por CCD foi baseada na metodologia claacutessica descrita por Moraes (1991) com
adaptaccedilatildeo
Os resiacuteduos obtidos por ELL foram ressuspendidos em MetanolAacutegua (91) e aplicados
nas placas cromatograacuteficas previamente ativadas em estufas a 105ordmC por 30 minutos Aplicaram-
se nas placas aliacutequotas de 20 microL dos extratos obtidos por ELL Foi utilizado o sistema solvente
constituiacutedo de mistura de clorofoacutermio-metanol (91) e clorofoacutermio-acetona (41)
Os cromatogramas foram revelados usando meacutetodos quiacutemicos (agentes cromogecircnicos
Reativo de Dragendorff Difenilcarbazona Nitrato de Prata 1 e Cloreto Feacuterrico 5) e meacutetodo
fiacutesico (Cacircmera de Luz UV (λ=264nm)
Figura 01 - Esquema de extraccedilatildeo amostras
FONTE MORAES 1991
325 Estudo de seletividade e recuperaccedilatildeo
Seletividade
A seletividade do meacutetodo foi avaliada atraveacutes da extraccedilatildeo de 6 amostras diferentes de
urinas (n=6) por LLE e depois analisadas por CCDC
25 ml
13
Recuperaccedilatildeo
A extraccedilatildeo para avaliar a recuperaccedilatildeo foi realizada pela anaacutelise de amostras em
triplicatas contaminadas (fortificadas) em trecircs concentraccedilotildees do padratildeo de Alprazolam (baixa=
100microgml meacutedia=200 microgml e alta= 400 microgml)
326 O Limite de Detecccedilatildeo (LD) e o Limite de Quantificaccedilatildeo (LQ)
O Limite de Detecccedilatildeo eacute a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser
detectada mas natildeo necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento
experimental O Limite de Quantificaccedilatildeo eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia
em exame que pode ser medida utilizando um determinado procedimento experimental
O LD foi determinado por anaacutelise de urina contaminada em concentraccedilotildees decrescentes
de faacutermaco e medicamento ateacute a concentraccedilatildeo possiacutevel de se detectar a presenccedila de ambos O LQ
foi determinado por analise de urina contaminada em concentraccedilotildees decrescentes de faacutermaco e
medicamento ateacute a concentraccedilatildeo possiacutevel de se quantificar a presenccedila de ambos
327 Robustez
Na avaliaccedilatildeo da robustez foram utilizados como solventes o metanol a aacutegua uma soluccedilatildeo
de clorofoacutermio- acetona (41) e uma soluccedilatildeo de clorofoacutermio-metanol (91) para preparaccedilatildeo dos
padrotildees de Alprazolam
328 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier - FTIR
Foram feitas anaacutelises de soluccedilotildees metanoacutelicas ( 10 mgmL n=3) do faacutermaco padratildeo e suas
extraccedilotildees utilizando a faixa de varredura de 4000 a 500 cm-1
em temperatura ambiente
4 DADOS E ANAacuteLISE DA PESQUISA
41 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
No periacuteodo de agosto a setembro de 2012 o Ceatox-CG registrou 28 casos com histoacuteria
de intoxicaccedilatildeo por medicamentos Destes 18 casos foram classificados como
14
neuropsicofaacutermacos Na anaacutelise dos casos do uso isolado de medicamentos os Antiepileacutepticos
assim como os Ansioliticos foram os responsaacuteveis pelo maior nuacutemero de ocorrecircncias com um
percentual de 22 (n=4) cada um Um estudo realizado com crianccedilas no estado de Mato Grosso
do Sul verificou que os anticonvulsivantes foram os principais responsaacuteveis pelos eventos toacutexicos
por medicamentos que agem no SNC (MATOS et al 2008)
Ao analisarmos as associaccedilotildees de medicamentos (n=7-39) nos chama a atenccedilatildeo o
nuacutemero de ocorrecircncias por tentativa de suiciacutedio (n=10-557) Bernades Turini e Matsuo
(2010) afirmam que pacientes que tentam suiciacutedio em sua grande maioria fazem uso de mais de
um tipo de substacircncia quiacutemica ndash medicamentosa ou natildeo ndash quando o meacutetodo eacute a intoxicaccedilatildeo
voluntaacuteria
Os eventos toxicoloacutegicos foram mais comuns em mulheres (556) por tentativa de
suiciacutedio (557) e entre adultos e jovens (389) (Tabela 01) Um estudo realizado entre os anos
de 1997 e 2007 no Centro de Controle de Intoxicaccedilatildeo (CCI) em Londrina Paranaacute analisando as
tentativas de suiciacutedio por sobredose intencional de medicamentos com relaccedilatildeo ao gecircnero condiz
com dados aqui obtidos (BERNADES TURINI MATZUO 2010) Por outro lado Gandolfi e
Andrade (2006) mostra o ldquoacidente individualrdquo como principal fator responsaacutevel pelas exposiccedilotildees
toacutexicas a medicamentos em Satildeo Paulo seguido pela tentativa de suiciacutedio
Graacutefico 01 - Grupos farmacoloacutegicos de acordo com a classificaccedilatildeo da ATC responsaacuteveis pelas
intoxicaccedilotildees registradas no Ceatox-CG entre agosto a setembro de 2012 (N= 18)
2239
1722
Associaccedilotildees
N05A
N03A
N05B
NOTA N05A Antipsicoacuteticos N03A Antiepileacuteptico NO5B Ansioliacuteticos e associaccedilatildeo
15
Acerca da ocupaccedilatildeo dos pacientes os estudantes foram os mais frequentes (n=6-333)
Este dado entra em desacordo com a mesma variaacutevel analisada no estudo de Turini et al (2010)
em que mostra que a ocupaccedilatildeo mais relevante nos seu estudo eacute a de empregado (Tabela 01)
Observando-se os sinais e sintomas das intoxicaccedilotildees as Siacutendromes Toacutexicas por
Superdosagem de Sedativos (pupilas mioacuteticas tremor hipotensatildeo confusatildeo mental e sonolecircncia)
e a Extrapiramidal (choro monoacutetono opistoacutetomo e distonia) foram predominantes O quadro
toacutexico se desenvolve dependendo da dose do subgrupo terapecircutico e do tempo entre a exposiccedilatildeo
e o atendimento Os ansioliacuteticos principalmente os Benzodiazepiacutenicos (BZD) satildeo compostos
que apresentam maior iacutendice terapecircutico e menor potencialidade de provocar acidentes fatais e
menor tendecircncia para produzir toleracircncia farmacoloacutegica (FORSAN 2010)
Tabela 01 ndash Frequecircncia do tipo de circunstacircncia da faixa etaacuteria do gecircnero e da ocupaccedilatildeo dos pacientes intoxicados
atendidos no Ceatox-CG
Variaacutevel
N
Circunstacircncia (N=18)
Tentativa de Suiciacutedio 10 557
Acidental 1 57
Outra 7 389
Faixa Etaacuteria (anos) (N=18)
1---9 3 166
10---19 5 278
20---39 7 389
gt 40 3 167
Gecircnero (N=18)
Masculino 8 444
Feminino 10 556
Ocupaccedilatildeo (N=18)
Estudante 6 333
Do lar 4 222
Outra 8 444
16
Em relaccedilatildeo agrave variaacutevel evoluccedilatildeo natildeo se registrou nenhum oacutebito no periacuteodo estudado
Dados nacionais entre os anos de 2007 a 2009 mostram que os medicamentos apresentaram
baixo coeficiente de letalidade meacutedio quando comparado aos agrotoacutexicos de uso agriacutecola e as
drogas de abuso (SISTEMA2012) Um estudo realizado por Mota et al (2012) usando dados
secundaacuterios do Sistema Informaccedilatildeo de Mortalidade (SIM)MS entre 1996 a 2005 identificou
4403 oacutebitos relacionados a medicamentos entretanto natildeo foi possiacutevel estabelecer qual a
principal classe de medicamentos nem o princiacutepio ativo envolvido com o agravo
42 Dados Experimentais
Para otimizaccedilatildeo do meacutetodo vaacuterios procedimentos foram realizados seguindo os
paracircmetros analiacuteticos de validaccedilatildeo objetivando detectar a presenccedila de Alprazolam em urina de
paciente com histoacuterico de exposiccedilatildeo toxica a esse faacutermaco A metodologia desenvolvida e
validada mostrou-se em conformidade com as especificaccedilotildees da Resoluccedilatildeo RDC nordm899 de 29 de
maio de 2003 (BRASIL 2003)
Na avaliaccedilatildeo da seletividade nas amostras de urina analisadas natildeo foram detectados
interferentes nas condiccedilotildees de extraccedilatildeo estabelecidas Assim o meacutetodo mostrou-se seletivo jaacute
que as amostras natildeo mostraram nenhum spot(mancha) semelhante aos desenvolvidos pelos
padrotildees No processo de validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos a especificidade ou seletividade eacute o
primeiro passo para o desenvolvimento de um meacutetodo este paracircmetro deve ser avaliado
continuamente para assegurar a precisatildeo e exatidatildeo deste durante sua validaccedilatildeo (SILVA et al
2010) (Tabela 02)
Para os ensaios de recuperaccedilatildeo foi observada a intensidade do spot desenvolvido em cada
amostra para cada niacutevel de fortificaccedilatildeo Nas amostras fortificadas com 200 microg do padratildeo
obtivemos uma recuperaccedilatildeo de 917 enquanto que nas amostras fortificadas com 400 microg do
mesmo o percentual meacutedio obtido foi de 967 demonstrando assim a exatidatildeo do meacutetodo
Segundo a Resoluccedilatildeo RDC nordm 899 de 29 de maio de 2003 a exatidatildeo se daacute pela concordacircncia
entre o resultado de um ensaio e um valor de referecircncia
17
Tabela 02 ndash Avaliaccedilatildeo da seletividade comparando-se spot e Rf (Relative Front) dos padrotildees de
Alprazolam e amostras branco
Sistema-solvente Agente cromogecircnico
Clorofoacutermio-metanol(91v v)
DI
Clorofoacutermio-acetona(41vv)
DI
FaacutermacoAmostras Rf e Cor Rf e Cor
Padratildeo Alprazolam faacutermaco
Padratildeo Alprazolam comprimido
ABal1
ABal2
ABal3
ABal4
ABal5
05 + c
026 + c
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Nota DI = Dragendorff iodado ABal = amostra branco alcalina Rf = fator de retenccedilatildeo c = cor
castanha
O Limite de Detecccedilatildeo e o Limite de Quantificaccedilatildeo para o Alprazolam foram de
100microgmL e 200 microgmL respectivamente Ribani et al (2004) define o Limite de Detecccedilatildeo (LD)
como sendo a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser detectada mas natildeo
necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento experimental O Limite
de Quantificaccedilatildeo (LQ) eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode
ser medida utilizando um determinado procedimento experimental (Figura 01)
O meacutetodo de extraccedilatildeo utilizado particcedilatildeo liacutequido-liacutequido demonstrou-se eficaz pois a
solubilidade do faacutermaco avaliado possui uma elevada afinidade pela mistura de solventes
utilizados nesse procedimento Na separaccedilatildeo do analito da matriz a sonicaccedilatildeo que eacute o processo
que utiliza a energia das ondas sonoras mais comumente a ultrassom se mostrou mais eficaz que
a centrifugaccedilatildeo
O sistema formado pelos solventes clorofoacutermio-metanol (91 vv) obteve o melhor
resultado em relaccedilatildeo ao sistema solvente clorofoacutermio-acetona(41 vv) tendo em vista melhor
resultado na separaccedilatildeo dos padrotildees e amostras
18
Figura 01-Identificaccedilatildeo de Alprazolam em trecircs niacuteveis de fortificaccedilatildeo (n = 3) alta meacutedia e baixa
Dentre os agentes cromogecircnicos utilizados na revelaccedilatildeo apenas o Reativo de Dragendorff
se mostrou eficaz Observou-se atraveacutes do meacutetodo fiacutesico utilizando a Cacircmera de Luz UV que o
Alprazolam faacutermaco e o Alprazolam comprimido natildeo transmite fluorescecircncia no comprimento
de onda de 366nm
Para avaliaccedilatildeo da Robustez as soluccedilotildees-padratildeo (faacutermaco e medicamento) foram
dissolvidas em diversos solventes como apresentado na Tabela 03 O metanol foi o solvente em
que houve revelaccedilatildeo na placa cromatograacutefica tanto do faacutermaco como do medicamento
Tabela 03 - Anaacutelise dos diferentes solventes da soluccedilatildeo estoque padratildeo puro do faacutermaco e do medicamento de
Alprazolam a partir do Rf
NOTA Rf = Relative Front spot= cormancha
Solvente Alprazolam faacutermaco Alprazolam medicamento
Rf Rf
Metanol 05 026
Aacutegua 06 -
ClorofoacutermioAcetona
(41)
056 -
ClorofoacutermioMetanol
(41)
052 -
AMOSTRAS
PADRAtildeO
19
Os testes de robustez satildeo de fundamental importacircncia para que os analistas conheccedilam
quais fatores devem ser estritamente controlados durante a execuccedilatildeo de um meacutetodo Se as
alteraccedilotildees das condiccedilotildees de anaacutelise produzirem resultados dentro dos limites aceitaacuteveis de
seletividade exatidatildeo e precisatildeo o meacutetodo pode ser considerado robusto e tais variaccedilotildees podem
ser incorporadas ao procedimento (CASSIANO et al 2009)
Apesar do meacutetodo ter se mostrado seletivo para o Alprazolam ele natildeo eacute especifico apenas
para esse faacutermaco Sendo assim o meacutetodo foi aplicado em 7 (sete) amostras de pacientes com
histoacuterico de exposiccedilatildeo toacutexica por medicamentos atendidos pelo Centro de Informaccedilatildeo
Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) poreacutem natildeo foi possiacutevel obter a recuperaccedilatildeo dos
faacutermacos Acredita-se que a quantidade ingerida dos medicamentos pelos pacientes foi baixa ou
que pela demora da coleta da amostra os faacutermacos tenham sido metabolizado pelo organismo
Nos ensaios de confirmaccedilatildeo por FTIR observou-se que o Alprazolam padratildeo apresentou as
seguintes vibraccedilotildees moleculares A deformaccedilatildeo angular N-H de amina secundaacuteria eacute observada na
banda em 1660 cm-1
Em 1647 cm-1
aparece uma banda que pode ser atribuiacuteda ao estiramento
C=N da imina e em 1397 cm-1
aparece uma banda atribuiacuteda ao estiramento C-N das aminas A
banda caracteriacutestica do estiramento =C-H de carbono sp2 do anel aromaacutetico se encontra em 3275
cm-1
O espectro do faacutermaco extraiacutedo da matriz bioloacutegica mantecircm as mesmas caracteriacutesticas do
faacutermaco padratildeo Dessa forma podemos afirmar que a moleacutecula natildeo sofreu alteraccedilatildeo durante o
processo de extraccedilatildeo (Figura 02)
Figura 02 - Espectro da analise no FTIR do padratildeo de Alprazolam faacutermaco e de amostra extraiacuteda
20
5 CONCLUSAtildeO
O meacutetodo demonstrou atender aos requisitos de boas praacuteticas exigidos pela Resoluccedilatildeo
RDC 899 de 29 de maio de 2003 sendo exato e sensiacutevel
Dentre as amostras de pacientes intoxicados por medicamentos natildeo se obteve resultados
positivos para o Alprazolam
Os medicamentos constituem como um dos principais meios utilizado para tentativa de
suiciacutedio tendecircncia que eacute observada nos paiacuteses de terceiro mundo entre eles os psicofaacutermacos os
mais utilizados Haacute necessidade de uma melhor formaccedilatildeo e atualizaccedilatildeo dos profissionais assim
como de informaccedilatildeo aos usuaacuterios e medidas de prevenccedilatildeo que poderiam alertar sobre os riscos e
monitorar o uso desses medicamentos
O Brasil em agosto de 2006 deu o primeiro passo lanccedilando a Portaria nordm 1876 com as
diretrizes nacionais para Prevenccedilatildeo do Suiciacutedio nas trecircs esferas da gestatildeo Portanto estudar e
prevenir as tentativas de suiciacutedio eacute um desafio pois envolve recursos financeiros e sensibilidade
da parte dos profissionais envolvidos
Por outro lado aleacutem do conhecimento dos dados epidemioloacutegicos eacute necessaacuteria a
identificaccedilatildeo dos grupos terapecircuticos responsaacuteveis pelas intoxicaccedilotildees As teacutecnicas
cromatograacuteficas e espectrofotomeacutetricas possuem uma extensa aplicabilidade em pesquisas
cientiacuteficas anaacutelise quiacutemica teste de controle de qualidade de medicamentos entre outros Isso se
daacute por serem teacutecnicas altamente sensiacuteveis de alta resoluccedilatildeo e por ser um meacutetodo mais raacutepido e
preciso Ao analisar traccedilos de compostos em amostras complexas como sangue e urina as
anaacutelises toxicoloacutegicas auxiliam no prognoacutestico e diagnoacutestico de intoxicaccedilotildees uma vez que eacute
possiacutevel identificaccedilatildeo destes compostos em amostras bioloacutegicas
O meacutetodo por CCDC tem caraacuteter semindashquantitativo jaacute que a quantificaccedilatildeo dos faacutermacos eacute
baseada apenas na comparaccedilatildeo visual dos ldquoSpotsrdquo das amostras e dos padrotildees Embora o meacutetodo
seja adequado para triagem os resultados mostram que a quantificaccedilatildeo de faacutermacos por meacutetodos
baseados no uso de CCDC deve possuir uma interpretaccedilatildeo bem cautelosa especialmente devido agrave
incerteza associada a este tipo de comparaccedilatildeo
Se faz necessaacuterio a confirmaccedilatildeo da identidade do faacutermaco por outras teacutecnicas eou outros
meacutetodos de anaacutelise como a Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia (CLAE) e Cromatografia
21
Gasosa (CG) sendo assim possiacutevel correlacionar os perfis cromatograacuteficos entre as diferentes
teacutecnicas
ABSTRACT
The medicines are presented as the main toxic agent responsible for cases of human poisoning
thus constituting a major challenge for those working with Public Health However the absence
of a specialized toxicological analysis hinders a more accurate diagnosis of cases The
spectrophotometric and chromatographic techniques may assist in confirming the diagnosis A
Comparative Thin Layer Chromatography (CCDC) is a separation technique simple low cost and
good sensitivity The identification of the drug can be achieved both quantitatively and
qualitatively by infrared spectroscopy Fourier transform (FTIR) This research proposal was to
evaluate two techniques for identification of Alprazolam in urine of patients with toxic exposure
to drugs assessing the selectivity accuracy limit of detection limit of quantification and
robustness in chromatographic techniques The method was optimized validated and applied in
accordance with Resolution RDC Nordm 899 of May 29 2003 The chromatographic assay used
plates of Silica Gel G-60 elution with chloroform-methanol 91 (v v) and as a chromogenic
agent the Reactive Dragendorff The presence of the drug was confirmed by the FTIR analysis
The method proved to be selective chromatographic conditions established by presenting Limit
Detection and Quantification 200μgml and 100μgml respectively Among the patient samples
drug poisoning no positive results obtained for Alprazolam The FTIR analysis showed that the
drug did not undergo degradation in the extraction process The method has proven to meet the
requirements of good practice required by RDC Nordm 899 of 29 May 2003 being sensitive and
accurate
KEYWORDS Alprazolam Spectroscopy Chromatography Intoxication
REFEREcircNCIAS
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27
ANEXO A
28
5
A validaccedilatildeo consiste no ato de tornar legiacutetimo ou legal um meacutetodo equipamento sistema
ou metodologia atraveacutes do estabelecimento de documentaccedilotildees visando diminuir ou controlar os
fatores que levam agrave imprecisatildeo ou inexatidatildeo para garantir a confiabilidade e rastreabilidade dos
dados gerados Para validar um meacutetodo eacute essencial que sejam incluiacutedos pelo menos os seguintes
paracircmetros exatidatildeo precisatildeo fidelidade linearidade limite de detecccedilatildeo e limite de
quantificaccedilatildeo sensibilidade especificidade recuperaccedilatildeo robustez estabilidade e intervalo de
aplicaccedilatildeo (RIBANI et al 2004 LANCcedilAS 2004 VALENTINI SOMMER MATIOLI 2007)
A otimizaccedilatildeo das metodologias analiacuteticas possibilita a aplicaccedilatildeo de teacutecnicas
cromatograacuteficas e espectrofotomeacutetricas em amostras bioloacutegicas na rotina de um laboratoacuterio de
emergecircncia toxicoloacutegica e nos serviccedilos puacuteblicos de sauacutede auxiliando na confirmaccedilatildeo do
diagnoacutestico e no prognoacutestico dos pacientes com histoacuterico de exposiccedilatildeo toacutexica por medicamentos
Assim esta pesquisa teve como objetivo realizar ensaios cromatograacuteficos avaliando a
seletividade exatidatildeo limite de detecccedilatildeo limite de quantificaccedilatildeo e robustez para pesquisa de
Alprazolam em amostras bioloacutegicas de pacientes com diagnoacutestico de exposiccedilatildeo toacutexica a
medicamentos A confirmaccedilatildeo dos resultados foi realizada atraveacutes da Espectroscopia
Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR)
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
No Brasil e outros paiacuteses como Alemanha Canadaacute e Inglaterra os medicamentos vecircm
preocupando as autoridades e os profissionais de sauacutede pois se apresentam como o principal
agente toacutexico responsaacutevel pelos casos de intoxicaccedilotildees humanas constituindo portanto um
grande desafio para os que trabalham com a Sauacutede Puacuteblica (FALCAtildeO 2004 SISTEMA
2012)
Vaacuterios episoacutedios histoacutericos marcaram acidentes com medicamentos em 1937 mais de 100
crianccedilas morreram nos Estados Unidos pelo uso de um elixir sulfanilamida que continha como
veiacuteculo o dietilenoglicol Em 1938 como consequecircncia deste evento foi aprovada nos Estados
Unidos a lei que criou a ldquoFood and Drug Administrationrdquo (FDA) obrigando as induacutestrias
farmacecircuticas a fornecer informaccedilotildees a esta instituiccedilatildeo dados cliacutenicos sobre novos
6
medicamentos Um dos acidentes marcantes relacionado ao uso de medicamentos aconteceu na
Alemanha Oriental em 1961 pelo uso da Talidomida um hipnoacutetico natildeo barbituacuterico prescrito na
eacutepoca para tratar naacuteuseas e vocircmitos em mulheres graacutevidas aproximadamente 12000 crianccedilas
nasceram com focomelia (termo Grego que significa membro de focas e caracteriza um processo
de deformidade dos membros) Atraveacutes de estudos epidemioloacutegicos foi comprovado o efeito
teratogecircnico da Talidomida e como consequecircncia entre 1961 a 1962 foi retirada do mercado em
quase todo o mundo
Um marco na histoacuteria da organizaccedilatildeo da Assistecircncia Farmacecircutica no Brasil foi a
aprovaccedilatildeo da Poliacutetica Nacional de Medicamentos em 30 de outubro de 1998 pela Portaria nordm
3916 Esta Portaria contempla diretrizes como Adoccedilatildeo de Relaccedilatildeo de Medicamentos Essenciais
(Rename) Regulamentaccedilatildeo Sanitaacuteria de Medicamentos Reorientaccedilatildeo da Assistecircncia
Farmacecircutica Promoccedilatildeo do Uso Racional de Medicamentos Desenvolvimento Cientiacutefico e
Tecnoloacutegico Promoccedilatildeo da Produccedilatildeo de Medicamentos Garantia da Seguranccedila Eficaacutecia e
Qualidade dos Medicamentos e Desenvolvimento e Capacitaccedilatildeo de Recursos Humanos aleacutem de
definir prioridades relacionadas agrave legislaccedilatildeo incluindo Revisatildeo da Rename Assistecircncia
Farmacecircutica Promoccedilatildeo do Uso Racional de Medicamentos e a Organizaccedilatildeo das Atividades de
Vigilacircncia Sanitaacuteria de Medicamentos (BRASIL 2006)
Uma significativa parcela dos medicamentos prescritos no Brasil eacute da classe dos
psicofaacutermacos Estima-se que pelo menos 13 do total de faacutermacos consumidos no nosso paiacutes
envolva Benzodiazepiacutenicos Antidepressivos e Neuroleacutepticos Anticonvulsivantes ou estimulantes
do Sistema Nervoso Central (SNC) (LUCHETTI et al 2010)
Rodrigues et al (2006) afirmam que esse percentual estaacute relacionado ao aumento da
frequecircncia de diagnoacutesticos de transtornos psiquiaacutetricos na populaccedilatildeo agrave introduccedilatildeo de novos
psicofaacutermacos no mercado farmacecircutico e agraves novas indicaccedilotildees terapecircuticas de psicofaacutermacos jaacute
existentes
Os benzodiazepiacutenicos estatildeo entre as drogas mais prescritas no mundo Satildeo utilizados
principalmente como ansioliacuteticos e hipnoacuteticos aleacutem de possuir accedilatildeo miorrelaxante e
anticonvulsivante (AUCHEWSKI et al 2004)
Apoacutes sua comercializaccedilatildeo no iniacutecio dos anos 60 os Benzodiazepiacutenicos (BZD)
substituiacuteram praticamente todas as drogas utilizadas no tratamento da ansiedade - Barbituacutericos
Meprobamato Hidrato de Cloral e outros que provocavam seacuterios efeitos colaterais Isso ocorreu
7
em virtude do maior iacutendice terapecircutico dessas substacircncias menor potencialidade de provocar
acidentes fatais e menor tendecircncia para produzir siacutendromes de abstinecircncia e toleracircncia
farmacoloacutegica (FORSAN 2010)
Embora sejam drogas relativamente seguras restriccedilotildees agrave sua utilizaccedilatildeo tecircm sido cada vez
maiores devido agrave incidecircncia dos efeitos colaterais relacionados agrave depressatildeo do sistema nervoso
central Dentre eles os principais satildeo a diminuiccedilatildeo da atividade psicomotora o prejuiacutezo na
memoacuteria a desinibiccedilatildeo paradoxal e a potencializaccedilatildeo do efeito depressor pela interaccedilatildeo com
outras drogas depressoras principalmente o aacutelcool Aleacutem disso a depressatildeo e a distimia (tipo de
depressatildeo crocircnica) podem ocorrer consequumlentemente ao uso de alprazolam e clonazepam
(LACERDA et al 2004)
Esta classe de faacutermacos constitui a primeira causa de exposiccedilotildees toacutexicas dentre os outros
grupos de medicamentos em nosso meio No entanto as intoxicaccedilotildees por essa classe
farmacoloacutegica excepcionalmente tecircm evoluccedilatildeo letal Exercem accedilatildeo sobre o sistema nervoso
central atraveacutes da ligaccedilatildeo aos receptores benzodiazepiacutenicos no complexo do receptor dos canais
de cloro do Aacutecido Gama-Aminobutiacuterico (GABA) As principais manifestaccedilotildees das intoxicaccedilotildees
por benzodiazepiacutenicos satildeo a depressatildeo neuroloacutegica da resposta ventilatoacuteria ao CO2 e diminuiccedilatildeo
da frequecircncia respiratoacuteria (OLIVEIRA et al 2010)
O diagnoacutestico das intoxicaccedilotildees pode ser realizado atraveacutes da histoacuteria do paciente
(anamnese) dos sinais cliacutenicos e laboratoriais
8
A Cromatografia em Camada Delgada (CCD) eacute uma teacutecnica de adsorccedilatildeo do tipo soacutelido-
liacutequida Nesse caso a separaccedilatildeo se daacute pela diferenccedila de afinidade dos componentes de uma
mistura pela fase estacionaacuteria (DEGANI CASS VIEIRA 1998) A fase estacionaacuteria
corresponde a uma camada fina formada por um soacutelido granulado geralmente siacutelica depositado
sobre uma placa de vidro alumiacutenio ou outro suporte inerte Este meacutetodo merece atenccedilatildeo especial
pela sua versatilidade rapidez sensibilidade e nitidez das separaccedilotildees (EIZENDEHER 2005)
A Espectroscopia Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) pode ser usada para
identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo de compostos orgacircnicos inorgacircnicos e polimeacutericos Basicamente o
que se mede nesta anaacutelise eacute a fraccedilatildeo da energia transmitida ou absorvida em relaccedilatildeo agrave incidente
em determinado comprimento de onda ou nuacutemero de onda (EVORA et al 2002)
A espectrometria FTIR permite a determinaccedilatildeo automatizada dos paracircmetros de maior
importacircncia na caracterizaccedilatildeo de amostras Hoje os instrumentos de FTIR satildeo informatizados o
que os torna mais raacutepidos e mais sensiacuteveis do que os instrumentos mais antigos dispersivos Ele
pode ser aplicado agrave anaacutelise de soacutelidos liacutequidos e gases Trata-se de uma metodologia que origina
rapidamente uma informaccedilatildeo sumaacuteria de 30 segundos por amostra eacute uma teacutecnica natildeo poluente jaacute
que natildeo utiliza reagentes aleacutem de natildeo necessitar de pessoal especializado para ser operada em
rotina (MOREIRA MARCOS BARROS 2002)
Para garantir que um novo meacutetodo analiacutetico gere informaccedilotildees confiaacuteveis e interpretaacuteveis
sobre a amostra ele deve passar por um processo de validaccedilatildeo A validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos
eacute o processo pelo qual eacute estabelecido por estudos de laboratoacuterio que as caracteriacutesticas
executadas do meacutetodo satisfazem aos requisitos para as aplicaccedilotildees analiacuteticas praticadas (RIBANI
et al2004 VALENTINI SOMMER MATIOLI 2007)
3 REFERENCIAL METODOLOacuteGICO
31 Dados epidemioloacutegicos
9
311 Delineamento do estudo e instrumento de coleta de dados
Tratou-se de uma pesquisa prospectiva descritiva e analiacutetica Os dados epidemioloacutegicos
foram coletados dos pacientes admitidos com histoacuteria de exposiccedilatildeo e ou intoxicaccedilatildeo por
medicamentos no Hospital de Emergecircncia e Trauma de Campina Grande atendidos e notificados
pelo Centro de Informaccedilatildeo Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) nos meses de agosto
e setembro de 2012 Utilizou-se a ficha do Sistema Nacional de Agravos de Notificaccedilatildeo
(Sinan)MS para a coleta dos dados epidemioloacutegicos desses pacientes (Anexo A)
312 Variaacuteveis demograacuteficas e socioeconocircmicas
Gecircnero
Faixa Etaacuteria
Ocupaccedilatildeo
313 Variaacuteveis relativas ao evento
Circunstacircncia
314 Variaacutevel relativa ao Agente Toacutexico
Os grupos de medicamentos foram classificados em categorias terapecircuticas segundo o
Anatomical-Therapeutical-ChemicalClassification System (ATC)
Os medicamentos pertencentes ao nono niacutevel dessa classificaccedilatildeo satildeo classificados como
os medicamentos que atuam no sistema nervoso central representado pela letra N Neste niacutevel
estatildeo incluiacutedos os psicodisleacutepticos ansioliacuteticos (NO5B) antipsicoacuteticos (NO5A) hipnoacutetico-
sedativos (NO5C) e os psicoanaleacutepticos antidepressivos (NO6A) e
estimulantespsicoestimulantes (NO6B)
315 Variaacuteveis relativas agrave intoxicaccedilatildeo
Avaliar os sinais e sintomas
Classificar os casos quanto agrave gravidade
10
Quanto ao item gravidade adotamos o seguinte criteacuterio com base no trabalho de King e
Palmisano 1989
Grave o paciente que permanece internado apoacutes procedimentos do tipo lavagem gaacutestrica
ou observaccedilatildeo meacutedica
Moderada ocorre algum procedimento do tipo lavagem gaacutestrica ou observaccedilatildeo meacutedica
mas sem internaccedilatildeo
Leve a famiacutelia recebe somente orientaccedilatildeo ou acompanhamento por telefone e nenhum
procedimento
Ignorada natildeo eacute possiacutevel classificar a extensatildeo do dano
Evoluccedilatildeo
Alta meacutedica (Cura)
Transferecircncia para outra unidade hospitalar
Ignorado
Oacutebito
32 DADOS EXPERIMENTAIS
321 Ensaios de Desenvolvimento e Validaccedilatildeo da Metodologia
Local da Pesquisa Laboratoacuterio de Desenvolvimento e Certificaccedilatildeo de Biomaterias do
Nordeste unidades da UEPB e UFCG
Materiais
Solventes reagentes e outros aparatos
-Alprazolam (faacutermaco) doaccedilatildeo feita pelo Nuacutecleo de odontologia e medicina Legal - NUMOL
-Medicamento (Medley) Alprazolam
-Acetona Vetec
11
-Clorofoacutermio Vetec
-Sulfato de Soacutedio Anidro Vetec
-Metanol (HPLC) Paneac
-Placas de Siacutelica Gel ALUGRAM SIL G 60F de (20x20) cm
2 foram adquiridas da Macherey-
Nagel (REF 818033)
-Cubas Cromatograacuteficas
-Papel de filtro Qualy
Equipamentos
-Estufa Med Clav
-Banho de Ultra-Som ULTRAsonic 1440A
-Centrifuga DCS-16 RV
-Cacircmera de Luz UV (λ=264nm)
-Espectrocircmetro FTIR SPECTRUM 400 Perkin-Elmer (4000 a 600 cm-1 para anaacutelise das
caracteriacutesticas do grupos funcionais dos faacutermacos)
322 Preparaccedilatildeo dos padrotildees
As soluccedilotildees estoque do faacutermaco foram preparadas pela dissoluccedilatildeo de cada composto em
metanol para obter a concentraccedilatildeo de 400 microg mL
323 Preparaccedilatildeo das Amostras
Procedimento de Extraccedilatildeo Extraccedilatildeo Liacutequido-Liacutequido (ELL)
Na fase de desenvolvimento do meacutetodo um importante passo foi a retirada dos
interferentes das amostras Para isto foram realizados vaacuterios procedimentos de Clean-up usando
ELL Para a ELL foi usado o meacutetodo de Stas-Otto que considera o caraacuteter aacutecidobase de cada
substacircncia do meio em que essa se encontra o seu grau de ionizaccedilatildeo como fatores influentes em
sua solubilidade em solventes orgacircnicos pois a partir de mistura desses em proporccedilotildees
adequadas pode-se submeter agraves amostras agrave ELL (FIGURA 01)
Terminada a extraccedilatildeo por sonicaccedilatildeo ou centrifugaccedilatildeo a fase orgacircnica foi recolhida
evaporada e ressuspendida para anaacutelise cromatograacutefica e espectrofotomeacutetrica
12
324 Teacutecnicas
Anaacutelise por CCD
A anaacutelise por CCD foi baseada na metodologia claacutessica descrita por Moraes (1991) com
adaptaccedilatildeo
Os resiacuteduos obtidos por ELL foram ressuspendidos em MetanolAacutegua (91) e aplicados
nas placas cromatograacuteficas previamente ativadas em estufas a 105ordmC por 30 minutos Aplicaram-
se nas placas aliacutequotas de 20 microL dos extratos obtidos por ELL Foi utilizado o sistema solvente
constituiacutedo de mistura de clorofoacutermio-metanol (91) e clorofoacutermio-acetona (41)
Os cromatogramas foram revelados usando meacutetodos quiacutemicos (agentes cromogecircnicos
Reativo de Dragendorff Difenilcarbazona Nitrato de Prata 1 e Cloreto Feacuterrico 5) e meacutetodo
fiacutesico (Cacircmera de Luz UV (λ=264nm)
Figura 01 - Esquema de extraccedilatildeo amostras
FONTE MORAES 1991
325 Estudo de seletividade e recuperaccedilatildeo
Seletividade
A seletividade do meacutetodo foi avaliada atraveacutes da extraccedilatildeo de 6 amostras diferentes de
urinas (n=6) por LLE e depois analisadas por CCDC
25 ml
13
Recuperaccedilatildeo
A extraccedilatildeo para avaliar a recuperaccedilatildeo foi realizada pela anaacutelise de amostras em
triplicatas contaminadas (fortificadas) em trecircs concentraccedilotildees do padratildeo de Alprazolam (baixa=
100microgml meacutedia=200 microgml e alta= 400 microgml)
326 O Limite de Detecccedilatildeo (LD) e o Limite de Quantificaccedilatildeo (LQ)
O Limite de Detecccedilatildeo eacute a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser
detectada mas natildeo necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento
experimental O Limite de Quantificaccedilatildeo eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia
em exame que pode ser medida utilizando um determinado procedimento experimental
O LD foi determinado por anaacutelise de urina contaminada em concentraccedilotildees decrescentes
de faacutermaco e medicamento ateacute a concentraccedilatildeo possiacutevel de se detectar a presenccedila de ambos O LQ
foi determinado por analise de urina contaminada em concentraccedilotildees decrescentes de faacutermaco e
medicamento ateacute a concentraccedilatildeo possiacutevel de se quantificar a presenccedila de ambos
327 Robustez
Na avaliaccedilatildeo da robustez foram utilizados como solventes o metanol a aacutegua uma soluccedilatildeo
de clorofoacutermio- acetona (41) e uma soluccedilatildeo de clorofoacutermio-metanol (91) para preparaccedilatildeo dos
padrotildees de Alprazolam
328 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier - FTIR
Foram feitas anaacutelises de soluccedilotildees metanoacutelicas ( 10 mgmL n=3) do faacutermaco padratildeo e suas
extraccedilotildees utilizando a faixa de varredura de 4000 a 500 cm-1
em temperatura ambiente
4 DADOS E ANAacuteLISE DA PESQUISA
41 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
No periacuteodo de agosto a setembro de 2012 o Ceatox-CG registrou 28 casos com histoacuteria
de intoxicaccedilatildeo por medicamentos Destes 18 casos foram classificados como
14
neuropsicofaacutermacos Na anaacutelise dos casos do uso isolado de medicamentos os Antiepileacutepticos
assim como os Ansioliticos foram os responsaacuteveis pelo maior nuacutemero de ocorrecircncias com um
percentual de 22 (n=4) cada um Um estudo realizado com crianccedilas no estado de Mato Grosso
do Sul verificou que os anticonvulsivantes foram os principais responsaacuteveis pelos eventos toacutexicos
por medicamentos que agem no SNC (MATOS et al 2008)
Ao analisarmos as associaccedilotildees de medicamentos (n=7-39) nos chama a atenccedilatildeo o
nuacutemero de ocorrecircncias por tentativa de suiciacutedio (n=10-557) Bernades Turini e Matsuo
(2010) afirmam que pacientes que tentam suiciacutedio em sua grande maioria fazem uso de mais de
um tipo de substacircncia quiacutemica ndash medicamentosa ou natildeo ndash quando o meacutetodo eacute a intoxicaccedilatildeo
voluntaacuteria
Os eventos toxicoloacutegicos foram mais comuns em mulheres (556) por tentativa de
suiciacutedio (557) e entre adultos e jovens (389) (Tabela 01) Um estudo realizado entre os anos
de 1997 e 2007 no Centro de Controle de Intoxicaccedilatildeo (CCI) em Londrina Paranaacute analisando as
tentativas de suiciacutedio por sobredose intencional de medicamentos com relaccedilatildeo ao gecircnero condiz
com dados aqui obtidos (BERNADES TURINI MATZUO 2010) Por outro lado Gandolfi e
Andrade (2006) mostra o ldquoacidente individualrdquo como principal fator responsaacutevel pelas exposiccedilotildees
toacutexicas a medicamentos em Satildeo Paulo seguido pela tentativa de suiciacutedio
Graacutefico 01 - Grupos farmacoloacutegicos de acordo com a classificaccedilatildeo da ATC responsaacuteveis pelas
intoxicaccedilotildees registradas no Ceatox-CG entre agosto a setembro de 2012 (N= 18)
2239
1722
Associaccedilotildees
N05A
N03A
N05B
NOTA N05A Antipsicoacuteticos N03A Antiepileacuteptico NO5B Ansioliacuteticos e associaccedilatildeo
15
Acerca da ocupaccedilatildeo dos pacientes os estudantes foram os mais frequentes (n=6-333)
Este dado entra em desacordo com a mesma variaacutevel analisada no estudo de Turini et al (2010)
em que mostra que a ocupaccedilatildeo mais relevante nos seu estudo eacute a de empregado (Tabela 01)
Observando-se os sinais e sintomas das intoxicaccedilotildees as Siacutendromes Toacutexicas por
Superdosagem de Sedativos (pupilas mioacuteticas tremor hipotensatildeo confusatildeo mental e sonolecircncia)
e a Extrapiramidal (choro monoacutetono opistoacutetomo e distonia) foram predominantes O quadro
toacutexico se desenvolve dependendo da dose do subgrupo terapecircutico e do tempo entre a exposiccedilatildeo
e o atendimento Os ansioliacuteticos principalmente os Benzodiazepiacutenicos (BZD) satildeo compostos
que apresentam maior iacutendice terapecircutico e menor potencialidade de provocar acidentes fatais e
menor tendecircncia para produzir toleracircncia farmacoloacutegica (FORSAN 2010)
Tabela 01 ndash Frequecircncia do tipo de circunstacircncia da faixa etaacuteria do gecircnero e da ocupaccedilatildeo dos pacientes intoxicados
atendidos no Ceatox-CG
Variaacutevel
N
Circunstacircncia (N=18)
Tentativa de Suiciacutedio 10 557
Acidental 1 57
Outra 7 389
Faixa Etaacuteria (anos) (N=18)
1---9 3 166
10---19 5 278
20---39 7 389
gt 40 3 167
Gecircnero (N=18)
Masculino 8 444
Feminino 10 556
Ocupaccedilatildeo (N=18)
Estudante 6 333
Do lar 4 222
Outra 8 444
16
Em relaccedilatildeo agrave variaacutevel evoluccedilatildeo natildeo se registrou nenhum oacutebito no periacuteodo estudado
Dados nacionais entre os anos de 2007 a 2009 mostram que os medicamentos apresentaram
baixo coeficiente de letalidade meacutedio quando comparado aos agrotoacutexicos de uso agriacutecola e as
drogas de abuso (SISTEMA2012) Um estudo realizado por Mota et al (2012) usando dados
secundaacuterios do Sistema Informaccedilatildeo de Mortalidade (SIM)MS entre 1996 a 2005 identificou
4403 oacutebitos relacionados a medicamentos entretanto natildeo foi possiacutevel estabelecer qual a
principal classe de medicamentos nem o princiacutepio ativo envolvido com o agravo
42 Dados Experimentais
Para otimizaccedilatildeo do meacutetodo vaacuterios procedimentos foram realizados seguindo os
paracircmetros analiacuteticos de validaccedilatildeo objetivando detectar a presenccedila de Alprazolam em urina de
paciente com histoacuterico de exposiccedilatildeo toxica a esse faacutermaco A metodologia desenvolvida e
validada mostrou-se em conformidade com as especificaccedilotildees da Resoluccedilatildeo RDC nordm899 de 29 de
maio de 2003 (BRASIL 2003)
Na avaliaccedilatildeo da seletividade nas amostras de urina analisadas natildeo foram detectados
interferentes nas condiccedilotildees de extraccedilatildeo estabelecidas Assim o meacutetodo mostrou-se seletivo jaacute
que as amostras natildeo mostraram nenhum spot(mancha) semelhante aos desenvolvidos pelos
padrotildees No processo de validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos a especificidade ou seletividade eacute o
primeiro passo para o desenvolvimento de um meacutetodo este paracircmetro deve ser avaliado
continuamente para assegurar a precisatildeo e exatidatildeo deste durante sua validaccedilatildeo (SILVA et al
2010) (Tabela 02)
Para os ensaios de recuperaccedilatildeo foi observada a intensidade do spot desenvolvido em cada
amostra para cada niacutevel de fortificaccedilatildeo Nas amostras fortificadas com 200 microg do padratildeo
obtivemos uma recuperaccedilatildeo de 917 enquanto que nas amostras fortificadas com 400 microg do
mesmo o percentual meacutedio obtido foi de 967 demonstrando assim a exatidatildeo do meacutetodo
Segundo a Resoluccedilatildeo RDC nordm 899 de 29 de maio de 2003 a exatidatildeo se daacute pela concordacircncia
entre o resultado de um ensaio e um valor de referecircncia
17
Tabela 02 ndash Avaliaccedilatildeo da seletividade comparando-se spot e Rf (Relative Front) dos padrotildees de
Alprazolam e amostras branco
Sistema-solvente Agente cromogecircnico
Clorofoacutermio-metanol(91v v)
DI
Clorofoacutermio-acetona(41vv)
DI
FaacutermacoAmostras Rf e Cor Rf e Cor
Padratildeo Alprazolam faacutermaco
Padratildeo Alprazolam comprimido
ABal1
ABal2
ABal3
ABal4
ABal5
05 + c
026 + c
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Nota DI = Dragendorff iodado ABal = amostra branco alcalina Rf = fator de retenccedilatildeo c = cor
castanha
O Limite de Detecccedilatildeo e o Limite de Quantificaccedilatildeo para o Alprazolam foram de
100microgmL e 200 microgmL respectivamente Ribani et al (2004) define o Limite de Detecccedilatildeo (LD)
como sendo a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser detectada mas natildeo
necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento experimental O Limite
de Quantificaccedilatildeo (LQ) eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode
ser medida utilizando um determinado procedimento experimental (Figura 01)
O meacutetodo de extraccedilatildeo utilizado particcedilatildeo liacutequido-liacutequido demonstrou-se eficaz pois a
solubilidade do faacutermaco avaliado possui uma elevada afinidade pela mistura de solventes
utilizados nesse procedimento Na separaccedilatildeo do analito da matriz a sonicaccedilatildeo que eacute o processo
que utiliza a energia das ondas sonoras mais comumente a ultrassom se mostrou mais eficaz que
a centrifugaccedilatildeo
O sistema formado pelos solventes clorofoacutermio-metanol (91 vv) obteve o melhor
resultado em relaccedilatildeo ao sistema solvente clorofoacutermio-acetona(41 vv) tendo em vista melhor
resultado na separaccedilatildeo dos padrotildees e amostras
18
Figura 01-Identificaccedilatildeo de Alprazolam em trecircs niacuteveis de fortificaccedilatildeo (n = 3) alta meacutedia e baixa
Dentre os agentes cromogecircnicos utilizados na revelaccedilatildeo apenas o Reativo de Dragendorff
se mostrou eficaz Observou-se atraveacutes do meacutetodo fiacutesico utilizando a Cacircmera de Luz UV que o
Alprazolam faacutermaco e o Alprazolam comprimido natildeo transmite fluorescecircncia no comprimento
de onda de 366nm
Para avaliaccedilatildeo da Robustez as soluccedilotildees-padratildeo (faacutermaco e medicamento) foram
dissolvidas em diversos solventes como apresentado na Tabela 03 O metanol foi o solvente em
que houve revelaccedilatildeo na placa cromatograacutefica tanto do faacutermaco como do medicamento
Tabela 03 - Anaacutelise dos diferentes solventes da soluccedilatildeo estoque padratildeo puro do faacutermaco e do medicamento de
Alprazolam a partir do Rf
NOTA Rf = Relative Front spot= cormancha
Solvente Alprazolam faacutermaco Alprazolam medicamento
Rf Rf
Metanol 05 026
Aacutegua 06 -
ClorofoacutermioAcetona
(41)
056 -
ClorofoacutermioMetanol
(41)
052 -
AMOSTRAS
PADRAtildeO
19
Os testes de robustez satildeo de fundamental importacircncia para que os analistas conheccedilam
quais fatores devem ser estritamente controlados durante a execuccedilatildeo de um meacutetodo Se as
alteraccedilotildees das condiccedilotildees de anaacutelise produzirem resultados dentro dos limites aceitaacuteveis de
seletividade exatidatildeo e precisatildeo o meacutetodo pode ser considerado robusto e tais variaccedilotildees podem
ser incorporadas ao procedimento (CASSIANO et al 2009)
Apesar do meacutetodo ter se mostrado seletivo para o Alprazolam ele natildeo eacute especifico apenas
para esse faacutermaco Sendo assim o meacutetodo foi aplicado em 7 (sete) amostras de pacientes com
histoacuterico de exposiccedilatildeo toacutexica por medicamentos atendidos pelo Centro de Informaccedilatildeo
Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) poreacutem natildeo foi possiacutevel obter a recuperaccedilatildeo dos
faacutermacos Acredita-se que a quantidade ingerida dos medicamentos pelos pacientes foi baixa ou
que pela demora da coleta da amostra os faacutermacos tenham sido metabolizado pelo organismo
Nos ensaios de confirmaccedilatildeo por FTIR observou-se que o Alprazolam padratildeo apresentou as
seguintes vibraccedilotildees moleculares A deformaccedilatildeo angular N-H de amina secundaacuteria eacute observada na
banda em 1660 cm-1
Em 1647 cm-1
aparece uma banda que pode ser atribuiacuteda ao estiramento
C=N da imina e em 1397 cm-1
aparece uma banda atribuiacuteda ao estiramento C-N das aminas A
banda caracteriacutestica do estiramento =C-H de carbono sp2 do anel aromaacutetico se encontra em 3275
cm-1
O espectro do faacutermaco extraiacutedo da matriz bioloacutegica mantecircm as mesmas caracteriacutesticas do
faacutermaco padratildeo Dessa forma podemos afirmar que a moleacutecula natildeo sofreu alteraccedilatildeo durante o
processo de extraccedilatildeo (Figura 02)
Figura 02 - Espectro da analise no FTIR do padratildeo de Alprazolam faacutermaco e de amostra extraiacuteda
20
5 CONCLUSAtildeO
O meacutetodo demonstrou atender aos requisitos de boas praacuteticas exigidos pela Resoluccedilatildeo
RDC 899 de 29 de maio de 2003 sendo exato e sensiacutevel
Dentre as amostras de pacientes intoxicados por medicamentos natildeo se obteve resultados
positivos para o Alprazolam
Os medicamentos constituem como um dos principais meios utilizado para tentativa de
suiciacutedio tendecircncia que eacute observada nos paiacuteses de terceiro mundo entre eles os psicofaacutermacos os
mais utilizados Haacute necessidade de uma melhor formaccedilatildeo e atualizaccedilatildeo dos profissionais assim
