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Camila Cristina Rodrigues

ANÁLISE DO COMPORTAMENTO PROLIFERATIVO DE UMA LINHAGEM DE

Saccharomyces cerevisiae POR CITOMETRIA DE FLUXO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Farmacêuticas da

Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e

Mucuri, como requisito para obtenção do título de

Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Orientador: Prof. Dr. Gustavo Eustáquio Brito

Alvim de Melo

Coorientador: Prof. Dr. Rinaldo Duarte

Diamantina

2017

Dedico este trabalho ao meu filho Davi,

fonte de minha inspiração e luta constante!

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, por essa benção, por me ajudar nessa caminhada,

pois, sem Ele nada é possível, ele me fez acreditar, persistir, renovando sempre minha

esperança e fé.

Aos meus pais Teresa e Rodrigues, que abriram a porta do meu futuro com o estudo

sendo sempre amigos, protetores, companheiros e conselheiros. Nas horas mais difíceis, eu

sabia com quem contar, sendo sempre meu porto seguro, não medindo esforços em me ajudar

e em ajudar ao meu filho. Amo vocês!

A minha irmã Ana, sempre sendo minha amiga e companheira para todos os

momentos, e pode ter certeza que sempre estaremos juntas uma apoiando a outra. Amo você

DINDA do nosso Davi. Agradeço também minha prima-irmã Maria Eduarda pela amizade e

por nunca deixar eu desistir!

A Deyverson, meu marido, por seu amor e cumplicidade. Por compreender minha

ausência e por me incentivar a seguir em frente, me inspirando e estando sempre ao meu lado.

Eu te amo!

Ao meu filho Davi, que com ele aprendi o precioso dom da vida. Por ter aprendido a

superar minha ausência, sendo sempre carinhoso e preocupado comigo. Você será sempre

meu bebê, minha vida!!!

Agradeço todos os meus familiares, tios, tias, avós, primos e afilhada pelo incentivo e

suporte que me proporcionaram e pelas alegrias nos momentos de lazer.

A família do meu marido, Deliane, Débora, Desiane, Zelita e Geraldo pela amizade e

apoio. Obrigada por amar meu filho!

Aos companheiros do CIPq, Bruna, professora Etel, Vinícius, Rosa, Karine, Mariana

Adriana, Ulisses, professor Danilo, Gabriel, Irma, Carol Ansani, que durante esta caminhada

transformamos cúmplices um dos outros.

Aos amigos do Labimuno Gustavo, Wagner, Lucas, Mica, Valéria, Bethânia, Agnes,

Marcelo, Angélica, Willian, Gilda e Josué, pela descoberta, desafio, conquistas, entusiasmo,

forças e alegrias. Pela amizade ou pelo simples convívio, me apontaram o caminho. Obrigada

a todos por tornar inesquecíveis meus momentos no laboratório!

A Carol Ferreira e Tiago, pela simplicidade, companheirismo, e por estar sempre

dispostos a me ajudar.

Agradeço a todos os meus colegas de pós-graduação, em especial aos meus amigos de

turma de Mestrado, Valério, Jorge, Thaisa, Dayana, Laura, Eliziana e Carolle por toda a força

nesta luta que travamos juntos!

Agradeço a todos os professores que me ajudaram a percorrer este caminho

transmitindo seus conhecimentos e auxiliando em minha formação.

Em especial um muito obrigado a Agnes, Valéria, Mica e Bethânia, pessoas e

profissionais excepcionais.

Ao meu co-orientador Rinaldo pelo tempo dedicado e por estar sempre disposto a me

ajudar.

Ao professor Doutor Gustavo Eustáquio Brito pela oportunidade, amizade, ensino,

paciência e dedicação, você é meu exemplo de profissional e pessoa.

Agradeço aos órgãos de fomento, cuja contribuição foi fundamental para a realização

do meu trabalho. Ao Centro Integrado de Pós-Graduação e Pesquisa em Saúde (CIPq) da

Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, em Diamantina, MG, por

fornecer equipamentos e suporte técnico para os experimentos.

Agradeço à equipe de funcionários do Campus JK e do CIPq pelo empenho e pela

disposição em ajudar.

Enfim, agradeço a todos que tornaram possível a realização desse trabalho, fico

lisonjeada de ser membro de um grupo de pesquisa excepcional que me aceitaram,

compartilharam conhecimentos e fizeram parte de grandes momentos da minha vida.

“A persistência é o menor caminho do

êxito.”

(Charles Chaplin)

RESUMO

As leveduras do gênero Saccharomyces, em especial as da espécie Saccharomyces cerevisiae,

são microrganismos eucarióticos unicelulares do Reino Fungi. Possuem um papel importante

em processos de fermentação, como na utilização para a produção de bebidas alcoólicas e

pães, sendo considerados micro-organismos seguros para alimentos. O monitoramento das

matérias-primas e da proliferação de leveduras é uma necessidade para o sucesso do processo

fermentativo. Nesse sentido, a citometria de fluxo, que é um método rápido e preciso, pode se

apresentar como ferramenta promissora no campo da fermentação e no controle de

bioprocessos. Assim, o objetivo desse trabalho foi realizar a análise do crescimento e

heterogeneidade populacional de uma linhagem comercial de Saccharomyces cerevisiae pela

técnica de citometria de fluxo. Para isso foi utilizada a marcação intracelular com o

fluorocromo éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína. A suspensão de

levedura incorporada com o fluorocromo foi transferida para tubos de ensaio contendo 10 mL

de YEPD e incubada a 25º C e foram analisadas, após diferentes tempos, por citometria de

fluxo, microscopia confocal e espectrofotometria. Os resultados demonstraram que foi

possível observar, por citometria de fluxo, alterações morfológicas da linhagem

Saccharomyces cerevisiae ao longo do tempo, bem como quantificar o decaimento da

fluorescência do corante CFSE após sucessivos processos mitóticos. Por essa técnica também

foi possível mensurar o número de células da linhagem estudada ao longo do processo de

multiplicação comparando-se às outras metodologias comumente utilizadas para este fim.

Conclui-se com esse estudo que a citometria de fluxo mostrou-se como uma ferramenta

confiável e sensível para a análise do crescimento e heterogeneidade populacional de

Saccharomyces cerevisiae.

Palavras-chave: processos fermentativos, proliferação, Saccharomyces cerevisiae, citometria

de fluxo.

1

ABSTRACT

Yeasts of the genus Saccharomyces, especially those of the species Saccharomyces

cerevisiae, are unicellular eukaryotic microorganisms of the Fungi Kingdom. They have an

important role in fermentation processes, such as in the use for the production of alcoholic

beverages and breads, being considered microorganisms safe for food. The monitoring of raw

materials and the proliferation of yeasts is a necessity for the success of the fermentation

process. In this sense, flow cytometry, which is a fast and precise method, can be presented as

a promising tool in the field of fermentation and in the control of bioprocesses. Thus, the

objective of this work was to analyze the growth and population heterogeneity of a

commercial strain of Saccharomyces cerevisiae by the flow cytometry technique. For this,

intracellular labeling was used with the fluorochrome succinimidyl ester of

carboxyfluorescein diacetate. The yeast suspension incorporated with the fluorochrome was

transferred into test tubes containing 10 ml of YEPD and incubated at 25 ° C and analyzed

after different times by flow cytometry, confocal microscopy and spectrophotometry. The

results demonstrated that it was possible to observe, by flow cytometry, morphological

alterations of the Saccharomyces cerevisiae lineage over time, as well as to quantify the decay

of CFSE dye fluorescence after successive mitotic processes. By this technique it was also

possible to measure the number of cells of the lineage studied throughout the multiplication

process, comparing to the other methodologies commonly used for this purpose. It is

concluded with this study that flow cytometry proved to be a reliable and sensitive tool for the

analysis of the growth and population heterogeneity of Saccharomyces cerevisiae.

Key words: fermentative processes, proliferation, Saccharomyces cerevisiae, flow cytometry.

1

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Células de Saccharomyces cerevisiae em reprodução por brotamento.. .................. 24

Figura 2: Estrutura simplificada de uma levedura com broto. ................................................. 25

Figura 3: Configuração de um citômetro de fluxo ................................................................... 29

Figura 4: Esquema do espalhamento da luz técnica de citometria de fluxo ............................. 30

Figura 5: Coloração fluorescente de CFSE em esplenócitos de ratos. ..................................... 31

Figura 6: Análise do crescimento inicial do Aspergillus nidulans em resposta a fonte de

carbono por citometria de fluxo................................................................................................ 33

Figura 7: Estratégia de análise do crescimento celular por citomeria de fluxo ........................ 39

Figura 8: Estratégia de análise de proliferação celular pela diluição do CFSE. ....................... 40

Figura 9: Câmara de Neubauer ................................................................................................. 42

Figura 10: Análise da linhagem de Saccharomyces cerevisiae por microscopia confocal

(aumento de 400x). ................................................................................................................... 46

Figura 11: Análise da linhagem de Saccharomyces cerevisiae por microscopia confocal

(aumento de 400x) nos tempos de 0, 6, 12 e 18 horas de incubação ........................................ 47

Figura 12: Análise da proliferação celular da levedura Saccharomyces cerevisiae pela diluição

do CFSE por citometria de fluxo nos tempos de 0, 6, 24, e 30 horas. .................................. 49


do CFSE por citometria de fluxo nos tempos de 0, 6, 12, 18 e 24 horas. ................................ 50


do CFSE por citometria de fluxo nos tempos de 0, 3, 6, 9, 12, 15 e 18 horas. ........................ 51

Figura 15: Percentual de eventos da região M1 nas culturas de 0, 3, 6, 9, 12, 15 e 18 horas de

incubação. ................................................................................................................................. 51

Figura 16: Avaliação das alterações morfológicas das células de leveduras de Saccharomyces

cerevisiae por citometria de fluxo nos tempos de 0, 6, 24 e 30 horas. ..................................... 53


cerevisiae por citometria de fluxo nos tempos de 0, 6, 12, 18 e 24 horas ................................ 54


cerevisiae por citometria de fluxo nos tempos de 0, 3, 6, 9, 12, 15 e 18 horas.. ...................... 55

Figura 19: Percentual de eventos da região SC nas culturas de 0, 3, 6, 9, 12, 15 e 18 horas de

incubação. ................................................................................................................................ 56

Figura 20: Avaliação no número de células por citometria de fluxo. ...................................... 58

Figura 21: Avaliação no número de células por espectrofometria. .......................................... 59

Figura 22: Avaliação no número de células por Câmera de Neubauer .................................... 60

Figura 23: Correlação do número de células. .......................................................................... 61

11

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Composição do meio utilizado nos ensaios de crescimento. ................................... 37

13

LISTA DE QUADROS

Quadro 1: Classificação taxonômica de Saccharomyces cerevisiae. ...................................... 23

Quadro 2: Principais diferenças entre leveduras “ale” e “lager”.. .......................................... 27