como de informaccedilatildeo aos usuaacuterios e medidas de prevenccedilatildeo que poderiam alertar sobre os riscos e
monitorar o uso desses medicamentos
O Brasil em agosto de 2006 deu o primeiro passo lanccedilando a Portaria nordm 1876 com as
diretrizes nacionais para Prevenccedilatildeo do Suiciacutedio nas trecircs esferas da gestatildeo Portanto estudar e
prevenir as tentativas de suiciacutedio eacute um desafio pois envolve recursos financeiros e sensibilidade
da parte dos profissionais envolvidos
Por outro lado aleacutem do conhecimento dos dados epidemioloacutegicos eacute necessaacuteria a
identificaccedilatildeo dos grupos terapecircuticos responsaacuteveis pelas intoxicaccedilotildees As teacutecnicas
cromatograacuteficas e espectrofotomeacutetricas possuem uma extensa aplicabilidade em pesquisas
cientiacuteficas anaacutelise quiacutemica teste de controle de qualidade de medicamentos entre outros Isso se
daacute por serem teacutecnicas altamente sensiacuteveis de alta resoluccedilatildeo e por ser um meacutetodo mais raacutepido e
preciso Ao analisar traccedilos de compostos em amostras complexas como sangue e urina as
anaacutelises toxicoloacutegicas auxiliam no prognoacutestico e diagnoacutestico de intoxicaccedilotildees uma vez que eacute
possiacutevel identificaccedilatildeo destes compostos em amostras bioloacutegicas
O meacutetodo por CCDC tem caraacuteter semindashquantitativo jaacute que a quantificaccedilatildeo dos faacutermacos eacute
baseada apenas na comparaccedilatildeo visual dos ldquoSpotsrdquo das amostras e dos padrotildees Embora o meacutetodo
seja adequado para triagem os resultados mostram que a quantificaccedilatildeo de faacutermacos por meacutetodos
baseados no uso de CCDC deve possuir uma interpretaccedilatildeo bem cautelosa especialmente devido agrave
incerteza associada a este tipo de comparaccedilatildeo
Se faz necessaacuterio a confirmaccedilatildeo da identidade do faacutermaco por outras teacutecnicas eou outros
meacutetodos de anaacutelise como a Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia (CLAE) e Cromatografia
21
Gasosa (CG) sendo assim possiacutevel correlacionar os perfis cromatograacuteficos entre as diferentes
teacutecnicas
ABSTRACT
The medicines are presented as the main toxic agent responsible for cases of human poisoning
thus constituting a major challenge for those working with Public Health However the absence
of a specialized toxicological analysis hinders a more accurate diagnosis of cases The
spectrophotometric and chromatographic techniques may assist in confirming the diagnosis A
Comparative Thin Layer Chromatography (CCDC) is a separation technique simple low cost and
good sensitivity The identification of the drug can be achieved both quantitatively and
qualitatively by infrared spectroscopy Fourier transform (FTIR) This research proposal was to
evaluate two techniques for identification of Alprazolam in urine of patients with toxic exposure
to drugs assessing the selectivity accuracy limit of detection limit of quantification and
robustness in chromatographic techniques The method was optimized validated and applied in
accordance with Resolution RDC Nordm 899 of May 29 2003 The chromatographic assay used
plates of Silica Gel G-60 elution with chloroform-methanol 91 (v v) and as a chromogenic
agent the Reactive Dragendorff The presence of the drug was confirmed by the FTIR analysis
The method proved to be selective chromatographic conditions established by presenting Limit
Detection and Quantification 200μgml and 100μgml respectively Among the patient samples
drug poisoning no positive results obtained for Alprazolam The FTIR analysis showed that the
drug did not undergo degradation in the extraction process The method has proven to meet the
requirements of good practice required by RDC Nordm 899 of 29 May 2003 being sensitive and
accurate
KEYWORDS Alprazolam Spectroscopy Chromatography Intoxication
REFEREcircNCIAS
AMERICAN ASSOCIATION OF POISON CENTERS TOXIC EXPOSURE SURVEILLANCE
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22
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27
ANEXO A
28
6
medicamentos Um dos acidentes marcantes relacionado ao uso de medicamentos aconteceu na
Alemanha Oriental em 1961 pelo uso da Talidomida um hipnoacutetico natildeo barbituacuterico prescrito na
eacutepoca para tratar naacuteuseas e vocircmitos em mulheres graacutevidas aproximadamente 12000 crianccedilas
nasceram com focomelia (termo Grego que significa membro de focas e caracteriza um processo
de deformidade dos membros) Atraveacutes de estudos epidemioloacutegicos foi comprovado o efeito
teratogecircnico da Talidomida e como consequecircncia entre 1961 a 1962 foi retirada do mercado em
quase todo o mundo
Um marco na histoacuteria da organizaccedilatildeo da Assistecircncia Farmacecircutica no Brasil foi a
aprovaccedilatildeo da Poliacutetica Nacional de Medicamentos em 30 de outubro de 1998 pela Portaria nordm
3916 Esta Portaria contempla diretrizes como Adoccedilatildeo de Relaccedilatildeo de Medicamentos Essenciais
(Rename) Regulamentaccedilatildeo Sanitaacuteria de Medicamentos Reorientaccedilatildeo da Assistecircncia
Farmacecircutica Promoccedilatildeo do Uso Racional de Medicamentos Desenvolvimento Cientiacutefico e
Tecnoloacutegico Promoccedilatildeo da Produccedilatildeo de Medicamentos Garantia da Seguranccedila Eficaacutecia e
Qualidade dos Medicamentos e Desenvolvimento e Capacitaccedilatildeo de Recursos Humanos aleacutem de
definir prioridades relacionadas agrave legislaccedilatildeo incluindo Revisatildeo da Rename Assistecircncia
Farmacecircutica Promoccedilatildeo do Uso Racional de Medicamentos e a Organizaccedilatildeo das Atividades de
Vigilacircncia Sanitaacuteria de Medicamentos (BRASIL 2006)
Uma significativa parcela dos medicamentos prescritos no Brasil eacute da classe dos
psicofaacutermacos Estima-se que pelo menos 13 do total de faacutermacos consumidos no nosso paiacutes
envolva Benzodiazepiacutenicos Antidepressivos e Neuroleacutepticos Anticonvulsivantes ou estimulantes
do Sistema Nervoso Central (SNC) (LUCHETTI et al 2010)
Rodrigues et al (2006) afirmam que esse percentual estaacute relacionado ao aumento da
frequecircncia de diagnoacutesticos de transtornos psiquiaacutetricos na populaccedilatildeo agrave introduccedilatildeo de novos
psicofaacutermacos no mercado farmacecircutico e agraves novas indicaccedilotildees terapecircuticas de psicofaacutermacos jaacute
existentes
Os benzodiazepiacutenicos estatildeo entre as drogas mais prescritas no mundo Satildeo utilizados
principalmente como ansioliacuteticos e hipnoacuteticos aleacutem de possuir accedilatildeo miorrelaxante e
anticonvulsivante (AUCHEWSKI et al 2004)
Apoacutes sua comercializaccedilatildeo no iniacutecio dos anos 60 os Benzodiazepiacutenicos (BZD)
substituiacuteram praticamente todas as drogas utilizadas no tratamento da ansiedade - Barbituacutericos
Meprobamato Hidrato de Cloral e outros que provocavam seacuterios efeitos colaterais Isso ocorreu
7
em virtude do maior iacutendice terapecircutico dessas substacircncias menor potencialidade de provocar
acidentes fatais e menor tendecircncia para produzir siacutendromes de abstinecircncia e toleracircncia
farmacoloacutegica (FORSAN 2010)
Embora sejam drogas relativamente seguras restriccedilotildees agrave sua utilizaccedilatildeo tecircm sido cada vez
maiores devido agrave incidecircncia dos efeitos colaterais relacionados agrave depressatildeo do sistema nervoso
central Dentre eles os principais satildeo a diminuiccedilatildeo da atividade psicomotora o prejuiacutezo na
memoacuteria a desinibiccedilatildeo paradoxal e a potencializaccedilatildeo do efeito depressor pela interaccedilatildeo com
outras drogas depressoras principalmente o aacutelcool Aleacutem disso a depressatildeo e a distimia (tipo de
depressatildeo crocircnica) podem ocorrer consequumlentemente ao uso de alprazolam e clonazepam
(LACERDA et al 2004)
Esta classe de faacutermacos constitui a primeira causa de exposiccedilotildees toacutexicas dentre os outros
grupos de medicamentos em nosso meio No entanto as intoxicaccedilotildees por essa classe
farmacoloacutegica excepcionalmente tecircm evoluccedilatildeo letal Exercem accedilatildeo sobre o sistema nervoso
central atraveacutes da ligaccedilatildeo aos receptores benzodiazepiacutenicos no complexo do receptor dos canais
de cloro do Aacutecido Gama-Aminobutiacuterico (GABA) As principais manifestaccedilotildees das intoxicaccedilotildees
por benzodiazepiacutenicos satildeo a depressatildeo neuroloacutegica da resposta ventilatoacuteria ao CO2 e diminuiccedilatildeo
da frequecircncia respiratoacuteria (OLIVEIRA et al 2010)
O diagnoacutestico das intoxicaccedilotildees pode ser realizado atraveacutes da histoacuteria do paciente
(anamnese) dos sinais cliacutenicos e laboratoriais
8
A Cromatografia em Camada Delgada (CCD) eacute uma teacutecnica de adsorccedilatildeo do tipo soacutelido-
liacutequida Nesse caso a separaccedilatildeo se daacute pela diferenccedila de afinidade dos componentes de uma
mistura pela fase estacionaacuteria (DEGANI CASS VIEIRA 1998) A fase estacionaacuteria
corresponde a uma camada fina formada por um soacutelido granulado geralmente siacutelica depositado
sobre uma placa de vidro alumiacutenio ou outro suporte inerte Este meacutetodo merece atenccedilatildeo especial
pela sua versatilidade rapidez sensibilidade e nitidez das separaccedilotildees (EIZENDEHER 2005)
A Espectroscopia Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) pode ser usada para
identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo de compostos orgacircnicos inorgacircnicos e polimeacutericos Basicamente o
que se mede nesta anaacutelise eacute a fraccedilatildeo da energia transmitida ou absorvida em relaccedilatildeo agrave incidente
em determinado comprimento de onda ou nuacutemero de onda (EVORA et al 2002)
A espectrometria FTIR permite a determinaccedilatildeo automatizada dos paracircmetros de maior
importacircncia na caracterizaccedilatildeo de amostras Hoje os instrumentos de FTIR satildeo informatizados o
que os torna mais raacutepidos e mais sensiacuteveis do que os instrumentos mais antigos dispersivos Ele
pode ser aplicado agrave anaacutelise de soacutelidos liacutequidos e gases Trata-se de uma metodologia que origina
rapidamente uma informaccedilatildeo sumaacuteria de 30 segundos por amostra eacute uma teacutecnica natildeo poluente jaacute
que natildeo utiliza reagentes aleacutem de natildeo necessitar de pessoal especializado para ser operada em
rotina (MOREIRA MARCOS BARROS 2002)
Para garantir que um novo meacutetodo analiacutetico gere informaccedilotildees confiaacuteveis e interpretaacuteveis
sobre a amostra ele deve passar por um processo de validaccedilatildeo A validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos
eacute o processo pelo qual eacute estabelecido por estudos de laboratoacuterio que as caracteriacutesticas
executadas do meacutetodo satisfazem aos requisitos para as aplicaccedilotildees analiacuteticas praticadas (RIBANI
et al2004 VALENTINI SOMMER MATIOLI 2007)
3 REFERENCIAL METODOLOacuteGICO
31 Dados epidemioloacutegicos
9
311 Delineamento do estudo e instrumento de coleta de dados
Tratou-se de uma pesquisa prospectiva descritiva e analiacutetica Os dados epidemioloacutegicos
foram coletados dos pacientes admitidos com histoacuteria de exposiccedilatildeo e ou intoxicaccedilatildeo por
medicamentos no Hospital de Emergecircncia e Trauma de Campina Grande atendidos e notificados
pelo Centro de Informaccedilatildeo Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) nos meses de agosto
e setembro de 2012 Utilizou-se a ficha do Sistema Nacional de Agravos de Notificaccedilatildeo
(Sinan)MS para a coleta dos dados epidemioloacutegicos desses pacientes (Anexo A)
312 Variaacuteveis demograacuteficas e socioeconocircmicas
Gecircnero
Faixa Etaacuteria
Ocupaccedilatildeo
313 Variaacuteveis relativas ao evento
Circunstacircncia
314 Variaacutevel relativa ao Agente Toacutexico
Os grupos de medicamentos foram classificados em categorias terapecircuticas segundo o
Anatomical-Therapeutical-ChemicalClassification System (ATC)
Os medicamentos pertencentes ao nono niacutevel dessa classificaccedilatildeo satildeo classificados como
os medicamentos que atuam no sistema nervoso central representado pela letra N Neste niacutevel
estatildeo incluiacutedos os psicodisleacutepticos ansioliacuteticos (NO5B) antipsicoacuteticos (NO5A) hipnoacutetico-
sedativos (NO5C) e os psicoanaleacutepticos antidepressivos (NO6A) e
estimulantespsicoestimulantes (NO6B)
315 Variaacuteveis relativas agrave intoxicaccedilatildeo
Avaliar os sinais e sintomas
Classificar os casos quanto agrave gravidade
10
Quanto ao item gravidade adotamos o seguinte criteacuterio com base no trabalho de King e
Palmisano 1989
Grave o paciente que permanece internado apoacutes procedimentos do tipo lavagem gaacutestrica
ou observaccedilatildeo meacutedica
Moderada ocorre algum procedimento do tipo lavagem gaacutestrica ou observaccedilatildeo meacutedica
mas sem internaccedilatildeo
Leve a famiacutelia recebe somente orientaccedilatildeo ou acompanhamento por telefone e nenhum
procedimento
Ignorada natildeo eacute possiacutevel classificar a extensatildeo do dano
Evoluccedilatildeo
Alta meacutedica (Cura)
Transferecircncia para outra unidade hospitalar
Ignorado
Oacutebito
32 DADOS EXPERIMENTAIS
321 Ensaios de Desenvolvimento e Validaccedilatildeo da Metodologia
Local da Pesquisa Laboratoacuterio de Desenvolvimento e Certificaccedilatildeo de Biomaterias do
Nordeste unidades da UEPB e UFCG
Materiais
Solventes reagentes e outros aparatos
-Alprazolam (faacutermaco) doaccedilatildeo feita pelo Nuacutecleo de odontologia e medicina Legal - NUMOL
-Medicamento (Medley) Alprazolam
-Acetona Vetec
11
-Clorofoacutermio Vetec
-Sulfato de Soacutedio Anidro Vetec
-Metanol (HPLC) Paneac
-Placas de Siacutelica Gel ALUGRAM SIL G 60F de (20x20) cm
2 foram adquiridas da Macherey-
Nagel (REF 818033)
-Cubas Cromatograacuteficas
-Papel de filtro Qualy
Equipamentos
-Estufa Med Clav
-Banho de Ultra-Som ULTRAsonic 1440A
-Centrifuga DCS-16 RV
-Cacircmera de Luz UV (λ=264nm)
-Espectrocircmetro FTIR SPECTRUM 400 Perkin-Elmer (4000 a 600 cm-1 para anaacutelise das
caracteriacutesticas do grupos funcionais dos faacutermacos)
322 Preparaccedilatildeo dos padrotildees
As soluccedilotildees estoque do faacutermaco foram preparadas pela dissoluccedilatildeo de cada composto em
metanol para obter a concentraccedilatildeo de 400 microg mL
323 Preparaccedilatildeo das Amostras
Procedimento de Extraccedilatildeo Extraccedilatildeo Liacutequido-Liacutequido (ELL)
Na fase de desenvolvimento do meacutetodo um importante passo foi a retirada dos
interferentes das amostras Para isto foram realizados vaacuterios procedimentos de Clean-up usando
ELL Para a ELL foi usado o meacutetodo de Stas-Otto que considera o caraacuteter aacutecidobase de cada
substacircncia do meio em que essa se encontra o seu grau de ionizaccedilatildeo como fatores influentes em
sua solubilidade em solventes orgacircnicos pois a partir de mistura desses em proporccedilotildees
adequadas pode-se submeter agraves amostras agrave ELL (FIGURA 01)
Terminada a extraccedilatildeo por sonicaccedilatildeo ou centrifugaccedilatildeo a fase orgacircnica foi recolhida
evaporada e ressuspendida para anaacutelise cromatograacutefica e espectrofotomeacutetrica
12
324 Teacutecnicas
Anaacutelise por CCD
A anaacutelise por CCD foi baseada na metodologia claacutessica descrita por Moraes (1991) com
adaptaccedilatildeo
Os resiacuteduos obtidos por ELL foram ressuspendidos em MetanolAacutegua (91) e aplicados
nas placas cromatograacuteficas previamente ativadas em estufas a 105ordmC por 30 minutos Aplicaram-
se nas placas aliacutequotas de 20 microL dos extratos obtidos por ELL Foi utilizado o sistema solvente
constituiacutedo de mistura de clorofoacutermio-metanol (91) e clorofoacutermio-acetona (41)
Os cromatogramas foram revelados usando meacutetodos quiacutemicos (agentes cromogecircnicos
Reativo de Dragendorff Difenilcarbazona Nitrato de Prata 1 e Cloreto Feacuterrico 5) e meacutetodo
fiacutesico (Cacircmera de Luz UV (λ=264nm)
Figura 01 - Esquema de extraccedilatildeo amostras
FONTE MORAES 1991
325 Estudo de seletividade e recuperaccedilatildeo
Seletividade
A seletividade do meacutetodo foi avaliada atraveacutes da extraccedilatildeo de 6 amostras diferentes de
urinas (n=6) por LLE e depois analisadas por CCDC
25 ml
13
Recuperaccedilatildeo
A extraccedilatildeo para avaliar a recuperaccedilatildeo foi realizada pela anaacutelise de amostras em
triplicatas contaminadas (fortificadas) em trecircs concentraccedilotildees do padratildeo de Alprazolam (baixa=
100microgml meacutedia=200 microgml e alta= 400 microgml)
326 O Limite de Detecccedilatildeo (LD) e o Limite de Quantificaccedilatildeo (LQ)
O Limite de Detecccedilatildeo eacute a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser
detectada mas natildeo necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento
experimental O Limite de Quantificaccedilatildeo eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia
em exame que pode ser medida utilizando um determinado procedimento experimental
O LD foi determinado por anaacutelise de urina contaminada em concentraccedilotildees decrescentes
de faacutermaco e medicamento ateacute a concentraccedilatildeo possiacutevel de se detectar a presenccedila de ambos O LQ
foi determinado por analise de urina contaminada em concentraccedilotildees decrescentes de faacutermaco e
medicamento ateacute a concentraccedilatildeo possiacutevel de se quantificar a presenccedila de ambos
327 Robustez
Na avaliaccedilatildeo da robustez foram utilizados como solventes o metanol a aacutegua uma soluccedilatildeo
de clorofoacutermio- acetona (41) e uma soluccedilatildeo de clorofoacutermio-metanol (91) para preparaccedilatildeo dos
padrotildees de Alprazolam
328 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier - FTIR
Foram feitas anaacutelises de soluccedilotildees metanoacutelicas ( 10 mgmL n=3) do faacutermaco padratildeo e suas
extraccedilotildees utilizando a faixa de varredura de 4000 a 500 cm-1
em temperatura ambiente
4 DADOS E ANAacuteLISE DA PESQUISA
41 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
No periacuteodo de agosto a setembro de 2012 o Ceatox-CG registrou 28 casos com histoacuteria
de intoxicaccedilatildeo por medicamentos Destes 18 casos foram classificados como
14
neuropsicofaacutermacos Na anaacutelise dos casos do uso isolado de medicamentos os Antiepileacutepticos
assim como os Ansioliticos foram os responsaacuteveis pelo maior nuacutemero de ocorrecircncias com um
percentual de 22 (n=4) cada um Um estudo realizado com crianccedilas no estado de Mato Grosso
do Sul verificou que os anticonvulsivantes foram os principais responsaacuteveis pelos eventos toacutexicos
por medicamentos que agem no SNC (MATOS et al 2008)
Ao analisarmos as associaccedilotildees de medicamentos (n=7-39) nos chama a atenccedilatildeo o
nuacutemero de ocorrecircncias por tentativa de suiciacutedio (n=10-557) Bernades Turini e Matsuo
(2010) afirmam que pacientes que tentam suiciacutedio em sua grande maioria fazem uso de mais de
um tipo de substacircncia quiacutemica ndash medicamentosa ou natildeo ndash quando o meacutetodo eacute a intoxicaccedilatildeo
voluntaacuteria
Os eventos toxicoloacutegicos foram mais comuns em mulheres (556) por tentativa de
suiciacutedio (557) e entre adultos e jovens (389) (Tabela 01) Um estudo realizado entre os anos
de 1997 e 2007 no Centro de Controle de Intoxicaccedilatildeo (CCI) em Londrina Paranaacute analisando as
tentativas de suiciacutedio por sobredose intencional de medicamentos com relaccedilatildeo ao gecircnero condiz
com dados aqui obtidos (BERNADES TURINI MATZUO 2010) Por outro lado Gandolfi e
Andrade (2006) mostra o ldquoacidente individualrdquo como principal fator responsaacutevel pelas exposiccedilotildees
toacutexicas a medicamentos em Satildeo Paulo seguido pela tentativa de suiciacutedio
Graacutefico 01 - Grupos farmacoloacutegicos de acordo com a classificaccedilatildeo da ATC responsaacuteveis pelas
intoxicaccedilotildees registradas no Ceatox-CG entre agosto a setembro de 2012 (N= 18)
2239
1722
Associaccedilotildees
N05A
N03A
N05B
NOTA N05A Antipsicoacuteticos N03A Antiepileacuteptico NO5B Ansioliacuteticos e associaccedilatildeo
15
Acerca da ocupaccedilatildeo dos pacientes os estudantes foram os mais frequentes (n=6-333)
Este dado entra em desacordo com a mesma variaacutevel analisada no estudo de Turini et al (2010)
em que mostra que a ocupaccedilatildeo mais relevante nos seu estudo eacute a de empregado (Tabela 01)
Observando-se os sinais e sintomas das intoxicaccedilotildees as Siacutendromes Toacutexicas por
Superdosagem de Sedativos (pupilas mioacuteticas tremor hipotensatildeo confusatildeo mental e sonolecircncia)
e a Extrapiramidal (choro monoacutetono opistoacutetomo e distonia) foram predominantes O quadro
toacutexico se desenvolve dependendo da dose do subgrupo terapecircutico e do tempo entre a exposiccedilatildeo
e o atendimento Os ansioliacuteticos principalmente os Benzodiazepiacutenicos (BZD) satildeo compostos
que apresentam maior iacutendice terapecircutico e menor potencialidade de provocar acidentes fatais e
menor tendecircncia para produzir toleracircncia farmacoloacutegica (FORSAN 2010)
Tabela 01 ndash Frequecircncia do tipo de circunstacircncia da faixa etaacuteria do gecircnero e da ocupaccedilatildeo dos pacientes intoxicados
atendidos no Ceatox-CG
Variaacutevel
N
Circunstacircncia (N=18)
Tentativa de Suiciacutedio 10 557
Acidental 1 57
Outra 7 389
Faixa Etaacuteria (anos) (N=18)
1---9 3 166
10---19 5 278
20---39 7 389
gt 40 3 167
Gecircnero (N=18)
Masculino 8 444
Feminino 10 556
Ocupaccedilatildeo (N=18)
Estudante 6 333
Do lar 4 222
Outra 8 444
16
Em relaccedilatildeo agrave variaacutevel evoluccedilatildeo natildeo se registrou nenhum oacutebito no periacuteodo estudado
Dados nacionais entre os anos de 2007 a 2009 mostram que os medicamentos apresentaram
baixo coeficiente de letalidade meacutedio quando comparado aos agrotoacutexicos de uso agriacutecola e as
drogas de abuso (SISTEMA2012) Um estudo realizado por Mota et al (2012) usando dados
secundaacuterios do Sistema Informaccedilatildeo de Mortalidade (SIM)MS entre 1996 a 2005 identificou
4403 oacutebitos relacionados a medicamentos entretanto natildeo foi possiacutevel estabelecer qual a
principal classe de medicamentos nem o princiacutepio ativo envolvido com o agravo
42 Dados Experimentais
Para otimizaccedilatildeo do meacutetodo vaacuterios procedimentos foram realizados seguindo os
paracircmetros analiacuteticos de validaccedilatildeo objetivando detectar a presenccedila de Alprazolam em urina de
paciente com histoacuterico de exposiccedilatildeo toxica a esse faacutermaco A metodologia desenvolvida e
validada mostrou-se em conformidade com as especificaccedilotildees da Resoluccedilatildeo RDC nordm899 de 29 de
maio de 2003 (BRASIL 2003)
Na avaliaccedilatildeo da seletividade nas amostras de urina analisadas natildeo foram detectados
interferentes nas condiccedilotildees de extraccedilatildeo estabelecidas Assim o meacutetodo mostrou-se seletivo jaacute
que as amostras natildeo mostraram nenhum spot(mancha) semelhante aos desenvolvidos pelos
padrotildees No processo de validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos a especificidade ou seletividade eacute o
primeiro passo para o desenvolvimento de um meacutetodo este paracircmetro deve ser avaliado
continuamente para assegurar a precisatildeo e exatidatildeo deste durante sua validaccedilatildeo (SILVA et al
2010) (Tabela 02)
Para os ensaios de recuperaccedilatildeo foi observada a intensidade do spot desenvolvido em cada
amostra para cada niacutevel de fortificaccedilatildeo Nas amostras fortificadas com 200 microg do padratildeo
obtivemos uma recuperaccedilatildeo de 917 enquanto que nas amostras fortificadas com 400 microg do
mesmo o percentual meacutedio obtido foi de 967 demonstrando assim a exatidatildeo do meacutetodo
Segundo a Resoluccedilatildeo RDC nordm 899 de 29 de maio de 2003 a exatidatildeo se daacute pela concordacircncia
entre o resultado de um ensaio e um valor de referecircncia
17
Tabela 02 ndash Avaliaccedilatildeo da seletividade comparando-se spot e Rf (Relative Front) dos padrotildees de
Alprazolam e amostras branco
Sistema-solvente Agente cromogecircnico
Clorofoacutermio-metanol(91v v)
DI
Clorofoacutermio-acetona(41vv)
DI
FaacutermacoAmostras Rf e Cor Rf e Cor
Padratildeo Alprazolam faacutermaco
Padratildeo Alprazolam comprimido
ABal1
ABal2
ABal3
ABal4
ABal5
05 + c
026 + c
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Nota DI = Dragendorff iodado ABal = amostra branco alcalina Rf = fator de retenccedilatildeo c = cor
castanha
O Limite de Detecccedilatildeo e o Limite de Quantificaccedilatildeo para o Alprazolam foram de
100microgmL e 200 microgmL respectivamente Ribani et al (2004) define o Limite de Detecccedilatildeo (LD)
como sendo a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser detectada mas natildeo
necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento experimental O Limite
de Quantificaccedilatildeo (LQ) eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode
ser medida utilizando um determinado procedimento experimental (Figura 01)
O meacutetodo de extraccedilatildeo utilizado particcedilatildeo liacutequido-liacutequido demonstrou-se eficaz pois a
solubilidade do faacutermaco avaliado possui uma elevada afinidade pela mistura de solventes
utilizados nesse procedimento Na separaccedilatildeo do analito da matriz a sonicaccedilatildeo que eacute o processo
que utiliza a energia das ondas sonoras mais comumente a ultrassom se mostrou mais eficaz que
a centrifugaccedilatildeo
O sistema formado pelos solventes clorofoacutermio-metanol (91 vv) obteve o melhor
resultado em relaccedilatildeo ao sistema solvente clorofoacutermio-acetona(41 vv) tendo em vista melhor
resultado na separaccedilatildeo dos padrotildees e amostras
18
Figura 01-Identificaccedilatildeo de Alprazolam em trecircs niacuteveis de fortificaccedilatildeo (n = 3) alta meacutedia e baixa
Dentre os agentes cromogecircnicos utilizados na revelaccedilatildeo apenas o Reativo de Dragendorff
se mostrou eficaz Observou-se atraveacutes do meacutetodo fiacutesico utilizando a Cacircmera de Luz UV que o
Alprazolam faacutermaco e o Alprazolam comprimido natildeo transmite fluorescecircncia no comprimento
de onda de 366nm
Para avaliaccedilatildeo da Robustez as soluccedilotildees-padratildeo (faacutermaco e medicamento) foram
dissolvidas em diversos solventes como apresentado na Tabela 03 O metanol foi o solvente em
que houve revelaccedilatildeo na placa cromatograacutefica tanto do faacutermaco como do medicamento
Tabela 03 - Anaacutelise dos diferentes solventes da soluccedilatildeo estoque padratildeo puro do faacutermaco e do medicamento de
Alprazolam a partir do Rf
NOTA Rf = Relative Front spot= cormancha
Solvente Alprazolam faacutermaco Alprazolam medicamento
Rf Rf
Metanol 05 026
Aacutegua 06 -
ClorofoacutermioAcetona
(41)
056 -
ClorofoacutermioMetanol
(41)
052 -
AMOSTRAS
PADRAtildeO
19
Os testes de robustez satildeo de fundamental importacircncia para que os analistas conheccedilam
quais fatores devem ser estritamente controlados durante a execuccedilatildeo de um meacutetodo Se as
alteraccedilotildees das condiccedilotildees de anaacutelise produzirem resultados dentro dos limites aceitaacuteveis de
seletividade exatidatildeo e precisatildeo o meacutetodo pode ser considerado robusto e tais variaccedilotildees podem
ser incorporadas ao procedimento (CASSIANO et al 2009)
Apesar do meacutetodo ter se mostrado seletivo para o Alprazolam ele natildeo eacute especifico apenas
para esse faacutermaco Sendo assim o meacutetodo foi aplicado em 7 (sete) amostras de pacientes com
histoacuterico de exposiccedilatildeo toacutexica por medicamentos atendidos pelo Centro de Informaccedilatildeo
Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) poreacutem natildeo foi possiacutevel obter a recuperaccedilatildeo dos
faacutermacos Acredita-se que a quantidade ingerida dos medicamentos pelos pacientes foi baixa ou
que pela demora da coleta da amostra os faacutermacos tenham sido metabolizado pelo organismo
Nos ensaios de confirmaccedilatildeo por FTIR observou-se que o Alprazolam padratildeo apresentou as
seguintes vibraccedilotildees moleculares A deformaccedilatildeo angular N-H de amina secundaacuteria eacute observada na
banda em 1660 cm-1
Em 1647 cm-1
aparece uma banda que pode ser atribuiacuteda ao estiramento
C=N da imina e em 1397 cm-1
aparece uma banda atribuiacuteda ao estiramento C-N das aminas A
banda caracteriacutestica do estiramento =C-H de carbono sp2 do anel aromaacutetico se encontra em 3275
cm-1
O espectro do faacutermaco extraiacutedo da matriz bioloacutegica mantecircm as mesmas caracteriacutesticas do
faacutermaco padratildeo Dessa forma podemos afirmar que a moleacutecula natildeo sofreu alteraccedilatildeo durante o
processo de extraccedilatildeo (Figura 02)
Figura 02 - Espectro da analise no FTIR do padratildeo de Alprazolam faacutermaco e de amostra extraiacuteda
20
5 CONCLUSAtildeO
O meacutetodo demonstrou atender aos requisitos de boas praacuteticas exigidos pela Resoluccedilatildeo
RDC 899 de 29 de maio de 2003 sendo exato e sensiacutevel
Dentre as amostras de pacientes intoxicados por medicamentos natildeo se obteve resultados
positivos para o Alprazolam
Os medicamentos constituem como um dos principais meios utilizado para tentativa de
suiciacutedio tendecircncia que eacute observada nos paiacuteses de terceiro mundo entre eles os psicofaacutermacos os
mais utilizados Haacute necessidade de uma melhor formaccedilatildeo e atualizaccedilatildeo dos profissionais assim
como de informaccedilatildeo aos usuaacuterios e medidas de prevenccedilatildeo que poderiam alertar sobre os riscos e
monitorar o uso desses medicamentos
O Brasil em agosto de 2006 deu o primeiro passo lanccedilando a Portaria nordm 1876 com as
diretrizes nacionais para Prevenccedilatildeo do Suiciacutedio nas trecircs esferas da gestatildeo Portanto estudar e
prevenir as tentativas de suiciacutedio eacute um desafio pois envolve recursos financeiros e sensibilidade
da parte dos profissionais envolvidos
Por outro lado aleacutem do conhecimento dos dados epidemioloacutegicos eacute necessaacuteria a
identificaccedilatildeo dos grupos terapecircuticos responsaacuteveis pelas intoxicaccedilotildees As teacutecnicas
cromatograacuteficas e espectrofotomeacutetricas possuem uma extensa aplicabilidade em pesquisas
cientiacuteficas anaacutelise quiacutemica teste de controle de qualidade de medicamentos entre outros Isso se
daacute por serem teacutecnicas altamente sensiacuteveis de alta resoluccedilatildeo e por ser um meacutetodo mais raacutepido e
preciso Ao analisar traccedilos de compostos em amostras complexas como sangue e urina as
anaacutelises toxicoloacutegicas auxiliam no prognoacutestico e diagnoacutestico de intoxicaccedilotildees uma vez que eacute
possiacutevel identificaccedilatildeo destes compostos em amostras bioloacutegicas
O meacutetodo por CCDC tem caraacuteter semindashquantitativo jaacute que a quantificaccedilatildeo dos faacutermacos eacute
baseada apenas na comparaccedilatildeo visual dos ldquoSpotsrdquo das amostras e dos padrotildees Embora o meacutetodo
seja adequado para triagem os resultados mostram que a quantificaccedilatildeo de faacutermacos por meacutetodos
baseados no uso de CCDC deve possuir uma interpretaccedilatildeo bem cautelosa especialmente devido agrave
incerteza associada a este tipo de comparaccedilatildeo
Se faz necessaacuterio a confirmaccedilatildeo da identidade do faacutermaco por outras teacutecnicas eou outros
meacutetodos de anaacutelise como a Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia (CLAE) e Cromatografia
21
Gasosa (CG) sendo assim possiacutevel correlacionar os perfis cromatograacuteficos entre as diferentes
teacutecnicas
ABSTRACT
The medicines are presented as the main toxic agent responsible for cases of human poisoning
thus constituting a major challenge for those working with Public Health However the absence
of a specialized toxicological analysis hinders a more accurate diagnosis of cases The
spectrophotometric and chromatographic techniques may assist in confirming the diagnosis A
Comparative Thin Layer Chromatography (CCDC) is a separation technique simple low cost and
good sensitivity The identification of the drug can be achieved both quantitatively and
qualitatively by infrared spectroscopy Fourier transform (FTIR) This research proposal was to
evaluate two techniques for identification of Alprazolam in urine of patients with toxic exposure
to drugs assessing the selectivity accuracy limit of detection limit of quantification and
robustness in chromatographic techniques The method was optimized validated and applied in
accordance with Resolution RDC Nordm 899 of May 29 2003 The chromatographic assay used
plates of Silica Gel G-60 elution with chloroform-methanol 91 (v v) and as a chromogenic
agent the Reactive Dragendorff The presence of the drug was confirmed by the FTIR analysis
The method proved to be selective chromatographic conditions established by presenting Limit
Detection and Quantification 200μgml and 100μgml respectively Among the patient samples
drug poisoning no positive results obtained for Alprazolam The FTIR analysis showed that the
drug did not undergo degradation in the extraction process The method has proven to meet the
requirements of good practice required by RDC Nordm 899 of 29 May 2003 being sensitive and
accurate
KEYWORDS Alprazolam Spectroscopy Chromatography Intoxication
REFEREcircNCIAS
AMERICAN ASSOCIATION OF POISON CENTERS TOXIC EXPOSURE SURVEILLANCE
SYSTEM (AAPCC) Disponivel em lt httpwwwaapccorgdnndefaultaspx gt acessado em 18
de setembro de 2012
22
AMEacuteRICO M A MOSSIN S A G NISHIYAMA P Perfil de faacutermacos por
espectrofotometria no ultravioleta Revista Brasileira de Anaacutelises Cliacutenicas Paranaacute v 40 n 4
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AUCHEWSKI L et al Avaliaccedilatildeo da orientaccedilatildeo meacutedica sobre os efeitos colaterais de
benzodiazepiacutenicos Revista Brasileira de Psiquiatria v 26 n 1 p 24-31 2004
BERNADES S S TURINI C A MATSUO T Perfil das tentativas de suiciacutedio por sobredose
intencional de medicamentos atendidas por um Centro de Controle de intoxicaccedilotildees do Paranaacute
Brasil Caderno de Sauacutede Puacuteblica Rio de Janeiro v 26 n 7 p 1366-1372 jul 2010
BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) Resoluccedilatildeo
- RDC Nordm 899 de 29052003 Dispotildee sobre o Guia para validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos e
bioanaliacuteticos Diaacuterio Oficial [da] Republica Repuacuteblica Federativa do Brasil Brasiacutelia DF 02 de
junho de 2003
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27
ANEXO A
28
7
em virtude do maior iacutendice terapecircutico dessas substacircncias menor potencialidade de provocar
acidentes fatais e menor tendecircncia para produzir siacutendromes de abstinecircncia e toleracircncia
farmacoloacutegica (FORSAN 2010)
Embora sejam drogas relativamente seguras restriccedilotildees agrave sua utilizaccedilatildeo tecircm sido cada vez
maiores devido agrave incidecircncia dos efeitos colaterais relacionados agrave depressatildeo do sistema nervoso
central Dentre eles os principais satildeo a diminuiccedilatildeo da atividade psicomotora o prejuiacutezo na
memoacuteria a desinibiccedilatildeo paradoxal e a potencializaccedilatildeo do efeito depressor pela interaccedilatildeo com
outras drogas depressoras principalmente o aacutelcool Aleacutem disso a depressatildeo e a distimia (tipo de
depressatildeo crocircnica) podem ocorrer consequumlentemente ao uso de alprazolam e clonazepam
(LACERDA et al 2004)
Esta classe de faacutermacos constitui a primeira causa de exposiccedilotildees toacutexicas dentre os outros
grupos de medicamentos em nosso meio No entanto as intoxicaccedilotildees por essa classe
farmacoloacutegica excepcionalmente tecircm evoluccedilatildeo letal Exercem accedilatildeo sobre o sistema nervoso
central atraveacutes da ligaccedilatildeo aos receptores benzodiazepiacutenicos no complexo do receptor dos canais
de cloro do Aacutecido Gama-Aminobutiacuterico (GABA) As principais manifestaccedilotildees das intoxicaccedilotildees
por benzodiazepiacutenicos satildeo a depressatildeo neuroloacutegica da resposta ventilatoacuteria ao CO2 e diminuiccedilatildeo
da frequecircncia respiratoacuteria (OLIVEIRA et al 2010)
O diagnoacutestico das intoxicaccedilotildees pode ser realizado atraveacutes da histoacuteria do paciente
(anamnese) dos sinais cliacutenicos e laboratoriais
8
A Cromatografia em Camada Delgada (CCD) eacute uma teacutecnica de adsorccedilatildeo do tipo soacutelido-
liacutequida Nesse caso a separaccedilatildeo se daacute pela diferenccedila de afinidade dos componentes de uma
mistura pela fase estacionaacuteria (DEGANI CASS VIEIRA 1998) A fase estacionaacuteria
corresponde a uma camada fina formada por um soacutelido granulado geralmente siacutelica depositado
sobre uma placa de vidro alumiacutenio ou outro suporte inerte Este meacutetodo merece atenccedilatildeo especial
pela sua versatilidade rapidez sensibilidade e nitidez das separaccedilotildees (EIZENDEHER 2005)
A Espectroscopia Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) pode ser usada para
identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo de compostos orgacircnicos inorgacircnicos e polimeacutericos Basicamente o
que se mede nesta anaacutelise eacute a fraccedilatildeo da energia transmitida ou absorvida em relaccedilatildeo agrave incidente
em determinado comprimento de onda ou nuacutemero de onda (EVORA et al 2002)
A espectrometria FTIR permite a determinaccedilatildeo automatizada dos paracircmetros de maior
importacircncia na caracterizaccedilatildeo de amostras Hoje os instrumentos de FTIR satildeo informatizados o
que os torna mais raacutepidos e mais sensiacuteveis do que os instrumentos mais antigos dispersivos Ele
pode ser aplicado agrave anaacutelise de soacutelidos liacutequidos e gases Trata-se de uma metodologia que origina
rapidamente uma informaccedilatildeo sumaacuteria de 30 segundos por amostra eacute uma teacutecnica natildeo poluente jaacute
que natildeo utiliza reagentes aleacutem de natildeo necessitar de pessoal especializado para ser operada em
rotina (MOREIRA MARCOS BARROS 2002)
Para garantir que um novo meacutetodo analiacutetico gere informaccedilotildees confiaacuteveis e interpretaacuteveis
sobre a amostra ele deve passar por um processo de validaccedilatildeo A validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos
eacute o processo pelo qual eacute estabelecido por estudos de laboratoacuterio que as caracteriacutesticas
executadas do meacutetodo satisfazem aos requisitos para as aplicaccedilotildees analiacuteticas praticadas (RIBANI
et al2004 VALENTINI SOMMER MATIOLI 2007)
3 REFERENCIAL METODOLOacuteGICO
31 Dados epidemioloacutegicos
9
311 Delineamento do estudo e instrumento de coleta de dados
Tratou-se de uma pesquisa prospectiva descritiva e analiacutetica Os dados epidemioloacutegicos
foram coletados dos pacientes admitidos com histoacuteria de exposiccedilatildeo e ou intoxicaccedilatildeo por
medicamentos no Hospital de Emergecircncia e Trauma de Campina Grande atendidos e notificados
pelo Centro de Informaccedilatildeo Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) nos meses de agosto
e setembro de 2012 Utilizou-se a ficha do Sistema Nacional de Agravos de Notificaccedilatildeo
(Sinan)MS para a coleta dos dados epidemioloacutegicos desses pacientes (Anexo A)
312 Variaacuteveis demograacuteficas e socioeconocircmicas
Gecircnero
Faixa Etaacuteria
Ocupaccedilatildeo
313 Variaacuteveis relativas ao evento
Circunstacircncia
314 Variaacutevel relativa ao Agente Toacutexico
Os grupos de medicamentos foram classificados em categorias terapecircuticas segundo o
Anatomical-Therapeutical-ChemicalClassification System (ATC)
Os medicamentos pertencentes ao nono niacutevel dessa classificaccedilatildeo satildeo classificados como
os medicamentos que atuam no sistema nervoso central representado pela letra N Neste niacutevel
estatildeo incluiacutedos os psicodisleacutepticos ansioliacuteticos (NO5B) antipsicoacuteticos (NO5A) hipnoacutetico-
sedativos (NO5C) e os psicoanaleacutepticos antidepressivos (NO6A) e
estimulantespsicoestimulantes (NO6B)
315 Variaacuteveis relativas agrave intoxicaccedilatildeo
Avaliar os sinais e sintomas
Classificar os casos quanto agrave gravidade
10
Quanto ao item gravidade adotamos o seguinte criteacuterio com base no trabalho de King e
Palmisano 1989
Grave o paciente que permanece internado apoacutes procedimentos do tipo lavagem gaacutestrica
ou observaccedilatildeo meacutedica
Moderada ocorre algum procedimento do tipo lavagem gaacutestrica ou observaccedilatildeo meacutedica
mas sem internaccedilatildeo
Leve a famiacutelia recebe somente orientaccedilatildeo ou acompanhamento por telefone e nenhum
procedimento
Ignorada natildeo eacute possiacutevel classificar a extensatildeo do dano
Evoluccedilatildeo
Alta meacutedica (Cura)
Transferecircncia para outra unidade hospitalar
Ignorado
Oacutebito
32 DADOS EXPERIMENTAIS
321 Ensaios de Desenvolvimento e Validaccedilatildeo da Metodologia
Local da Pesquisa Laboratoacuterio de Desenvolvimento e Certificaccedilatildeo de Biomaterias do
Nordeste unidades da UEPB e UFCG
Materiais
Solventes reagentes e outros aparatos
-Alprazolam (faacutermaco) doaccedilatildeo feita pelo Nuacutecleo de odontologia e medicina Legal - NUMOL
-Medicamento (Medley) Alprazolam
-Acetona Vetec
11
-Clorofoacutermio Vetec
-Sulfato de Soacutedio Anidro Vetec
-Metanol (HPLC) Paneac
-Placas de Siacutelica Gel ALUGRAM SIL G 60F de (20x20) cm
2 foram adquiridas da Macherey-
Nagel (REF 818033)
-Cubas Cromatograacuteficas
-Papel de filtro Qualy
Equipamentos
-Estufa Med Clav
-Banho de Ultra-Som ULTRAsonic 1440A
-Centrifuga DCS-16 RV
-Cacircmera de Luz UV (λ=264nm)
-Espectrocircmetro FTIR SPECTRUM 400 Perkin-Elmer (4000 a 600 cm-1 para anaacutelise das
caracteriacutesticas do grupos funcionais dos faacutermacos)
322 Preparaccedilatildeo dos padrotildees
As soluccedilotildees estoque do faacutermaco foram preparadas pela dissoluccedilatildeo de cada composto em
metanol para obter a concentraccedilatildeo de 400 microg mL
323 Preparaccedilatildeo das Amostras
Procedimento de Extraccedilatildeo Extraccedilatildeo Liacutequido-Liacutequido (ELL)
Na fase de desenvolvimento do meacutetodo um importante passo foi a retirada dos
interferentes das amostras Para isto foram realizados vaacuterios procedimentos de Clean-up usando
ELL Para a ELL foi usado o meacutetodo de Stas-Otto que considera o caraacuteter aacutecidobase de cada
substacircncia do meio em que essa se encontra o seu grau de ionizaccedilatildeo como fatores influentes em
sua solubilidade em solventes orgacircnicos pois a partir de mistura desses em proporccedilotildees
adequadas pode-se submeter agraves amostras agrave ELL (FIGURA 01)
Terminada a extraccedilatildeo por sonicaccedilatildeo ou centrifugaccedilatildeo a fase orgacircnica foi recolhida
evaporada e ressuspendida para anaacutelise cromatograacutefica e espectrofotomeacutetrica
12
324 Teacutecnicas
Anaacutelise por CCD
A anaacutelise por CCD foi baseada na metodologia claacutessica descrita por Moraes (1991) com
adaptaccedilatildeo
Os resiacuteduos obtidos por ELL foram ressuspendidos em MetanolAacutegua (91) e aplicados
nas placas cromatograacuteficas previamente ativadas em estufas a 105ordmC por 30 minutos Aplicaram-
se nas placas aliacutequotas de 20 microL dos extratos obtidos por ELL Foi utilizado o sistema solvente
constituiacutedo de mistura de clorofoacutermio-metanol (91) e clorofoacutermio-acetona (41)
Os cromatogramas foram revelados usando meacutetodos quiacutemicos (agentes cromogecircnicos
Reativo de Dragendorff Difenilcarbazona Nitrato de Prata 1 e Cloreto Feacuterrico 5) e meacutetodo
fiacutesico (Cacircmera de Luz UV (λ=264nm)
Figura 01 - Esquema de extraccedilatildeo amostras
FONTE MORAES 1991
325 Estudo de seletividade e recuperaccedilatildeo
Seletividade
A seletividade do meacutetodo foi avaliada atraveacutes da extraccedilatildeo de 6 amostras diferentes de
urinas (n=6) por LLE e depois analisadas por CCDC
25 ml
13
Recuperaccedilatildeo
A extraccedilatildeo para avaliar a recuperaccedilatildeo foi realizada pela anaacutelise de amostras em
triplicatas contaminadas (fortificadas) em trecircs concentraccedilotildees do padratildeo de Alprazolam (baixa=
100microgml meacutedia=200 microgml e alta= 400 microgml)
326 O Limite de Detecccedilatildeo (LD) e o Limite de Quantificaccedilatildeo (LQ)
O Limite de Detecccedilatildeo eacute a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser
detectada mas natildeo necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento
experimental O Limite de Quantificaccedilatildeo eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia
em exame que pode ser medida utilizando um determinado procedimento experimental
O LD foi determinado por anaacutelise de urina contaminada em concentraccedilotildees decrescentes
de faacutermaco e medicamento ateacute a concentraccedilatildeo possiacutevel de se detectar a presenccedila de ambos O LQ
foi determinado por analise de urina contaminada em concentraccedilotildees decrescentes de faacutermaco e
medicamento ateacute a concentraccedilatildeo possiacutevel de se quantificar a presenccedila de ambos
327 Robustez
Na avaliaccedilatildeo da robustez foram utilizados como solventes o metanol a aacutegua uma soluccedilatildeo
de clorofoacutermio- acetona (41) e uma soluccedilatildeo de clorofoacutermio-metanol (91) para preparaccedilatildeo dos
padrotildees de Alprazolam
328 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier - FTIR
Foram feitas anaacutelises de soluccedilotildees metanoacutelicas ( 10 mgmL n=3) do faacutermaco padratildeo e suas
extraccedilotildees utilizando a faixa de varredura de 4000 a 500 cm-1
em temperatura ambiente
4 DADOS E ANAacuteLISE DA PESQUISA
41 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
No periacuteodo de agosto a setembro de 2012 o Ceatox-CG registrou 28 casos com histoacuteria
de intoxicaccedilatildeo por medicamentos Destes 18 casos foram classificados como
14
neuropsicofaacutermacos Na anaacutelise dos casos do uso isolado de medicamentos os Antiepileacutepticos
assim como os Ansioliticos foram os responsaacuteveis pelo maior nuacutemero de ocorrecircncias com um
percentual de 22 (n=4) cada um Um estudo realizado com crianccedilas no estado de Mato Grosso
do Sul verificou que os anticonvulsivantes foram os principais responsaacuteveis pelos eventos toacutexicos
por medicamentos que agem no SNC (MATOS et al 2008)
Ao analisarmos as associaccedilotildees de medicamentos (n=7-39) nos chama a atenccedilatildeo o
nuacutemero de ocorrecircncias por tentativa de suiciacutedio (n=10-557) Bernades Turini e Matsuo
(2010) afirmam que pacientes que tentam suiciacutedio em sua grande maioria fazem uso de mais de
um tipo de substacircncia quiacutemica ndash medicamentosa ou natildeo ndash quando o meacutetodo eacute a intoxicaccedilatildeo
voluntaacuteria
Os eventos toxicoloacutegicos foram mais comuns em mulheres (556) por tentativa de
suiciacutedio (557) e entre adultos e jovens (389) (Tabela 01) Um estudo realizado entre os anos
de 1997 e 2007 no Centro de Controle de Intoxicaccedilatildeo (CCI) em Londrina Paranaacute analisando as
tentativas de suiciacutedio por sobredose intencional de medicamentos com relaccedilatildeo ao gecircnero condiz
com dados aqui obtidos (BERNADES TURINI MATZUO 2010) Por outro lado Gandolfi e
Andrade (2006) mostra o ldquoacidente individualrdquo como principal fator responsaacutevel pelas exposiccedilotildees
toacutexicas a medicamentos em Satildeo Paulo seguido pela tentativa de suiciacutedio
Graacutefico 01 - Grupos farmacoloacutegicos de acordo com a classificaccedilatildeo da ATC responsaacuteveis pelas
intoxicaccedilotildees registradas no Ceatox-CG entre agosto a setembro de 2012 (N= 18)
2239
1722
Associaccedilotildees
N05A
N03A
N05B
NOTA N05A Antipsicoacuteticos N03A Antiepileacuteptico NO5B Ansioliacuteticos e associaccedilatildeo
15
Acerca da ocupaccedilatildeo dos pacientes os estudantes foram os mais frequentes (n=6-333)
Este dado entra em desacordo com a mesma variaacutevel analisada no estudo de Turini et al (2010)
em que mostra que a ocupaccedilatildeo mais relevante nos seu estudo eacute a de empregado (Tabela 01)
Observando-se os sinais e sintomas das intoxicaccedilotildees as Siacutendromes Toacutexicas por
Superdosagem de Sedativos (pupilas mioacuteticas tremor hipotensatildeo confusatildeo mental e sonolecircncia)
e a Extrapiramidal (choro monoacutetono opistoacutetomo e distonia) foram predominantes O quadro
toacutexico se desenvolve dependendo da dose do subgrupo terapecircutico e do tempo entre a exposiccedilatildeo
e o atendimento Os ansioliacuteticos principalmente os Benzodiazepiacutenicos (BZD) satildeo compostos
que apresentam maior iacutendice terapecircutico e menor potencialidade de provocar acidentes fatais e
menor tendecircncia para produzir toleracircncia farmacoloacutegica (FORSAN 2010)
Tabela 01 ndash Frequecircncia do tipo de circunstacircncia da faixa etaacuteria do gecircnero e da ocupaccedilatildeo dos pacientes intoxicados
atendidos no Ceatox-CG
Variaacutevel
N
Circunstacircncia (N=18)
Tentativa de Suiciacutedio 10 557
Acidental 1 57
Outra 7 389
Faixa Etaacuteria (anos) (N=18)
1---9 3 166
10---19 5 278
20---39 7 389
gt 40 3 167
Gecircnero (N=18)
Masculino 8 444
Feminino 10 556
Ocupaccedilatildeo (N=18)
Estudante 6 333
Do lar 4 222
Outra 8 444
16
Em relaccedilatildeo agrave variaacutevel evoluccedilatildeo natildeo se registrou nenhum oacutebito no periacuteodo estudado
Dados nacionais entre os anos de 2007 a 2009 mostram que os medicamentos apresentaram
baixo coeficiente de letalidade meacutedio quando comparado aos agrotoacutexicos de uso agriacutecola e as
drogas de abuso (SISTEMA2012) Um estudo realizado por Mota et al (2012) usando dados
secundaacuterios do Sistema Informaccedilatildeo de Mortalidade (SIM)MS entre 1996 a 2005 identificou
4403 oacutebitos relacionados a medicamentos entretanto natildeo foi possiacutevel estabelecer qual a
principal classe de medicamentos nem o princiacutepio ativo envolvido com o agravo
42 Dados Experimentais
Para otimizaccedilatildeo do meacutetodo vaacuterios procedimentos foram realizados seguindo os
paracircmetros analiacuteticos de validaccedilatildeo objetivando detectar a presenccedila de Alprazolam em urina de
paciente com histoacuterico de exposiccedilatildeo toxica a esse faacutermaco A metodologia desenvolvida e
validada mostrou-se em conformidade com as especificaccedilotildees da Resoluccedilatildeo RDC nordm899 de 29 de
maio de 2003 (BRASIL 2003)
Na avaliaccedilatildeo da seletividade nas amostras de urina analisadas natildeo foram detectados
interferentes nas condiccedilotildees de extraccedilatildeo estabelecidas Assim o meacutetodo mostrou-se seletivo jaacute
que as amostras natildeo mostraram nenhum spot(mancha) semelhante aos desenvolvidos pelos
padrotildees No processo de validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos a especificidade ou seletividade eacute o
primeiro passo para o desenvolvimento de um meacutetodo este paracircmetro deve ser avaliado
continuamente para assegurar a precisatildeo e exatidatildeo deste durante sua validaccedilatildeo (SILVA et al
2010) (Tabela 02)
Para os ensaios de recuperaccedilatildeo foi observada a intensidade do spot desenvolvido em cada
amostra para cada niacutevel de fortificaccedilatildeo Nas amostras fortificadas com 200 microg do padratildeo
obtivemos uma recuperaccedilatildeo de 917 enquanto que nas amostras fortificadas com 400 microg do
mesmo o percentual meacutedio obtido foi de 967 demonstrando assim a exatidatildeo do meacutetodo
Segundo a Resoluccedilatildeo RDC nordm 899 de 29 de maio de 2003 a exatidatildeo se daacute pela concordacircncia
entre o resultado de um ensaio e um valor de referecircncia
17
Tabela 02 ndash Avaliaccedilatildeo da seletividade comparando-se spot e Rf (Relative Front) dos padrotildees de
Alprazolam e amostras branco
Sistema-solvente Agente cromogecircnico
Clorofoacutermio-metanol(91v v)
DI
Clorofoacutermio-acetona(41vv)
DI
FaacutermacoAmostras Rf e Cor Rf e Cor
Padratildeo Alprazolam faacutermaco
Padratildeo Alprazolam comprimido
ABal1
ABal2
ABal3
ABal4
ABal5
05 + c
026 + c
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Nota DI = Dragendorff iodado ABal = amostra branco alcalina Rf = fator de retenccedilatildeo c = cor
castanha
O Limite de Detecccedilatildeo e o Limite de Quantificaccedilatildeo para o Alprazolam foram de
100microgmL e 200 microgmL respectivamente Ribani et al (2004) define o Limite de Detecccedilatildeo (LD)
como sendo a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser detectada mas natildeo
necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento experimental O Limite
de Quantificaccedilatildeo (LQ) eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode
ser medida utilizando um determinado procedimento experimental (Figura 01)
O meacutetodo de extraccedilatildeo utilizado particcedilatildeo liacutequido-liacutequido demonstrou-se eficaz pois a
solubilidade do faacutermaco avaliado possui uma elevada afinidade pela mistura de solventes
utilizados nesse procedimento Na separaccedilatildeo do analito da matriz a sonicaccedilatildeo que eacute o processo
que utiliza a energia das ondas sonoras mais comumente a ultrassom se mostrou mais eficaz que
a centrifugaccedilatildeo
O sistema formado pelos solventes clorofoacutermio-metanol (91 vv) obteve o melhor
resultado em relaccedilatildeo ao sistema solvente clorofoacutermio-acetona(41 vv) tendo em vista melhor
resultado na separaccedilatildeo dos padrotildees e amostras
18
Figura 01-Identificaccedilatildeo de Alprazolam em trecircs niacuteveis de fortificaccedilatildeo (n = 3) alta meacutedia e baixa
Dentre os agentes cromogecircnicos utilizados na revelaccedilatildeo apenas o Reativo de Dragendorff
se mostrou eficaz Observou-se atraveacutes do meacutetodo fiacutesico utilizando a Cacircmera de Luz UV que o
Alprazolam faacutermaco e o Alprazolam comprimido natildeo transmite fluorescecircncia no comprimento
de onda de 366nm
Para avaliaccedilatildeo da Robustez as soluccedilotildees-padratildeo (faacutermaco e medicamento) foram
dissolvidas em diversos solventes como apresentado na Tabela 03 O metanol foi o solvente em
que houve revelaccedilatildeo na placa cromatograacutefica tanto do faacutermaco como do medicamento
Tabela 03 - Anaacutelise dos diferentes solventes da soluccedilatildeo estoque padratildeo puro do faacutermaco e do medicamento de
Alprazolam a partir do Rf
NOTA Rf = Relative Front spot= cormancha
Solvente Alprazolam faacutermaco Alprazolam medicamento
Rf Rf
Metanol 05 026
Aacutegua 06 -
ClorofoacutermioAcetona
(41)
056 -
ClorofoacutermioMetanol
(41)
052 -
AMOSTRAS
PADRAtildeO
19
Os testes de robustez satildeo de fundamental importacircncia para que os analistas conheccedilam
quais fatores devem ser estritamente controlados durante a execuccedilatildeo de um meacutetodo Se as
alteraccedilotildees das condiccedilotildees de anaacutelise produzirem resultados dentro dos limites aceitaacuteveis de
seletividade exatidatildeo e precisatildeo o meacutetodo pode ser considerado robusto e tais variaccedilotildees podem
ser incorporadas ao procedimento (CASSIANO et al 2009)
Apesar do meacutetodo ter se mostrado seletivo para o Alprazolam ele natildeo eacute especifico apenas
para esse faacutermaco Sendo assim o meacutetodo foi aplicado em 7 (sete) amostras de pacientes com
histoacuterico de exposiccedilatildeo toacutexica por medicamentos atendidos pelo Centro de Informaccedilatildeo
Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) poreacutem natildeo foi possiacutevel obter a recuperaccedilatildeo dos
faacutermacos Acredita-se que a quantidade ingerida dos medicamentos pelos pacientes foi baixa ou
que pela demora da coleta da amostra os faacutermacos tenham sido metabolizado pelo organismo
Nos ensaios de confirmaccedilatildeo por FTIR observou-se que o Alprazolam padratildeo apresentou as
seguintes vibraccedilotildees moleculares A deformaccedilatildeo angular N-H de amina secundaacuteria eacute observada na
banda em 1660 cm-1
Em 1647 cm-1
aparece uma banda que pode ser atribuiacuteda ao estiramento
C=N da imina e em 1397 cm-1
aparece uma banda atribuiacuteda ao estiramento C-N das aminas A
banda caracteriacutestica do estiramento =C-H de carbono sp2 do anel aromaacutetico se encontra em 3275
cm-1
O espectro do faacutermaco extraiacutedo da matriz bioloacutegica mantecircm as mesmas caracteriacutesticas do
faacutermaco padratildeo Dessa forma podemos afirmar que a moleacutecula natildeo sofreu alteraccedilatildeo durante o
processo de extraccedilatildeo (Figura 02)
Figura 02 - Espectro da analise no FTIR do padratildeo de Alprazolam faacutermaco e de amostra extraiacuteda
20
5 CONCLUSAtildeO
O meacutetodo demonstrou atender aos requisitos de boas praacuteticas exigidos pela Resoluccedilatildeo
RDC 899 de 29 de maio de 2003 sendo exato e sensiacutevel
Dentre as amostras de pacientes intoxicados por medicamentos natildeo se obteve resultados
positivos para o Alprazolam
Os medicamentos constituem como um dos principais meios utilizado para tentativa de
suiciacutedio tendecircncia que eacute observada nos paiacuteses de terceiro mundo entre eles os psicofaacutermacos os
mais utilizados Haacute necessidade de uma melhor formaccedilatildeo e atualizaccedilatildeo dos profissionais assim
como de informaccedilatildeo aos usuaacuterios e medidas de prevenccedilatildeo que poderiam alertar sobre os riscos e
monitorar o uso desses medicamentos
O Brasil em agosto de 2006 deu o primeiro passo lanccedilando a Portaria nordm 1876 com as
diretrizes nacionais para Prevenccedilatildeo do Suiciacutedio nas trecircs esferas da gestatildeo Portanto estudar e
prevenir as tentativas de suiciacutedio eacute um desafio pois envolve recursos financeiros e sensibilidade
da parte dos profissionais envolvidos
Por outro lado aleacutem do conhecimento dos dados epidemioloacutegicos eacute necessaacuteria a
identificaccedilatildeo dos grupos terapecircuticos responsaacuteveis pelas intoxicaccedilotildees As teacutecnicas
cromatograacuteficas e espectrofotomeacutetricas possuem uma extensa aplicabilidade em pesquisas
cientiacuteficas anaacutelise quiacutemica teste de controle de qualidade de medicamentos entre outros Isso se
daacute por serem teacutecnicas altamente sensiacuteveis de alta resoluccedilatildeo e por ser um meacutetodo mais raacutepido e
preciso Ao analisar traccedilos de compostos em amostras complexas como sangue e urina as
anaacutelises toxicoloacutegicas auxiliam no prognoacutestico e diagnoacutestico de intoxicaccedilotildees uma vez que eacute
possiacutevel identificaccedilatildeo destes compostos em amostras bioloacutegicas
O meacutetodo por CCDC tem caraacuteter semindashquantitativo jaacute que a quantificaccedilatildeo dos faacutermacos eacute
baseada apenas na comparaccedilatildeo visual dos ldquoSpotsrdquo das amostras e dos padrotildees Embora o meacutetodo
seja adequado para triagem os resultados mostram que a quantificaccedilatildeo de faacutermacos por meacutetodos
baseados no uso de CCDC deve possuir uma interpretaccedilatildeo bem cautelosa especialmente devido agrave
incerteza associada a este tipo de comparaccedilatildeo
Se faz necessaacuterio a confirmaccedilatildeo da identidade do faacutermaco por outras teacutecnicas eou outros
meacutetodos de anaacutelise como a Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia (CLAE) e Cromatografia
21
Gasosa (CG) sendo assim possiacutevel correlacionar os perfis cromatograacuteficos entre as diferentes
teacutecnicas
ABSTRACT
The medicines are presented as the main toxic agent responsible for cases of human poisoning
thus constituting a major challenge for those working with Public Health However the absence
of a specialized toxicological analysis hinders a more accurate diagnosis of cases The
spectrophotometric and chromatographic techniques may assist in confirming the diagnosis A
Comparative Thin Layer Chromatography (CCDC) is a separation technique simple low cost and
good sensitivity The identification of the drug can be achieved both quantitatively and
qualitatively by infrared spectroscopy Fourier transform (FTIR) This research proposal was to
evaluate two techniques for identification of Alprazolam in urine of patients with toxic exposure
to drugs assessing the selectivity accuracy limit of detection limit of quantification and
robustness in chromatographic techniques The method was optimized validated and applied in
accordance with Resolution RDC Nordm 899 of May 29 2003 The chromatographic assay used
plates of Silica Gel G-60 elution with chloroform-methanol 91 (v v) and as a chromogenic
agent the Reactive Dragendorff The presence of the drug was confirmed by the FTIR analysis
The method proved to be selective chromatographic conditions established by presenting Limit
Detection and Quantification 200μgml and 100μgml respectively Among the patient samples
drug poisoning no positive results obtained for Alprazolam The FTIR analysis showed that the
drug did not undergo degradation in the extraction process The method has proven to meet the
requirements of good practice required by RDC Nordm 899 of 29 May 2003 being sensitive and
accurate
KEYWORDS Alprazolam Spectroscopy Chromatography Intoxication
REFEREcircNCIAS
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27
ANEXO A
28
8
A Cromatografia em Camada Delgada (CCD) eacute uma teacutecnica de adsorccedilatildeo do tipo soacutelido-
liacutequida Nesse caso a separaccedilatildeo se daacute pela diferenccedila de afinidade dos componentes de uma
mistura pela fase estacionaacuteria (DEGANI CASS VIEIRA 1998) A fase estacionaacuteria
corresponde a uma camada fina formada por um soacutelido granulado geralmente siacutelica depositado
sobre uma placa de vidro alumiacutenio ou outro suporte inerte Este meacutetodo merece atenccedilatildeo especial
pela sua versatilidade rapidez sensibilidade e nitidez das separaccedilotildees (EIZENDEHER 2005)
A Espectroscopia Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) pode ser usada para
identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo de compostos orgacircnicos inorgacircnicos e polimeacutericos Basicamente o
que se mede nesta anaacutelise eacute a fraccedilatildeo da energia transmitida ou absorvida em relaccedilatildeo agrave incidente
em determinado comprimento de onda ou nuacutemero de onda (EVORA et al 2002)
A espectrometria FTIR permite a determinaccedilatildeo automatizada dos paracircmetros de maior
importacircncia na caracterizaccedilatildeo de amostras Hoje os instrumentos de FTIR satildeo informatizados o
que os torna mais raacutepidos e mais sensiacuteveis do que os instrumentos mais antigos dispersivos Ele
pode ser aplicado agrave anaacutelise de soacutelidos liacutequidos e gases Trata-se de uma metodologia que origina
rapidamente uma informaccedilatildeo sumaacuteria de 30 segundos por amostra eacute uma teacutecnica natildeo poluente jaacute
que natildeo utiliza reagentes aleacutem de natildeo necessitar de pessoal especializado para ser operada em
rotina (MOREIRA MARCOS BARROS 2002)
Para garantir que um novo meacutetodo analiacutetico gere informaccedilotildees confiaacuteveis e interpretaacuteveis
sobre a amostra ele deve passar por um processo de validaccedilatildeo A validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos
eacute o processo pelo qual eacute estabelecido por estudos de laboratoacuterio que as caracteriacutesticas
executadas do meacutetodo satisfazem aos requisitos para as aplicaccedilotildees analiacuteticas praticadas (RIBANI
et al2004 VALENTINI SOMMER MATIOLI 2007)
3 REFERENCIAL METODOLOacuteGICO
31 Dados epidemioloacutegicos
9
311 Delineamento do estudo e instrumento de coleta de dados
Tratou-se de uma pesquisa prospectiva descritiva e analiacutetica Os dados epidemioloacutegicos
foram coletados dos pacientes admitidos com histoacuteria de exposiccedilatildeo e ou intoxicaccedilatildeo por
medicamentos no Hospital de Emergecircncia e Trauma de Campina Grande atendidos e notificados
pelo Centro de Informaccedilatildeo Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) nos meses de agosto
e setembro de 2012 Utilizou-se a ficha do Sistema Nacional de Agravos de Notificaccedilatildeo
(Sinan)MS para a coleta dos dados epidemioloacutegicos desses pacientes (Anexo A)
312 Variaacuteveis demograacuteficas e socioeconocircmicas
Gecircnero
Faixa Etaacuteria
Ocupaccedilatildeo
313 Variaacuteveis relativas ao evento
Circunstacircncia
314 Variaacutevel relativa ao Agente Toacutexico
Os grupos de medicamentos foram classificados em categorias terapecircuticas segundo o
Anatomical-Therapeutical-ChemicalClassification System (ATC)
Os medicamentos pertencentes ao nono niacutevel dessa classificaccedilatildeo satildeo classificados como
os medicamentos que atuam no sistema nervoso central representado pela letra N Neste niacutevel
estatildeo incluiacutedos os psicodisleacutepticos ansioliacuteticos (NO5B) antipsicoacuteticos (NO5A) hipnoacutetico-
sedativos (NO5C) e os psicoanaleacutepticos antidepressivos (NO6A) e
estimulantespsicoestimulantes (NO6B)
315 Variaacuteveis relativas agrave intoxicaccedilatildeo
Avaliar os sinais e sintomas
Classificar os casos quanto agrave gravidade
10
Quanto ao item gravidade adotamos o seguinte criteacuterio com base no trabalho de King e
Palmisano 1989
Grave o paciente que permanece internado apoacutes procedimentos do tipo lavagem gaacutestrica
ou observaccedilatildeo meacutedica
Moderada ocorre algum procedimento do tipo lavagem gaacutestrica ou observaccedilatildeo meacutedica
mas sem internaccedilatildeo
Leve a famiacutelia recebe somente orientaccedilatildeo ou acompanhamento por telefone e nenhum
procedimento
Ignorada natildeo eacute possiacutevel classificar a extensatildeo do dano
Evoluccedilatildeo
Alta meacutedica (Cura)
Transferecircncia para outra unidade hospitalar
Ignorado
Oacutebito
32 DADOS EXPERIMENTAIS
321 Ensaios de Desenvolvimento e Validaccedilatildeo da Metodologia
Local da Pesquisa Laboratoacuterio de Desenvolvimento e Certificaccedilatildeo de Biomaterias do
Nordeste unidades da UEPB e UFCG
Materiais
Solventes reagentes e outros aparatos
-Alprazolam (faacutermaco) doaccedilatildeo feita pelo Nuacutecleo de odontologia e medicina Legal - NUMOL
-Medicamento (Medley) Alprazolam
-Acetona Vetec
11
-Clorofoacutermio Vetec
-Sulfato de Soacutedio Anidro Vetec
-Metanol (HPLC) Paneac
-Placas de Siacutelica Gel ALUGRAM SIL G 60F de (20x20) cm
2 foram adquiridas da Macherey-
Nagel (REF 818033)
-Cubas Cromatograacuteficas
-Papel de filtro Qualy
Equipamentos
-Estufa Med Clav
-Banho de Ultra-Som ULTRAsonic 1440A
-Centrifuga DCS-16 RV
-Cacircmera de Luz UV (λ=264nm)
-Espectrocircmetro FTIR SPECTRUM 400 Perkin-Elmer (4000 a 600 cm-1 para anaacutelise das
caracteriacutesticas do grupos funcionais dos faacutermacos)
322 Preparaccedilatildeo dos padrotildees
As soluccedilotildees estoque do faacutermaco foram preparadas pela dissoluccedilatildeo de cada composto em
metanol para obter a concentraccedilatildeo de 400 microg mL
323 Preparaccedilatildeo das Amostras
Procedimento de Extraccedilatildeo Extraccedilatildeo Liacutequido-Liacutequido (ELL)
Na fase de desenvolvimento do meacutetodo um importante passo foi a retirada dos
interferentes das amostras Para isto foram realizados vaacuterios procedimentos de Clean-up usando
ELL Para a ELL foi usado o meacutetodo de Stas-Otto que considera o caraacuteter aacutecidobase de cada
substacircncia do meio em que essa se encontra o seu grau de ionizaccedilatildeo como fatores influentes em
sua solubilidade em solventes orgacircnicos pois a partir de mistura desses em proporccedilotildees
adequadas pode-se submeter agraves amostras agrave ELL (FIGURA 01)
Terminada a extraccedilatildeo por sonicaccedilatildeo ou centrifugaccedilatildeo a fase orgacircnica foi recolhida
evaporada e ressuspendida para anaacutelise cromatograacutefica e espectrofotomeacutetrica
12
324 Teacutecnicas
Anaacutelise por CCD
A anaacutelise por CCD foi baseada na metodologia claacutessica descrita por Moraes (1991) com
adaptaccedilatildeo
Os resiacuteduos obtidos por ELL foram ressuspendidos em MetanolAacutegua (91) e aplicados
nas placas cromatograacuteficas previamente ativadas em estufas a 105ordmC por 30 minutos Aplicaram-
se nas placas aliacutequotas de 20 microL dos extratos obtidos por ELL Foi utilizado o sistema solvente
constituiacutedo de mistura de clorofoacutermio-metanol (91) e clorofoacutermio-acetona (41)
Os cromatogramas foram revelados usando meacutetodos quiacutemicos (agentes cromogecircnicos
Reativo de Dragendorff Difenilcarbazona Nitrato de Prata 1 e Cloreto Feacuterrico 5) e meacutetodo
fiacutesico (Cacircmera de Luz UV (λ=264nm)
Figura 01 - Esquema de extraccedilatildeo amostras
FONTE MORAES 1991
325 Estudo de seletividade e recuperaccedilatildeo
Seletividade
A seletividade do meacutetodo foi avaliada atraveacutes da extraccedilatildeo de 6 amostras diferentes de
urinas (n=6) por LLE e depois analisadas por CCDC
25 ml
13
Recuperaccedilatildeo
A extraccedilatildeo para avaliar a recuperaccedilatildeo foi realizada pela anaacutelise de amostras em
triplicatas contaminadas (fortificadas) em trecircs concentraccedilotildees do padratildeo de Alprazolam (baixa=
100microgml meacutedia=200 microgml e alta= 400 microgml)
326 O Limite de Detecccedilatildeo (LD) e o Limite de Quantificaccedilatildeo (LQ)
O Limite de Detecccedilatildeo eacute a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser
detectada mas natildeo necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento
experimental O Limite de Quantificaccedilatildeo eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia
em exame que pode ser medida utilizando um determinado procedimento experimental
O LD foi determinado por anaacutelise de urina contaminada em concentraccedilotildees decrescentes
de faacutermaco e medicamento ateacute a concentraccedilatildeo possiacutevel de se detectar a presenccedila de ambos O LQ
foi determinado por analise de urina contaminada em concentraccedilotildees decrescentes de faacutermaco e
medicamento ateacute a concentraccedilatildeo possiacutevel de se quantificar a presenccedila de ambos
327 Robustez
Na avaliaccedilatildeo da robustez foram utilizados como solventes o metanol a aacutegua uma soluccedilatildeo
de clorofoacutermio- acetona (41) e uma soluccedilatildeo de clorofoacutermio-metanol (91) para preparaccedilatildeo dos
padrotildees de Alprazolam
328 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier - FTIR
Foram feitas anaacutelises de soluccedilotildees metanoacutelicas ( 10 mgmL n=3) do faacutermaco padratildeo e suas
extraccedilotildees utilizando a faixa de varredura de 4000 a 500 cm-1
em temperatura ambiente
4 DADOS E ANAacuteLISE DA PESQUISA
41 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
No periacuteodo de agosto a setembro de 2012 o Ceatox-CG registrou 28 casos com histoacuteria
de intoxicaccedilatildeo por medicamentos Destes 18 casos foram classificados como
14
neuropsicofaacutermacos Na anaacutelise dos casos do uso isolado de medicamentos os Antiepileacutepticos
assim como os Ansioliticos foram os responsaacuteveis pelo maior nuacutemero de ocorrecircncias com um
percentual de 22 (n=4) cada um Um estudo realizado com crianccedilas no estado de Mato Grosso
do Sul verificou que os anticonvulsivantes foram os principais responsaacuteveis pelos eventos toacutexicos
por medicamentos que agem no SNC (MATOS et al 2008)
Ao analisarmos as associaccedilotildees de medicamentos (n=7-39) nos chama a atenccedilatildeo o
nuacutemero de ocorrecircncias por tentativa de suiciacutedio (n=10-557) Bernades Turini e Matsuo
(2010) afirmam que pacientes que tentam suiciacutedio em sua grande maioria fazem uso de mais de
um tipo de substacircncia quiacutemica ndash medicamentosa ou natildeo ndash quando o meacutetodo eacute a intoxicaccedilatildeo
voluntaacuteria
Os eventos toxicoloacutegicos foram mais comuns em mulheres (556) por tentativa de
suiciacutedio (557) e entre adultos e jovens (389) (Tabela 01) Um estudo realizado entre os anos
de 1997 e 2007 no Centro de Controle de Intoxicaccedilatildeo (CCI) em Londrina Paranaacute analisando as
tentativas de suiciacutedio por sobredose intencional de medicamentos com relaccedilatildeo ao gecircnero condiz
com dados aqui obtidos (BERNADES TURINI MATZUO 2010) Por outro lado Gandolfi e
Andrade (2006) mostra o ldquoacidente individualrdquo como principal fator responsaacutevel pelas exposiccedilotildees
toacutexicas a medicamentos em Satildeo Paulo seguido pela tentativa de suiciacutedio
Graacutefico 01 - Grupos farmacoloacutegicos de acordo com a classificaccedilatildeo da ATC responsaacuteveis pelas
intoxicaccedilotildees registradas no Ceatox-CG entre agosto a setembro de 2012 (N= 18)
2239
1722
Associaccedilotildees
N05A
N03A
N05B
NOTA N05A Antipsicoacuteticos N03A Antiepileacuteptico NO5B Ansioliacuteticos e associaccedilatildeo
15
Acerca da ocupaccedilatildeo dos pacientes os estudantes foram os mais frequentes (n=6-333)
Este dado entra em desacordo com a mesma variaacutevel analisada no estudo de Turini et al (2010)
em que mostra que a ocupaccedilatildeo mais relevante nos seu estudo eacute a de empregado (Tabela 01)
Observando-se os sinais e sintomas das intoxicaccedilotildees as Siacutendromes Toacutexicas por
Superdosagem de Sedativos (pupilas mioacuteticas tremor hipotensatildeo confusatildeo mental e sonolecircncia)
e a Extrapiramidal (choro monoacutetono opistoacutetomo e distonia) foram predominantes O quadro
toacutexico se desenvolve dependendo da dose do subgrupo terapecircutico e do tempo entre a exposiccedilatildeo
e o atendimento Os ansioliacuteticos principalmente os Benzodiazepiacutenicos (BZD) satildeo compostos
que apresentam maior iacutendice terapecircutico e menor potencialidade de provocar acidentes fatais e
menor tendecircncia para produzir toleracircncia farmacoloacutegica (FORSAN 2010)
Tabela 01 ndash Frequecircncia do tipo de circunstacircncia da faixa etaacuteria do gecircnero e da ocupaccedilatildeo dos pacientes intoxicados
atendidos no Ceatox-CG
Variaacutevel
N
Circunstacircncia (N=18)
Tentativa de Suiciacutedio 10 557
Acidental 1 57
Outra 7 389
Faixa Etaacuteria (anos) (N=18)
1---9 3 166
10---19 5 278
20---39 7 389
gt 40 3 167
Gecircnero (N=18)
Masculino 8 444
Feminino 10 556
Ocupaccedilatildeo (N=18)
Estudante 6 333
Do lar 4 222
Outra 8 444
16
Em relaccedilatildeo agrave variaacutevel evoluccedilatildeo natildeo se registrou nenhum oacutebito no periacuteodo estudado
Dados nacionais entre os anos de 2007 a 2009 mostram que os medicamentos apresentaram
baixo coeficiente de letalidade meacutedio quando comparado aos agrotoacutexicos de uso agriacutecola e as
drogas de abuso (SISTEMA2012) Um estudo realizado por Mota et al (2012) usando dados
secundaacuterios do Sistema Informaccedilatildeo de Mortalidade (SIM)MS entre 1996 a 2005 identificou
4403 oacutebitos relacionados a medicamentos entretanto natildeo foi possiacutevel estabelecer qual a
principal classe de medicamentos nem o princiacutepio ativo envolvido com o agravo
42 Dados Experimentais
Para otimizaccedilatildeo do meacutetodo vaacuterios procedimentos foram realizados seguindo os
paracircmetros analiacuteticos de validaccedilatildeo objetivando detectar a presenccedila de Alprazolam em urina de
paciente com histoacuterico de exposiccedilatildeo toxica a esse faacutermaco A metodologia desenvolvida e
validada mostrou-se em conformidade com as especificaccedilotildees da Resoluccedilatildeo RDC nordm899 de 29 de
maio de 2003 (BRASIL 2003)
Na avaliaccedilatildeo da seletividade nas amostras de urina analisadas natildeo foram detectados
interferentes nas condiccedilotildees de extraccedilatildeo estabelecidas Assim o meacutetodo mostrou-se seletivo jaacute
que as amostras natildeo mostraram nenhum spot(mancha) semelhante aos desenvolvidos pelos
padrotildees No processo de validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos a especificidade ou seletividade eacute o
primeiro passo para o desenvolvimento de um meacutetodo este paracircmetro deve ser avaliado
continuamente para assegurar a precisatildeo e exatidatildeo deste durante sua validaccedilatildeo (SILVA et al
2010) (Tabela 02)
Para os ensaios de recuperaccedilatildeo foi observada a intensidade do spot desenvolvido em cada
amostra para cada niacutevel de fortificaccedilatildeo Nas amostras fortificadas com 200 microg do padratildeo
obtivemos uma recuperaccedilatildeo de 917 enquanto que nas amostras fortificadas com 400 microg do
mesmo o percentual meacutedio obtido foi de 967 demonstrando assim a exatidatildeo do meacutetodo
Segundo a Resoluccedilatildeo RDC nordm 899 de 29 de maio de 2003 a exatidatildeo se daacute pela concordacircncia
entre o resultado de um ensaio e um valor de referecircncia
17
Tabela 02 ndash Avaliaccedilatildeo da seletividade comparando-se spot e Rf (Relative Front) dos padrotildees de
Alprazolam e amostras branco
Sistema-solvente Agente cromogecircnico
Clorofoacutermio-metanol(91v v)
DI
Clorofoacutermio-acetona(41vv)
DI
FaacutermacoAmostras Rf e Cor Rf e Cor
Padratildeo Alprazolam faacutermaco
Padratildeo Alprazolam comprimido
ABal1
ABal2
ABal3
ABal4
ABal5
05 + c
026 + c
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Nota DI = Dragendorff iodado ABal = amostra branco alcalina Rf = fator de retenccedilatildeo c = cor
castanha
O Limite de Detecccedilatildeo e o Limite de Quantificaccedilatildeo para o Alprazolam foram de
100microgmL e 200 microgmL respectivamente Ribani et al (2004) define o Limite de Detecccedilatildeo (LD)
como sendo a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser detectada mas natildeo
necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento experimental O Limite
de Quantificaccedilatildeo (LQ) eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode
ser medida utilizando um determinado procedimento experimental (Figura 01)
O meacutetodo de extraccedilatildeo utilizado particcedilatildeo liacutequido-liacutequido demonstrou-se eficaz pois a
solubilidade do faacutermaco avaliado possui uma elevada afinidade pela mistura de solventes
utilizados nesse procedimento Na separaccedilatildeo do analito da matriz a sonicaccedilatildeo que eacute o processo
que utiliza a energia das ondas sonoras mais comumente a ultrassom se mostrou mais eficaz que
a centrifugaccedilatildeo
O sistema formado pelos solventes clorofoacutermio-metanol (91 vv) obteve o melhor
resultado em relaccedilatildeo ao sistema solvente clorofoacutermio-acetona(41 vv) tendo em vista melhor
resultado na separaccedilatildeo dos padrotildees e amostras
18
Figura 01-Identificaccedilatildeo de Alprazolam em trecircs niacuteveis de fortificaccedilatildeo (n = 3) alta meacutedia e baixa
Dentre os agentes cromogecircnicos utilizados na revelaccedilatildeo apenas o Reativo de Dragendorff
se mostrou eficaz Observou-se atraveacutes do meacutetodo fiacutesico utilizando a Cacircmera de Luz UV que o
Alprazolam faacutermaco e o Alprazolam comprimido natildeo transmite fluorescecircncia no comprimento
de onda de 366nm
Para avaliaccedilatildeo da Robustez as soluccedilotildees-padratildeo (faacutermaco e medicamento) foram
dissolvidas em diversos solventes como apresentado na Tabela 03 O metanol foi o solvente em
que houve revelaccedilatildeo na placa cromatograacutefica tanto do faacutermaco como do medicamento
Tabela 03 - Anaacutelise dos diferentes solventes da soluccedilatildeo estoque padratildeo puro do faacutermaco e do medicamento de
Alprazolam a partir do Rf
NOTA Rf = Relative Front spot= cormancha
Solvente Alprazolam faacutermaco Alprazolam medicamento
Rf Rf
Metanol 05 026
Aacutegua 06 -
ClorofoacutermioAcetona
(41)
056 -
ClorofoacutermioMetanol
(41)
052 -
AMOSTRAS
PADRAtildeO
19
Os testes de robustez satildeo de fundamental importacircncia para que os analistas conheccedilam
quais fatores devem ser estritamente controlados durante a execuccedilatildeo de um meacutetodo Se as
alteraccedilotildees das condiccedilotildees de anaacutelise produzirem resultados dentro dos limites aceitaacuteveis de
seletividade exatidatildeo e precisatildeo o meacutetodo pode ser considerado robusto e tais variaccedilotildees podem
ser incorporadas ao procedimento (CASSIANO et al 2009)
Apesar do meacutetodo ter se mostrado seletivo para o Alprazolam ele natildeo eacute especifico apenas
para esse faacutermaco Sendo assim o meacutetodo foi aplicado em 7 (sete) amostras de pacientes com
histoacuterico de exposiccedilatildeo toacutexica por medicamentos atendidos pelo Centro de Informaccedilatildeo
Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) poreacutem natildeo foi possiacutevel obter a recuperaccedilatildeo dos
faacutermacos Acredita-se que a quantidade ingerida dos medicamentos pelos pacientes foi baixa ou
que pela demora da coleta da amostra os faacutermacos tenham sido metabolizado pelo organismo
Nos ensaios de confirmaccedilatildeo por FTIR observou-se que o Alprazolam padratildeo apresentou as
seguintes vibraccedilotildees moleculares A deformaccedilatildeo angular N-H de amina secundaacuteria eacute observada na
banda em 1660 cm-1
Em 1647 cm-1
aparece uma banda que pode ser atribuiacuteda ao estiramento
C=N da imina e em 1397 cm-1
aparece uma banda atribuiacuteda ao estiramento C-N das aminas A
banda caracteriacutestica do estiramento =C-H de carbono sp2 do anel aromaacutetico se encontra em 3275
cm-1
O espectro do faacutermaco extraiacutedo da matriz bioloacutegica mantecircm as mesmas caracteriacutesticas do
faacutermaco padratildeo Dessa forma podemos afirmar que a moleacutecula natildeo sofreu alteraccedilatildeo durante o
processo de extraccedilatildeo (Figura 02)
Figura 02 - Espectro da analise no FTIR do padratildeo de Alprazolam faacutermaco e de amostra extraiacuteda
20
5 CONCLUSAtildeO
O meacutetodo demonstrou atender aos requisitos de boas praacuteticas exigidos pela Resoluccedilatildeo
RDC 899 de 29 de maio de 2003 sendo exato e sensiacutevel
Dentre as amostras de pacientes intoxicados por medicamentos natildeo se obteve resultados
positivos para o Alprazolam
Os medicamentos constituem como um dos principais meios utilizado para tentativa de
suiciacutedio tendecircncia que eacute observada nos paiacuteses de terceiro mundo entre eles os psicofaacutermacos os
mais utilizados Haacute necessidade de uma melhor formaccedilatildeo e atualizaccedilatildeo dos profissionais assim
como de informaccedilatildeo aos usuaacuterios e medidas de prevenccedilatildeo que poderiam alertar sobre os riscos e
monitorar o uso desses medicamentos
O Brasil em agosto de 2006 deu o primeiro passo lanccedilando a Portaria nordm 1876 com as
diretrizes nacionais para Prevenccedilatildeo do Suiciacutedio nas trecircs esferas da gestatildeo Portanto estudar e
prevenir as tentativas de suiciacutedio eacute um desafio pois envolve recursos financeiros e sensibilidade
da parte dos profissionais envolvidos
Por outro lado aleacutem do conhecimento dos dados epidemioloacutegicos eacute necessaacuteria a
identificaccedilatildeo dos grupos terapecircuticos responsaacuteveis pelas intoxicaccedilotildees As teacutecnicas
cromatograacuteficas e espectrofotomeacutetricas possuem uma extensa aplicabilidade em pesquisas
cientiacuteficas anaacutelise quiacutemica teste de controle de qualidade de medicamentos entre outros Isso se
daacute por serem teacutecnicas altamente sensiacuteveis de alta resoluccedilatildeo e por ser um meacutetodo mais raacutepido e
preciso Ao analisar traccedilos de compostos em amostras complexas como sangue e urina as
anaacutelises toxicoloacutegicas auxiliam no prognoacutestico e diagnoacutestico de intoxicaccedilotildees uma vez que eacute
possiacutevel identificaccedilatildeo destes compostos em amostras bioloacutegicas
O meacutetodo por CCDC tem caraacuteter semindashquantitativo jaacute que a quantificaccedilatildeo dos faacutermacos eacute
baseada apenas na comparaccedilatildeo visual dos ldquoSpotsrdquo das amostras e dos padrotildees Embora o meacutetodo
seja adequado para triagem os resultados mostram que a quantificaccedilatildeo de faacutermacos por meacutetodos
baseados no uso de CCDC deve possuir uma interpretaccedilatildeo bem cautelosa especialmente devido agrave
incerteza associada a este tipo de comparaccedilatildeo
Se faz necessaacuterio a confirmaccedilatildeo da identidade do faacutermaco por outras teacutecnicas eou outros
meacutetodos de anaacutelise como a Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia (CLAE) e Cromatografia
21
Gasosa (CG) sendo assim possiacutevel correlacionar os perfis cromatograacuteficos entre as diferentes
teacutecnicas
ABSTRACT
The medicines are presented as the main toxic agent responsible for cases of human poisoning
thus constituting a major challenge for those working with Public Health However the absence
of a specialized toxicological analysis hinders a more accurate diagnosis of cases The
spectrophotometric and chromatographic techniques may assist in confirming the diagnosis A
Comparative Thin Layer Chromatography (CCDC) is a separation technique simple low cost and
good sensitivity The identification of the drug can be achieved both quantitatively and
qualitatively by infrared spectroscopy Fourier transform (FTIR) This research proposal was to
evaluate two techniques for identification of Alprazolam in urine of patients with toxic exposure
to drugs assessing the selectivity accuracy limit of detection limit of quantification and
robustness in chromatographic techniques The method was optimized validated and applied in
accordance with Resolution RDC Nordm 899 of May 29 2003 The chromatographic assay used
plates of Silica Gel G-60 elution with chloroform-methanol 91 (v v) and as a chromogenic
agent the Reactive Dragendorff The presence of the drug was confirmed by the FTIR analysis
The method proved to be selective chromatographic conditions established by presenting Limit
Detection and Quantification 200μgml and 100μgml respectively Among the patient samples
drug poisoning no positive results obtained for Alprazolam The FTIR analysis showed that the
drug did not undergo degradation in the extraction process The method has proven to meet the
requirements of good practice required by RDC Nordm 899 of 29 May 2003 being sensitive and
accurate
KEYWORDS Alprazolam Spectroscopy Chromatography Intoxication
REFEREcircNCIAS
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27
ANEXO A
28
9
311 Delineamento do estudo e instrumento de coleta de dados
Tratou-se de uma pesquisa prospectiva descritiva e analiacutetica Os dados epidemioloacutegicos
foram coletados dos pacientes admitidos com histoacuteria de exposiccedilatildeo e ou intoxicaccedilatildeo por
medicamentos no Hospital de Emergecircncia e Trauma de Campina Grande atendidos e notificados
pelo Centro de Informaccedilatildeo Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) nos meses de agosto
e setembro de 2012 Utilizou-se a ficha do Sistema Nacional de Agravos de Notificaccedilatildeo
(Sinan)MS para a coleta dos dados epidemioloacutegicos desses pacientes (Anexo A)
312 Variaacuteveis demograacuteficas e socioeconocircmicas
Gecircnero
Faixa Etaacuteria
Ocupaccedilatildeo
313 Variaacuteveis relativas ao evento
Circunstacircncia
314 Variaacutevel relativa ao Agente Toacutexico
Os grupos de medicamentos foram classificados em categorias terapecircuticas segundo o
Anatomical-Therapeutical-ChemicalClassification System (ATC)
Os medicamentos pertencentes ao nono niacutevel dessa classificaccedilatildeo satildeo classificados como
os medicamentos que atuam no sistema nervoso central representado pela letra N Neste niacutevel
estatildeo incluiacutedos os psicodisleacutepticos ansioliacuteticos (NO5B) antipsicoacuteticos (NO5A) hipnoacutetico-
sedativos (NO5C) e os psicoanaleacutepticos antidepressivos (NO6A) e
estimulantespsicoestimulantes (NO6B)
315 Variaacuteveis relativas agrave intoxicaccedilatildeo
Avaliar os sinais e sintomas
Classificar os casos quanto agrave gravidade
10
Quanto ao item gravidade adotamos o seguinte criteacuterio com base no trabalho de King e
Palmisano 1989
Grave o paciente que permanece internado apoacutes procedimentos do tipo lavagem gaacutestrica
ou observaccedilatildeo meacutedica
Moderada ocorre algum procedimento do tipo lavagem gaacutestrica ou observaccedilatildeo meacutedica
mas sem internaccedilatildeo
Leve a famiacutelia recebe somente orientaccedilatildeo ou acompanhamento por telefone e nenhum
procedimento
Ignorada natildeo eacute possiacutevel classificar a extensatildeo do dano
Evoluccedilatildeo
Alta meacutedica (Cura)
Transferecircncia para outra unidade hospitalar
Ignorado
Oacutebito
32 DADOS EXPERIMENTAIS
321 Ensaios de Desenvolvimento e Validaccedilatildeo da Metodologia
Local da Pesquisa Laboratoacuterio de Desenvolvimento e Certificaccedilatildeo de Biomaterias do
Nordeste unidades da UEPB e UFCG
Materiais
Solventes reagentes e outros aparatos
-Alprazolam (faacutermaco) doaccedilatildeo feita pelo Nuacutecleo de odontologia e medicina Legal - NUMOL
-Medicamento (Medley) Alprazolam
-Acetona Vetec
11
-Clorofoacutermio Vetec
-Sulfato de Soacutedio Anidro Vetec
-Metanol (HPLC) Paneac
-Placas de Siacutelica Gel ALUGRAM SIL G 60F de (20x20) cm
2 foram adquiridas da Macherey-
Nagel (REF 818033)
-Cubas Cromatograacuteficas
-Papel de filtro Qualy
Equipamentos
-Estufa Med Clav
-Banho de Ultra-Som ULTRAsonic 1440A
-Centrifuga DCS-16 RV
-Cacircmera de Luz UV (λ=264nm)
-Espectrocircmetro FTIR SPECTRUM 400 Perkin-Elmer (4000 a 600 cm-1 para anaacutelise das
caracteriacutesticas do grupos funcionais dos faacutermacos)
322 Preparaccedilatildeo dos padrotildees
As soluccedilotildees estoque do faacutermaco foram preparadas pela dissoluccedilatildeo de cada composto em
metanol para obter a concentraccedilatildeo de 400 microg mL
323 Preparaccedilatildeo das Amostras
Procedimento de Extraccedilatildeo Extraccedilatildeo Liacutequido-Liacutequido (ELL)
Na fase de desenvolvimento do meacutetodo um importante passo foi a retirada dos
interferentes das amostras Para isto foram realizados vaacuterios procedimentos de Clean-up usando
ELL Para a ELL foi usado o meacutetodo de Stas-Otto que considera o caraacuteter aacutecidobase de cada
substacircncia do meio em que essa se encontra o seu grau de ionizaccedilatildeo como fatores influentes em
sua solubilidade em solventes orgacircnicos pois a partir de mistura desses em proporccedilotildees
adequadas pode-se submeter agraves amostras agrave ELL (FIGURA 01)
Terminada a extraccedilatildeo por sonicaccedilatildeo ou centrifugaccedilatildeo a fase orgacircnica foi recolhida
evaporada e ressuspendida para anaacutelise cromatograacutefica e espectrofotomeacutetrica
12
324 Teacutecnicas
Anaacutelise por CCD
A anaacutelise por CCD foi baseada na metodologia claacutessica descrita por Moraes (1991) com
adaptaccedilatildeo
Os resiacuteduos obtidos por ELL foram ressuspendidos em MetanolAacutegua (91) e aplicados
nas placas cromatograacuteficas previamente ativadas em estufas a 105ordmC por 30 minutos Aplicaram-
se nas placas aliacutequotas de 20 microL dos extratos obtidos por ELL Foi utilizado o sistema solvente
constituiacutedo de mistura de clorofoacutermio-metanol (91) e clorofoacutermio-acetona (41)
Os cromatogramas foram revelados usando meacutetodos quiacutemicos (agentes cromogecircnicos
Reativo de Dragendorff Difenilcarbazona Nitrato de Prata 1 e Cloreto Feacuterrico 5) e meacutetodo
fiacutesico (Cacircmera de Luz UV (λ=264nm)
Figura 01 - Esquema de extraccedilatildeo amostras
FONTE MORAES 1991
325 Estudo de seletividade e recuperaccedilatildeo
Seletividade
A seletividade do meacutetodo foi avaliada atraveacutes da extraccedilatildeo de 6 amostras diferentes de
urinas (n=6) por LLE e depois analisadas por CCDC
25 ml
13
Recuperaccedilatildeo
A extraccedilatildeo para avaliar a recuperaccedilatildeo foi realizada pela anaacutelise de amostras em
triplicatas contaminadas (fortificadas) em trecircs concentraccedilotildees do padratildeo de Alprazolam (baixa=
100microgml meacutedia=200 microgml e alta= 400 microgml)
326 O Limite de Detecccedilatildeo (LD) e o Limite de Quantificaccedilatildeo (LQ)
O Limite de Detecccedilatildeo eacute a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser
detectada mas natildeo necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento
experimental O Limite de Quantificaccedilatildeo eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia
em exame que pode ser medida utilizando um determinado procedimento experimental
O LD foi determinado por anaacutelise de urina contaminada em concentraccedilotildees decrescentes
de faacutermaco e medicamento ateacute a concentraccedilatildeo possiacutevel de se detectar a presenccedila de ambos O LQ
foi determinado por analise de urina contaminada em concentraccedilotildees decrescentes de faacutermaco e
medicamento ateacute a concentraccedilatildeo possiacutevel de se quantificar a presenccedila de ambos
327 Robustez