15

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

%: Porcentagem

A. tubingensis: Aspergillus tubingensis

a.c.: antes de Cristo

ANOVA: Análise de Variância

BD: Becton Dickinson

BP: Bandpass

CFSE: éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (do inglês: 5-6-

carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester)

CIPq-Saúde: Centro Integrado de Pós-Graduação e Pesquisa em Saúde

FITC: Isotiocianato de fluoresceína (do inglês: fluorescein isothiocyanate)

FSC: Dispersão frontal (do inglês: forward scatter)

FSC-A: Área do pico de voltagem do parâmetro tamanho (do inglês: forward scatter)

h: hora

log: Logaritmo decimal

LP: Long pass

mL: Mililitro

mm: Milímetro

mM: Milimolar

nm: Nanômetro

N: tamanho amostral

nº: Número

16

ºC: Graus Celsius

p/v: peso por volume

PBS: tampão fosfato salina (do inglês: Posphate Buffered Saline)

R2:

coeficiente de correlação

S. cerevisiae: Saccharomyces cerevisiae

SC: população celular de levedura identificada no gate

SSC: Dispersão lateral, side scatter

SSC-H: Altura do pico de voltagem do parâmetro (do inglês: side scatter)

UFVJM: Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri

US$: Dólares

US-05: Fermento neutro para fermentaçao de cervejas Ale Americanas

USA: United States of America

xg: força da centrífuga aplicada é X vezes maior que a força gravitacional da Terra

YEPD: Yeast extract – peptone – dextrose

α: Alfa

μL: Microlitro

μm: Micrômetro

μM: Micromolar

17

SUMÁRIO

1.INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 19

2. REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................................ 21

2.1 Processos Fermentativos .................................................................................................... 21

2.2 Leveduras............................................................................................................................ 22

2.3 A levedura Saccharomyces cerevisiae ............................................................................... 23

2.4 Citometria de fluxo ............................................................................................................. 28

3. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 35

3.1 Objetivo Geral .................................................................................................................... 35

3.2 Objetivos Específicos ......................................................................................................... 35

4 METODOLOGIA .................................................................................................................. 37

4.1 Linhagem e manutenção de Saccharomyces cerevisiae ..................................................... 37

4.2 Marcação da levedura Saccharomyces cerevisiae com 5-6-carboxyfluorescein diacetate

succinimidyl ester (CFSE) ........................................................................................................ 38

4.3 Análise por citometria de fluxo .......................................................................................... 38

4.3.1 Análise fenotípica de S. cerevisiae ...................................................................... 38

4.3.2 Análise da marcação com a sonda fluorescente CFSE ........................................ 40

4.4 Análise por microscopia confocal ...................................................................................... 41

4.5 Análise da concentração das suspensões de S. cerevisiae no Espectrofotômetro e

Contagem de Células Viáveis na câmera de Neubauer............................................................41

4.6 Análises Estatísticas ........................................................................................................... 43

18

5.RESULTADOS ..................................................................................................................... 45

5.1 Verificação da marcação da levedura Saccharomyces cerevisiae com a sonda CFSE ...... 45

5.2 Avaliação do decaimento da fluorêscencia do CFSE na levedura Saccharomyces

cerevisiae por microscopia confocal ........................................................................................ 46


cerevisiae por citometria de fluxo ............................................................................................ 48

5.4 Avaliação das alterações morfológicas da levedura Saccharomyces cerevisiae por

citometria de fluxo ................................................................................................................... 52

5.5 Análise do número de células da linhagem Saccharomyces cerevisiae ao longo da

incubação ................................................................................................................................. 56

6. DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 63

7. CONCLUSÕES ................................................................................................................... 67

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 69

19

1 INTRODUÇÃO

A utilização dos processos fermentativos é uma prática que ocorre em momentos

diferentes da história da humanidade e a aquisição de conhecimentos sobre os micro-

organismos e as enzimas possibilitou, a partir da segunda metade do século XIX, o

desenvolvimento e o progresso da biotecnologia (OLIVEIRA e MANTOVANI, 2009).

Um importante campo de pesquisa na área biotecnológica é o estudo do processo

fermentativo utilizando linhagens de leveduras com características específicas para a obtenção

de produtos industriais. Dentro do universo de leveduras de interesse biotecnológico

encontram-se as leveduras do gênero Saccharomyces com aplicação em fermentações

alcoólicas e de pães.

A levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae, especialmente, possui a habilidade

de converter vários substratos em produtos de interesse biotecnológico e apresentam elevado

poder vegetativo, alta capacidade de multiplicação, fácil conservação e ação enzimática

prolongada. Essa levedura possui relevância no mercado industrial e há uma busca crescente

por condições fermentativas e/ou organismos fermentadores ainda mais eficientes (MARTINS

et al, 2013).

Neste contexto, a citometria de fluxo tem sido utilizada em processos biotecnológicos

há alguns anos. Trata-se de uma técnica bem conhecida no campo científico, principalmente

na análise de células humanas, sendo muito versátil pela rapidez, sensibilidade e capacidade

de avaliar células individualizadas com alta precisão. Além disso, a possibilidade de análise

de múltiplos parâmetros permite a avaliação simultânea de diversos parâmetros biológicos,

como o crescimento e comportamento proliferativo de leveduras importante em processos

fermentativos (ROBINSON E ROEDERER, 2015, GALBRAITH, 2012).

Diante disso, o presente estudo tem por objetivo utilizar a citometria de fluxo como

método quantitativo alternativo para analisar o crescimento e heterogeneidade populacional

da levedura Saccharomyces cerevisiae, visto que, essa técnica oferece a possibilidade de

análises de células individuais e medidas diretas multiparamétrica.

21

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Processos fermentativos

Os processos biotecnológicos são conhecidos pela humanidade desde a antiguidade.

As civilizações antigas já utilizavam à fermentação de cereais em grãos para produção de

bebidas alcoólicas e para a produção de pão, além da produção de queijos e iogurtes

(OLIVEIRA e MANTOVANI, 2009).

Os trabalhos de Pasteur e o progresso da microbiologia no século XIX permitiram a

expansão da microbiologia industrial possibilitando, mediante o desenvolvimento de

processos baseados no metabolismo microbiano, a produção de substâncias como: acetona,

butanol, etanol, ácido cítrico, antibióticos, dentre outros. Esse avanço tecnológico permitiu a

utilização de leveduras em outras áreas de aplicação, tais como no tratamento ambiental, na

produção de aditivos, de produtos químicos e de medicamentos (OLIVEIRA e

MANTOVANI, 2009).

Na indústria biotecnológica, que necessita do uso de biofermentadores, é fundamental

o controle rigoroso do crescimento do micro-organismo. Para que um bioprocesso seja viável

é necessário compreender as características morfológicas, genéticas, fisiológicas e

bioquímicas, uma vez que o modo de crescimento de um micro-organismo está relacionado

com a absorção dos substratos e a produção e secreção dos compostos desejados

(ARAKAWA, 2009; COLEN, 2006). As características de um micro-organismo utilizado em

processos fermentativos é um fator determinante para o sucesso desses processos. A linhagem

de interesse deve apresentar um bom rendimento de produção, manter constância fisiológica e

não provocar patogenia. Além disso, deve-se ter em mente que cada micro-organismo é único

no seu desenvolvimento anatômico, morfológico e fisiológico. Dessa forma, o

reconhecimento de suas características de crescimento e sua fisiologia é importante para a

obtenção bem sucedida da produção do metabólito pelo micro-organismo em questão. Por

isso, para cada fermentação, as condições devem ser estabelecidas para a produção máxima

do metabólito de interesse, visando aumentar o seu potencial de produção (COLEN, 2006).

22

As enzimas estão entre os mais importantes produtos obtidos para a necessidade

humana por meio das fontes microbianas, visto que os micro-organismos são atualmente a

primeira fonte industrial de enzimas (50% são originárias de fungos e leveduras, 35% de

bactérias e 15% de plantas e animais). A produção a partir de processos fermentativos

utilizando-se linhagens microbianas é mais aplicada quando comparada à extração vegetal ou

animal devido a diversos fatores, tais como a possibilidade de produção em larga escala,

grande variedade de atividades catalíticas, possibilidade de manipulação genética e menor

impacto econômico e ambiental (ERICKSON, NELSON, e WINTERS, 2012).

Dentre os micro-organismos utilizados para aplicações biotecnológicas destacam-se os

do Reino Fungi cuja relevância se dá pela versatilidade na produção de enzimas e metabólitos

de interesse econômico, na indústria farmacêutica e alimentícia (COLEN, 2006).

2.2 Leveduras

Os fungos abrangem um vasto grupo de organismos que compreendem mais de cinco

milhões de espécies (BLACKWELL, 2011). São organismos macro ou microscópios, estão

distribuídos em vários ambientes terrestres e utilizam diversos tipos de substratos para sua

sobrevivência. Os fungos constituem um grupo de eucariotos identificados e caracterizados

através de critérios morfológicos e fisiológicos e seus integrantes possuem ciclos de vida e

metabolismo variados devido à diversidade genética e metabólica (WADMAN et al., 2009;

LOGUERCIO-LEITE et al., 2006).

Esses micro-organismos representam os principais decompositores de ambientes

terrestres, explorando novos territórios pelo típico crescimento celular polarizado

(SILVERMAN-GAVRILA e LEW R., 2002). São bioquimicamente versáteis e podem causar

doenças em plantas, animais e humanos, principalmente em indivíduos imunocomprometidos

(MADIGAN et al., 2010).

Por outro lado, os fungos são utilizados em diversas áreas industriais, como na

produção de alimentos, de ácidos orgânicos, enzimas, vitaminas, polissacarídeos, lipídeos,

entre outros, além de ser valiosos na produção de metabólicos primários e secundários, e

extremamente úteis na realização de processos de biotransformação. Diante disso, é fácil

compreender o aumento dos estudos e a exploração racional de algumas linhagens fúngicas,

pois são micro-organismos com potencial para a obtenção de produtos biotecnológicos

23

(GUIMARÃES et al., 2006; SILVA, 2004; ADRIO e DEMAIN, 2003).

As leveduras constituem um grupo de micro-organismos unicelulares pertencentes ao

Reino Fungi que se reproduzem assexuadamente por brotamento ou por fissão binária, e que

apresentam núcleo organizado com membrana nuclear (célula eucariótica) e parede celular

rígida. São aclorofiladas, com nutrição heterotrófica através da absorção dos nutrientes

(KURTZMAN et al., 2011).

As aplicações industriais das leveduras incluem a produção de enzimas, nucleotídeos,

vitaminas, glicoproteínas, coenzimas, ácidos nucléicos, lipídeos, glicerina e riboflavina. Além

disso, as leveduras são utilizadas como modelo experimental de células eucarióticas por serem

facilmente manipuláveis, não patogênicas e fornecerem grande quantidade de células em um

tempo relativamente curto. As leveduras também podem ser utilizadas em fermentações para

a produção de pães, vinhos, cervejas e aguardentes (BORZANI, 2008, ARAUJO et al., 2009).