Na avaliaccedilatildeo da robustez foram utilizados como solventes o metanol a aacutegua uma soluccedilatildeo
de clorofoacutermio- acetona (41) e uma soluccedilatildeo de clorofoacutermio-metanol (91) para preparaccedilatildeo dos
padrotildees de Alprazolam
328 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier - FTIR
Foram feitas anaacutelises de soluccedilotildees metanoacutelicas ( 10 mgmL n=3) do faacutermaco padratildeo e suas
extraccedilotildees utilizando a faixa de varredura de 4000 a 500 cm-1
em temperatura ambiente
4 DADOS E ANAacuteLISE DA PESQUISA
41 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
No periacuteodo de agosto a setembro de 2012 o Ceatox-CG registrou 28 casos com histoacuteria
de intoxicaccedilatildeo por medicamentos Destes 18 casos foram classificados como
14
neuropsicofaacutermacos Na anaacutelise dos casos do uso isolado de medicamentos os Antiepileacutepticos
assim como os Ansioliticos foram os responsaacuteveis pelo maior nuacutemero de ocorrecircncias com um
percentual de 22 (n=4) cada um Um estudo realizado com crianccedilas no estado de Mato Grosso
do Sul verificou que os anticonvulsivantes foram os principais responsaacuteveis pelos eventos toacutexicos
por medicamentos que agem no SNC (MATOS et al 2008)
Ao analisarmos as associaccedilotildees de medicamentos (n=7-39) nos chama a atenccedilatildeo o
nuacutemero de ocorrecircncias por tentativa de suiciacutedio (n=10-557) Bernades Turini e Matsuo
(2010) afirmam que pacientes que tentam suiciacutedio em sua grande maioria fazem uso de mais de
um tipo de substacircncia quiacutemica ndash medicamentosa ou natildeo ndash quando o meacutetodo eacute a intoxicaccedilatildeo
voluntaacuteria
Os eventos toxicoloacutegicos foram mais comuns em mulheres (556) por tentativa de
suiciacutedio (557) e entre adultos e jovens (389) (Tabela 01) Um estudo realizado entre os anos
de 1997 e 2007 no Centro de Controle de Intoxicaccedilatildeo (CCI) em Londrina Paranaacute analisando as
tentativas de suiciacutedio por sobredose intencional de medicamentos com relaccedilatildeo ao gecircnero condiz
com dados aqui obtidos (BERNADES TURINI MATZUO 2010) Por outro lado Gandolfi e
Andrade (2006) mostra o ldquoacidente individualrdquo como principal fator responsaacutevel pelas exposiccedilotildees
toacutexicas a medicamentos em Satildeo Paulo seguido pela tentativa de suiciacutedio
Graacutefico 01 - Grupos farmacoloacutegicos de acordo com a classificaccedilatildeo da ATC responsaacuteveis pelas
intoxicaccedilotildees registradas no Ceatox-CG entre agosto a setembro de 2012 (N= 18)
2239
1722
Associaccedilotildees
N05A
N03A
N05B
NOTA N05A Antipsicoacuteticos N03A Antiepileacuteptico NO5B Ansioliacuteticos e associaccedilatildeo
15
Acerca da ocupaccedilatildeo dos pacientes os estudantes foram os mais frequentes (n=6-333)
Este dado entra em desacordo com a mesma variaacutevel analisada no estudo de Turini et al (2010)
em que mostra que a ocupaccedilatildeo mais relevante nos seu estudo eacute a de empregado (Tabela 01)
Observando-se os sinais e sintomas das intoxicaccedilotildees as Siacutendromes Toacutexicas por
Superdosagem de Sedativos (pupilas mioacuteticas tremor hipotensatildeo confusatildeo mental e sonolecircncia)
e a Extrapiramidal (choro monoacutetono opistoacutetomo e distonia) foram predominantes O quadro
toacutexico se desenvolve dependendo da dose do subgrupo terapecircutico e do tempo entre a exposiccedilatildeo
e o atendimento Os ansioliacuteticos principalmente os Benzodiazepiacutenicos (BZD) satildeo compostos
que apresentam maior iacutendice terapecircutico e menor potencialidade de provocar acidentes fatais e
menor tendecircncia para produzir toleracircncia farmacoloacutegica (FORSAN 2010)
Tabela 01 ndash Frequecircncia do tipo de circunstacircncia da faixa etaacuteria do gecircnero e da ocupaccedilatildeo dos pacientes intoxicados
atendidos no Ceatox-CG
Variaacutevel
N
Circunstacircncia (N=18)
Tentativa de Suiciacutedio 10 557
Acidental 1 57
Outra 7 389
Faixa Etaacuteria (anos) (N=18)
1---9 3 166
10---19 5 278
20---39 7 389
gt 40 3 167
Gecircnero (N=18)
Masculino 8 444
Feminino 10 556
Ocupaccedilatildeo (N=18)
Estudante 6 333
Do lar 4 222
Outra 8 444
16
Em relaccedilatildeo agrave variaacutevel evoluccedilatildeo natildeo se registrou nenhum oacutebito no periacuteodo estudado
Dados nacionais entre os anos de 2007 a 2009 mostram que os medicamentos apresentaram
baixo coeficiente de letalidade meacutedio quando comparado aos agrotoacutexicos de uso agriacutecola e as
drogas de abuso (SISTEMA2012) Um estudo realizado por Mota et al (2012) usando dados
secundaacuterios do Sistema Informaccedilatildeo de Mortalidade (SIM)MS entre 1996 a 2005 identificou
4403 oacutebitos relacionados a medicamentos entretanto natildeo foi possiacutevel estabelecer qual a
principal classe de medicamentos nem o princiacutepio ativo envolvido com o agravo
42 Dados Experimentais
Para otimizaccedilatildeo do meacutetodo vaacuterios procedimentos foram realizados seguindo os
paracircmetros analiacuteticos de validaccedilatildeo objetivando detectar a presenccedila de Alprazolam em urina de
paciente com histoacuterico de exposiccedilatildeo toxica a esse faacutermaco A metodologia desenvolvida e
validada mostrou-se em conformidade com as especificaccedilotildees da Resoluccedilatildeo RDC nordm899 de 29 de
maio de 2003 (BRASIL 2003)
Na avaliaccedilatildeo da seletividade nas amostras de urina analisadas natildeo foram detectados
interferentes nas condiccedilotildees de extraccedilatildeo estabelecidas Assim o meacutetodo mostrou-se seletivo jaacute
que as amostras natildeo mostraram nenhum spot(mancha) semelhante aos desenvolvidos pelos
padrotildees No processo de validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos a especificidade ou seletividade eacute o
primeiro passo para o desenvolvimento de um meacutetodo este paracircmetro deve ser avaliado
continuamente para assegurar a precisatildeo e exatidatildeo deste durante sua validaccedilatildeo (SILVA et al
2010) (Tabela 02)
Para os ensaios de recuperaccedilatildeo foi observada a intensidade do spot desenvolvido em cada
amostra para cada niacutevel de fortificaccedilatildeo Nas amostras fortificadas com 200 microg do padratildeo
obtivemos uma recuperaccedilatildeo de 917 enquanto que nas amostras fortificadas com 400 microg do
mesmo o percentual meacutedio obtido foi de 967 demonstrando assim a exatidatildeo do meacutetodo
Segundo a Resoluccedilatildeo RDC nordm 899 de 29 de maio de 2003 a exatidatildeo se daacute pela concordacircncia
entre o resultado de um ensaio e um valor de referecircncia
17
Tabela 02 ndash Avaliaccedilatildeo da seletividade comparando-se spot e Rf (Relative Front) dos padrotildees de
Alprazolam e amostras branco
Sistema-solvente Agente cromogecircnico
Clorofoacutermio-metanol(91v v)
DI
Clorofoacutermio-acetona(41vv)
DI
FaacutermacoAmostras Rf e Cor Rf e Cor
Padratildeo Alprazolam faacutermaco
Padratildeo Alprazolam comprimido
ABal1
ABal2
ABal3
ABal4
ABal5
05 + c
026 + c
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Nota DI = Dragendorff iodado ABal = amostra branco alcalina Rf = fator de retenccedilatildeo c = cor
castanha
O Limite de Detecccedilatildeo e o Limite de Quantificaccedilatildeo para o Alprazolam foram de
100microgmL e 200 microgmL respectivamente Ribani et al (2004) define o Limite de Detecccedilatildeo (LD)
como sendo a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser detectada mas natildeo
necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento experimental O Limite
de Quantificaccedilatildeo (LQ) eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode
ser medida utilizando um determinado procedimento experimental (Figura 01)
O meacutetodo de extraccedilatildeo utilizado particcedilatildeo liacutequido-liacutequido demonstrou-se eficaz pois a
solubilidade do faacutermaco avaliado possui uma elevada afinidade pela mistura de solventes
utilizados nesse procedimento Na separaccedilatildeo do analito da matriz a sonicaccedilatildeo que eacute o processo
que utiliza a energia das ondas sonoras mais comumente a ultrassom se mostrou mais eficaz que
a centrifugaccedilatildeo
O sistema formado pelos solventes clorofoacutermio-metanol (91 vv) obteve o melhor
resultado em relaccedilatildeo ao sistema solvente clorofoacutermio-acetona(41 vv) tendo em vista melhor
resultado na separaccedilatildeo dos padrotildees e amostras
18
Figura 01-Identificaccedilatildeo de Alprazolam em trecircs niacuteveis de fortificaccedilatildeo (n = 3) alta meacutedia e baixa
Dentre os agentes cromogecircnicos utilizados na revelaccedilatildeo apenas o Reativo de Dragendorff
se mostrou eficaz Observou-se atraveacutes do meacutetodo fiacutesico utilizando a Cacircmera de Luz UV que o
Alprazolam faacutermaco e o Alprazolam comprimido natildeo transmite fluorescecircncia no comprimento
de onda de 366nm
Para avaliaccedilatildeo da Robustez as soluccedilotildees-padratildeo (faacutermaco e medicamento) foram
dissolvidas em diversos solventes como apresentado na Tabela 03 O metanol foi o solvente em
que houve revelaccedilatildeo na placa cromatograacutefica tanto do faacutermaco como do medicamento
Tabela 03 - Anaacutelise dos diferentes solventes da soluccedilatildeo estoque padratildeo puro do faacutermaco e do medicamento de
Alprazolam a partir do Rf
NOTA Rf = Relative Front spot= cormancha
Solvente Alprazolam faacutermaco Alprazolam medicamento
Rf Rf
Metanol 05 026
Aacutegua 06 -
ClorofoacutermioAcetona
(41)
056 -
ClorofoacutermioMetanol
(41)
052 -
AMOSTRAS
PADRAtildeO
19
Os testes de robustez satildeo de fundamental importacircncia para que os analistas conheccedilam
quais fatores devem ser estritamente controlados durante a execuccedilatildeo de um meacutetodo Se as
alteraccedilotildees das condiccedilotildees de anaacutelise produzirem resultados dentro dos limites aceitaacuteveis de
seletividade exatidatildeo e precisatildeo o meacutetodo pode ser considerado robusto e tais variaccedilotildees podem
ser incorporadas ao procedimento (CASSIANO et al 2009)
Apesar do meacutetodo ter se mostrado seletivo para o Alprazolam ele natildeo eacute especifico apenas
para esse faacutermaco Sendo assim o meacutetodo foi aplicado em 7 (sete) amostras de pacientes com
histoacuterico de exposiccedilatildeo toacutexica por medicamentos atendidos pelo Centro de Informaccedilatildeo
Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) poreacutem natildeo foi possiacutevel obter a recuperaccedilatildeo dos
faacutermacos Acredita-se que a quantidade ingerida dos medicamentos pelos pacientes foi baixa ou
que pela demora da coleta da amostra os faacutermacos tenham sido metabolizado pelo organismo
Nos ensaios de confirmaccedilatildeo por FTIR observou-se que o Alprazolam padratildeo apresentou as
seguintes vibraccedilotildees moleculares A deformaccedilatildeo angular N-H de amina secundaacuteria eacute observada na
banda em 1660 cm-1
Em 1647 cm-1
aparece uma banda que pode ser atribuiacuteda ao estiramento
C=N da imina e em 1397 cm-1
aparece uma banda atribuiacuteda ao estiramento C-N das aminas A
banda caracteriacutestica do estiramento =C-H de carbono sp2 do anel aromaacutetico se encontra em 3275
cm-1
O espectro do faacutermaco extraiacutedo da matriz bioloacutegica mantecircm as mesmas caracteriacutesticas do
faacutermaco padratildeo Dessa forma podemos afirmar que a moleacutecula natildeo sofreu alteraccedilatildeo durante o
processo de extraccedilatildeo (Figura 02)
Figura 02 - Espectro da analise no FTIR do padratildeo de Alprazolam faacutermaco e de amostra extraiacuteda
20
5 CONCLUSAtildeO
O meacutetodo demonstrou atender aos requisitos de boas praacuteticas exigidos pela Resoluccedilatildeo
RDC 899 de 29 de maio de 2003 sendo exato e sensiacutevel
Dentre as amostras de pacientes intoxicados por medicamentos natildeo se obteve resultados
positivos para o Alprazolam
Os medicamentos constituem como um dos principais meios utilizado para tentativa de
suiciacutedio tendecircncia que eacute observada nos paiacuteses de terceiro mundo entre eles os psicofaacutermacos os
mais utilizados Haacute necessidade de uma melhor formaccedilatildeo e atualizaccedilatildeo dos profissionais assim
como de informaccedilatildeo aos usuaacuterios e medidas de prevenccedilatildeo que poderiam alertar sobre os riscos e
monitorar o uso desses medicamentos
O Brasil em agosto de 2006 deu o primeiro passo lanccedilando a Portaria nordm 1876 com as
diretrizes nacionais para Prevenccedilatildeo do Suiciacutedio nas trecircs esferas da gestatildeo Portanto estudar e
prevenir as tentativas de suiciacutedio eacute um desafio pois envolve recursos financeiros e sensibilidade
da parte dos profissionais envolvidos
Por outro lado aleacutem do conhecimento dos dados epidemioloacutegicos eacute necessaacuteria a
identificaccedilatildeo dos grupos terapecircuticos responsaacuteveis pelas intoxicaccedilotildees As teacutecnicas
cromatograacuteficas e espectrofotomeacutetricas possuem uma extensa aplicabilidade em pesquisas
cientiacuteficas anaacutelise quiacutemica teste de controle de qualidade de medicamentos entre outros Isso se
daacute por serem teacutecnicas altamente sensiacuteveis de alta resoluccedilatildeo e por ser um meacutetodo mais raacutepido e
preciso Ao analisar traccedilos de compostos em amostras complexas como sangue e urina as
anaacutelises toxicoloacutegicas auxiliam no prognoacutestico e diagnoacutestico de intoxicaccedilotildees uma vez que eacute
possiacutevel identificaccedilatildeo destes compostos em amostras bioloacutegicas
O meacutetodo por CCDC tem caraacuteter semindashquantitativo jaacute que a quantificaccedilatildeo dos faacutermacos eacute
baseada apenas na comparaccedilatildeo visual dos ldquoSpotsrdquo das amostras e dos padrotildees Embora o meacutetodo
seja adequado para triagem os resultados mostram que a quantificaccedilatildeo de faacutermacos por meacutetodos
baseados no uso de CCDC deve possuir uma interpretaccedilatildeo bem cautelosa especialmente devido agrave
incerteza associada a este tipo de comparaccedilatildeo
Se faz necessaacuterio a confirmaccedilatildeo da identidade do faacutermaco por outras teacutecnicas eou outros
meacutetodos de anaacutelise como a Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia (CLAE) e Cromatografia
21
Gasosa (CG) sendo assim possiacutevel correlacionar os perfis cromatograacuteficos entre as diferentes
teacutecnicas
ABSTRACT
The medicines are presented as the main toxic agent responsible for cases of human poisoning
thus constituting a major challenge for those working with Public Health However the absence
of a specialized toxicological analysis hinders a more accurate diagnosis of cases The
spectrophotometric and chromatographic techniques may assist in confirming the diagnosis A
Comparative Thin Layer Chromatography (CCDC) is a separation technique simple low cost and
good sensitivity The identification of the drug can be achieved both quantitatively and
qualitatively by infrared spectroscopy Fourier transform (FTIR) This research proposal was to
evaluate two techniques for identification of Alprazolam in urine of patients with toxic exposure
to drugs assessing the selectivity accuracy limit of detection limit of quantification and
robustness in chromatographic techniques The method was optimized validated and applied in
accordance with Resolution RDC Nordm 899 of May 29 2003 The chromatographic assay used
plates of Silica Gel G-60 elution with chloroform-methanol 91 (v v) and as a chromogenic
agent the Reactive Dragendorff The presence of the drug was confirmed by the FTIR analysis
The method proved to be selective chromatographic conditions established by presenting Limit
Detection and Quantification 200μgml and 100μgml respectively Among the patient samples
drug poisoning no positive results obtained for Alprazolam The FTIR analysis showed that the
drug did not undergo degradation in the extraction process The method has proven to meet the
requirements of good practice required by RDC Nordm 899 of 29 May 2003 being sensitive and
accurate
KEYWORDS Alprazolam Spectroscopy Chromatography Intoxication
REFEREcircNCIAS
AMERICAN ASSOCIATION OF POISON CENTERS TOXIC EXPOSURE SURVEILLANCE
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de setembro de 2012
22
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27
ANEXO A
28
10
Quanto ao item gravidade adotamos o seguinte criteacuterio com base no trabalho de King e
Palmisano 1989
Grave o paciente que permanece internado apoacutes procedimentos do tipo lavagem gaacutestrica
ou observaccedilatildeo meacutedica
Moderada ocorre algum procedimento do tipo lavagem gaacutestrica ou observaccedilatildeo meacutedica
mas sem internaccedilatildeo
Leve a famiacutelia recebe somente orientaccedilatildeo ou acompanhamento por telefone e nenhum
procedimento
Ignorada natildeo eacute possiacutevel classificar a extensatildeo do dano
Evoluccedilatildeo
Alta meacutedica (Cura)
Transferecircncia para outra unidade hospitalar
Ignorado
Oacutebito
32 DADOS EXPERIMENTAIS
321 Ensaios de Desenvolvimento e Validaccedilatildeo da Metodologia
Local da Pesquisa Laboratoacuterio de Desenvolvimento e Certificaccedilatildeo de Biomaterias do
Nordeste unidades da UEPB e UFCG
Materiais
Solventes reagentes e outros aparatos
-Alprazolam (faacutermaco) doaccedilatildeo feita pelo Nuacutecleo de odontologia e medicina Legal - NUMOL
-Medicamento (Medley) Alprazolam
-Acetona Vetec
11
-Clorofoacutermio Vetec
-Sulfato de Soacutedio Anidro Vetec
-Metanol (HPLC) Paneac
-Placas de Siacutelica Gel ALUGRAM SIL G 60F de (20x20) cm
2 foram adquiridas da Macherey-
Nagel (REF 818033)
-Cubas Cromatograacuteficas
-Papel de filtro Qualy
Equipamentos
-Estufa Med Clav
-Banho de Ultra-Som ULTRAsonic 1440A
-Centrifuga DCS-16 RV
-Cacircmera de Luz UV (λ=264nm)
-Espectrocircmetro FTIR SPECTRUM 400 Perkin-Elmer (4000 a 600 cm-1 para anaacutelise das
caracteriacutesticas do grupos funcionais dos faacutermacos)
322 Preparaccedilatildeo dos padrotildees
As soluccedilotildees estoque do faacutermaco foram preparadas pela dissoluccedilatildeo de cada composto em
metanol para obter a concentraccedilatildeo de 400 microg mL
323 Preparaccedilatildeo das Amostras
Procedimento de Extraccedilatildeo Extraccedilatildeo Liacutequido-Liacutequido (ELL)
Na fase de desenvolvimento do meacutetodo um importante passo foi a retirada dos
interferentes das amostras Para isto foram realizados vaacuterios procedimentos de Clean-up usando
ELL Para a ELL foi usado o meacutetodo de Stas-Otto que considera o caraacuteter aacutecidobase de cada
substacircncia do meio em que essa se encontra o seu grau de ionizaccedilatildeo como fatores influentes em
sua solubilidade em solventes orgacircnicos pois a partir de mistura desses em proporccedilotildees
adequadas pode-se submeter agraves amostras agrave ELL (FIGURA 01)
Terminada a extraccedilatildeo por sonicaccedilatildeo ou centrifugaccedilatildeo a fase orgacircnica foi recolhida
evaporada e ressuspendida para anaacutelise cromatograacutefica e espectrofotomeacutetrica
12
324 Teacutecnicas
Anaacutelise por CCD
A anaacutelise por CCD foi baseada na metodologia claacutessica descrita por Moraes (1991) com
adaptaccedilatildeo
Os resiacuteduos obtidos por ELL foram ressuspendidos em MetanolAacutegua (91) e aplicados
nas placas cromatograacuteficas previamente ativadas em estufas a 105ordmC por 30 minutos Aplicaram-
se nas placas aliacutequotas de 20 microL dos extratos obtidos por ELL Foi utilizado o sistema solvente
constituiacutedo de mistura de clorofoacutermio-metanol (91) e clorofoacutermio-acetona (41)
Os cromatogramas foram revelados usando meacutetodos quiacutemicos (agentes cromogecircnicos
Reativo de Dragendorff Difenilcarbazona Nitrato de Prata 1 e Cloreto Feacuterrico 5) e meacutetodo
fiacutesico (Cacircmera de Luz UV (λ=264nm)
Figura 01 - Esquema de extraccedilatildeo amostras
FONTE MORAES 1991
325 Estudo de seletividade e recuperaccedilatildeo
Seletividade
A seletividade do meacutetodo foi avaliada atraveacutes da extraccedilatildeo de 6 amostras diferentes de
urinas (n=6) por LLE e depois analisadas por CCDC
25 ml
13
Recuperaccedilatildeo
A extraccedilatildeo para avaliar a recuperaccedilatildeo foi realizada pela anaacutelise de amostras em
triplicatas contaminadas (fortificadas) em trecircs concentraccedilotildees do padratildeo de Alprazolam (baixa=
100microgml meacutedia=200 microgml e alta= 400 microgml)
326 O Limite de Detecccedilatildeo (LD) e o Limite de Quantificaccedilatildeo (LQ)
O Limite de Detecccedilatildeo eacute a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser
detectada mas natildeo necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento
experimental O Limite de Quantificaccedilatildeo eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia
em exame que pode ser medida utilizando um determinado procedimento experimental
O LD foi determinado por anaacutelise de urina contaminada em concentraccedilotildees decrescentes
de faacutermaco e medicamento ateacute a concentraccedilatildeo possiacutevel de se detectar a presenccedila de ambos O LQ
foi determinado por analise de urina contaminada em concentraccedilotildees decrescentes de faacutermaco e
medicamento ateacute a concentraccedilatildeo possiacutevel de se quantificar a presenccedila de ambos
327 Robustez
Na avaliaccedilatildeo da robustez foram utilizados como solventes o metanol a aacutegua uma soluccedilatildeo
de clorofoacutermio- acetona (41) e uma soluccedilatildeo de clorofoacutermio-metanol (91) para preparaccedilatildeo dos
padrotildees de Alprazolam
328 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier - FTIR
Foram feitas anaacutelises de soluccedilotildees metanoacutelicas ( 10 mgmL n=3) do faacutermaco padratildeo e suas
extraccedilotildees utilizando a faixa de varredura de 4000 a 500 cm-1
em temperatura ambiente
4 DADOS E ANAacuteLISE DA PESQUISA
41 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
No periacuteodo de agosto a setembro de 2012 o Ceatox-CG registrou 28 casos com histoacuteria
de intoxicaccedilatildeo por medicamentos Destes 18 casos foram classificados como
14
neuropsicofaacutermacos Na anaacutelise dos casos do uso isolado de medicamentos os Antiepileacutepticos
assim como os Ansioliticos foram os responsaacuteveis pelo maior nuacutemero de ocorrecircncias com um
percentual de 22 (n=4) cada um Um estudo realizado com crianccedilas no estado de Mato Grosso
do Sul verificou que os anticonvulsivantes foram os principais responsaacuteveis pelos eventos toacutexicos
por medicamentos que agem no SNC (MATOS et al 2008)
Ao analisarmos as associaccedilotildees de medicamentos (n=7-39) nos chama a atenccedilatildeo o
nuacutemero de ocorrecircncias por tentativa de suiciacutedio (n=10-557) Bernades Turini e Matsuo
(2010) afirmam que pacientes que tentam suiciacutedio em sua grande maioria fazem uso de mais de
um tipo de substacircncia quiacutemica ndash medicamentosa ou natildeo ndash quando o meacutetodo eacute a intoxicaccedilatildeo
voluntaacuteria
Os eventos toxicoloacutegicos foram mais comuns em mulheres (556) por tentativa de
suiciacutedio (557) e entre adultos e jovens (389) (Tabela 01) Um estudo realizado entre os anos
de 1997 e 2007 no Centro de Controle de Intoxicaccedilatildeo (CCI) em Londrina Paranaacute analisando as
tentativas de suiciacutedio por sobredose intencional de medicamentos com relaccedilatildeo ao gecircnero condiz
com dados aqui obtidos (BERNADES TURINI MATZUO 2010) Por outro lado Gandolfi e
Andrade (2006) mostra o ldquoacidente individualrdquo como principal fator responsaacutevel pelas exposiccedilotildees
toacutexicas a medicamentos em Satildeo Paulo seguido pela tentativa de suiciacutedio
Graacutefico 01 - Grupos farmacoloacutegicos de acordo com a classificaccedilatildeo da ATC responsaacuteveis pelas
intoxicaccedilotildees registradas no Ceatox-CG entre agosto a setembro de 2012 (N= 18)
2239
1722
Associaccedilotildees
N05A
N03A
N05B
NOTA N05A Antipsicoacuteticos N03A Antiepileacuteptico NO5B Ansioliacuteticos e associaccedilatildeo
15
Acerca da ocupaccedilatildeo dos pacientes os estudantes foram os mais frequentes (n=6-333)
Este dado entra em desacordo com a mesma variaacutevel analisada no estudo de Turini et al (2010)
em que mostra que a ocupaccedilatildeo mais relevante nos seu estudo eacute a de empregado (Tabela 01)
Observando-se os sinais e sintomas das intoxicaccedilotildees as Siacutendromes Toacutexicas por
Superdosagem de Sedativos (pupilas mioacuteticas tremor hipotensatildeo confusatildeo mental e sonolecircncia)
e a Extrapiramidal (choro monoacutetono opistoacutetomo e distonia) foram predominantes O quadro
toacutexico se desenvolve dependendo da dose do subgrupo terapecircutico e do tempo entre a exposiccedilatildeo
e o atendimento Os ansioliacuteticos principalmente os Benzodiazepiacutenicos (BZD) satildeo compostos
que apresentam maior iacutendice terapecircutico e menor potencialidade de provocar acidentes fatais e
menor tendecircncia para produzir toleracircncia farmacoloacutegica (FORSAN 2010)
Tabela 01 ndash Frequecircncia do tipo de circunstacircncia da faixa etaacuteria do gecircnero e da ocupaccedilatildeo dos pacientes intoxicados
atendidos no Ceatox-CG
Variaacutevel
N
Circunstacircncia (N=18)
Tentativa de Suiciacutedio 10 557
Acidental 1 57
Outra 7 389
Faixa Etaacuteria (anos) (N=18)
1---9 3 166
10---19 5 278
20---39 7 389
gt 40 3 167
Gecircnero (N=18)
Masculino 8 444
Feminino 10 556
Ocupaccedilatildeo (N=18)
Estudante 6 333
Do lar 4 222
Outra 8 444
16
Em relaccedilatildeo agrave variaacutevel evoluccedilatildeo natildeo se registrou nenhum oacutebito no periacuteodo estudado
Dados nacionais entre os anos de 2007 a 2009 mostram que os medicamentos apresentaram
baixo coeficiente de letalidade meacutedio quando comparado aos agrotoacutexicos de uso agriacutecola e as
drogas de abuso (SISTEMA2012) Um estudo realizado por Mota et al (2012) usando dados
secundaacuterios do Sistema Informaccedilatildeo de Mortalidade (SIM)MS entre 1996 a 2005 identificou
4403 oacutebitos relacionados a medicamentos entretanto natildeo foi possiacutevel estabelecer qual a
principal classe de medicamentos nem o princiacutepio ativo envolvido com o agravo
42 Dados Experimentais
Para otimizaccedilatildeo do meacutetodo vaacuterios procedimentos foram realizados seguindo os
paracircmetros analiacuteticos de validaccedilatildeo objetivando detectar a presenccedila de Alprazolam em urina de
paciente com histoacuterico de exposiccedilatildeo toxica a esse faacutermaco A metodologia desenvolvida e
validada mostrou-se em conformidade com as especificaccedilotildees da Resoluccedilatildeo RDC nordm899 de 29 de
maio de 2003 (BRASIL 2003)
Na avaliaccedilatildeo da seletividade nas amostras de urina analisadas natildeo foram detectados
interferentes nas condiccedilotildees de extraccedilatildeo estabelecidas Assim o meacutetodo mostrou-se seletivo jaacute
que as amostras natildeo mostraram nenhum spot(mancha) semelhante aos desenvolvidos pelos
padrotildees No processo de validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos a especificidade ou seletividade eacute o
primeiro passo para o desenvolvimento de um meacutetodo este paracircmetro deve ser avaliado
continuamente para assegurar a precisatildeo e exatidatildeo deste durante sua validaccedilatildeo (SILVA et al
2010) (Tabela 02)
Para os ensaios de recuperaccedilatildeo foi observada a intensidade do spot desenvolvido em cada
amostra para cada niacutevel de fortificaccedilatildeo Nas amostras fortificadas com 200 microg do padratildeo
obtivemos uma recuperaccedilatildeo de 917 enquanto que nas amostras fortificadas com 400 microg do
mesmo o percentual meacutedio obtido foi de 967 demonstrando assim a exatidatildeo do meacutetodo
Segundo a Resoluccedilatildeo RDC nordm 899 de 29 de maio de 2003 a exatidatildeo se daacute pela concordacircncia
entre o resultado de um ensaio e um valor de referecircncia
17
Tabela 02 ndash Avaliaccedilatildeo da seletividade comparando-se spot e Rf (Relative Front) dos padrotildees de
Alprazolam e amostras branco
Sistema-solvente Agente cromogecircnico
Clorofoacutermio-metanol(91v v)
DI
Clorofoacutermio-acetona(41vv)
DI
FaacutermacoAmostras Rf e Cor Rf e Cor
Padratildeo Alprazolam faacutermaco
Padratildeo Alprazolam comprimido
ABal1
ABal2
ABal3
ABal4
ABal5
05 + c
026 + c
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Nota DI = Dragendorff iodado ABal = amostra branco alcalina Rf = fator de retenccedilatildeo c = cor
castanha
O Limite de Detecccedilatildeo e o Limite de Quantificaccedilatildeo para o Alprazolam foram de
100microgmL e 200 microgmL respectivamente Ribani et al (2004) define o Limite de Detecccedilatildeo (LD)
como sendo a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser detectada mas natildeo
necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento experimental O Limite
de Quantificaccedilatildeo (LQ) eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode
ser medida utilizando um determinado procedimento experimental (Figura 01)
O meacutetodo de extraccedilatildeo utilizado particcedilatildeo liacutequido-liacutequido demonstrou-se eficaz pois a
solubilidade do faacutermaco avaliado possui uma elevada afinidade pela mistura de solventes
utilizados nesse procedimento Na separaccedilatildeo do analito da matriz a sonicaccedilatildeo que eacute o processo
que utiliza a energia das ondas sonoras mais comumente a ultrassom se mostrou mais eficaz que
a centrifugaccedilatildeo
O sistema formado pelos solventes clorofoacutermio-metanol (91 vv) obteve o melhor
resultado em relaccedilatildeo ao sistema solvente clorofoacutermio-acetona(41 vv) tendo em vista melhor
resultado na separaccedilatildeo dos padrotildees e amostras
18
Figura 01-Identificaccedilatildeo de Alprazolam em trecircs niacuteveis de fortificaccedilatildeo (n = 3) alta meacutedia e baixa
Dentre os agentes cromogecircnicos utilizados na revelaccedilatildeo apenas o Reativo de Dragendorff
se mostrou eficaz Observou-se atraveacutes do meacutetodo fiacutesico utilizando a Cacircmera de Luz UV que o
Alprazolam faacutermaco e o Alprazolam comprimido natildeo transmite fluorescecircncia no comprimento
de onda de 366nm
Para avaliaccedilatildeo da Robustez as soluccedilotildees-padratildeo (faacutermaco e medicamento) foram
dissolvidas em diversos solventes como apresentado na Tabela 03 O metanol foi o solvente em
que houve revelaccedilatildeo na placa cromatograacutefica tanto do faacutermaco como do medicamento
Tabela 03 - Anaacutelise dos diferentes solventes da soluccedilatildeo estoque padratildeo puro do faacutermaco e do medicamento de
Alprazolam a partir do Rf
NOTA Rf = Relative Front spot= cormancha
Solvente Alprazolam faacutermaco Alprazolam medicamento
Rf Rf
Metanol 05 026
Aacutegua 06 -
ClorofoacutermioAcetona
(41)
056 -
ClorofoacutermioMetanol
(41)
052 -
AMOSTRAS
PADRAtildeO
19
Os testes de robustez satildeo de fundamental importacircncia para que os analistas conheccedilam
quais fatores devem ser estritamente controlados durante a execuccedilatildeo de um meacutetodo Se as
alteraccedilotildees das condiccedilotildees de anaacutelise produzirem resultados dentro dos limites aceitaacuteveis de
seletividade exatidatildeo e precisatildeo o meacutetodo pode ser considerado robusto e tais variaccedilotildees podem
ser incorporadas ao procedimento (CASSIANO et al 2009)
Apesar do meacutetodo ter se mostrado seletivo para o Alprazolam ele natildeo eacute especifico apenas
para esse faacutermaco Sendo assim o meacutetodo foi aplicado em 7 (sete) amostras de pacientes com
histoacuterico de exposiccedilatildeo toacutexica por medicamentos atendidos pelo Centro de Informaccedilatildeo
Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) poreacutem natildeo foi possiacutevel obter a recuperaccedilatildeo dos
faacutermacos Acredita-se que a quantidade ingerida dos medicamentos pelos pacientes foi baixa ou
que pela demora da coleta da amostra os faacutermacos tenham sido metabolizado pelo organismo
Nos ensaios de confirmaccedilatildeo por FTIR observou-se que o Alprazolam padratildeo apresentou as
seguintes vibraccedilotildees moleculares A deformaccedilatildeo angular N-H de amina secundaacuteria eacute observada na
banda em 1660 cm-1
Em 1647 cm-1
aparece uma banda que pode ser atribuiacuteda ao estiramento
C=N da imina e em 1397 cm-1
aparece uma banda atribuiacuteda ao estiramento C-N das aminas A
banda caracteriacutestica do estiramento =C-H de carbono sp2 do anel aromaacutetico se encontra em 3275
cm-1
O espectro do faacutermaco extraiacutedo da matriz bioloacutegica mantecircm as mesmas caracteriacutesticas do
faacutermaco padratildeo Dessa forma podemos afirmar que a moleacutecula natildeo sofreu alteraccedilatildeo durante o
processo de extraccedilatildeo (Figura 02)
Figura 02 - Espectro da analise no FTIR do padratildeo de Alprazolam faacutermaco e de amostra extraiacuteda
20
5 CONCLUSAtildeO
O meacutetodo demonstrou atender aos requisitos de boas praacuteticas exigidos pela Resoluccedilatildeo
RDC 899 de 29 de maio de 2003 sendo exato e sensiacutevel
Dentre as amostras de pacientes intoxicados por medicamentos natildeo se obteve resultados
positivos para o Alprazolam
Os medicamentos constituem como um dos principais meios utilizado para tentativa de
suiciacutedio tendecircncia que eacute observada nos paiacuteses de terceiro mundo entre eles os psicofaacutermacos os
mais utilizados Haacute necessidade de uma melhor formaccedilatildeo e atualizaccedilatildeo dos profissionais assim
como de informaccedilatildeo aos usuaacuterios e medidas de prevenccedilatildeo que poderiam alertar sobre os riscos e
monitorar o uso desses medicamentos
O Brasil em agosto de 2006 deu o primeiro passo lanccedilando a Portaria nordm 1876 com as
diretrizes nacionais para Prevenccedilatildeo do Suiciacutedio nas trecircs esferas da gestatildeo Portanto estudar e
prevenir as tentativas de suiciacutedio eacute um desafio pois envolve recursos financeiros e sensibilidade
da parte dos profissionais envolvidos
Por outro lado aleacutem do conhecimento dos dados epidemioloacutegicos eacute necessaacuteria a
identificaccedilatildeo dos grupos terapecircuticos responsaacuteveis pelas intoxicaccedilotildees As teacutecnicas
cromatograacuteficas e espectrofotomeacutetricas possuem uma extensa aplicabilidade em pesquisas
cientiacuteficas anaacutelise quiacutemica teste de controle de qualidade de medicamentos entre outros Isso se
daacute por serem teacutecnicas altamente sensiacuteveis de alta resoluccedilatildeo e por ser um meacutetodo mais raacutepido e
preciso Ao analisar traccedilos de compostos em amostras complexas como sangue e urina as
anaacutelises toxicoloacutegicas auxiliam no prognoacutestico e diagnoacutestico de intoxicaccedilotildees uma vez que eacute
possiacutevel identificaccedilatildeo destes compostos em amostras bioloacutegicas
O meacutetodo por CCDC tem caraacuteter semindashquantitativo jaacute que a quantificaccedilatildeo dos faacutermacos eacute
baseada apenas na comparaccedilatildeo visual dos ldquoSpotsrdquo das amostras e dos padrotildees Embora o meacutetodo
seja adequado para triagem os resultados mostram que a quantificaccedilatildeo de faacutermacos por meacutetodos
baseados no uso de CCDC deve possuir uma interpretaccedilatildeo bem cautelosa especialmente devido agrave
incerteza associada a este tipo de comparaccedilatildeo
Se faz necessaacuterio a confirmaccedilatildeo da identidade do faacutermaco por outras teacutecnicas eou outros
meacutetodos de anaacutelise como a Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia (CLAE) e Cromatografia
21
Gasosa (CG) sendo assim possiacutevel correlacionar os perfis cromatograacuteficos entre as diferentes
teacutecnicas
ABSTRACT
The medicines are presented as the main toxic agent responsible for cases of human poisoning
thus constituting a major challenge for those working with Public Health However the absence
of a specialized toxicological analysis hinders a more accurate diagnosis of cases The
spectrophotometric and chromatographic techniques may assist in confirming the diagnosis A
Comparative Thin Layer Chromatography (CCDC) is a separation technique simple low cost and
good sensitivity The identification of the drug can be achieved both quantitatively and
qualitatively by infrared spectroscopy Fourier transform (FTIR) This research proposal was to
evaluate two techniques for identification of Alprazolam in urine of patients with toxic exposure
to drugs assessing the selectivity accuracy limit of detection limit of quantification and
robustness in chromatographic techniques The method was optimized validated and applied in
accordance with Resolution RDC Nordm 899 of May 29 2003 The chromatographic assay used
plates of Silica Gel G-60 elution with chloroform-methanol 91 (v v) and as a chromogenic
agent the Reactive Dragendorff The presence of the drug was confirmed by the FTIR analysis
The method proved to be selective chromatographic conditions established by presenting Limit
Detection and Quantification 200μgml and 100μgml respectively Among the patient samples
drug poisoning no positive results obtained for Alprazolam The FTIR analysis showed that the
drug did not undergo degradation in the extraction process The method has proven to meet the
requirements of good practice required by RDC Nordm 899 of 29 May 2003 being sensitive and
accurate
KEYWORDS Alprazolam Spectroscopy Chromatography Intoxication
REFEREcircNCIAS
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SYSTEM (AAPCC) Disponivel em lt httpwwwaapccorgdnndefaultaspx gt acessado em 18
de setembro de 2012
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26
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27
ANEXO A
28
11
-Clorofoacutermio Vetec
-Sulfato de Soacutedio Anidro Vetec
-Metanol (HPLC) Paneac
-Placas de Siacutelica Gel ALUGRAM SIL G 60F de (20x20) cm
2 foram adquiridas da Macherey-
Nagel (REF 818033)
-Cubas Cromatograacuteficas
-Papel de filtro Qualy
Equipamentos
-Estufa Med Clav
-Banho de Ultra-Som ULTRAsonic 1440A
-Centrifuga DCS-16 RV
-Cacircmera de Luz UV (λ=264nm)
-Espectrocircmetro FTIR SPECTRUM 400 Perkin-Elmer (4000 a 600 cm-1 para anaacutelise das
caracteriacutesticas do grupos funcionais dos faacutermacos)
322 Preparaccedilatildeo dos padrotildees
As soluccedilotildees estoque do faacutermaco foram preparadas pela dissoluccedilatildeo de cada composto em
metanol para obter a concentraccedilatildeo de 400 microg mL
323 Preparaccedilatildeo das Amostras
Procedimento de Extraccedilatildeo Extraccedilatildeo Liacutequido-Liacutequido (ELL)
Na fase de desenvolvimento do meacutetodo um importante passo foi a retirada dos
interferentes das amostras Para isto foram realizados vaacuterios procedimentos de Clean-up usando
ELL Para a ELL foi usado o meacutetodo de Stas-Otto que considera o caraacuteter aacutecidobase de cada
substacircncia do meio em que essa se encontra o seu grau de ionizaccedilatildeo como fatores influentes em
sua solubilidade em solventes orgacircnicos pois a partir de mistura desses em proporccedilotildees
adequadas pode-se submeter agraves amostras agrave ELL (FIGURA 01)
Terminada a extraccedilatildeo por sonicaccedilatildeo ou centrifugaccedilatildeo a fase orgacircnica foi recolhida
evaporada e ressuspendida para anaacutelise cromatograacutefica e espectrofotomeacutetrica
12
324 Teacutecnicas
Anaacutelise por CCD
A anaacutelise por CCD foi baseada na metodologia claacutessica descrita por Moraes (1991) com
adaptaccedilatildeo
Os resiacuteduos obtidos por ELL foram ressuspendidos em MetanolAacutegua (91) e aplicados
nas placas cromatograacuteficas previamente ativadas em estufas a 105ordmC por 30 minutos Aplicaram-
se nas placas aliacutequotas de 20 microL dos extratos obtidos por ELL Foi utilizado o sistema solvente
constituiacutedo de mistura de clorofoacutermio-metanol (91) e clorofoacutermio-acetona (41)
Os cromatogramas foram revelados usando meacutetodos quiacutemicos (agentes cromogecircnicos
Reativo de Dragendorff Difenilcarbazona Nitrato de Prata 1 e Cloreto Feacuterrico 5) e meacutetodo
fiacutesico (Cacircmera de Luz UV (λ=264nm)
Figura 01 - Esquema de extraccedilatildeo amostras
FONTE MORAES 1991
325 Estudo de seletividade e recuperaccedilatildeo
Seletividade
A seletividade do meacutetodo foi avaliada atraveacutes da extraccedilatildeo de 6 amostras diferentes de
urinas (n=6) por LLE e depois analisadas por CCDC
25 ml
13
Recuperaccedilatildeo
A extraccedilatildeo para avaliar a recuperaccedilatildeo foi realizada pela anaacutelise de amostras em
triplicatas contaminadas (fortificadas) em trecircs concentraccedilotildees do padratildeo de Alprazolam (baixa=
100microgml meacutedia=200 microgml e alta= 400 microgml)
326 O Limite de Detecccedilatildeo (LD) e o Limite de Quantificaccedilatildeo (LQ)
O Limite de Detecccedilatildeo eacute a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser
detectada mas natildeo necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento
experimental O Limite de Quantificaccedilatildeo eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia
em exame que pode ser medida utilizando um determinado procedimento experimental
O LD foi determinado por anaacutelise de urina contaminada em concentraccedilotildees decrescentes
de faacutermaco e medicamento ateacute a concentraccedilatildeo possiacutevel de se detectar a presenccedila de ambos O LQ
foi determinado por analise de urina contaminada em concentraccedilotildees decrescentes de faacutermaco e
medicamento ateacute a concentraccedilatildeo possiacutevel de se quantificar a presenccedila de ambos
327 Robustez
Na avaliaccedilatildeo da robustez foram utilizados como solventes o metanol a aacutegua uma soluccedilatildeo
de clorofoacutermio- acetona (41) e uma soluccedilatildeo de clorofoacutermio-metanol (91) para preparaccedilatildeo dos
padrotildees de Alprazolam
328 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier - FTIR
Foram feitas anaacutelises de soluccedilotildees metanoacutelicas ( 10 mgmL n=3) do faacutermaco padratildeo e suas
extraccedilotildees utilizando a faixa de varredura de 4000 a 500 cm-1
em temperatura ambiente
4 DADOS E ANAacuteLISE DA PESQUISA
41 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
No periacuteodo de agosto a setembro de 2012 o Ceatox-CG registrou 28 casos com histoacuteria
de intoxicaccedilatildeo por medicamentos Destes 18 casos foram classificados como
14
neuropsicofaacutermacos Na anaacutelise dos casos do uso isolado de medicamentos os Antiepileacutepticos
assim como os Ansioliticos foram os responsaacuteveis pelo maior nuacutemero de ocorrecircncias com um
percentual de 22 (n=4) cada um Um estudo realizado com crianccedilas no estado de Mato Grosso
do Sul verificou que os anticonvulsivantes foram os principais responsaacuteveis pelos eventos toacutexicos
por medicamentos que agem no SNC (MATOS et al 2008)
Ao analisarmos as associaccedilotildees de medicamentos (n=7-39) nos chama a atenccedilatildeo o
nuacutemero de ocorrecircncias por tentativa de suiciacutedio (n=10-557) Bernades Turini e Matsuo
(2010) afirmam que pacientes que tentam suiciacutedio em sua grande maioria fazem uso de mais de
um tipo de substacircncia quiacutemica ndash medicamentosa ou natildeo ndash quando o meacutetodo eacute a intoxicaccedilatildeo
voluntaacuteria
Os eventos toxicoloacutegicos foram mais comuns em mulheres (556) por tentativa de
suiciacutedio (557) e entre adultos e jovens (389) (Tabela 01) Um estudo realizado entre os anos
de 1997 e 2007 no Centro de Controle de Intoxicaccedilatildeo (CCI) em Londrina Paranaacute analisando as
tentativas de suiciacutedio por sobredose intencional de medicamentos com relaccedilatildeo ao gecircnero condiz
com dados aqui obtidos (BERNADES TURINI MATZUO 2010) Por outro lado Gandolfi e
Andrade (2006) mostra o ldquoacidente individualrdquo como principal fator responsaacutevel pelas exposiccedilotildees
toacutexicas a medicamentos em Satildeo Paulo seguido pela tentativa de suiciacutedio
Graacutefico 01 - Grupos farmacoloacutegicos de acordo com a classificaccedilatildeo da ATC responsaacuteveis pelas
intoxicaccedilotildees registradas no Ceatox-CG entre agosto a setembro de 2012 (N= 18)
2239
1722
Associaccedilotildees
N05A
N03A
N05B
NOTA N05A Antipsicoacuteticos N03A Antiepileacuteptico NO5B Ansioliacuteticos e associaccedilatildeo
15
Acerca da ocupaccedilatildeo dos pacientes os estudantes foram os mais frequentes (n=6-333)
Este dado entra em desacordo com a mesma variaacutevel analisada no estudo de Turini et al (2010)
em que mostra que a ocupaccedilatildeo mais relevante nos seu estudo eacute a de empregado (Tabela 01)
Observando-se os sinais e sintomas das intoxicaccedilotildees as Siacutendromes Toacutexicas por
Superdosagem de Sedativos (pupilas mioacuteticas tremor hipotensatildeo confusatildeo mental e sonolecircncia)
e a Extrapiramidal (choro monoacutetono opistoacutetomo e distonia) foram predominantes O quadro
toacutexico se desenvolve dependendo da dose do subgrupo terapecircutico e do tempo entre a exposiccedilatildeo
e o atendimento Os ansioliacuteticos principalmente os Benzodiazepiacutenicos (BZD) satildeo compostos
que apresentam maior iacutendice terapecircutico e menor potencialidade de provocar acidentes fatais e
menor tendecircncia para produzir toleracircncia farmacoloacutegica (FORSAN 2010)
Tabela 01 ndash Frequecircncia do tipo de circunstacircncia da faixa etaacuteria do gecircnero e da ocupaccedilatildeo dos pacientes intoxicados
atendidos no Ceatox-CG
Variaacutevel
N
Circunstacircncia (N=18)
Tentativa de Suiciacutedio 10 557
Acidental 1 57
Outra 7 389
Faixa Etaacuteria (anos) (N=18)
1---9 3 166
10---19 5 278
20---39 7 389
gt 40 3 167
Gecircnero (N=18)
Masculino 8 444
Feminino 10 556
Ocupaccedilatildeo (N=18)
Estudante 6 333
Do lar 4 222
Outra 8 444
16
Em relaccedilatildeo agrave variaacutevel evoluccedilatildeo natildeo se registrou nenhum oacutebito no periacuteodo estudado
Dados nacionais entre os anos de 2007 a 2009 mostram que os medicamentos apresentaram
baixo coeficiente de letalidade meacutedio quando comparado aos agrotoacutexicos de uso agriacutecola e as
drogas de abuso (SISTEMA2012) Um estudo realizado por Mota et al (2012) usando dados
secundaacuterios do Sistema Informaccedilatildeo de Mortalidade (SIM)MS entre 1996 a 2005 identificou
4403 oacutebitos relacionados a medicamentos entretanto natildeo foi possiacutevel estabelecer qual a
principal classe de medicamentos nem o princiacutepio ativo envolvido com o agravo
42 Dados Experimentais
Para otimizaccedilatildeo do meacutetodo vaacuterios procedimentos foram realizados seguindo os
paracircmetros analiacuteticos de validaccedilatildeo objetivando detectar a presenccedila de Alprazolam em urina de
paciente com histoacuterico de exposiccedilatildeo toxica a esse faacutermaco A metodologia desenvolvida e
validada mostrou-se em conformidade com as especificaccedilotildees da Resoluccedilatildeo RDC nordm899 de 29 de
maio de 2003 (BRASIL 2003)
Na avaliaccedilatildeo da seletividade nas amostras de urina analisadas natildeo foram detectados
interferentes nas condiccedilotildees de extraccedilatildeo estabelecidas Assim o meacutetodo mostrou-se seletivo jaacute
que as amostras natildeo mostraram nenhum spot(mancha) semelhante aos desenvolvidos pelos
padrotildees No processo de validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos a especificidade ou seletividade eacute o
primeiro passo para o desenvolvimento de um meacutetodo este paracircmetro deve ser avaliado
continuamente para assegurar a precisatildeo e exatidatildeo deste durante sua validaccedilatildeo (SILVA et al
2010) (Tabela 02)
Para os ensaios de recuperaccedilatildeo foi observada a intensidade do spot desenvolvido em cada
amostra para cada niacutevel de fortificaccedilatildeo Nas amostras fortificadas com 200 microg do padratildeo
obtivemos uma recuperaccedilatildeo de 917 enquanto que nas amostras fortificadas com 400 microg do
mesmo o percentual meacutedio obtido foi de 967 demonstrando assim a exatidatildeo do meacutetodo
Segundo a Resoluccedilatildeo RDC nordm 899 de 29 de maio de 2003 a exatidatildeo se daacute pela concordacircncia
entre o resultado de um ensaio e um valor de referecircncia
17
Tabela 02 ndash Avaliaccedilatildeo da seletividade comparando-se spot e Rf (Relative Front) dos padrotildees de
Alprazolam e amostras branco
Sistema-solvente Agente cromogecircnico
Clorofoacutermio-metanol(91v v)
DI
Clorofoacutermio-acetona(41vv)
DI
FaacutermacoAmostras Rf e Cor Rf e Cor
Padratildeo Alprazolam faacutermaco
Padratildeo Alprazolam comprimido
ABal1
ABal2
ABal3
ABal4
ABal5
05 + c
026 + c
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Nota DI = Dragendorff iodado ABal = amostra branco alcalina Rf = fator de retenccedilatildeo c = cor
castanha
O Limite de Detecccedilatildeo e o Limite de Quantificaccedilatildeo para o Alprazolam foram de
100microgmL e 200 microgmL respectivamente Ribani et al (2004) define o Limite de Detecccedilatildeo (LD)
como sendo a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser detectada mas natildeo
necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento experimental O Limite
de Quantificaccedilatildeo (LQ) eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode
ser medida utilizando um determinado procedimento experimental (Figura 01)
O meacutetodo de extraccedilatildeo utilizado particcedilatildeo liacutequido-liacutequido demonstrou-se eficaz pois a
solubilidade do faacutermaco avaliado possui uma elevada afinidade pela mistura de solventes
utilizados nesse procedimento Na separaccedilatildeo do analito da matriz a sonicaccedilatildeo que eacute o processo
que utiliza a energia das ondas sonoras mais comumente a ultrassom se mostrou mais eficaz que
a centrifugaccedilatildeo
O sistema formado pelos solventes clorofoacutermio-metanol (91 vv) obteve o melhor
resultado em relaccedilatildeo ao sistema solvente clorofoacutermio-acetona(41 vv) tendo em vista melhor
resultado na separaccedilatildeo dos padrotildees e amostras
18
Figura 01-Identificaccedilatildeo de Alprazolam em trecircs niacuteveis de fortificaccedilatildeo (n = 3) alta meacutedia e baixa
Dentre os agentes cromogecircnicos utilizados na revelaccedilatildeo apenas o Reativo de Dragendorff
se mostrou eficaz Observou-se atraveacutes do meacutetodo fiacutesico utilizando a Cacircmera de Luz UV que o
Alprazolam faacutermaco e o Alprazolam comprimido natildeo transmite fluorescecircncia no comprimento
de onda de 366nm
Para avaliaccedilatildeo da Robustez as soluccedilotildees-padratildeo (faacutermaco e medicamento) foram
dissolvidas em diversos solventes como apresentado na Tabela 03 O metanol foi o solvente em
que houve revelaccedilatildeo na placa cromatograacutefica tanto do faacutermaco como do medicamento
Tabela 03 - Anaacutelise dos diferentes solventes da soluccedilatildeo estoque padratildeo puro do faacutermaco e do medicamento de
Alprazolam a partir do Rf
NOTA Rf = Relative Front spot= cormancha
Solvente Alprazolam faacutermaco Alprazolam medicamento
Rf Rf
Metanol 05 026
Aacutegua 06 -
ClorofoacutermioAcetona
(41)
056 -
ClorofoacutermioMetanol
(41)
052 -
AMOSTRAS
PADRAtildeO
19
Os testes de robustez satildeo de fundamental importacircncia para que os analistas conheccedilam
quais fatores devem ser estritamente controlados durante a execuccedilatildeo de um meacutetodo Se as
alteraccedilotildees das condiccedilotildees de anaacutelise produzirem resultados dentro dos limites aceitaacuteveis de
seletividade exatidatildeo e precisatildeo o meacutetodo pode ser considerado robusto e tais variaccedilotildees podem
ser incorporadas ao procedimento (CASSIANO et al 2009)
Apesar do meacutetodo ter se mostrado seletivo para o Alprazolam ele natildeo eacute especifico apenas
para esse faacutermaco Sendo assim o meacutetodo foi aplicado em 7 (sete) amostras de pacientes com
histoacuterico de exposiccedilatildeo toacutexica por medicamentos atendidos pelo Centro de Informaccedilatildeo
Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) poreacutem natildeo foi possiacutevel obter a recuperaccedilatildeo dos
faacutermacos Acredita-se que a quantidade ingerida dos medicamentos pelos pacientes foi baixa ou
que pela demora da coleta da amostra os faacutermacos tenham sido metabolizado pelo organismo
Nos ensaios de confirmaccedilatildeo por FTIR observou-se que o Alprazolam padratildeo apresentou as
seguintes vibraccedilotildees moleculares A deformaccedilatildeo angular N-H de amina secundaacuteria eacute observada na
banda em 1660 cm-1
Em 1647 cm-1
aparece uma banda que pode ser atribuiacuteda ao estiramento
C=N da imina e em 1397 cm-1
aparece uma banda atribuiacuteda ao estiramento C-N das aminas A
banda caracteriacutestica do estiramento =C-H de carbono sp2 do anel aromaacutetico se encontra em 3275
cm-1
O espectro do faacutermaco extraiacutedo da matriz bioloacutegica mantecircm as mesmas caracteriacutesticas do
faacutermaco padratildeo Dessa forma podemos afirmar que a moleacutecula natildeo sofreu alteraccedilatildeo durante o
processo de extraccedilatildeo (Figura 02)
Figura 02 - Espectro da analise no FTIR do padratildeo de Alprazolam faacutermaco e de amostra extraiacuteda
20
5 CONCLUSAtildeO
O meacutetodo demonstrou atender aos requisitos de boas praacuteticas exigidos pela Resoluccedilatildeo
RDC 899 de 29 de maio de 2003 sendo exato e sensiacutevel
Dentre as amostras de pacientes intoxicados por medicamentos natildeo se obteve resultados
positivos para o Alprazolam
Os medicamentos constituem como um dos principais meios utilizado para tentativa de
suiciacutedio tendecircncia que eacute observada nos paiacuteses de terceiro mundo entre eles os psicofaacutermacos os
mais utilizados Haacute necessidade de uma melhor formaccedilatildeo e atualizaccedilatildeo dos profissionais assim
como de informaccedilatildeo aos usuaacuterios e medidas de prevenccedilatildeo que poderiam alertar sobre os riscos e
monitorar o uso desses medicamentos
O Brasil em agosto de 2006 deu o primeiro passo lanccedilando a Portaria nordm 1876 com as
diretrizes nacionais para Prevenccedilatildeo do Suiciacutedio nas trecircs esferas da gestatildeo Portanto estudar e
prevenir as tentativas de suiciacutedio eacute um desafio pois envolve recursos financeiros e sensibilidade
da parte dos profissionais envolvidos
Por outro lado aleacutem do conhecimento dos dados epidemioloacutegicos eacute necessaacuteria a
identificaccedilatildeo dos grupos terapecircuticos responsaacuteveis pelas intoxicaccedilotildees As teacutecnicas
cromatograacuteficas e espectrofotomeacutetricas possuem uma extensa aplicabilidade em pesquisas
cientiacuteficas anaacutelise quiacutemica teste de controle de qualidade de medicamentos entre outros Isso se
daacute por serem teacutecnicas altamente sensiacuteveis de alta resoluccedilatildeo e por ser um meacutetodo mais raacutepido e
preciso Ao analisar traccedilos de compostos em amostras complexas como sangue e urina as
anaacutelises toxicoloacutegicas auxiliam no prognoacutestico e diagnoacutestico de intoxicaccedilotildees uma vez que eacute
possiacutevel identificaccedilatildeo destes compostos em amostras bioloacutegicas
O meacutetodo por CCDC tem caraacuteter semindashquantitativo jaacute que a quantificaccedilatildeo dos faacutermacos eacute
baseada apenas na comparaccedilatildeo visual dos ldquoSpotsrdquo das amostras e dos padrotildees Embora o meacutetodo
seja adequado para triagem os resultados mostram que a quantificaccedilatildeo de faacutermacos por meacutetodos
baseados no uso de CCDC deve possuir uma interpretaccedilatildeo bem cautelosa especialmente devido agrave
incerteza associada a este tipo de comparaccedilatildeo
Se faz necessaacuterio a confirmaccedilatildeo da identidade do faacutermaco por outras teacutecnicas eou outros
meacutetodos de anaacutelise como a Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia (CLAE) e Cromatografia
21
Gasosa (CG) sendo assim possiacutevel correlacionar os perfis cromatograacuteficos entre as diferentes
teacutecnicas
ABSTRACT
The medicines are presented as the main toxic agent responsible for cases of human poisoning
thus constituting a major challenge for those working with Public Health However the absence
of a specialized toxicological analysis hinders a more accurate diagnosis of cases The
spectrophotometric and chromatographic techniques may assist in confirming the diagnosis A
Comparative Thin Layer Chromatography (CCDC) is a separation technique simple low cost and
good sensitivity The identification of the drug can be achieved both quantitatively and
qualitatively by infrared spectroscopy Fourier transform (FTIR) This research proposal was to
evaluate two techniques for identification of Alprazolam in urine of patients with toxic exposure
to drugs assessing the selectivity accuracy limit of detection limit of quantification and
robustness in chromatographic techniques The method was optimized validated and applied in
accordance with Resolution RDC Nordm 899 of May 29 2003 The chromatographic assay used
plates of Silica Gel G-60 elution with chloroform-methanol 91 (v v) and as a chromogenic
agent the Reactive Dragendorff The presence of the drug was confirmed by the FTIR analysis
The method proved to be selective chromatographic conditions established by presenting Limit
Detection and Quantification 200μgml and 100μgml respectively Among the patient samples
drug poisoning no positive results obtained for Alprazolam The FTIR analysis showed that the
drug did not undergo degradation in the extraction process The method has proven to meet the
requirements of good practice required by RDC Nordm 899 of 29 May 2003 being sensitive and
accurate
KEYWORDS Alprazolam Spectroscopy Chromatography Intoxication
REFEREcircNCIAS
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27
ANEXO A
28
12
324 Teacutecnicas
Anaacutelise por CCD
A anaacutelise por CCD foi baseada na metodologia claacutessica descrita por Moraes (1991) com
adaptaccedilatildeo
Os resiacuteduos obtidos por ELL foram ressuspendidos em MetanolAacutegua (91) e aplicados
nas placas cromatograacuteficas previamente ativadas em estufas a 105ordmC por 30 minutos Aplicaram-
se nas placas aliacutequotas de 20 microL dos extratos obtidos por ELL Foi utilizado o sistema solvente
constituiacutedo de mistura de clorofoacutermio-metanol (91) e clorofoacutermio-acetona (41)
Os cromatogramas foram revelados usando meacutetodos quiacutemicos (agentes cromogecircnicos
Reativo de Dragendorff Difenilcarbazona Nitrato de Prata 1 e Cloreto Feacuterrico 5) e meacutetodo
fiacutesico (Cacircmera de Luz UV (λ=264nm)
Figura 01 - Esquema de extraccedilatildeo amostras
FONTE MORAES 1991
325 Estudo de seletividade e recuperaccedilatildeo
Seletividade
A seletividade do meacutetodo foi avaliada atraveacutes da extraccedilatildeo de 6 amostras diferentes de
urinas (n=6) por LLE e depois analisadas por CCDC
25 ml
13
Recuperaccedilatildeo
A extraccedilatildeo para avaliar a recuperaccedilatildeo foi realizada pela anaacutelise de amostras em
triplicatas contaminadas (fortificadas) em trecircs concentraccedilotildees do padratildeo de Alprazolam (baixa=
100microgml meacutedia=200 microgml e alta= 400 microgml)
326 O Limite de Detecccedilatildeo (LD) e o Limite de Quantificaccedilatildeo (LQ)
O Limite de Detecccedilatildeo eacute a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser
detectada mas natildeo necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento
experimental O Limite de Quantificaccedilatildeo eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia
em exame que pode ser medida utilizando um determinado procedimento experimental
O LD foi determinado por anaacutelise de urina contaminada em concentraccedilotildees decrescentes
de faacutermaco e medicamento ateacute a concentraccedilatildeo possiacutevel de se detectar a presenccedila de ambos O LQ
foi determinado por analise de urina contaminada em concentraccedilotildees decrescentes de faacutermaco e
medicamento ateacute a concentraccedilatildeo possiacutevel de se quantificar a presenccedila de ambos
327 Robustez
Na avaliaccedilatildeo da robustez foram utilizados como solventes o metanol a aacutegua uma soluccedilatildeo
de clorofoacutermio- acetona (41) e uma soluccedilatildeo de clorofoacutermio-metanol (91) para preparaccedilatildeo dos
padrotildees de Alprazolam
328 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier - FTIR
Foram feitas anaacutelises de soluccedilotildees metanoacutelicas ( 10 mgmL n=3) do faacutermaco padratildeo e suas
extraccedilotildees utilizando a faixa de varredura de 4000 a 500 cm-1
em temperatura ambiente
4 DADOS E ANAacuteLISE DA PESQUISA
41 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
No periacuteodo de agosto a setembro de 2012 o Ceatox-CG registrou 28 casos com histoacuteria
de intoxicaccedilatildeo por medicamentos Destes 18 casos foram classificados como
14
neuropsicofaacutermacos Na anaacutelise dos casos do uso isolado de medicamentos os Antiepileacutepticos
assim como os Ansioliticos foram os responsaacuteveis pelo maior nuacutemero de ocorrecircncias com um
percentual de 22 (n=4) cada um Um estudo realizado com crianccedilas no estado de Mato Grosso
do Sul verificou que os anticonvulsivantes foram os principais responsaacuteveis pelos eventos toacutexicos
por medicamentos que agem no SNC (MATOS et al 2008)
Ao analisarmos as associaccedilotildees de medicamentos (n=7-39) nos chama a atenccedilatildeo o
nuacutemero de ocorrecircncias por tentativa de suiciacutedio (n=10-557) Bernades Turini e Matsuo
(2010) afirmam que pacientes que tentam suiciacutedio em sua grande maioria fazem uso de mais de
um tipo de substacircncia quiacutemica ndash medicamentosa ou natildeo ndash quando o meacutetodo eacute a intoxicaccedilatildeo
voluntaacuteria
Os eventos toxicoloacutegicos foram mais comuns em mulheres (556) por tentativa de
suiciacutedio (557) e entre adultos e jovens (389) (Tabela 01) Um estudo realizado entre os anos
de 1997 e 2007 no Centro de Controle de Intoxicaccedilatildeo (CCI) em Londrina Paranaacute analisando as
tentativas de suiciacutedio por sobredose intencional de medicamentos com relaccedilatildeo ao gecircnero condiz
com dados aqui obtidos (BERNADES TURINI MATZUO 2010) Por outro lado Gandolfi e
Andrade (2006) mostra o ldquoacidente individualrdquo como principal fator responsaacutevel pelas exposiccedilotildees
toacutexicas a medicamentos em Satildeo Paulo seguido pela tentativa de suiciacutedio
Graacutefico 01 - Grupos farmacoloacutegicos de acordo com a classificaccedilatildeo da ATC responsaacuteveis pelas
intoxicaccedilotildees registradas no Ceatox-CG entre agosto a setembro de 2012 (N= 18)
2239
1722
Associaccedilotildees
N05A
N03A
N05B
NOTA N05A Antipsicoacuteticos N03A Antiepileacuteptico NO5B Ansioliacuteticos e associaccedilatildeo
15
Acerca da ocupaccedilatildeo dos pacientes os estudantes foram os mais frequentes (n=6-333)
Este dado entra em desacordo com a mesma variaacutevel analisada no estudo de Turini et al (2010)
em que mostra que a ocupaccedilatildeo mais relevante nos seu estudo eacute a de empregado (Tabela 01)
Observando-se os sinais e sintomas das intoxicaccedilotildees as Siacutendromes Toacutexicas por
Superdosagem de Sedativos (pupilas mioacuteticas tremor hipotensatildeo confusatildeo mental e sonolecircncia)
e a Extrapiramidal (choro monoacutetono opistoacutetomo e distonia) foram predominantes O quadro
toacutexico se desenvolve dependendo da dose do subgrupo terapecircutico e do tempo entre a exposiccedilatildeo
e o atendimento Os ansioliacuteticos principalmente os Benzodiazepiacutenicos (BZD) satildeo compostos
que apresentam maior iacutendice terapecircutico e menor potencialidade de provocar acidentes fatais e
menor tendecircncia para produzir toleracircncia farmacoloacutegica (FORSAN 2010)
Tabela 01 ndash Frequecircncia do tipo de circunstacircncia da faixa etaacuteria do gecircnero e da ocupaccedilatildeo dos pacientes intoxicados
atendidos no Ceatox-CG
Variaacutevel
N
Circunstacircncia (N=18)
Tentativa de Suiciacutedio 10 557
Acidental 1 57
Outra 7 389
Faixa Etaacuteria (anos) (N=18)
1---9 3 166
10---19 5 278
20---39 7 389
gt 40 3 167
Gecircnero (N=18)
Masculino 8 444
Feminino 10 556
Ocupaccedilatildeo (N=18)
Estudante 6 333
Do lar 4 222
Outra 8 444
16
Em relaccedilatildeo agrave variaacutevel evoluccedilatildeo natildeo se registrou nenhum oacutebito no periacuteodo estudado
Dados nacionais entre os anos de 2007 a 2009 mostram que os medicamentos apresentaram
baixo coeficiente de letalidade meacutedio quando comparado aos agrotoacutexicos de uso agriacutecola e as
drogas de abuso (SISTEMA2012) Um estudo realizado por Mota et al (2012) usando dados
secundaacuterios do Sistema Informaccedilatildeo de Mortalidade (SIM)MS entre 1996 a 2005 identificou
4403 oacutebitos relacionados a medicamentos entretanto natildeo foi possiacutevel estabelecer qual a
principal classe de medicamentos nem o princiacutepio ativo envolvido com o agravo
42 Dados Experimentais
Para otimizaccedilatildeo do meacutetodo vaacuterios procedimentos foram realizados seguindo os
paracircmetros analiacuteticos de validaccedilatildeo objetivando detectar a presenccedila de Alprazolam em urina de
paciente com histoacuterico de exposiccedilatildeo toxica a esse faacutermaco A metodologia desenvolvida e
validada mostrou-se em conformidade com as especificaccedilotildees da Resoluccedilatildeo RDC nordm899 de 29 de
maio de 2003 (BRASIL 2003)
Na avaliaccedilatildeo da seletividade nas amostras de urina analisadas natildeo foram detectados
interferentes nas condiccedilotildees de extraccedilatildeo estabelecidas Assim o meacutetodo mostrou-se seletivo jaacute
que as amostras natildeo mostraram nenhum spot(mancha) semelhante aos desenvolvidos pelos
padrotildees No processo de validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos a especificidade ou seletividade eacute o
primeiro passo para o desenvolvimento de um meacutetodo este paracircmetro deve ser avaliado
continuamente para assegurar a precisatildeo e exatidatildeo deste durante sua validaccedilatildeo (SILVA et al
2010) (Tabela 02)
Para os ensaios de recuperaccedilatildeo foi observada a intensidade do spot desenvolvido em cada
amostra para cada niacutevel de fortificaccedilatildeo Nas amostras fortificadas com 200 microg do padratildeo
obtivemos uma recuperaccedilatildeo de 917 enquanto que nas amostras fortificadas com 400 microg do
mesmo o percentual meacutedio obtido foi de 967 demonstrando assim a exatidatildeo do meacutetodo
Segundo a Resoluccedilatildeo RDC nordm 899 de 29 de maio de 2003 a exatidatildeo se daacute pela concordacircncia
entre o resultado de um ensaio e um valor de referecircncia
17
Tabela 02 ndash Avaliaccedilatildeo da seletividade comparando-se spot e Rf (Relative Front) dos padrotildees de
Alprazolam e amostras branco
Sistema-solvente Agente cromogecircnico
Clorofoacutermio-metanol(91v v)
DI
Clorofoacutermio-acetona(41vv)
DI
FaacutermacoAmostras Rf e Cor Rf e Cor
Padratildeo Alprazolam faacutermaco
Padratildeo Alprazolam comprimido
ABal1
ABal2
ABal3
ABal4
ABal5
05 + c
026 + c
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Nota DI = Dragendorff iodado ABal = amostra branco alcalina Rf = fator de retenccedilatildeo c = cor
castanha
O Limite de Detecccedilatildeo e o Limite de Quantificaccedilatildeo para o Alprazolam foram de
100microgmL e 200 microgmL respectivamente Ribani et al (2004) define o Limite de Detecccedilatildeo (LD)
como sendo a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser detectada mas natildeo
necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento experimental O Limite
de Quantificaccedilatildeo (LQ) eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode
ser medida utilizando um determinado procedimento experimental (Figura 01)
O meacutetodo de extraccedilatildeo utilizado particcedilatildeo liacutequido-liacutequido demonstrou-se eficaz pois a
solubilidade do faacutermaco avaliado possui uma elevada afinidade pela mistura de solventes
utilizados nesse procedimento Na separaccedilatildeo do analito da matriz a sonicaccedilatildeo que eacute o processo
que utiliza a energia das ondas sonoras mais comumente a ultrassom se mostrou mais eficaz que
a centrifugaccedilatildeo
O sistema formado pelos solventes clorofoacutermio-metanol (91 vv) obteve o melhor
resultado em relaccedilatildeo ao sistema solvente clorofoacutermio-acetona(41 vv) tendo em vista melhor
resultado na separaccedilatildeo dos padrotildees e amostras
18
Figura 01-Identificaccedilatildeo de Alprazolam em trecircs niacuteveis de fortificaccedilatildeo (n = 3) alta meacutedia e baixa
Dentre os agentes cromogecircnicos utilizados na revelaccedilatildeo apenas o Reativo de Dragendorff
se mostrou eficaz Observou-se atraveacutes do meacutetodo fiacutesico utilizando a Cacircmera de Luz UV que o
Alprazolam faacutermaco e o Alprazolam comprimido natildeo transmite fluorescecircncia no comprimento
de onda de 366nm
Para avaliaccedilatildeo da Robustez as soluccedilotildees-padratildeo (faacutermaco e medicamento) foram
dissolvidas em diversos solventes como apresentado na Tabela 03 O metanol foi o solvente em
que houve revelaccedilatildeo na placa cromatograacutefica tanto do faacutermaco como do medicamento
Tabela 03 - Anaacutelise dos diferentes solventes da soluccedilatildeo estoque padratildeo puro do faacutermaco e do medicamento de
Alprazolam a partir do Rf
NOTA Rf = Relative Front spot= cormancha
Solvente Alprazolam faacutermaco Alprazolam medicamento
Rf Rf
Metanol 05 026
Aacutegua 06 -
ClorofoacutermioAcetona
(41)
056 -
ClorofoacutermioMetanol
(41)
052 -
AMOSTRAS
PADRAtildeO
19
Os testes de robustez satildeo de fundamental importacircncia para que os analistas conheccedilam
quais fatores devem ser estritamente controlados durante a execuccedilatildeo de um meacutetodo Se as
alteraccedilotildees das condiccedilotildees de anaacutelise produzirem resultados dentro dos limites aceitaacuteveis de
seletividade exatidatildeo e precisatildeo o meacutetodo pode ser considerado robusto e tais variaccedilotildees podem
ser incorporadas ao procedimento (CASSIANO et al 2009)
Apesar do meacutetodo ter se mostrado seletivo para o Alprazolam ele natildeo eacute especifico apenas
para esse faacutermaco Sendo assim o meacutetodo foi aplicado em 7 (sete) amostras de pacientes com
histoacuterico de exposiccedilatildeo toacutexica por medicamentos atendidos pelo Centro de Informaccedilatildeo
Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) poreacutem natildeo foi possiacutevel obter a recuperaccedilatildeo dos
faacutermacos Acredita-se que a quantidade ingerida dos medicamentos pelos pacientes foi baixa ou
que pela demora da coleta da amostra os faacutermacos tenham sido metabolizado pelo organismo
Nos ensaios de confirmaccedilatildeo por FTIR observou-se que o Alprazolam padratildeo apresentou as
seguintes vibraccedilotildees moleculares A deformaccedilatildeo angular N-H de amina secundaacuteria eacute observada na
banda em 1660 cm-1
Em 1647 cm-1
aparece uma banda que pode ser atribuiacuteda ao estiramento
C=N da imina e em 1397 cm-1
aparece uma banda atribuiacuteda ao estiramento C-N das aminas A
banda caracteriacutestica do estiramento =C-H de carbono sp2 do anel aromaacutetico se encontra em 3275
cm-1
O espectro do faacutermaco extraiacutedo da matriz bioloacutegica mantecircm as mesmas caracteriacutesticas do
faacutermaco padratildeo Dessa forma podemos afirmar que a moleacutecula natildeo sofreu alteraccedilatildeo durante o
processo de extraccedilatildeo (Figura 02)
Figura 02 - Espectro da analise no FTIR do padratildeo de Alprazolam faacutermaco e de amostra extraiacuteda
20
5 CONCLUSAtildeO
O meacutetodo demonstrou atender aos requisitos de boas praacuteticas exigidos pela Resoluccedilatildeo
RDC 899 de 29 de maio de 2003 sendo exato e sensiacutevel
Dentre as amostras de pacientes intoxicados por medicamentos natildeo se obteve resultados
positivos para o Alprazolam
Os medicamentos constituem como um dos principais meios utilizado para tentativa de
suiciacutedio tendecircncia que eacute observada nos paiacuteses de terceiro mundo entre eles os psicofaacutermacos os
mais utilizados Haacute necessidade de uma melhor formaccedilatildeo e atualizaccedilatildeo dos profissionais assim
como de informaccedilatildeo aos usuaacuterios e medidas de prevenccedilatildeo que poderiam alertar sobre os riscos e
monitorar o uso desses medicamentos
O Brasil em agosto de 2006 deu o primeiro passo lanccedilando a Portaria nordm 1876 com as
diretrizes nacionais para Prevenccedilatildeo do Suiciacutedio nas trecircs esferas da gestatildeo Portanto estudar e
prevenir as tentativas de suiciacutedio eacute um desafio pois envolve recursos financeiros e sensibilidade
da parte dos profissionais envolvidos
Por outro lado aleacutem do conhecimento dos dados epidemioloacutegicos eacute necessaacuteria a
identificaccedilatildeo dos grupos terapecircuticos responsaacuteveis pelas intoxicaccedilotildees As teacutecnicas
cromatograacuteficas e espectrofotomeacutetricas possuem uma extensa aplicabilidade em pesquisas
cientiacuteficas anaacutelise quiacutemica teste de controle de qualidade de medicamentos entre outros Isso se
daacute por serem teacutecnicas altamente sensiacuteveis de alta resoluccedilatildeo e por ser um meacutetodo mais raacutepido e
preciso Ao analisar traccedilos de compostos em amostras complexas como sangue e urina as
anaacutelises toxicoloacutegicas auxiliam no prognoacutestico e diagnoacutestico de intoxicaccedilotildees uma vez que eacute
possiacutevel identificaccedilatildeo destes compostos em amostras bioloacutegicas
O meacutetodo por CCDC tem caraacuteter semindashquantitativo jaacute que a quantificaccedilatildeo dos faacutermacos eacute
baseada apenas na comparaccedilatildeo visual dos ldquoSpotsrdquo das amostras e dos padrotildees Embora o meacutetodo
seja adequado para triagem os resultados mostram que a quantificaccedilatildeo de faacutermacos por meacutetodos
baseados no uso de CCDC deve possuir uma interpretaccedilatildeo bem cautelosa especialmente devido agrave
incerteza associada a este tipo de comparaccedilatildeo
Se faz necessaacuterio a confirmaccedilatildeo da identidade do faacutermaco por outras teacutecnicas eou outros
meacutetodos de anaacutelise como a Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia (CLAE) e Cromatografia
21
Gasosa (CG) sendo assim possiacutevel correlacionar os perfis cromatograacuteficos entre as diferentes
teacutecnicas
ABSTRACT
The medicines are presented as the main toxic agent responsible for cases of human poisoning
thus constituting a major challenge for those working with Public Health However the absence
of a specialized toxicological analysis hinders a more accurate diagnosis of cases The
spectrophotometric and chromatographic techniques may assist in confirming the diagnosis A
Comparative Thin Layer Chromatography (CCDC) is a separation technique simple low cost and
good sensitivity The identification of the drug can be achieved both quantitatively and
qualitatively by infrared spectroscopy Fourier transform (FTIR) This research proposal was to
evaluate two techniques for identification of Alprazolam in urine of patients with toxic exposure
to drugs assessing the selectivity accuracy limit of detection limit of quantification and
robustness in chromatographic techniques The method was optimized validated and applied in
accordance with Resolution RDC Nordm 899 of May 29 2003 The chromatographic assay used
plates of Silica Gel G-60 elution with chloroform-methanol 91 (v v) and as a chromogenic
agent the Reactive Dragendorff The presence of the drug was confirmed by the FTIR analysis
The method proved to be selective chromatographic conditions established by presenting Limit
Detection and Quantification 200μgml and 100μgml respectively Among the patient samples
drug poisoning no positive results obtained for Alprazolam The FTIR analysis showed that the
drug did not undergo degradation in the extraction process The method has proven to meet the
requirements of good practice required by RDC Nordm 899 of 29 May 2003 being sensitive and
accurate
KEYWORDS Alprazolam Spectroscopy Chromatography Intoxication
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27
ANEXO A
28
13
Recuperaccedilatildeo
A extraccedilatildeo para avaliar a recuperaccedilatildeo foi realizada pela anaacutelise de amostras em
triplicatas contaminadas (fortificadas) em trecircs concentraccedilotildees do padratildeo de Alprazolam (baixa=
100microgml meacutedia=200 microgml e alta= 400 microgml)
326 O Limite de Detecccedilatildeo (LD) e o Limite de Quantificaccedilatildeo (LQ)
O Limite de Detecccedilatildeo eacute a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser
detectada mas natildeo necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento
experimental O Limite de Quantificaccedilatildeo eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia
em exame que pode ser medida utilizando um determinado procedimento experimental
O LD foi determinado por anaacutelise de urina contaminada em concentraccedilotildees decrescentes
de faacutermaco e medicamento ateacute a concentraccedilatildeo possiacutevel de se detectar a presenccedila de ambos O LQ
foi determinado por analise de urina contaminada em concentraccedilotildees decrescentes de faacutermaco e
medicamento ateacute a concentraccedilatildeo possiacutevel de se quantificar a presenccedila de ambos
327 Robustez
Na avaliaccedilatildeo da robustez foram utilizados como solventes o metanol a aacutegua uma soluccedilatildeo
de clorofoacutermio- acetona (41) e uma soluccedilatildeo de clorofoacutermio-metanol (91) para preparaccedilatildeo dos
padrotildees de Alprazolam
328 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier - FTIR
Foram feitas anaacutelises de soluccedilotildees metanoacutelicas ( 10 mgmL n=3) do faacutermaco padratildeo e suas
extraccedilotildees utilizando a faixa de varredura de 4000 a 500 cm-1
em temperatura ambiente
4 DADOS E ANAacuteLISE DA PESQUISA
41 Aplicaccedilatildeo do meacutetodo
No periacuteodo de agosto a setembro de 2012 o Ceatox-CG registrou 28 casos com histoacuteria
de intoxicaccedilatildeo por medicamentos Destes 18 casos foram classificados como
14
neuropsicofaacutermacos Na anaacutelise dos casos do uso isolado de medicamentos os Antiepileacutepticos
assim como os Ansioliticos foram os responsaacuteveis pelo maior nuacutemero de ocorrecircncias com um
percentual de 22 (n=4) cada um Um estudo realizado com crianccedilas no estado de Mato Grosso
do Sul verificou que os anticonvulsivantes foram os principais responsaacuteveis pelos eventos toacutexicos
por medicamentos que agem no SNC (MATOS et al 2008)
Ao analisarmos as associaccedilotildees de medicamentos (n=7-39) nos chama a atenccedilatildeo o
nuacutemero de ocorrecircncias por tentativa de suiciacutedio (n=10-557) Bernades Turini e Matsuo
(2010) afirmam que pacientes que tentam suiciacutedio em sua grande maioria fazem uso de mais de
um tipo de substacircncia quiacutemica ndash medicamentosa ou natildeo ndash quando o meacutetodo eacute a intoxicaccedilatildeo
voluntaacuteria
Os eventos toxicoloacutegicos foram mais comuns em mulheres (556) por tentativa de
suiciacutedio (557) e entre adultos e jovens (389) (Tabela 01) Um estudo realizado entre os anos
de 1997 e 2007 no Centro de Controle de Intoxicaccedilatildeo (CCI) em Londrina Paranaacute analisando as
tentativas de suiciacutedio por sobredose intencional de medicamentos com relaccedilatildeo ao gecircnero condiz
com dados aqui obtidos (BERNADES TURINI MATZUO 2010) Por outro lado Gandolfi e
Andrade (2006) mostra o ldquoacidente individualrdquo como principal fator responsaacutevel pelas exposiccedilotildees
toacutexicas a medicamentos em Satildeo Paulo seguido pela tentativa de suiciacutedio
Graacutefico 01 - Grupos farmacoloacutegicos de acordo com a classificaccedilatildeo da ATC responsaacuteveis pelas
intoxicaccedilotildees registradas no Ceatox-CG entre agosto a setembro de 2012 (N= 18)
2239
1722
Associaccedilotildees
N05A
N03A
N05B
NOTA N05A Antipsicoacuteticos N03A Antiepileacuteptico NO5B Ansioliacuteticos e associaccedilatildeo
15
Acerca da ocupaccedilatildeo dos pacientes os estudantes foram os mais frequentes (n=6-333)
Este dado entra em desacordo com a mesma variaacutevel analisada no estudo de Turini et al (2010)
em que mostra que a ocupaccedilatildeo mais relevante nos seu estudo eacute a de empregado (Tabela 01)
Observando-se os sinais e sintomas das intoxicaccedilotildees as Siacutendromes Toacutexicas por
Superdosagem de Sedativos (pupilas mioacuteticas tremor hipotensatildeo confusatildeo mental e sonolecircncia)
e a Extrapiramidal (choro monoacutetono opistoacutetomo e distonia) foram predominantes O quadro
toacutexico se desenvolve dependendo da dose do subgrupo terapecircutico e do tempo entre a exposiccedilatildeo
e o atendimento Os ansioliacuteticos principalmente os Benzodiazepiacutenicos (BZD) satildeo compostos
que apresentam maior iacutendice terapecircutico e menor potencialidade de provocar acidentes fatais e
menor tendecircncia para produzir toleracircncia farmacoloacutegica (FORSAN 2010)
Tabela 01 ndash Frequecircncia do tipo de circunstacircncia da faixa etaacuteria do gecircnero e da ocupaccedilatildeo dos pacientes intoxicados
atendidos no Ceatox-CG
Variaacutevel
N
Circunstacircncia (N=18)
Tentativa de Suiciacutedio 10 557
Acidental 1 57
Outra 7 389
Faixa Etaacuteria (anos) (N=18)
1---9 3 166
10---19 5 278
20---39 7 389
gt 40 3 167
Gecircnero (N=18)
Masculino 8 444
Feminino 10 556
Ocupaccedilatildeo (N=18)
Estudante 6 333
Do lar 4 222
Outra 8 444
16
Em relaccedilatildeo agrave variaacutevel evoluccedilatildeo natildeo se registrou nenhum oacutebito no periacuteodo estudado
Dados nacionais entre os anos de 2007 a 2009 mostram que os medicamentos apresentaram
baixo coeficiente de letalidade meacutedio quando comparado aos agrotoacutexicos de uso agriacutecola e as
drogas de abuso (SISTEMA2012) Um estudo realizado por Mota et al (2012) usando dados
secundaacuterios do Sistema Informaccedilatildeo de Mortalidade (SIM)MS entre 1996 a 2005 identificou
4403 oacutebitos relacionados a medicamentos entretanto natildeo foi possiacutevel estabelecer qual a
principal classe de medicamentos nem o princiacutepio ativo envolvido com o agravo
42 Dados Experimentais
Para otimizaccedilatildeo do meacutetodo vaacuterios procedimentos foram realizados seguindo os
paracircmetros analiacuteticos de validaccedilatildeo objetivando detectar a presenccedila de Alprazolam em urina de
paciente com histoacuterico de exposiccedilatildeo toxica a esse faacutermaco A metodologia desenvolvida e
validada mostrou-se em conformidade com as especificaccedilotildees da Resoluccedilatildeo RDC nordm899 de 29 de
maio de 2003 (BRASIL 2003)
Na avaliaccedilatildeo da seletividade nas amostras de urina analisadas natildeo foram detectados
interferentes nas condiccedilotildees de extraccedilatildeo estabelecidas Assim o meacutetodo mostrou-se seletivo jaacute
que as amostras natildeo mostraram nenhum spot(mancha) semelhante aos desenvolvidos pelos
padrotildees No processo de validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos a especificidade ou seletividade eacute o
primeiro passo para o desenvolvimento de um meacutetodo este paracircmetro deve ser avaliado
continuamente para assegurar a precisatildeo e exatidatildeo deste durante sua validaccedilatildeo (SILVA et al
2010) (Tabela 02)
Para os ensaios de recuperaccedilatildeo foi observada a intensidade do spot desenvolvido em cada
amostra para cada niacutevel de fortificaccedilatildeo Nas amostras fortificadas com 200 microg do padratildeo
obtivemos uma recuperaccedilatildeo de 917 enquanto que nas amostras fortificadas com 400 microg do
mesmo o percentual meacutedio obtido foi de 967 demonstrando assim a exatidatildeo do meacutetodo
Segundo a Resoluccedilatildeo RDC nordm 899 de 29 de maio de 2003 a exatidatildeo se daacute pela concordacircncia
entre o resultado de um ensaio e um valor de referecircncia
17
Tabela 02 ndash Avaliaccedilatildeo da seletividade comparando-se spot e Rf (Relative Front) dos padrotildees de
Alprazolam e amostras branco
Sistema-solvente Agente cromogecircnico
Clorofoacutermio-metanol(91v v)
DI
Clorofoacutermio-acetona(41vv)
DI
FaacutermacoAmostras Rf e Cor Rf e Cor
Padratildeo Alprazolam faacutermaco
Padratildeo Alprazolam comprimido
ABal1
ABal2
ABal3
ABal4
ABal5
05 + c
026 + c
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Nota DI = Dragendorff iodado ABal = amostra branco alcalina Rf = fator de retenccedilatildeo c = cor
castanha
O Limite de Detecccedilatildeo e o Limite de Quantificaccedilatildeo para o Alprazolam foram de
100microgmL e 200 microgmL respectivamente Ribani et al (2004) define o Limite de Detecccedilatildeo (LD)
como sendo a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser detectada mas natildeo
necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento experimental O Limite
de Quantificaccedilatildeo (LQ) eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode
ser medida utilizando um determinado procedimento experimental (Figura 01)
O meacutetodo de extraccedilatildeo utilizado particcedilatildeo liacutequido-liacutequido demonstrou-se eficaz pois a
solubilidade do faacutermaco avaliado possui uma elevada afinidade pela mistura de solventes
utilizados nesse procedimento Na separaccedilatildeo do analito da matriz a sonicaccedilatildeo que eacute o processo
que utiliza a energia das ondas sonoras mais comumente a ultrassom se mostrou mais eficaz que
a centrifugaccedilatildeo
O sistema formado pelos solventes clorofoacutermio-metanol (91 vv) obteve o melhor
resultado em relaccedilatildeo ao sistema solvente clorofoacutermio-acetona(41 vv) tendo em vista melhor
resultado na separaccedilatildeo dos padrotildees e amostras
18
Figura 01-Identificaccedilatildeo de Alprazolam em trecircs niacuteveis de fortificaccedilatildeo (n = 3) alta meacutedia e baixa
Dentre os agentes cromogecircnicos utilizados na revelaccedilatildeo apenas o Reativo de Dragendorff
se mostrou eficaz Observou-se atraveacutes do meacutetodo fiacutesico utilizando a Cacircmera de Luz UV que o
Alprazolam faacutermaco e o Alprazolam comprimido natildeo transmite fluorescecircncia no comprimento
de onda de 366nm
Para avaliaccedilatildeo da Robustez as soluccedilotildees-padratildeo (faacutermaco e medicamento) foram
dissolvidas em diversos solventes como apresentado na Tabela 03 O metanol foi o solvente em
que houve revelaccedilatildeo na placa cromatograacutefica tanto do faacutermaco como do medicamento
Tabela 03 - Anaacutelise dos diferentes solventes da soluccedilatildeo estoque padratildeo puro do faacutermaco e do medicamento de
Alprazolam a partir do Rf
NOTA Rf = Relative Front spot= cormancha
Solvente Alprazolam faacutermaco Alprazolam medicamento
Rf Rf
Metanol 05 026
Aacutegua 06 -
ClorofoacutermioAcetona
(41)
056 -
ClorofoacutermioMetanol
(41)
052 -
AMOSTRAS
PADRAtildeO
19
Os testes de robustez satildeo de fundamental importacircncia para que os analistas conheccedilam
quais fatores devem ser estritamente controlados durante a execuccedilatildeo de um meacutetodo Se as
alteraccedilotildees das condiccedilotildees de anaacutelise produzirem resultados dentro dos limites aceitaacuteveis de
seletividade exatidatildeo e precisatildeo o meacutetodo pode ser considerado robusto e tais variaccedilotildees podem
ser incorporadas ao procedimento (CASSIANO et al 2009)
Apesar do meacutetodo ter se mostrado seletivo para o Alprazolam ele natildeo eacute especifico apenas
para esse faacutermaco Sendo assim o meacutetodo foi aplicado em 7 (sete) amostras de pacientes com
histoacuterico de exposiccedilatildeo toacutexica por medicamentos atendidos pelo Centro de Informaccedilatildeo
Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) poreacutem natildeo foi possiacutevel obter a recuperaccedilatildeo dos
faacutermacos Acredita-se que a quantidade ingerida dos medicamentos pelos pacientes foi baixa ou
que pela demora da coleta da amostra os faacutermacos tenham sido metabolizado pelo organismo
Nos ensaios de confirmaccedilatildeo por FTIR observou-se que o Alprazolam padratildeo apresentou as
seguintes vibraccedilotildees moleculares A deformaccedilatildeo angular N-H de amina secundaacuteria eacute observada na
banda em 1660 cm-1
Em 1647 cm-1
aparece uma banda que pode ser atribuiacuteda ao estiramento
C=N da imina e em 1397 cm-1
aparece uma banda atribuiacuteda ao estiramento C-N das aminas A
banda caracteriacutestica do estiramento =C-H de carbono sp2 do anel aromaacutetico se encontra em 3275
cm-1
O espectro do faacutermaco extraiacutedo da matriz bioloacutegica mantecircm as mesmas caracteriacutesticas do
faacutermaco padratildeo Dessa forma podemos afirmar que a moleacutecula natildeo sofreu alteraccedilatildeo durante o
processo de extraccedilatildeo (Figura 02)
Figura 02 - Espectro da analise no FTIR do padratildeo de Alprazolam faacutermaco e de amostra extraiacuteda
20
5 CONCLUSAtildeO
O meacutetodo demonstrou atender aos requisitos de boas praacuteticas exigidos pela Resoluccedilatildeo
RDC 899 de 29 de maio de 2003 sendo exato e sensiacutevel
Dentre as amostras de pacientes intoxicados por medicamentos natildeo se obteve resultados
positivos para o Alprazolam
Os medicamentos constituem como um dos principais meios utilizado para tentativa de
suiciacutedio tendecircncia que eacute observada nos paiacuteses de terceiro mundo entre eles os psicofaacutermacos os
mais utilizados Haacute necessidade de uma melhor formaccedilatildeo e atualizaccedilatildeo dos profissionais assim
como de informaccedilatildeo aos usuaacuterios e medidas de prevenccedilatildeo que poderiam alertar sobre os riscos e
monitorar o uso desses medicamentos
O Brasil em agosto de 2006 deu o primeiro passo lanccedilando a Portaria nordm 1876 com as
diretrizes nacionais para Prevenccedilatildeo do Suiciacutedio nas trecircs esferas da gestatildeo Portanto estudar e
prevenir as tentativas de suiciacutedio eacute um desafio pois envolve recursos financeiros e sensibilidade
da parte dos profissionais envolvidos
Por outro lado aleacutem do conhecimento dos dados epidemioloacutegicos eacute necessaacuteria a
identificaccedilatildeo dos grupos terapecircuticos responsaacuteveis pelas intoxicaccedilotildees As teacutecnicas
cromatograacuteficas e espectrofotomeacutetricas possuem uma extensa aplicabilidade em pesquisas
cientiacuteficas anaacutelise quiacutemica teste de controle de qualidade de medicamentos entre outros Isso se
daacute por serem teacutecnicas altamente sensiacuteveis de alta resoluccedilatildeo e por ser um meacutetodo mais raacutepido e
preciso Ao analisar traccedilos de compostos em amostras complexas como sangue e urina as
anaacutelises toxicoloacutegicas auxiliam no prognoacutestico e diagnoacutestico de intoxicaccedilotildees uma vez que eacute
possiacutevel identificaccedilatildeo destes compostos em amostras bioloacutegicas
O meacutetodo por CCDC tem caraacuteter semindashquantitativo jaacute que a quantificaccedilatildeo dos faacutermacos eacute
baseada apenas na comparaccedilatildeo visual dos ldquoSpotsrdquo das amostras e dos padrotildees Embora o meacutetodo
seja adequado para triagem os resultados mostram que a quantificaccedilatildeo de faacutermacos por meacutetodos
baseados no uso de CCDC deve possuir uma interpretaccedilatildeo bem cautelosa especialmente devido agrave
incerteza associada a este tipo de comparaccedilatildeo
Se faz necessaacuterio a confirmaccedilatildeo da identidade do faacutermaco por outras teacutecnicas eou outros
meacutetodos de anaacutelise como a Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia (CLAE) e Cromatografia
21
Gasosa (CG) sendo assim possiacutevel correlacionar os perfis cromatograacuteficos entre as diferentes
teacutecnicas
ABSTRACT
The medicines are presented as the main toxic agent responsible for cases of human poisoning
thus constituting a major challenge for those working with Public Health However the absence
of a specialized toxicological analysis hinders a more accurate diagnosis of cases The
spectrophotometric and chromatographic techniques may assist in confirming the diagnosis A
Comparative Thin Layer Chromatography (CCDC) is a separation technique simple low cost and
good sensitivity The identification of the drug can be achieved both quantitatively and
qualitatively by infrared spectroscopy Fourier transform (FTIR) This research proposal was to
evaluate two techniques for identification of Alprazolam in urine of patients with toxic exposure
to drugs assessing the selectivity accuracy limit of detection limit of quantification and
robustness in chromatographic techniques The method was optimized validated and applied in
accordance with Resolution RDC Nordm 899 of May 29 2003 The chromatographic assay used
plates of Silica Gel G-60 elution with chloroform-methanol 91 (v v) and as a chromogenic
agent the Reactive Dragendorff The presence of the drug was confirmed by the FTIR analysis
The method proved to be selective chromatographic conditions established by presenting Limit
Detection and Quantification 200μgml and 100μgml respectively Among the patient samples
drug poisoning no positive results obtained for Alprazolam The FTIR analysis showed that the
drug did not undergo degradation in the extraction process The method has proven to meet the
requirements of good practice required by RDC Nordm 899 of 29 May 2003 being sensitive and
accurate
KEYWORDS Alprazolam Spectroscopy Chromatography Intoxication
REFEREcircNCIAS