2.3 A levedura Saccharomyces cerevisiae

As células de Saccharomyces cerevisiae apresentam-se na forma unicelular, elíptica,

cujas dimensões são de 3 a 8 µm de comprimento por 5 μm de largura com reprodução

assexuada por brotamento ou gemulação (Figura 1) (LEGRAS et al., 2007). A classificação

taxonômica da S. cerevisiae está indicada no Quadro 1.

QUADRO 1 – Classificação taxonômica de Saccharomyces cerevisiae

Táxons

Classificação

Domínio Eukarya

Reino Fungi

Filo Ascomycota

Classe Saccharomycetes

Ordem Saccharomycetales

Família Saccharomycetaceae

Gênero Saccharomyces

Espécie Saccharomyces cerevisiae

24

Figura 1: Células de Saccharomyces cerevisiae em reprodução por brotamento

Fonte: Miranda Júnior, 2012.

No processo de brotamento, uma nova célula é formada como uma pequena

protuberância da célula antiga; o broto gradualmente aumenta de tamanho e então, separa da

célula parental, ou seja, ocorre divisão do núcleo por constrição, e parte dele, e outras

organelas, entram no broto, após essa constrição, a conexão citoplasmática é fechada pela

síntese de novo material de parede celular (Figura 2). Outras leveduras podem reproduzir-se

assexuadamente por fissão binária transversa, ou ainda sexuadamente (LEGRAS et al.,2007;

CARVALHO et al., 2006).

25

Figura 2: Estrutura simplificada de uma levedura com broto

Adaptado de Suhre, 2014.

A levedura Saccharomyces cerevisiae é utilizada para a produção de pão e da maioria

das bebidas alcoólicas. Essas leveduras são encontradas em ambientes ricos em açúcar e

podem realizar duas formas de metabolismo quimiorganotrófico: a respiração e a

fermentação. No processo de respiração, na presença de oxigênio, as leveduras crescem

eficientemente em diferentes açúcares originando varias células de leveduras e CO2. Em

condições anóxicas, as leveduras realizam o metabolismo fermentativo que é um processo

bioquímico que ocorre no citoplasma da levedura pela ação de inúmeras enzimas durante a

fase da oxidação anaeróbica, transformando o açúcar em álcool, anidrido carbônico e outros

produtos secundários. É um processo importante no qual são obtidos os álcoois industriais, a

produção de diversas bebidas alcoólica e como produto secundário, o gás carbônico

(BORZANI, 2008, ARAUJO et al., 2009, MADIGAN et al., 2010).

Como exemplo de processo de fermentação, têm-se a utilização da Saccharomyces

cerevisiae para produção de cerveja, devido à sua segurança e capacidade de produzir os

metabólitos primários etanol e dióxido de carbono, bem como outros subprodutos que

Broto

Citoplasma Parede celular

Membrana Plasmática

Vacúolo

Núcleo

Mitocôndrias

Complexo de Golgi

Retículo Endoplasmático

Centríolos

26

proporcionam características organolépticas específicas para obtenção dos diversos estilos

existentes da bebida (LEGRAS et al., 2007; CARVALHO et al., 2006).

As cepas de leveduras de S. cerevisiae podem ser classificadas de acordo com seu

processo fermentativo para a produção de cerveja em dois grupos: as leveduras de alta

fermentação (ale) e leveduras de baixa fermentação (lager). Apesar da literatura científica

progressivamente se referir às leveduras como S. cerevisiae tipo “ale” e S. cerevisiae tipo

“lager”, é necessário manter uma distinção entre elas, devido ao fato de existirem algumas

diferenças bioquímicas relevantes entre esses dois tipos de cepas de leveduras (BOKULICH e

BAMFORTH 2015; CARVALHO et al, 2006).

Leveduras “ale", elaboradas de leveduras de Saccharomyces cerevisiae, são

organismos mais complexos e diversificados (BOKULICH E BAMFORTH, 2015), não

apresentam o gene mel, que produzem a enzima extracelular α-galactosidase (melibiase), o

que as impossibilita de utilizarem a melibiose como fonte de carbono. Além disso, as cepas

“ale” podem crescer a 37°C e a maioria das fermentações de cervejas ”ale” propiciam rapidez

ao processo (3 a 5 dias) em temperaturas relativamente altas (18 a 25 ºC). Essas leveduras são

descritas como “leveduras de alta fermentação” isto é, se elevam à superfície do líquido

durante e ao final da fermentação, formando uma película flutuante e espessa de biomassa que

podem ser retiradas desta superfície (CARVALHO et al, 2006).

Já as leveduras “lager” são leveduras das cepas de Saccharomyces pastorianus

(carlsbergensis) caracterizadas por possuírem os genes mel, permitindo assim a utilização do

dissacarídeo melibiose (glicose-galactose), e não apresentam crescimento em temperaturas

superiores a 34°C. Cervejas do tipo “lager” são fermentadas à temperatura entre 7 a 15 °C e a

duração da fermentação e da maturação são de 7 a 10 dias. Os sabores e aromas das cervejas

“lager” são mais suaves e leves em comparação com as cervejas “ale”, por realizar o processo

em baixas temperaturas. Leveduras “lager” são descritas como “de baixa fermentação”

floculando na base do fermentador no final da fermentação formando uma fase sedimentada

de biomassa que pode ser retirada, ao final do processo, do fundo da base do fermentador. De

maneira simplificada está demonstrado no quadro 2 as principais diferenças entre leveduras

“ale” e “lager” (ARAÚJO; SILVA; MINIM, 2003).

27

Quadro 2: Principais diferenças entre leveduras “ale” e “lager”

Leveduras de baixa fermentação “lager” Leveduras de alta fermentação “ale"

Possuem os genes mel Não apresentam os genes mel

Não apresentam crescimento a temperaturas

superiores a 34°C

Podem crescer a 37°C

Fermentadas à temperatura entre 7 a 15 °C e

a duração da fermentação e da maturação são

de 7 a 10 dias

Rapidez ao processo (3 a 5 dias) em

temperaturas relativamente altas (18 a 22 ºC)

Durante a fermentação, o crescimento das leveduras pode ser dividido em cinco fases:

(1) lag; (2) log; (3) desaceleração; (4) estacionária e (5) declínio. Durante a fase lag não

ocorre crescimento, ou seja, é a fase em que a levedura se adapta ao meio e, apesar de não se

multiplicarem, esses micro-organismos sintetizam enzimas e constituintes celulares. Na fase

logarítmica (log), a população de leveduras cresce de maneira exponencial, sendo sintetizados

numerosos metabólitos primários. Durante a fase de desaceleração ocorre um declínio da taxa

específica máxima de crescimento, em resultado da diminuição de nutrientes essenciais ao

metabolismo celular e/ou do aumento da concentração de produtos do metabolismo tóxicos

para as células. As leveduras então atingem a fase estacionária, devido ao esgotamento dos

nutrientes e, ao acúmulo de excretas, algumas células morrem, enquanto outras continuam a

se dividir. No fim da fase log e início da fase estacionária começam a serem sintetizados os

metabólitos secundários que são importantes para os processos

de crescimento, desenvolvimento e reprodução dos organismos e para a indústria

biotecnológica. E por fim, a fase de declínio, sem a renovação dos nutrientes, as células

morrem em um tempo variável (MEGA et al., 2011; LEGRAS et al.,2007).

O conhecimento de como as populações microbianas expande é relevante para o

desenvolvimento de métodos de controle do crescimento microbiano, pois durante a divisão

celular, uma célula se transforma em duas e de acordo com um tempo necessário (tempo de

geração) o número total de células e a massa duplicam, e esses tempos de geração variam

entre os micro-organismos e depende do meio e das condições de incubação. Portanto, para

que a fermentação resulte num produto economicamente viável, o micro-organismo deve ser

capaz de se multiplicar rapidamente, produzir a substância de interesse em altos níveis e em

um período de tempo relativamente curto, ser facilmente manipulável e geneticamente

https://pt.wikipedia.org/wiki/Crescimento_celular

https://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Desenvolvimento_biol%C3%B3gico&action=edit&redlink=1

https://pt.wikipedia.org/wiki/Reprodu%C3%A7%C3%A3o

https://pt.wikipedia.org/wiki/Organismo

28

estável, sendo essencial que os fermentadores sejam monitorados durante o processo de

produção. Nesse contexto, a busca por processos fermentativos ainda mais eficientes é uma

área de pesquisa em ascensão (MADIGAN et al., 2010).

2.4 Citometria de fluxo

O crescimento de uma população pode ser mensurado pela análise de alterações no

número de células ou alterações na concentração de algum componente celular. Alguns

métodos comuns de crescimento celular são: a contagens de células com o uso de microscópio

para enumerar e observar as células presentes em uma cultura, sendo um método simples e

rápido, porém os resultados podem não ser confiáveis; contagem de células viáveis em placa

pelo método de semeadura por espalhamento ou semeadura em profundidade que fornece a

melhor estimativa do número de células viáveis em uma amostra, mas podem apresentar erros

devido à adequação do meio de cultura e das condições de incubação. Outro método útil para

estimar o crescimento celular baseia-se nas medidas da turbidez com um auxílio de um

espectrofotômetro que promove a passagem de luz através de uma suspensão celular, dessa

forma, quanto maior o número de células, mais turva a suspensão e maior a quantidade de luz

dispersa, porém devido a agregados e biofilmes que formam nas suspensões às vezes é um

método impreciso (MADIGAN et al., 2010).

A citometria de fluxo é outro método para a contagem de células em amostras líquidas

e a sua utilização em microbiologia aumentou significantemente, apresentando vantagens

como rapidez nos resultados, precisão e fácil padronização. Além disso, a citometria é uma

técnica multiparamétrica que pode ser usada para a monitorização em tempo real de processos

biológicos e industriais, permitindo a tomada de decisões para ajustar condições de operação

no decorrer do processo. A técnica baseia-se na medida do espalhamento de luz quando uma

célula ou partícula é interceptada, individualmente, por um feixe de luz. Tais medidas

possibilitam avaliar características citométricas de uma dada população celular, permitindo

sua caracterização por meio de parâmetros relacionados à sua morfologia (PEREIRA DE

SOUZA et al., 2011; KUŘEC et al., 2009).

O citômetro de fluxo é composto pelos sistemas fluido, óptico e eletrônico (Figura 3).

O sistema fluido, composto por reservatórios de salina e mangueiras, é responsável por

conduzir as células para um compartimento onde as mesmas são interceptadas

29

individualmente por um laser. O laser, juntamente com os espelhos, lentes e detectores

compreendem o sistema óptico: ao ser interceptada pelo feixe de luz, a célula promove o

espalhamento da luz incidente, cuja detecção fornece informações sobre o tamanho (dispersão

frontal da luz ou FSC) e granulosidade (dispersão lateral da luz ou SSC) celulares. A Figura 4

representa o espalhamento da luz incidente. Além disso, caso a célula esteja marcada com

sondas fluorescentes, haverá ainda excitação das mesmas, seguido de emissão de

fluorescência que será filtrada e direcionada aos detectores através de filtros e espelhos

ópticos. A luz captada pelos detectores é transformada em um pico de voltagem que é

convertido em sinal eletrônico permitindo a análise, pelo experimentador, por meio de

programas computacionais específicos (TUCHIN, 2011; BASIJI et al., 2007).

FIGURA 3: Configuração de um citômetro de fluxo

As células ou partículas em suspensão são carreadas pelo fluxo do citômetro e enfileiradas para interceptar o

laser individualmente. A dispersão frontal do laser é mensurada pelo detector forward scatter (FSC) e a

dispersão lateral é mensurada pelo detector side scatter (SSC). O laser também pode excitar fluorocromos de

marcadores fluorescentes, sendo a fluorescência detectada por detectores específicos. O conjunto de espelhos

dicroicos e filtros bandpass ou longpass são posicionados antes dos canais de detecção de fluorescência para

selecionar a faixa de comprimento de onda que poderá chegar aos canais de detecção. A luz captada pelos

detectores é transformada em um pico de voltagem que é convertido em sinal eletrônico. Fonte:

<http://www.semrock.com/flow-cytometry. aspx> Acesso em Maio de 2017.

30

FIGURA 4 – Esquema do espalhamento da luz

A dispersão gerada pelas células ao passar o laser é responsável por fornecer os parâmetros de tamanho - FSC

(do inglês, Forward scatter) e granulosidade SSC (do inglês, Side scatter) ou complexidade interna. O tamanho

é fornecido devido à dispersão frontal do laser, que é mensurada por um detector posicionado à frente do

mesmo, enquanto a complexidade interna da célula é dada a partir de um detector que capta a dispersão lateral

do mesmo feixe que atingiu a célula. Adaptado de

<http://www.ibb.unesp.br/Home/Departamentos/MicrobiologiaeImunologia/citometria_de_fluxo.pdf> Acesso

em Junho de 2017.

Os corantes relacionados com proliferação celular, e utilizados na citometria de fluxo,

não são moléculas fluorescentes, mas apresentam a capacidade de se difundirem passivamente

na célula. Uma vez dentro da célula, essas moléculas são hidrolisadas por esterases

intracelulares não específicas e geram produtos fluorescentes que permanecem no meio

intracelular de maneira homogênea. Como exemplo, tem-se o composto Violet Prolifereration

Dye 450 (VPD450), que se excita à 405nm (laser violeta) e emite luz a 450 nm (fluorescência

azul), bem como o 5-6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl éster – CFSE, que é

excitado a 488nm (laser azul) e emite luz fluorescente à 521 nm (fluorescência verde FITC).

A distribuição homogênea dos produtos fluorescentes no citoplasma da célula resulta em

fluorescência uniforme. Quando ocorre divisão celular, tais compostos são distribuídos entre

as células filhas, o que faz com que essas tais células emitam menos fluorescência quando

comparadas às células progenitoras. Esse fenômeno permite a análise, por técnicas

fluorescentes, do comportamento proliferativo das células, por meio do decaimento da

fluorescência emitida pelas mesmas, ao longo das sucessivas divisões celulares ocorridas.

Incident

Light Source

Side Scatter Detector

Forward Scatter Detector

31

Essas divisões podem ser mensuradas por meio de histogramas de fluorescência, onde cada

pico corresponde a um ciclo de divisão celular (LYONS et al. 2000). A figura 5 mostra um

exemplo de análise por citometria de fluxo utilizando o fluorocromo CFSE. No exemplo

podemos perceber que as células não estimuladas e coradas com CFSE apresentam a máxima

intensidade de fluorescência. Já as células estimuladas com um estímulo específico

(anticorpos anti-CD3 e anti-CD28) apresentam picos de menor intensidade de fluorescência,

correspondendo aos ciclos de divisão da linhagem celular em questão. Atualmente os

citômetros podem apresentar até 16 detectores, o que permite analisar múltiplas características

celulares e/ou componentes celulares de um elevado número de células de forma individual

(RIESEBERG el al., 2001).

FIGURA 5 - Coloração fluorescente de CFSE em esplenócitos de ratos

Os esplenócitos foram marcados com 1 μM de CFSE e analisados com ou sem estimulação com anti-CD3 e

anti-CD28 após 3 dias. Pode-se observar um pico único com intensidade máxima de fluorêscencia em células

que não proliferaram (não estimuladas) e picos de diferentes intensidades de fluorescência referentes à

proliferação celular após estímulo devido à distribuição do corante CFSE entre as células filhas. Fonte:

https://www.bdbiosciences.com/documents/Horizon-DS-Cell-Proliferation-Dyes.pdf. Acesso em Junho de 2017.

A utilização da citometria de fluxo nos estudos com a levedura S. cerevisiae e nos

processos biotecnológicos relacionados com a produção de cerveja já foram descritos

previamente na literatura. Scheper e colaboradores (1987) demonstraram que a citometria de

fluxo foi uma técnica útil na diferenciação de aspectos biológicos da levedura Saccharomyces

cerevisiae submetidas às culturas contínuas e descontínuas. Foram avaliados parâmetros

celulares tais como tamanho, conteúdo de RNA e de DNA, além de parâmetros fenotípicos,

como a formação de brotamentos, ao longo do processo de proliferação celular. Já Boyd e

colaboradores (2003), utilizando o corante fluorescente oxonol, realizou uma análise, por

Não

est

imu

lad

a

Esti

mu

lad

a

32

citometria de fluxo, da viabilidade das leveduras durante o processo de produção de cerveja.

Os dados obtidos por essa técnica ofereceram um erro substancialmente reduzido na

determinação da viabilidade celular, em comparação ao método onde foi utilizado o corante

azul de metileno, que é a técnica de referência usada pela indústria para medir tal parâmetro

(LODOLO et al., 2008). Além disso, devido ao grande número de células avaliadas pela

citometria de fluxo, essa técnica se mostrou mais confiável, o que permitiu maior controle de

qualidade do processo fermentativo (BOYD et al., 2003).

Knutsen et al., (2011) em seu estudo utilizou a citometria de fluxo para análise do

ciclo celular da levedura Schizosaccharomyces pombe. Este trabalho apresentou grandes

avanços na análise de células de levedura por citometria de fluxo, uma vez que demonstrou

um método que permitiu a separação de células binucleares de mononucleares, além de outro

método que facilitou a eliminação dos dupletos celulares que são formados em uma

frequência significativa quando as células são fixadas. Esses dois métodos melhoraram as

análises de célula única da levedura estudada por citometria de fluxo e, assim, permitiu uma

análise de células muito mais detalhada, exata e sofisticada.

Estudos prévios, com fungos da espécie Aspergillus nidulans, realizados por nosso

grupo de pesquisa, demonstraram que a citometria de fluxo foi capaz de detectar diferenças

morfológicas durante o crescimento fúngico quando esses eram submetidos às diferentes

fontes de carbono. Para a realização desses experimentos foram utilizados os parâmetros de

tamanho e complexidade interna dos micro-organismos que foram comparados com dados

obtidos pela microscopia óptica. A estratégia de análise foi baseada na seleção de uma região

específica em gráficos bidimensionais de tamanho versus complexidade interna, onde foi

possível distinguir aglomerados correspondentes às células em brotamento ou em fase inicial

de proliferação. Esse estudo permitiu determinar diferenças no crescimento fúngico entre

culturas suplementadas com glicose e sacarose (Figura 6). No entanto, essas diferenças não

foram observadas nas análises realizadas por microscopia. Nesse estudo foi sugerido que a

citometria de fluxo poderia ser uma ferramenta útil no estudo da germinação e crescimento

fúngico, tendo em vista a facilidade de execução, boa sensibilidade e reprodutibilidade, e

principalmente na capacidade de análise de um número expressivo de células, que pode

chegar à 50.000 ou 100.000 células em uma única análise, o que aumenta a confiabilidade dos

resultados (PEREIRA DE SOUZA, et al, 2011).

33

FIGURA 6: Análise do crescimento inicial do Aspergillus nidulans em resposta a fonte de carbono por

citometria de fluxo

Os conídios foram colhidos em solução salina e imediatamente analisados por citometria de fluxo constituindo o

controle (0 h). Culturas em solução salina suplemento ou não com uma fonte de carbono (glicose ou sacarose)

foram analisados por citometria de fluxo após 3-8 h de incubação a 30 ° C. Populações R1, R2 e R3 são

indicadas no primeiro gráfico. Os valores de R2 são dados na parte inferior de cada gráfico como percentagem

de eventos ± desvio padrão (SD) Fonte: Pereira de Souza et al., 2011.

Tendo em vista a experiência acumulada com as investigações já realizadas por nosso

grupo de pesquisa, e considerando a importância do conhecimento acerca do comportamento

34

proliferativo de leveduras durante sua utilização em processos produtivos fermentativos, o

presente estudo propõe uma análise alternativa, por citometria de fluxo, do comportamento

proliferativo de uma cepa comercial de S. cerevisiae.

Como estratégia experimental, decidimos verificar se corantes, normalmente utilizados

para avaliação de proliferação de células humanas, também poderiam ser usados para avaliar

o crescimento de leveduras. Vale ressaltar que diferenças estruturais entre essas duas células,

tais como a presença de parede celular nas leveduras, poderiam ser determinantes para a

utilização ou não das sondas fluorescentes. Tendo como base os estudos realizados por

Pereira e colaboradores (2011), decidimos também verificar se a citometria de fluxo poderia

ser capaz de demonstrar diferenças morfológicas detectáveis ao longo do processo

fermentativo. Como descrito anteriormente, a citometria de fluxo é uma técnica capaz de

detectar alterações no tamanho e complexidade interna de células em crescimento e esse tipo

de análise permite comparar o perfil morfológico de leveduras que crescem em condições

normais daquelas que crescem em condições adversas, tais como em ambientes com altas

concentrações de álcool ou em ambientes que envolvam a adição de insumos que possam ser

prejudiciais ao processo fermentativo. Por fim, também nos propusemos a verificar se a

técnica de citometria de fluxo poderia ser utilizada para mensurar o número de células ao

longo do processo de multiplicação de leveduras. Esses dados, uma vez comparados aqueles

obtidos por técnicas convencionais utilizadas para esse fim, poderão ser utilizados para

verificar a confiabilidade do ensaio aqui proposto.

35

3 OBJETIVOS

3.1 GERAL

Analisar o crescimento e heterogeneidade populacional de uma linhagem comercial

de Saccharomyces cerevisiae (US-05 – Fermentis) por citometria de fluxo.