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MOREIRA J L MARCOS A M BARROS P Potencialidades da Espectrometria de
Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) na anaacutelise de vinhos Ciecircncia e Teacutecnica
Vitiviniacutecola v 17 n 1 p 27-33 2002
25
MOTA D M MELO J R R FREITAS D R C MACHADO M Perfil da mortalidade por
intoxicaccedilatildeo com medicamentos no Brasil 1996-2005 retrato de uma deacutecada Ciecircncia amp Sauacutede
Coletiva v 17 n 1 p 61-70 2012
OLIVEIRA J C et al Intoxicaccedilotildees por Medicamentos Registradas na Regiatildeo da Comcam-PR
em 2007 e 2008 Revista Sauacutede e Pesquisa v 3 n 3 p 303-308 setdez 2010
RIBANI M et al Validaccedilatildeo de meacutetodos cromatograacuteficos e eletroforeacuteticos Quiacutemica Nova Satildeo
Paulo v 27 n 5 p 771-780 setout 2004
ROCA M F de La et al Desenvolvimento e validaccedilatildeo de meacutetodo analiacutetico passo importante na
produccedilatildeo de medicamentos Revista Brasileira de Farmaacutecia PE v 88 n 4 p 177-180 jul
2007
RODRIGUES M A P et al Modificaccedilotildees nos padrotildees de consumo de psicofaacutermacos em
localidade do Sul do Brasil Revista de Sauacutede Puacuteblica v 40 n 1 p 107-114 2006
SILVA J A BEDOR D C G SOUSA C E M et al Desenvolvimento e validaccedilatildeo de meacutetodo
analiacutetico para quantificaccedilatildeo de diclofenaco de dietilamocircnio em pele humana por cromatografia
liacutequida de alta eficiecircncia Revista de Ciecircncias Farmacecircuticas Baacutesica e Aplicada v 31 n 1 p
6 mar 2010
SISTEMA NACIONAL DE INFORMACcedilAtildeO TOacuteXICO-FARMACOLOacuteGICA (Sinitox) Centro
de Informaccedilatildeo Cientiacutefica e Tecnoloacutegica Fundaccedilatildeo Oswaldo Cruz Disponiacutevel em lt
httpwwwfiocruzbrsinitoxgt Acesso em 18 de setembro de 2012
STOPPE A Estudo observacional de Alprazolam no tratamento da ansiedade Revista
Brasileira de Medicina v 61 n 3 p 141-145 mar 2004
TRUJILLO LM et al Erro na manipulaccedilatildeo de caacutepsulas de Alprazolam Revista do Instituto
Adolfo Lutz Satildeo Paulo v 66 n 3 p 308-310 2007
26
VALENTINI S R SOMMER W A MATIOLI G Validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos
Arquivos do Mudi v 11 n 2 p 26-31 2007
YANG H IRUDAYARAJ J Rapid determination of vitamin C by NIR MIR and FT-Raman
techniques Journal of Pharmacy and Pharmacology London v 54 n 9 p 1247-1255 2002
27
ANEXO A
28
14
neuropsicofaacutermacos Na anaacutelise dos casos do uso isolado de medicamentos os Antiepileacutepticos
assim como os Ansioliticos foram os responsaacuteveis pelo maior nuacutemero de ocorrecircncias com um
percentual de 22 (n=4) cada um Um estudo realizado com crianccedilas no estado de Mato Grosso
do Sul verificou que os anticonvulsivantes foram os principais responsaacuteveis pelos eventos toacutexicos
por medicamentos que agem no SNC (MATOS et al 2008)
Ao analisarmos as associaccedilotildees de medicamentos (n=7-39) nos chama a atenccedilatildeo o
nuacutemero de ocorrecircncias por tentativa de suiciacutedio (n=10-557) Bernades Turini e Matsuo
(2010) afirmam que pacientes que tentam suiciacutedio em sua grande maioria fazem uso de mais de
um tipo de substacircncia quiacutemica ndash medicamentosa ou natildeo ndash quando o meacutetodo eacute a intoxicaccedilatildeo
voluntaacuteria
Os eventos toxicoloacutegicos foram mais comuns em mulheres (556) por tentativa de
suiciacutedio (557) e entre adultos e jovens (389) (Tabela 01) Um estudo realizado entre os anos
de 1997 e 2007 no Centro de Controle de Intoxicaccedilatildeo (CCI) em Londrina Paranaacute analisando as
tentativas de suiciacutedio por sobredose intencional de medicamentos com relaccedilatildeo ao gecircnero condiz
com dados aqui obtidos (BERNADES TURINI MATZUO 2010) Por outro lado Gandolfi e
Andrade (2006) mostra o ldquoacidente individualrdquo como principal fator responsaacutevel pelas exposiccedilotildees
toacutexicas a medicamentos em Satildeo Paulo seguido pela tentativa de suiciacutedio
Graacutefico 01 - Grupos farmacoloacutegicos de acordo com a classificaccedilatildeo da ATC responsaacuteveis pelas
intoxicaccedilotildees registradas no Ceatox-CG entre agosto a setembro de 2012 (N= 18)
2239
1722
Associaccedilotildees
N05A
N03A
N05B
NOTA N05A Antipsicoacuteticos N03A Antiepileacuteptico NO5B Ansioliacuteticos e associaccedilatildeo
15
Acerca da ocupaccedilatildeo dos pacientes os estudantes foram os mais frequentes (n=6-333)
Este dado entra em desacordo com a mesma variaacutevel analisada no estudo de Turini et al (2010)
em que mostra que a ocupaccedilatildeo mais relevante nos seu estudo eacute a de empregado (Tabela 01)
Observando-se os sinais e sintomas das intoxicaccedilotildees as Siacutendromes Toacutexicas por
Superdosagem de Sedativos (pupilas mioacuteticas tremor hipotensatildeo confusatildeo mental e sonolecircncia)
e a Extrapiramidal (choro monoacutetono opistoacutetomo e distonia) foram predominantes O quadro
toacutexico se desenvolve dependendo da dose do subgrupo terapecircutico e do tempo entre a exposiccedilatildeo
e o atendimento Os ansioliacuteticos principalmente os Benzodiazepiacutenicos (BZD) satildeo compostos
que apresentam maior iacutendice terapecircutico e menor potencialidade de provocar acidentes fatais e
menor tendecircncia para produzir toleracircncia farmacoloacutegica (FORSAN 2010)
Tabela 01 ndash Frequecircncia do tipo de circunstacircncia da faixa etaacuteria do gecircnero e da ocupaccedilatildeo dos pacientes intoxicados
atendidos no Ceatox-CG
Variaacutevel
N
Circunstacircncia (N=18)
Tentativa de Suiciacutedio 10 557
Acidental 1 57
Outra 7 389
Faixa Etaacuteria (anos) (N=18)
1---9 3 166
10---19 5 278
20---39 7 389
gt 40 3 167
Gecircnero (N=18)
Masculino 8 444
Feminino 10 556
Ocupaccedilatildeo (N=18)
Estudante 6 333
Do lar 4 222
Outra 8 444
16
Em relaccedilatildeo agrave variaacutevel evoluccedilatildeo natildeo se registrou nenhum oacutebito no periacuteodo estudado
Dados nacionais entre os anos de 2007 a 2009 mostram que os medicamentos apresentaram
baixo coeficiente de letalidade meacutedio quando comparado aos agrotoacutexicos de uso agriacutecola e as
drogas de abuso (SISTEMA2012) Um estudo realizado por Mota et al (2012) usando dados
secundaacuterios do Sistema Informaccedilatildeo de Mortalidade (SIM)MS entre 1996 a 2005 identificou
4403 oacutebitos relacionados a medicamentos entretanto natildeo foi possiacutevel estabelecer qual a
principal classe de medicamentos nem o princiacutepio ativo envolvido com o agravo
42 Dados Experimentais
Para otimizaccedilatildeo do meacutetodo vaacuterios procedimentos foram realizados seguindo os
paracircmetros analiacuteticos de validaccedilatildeo objetivando detectar a presenccedila de Alprazolam em urina de
paciente com histoacuterico de exposiccedilatildeo toxica a esse faacutermaco A metodologia desenvolvida e
validada mostrou-se em conformidade com as especificaccedilotildees da Resoluccedilatildeo RDC nordm899 de 29 de
maio de 2003 (BRASIL 2003)
Na avaliaccedilatildeo da seletividade nas amostras de urina analisadas natildeo foram detectados
interferentes nas condiccedilotildees de extraccedilatildeo estabelecidas Assim o meacutetodo mostrou-se seletivo jaacute
que as amostras natildeo mostraram nenhum spot(mancha) semelhante aos desenvolvidos pelos
padrotildees No processo de validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos a especificidade ou seletividade eacute o
primeiro passo para o desenvolvimento de um meacutetodo este paracircmetro deve ser avaliado
continuamente para assegurar a precisatildeo e exatidatildeo deste durante sua validaccedilatildeo (SILVA et al
2010) (Tabela 02)
Para os ensaios de recuperaccedilatildeo foi observada a intensidade do spot desenvolvido em cada
amostra para cada niacutevel de fortificaccedilatildeo Nas amostras fortificadas com 200 microg do padratildeo
obtivemos uma recuperaccedilatildeo de 917 enquanto que nas amostras fortificadas com 400 microg do
mesmo o percentual meacutedio obtido foi de 967 demonstrando assim a exatidatildeo do meacutetodo
Segundo a Resoluccedilatildeo RDC nordm 899 de 29 de maio de 2003 a exatidatildeo se daacute pela concordacircncia
entre o resultado de um ensaio e um valor de referecircncia
17
Tabela 02 ndash Avaliaccedilatildeo da seletividade comparando-se spot e Rf (Relative Front) dos padrotildees de
Alprazolam e amostras branco
Sistema-solvente Agente cromogecircnico
Clorofoacutermio-metanol(91v v)
DI
Clorofoacutermio-acetona(41vv)
DI
FaacutermacoAmostras Rf e Cor Rf e Cor
Padratildeo Alprazolam faacutermaco
Padratildeo Alprazolam comprimido
ABal1
ABal2
ABal3
ABal4
ABal5
05 + c
026 + c
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Nota DI = Dragendorff iodado ABal = amostra branco alcalina Rf = fator de retenccedilatildeo c = cor
castanha
O Limite de Detecccedilatildeo e o Limite de Quantificaccedilatildeo para o Alprazolam foram de
100microgmL e 200 microgmL respectivamente Ribani et al (2004) define o Limite de Detecccedilatildeo (LD)
como sendo a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser detectada mas natildeo
necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento experimental O Limite
de Quantificaccedilatildeo (LQ) eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode
ser medida utilizando um determinado procedimento experimental (Figura 01)
O meacutetodo de extraccedilatildeo utilizado particcedilatildeo liacutequido-liacutequido demonstrou-se eficaz pois a
solubilidade do faacutermaco avaliado possui uma elevada afinidade pela mistura de solventes
utilizados nesse procedimento Na separaccedilatildeo do analito da matriz a sonicaccedilatildeo que eacute o processo
que utiliza a energia das ondas sonoras mais comumente a ultrassom se mostrou mais eficaz que
a centrifugaccedilatildeo
O sistema formado pelos solventes clorofoacutermio-metanol (91 vv) obteve o melhor
resultado em relaccedilatildeo ao sistema solvente clorofoacutermio-acetona(41 vv) tendo em vista melhor
resultado na separaccedilatildeo dos padrotildees e amostras
18
Figura 01-Identificaccedilatildeo de Alprazolam em trecircs niacuteveis de fortificaccedilatildeo (n = 3) alta meacutedia e baixa
Dentre os agentes cromogecircnicos utilizados na revelaccedilatildeo apenas o Reativo de Dragendorff
se mostrou eficaz Observou-se atraveacutes do meacutetodo fiacutesico utilizando a Cacircmera de Luz UV que o
Alprazolam faacutermaco e o Alprazolam comprimido natildeo transmite fluorescecircncia no comprimento
de onda de 366nm
Para avaliaccedilatildeo da Robustez as soluccedilotildees-padratildeo (faacutermaco e medicamento) foram
dissolvidas em diversos solventes como apresentado na Tabela 03 O metanol foi o solvente em
que houve revelaccedilatildeo na placa cromatograacutefica tanto do faacutermaco como do medicamento
Tabela 03 - Anaacutelise dos diferentes solventes da soluccedilatildeo estoque padratildeo puro do faacutermaco e do medicamento de
Alprazolam a partir do Rf
NOTA Rf = Relative Front spot= cormancha
Solvente Alprazolam faacutermaco Alprazolam medicamento
Rf Rf
Metanol 05 026
Aacutegua 06 -
ClorofoacutermioAcetona
(41)
056 -
ClorofoacutermioMetanol
(41)
052 -
AMOSTRAS
PADRAtildeO
19
Os testes de robustez satildeo de fundamental importacircncia para que os analistas conheccedilam
quais fatores devem ser estritamente controlados durante a execuccedilatildeo de um meacutetodo Se as
alteraccedilotildees das condiccedilotildees de anaacutelise produzirem resultados dentro dos limites aceitaacuteveis de
seletividade exatidatildeo e precisatildeo o meacutetodo pode ser considerado robusto e tais variaccedilotildees podem
ser incorporadas ao procedimento (CASSIANO et al 2009)
Apesar do meacutetodo ter se mostrado seletivo para o Alprazolam ele natildeo eacute especifico apenas
para esse faacutermaco Sendo assim o meacutetodo foi aplicado em 7 (sete) amostras de pacientes com
histoacuterico de exposiccedilatildeo toacutexica por medicamentos atendidos pelo Centro de Informaccedilatildeo
Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) poreacutem natildeo foi possiacutevel obter a recuperaccedilatildeo dos
faacutermacos Acredita-se que a quantidade ingerida dos medicamentos pelos pacientes foi baixa ou
que pela demora da coleta da amostra os faacutermacos tenham sido metabolizado pelo organismo
Nos ensaios de confirmaccedilatildeo por FTIR observou-se que o Alprazolam padratildeo apresentou as
seguintes vibraccedilotildees moleculares A deformaccedilatildeo angular N-H de amina secundaacuteria eacute observada na
banda em 1660 cm-1
Em 1647 cm-1
aparece uma banda que pode ser atribuiacuteda ao estiramento
C=N da imina e em 1397 cm-1
aparece uma banda atribuiacuteda ao estiramento C-N das aminas A
banda caracteriacutestica do estiramento =C-H de carbono sp2 do anel aromaacutetico se encontra em 3275
cm-1
O espectro do faacutermaco extraiacutedo da matriz bioloacutegica mantecircm as mesmas caracteriacutesticas do
faacutermaco padratildeo Dessa forma podemos afirmar que a moleacutecula natildeo sofreu alteraccedilatildeo durante o
processo de extraccedilatildeo (Figura 02)
Figura 02 - Espectro da analise no FTIR do padratildeo de Alprazolam faacutermaco e de amostra extraiacuteda
20
5 CONCLUSAtildeO
O meacutetodo demonstrou atender aos requisitos de boas praacuteticas exigidos pela Resoluccedilatildeo
RDC 899 de 29 de maio de 2003 sendo exato e sensiacutevel
Dentre as amostras de pacientes intoxicados por medicamentos natildeo se obteve resultados
positivos para o Alprazolam
Os medicamentos constituem como um dos principais meios utilizado para tentativa de
suiciacutedio tendecircncia que eacute observada nos paiacuteses de terceiro mundo entre eles os psicofaacutermacos os
mais utilizados Haacute necessidade de uma melhor formaccedilatildeo e atualizaccedilatildeo dos profissionais assim
como de informaccedilatildeo aos usuaacuterios e medidas de prevenccedilatildeo que poderiam alertar sobre os riscos e
monitorar o uso desses medicamentos
O Brasil em agosto de 2006 deu o primeiro passo lanccedilando a Portaria nordm 1876 com as
diretrizes nacionais para Prevenccedilatildeo do Suiciacutedio nas trecircs esferas da gestatildeo Portanto estudar e
prevenir as tentativas de suiciacutedio eacute um desafio pois envolve recursos financeiros e sensibilidade
da parte dos profissionais envolvidos
Por outro lado aleacutem do conhecimento dos dados epidemioloacutegicos eacute necessaacuteria a
identificaccedilatildeo dos grupos terapecircuticos responsaacuteveis pelas intoxicaccedilotildees As teacutecnicas
cromatograacuteficas e espectrofotomeacutetricas possuem uma extensa aplicabilidade em pesquisas
cientiacuteficas anaacutelise quiacutemica teste de controle de qualidade de medicamentos entre outros Isso se
daacute por serem teacutecnicas altamente sensiacuteveis de alta resoluccedilatildeo e por ser um meacutetodo mais raacutepido e
preciso Ao analisar traccedilos de compostos em amostras complexas como sangue e urina as
anaacutelises toxicoloacutegicas auxiliam no prognoacutestico e diagnoacutestico de intoxicaccedilotildees uma vez que eacute
possiacutevel identificaccedilatildeo destes compostos em amostras bioloacutegicas
O meacutetodo por CCDC tem caraacuteter semindashquantitativo jaacute que a quantificaccedilatildeo dos faacutermacos eacute
baseada apenas na comparaccedilatildeo visual dos ldquoSpotsrdquo das amostras e dos padrotildees Embora o meacutetodo
seja adequado para triagem os resultados mostram que a quantificaccedilatildeo de faacutermacos por meacutetodos
baseados no uso de CCDC deve possuir uma interpretaccedilatildeo bem cautelosa especialmente devido agrave
incerteza associada a este tipo de comparaccedilatildeo
Se faz necessaacuterio a confirmaccedilatildeo da identidade do faacutermaco por outras teacutecnicas eou outros
meacutetodos de anaacutelise como a Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia (CLAE) e Cromatografia
21
Gasosa (CG) sendo assim possiacutevel correlacionar os perfis cromatograacuteficos entre as diferentes
teacutecnicas
ABSTRACT
The medicines are presented as the main toxic agent responsible for cases of human poisoning
thus constituting a major challenge for those working with Public Health However the absence
of a specialized toxicological analysis hinders a more accurate diagnosis of cases The
spectrophotometric and chromatographic techniques may assist in confirming the diagnosis A
Comparative Thin Layer Chromatography (CCDC) is a separation technique simple low cost and
good sensitivity The identification of the drug can be achieved both quantitatively and
qualitatively by infrared spectroscopy Fourier transform (FTIR) This research proposal was to
evaluate two techniques for identification of Alprazolam in urine of patients with toxic exposure
to drugs assessing the selectivity accuracy limit of detection limit of quantification and
robustness in chromatographic techniques The method was optimized validated and applied in
accordance with Resolution RDC Nordm 899 of May 29 2003 The chromatographic assay used
plates of Silica Gel G-60 elution with chloroform-methanol 91 (v v) and as a chromogenic
agent the Reactive Dragendorff The presence of the drug was confirmed by the FTIR analysis
The method proved to be selective chromatographic conditions established by presenting Limit
Detection and Quantification 200μgml and 100μgml respectively Among the patient samples
drug poisoning no positive results obtained for Alprazolam The FTIR analysis showed that the
drug did not undergo degradation in the extraction process The method has proven to meet the
requirements of good practice required by RDC Nordm 899 of 29 May 2003 being sensitive and
accurate
KEYWORDS Alprazolam Spectroscopy Chromatography Intoxication
REFEREcircNCIAS
AMERICAN ASSOCIATION OF POISON CENTERS TOXIC EXPOSURE SURVEILLANCE
SYSTEM (AAPCC) Disponivel em lt httpwwwaapccorgdnndefaultaspx gt acessado em 18
de setembro de 2012
22
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espectrofotometria no ultravioleta Revista Brasileira de Anaacutelises Cliacutenicas Paranaacute v 40 n 4
p 257-259 ago 2008
AUCHEWSKI L et al Avaliaccedilatildeo da orientaccedilatildeo meacutedica sobre os efeitos colaterais de
benzodiazepiacutenicos Revista Brasileira de Psiquiatria v 26 n 1 p 24-31 2004
BERNADES S S TURINI C A MATSUO T Perfil das tentativas de suiciacutedio por sobredose
intencional de medicamentos atendidas por um Centro de Controle de intoxicaccedilotildees do Paranaacute
Brasil Caderno de Sauacutede Puacuteblica Rio de Janeiro v 26 n 7 p 1366-1372 jul 2010
BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) Resoluccedilatildeo
- RDC Nordm 899 de 29052003 Dispotildee sobre o Guia para validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos e
bioanaliacuteticos Diaacuterio Oficial [da] Republica Repuacuteblica Federativa do Brasil Brasiacutelia DF 02 de
junho de 2003
BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Portaria nordm 1876 de 14 de agosto de 2006 Diaacuterio Oficial da
Uniatildeo Brasiacutelia DF 15 de agosto de 2006 Seccedilatildeo 1 p 65
CASSIANO N M et al Validaccedilatildeo em meacutetodos cromatograacuteficos para anaacutelises de pequenas
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Nova na Escola n 7 p 21-25 1998
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antiinflamatoacuterios natildeo-esteroacuteides manipulados empregando espectroscopia no infravermelho
(DRIFTS) Revista de Ciecircncias Farmacecircuticas Araraquara v 25 n 2 p 91-98 2004
EIZENDEHER L B Comparaccedilatildeo de meacutetodos cromatograacuteficos por camada delgada E
liacutequida com kits imunoloacutegicos para detecccedilatildeo de aflatoxinas em amendoim in natura e doce
de amendoim 2005 87 f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Tecnologia de Alimentos) ndash Programa de
23
poacutes-graduaccedilatildeo em Tecnologia de Alimentos Universidade Federal do Paraacute Beleacutem PA 2005
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zero a 14 anos registradas no Centro de Informaccedilotildees Toxicoloacutegicas de Santa Catarina ndash
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Federal de Santa Catarina Florianoacutepolis 2004
FORSAN M A O uso indiscriminado de benzodiazepiacutenicos uma anaacutelise criacutetica das
praacuteticas de prescriccedilatildeo dispensaccedilatildeo e uso prolongado 26 f 2010 Trabalho de Conclusatildeo de
Curso de Especializaccedilatildeo (Atenccedilatildeo Baacutesica em Sauacutede da Famiacutelia) ndash Universidade Federal de Minas
Gerais Campos Gerais 2010
GANDOLFI E ANDRADE M G G Eventos toxicoloacutegicos relacionados a medicamentos no
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realizado no acircmbito da disciplina de Toxicologia Mecaniacutestica- Curso de mestrado de Ciecircncias
Farmacecircuticas- Faculdade de Farmaacutecia da universidade do Porto 2008
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mulheres de um centro de convivecircncia para idosos Caderno de Sauacutede Puacuteblica Rio de Janeiro
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para determinaccedilatildeo de Alprazolam e Diazepam em formulaccedilotildees farmacecircuticas de uso humano e
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Psiquiatria do Rio Grande do Sul Rio Grande do Sul v 32 n 2 p 38-43 2010
MATOS V T G et al Avaliaccedilatildeo dos eventos toacutexicos com medicamentos ocorridos em crianccedilas
no estado de Mato Grosso do Sul Revista Brasileira de Toxicologia v 21 n 2 p 81-86 2008
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analiacutetico para quantificaccedilatildeo de diclofenaco de dietilamocircnio em pele humana por cromatografia
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ANEXO A
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15
Acerca da ocupaccedilatildeo dos pacientes os estudantes foram os mais frequentes (n=6-333)
Este dado entra em desacordo com a mesma variaacutevel analisada no estudo de Turini et al (2010)
em que mostra que a ocupaccedilatildeo mais relevante nos seu estudo eacute a de empregado (Tabela 01)
Observando-se os sinais e sintomas das intoxicaccedilotildees as Siacutendromes Toacutexicas por
Superdosagem de Sedativos (pupilas mioacuteticas tremor hipotensatildeo confusatildeo mental e sonolecircncia)
e a Extrapiramidal (choro monoacutetono opistoacutetomo e distonia) foram predominantes O quadro
toacutexico se desenvolve dependendo da dose do subgrupo terapecircutico e do tempo entre a exposiccedilatildeo
e o atendimento Os ansioliacuteticos principalmente os Benzodiazepiacutenicos (BZD) satildeo compostos
que apresentam maior iacutendice terapecircutico e menor potencialidade de provocar acidentes fatais e
menor tendecircncia para produzir toleracircncia farmacoloacutegica (FORSAN 2010)
Tabela 01 ndash Frequecircncia do tipo de circunstacircncia da faixa etaacuteria do gecircnero e da ocupaccedilatildeo dos pacientes intoxicados
atendidos no Ceatox-CG
Variaacutevel
N
Circunstacircncia (N=18)
Tentativa de Suiciacutedio 10 557
Acidental 1 57
Outra 7 389
Faixa Etaacuteria (anos) (N=18)
1---9 3 166
10---19 5 278
20---39 7 389
gt 40 3 167
Gecircnero (N=18)
Masculino 8 444
Feminino 10 556
Ocupaccedilatildeo (N=18)
Estudante 6 333
Do lar 4 222
Outra 8 444
16
Em relaccedilatildeo agrave variaacutevel evoluccedilatildeo natildeo se registrou nenhum oacutebito no periacuteodo estudado
Dados nacionais entre os anos de 2007 a 2009 mostram que os medicamentos apresentaram
baixo coeficiente de letalidade meacutedio quando comparado aos agrotoacutexicos de uso agriacutecola e as
drogas de abuso (SISTEMA2012) Um estudo realizado por Mota et al (2012) usando dados
secundaacuterios do Sistema Informaccedilatildeo de Mortalidade (SIM)MS entre 1996 a 2005 identificou
4403 oacutebitos relacionados a medicamentos entretanto natildeo foi possiacutevel estabelecer qual a
principal classe de medicamentos nem o princiacutepio ativo envolvido com o agravo
42 Dados Experimentais
Para otimizaccedilatildeo do meacutetodo vaacuterios procedimentos foram realizados seguindo os
paracircmetros analiacuteticos de validaccedilatildeo objetivando detectar a presenccedila de Alprazolam em urina de
paciente com histoacuterico de exposiccedilatildeo toxica a esse faacutermaco A metodologia desenvolvida e
validada mostrou-se em conformidade com as especificaccedilotildees da Resoluccedilatildeo RDC nordm899 de 29 de
maio de 2003 (BRASIL 2003)
Na avaliaccedilatildeo da seletividade nas amostras de urina analisadas natildeo foram detectados
interferentes nas condiccedilotildees de extraccedilatildeo estabelecidas Assim o meacutetodo mostrou-se seletivo jaacute
que as amostras natildeo mostraram nenhum spot(mancha) semelhante aos desenvolvidos pelos
padrotildees No processo de validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos a especificidade ou seletividade eacute o
primeiro passo para o desenvolvimento de um meacutetodo este paracircmetro deve ser avaliado
continuamente para assegurar a precisatildeo e exatidatildeo deste durante sua validaccedilatildeo (SILVA et al
2010) (Tabela 02)
Para os ensaios de recuperaccedilatildeo foi observada a intensidade do spot desenvolvido em cada
amostra para cada niacutevel de fortificaccedilatildeo Nas amostras fortificadas com 200 microg do padratildeo
obtivemos uma recuperaccedilatildeo de 917 enquanto que nas amostras fortificadas com 400 microg do
mesmo o percentual meacutedio obtido foi de 967 demonstrando assim a exatidatildeo do meacutetodo
Segundo a Resoluccedilatildeo RDC nordm 899 de 29 de maio de 2003 a exatidatildeo se daacute pela concordacircncia
entre o resultado de um ensaio e um valor de referecircncia
17
Tabela 02 ndash Avaliaccedilatildeo da seletividade comparando-se spot e Rf (Relative Front) dos padrotildees de
Alprazolam e amostras branco
Sistema-solvente Agente cromogecircnico
Clorofoacutermio-metanol(91v v)
DI
Clorofoacutermio-acetona(41vv)
DI
FaacutermacoAmostras Rf e Cor Rf e Cor
Padratildeo Alprazolam faacutermaco
Padratildeo Alprazolam comprimido
ABal1
ABal2
ABal3
ABal4
ABal5
05 + c
026 + c
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Nota DI = Dragendorff iodado ABal = amostra branco alcalina Rf = fator de retenccedilatildeo c = cor
castanha
O Limite de Detecccedilatildeo e o Limite de Quantificaccedilatildeo para o Alprazolam foram de
100microgmL e 200 microgmL respectivamente Ribani et al (2004) define o Limite de Detecccedilatildeo (LD)
como sendo a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser detectada mas natildeo
necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento experimental O Limite
de Quantificaccedilatildeo (LQ) eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode
ser medida utilizando um determinado procedimento experimental (Figura 01)
O meacutetodo de extraccedilatildeo utilizado particcedilatildeo liacutequido-liacutequido demonstrou-se eficaz pois a
solubilidade do faacutermaco avaliado possui uma elevada afinidade pela mistura de solventes
utilizados nesse procedimento Na separaccedilatildeo do analito da matriz a sonicaccedilatildeo que eacute o processo
que utiliza a energia das ondas sonoras mais comumente a ultrassom se mostrou mais eficaz que
a centrifugaccedilatildeo
O sistema formado pelos solventes clorofoacutermio-metanol (91 vv) obteve o melhor
resultado em relaccedilatildeo ao sistema solvente clorofoacutermio-acetona(41 vv) tendo em vista melhor
resultado na separaccedilatildeo dos padrotildees e amostras
18
Figura 01-Identificaccedilatildeo de Alprazolam em trecircs niacuteveis de fortificaccedilatildeo (n = 3) alta meacutedia e baixa
Dentre os agentes cromogecircnicos utilizados na revelaccedilatildeo apenas o Reativo de Dragendorff
se mostrou eficaz Observou-se atraveacutes do meacutetodo fiacutesico utilizando a Cacircmera de Luz UV que o
Alprazolam faacutermaco e o Alprazolam comprimido natildeo transmite fluorescecircncia no comprimento
de onda de 366nm
Para avaliaccedilatildeo da Robustez as soluccedilotildees-padratildeo (faacutermaco e medicamento) foram
dissolvidas em diversos solventes como apresentado na Tabela 03 O metanol foi o solvente em
que houve revelaccedilatildeo na placa cromatograacutefica tanto do faacutermaco como do medicamento
Tabela 03 - Anaacutelise dos diferentes solventes da soluccedilatildeo estoque padratildeo puro do faacutermaco e do medicamento de
Alprazolam a partir do Rf
NOTA Rf = Relative Front spot= cormancha
Solvente Alprazolam faacutermaco Alprazolam medicamento
Rf Rf
Metanol 05 026
Aacutegua 06 -
ClorofoacutermioAcetona
(41)
056 -
ClorofoacutermioMetanol
(41)
052 -
AMOSTRAS
PADRAtildeO
19
Os testes de robustez satildeo de fundamental importacircncia para que os analistas conheccedilam
quais fatores devem ser estritamente controlados durante a execuccedilatildeo de um meacutetodo Se as
alteraccedilotildees das condiccedilotildees de anaacutelise produzirem resultados dentro dos limites aceitaacuteveis de
seletividade exatidatildeo e precisatildeo o meacutetodo pode ser considerado robusto e tais variaccedilotildees podem
ser incorporadas ao procedimento (CASSIANO et al 2009)
Apesar do meacutetodo ter se mostrado seletivo para o Alprazolam ele natildeo eacute especifico apenas
para esse faacutermaco Sendo assim o meacutetodo foi aplicado em 7 (sete) amostras de pacientes com
histoacuterico de exposiccedilatildeo toacutexica por medicamentos atendidos pelo Centro de Informaccedilatildeo
Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) poreacutem natildeo foi possiacutevel obter a recuperaccedilatildeo dos
faacutermacos Acredita-se que a quantidade ingerida dos medicamentos pelos pacientes foi baixa ou
que pela demora da coleta da amostra os faacutermacos tenham sido metabolizado pelo organismo
Nos ensaios de confirmaccedilatildeo por FTIR observou-se que o Alprazolam padratildeo apresentou as
seguintes vibraccedilotildees moleculares A deformaccedilatildeo angular N-H de amina secundaacuteria eacute observada na
banda em 1660 cm-1
Em 1647 cm-1
aparece uma banda que pode ser atribuiacuteda ao estiramento
C=N da imina e em 1397 cm-1
aparece uma banda atribuiacuteda ao estiramento C-N das aminas A
banda caracteriacutestica do estiramento =C-H de carbono sp2 do anel aromaacutetico se encontra em 3275
cm-1
O espectro do faacutermaco extraiacutedo da matriz bioloacutegica mantecircm as mesmas caracteriacutesticas do
faacutermaco padratildeo Dessa forma podemos afirmar que a moleacutecula natildeo sofreu alteraccedilatildeo durante o
processo de extraccedilatildeo (Figura 02)
Figura 02 - Espectro da analise no FTIR do padratildeo de Alprazolam faacutermaco e de amostra extraiacuteda
20
5 CONCLUSAtildeO
O meacutetodo demonstrou atender aos requisitos de boas praacuteticas exigidos pela Resoluccedilatildeo
RDC 899 de 29 de maio de 2003 sendo exato e sensiacutevel
Dentre as amostras de pacientes intoxicados por medicamentos natildeo se obteve resultados
positivos para o Alprazolam
Os medicamentos constituem como um dos principais meios utilizado para tentativa de
suiciacutedio tendecircncia que eacute observada nos paiacuteses de terceiro mundo entre eles os psicofaacutermacos os
mais utilizados Haacute necessidade de uma melhor formaccedilatildeo e atualizaccedilatildeo dos profissionais assim
como de informaccedilatildeo aos usuaacuterios e medidas de prevenccedilatildeo que poderiam alertar sobre os riscos e
monitorar o uso desses medicamentos
O Brasil em agosto de 2006 deu o primeiro passo lanccedilando a Portaria nordm 1876 com as
diretrizes nacionais para Prevenccedilatildeo do Suiciacutedio nas trecircs esferas da gestatildeo Portanto estudar e
prevenir as tentativas de suiciacutedio eacute um desafio pois envolve recursos financeiros e sensibilidade
da parte dos profissionais envolvidos
Por outro lado aleacutem do conhecimento dos dados epidemioloacutegicos eacute necessaacuteria a
identificaccedilatildeo dos grupos terapecircuticos responsaacuteveis pelas intoxicaccedilotildees As teacutecnicas
cromatograacuteficas e espectrofotomeacutetricas possuem uma extensa aplicabilidade em pesquisas
cientiacuteficas anaacutelise quiacutemica teste de controle de qualidade de medicamentos entre outros Isso se
daacute por serem teacutecnicas altamente sensiacuteveis de alta resoluccedilatildeo e por ser um meacutetodo mais raacutepido e
preciso Ao analisar traccedilos de compostos em amostras complexas como sangue e urina as
anaacutelises toxicoloacutegicas auxiliam no prognoacutestico e diagnoacutestico de intoxicaccedilotildees uma vez que eacute
possiacutevel identificaccedilatildeo destes compostos em amostras bioloacutegicas
O meacutetodo por CCDC tem caraacuteter semindashquantitativo jaacute que a quantificaccedilatildeo dos faacutermacos eacute
baseada apenas na comparaccedilatildeo visual dos ldquoSpotsrdquo das amostras e dos padrotildees Embora o meacutetodo
seja adequado para triagem os resultados mostram que a quantificaccedilatildeo de faacutermacos por meacutetodos
baseados no uso de CCDC deve possuir uma interpretaccedilatildeo bem cautelosa especialmente devido agrave
incerteza associada a este tipo de comparaccedilatildeo
Se faz necessaacuterio a confirmaccedilatildeo da identidade do faacutermaco por outras teacutecnicas eou outros
meacutetodos de anaacutelise como a Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia (CLAE) e Cromatografia
21
Gasosa (CG) sendo assim possiacutevel correlacionar os perfis cromatograacuteficos entre as diferentes
teacutecnicas
ABSTRACT
The medicines are presented as the main toxic agent responsible for cases of human poisoning
thus constituting a major challenge for those working with Public Health However the absence
of a specialized toxicological analysis hinders a more accurate diagnosis of cases The
spectrophotometric and chromatographic techniques may assist in confirming the diagnosis A
Comparative Thin Layer Chromatography (CCDC) is a separation technique simple low cost and
good sensitivity The identification of the drug can be achieved both quantitatively and
qualitatively by infrared spectroscopy Fourier transform (FTIR) This research proposal was to
evaluate two techniques for identification of Alprazolam in urine of patients with toxic exposure
to drugs assessing the selectivity accuracy limit of detection limit of quantification and
robustness in chromatographic techniques The method was optimized validated and applied in
accordance with Resolution RDC Nordm 899 of May 29 2003 The chromatographic assay used
plates of Silica Gel G-60 elution with chloroform-methanol 91 (v v) and as a chromogenic
agent the Reactive Dragendorff The presence of the drug was confirmed by the FTIR analysis
The method proved to be selective chromatographic conditions established by presenting Limit
Detection and Quantification 200μgml and 100μgml respectively Among the patient samples
drug poisoning no positive results obtained for Alprazolam The FTIR analysis showed that the
drug did not undergo degradation in the extraction process The method has proven to meet the
requirements of good practice required by RDC Nordm 899 of 29 May 2003 being sensitive and
accurate
KEYWORDS Alprazolam Spectroscopy Chromatography Intoxication
REFEREcircNCIAS
AMERICAN ASSOCIATION OF POISON CENTERS TOXIC EXPOSURE SURVEILLANCE
SYSTEM (AAPCC) Disponivel em lt httpwwwaapccorgdnndefaultaspx gt acessado em 18
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22
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YANG H IRUDAYARAJ J Rapid determination of vitamin C by NIR MIR and FT-Raman
techniques Journal of Pharmacy and Pharmacology London v 54 n 9 p 1247-1255 2002
27
ANEXO A
28
16
Em relaccedilatildeo agrave variaacutevel evoluccedilatildeo natildeo se registrou nenhum oacutebito no periacuteodo estudado
Dados nacionais entre os anos de 2007 a 2009 mostram que os medicamentos apresentaram
baixo coeficiente de letalidade meacutedio quando comparado aos agrotoacutexicos de uso agriacutecola e as
drogas de abuso (SISTEMA2012) Um estudo realizado por Mota et al (2012) usando dados
secundaacuterios do Sistema Informaccedilatildeo de Mortalidade (SIM)MS entre 1996 a 2005 identificou
4403 oacutebitos relacionados a medicamentos entretanto natildeo foi possiacutevel estabelecer qual a
principal classe de medicamentos nem o princiacutepio ativo envolvido com o agravo
42 Dados Experimentais
Para otimizaccedilatildeo do meacutetodo vaacuterios procedimentos foram realizados seguindo os
paracircmetros analiacuteticos de validaccedilatildeo objetivando detectar a presenccedila de Alprazolam em urina de
paciente com histoacuterico de exposiccedilatildeo toxica a esse faacutermaco A metodologia desenvolvida e
validada mostrou-se em conformidade com as especificaccedilotildees da Resoluccedilatildeo RDC nordm899 de 29 de
maio de 2003 (BRASIL 2003)
Na avaliaccedilatildeo da seletividade nas amostras de urina analisadas natildeo foram detectados
interferentes nas condiccedilotildees de extraccedilatildeo estabelecidas Assim o meacutetodo mostrou-se seletivo jaacute
que as amostras natildeo mostraram nenhum spot(mancha) semelhante aos desenvolvidos pelos
padrotildees No processo de validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos a especificidade ou seletividade eacute o
primeiro passo para o desenvolvimento de um meacutetodo este paracircmetro deve ser avaliado
continuamente para assegurar a precisatildeo e exatidatildeo deste durante sua validaccedilatildeo (SILVA et al
2010) (Tabela 02)
Para os ensaios de recuperaccedilatildeo foi observada a intensidade do spot desenvolvido em cada
amostra para cada niacutevel de fortificaccedilatildeo Nas amostras fortificadas com 200 microg do padratildeo
obtivemos uma recuperaccedilatildeo de 917 enquanto que nas amostras fortificadas com 400 microg do
mesmo o percentual meacutedio obtido foi de 967 demonstrando assim a exatidatildeo do meacutetodo
Segundo a Resoluccedilatildeo RDC nordm 899 de 29 de maio de 2003 a exatidatildeo se daacute pela concordacircncia
entre o resultado de um ensaio e um valor de referecircncia
17
Tabela 02 ndash Avaliaccedilatildeo da seletividade comparando-se spot e Rf (Relative Front) dos padrotildees de
Alprazolam e amostras branco
Sistema-solvente Agente cromogecircnico
Clorofoacutermio-metanol(91v v)
DI
Clorofoacutermio-acetona(41vv)
DI
FaacutermacoAmostras Rf e Cor Rf e Cor
Padratildeo Alprazolam faacutermaco
Padratildeo Alprazolam comprimido
ABal1
ABal2
ABal3
ABal4
ABal5
05 + c
026 + c
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Nota DI = Dragendorff iodado ABal = amostra branco alcalina Rf = fator de retenccedilatildeo c = cor
castanha
O Limite de Detecccedilatildeo e o Limite de Quantificaccedilatildeo para o Alprazolam foram de
100microgmL e 200 microgmL respectivamente Ribani et al (2004) define o Limite de Detecccedilatildeo (LD)
como sendo a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser detectada mas natildeo
necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento experimental O Limite
de Quantificaccedilatildeo (LQ) eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode
ser medida utilizando um determinado procedimento experimental (Figura 01)
O meacutetodo de extraccedilatildeo utilizado particcedilatildeo liacutequido-liacutequido demonstrou-se eficaz pois a
solubilidade do faacutermaco avaliado possui uma elevada afinidade pela mistura de solventes
utilizados nesse procedimento Na separaccedilatildeo do analito da matriz a sonicaccedilatildeo que eacute o processo
que utiliza a energia das ondas sonoras mais comumente a ultrassom se mostrou mais eficaz que
a centrifugaccedilatildeo
O sistema formado pelos solventes clorofoacutermio-metanol (91 vv) obteve o melhor
resultado em relaccedilatildeo ao sistema solvente clorofoacutermio-acetona(41 vv) tendo em vista melhor
resultado na separaccedilatildeo dos padrotildees e amostras
18
Figura 01-Identificaccedilatildeo de Alprazolam em trecircs niacuteveis de fortificaccedilatildeo (n = 3) alta meacutedia e baixa
Dentre os agentes cromogecircnicos utilizados na revelaccedilatildeo apenas o Reativo de Dragendorff
se mostrou eficaz Observou-se atraveacutes do meacutetodo fiacutesico utilizando a Cacircmera de Luz UV que o
Alprazolam faacutermaco e o Alprazolam comprimido natildeo transmite fluorescecircncia no comprimento
de onda de 366nm
Para avaliaccedilatildeo da Robustez as soluccedilotildees-padratildeo (faacutermaco e medicamento) foram
dissolvidas em diversos solventes como apresentado na Tabela 03 O metanol foi o solvente em
que houve revelaccedilatildeo na placa cromatograacutefica tanto do faacutermaco como do medicamento
Tabela 03 - Anaacutelise dos diferentes solventes da soluccedilatildeo estoque padratildeo puro do faacutermaco e do medicamento de
Alprazolam a partir do Rf
NOTA Rf = Relative Front spot= cormancha
Solvente Alprazolam faacutermaco Alprazolam medicamento
Rf Rf
Metanol 05 026
Aacutegua 06 -
ClorofoacutermioAcetona
(41)
056 -
ClorofoacutermioMetanol
(41)
052 -
AMOSTRAS
PADRAtildeO
19
Os testes de robustez satildeo de fundamental importacircncia para que os analistas conheccedilam
quais fatores devem ser estritamente controlados durante a execuccedilatildeo de um meacutetodo Se as
alteraccedilotildees das condiccedilotildees de anaacutelise produzirem resultados dentro dos limites aceitaacuteveis de
seletividade exatidatildeo e precisatildeo o meacutetodo pode ser considerado robusto e tais variaccedilotildees podem
ser incorporadas ao procedimento (CASSIANO et al 2009)
Apesar do meacutetodo ter se mostrado seletivo para o Alprazolam ele natildeo eacute especifico apenas
para esse faacutermaco Sendo assim o meacutetodo foi aplicado em 7 (sete) amostras de pacientes com
histoacuterico de exposiccedilatildeo toacutexica por medicamentos atendidos pelo Centro de Informaccedilatildeo
Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) poreacutem natildeo foi possiacutevel obter a recuperaccedilatildeo dos
faacutermacos Acredita-se que a quantidade ingerida dos medicamentos pelos pacientes foi baixa ou
que pela demora da coleta da amostra os faacutermacos tenham sido metabolizado pelo organismo
Nos ensaios de confirmaccedilatildeo por FTIR observou-se que o Alprazolam padratildeo apresentou as
seguintes vibraccedilotildees moleculares A deformaccedilatildeo angular N-H de amina secundaacuteria eacute observada na
banda em 1660 cm-1
Em 1647 cm-1
aparece uma banda que pode ser atribuiacuteda ao estiramento
C=N da imina e em 1397 cm-1
aparece uma banda atribuiacuteda ao estiramento C-N das aminas A
banda caracteriacutestica do estiramento =C-H de carbono sp2 do anel aromaacutetico se encontra em 3275
cm-1
O espectro do faacutermaco extraiacutedo da matriz bioloacutegica mantecircm as mesmas caracteriacutesticas do
faacutermaco padratildeo Dessa forma podemos afirmar que a moleacutecula natildeo sofreu alteraccedilatildeo durante o
processo de extraccedilatildeo (Figura 02)
Figura 02 - Espectro da analise no FTIR do padratildeo de Alprazolam faacutermaco e de amostra extraiacuteda
20
5 CONCLUSAtildeO
O meacutetodo demonstrou atender aos requisitos de boas praacuteticas exigidos pela Resoluccedilatildeo
RDC 899 de 29 de maio de 2003 sendo exato e sensiacutevel
Dentre as amostras de pacientes intoxicados por medicamentos natildeo se obteve resultados
positivos para o Alprazolam
Os medicamentos constituem como um dos principais meios utilizado para tentativa de
suiciacutedio tendecircncia que eacute observada nos paiacuteses de terceiro mundo entre eles os psicofaacutermacos os
mais utilizados Haacute necessidade de uma melhor formaccedilatildeo e atualizaccedilatildeo dos profissionais assim
como de informaccedilatildeo aos usuaacuterios e medidas de prevenccedilatildeo que poderiam alertar sobre os riscos e
monitorar o uso desses medicamentos
O Brasil em agosto de 2006 deu o primeiro passo lanccedilando a Portaria nordm 1876 com as
diretrizes nacionais para Prevenccedilatildeo do Suiciacutedio nas trecircs esferas da gestatildeo Portanto estudar e
prevenir as tentativas de suiciacutedio eacute um desafio pois envolve recursos financeiros e sensibilidade
da parte dos profissionais envolvidos
Por outro lado aleacutem do conhecimento dos dados epidemioloacutegicos eacute necessaacuteria a
identificaccedilatildeo dos grupos terapecircuticos responsaacuteveis pelas intoxicaccedilotildees As teacutecnicas
cromatograacuteficas e espectrofotomeacutetricas possuem uma extensa aplicabilidade em pesquisas
cientiacuteficas anaacutelise quiacutemica teste de controle de qualidade de medicamentos entre outros Isso se
daacute por serem teacutecnicas altamente sensiacuteveis de alta resoluccedilatildeo e por ser um meacutetodo mais raacutepido e
preciso Ao analisar traccedilos de compostos em amostras complexas como sangue e urina as
anaacutelises toxicoloacutegicas auxiliam no prognoacutestico e diagnoacutestico de intoxicaccedilotildees uma vez que eacute
possiacutevel identificaccedilatildeo destes compostos em amostras bioloacutegicas
O meacutetodo por CCDC tem caraacuteter semindashquantitativo jaacute que a quantificaccedilatildeo dos faacutermacos eacute
baseada apenas na comparaccedilatildeo visual dos ldquoSpotsrdquo das amostras e dos padrotildees Embora o meacutetodo
seja adequado para triagem os resultados mostram que a quantificaccedilatildeo de faacutermacos por meacutetodos
baseados no uso de CCDC deve possuir uma interpretaccedilatildeo bem cautelosa especialmente devido agrave
incerteza associada a este tipo de comparaccedilatildeo
Se faz necessaacuterio a confirmaccedilatildeo da identidade do faacutermaco por outras teacutecnicas eou outros
meacutetodos de anaacutelise como a Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia (CLAE) e Cromatografia
21
Gasosa (CG) sendo assim possiacutevel correlacionar os perfis cromatograacuteficos entre as diferentes
teacutecnicas
ABSTRACT
The medicines are presented as the main toxic agent responsible for cases of human poisoning
thus constituting a major challenge for those working with Public Health However the absence
of a specialized toxicological analysis hinders a more accurate diagnosis of cases The
spectrophotometric and chromatographic techniques may assist in confirming the diagnosis A
Comparative Thin Layer Chromatography (CCDC) is a separation technique simple low cost and
good sensitivity The identification of the drug can be achieved both quantitatively and
qualitatively by infrared spectroscopy Fourier transform (FTIR) This research proposal was to
evaluate two techniques for identification of Alprazolam in urine of patients with toxic exposure
to drugs assessing the selectivity accuracy limit of detection limit of quantification and
robustness in chromatographic techniques The method was optimized validated and applied in
accordance with Resolution RDC Nordm 899 of May 29 2003 The chromatographic assay used