3.2 ESPECÍFICOS

Verificar, por microscopia confocal, a capacidade de marcação intracelular com sondas

fluorescentes;

Analisar, por citometria de fluxo, o comportamento proliferativo da linhagem de

Saccharomyces cerevisiae por meio do decaimento da fluorescência emitida pela

marcação intracelular com a sonda CFSE;

Analisar, por citometria de fluxo, mudanças no perfil morfológico (tamanho e

complexidade interna) da linhagem de Saccharomyces cerevisiae ao longo do processo

de multiplicação celular;

Comparar as análises realizadas pela citometria de fluxo com técnicas comumente

utilizadas para o estudo da proliferação de leveduras.

37

4 METODOLOGIA

4.1 Linhagem e manutenção de Saccharomyces cerevisiae

A levedura Saccharomyces cerevisiae utilizada no presente trabalho foi adquirida

comercialmente (US-05 - Fermentis Division of S.I.Lesaffre BP 3029) e mantida em estoque

no laboratório de Imunologia do Departamento de Farmácia da UFVJM. A levedura

liofilizada foi reativada em tubos contendo meio de cultura líquido “Yeast extract peptone

dextrose” (YEPD) a 25ºC cuja composição encontra-se descrita na Tabela 1. Após quatro

dias, foi retirada uma alíquota dessa suspensão celular para posterior inoculação no meio Ágar

Saboraud (Acumedia Manufacturing, Michigan-USA), em temperatura de 25ºC, por três dias,

seguindo as recomendações do fabricante. Após o período de incubação, foi coletada uma

colônia isolada para análise por microscopia óptica (BX41TF Olymmpus, Olymmpus Optical

CO, LTD, Laboratory Equipament LISTED 8C57, Japão), que também serviu para ser

inoculada em tubos contendo 10 ml do meio YEPD. Após 48 horas de incubação a 25ºC, foi

adicionado glicerol (30%, p/v, concentração final) e confeccionadas alíquotas de 2 mL em

tubos de polipropileno específicos para criopreservação. As alíquotas foram armazenadas a -

80ºC até o momento de uso nos experimentos.

Tabela 1: Composição do meio utilizado nos ensaios de crescimento

Constituintes Composições

Extrato de levedura 1%

Peptona de carne 2%

Glicose 2%

38

4.2 Marcação da levedura Saccharomyces cerevisiae com 5-6-carboxyfluorescein

diacetate succinimidyl ester (CFSE)

Uma alíquota de 1mL da suspensão de leveduras congeladas foi inoculada em tubo de

ensaio contendo 10 mL de meio YEPD e incubada a 25º C por 48 horas. Após esse tempo,

retirou-se do tubo de ensaio uma alíquota de 2 ml da suspensão de levedura e transferiu-se

para um tubo de polipropileno contendo 10 mL de tampão fosfato salina (PBS), que foi

centrifugada a 2000 x g, a 25º C por 10 minutos. Após a centrifugação, descartou-se o

sobrenadante e o precipitado de células (pellet) foi suspendido em PBS.

Para ajustar a concentração da suspensão de leveduras para 1 x 107

células/mL,

utilizou-se a câmera de Neubauer para contagem, em microscópio óptico, das leveduras

viáveis pelo método de exclusão pelo Azul de Tripan. Ajustada a concentração, a suspensão

de leveduras foi marcada com CFSE (Sigma St. Louis, MO, USA) a 10 µM, por 30 minutos a

25º C, ao abrigo da luz e agitação manual por 20 segundos a cada 10 minutos. Após esse

tempo, a reação foi interrompida adicionando-se 10 mL de PBS, por 5 minutos a 25º C. Em

seguida, a suspensão foi centrifugada por 10 minutos a 2000 x g e 25ºC. Após descarte do

sobrenadante, as leveduras foram suspendidas com 1 mL de PBS e a suspensão de leveduras

marcadas com o CFSE foi transferida para tubos de ensaio contendo 10 mL de YEPD e

incubada a 25º C e foram analisadas por citometria de fluxo, microscopia confocal e

espectrofotometria.

4.3 Análise por citometria de fluxo

4.3.1 Análise fenotípica de S. cerevisiae

Foi realizada a análise por citometria de fluxo em um citômetro BD FACSCanto™ II

(BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) com a seguinte configuração: 3 lasers (azul 488 nm,

vermelho 633 nm e violeta 405 nm), um octógono (488/10 Band pass-BP, 530/30 BP, 585/42

BP, 670 Long Pass - LP e 780/60 BP) e dois trígonos (trígono I -660/20 BP e 780/60 BP;

trigono II - 450/50 BP e 510/50 BP), que possibilita a análise dos parâmetros de tamanho

(FSC - forward side scatter), complexidade ou granulosidade celular (SSC - side light scatter

39

e 8 fluorescências de espectros diferentes, simultaneamente.

A estratégia de análise consistiu na aquisição de uma amostra no tempo inicial de 0

hora e discriminação de uma região “SC” (gate SC) contendo a população de leveduras com

morfologias semelhantes que caracterizassem, teoricamente, as leveduras em estado de

repouso, antes do processo de multiplicação. Essa região “SC” (gate) estabelecida foi adotada

e mantida para as análises em tempos posteriores para verificação das mudanças no padrão

fenotípico (tamanho e complexidade interna) das leveduras ao longo de sua proliferação. Vale

ressaltar que os ajustes de voltagem do citômetro foram estabelecidos a partir dessa primeira

amostra adquirida e foram mantidos ao longo dos experimentos subsequentes. A Figura 7

ilustra como foi realizada a análise da primeira amostra e o estabelecimento do gate SC.

Tendo em vista que o processo de multiplicação de leveduras ocorre por brotamento e que

durante a divisão celular há uma produção de novas organelas e metabólitos, as leveduras, ao

longo do tempo, mudam sua morfologia. Essa mudança, na citometria, se reflete por um

deslocamento para a direita do gate SC estabelecido. A aquisição dos dados foi realizada em

cultura de leveduras submetidas à tempos distintos, utilizando-se o software BD FACSDiva

(BD Biosciences, San Jose, CA, EUA), tendo sido adquiridos um total de 50.000 eventos. A

análise dos dados foi realizada pelo Programa FlowJo 10.0.7 (Tree Star, Ashland, OR, USA).

FIGURA 7: Estratégia de análise do crescimento celular por citometria de fluxo

Gráfico de distribuição pontual de tamanho (FSC - Forward side scatter) versus granulosidade (SSC - Side light

scatter) utilizado para analisar o percentual de células.

Gra

nu

losi

dad

e

Tamanho

SC

50000 eventos

40

4.3.2 – Análise da marcação com a sonda fluorescente CFSE

O comportamento proliferativo da levedura foi determinado utilizando a técnica de

incorporação e decaimento da fluorescência de CFSE, conforme descrito por Lyons et al.

(2000), um corante excitável pelo laser azul (488nm) do citômetro de fluxo.

Para a análise das células marcadas com CFSE, foi feita, primeiramente, a seleção da

população celular de leveduras, identificada em SC, em gráficos de FSC-A versus SSC-H

para as células de leveduras analisadas no tempo inicial (0 hora). Em seguida as células de

leveduras foram analisadas para intensidade de fluorescência do CFSE utilizando-se

histogramas do número de eventos em função da fluorescência (Figura 8). O marcador M1 foi

definido como células que possuem menor intensidade de fluorescência de CFSE e o

marcador M2 foi definido como pico de células de máxima intensidade de fluorescência. Em

seguida, esses marcadores foram utilizados para a análise do comportamento proliferativo da

linhagem de Saccharomyces cerevisiae, pois, espera-se que ao longo da proliferação, maior

percentual de células tendem a ser detectado na região M1, devido ao processo de divisão

celular, uma vez que o corante se distribui entre as células filhas provocando o decaimento da

intensidade da fluorescência do mesmo.

FIGURA 8: Estratégia de análise de proliferação celular pela diluição do CFSE

A B

Gráfico de distribuição pontual FSC x SSC foi utilizado para a seleção da população desejada (A). Em seguida,

histograma de CFSE x número de eventos, foi utilizado para definir a região M1 como células que possuem

menor intensidade de fluorescência de CFSE e a região M2 como pico de células de máxima intensidade de

fluorescência.

Gra

nu

losi

dad

e

Tamanho

Ev

ento

s

CFSE

50000 eventos

M1 M2

0 100

41

4.4 Análise por microscopia confocal

Para a realização das análises por microscopia confocal, a suspensão de leveduras

coradas e não coradas pelo CFSE, em determinados tempos, foram centrifugadas a 2000 x g,

por 10 minutos a 25ºC, seguido de duas lavagens com PBS. Após essa etapa, foram utilizados

200 µL de suspensão das leveduras para a análise da fluorescência e morfologia celulares,

utilizando-se lâminas de vidro e lamínulas de 0,17 mm de espessura. A leitura das lâminas foi

realizada em microscópio confocal Zeiss Laser Scanning Microscope 700 (LSM 700) (Carl

Zeiss, Jena, Germany), sob aumento de 400 vezes. Para a aquisição das imagens, foi utilizado

o software ZEN (Carl Zeiss, Jena, Turíngia, Alemanha).

Para avaliar a presença do fluorocromo CSFE nas células de leveduras foi utilizado o

laser azul (488 nm). O equipamento foi configurado para detectar fluorescência com intervalo

de comprimento de onda entre 515 e 545nm. Os parâmetros adotados de potência do laser e

ganho de detector foram padronizados para todas as análises.

As imagens das células de leveduras foram adquiridas em campo escuro (campo usado

para avaliar a emissão de fluorescência) e em campo claro, obtidas com o auxílio de um

detector de luz transmitida. Também foi adotada a sobreposição das imagens (merge) obtidas

pela análise de fluorescência e de campo claro com o objetivo de avaliar se a fluorescência

emitida estava restrita aos compartimentos celulares.

4.5 Análise da concentração das suspensões de S. cerevisiae no Espectrofotômetro e

Contagem de Células Viáveis em Câmera de Neubauer

Com o objetivo de acompanhar a concentração da suspensão de leveduras ao longo do

tempo de incubação, foram realizadas análises espectrofotométricas e a contagem

microscópica de células em câmara de Neubauer. Para a primeira análise foi utilizado um

espectrofotômetro, modelo Multiskan™ GO (Thermo Fisher Scientific, MA, EUA). Após os

períodos determinados de incubação, a suspensão de leveduras foi centrifugada a 2000 x g,

por 10 minutos e à 25º C seguida de duas lavagens com PBS. O volume da suspensão de

42

leveduras foi ajustado para o mesmo volume inicial contido na cultura e foi retirado cerca de

200 µL da amostra, que em seguida, foram transferidos para uma placa transparente de 96

poços de fundo chato, em duplicata, para leitura da absorbância, utilizando-se o comprimento

de onda de 650 nm.

A contagem de células viáveis em Câmera de Neubauer (Figura 9) foi realizada pelo

método de exclusão pelo Azul de Tripan, com auxílio do microscópico óptico (BX41TF

Olymmpus, Olymmpus Optical CO, LTD, Laboratory Equipament LISTED 8C57, Japão)

com objetiva de 40X. A contagem foi realizada nos quatro quadrantes laterais da câmara e a

concentração da suspensão de células na amostra foi estimada de acordo com a seguinte

fórmula:

nº de células/mL = nº total de células x fator de diluição x 10000

nº de quadrantes contados

FIGURA 9: Câmara de Neubauer

A B

A Câmera de Neubauer é utilizada para determinar a quantidade de células e outras estruturas em amostras

(A). A grade de contagem da Câmera de Neubauer é constituída de quadrantes com subdivisões diferentes, o

tamanho é o critério de escolha do quadrante no qual a célula é contada. A contagem da levedura foi realizada

nas quatro partes laterais da câmara (1), sendo contadas as células de leveduras situadas nos quadrantes

representados pelo número 2 (B). Fonte: Adaptado de

<http://fei.edu.br/~rbianchi/publications/RevistaFEI2004-a.pdf>;

<http://www.biomedicinapadrao.com.br/2013/10/conhecendo-camara-de-neubauer.html > Acesso em Junho de

2017.

43

4.6 Análises estatísticas

Para análise da normalidade dos dados, utilizou-se o teste Shapiro-Wil e as diferenças

entre as variáveis com distribuição normal foram testadas utilizando-se ANOVA com Post

Hoc de Tukey. Diferenças estatisticamente significativas foram consideradas quando p<0,05.

Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão e as análises foram realizadas

utilizando o software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EU).

45

5 RESULTADOS

5.1 Verificação da marcação da levedura Saccharomyces cerevisiae com a sonda

CFSE

Neste estudo, objetivou-se verificar se a citometria de fluxo poderia ser útil na análise

do crescimento e heterogeneidade populacional da linhagem de Saccharomyces cerevisiae,

por meio da marcação intracelular com a sonda fluorescente CFSE. No entanto, foi necessário

confirmar se o CFSE teria a capacidade de ultrapassar a rígida parede celular da levedura e

atingir o meio intracelular. Esse seria o requisito necessário para que a análise de proliferação

celular, por citometria de fluxo, pudesse ser realizada (LYONS et al. 2000). Além disso, era

importante demonstrar que a fluorescência detectada pelo citômetro de fluxo seria fruto da

penetração da sonda fluorescente no interior da célula e não de artefatos provenientes de

marcações inespecíficas ocorridas aleatoriamente.

A análise por microscopia confocal permitiu confirmar que o fluorocromo CFSE

penetrou na linhagem Saccharomyces cerevisiae estudada (Figura 10) e que a fluorescência

emitida esteve relacionada com a presença do corante no interior da célula. Também foi

possível verificar que a sonda CFSE se distribui de maneira homogênea no interior da célula.

Esse resultado forneceu segurança e confiabilidade para a realização das análises de

proliferação por citometria de fluxo.

46

FIGURA 10: Análise da linhagem de Saccharomyces cerevisiae por microscopia confocal

(aumento de 400x) A B

Levedura em campo claro: observa-se a forma unicelular elíptica e a delimitação da parede celular (A). Levedura

marcada - emissão de fluorescência: observa-se o citoplasma todo corado com o fluorocromo CFSE (B).


cerevisiae por microscopia confocal

Visto que a sonda fluorescente CFSE foi capaz de penetrar no interior das

leveduras, e sabendo que ao longo das divisões celulares esse corante se distribui para as

células filhas, foi testado se esse decaimento da fluorescência poderia ser observado pela

microscopia confocal. Para essa análise, as leveduras foram avaliadas após 0, 6, 12 e 18 horas

de incubação e as imagens representativas dos experimentos estão apresentadas na Figura 11.

De acordo com as imagens, percebe-se que ocorreu um decaimento da fluorescência de CFSE

ao longo do tempo. Também foi possível observar que o número de células por campo, com o

passar das horas, foi aumentando em relação ao tempo anterior analisado.

47

FIGURA 11: Análise da linhagem de Saccharomyces cerevisiae por microscopia confocal (aumento de

400x) nos tempos de 0, 6, 12 e 18 horas de incubação

A B C

Campo claro (A). Campo escuro (B) e a sobreposição do campo claro e do campo escuro - merge (C).

0 h

6 h

12h

18 h

48


cerevisiae por citometria de fluxo

Pelas análises realizadas por microscopia confocal não é possível quantificar o

decaimento da fluorescência, bem como realizar uma análise que contemple uma grande

quantidade de células. Além disso, há a subjetividade das análises de intensidade de

fluorescência, principalmente quando são realizados experimentos em dias distintos.

Diante dessas limitações, foi decidido realizar uma análise quantitativa, avaliando um

número bem maior de células, pela técnica de citometria de fluxo. Para essa análise foram

avaliadas 50.000 células para verificar a marcação e decaimento da fluorescência emitida pelo

corante intracelular CFSE. Para a quantificação dos dados foram utilizados histogramas de

fluorescência versus número de leveduras nas culturas de S. cerevisiae não tratadas com

CFSE (Controle não corado), bem como culturas de células coradas com esse corante e

avaliadas após 0, 6, 24 e 30h de incubação. Utilizando a cultura com 0 h de incubação, foi

delimitada uma região (M2) que contemplasse células com a máxima intensidade de

fluorescência, ou seja, as células recém-coradas que ainda não haviam entrado em processo de

mitose. Também foi estabelecida uma região (M1) para obter a quantidade de células que, ao

entrarem em divisão, apresentariam valores menores de intensidade de fluorescência de

CFSE.

De acordo com os resultados, foi possível detectar o decaimento da fluorescência do

CFSE incorporado pela levedura, pela técnica de citometria de fluxo (Controle: M1= 100%,

M2= 0%; 0 hora M1= 1,62% e M2= 92,8%; 6 horas M1= 56,2% e M2= 42,9%; 24 horas M1=

98,8% e M2= 1,18%; 30 horas M1= 99,2% e M2=0,76%). Sendo o controle constituído de

leveduras não marcadas com o CFSE.

49

FIGURA 12: Análise da proliferação celular da levedura Saccharomyces cerevisiae pela diluição do CFSE

por citometria de fluxo nos tempos de 0, 6, 24, e 30 horas

Histograma de intensidade de fluorescência do CFSE x número de eventos. No controle a região M1 representa a

região de células não marcadas e M2 representa a região de células marcadas.

Nessa primeira análise observou-se que os histogramas referentes aos tempos de 24 e

30 horas de incubação foram semelhantes ao da cultura controle não marcada. Também foi

possível concluir que o intervalo de tempo entre 6 e 24 horas foi muito grande para

acompanhar o decaimento gradual da fluorescência de CFSE. Dessa forma, decidiu-se realizar

as análises com um intervalo menor de incubação, sendo eles: 0, 6, 12, 18 e 24 horas de

incubação.

De acordo com os dados demonstrados na Figura 13, o intervalo de 6 em 6 horas

continuou sendo muito longo para detecção gradual do decaimento da fluorescência do

corante CFSE (Controle: M1= 100%, M2= 0%; 0 hora M1= 1,62% e M2= 92,8%; 6 horas

M1= 56,2% e M2= 42,9%; 12 horas M1= 93,8% e M2= 5,57%; 18 horas M1= 98,3% e M2=

1,60%; 24 horas M1= 98,8% e M2= 1,18%). Além disso, foi possível perceber que a

fluorescência do corante CFSE nas leveduras incubadas por 18 e 24 horas se assemelhou às

culturas não marcadas (controle). Diante desses dados, definimos um intervalo de 3 horas para

a realização de novas análises.

Controle 0 hora 6 horas

24 horas 30 horas

Ev

ento

s

CFSE

M1 M2

100 0

M1 M2

1,62 92,8

M1 M2

56,2 42,9

M1 M2

98,8 1,18

M1 M2

99,2 0,76

50


por citometria de fluxo nos tempos de 0, 6, 12, 18 e 24 horas

Histograma de intensidade de fluorescência de CFSE x número de eventos. No controle a região M1 representa a


A Figura 14 representa os dados referentes às análises citométricas das leveduras após

0, 3, 6, 9, 12, 15 e 18 horas de incubação (N= 7). A análise do percentual de eventos

representada pelas regiões M1 e M2 demonstrou a ocorrência de decaimento gradual de CFSE

ao longo do tempo, permitindo inclusive determinar o tempo máximo para análise da

proliferação dessa cepa de S. cerevisiae específica que foi de 18 horas de incubação.

Os valores percentuais de células posicionadas dentro da região M1 (células que

sofreram mitoses), em cada um dos tempos avaliados, estão demonstrados na figura 15. A

análise dos dados revela que houve diferença estatística nos tempos de 0, 3, 6 e 9 horas em

relação ao controle; para os tempos de 12, 15 e 18 horas não houve diferença estatística em

relação ao controle. Também podemos verificar que os níveis de fluorescência, após 9 horas,

ficaram bastante baixos, com valores próximos aos observados para a cultura controle não

marcada.


Ev

ento

s

CFSE

24 horas18 horas12 horas

M1 M2

100 0

M1 M2

1,62 92,8

M1 M2

56,2 42,9

M1 M2

93,8 5,57

M1 M2

98,3 1,60

M1 M2

98,8 1,18

51


por citometria de fluxo nos tempos de 0, 3, 6, 9, 12, 15 e 18 horas

Histograma de intensidade de fluorescência do CFSE x número de eventos. No controle a região M1 representa a


FIGURA 15: Percentual de eventos da região M1 nas culturas de 0, 3, 6, 9, 12, 15 e 18 horas de incubação

Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão. Diferenças estatisticamente significante (p<

0,05,ANOVA com post hoc de Tukey) são identificadas pelas letras diferentes (N= 7).


9 horas 12 horas 15 horas

Ev

ento

s

6 horas

18 horas

CFSE

M1 M2

100 0

M1 M2

5,03 94,6

M1 M2

9,22 89,0

M1 M2

56,2 42,9

M1 M2

84,3 15,3

M1 M2

92,6 7,22

M1 M2

94,6 5,26

M1 M2

96,1 3,78

Cont. 0 3 6 9 12 15 180

20

40

60

80

100

Per

cen

tual

de

even

tos

da

reg

ião

M1

Tempo de incubação (horas)

a

b

a, e

d

c

e

a a

52

5.4 Avaliação das alterações morfológicas da levedura Saccharomyces cerevisiae por

citometria de fluxo

Estudos anteriores realizados por nosso grupo de pesquisa demonstraram que a

citometria de fluxo foi capaz de detectar alterações no tamanho e complexidade interna, de

maneira quantitativa, ao longo do crescimento de Aspergillus nidulans antes mesmo que tais

alterações pudessem ser detectadas por microscopia convencional (PEREIRA DE SOUZA et

al., 2011). Esse estudo nos motivou a verificar se, ao longo da proliferação da levedura S.

cerevisiae, seria possível detectar diferenças morfológicas, uma vez que células em divisão

necessitam aumentar a síntese de diversos componentes citoplasmáticos e nucleares para

garantirem a formação das células-filhas.