plates of Silica Gel G-60 elution with chloroform-methanol 91 (v v) and as a chromogenic
agent the Reactive Dragendorff The presence of the drug was confirmed by the FTIR analysis
The method proved to be selective chromatographic conditions established by presenting Limit
Detection and Quantification 200μgml and 100μgml respectively Among the patient samples
drug poisoning no positive results obtained for Alprazolam The FTIR analysis showed that the
drug did not undergo degradation in the extraction process The method has proven to meet the
requirements of good practice required by RDC Nordm 899 of 29 May 2003 being sensitive and
accurate
KEYWORDS Alprazolam Spectroscopy Chromatography Intoxication
REFEREcircNCIAS
AMERICAN ASSOCIATION OF POISON CENTERS TOXIC EXPOSURE SURVEILLANCE
SYSTEM (AAPCC) Disponivel em lt httpwwwaapccorgdnndefaultaspx gt acessado em 18
de setembro de 2012
22
AMEacuteRICO M A MOSSIN S A G NISHIYAMA P Perfil de faacutermacos por
espectrofotometria no ultravioleta Revista Brasileira de Anaacutelises Cliacutenicas Paranaacute v 40 n 4
p 257-259 ago 2008
AUCHEWSKI L et al Avaliaccedilatildeo da orientaccedilatildeo meacutedica sobre os efeitos colaterais de
benzodiazepiacutenicos Revista Brasileira de Psiquiatria v 26 n 1 p 24-31 2004
BERNADES S S TURINI C A MATSUO T Perfil das tentativas de suiciacutedio por sobredose
intencional de medicamentos atendidas por um Centro de Controle de intoxicaccedilotildees do Paranaacute
Brasil Caderno de Sauacutede Puacuteblica Rio de Janeiro v 26 n 7 p 1366-1372 jul 2010
BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) Resoluccedilatildeo
- RDC Nordm 899 de 29052003 Dispotildee sobre o Guia para validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos e
bioanaliacuteticos Diaacuterio Oficial [da] Republica Repuacuteblica Federativa do Brasil Brasiacutelia DF 02 de
junho de 2003
BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Portaria nordm 1876 de 14 de agosto de 2006 Diaacuterio Oficial da
Uniatildeo Brasiacutelia DF 15 de agosto de 2006 Seccedilatildeo 1 p 65
CASSIANO N M et al Validaccedilatildeo em meacutetodos cromatograacuteficos para anaacutelises de pequenas
moleacuteculas em matrizes bioloacutegicas Quimica Nova v 32 n 4 p 1021-1030 2009
DEGANI A L G CASS Q B VIEIRA P C Cromatografia um breve ensaio Quiacutemica
Nova na Escola n 7 p 21-25 1998
DE SOUZA JS FERRAtildeO MF PARISOTTO G FURTADO JC Anaacutelise de medicamentos
antiinflamatoacuterios natildeo-esteroacuteides manipulados empregando espectroscopia no infravermelho
(DRIFTS) Revista de Ciecircncias Farmacecircuticas Araraquara v 25 n 2 p 91-98 2004
EIZENDEHER L B Comparaccedilatildeo de meacutetodos cromatograacuteficos por camada delgada E
liacutequida com kits imunoloacutegicos para detecccedilatildeo de aflatoxinas em amendoim in natura e doce
de amendoim 2005 87 f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Tecnologia de Alimentos) ndash Programa de
23
poacutes-graduaccedilatildeo em Tecnologia de Alimentos Universidade Federal do Paraacute Beleacutem PA 2005
EVORA M C et al Comparaccedilatildeo de teacutecnica FTIR de transmissatildeo reflexatildeo e fotoacuacutestica na
analise de poliamida- 6 reciclada e irradiada Polimeros Ciecircncia e tecnologia Satildeo Carlos v
12 n 1 p 60-68 2002
FALCAtildeO C C Perfil epidemioloacutegico das intoxicaccedilotildees por medicamentos em crianccedilas de
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KASSAB NM PAULO GNC Desenvolvimento e validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos por CLAE
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24
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25
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em 2007 e 2008 Revista Sauacutede e Pesquisa v 3 n 3 p 303-308 setdez 2010
RIBANI M et al Validaccedilatildeo de meacutetodos cromatograacuteficos e eletroforeacuteticos Quiacutemica Nova Satildeo
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STOPPE A Estudo observacional de Alprazolam no tratamento da ansiedade Revista
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Adolfo Lutz Satildeo Paulo v 66 n 3 p 308-310 2007
26
VALENTINI S R SOMMER W A MATIOLI G Validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos
Arquivos do Mudi v 11 n 2 p 26-31 2007
YANG H IRUDAYARAJ J Rapid determination of vitamin C by NIR MIR and FT-Raman
techniques Journal of Pharmacy and Pharmacology London v 54 n 9 p 1247-1255 2002
27
ANEXO A
28
17
Tabela 02 ndash Avaliaccedilatildeo da seletividade comparando-se spot e Rf (Relative Front) dos padrotildees de
Alprazolam e amostras branco
Sistema-solvente Agente cromogecircnico
Clorofoacutermio-metanol(91v v)
DI
Clorofoacutermio-acetona(41vv)
DI
FaacutermacoAmostras Rf e Cor Rf e Cor
Padratildeo Alprazolam faacutermaco
Padratildeo Alprazolam comprimido
ABal1
ABal2
ABal3
ABal4
ABal5
05 + c
026 + c
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Nota DI = Dragendorff iodado ABal = amostra branco alcalina Rf = fator de retenccedilatildeo c = cor
castanha
O Limite de Detecccedilatildeo e o Limite de Quantificaccedilatildeo para o Alprazolam foram de
100microgmL e 200 microgmL respectivamente Ribani et al (2004) define o Limite de Detecccedilatildeo (LD)
como sendo a menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode ser detectada mas natildeo
necessariamente quantificada utilizando um determinado procedimento experimental O Limite
de Quantificaccedilatildeo (LQ) eacute representado pela menor concentraccedilatildeo da substacircncia em exame que pode
ser medida utilizando um determinado procedimento experimental (Figura 01)
O meacutetodo de extraccedilatildeo utilizado particcedilatildeo liacutequido-liacutequido demonstrou-se eficaz pois a
solubilidade do faacutermaco avaliado possui uma elevada afinidade pela mistura de solventes
utilizados nesse procedimento Na separaccedilatildeo do analito da matriz a sonicaccedilatildeo que eacute o processo
que utiliza a energia das ondas sonoras mais comumente a ultrassom se mostrou mais eficaz que
a centrifugaccedilatildeo
O sistema formado pelos solventes clorofoacutermio-metanol (91 vv) obteve o melhor
resultado em relaccedilatildeo ao sistema solvente clorofoacutermio-acetona(41 vv) tendo em vista melhor
resultado na separaccedilatildeo dos padrotildees e amostras
18
Figura 01-Identificaccedilatildeo de Alprazolam em trecircs niacuteveis de fortificaccedilatildeo (n = 3) alta meacutedia e baixa
Dentre os agentes cromogecircnicos utilizados na revelaccedilatildeo apenas o Reativo de Dragendorff
se mostrou eficaz Observou-se atraveacutes do meacutetodo fiacutesico utilizando a Cacircmera de Luz UV que o
Alprazolam faacutermaco e o Alprazolam comprimido natildeo transmite fluorescecircncia no comprimento
de onda de 366nm
Para avaliaccedilatildeo da Robustez as soluccedilotildees-padratildeo (faacutermaco e medicamento) foram
dissolvidas em diversos solventes como apresentado na Tabela 03 O metanol foi o solvente em
que houve revelaccedilatildeo na placa cromatograacutefica tanto do faacutermaco como do medicamento
Tabela 03 - Anaacutelise dos diferentes solventes da soluccedilatildeo estoque padratildeo puro do faacutermaco e do medicamento de
Alprazolam a partir do Rf
NOTA Rf = Relative Front spot= cormancha
Solvente Alprazolam faacutermaco Alprazolam medicamento
Rf Rf
Metanol 05 026
Aacutegua 06 -
ClorofoacutermioAcetona
(41)
056 -
ClorofoacutermioMetanol
(41)
052 -
AMOSTRAS
PADRAtildeO
19
Os testes de robustez satildeo de fundamental importacircncia para que os analistas conheccedilam
quais fatores devem ser estritamente controlados durante a execuccedilatildeo de um meacutetodo Se as
alteraccedilotildees das condiccedilotildees de anaacutelise produzirem resultados dentro dos limites aceitaacuteveis de
seletividade exatidatildeo e precisatildeo o meacutetodo pode ser considerado robusto e tais variaccedilotildees podem
ser incorporadas ao procedimento (CASSIANO et al 2009)
Apesar do meacutetodo ter se mostrado seletivo para o Alprazolam ele natildeo eacute especifico apenas
para esse faacutermaco Sendo assim o meacutetodo foi aplicado em 7 (sete) amostras de pacientes com
histoacuterico de exposiccedilatildeo toacutexica por medicamentos atendidos pelo Centro de Informaccedilatildeo
Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) poreacutem natildeo foi possiacutevel obter a recuperaccedilatildeo dos
faacutermacos Acredita-se que a quantidade ingerida dos medicamentos pelos pacientes foi baixa ou
que pela demora da coleta da amostra os faacutermacos tenham sido metabolizado pelo organismo
Nos ensaios de confirmaccedilatildeo por FTIR observou-se que o Alprazolam padratildeo apresentou as
seguintes vibraccedilotildees moleculares A deformaccedilatildeo angular N-H de amina secundaacuteria eacute observada na
banda em 1660 cm-1
Em 1647 cm-1
aparece uma banda que pode ser atribuiacuteda ao estiramento
C=N da imina e em 1397 cm-1
aparece uma banda atribuiacuteda ao estiramento C-N das aminas A
banda caracteriacutestica do estiramento =C-H de carbono sp2 do anel aromaacutetico se encontra em 3275
cm-1
O espectro do faacutermaco extraiacutedo da matriz bioloacutegica mantecircm as mesmas caracteriacutesticas do
faacutermaco padratildeo Dessa forma podemos afirmar que a moleacutecula natildeo sofreu alteraccedilatildeo durante o
processo de extraccedilatildeo (Figura 02)
Figura 02 - Espectro da analise no FTIR do padratildeo de Alprazolam faacutermaco e de amostra extraiacuteda
20
5 CONCLUSAtildeO
O meacutetodo demonstrou atender aos requisitos de boas praacuteticas exigidos pela Resoluccedilatildeo
RDC 899 de 29 de maio de 2003 sendo exato e sensiacutevel
Dentre as amostras de pacientes intoxicados por medicamentos natildeo se obteve resultados
positivos para o Alprazolam
Os medicamentos constituem como um dos principais meios utilizado para tentativa de
suiciacutedio tendecircncia que eacute observada nos paiacuteses de terceiro mundo entre eles os psicofaacutermacos os
mais utilizados Haacute necessidade de uma melhor formaccedilatildeo e atualizaccedilatildeo dos profissionais assim
como de informaccedilatildeo aos usuaacuterios e medidas de prevenccedilatildeo que poderiam alertar sobre os riscos e
monitorar o uso desses medicamentos
O Brasil em agosto de 2006 deu o primeiro passo lanccedilando a Portaria nordm 1876 com as
diretrizes nacionais para Prevenccedilatildeo do Suiciacutedio nas trecircs esferas da gestatildeo Portanto estudar e
prevenir as tentativas de suiciacutedio eacute um desafio pois envolve recursos financeiros e sensibilidade
da parte dos profissionais envolvidos
Por outro lado aleacutem do conhecimento dos dados epidemioloacutegicos eacute necessaacuteria a
identificaccedilatildeo dos grupos terapecircuticos responsaacuteveis pelas intoxicaccedilotildees As teacutecnicas
cromatograacuteficas e espectrofotomeacutetricas possuem uma extensa aplicabilidade em pesquisas
cientiacuteficas anaacutelise quiacutemica teste de controle de qualidade de medicamentos entre outros Isso se
daacute por serem teacutecnicas altamente sensiacuteveis de alta resoluccedilatildeo e por ser um meacutetodo mais raacutepido e
preciso Ao analisar traccedilos de compostos em amostras complexas como sangue e urina as
anaacutelises toxicoloacutegicas auxiliam no prognoacutestico e diagnoacutestico de intoxicaccedilotildees uma vez que eacute
possiacutevel identificaccedilatildeo destes compostos em amostras bioloacutegicas
O meacutetodo por CCDC tem caraacuteter semindashquantitativo jaacute que a quantificaccedilatildeo dos faacutermacos eacute
baseada apenas na comparaccedilatildeo visual dos ldquoSpotsrdquo das amostras e dos padrotildees Embora o meacutetodo
seja adequado para triagem os resultados mostram que a quantificaccedilatildeo de faacutermacos por meacutetodos
baseados no uso de CCDC deve possuir uma interpretaccedilatildeo bem cautelosa especialmente devido agrave
incerteza associada a este tipo de comparaccedilatildeo
Se faz necessaacuterio a confirmaccedilatildeo da identidade do faacutermaco por outras teacutecnicas eou outros
meacutetodos de anaacutelise como a Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia (CLAE) e Cromatografia
21
Gasosa (CG) sendo assim possiacutevel correlacionar os perfis cromatograacuteficos entre as diferentes
teacutecnicas
ABSTRACT
The medicines are presented as the main toxic agent responsible for cases of human poisoning
thus constituting a major challenge for those working with Public Health However the absence
of a specialized toxicological analysis hinders a more accurate diagnosis of cases The
spectrophotometric and chromatographic techniques may assist in confirming the diagnosis A
Comparative Thin Layer Chromatography (CCDC) is a separation technique simple low cost and
good sensitivity The identification of the drug can be achieved both quantitatively and
qualitatively by infrared spectroscopy Fourier transform (FTIR) This research proposal was to
evaluate two techniques for identification of Alprazolam in urine of patients with toxic exposure
to drugs assessing the selectivity accuracy limit of detection limit of quantification and
robustness in chromatographic techniques The method was optimized validated and applied in
accordance with Resolution RDC Nordm 899 of May 29 2003 The chromatographic assay used
plates of Silica Gel G-60 elution with chloroform-methanol 91 (v v) and as a chromogenic
agent the Reactive Dragendorff The presence of the drug was confirmed by the FTIR analysis
The method proved to be selective chromatographic conditions established by presenting Limit
Detection and Quantification 200μgml and 100μgml respectively Among the patient samples
drug poisoning no positive results obtained for Alprazolam The FTIR analysis showed that the
drug did not undergo degradation in the extraction process The method has proven to meet the
requirements of good practice required by RDC Nordm 899 of 29 May 2003 being sensitive and
accurate
KEYWORDS Alprazolam Spectroscopy Chromatography Intoxication
REFEREcircNCIAS
AMERICAN ASSOCIATION OF POISON CENTERS TOXIC EXPOSURE SURVEILLANCE
SYSTEM (AAPCC) Disponivel em lt httpwwwaapccorgdnndefaultaspx gt acessado em 18
de setembro de 2012
22
AMEacuteRICO M A MOSSIN S A G NISHIYAMA P Perfil de faacutermacos por
espectrofotometria no ultravioleta Revista Brasileira de Anaacutelises Cliacutenicas Paranaacute v 40 n 4
p 257-259 ago 2008
AUCHEWSKI L et al Avaliaccedilatildeo da orientaccedilatildeo meacutedica sobre os efeitos colaterais de
benzodiazepiacutenicos Revista Brasileira de Psiquiatria v 26 n 1 p 24-31 2004
BERNADES S S TURINI C A MATSUO T Perfil das tentativas de suiciacutedio por sobredose
intencional de medicamentos atendidas por um Centro de Controle de intoxicaccedilotildees do Paranaacute
Brasil Caderno de Sauacutede Puacuteblica Rio de Janeiro v 26 n 7 p 1366-1372 jul 2010
BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) Resoluccedilatildeo
- RDC Nordm 899 de 29052003 Dispotildee sobre o Guia para validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos e
bioanaliacuteticos Diaacuterio Oficial [da] Republica Repuacuteblica Federativa do Brasil Brasiacutelia DF 02 de
junho de 2003
BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Portaria nordm 1876 de 14 de agosto de 2006 Diaacuterio Oficial da
Uniatildeo Brasiacutelia DF 15 de agosto de 2006 Seccedilatildeo 1 p 65
CASSIANO N M et al Validaccedilatildeo em meacutetodos cromatograacuteficos para anaacutelises de pequenas
moleacuteculas em matrizes bioloacutegicas Quimica Nova v 32 n 4 p 1021-1030 2009
DEGANI A L G CASS Q B VIEIRA P C Cromatografia um breve ensaio Quiacutemica
Nova na Escola n 7 p 21-25 1998
DE SOUZA JS FERRAtildeO MF PARISOTTO G FURTADO JC Anaacutelise de medicamentos
antiinflamatoacuterios natildeo-esteroacuteides manipulados empregando espectroscopia no infravermelho
(DRIFTS) Revista de Ciecircncias Farmacecircuticas Araraquara v 25 n 2 p 91-98 2004
EIZENDEHER L B Comparaccedilatildeo de meacutetodos cromatograacuteficos por camada delgada E
liacutequida com kits imunoloacutegicos para detecccedilatildeo de aflatoxinas em amendoim in natura e doce
de amendoim 2005 87 f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Tecnologia de Alimentos) ndash Programa de
23
poacutes-graduaccedilatildeo em Tecnologia de Alimentos Universidade Federal do Paraacute Beleacutem PA 2005
EVORA M C et al Comparaccedilatildeo de teacutecnica FTIR de transmissatildeo reflexatildeo e fotoacuacutestica na
analise de poliamida- 6 reciclada e irradiada Polimeros Ciecircncia e tecnologia Satildeo Carlos v
12 n 1 p 60-68 2002
FALCAtildeO C C Perfil epidemioloacutegico das intoxicaccedilotildees por medicamentos em crianccedilas de
zero a 14 anos registradas no Centro de Informaccedilotildees Toxicoloacutegicas de Santa Catarina ndash
CITSC (1995-2003) Trabalho de Conclusatildeo de Curso (Formaccedilatildeo em Medicina) ndash Universidade
Federal de Santa Catarina Florianoacutepolis 2004
FORSAN M A O uso indiscriminado de benzodiazepiacutenicos uma anaacutelise criacutetica das
praacuteticas de prescriccedilatildeo dispensaccedilatildeo e uso prolongado 26 f 2010 Trabalho de Conclusatildeo de
Curso de Especializaccedilatildeo (Atenccedilatildeo Baacutesica em Sauacutede da Famiacutelia) ndash Universidade Federal de Minas
Gerais Campos Gerais 2010
GANDOLFI E ANDRADE M G G Eventos toxicoloacutegicos relacionados a medicamentos no
estado de Satildeo Paulo Revista de Sauacutede Puacuteblica Satildeo Paulo v 40 n 6 p 1056-1064 2006
GONCcedilALVES AC CARVALHO A L BATISTA M Toxicologia Mecaniacutestica Trabalho
realizado no acircmbito da disciplina de Toxicologia Mecaniacutestica- Curso de mestrado de Ciecircncias
Farmacecircuticas- Faculdade de Farmaacutecia da universidade do Porto 2008
HUF G LOPES C S amp ROZENFELD S O uso prolongado de benzodiazepiacutenicos em
mulheres de um centro de convivecircncia para idosos Caderno de Sauacutede Puacuteblica Rio de Janeiro
v 16 n2 p 351-362 abrjun 2000
KARP J Biologia Celular e molecular conceitos e experimentos 3 ed Editora Manole 2005
KASSAB NM PAULO GNC Desenvolvimento e validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos por CLAE
para determinaccedilatildeo de Alprazolam e Diazepam em formulaccedilotildees farmacecircuticas de uso humano e
24
veterinario Revista Brasileira de Ciecircncias Farmacecircuticas Satildeo Paulo v 41 n 4 outdez
2009
KING WD PALMISANO PA Ingestion of prescription drugs by children an epidemiologic
study South Med J v 82 n 12 p 1468-1471 dez 1989
LANCcedilAS F M Validaccedilatildeo de meacutetodos cromatograacuteficos de anaacutelise Satildeo Carlos Rima p 62
2004
LACERDA R B et al Orientaccedilatildeo meacutedica sobre benzodiazepiacutenicos Revista Brasileira de
Psiquiatria v 26 n 1 p 24-31 2006
LUCHETTI G et al Fatores associados ao uso de psicofaacutermacos em idosos asilados Revista de
Psiquiatria do Rio Grande do Sul Rio Grande do Sul v 32 n 2 p 38-43 2010
MATOS V T G et al Avaliaccedilatildeo dos eventos toacutexicos com medicamentos ocorridos em crianccedilas
no estado de Mato Grosso do Sul Revista Brasileira de Toxicologia v 21 n 2 p 81-86 2008
MOJSIEWICZ-PIEŃKOWSKA K Size exclusion chromatography with evaporative light
scattering detection as a method for speciation analysis of polydimethylsiloxanes II Validation of
the method for analysis of pharmaceutical formulations Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis v 56 Jul 2011
MORAES E C F Manual de Toxicologia Analiacutetica ndash Satildeo Paulo Roca p 262 1991
MOREIRA J L MARCOS A M BARROS P Potencialidades da Espectrometria de
Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) na anaacutelise de vinhos Ciecircncia e Teacutecnica
Vitiviniacutecola v 17 n 1 p 27-33 2002
25
MOTA D M MELO J R R FREITAS D R C MACHADO M Perfil da mortalidade por
intoxicaccedilatildeo com medicamentos no Brasil 1996-2005 retrato de uma deacutecada Ciecircncia amp Sauacutede
Coletiva v 17 n 1 p 61-70 2012
OLIVEIRA J C et al Intoxicaccedilotildees por Medicamentos Registradas na Regiatildeo da Comcam-PR
em 2007 e 2008 Revista Sauacutede e Pesquisa v 3 n 3 p 303-308 setdez 2010
RIBANI M et al Validaccedilatildeo de meacutetodos cromatograacuteficos e eletroforeacuteticos Quiacutemica Nova Satildeo
Paulo v 27 n 5 p 771-780 setout 2004
ROCA M F de La et al Desenvolvimento e validaccedilatildeo de meacutetodo analiacutetico passo importante na
produccedilatildeo de medicamentos Revista Brasileira de Farmaacutecia PE v 88 n 4 p 177-180 jul
2007
RODRIGUES M A P et al Modificaccedilotildees nos padrotildees de consumo de psicofaacutermacos em
localidade do Sul do Brasil Revista de Sauacutede Puacuteblica v 40 n 1 p 107-114 2006
SILVA J A BEDOR D C G SOUSA C E M et al Desenvolvimento e validaccedilatildeo de meacutetodo
analiacutetico para quantificaccedilatildeo de diclofenaco de dietilamocircnio em pele humana por cromatografia
liacutequida de alta eficiecircncia Revista de Ciecircncias Farmacecircuticas Baacutesica e Aplicada v 31 n 1 p
6 mar 2010
SISTEMA NACIONAL DE INFORMACcedilAtildeO TOacuteXICO-FARMACOLOacuteGICA (Sinitox) Centro
de Informaccedilatildeo Cientiacutefica e Tecnoloacutegica Fundaccedilatildeo Oswaldo Cruz Disponiacutevel em lt
httpwwwfiocruzbrsinitoxgt Acesso em 18 de setembro de 2012
STOPPE A Estudo observacional de Alprazolam no tratamento da ansiedade Revista
Brasileira de Medicina v 61 n 3 p 141-145 mar 2004
TRUJILLO LM et al Erro na manipulaccedilatildeo de caacutepsulas de Alprazolam Revista do Instituto
Adolfo Lutz Satildeo Paulo v 66 n 3 p 308-310 2007
26
VALENTINI S R SOMMER W A MATIOLI G Validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos
Arquivos do Mudi v 11 n 2 p 26-31 2007
YANG H IRUDAYARAJ J Rapid determination of vitamin C by NIR MIR and FT-Raman
techniques Journal of Pharmacy and Pharmacology London v 54 n 9 p 1247-1255 2002
27
ANEXO A
28
18
Figura 01-Identificaccedilatildeo de Alprazolam em trecircs niacuteveis de fortificaccedilatildeo (n = 3) alta meacutedia e baixa
Dentre os agentes cromogecircnicos utilizados na revelaccedilatildeo apenas o Reativo de Dragendorff
se mostrou eficaz Observou-se atraveacutes do meacutetodo fiacutesico utilizando a Cacircmera de Luz UV que o
Alprazolam faacutermaco e o Alprazolam comprimido natildeo transmite fluorescecircncia no comprimento
de onda de 366nm
Para avaliaccedilatildeo da Robustez as soluccedilotildees-padratildeo (faacutermaco e medicamento) foram
dissolvidas em diversos solventes como apresentado na Tabela 03 O metanol foi o solvente em
que houve revelaccedilatildeo na placa cromatograacutefica tanto do faacutermaco como do medicamento
Tabela 03 - Anaacutelise dos diferentes solventes da soluccedilatildeo estoque padratildeo puro do faacutermaco e do medicamento de
Alprazolam a partir do Rf
NOTA Rf = Relative Front spot= cormancha
Solvente Alprazolam faacutermaco Alprazolam medicamento
Rf Rf
Metanol 05 026
Aacutegua 06 -
ClorofoacutermioAcetona
(41)
056 -
ClorofoacutermioMetanol
(41)
052 -
AMOSTRAS
PADRAtildeO
19
Os testes de robustez satildeo de fundamental importacircncia para que os analistas conheccedilam
quais fatores devem ser estritamente controlados durante a execuccedilatildeo de um meacutetodo Se as
alteraccedilotildees das condiccedilotildees de anaacutelise produzirem resultados dentro dos limites aceitaacuteveis de
seletividade exatidatildeo e precisatildeo o meacutetodo pode ser considerado robusto e tais variaccedilotildees podem
ser incorporadas ao procedimento (CASSIANO et al 2009)
Apesar do meacutetodo ter se mostrado seletivo para o Alprazolam ele natildeo eacute especifico apenas
para esse faacutermaco Sendo assim o meacutetodo foi aplicado em 7 (sete) amostras de pacientes com
histoacuterico de exposiccedilatildeo toacutexica por medicamentos atendidos pelo Centro de Informaccedilatildeo
Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) poreacutem natildeo foi possiacutevel obter a recuperaccedilatildeo dos
faacutermacos Acredita-se que a quantidade ingerida dos medicamentos pelos pacientes foi baixa ou
que pela demora da coleta da amostra os faacutermacos tenham sido metabolizado pelo organismo
Nos ensaios de confirmaccedilatildeo por FTIR observou-se que o Alprazolam padratildeo apresentou as
seguintes vibraccedilotildees moleculares A deformaccedilatildeo angular N-H de amina secundaacuteria eacute observada na
banda em 1660 cm-1
Em 1647 cm-1
aparece uma banda que pode ser atribuiacuteda ao estiramento
C=N da imina e em 1397 cm-1
aparece uma banda atribuiacuteda ao estiramento C-N das aminas A
banda caracteriacutestica do estiramento =C-H de carbono sp2 do anel aromaacutetico se encontra em 3275
cm-1
O espectro do faacutermaco extraiacutedo da matriz bioloacutegica mantecircm as mesmas caracteriacutesticas do
faacutermaco padratildeo Dessa forma podemos afirmar que a moleacutecula natildeo sofreu alteraccedilatildeo durante o
processo de extraccedilatildeo (Figura 02)
Figura 02 - Espectro da analise no FTIR do padratildeo de Alprazolam faacutermaco e de amostra extraiacuteda
20
5 CONCLUSAtildeO
O meacutetodo demonstrou atender aos requisitos de boas praacuteticas exigidos pela Resoluccedilatildeo
RDC 899 de 29 de maio de 2003 sendo exato e sensiacutevel
Dentre as amostras de pacientes intoxicados por medicamentos natildeo se obteve resultados
positivos para o Alprazolam
Os medicamentos constituem como um dos principais meios utilizado para tentativa de
suiciacutedio tendecircncia que eacute observada nos paiacuteses de terceiro mundo entre eles os psicofaacutermacos os
mais utilizados Haacute necessidade de uma melhor formaccedilatildeo e atualizaccedilatildeo dos profissionais assim
como de informaccedilatildeo aos usuaacuterios e medidas de prevenccedilatildeo que poderiam alertar sobre os riscos e
monitorar o uso desses medicamentos
O Brasil em agosto de 2006 deu o primeiro passo lanccedilando a Portaria nordm 1876 com as
diretrizes nacionais para Prevenccedilatildeo do Suiciacutedio nas trecircs esferas da gestatildeo Portanto estudar e
prevenir as tentativas de suiciacutedio eacute um desafio pois envolve recursos financeiros e sensibilidade
da parte dos profissionais envolvidos
Por outro lado aleacutem do conhecimento dos dados epidemioloacutegicos eacute necessaacuteria a
identificaccedilatildeo dos grupos terapecircuticos responsaacuteveis pelas intoxicaccedilotildees As teacutecnicas
cromatograacuteficas e espectrofotomeacutetricas possuem uma extensa aplicabilidade em pesquisas
cientiacuteficas anaacutelise quiacutemica teste de controle de qualidade de medicamentos entre outros Isso se
daacute por serem teacutecnicas altamente sensiacuteveis de alta resoluccedilatildeo e por ser um meacutetodo mais raacutepido e
preciso Ao analisar traccedilos de compostos em amostras complexas como sangue e urina as
anaacutelises toxicoloacutegicas auxiliam no prognoacutestico e diagnoacutestico de intoxicaccedilotildees uma vez que eacute
possiacutevel identificaccedilatildeo destes compostos em amostras bioloacutegicas
O meacutetodo por CCDC tem caraacuteter semindashquantitativo jaacute que a quantificaccedilatildeo dos faacutermacos eacute
baseada apenas na comparaccedilatildeo visual dos ldquoSpotsrdquo das amostras e dos padrotildees Embora o meacutetodo
seja adequado para triagem os resultados mostram que a quantificaccedilatildeo de faacutermacos por meacutetodos
baseados no uso de CCDC deve possuir uma interpretaccedilatildeo bem cautelosa especialmente devido agrave
incerteza associada a este tipo de comparaccedilatildeo
Se faz necessaacuterio a confirmaccedilatildeo da identidade do faacutermaco por outras teacutecnicas eou outros
meacutetodos de anaacutelise como a Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia (CLAE) e Cromatografia
21
Gasosa (CG) sendo assim possiacutevel correlacionar os perfis cromatograacuteficos entre as diferentes
teacutecnicas
ABSTRACT
The medicines are presented as the main toxic agent responsible for cases of human poisoning
thus constituting a major challenge for those working with Public Health However the absence
of a specialized toxicological analysis hinders a more accurate diagnosis of cases The
spectrophotometric and chromatographic techniques may assist in confirming the diagnosis A
Comparative Thin Layer Chromatography (CCDC) is a separation technique simple low cost and
good sensitivity The identification of the drug can be achieved both quantitatively and
qualitatively by infrared spectroscopy Fourier transform (FTIR) This research proposal was to
evaluate two techniques for identification of Alprazolam in urine of patients with toxic exposure
to drugs assessing the selectivity accuracy limit of detection limit of quantification and
robustness in chromatographic techniques The method was optimized validated and applied in
accordance with Resolution RDC Nordm 899 of May 29 2003 The chromatographic assay used
plates of Silica Gel G-60 elution with chloroform-methanol 91 (v v) and as a chromogenic
agent the Reactive Dragendorff The presence of the drug was confirmed by the FTIR analysis
The method proved to be selective chromatographic conditions established by presenting Limit
Detection and Quantification 200μgml and 100μgml respectively Among the patient samples
drug poisoning no positive results obtained for Alprazolam The FTIR analysis showed that the
drug did not undergo degradation in the extraction process The method has proven to meet the
requirements of good practice required by RDC Nordm 899 of 29 May 2003 being sensitive and
accurate
KEYWORDS Alprazolam Spectroscopy Chromatography Intoxication
REFEREcircNCIAS
AMERICAN ASSOCIATION OF POISON CENTERS TOXIC EXPOSURE SURVEILLANCE
SYSTEM (AAPCC) Disponivel em lt httpwwwaapccorgdnndefaultaspx gt acessado em 18
de setembro de 2012
22
AMEacuteRICO M A MOSSIN S A G NISHIYAMA P Perfil de faacutermacos por
espectrofotometria no ultravioleta Revista Brasileira de Anaacutelises Cliacutenicas Paranaacute v 40 n 4
p 257-259 ago 2008
AUCHEWSKI L et al Avaliaccedilatildeo da orientaccedilatildeo meacutedica sobre os efeitos colaterais de
benzodiazepiacutenicos Revista Brasileira de Psiquiatria v 26 n 1 p 24-31 2004
BERNADES S S TURINI C A MATSUO T Perfil das tentativas de suiciacutedio por sobredose
intencional de medicamentos atendidas por um Centro de Controle de intoxicaccedilotildees do Paranaacute
Brasil Caderno de Sauacutede Puacuteblica Rio de Janeiro v 26 n 7 p 1366-1372 jul 2010
BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) Resoluccedilatildeo
- RDC Nordm 899 de 29052003 Dispotildee sobre o Guia para validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos e
bioanaliacuteticos Diaacuterio Oficial [da] Republica Repuacuteblica Federativa do Brasil Brasiacutelia DF 02 de
junho de 2003
BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Portaria nordm 1876 de 14 de agosto de 2006 Diaacuterio Oficial da
Uniatildeo Brasiacutelia DF 15 de agosto de 2006 Seccedilatildeo 1 p 65
CASSIANO N M et al Validaccedilatildeo em meacutetodos cromatograacuteficos para anaacutelises de pequenas
moleacuteculas em matrizes bioloacutegicas Quimica Nova v 32 n 4 p 1021-1030 2009
DEGANI A L G CASS Q B VIEIRA P C Cromatografia um breve ensaio Quiacutemica
Nova na Escola n 7 p 21-25 1998
DE SOUZA JS FERRAtildeO MF PARISOTTO G FURTADO JC Anaacutelise de medicamentos
antiinflamatoacuterios natildeo-esteroacuteides manipulados empregando espectroscopia no infravermelho
(DRIFTS) Revista de Ciecircncias Farmacecircuticas Araraquara v 25 n 2 p 91-98 2004
EIZENDEHER L B Comparaccedilatildeo de meacutetodos cromatograacuteficos por camada delgada E
liacutequida com kits imunoloacutegicos para detecccedilatildeo de aflatoxinas em amendoim in natura e doce
de amendoim 2005 87 f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Tecnologia de Alimentos) ndash Programa de
23
poacutes-graduaccedilatildeo em Tecnologia de Alimentos Universidade Federal do Paraacute Beleacutem PA 2005
EVORA M C et al Comparaccedilatildeo de teacutecnica FTIR de transmissatildeo reflexatildeo e fotoacuacutestica na
analise de poliamida- 6 reciclada e irradiada Polimeros Ciecircncia e tecnologia Satildeo Carlos v
12 n 1 p 60-68 2002
FALCAtildeO C C Perfil epidemioloacutegico das intoxicaccedilotildees por medicamentos em crianccedilas de
zero a 14 anos registradas no Centro de Informaccedilotildees Toxicoloacutegicas de Santa Catarina ndash
CITSC (1995-2003) Trabalho de Conclusatildeo de Curso (Formaccedilatildeo em Medicina) ndash Universidade
Federal de Santa Catarina Florianoacutepolis 2004
FORSAN M A O uso indiscriminado de benzodiazepiacutenicos uma anaacutelise criacutetica das
praacuteticas de prescriccedilatildeo dispensaccedilatildeo e uso prolongado 26 f 2010 Trabalho de Conclusatildeo de
Curso de Especializaccedilatildeo (Atenccedilatildeo Baacutesica em Sauacutede da Famiacutelia) ndash Universidade Federal de Minas
Gerais Campos Gerais 2010
GANDOLFI E ANDRADE M G G Eventos toxicoloacutegicos relacionados a medicamentos no
estado de Satildeo Paulo Revista de Sauacutede Puacuteblica Satildeo Paulo v 40 n 6 p 1056-1064 2006
GONCcedilALVES AC CARVALHO A L BATISTA M Toxicologia Mecaniacutestica Trabalho
realizado no acircmbito da disciplina de Toxicologia Mecaniacutestica- Curso de mestrado de Ciecircncias
Farmacecircuticas- Faculdade de Farmaacutecia da universidade do Porto 2008
HUF G LOPES C S amp ROZENFELD S O uso prolongado de benzodiazepiacutenicos em
mulheres de um centro de convivecircncia para idosos Caderno de Sauacutede Puacuteblica Rio de Janeiro
v 16 n2 p 351-362 abrjun 2000
KARP J Biologia Celular e molecular conceitos e experimentos 3 ed Editora Manole 2005
KASSAB NM PAULO GNC Desenvolvimento e validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos por CLAE
para determinaccedilatildeo de Alprazolam e Diazepam em formulaccedilotildees farmacecircuticas de uso humano e
24
veterinario Revista Brasileira de Ciecircncias Farmacecircuticas Satildeo Paulo v 41 n 4 outdez
2009
KING WD PALMISANO PA Ingestion of prescription drugs by children an epidemiologic
study South Med J v 82 n 12 p 1468-1471 dez 1989
LANCcedilAS F M Validaccedilatildeo de meacutetodos cromatograacuteficos de anaacutelise Satildeo Carlos Rima p 62
2004
LACERDA R B et al Orientaccedilatildeo meacutedica sobre benzodiazepiacutenicos Revista Brasileira de
Psiquiatria v 26 n 1 p 24-31 2006
LUCHETTI G et al Fatores associados ao uso de psicofaacutermacos em idosos asilados Revista de
Psiquiatria do Rio Grande do Sul Rio Grande do Sul v 32 n 2 p 38-43 2010
MATOS V T G et al Avaliaccedilatildeo dos eventos toacutexicos com medicamentos ocorridos em crianccedilas
no estado de Mato Grosso do Sul Revista Brasileira de Toxicologia v 21 n 2 p 81-86 2008
MOJSIEWICZ-PIEŃKOWSKA K Size exclusion chromatography with evaporative light
scattering detection as a method for speciation analysis of polydimethylsiloxanes II Validation of
the method for analysis of pharmaceutical formulations Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis v 56 Jul 2011
MORAES E C F Manual de Toxicologia Analiacutetica ndash Satildeo Paulo Roca p 262 1991
MOREIRA J L MARCOS A M BARROS P Potencialidades da Espectrometria de
Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) na anaacutelise de vinhos Ciecircncia e Teacutecnica
Vitiviniacutecola v 17 n 1 p 27-33 2002
25
MOTA D M MELO J R R FREITAS D R C MACHADO M Perfil da mortalidade por
intoxicaccedilatildeo com medicamentos no Brasil 1996-2005 retrato de uma deacutecada Ciecircncia amp Sauacutede
Coletiva v 17 n 1 p 61-70 2012
OLIVEIRA J C et al Intoxicaccedilotildees por Medicamentos Registradas na Regiatildeo da Comcam-PR
em 2007 e 2008 Revista Sauacutede e Pesquisa v 3 n 3 p 303-308 setdez 2010
RIBANI M et al Validaccedilatildeo de meacutetodos cromatograacuteficos e eletroforeacuteticos Quiacutemica Nova Satildeo
Paulo v 27 n 5 p 771-780 setout 2004
ROCA M F de La et al Desenvolvimento e validaccedilatildeo de meacutetodo analiacutetico passo importante na
produccedilatildeo de medicamentos Revista Brasileira de Farmaacutecia PE v 88 n 4 p 177-180 jul
2007
RODRIGUES M A P et al Modificaccedilotildees nos padrotildees de consumo de psicofaacutermacos em
localidade do Sul do Brasil Revista de Sauacutede Puacuteblica v 40 n 1 p 107-114 2006
SILVA J A BEDOR D C G SOUSA C E M et al Desenvolvimento e validaccedilatildeo de meacutetodo
analiacutetico para quantificaccedilatildeo de diclofenaco de dietilamocircnio em pele humana por cromatografia
liacutequida de alta eficiecircncia Revista de Ciecircncias Farmacecircuticas Baacutesica e Aplicada v 31 n 1 p
6 mar 2010
SISTEMA NACIONAL DE INFORMACcedilAtildeO TOacuteXICO-FARMACOLOacuteGICA (Sinitox) Centro
de Informaccedilatildeo Cientiacutefica e Tecnoloacutegica Fundaccedilatildeo Oswaldo Cruz Disponiacutevel em lt
httpwwwfiocruzbrsinitoxgt Acesso em 18 de setembro de 2012
STOPPE A Estudo observacional de Alprazolam no tratamento da ansiedade Revista
Brasileira de Medicina v 61 n 3 p 141-145 mar 2004
TRUJILLO LM et al Erro na manipulaccedilatildeo de caacutepsulas de Alprazolam Revista do Instituto
Adolfo Lutz Satildeo Paulo v 66 n 3 p 308-310 2007
26
VALENTINI S R SOMMER W A MATIOLI G Validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos
Arquivos do Mudi v 11 n 2 p 26-31 2007
YANG H IRUDAYARAJ J Rapid determination of vitamin C by NIR MIR and FT-Raman
techniques Journal of Pharmacy and Pharmacology London v 54 n 9 p 1247-1255 2002
27
ANEXO A
28
19
Os testes de robustez satildeo de fundamental importacircncia para que os analistas conheccedilam
quais fatores devem ser estritamente controlados durante a execuccedilatildeo de um meacutetodo Se as
alteraccedilotildees das condiccedilotildees de anaacutelise produzirem resultados dentro dos limites aceitaacuteveis de
seletividade exatidatildeo e precisatildeo o meacutetodo pode ser considerado robusto e tais variaccedilotildees podem
ser incorporadas ao procedimento (CASSIANO et al 2009)
Apesar do meacutetodo ter se mostrado seletivo para o Alprazolam ele natildeo eacute especifico apenas
para esse faacutermaco Sendo assim o meacutetodo foi aplicado em 7 (sete) amostras de pacientes com
histoacuterico de exposiccedilatildeo toacutexica por medicamentos atendidos pelo Centro de Informaccedilatildeo
Toxicoloacutegica de Campina Grande (Ceatox-CG) poreacutem natildeo foi possiacutevel obter a recuperaccedilatildeo dos
faacutermacos Acredita-se que a quantidade ingerida dos medicamentos pelos pacientes foi baixa ou
que pela demora da coleta da amostra os faacutermacos tenham sido metabolizado pelo organismo
Nos ensaios de confirmaccedilatildeo por FTIR observou-se que o Alprazolam padratildeo apresentou as
seguintes vibraccedilotildees moleculares A deformaccedilatildeo angular N-H de amina secundaacuteria eacute observada na
banda em 1660 cm-1
Em 1647 cm-1
aparece uma banda que pode ser atribuiacuteda ao estiramento
C=N da imina e em 1397 cm-1
aparece uma banda atribuiacuteda ao estiramento C-N das aminas A
banda caracteriacutestica do estiramento =C-H de carbono sp2 do anel aromaacutetico se encontra em 3275
cm-1
O espectro do faacutermaco extraiacutedo da matriz bioloacutegica mantecircm as mesmas caracteriacutesticas do
faacutermaco padratildeo Dessa forma podemos afirmar que a moleacutecula natildeo sofreu alteraccedilatildeo durante o
processo de extraccedilatildeo (Figura 02)
Figura 02 - Espectro da analise no FTIR do padratildeo de Alprazolam faacutermaco e de amostra extraiacuteda
20
5 CONCLUSAtildeO
O meacutetodo demonstrou atender aos requisitos de boas praacuteticas exigidos pela Resoluccedilatildeo
RDC 899 de 29 de maio de 2003 sendo exato e sensiacutevel
Dentre as amostras de pacientes intoxicados por medicamentos natildeo se obteve resultados
positivos para o Alprazolam
Os medicamentos constituem como um dos principais meios utilizado para tentativa de
suiciacutedio tendecircncia que eacute observada nos paiacuteses de terceiro mundo entre eles os psicofaacutermacos os
mais utilizados Haacute necessidade de uma melhor formaccedilatildeo e atualizaccedilatildeo dos profissionais assim
como de informaccedilatildeo aos usuaacuterios e medidas de prevenccedilatildeo que poderiam alertar sobre os riscos e
monitorar o uso desses medicamentos
O Brasil em agosto de 2006 deu o primeiro passo lanccedilando a Portaria nordm 1876 com as
diretrizes nacionais para Prevenccedilatildeo do Suiciacutedio nas trecircs esferas da gestatildeo Portanto estudar e
prevenir as tentativas de suiciacutedio eacute um desafio pois envolve recursos financeiros e sensibilidade
da parte dos profissionais envolvidos
Por outro lado aleacutem do conhecimento dos dados epidemioloacutegicos eacute necessaacuteria a
identificaccedilatildeo dos grupos terapecircuticos responsaacuteveis pelas intoxicaccedilotildees As teacutecnicas
cromatograacuteficas e espectrofotomeacutetricas possuem uma extensa aplicabilidade em pesquisas
cientiacuteficas anaacutelise quiacutemica teste de controle de qualidade de medicamentos entre outros Isso se
daacute por serem teacutecnicas altamente sensiacuteveis de alta resoluccedilatildeo e por ser um meacutetodo mais raacutepido e
preciso Ao analisar traccedilos de compostos em amostras complexas como sangue e urina as
anaacutelises toxicoloacutegicas auxiliam no prognoacutestico e diagnoacutestico de intoxicaccedilotildees uma vez que eacute
possiacutevel identificaccedilatildeo destes compostos em amostras bioloacutegicas
O meacutetodo por CCDC tem caraacuteter semindashquantitativo jaacute que a quantificaccedilatildeo dos faacutermacos eacute
baseada apenas na comparaccedilatildeo visual dos ldquoSpotsrdquo das amostras e dos padrotildees Embora o meacutetodo
seja adequado para triagem os resultados mostram que a quantificaccedilatildeo de faacutermacos por meacutetodos
baseados no uso de CCDC deve possuir uma interpretaccedilatildeo bem cautelosa especialmente devido agrave
incerteza associada a este tipo de comparaccedilatildeo
Se faz necessaacuterio a confirmaccedilatildeo da identidade do faacutermaco por outras teacutecnicas eou outros
meacutetodos de anaacutelise como a Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia (CLAE) e Cromatografia
21
Gasosa (CG) sendo assim possiacutevel correlacionar os perfis cromatograacuteficos entre as diferentes
teacutecnicas
ABSTRACT
The medicines are presented as the main toxic agent responsible for cases of human poisoning
thus constituting a major challenge for those working with Public Health However the absence
of a specialized toxicological analysis hinders a more accurate diagnosis of cases The
spectrophotometric and chromatographic techniques may assist in confirming the diagnosis A
Comparative Thin Layer Chromatography (CCDC) is a separation technique simple low cost and
good sensitivity The identification of the drug can be achieved both quantitatively and
qualitatively by infrared spectroscopy Fourier transform (FTIR) This research proposal was to
evaluate two techniques for identification of Alprazolam in urine of patients with toxic exposure
to drugs assessing the selectivity accuracy limit of detection limit of quantification and
robustness in chromatographic techniques The method was optimized validated and applied in
accordance with Resolution RDC Nordm 899 of May 29 2003 The chromatographic assay used
plates of Silica Gel G-60 elution with chloroform-methanol 91 (v v) and as a chromogenic
agent the Reactive Dragendorff The presence of the drug was confirmed by the FTIR analysis
The method proved to be selective chromatographic conditions established by presenting Limit
Detection and Quantification 200μgml and 100μgml respectively Among the patient samples
drug poisoning no positive results obtained for Alprazolam The FTIR analysis showed that the
drug did not undergo degradation in the extraction process The method has proven to meet the
requirements of good practice required by RDC Nordm 899 of 29 May 2003 being sensitive and
accurate
KEYWORDS Alprazolam Spectroscopy Chromatography Intoxication
REFEREcircNCIAS
AMERICAN ASSOCIATION OF POISON CENTERS TOXIC EXPOSURE SURVEILLANCE
SYSTEM (AAPCC) Disponivel em lt httpwwwaapccorgdnndefaultaspx gt acessado em 18
de setembro de 2012
22
AMEacuteRICO M A MOSSIN S A G NISHIYAMA P Perfil de faacutermacos por
espectrofotometria no ultravioleta Revista Brasileira de Anaacutelises Cliacutenicas Paranaacute v 40 n 4
p 257-259 ago 2008
AUCHEWSKI L et al Avaliaccedilatildeo da orientaccedilatildeo meacutedica sobre os efeitos colaterais de
benzodiazepiacutenicos Revista Brasileira de Psiquiatria v 26 n 1 p 24-31 2004
BERNADES S S TURINI C A MATSUO T Perfil das tentativas de suiciacutedio por sobredose
intencional de medicamentos atendidas por um Centro de Controle de intoxicaccedilotildees do Paranaacute
Brasil Caderno de Sauacutede Puacuteblica Rio de Janeiro v 26 n 7 p 1366-1372 jul 2010
BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) Resoluccedilatildeo
- RDC Nordm 899 de 29052003 Dispotildee sobre o Guia para validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos e
bioanaliacuteticos Diaacuterio Oficial [da] Republica Repuacuteblica Federativa do Brasil Brasiacutelia DF 02 de
junho de 2003
BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Portaria nordm 1876 de 14 de agosto de 2006 Diaacuterio Oficial da
Uniatildeo Brasiacutelia DF 15 de agosto de 2006 Seccedilatildeo 1 p 65
CASSIANO N M et al Validaccedilatildeo em meacutetodos cromatograacuteficos para anaacutelises de pequenas
moleacuteculas em matrizes bioloacutegicas Quimica Nova v 32 n 4 p 1021-1030 2009
DEGANI A L G CASS Q B VIEIRA P C Cromatografia um breve ensaio Quiacutemica
Nova na Escola n 7 p 21-25 1998
DE SOUZA JS FERRAtildeO MF PARISOTTO G FURTADO JC Anaacutelise de medicamentos
antiinflamatoacuterios natildeo-esteroacuteides manipulados empregando espectroscopia no infravermelho
(DRIFTS) Revista de Ciecircncias Farmacecircuticas Araraquara v 25 n 2 p 91-98 2004
EIZENDEHER L B Comparaccedilatildeo de meacutetodos cromatograacuteficos por camada delgada E
liacutequida com kits imunoloacutegicos para detecccedilatildeo de aflatoxinas em amendoim in natura e doce
de amendoim 2005 87 f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Tecnologia de Alimentos) ndash Programa de
23
poacutes-graduaccedilatildeo em Tecnologia de Alimentos Universidade Federal do Paraacute Beleacutem PA 2005
EVORA M C et al Comparaccedilatildeo de teacutecnica FTIR de transmissatildeo reflexatildeo e fotoacuacutestica na
analise de poliamida- 6 reciclada e irradiada Polimeros Ciecircncia e tecnologia Satildeo Carlos v
12 n 1 p 60-68 2002
FALCAtildeO C C Perfil epidemioloacutegico das intoxicaccedilotildees por medicamentos em crianccedilas de
zero a 14 anos registradas no Centro de Informaccedilotildees Toxicoloacutegicas de Santa Catarina ndash