Para essa investigação, as mesmas células utilizadas na análise de fluorescência foram

também utilizadas para avaliar o perfil morfológico. Leveduras não coradas com CFSE

(controle) foram testadas para fins comparativos e para demonstrar que a presença do corante

CFSE não induziu mudanças nos parâmetros morfológicos aqui avaliados. Nesse primeiro

experimento foram realizadas as análises citométricas em leveduras no tempo inicial (0 hora)

e após incubação de 6, 24 e 30 horas. A Figura 16 mostra as alterações morfológicas de

Saccharomyces cerevisiae e o percentual de células presentes na região SC (Controle = 95%,

0 hora = 96%; 6 horas = 60,7%; 24 horas = 92,7%; 30 horas = 86,5%).

53

FIGURA 16: Avaliação das alterações morfológicas das células de leveduras de Saccharomyces

cerevisiae por citometria de fluxo nos tempos de 0, 6, 24 e 30 horas


scatter) demonstrando o percentual de células presente na região SC.

Novamente, e corroborando os dados obtidos na análise do decaimento de CFSE, as

diferenças no perfil de tamanho e granulosidade utilizando a análise de intervalos muito

grandes de incubação não foram suficientes para demonstrar diferenças nos parâmetros

avaliados. Sendo assim, foram realizados novos testes onde o intervalo de incubação foi de 6

horas, ou seja, no tempo inicial (0 hora) e após incubação de 6, 12, 18 e 24 horas. A Figura 17

ilustra as alterações morfológicas das leveduras de Saccharomyces cerevisiae por citometria

de fluxo e o percentual de células presente na região SC (Controle = 95%, 0 hora = 96%; 6

horas = 60,7%; 12 horas = 83,6%; 18 horas = 90,9%; 24 horas = 92,7%).

SC

95

SC

96SC

60,7

SC

93,8

SC

95,3

Gra

nu

losi

dad

e

Tamanho


24 horas 30 horas

54

FIGURA 17: Avaliação das alterações morfológicas das células de leveduras de Saccharomyces cerevisiae

por citometria de fluxo nos tempos de 0, 6, 12, 18 e 24 horas


scatter) demonstrando o percentual de células presente na região SC.

Tendo em vista que as alterações morfológicas mais expressivas foram observadas

entre as leveduras avaliadas após 0 e 6 horas e 6 e 12 horas de incubação, supõe-se que o

intervalo de 6 horas ainda não foi um intervalo adequado para se avaliar a dinâmica das

alterações de tamanho e complexidade interna da célula, inerentes ao processo proliferativo.

Pensando nisso, e também com base nos dados já observados para as análises de proliferação

demonstradas anteriormente, decidiu-se realizar as análises em tempos ainda menores. A

Figura 18 é uma figura representativa de 7 experimentos e mostra as alterações morfológicas

das leveduras de Saccharomyces cerevisiae e o percentual de células presente na região SC no

tempo inicial de 0 hora e após 3, 6, 9, 12, 15 e 18 horas de incubação. De acordo com os

dados obtidos, podemos verificar que as análises realizadas de 3 em 3 horas permitiu uma

melhor visualização das alterações morfológicas ocorridas ao longo da proliferação celular.

Na Figura 19 podemos observar os valores percentuais obtidos na região SC, que representam

SC

95SC

96

SC

60,7

SC

92,7SC

83,6

SC

90,9


24 horas

Gra

nu

losi

dad

e

Tamanho

12 horas 18 horas

55

a fração de células com morfologia característica de células em estágios iniciais do processo

de proliferação.

FIGURA 18: Avaliação das alterações morfológicas das células de leveduras de Saccharomyces cerevisiae

por citometria de fluxo nos tempos de 0, 3, 6, 9, 12, 15 e 18 horas


scatter) demonstrando o percentual de células na região SC.


Gra

nu

losi

dad

e

6 horas

Tamanho

9 horas 12 horas 15 horas 18 horas

SC

93,7

SC

92,1

SC

70,4

SC

64

SC

85,9

SC

88,8

SC

91,8

SC

91

56

FIGURA 19: Percentual de eventos da região SC nas culturas de 0, 3, 6, 9, 12, 15 e 18 horas de incubação

Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão. Diferenças estatisticamente significativas (p< 0,05

ANOVA com post hoc de Tukey) são identificadas pelas letras diferentes (N= 7).

A análise dos dados revela que a diminuição do percentual de leveduras dentro da

região SC das culturas avaliadas após 3 e 6 horas de incubação ocorreu por um deslocamento

das populações celulares em direção a uma região onde se encontram células com valores

aumentados de FSC, ou seja, de maior tamanho celular. Há uma tendência ao aumento do

percentual de células na região SC, após 9 horas de culturas, se igualando à cultura controle a

partir de 12 horas de incubação, permitindo inferir que as leveduras, depois de certo tempo,

retornam à morfologia inicial. Esse dado é consistente com a dinâmica das alterações

morfológicas ocorridas durante o processo de divisão celular, ou seja, a célula em processo de

mitose aumenta seu tamanho e sua complexidade e ao final da mitose, ambas as células-filhas

assumem uma morfologia semelhante às células progenitoras.

5.5 Análise do número de células da linhagem Saccharomyces cerevisiae ao longo da

incubação

A divisão celular intensa ao longo das 18 horas de incubação foi detectada

visualmente por meio da turvação do meio de cultura, bem como por meio do número de

eventos analisados por unidade de tempo (fluxo) durante a aquisição dos dados pela

Cont. 0 3 6 9 12 15 180

20

40

60

80

100

Tempo (horas)

Per

cen

tual

de

even

tos

da

regiã

o S

CP

erce

ntu

ald

e ev

ento

sd

a re

giã

oS

C


a a

b, d

d

c

a a a

57

citometria de fluxo. Diante dessa observação, indagamos se a citometria de fluxo também

poderia ser utilizada para mensurar o número de células, e mesmo a concentração da

suspensão celular, após um determinado intervalo de tempo de incubação das leveduras. Vale

ressaltar que na citometria de fluxo, as células são alinhadas e interceptadas uma a uma pelo

laser, e a detecção dos sinais fluorescentes da célula, juntamente com os dados de dispersão

da luz incidente, são interpretados em conjunto como evento único. Para o observador, cada

evento pode ser considerado como uma célula e, quanto mais concentrada estiver a suspensão

celular, maior será a quantidade de eventos analisados por uma unidade de tempo (taxa de

leitura). Assim, de maneira geral, a taxa de leitura reflete a concentração da suspensão celular

analisada.

Diante do exposto, utilizou-se a citometria de fluxo para mensurar a concentração das

suspensões celulares após um determinado tempo de cultura. A estimativa do número de

células na citometria de fluxo foi avaliada analisando a quantidade de células interceptadas

pelo laser durante um intervalo fixo de tempo previamente determinado (30 segundos). A

análise das suspensões de leveduras após 3, 6, 9, 12, 15 e 18 horas de incubação está

demonstrada na Figura 20.

58

FIGURA 20: Avaliação no número de células por citometria de fluxo

Número de células no tempo inicial de 0 hora e após incubação nos tempos de 3, 6, 9, 12, 15 e 18 horas. Os

resultados foram expressos como média ± desvio padrão. Diferenças estatisticamente significativas (p< 0,05, ANOVA com post hoc de Tukey) são identificadas pelas letras diferentes (N= 7).

Essas análises foram comparadas com aquelas obtidas por técnicas convencionais

utilizadas para esse fim, tais como a espectrofotometria. Na análise espectrofotométrica, foi

utilizada uma curva padrão, obtida por meio da análise de absorbância a 650nm, de

suspensões de S. cerevisiae após uma diluição seriada de uma concentração devidamente

conhecida (Figura 21A). A partir dessa curva, foi possível mensurar a concentração das

suspensões celulares experimentais no tempo inicial de cultura e após 3, 6, 9, 12, 15 e 18

horas de incubação (Figura 21B).

O número de leveduras por mL de suspensão, após diferentes tempos de incubação

também foi avaliado por meio da contagem de células em câmera de Neubauer pelo método

de exclusão pelo Azul de Tripan. Os resultados desta análise estão demonstrados na Figura 22.

0 3 6 9 12 15 180

2

4

6

8

10

12

14


a aa, b

b

a, b

c

d

Nú

mer

o d

e cé

lula

s (1

06/m

L)

59

FIGURA 21: Avaliação no número de células por espectrofotometria

Curva padrão da suspensão de levedura (A); número de células no tempo inicial de 0 hora e após incubação nos

tempos de 3, 6, 9, 12, 15 e 18 horas (B). Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão. Diferenças

estatisticamente significativas (p< 0,05,ANOVA com post hoc de Tukey) são identificadas pelas letras diferentes

(N= 7).

0 3 6 9 12 15 180.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

2.4

2.8

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.70

4

8

12

16

20

24

Y= 54,65X + 002648

r² = 0,9957

Absorbância

Núm

ero d

e C

élula

s (1

06/m

L)

A

B

Núm

ero d

e cé

lula

s (1

06/m

L)


aa

a

a,ba,b

b

c

60

FIGURA 22: Avaliação no número de células por câmera de Neubauer

Número de células no tempo inicial de 0 hora e após incubação nos tempos de 3, 6, 9, 12, 15 e 18 horas. Os

resultados foram expressos como média ± desvio padrão. Diferenças estatisticamente significativas (p< 0,05,

ANOVA com post hoc de Tukey) são identificadas pelas letras diferentes (N= 7).

Diante dos resultados, foi possível verificar que os dados obtidos pela citometria de

fluxo apresentaram uma concordância na mensuração do número de células contadas ao longo

do processo de crescimento da levedura quando comparados às outras duas técnicas avaliadas,

o que pode ser comprovado pelos altos índices de correlação observados e demonstrados na

Figura 23. Esses dados reforçam o potencial da técnica de citometria de fluxo para a avaliação

do comportamento proliferativo de culturas de leveduras.

0 3 6 9 12 15 180

4

8

12

16

20

24

28

Tempo (horas)

Nº

de

Cél

ula

s viá

vei

s(x106)

Nú

mer

o d

e C

élula

s V

iávei

s (1

06/m

L)


aa

a, b

b

a, b

c, d

d

61

FIGURA 23: Correlação do número de células

Número de células contadas por Câmera de Neubauer versus citometria de fluxo (A); Número de células

contadas por espectrofotometria versus citometria de fluxo (B).

0 3 6 9 12 150.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

0 3 6 9 12 150

5

10

15

20

25

r² = 0,9870

Núm

ero d

e cé

lula

s co

nta

das

por

Neu

bau

er(1

06/m

L)

Número de células contadas por citometria (106/mL)

r² = 0,9474

Número de células contadas por citometria (106/mL)

Núm

ero d

e cé

lula

s co

nta

das

po

r

esp

ectr

ofo

tom

etri

a (1

06/m

L)

A

B

63

6 DISCUSSÃO

O controle de processos e a otimização no campo da biotecnologia requer métodos

modernos para obter uma rápida avaliação dos processos metabólicos e crescimento das

células durante a fermentação (RIESEBERG et al., 2001).

Com grande impacto na comunidade científica, a citometria de fluxo permite realizar

medições de grandes quantidades de células em um curto período de tempo, de maneira que a

heterogeneidade das populações pode ser revelada e diferentes subconjuntos de células

identificados e quantificados (CÔRTE-REAL et al., 2002). Além disso, é uma técnica

multiparamétrica que pode ser usada para monitoramento em tempo real de qualquer processo

fermentativo, permitindo tomar decisões para ajustar condições de operação no decorrer do

processo (KUŘEC et al., 2009).

Em trabalhos prévios, analisando fungos do gênero Aspergillus, foi desenvolvida uma

técnica alternativa de acompanhamento do crescimento desse micro-organismo por meio da

citometria de fluxo (PEREIRA DE SOUZA et al., 2011). De acordo com os resultados, a

técnica permitiu observar diferenças morfológicas ao longo do crescimento fúngico, ainda não

detectáveis pelas técnicas convencionais como a microscopia óptica. Em outro estudo com a

linhagem A. tubingensis AN1257, além de acompanhar o crescimento fúngico por citometria

de fluxo, foi analisada a necessidade ou não de fixação desse fungo e os resultados

possibilitaram quantificar as populações de forma precisa, independente do processo de

fixação das células com paraformaldeído (RODRIGUES, 2014).

Diante dos resultados obtidos com fungos do gênero Aspergillus, e ampliando a

aplicação da citometria de fluxo nos processos biotecnológicos, o presente estudo focou na

análise do crescimento e heterogeneidade populacional de uma linhagem comercial de

leveduras utilizadas na produção de cervejas, tendo em vista a possibilidade de inclusão dessa

ferramenta na análise de parâmetros ligados ao controle de qualidade do processo produtivo

da bebida, tais como: i) possibilidade de avaliar o percentual de contaminação ou presença de

levedura selvagem ao longo do processo fermentativo; ii) capacidade de avaliar, de maneira

individualizada, uma grande quantidade de células e seus parâmetros fenotípicos durante o

crescimento; iii) acompanhar a produção de cervejas que utilizam mais de uma cepa de

levedura, iv) acompanhar a eficiência da proliferação das leveduras em determinadas

condições (altos teores de álcool ou adição de insumos diversos na cerveja em fermentação).

64

Visto que a espécie Saccharomyces cerevisiae se reproduz assexuadamente por

brotamento ou gemulação, e durante o processo de brotamento, o núcleo se divide por

constrição e parte dele, bem como outras organelas, entram no broto (LEGRAS et al.,2007;

CARVALHO et al., 2006) foi possível, pela citometria de fluxo demonstrar o decaimento da

intensidade da sonda fluorescente, utilizada para análise de proliferação celular, ao longo do

tempo de incubação da levedura (Figura 14). Esse resultado foi confirmado com a marcação e

decaimento desse corante pela técnica de microscopia confocal como evidenciado na Figura

11. No entanto, sempre que a técnica for utilizada, é necessário avaliar o intervalo de tempo

em que se deseja verificar o fenômeno do decaimento de CFSE, visto que cada levedura tem

um tempo específico para divisão celular. Em nosso estudo, por exemplo, verificamos que em

tempos superiores a 18 horas, não foi possível verificar a marcação com o referido corante.

Após 24 e 30 horas, as células já se apresentavam, mesmo tendo sido marcadas no início do

experimento, como àquelas do grupo controle não corado.

Verificou-se também no presente estudo, que as alterações morfológicas do processo

de brotamento da linhagem Saccharomyces cerevisiae podem ser estudadas por citometria de

fluxo, visto que as células proliferaram apresentando diferenças em complexidade celular e

morfologia, sendo então separadas por tamanho na fase de brotamento (Figura 18). Os

resultados baseados em tamanho e complexidade celular demonstraram um perfil cíclico,

característico das alterações morfológicas observadas ao longo da multiplicação de leveduras.

Ou seja, ao longo da proliferação, células progenitoras modificam sua conformação para dar

origem a duas novas células filhas, sendo essas, uma vez formadas, morfologicamente

semelhantes à célula progenitora antes de iniciar a divisão celular (MADIGAN et al., 2010).

Em nossa análise, foi possível quantificar o percentual de células no início do processo de

divisão, bem como a redução desse percentual após um intervalo de 3 e 6 horas,

correspondente às células que perderam suas características iniciais e migraram para uma

região fora da demarcação estabelecida (região SC). Esses dados permitiram inferir que a

cepa comercial de S. cerevisiae completou seu processo mitótico próximo de 6 horas (doble

time ou tempo de geração).

Embora os resultados apresentados aqui tenham sido satisfatórios para a proposição da

técnica como uma ferramenta útil na análise morfológica das leveduras, os dados obtidos

também revelaram a necessidade de adoção de medidas, tais como a sincronização do

processo de proliferação celular, que proporcione maior definição entre as células

65

progenitoras nas fases inicial e intermediária/final do processo mitótico. Como pode ser

observado nos gráficos da Figura 18 e 19, a região SC estabelecida apresenta claramente, no

tempo 0, populações diferentes em termos de tamanho, que certamente se encontram em

etapas diferentes da mitose.

As análises realizadas por citometria de fluxo permitiram também mensurar o número

de células ao longo do tempo de incubação, o que coloca a técnica como um método

promissor e alternativo para estudos quantitativos (Figura 22). A alta correlação entre as

células contadas pela citometria de fluxo e aquelas contadas em câmara de Neubauer e pela

espectrofotometria confirma o potencial da técnica para esse fim (Figura 23) (SAMPAIO,

2007). Outra abordagem possível para se mensurar a concentração de uma suspensão de

leveduras seria utilizar suspensões celulares com concentrações distintas e conhecidas e

submetê-las à análise por citometria de fluxo para quantificar a taxa de leitura, que representa

um número de células contadas em uma unidade definida de tempo. Dessa forma, uma

suspensão menos concentrada geraria uma taxa de leitura menor do que as suspensões mais

concentradas. Esses parâmetros poderiam ser utilizados para a construção de curvas padrões

que serviriam para a determinação de suspensões celulares com concentração desconhecida.

Questionamentos sobre esse tipo de análise poderiam ser levantados uma vez que é possível,

principalmente em suspensões celulares muito concentradas, a contagem de leveduras

agregadas. Essas aglomerações poderiam ser contabilizadas como um único evento, ou seja,

uma única célula. No entanto, existem maneiras de minimizar esse erro avaliando-se o sinal

de voltagem gerado quando as células são interceptadas pelo laser. O sinal de voltagem

gerado quando uma célula é interceptada, de maneira individual, pela fonte de laser, apresenta

uma altura, largura e área bem definidas. No entanto, quando duas células agregadas são

interceptadas, o sinal de voltagem sofre alteração em pelo menos um desses parâmetros

(altura, largura ou área). Durante a aquisição de dados pela citometria de fluxo, é possível

configurar o equipamento para identificar e excluir os sinais de voltagem que fogem ao

padrão de células individualizadas, e dessa forma garantir a confiabilidade dos resultados

obtidos ((TUCHIN, 2011; BASIJI et al., 2007).

Estudos prévios conduzidos por Boyd e colaboradores (2006) demonstraram o

potencial da citometria de fluxo no controle de processos biotecnológicos na produção de

cerveja. Nessa investigação os autores propõem um método para a determinação citométrica

66

da viabilidade de leveduras por meio da utilização da sonda fluorescente oxonol, um corante

lipofílico e aniônico que acumula no citoplasma de células mortas. Após a incubação das

leveduras, obtidas do processo de fermentação do mosto cervejeiro, com o referido corante,

foi possível determinar o percentual de células fluorescentes (mortas) e não fluorescentes

(viáveis). Esse ensaio se mostrou mais sensível e reprodutível quando comparado ao ensaio

clássico utilizando-se a marcação das células com o corante azul de metileno, seguido de

análise microscópica. Segundo os autores, a possibilidade de análise de um grande número de

células pela citometria de fluxo foi um fator preponderante na reprodutibilidade dos dados.

O presente estudo teve como principal objetivo a proposição da citometria de fluxo

como uma técnica alternativa para a análise do crescimento e heterogeneidade populacional

de leveduras comerciais de S. cerevisiae. No entanto, a citometria de fluxo também possibilita

a avaliação de diversos outros parâmetros, sejam eles fisiológicos e bioquímicos, de maneira

simultânea, ao longo de processos biotecnológicos. A utilização de anticorpos específicos

conjugados a fluorocromos e direcionados para marcadores celulares específicos da estrutura

celular, bem como a utilização de substâncias capazes de emitir fluorescência após a ação de

enzimas presentes no interior das células, faz com que a citometria possa ser utilizada para a

observação de diversos mecanismos moleculares que possam influenciar no processo

produtivo biotecnológico, tais como a expressão e atividade de enzimas, bem como a

produção de metabólitos de interesse. Nesse sentido, a citometria de fluxo, além de

possibilitar a análise do processo fermentativo como demonstrado aqui, abre perspectivas para

investigações futuras em outras áreas biotecnológicas.

67

7 CONCLUSÕES

A partir dos resultados obtidos, corantes normalmente utilizados para avaliação de

proliferação de células humanas, também podem ser usados para avaliar o crescimento da

levedura, uma vez que através da citometria de fluxo, por meio da marcação intracelular do

fluorocromo CFSE, foi capaz de demonstrar o decaimento da fluorescência do fluorocromo

específico para análise de proliferação celular ao longo do tempo de incubação da levedura

Saccharomyces cerevisiae.

A citometria de fluxo foi capaz de demonstrar diferenças morfológicas ao longo do

processo fermentativo, através das alterações no tamanho e complexidade interna de células

em crescimento. Verificou-se também que as análises realizadas em tempos menores (de 3 em

3 horas de incubação) obteve melhor configuração observada para o estudo da população

celular de interesse.

A técnica de citometria de fluxo também foi utilizada para mensurar o número de

células ao longo do processo de multiplicação de leveduras, demonstrando que a citometria de

fluxo pode ser um método multiparamétrico interessante e alternativo para estudos

quantitativos e principalmente com a capacidade de análise de um número expressivo de

células.

De acordo com os dados obtidos no presente estudo concluiu-se que a análise do

comportamento proliferativo, tais como crescimento celular, tamanho e granulosidade

(complexidade) de S. cerevisiae foram possíveis de ser realizada por citometria de fluxo. A

possibilidade de uso de sondas fluorescentes para marcação intracelular dessa levedura

também abriu perspectivas para o uso da técnica para detecção ou quantificação de outros

parâmetros bioquímicos e fisiológicos de interesse biotecnológico.

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