CITSC (1995-2003) Trabalho de Conclusatildeo de Curso (Formaccedilatildeo em Medicina) ndash Universidade
Federal de Santa Catarina Florianoacutepolis 2004
FORSAN M A O uso indiscriminado de benzodiazepiacutenicos uma anaacutelise criacutetica das
praacuteticas de prescriccedilatildeo dispensaccedilatildeo e uso prolongado 26 f 2010 Trabalho de Conclusatildeo de
Curso de Especializaccedilatildeo (Atenccedilatildeo Baacutesica em Sauacutede da Famiacutelia) ndash Universidade Federal de Minas
Gerais Campos Gerais 2010
GANDOLFI E ANDRADE M G G Eventos toxicoloacutegicos relacionados a medicamentos no
estado de Satildeo Paulo Revista de Sauacutede Puacuteblica Satildeo Paulo v 40 n 6 p 1056-1064 2006
GONCcedilALVES AC CARVALHO A L BATISTA M Toxicologia Mecaniacutestica Trabalho
realizado no acircmbito da disciplina de Toxicologia Mecaniacutestica- Curso de mestrado de Ciecircncias
Farmacecircuticas- Faculdade de Farmaacutecia da universidade do Porto 2008
HUF G LOPES C S amp ROZENFELD S O uso prolongado de benzodiazepiacutenicos em
mulheres de um centro de convivecircncia para idosos Caderno de Sauacutede Puacuteblica Rio de Janeiro
v 16 n2 p 351-362 abrjun 2000
KARP J Biologia Celular e molecular conceitos e experimentos 3 ed Editora Manole 2005
KASSAB NM PAULO GNC Desenvolvimento e validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos por CLAE
para determinaccedilatildeo de Alprazolam e Diazepam em formulaccedilotildees farmacecircuticas de uso humano e
24
veterinario Revista Brasileira de Ciecircncias Farmacecircuticas Satildeo Paulo v 41 n 4 outdez
2009
KING WD PALMISANO PA Ingestion of prescription drugs by children an epidemiologic
study South Med J v 82 n 12 p 1468-1471 dez 1989
LANCcedilAS F M Validaccedilatildeo de meacutetodos cromatograacuteficos de anaacutelise Satildeo Carlos Rima p 62
2004
LACERDA R B et al Orientaccedilatildeo meacutedica sobre benzodiazepiacutenicos Revista Brasileira de
Psiquiatria v 26 n 1 p 24-31 2006
LUCHETTI G et al Fatores associados ao uso de psicofaacutermacos em idosos asilados Revista de
Psiquiatria do Rio Grande do Sul Rio Grande do Sul v 32 n 2 p 38-43 2010
MATOS V T G et al Avaliaccedilatildeo dos eventos toacutexicos com medicamentos ocorridos em crianccedilas
no estado de Mato Grosso do Sul Revista Brasileira de Toxicologia v 21 n 2 p 81-86 2008
MOJSIEWICZ-PIEŃKOWSKA K Size exclusion chromatography with evaporative light
scattering detection as a method for speciation analysis of polydimethylsiloxanes II Validation of
the method for analysis of pharmaceutical formulations Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis v 56 Jul 2011
MORAES E C F Manual de Toxicologia Analiacutetica ndash Satildeo Paulo Roca p 262 1991
MOREIRA J L MARCOS A M BARROS P Potencialidades da Espectrometria de
Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) na anaacutelise de vinhos Ciecircncia e Teacutecnica
Vitiviniacutecola v 17 n 1 p 27-33 2002
25
MOTA D M MELO J R R FREITAS D R C MACHADO M Perfil da mortalidade por
intoxicaccedilatildeo com medicamentos no Brasil 1996-2005 retrato de uma deacutecada Ciecircncia amp Sauacutede
Coletiva v 17 n 1 p 61-70 2012
OLIVEIRA J C et al Intoxicaccedilotildees por Medicamentos Registradas na Regiatildeo da Comcam-PR
em 2007 e 2008 Revista Sauacutede e Pesquisa v 3 n 3 p 303-308 setdez 2010
RIBANI M et al Validaccedilatildeo de meacutetodos cromatograacuteficos e eletroforeacuteticos Quiacutemica Nova Satildeo
Paulo v 27 n 5 p 771-780 setout 2004
ROCA M F de La et al Desenvolvimento e validaccedilatildeo de meacutetodo analiacutetico passo importante na
produccedilatildeo de medicamentos Revista Brasileira de Farmaacutecia PE v 88 n 4 p 177-180 jul
2007
RODRIGUES M A P et al Modificaccedilotildees nos padrotildees de consumo de psicofaacutermacos em
localidade do Sul do Brasil Revista de Sauacutede Puacuteblica v 40 n 1 p 107-114 2006
SILVA J A BEDOR D C G SOUSA C E M et al Desenvolvimento e validaccedilatildeo de meacutetodo
analiacutetico para quantificaccedilatildeo de diclofenaco de dietilamocircnio em pele humana por cromatografia
liacutequida de alta eficiecircncia Revista de Ciecircncias Farmacecircuticas Baacutesica e Aplicada v 31 n 1 p
6 mar 2010
SISTEMA NACIONAL DE INFORMACcedilAtildeO TOacuteXICO-FARMACOLOacuteGICA (Sinitox) Centro
de Informaccedilatildeo Cientiacutefica e Tecnoloacutegica Fundaccedilatildeo Oswaldo Cruz Disponiacutevel em lt
httpwwwfiocruzbrsinitoxgt Acesso em 18 de setembro de 2012
STOPPE A Estudo observacional de Alprazolam no tratamento da ansiedade Revista
Brasileira de Medicina v 61 n 3 p 141-145 mar 2004
TRUJILLO LM et al Erro na manipulaccedilatildeo de caacutepsulas de Alprazolam Revista do Instituto
Adolfo Lutz Satildeo Paulo v 66 n 3 p 308-310 2007
26
VALENTINI S R SOMMER W A MATIOLI G Validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos
Arquivos do Mudi v 11 n 2 p 26-31 2007
YANG H IRUDAYARAJ J Rapid determination of vitamin C by NIR MIR and FT-Raman
techniques Journal of Pharmacy and Pharmacology London v 54 n 9 p 1247-1255 2002
27
ANEXO A
28
20
5 CONCLUSAtildeO
O meacutetodo demonstrou atender aos requisitos de boas praacuteticas exigidos pela Resoluccedilatildeo
RDC 899 de 29 de maio de 2003 sendo exato e sensiacutevel
Dentre as amostras de pacientes intoxicados por medicamentos natildeo se obteve resultados
positivos para o Alprazolam
Os medicamentos constituem como um dos principais meios utilizado para tentativa de
suiciacutedio tendecircncia que eacute observada nos paiacuteses de terceiro mundo entre eles os psicofaacutermacos os
mais utilizados Haacute necessidade de uma melhor formaccedilatildeo e atualizaccedilatildeo dos profissionais assim
como de informaccedilatildeo aos usuaacuterios e medidas de prevenccedilatildeo que poderiam alertar sobre os riscos e
monitorar o uso desses medicamentos
O Brasil em agosto de 2006 deu o primeiro passo lanccedilando a Portaria nordm 1876 com as
diretrizes nacionais para Prevenccedilatildeo do Suiciacutedio nas trecircs esferas da gestatildeo Portanto estudar e
prevenir as tentativas de suiciacutedio eacute um desafio pois envolve recursos financeiros e sensibilidade
da parte dos profissionais envolvidos
Por outro lado aleacutem do conhecimento dos dados epidemioloacutegicos eacute necessaacuteria a
identificaccedilatildeo dos grupos terapecircuticos responsaacuteveis pelas intoxicaccedilotildees As teacutecnicas
cromatograacuteficas e espectrofotomeacutetricas possuem uma extensa aplicabilidade em pesquisas
cientiacuteficas anaacutelise quiacutemica teste de controle de qualidade de medicamentos entre outros Isso se
daacute por serem teacutecnicas altamente sensiacuteveis de alta resoluccedilatildeo e por ser um meacutetodo mais raacutepido e
preciso Ao analisar traccedilos de compostos em amostras complexas como sangue e urina as
anaacutelises toxicoloacutegicas auxiliam no prognoacutestico e diagnoacutestico de intoxicaccedilotildees uma vez que eacute
possiacutevel identificaccedilatildeo destes compostos em amostras bioloacutegicas
O meacutetodo por CCDC tem caraacuteter semindashquantitativo jaacute que a quantificaccedilatildeo dos faacutermacos eacute
baseada apenas na comparaccedilatildeo visual dos ldquoSpotsrdquo das amostras e dos padrotildees Embora o meacutetodo
seja adequado para triagem os resultados mostram que a quantificaccedilatildeo de faacutermacos por meacutetodos
baseados no uso de CCDC deve possuir uma interpretaccedilatildeo bem cautelosa especialmente devido agrave
incerteza associada a este tipo de comparaccedilatildeo
Se faz necessaacuterio a confirmaccedilatildeo da identidade do faacutermaco por outras teacutecnicas eou outros
meacutetodos de anaacutelise como a Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia (CLAE) e Cromatografia
21
Gasosa (CG) sendo assim possiacutevel correlacionar os perfis cromatograacuteficos entre as diferentes
teacutecnicas
ABSTRACT
The medicines are presented as the main toxic agent responsible for cases of human poisoning
thus constituting a major challenge for those working with Public Health However the absence
of a specialized toxicological analysis hinders a more accurate diagnosis of cases The
spectrophotometric and chromatographic techniques may assist in confirming the diagnosis A
Comparative Thin Layer Chromatography (CCDC) is a separation technique simple low cost and
good sensitivity The identification of the drug can be achieved both quantitatively and
qualitatively by infrared spectroscopy Fourier transform (FTIR) This research proposal was to
evaluate two techniques for identification of Alprazolam in urine of patients with toxic exposure
to drugs assessing the selectivity accuracy limit of detection limit of quantification and
robustness in chromatographic techniques The method was optimized validated and applied in
accordance with Resolution RDC Nordm 899 of May 29 2003 The chromatographic assay used
plates of Silica Gel G-60 elution with chloroform-methanol 91 (v v) and as a chromogenic
agent the Reactive Dragendorff The presence of the drug was confirmed by the FTIR analysis
The method proved to be selective chromatographic conditions established by presenting Limit
Detection and Quantification 200μgml and 100μgml respectively Among the patient samples
drug poisoning no positive results obtained for Alprazolam The FTIR analysis showed that the
drug did not undergo degradation in the extraction process The method has proven to meet the
requirements of good practice required by RDC Nordm 899 of 29 May 2003 being sensitive and
accurate
KEYWORDS Alprazolam Spectroscopy Chromatography Intoxication
REFEREcircNCIAS
AMERICAN ASSOCIATION OF POISON CENTERS TOXIC EXPOSURE SURVEILLANCE
SYSTEM (AAPCC) Disponivel em lt httpwwwaapccorgdnndefaultaspx gt acessado em 18
de setembro de 2012
22
AMEacuteRICO M A MOSSIN S A G NISHIYAMA P Perfil de faacutermacos por
espectrofotometria no ultravioleta Revista Brasileira de Anaacutelises Cliacutenicas Paranaacute v 40 n 4
p 257-259 ago 2008
AUCHEWSKI L et al Avaliaccedilatildeo da orientaccedilatildeo meacutedica sobre os efeitos colaterais de
benzodiazepiacutenicos Revista Brasileira de Psiquiatria v 26 n 1 p 24-31 2004
BERNADES S S TURINI C A MATSUO T Perfil das tentativas de suiciacutedio por sobredose
intencional de medicamentos atendidas por um Centro de Controle de intoxicaccedilotildees do Paranaacute
Brasil Caderno de Sauacutede Puacuteblica Rio de Janeiro v 26 n 7 p 1366-1372 jul 2010
BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) Resoluccedilatildeo
- RDC Nordm 899 de 29052003 Dispotildee sobre o Guia para validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos e
bioanaliacuteticos Diaacuterio Oficial [da] Republica Repuacuteblica Federativa do Brasil Brasiacutelia DF 02 de
junho de 2003
BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Portaria nordm 1876 de 14 de agosto de 2006 Diaacuterio Oficial da
Uniatildeo Brasiacutelia DF 15 de agosto de 2006 Seccedilatildeo 1 p 65
CASSIANO N M et al Validaccedilatildeo em meacutetodos cromatograacuteficos para anaacutelises de pequenas
moleacuteculas em matrizes bioloacutegicas Quimica Nova v 32 n 4 p 1021-1030 2009
DEGANI A L G CASS Q B VIEIRA P C Cromatografia um breve ensaio Quiacutemica
Nova na Escola n 7 p 21-25 1998
DE SOUZA JS FERRAtildeO MF PARISOTTO G FURTADO JC Anaacutelise de medicamentos
antiinflamatoacuterios natildeo-esteroacuteides manipulados empregando espectroscopia no infravermelho
(DRIFTS) Revista de Ciecircncias Farmacecircuticas Araraquara v 25 n 2 p 91-98 2004
EIZENDEHER L B Comparaccedilatildeo de meacutetodos cromatograacuteficos por camada delgada E
liacutequida com kits imunoloacutegicos para detecccedilatildeo de aflatoxinas em amendoim in natura e doce
de amendoim 2005 87 f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Tecnologia de Alimentos) ndash Programa de
23
poacutes-graduaccedilatildeo em Tecnologia de Alimentos Universidade Federal do Paraacute Beleacutem PA 2005
EVORA M C et al Comparaccedilatildeo de teacutecnica FTIR de transmissatildeo reflexatildeo e fotoacuacutestica na
analise de poliamida- 6 reciclada e irradiada Polimeros Ciecircncia e tecnologia Satildeo Carlos v
12 n 1 p 60-68 2002
FALCAtildeO C C Perfil epidemioloacutegico das intoxicaccedilotildees por medicamentos em crianccedilas de
zero a 14 anos registradas no Centro de Informaccedilotildees Toxicoloacutegicas de Santa Catarina ndash
CITSC (1995-2003) Trabalho de Conclusatildeo de Curso (Formaccedilatildeo em Medicina) ndash Universidade
Federal de Santa Catarina Florianoacutepolis 2004
FORSAN M A O uso indiscriminado de benzodiazepiacutenicos uma anaacutelise criacutetica das
praacuteticas de prescriccedilatildeo dispensaccedilatildeo e uso prolongado 26 f 2010 Trabalho de Conclusatildeo de
Curso de Especializaccedilatildeo (Atenccedilatildeo Baacutesica em Sauacutede da Famiacutelia) ndash Universidade Federal de Minas
Gerais Campos Gerais 2010
GANDOLFI E ANDRADE M G G Eventos toxicoloacutegicos relacionados a medicamentos no
estado de Satildeo Paulo Revista de Sauacutede Puacuteblica Satildeo Paulo v 40 n 6 p 1056-1064 2006
GONCcedilALVES AC CARVALHO A L BATISTA M Toxicologia Mecaniacutestica Trabalho
realizado no acircmbito da disciplina de Toxicologia Mecaniacutestica- Curso de mestrado de Ciecircncias
Farmacecircuticas- Faculdade de Farmaacutecia da universidade do Porto 2008
HUF G LOPES C S amp ROZENFELD S O uso prolongado de benzodiazepiacutenicos em
mulheres de um centro de convivecircncia para idosos Caderno de Sauacutede Puacuteblica Rio de Janeiro
v 16 n2 p 351-362 abrjun 2000
KARP J Biologia Celular e molecular conceitos e experimentos 3 ed Editora Manole 2005
KASSAB NM PAULO GNC Desenvolvimento e validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos por CLAE
para determinaccedilatildeo de Alprazolam e Diazepam em formulaccedilotildees farmacecircuticas de uso humano e
24
veterinario Revista Brasileira de Ciecircncias Farmacecircuticas Satildeo Paulo v 41 n 4 outdez
2009
KING WD PALMISANO PA Ingestion of prescription drugs by children an epidemiologic
study South Med J v 82 n 12 p 1468-1471 dez 1989
LANCcedilAS F M Validaccedilatildeo de meacutetodos cromatograacuteficos de anaacutelise Satildeo Carlos Rima p 62
2004
LACERDA R B et al Orientaccedilatildeo meacutedica sobre benzodiazepiacutenicos Revista Brasileira de
Psiquiatria v 26 n 1 p 24-31 2006
LUCHETTI G et al Fatores associados ao uso de psicofaacutermacos em idosos asilados Revista de
Psiquiatria do Rio Grande do Sul Rio Grande do Sul v 32 n 2 p 38-43 2010
MATOS V T G et al Avaliaccedilatildeo dos eventos toacutexicos com medicamentos ocorridos em crianccedilas
no estado de Mato Grosso do Sul Revista Brasileira de Toxicologia v 21 n 2 p 81-86 2008
MOJSIEWICZ-PIEŃKOWSKA K Size exclusion chromatography with evaporative light
scattering detection as a method for speciation analysis of polydimethylsiloxanes II Validation of
the method for analysis of pharmaceutical formulations Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis v 56 Jul 2011
MORAES E C F Manual de Toxicologia Analiacutetica ndash Satildeo Paulo Roca p 262 1991
MOREIRA J L MARCOS A M BARROS P Potencialidades da Espectrometria de
Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) na anaacutelise de vinhos Ciecircncia e Teacutecnica
Vitiviniacutecola v 17 n 1 p 27-33 2002
25
MOTA D M MELO J R R FREITAS D R C MACHADO M Perfil da mortalidade por
intoxicaccedilatildeo com medicamentos no Brasil 1996-2005 retrato de uma deacutecada Ciecircncia amp Sauacutede
Coletiva v 17 n 1 p 61-70 2012
OLIVEIRA J C et al Intoxicaccedilotildees por Medicamentos Registradas na Regiatildeo da Comcam-PR
em 2007 e 2008 Revista Sauacutede e Pesquisa v 3 n 3 p 303-308 setdez 2010
RIBANI M et al Validaccedilatildeo de meacutetodos cromatograacuteficos e eletroforeacuteticos Quiacutemica Nova Satildeo
Paulo v 27 n 5 p 771-780 setout 2004
ROCA M F de La et al Desenvolvimento e validaccedilatildeo de meacutetodo analiacutetico passo importante na
produccedilatildeo de medicamentos Revista Brasileira de Farmaacutecia PE v 88 n 4 p 177-180 jul
2007
RODRIGUES M A P et al Modificaccedilotildees nos padrotildees de consumo de psicofaacutermacos em
localidade do Sul do Brasil Revista de Sauacutede Puacuteblica v 40 n 1 p 107-114 2006
SILVA J A BEDOR D C G SOUSA C E M et al Desenvolvimento e validaccedilatildeo de meacutetodo
analiacutetico para quantificaccedilatildeo de diclofenaco de dietilamocircnio em pele humana por cromatografia
liacutequida de alta eficiecircncia Revista de Ciecircncias Farmacecircuticas Baacutesica e Aplicada v 31 n 1 p
6 mar 2010
SISTEMA NACIONAL DE INFORMACcedilAtildeO TOacuteXICO-FARMACOLOacuteGICA (Sinitox) Centro
de Informaccedilatildeo Cientiacutefica e Tecnoloacutegica Fundaccedilatildeo Oswaldo Cruz Disponiacutevel em lt
httpwwwfiocruzbrsinitoxgt Acesso em 18 de setembro de 2012
STOPPE A Estudo observacional de Alprazolam no tratamento da ansiedade Revista
Brasileira de Medicina v 61 n 3 p 141-145 mar 2004
TRUJILLO LM et al Erro na manipulaccedilatildeo de caacutepsulas de Alprazolam Revista do Instituto
Adolfo Lutz Satildeo Paulo v 66 n 3 p 308-310 2007
26
VALENTINI S R SOMMER W A MATIOLI G Validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos
Arquivos do Mudi v 11 n 2 p 26-31 2007
YANG H IRUDAYARAJ J Rapid determination of vitamin C by NIR MIR and FT-Raman
techniques Journal of Pharmacy and Pharmacology London v 54 n 9 p 1247-1255 2002
27
ANEXO A
28
21
Gasosa (CG) sendo assim possiacutevel correlacionar os perfis cromatograacuteficos entre as diferentes
teacutecnicas
ABSTRACT
The medicines are presented as the main toxic agent responsible for cases of human poisoning
thus constituting a major challenge for those working with Public Health However the absence
of a specialized toxicological analysis hinders a more accurate diagnosis of cases The
spectrophotometric and chromatographic techniques may assist in confirming the diagnosis A
Comparative Thin Layer Chromatography (CCDC) is a separation technique simple low cost and
good sensitivity The identification of the drug can be achieved both quantitatively and
qualitatively by infrared spectroscopy Fourier transform (FTIR) This research proposal was to
evaluate two techniques for identification of Alprazolam in urine of patients with toxic exposure
to drugs assessing the selectivity accuracy limit of detection limit of quantification and
robustness in chromatographic techniques The method was optimized validated and applied in
accordance with Resolution RDC Nordm 899 of May 29 2003 The chromatographic assay used
plates of Silica Gel G-60 elution with chloroform-methanol 91 (v v) and as a chromogenic
agent the Reactive Dragendorff The presence of the drug was confirmed by the FTIR analysis
The method proved to be selective chromatographic conditions established by presenting Limit
Detection and Quantification 200μgml and 100μgml respectively Among the patient samples
drug poisoning no positive results obtained for Alprazolam The FTIR analysis showed that the
drug did not undergo degradation in the extraction process The method has proven to meet the
requirements of good practice required by RDC Nordm 899 of 29 May 2003 being sensitive and
accurate
KEYWORDS Alprazolam Spectroscopy Chromatography Intoxication
REFEREcircNCIAS
AMERICAN ASSOCIATION OF POISON CENTERS TOXIC EXPOSURE SURVEILLANCE
SYSTEM (AAPCC) Disponivel em lt httpwwwaapccorgdnndefaultaspx gt acessado em 18
de setembro de 2012
22
AMEacuteRICO M A MOSSIN S A G NISHIYAMA P Perfil de faacutermacos por
espectrofotometria no ultravioleta Revista Brasileira de Anaacutelises Cliacutenicas Paranaacute v 40 n 4
p 257-259 ago 2008
AUCHEWSKI L et al Avaliaccedilatildeo da orientaccedilatildeo meacutedica sobre os efeitos colaterais de
benzodiazepiacutenicos Revista Brasileira de Psiquiatria v 26 n 1 p 24-31 2004
BERNADES S S TURINI C A MATSUO T Perfil das tentativas de suiciacutedio por sobredose
intencional de medicamentos atendidas por um Centro de Controle de intoxicaccedilotildees do Paranaacute
Brasil Caderno de Sauacutede Puacuteblica Rio de Janeiro v 26 n 7 p 1366-1372 jul 2010
BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) Resoluccedilatildeo
- RDC Nordm 899 de 29052003 Dispotildee sobre o Guia para validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos e
bioanaliacuteticos Diaacuterio Oficial [da] Republica Repuacuteblica Federativa do Brasil Brasiacutelia DF 02 de
junho de 2003
BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Portaria nordm 1876 de 14 de agosto de 2006 Diaacuterio Oficial da
Uniatildeo Brasiacutelia DF 15 de agosto de 2006 Seccedilatildeo 1 p 65
CASSIANO N M et al Validaccedilatildeo em meacutetodos cromatograacuteficos para anaacutelises de pequenas
moleacuteculas em matrizes bioloacutegicas Quimica Nova v 32 n 4 p 1021-1030 2009
DEGANI A L G CASS Q B VIEIRA P C Cromatografia um breve ensaio Quiacutemica
Nova na Escola n 7 p 21-25 1998
DE SOUZA JS FERRAtildeO MF PARISOTTO G FURTADO JC Anaacutelise de medicamentos
antiinflamatoacuterios natildeo-esteroacuteides manipulados empregando espectroscopia no infravermelho
(DRIFTS) Revista de Ciecircncias Farmacecircuticas Araraquara v 25 n 2 p 91-98 2004
EIZENDEHER L B Comparaccedilatildeo de meacutetodos cromatograacuteficos por camada delgada E
liacutequida com kits imunoloacutegicos para detecccedilatildeo de aflatoxinas em amendoim in natura e doce
de amendoim 2005 87 f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Tecnologia de Alimentos) ndash Programa de
23
poacutes-graduaccedilatildeo em Tecnologia de Alimentos Universidade Federal do Paraacute Beleacutem PA 2005
EVORA M C et al Comparaccedilatildeo de teacutecnica FTIR de transmissatildeo reflexatildeo e fotoacuacutestica na
analise de poliamida- 6 reciclada e irradiada Polimeros Ciecircncia e tecnologia Satildeo Carlos v
12 n 1 p 60-68 2002
FALCAtildeO C C Perfil epidemioloacutegico das intoxicaccedilotildees por medicamentos em crianccedilas de
zero a 14 anos registradas no Centro de Informaccedilotildees Toxicoloacutegicas de Santa Catarina ndash
CITSC (1995-2003) Trabalho de Conclusatildeo de Curso (Formaccedilatildeo em Medicina) ndash Universidade
Federal de Santa Catarina Florianoacutepolis 2004
FORSAN M A O uso indiscriminado de benzodiazepiacutenicos uma anaacutelise criacutetica das
praacuteticas de prescriccedilatildeo dispensaccedilatildeo e uso prolongado 26 f 2010 Trabalho de Conclusatildeo de
Curso de Especializaccedilatildeo (Atenccedilatildeo Baacutesica em Sauacutede da Famiacutelia) ndash Universidade Federal de Minas
Gerais Campos Gerais 2010
GANDOLFI E ANDRADE M G G Eventos toxicoloacutegicos relacionados a medicamentos no
estado de Satildeo Paulo Revista de Sauacutede Puacuteblica Satildeo Paulo v 40 n 6 p 1056-1064 2006
GONCcedilALVES AC CARVALHO A L BATISTA M Toxicologia Mecaniacutestica Trabalho
realizado no acircmbito da disciplina de Toxicologia Mecaniacutestica- Curso de mestrado de Ciecircncias
Farmacecircuticas- Faculdade de Farmaacutecia da universidade do Porto 2008
HUF G LOPES C S amp ROZENFELD S O uso prolongado de benzodiazepiacutenicos em
mulheres de um centro de convivecircncia para idosos Caderno de Sauacutede Puacuteblica Rio de Janeiro
v 16 n2 p 351-362 abrjun 2000
KARP J Biologia Celular e molecular conceitos e experimentos 3 ed Editora Manole 2005
KASSAB NM PAULO GNC Desenvolvimento e validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos por CLAE
para determinaccedilatildeo de Alprazolam e Diazepam em formulaccedilotildees farmacecircuticas de uso humano e
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veterinario Revista Brasileira de Ciecircncias Farmacecircuticas Satildeo Paulo v 41 n 4 outdez
2009
KING WD PALMISANO PA Ingestion of prescription drugs by children an epidemiologic
study South Med J v 82 n 12 p 1468-1471 dez 1989
LANCcedilAS F M Validaccedilatildeo de meacutetodos cromatograacuteficos de anaacutelise Satildeo Carlos Rima p 62
2004
LACERDA R B et al Orientaccedilatildeo meacutedica sobre benzodiazepiacutenicos Revista Brasileira de
Psiquiatria v 26 n 1 p 24-31 2006
LUCHETTI G et al Fatores associados ao uso de psicofaacutermacos em idosos asilados Revista de
Psiquiatria do Rio Grande do Sul Rio Grande do Sul v 32 n 2 p 38-43 2010
MATOS V T G et al Avaliaccedilatildeo dos eventos toacutexicos com medicamentos ocorridos em crianccedilas
no estado de Mato Grosso do Sul Revista Brasileira de Toxicologia v 21 n 2 p 81-86 2008
MOJSIEWICZ-PIEŃKOWSKA K Size exclusion chromatography with evaporative light
scattering detection as a method for speciation analysis of polydimethylsiloxanes II Validation of
the method for analysis of pharmaceutical formulations Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis v 56 Jul 2011
MORAES E C F Manual de Toxicologia Analiacutetica ndash Satildeo Paulo Roca p 262 1991
MOREIRA J L MARCOS A M BARROS P Potencialidades da Espectrometria de
Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) na anaacutelise de vinhos Ciecircncia e Teacutecnica
Vitiviniacutecola v 17 n 1 p 27-33 2002
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MOTA D M MELO J R R FREITAS D R C MACHADO M Perfil da mortalidade por
intoxicaccedilatildeo com medicamentos no Brasil 1996-2005 retrato de uma deacutecada Ciecircncia amp Sauacutede
Coletiva v 17 n 1 p 61-70 2012
OLIVEIRA J C et al Intoxicaccedilotildees por Medicamentos Registradas na Regiatildeo da Comcam-PR
em 2007 e 2008 Revista Sauacutede e Pesquisa v 3 n 3 p 303-308 setdez 2010
RIBANI M et al Validaccedilatildeo de meacutetodos cromatograacuteficos e eletroforeacuteticos Quiacutemica Nova Satildeo
Paulo v 27 n 5 p 771-780 setout 2004
ROCA M F de La et al Desenvolvimento e validaccedilatildeo de meacutetodo analiacutetico passo importante na
produccedilatildeo de medicamentos Revista Brasileira de Farmaacutecia PE v 88 n 4 p 177-180 jul
2007
RODRIGUES M A P et al Modificaccedilotildees nos padrotildees de consumo de psicofaacutermacos em
localidade do Sul do Brasil Revista de Sauacutede Puacuteblica v 40 n 1 p 107-114 2006
SILVA J A BEDOR D C G SOUSA C E M et al Desenvolvimento e validaccedilatildeo de meacutetodo
analiacutetico para quantificaccedilatildeo de diclofenaco de dietilamocircnio em pele humana por cromatografia
liacutequida de alta eficiecircncia Revista de Ciecircncias Farmacecircuticas Baacutesica e Aplicada v 31 n 1 p
6 mar 2010
SISTEMA NACIONAL DE INFORMACcedilAtildeO TOacuteXICO-FARMACOLOacuteGICA (Sinitox) Centro
de Informaccedilatildeo Cientiacutefica e Tecnoloacutegica Fundaccedilatildeo Oswaldo Cruz Disponiacutevel em lt
httpwwwfiocruzbrsinitoxgt Acesso em 18 de setembro de 2012
STOPPE A Estudo observacional de Alprazolam no tratamento da ansiedade Revista
Brasileira de Medicina v 61 n 3 p 141-145 mar 2004
TRUJILLO LM et al Erro na manipulaccedilatildeo de caacutepsulas de Alprazolam Revista do Instituto
Adolfo Lutz Satildeo Paulo v 66 n 3 p 308-310 2007
26
VALENTINI S R SOMMER W A MATIOLI G Validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos
Arquivos do Mudi v 11 n 2 p 26-31 2007
YANG H IRUDAYARAJ J Rapid determination of vitamin C by NIR MIR and FT-Raman
techniques Journal of Pharmacy and Pharmacology London v 54 n 9 p 1247-1255 2002
27
ANEXO A
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AMEacuteRICO M A MOSSIN S A G NISHIYAMA P Perfil de faacutermacos por
espectrofotometria no ultravioleta Revista Brasileira de Anaacutelises Cliacutenicas Paranaacute v 40 n 4
p 257-259 ago 2008
AUCHEWSKI L et al Avaliaccedilatildeo da orientaccedilatildeo meacutedica sobre os efeitos colaterais de
benzodiazepiacutenicos Revista Brasileira de Psiquiatria v 26 n 1 p 24-31 2004
BERNADES S S TURINI C A MATSUO T Perfil das tentativas de suiciacutedio por sobredose
intencional de medicamentos atendidas por um Centro de Controle de intoxicaccedilotildees do Paranaacute
Brasil Caderno de Sauacutede Puacuteblica Rio de Janeiro v 26 n 7 p 1366-1372 jul 2010
BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) Resoluccedilatildeo
- RDC Nordm 899 de 29052003 Dispotildee sobre o Guia para validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos e
bioanaliacuteticos Diaacuterio Oficial [da] Republica Repuacuteblica Federativa do Brasil Brasiacutelia DF 02 de
junho de 2003
BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Portaria nordm 1876 de 14 de agosto de 2006 Diaacuterio Oficial da
Uniatildeo Brasiacutelia DF 15 de agosto de 2006 Seccedilatildeo 1 p 65
CASSIANO N M et al Validaccedilatildeo em meacutetodos cromatograacuteficos para anaacutelises de pequenas
moleacuteculas em matrizes bioloacutegicas Quimica Nova v 32 n 4 p 1021-1030 2009
DEGANI A L G CASS Q B VIEIRA P C Cromatografia um breve ensaio Quiacutemica
Nova na Escola n 7 p 21-25 1998
DE SOUZA JS FERRAtildeO MF PARISOTTO G FURTADO JC Anaacutelise de medicamentos
antiinflamatoacuterios natildeo-esteroacuteides manipulados empregando espectroscopia no infravermelho
(DRIFTS) Revista de Ciecircncias Farmacecircuticas Araraquara v 25 n 2 p 91-98 2004
EIZENDEHER L B Comparaccedilatildeo de meacutetodos cromatograacuteficos por camada delgada E
liacutequida com kits imunoloacutegicos para detecccedilatildeo de aflatoxinas em amendoim in natura e doce
de amendoim 2005 87 f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Tecnologia de Alimentos) ndash Programa de
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poacutes-graduaccedilatildeo em Tecnologia de Alimentos Universidade Federal do Paraacute Beleacutem PA 2005
EVORA M C et al Comparaccedilatildeo de teacutecnica FTIR de transmissatildeo reflexatildeo e fotoacuacutestica na
analise de poliamida- 6 reciclada e irradiada Polimeros Ciecircncia e tecnologia Satildeo Carlos v
12 n 1 p 60-68 2002
FALCAtildeO C C Perfil epidemioloacutegico das intoxicaccedilotildees por medicamentos em crianccedilas de
zero a 14 anos registradas no Centro de Informaccedilotildees Toxicoloacutegicas de Santa Catarina ndash
CITSC (1995-2003) Trabalho de Conclusatildeo de Curso (Formaccedilatildeo em Medicina) ndash Universidade
Federal de Santa Catarina Florianoacutepolis 2004
FORSAN M A O uso indiscriminado de benzodiazepiacutenicos uma anaacutelise criacutetica das
praacuteticas de prescriccedilatildeo dispensaccedilatildeo e uso prolongado 26 f 2010 Trabalho de Conclusatildeo de
Curso de Especializaccedilatildeo (Atenccedilatildeo Baacutesica em Sauacutede da Famiacutelia) ndash Universidade Federal de Minas
Gerais Campos Gerais 2010
GANDOLFI E ANDRADE M G G Eventos toxicoloacutegicos relacionados a medicamentos no
estado de Satildeo Paulo Revista de Sauacutede Puacuteblica Satildeo Paulo v 40 n 6 p 1056-1064 2006
GONCcedilALVES AC CARVALHO A L BATISTA M Toxicologia Mecaniacutestica Trabalho
realizado no acircmbito da disciplina de Toxicologia Mecaniacutestica- Curso de mestrado de Ciecircncias
Farmacecircuticas- Faculdade de Farmaacutecia da universidade do Porto 2008
HUF G LOPES C S amp ROZENFELD S O uso prolongado de benzodiazepiacutenicos em
mulheres de um centro de convivecircncia para idosos Caderno de Sauacutede Puacuteblica Rio de Janeiro
v 16 n2 p 351-362 abrjun 2000
KARP J Biologia Celular e molecular conceitos e experimentos 3 ed Editora Manole 2005
KASSAB NM PAULO GNC Desenvolvimento e validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos por CLAE
para determinaccedilatildeo de Alprazolam e Diazepam em formulaccedilotildees farmacecircuticas de uso humano e
24
veterinario Revista Brasileira de Ciecircncias Farmacecircuticas Satildeo Paulo v 41 n 4 outdez
2009
KING WD PALMISANO PA Ingestion of prescription drugs by children an epidemiologic
study South Med J v 82 n 12 p 1468-1471 dez 1989
LANCcedilAS F M Validaccedilatildeo de meacutetodos cromatograacuteficos de anaacutelise Satildeo Carlos Rima p 62
2004
LACERDA R B et al Orientaccedilatildeo meacutedica sobre benzodiazepiacutenicos Revista Brasileira de
Psiquiatria v 26 n 1 p 24-31 2006
LUCHETTI G et al Fatores associados ao uso de psicofaacutermacos em idosos asilados Revista de
Psiquiatria do Rio Grande do Sul Rio Grande do Sul v 32 n 2 p 38-43 2010
MATOS V T G et al Avaliaccedilatildeo dos eventos toacutexicos com medicamentos ocorridos em crianccedilas
no estado de Mato Grosso do Sul Revista Brasileira de Toxicologia v 21 n 2 p 81-86 2008
MOJSIEWICZ-PIEŃKOWSKA K Size exclusion chromatography with evaporative light
scattering detection as a method for speciation analysis of polydimethylsiloxanes II Validation of
the method for analysis of pharmaceutical formulations Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis v 56 Jul 2011
MORAES E C F Manual de Toxicologia Analiacutetica ndash Satildeo Paulo Roca p 262 1991
MOREIRA J L MARCOS A M BARROS P Potencialidades da Espectrometria de
Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) na anaacutelise de vinhos Ciecircncia e Teacutecnica
Vitiviniacutecola v 17 n 1 p 27-33 2002
25
MOTA D M MELO J R R FREITAS D R C MACHADO M Perfil da mortalidade por
intoxicaccedilatildeo com medicamentos no Brasil 1996-2005 retrato de uma deacutecada Ciecircncia amp Sauacutede
Coletiva v 17 n 1 p 61-70 2012
OLIVEIRA J C et al Intoxicaccedilotildees por Medicamentos Registradas na Regiatildeo da Comcam-PR
em 2007 e 2008 Revista Sauacutede e Pesquisa v 3 n 3 p 303-308 setdez 2010
RIBANI M et al Validaccedilatildeo de meacutetodos cromatograacuteficos e eletroforeacuteticos Quiacutemica Nova Satildeo
Paulo v 27 n 5 p 771-780 setout 2004
ROCA M F de La et al Desenvolvimento e validaccedilatildeo de meacutetodo analiacutetico passo importante na
produccedilatildeo de medicamentos Revista Brasileira de Farmaacutecia PE v 88 n 4 p 177-180 jul
2007
RODRIGUES M A P et al Modificaccedilotildees nos padrotildees de consumo de psicofaacutermacos em
localidade do Sul do Brasil Revista de Sauacutede Puacuteblica v 40 n 1 p 107-114 2006
SILVA J A BEDOR D C G SOUSA C E M et al Desenvolvimento e validaccedilatildeo de meacutetodo
analiacutetico para quantificaccedilatildeo de diclofenaco de dietilamocircnio em pele humana por cromatografia
liacutequida de alta eficiecircncia Revista de Ciecircncias Farmacecircuticas Baacutesica e Aplicada v 31 n 1 p
6 mar 2010
SISTEMA NACIONAL DE INFORMACcedilAtildeO TOacuteXICO-FARMACOLOacuteGICA (Sinitox) Centro
de Informaccedilatildeo Cientiacutefica e Tecnoloacutegica Fundaccedilatildeo Oswaldo Cruz Disponiacutevel em lt
httpwwwfiocruzbrsinitoxgt Acesso em 18 de setembro de 2012
STOPPE A Estudo observacional de Alprazolam no tratamento da ansiedade Revista
Brasileira de Medicina v 61 n 3 p 141-145 mar 2004
TRUJILLO LM et al Erro na manipulaccedilatildeo de caacutepsulas de Alprazolam Revista do Instituto
Adolfo Lutz Satildeo Paulo v 66 n 3 p 308-310 2007
26
VALENTINI S R SOMMER W A MATIOLI G Validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos
Arquivos do Mudi v 11 n 2 p 26-31 2007
YANG H IRUDAYARAJ J Rapid determination of vitamin C by NIR MIR and FT-Raman
techniques Journal of Pharmacy and Pharmacology London v 54 n 9 p 1247-1255 2002
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ANEXO A
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poacutes-graduaccedilatildeo em Tecnologia de Alimentos Universidade Federal do Paraacute Beleacutem PA 2005
EVORA M C et al Comparaccedilatildeo de teacutecnica FTIR de transmissatildeo reflexatildeo e fotoacuacutestica na
analise de poliamida- 6 reciclada e irradiada Polimeros Ciecircncia e tecnologia Satildeo Carlos v
12 n 1 p 60-68 2002
FALCAtildeO C C Perfil epidemioloacutegico das intoxicaccedilotildees por medicamentos em crianccedilas de
zero a 14 anos registradas no Centro de Informaccedilotildees Toxicoloacutegicas de Santa Catarina ndash
CITSC (1995-2003) Trabalho de Conclusatildeo de Curso (Formaccedilatildeo em Medicina) ndash Universidade
Federal de Santa Catarina Florianoacutepolis 2004
FORSAN M A O uso indiscriminado de benzodiazepiacutenicos uma anaacutelise criacutetica das
praacuteticas de prescriccedilatildeo dispensaccedilatildeo e uso prolongado 26 f 2010 Trabalho de Conclusatildeo de
Curso de Especializaccedilatildeo (Atenccedilatildeo Baacutesica em Sauacutede da Famiacutelia) ndash Universidade Federal de Minas
Gerais Campos Gerais 2010
GANDOLFI E ANDRADE M G G Eventos toxicoloacutegicos relacionados a medicamentos no
estado de Satildeo Paulo Revista de Sauacutede Puacuteblica Satildeo Paulo v 40 n 6 p 1056-1064 2006
GONCcedilALVES AC CARVALHO A L BATISTA M Toxicologia Mecaniacutestica Trabalho
realizado no acircmbito da disciplina de Toxicologia Mecaniacutestica- Curso de mestrado de Ciecircncias
Farmacecircuticas- Faculdade de Farmaacutecia da universidade do Porto 2008
HUF G LOPES C S amp ROZENFELD S O uso prolongado de benzodiazepiacutenicos em
mulheres de um centro de convivecircncia para idosos Caderno de Sauacutede Puacuteblica Rio de Janeiro
v 16 n2 p 351-362 abrjun 2000
KARP J Biologia Celular e molecular conceitos e experimentos 3 ed Editora Manole 2005
KASSAB NM PAULO GNC Desenvolvimento e validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos por CLAE
para determinaccedilatildeo de Alprazolam e Diazepam em formulaccedilotildees farmacecircuticas de uso humano e
24
veterinario Revista Brasileira de Ciecircncias Farmacecircuticas Satildeo Paulo v 41 n 4 outdez
2009
KING WD PALMISANO PA Ingestion of prescription drugs by children an epidemiologic
study South Med J v 82 n 12 p 1468-1471 dez 1989
LANCcedilAS F M Validaccedilatildeo de meacutetodos cromatograacuteficos de anaacutelise Satildeo Carlos Rima p 62
2004
LACERDA R B et al Orientaccedilatildeo meacutedica sobre benzodiazepiacutenicos Revista Brasileira de
Psiquiatria v 26 n 1 p 24-31 2006
LUCHETTI G et al Fatores associados ao uso de psicofaacutermacos em idosos asilados Revista de
Psiquiatria do Rio Grande do Sul Rio Grande do Sul v 32 n 2 p 38-43 2010
MATOS V T G et al Avaliaccedilatildeo dos eventos toacutexicos com medicamentos ocorridos em crianccedilas
no estado de Mato Grosso do Sul Revista Brasileira de Toxicologia v 21 n 2 p 81-86 2008
MOJSIEWICZ-PIEŃKOWSKA K Size exclusion chromatography with evaporative light
scattering detection as a method for speciation analysis of polydimethylsiloxanes II Validation of
the method for analysis of pharmaceutical formulations Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis v 56 Jul 2011
MORAES E C F Manual de Toxicologia Analiacutetica ndash Satildeo Paulo Roca p 262 1991
MOREIRA J L MARCOS A M BARROS P Potencialidades da Espectrometria de
Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) na anaacutelise de vinhos Ciecircncia e Teacutecnica
Vitiviniacutecola v 17 n 1 p 27-33 2002
25
MOTA D M MELO J R R FREITAS D R C MACHADO M Perfil da mortalidade por
intoxicaccedilatildeo com medicamentos no Brasil 1996-2005 retrato de uma deacutecada Ciecircncia amp Sauacutede
Coletiva v 17 n 1 p 61-70 2012
OLIVEIRA J C et al Intoxicaccedilotildees por Medicamentos Registradas na Regiatildeo da Comcam-PR
em 2007 e 2008 Revista Sauacutede e Pesquisa v 3 n 3 p 303-308 setdez 2010
RIBANI M et al Validaccedilatildeo de meacutetodos cromatograacuteficos e eletroforeacuteticos Quiacutemica Nova Satildeo
Paulo v 27 n 5 p 771-780 setout 2004
ROCA M F de La et al Desenvolvimento e validaccedilatildeo de meacutetodo analiacutetico passo importante na
produccedilatildeo de medicamentos Revista Brasileira de Farmaacutecia PE v 88 n 4 p 177-180 jul
2007
RODRIGUES M A P et al Modificaccedilotildees nos padrotildees de consumo de psicofaacutermacos em
localidade do Sul do Brasil Revista de Sauacutede Puacuteblica v 40 n 1 p 107-114 2006
SILVA J A BEDOR D C G SOUSA C E M et al Desenvolvimento e validaccedilatildeo de meacutetodo
analiacutetico para quantificaccedilatildeo de diclofenaco de dietilamocircnio em pele humana por cromatografia
liacutequida de alta eficiecircncia Revista de Ciecircncias Farmacecircuticas Baacutesica e Aplicada v 31 n 1 p
6 mar 2010
SISTEMA NACIONAL DE INFORMACcedilAtildeO TOacuteXICO-FARMACOLOacuteGICA (Sinitox) Centro
de Informaccedilatildeo Cientiacutefica e Tecnoloacutegica Fundaccedilatildeo Oswaldo Cruz Disponiacutevel em lt
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STOPPE A Estudo observacional de Alprazolam no tratamento da ansiedade Revista
Brasileira de Medicina v 61 n 3 p 141-145 mar 2004
TRUJILLO LM et al Erro na manipulaccedilatildeo de caacutepsulas de Alprazolam Revista do Instituto
Adolfo Lutz Satildeo Paulo v 66 n 3 p 308-310 2007
26
VALENTINI S R SOMMER W A MATIOLI G Validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos
Arquivos do Mudi v 11 n 2 p 26-31 2007
YANG H IRUDAYARAJ J Rapid determination of vitamin C by NIR MIR and FT-Raman
techniques Journal of Pharmacy and Pharmacology London v 54 n 9 p 1247-1255 2002
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ANEXO A
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veterinario Revista Brasileira de Ciecircncias Farmacecircuticas Satildeo Paulo v 41 n 4 outdez
2009
KING WD PALMISANO PA Ingestion of prescription drugs by children an epidemiologic
study South Med J v 82 n 12 p 1468-1471 dez 1989
LANCcedilAS F M Validaccedilatildeo de meacutetodos cromatograacuteficos de anaacutelise Satildeo Carlos Rima p 62
2004
LACERDA R B et al Orientaccedilatildeo meacutedica sobre benzodiazepiacutenicos Revista Brasileira de
Psiquiatria v 26 n 1 p 24-31 2006
LUCHETTI G et al Fatores associados ao uso de psicofaacutermacos em idosos asilados Revista de
Psiquiatria do Rio Grande do Sul Rio Grande do Sul v 32 n 2 p 38-43 2010
MATOS V T G et al Avaliaccedilatildeo dos eventos toacutexicos com medicamentos ocorridos em crianccedilas
no estado de Mato Grosso do Sul Revista Brasileira de Toxicologia v 21 n 2 p 81-86 2008
MOJSIEWICZ-PIEŃKOWSKA K Size exclusion chromatography with evaporative light
scattering detection as a method for speciation analysis of polydimethylsiloxanes II Validation of
the method for analysis of pharmaceutical formulations Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis v 56 Jul 2011
MORAES E C F Manual de Toxicologia Analiacutetica ndash Satildeo Paulo Roca p 262 1991
MOREIRA J L MARCOS A M BARROS P Potencialidades da Espectrometria de
Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) na anaacutelise de vinhos Ciecircncia e Teacutecnica
Vitiviniacutecola v 17 n 1 p 27-33 2002
25
MOTA D M MELO J R R FREITAS D R C MACHADO M Perfil da mortalidade por
intoxicaccedilatildeo com medicamentos no Brasil 1996-2005 retrato de uma deacutecada Ciecircncia amp Sauacutede
Coletiva v 17 n 1 p 61-70 2012
OLIVEIRA J C et al Intoxicaccedilotildees por Medicamentos Registradas na Regiatildeo da Comcam-PR
em 2007 e 2008 Revista Sauacutede e Pesquisa v 3 n 3 p 303-308 setdez 2010
RIBANI M et al Validaccedilatildeo de meacutetodos cromatograacuteficos e eletroforeacuteticos Quiacutemica Nova Satildeo
Paulo v 27 n 5 p 771-780 setout 2004
ROCA M F de La et al Desenvolvimento e validaccedilatildeo de meacutetodo analiacutetico passo importante na
produccedilatildeo de medicamentos Revista Brasileira de Farmaacutecia PE v 88 n 4 p 177-180 jul
2007
RODRIGUES M A P et al Modificaccedilotildees nos padrotildees de consumo de psicofaacutermacos em
localidade do Sul do Brasil Revista de Sauacutede Puacuteblica v 40 n 1 p 107-114 2006
SILVA J A BEDOR D C G SOUSA C E M et al Desenvolvimento e validaccedilatildeo de meacutetodo
analiacutetico para quantificaccedilatildeo de diclofenaco de dietilamocircnio em pele humana por cromatografia
liacutequida de alta eficiecircncia Revista de Ciecircncias Farmacecircuticas Baacutesica e Aplicada v 31 n 1 p
6 mar 2010
SISTEMA NACIONAL DE INFORMACcedilAtildeO TOacuteXICO-FARMACOLOacuteGICA (Sinitox) Centro
de Informaccedilatildeo Cientiacutefica e Tecnoloacutegica Fundaccedilatildeo Oswaldo Cruz Disponiacutevel em lt
httpwwwfiocruzbrsinitoxgt Acesso em 18 de setembro de 2012
STOPPE A Estudo observacional de Alprazolam no tratamento da ansiedade Revista
Brasileira de Medicina v 61 n 3 p 141-145 mar 2004
TRUJILLO LM et al Erro na manipulaccedilatildeo de caacutepsulas de Alprazolam Revista do Instituto
Adolfo Lutz Satildeo Paulo v 66 n 3 p 308-310 2007
26
VALENTINI S R SOMMER W A MATIOLI G Validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos
Arquivos do Mudi v 11 n 2 p 26-31 2007
YANG H IRUDAYARAJ J Rapid determination of vitamin C by NIR MIR and FT-Raman
techniques Journal of Pharmacy and Pharmacology London v 54 n 9 p 1247-1255 2002
27
ANEXO A
28
25
MOTA D M MELO J R R FREITAS D R C MACHADO M Perfil da mortalidade por
intoxicaccedilatildeo com medicamentos no Brasil 1996-2005 retrato de uma deacutecada Ciecircncia amp Sauacutede
Coletiva v 17 n 1 p 61-70 2012
OLIVEIRA J C et al Intoxicaccedilotildees por Medicamentos Registradas na Regiatildeo da Comcam-PR
em 2007 e 2008 Revista Sauacutede e Pesquisa v 3 n 3 p 303-308 setdez 2010
RIBANI M et al Validaccedilatildeo de meacutetodos cromatograacuteficos e eletroforeacuteticos Quiacutemica Nova Satildeo
Paulo v 27 n 5 p 771-780 setout 2004
ROCA M F de La et al Desenvolvimento e validaccedilatildeo de meacutetodo analiacutetico passo importante na
produccedilatildeo de medicamentos Revista Brasileira de Farmaacutecia PE v 88 n 4 p 177-180 jul
2007
RODRIGUES M A P et al Modificaccedilotildees nos padrotildees de consumo de psicofaacutermacos em
localidade do Sul do Brasil Revista de Sauacutede Puacuteblica v 40 n 1 p 107-114 2006
SILVA J A BEDOR D C G SOUSA C E M et al Desenvolvimento e validaccedilatildeo de meacutetodo
analiacutetico para quantificaccedilatildeo de diclofenaco de dietilamocircnio em pele humana por cromatografia
liacutequida de alta eficiecircncia Revista de Ciecircncias Farmacecircuticas Baacutesica e Aplicada v 31 n 1 p
6 mar 2010
SISTEMA NACIONAL DE INFORMACcedilAtildeO TOacuteXICO-FARMACOLOacuteGICA (Sinitox) Centro
de Informaccedilatildeo Cientiacutefica e Tecnoloacutegica Fundaccedilatildeo Oswaldo Cruz Disponiacutevel em lt
httpwwwfiocruzbrsinitoxgt Acesso em 18 de setembro de 2012
STOPPE A Estudo observacional de Alprazolam no tratamento da ansiedade Revista
Brasileira de Medicina v 61 n 3 p 141-145 mar 2004
TRUJILLO LM et al Erro na manipulaccedilatildeo de caacutepsulas de Alprazolam Revista do Instituto
Adolfo Lutz Satildeo Paulo v 66 n 3 p 308-310 2007
26
VALENTINI S R SOMMER W A MATIOLI G Validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos
Arquivos do Mudi v 11 n 2 p 26-31 2007
YANG H IRUDAYARAJ J Rapid determination of vitamin C by NIR MIR and FT-Raman
techniques Journal of Pharmacy and Pharmacology London v 54 n 9 p 1247-1255 2002
27
ANEXO A
28
26
VALENTINI S R SOMMER W A MATIOLI G Validaccedilatildeo de meacutetodos analiacuteticos
Arquivos do Mudi v 11 n 2 p 26-31 2007
YANG H IRUDAYARAJ J Rapid determination of vitamin C by NIR MIR and FT-Raman
techniques Journal of Pharmacy and Pharmacology London v 54 n 9 p 1247-1255 2002
27
ANEXO A
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ANEXO A
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